WO2000032235A1 - Transportsystemkonjugate - Google Patents

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WO2000032235A1
WO2000032235A1 PCT/CH1999/000567 CH9900567W WO0032235A1 WO 2000032235 A1 WO2000032235 A1 WO 2000032235A1 CH 9900567 W CH9900567 W CH 9900567W WO 0032235 A1 WO0032235 A1 WO 0032235A1
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WO
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glu
acid
transport system
amino
asp
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PCT/CH1999/000567
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Dominik Imfeld
Christian Ludin
Thomas Schreier
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Pentapharm Ag
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Definitions

  • the present invention relates to transport system conjugates as transmembrane transport systems for topical and transdermal applications, in particular in dermatology and cosmetics, and for systemically active pharmaceutical ingredients.
  • the transport system according to the invention can be used for peptide active substances as well as for non-peptide active substances, e.g. Vitamins or hormones or antibiotics can be applied.
  • the areas of application for the topical and transdermal use according to the invention are numerous and relate, for example, to the transport of active substances into and through the skin for healing or for protecting the skin, as described below.
  • the transport of pharmaceutically and / or cosmetically usable active ingredients, such as polypeptides, through a cell membrane to the intracellular site of action in sufficient concentration is a critical factor in the development of a topically or transdermally effective application.
  • most polypeptides are polar and large molecules that are poorly absorbable when administered orally or parental.
  • transdermal administration It is advantageous that the skin has only a few proteolytic enzymes that can hydrolyze the polypeptide.
  • the hurdles to be overcome in the transdermal application form the natural lipid barrier of the outermost layer of the skin, the horny layer, and for intracellularly active substances also the cell membranes. Since lipophilicity is required to overcome lipophilic membrane barriers, the transport properties of polypeptides can be increased by lipophilic modification. The goal is usually only achieved to an insufficient extent.
  • transport system conjugates can be used on fibroblasts, keratinocytes, melanocytes and Langerhans cells and are less readily biodegradable. They can therefore function longer in the cell.
  • Fibroblasts are localized in the connective tissue, including the dermis. During wound healing, the fibroblasts differentiated into myofibroblasts form bundles of
  • ⁇ SM-Actin ⁇ -smooth muscle actin
  • These fibers are also cross-linked with contractile proteins and cytoskeletal proteins. These stress fibers therefore play a major role in the contraction of wounds. Smooth muscle cells have the same stress fibers as the myofibroblasts and therefore serve as a model system.
  • this tetrapeptide can be brought into the cell in the form of the transport system conjugate according to the invention without microinjection and thus blocks the polymerization of ⁇ SM-actin as effectively as the microinjected tetrapeptide.
  • the latter cannot penetrate the cell membrane itself, as was shown in a control experiment.
  • the generally known approach of using lipophilic fatty acid conjugates (hexadecanoyl or octanoyl or others) of the tetrapeptide does not work here.
  • the tetrapeptide was shown in the experiment that it is surprisingly possible for the tetrapeptide to be taken up into the cell if it is present as a transmembrane transport system or is connected to a transporter according to the invention which is linked to the carboxy-terminal end of the tetrapeptide via the amino acid Asp.
  • the transporter in the present experiment consists of the amino acid lysine, in which the side chain of lysine in the ⁇ position is linked via an amide bond with D, L-6, 8-dithio-octanoic acid.
  • the tetrapeptide, linked to the named transporter molecule has a significantly higher availability in the cell compared to the unmodified tetrapeptide.
  • Availability can be further increased significantly if the carboxy-terminal end of the tetrapeptide is additionally conjugated to a fatty acid, for example octanoic acid, by a 1,2-ethylene diamide linkage. It is advantageous that a fatty acid reduces the unwanted enzymatic degradability of the active ingredient without impairing the effectiveness of the active ingredient.
  • Keratinocytes essentially build up the outer layers of the skin, the epidermis and stratum corneum (horny layer). The condition of the epidermis is therefore primarily dependent on the growth properties and the degree of differentiation of the keratinocytes.
  • the transport of usable, pharmacologically active compounds, such as peptides, through the cell membrane of keratinocytes is of great interest for dermatological and cosmetic applications.
  • 5- (Biotinamido) pentylamine (Pierce Ine, Rockport, II, USA) serves as a fluorescence marker and is attached to the Asp as A id.
  • Tyrosinase is an enzyme expressed in melanocytes that plays a key role in the biosynthesis of melanins. It has been shown that the activation of the melanin-forming enzyme (tyrosinase) is essentially dependent on phosphorylations on serine residues of the cytoplasmic domain of the enzyme (Park et al, 1993, JBC 268; 11742-11749 / Park et al. 1995, J. Invest Dermatol. 104: 585 Abstr. 186).
  • TMP tyrosinase-mimicking peptide
  • the present invention relates to a transport system conjugate as a transmembrane transport system, which is characterized in that this transport system conjugate consists of at least one pharmaceutically and / or cosmetically active compound, and this compound has been modified such that it has at least one substituent of the formula ( I) and at least one substituent of the formula (II) and / or (III) bonded to Y:
  • Y is a residue of an amino acid with originally at least 3 reactive groups or a residue of 2 or 3 amino acids bonded to one another with originally at least 3 reactive groups, each selected from amino
  • R is hydrogen or alkyl having 1, 2, 3 or 4 carbon atoms, preferably hydrogen or methyl, preferably hydrogen, m is an integer from 3 to 8, preferably 4, 5 or 6, p 1 2 or 3, and preferably 1, mean.
  • the present invention further relates to the process for the preparation of the transporter system conjugates according to the invention and the use of these transporter system conjugates for topical and transdermal applications in dermatology, cosmetics or for systemically active pharmaceuticals.
  • the present invention further relates to medicinal products which contain a transport system conjugate according to the invention, and to their topical and transdermal use in dermatology, cosmetics or for systemically active pharmaceuticals.
  • Y denotes a residue of an amino acid with originally at least 3 reactive groups
  • Y preferably denotes a residue of an amino acid with originally at least one carboxyl group [-C (O) 0H] and at least two amino groups (-NH 2 ), such as lysine (Lys), or a residue of an amino acid with originally at least two carboxy groups and at least one amino group, such as, for example, aspartic acid (Asp) or glutamic acid (Glu),
  • Ornithine D, L ⁇ , ß-diaminopropionyl acid, D, L- ⁇ , ⁇ butyryl-a inoic acid, citrulline, homocitrulline, D, L-2-amino-hexanedioic acid, D, L-2-aminoheptanedioic acid, 2-amino -2 octanedioic acid.
  • Y as the residue of 2 or 3 amino acids bonded to one another with originally at least 3 reactive groups, is represented, for example, by the remainder of two molecules Lys, Gly (Lys.Gly) or bound to one another and alanine and L-2-amino-adipic acid, (L-2-amino-adipic acid. Ala).
  • Y preferably denotes the remainder of lysine, aspartic acid or glutamic acid, ornithine, L-2,3-diaminopropionic acid, L- ⁇ , ⁇ -butyrylamino acid, citrulline, ho-ocitrulline, L-2-aminoadipic acid, L-2-amino-heptanedioic acid, L-2-amino-octanedioic acid or tris (2-aminoethyl) amine and preferably the rest of lysine.
  • the D.L form, D or L form of these amino acids can be used,
  • RC (O) - as a residue of a saturated, mono- or polyunsaturated, optionally substituted, (C 4 -C 24 ) - fatty acid means as residue of a saturated acid, for example, the corresponding carbonyl residue of butyric acid, valeric acid, caproic acid, heptanoic acid, caprylic acid, capric acid , Lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid or arachic acid, the residue of an unsaturated acid, for example the corresponding carbonyl residue of ⁇ -dodecylenic acid, oleic acid, linoleic acid, arachidonic acid, and the residue of a substituted olefinic fatty acid, for example the corresponding carbonyl of ricinoleic acid.
  • RC (O) preferably denotes the residue of a saturated or unsaturated fatty acid having 6, 8, 10, 12, 14, 16 or 18 carbon atoms, preferably the corresponding residue of a saturated fatty acid, preferably the corresponding residue of caprylic acid [CH 3 - ( CH 2 ) 6 -C (O) -], Lauric acid [CH 3 - (CH 2) 1 0 -C (O) -], myristic acid [CH 3 - (CH 2) i 2 "c (°) ⁇ ] / palmitic acid [CH 3 - (CH 2) x 6 - C (0) -] or stearic acid [CH 3 - (CH 2 ) i 6 "C (0) -].
  • the rest of the formula (II) is preferably D, L-6,8-di-thiooctanecarbonyl.
  • This radical can be attached directly to an NH group of Y, or via a transition group (linker), for example via the group - (NH-C n H 2 n -NH) -, which is preferably - (NH-CH 2 CH 2 -NH ) - means to be bonded to a carbonyl group of Y.
  • the radical of the formula (II), preferably as a D, L-6, 8-dithiooctanamide radical, is preferably attached directly to the amino-terminal end of the amino-terminal side chain and / or to the NH radical in the ⁇ -position of Y by means of an amide bond.
  • m is preferably 4 and p is preferably 1.
  • the rest of the formula (III) can be bound to Y in a manner analogous to that described for the rest of the formula (II).
  • Protecting groups of the thiol function are preferably trityl, t-butyl, benzyl, ethyl, methyl, acetamidomethyl, 4-methoxybenzyl, 4-methylbenzyl, diphenylmethyl.
  • the pharmaceutically and / or cosmetically active compound contained in the transport system conjugate according to the invention can be bound directly to an NH group or to a carbonyl group of Y, if appropriate via a suitable transition group, such as, for example, - (NH-C n H 2 n ⁇ N H) - his. This depends on whether the pharmaceutically and / or cosmetically active compound is to be bound to Y via a hydroxyl, carboxyl, amino, or SH group or other suitable group contained therein.
  • the pharmaceutically and / or cosmetically active compound is preferably attached directly or via a suitable intermediate group to an NH group of Y, preferably directly to the amino terminal end and / or to the NH residue in the ⁇ position of Y.
  • Transport system conjugates according to the invention as transmembrane transport systems preferably correspond to formula (IV) or formula (V):
  • A represents the remainder of the pharmaceutically and / or cosmetically active compound modified according to the invention and R has the meaning given above.
  • the transport system according to the invention can be used for pharmaceutically and / or cosmetically active compounds, for example for peptide active substances and also for non-peptide active substances, such as e.g. Vitamins, hormones or antibiotics can be applied.
  • Preferred is use for peptide drugs, i.e. for peptides and polypeptide compounds.
  • peptide means an amino acid, preferably an ⁇ -amino acid.
  • Polypeptide as a peptide active ingredient means a polypeptide with preferably 2-20 amino acid units, preferably Glu-Glu- Glu-Asp, Glu-Glu-Glu-Asp-Lys, Glu-Glu-Glu-Asp-Ser-Thr-Ala- Leu-Val-Cys, Ala-Glu-Glu-Asp, Glu-Glu-Glu-Glu, Ala-Glu-Glu-Glu, Glu-Glu-Glu-Asp-Ala-Thr-Ala-Leu-Val-Cys, Glu-Glu-Glu Asp-Leu-Thr-Ala-Leu-Val-Cys, Leu- Gly-Asp.
  • the amino acids can be both L-amino acids and D-amino acids, and also corresponding salts, such as, for example, with TFA, or acetates or propionate
  • a modified peptide or polypeptide and / or compounds which have free groups such as, for example, -OH, -COOH, -NH 2 or -SH, are used as the active ingredient in the transport systems according to the invention, these compounds can be provided with protective groups, which are at most attached to them existing reactive groups are attached.
  • Such protective groups are preferably acetyl, Boc, tert-butyl, substituted benzyl esters, substituted methyl esters, 2-substituted ethyl esters, optionally substituted (C 2 -C 22 ) alkylcarbonyl or mono- or polyunsaturated optionally substituted (C -C 2 2 ) alkenylcarbonyl , substituted methyl, ethyl, propyl or isopropyl carbamates.
  • a fluorescent marker preferably biotin, can also be used as a protective and control group, the low-molecular protective group, the (C 2 -C 22 ) - alkylcarboxylic acid, the (C 2 -C 22 ) - when using peptides and polypeptides.
  • Alkenylcarboxylic acid or the fluorescent marker is preferably attached directly to the amino-terminal end or via the linker -Y- to the carbonyl-terminated end of the peptide or polypeptide.
  • Vitamins, hormones and antibiotics are also suitable for the use according to the invention.
  • Preferred vitamins are vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, vitamin C, vitamin D, vitamin E and vitamin K.
  • the transport conjugates of the formula 4 or 5 are preferably used via a transition group as an amide on the conjugate side with, for example, succinyl or one other dicarboxylic acid and as an ester with the hydroxyl group of vitamins and hormones.
  • the transporter is linked directly as an amide.
  • Preferred hormones are peptide hormones, in particular aduretin, oxytocin, melanocyte-stimulating hormone, calcitone and non-peptide hormones, in particular glucocorticoids, androgens and estrogens.
  • the oligopeptide can be produced by the processes described in the following known methods (1994 general rules of M. Bodanszky "The Practice of Peptide Synthesis” Springer Verlag, 2 nd Edition).
  • the amino acid for example Asp
  • the amino acid is attached to a resin in a solid phase synthesis at the carboxy-terminal end, the amino group of which is protected by a protective group, for example the F oc protective group.
  • the side chain is protected with Boc or t-butyl, for example.
  • the protective groups are split off selectively as required in order to link the further amino acid derivatives with the reagents customary in peptide synthesis until the desired chain length has been built up completely.
  • the peptide is then cleaved from the resin at the carboxy-terminal end and this carboxyl-terminal end is linked to the amino-terminal residue of Lys, which is linked to different carboxylic acid residues at the carboxy-terminal end by a 1,2-ethylenediamide linkage.
  • the protective groups are removed and the free ⁇ -amino-terminal end of the side chain of the lysine is reacted, for example, with the N-hydroxysuccinimide ester of D, L-6, 8-dithiooctanamide.
  • the transporter system conjugate according to the invention is prepared in such a way that a pharmaceutically and / or cosmetically active compound known per se, preferably an amino acid with any amino-terminal side chain and a carbonyl-terminated end, has an amide structure with a suitable one corresponding to the rest -Y- Starting compound, in a manner known per se, linked directly or via a linker at their amino-terminal end and / or carboxy-terminal end, one or more protective groups optionally being added before or after, and the intermediate product obtained is then known in a manner known per se using the appropriate one Radical -C (0) R and the starting compounds corresponding to formulas (II) and / or (III) are converted into the transport system conjugate.
  • a pharmaceutically and / or cosmetically active compound known per se preferably an amino acid with any amino-terminal side chain and a carbonyl-terminated end
  • the transport system conjugate according to the invention can also be put together in any other order. So you can first the compound of formula (Ia):
  • the described transport system conjugates according to the invention are preferably used for a peptide / oligopeptide consisting of amino acids with the configuration D- or L- or unnatural amino acids, for example peptoids, ie peptide-like compounds, with any sequence, optionally with protective groups customary in peptide chemistry, or a protein up to a size of 20kDa (Average molecular weight 20'000) to be transported through the cell membrane into the interior of the cell if necessary.
  • the corresponding transport system according to the invention is applicable to fibroblasts, keratinocytes, melanocytes and Langerhans cells. Such compounds are less biodegradable and can therefore have a longer function in the cell.
  • the transport system according to the invention can also be conjugated with oligonucleotide analogs in order to transport these molecules into the cell interior.
  • oligonucleotide analogs can specifically inhibit the expression of selected genes (hybridization of the mRNA prevents protein synthesis).
  • structurally similar derivatives that degrade less quickly can also be used.
  • the transport system-bound peptides are substances that perform a biological function inside the cells mentioned above. These include enzyme inhibitors (e.g. protease inhibitors), receptor-binding peptides that act as agonists or antagonists. Peptides or peptide-like compounds can also be used which can simulate the presence of another molecule in the cell.
  • a peptide that mimics a phosphorylation site of a protein kinase can be used to inhibit intracellular signaling cascades.
  • the application comes e.g. modulating cell growth (preventing hyperproliferation of keratinocytes for the treatment of psoriasis).
  • substances which regulate the growth and / or differentiation of the keratinocytes can be used according to the invention for cosmetic purposes or for the treatment of psoriasis.
  • substances can also be used which are used to modulate melanin synthesis in the skin (in the narrower sense in the melanocytes).
  • Substances can be used, which inhibit melanin formation or which accelerate melanin formation.
  • the transport system according to the invention can also be conjugated with non-peptitic active substances with a maximum molecular weight of up to 700 (seven hundred), e.g. with vitamins, hormones, antibiotics and similar substances, the transport systems according to the invention being bound directly or via suitable linkers to the corresponding molecule.
  • the transport system conjugates described herein and which result from the above examples and contain active substances can be used for topical and transdermal applications in dermatology, cosmetics or for systemically active pharmaceuticals.
  • the present invention relates to medicines which contain a transport system according to the invention, in particular for their topical and transdermal use.
  • Selected areas of application for the topical and transdermal use according to the invention are, for example, active substances for combating skin aging, inflammation, cellulitis, psoriasis, antimelanoma, arthritis, acne, neurodermatitis, eczema, periodontitis or burns, as radical scavengers, skin tanners or skin bleachers, for promoting hair growth or hair growth inhibition Immunostimulators, for the transport of regeneration agents or antibiotics or in the field of wound healing.
  • active substances for combating skin aging, inflammation, cellulitis, psoriasis, antimelanoma, arthritis, acne, neurodermatitis, eczema, periodontitis or burns, as radical scavengers, skin tanners or skin bleachers, for promoting hair growth or hair growth inhibition Immunostimulators, for the transport of regeneration agents or antibiotics or in the field of wound healing.
  • active substances for combating skin aging, inflammation, cellulitis, p
  • TBTU 0- (benzotriazol-l-yl) -N, N, N ', N 1 , - tetramethyluronium tetrafluoroborate
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FCS Fetal Calf Serum
  • PBS Phosphate-buffered saline
  • Ig immunoglobulin
  • Smooth muscle cells are isolated from the thoracic aorta of 6 week old Wistar rats by enzymatic cleavage. 10,000 cells are applied to 60 mm petri dishes and grown for 5-6 hours in DME and 10% fetal calf serum. The cells are incubated with the peptides in the incubator for about 1 hour, then washed twice with PBS buffer (0.5 mmol CaCl 2 , 3 mmol MgCl 2 ), then fixed with 3% paraformaldehyde for 10 min and permeabilized with 0.1% Triton X 100 in PBS buffer for 1 minute double
  • Anti- ⁇ -SM 1 and rabbit polyclonal anti actin antibodies followed by tetramethylrhodamine B isothiocyanate or fluorescence isothiocyanate conjugated sheep anti-mouse IgG and fluorescent isothiocyanate conjugated sheep anti-rabbit IgG. It is washed with PBS buffer and the preparations are fixed in polyvinyl alcohol buffer. Photographs are taken with a Zeiss Axiophot photo microscope with a filter for fluorescein or rhodamine:
  • FIGS. 1-6 show the immunofluorescence photographs of the inhibition of the polymerization 1 hour after treatment of the cell cultures with the substances and the concentration of the cell culture solution of 1 mg / ml:
  • Figure 1 Control experiment with Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-NH Left picture: strong fluorescence staining; right picture: strong rhodamine staining of the smooth muscle ⁇ -actin polymers. The polymerization of the smooth ⁇ -actin filaments is fully developed. No penetration of the peptide into the cell.
  • FIG. 2 Tetrapeptide conjugated with transporter: Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-Ly ⁇ -NH-CH 2 -CH 2 -NH-hexadecanoylamide.
  • Left picture strong fluorescent staining; right picture: strong rhodamine staining of the smooth muscle ⁇ -actin polymers. The polymerization of the smooth ⁇ -actin filaments is fully developed. No penetration of the peptide into the cell.
  • FIG. 3 Tetrapeptide conjugated with transporter: Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-Lys-NH-CH 2 -CH 2 -NH-octanoylamide.
  • Left picture strong fluorescent staining; right picture: strong rhodamine staining of the smooth muscle ⁇ -actin polymers.
  • FIG. 4 Tetrapeptide conjugated with transporter: Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-Lys ( ⁇ -D, L-6, 8-dithiooctanoylamide) -NH 2 Left picture: partially fluorescent staining; right picture: partial rhodamine staining of the smooth muscle ⁇ -actin polymers. The polymerization of the smooth ⁇ -actin filaments has been partially developed. Penetration of the peptide into the cell.
  • FIG. 5 tetrapeptide conjugated with transporter:
  • FIG. 6 Tetrapeptide conjugated with transporter: Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-Lys ( ⁇ -D, L-6, 8-dithiooctanoylamide) -NH-CH 2 -CH 2 - NH-hexadecanoylamide.
  • Left picture Low fluorescence staining, right picture: Little rhodamine staining of the smooth muscle ⁇ -actin polymers: The polymerization of the smooth- ⁇ -actin filaments is very poorly developed: Good penetration of the peptide into the cell.
  • Approach d shows a nice fluorescent stain.
  • approach b) with biotin or with cells treated with Ac-Leu-Gly-Asp-OH (approach c) shows no fluorescence staining.
  • TMP Carrier-Conjugated Tyrosinase Mimicking Peptides
  • Cloudman S91 melanoma cells (ATCC CCL-53.1) are grown to confluence in 24-well culture dishes in DMEM + 10% FCS.
  • the S91 cells (0.5 ml per culture) are incubated for 5 days with and without TMP and with 15nM ⁇ -MSH and then harvested.
  • the TMP / TMP-L is added at least 2 hours before the ⁇ -MSH.
  • the medium is discarded and the adherent cells lx with PBS washed.
  • the cells are then lysed with 0.1 ml of 0.2 M NaOH and the melanin content in the lysate is measured at 450 nm.
  • the cultures of the test series are set up twice in order to determine the cell number from the second batch using the MTT test (Mosmann T. 1983, J. of Immun. Methods, 65, 55-63).
  • the cell number indicates growth-inhibiting effects and the melanin content is given in relation to the cell number (OD 45 onm / 10 6 cells).
  • TMP peptide transporter H-Glu-Asp-Tyr-His-Ser-Leu-Tyr-Asn-
  • Transporter H-Lys ( ⁇ -D, L-6, 8-dithiooctanamide) -NH-CH 2 CH 2 -NH-
  • S91 with 15nM ⁇ -MSH (e), as well as 15nM ⁇ -MSH and 30nM free TMP (f) as well as 15nM ⁇ -MSH with 30nM free transporter (h) an increased OD450nm value (approx. 0.7) measured. In In these cases, melanin formation was stimulated by ⁇ -MSH.
  • Examples 4 to 8 describe the preparation of the oligopeptide derivatives according to the invention.
  • the analysis of the eluates and products obtained according to the examples was carried out using proton NMR, HPLC electrospray MS.
  • Example 4 0.2 g (0.19 mmol) of the compound Example 4 was dissolved in a mixture of 10 ml of water and 5 ml and stirred with 0.015 g (0.4 mmol) of sodium borohydride at 5 ° C. After 3 h, 1 ml of acetic acid was added and the solution was concentrated. After preparative HPLC (Waters Deltaprep, Deltapak column

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Abstract

Transportsystemkonjugat als transmembranäres Transportsystem, welches aus mindestens einer pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksamen Verbindung besteht, und diese Verbindung derart modifiziert wurde, dass sie mindestens einen Substituenten der Formel (I) -Y-(NH-CnH2n-NH)r-C(O)-R und mindestens einen an Y gebundenen Substituenten der Formel (II) und/oder (III), aufweist, worin Y einen Rest einer Aminosäure mit ursprünglich mindestens 3 reaktiven Gruppen oder einen Rest von 2 oder 3 aneinander gebundenen Aminosäuren mit ursprünglich mindestens 3 reaktiven Gruppen, jeweils ausgewählt aus Amino (-NH2) und/oder Carboxyl [-C(O)OH], oder einen dreiwertigen Rest eines Trisamins mit 2-8 C-Atomen, CnH2n -CH2CH2CH2- oder -CH2CH2-, vorzugsweise -CH2CH2-, r Null oder eins, vorzugsweise 1, R-C(O) den Rest einer gesättigten, einfach oder mehrfach ungesättigten, gegebenenfalls substituierten, (C4-C24)-Fettsäure, R1 Wasserstoff oder Alkyl mit 1, 2, 3 oder 4 C-Atomen, vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl, vorzugsweise Wasserstoff, m eine ganze Zahl von 3 bis 8, vorzugsweise 4, 5 oder 6, p 1, 2 oder 3, und vorzugsweise 1, bedeuten, Verwendung solcher Systeme zur Herstellung von Heilmitteln für topische und transdermale Anwendung, insbesondere in der Dermatologie, Kosmetik oder für systemische Pharmaka.

Description

Transportsystemkonjugate
Die vorliegende Erfindung betrifft Transportsystemkonjugate als transmembranäre Transportsysteme für topische und transdermale Anwendungen, insbesondere in der Dermatologie und Kosmetik sowie für systemisch wirkende pharmazeutische Wirkstoffe. Das erfindungsgemässe Transportsystem kann für peptidische Wirkstoffe sowie auch für nicht-peptidische Wirkstoffe, wie z.B. Vitamine oder Hormone oder Antibiotika angewendet werden. Die Anwendungsgebiete für die erfindungsgemässe topische und transdermale Verwendung sind zahlreich und betreffen beispielsweise den Transport von Wirkstoffen in und durch die Haut zur Heilung oder zum Schutz der Haut, wie dies im weiteren beschrieben ist.
Der Transport von pharmazeutisch und/oder kosmetisch nutzbaren Wirkstoffen, wie beispielsweise Polypeptide, durch eine Zellmembran zum intrazellulären Wirkort in ausreichender Konzentration ist ein kritischer Faktor bei der Entwicklung einer topisch oder transdermal wirksamen Applikation. So sind beispielsweise die meisten Polypeptide polare und grosse Moleküle, welche schlecht resorbierbar sind, wenn sie oral oder parental verabreicht werden. Einen Ausweg stellt die transdermale Administration dar. Vorteilhaft ist dabei, dass die Haut nur wenige proteolytische Enzyme besitzt, welche das Polypeptid hydrolysieren können. Die zu überwindenden Hürden bei der transdermalen Applikation bilden die natürliche Lipidbarriere der äussersten Hautschicht, der Hornschicht, und für intrazellulär aktive Stoffe zusätzlich die Zellmembranen. Da eine Lipophilie benötigt wird, um lipophile Membranbarrieren zu überwinden, können die Transporteigenschaften von Polypeptiden durch eine lipophile Modifikation erhöht werden. Das Ziel wird meist aber nur in ungenügendem Masse erreicht.
Aus J. Med. Chem. 1992, (35) Seiten 118-123, Pharmaceutical Research 1989, (6), Seiten 171-170, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 1999 (48) Seiten 21-26 ist bekannt, dass kurze Peptide, welche mit Fettsäureresten konjugiert sind, eine erhöhte Lipophilie und enzymatische Abbauresiεtenz aufweisen. So macht -Melanotropin, welches mit Decansäure oder Hexadecansäure konjugiert ist, in einem Eidechsen-Haut-Modell eine gewisse Dunkelfärbung der Haut. Die Aktivität der Konjugate ist aber insgesamt ungenügend und das Prinzip der Konjugate insbesondere nicht breiter anwendbar.
Es wurde nun gefunden, dass es überraschenderweise gelingt, pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksame Substanzen als Transportsystemkonjugate bzw. als transmembranäre Transportsysteme für topische und transdermale Anwendungen herzustellen, so dass diese schnell und in ausreichender Konzentration durch die Zellmembran zum intrazellulären Wirkort diffundieren. Die erfindungsgemässen Transportsystemkonjugate sind auf Fibroblasten, Keratinozyten, Melanozyten und Langerhans-Zellen anwendbar und sind biologisch weniger leicht abbaubar. Sie können deshalb ihre Funktion in der Zelle länger ausüben.
Fibroblasten sind im Bindegewebe, unter anderem auch in der Dermis lokalisiert. Während der Wundheilung bilden die zu Myofibroblasten umdifferenzierten Fibroblasten Bündel von
Actinmikrofilamenten, genannt Stressfibers, welche α-smooth muscle actin (αSM-Actin) enthalten. Diese Fibers sind auch mit kontraktilen Proteinen und Cytoskelettproteinen vernetzt. In der Kontraktion von Wunden spielen daher diese Stressfibers eine grosse Rolle. Glatte Muskelzellen besitzen die gleichen Stressfibers wie die Myofibroblasten und dienen daher als Modellsyste .
In Journal of Cell Biology, 1995, 130, 887-895 (Gabbiani et al.) wird vorgeschlagen, dass in der Zelle ein bisher nicht identifiziertes Protein am Einbau von αSM-Actin in die Stressfibers beteiligt ist. Dabei wird αSM-Actin selbst poly erisiert und in die Stressfibers eingebaut. Wird ein kurzes, isoliertes Fragment dieses αSM-Actin Polypeptids mit der spezifischen Sequenz Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-NH im Uberschuss in diese Zellen mikroinj iziert, so hemmt dies in vivo die Polymerisation von α-smooth muscle actin. Es ist daher möglich, dass dieses Tetrapeptid den vollständigen Aufbau der Stressfibers hemmt und dadurch die unerwünschte Funktion der Kontraktion in der Wundheilung verhindert.
In der vorliegenden Erfindung kann bei den Fibroblasten gezeigt werden, dass dieses Tetrapeptid in der Form des erfindungsgemässen Transportsystemkonjugats ohne Mikro- injektion in die Zelle gebracht werden kann und derart die Polymerisation von αSM-Actin genauso effektiv blockiert wie das mikroinj izierte Tetrapeptid. Letzteres kann die Zellmembran selbst nicht penetrieren, wie in einem Kontrollexperiment gezeigt wurde. Insbesondere kann gezeigt werden, dass der allgemein bekannte Ansatz, lipophile Fettsäure- konjugate (Hexadecanoyl oder Octanoyl oder andere) des Tetrapeptids zu verwenden hier nicht funktioniert. Für das vorliegende Tetrapeptid wurde im Experiment gezeigt, dass die Aufnahme des Tetrapeptids in die Zelle überraschenderweise möglich ist, wenn dieses als transmembranäres Transportsystem vorliegt bzw. mit einem erfindungsgemässen Transporter verbunden ist, welcher an das carboxyterminale Ende des Tetrapeptids über die Aminosäure Asp verknüpft ist. Der Transporter besteht im vorliegenden Experiment aus der Aminosäure Lysin, bei welcher die Seitenkette von Lysin in der ε-Position über eine Amidbindung mit D, L-6, 8-Dithio- octansäure verknüpft ist. Das Tetrapeptid, verknüpft mit dem genannten Transportermolekül, weist eine signifikant höhere Verfügbarkeit in der Zelle auf, verglichen mit dem nicht modifizierten Tetrapeptid. Die Verfügbarkeit kann weiter merklich erhöht werden, wenn das carboxyterminalen Ende des Tetrapeptids zusätzlich durch eine 1,2-Ethylen- diamid-Verknüpfung mit einer Fettsäure, beispielsweise mit Octansäure, konjugiert wird. Vorteilhaft ist dabei, dass durch eine Fettsäure die unerwünschte enzymatische Abbau- barkeit des Wirkstoffes heruntergesetzt wird, ohne die Wirksamkeit des Wirkstoffes zu beeinträchtigen. Keratino- zyten bauen im wesentlichen die äusseren Hautschichten, die Epidermis und Stratum Corneum (Hornschicht) auf. Der Zustand der Epidermis ist deshalb vor allem von den Wachstumseigenschaften und dem Differenzierungsgrad der Keratinozyten abhängig. Der Transport von nutzbaren, phar- makologisch aktiven Verbindungen, wie beispielsweise Peptide, durch die Zellmembran von Keratinozyten ist für dermatologische und kosmetische Anwendungen von grossem Interesse.
In der vorliegenden Erfindung kann gezeigt werden, dass das Peptid Ac-Leu-Gly-Asp konjugiert mit dem Transporter H-Lys (ε-D, L-6 , 8-Dithiooctanamid) -NH-CH CH2-NH-octanoylamid die Zellmembran penetrieren kann. 5- (Biotinamido) pentylamin (Pierce Ine, Rockport, II, USA) dient dabei als Fluoreszenzmarker und ist als A id am Asp befestigt.
Melanozyten sind in der Basal-Zellschicht der Epidermis lokalisiert und verantwortlich für die Pigmentierung (Melanine) der Haut. Die Tyrosinase ist ein in Melanozyten exprimiertes Enzym, das in der Biosynthese der Melanine eine Schlüsselrolle spielt. Es wurde gezeigt, dass die Aktivierung des Melanin-bildenden Enzyms (Tyrosinase) wesentlich von Phosphorylierungen an Serinresten der cytoplasmatischen Domäne des Enzymes abhängig ist (Park et al, 1993, JBC 268; 11742-11749/Park et al. 1995, J. Invest. Dermatol. 104:585 Abstr. 186). Darauf basierend wurde beschrieben, dass ein Peptid, genannt Tyrosinase-Mimicking Peptid (TMP) , mit der Sequenz Glu-Asp-Tyr-His-Ser-Leu-Tyr- Asn-Ser-His-Leu in der Zelle die Phosphorylierung der Tyrosinase verhindert und so die Aktivität der Tyrosinase und das Ausmass der Pigmentierung der Haut reduziert (PCT WO 97/35998) . Wird das Peptid TMP mit dem Transporter
H-Lys (ε-D, L-6 , 8-Dithiooctanoylamid) -NH-CH2CH2-NH- octanoylamid verknüpft, so dringt diese als trans- membranäres Transportsystem erfindungsgemäss ausgebildete Form erheblich besser in die Zellen ein als freies TMP. Da TMP die Phosphorylierung und damit die Aktivierung der Tyrosinase kompetitiv hemmt, kann das Einschleusen von Transporter-gebundenem TMP in die Zellen indirekt durch die Hemmung der Melaninbildung gemessen werden.
Die vorliegende Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Transportsystemkonjugat als transmembranäres Transportsys- tem, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses Trans- portsystemkonjugat aus mindestens einer pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksamen Verbindung besteht, und diese Verbindung derart modifiziert wurde, dass sie mindestens einen Substituenten der Formel (I) und mindestens einen an Y gebundenen Substituenten der Formel (II) und/oder (III) :
-Y-(NH-CnH2n-NH)r- C(0)-R (I)
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000007_0002
aufweist, worin
Y einen Rest einer Aminosäure mit ursprünglich mindestens 3 reaktiven Gruppen oder einen Rest von 2 oder 3 aneinander gebundenen Aminosäuren mit ursprünglich mindestens 3 reaktiven Gruppen, jeweils ausgewählt aus Amino
(-NH ) und/oder Carboxyl [-C(0)OH], oder einen dreiwertigen Rest eines Trisamins mit 2-8 C-Atomen, nH 2n -CH2CH CH2- oder -CH2CH2-, vorzugsweise - CH CH - , r Null, 1 oder 2, vorzugsweise Null oder 1, vorzugsweise 1 R-C(O) den Rest einer gesättigten, einfach oder mehrfach ungesättigten, gegebenenfalls substituierten, (C4-C24 ) - Fettsäure,
R Wasserstoff oder Alkyl mit 1, 2, 3 oder 4 C-Atomen, vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl, vorzugsweise Wasserstoff, m eine ganze Zahl von 3 bis 8, vorzugsweise 4, 5 oder 6, p 1 2 oder 3, und vorzugsweise 1, bedeuten.
Die vorliegende Erfindung betrifft im weiteren Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Transportersystem- konjugate, sowie die Verwendung dieser Transportsystemkonjugate für topische und transdermale Anwendungen in der Dermatologie, Kosmetik oder für systemisch wirkende Pharmaka. Die vorliegende Erfindung betrifft im weiteren Heilmittel, welche ein erfindungsgemässes Transportsystem- konjugat enthalten, sowie deren topische und transdermale Anwendung in der Dermatologie, Kosmetik oder für systemisch wirkende Pharmaka.
Bedeutet Y einen Rest einer Aminosäure mit ursprünglich mindestens 3 reaktiven Gruppen, so bedeutet Y vorzugsweise einen Rest einer Aminosäure mit ursprünglich mindestens einer Carboxylgruppe [-C(O)0H] und mindestens zwei A ino- gruppen (-NH2), wie beispielsweise Lysin (Lys), oder einen Rest einer Aminosäure mit ursprünglich mindesten zwei Carb- oxylgruppen und mindestens einer Aminogruppe, wie beispielsweise Asparaginsäure (Asp) oder Glutaminsäure (Glu) ,
Ornithin, D,L α, ß-Diaminopropionylsäure, D,L-α,γ butyryl- a inosäure, Citrullin, Homocitrullin, D, L-2-Amino-Hexan- disäure, D,L-2-Aminoheptandisäure, 2-Amino-2 Octandisäure.
Y als Rest von 2 oder 3 aneinander gebundenen Aminosäuren mit ursprünglich mindestens 3 reaktiven Gruppen, wird bei- spielsweise durch den Rest von zwei aneinandergebundenen Moleküle Lys, Gly (Lys.Gly) oder aneinandergebundenes und Alanin und L-2-Amino-Adipinsäure, (L-2-Amino- adipinsäure. Ala) dargestellt.
Y bedeutet vorzugsweise den Rest von Lysin, Asparaginsäure oder Glutaminsäure, Ornithin, L-2 , 3-Diaminopropionsäure, L- α,γ butyrylaminosäure, Citrullin, Ho ocitrullin, L-2-Amino- adipinsäure, L-2-Amino-heptandisäure, L-2-Amino-Octandisäu- re oder von Tris (2-aminoethyl) amin und vorzugsweise den Rest von Lysin. Dabei können die D.L-Form, D oder L Form dieser Aminosäuren verwendet werden,
Bedeutet r = 1, so ist im Rest der Formel (I) der Rest -C(0)-R über die Übergangsgruppe (Linker) -(NH-CnH2n-NH)- an die Carbonylgruppe von Y gebunden. Bedeutet r = Null, so ist im Rest der Formel (I) der Rest -C(0)-R direkt, d.h. ohne Linker, an eine NH-Gruppe von Y gebunden. Vorzugsweise bedeutet r = 1, wobei dann der Rest der Formel (I) vorzugsweise der Formel -Y-NH-CH2CH2-NH-C(0) -R entspricht.
R-C(O)- als Rest einer gesättigten, einfach oder mehrfach ungesättigten, gegebenenfalls substituierten, (C4-C24 ) - Fettsäure, bedeutet als Rest einer gesättigte Säure beispielsweise den entsprechenden Carbonylrest der Buttersäure, Valeriansäure, Capronsäure, Heptansäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Pal- mitinsäure, Stearinsäure oder Arachinsäure, als Rest einer ungesättigte Säure beispielsweise den entsprechenden Carbonylrest der Δ -Dodecylensäure, Oleinsäure, Linolsäure, Ara- chidonsäure, und als Rest einer substituierten olefinischen Fettsäure beispielsweise den entsprechenden Carbonyl der Ricinoleinsäure. Bevorzugt bedeutet R-C(O) den Rest einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure mit 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder 18 C-Atomen, vorzugsweise den entsprechenden Rest einer gesättigten Fettsäure, vorzugsweise den entsprechenden Rest der Caprylsäure [CH3- ( CH2) 6-C ( O) -] , Laurinsäure [CH3- (CH2) 1 0-C (O) -], Myristinsäure [CH3- (CH2) i 2"c(°) ~]/ Palmitinsäure [CH3- (CH2) x 6 -C (0) -] oder Stearinsäure [CH3-(CH2) i6"C(0)-].
Der Rest der Formel (II) bedeutet vorzugsweise D,L-6,8-Di- thiooctancarbonyl. Dieser Rest kann direkt an eine NH- Gruppe von Y, oder über eine Übergangsgruppe (Linker), z.B. über die Gruppe - (NH-CnH2 n-NH) -, welche vorzugsweise -(NH- CH2CH2-NH)- bedeutet, an eine Carbonylgruppe von Y gebunden sein. Vorzugsweise ist der Rest der Formel (II) , vorzugsweise als D,L-6, 8-Dithiooctanamidrest, direkt am aminoter- minalen Ende der aminoterminalen Seitenkette und/oder an den NH-Rest in α-Stellung von Y mittels einer Amidbindung befestigt.
Im Rest der Verbindung der Formel (III) bedeutet m vorzugsweise 4 und p vorzugsweise 1. Der Rest der Formel (III) kann in analoger Weise, wie für den Rest der Formel (II) beschrieben, an Y gebunden sein. Schutzgruppen der Thiol- funktion sind vorzugsweise Trityl, t-Butyl, Benzyl, Ethyl, Methyl, Acetamidomethyl, 4-Methoxybenzyl , 4-Methylbenzyl, Diphenylmethyl .
Die im erfindungsgemässen Transportsystemkonjugat enthaltene pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksame Verbindung kann direkt an eine NH-Gruppe oder an eine Carbonylgruppe von Y, gegebenenfalls über eine geeignete Übergangsgruppe, wie z.B. - (NH-CnH2 n~NH) -, gebunden sein. Dies hängt davon ab, ob die pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksame Verbindung über eine darin enthaltene Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino-, oder SH-gruppe oder andere geeignete Gruppe an Y gebunden werden soll. Vorzugsweise ist die pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksame Verbindung direkt oder über eine geeignete Zwischengruppe an eine NH-Gruppe von Y gebunden, vorzugsweise direkt am aminoterminalen Ende und/oder an den NH-Rest in α-Stellung von Y, befestigt. Erfindungsgemässe Transportsystemkonjugate als transmembranäre Transportsysteme entsprechen vorzugsweise der Formel (IV) oder der Formel (V) :
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
worin A den Rest der erfindungsgemass modifizierten pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksamen Verbindung bedeutet und R die oben angegebenen Bedeutung hat.
Das erfindungsgemässe Transportsystem kann für pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksame Verbindungen, beispielsweise für peptidische Wirkstoffe sowie auch für nicht- peptidische Wirkstoffe, wie z.B. Vitamine, Hormone oder Antibiotika angewendet werden. Bevorzugt ist Verwendung für peptidische Wirkstoffe, d.h. für Peptide und Polypeptidver- bindung.
Als peptidischer Wirkstoff bedeutet "Peptid" eine Aminosäure, vorzugsweise eine α-Aminosäure. "Polypeptid" als peptidischer Wirkstoff bedeutet ein Polypeptid mit vorzugsweise 2-20 Aminosäureeinheiten, vorzugsweise Glu-Glu- Glu-Asp, Glu-Glu-Glu-Asp-Lys, Glu-Glu-Glu-Asp-Ser-Thr-Ala- Leu-Val-Cys, Ala-Glu-Glu-Asp, Glu-Glu-Glu-Glu, Ala-Glu-Glu- Glu, Glu-Glu-Glu-Asp-Ala-Thr-Ala-Leu-Val-Cys, Glu-Glu-Glu- Asp-Leu-Thr-Ala-Leu-Val-Cys, Leu-Gly-Asp. Bei den Aminosäuren kann es sich sowohl um L-Aminosäuren als auch um D- Aminosäuren, sowie auch um entsprechende Salze, wie beispielsweise mit TFA, oder Acetate oder Propionate, oder Salze gebildet mit H3Pθ4, HBr handeln.
Verwendet man im erfindungsgemässen Transportsysteme als Wirkstoff ein modifiziertes Peptid oder Polypeptid und/oder Verbindungen, welche freie Gruppen, wie beispielsweise -OH, -COOH, -NH2 oder -SH aufweisen, so können diese Verbindungen mit Schutzgruppen versehen sein, welche an diesen allenfalls vorhandenen reaktiven Gruppen befestigt sind. Solche Schutzgruppen sind vorzugsweise Acetyl, Boc, tert.- Butyl, substituierte Benzylester, substituierte Methylester, 2-substituierte Ethylester, gegebenenfalls substituiertes (C2-C22 ) lkylcarbonyl oder einfach oder mehrfach ungesättigtes gegebenenfalls substituiertes (C -C2 2)- Alkenylcarbonyl, substituierte Methyl, Ethyl-, Propyl- oder Isopropylcarbamate. Als Schutz- und Kontrollgruppe kann auch ein Fuoreszenzmarker , vorzugsweise Biotin, verwendet werden, wobei - bei Verwendung von Peptiden und Poly- peptiden - die niedermolekulare Schutzgruppe, die (C2-C22)- Alkylcarbonsäure, die (C2-C22 ) Alkenylcarbonsäure oder der Fuoreszenzmarker vorzugsweise direkt am aminoterminalen Ende oder über den Linker -Y- am carbonylterminierten Ende des Peptids oder Polypeptids befestigt ist.
Alle an sich bekannten Peptide, insbesondere Oligopeptide, vorzugsweise solche mit einem mittleren Molekulargewicht von bis zu 20kDa (mittleres Molekulargewicht bis zu 20' 000), können erfindungsgemass verwendet werden. Bevorzugt sind Polypetide mit den Sequenzen Glu-Glu-Glu-Asp, Glu-Glu-Glu-Asp-Lys, Leu-Gly-Asp, Glu-Asp-Tyr-His-Ser-Leu- Tyr-Asn-Ser-His-Leu, sowie analoge Sequenzen. Für die erfindungsgemässe Verwendung sind auch Vitamine, Hormone und Antibiotika geeignet. Bevorzugt verwendete Vitamine sind Vitamin A, Vitamin Bl, Vitamin B2, Vitamin B6, Vitamin C, Vitamin D, Vitamin E und Vitamin K. Die Transportkonjugate der Formel 4 oder 5 werden bevorzugt über eine Uebergangsgruppe als Amid auf der Konjugatseite mit z.B. Succinyl oder einer anderen Dicarbonsäure und als Ester mit der Hydroxylgruppe von Vitaminen und Hormonen verbunden. Im Falle von Hormonen und Vitaminen mit Carb- oxylgruppe wird der Transporter direkt als Amid geknüpft.
Bevorzugte Hormone sind Peptid-Hormone, insbesondere Adi- uretin, Oxytocin, Melanozyten-stimulierendes Hormon, Calci- tonon sowie Nichtpeptidhormone, insbesondere Glucocorti- coide, Androgene und Östrogene.
Die Oligopeptidderivate können nach den im folgenden beschriebenen an sich bekannten Verfahren (allgemeinen Vorschriften von M. Bodanszky "The Practice of Peptide Synthesis" Springer Verlag, 2nd Edition 1994) hergestellt werden. Entsprechend wird die Aminosäure, beispielsweise Asp, in einer Festphasensynthese am carboxyterminalen Ende an ein Harz angeknüpft, wobei deren Aminogruppe durch eine Schutzgruppe, z.B. durch die F oc-Schutzgruppe, geschützt wird. Die Seitenkette wird z.B. mit Boc oder t-Butyl geschützt. Die Schutzgruppen werden nach Bedarf selektiv abgespalten, um die weiteren Aminosäurenderivate mit den in der Peptidsynthese üblichen Reagentien anzuknüpfen bis die gewünschte Kettenlänge vollständig aufgebaut ist. Das Peptid wird dann am carboxyterminalen Ende vom Harz abgespalten und dieses carboxylterminale Ende mit dem aminoterminalen Rest von Lys, welches am carboxyterminalen Ende durch eine 1, 2-Ethylendiamidverknüpfung mit unterschiedlichen Alkylsäureresten verbunden ist, verknüpft. Die Schutzgruppen werden entfernt und das freie ε-aminoterminale Ende der Seitenkette des Lysin z.B. mit dem N-Hydroxysuccinimid- ester von D, L-6, 8-Dithiooctanamid umgesetzt. Im Prinzip stellt man das erfindungsgemässe Transporter- systemkonjugat so her, dass man eine an sich bekannte pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksame Verbindung, vorzugsweise eine Aminosäure mit beliebiger aminoterminaler Seitenkette und einem carbonylterminierten Ende, über eine Amidstruktur mit einer geeigneten dem Rest -Y- entsprechenden Ausgangsverbindung, in an sich bekannter Weise an deren aminoterminalen Ende und/oder carboxyterminalen Ende direkt oder über einen Linker verknüpft, wobei man gegebenenfalls vorher oder nachher eine oder mehrere Schutzgruppen einfügt, und man anschliessend das erhaltenen Zwischenprodukt in an sich bekannter Weise mit den geeigneten dem Rest -C(0)R und den Formeln (II) und/oder (III) entsprechenden Ausgangsverbindungen zum Transportsystemkonjugat umsetzt.
Man kann das erfindungsgemässe Transportsystemkonjugat auch in anderer beliebiger Reihenfolge zusammenfügen. So kann man zuerst die Verbindung der Formel (Ia) :
H-Y-(NH-CnH2n-NH) r- C(0)-R (Ia)
herstellen, welche mit den Resten der Formeln (II) und/oder (III) sowie der pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksamen Verbindung noch nicht verknüpft ist, und anschliessend die Verbindung der Formel (Ia) mit den geeigneten Ausgangs- verbindungen der Reste der Formeln (II) und/oder (III) sowie der pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksamen Verbindung in an sich bekannter Weise umsetzen.
Die beschriebenen erfindungsgemässen Transportsystemkonjugate dienen vorzugsweise dazu, ein Peptid/Oligopeptid bestehend aus Aminosäuren mit der Konfiguration D- oder L- oder nicht-natürlichen Aminosäuren, z.B. Peptoide, d.h. peptidähnliche Verbindungen, mit beliebiger Sequenz gegebenenfalls mit in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen, oder ein Protein bis zu einer Grosse von 20kDa (mittleres Molekulargewicht 20 '000) gegebenenfalls durch die Zellmembran ins Innere der Zelle zu transportieren. Das entsprechende er indungsgemässe Transportsyste ist auf Fibroblasten, Keratinozyten, Melanozyten und Langerhans- Zellen anwendbar. Solche Verbindungen sind biologisch weniger leicht abbaubar und können deshalb ihre Funktion in der Zelle länger ausüben.
Das erfindungsgemässe Transportsystem kann auch mit Oligo- nucleotiden-Analoga konjugiert werden, um diese Moleküle ins Zellinnere zu transportieren. Solche Oligonukleotide- analoga können gezielt die Expression ausgewählter Gene hemmen (durch Hybridisierung der mRNA wird die Proteinsynthese verhindert) . Anstelle von Oligonukleotiden können auch strukturell ähnliche Derivate verwendet werden, die weniger schnell abgebaut werden. Bei den Transportsystem- gebundenen Peptiden handelt es sich um Substanzen, die im Innern der oben erwähnten Zellen eine biologische Funktion ausüben. Darunter werden Enzyminhibitoren (z.B. Protease- inhibitoren) , Rezeptor bindende Peptide, die als Agonisten oder Antagonisten wirken, verstanden. Es können auch Peptide oder peptidähnliche Verbindungen eingesetzt werden, die in der Zelle die Präsenz eines anderen Moleküles vortäuschen können. Ein Peptid, das eine Phosphorylierungs- stelle einer Proteinkinase imitiert kann eingesetzt werden, um intrazelluläre Signalkaskaden zu hemmen. Als Anwendung kommt z.B. die Modulation des Zellwachstums (Verhinderung der Hyperproliferation von Keratinozyten zur Behandlung von Psoriasis) in Frage. Ebenso können Substanzen, die das Wachstum und/oder die Differenzierung der Keratinozyten regulieren, für kosmetische Zwecke oder zur Behandlung von Psoriasis erfindungsgemass eingesetzt werden.
Gemäss der vorliegenden Erfindung können auch Substanzen zur Anwendung kommen, die zur Modulation der Melanin- synthese in der Haut (im engeren Sinne in den Melanozyten) dienen. Dabei können Substanzen eingesetzt werden, welche die Melaninbildung hemmen oder welche die Melaninbildung beschleunigen.
Im weiteren kann das erfindungsgemässe Transportsystem auch mit nichtpeptitischen Wirkstoffen mit maximalen Molekulargewicht bis 700 (siebenhundert) konjugiert werden, z.B. mit Vitaminen, Hormonen, Antibiotika und ähnlichen Substanzen, wobei die erfindungsgemässen Transportsysteme direkt oder über geeignete Linker an das entsprechende Molekül gebunden sind.
Die hierin beschriebenen und aus den obigen Beispielen hervorgehenden, Wirkstoffe enthaltenden, Transportsystemkonjugate sind für topische und transdermale Anwendungen in der Dermatologie, Kosmetik oder für systemisch wirkende Pharmaka anwendbar. In diesem Sinne betrifft die vorliegende Erfindung Heilmittel, welche ein erfindungsgemässes Transportsystem enthalten, insbesondere für deren topiche und transdermale Anwendung. Ausgewählte Anwendungsgebiete für die erfindungsgemässe topische und transdermale Verwendung sind beispielsweise Wirkstoffe zur Bekämpfung von Hautalterung, Entzündungen, Cellulitis, Psoriasis, Antimelanoma, Arthritis, Akne, Neurodermitis, Ekzeme, Paradontitis oder Verbrennungen, als Radikalfänger, Hautbräuner oder Hautbleicher, zur Haarwuchsförderung oder Haarwuchshemmung, als Immunstimulatoren, zum Transport von Regenerierungswirkstoffen oder Antibiotika oder in der Verwendung auf dem Gebiet der Wundheilung. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Benutzte Abkürzungen im Text und in den Beispielen 1-8:
Gly: Glycin
L-Leu: L-Leucin
L-Asp: L-Asparaginsäure
L-Glu: L-Glutaminsäure
L-Lys: L-Lysin
Ac: Acetyl AcOH: Essigsäure
Boc: tert-Butoxycarbonyl
DCH: N,N-Dicyclohexylharnstoff
DIC: Diisopropylcarbodiimid
DMF: N,N-Dimethylformamid
NHS: N-Hydroxysuccinimid
HCl: Hydrochlorid
NMM: N-Methylmorpholin
TBTU: 0-(Benzotriazol-l-yl)-N,N,N' , N1 , - tetramethyluronium-tetrafluoroborat
TFA: Trifluoressigsäure
RT: Raumtemperatur
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium
FCS: Foetal Calf Serum
PBS: Phosphate-buffered saline
DME: 1, 2-Dimethoxyethan
Biotin: Vitamin H
Ig: Immunglobulin
Beispiel 1 (Penetration von carrierkonjugierten Peptiden im Zelltyp Hautfibroblasten [Glatte Muskelzellen])
Benutzte Untersuchungsmethode:
Smooth muscle cells werden aus der Thorax-Aorta von 6 Wochen alten Wistarratten durch enzymatische Spaltung isoliert. 10000 Zellen werden auf 60 mm Petrischalen aufgebracht und 5-6h in DME und 10% Fetal Calf-Serum wachsen gelassen. Die Zellen werden mit den Peptiden ca. 1 Stunde im Inkubator inkubiert, anschliessend zweimal mit PBS- Puffer (0.5 mmol CaCl2, 3 mmol MgCl2) gewaschen, dann mit 3% Paraformaldehyd für 10 min fixiert und permeabilisiert mit 0.1% Triton X 100 in PBS-Puffer für 1 Minute Doppel-
Immunfluoreszenzfarbung für α-SM-Actin und Gesamt-Actin mit
Anti-α-SM 1 und Kaninchen-polyklonal anti Actin-Antikörper , gefolgt von Tetramethylrhodamin B isothiocyanat oder Fluoreszenzisothiocyanat konjugierten Schaf-Anti-Maus IgG und Fluoreszenzisothiocyanat konjugierten Schaf-AntiKaninchen IgG. Man wäscht mit PBS-Puffer und fixiert die Präparationen in Polyvinylalkohol-Puffer . Fotografische Aufnahmen werden mit einem Zeiss Axiophot Photo ikroskop durchgeführt mit Filter für Fluoreszein oder Rhodamin:
Die Figuren 1-6 zeigen die Immunfluoreszenz-Photographien der Hemmung der Polymerisation 1 Stunde nach Behandlung der Zellkulturen mit den Substanzen und der Konzentration der Zellkulturlösung von 1 mg/ ml:
Figur 1: Kontrollexperiment mit Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-NH Linkes Bild: Starke Fluoreszeinfärbung; rechtes Bild: starke Rhodaminfärbung der Smooth muscle α-Actinpolymere. Die Polymerisation der Smooth-α-Actin-Filamente ist vollständig entwickelt. Keine Penetration des Peptids in die Zelle.
Figur 2: Tetrapeptid konjugiert mit Transporter: Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-LyΞ-NH-CH2-CH2-NH-hexadecanoylamid. Linkes Bild: starke Fluoreszeinfärbung; rechtes Bild: starke Rhodaminfärbung der Smooth muscle α-Actinpolymere. Die Polymerisation der Smooth-α-Actin-Filamente ist vollständig entwickelt. Keine Penetration des Peptids in die Zelle.
Figur 3: Tetrapeptid konjugiert mit Transporter: Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-Lys-NH-CH2-CH2-NH-octanoylamid. Linkes Bild: starke Fluoreszeinfärbung; rechtes Bild: starke Rhodaminfärbung der Smooth muscle α-Actinpolymere.
Die Polymerisation der Smooth-α-Actin-Filamente ist vollständig entwickelt. Keine Penetration des Peptids in die Zelle.
Figur 4: Tetrapeptid konjugiert mit Transporter: Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-Lys (ε-D, L-6 , 8-Dithiooctanoylamid) -NH2 Linkes Bild: teilweise Fluoreszeinfärbung; rechtes Bild: teilweise Rhodaminfärbung der Smooth muscle α-Actinpolymere. Die Polymerisation der Smooth-α-Actin-Filamente ist teilweise entwickelt. Penetration des Peptids in die Zelle.
Figur 5: Tetrapeptid konjugiert mit Transporter:
Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-Lys (ε-D, L-6 , 8-Dithiooctanoylamid) -NH-
CH2-CH2-NH-octanolyamid.
Linkes Bild: geringe Fluoreszeinfärbung; rechtes Bild: geringe Rhodaminfärbung der Smooth muscle α-Actinpolymere:
Die Polymerisation der Smooth muscle-α-Actin-Filamente ist sehr schwach entwickelt: Beste Penetration des Peptids in die Zelle.
Figur 6: Tetrapeptid konjugiert mit Transporter: Ac-Glu- Glu-Glu-Asp-Lys (ε-D, L-6 , 8-Dithiooctanoylamid) -NH-CH2-CH2- NH-hexadecanoylamid. Linkes Bild: Geringe Fluoreszeinfärbung, rechtes Bild: Geringe Rhodaminfärbung der Smooth muscle α-Actinpolymere: Die Polymerisation der Smooth-α- Actin-Filamente ist sehr schwach entwickelt: Gute Penetration des Peptids in die Zelle.
Eine qualitative Dosis-Wirkungsbeziehung für Ac-Glu-Glu- Glu-Asp-Lys (ε-D, L-6 , 8-Dithiooctanoylamid) -NH-CH2-CH2-NH- octanoylamid wurde durchgeführt für c = 0.5 mg, 1 mg, 2 mg pro ml Zellkulturlösung.
Beispiel 2 (Penetration von carrierkonjugierten Peptiden im Zelltyp Keratinozyten)
Benutze Untersuchungsmethoden: Ca. 5xl05 HaCaT-Zellen (ein Geschenk von Dr.N.E. Fusenig, Deutsches Krebsforschungs- zentrum Heidelberg) werden aus einer konfluenten Kultur (DMEM + 5 % FCS) in 60mm Kulturschalen ausgesäht und etwa 12 Stunden wachsen gelassen. Man inkubiert während 4 Stun- den die Zellkulturen mit 25 μM Ac-Leu-Gly-Asp[NH (CH2) 5-N H- CO-Biotin]-Lys(ε-D,L-6,8-Dithiooctanamid) -NH-CH2CH2-NH- octanoylamid, wäscht (2 x mit DMEM ohne FCS) und fixiert für 5 min die Zellen bei -20°C mit EtOH/Essigsäure (95/5) . Nach dreimaligem Waschen mit PBS wird mit Fluorescein markiertem Streptavidin (1000 x verdünnt in PBS+lo % FCS) gebunden. Vor der Mikroskopie wurden die Zellen noch dreimal mit PBS gewaschen und getrocknet. Aufnahmen mit Confocal Scanning Laser Mikroskop (Sarastro 2000, Molecular Dynamics) . Exzitation bei 488nm, Emissionsfilter bei 510nm.
Folgende Ansätze wurden gemacht: a) HaCaT b) HaCaT + NH2 (CH2) -NH-CO-Biotin c) HaCaT + Ac-Leu-Gly-Asp[NH (CH2 ) 5-NH-CO-Biotin] -OH d) HaCaT + Ac-Leu-Gly-Asp[NH(CH2) 5-NH-CO-Biotin]-Lys (ε- D, L-6 , 8-Dithiooctanamid) -NH-CH2CH2-NH-octanoylamid
Ansatz d zeigt eine schöne Fluoreszenzfärbung. Im Gegensatz dazu zeigt der Ansatz b) mit Biotin oder mit Ac-Leu-Gly- Asp-OH (Ansatz c) behandelten Zellen keine Fluoreszenzfärbung.
Beispiel 3 (Penetration von carrierkonjugierten Tyrosinase Mimicking Peptide (TMP) im Zelltyp Melanozyten)
Benutzte Untersuchungsmethoden:
Cloudman S91 Melanomazellen (ATCC CCL-53.1) werden bis zur Konfluenz in 24-Loch Kulturschalen in DMEM + 10% FCS kultiviert. Die S91 Zellen (0.5 ml pro Kultur) werden für 5 Tage mit und ohne TMP und mit 15nM α-MSH inkubiert und anschliessend geerntet. Das TMP/TMP-L wird mindestens 2 Stunden vor dem α-MSH zugegeben. Für die Melaninbestimmung wird das Medium verworfen und die adherenten Zellen lx mit PBS gewaschen. Anschliessend werden die Zellen mit 0.1 ml 0.2 M NaOH lysiert und der Melaningehalt im Lysat bei 450nm gemessen. Die Kulturen der Versuchsreihe werden doppelt angesetzt, um vom 2. Ansatz die Zellzahl mit dem MTT-Test (Mosmann T. 1983, J. of Immun. Methods, 65, 55-63) zu bestimmen. Die Zellzahl gibt wachstumshemmende Effekte an und der Melaningehalt wird in Relation zur Zellzahl angegeben (OD45onm/106 Zellen). Folgende Ansätze wurden gemacht: a) S91 b) S91+30nM TMP c) S91+30nM TMP-Transporter d) S91+30nM Transporter e) S91+15nM α-MSH f) S91 +15nM α-MSH+30nM TMP g) S91 +15nM α-MSH+30nM TMP-Transporter h) S91 +15nM α-MSH+30nM Transporter
TMP-Peptid-Transporter: H-Glu-Asp-Tyr-His-Ser-Leu-Tyr-Asn-
Ser-His-Leu-Lys(ε-D,L-6,8-Dithiooctanamid) -NH-CH2CH2-NH-NH- octanoylamid
Transporter: H-Lys (ε-D, L-6 , 8-Dithiooctanamid) -NH-CH2CH2-NH-
NH-octanoylamid
Bei den Ansätzen von S91, behandelt mit 30nM freiem TMP (b) , sowie S91 mit 30nM Transporter gebundenem TMP (c) , oder S91 nur mit freiem Transporter (d) und auch S91 mit
15nM α-MSH (g) und Transportert gebundenem TMP weichen die gemessenen OD-Werte bei 450nm (OD450nm ca • 0.2) nicht wesentlich von der negativen Kontrolle (= S91 unbehandelt) (a) ab. Folglich wurde in diesen Ansätzen die Melaninbildung nicht zusätzlich angeregt. Bei den Ansätzen von S91 mit 15nM α-MSH (e) , sowie 15nM α-MSH und 30nM freiem TMP (f) als auch 15nM α-MSH mit 30nM freiem Transporter (h) wurde ein erhöhter OD450nm-Wert (ca. 0.7) gemessen. In diesen Fällen wurde die Melaninbildung durch α-MSH angeregt.
Die Verhinderung der durch α-MSH induzierten Melaninbildung wurde dank dem besser membranpermeablen, Transporter-gebundenem TMP ermöglicht (im Ansatz von S91 mit α-MSH kombiniert mit Transportergebundenem TMP) (g) .
In den folgenden Beispielen 4 bis 8 ist die Herstellung der erfindungsgemässen Oligopeptidderivaten beschrieben. Die Analyse der gemäss den Beispielen erhaltenen Eluate und Produkte wurde mit Proton-NMR, HPLC-Elektrospray-MS.
Beispiel 4 (Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-Lys- (ε-D, L-6 , 8-Dithiooctano- ylamid)-NH-CH2-CH2-NH-C=0-(CH2) 6~CH3)
4a) Herstellung von Ac-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -
Asp(OtBu)-OH:
In einem typischen Festphasensyntheseprotokoll wurden durch repetitive Kopplung von 20 g (9.8 mmol, Beladung: 0.49 mmol/g) käuflichem H-Asp-chlorotritylharz mit 14.7 mmol der
Aminosäuren Fmoc-Glu(Otbu) -OH (2 x) und Ac-Glu (Otbu) -OH,
14.7 mmol TBTU, 29.7 mmol Collidin und Deblockierung mit
20% Piperidin in DMF (2 x 5 min) das Tetrapeptid aufgebaut, mit 1% TFA in Dichlormethan vom Harz abgespalten und über
Sephadex LH20® (MeOH) gereinigt, Ausbeute: 6.02 g (70%).
4b) Herstellung von H-Lys (Boc) -NH-CH2-CH2-NH-C=0- (CH2) 6- CH3:
(i) 4.0 g (25.0 mmol) Boc-NH-ethylendiamin und 2.0 g (12.5 mmol) Octanoylchlorid wurden in 20 ml Dichlormethan bei RT lh gerührt, die organische Phase 2mal mit Wasser extrahiert und getrocknet (MgS04) Ausbeute: 3.5 g (98%). (ii) Das Produkt wurde in 10 ml Trifluoressigsäure für 20 Minuten gerührt und mit Diethylether ausgefällt und getrocknet, man erhielt NH2-CH2-CH2-NH-C=0- (CH2) 6-C H3 x TFA (2.1 g, 92%). (iii) 5.2 g (10.7 mmol) FmocLys (Boc) -OH wurden in 50 ml DMF gelöst und 3.53 g (11.0 mmol) TBTU und 2.66 g (22.0 mmol) Collidin zugeben. Nach 1 min gab man 2.0 g (10.7 mmol) NH2-CH2-CH2-NH-C=0- (CH2) 6~C H3 x TFA zu und rührt bei Raumtemperatur (RT) 4 h. Nach Extraktion mit Chloroform/Wasser wurde die organische Phase eingeengt, nach säulenchromatographischer Reinigung (Sephadex LH20®) erhielt man 5.0 g (71%) Produkt, (iiii) 3.0 g (4.48 mmol) des Produkts wurden in einer Lösung aus 5 ml Piperdin in 20 ml DMF 20 Minuten gerührt, nach säulenchromatografischer
Reinigung (Sephadex LH20®) erhielt man 1.56 g (79%) H-Lys (Boc) -NH-CH2-CH2-NH-C=0-(CH2) 6_CH3-
4c) 2.36 g (3.0 mmol) der Verbindung aus Absatz 4a) wurden in 10 ml DMF gelöst und 0.99 g (3.1 mmol) TBTU und 0.75 g (6.2 mmol) Collidin zugeben. Nach 1 Minute gab man 1.3 g (3.0 mmol) der Verbindung aus Absatz 4b) zu und rührte bei RT 4 Stunden. Nach Extraktion mit Chloroform/Wasser wurde die organische Phase eingeengt, nach säulenchromatographischer Reinigung (Sephadex LH20®, MeOH) erhielt man 2.23 g (70%). 0.6 g (0.5 mmol) wurden in einer Mischung aus 9.5 ml TFA, 0.2 ml Wasser und 0.2 ml Triisopropylsilan 3 h bei RT gerührt. Nach Ausfällen mit Diethylether und säulenchromatografischer Reinigung (Sephadex LH20®) erhielt man 0.4 g (91%) Produkt.
4d) 0.35 g (0.41 mmol) 4c, Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-Lys-NH-CH2- CH2-NH-C=0-(CH2) 6~CH3 wurden mit 0.64 g (2.1 mmol) D,L-6,8- Dithiooctanoyl-NHS in DME/Wasser 1:1 (50 ml) bei RT 3 d gerührt, wobei der pH der Lösung auf 7.0 mit Collidin eingestellt wurde, nach säulenchromatographischer Reinigung über Sephadex LH20® (MeOH) erhielt man 0.247 g (57.6 %) der Verbindung 4. Beispiel 5 Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-Lys (ε-D, L-6 , 8-Dithiooctanoyl- amid) -NH2
5a) Ac-Glu (O-tBu) -Glu (O-tBu) -Glu (O-tBu) -Asp (O-tBu) - Lys(Boc)-NH
Käufliches 20 g (9.0 mmol, Beladung: 0.9 mmol/g) Amino- methylharz mit Linker Fmoc-4-Methoxy-4" (carboxypropyl- oxy) benzhydrylamin wurde in einem typischen Festphasensyntheseprotokoll zuerst mit 20% Piperidin in DMF behandelt (2 x 5 Minuten). Nach repetitiver Kopplung mit 15.0 mmol der Aminosäuren Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH , Fmoc- Glu(OtBu)-OH (2 x) und Ac-Glu (OtBu) -OH, 15 mmol TBTU, 30 mmol Collidin und Deblockierung mit 20% Piperidin in DMF (2 x 5 Minuten) wurde das Pentapeptida id mit 100% TFA vom
Harz abgespalten und über Sephadex LH20® (MeOH) gereinigt. Ausbeute: 3.97 g (64.9%).
5b) 0.25 g (0.31 mmol) Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-Lys-NH2 wurden in DME/Wasser 1:1 (50 ml) gelöst der pH mit Collidin auf 7 eigestellt, mit 0.38 g (1.24 mmol) D, L-6 , 8-Dithiooctanoyl- NHS in bei RT 3d gerührt, nach Einengen und säulenchromatographischer Reinigung über Sephadex LH20® (MeOH) erhielt man 0.10 g (37.7 %) des Endprodukts 5.
Beispiel 6 Ac-Leu-Gly-Asp[NH(CH2 ) 5-NH-CO-Biotin]-Lys (ε-D, L- 6 , 8-Dithiooctanamid) -NH-CH2CH2-NH-octanoylamid 6a) Herstellung von Ac-Leu-Gly-Asp(OtBu) -OH: In einem typischen Festphasensyntheseprotokoll wurden durch repetitiver Kopplung von 20 g (9.8 mmol, Beladung: 0.49 mmol/g) käuflichem H-Asp-chlorotritylharz mit 14.7 mmol der Aminosäuren Fmoc-Gly OH und Ac-Leu-OH, 14.7 mmol TBTU, 29.7 mmol Collidin und Deblockierung mit 20% Piperidin in DMF (2 x 5 min) das Tripeptid aufgebaut, mit 1% TFA in Dichlormethan vom Harz abgespalten und über Sephadex LH20® (MeOH) gereinigt. Ausbeute: 2.56 g (65%). 6b) 1.156 g (3.0 mmol) 6a wurden in 10 ml DMF gelöst und 0.99 g (3.1 mmol) TBTU und 0.75 g (6.2 mmol) Collidin zugegeben. Nach 1 Minute gab man 1.3 g (3.0 mmol) der Verbindung 4b zu und rührte bei RT 4 Stunden. Nach Extraktion mit Chloroform/Wasser wurde die organische Phase eingeengt, nach säulenchromatographischer Reinigung
(Sephadex LH20®, MeOH) erhielt man 1.72 g (70%).
6c) 0.41 g (0.5 mmol) 6b wurden in einer Mischung aus 9.5 ml TFA, 0.2 ml Wasser und 0.2 ml Triisopropylsilan 3 h bei RT gerührt. Nach Ausfällen mit Diethylether und säulenchromatografischer Reinigung (Sephadex LH20®, MeOH) erhielt man 0.38 g (90%) Produkt.
6d) 0.3 g (0.38 mmol) 6c wurden in DME/Wasεer 1:1 (50 ml) gelöst, mit Collidin auf pH 7 eingestellt. Man gab 0.23 g (0.76 mmol) D,L-6, 8-Dithiooctanoyl-NHS zu und rührte bei RT 2d, nach säulenchromatographischer Reinigung über Sephadex
LH20® (MeOH) und präparativer HPLC (Waters Deltaprep, Deltapaksäule C18,15μm Laufmittel Wasser/Acetonitril/TFA) erhielt man 0.16 g (57.6 %) .
6e) 0.1 g (0.12 mmol) 6d wurden in 5ml DMF gelöst und 0.026 g (0.12 mmol) TBTU, 0.029 g (0.24 mmol) Collidin und 5- (Biotinamido) pentylamin (Pierce, Rockport, II, USA) zugegeben. Man rührte 6h bei RT, engte ein und Reinigung mittels präparativer HPLC (Waters Deltaprep, Deltapaksäule C18,15μm, Laufmittel Wasser/Acetonitril/TFA ergab 0.069 g (50 %) Endprodukt 6.
Beispiel 7 H-Glu-Asp-Tyr-His-Ser-Leu-Tyr-Asn-Ser-His-Leu- Lys (ε-D , L-6 , 8-Dithiooctanamid) -NH-CH2CH2-NH-octanylamid
7a) Fmoc-Glu(t-but) -Asp (t-but) -Tyr (t-but) -His(Boc) -Ser (t- but)-Leu-Tyr (t-but) -Asn (Trt) -Ser (t-but) -His(Boc) -Leu-OH In einem typischen Festphasensyntheseprotokoll wurden durch repetitiver Kopplung von 31 g (15 mmol, Beladung: 0.5 mmol/g) käuflichem H-Leu-chlorotritylharz mit 18.6 mmol der Aminosäuren Fmoc-Glu (t-but) -OH, Fmoc-His (Boc) -OH, Fmoc- Tyr (t-but) -OH, Fmoc-Asp (t-but) -OH, Fmoc-Asn(Trt) -OH, Fmoc- Ser (t-But) -OH, Fmoc-Leu-OH in der Reihenfolge der Sequenz am H-Leu-Harz aufgebaut, mit den Reagentien 18.6 mmol TBTU, 37.2 mmol Collidin und Deblockierung mit 20% Piperidin in DMF (2 x 5 min) , mit 1% TFA in Dichlormethan vom Harz abgespalten und über Sephadex LH20® gereinigt. Ausbeute: 5.3 g (13%) .
7b) 4 g (1.68 mmol) 7a wurden in 20 ml DMF gelöst, 0.393 g (1.68 mmol) TBTU, 0.406 g (3.36 mmol) Collidin und 0.73 g (1.68 mmol) 4b wurden zugegeben und rührte bei RT 4 Stunden. Nach Einengen und nach säulenchromatographischer
Reinigung (Sephadex LH20®, MeOH) erhielt man 3.28 g (70%).
7c) 3.0 g (1.05 mmol) 7b werden in einer Mischung aus 95 ml TFA, 2 ml Wasser und 2 ml Triisopropylsilan, 5 g Phenol 6 h bei RT gerührt. Nach Ausfällen mit Diethylether und säulenchromatografischer Reinigung (Sephadex LH20®, MeOH) und Reinigung mittels präparativer HPLC (Waters Deltaprep, Deltapaksäule C18,15μm, Laufmittel Wasser/Acetonitril/TFA) erhielt man 1.23 g (60%) Produkt.
7d) 1.0 g (0.52 mmol) 7c wurden in DME/Wasser 1:1 (50 ml) gelöst, mit Collidin auf pH 7 eingestellt. Man gab 0.3 g (1.02 mmol) D, L-6 , 8-Dithiooctanoyl-NHS zu und rührte bei RT 2d, nach säulenchromatographischer Reinigung über Sephadex LH20® (MeOH) wurde das Rohprodukt 10 min mit 5 ml 20% Piperidin/DMF behandelt und nach präparativer HPLC (Waters Deltaprep, Deltapaksäule C18,15μm, Laufmittel Wasser/Acetonitril/TFA) erhielt man 0.088 g (20%) Endprodukt 7. Beispiel 8 D,L-6, 8-Dithiooctanoylamid-Lys (ε-Asp-Glu-Glu-Glu- AC)-NH-CH2CH2-NH-C=0-(CH ) 14"CH3
8a) Herstellung von Boc-Lys-NH-CH2-CH2-NH-C=0- (CH2) i 4 ~CH3 (i) 6.4 g (40.0 mmol) Boc-NH-ethylendiamin und 5.4 g (12.5 mmol) Palmitoylchlorid wurden in 200 ml Dichlormethan bei RT lh gerührt, eingeengt, nach säulenchromatographischer Reinigung (Sephadex LH20®, MeOH) erhielt man 7.9 g (95%) Produkt, (ii) Das Produkt wurde in 100 ml Trifluoressigsäure für 20 Minuten gerührt und mit Diethylether ausgefällt und getrocknet, man erhielt NH - CH2-CH2-NH-C=0-(CH2) ι4-CH3 x TFA (7.8 g, 100%) Rohprodukt, (iii) 2.95 g (12.1 mmol) Boc-Lys-OH wurden in 50 ml DMF gelöst und 2.8 g (12.1 mmol) TBTU und 2.93 g 24.2.0 mmol) Collidin zugegeben. Nach 1 min gab man 5.0 g (12.1 mmol) NH2-CH2-CH2-NH-C=0-(CH2) i4"CH3 x TFA zu und rührte bei Raumtemperatur (RT) 4 h. Nach Einengen und nach säulenchromatographischer Reinigung (Sephadex LH20®, MeOH) erhielt man 5.7 g (90%) Produkt 8a.
8b) H-Lys (ε-Asp-Glu-Glu-Glu-Ac) -NH-CH2CH2-NH-C=0- (CH2) 14 - CH3
1.0 g (0.56 mmol) 4a wurden in 20 ml DMF gelöst, Zugabe von 0.131 g (0.56 mmol) TBTU, 0.141 g (1.12 mmol) Collidin und 0.294 g (0.56 mmol) 8a. Nach Rühren bei 6h RT wurde eingeengt, nach säulenchromatographischer Reinigung (Sephadex LH20®, MeOH) erhielt man 0.54 g (75%) Produkt. 8c) 0.5 g (0.386 mmol) 8b wurden in einer Mischung aus 9.5 ml TFA, 0.2 ml Wasser und 0.2 ml Triisopropylsilan 3 h bei RT gerührt. Nach Ausfällen mit Diethylether und säulenchromatografischer Reinigung (Sephadex LH20®, MeOH) erhielt man 0.251 g (60%) Produkt.
8c) 0.2 g (0.18 mmol) 8b wurden in DME/Wasser 1:1 (50 ml) gelöst, mit Collidin auf pH 7 eingestellt. Man gab 0.11 g (0.36 mmol) D, L-6 , 8-Dithiooctanoyl-NHS zu und rührte bei RT 2d, nach säulenchromatographischer Reinigung über Sephadex LH20® (MeOH) und nach präparativer HPLC (Waters Deltaprep,
Deltapaksäule C18,15μm, Laufmittel Wasser/Acetonitril/TFA) erhielt man 104 mg (50%) Endprodukt 8.
Beispiel 9 (Ac-Glu-Glu-Glu-Asp-Lys- (ε-6 , 8- dimercaptooctansäureamid) -NH-CH2-CH2-NH-C=0- (CH2) 6 _CH3)
0.2 g (0.19 mmol) der Verbindung Beispiel 4 wurde in einem Gemisch von 10 ml Wasser und 5 ml gelöst und mit 0.015 g (0.4 mmol) Natriumborhydrid bei 5°C gerührt. Nach 3 h wurde 1 ml Essigsäure zugegeben und die Lösung eingeengt. Nach präparativer HPLC (Waters Deltaprep, Deltapaksäule
C18,15μm, Laufmittel Wasser/Acetonitril/TFA) erhielt man 0.1 g (49%) Endprodukt 9.

Claims

Patentansprüche
1. Transportsystemkonjugat als transmembranäres Transportsystem, dadurch gekennzeichnet, dass dieses aus mindestens einer pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksamen Verbindung besteht, und diese Verbindung derart modifiziert wurde, dass sie mindestens einen Substituenten der Formel (I) und mindestens einen an Y gebundenen Substituenten der Formel (II) und/oder (III) :
-Y-(NH-CnH2n-NH) r- C(0)-R (I)
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0002
aufweist, worin
Y einen Rest einer Aminosäure mit ursprünglich mindestens 3 reaktiven Gruppen oder einen Rest von 2 oder 3 aneinander gebundenen Aminosäuren mit ursprünglich mindestens 3 reaktiven Gruppen, jeweils ausgewählt aus
Amino (-NH2) und/oder Carboxyl [-C(0)OH], oder einen dreiwertigen Rest eines Trisamins mit 3-8 C-Atomen, cnH 2n -CH CH2CH - oder -CH2CH2-, vorzugsweise - CH2CH2-, r Null, 1 oder 2, vorzugsweise Null oder eins, vorzugsweise 1, R-C(O) den Rest einer gesättigten, einfach oder mehrfach ungesättigten, gegebenenfalls substituierten, (C4-
C24 ) -Fettsäure, Ri Wasserstoff oder Alkyl mit 1, 2 , 3 oder 4 C-Atomen, vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl, vorzugsweise
Wasserstoff, m eine ganze Zahl von 3 bis 8, vorzugsweise 4, 5 oder 6, p 1, 2 oder 3, und vorzugsweise 1, bedeuten.
2. Transportsystemkonjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Y den Rest von Lysin (Lys) , Aspara- ginsäure (Asp), Glutaminsäure (Glu), Ornithin, D,L α,ß-Diaminopropionylsäure, D,L-α,γ butyrylaminosäure, Citrullin, Homocitrullin, D, L-2-Amino-Hexandisäure,
D, L-2-Aminoheptandisäure, 2-Amino-2 Octandisaure. von zwei aneinandergebundenen Glycinmolekülen (Gly.Gly) oder von aneinandergebundenm Glycin und Alanin (Gly.Ala) oder von Tris (2-aminoethyl) a in bedeutet.
3. Transportsystemkonjugat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Y den Rest von Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Ornithin, L-2,3-Di- aminopropionsäure, L-α,γ butyrylaminosäure, Citrullin, Homocitrullin, L-2-Amino-adipinsäure, L-2-Amino- heptandisäure, L-2-Amino-Octandisäure und vorzugsweise von Lysin, bedeutet.
4. Transportsystemkonjugat nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest der Formel (I) der Formel -Y-NH-CH2CH2-NH-C (0) -R entspricht.
5. Transportsystemkonjugat nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest R-C(O)- den Carbonylrest der Buttersäure, Valeriansäure, Capron- säure, Heptansäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Laurin- säure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Arachinsäure, Δ -Dodecylensäure, Oleinsäure, Linol- säure, Arachidonsäure, Ricinoleinsäure, vorzugsweise den Rest der Caprylsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure oder Stearinsäure, bedeutet. Transportsystemkonjugat nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest der Formel (II) direkt an eine NH-Gruppe von Y, oder über eine Übergangsgruppe, vorzugsweise über die Gruppe -(NH- CnH2n-NH)-, an eine Carbonylgruppe von Y gebunden ist.
Transportsystemkonjugat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest der Formel (II) als D,L- 6, 8-Dithiooctanamidrest, direkt am aminoterminalen Ende der aminoterminalen Seitenkette und/oder an den
NH-Rest in α-Stellung von Y befestigt ist.
Transportsystemkonjugat nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass im Rest der Formel (III) m = 4 und p = 1 bedeuten und dieser Rest direkt am aminoterminalen Ende und/oder an den NH-Rest in α- Stellung von Y befestigt ist.
Transportsystemkonjugat nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutisch und/- oder kosmetisch wirksame Verbindung direkt an eine NH- Gruppe oder an eine Carbonylgruppe von Y, gegebenenfalls über eine geeignete Übergangsgruppe, gebunden ist und vorzugsweise am aminoterminalen Ende und/oder an den NH-Rest in α-Stellung von Y befestigt ist.
10. 10. Transportsystemkonjugat nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass dieses der Formel (IV) oder der Formel (V) :
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000032_0002
entspricht, worin A den Rest der modifizierten pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksamen Verbindung bedeutet.
11. Transportsystemkonjugat nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutisch und/- oder kosmetisch wirksame Verbindung einen peptidischen oder nicht-peptidischen Wirkstoffe darstellt.
12. Transportsystemkonjugat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksame Verbindung ein Peptid, vorzugsweise eine α-Aminosäure, oder ein Polypeptid mit vorzugsweise 2-20 Aminosäureeinheiten, vorzugsweise Glu-Glu- Glu-Asp, Glu-Glu-Glu-Asp-Lys, Glu-Glu-Glu-Asp-Ser-Thr- Ala-Leu-Val-Cys, Ala-Glu-Glu-Asp, Glu-Glu-Glu-Glu, Ala-Glu-Glu-Glu, Glu-Glu-Glu-Asp-Ala-Thr-Ala-Leu-Val- Cys, Glu-Glu-Glu-Asp-Leu-Thr-Ala-Leu-Val-Cys, Leu-Gly- Asp, bedeutet.
13. Transportsystemkonjugat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein Oligopeptid mit einem mittleren Molekulargewicht von bis zu 20kDa darstellt, vorzugsweise mit den Sequenzen Glu-Glu-Glu- Asp, Glu-Glu-Glu-Asp-Lys, Leu-Gly-Asp, Glu-Asp-Tyr- His-Ser-Leu-Tyr-Asn-Ser-His-Leu, sowie analoge Sequenzen, sowie entsprechende Salze, vorzugsweise mit TFA, oder Acetate oder Propionate, oder Salze gebildet mit H3PO4 oder HBr.
14. Transportsystemkonjugat nach den Ansprüchen 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit Schutzgruppen versehen ist, welche an vorhandenen reaktiven Gruppen befestigt sind.
15. Transportsystemkonjugat nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutisch und/- oder kosmetisch wirksame Verbindung ein Vitamin, Hormon oder Antibiotikum darstellt, vorzugsweise Vitamin A, Vitamin Bl, Vitamin B2 , Vitamin B6, Vitamin C, Vitamin D, Vitamin E und Vitamin K, Adiuretin, Oxytocin, ein Melanozyten-stimulierendes Hormon, Calcitonon, ein Glucocorticoid, ein Androgen und Östrogen.
16. Transportsystemkonjugat nach einem der Ansprüche 1-15, dadurch gekennzeichnet, dass dieses mit Oligonucleoti- den-Analoga konjugiert ist.
17. Verfahren zur Herstellung eines Transportersystemkon- jugats nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, dass man eine an sich bekannte pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksame Verbindung, vorzugsweise eine Aminosäure mit beliebiger aminotermi- naler Seitenkette und einem carbonylterminierten Ende, über eine Amidstruktur mit einer geeigneten, dem Rest -Y- entsprechenden Ausgangsverbindung, in an sich bekannter Weise an deren aminoterminalen Ende und/oder carboxyterminalen Ende direkt oder über einen Linker verknüpft, wobei man gegebenenfalls vorher oder nachher eine oder mehrere Schutzgruppen einfügt, und man anschliessend das erhaltenen Zwischenprodukt in an sich bekannter Weise mit den geeigneten dem Rest -C(0)R und den Formeln (II) und/oder (III) entsprechenden Ausgangsverbindungen zum Transportsystemkonjugat umsetzt.
3. Verfahren zur Herstellung eines Transportersyste kon- jugats nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, dass man zuerst die Verbindung der Formel (Ia):
H-Y-(NH-CnH2n-NH) r- C(0)-R (Ia)
herstellt, welche mit den Resten der Formeln (II) und/oder (III) sowie der pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksamen Verbindung noch nicht verknüpft ist, und anschliessend die Verbindung der Formel (Ia) mit den geeigneten Ausgangsverbindungen der Reste der Formeln (II) und/oder (III) sowie der pharmazeutisch und/oder kosmetisch wirksamen Verbindung in an sich bekannter Weise umsetzt.
19. Verwendung der Transportsystemkonjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 16, für topische und transdermale Anwendungen in der Dermatologie, Kosmetik oder für systemisch wirkende Pharmaka.
20. Verwendung der Transportsystemkonjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 16, zur Bekämpfung von Hautalterung, Entzündungen, Cellulitis, Psoriasis, Antimelanoma, Arthritis, Akne, Neurodermitis, Ekzeme, Paradontitis oder Verbrennungen, als Radikalf nger, Hautbräuner oder Hautbleicher, zur Haarwuchsförderung oder Haarwuchshemmung, als Immunstimulatoren, zum Transport von Regenerierungswirkstoffen oder Antibiotika oder in der Verwendung auf dem Gebiet der Wundheilung.
21. Verwendung eines Transportsystems gemäss einem der Ansprüche 1 bis 16 für die Herstellung von Heilmitteln für topische und transdermale Anwendungen in der Dermatologie, Kosmetik oder für systemisch wirkende Pharmaka .
22. Heilmittel, welches ein Transportsystem gemäss einem der Ansprüche 1 bis 16 enthält, für topische und transdermale Anwendungen in der Dermatologie, Kosmetik oder für systemisch wirkende Pharmaka, vorzugsweise zur Bekämpfung von Hautalterung, Entzündungen, Cellu- litis, Psoriasis, Antimelanoma, Arthritis, Akne, Neurodermitis, Ekzeme, Paradontitis oder Verbrennungen, als Radikalfänger, Hautbräuner oder Hautbleicher, zur Haarwuchsförderung oder Haarwuchshemmung, als Immunstimulatoren, zum Transport von Regenerierungswirkstoffen oder Antibiotika oder in der Verwendung auf dem Gebiet der Wundheilung.
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