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Die
Erfindung bezieht sich auf neue synthetische Derivate von zwei Thymushormonen,
Thymulin und Thymosin, und auf deren Anwendungen als Arzneimittel
oder auf dem Gebiet der Kosmetik.
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Zahlreiche
Untersuchungen hinsichtlich der Funktionsweise des Immunsystems
haben die zentrale Rolle des Thymus und der Thymushormone bei der
Stimulierung der Immunabwehrreaktionen des Organismus nachgewiesen.
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Es
wurde festgestellt, dass die Thymushormone, insbesondere Thymulin, „J. F.
BACH und Koll.”,
Thymopoetin, „GRANDSTEIN”, und Thymosin, „DAYNE”, von Polypeptid-
und Peptid-Natur
sind.
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Diese
Hormone, und hauptsächlich
Thymulin und Thymopoetin, haben die Eigenschaft, die Reifung der
T-Lymphozyten zu induzieren und die Immunantwort des Organismus
zu stimulieren.
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Es
wurde wissenschaftlich gezeigt, dass eine enge Verbindung zwischen
der Abnahme der Thymusfunktionen mit dem Alter und der Hautalterung
auf normaler physiologischer Ebene besteht.
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Auf
pathologischer Ebene manifestiert sich der Aktivitätsverlust
des Thymus, die „Involution”, in dem Auftreten
von physiologischen Störungen: „Autoimmunerkrankungen,
Alopezien (abnormaler Haarausfall) u. s. w.”.
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Es
ist gleichfalls gezeigt worden, dass eine Verbindung zwischen den
physiologischen Eigenschaften des Thymus und bestimmten Zellen der
Epidermis besteht.
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Es
existiert tatsächlich
eine strukturelle Ähnlichkeit
zwischen bestimmten Zellen des Thymus und den Keratinozyten. Es
wurde gezeigt, dass die Keratinozyten gleichfalls unter bestimmten
Bedingungen ein Hormon vom Thymopoetin-Typ sezernieren, welches
identisch ist mit jenem, das durch den Thymus sezerniert wird, und
in der Lage sind, eine postthymische Lymphozytenreifung zu induzieren
und so an die Stelle des Thymus zu treten.
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Diese
Verbindung zwischen den physiologischen Aktivitäten der Zellen des Thymus und
den Keratinozyten wurde unlängst
durch den Nachweis des Vorhandenseins von Kerstin und von Keratohyalin,
Strukturen, die identisch zu Kerstin und Keratohyalin, welche durch
die Keratinozyten der Epidermis sezerniert werden, sind, in den
Zellen des Thymus bestätigt.
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Außerdem bestätigt der
auf wissenschaftlicher Ebene erbrachte Nachweis, dass die Keratinozyten
in der Phase der Differenzierung eine Substanz, welche die Vermehrung
der Thymozyten aktiviert, ETAF, sezernieren, die physiologischen
Verbindungen, die zwischen dem Thymus und den Keratinozyten bestehen. (ETAF:
Epidermal Thymocyte Activating Factor).
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Es
existiert eine Parallele zwischen der „Involution” oder Rückbildung
des Thymus und der Abnahme der Synthese von TAF durch die Keratinozyten
in Abhängigkeit
vom Alter, mit gleichwohl einer funktionellen Verschiebung zu Gunsten
der Keratinozyten (postthymische Lymphozytenreifung).
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Die
therapeutische Verwendung der Thymushormone, insbesondere von Thymulin
und Thymopoetin, war Gegenstand zahlreicher pharmakologischer und
klinischer Arbeiten in Hinblick auf die Stimulierung und die Regulation
der Immunabwehrreaktionen des Organismus.
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Eingesetzt
in Form von Extrakten oder von Molekülen, die durch chemische Synthese
erhalten worden sind, lieferten diese Produkte irreguläre und trügerische
Ergebnisse infolge ihrer mangelnden Stabilität und einer ubiquitären Wirkung,
die mit dem Fehlen von Dosis-Wirkungs-Beziehungen
verbunden war.
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Die
Patentanmeldung
FR 2 411 174 offenbart
eine Aminosäuresequenz
-ALA-LYS-SER-GLN-, die eine biologische Aktivität bei Injektion aufweist, welche
im Immunsystem von menschlichen und tierischen Lebewesen nützlich ist.
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Die
Patentanmeldung
EP 166 612 beschreibt
von Thymopoetin abgeleitete Pentapeptide, die bei der Behandlung
von Krankheiten, an welchen chronische Infektionen beteiligt sind,
nützlich
sind.
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Die
Erfindung hat die Herstellung von Peptidderivaten von Thymushormonen,
deren Struktur darauf ausgerichtet ist, bei diesen eine hohe physikalisch-chemische
Stabilität
und eine perfekt definierte pharmakologische Aktivität sicherzustellen,
durch chemische Synthese zum Gegenstand.
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Unter
Einsatz der Gesamtheit der unlängst
durch unsere Gruppen erworbenen und entwickelten Kenntnisse, welche
die wesentliche Rolle der Epidermis bei den Immunabwehrreaktionen
und deren Verbindungen mit dem Thymus betreffen (International Society
of Development and Comparative Immunology), hat die vorliegende
Erfindung die Herstellung von synthetischen Peptidderivaten zum
Gegenstand, deren physiologische und therapeutische Aktivität bevorzugt
bei jeglicher systemischer Wirkung auf die Stimulierung und die
Modulierung der Immunabwehrreaktionen der Dermis und der Epidermis
ausgerichtet ist.
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Ein
bevorzugter Gegenstand der Erfindung betrifft die Herstellung von
Metallopeptiden, deren physiologische Eigenschaften speziell auf
die Aktivierung des kutanen Immunsystems und die Stimulierung der
germinativen Funktionen der Basalzellen der Epidermis bei Ausschluß einer
jeglichen Nebenwirkung in Hinblick auf die systemische (allgemeine)
Immunität
ausgerichtet sind, durch chemische Synthese.
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Die
Erfindung hat die Herstellung von Peptidmolekülen, Homologen oder Derivaten
der aktiven Peptidsequenzen der hauptsächlichen Thymushormone, „Thymulin
und Thymopoetin”,
zum Gegenstand.
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Die
mit diesen hormonalen Vermittlersubstanzen ausgeführten zahlreichen
klinischen Versuche haben es nicht erlaubt, deren therapeutischen
Nutzen nachzuweisen.
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Tatsächlich sind
bei einer Verwendung in Form von injizierbaren Zubereitungen für die Behandlung von
Immunmangelzuständen
bzw. Mängeln
des Immunsystems und Autoimmunerkrankungen die Ergebnisse allesamt
negativ gewesen aufgrund ihrer ubiquitären Aktivität in Abhängigkeit von den verabreichten
Dosen.
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Es
scheint, dass diese ubiquitären
Wirkungen mit der Struktur dieser Verbindungen, welche durch Synthese
erhalten werden, verbunden sind, welche es diesen nicht erlaubt,
sich normal an die Globuline und die zellulären Rezeptoren anzuheften,
berücksichtigt
man deren parenterale Verabreichung.
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Aus
diesem Grunde ist einer der Gegenstände der Erfindung die Herstellung
von Verbindungen in Form von Metallopeptiden, welche durch Synthese
erhalten werden, deren physiologische Aktivitäten auf die Modulierung des
Immunsystems und die Aktivierung der germinati ven Zellen der Epidermis
durch topische lokale Anwendungen gemäß dem pharmakologischen Prinzip
der „Struktur-Wirkungs-Beziehungen” (Hänch-Prinzip)
ausgerichtet sind.
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Die
Erfindung hat insbesondere eine pharmazeutische oder kosmetische
Zusammensetzung zum Gegenstand, welche wenigstens ein Peptidkonjugat
enthält,
das eine Sequenz von wenigstens 3 Aminosäuren, abgeleitet von der vollständigen Sequenz
von Thymulin oder Thymopoetin, umfasst, wobei die Aminosäuren in
D-, L- oder DL-Form vorliegen können,
wobei die Sequenz chemisch oder physikalisch mit wenigstens einer Verbindung
konjugiert ist, die ausgewählt
ist unter:
- – den Monocarbonsäuren der
allgemeinen Formel HOOC-R (I),in welcher
R für einen
linearen oder verzweigten, gegebenenfalls substituierten aliphatischen
C1-C20-Rest, der
eine oder mehrere Ungesättigtheiten
enthalten kann, steht, wie auch den Alkohol- oder Aldehyd- oder Amidderivaten
der Säuren
der Formel I;
- – den
Dicarbonsäuren
der allgemeinen Formel HOOC-R1-COOH (II),in
welcher R1 für einen gerad- oder verzweigtkettigen
zweiwertigen aliphatischen Rest, der wenigstens 3 Kohlenstoffatome,
vorzugsweise 3 bis 10 Kohlenstoffatome umfasst, insbesondere einen
Alkyl-, Alkylen-, Alkenylen- oder Alkinylenrest, der eine oder mehrere
Ungesättigtheiten
umfassen kann, gegebenenfalls substituiert ist, insbesondere durch
eine oder mehrere Amino-, Hydroxy-, Oxogruppen oder einen C1-C3-Alkylrest, wobei
R1 außerdem
mit einer der Säurefunktionen
einen Cyclus bilden kann, steht.
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Die
erfindungsgemäßen Konjugate
sind Derivate mit niedrigem Molekulargewicht, die insbesondere in Form
von Salzen, Estern oder Amiden der Verbindungen der Formel I oder
II erhalten werden.
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Unter
den Verbindungen der Formel I sind Carbonsäuren mit für den Krebs-Tricarbonsäurecyclus essentieller Stoffwechselaktivität besonders
bevorzugt, welche auf der Ebene der Mitochondrien als Coenzym von
oxidativen Decarboxylierungen wirken und deren Eigenschaften sind,
sich bevorzugt kovalent an die ε-aminierten
Funktionen von bestimmten Peptiden in Form von Lipoamiden anzuheften,
wobei auf diese Weise die Präsentation
der gemäß der Erfindung
erhaltenen Peptidkonjugate gegenüber
dem β-Rezeptor
der Klasse G der Zellen der Epidermis vereinfacht wird.
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Für diese
Säuren
und andere, die für
das Ausführen
der Erfindung geeignet sind, kann R für einen linearen oder verzweigten,
substituierten oder nicht-substituierten C1-C20-Rest, insbesondere C1-C4-Rest, insbesondere einen Alkyl-, Alkenyl-
oder Alkinylrest stehen, welcher eine oder mehrere Ungesättigtheiten
umfassen kann und substituiert sein kann durch einen oder mehrere
Reste, die ausgewählt
werden aus der Gruppe, umfassend: NH2, OH,
Oxo, Thiol oder einen cyclischen nicht-aromatischen Rest, welcher
5 bis 6 Atome im Zyklus umfasst, von denen 1 oder 2 von Kohlenstoff
verschieden sein können,
insbesondere S, O oder N, wobei die Cyclen durch C1-C3-Alkylreste, insbesondere Methyl substituiert
sein können.
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Insbesondere
wenn R für
eine aliphatische C
1-C
20-Kette
steht, kann diese substituiert sein durch einen Zyklus, ausgewählt unter
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Andere
Verbindungen der Formel I, die für
das Ausführen
der Erfindung geeignet sind, sind jene, bei denen in der allgemeinen
Formel I R für
einen einfach ungesättigten
Rest von cis- oder
trans-Konfiguration mit der allgemeinen Formel R2-CH=CH stehen kann,
in welcher R2 für einen linearen oder verzweigten
Alkylrest, der wenigstens 6 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 6 bis
16 Kohlenstoffatome umfasst und der gegebenenfalls durch eine Amino-,
Hydroxy- oder Oxogruppe substituiert ist, stehen kann.
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Vorteilhafterweise
steht R1 in der Formel II für einen
gegebenenfalls substituierten C4-C8-Alkylenrest.
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Erfindungsgemäße Peptidkonjugate
sind insbesondere jene, bei denen die Säure der allgemeinen Formel
I unter Essigsäure,
Pyroglutaminsäure,
DL-Liponsäure,
Dihydroliponsäure,
N-Lipoyllysin, den
Hydroxydecensäuren
und Decinsäuren,
Retinsäure
und deren Derivaten, Retinal und Retinol, Myristinsäure und
deren Derivaten, Palmitinsäure,
in Form von Salzen, Estern oder Amiden ausgewählt ist oder auch die Säure der allgemeinen
Formel II unter Adipinsäure, α-Aminoadipinsäure, Pimelinsäure, Sebacinsäure und
deren Derivaten ausgewählt
ist.
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Die
Säuren
der allgemeinen Formeln I oder II sind vorzugsweise unter Essigsäure und
deren Derivaten, Pyroglutaminsäure, α-DL-Liponsäure und
deren Derivaten, Dihydroliponsäure,
N-Lipoyllysin, Adipinsäure, α-Aminoadipinsäure, Pimelinsäure, Sebacinsäure und
deren Derivaten, trans-10-Hydroxy-Δ2-decensäure und trans-Oxo-9-decen-2-säure, Retinsäure und
deren Derivaten, Retinol und Retinal, Myristinsäure und Palmitinsäure ausgewählt.
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Die
Aminosäuresequenz
der erfindungsgemäßen Konjugate
enthält
eine der 3 folgenden Sequenzen:
Gln-Gly-Gly
Arg-Lys-Asp
Lys-Asp-Val.
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Tatsächlich betrifft
die Erfindung genauer die Herstellung von zwei Reihen von Peptidmolekülen, deren Aktivitäten auf
der Ebene der Anwendungen auf den Gebieten der Humanmedizin und
der Hautkosmetik komplementär
sind.
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Die
Erfindung betrifft bevorzugt Peptidkonjugate, welche von dem zirkulierenden
Thymushormon Thymulin abgeleitet sind und deren physiologische Aktivitäten auf
die Reifung des Immunsystems und von verschiedenen Vermittlersubstanzen
des kutanen Immunsystems gerichtet sind.
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Diese
Peptidkonjugate sind insbesondere auf die Behandlung von Autoimmunerkrankungen
der Haut und insbesondere die Verhütung und Behandlung von Alopezien,
seien sie physiologischen Ursprungs (Alterung), traumatischen oder
pathologischen Ursprungs, ausgerichtet.
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Die
Erfindung betrifft gleichfalls die Herstellung von Peptidkonjugaten,
welche von dem zellulären
Thymushormon Thymopoetin abgeleitet sind und deren physiologische
Aktivitäten
gleichfalls auf die Reifung des Immunsystems der Haut ausgerichtet
sind, wobei sie eine präferentielle
Aktivität
für die
Stimulierung der Stoffwechselvorgänge, der Zellen der Epidermis,
insbesondere der germinativen Keratinozyten aufweisen, bei denen
sie die Sekretionen und die endozellulären Synthesen der Strukturmoleküle „Keratine
mit niedrigen Molekulargewichten und Keratohyalinen” stimulieren.
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Diese
Reihe von Peptidkonjugaten ist insbesondere für die Behandlung von Erkrankungen
der Haut, welche mit Mängeln
des Immunsystems verbunden sind, und insbesondere für die präventive
und heilende Behandlung der Hautalterung von physiologischer Größenordnung
(Alter) oder pathologischer Größenordnung indiziert.
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Die
Aminosäuresequenz
der Peptidkonjugate, die von Thymulin abgeleitet sind, entspricht
vorzugsweise der folgenden allgemeinen Formel:
X-Gln-Gly-Gly-Y,
in
welcher Gln für
Glutamin oder ein Derivat von Glutamin steht, Gly für Glycin
oder ein Derivat von Glycin steht; wobei. die Derivate insbesondere
die halogenierten Derivate der fraglichen Aminosäuren umfassen. Die Aminosäuren können in
der natürlich
vorkommenden Form oder nicht vorliegen.
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Gemäß einem
der Aspekte der Erfindung weisen die Peptidkonjugate dementsprechend
die folgende Formel auf: A-X-Gln-Gly-Gly-Y (III),in der
A eine Verbindung der allgemeinen Formel I oder II, wie zuvor definiert,
insbesondere DL-Liponsäure, Dihydroliponsäure oder
N-Lipoyllysin ist,
- – X: Ser, Lys-Ser, Ala-Lys-Ser,
Pyr-Ala-Lys-Ser, eine Bindung oder Glx-Ala-Lys-Ser ist,
worin
Glx: Pyro-Glu, Glu oder Gly und dessen Derivate ist,
- – Y:
Ser-Asn-OH
Ser-Asn-NH2
Ser-OH
Ser-NH2 ist,
wobei die Aminosäuren in
L-, D- oder DL-Form vorliegen.
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In
den folgenden Formeln steht Pyr für Pyroglutaminsäure.
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Die
Peptidkonjugate der Formel III umfassen vorzugsweise eine Abfolge
von wenigstens 4 Aminosäuren,
insbesondere 4 bis 9 Aminosäuren,
welche vorteilhafterweise die Sequenz Gln-Gly-Gly-Ser umfasst.
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Die
Erfindung betrifft ganz besonders die folgenden Konjugate:
- I A-Pyr-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH2
- II A-Pyr-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH2
- III A-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH2
- IV A-Ala-ys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH2
- V A-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH2
- VI A-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH2
- VII A-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH2
- VIII A-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH2
- IX A-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH2
- X A-Gln-Gly-Gly-Ser-NH2
- XXIII A-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-OH,
wobei
A vorstehend definiert wird, wie auch die Derivate dieser Moleküle in Form
von Salzen, Estern oder Amiden.
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Die
oben erwähnten
Aminosäuresequenzen
können
natürliche
oder nicht-natürliche
Aminosäuresequenzen
sein.
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Es
wird gleichfalls präzisiert,
dass die oben erwähnten
und den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildenden Peptidkonjugate
in der Form mit NH2-Terminus und in der
Form mit OH-Terminus
erhalten werden können.
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Ebenso
ist es in bestimmten Fällen
möglich,
dass bestimmte dieser Aminosäuren
Funktionen, beispielsweise Glycosylierungen, tragen.
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Gemäß einem
anderen Aspekt betrifft die Erfindung Peptidkonjugate, welche von
Thymopoetin abgeleitet sind und der folgenden allgemeinen Formel
entsprechen: A-W-Lys-Asp-Z (IV),in welcher
A eine Verbindung der allgemeinen Formel I oder II, wie zuvor definiert,
oder der entsprechende Rest, und insbesondere Essigsäure und
deren Derivate, DL-α-Liponsäure und
deren Derivate, Dihydroliponsäure,
N-Lipoyllysin, Adipinsäure, α-Aminoadipinsäure, Pimelinsäure, Sebacinsäure und
deren Derivate, trans-Oxo-9-decen-2-säure, trans-Hydroxy-10-decen-2-säure ist,
W
für: Glu-Gln-Arg,
Gln-Arg, Arg, Arg-Lys-, Arg-Lys-Asp oder eine Bindung steht,
Z
für: Val-Tyr-NH2, Val-Tyr-OH, Val-NH2,
Val-OH, Tyr-OH, Tyr-NH2, OH oder NH2 steht,
wobei W und Z so ausgewählt sind,
dass wenigstens eine der Sequenzen Arg-Lys-Asp oder Lys-Asp-Val
in den Verbindungen der Formel IV vorhanden ist, mit Ausnahme der
Konjugate der Formel XI, XII, XIII, XIV, XV und XVI, wie in Anspruch
1 definiert.
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Peptidkonjugate
der Formel IV, welche die Sequenz Arg-Lys-Asp-Val umfassen, liefern
hervorragende Ergebnisse.
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Die
Aminosäuren
können
in D-, L- oder DL-Form vorliegen und können gegebenenfalls glycosyliert sein.
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Peptidkonjugate,
die besonders geeignet sind und deren biologische Aktivitäten komplementär zu den Peptidkonjugaten
der Formel III sind, sind die folgenden Konjugate der Formel IV:
- XVII A-Lys-Asp-Val-Tyr-NH2
- XVIII A-Lys-Asp-Val-Tyr-OH
- XIX A-Arg-Lys-Asp-Val-NH2
- XX A-Arg-Lys-Asp-Val-OH
- XXI A-Arg-Lys-Asp-NH2
- XXII A-Arg-Lys-Asp-OH,
wobei „A” vorstehend definiert ist,
wie auch die Derivate dieser Moleküle in Form von Salzen, Estern
oder Amiden.
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Die
oben erwähnten
Aminosäuresequenzen
können
natürliche
oder nicht-natürliche
Aminosäuresequenzen
sein.
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Es
wird präzisiert,
dass die oben erwähnten
Peptidkonjugate in der Form mit NH2- oder
OH-Terminus erhalten
werden können.
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Die
erfindungsgemäßen Peptidkonjugate
können
gleichfalls in Form von Molekülkomplexen
mit einem Metall, insbesondere Zink, vorliegen.
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Die
erfindungsgemäße Konjugate
können
durch Synthese durch Techniken, die den Fachleuten auf diesem Gebiet
bekannt sind, erhalten werden.
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Die
Synthesen der freien Peptide können
nach den Techniken von MERRIFIELD gemäß zwei Verfahren ausgeführt werden.
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In
einem ersten Verfahren setzt man ein Derivat von Glutamin ein, welches
an seiner γ-Amid-Funktion durch „Mbh”, 4,4-Dimethoxybenzhydryl,
geschützt
ist.
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In
einem zweiten Verfahren wird die Synthese ohne Schutz des γ-Amids der
Glutamin-Reste ausgeführt.
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Indem
man das erste und das zweite Verfahren einsetzt, wird der geschützte C-terminale
Teil des Dipeptids an das geschützte
Tetrapeptid Ser-Gln-Gly bzw. an das geschützte Hexapeptid Ala-Lys-Gln-Gly-Gly gekoppelt.
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So
wird die Herstellung der Polypeptide mit der Sequenz X-Gln-Gly-Gly-Y, in welcher
Y für Ser-Asn
steht und X für
Ser oder Ala-Lys-Ser steht, ausgeführt, indem das geschützte Dipeptid Ser-Asn
mit dem geschützten
Peptid X-Gln-Gly-Gly gekoppelt wird und durch mögliche nachfolgende Entfernung
der Schutzgruppen.
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Indem
man das zweite Verfahren einsetzt, ist es folglich das Octapeptid Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn, welches
erhalten wird, wohingegen, indem man das erste Verfahren einsetzt,
das gleiche Octapeptid ausgehend von dem Hexapeptid Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn über die
Zwischenstufe des Heptapeptids Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn hergestellt
wird.
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Das
Octapeptid Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn erlaubt dann, die beiden
Formen durch Ankopplung des ersten Rests PyroGlu oder Gln herzustellen.
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Das
Verfahren, welches eingesetzt wird, um den Rest PyroGlu an die Sequenz Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Y anzukoppeln,
ist das gleiche unabhängig
davon, welches die möglichen
Bedeutungen von Y, nämlich
Ser und Ser-Asn, und die möglichen
Bedeutungen, die sich davon durch die Modifizierung einer Aminosäure ableiten,
beispielsweise für
Ser-Asp, Ala-Asn, sind.
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Diese
Ankopplung wird vorteilhafterweise mittels des Derivats PyroGlu-OTcp
in die Sequenz Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Y, in welcher bestimmte Aminosäuren die
Möglichkeit
haben, an ihrer Seitenketten-Funktion geschützt zu werden, erzielt.
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Die
Peptidderivate, die den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden
und zuvor beschrieben worden sind, können in ihrer peptidischen
Form oder in Form von Konjugaten mit den zuvor beschriebenen Carbonsäuren, die
der allgemeinen Formel I entsprechen, eingesetzt werden.
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Eben
diese Peptidkonjugate können
in Form von Molekülkomplexen
mit einem Metall eingesetzt werden.
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Das
für die
Herstellung der Metall-Peptid-Komplexe der Erfindung eingesetzte
Metall ist beispielsweise Zink in Form von ZnCl2,
welches in Form eines Salzes mit einer Carboxylgruppe der terminalen
Aminosäure gekoppelt
werden kann oder in Form von Komplexen „Peptide-Zn2” in den
folgenden Anteilen von 0,5 bis 5%, vorzugsweise 1% ZnCl2 pro
Peptidmolekül.
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Diese
Anteile sind abhängig
von dem Molekulargewicht des Peptidkonjugats variabel.
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Der
Metall-Peptid-Komplex kann insbesondere in Lösung mit 10% ZnCl2 pro
Peptidmolekül
nach Erwärmen
für 10
min bei 20°C
erhalten werden.
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Der
Komplex wird dann gereinigt, beispielsweise an einer Biogel P-2-Säule und
mit destilliertem Wasser eluiert und lyophilisiert.
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Man
erhält
ein stabiles Colyophilisat, welches 1% Zink gebunden an das Peptidmolekül infolge
von Affinität
enthält.
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Die
Gesamtheit der erfindungsgemäßen Verbindungen
kann als Arzneimittel eingesetzt werden.
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Die
erfindungsgemäßen Konjugate
können
insbesondere für
die Herstellung eines Arzneimittels dienen, das dazu bestimmt ist,
Mangelzustände
oder Mängel
des Immunsystems zu korrigieren.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen können
wenigstens ein erfindungsgemäßes Konjugat
und Trägersubstanzen,
welche für
die Verabreichung auf parenteralem Wege oder auf äußerlichem
topischem Wege angepasst sind, enthalten.
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Diese
Zusammensetzungen können
ebenso auf dem Gebiet der Humanmedizin wie der Veterinärmedizin
eingesetzt werden, können
auf oralem oder parenteralem Wege verabreicht werden, vorzugsweise
aber in einer auf topischem äußerlichem
Wege verabreichbaren Form.
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Für das Ausführen der
Erfindung besonders angepasste Zusammensetzungen sind jene, die
das folgende Konjugat enthalten: Pyr-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-OH, gegebenenfalls
in Form eines Komplexes mit einem Metall.
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Die
Peptidkonjugate, die den Gegenstand der Erfindung bilden, ihre Derivate
und ihre galenischen Zusammensetzungen können in Form von Cremes, von
Milchpräparaten,
von Lotionen oder von Sprays angeboten werden und bekannte Trägersubstanzen
und gegebenenfalls andere Wirkstoffe enthalten.
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Sie
können
allein oder in Form von Kombinationen oder galenischen Zusammensetzungen
für die
Behandlung von Autoimmunerkrankungen in den verschiedenen Gebieten
der Dermatologie eingesetzt werden.
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Die
Erfindung betrifft gleichfalls die Verwendung der Peptidkonjugate
in der Dermo- oder Hautkosmetik und in der Kosmetik.
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Die
Erfindung hat dementsprechend galenische, pharmazeutische und kosmetische
Zusammensetzungen zum Gegenstand, welche wenigstens eines der zuvor
beschriebenen Peptidkonjugate umfassen.
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Die
Peptidkonjugate der Erfindung, ihre Derivate, ihre Kombinationen
mit bekannten Wirkstoffen können
in Form von kosmetischen Zubereitungen und Zubereitungen für das Haar,
insbesondere für
die Verjüngung
und die Erneuerung der oberflächlichen
Schichten der Haut und insbesondere für die haarkosmetische Behandlung
von Haarausfall eingesetzt werden.
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Die
folgenden Beispiele sind dazu bestimmt, die Erfindung und insbesondere
die immunstimulierende Aktivität
der auf topischem Wege verabreichten synthetischen thymischen Peptide
zu veranschaulichen, ohne in irgend einer Weise deren Umfang zu
beschränken.
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In
diesen Beispielen wird Bezug genommen auf die folgenden Figuren:
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1: Wirkung von ETF auf die DNA-Synthese
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2:
Wirkung von ETF auf die NK-Zellen auf topischem Wege (Zielzellen:
YAC1). Der Prozentsatz der Lyse wird an den Tagen 1, 3, 6, 9, 15,
18 und 21 nach der Injektion für
die verschiedenen Verhältnisse
von Effektorzellen/Zielzellen angegeben.
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3: Wirkung von ETF auf die NK-Zellen auf
topischem Wege (Zielzellen P815).
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4:
Wirkung von ETF auf die NK-Zellen in vitro. Der Prozentsatz der
Lyse in Abhängigkeit
von dem Verhältnis
von Effektorzellen/Zielzellen ist für verschiedene ETF-Dosen angegeben.
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5: Wirkung von ETF auf die NK-Zellen bei
Verabreichung durch Injektion. Der Prozentsatz der Lyse in Abhängigkeit
von dem Verhältnis
von Effektorzellen/Zielzellen ist nach Stimulierung durch 15 μg ETF und
für Vergleichstiere
angegeben.
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6: Rolle von Interferon bei der Stimulierung
der NK-Zellen durch ETF bei Verabreichung durch Injektion. Der Prozentsatz
der Lyse ist abhängig
von dem Verhältnis
von Effektorzellen/Zielzellen in Gegenwart von anti-Interferon oder
ohne dieses angegeben.
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7:
Wirkung von ETF auf NK-Zellen bei Verabreichung durch Injektion:
Kinetik der Reaktion 1, 3 und 8 Tage nach der Verabreichung von
15 μg ETF
auf intraperitonealem Wege.
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BEISPIEL Nr. 1 – HERSTELLUNG DES KONJUGATS
Nr. II
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- A-Pyro-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH2
- A = DL-Liponsäure
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Die
Synthese wird gemäß der beschriebenen
allgemeinen Methodik ausgeführt
gemäß den folgenden Schritten:
- 1 – Boc-Gin-Gly-Gly-OMe
- 2 – Trifluoracetat-Gln-Gly-Gly-OMe
- 3 – Z-Ser-NH-NH2(But) → Bop → DIEA → DMF
- 4 – Z-Ser-Glu-Gly-Gly-Ser-NH2
- 5 – Liponsäure → BOP → DIEA → DMF
- 6 – Lipoyl-Pyro-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH2
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HPLC-Analyse der Aminosäuren
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- Asp – 1,02;
Ser – 1,77;
Glu – 1,0;
Gly – 2,00;
Ala – 0,91.
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BEISPIEL Nr. 2 – HERSTELLUNG DES KONJUGATS
Nr. III
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- A-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH2
- A = Adipinsäure
-
Die
Synthese wurde gemäß der allgemeinen
Methodik ausgeführt
gemäß den folgenden
Schritten:
- 1 – Z-D-Ala-Lys-(Boc)-Ser(But) → DMF
- 2 – Lys-(Boc)-Ser(But)-Gln(Mbh) → DMF
- 3 – Gly-Gly-Ser(But)-Asn-O-But
- 4 – MeOH → CH3COOH → D-Ala-Lys(Boc)-Ser(But)-Gln(Mbh) → Gly-Gly-Ser-Asn(But)
- 5 – Adipinsäure → BOP → DIEA
- 6 – Adipoyl-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH2
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HPLC-Analyse der Aminosäuren:
-
- Asp – 1,02;
Ser – 1,77;
Glu – 1,0;
Gly – 2,00;
Ala – 0,91.
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BEISPIEL Nr. 3 – HERSTELLUNG DES KONJUGATS
Nr. I
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- A-Pyro-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH2
- A = Essigsäure
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Dieses
Konjugat wird durch die in Beispiel 1 beschriebene Methodik hergestellt
ausgehend von dem zuvor beschriebenen Derivat:
Ala-Lys(Boc)-Ser(But-Gln-Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn(But).
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Man
erhält
ein homogenes Produkt durch Chromatographie in den Lösemitteln
G und H, bei pH 2,3.
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HPLC-Analyse der Aminosäuren.
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- Asp – 0,97;
Ser – 1,67;
Glu – 1,84;
Gly – 2,00;
Ala – 0,98.
-
BEISPIEL 4 – MESSUNG DER AKTIVITAT AN
LANGERHANS-ZELLEN IA+ UND THYMOZYTEN THY.1.2+ DER EPIDERMIS VON C57-BL/6-MÄUSEN
-
I. Zusammenfassung
-
Die
Keratinozyten von „C57-BL/6”-Mäusen, welche
durch die Peptidderivate der Thymushormone stimuliert werden, setzen
Mediatoren (zelluläre
Botensubstanzen), wie ETAF, IL1 und IL6, frei, die eine Aktivierung
der Immunantwort der immunkompetenten Zellen der Epidermis, der
Langerhans-Zellen Ia+ und der Thymozyten
Thy 1.2+, induzieren.
-
Die
Messung dieser Aktivierung durch die Immunfluoreszenztechniken ist
charakteristisch für
die immunmodulierende Aktivität
der thymischen Peptide.
-
II. Material und Methode
-
1 – Proben,
an denen die Experimente ausgeführt
wurden – Code:
ETF
-
In
Lösung
in Propylenglycol in einer Konzentration von (c) = 10–5 M/ml:
- ETF – Peptid – Nr. I
- ETF – Peptid – Nr. III
- ETF – Peptid – Nr. XV – Vergleichsbeispiel
- ETF – Peptid – Nr. XIX
- Vergleichsprobe = Propylenglycol
-
2 – Methodik
-
Männliche
C57-BL/6-Mäuse
im Alter von 5 bis 7 Wochen, welche zu 4 pro Käfig aufgeteilt werden, mit freiem
Zugang zu Wasser und Futter, welche einer Photoperiode von 12 h
Licht pro 24 h unterworfen werden, erhalten täglich und während 5 aufeinanderfolgenden
Tagen eine topische Anwendung des Peptids in Propylenglycol (Vol.
50 μl) auf
die dorsale Fläche
des Ohrs.
-
Am
Tag 6 werden die Tiere getötet.
Man entfernt die Ohren mit Trennung der dorsalen Seite und der ventralen
Seite.
-
Die
Gewebe der dorsalen Seite werden 2 h bei 37°C in Na-EDTA (0,020 M) eingetaucht.
-
Nach
der Inkubation wird die Epidermis in Form eines intakten Blattes
präpariert,
mit Aceton fixiert und in PBS (Phosphatpuffer) rehydratisiert.
-
Die
DEZ (dendritischen Epidermiszellen) Thy 1–2+ und
Ia+ werden durch Doppelmarkierung in indirekter
Immunfluoreszenz identifiziert.
-
Die
Anzahl von Zellen pro mm2 wird mittels der
peripheren Zonen der gleichen Oberfläche für jedes Epidermisblatt bestimmt.
-
Die
DEZ (dendritischen Epidermiszellen), die den Marker Ia+ tragen,
wurden durch die Verwendung eines monoklonalen anti-Ia+-Antikörpers identifiziert.
-
Die
Epidermisblätter
werden mit Aceton fixiert, dann 1 h bei 37°C in Gegenwart des monoklonalen
anti-Ia+-Antikörpers inkubiert und durch die
indirekte Immunperoxidase-Methode (Kit) markiert.
-
Nach
Inkubation während
10 min bei 37°C
mit einer Lösung
von Aminoethylcarbazol wird das Präparat mit PBS gewaschen.
-
Die
DEZ Thy 1.2+ wurden durch Doppelmarkierung
in indirekter Immunfluoreszenz identifiziert. Die Epidermisblätter wurden
mit Aceton fixiert, dann in PBS rehydratisiert.
-
Die
Gewebe wurden gleichzeitig 16 h bei 4°C mittels 1:100 verdünntem anti-Thy
1.2+-Antikörper von der
Maus markiert. Die Gewebeproben wurden dreimal 60 min in PBS gewaschen,
dann 60 min bei 37°C
inkubiert entweder mit an Rhodamin gekoppelten Ziege-anti-Maus-Antikörpern, 1:20
verdünnt,
oder mit an Fluorescein gekoppelten Ziege-anti-Kaninchen-Antikörpern (Fluorescein 1:20 in
PBS verdünnt.
Die Gewebe wurden dann mit PBS gewaschen, bevor sie eingedeckt oder
fixiert wurden, wie zuvor beschrieben.) Die Vergleichsproben umfassten
Epidermisblätter,
welche nicht mit primärem
Antikörper
markiert und einzig in Gegenwart der sekundären Reagenzien inkubiert worden
waren, um etwaige Kreuzreaktionen mit den mit Rhodamin und mit Fluorescein
konjugierten Antikörpern
nachzuweisen.
-
Die
Anzahl von Langerhans-Zellen Ia+ oder von
DEZ Thy 1.2+ pro Quadratmillimeter wurde
in vier peripheren Zonen derselben Oberfläche für jedes Epidermisblatt durch
Immunfluores zenz mit einem zu diesem Zweck ausgerüsteten konfokalen
Zeiss-Mikroskop bestimmt. Es wurden in jeder der Gruppen mindestens
vier Tiere untersucht. Die Dichte der Langerhans-Zellen Ia+ und
der DEZ Thy 1.2+ ist für jede Messung angegeben.
-
3 – Ergebnisse
-
Die
in der Tabelle I zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass ETF und
dessen Homologe, verabreicht auf topischem Wege an C57 BL/6-Mäuse, in
hoch signifikanter Weise die Aktivität der residenten oder standortfesten
Zellen des kutanen Immunsystems erhöhen.
-
Man
beobachtet insbesondere eine signifikante Erhöhung der Phänotypen der dendritischen Langerhans
Ia+-Epidermiszellen (HLADR) bei Dosen von
0,1 bis 1 Nanogramm.
-
Parallel
dazu beobachtet man bei gleichen Dosen gleichfalls eine signifikante
Erhöhung
der Aktivität der
epidermalen Thymozyten vom Phänotyp
Thy 1.2+, d. h. von ETAF abhängigen Zellen.
-
Die
kutane Immunantwort ist abhängig
von der Aktivität
der kernhaltigen Keratinozyten, welche ETAF und die Vermittlersubstanzen
von Immunität
sezernieren, d. h. das zweite Signal, ohne welches es keine normalen
physiologischen Immunfunktionen gibt (Immuno-Dermatologie L. D. H.). Man kann annehmen,
dass ETF und seine Homologen die Immunfunktionen der Epidermis durch
Aktivierung der Keratinozyten der basalen Schichten auf physiologische
Weise wieder herstellen, im Gegensatz zu der exogenen Stimulierung
durch Antigene.
-
-
BEISPIEL 5 – MESSUNG DER AKTIVITÄT VON ETF
NR. IX AUF DIE AUS PRIMARKULTUR STAMMENDEN KERATINOZYTEN DER MENSCHLICHEN
HAUT
-
I. Material und Methode
-
1 – Zellmodell
-
Kultur
von normalen menschlichen Keratinozyten
- – Quellen:
Mammaplastik
- – Primärkultur:
Die frisch und vollständig
aseptisch als Biopsien gewonnenen Gewebe werden bei +4°C in 0,25%
Trypsin verdaut, um die Epidermis von der Dermis zu trennen.
-
Die
Epidermis wird dann unter sanfter mechanischer oder enzymatischer
Einwirkung dissoziiert, um individualisierte Zellen zu erhalten.
Allein die Basalzellen werden in der Lage sein, sich in vitro zu
vermehren.
-
Die
Kultur wird in kontrollierter feuchter Atmosphäre (95% O2–5% CO2) bei 37°C
ausgeführt.
-
Bei
einer Monolager-Kultur liegt die Calciumkonzentration zwischen 0,05
und 0,1 mM. Unter diesen Bedingungen proliferieren die Keratinozyten
schnell, bilden aber keine Schichten oder Lager. Die Synthese der Keratinozyten
wird beibehalten. Die interzellulären Räume sind breit: die zellulären Verbindungen
werden durch die Kleinzotten und nicht durch die „tight-junctions” (Verschlusskontakte;
Zonula occludens) sichergestellt. Die Tonofilamente des perinukleären Raums
sind sichtbar, sie sind aber noch nicht wieder mit den Haftzotten
verbunden.
-
Die
Schichtbildung kann durch eine Erhöhung der Endkonzentration an
Calcium im Kulturmedium bis auf 1,2 M induziert werden. Dann tritt
nach 2 h die Bildung von Desmosomen auf. Der intrazelluläre Natrium- und
Kaliumgehalt nimmt ab der 12. Stunde zu, außerdem wird er durch die klassischen
Inhibitoren des Ca2+/Na+-Flusses
nicht blockiert.
-
Die
vertikale Schichtbildung ist nach 2 Tagen sichtbar und die terminale
Differenzierung kommt zum Abschluss in Zellen mit verhornter Umhüllung.
- (Hennings
und Koll. 1980).
-
2 – Analysierte
Proben
-
- I – ETF-Derivat
Nr. IX, lyophilisiert in Dextran (40 g/l), 10–6 M
in dem endgültigen
Kulturmedium.
- II – Thymopoetin
Crist. SIGMA – 106 M in dem endgültigen Kulturmedium.
- III – Vergleichsprobe:
Dextran 15.000 D – (40
g/l).
- IV – Zelluläre Proteine – Lösg. von
zermahlenem Referenz-Zellmaterial in einer Konzentration von 50 μg/ml.
-
3 – Methodik
-
Die
Kultur von menschlichen Keratinozyten wird ausgeführt, wie
von Henning und Koll. (1983) oder Fuchs und Koll. (1981) beschrieben.
Man führt
gleichfalls Luft-Flüssigkeits-Kulturen gemäß der folgenden
Methodik aus. Kollagen vom Typ I oder IV wird in das Kulturmedium
eingebracht.
-
– Kollagen-Gitter(-Lattices)
auf einem Rost
-
3T3-Fibroblasten
werden dieser Lösung
zu einer Konzentration von 1,5·105/ml zugesetzt und damit wird eine 35 mm-Petrischale
angeimpft, die dann bei 37°C
aufgestellt wird.
-
Nach
der Bildung des Gels wird Medium dergestalt zugesetzt, dass die
Gitter vollständig
bedeckt werden. Die Keratinozyten werden angeimpft und so 7 Tage
in Submerskultur gehalten.
-
In
diesem Stadium werden die Gitter (Lattices) auf rostfreie Stahlroste
transferiert. Diese Roste werden 7 bis 24 Tage in Medium enthaltende
Schalen gelegt.
-
– Künstliche
Basalmembran
-
Endothelzellen
von Rinder-Hornhaut werden auf mit Kollagen bedeckten Filtern kultiviert.
Nach Stimulierung mit einem Wachstumsfaktor vom Typ FGF sezernieren
diese Zellen Kolla gen IV und Laminin wie auch andere Moleküle, die
sich auf dem Kollagen abscheiden, wodurch eine Pseudo-Basalmembran
rekonstitutiert wird.
-
Nach
Entfernung der Rinder-Endothelzellen wird dieser Träger mit
den Keratinozyten angeimpft.
-
– Künstliche
Dermis
-
Fibroblasten
werden in ein Kollagen-Gel inkorporiert. Nach Schrumpfung des Gels
wird dieses Gitter (Lattice) mit den Keratinozyten angeimpft.
-
– Basalmembran
der Dermis
-
Fragmente
von menschlicher Haut werden durch Eintauchen während 5 Tagen in PBS bei 37°C von der
Epidermis befreit. Nach einer solchen Behandlung löst sich
die Epidermis vollständig
oberhalb der Basalmembran ab. Aufeinanderfolgende Einfrier- und
Auftauvorgänge
werden die Fibroblasten abtöten.
Dieses Gewebe, welches die Dermis und die Basalmembran umfasst,
wird als Nährschicht
(Feeder-Layer) für
die Keratinozyten dienen.
| Kultiviert
auf: | | Keratohyalin | Kerstin
67 kD |
| 1.
Kunststoff + Submerskultur | | – | – |
| 2.
Mit Koll. I oder IV bedeckter Filter | I | – | – |
| | E | – | – |
| 3.
Mit künstlicher
Basalmembran bedeckter Filter | I | – | – |
| | E | – | – |
| 4.
Künstliche
Dermis | I | ± | – |
| | E | + | ++ |
| 5.
Natürliche,
von der Epidermis befreite und abgetötete Dermis | I | ± | – |
| | E | ++ | ++ |
| I = submers/untergetaucht
E = emers/herausragend |
-
Die
Kontrolle der Differenzierung der Epidermis erfolgt durch Elektronenmikroskopie
(Prunieras, 1988), durch biochemische Analyse (Tinois und Koll.,
1993) und durch immunologische Analyse (Woodcock und Koll., 1982,
Prunieras, 1988). Diese Letztere kann anti-Involucrin-, anti-epidermale
Transglutaminase-, anti-Fillagrin- und gegen (anti) Keratine (AE1,
AE2, AE3) gerichtete Antikörper
einsetzen.
-
Die
Keratine von 48 kD sind die Proliferations-Marker.
-
Die
Keratine von 50 und 58 kD sind die permanten Marker der Keratine.
-
Die
Keratine von 56,5 und 65/67 kD sind die Differenzierungs-Marker.
-
Die
ausgewählten
Zellmarker sind die Keratine mit niedrigem Molekulargewicht von
46/47 kD, welche für
die Vermehrung der germinativen Zellen und deren zelluläre Differenzierung
spezifisch sind.
-
Die
Filaggrine sind Marker von Keratohyalin.
-
Indirekte
Fluoreszenzmarkierung gemäß der Sandwich-Technik – 48 h nach
Zugabe von Calcium zum Kulturmedium (Schichtbildung).
-
I – Primäre Antikörper „SIGMA”
-
- – Gegen
menschliches Kerstin von 46–47
kD gerichtete AK von der Ratte
- – Gegen
menschliches Kerstin von 56,5/68 kD gerichtete menschliche AK
- – Gegen
Keratohyalin (Filaggrin) gerichtete menschliche AK
-
II – Sekundäre Antikörper „SIGMA”
-
- – Gegen
Ig G2 von der Ratte gerichtete, FITC-markierte AK von der Maus
- – Gegen
menschliches IgG gerichtete, FITC-markierte AK von der Ziege.
-
– Mikroskopische
(quantitative) Bestimmungen
-
– „Mikroskop
ZEISS Confocal Laser Scanner”
-
– „Epi-fluorescent – LSM 310”
-
– Messung
der Zellmarker durch Immunfluoreszenz mit graphischer Aufzeichnung.
-
– Spektrofluorimetrische
(quantitative) Bestimmungen
-
- – „Spektrofluorimeter
Perkin Elmer LS – 50
B”
- – An Überständen von
zermahlenem Zellmaterial
-
– (Quantitative)
Bestimmungen der zellulären
Proteine
-
- – LOWRY-Technik
mittels eines Perkin-Elmer-UV-Spektrophotometers (Überstände von
zermahlenem Zellmaterial)
-
II Ergebnisse
-
Die
Tabellen Nr. II und III fassen die Aktivität des „ETF”-Peptids Nr. IX hinsichtlich
der Vermehrung der germinativen Zellen der Basal- und Suprabasalschichten
der Epidermis – „junge
Keratinozyten” – zusammen.
-
Die
Fluoreszenzintensität
der mit ETF Nr. IX behandelten Zellen wird im Vergleich zu der Fluoreszenzintensität der Vergleichsproben
bestimmt.
-
Man
beobachtet eine signifikante Erhöhung
der germinativen prä-keratinozytären Zellen
und von deren Stoffwechselaktivität, insbesondere auf der Ebene
der Synthesen von Kerstin mit niedrigem Molekulargewicht und der
Keratohyaline „Filaggrine” mit ähnlichen
Strukturen zu jener der Medulla des Thymus. Tabelle II – „Zusammenfassung” ”Wirkung
von ETF auf die Synthese von Kerstin mit 46–47 kD und zellulären Proteinen
durch Keratinozyten verglichen mit einer Vergleichsprobe (ausgedrückt in Mikrogramm/ml)
| Produkt | Konzentration
M | Kerstin/Protein
Mittelwert | Kerstin/Protein Standardabweichung | Stimulierung
% |
| Thymopoetin | 10–6 | 94,8 | 3,4 | 19 |
| ETF Nr.
IX | 10–6 | 151,5 | 14,9 | 90 |
| 10–8 | 156,0 | 13,2 | 95 |
| 10–10 | 148,9 | 22,9 | 86 |
| 10–12 | 113,0 | 5,6 | 41 |
Tabelle III – „Zusammenfassung” Wirkung von ETF auf die Synthese von Keratohyalin
und Proteinen durch Keratinozyten verglichen mit einer Vergleichsprobe
(ausgedrückt
in Mikrogramm/ml)
| Produkt | Konzentration
M | Keratohyalin/Protein
Mittelwert | Kerstin/Protein Standardabweichung | Stimulierung |
| Thymopoetin | 10–6 | 4,99 | 0,54 | 35 |
| ETF Nr.
IX | 10–6 | 5,97 | 0,12 | 62 |
| 10–8 | 6,75 | 0,66 | 83 |
| 10–10 | 5,13 | 0,25 | 39 |
| 10–12 | 5,11 | 0,39 | 38 |
-
BEISPIEL Nr. 6 – WIRKUNG VON ETF AUF DIE GRANULOZYTEN
DES „MONONUKLEAREN
PHAGOZYTEN-SYSTEMS”
-
I – Einführung
-
Die
Immunantwort der Epidermis ist abhängig von den Keratinozyten
und den Langerhans-Zellen
in Kombination mit anderen Zelllinien „Granulozyten-Thymozyten” u. s.
w...
-
Die
Langerhans-Zellen sind beträchtlich
weniger fähig
zu Phagozytose als die Keratinozyten, was diese formell von den
Makrophagen unterscheidet”.
-
Sie
sind phänotypisch
und funktional den Schleierzellen („Veiled Cells”) der afferenten
Lymphe und den interdigitalisierten Zellen der Lymphknoten ähnlich.
-
Die
Wirkung der Langerhans-Zellen ist das Ergebnis einer zellulären Kooperation,
insbesondere mit den granulozytären „Phagozyten”-Zellen
mit einem Schwerpunkt bei den Keratinozyten.
-
Es
war dementsprechend interessant, die Aktivität von ETF hinsichtlich der
phagozytären
Aktivität
der polymorphkernigen Granulozyten und der diesen nahestehenden
zellulären
Systeme, insbesondere der NK-Zellen (ENKAF, Epidermal Cell Derived
Natural Killer Activating Factor) zu bestimmen.
-
II – Wirkung von ETF auf die Granulozyten
des Bluts
-
1) Protokoll:
-
Polymorphkernige
Zellen des peripheren menschlichen Bluts (neutrophile Granulozyten)
in einer Konzentration von 106 Zellen/ml
werden 20 mm (min) bei 37°C
vorinkubiert vor der Zugabe von Luminol und von Teilchen von durch
Serum opsonisiertem Zymosan.
-
Die
Chemolumineszenz wird alle 3 Minuten nach der Zugabe des letzteren
Reagens gemessen. Die Ergebnisse repräsentieren den Mittelwert von
5 unabhängigen
Messungen für
jeden Punkt. (Standardabweichung unter 5% des Mittelwerts).
-
Es
werden zwei Systeme eingesetzt:
-
A. Das Induktor-Mittel ist das Peptid
ETF Nr. 1, welches während
der gesamten Dauer des Versuchs anwesend ist..
-
Normale
Granulozyten des peripheren menschlichen Bluts, angereichert durch
Sedimentation in Dextran und befreit von den Erythrozyten durch
hypotonische Lyse. ETF wird in Konzentrationen von 10,1 und 0,1 μg/ml getestet.
-
B. Das Induktor-Mittel ETF wird nach der
Vorinkubation und vor der Zugabe der chemolumineszierenden Reagenzien
durch Waschen entfernt.
-
Normale
Granulozyten des peripheren menschlichen Bluts, gereinigt durch
Dekantation auf Dextran und hypotonische Lyse der Erythrozyten.
ETF wird 20 mm (min) bei 37°C
mit den Granulozyten inkubiert, dann vor der Zugabe von opsonisiertem
Zymosan und von Luminol durch Waschen entfernt.
-
2 – Ergebnisse:
(die Werte repräsentieren
den Mittelwert von 5 Messungen)
-
System A
| Behandlung der Zellen | Chemolumineszenzwerte
nach: (mm) (min) |
| 3 | 6 | 9 | 12 | 15 | 18 | 21 |
| PBS | 22966 | 77598 | 140423 | 178951 | 198063 | 191781 | 188531 |
| ETF 10 μg/ml | 79358 | 140100 | 170947 | 183578 | 174710 | 160718 | 137798 |
| ETF 1 μg/ml | 59867 | 138846 | 183578 | 207713 | 203449 | 188901 | 168813 |
| ETF 0,1 μg/ml | 29205 | 86761 | 143463 | 176924 | 193589 | 188573 | 179449 |
System B
| Behandlung der Zellen | Chemolumineszenzwerte
nach: (mm) (min) |
| 6 | 9 | 12 | 15 | 18 |
| PBS | 69924 | 114751 | 144838 | 162594 | 164750 |
| ETF 10 μg/ml | 103105 | 119677 | 125307 | 119952 | 112499 |
| ETF 0,1 μg/ml | 100532 | 124819 | 134788 | 129950 | 133707 |
-
3 – Schlussfolgerungen
-
- A. ETF hat einen beträchtlichen Einfluss auf die
Potenzierung der Chemolumineszenz ab den ersten Augenblicken bei
Konzentrationen von 10 und 1 μg/ml.
- B. Sogar nach dem Waschen induziert ETF eine signifikante Aktivierung
der Granulozyten bei 10 und 0,1 μg/ml.
-
BEISPIEL 7 – WIRKUNG VON ETF AUF DIE DNA-SYNTHESE
-
I – Protokoll – Probenpeptid
ETF Nr. VII
-
Ein
Pool von normalen splenischen Zellen von der Maus wird erhalten
und in Mikroplatten mit ETF allein in steigenden Dosen inkubiert.
Die DNA wird am Tag 1 (d1), Tag 3 (d3) und Tag 5 (d5) quantitativ
bestimmt.
-
Die
Ergebnisse sind in der 1 aufgeführt.
-
II – Schlussfolgerungen
-
ETF
zeigt eine sehr deutliche Reaktion proportional zur Dosis. Die höchste eingesetzte
Dosis (10 μg/ml)
liefert die stärkste
DNA-Synthese an allen Tagen der Kontrolle mit einem Maximum am 3.
Tag. Es muss gleichwohl angemerkt werden, dass die Grundlinienwerte
am 3.
-
Tag
höher sind,
die spezifische Reaktion vielleicht in der Realitität zu einem
früheren
Zeitpunkt eintritt.
-
BEISPIEL 8 – WIRKUNG VON ETF AUF ZELLEN,
DIE LYSE-BEREICHE BILDEN (PFC, PLAQUE-BILDENDE ZELLEN)
-
I Protokoll
-
50
Balb/C-Mäusen,
die 5 μg
ETF auf subkutanem Wege erhalten, werden auf intravenösem Wege
20, 10 und 3 Tage nach dem ETF oder 2 Tage zuvor 108 GRM
(Schaferythrozyten) in 0,1 ml PBS injiziert. PFC-Technik von Cunningham
und Szenberg.
-
II Ergebnisse
-
Anzahl von PFC pro 10
6 splenische
Zellen
| Behandlung | Zeitpunkt der Immunstimulation | Anzahl von
PFC an |
| d
+ 3 | d
+ 4 | d
+ 5 | d
+ 6 |
| GRM-Vergleichsprobe ETF 5 μg, subkutan | 0 | 86 | 509 | 374 | 119 |
| d – 20 | 69 | 438 | 318 | 84 |
| d – 10 | 323 | 823 | 337 | 104 |
| d – 3 | 57 | 399 | 353 | 129 |
| d
+ 2 | 119 | 410 | 336 | 135 |
-
III Schlussfolgerungen:
-
Man
beobachtet eine Reaktion, die ein Maximum an d + 4 zeigt, mit einer
bedeutenden, sehr signifikanten Erhöhung der Anzahl von PFC bei
den Tieren, die 10 Tage vor dem Antigen das ETF erhalten hatten.
-
BEISPIEL 9 – WIRKUNG VON ETF AUF NK-ZELLEN
-
I Wirkung von ETF auf NK-Zellen – topische
Verabreichung
-
1 – Allgemeines
Protokoll bei topischer Verabreichung:
-
-
Zielzellen:
-
- – YAC-1,
empfindlich gegenüber
NK
- – P
815, nicht empfindlich gegenüber
NK
- – ETF
Nr. VII
-
Die
Mäuse erhielten
während
14 aufeinanderfolgenden Tagen jeden Tag auf topischem Wege 15 μg ETF in
Lösung
in Propylenglycol in einer Konzentration von 10–5 M/ml.
Am 18. Tag wird eine identische Wiederholungsdosis verabreicht.
-
Die
Messung der lytischen Aktivität
erfolgt alle drei Tage durch Zählung
von freigesetztem 51Cr für Verhältnisse von Effektorzellen:
Zielzellen von 200:1, 100:1, 50:1, 25:1 während 4 h Inkubation.
-
Die
Ergebnisse mit den NK-Zellen bei topischer Verabreichung sind in
den 2 und 3 aufgeführt.
-
Die
Ergebnisse sind extrem deutlich. Man stellt abhängig von der Zeit nach dem
Beginn der Behandlung mit ETF eine hoch signifikante Erhöhung der
NK-Aktivität
fest. Diese Aktivität,
die ab dem dritten Tag nachweisbar ist, wird am 6. und am 9. Tag
sehr bedeutend und bleibt auf einem sehr hohen Niveau während der
gesamten Dauer des Experiments (21 Tage).
-
2 – Schlussfolgerungen
-
Zu
keinem Moment des Experiments ist irgendwelche nicht-spezifische
Zytotoxizität
hinsichtlich der P 815-Zellen nachweisbar. Dies schließt aus,
dass die Verabreichung von ETF zur Induktion von Zellen von nicht-spezifischer
zytolytischer Natur oder zur polyklonalen Aktivierung der zytolytischen
T-Zellen führt.
-
II Wirkung von ETF auf NK-Zellen – in vitro
-
1 – Protokoll
des „in
vitro”-Versuchs
-
Normale
splenische Zellen von CBA-Mäusen.
Brutschrank bei 37°C
+ CO2, 107 Zellen
pro ml RPMI 1640-Medium + 5% fötales
Kälberserum.
Inkubation mit variablen Mengen der zu untersuchenden Substanz. Zielzellen
YAC-1.
-
Die
Messung der Lyse erfolgt durch Zählung
des 51Cr, welches für Verhältnisse von Effektorzellen/Zielzellen
von 200:1, 100:1, 50:1, 25:1 während
4 h Inkubation freigesetzt wird.
-
Die
Ergebnisse sind in 4 aufgeführt.
-
2 – Schlussfolgerungen,
-
ETF
stimuliert die Aktivität
der NK-Zellen in vitro auf zur Dosis proportionale Weise sehr stark.
-
Bei
einer Konzentration von 0,1 μg/ml
liegt die Aktivität
von ETF noch sehr deutlich über
25 μg/ml
von poly I:C.
- (Aktivität
wenigstens 100-fach höher
als jene des Referenzprodukts poly I:C, Interferon-Induktor).
-
III Wirkung von ETF auf NK-Zellen – Verabreichung
durch Injektion
-
1 – Allgemeines
Protokoll bei Verabreichung durch Injektion
-
- CBA/H-Mäuse
von 4 bis 5 Monaten (140 Mäuse)
-
Zielzellen:
-
- – YAC-1,
empfindlich gegenüber
NK (Lymphom induziert/Moloney-Virus)
- – P
815, nicht empfindlich gegenüber
NK (DBA/2-Mastozytom)
-
Die
zu untersuchende Substanz (ETF Nr. VII) wird auf intraperitonealem
Weg in 0,2 ml PBS 24 h vor dem Test injiziert. Die Messung der Lyse
erfolgt durch Zählung
des 51Cr, welches für Verhältnisse von Effektorzellen:
Zielzellen von 200:1, 100:1, 50:1, 25:1 während 4 h Inkubation freigesetzt
wird.
-
2 – Ergebnisse
NK/Verabreichung durch Injektion
-
Die
Ergebnisse der Aktivität
einer Stimulierung der NK-Zellen durch ETF sind in der 5 aufgeführt. Sie zeigen eine sehr signifikante
(P < 0,01), starke
Aktivierung der NK-Zellen bei den Tieren, die ETF (15 mg/intraperitoneal)
erhalten hatten, bezogen auf die Vergleichstiere. Keine nicht-spezifische
Zytotoxizität
gegenüber den
P815.
-
In
der 6 sieht man, dass die Aktivierung
der NK-Zellen durch ETF auf eine Wirkung als Induktor von Interferon
zurückzuführen ist.
Man beobachtet eine drastische Verringerung der NK-Zellen während der gleichzeitigen
Verabreichung von anti-Interferon (α-IF).
-
Die
Kinetik der Antwort der NK-Zellen an den Tagen 1, 3 oder 8 nach
der Injektion bezogen auf eine PBS-Vergleichsprobe ist in 7 gezeigt.
Die Stimulierung der NK-Zellen durch ETF ist bei Verabreichung durch
Injektion von kurzer Dauer.
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Bei
den jungen Tieren (7 bis 9 Monate) stimuliert ETF zugleich die NK-
und die Prä-NK-Zellen
auf identische Weise zu Dosen von Tiloron von 1 mg pro Tier.
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LEGENDEN DER FIGUREN
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1:
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2:
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- ETF, NK-Zellen/topische Verabreichung
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3:
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- ETF, NK-Zellen/topische Verabreichung
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4:
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- ETF: NK-Zellen „in
vitro”
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Vergleich
ETF 0,1 → 100 μg/ml mit
Poly I: C 25 μg/ml
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5:
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- ETF, NK-Zellen, Verabreichung durch Injektion
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6:
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- ETF, NK-Zellen, Verabreichung durch Injektion
- Rolle von Interferon bei der Stimulierung von NK-Zellen durch
ETF.
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7:
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- ETF, NK-Zellen, Verabreichung durch Injektion
- Kinetik der NK-ETF-Reaktion
- Test NK 1, 3 oder 8 Tage nach (i. p.) Verabreichung von 15 μg ETF
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BIBLIOGRAPHIE
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