CN114134129B - 一种线粒体定位多肽、定位系统及其应用 - Google Patents

一种线粒体定位多肽、定位系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学基础研究领域，公开了一种线粒体定位多肽、定位系统及其应用，所述线粒体定位多肽选自：(a)由SEQ ID NO.l～3任一所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)将SEQ ID NO.l～3任一所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有线粒体定位导肽功能的衍生多肽。本发明提供的线粒体定位多肽能够将目的蛋白靶向定位于线粒体上。将所述线粒体定位多肽和目的蛋白制备成融合蛋白，可以显示线粒体探针共定位现象，用于指示线粒体的具体位置和形态，同时也可用于过表达目的蛋白并定位在线粒体上。本发明所述线粒体定位多肽对细胞无毒副作用，具有广泛应用价值。

Description

一种线粒体定位多肽、定位系统及其应用
技术领域
本发明属于生物医学基础研究领域，涉及一种线粒体定位多肽、定位系统及其应用。所述线粒体定位多肽、定位系统能够应用于线粒体相关的基础研究中过表达基因或者作为线粒体指示蛋白。
背景技术
线粒体是细胞进行三羧酸循环和氧化磷酸化的重要场所，是细胞生命活动的最主要能量来源。但是研究证明，线粒体的生命活动是受到细胞核调控的，线粒体基因组(mtDNA)虽能自身编码合成蛋白质，但其种类十分有限。迄今已知，mtDNA编码的RNA和多肽有：线粒体核糖体中2种rRNA(12S及16S)，22种tRNA，13种多肽(每种约含50个氨基酸残基)。组成线粒体结构和参与三羧酸循环等能量代谢和电子传递活动的蛋白质，绝大多数都是由核DNA编码并在细胞质核糖体上合成后再通过线粒体定位信号肽运送到线粒体中的指定位置。所以，核基因组正是通过编码的线粒体定位信号实现了对线粒体生命活动的控制。
现在市场上的线粒体指示染料只对活细胞染色有效果，而对于含有细胞固定、通透的免疫荧光等显色效果很不理想，而且抗体和染料的荧光很容易发生猝灭，效果不佳。
发明内容
本发明的目的在于提供一种线粒体定位信号肽、编码基因及其应用，该线粒体定位多肽可将目的蛋白靶向定位于线粒体。本发明首次提出的具体序列的线粒体定位多肽，通过基因克隆技术和荧光蛋白融合在一起，可以实现指示线粒体的位置和形态的功能，而且可以通过过表达感兴趣的目的蛋白并定位在线粒体上，为研究目的蛋白与线粒体的相关功能提供新的载体。
本发明一方面提供了一种线粒体定位多肽，所述多肽选自如下序列：
(a)由SEQ ID NO.l～3任一所示的氨基酸序列组成的多肽；
(b)将SEQ ID NO.l～3任一所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有线粒体定位导肽功能的衍生多肽。
本发明另一方面是提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括如上所述的线粒体定位多肽和目的蛋白。
所述融合蛋白中：
所述线粒体定位多肽位于所述目的蛋白的N端或C端；优选为N端；和/或，
所述目的蛋白是荧光蛋白；优选为绿色荧光蛋白。
本发明另一方面是提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码如上任一项所述的线粒体定位多肽或如上所述的融合蛋白。
本发明所述分离的多核苷酸，所述多核苷酸的序列选自SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6中的一种或几种。
本发明另一方面是提供如上所述的分离的多核苷酸，当所述多核苷酸编码如上任一项所述的融合蛋白时，所述多核苷酸为融合基因，所述融合基因自上游至下游依次包括编码线粒体定位多肽的基因序列和编码目的蛋白的基因序列；优选地，在线粒体定位信号的末端增加一个碱基G。
本发明另一方面是提供一种构建体，所述构建体含有如上所述的分离的多核苷酸。
本发明另一方面是提供一种线粒体定位系统，所述定位系统包括如上任一项所述的线粒体定位多肽、融合蛋白、分离的多核苷酸或构建体。
本发明另一方面是一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的构建体，或所述宿主细胞基因组中整合有如上所述的分离的多核苷酸。
如上所述的线粒体定位多肽、融合蛋白、分离的多核苷酸、构建体、定位系统或宿主细胞在以下一项或几项中的应用：
制备定位线粒体或指示线粒体具体位置或形态的产品；
制备将目的蛋白定位或导入线粒体的产品；
制备在线粒体中过表达目的蛋白的产品；
制备治疗与线粒体相关疾病的药物；
制备与线粒体相关疾病的疫苗；
制备研究目的蛋白与线粒体的相互作用的产品。
本发明另一方面是提供一种将目的蛋白定位于线粒体的方法，包括以下步骤：
(a)将如上所述的编码融合蛋白的分离的多核苷酸导入靶细胞中，表达融合蛋白，从而将所述目的蛋白定位于所述靶细胞的线粒体上；或，
(b)将如上所述的融合蛋白加入靶细胞的生长环境中，从而使目的蛋白通过靶细胞的细胞膜进入所述靶细胞中，并定位于靶细胞的线粒体上；所述融合蛋白自N端至C端依次包括线粒体定位多肽和目的蛋白的氨基酸序列。
本发明所述方法中，优选地，所述的靶细胞为真核细胞。
其中所述真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。进一步地，所述真核细胞是选自哺乳动物细胞、鸟类细胞和昆虫细胞的动物细胞。更进一步地，所述宿主细胞是CHO细胞、COS、酵母细胞、昆虫Sf9细胞等。
本发明的有益效果在于，本发明提供的线粒体定位多肽、编码基因及定位系统，能够将目的蛋白靶向定位于线粒体上。将所述线粒体定位多肽和目的蛋白制备成融合蛋白，可以显示线粒体探针共定位现象，可作为指示线粒体具体位置和形态的重要研究工具，同时也为过表达目的蛋白并定位在线粒体上提供了新的载体。本发明所述线粒体定位多肽与合适的目标蛋白形成融合蛋白，通过细胞内过表达或外源加入到靶细胞生长环境中，能够增强内源及外源蛋白线粒体靶向定位的高效性和有效性，且对细胞无毒副作用，能够用于线粒体相关的研究中过表达基因或者作为线粒体指示蛋白，用于开发与线粒体相关疾病的疫苗或药物，并实现高效定向给药，具有广泛应用价值。
附图说明
图1为pcDNA3.1(+)-MCS-EGFP(pcDNA3.1-EGFP)空载质粒图谱。
图2为ATP5B质粒测序比对(151bp)。
图3为SCO1质粒测序比对(151bp)。
图4为NDUFS2质粒测序比对(151bp)。
图5为实施例4线粒体定位多肽融合绿色荧光蛋白的融合蛋白的线粒体荧光定位图。
图6为实施例5线粒体定位多肽融合绿色荧光蛋白的融合蛋白对CCK8细胞活力的影响结果图。
图7为实施例6未做PFA固定和TritonX-100通透的线粒体染料和荧光质粒指示线粒体效果对比图。
图8为实施例6经PFA固定和TritonX-100通透后的线粒体染料和荧光质粒指示线粒体效果对比图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
本发明提供了一种线粒体定位多肽(线粒体定位信号多肽)，所述多肽选自如下序列：
(a)由SEQ ID NO.l～3任一所示的氨基酸序列组成的多肽：
(b)将SEQ ID NO.l～3任一所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有线粒体定位导肽功能的衍生多肽。
所述线粒体定位多肽具有荧光蛋白定位功能，因此，可称之为线粒体荧光定位多肽。
在一实施方式中，所述线粒体定位多肽是基于ATP5B基因的线粒体定位信号蛋白，其氨基酸序列为：MLGFVGRVAAAPASGALRRLTPSASLPPAQLLLRAAPTAVHPVRDYAAQT(SEQ IDNO.1)；
所述基于ATP5B基因的线粒体定位信号DNA序列为：ATGTTGGGGTTTGTGGGTCGGGTGGCCGCTGCTCCGGCCTCCGGGGCCTTGCGGAGACTCACCCCTTCAGCGTCGCTGCCCCCAGCTCAGCTCTTACTGCGGGCCGCTCCGACGGCGGTCCATCCTGTCAGGGACTATGCGGCGCAAACAG(SEQ ID NO.4)。
在一实施方式中，所述线粒体定位多肽是基于SCO1基因的线粒体定位信号蛋白，其氨基酸序列为：MAMLVLVPGRVMRPLGGQLWRFLPRGLEFWGPAEGTARVLLRQFCARQAE(SEQ IDNO.2)；
所述基于SCO1基因的线粒体定位信号DNA序列为：ATGGCGATGCTGGTCCTAGTACCCGGACGAGTTATGCGGCCTCTGGGTGGCCAACTTTGGCGCTTCTTGCCTCGCGGACTCGAGTTTTGGGGCCCAGCCGAGGGGACTGCGAGAGTCTTGCTGAGGCAGTTCTGCGCGCGGCAAGCGGAGG(SEQ ID NO.5)。
在一实施方式中，所述线粒体定位多肽是基于NDUFS2基因的线粒体定位信号蛋白，其氨基酸序列为：MAALRALCGFRGVAAQVLRPGAGVRLPIQPSRGVRQWQPDVEWAQQFGGA(SEQ IDNO.3)；
所述基于NDUFS2基因的线粒体定位信号DNA序列为：ATGGCGGCGCTGAGGGCTTTGTGCGGCTTCCGGGGCGTCGCGGCCCAGGTGCTGCGGCCTGGGGCTGGAGTCCGATTGCCGATTCAGCCCAGCAGAGGTGTTCGGCAGTGGCAGCCAGATGTGGAATGGGCACAGCAGTTTGGGGGAGCTG(SEQ ID NO.6)。
在一些实施方式中，b)中，所述衍生多肽包括氨基酸序列与SEQ ID No.l～3任一所示的氨基酸序列具有90％以上序列同一性且具有a)限定的多肽片段的功能的多肽片段。具体的，b)中的多肽片段具体指：如SEQ ID No.l～3任一所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如SEQ ID No.l～3任一所示的氨基酸序列的功能的多肽片段，例如可以是与SEQ ID No.l～3任一所示的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性。
同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
本发明还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括如上所述的线粒体定位多肽和目的蛋白。所述融合蛋白中：
所述线粒体定位多肽位于所述目的蛋白的N端或C端；优选为N端；
所述目的蛋白是荧光蛋白；优选为绿色荧光蛋白。
当所述目的蛋白是绿色荧光蛋白时，所述线粒体定位多肽为线粒体荧光定位多肽。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码如上所述的线粒体定位多肽或如上任一项所述的融合蛋白。
在一具体实施方式中，所述多核苷酸的序列选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQID NO.6中的一种或几种。
在另一实施方式中，当所述多核苷酸编码如上任一项所述的融合蛋白时，所述多核苷酸为融合基因，所述融合基因自上游至下游依次包括编码线粒体定位多肽的基因序列和编码目的蛋白的基因序列。
本发明还提供了一种构建体，所述构建体含有如上所述的分离的多核苷酸。(所述表达载体为pcDNA3.1(+))。合适的提供上述构建体的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，上述构建体通常可以通过将上述分离的多核苷酸插入合适的载体中构建获得。
在一实施方式中，所述构建体包括载体和如上所述的融合蛋白，先将绿色荧光蛋白构建在载体上，得到自构建载体pcDNA3.1-MCS-EGFP，其结构示意图如图1所示，然后将线粒体定位多肽的编码基因构建到载体上，得到所述构建体。
在一实施方式中，所述构建体通过将如上所述的融合蛋白构建在表达载体上获得；所述构建过程中，选用上游Hind III和下游加EcoRI两酶切位点，并且为保证插入序列和EGFP蛋白表达翻译成融合蛋白而不发生框移突变，在各线粒体定位信号的末端增加一个碱基“G”。
本发明还提供了一种线粒体定位系统，所述定位系统包括如上任一项所述的线粒体定位多肽、融合蛋白、分离的多核苷酸、构建体中的一种或几种。在一实施方式中，所述线粒体定位系统为定位多肽融合荧光蛋白的线粒体定位系统。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的构建体，或所述宿主细胞基因组中整合有外源的如上所述的多核苷酸，从而可表达所述的线粒体定位多肽或融合蛋白。
本发明还提供了一种如上所述的线粒体定位多肽、融合蛋白、分离的多核苷酸、构建体、定位系统或宿主细胞在以下一项或几项中的应用：
制备定位线粒体或指示线粒体具体位置或形态的产品；
制备将目的蛋白定位或导入线粒体的产品；
制备在线粒体中过表达目的蛋白的产品；
制备治疗与线粒体相关疾病的药物；
制备与线粒体相关疾病的疫苗；
制备研究目的蛋白与线粒体的相互作用的产品。
所述产品包括但不限于是试剂盒、芯片、核酸膜条、药物、疫苗等。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的线粒体定位多肽、融合蛋白、分离的多核苷酸、构建体、定位系统或宿主细胞中的一种或几种。在一实施方式中，所述试剂盒还包括线粒体探针。
本发明还提供了一种治疗与线粒体相关疾病的药物或疫苗，所述药物或疫苗包含如上所述的线粒体定位多肽、融合蛋白、分离的多核苷酸、构建体、定位系统或宿主细胞中的一种或几种。所述药物或疫苗可实现高效定向给药。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物除包含如上所述的活性成分如线粒体定位多肽、融合蛋白、分离的多核苷酸、构建体、定位系统、宿主细胞或宿主细胞的培养物中的一种或几种外，还包括以及任选的一种或多种药学上可接受的载体、介质。所述可接受的载体、介质例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，PEG等)、非离子表面活性剂(吐温80，HCO-50)等。本领域技术人员可以根据病症的严重程度和受者的健康情况及年龄的不同考虑施用的有效量。有效量通常可在0.01ng/kg体重-约100mg/kg体重之间变动。
本发明所提供的活性成分或含所述活性成分的药物组合物可以适应于任何形式的给药方式，可以是口服或胃肠外给药，例如，可以是经肺、经鼻、经直肠和/或静脉注射，更具体可以是真皮内、皮下、肌内、关节内、腹膜内、肺部、口腔、舌下含服、经鼻、经皮、阴道、口服或胃肠外给药；注射给药包括静脉注射、肌内注射和皮下注射等，经皮给药等。
如本文所用，所述药物组合物的剂型选自：注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、滴剂、糖浆、气雾剂或粉雾剂等，再例如，适合于胃肠外给药的制剂形式可以是包括但不限于溶液、悬浮液、可复水的干制剂或喷雾剂等，再例如，适合于直肠给药的通常可以是栓剂，再例如，适合注射给药的可以是注射剂、注射用无菌粉末等。
本发明中，上述药物或组合物等中，所述活性成分可以是作为单一有效成分，也可以与其他活性组分进行组合使用。
本发明还提供了一种将目的蛋白定位于线粒体的方法，包括以下步骤：
(a)将如上所述的编码融合蛋白的分离的多核苷酸导入靶细胞中，表达融合蛋白，从而将所述目的蛋白定位于所述靶细胞的线粒体上；或，
(b)将如上所述的融合蛋白加入靶细胞的生长环境中，从而使目的蛋白通过靶细胞的细胞膜进入所述靶细胞中，并定位于靶细胞的线粒体上；所述融合蛋白自N端至C端依次包括线粒体定位多肽和目的蛋白的氨基酸序列；
优选地，所述的靶细胞为真核细胞。
本发明还提供了一种治疗与线粒体相关疾病的方法，所述方法包括，向个体中导入治疗有效量的如上所述的线粒体定位多肽、融合蛋白、分离的多核苷酸、构建体或定位系统。在一实施方式中，所述线粒体定位多肽、融合蛋白、分离的多核苷酸、构建体或定位系统与治疗线粒体相关疾病的药物共同施用。在另一实施方式中，所述线粒体定位多肽、融合蛋白、分离的多核苷酸、重组表达载体或定位系统通过将治疗线粒体相关疾病的药物定位于线粒体，实现线粒体相关疾病的治疗。
本发明中，所述线粒体相关疾病包括但不限于是遗传病、恶性肿瘤、血液病，病毒性感染、寄生虫感染、细菌感染等。
本发明针对定位信号融合荧光蛋白的线粒体定位系统设计合成了3个线粒体定位信号，分别基于ATP5B、SCO1和NDUFS2基因，该3个线粒体定位信号融合绿色荧光蛋白的融合蛋白均可以很好地显示线粒体探针共定位现象，从而研究目的蛋白与线粒体的某些相关功能。
如本文所用，如本文所用，术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本发明中可互换地使用，并且表示期望对其进行诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，特别是人。“受试者”可以是对之施用或施加所提供的组合物、方法、试剂盒、装置和系统的生物体或所述生物体的一部分或组分。例如，所述受试者可以是哺乳动物或所述哺乳动物的细胞、组织、器官或一部分。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用，并且它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。多核苷酸的实例包括但不限于如下这些：基因或基因片段(包括探针，引物，EST或SAGE标签)，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转运RNA，核糖体RNA，核酶，cDNA，dsRNA，siRNA，miRNA，重组多核苷酸，分支多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的DNA，任何序列的分离的RNA，核酸探针和引物。多核苷酸也包含经过修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。
本发明中，“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。
实施例1筛选线粒体定位的蛋白序列
分析线粒体相关蛋白的序列信息，筛选线粒体定位信号序列，如表1所示：
表1线粒体定位信号蛋白序列
Figure BDA0003363737360000101
实施例2DNA序列合成设计
以自构建质粒pcDNA3.1-MCS-EGFP为载体，选用上游Hind III和下游加EcoR I两酶切位点，并且保证插入序列和EGFP蛋白表达翻译成融合蛋白而不发生框移突变或者提前终止翻译过程，在各线粒体定位信号的末端增加一个碱基“G”。三种线粒体定位信号的基因DNA序列如表2所示：
表2线粒体定位信号DNA序列
Figure BDA0003363737360000102
Figure BDA0003363737360000111
实施例3构建融合表达质粒
转移表达载体和质粒测序比对。实施例2中获得的三种线粒体定位信号DNA经HindⅢ和EcoRⅠ在37℃水浴双酶切2h后，再次以1％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。同样pcDNA3.1(+)-MCS-EGFP空载质粒(图1)也经HindⅢ和EcoRⅠ在37℃水浴双酶切2h，经双酶切后的片段和载体经过T4 DNA连接酶在16℃下连接过夜。将连接好的片段移至DH5α感受态大肠杆菌中，冰浴5min，42℃水浴1min后立即冰浴5min，加入600μL空白LB培养基在37℃下摇菌1h，1200rpm离心3min，弃上清，保留20μL吹匀后涂布到氨苄抗性的LB培养板上，37℃过夜培养14h。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，选取阳性克隆菌落扩大培养，抽提质粒，测序验证，通过Seqman软件比对序列信息，与预期插入片段序列一致(图2-4)。构建得到三种融合表达质粒pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP，分别为pcDNA3.1-ATP5B-(MTS)-EGFP、pcDNA3.1-SCO1-(MTS)-EGFP、pcDNA3.1-NDUFS2-(MTS)-EGFP。
实施例4荧光实验验证线粒体定位信号
利用已构建的pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP融合表达质粒，Lipo3000转染Hela细胞，4-6h换液，24h后用MitoTracker-Red染色指示线粒体(碧云天，货号：C1035)，观察线粒体定位情况。具体步骤包括：
在24孔板中每孔加入2x10^4个Hela细胞，培养24h后换成OPTI-MEM(Gibco，货号：31985088)培养，分别在两管50μL OPTI-MEM中单独加入pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP融合表达质粒250ng、0.5μL Lipo3000(Invitrogen，货号：L3000150)，分别在室温放置5min，再将含有质粒的OPTI-MEM加入到含有Lipo2000的OPTI-MEM中，轻轻吹匀后37℃孵育30min，每10min混匀一下。将其分为两份均匀铺到24孔板中，培养4-6h后换成10％FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO2培养24h。
MitoTracker-Red用空白DMEM稀释后染色细胞，37℃染色30min，用PBS洗两遍后在荧光显微镜下观察，拍照记录细胞内的MTS-EGFP的定位情况。荧光定位结果如下所示，定位信号ATP5B、SCO1和NDUFS2融合绿色荧光蛋白均可以和线粒体指示试剂MitoTracker-Red的红色荧光发生共定位，重叠后的荧光为黄色荧光(如图中Merged-Yellow)，显示二者发生共定位现象(图5)。
绿色荧光为自发绿色荧光蛋白荧光，红色为线粒体探针荧光，发生共定位表示融合蛋白定位在线粒体上。可见，ATP5B、SCO1和NDUFS2融合绿色荧光蛋白可以显示线粒体探针共定位现象。
实施例5线粒体定位融合蛋白对细胞增殖的影响。
实验组：在24孔板中每孔加入8x104个Hela细胞，培养24h后换成OPTI-MEM(Gibco，货号：31985088)培养，分别在两管50μL OPTI-MEM中单独加入pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP融合表达质粒250ng、0.5μL lipo3000(Invitrogen，货号：L3000150)，各自室温放置5min，再将含有质粒的MEM加入到含有Lipo3000的MEM中，轻轻吹匀后37℃孵育30min，每10min混匀一下。将其分为两份均匀铺到24孔板中，培养4-6h后换成10％FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO2培养48h。去除细胞上清，通过加入CCK8(同仁化学)工作液，37℃反应2小时后酶标仪在450nm处检测吸光度值。如图6所示，线粒体定位信号融合荧光蛋白不影响细胞的正常增殖速率。
空白组：操作同上，不同之处在于转染空载质粒pcDNA3.1(+)-EGFP，其他操作和实验组相同。
实施例6线粒体定位信号融合蛋白与线粒体指示染料染色效果对比
线粒体定位信号融合蛋白组：在24孔板中每孔加入2.5x104个Hela细胞，培养24h后换成OPTI-MEM(Gibco，货号：31985088)培养，分别在两管50μL OPTI-MEM中单独加入实施例3构建得到的pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP(如pcDNA3.1-SCO1-(MTS)-EGFP)融合表达质粒250ng、0.5μL lipo3000(Invitrogen，货号：L3000150)，各自室温放置5min，再将含有质粒的MEM加入到含有Lipo3000的MEM中，轻轻吹匀后37℃孵育30min，每10min混匀一下。将其均匀铺到24孔板中，培养4-6h后换成10％FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO2培养24h。去除细胞上清，用1xDPBS洗涤一次，拍摄荧光图片，如图7所示。加入500μL 4％PFA室温固定20min。弃上清液，1xDPBS洗涤一次后，加入0.2％TritonX-100通透20min。弃上清液，1xDPBS洗涤一次后，加入10μg/mL DAPI染色10min。弃染色液后0.1％PBST洗涤两次，拍摄荧光图片，如图8所示。
线粒体指示染料组：操作同上，不同之处在于转染空载质粒pcDNA3.1(+)空载质粒，转染培养24h后，通过市场上某种线粒体指示荧光染料对活细胞进行染色(某品牌MitoTracker-Green，工作浓度为0.2μM)，拍摄荧光图片，如图7所示。加入500μL 4％PFA室温固定20min。弃上清液，1xDPBS洗涤一次后，加入0.2％TritonX-100通透20min。弃上清液，1xDPBS洗涤一次后，加入10μg/mL DAPI染色10min。弃染色液后0.1％PBST洗涤两次，拍摄荧光图片，如图8所示。
结果如图7和图8所示，未经PFA固定和TritonX-100通透的情况下，荧光染料MitoTracker-Green和线粒体定位信号融合蛋白(NDUFS2-EGFP、ATP5B-EGFP、SCO1-EGFP)的绿色荧光信号强度相差无几，可以清晰地指示线粒体。但是荧光染料MitoTracker-Green的绿色荧光经固定通透等实验操作后出现荧光衰减(图7中MitoTracker-Green的绿色荧光与图8中MitoTracker-Green的绿色荧光相比较)，非特异背景加重的情况；线粒体定位信号融合蛋白(NDUFS2-EGFP、ATP5B-EGFP、SCO1-EGFP)经固定通透等实验操作后未出现荧光衰减，非特异背景加重的情况。采用本发明实施例3构建的融合表达质粒表达的线粒体定位信号融合绿色荧光蛋白，用于指示线粒体比荧光染料MitoTracker-Green更加准确清晰(图8中MitoTracker-Green的绿色荧光和其他融合蛋白NDUFS2-EGFP、ATP5B-EGFP、SCO1-EGFP的绿色荧光相比较)，对PFA、TritonX-100等实验试剂的抗干扰性强，更适合指示线粒体位置和形态等用途。
综上所述，本发明线粒体荧光定位多肽可以显示线粒体探针共定位现象，且对细胞无毒副作用，能够用于线粒体相关的基础研究中过表达基因或者作为线粒体指示蛋白。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具广泛应用价值。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 上海生物芯片有限公司
<120> 一种线粒体定位多肽、定位系统及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Leu Gly Phe Val Gly Arg Val Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Arg Arg Leu Thr Pro Ser Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gln Leu Leu
20 25 30
Leu Arg Ala Ala Pro Thr Ala Val His Pro Val Arg Asp Tyr Ala Ala
35 40 45
Gln Thr
50
<210> 2
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgttggggt ttgtgggtcg ggtggccgct gctccggcct ccggggcctt gcggagactc 60
accccttcag cgtcgctgcc cccagctcag ctcttactgc gggccgctcc gacggcggtc 120
catcctgtca gggactatgc ggcgcaaaca g 151
<210> 3
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Met Leu Val Leu Val Pro Gly Arg Val Met Arg Pro Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gln Leu Trp Arg Phe Leu Pro Arg Gly Leu Glu Phe Trp Gly Pro
20 25 30
Ala Glu Gly Thr Ala Arg Val Leu Leu Arg Gln Phe Cys Ala Arg Gln
35 40 45
Ala Glu
50
<210> 4
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggcgatgc tggtcctagt acccggacga gttatgcggc ctctgggtgg ccaactttgg 60
cgcttcttgc ctcgcggact cgagttttgg ggcccagccg aggggactgc gagagtcttg 120
ctgaggcagt tctgcgcgcg gcaagcggag g 151
<210> 5
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Ala Leu Arg Ala Leu Cys Gly Phe Arg Gly Val Ala Ala Gln
1 5 10 15
Val Leu Arg Pro Gly Ala Gly Val Arg Leu Pro Ile Gln Pro Ser Arg
20 25 30
Gly Val Arg Gln Trp Gln Pro Asp Val Glu Trp Ala Gln Gln Phe Gly
35 40 45
Gly Ala
50
<210> 6
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggcggcgc tgagggcttt gtgcggcttc cggggcgtcg cggcccaggt gctgcggcct 60
ggggctggag tccgattgcc gattcagccc agcagaggtg ttcggcagtg gcagccagat 120
gtggaatggg cacagcagtt tgggggagct g 151

Claims (13)

1.一种线粒体定位多肽，其特征在于，所述肽选自如下序列：
由SEQ ID NO. l、 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5任一所示的氨基酸序列组成的多肽。
2.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括如权利要求1所述的线粒体定位多肽和目的蛋白。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中，
所述线粒体定位多肽位于所述目的蛋白的N端或C端。
4.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述目的蛋白是荧光蛋白。
5.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述目的蛋白为绿色荧光蛋白。
6.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的线粒体定位多肽或如权利要求2-5任一项所述的融合蛋白。
7.如权利要求6所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列为SEQ IDNO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6中的一种。
8.如权利要求6所述的分离的多核苷酸，其特征在于，当所述多核苷酸编码如权利要求2-5任一项所述的融合蛋白时，所述多核苷酸为融合基因，所述融合基因自上游至下游依次包括编码线粒体定位多肽的基因序列和编码目的蛋白的基因序列。
9.如权利要求8所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述融合基因在线粒体定位信号的末端增加碱基G。
10.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求6-9任一项所述的分离的多核苷酸。
11.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求10所述的重组表达载体，或所述宿主细胞基因组中整合有如权利要求6-9任一项所述的分离的多核苷酸；所述宿主细胞为非植物细胞。
12.如权利要求1所述的线粒体定位多肽或权利要求2-5任一项所述的融合蛋白或权利要求6-9任一项所述的分离的多核苷酸或权利要求10所述的重组表达载体或权利要求11所述的宿主细胞在以下一项或几项中的应用：
制备定位线粒体或指示线粒体具体位置或形态的产品；
制备将目的蛋白定位或导入线粒体的产品；
制备在线粒体中过表达目的蛋白的产品；
制备治疗与线粒体相关疾病的药物；
制备与线粒体相关疾病的疫苗；
制备研究目的蛋白与线粒体的相互作用的产品。
13.一种将目的蛋白定位于线粒体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将如权利要求6-9任一项所述的分离的多核苷酸导入靶细胞中，表达融合蛋白，从而将所述目的蛋白定位于所述靶细胞的线粒体上；或，
(b)将如权利要求2-5任一项所述的融合蛋白加入靶细胞的生长环境中，从而使目的蛋白通过靶细胞的细胞膜进入所述靶细胞中，并定位于靶细胞的线粒体上；所述融合蛋白自N端至C端依次包括线粒体定位多肽和目的蛋白的氨基酸序列。
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