CN116710129A - 用于预防和/或治疗covid-19的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开整体上涉及核酸疫苗的组合物、制剂、方法和/或用途，特别是编码SARS‑CoV‑2的一种或多种蛋白质、肽、其片段或变体的核酸疫苗(例如RNA、mRNA、DNA疫苗)，用于预防、缓解和/或治疗和/或预防COVID‑19，包括减轻感染和/或症状的生理影响。

Description

用于预防和/或治疗COVID-19的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年10月9日提交的加拿大申请3,096,009、2021年1月26日提交的加拿大申请3,107,232、2021年3月23日提交的加拿大申请3,113,094、2021年4月23日提交的加拿大申请3,116,284、2021年4月30日提交的加拿大申请3,116,932、2021年5月12日提交的加拿大申请3,118,329、2021年8月9日提交的加拿大申请3,128,078、2021年8月19日提交的加拿大申请3,128,660、2021年9月28日提交的加拿大申请3,132,188的优先权，每一申请的内容均通过引用整体并入。
序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表文件名为2092_1004PCT_SL.txt，创建于2021年10月1日，大小为193,800字节。序列表的电子格式的信息通过引用以其整体并入本文。
领域
本公开整体涉及核酸疫苗、特别是编码SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、肽、其片段或变体的核酸疫苗(例如，RNA、mRNA、DNA疫苗)的组合物、制剂、方法和/或用于预防、缓解和/或治疗和/或预防COVID-19，包括减轻感染的生理作用和/或症状的用途。
背景
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)是一种新型冠状病毒毒株，其已蔓延成大流行。SARS-CoV-2感染导致2019冠状病毒病(称为“COVID-19”)，它以不同的方式影响哺乳动物，包括无症状的个体和具有从轻微症状到严重疾病或死亡的各种症状的个体。
疫苗是针对感染性疾病提供预防保护的有效方式。目前，可用于预防、缓解和/或治疗COVID-19的疫苗有限。COVID-19的治疗仅限于处置疾病的症状和/或副作用。因此，仍然强烈需要COVID-19疫苗，包括用于将疫苗递送至一系列不同靶T细胞的制剂。
发明概述
本公开提供核酸疫苗、包含核酸疫苗的组合物和制剂，以及使用它们来预防冠状病毒感染以预防、缓解和治疗COVID-19的方法。核酸疫苗可以包括编码SARS-CoV-2的至少一种抗原蛋白、其片段或变体的多核苷酸。SARS-CoV-2抗原蛋白是SARS-CoV-2的结构蛋白。结构蛋白可以是刺突蛋白(spike protein)、膜蛋白、核衣壳磷蛋白或包膜蛋白。这些结构蛋白的氨基酸序列的非限制性实例显示在表1中(SEQ ID No:1-6和15-19)。
本文提供了用于在为受试者针对COVID-19进行疫苗接种的方法中使用的COVID-19核酸疫苗，其中核酸疫苗可以包括编码SARS-CoV-2的至少一种结构蛋白或其片段的至少一种多核苷酸。
本文提供了通过以产生免疫应答的有效量施用本文所述的核酸疫苗在受试者中诱导免疫应答的方法。免疫应答可以是但不限于T细胞应答或B细胞应答。作为一个非限制性实例，免疫应答可以通过单次施用本文所述的核酸疫苗来产生。作为另一个非限制性实例，免疫应答可以通过加强施用本文所述的核酸疫苗来产生。施用药物组合物可以使受试者产生剂量反应性免疫应答(dose-responsive immune response)。作为一个非限制性实例，剂量反应性免疫应答可以包括在受试者中诱导SARS-CoV-2刺突蛋白特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM和IgA抗体中的一种或多种。作为另一个非限制性实例，剂量反应性免疫应答可以包括诱导IL-2+T细胞、IL-4+T细胞和IFN-γ+T细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，施用药物组合物不在受试者中诱导显著的不良反应。
本文提供了通过施用本文所述的核酸疫苗治疗和/或预防受试者的COVID-19的方法。
本文提供了用于治疗和预防COVID-19的核酸疫苗的药物组合物和制剂。
本文所述的核酸疫苗可以配制在一种或多种脂质纳米颗粒(LNP)中。
本文还提供了包含约0.2mg/mL mRNA的COVID-19核酸疫苗，其中所述mRNA包含具有与SEQ ID NO:7至少95％同一的核酸序列的编码区。在一些实施方案中，本文公开的核酸疫苗的mRNA包含具有SEQ ID NO:7中所示核酸序列的编码区。所述核酸疫苗可以配制为在3mL玻璃小瓶中的2mL填充物。
在一些实施方案中，对受试者施用所述核酸疫苗包括向受试者施用约5μg至约100μg的mRNA。例如，所述方法可包括向受试者施用约16μg的mRNA。或者，所述方法可以包括向受试者施用约40μg的mRNA。或者所述方法可以包括向受试者施用约100μg的mRNA。
在一些实施方案中，向受试者施用核酸疫苗包括向受试者施用约0.025mL至约0.5mL的核酸疫苗。例如，该方法可以包括向受试者施用约0.025mL的核酸疫苗，向受试者施用约0.05mL的核酸疫苗，向受试者施用约0.08mL的核酸疫苗，向受试者施用约0.2mL的核酸疫苗，或向受试者施用约0.5mL的核酸疫苗。
在所提供的方法的一些实施方案中，施用包括向受试者肌内(IM)注射核酸疫苗。
核酸疫苗可以以第一剂核酸疫苗施用于受试者，然后在约1至约5周后施用第二剂核酸疫苗。在一些实施方案中，第二剂核酸疫苗在第一剂后约4周施用。
在一些实施方案中，在接受第一剂核酸疫苗后在至少第28天(by day28)在受试者中检测到抗刺突蛋白IgG抗体。
在一些实施方案中，在接受第一剂核酸疫苗后在至少第28天在受试者中检测到抗刺突蛋白IgG抗体，并且该抗刺突蛋白IgG抗体在受试者接受第二剂核酸疫苗后在至少第42天(by day 42)增强。
在一些实施方案中，受试者的抗刺突蛋白IgG抗体增加至比来自SARS-CoV-2康复患者的血清样品的抗刺突蛋白IgG抗体的平均值高至少10倍。
在一些实施方案中，在第一剂核酸疫苗后在至少第28天在受试者中检测到SARS-CoV-2中和抗体。
在一些实施方案中，在受试者接受第二剂核酸疫苗后，SARS-CoV-2中和抗体在至少第42天得到增强。
因此，本公开提供了用于在为受试者接种COVID-19疫苗的方法中使用的COVID-19核酸疫苗，其中所述核酸疫苗包含约0.2mg/mL mRNA，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO：7至少95％同一的核酸序列，并且其中核酸疫苗被配制用于肌内(IM)注射并被配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。
在下面的描述中阐述了各种实施方案的细节。根据该描述以及根据权利要求，其他特征、目的和优点将是显而易见的。
附图简述
图1显示了使用从安大略省一名患者分离的病毒进行的SARS-CoV-2中和测定的结果。第1-5组与施用的疫苗制剂相关(见表6)。
图2显示了使用编码荧光素酶基因并可感染HEK293T细胞的SARS-CoV-2假型慢病毒的中和测定的结果。第1-5组与施用的疫苗制剂相关(见表6)。
图3显示了SARS-CoV-2临床分离物和假病毒的中和测定的ID50(可见50％感染抑制的稀释度)。
图4显示了通过ELISpot进行的IFN-γ分析，以确定T细胞对PTX-B免疫的应答。
图5显示了通过Luminex在第1天和第22天进行PTX-B初始和加强疫苗接种的小鼠中进行的细胞因子谱分析。
图6A–图6B显示了通过流式细胞术在第1天和第22天进行PTX-B初始和加强疫苗接种的小鼠中进行的细胞因子谱分析。
图7显示了用SARS-CoV-2攻击的小鼠的体重变化。
图8显示了在AAV6-hACE2转导小鼠模型中的保护效力。
图9显示了AAV6-hACE2转导小鼠模型中的肺组织病理学评分。
图10显示了来自PTX-B免疫小鼠的脾细胞的IFN-γ和IL-4ELISpot分析。
图11显示了在SARS-CoV-2中和测定中保护免受SARS-CoV-2临床分离物感染的作用。
图12显示了在假病毒中和测定中保护免受感染。
图13A–图13C显示了抗-SARS-CoV-2抗刺突蛋白抗体谱。
图14显示在仓鼠的SARS-CoV-2攻击研究中，经疫苗接种的动物中的感染性病毒水平显著较低。
图15显示了在使用SARS-CoV-2N、M和N/M蛋白核酸疫苗的共培养实验中，T细胞刺激指数的计算。
图16显示了使用编码SARS-CoV-2关切变种(variant of concern，VOC)和其他变种的S蛋白变体的假病毒的血清/抗体中和测定的表征。
图17显示了PTX-B对来自SARS-CoV-2VOC假病毒和其他假病毒变种的感染的保护效率(ID50)。
图18显示了PTX-B对来自各SARS-CoV-2VOC假病毒和其他假病毒变种的感染的保护效率(ID50)。
图19显示了PTX-B疫苗接种受试者在疫苗接种16、40或100μg剂量后在第8、28和42天的抗刺突蛋白IgG水平。
图20显示了经安慰剂治疗的对照受试者的抗刺突蛋白IgG水平与SARS-CoV-2康复患者血浆的抗刺突蛋白IgG水平的比较。
图21显示了在用16、40或100μg剂量疫苗接种后在第8、28和42天，来自PTX-B疫苗接种受试者的样品中的中和活性。
图22显示了在用16、40或100μg剂量疫苗接种后在第8、28和42天，来自PTX-B疫苗接种受试者的样品中的抗COVID-19中和抗体水平。
图23显示了在用16、40或100μg剂量疫苗接种后在第28和42天，来自PTX-B疫苗接种受试者的样品中的抗COVID-19中和抗体浓度。
图24显示了在用16、40或100μg剂量疫苗接种后在第28和42天，来自PTX-B疫苗接种受试者的抗COVID-19中和抗体的假型化病毒中和作用。
图25显示了基于Khoury模型对PTX-B的保护效力的预测。
图26显示了PTX-B诱导的针对SARS-CoV-2原始毒株以及阿尔法VOC、贝塔VOC和德尔塔VOC的中和活性。
发明详述
I.介绍
以下描述阐述了示例性组合物、方法、参数等。然而，应当认识到，这样的描述并非旨在限制本公开的范围，而是作为对示例性实施方案的描述而提供。
本文描述了核酸疫苗、特别是包含编码SARS-CoV-2的一种或多种抗原蛋白、其片段或变体的多核苷酸的核酸疫苗的多核苷酸(例如，mRNA)、组合物、制剂、用于预防、缓解和/或治疗COVID-19的方法和/或用途。抗原蛋白可以是SARS-CoV-2的结构蛋白。结构蛋白可以是刺突(S)蛋白、膜(M)蛋白、核衣壳(N)磷蛋白或包膜(E)蛋白。
在一些实施方案中，核酸疫苗的至少一种组分是编码SARS-CoV-2的抗原蛋白或抗原蛋白的片段或变体中的至少一种的多核苷酸。抗原蛋白可以是SARS-CoV-2的结构蛋白。多核苷酸可以是RNA多核苷酸，例如mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，核酸疫苗包括至少一种mRNA多核苷酸，该至少一种mRNA多核苷酸编码SARS-CoV-2的结构蛋白或结构蛋白的片段或变体中的至少一种。
在一些实施方案中，可以设计多核苷酸以编码来自SARS-CoV-2的一种或多种目标多肽或其片段或变体。SARS-CoV-2的此类目标多肽可以包括但不限于完整的多肽、多个多肽或多肽的片段或多肽的变体，它们可以独立地由来自SARS-CoV-2的多核苷酸的一个或多个区域或部分或整体编码。如本文所用，术语“目标多肽(polypeptide of interest)”是指被选择在本文描述的多核苷酸内编码或其功能受本文描述的多核苷酸影响的任何多肽。本文所述的任何肽或多肽可以是抗原性的(也称为免疫原性的)。
如本文所用，“多肽(polypeptide)”是指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然)的聚合物。如本文所用，该术语是指具有任何大小、结构或功能或来源的蛋白质、多肽和肽。在一些实施方案中，目标多肽是由本文所述的多核苷酸编码的抗原。
在一些实施方案中，编码的多肽小于约50个氨基酸，然后该多肽被称为肽。如果多肽是肽，它将是至少约2、3、4或至少5个氨基酸残基长。因此，多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、前述的片段和其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单分子或可以是多分子复合物，如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包含单链或多链多肽，如抗体或胰岛素，并且可以是缔合的(associated)或连接的。最常见地，二硫键存在于多链多肽中。术语多肽还可以应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
术语“多肽变体(polypeptide variant)”是指其氨基酸序列与天然或参考序列不同的分子。与天然或参考序列相比，氨基酸序列变体可以在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。通常，变体将与天然或参考序列具有至少约50％的同一性(同源性)，并且优选地，它们将与天然或参考序列至少约80％、或至少约85％、更优选地至少约90％、甚至更优选地至少约95％同一(同源)。
在一些实施方案中，提供了“变体模拟物(variant mimics)”。如本文所用，术语“变体模拟物”是含有将模拟所激活的序列的一个或多个氨基酸的变体模拟物。例如，谷氨酸可以用作磷酸-苏氨酸和/或磷酸-丝氨酸的模拟物。或者，变体模拟物可以导致失活或产生含有该模拟物的灭活产物，例如苯丙氨酸可以充当酪氨酸的灭活取代；或丙氨酸可以充当丝氨酸的灭活取代。
“同源性(homology)”在其应用于氨基酸序列时被定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大同源性百分比后，候选氨基酸序列中与第二序列的氨基酸序列中的残基相同的残基百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域众所周知的。应理解，同源性取决于同一性百分比的计算，但由于计算中引入的空位和罚分，其值可能不同。
“同源物(homologs)”在其应用于多肽序列时意指与第二物种的第二序列具有实质同一性的其他物种的对应序列。
如本文所用，“类似物(analogs)”意在包括因一个或多个氨基酸改变(例如氨基酸残基的取代、添加或缺失)而不同但仍保持亲本或起始多肽的一种或多种特性的多肽变体。
在一些实施方案中，本公开考虑了基于多肽的几种类型的组合物，包括变体和衍生物。这些包括取代、插入、缺失和共价变体和衍生物。术语“衍生物(derivative)”与术语“变体(variant)”同义使用，但通常是指相对于参考分子或起始分子已经以任何方式修饰和/或改变的分子。
例如，可以将序列标签或氨基酸(例如一个或多个赖氨酸)添加到本文所述的肽序列中(例如，在N末端或C末端处)。序列标签可以用于肽纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽溶解度或允许生物素化。或者，位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区域的氨基酸残基可以任选地被缺失，从而提供截短序列。某些氨基酸(例如，C末端或N末端残基)可选地被缺失，这取决于序列的用途，例如，所述序列作为可溶或连接到固相支持物的较大序列的一部分而表达。
当提及多肽时，“取代变体(substitutional variant)”是天然或起始序列中的至少一个氨基酸残基被去除并且在其同一位置处的位置中插入不同的氨基酸的多肽。取代可以是单个的，其中分子中只有一个氨基酸被取代，或者取代可以是多个，其中在同一分子中的两个或更多个氨基酸已被取代。
如本文所用，术语“保守氨基酸取代(conservative amino acid substitution)”是指通常存在于序列中的氨基酸被具有类似大小、电荷或极性的不同氨基酸取代。保守取代的实例包括非极性(疏水性)残基如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸取代另一个非极性残基。同样，保守取代的实例包括一个极性(亲水性)残基取代另一个，例如在精氨酸和赖氨酸之间、在谷氨酰胺和天冬酰胺之间以及在甘氨酸和丝氨酸之间。此外，碱性残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代另一个碱性残基，或一个酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸取代另一个酸性残基是保守取代的另外实例。非保守取代的实例包括非极性(疏水性)氨基酸残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸取代极性(亲水性)残基如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸和/或极性残基取代非极性残基。
当提及多肽时，“插入变体(insertional variant)”是具有紧邻天然或起始序列中的特定位置处的氨基酸插入的一个或多个氨基酸的那些变体。“紧邻”氨基酸意指连接至所述氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团。
当提及多肽时，“缺失变体(deletional variant)”是天然或起始氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被去除的那些变体。通常，缺失变体将具有一个或多个氨基酸在分子的特定区域中缺失。
当提及多肽时，“共价衍生物(covalent derivative)”包括用有机蛋白质或非蛋白质衍生化试剂修饰天然或起始蛋白质，和/或翻译后修饰。传统上通过使蛋白质的靶标氨基酸残基与能够与选定侧链或末端残基反应的有机衍生化试剂反应，或通过利用在选定重组宿主细胞(hosT-cell)中起作用的翻译后修饰的机制来引入共价修饰。所得共价衍生物适用于旨在鉴定对于生物活性、对于免疫测定或对于制备用于重组糖蛋白的免疫亲和纯化的抗蛋白质抗体来说重要的残基的程序中。这类修饰在本领域普通技术的范围内并且无需过度实验即可进行。
当提及多肽时，“特征(feature)”被定义为分子的基于氨基酸序列的不同组分。由本文所述的多核苷酸编码的多肽的特征包括表面表观、局部构象形状、折叠、环、半环、结构域、半结构域、位点、末端或其任何组合。
如本文所用，当提及多肽时，术语“表面表观(surface manifestation)”是指蛋白质的出现在最外表面上的基于多肽的组分。
如本文所用，当提及多肽时，术语“局部构象形状(local conformationalshape)”意指蛋白质的位于蛋白质可定义空间内的基于多肽的结构表观。
如本文所用，当提及多肽时，术语“折叠(fold)”是指在能量最小化时氨基酸序列的所得构象。折叠可在折叠过程的二级或三级水平下发生。二级水平折叠的实例包括β折叠和α螺旋。三级折叠的实例包括由于高能力的聚集或分离形成的结构域和区域。以这种方式形成的区域包括疏水袋(hydrophobic pocket)和亲水袋(hydrophilic pocket)等。
如本文所用，术语“转角(turn)”在其涉及多肽构象时意指改变肽或多肽的主链方向的弯曲并且可以涉及一个、两个、三个或更多个氨基酸残基。
如本文所用，当提及多肽时，术语“环(loop)”是指多肽的结构特征，其可以用于反转肽或多肽的主链方向。当环在多肽中存在并且仅改变主链的方向时，它可以包含四个或更多个氨基酸残基。Oliva等人已经鉴定了至少5类蛋白质环(J.Mol Bio.,l 266(4):814-830；1997)。环可以是开放的或闭合的。闭合的环或“环状(cyclic)”环可以在桥接部分之间包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。此类桥接部分可以包含在具有二硫桥的多肽中典型的半胱氨酸-半胱氨酸桥(Cys-Cys)，或者可选地，桥接部分可以是基于非蛋白质的，如本文所用的dibromozylyl试剂。
如本文所用，当提及多肽时，术语“半环(half-loop)”是指所鉴定的环的一部分，所述部分具有其所衍生自的环的至少一半数目的氨基酸残基。应理解，环可能不是总是包含偶数数目的氨基酸残基。因此，在环包含或被鉴定为包含奇数数目的氨基酸的那些情况下，奇数数目的环的半环将包含所述环的整数部分或下一个整数部分(所述环的氨基酸的数目/2+/-0.5个氨基酸)。
如本文所用，当提及多肽时，术语“结构域(domain)”是指具有一种或多种可鉴定的结构或功能特征或性质(例如，结合能力，用作蛋白质-蛋白质相互作用的位点)的多肽的基序。
如本文所用，当提及多肽时，术语“半结构域(half-domain)”意指鉴定的结构域的一部分，所述部分具有其所衍生自的结构域的至少一半数目的氨基酸残基。应理解，结构域可能不是总是包含偶数数目的氨基酸残基。因此，在结构域含有或被鉴定为包含奇数数目的氨基酸的那些情况下，奇数数目的结构域的半结构域将包含所述结构域的整数部分或下一个整数部分(所述结构域的氨基酸的数目/2+/-0.5个氨基酸)。例如，被鉴定为7个氨基酸结构域的结构域可产生3个氨基酸或4个氨基酸的半结构域(7/2＝3.5+/-0.5为3或4)。还应理解，可以在结构域或半结构域内鉴定亚结构域，这些亚结构域拥有少于其所衍生自的结构域或半结构域中鉴定的所有结构或功能性质。还应理解，包含本文的任何结构域类型的氨基酸不需要是沿多肽的主链连续的(即，不相邻的氨基酸可以在结构上折叠以产生结构域、半结构域或亚结构域)。
如本文所用，当提及多肽时，术语“位点(site)”在其涉及基于氨基酸的实施方案时与“氨基酸残基(amino acid residue)”和“氨基酸侧链(amino acid side chain)”同义地使用。位点表示肽或多肽内的可以在本文所述的基于多肽的分子内修饰、操纵、改变、衍生化或变化的位置。
如本文所用，当提及多肽时，术语“末端(termini)”或“末端(terminus)”是指肽或多肽的端尾(extremity)。这种端尾不是仅限于肽或多肽的第一个或最后一个位点，而是可以包括末端区中的另外氨基酸。本文描述的基于多肽的分子可被表征为具有N末端(以具有游离氨基(NH2)的氨基酸为末端)和C末端(以具有游离羧基(COOH)的氨基酸为末端)两者。本文所述的蛋白质在一些情况下由通过二硫键或通过非共价力(多聚体、低聚物)集合在一起的多个多肽链组成。这些种类的蛋白质将具有多个N末端和C末端。或者，多肽的末端可以被修饰以使得它们根据情况以基于非多肽的部分(如有机缀合物)开始或结束。
一旦任何特征已被鉴定或定义为待由本文所述的多核苷酸编码的多肽的所需组分，可以通过移动、交换、反转、缺失、随机化或复制来进行这些特征的多种操纵和/或修饰中的任何一种。此外，应理解，特征的操纵可以产生与对本文所述分子的修饰相同的结果。例如，涉及使结构域缺失的操纵将产生正如修饰核酸以编码小于全长分子将产生的那样的分子长度的改变。
在多肽中，术语“修饰(modification)”是指与20个氨基酸的规范组(canonicalset)相比的修饰。修饰可以是各种不同的修饰。在一些实施方案中，区域可以含有一个、两个或更多个(任选不同的)修饰。
修饰和操纵可通过本领域已知的方法来实现，例如但不限于定点诱变或化学合成期间的先验掺入(prioriincorporation)。然后可使用体外或体内测定(如本文所描述的那些)或本领域已知的任何其他合适的筛选测定来测试所得到的修饰分子的活性。
在一些实施方案中，多肽可以包含通过多轮实验发现的共有序列。如本文所用，“共有(consensus)”序列是表示允许一个或多个位点处的可变性的序列集合群体的单个序列。
如本领域技术人员所认识到，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白质也被认为在本发明的目标多肽的范围内。例如，本文提供任何蛋白质片段(意指除了比参考多肽序列短至少一个氨基酸残基之外，在其他方面与参考蛋白质相同的多肽序列)。蛋白质片段可以含有长度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或大于100个氨基酸。在另一个实例中，根据本文所述的核酸疫苗可利用包含与本文所述的任何序列为约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％同一的具有约20、约30、约40、约50或约100个氨基酸的段(stretch)的任何蛋白质。在某些实施方案中，待根据本文所述的核酸疫苗使用的多肽包括2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个突变，如本文所提供或提及的任何序列中所示。
因此，本公开的多核苷酸编码相对于参考序列含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的肽或多肽，特别是本文公开的肽或多肽序列。所述多核苷酸相对于多核苷酸参考序列还可以含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰。
参考分子(多肽或多核苷酸)可以与设计的分子(多肽或多核苷酸)具有一定的同一性。如本领域已知的术语“同一性(identity)”是指如通过比较序列确定的两个或更多个肽、多肽或多核苷酸的序列之间的关系。在本领域中，同一性还意指如通过具有两个或更多个氨基酸残基或核苷的片段之间的匹配数目确定的它们之间的序列相关性程度。同一性测量具有通过特定数学模型或计算机程序(即“算法”)解决的空位比对(如果存在)的两个或更多个序列中较小者之间的相同匹配的百分比。相关肽的同一性可通过已知方法容易地计算。这类方法包括但不限于以下文献中描述的那些：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,N.Y.,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,N.Y.,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,N.J.,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,N.Y,1991；以及Carillo等,SIAM J.Applied Math.48:1073；1988)。
在一些实施方案中，编码的多肽变体可具有与参考多肽相同或类似的活性。或者，变体可以相对于参考多肽具有改变的活性(例如，增加的或减少的)。通常，本文所述的特定多核苷酸或多肽的变体将与所述特定参考多核苷酸或多肽具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性，如通过本文所描述的和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数确定的。用于比对的这类工具包括BLAST套件的那些(Stephen F.Altschul等,Gapped BLAST and PSLBLAST:a new generation of protein database searchprograms,Nucleic Acids Res.1997,25:3389-3402)。其他工具在本文、具体地在“同一性”的定义中进行描述。
II.本公开的组合物
SARS-CoV-2
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)是一种新的冠状病毒毒株，其导致称为“COVID-19”的2019冠状病毒病。COVID-19以不同方式影响哺乳动物，包括无症状个体和具有从轻微症状到严重疾病或死亡的广泛范围症状的个体。迄今为止，约80％的COVID-19患者具有轻度至中度症状，而约20％的患者可能出现并发症，如重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症以及甚至死亡。随着医生和科学家更多地了解COVID-19及其如何影响身体，与COVID-19相关的症状列表在不断变化，但迄今为止认识到的一些症状包括发热或发冷、咳嗽、气短或呼吸困难、疲劳、身体疼痛、肌肉疼痛、头痛、喉咙痛、鼻塞或流鼻涕、恶心和/或呕吐、腹泻和新的味觉或嗅觉丧失。
SARS-CoV-2的基因组编码四种结构蛋白：刺突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白，以及非结构蛋白(命名为nsp1至nsp16)和辅助蛋白。病毒表面刺突蛋白通常是病毒进入细胞的主要介体。SARS-CoV-2刺突蛋白通过其受体结合结构域(RBD)与其受体人ACE2(hACE2)结合，并被人类蛋白酶蛋白水解激活。SARS-CoV-2的刺突蛋白的另一个特征是该蛋白在S1-S2边界处(S1为受体结合单元，S2为膜融合单元)具有功能性弗林蛋白酶裂解位点，其可预激活包括SARS-CoV-2在内的许多病毒的进入。SARS-CoV-2刺突蛋白已被用作保护性抗原，其在各种疫苗开发策略中引发中和抗体。膜蛋白和包膜蛋白用于病毒组装。包膜蛋白(E)可形成对病毒致病性很重要的同五聚体阳离子通道(homopentamericcation channel)Mandala等,Nature Structural and Molecular Bio.2020,27:1202-1208)。核衣壳蛋白将病毒基因组包装成螺旋核糖核衣壳(RNP)，并在病毒自组装中发挥作用(Chang等；The SARS coronavirus nucleocapsid protein–Forms and functions；Antiviral Res.2014；103:39-50；其内容通过引用以其整体并入本文)。此外，SARS-CoV-2中的核衣壳蛋白可以调节宿主细胞机制，并可能在病毒生命周期中发挥调节作用。
不希望受到理论的束缚，SARS-CoV-2似乎与人受体ACE2(hACE2)结合。刺突蛋白中的受体结合结构域(RBD)似乎是冠状病毒基因组中变化最大的部分。有六种RBD氨基酸已被证明对与ACE2受体的结合至关重要，并且SARS-CoV-2基因组似乎具有与人类、雪貂、猫和其他具有高受体同源性的物种的ACE2具有高亲和力结合的RBD(Anderson等；The ProximalOrigin of SARS-CoV-2；Nature Medicine,2020；26(4):450-452；其内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗的多核苷酸编码SARS-CoV-2的结构蛋白的全长多肽，或SARS-CoV-2的结构蛋白的片段或变体，所述SARS-CoV-2的结构蛋白例如刺突蛋白、核衣壳蛋白、包膜蛋白或膜蛋白。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗的多核苷酸编码SARS-CoV-2的结构蛋白如刺突蛋白、核衣壳蛋白、包膜蛋白和/或膜蛋白的多于一个片段或变体。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗的多核苷酸编码SARS-CoV-2的结构蛋白之一的突变变体，或SARS-CoV-2的结构蛋白的突变变体的片段。作为一个非限制性实例，变体可以是SARS-CoV-2的结构蛋白之一中从天冬氨酸到甘氨酸的单个氨基酸变化。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗的多核苷酸编码SARS-CoV-2的刺突蛋白的全长多肽，或SARS-CoV-2的刺突蛋白的片段或变体。作为一个非限制性实例，变体可以是SARS-CoV-2的刺突蛋白中从天冬氨酸到甘氨酸的单个氨基酸变化。作为一个非限制性实例，变体可以是SARS-CoV-2刺突蛋白中第614位(D614G)处从天冬氨酸到甘氨酸的单个氨基酸变化(Korber等；Tracking Changes in SARS-CoV-2Spike:Evidence thatD614GIncreases Infectivity of the COVID-19Virus；Cell；2020,182(4):812-827；其内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗可以编码SARS-CoV-2的结构蛋白的一种或多种蛋白质、肽、其片段或变体。表1中提供了SARS-CoV-2的结构蛋白的蛋白质、肽、片段或变体的非限制性实例。在该表中，还提供了NCBI参考编号(如果是已知的)。
表1.SARS-CoV-2的结构蛋白序列
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗可以编码至少一种结构蛋白，其具有表1中的任何序列或表1中任何序列的片段或表1中任何序列的变体的至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一些实施方案中，核酸疫苗可以是mRNA疫苗，其在翻译时产生SARS-CoV-2结构蛋白的一种或多种蛋白质、肽、其片段或变体。因此，mRNA疫苗的多核苷酸是编码SARS-CoV-2的结构蛋白的一种或多种蛋白质、肽、其片段或变体的mRNA多核苷酸。
在一个实施方案中，本文所述的mRNA疫苗的编码序列可以基于来自SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1分离株基因组(GenBank:NM908947.3，全基因组序列)的刺突(S)蛋白的编码序列。在一些实施方案中，引入从D614到G614的单个氨基酸变化的编码变化以匹配当前主要循环毒株(circulating strain)的氨基酸。
编码SARS-CoV-2的结构蛋白的蛋白质、肽、片段或变体的RNA序列的非限制性实例在表2中提供。
表2.SARS-CoV-2的刺突蛋白序列
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在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2的具有D614G突变的刺突蛋白的mRNA序列包含SEQ ID NO：7的编码区，或其片段或变体。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2的具有D614G突变的刺突蛋白的mRNA序列包含SEQ ID NO：27，或其片段或变体。
在一些实施方案中，核酸疫苗可以包含编码表1中列出的任何序列或其片段或变体的区域。核酸疫苗可以包含杂合或嵌合区域，或模拟物或变体。在一些实施方案中，核酸疫苗可以包含表3中列出的任何多核苷酸序列。
表3.治疗或预防COVID-19的核酸疫苗中使用的示例性序列
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表1-3中提及的任何序列或其变体也可以用于本文所述的记忆增强疫苗。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗编码与表1中的氨基酸序列提供的蛋白质至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的蛋白质或其片段或变体。在两个或更多个多肽序列的情况中，术语“同一(identical)”或“同一性(identity)”百分比是指相同的两个或更多个序列。多肽序列之间的同一性百分比可以使用本领域已知的算法进行，例如BLAST和CLUSTAL。
SARS-CoV-2蛋白或其片段或变体的序列可以从任何来源获得。在一些实施方案中，SARS-CoV-2蛋白或其片段或变体的序列来自能够感染人类受试者或有感染人类受试者风险的毒株。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2蛋白或其片段或变体的序列可以被修饰或优化(例如密码子优化)以在特定细胞或宿主生物体中表达。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗可以是多价疫苗。多价疫苗可以包括编码SARS-CoV-2的至少两种不同的蛋白质、肽、其片段或变体的多核苷酸。作为一个非限制性实例，多核苷酸可以编码相同或不同的结构蛋白。作为一个非限制性实例，多核苷酸可以编码相同的结构蛋白但不同的结构蛋白变体。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的全长S蛋白。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的S蛋白的片段。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)片段。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2刺突蛋白的变体。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的S蛋白序列(例如，全长、片段或变体)，其中S蛋白具有突变的弗林蛋白酶裂解位点。S蛋白弗林蛋白酶裂解位点突变体将去除S蛋白中的弗林蛋白酶裂解位点(例如，在S1和S2边界之间)或使其失效。在一些病毒包膜蛋白中，发现破坏弗林蛋白酶裂解位点可增强表达和稳定性。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的S蛋白序列(例如，全长、片段或变体)，其中S蛋白包括D614G突变。编码SARS-CoV-2的S蛋白、其片段或变体的核酸疫苗还可以包括信号肽和/或至少一个接头(例如GSG接头)序列，并且核酸疫苗中的一个或多个序列可以是密码子优化的。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的全长M蛋白。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的M蛋白的片段。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的M蛋白的拓扑结构域(例如，病毒粒子表面或病毒粒子内区域)。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的M蛋白的跨膜结构域。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的M蛋白(例如，全长蛋白或片段)的变体。编码SARS-CoV-2的M蛋白、其片段或变体的核酸疫苗还可以包括信号肽和/或至少一个接头(例如GSG接头)序列，并且核酸疫苗中的一个或多个序列可以是密码子优化的。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的全长N蛋白。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的N蛋白的片段。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的N蛋白的RNA结合结构域。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的N蛋白的二聚化结构域。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的N蛋白(例如，全长蛋白或片段)的变体。编码SARS-CoV-2的N蛋白、其片段或变体的核酸疫苗还可以包括信号肽和/或至少一个接头(例如GSG接头)序列，并且核酸疫苗中的一个或多个序列可以是密码子优化的。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的全长E蛋白。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的E蛋白的片段。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的E蛋白的拓扑结构域(例如，病毒粒子表面或病毒粒子内区域)。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的E蛋白的跨膜结构域。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的E蛋白(例如，全长蛋白或片段)的变体。编码SARS-CoV-2的E蛋白、其片段或变体的核酸疫苗还可以包括信号肽和/或至少一个接头(例如GSG接头)序列，并且核酸疫苗中的一个或多个序列可以是密码子优化的。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的两种不同结构蛋白。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的S蛋白、其片段或变体和SARS-CoV-2的M蛋白、其片段或变体。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的S蛋白、其片段或变体和SARS-CoV-2的N蛋白、其片段或变体。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的S蛋白、其片段或变体和SARS-CoV-2的E蛋白、其片段或变体。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的M蛋白、其片段或变体和SARS-CoV-2的N蛋白、其片段或变体。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的M蛋白、其片段或变体和SARS-CoV-2的E蛋白、其片段或变体。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的N蛋白、其片段或变体和SARS-CoV-2的E蛋白、其片段或变体。编码SARS-CoV-2的两种不同结构蛋白、其片段或变体的核酸疫苗还可以包括信号肽和/或至少一个接头(例如GSG接头)序列，并且核酸疫苗中的一个或多个序列可以是密码子优化的。在一些实施方案中，编码核酸疫苗的SARS-CoV-2的两种不同结构蛋白或其片段或变体的序列被构建为单个多核苷酸。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的结构蛋白片段或其变体的至少三种不同序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的两种不同的S蛋白、片段或变体序列和SARS-CoV-2的M蛋白、片段或变体序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的两种不同的S蛋白、片段或变体序列和SARS-CoV-2的N蛋白、片段或变体序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的两种不同的S蛋白、片段或变体序列和SARS-CoV-2的E蛋白、片段或变体序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的两种不同的M蛋白、片段或变体序列和SARS-CoV-2的S蛋白、片段或变体序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的两种不同的N蛋白、片段或变体序列和SARS-CoV-2的S蛋白、片段或变体序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的两种不同的E蛋白、片段或变体序列和SARS-CoV-2的S蛋白、片段或变体序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的两种不同的M蛋白、片段或变体序列和SARS-CoV-2的N蛋白、片段或变体序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的两种不同的M蛋白、片段或变体序列和SARS-CoV-2的E蛋白、片段或变体序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的两种不同的N蛋白、片段或变体序列和SARS-CoV-2的M蛋白、片段或变体序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的两种不同的N蛋白、片段或变体序列和SARS-CoV-2的E蛋白、片段或变体序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的两种不同的E蛋白、片段或变体序列和SARS-CoV-2的N蛋白、片段或变体序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的S蛋白、片段或变体序列、SARS-CoV-2的M蛋白、片段或变体序列，以及SARS-CoV-2的N蛋白、片段或变体序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的S蛋白、片段或变体序列、SARS-CoV-2的M蛋白、片段或变体序列，以及SARS-CoV-2的E蛋白、片段或变体序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的S蛋白、片段或变体序列，SARS-CoV-2的N蛋白、片段或变体序列，以及SARS-CoV-2的E蛋白、片段或变体序列。在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2的M蛋白、片段或变体序列，SARS-CoV-2的N蛋白、片段或变体序列以及SARS-CoV-2的E蛋白、片段或变体序列。编码SARS-CoV-2结构蛋白片段或其变体的至少三个不同序列的核酸疫苗还可以包括信号肽和/或至少一个接头(例如GSG接头)序列，并且核酸疫苗中的一个或多个序列可以是密码子优化的。
SARS-CoV-2变种
SARS-CoV-2是大型冠状病毒家族的成员。在全球范围内已鉴定了SARS-CoV-2的多种变种(有时称为“毒株(strain)”或“谱系(lineage)”)。本描述中使用的SARS-CoV-2变种命名法与新病毒谱系的PANGO命名法一致(Rambaut,Andrew,等,A dynamic nomenclatureproposal for SARS-CoV-2lineages to assist genomic epidemiology.Naturemicrobiology,2020,5:1403-1407，其内容通过引用以其整体并入本文)。可以使用Nextstrain的SARs-CoV-2分析用户界面(nextstrain.org/ncov/global)在线访问与PANGOSARS-CoV-2谱系或变种相关的近实时数据。
对于本公开，已经鉴定了许多SARS-CoV-2的PANGO谱系变种，包括以下(括号中的数字表示每个提交的PANGO谱系的病例数：A(37)；A.1(8)；A.11(2)；A.12(1)；A.19(5)；A.2(6)；A.2.2(9)；A.2.4(5)；A.2.5(12)；A.21(8)；A.22(1)；A.23(2)；A.23.1(40)；A.24(2)；A.25(1)；A.28(4)；A.3(3)；A.5(5)；A.6(1)；AD.2(1)；AE.1(1)；AE.2(2)；AE.4(1)；AE.5(1)；AE.7(1)；AE.8(1)；AG.1(1)；AY.1；AY.2；AY.3；B(47)；B.1(374)；B.1.1(237)；B.1.1.1(40)；B.1.1.10(2)；B.1.1.111(2)；B.1.1.121(1)；B.1.1.133(2)；B.1.1.141(5)；B.1.1.142(6)；B.1.1.153(6)；B.1.1.157(1)；B.1.1.159(3)；B.1.1.160(1)；B.1.1.161(1)；B.1.1.163(8)；B.1.1.170(1)；B.1.1.174(1)；B.1.1.176(2)；B.1.1.180(1)；B.1.1.186(2)；B.1.1.189(4)；B.1.1.198(2)；B.1.1.200(1)；B.1.1.204(2)；B.1.1.207(6)；B.1.1.214(22)；B.1.1.216(9)；B.1.1.219(1)；B.1.1.222(32)；B.1.1.226(1)；B.1.1.230(1)；B.1.1.231(4)；B.1.1.232(1)；B.1.1.241(1)；B.1.1.243(1)；B.1.1.25(26)；B.1.1.263(2)；B.1.1.265(1)；B.1.1.27(6)；B.1.1.273(1)；B.1.1.274(7)；B.1.1.28(34)；B.1.1.280(3)；B.1.1.284(5)；B.1.1.294(7)；B.1.1.297(1)；B.1.1.300(1)；B.1.1.301(1)；B.1.1.304(1)；B.1.1.306(5)；B.1.1.312(3)；B.1.1.315(2)；B.1.1.316(4)；B.1.1.317(8)；B.1.1.318(1)；B.1.1.326(1)；B.1.1.328(3)；B.1.1.33(14)；B.1.1.330(6)；B.1.1.331(1)；B.1.1.333(4)；B.1.1.337(2)；B.1.1.344(2)；B.1.1.345(1)；B.1.1.348(29)；B.1.1.350(1)；B.1.1.351(2)；B.1.1.354(7)；B.1.1.355(2)；B.1.1.359(2)；B.1.1.365(1)；B.1.1.366(1)；B.1.1.368(1)；B.1.1.37(1)；B.1.1.372(2)；B.1.1.374(5)；B.1.1.375(9)；B.1.1.381(1)；B.1.1.383(1)；B.1.1.388(1)；B.1.1.389(17)；B.1.1.39(3)；B.1.1.394(3)；B.1.1.397(4)；B.1.1.398(2)；B.1.1.40(2)；B.1.1.404(1)；B.1.1.410(3)；B.1.1.411(3)；B.1.1.413(3)；B.1.1.416(6)；B.1.1.419(2)；B.1.1.420(4)；B.1.1.428(2)；B.1.1.429(2)；B.1.1.430(1)；B.1.1.432(8)；B.1.1.434(1)；B.1.1.447(1)；B.1.1.448(2)；B.1.1.451(1)；B.1.1.464(2)；B.1.1.485(1)；B.1.1.487(5)；B.1.1.50(16)；B.1.1.514(2)；B.1.1.516(2)；B.1.1.517(1)；B.1.1.519(106)；B.1.1.521(1)；B.1.1.54(2)；B.1.1.56(1)；B.1.1.57(1)；B.1.1.63(7)；B.1.1.7(534)；B.1.1.70(10)；B.1.1.71(1)；B.1.1.99(1)；B.1.108(1)；B.1.110.3(1)；B.1.111(29)；B.1.116(1)；B.1.126(2)；B.1.128(3)；B.1.13(1)；B.1.139(2)；B.1.146(1)；B.1.149(1)；B.1.153(2)；B.1.160(65)；B.1.160.14(1)；B.1.160.15(1)；B.1.160.25(1)；B.1.160.28(1)；B.1.160.8(1)；B.1.160.9(1)；B.1.164(2)；B.1.170(2)；B.1.177(71)；B.1.177.11(1)；B.1.177.12(1)；B.1.177.15(1)；B.1.177.18(1)；B.1.177.21(7)；B.1.177.32(4)；B.1.177.35(1)；B.1.177.4(1)；B.1.177.40(2)；B.1.177.42(1)；B.1.177.43(1)；B.1.177.44(2)；B.1.177.46(3)；B.1.177.49(1)；B.1.177.51(1)；B.1.177.52(3)；B.1.177.53(1)；B.1.177.54(2)；B.1.177.59(1)；B.1.177.6(1)；B.1.177.60(23)；B.1.177.68(1)；B.1.177.73(6)；B.1.177.76(1)；B.1.177.77(1)；B.1.177.78(1)；B.1.177.79(1)；B.1.177.81(5)；B.1.177.82(1)；B.1.177.83(1)；B.1.177.86(3)；B.1.189(2)；B.1.192(7)；B.1.195(4)；B.1.2(222)；B.1.210(2)；B.1.214(6)；B.1.214.2(1)；B.1.219(5)；B.1.22(3)；B.1.22.1(16)；B.1.220(1)；B.1.221(27)；B.1.221.1(1)；B.1.223(1)；B.1.229(1)；B.1.23(2)；B.1.232(1)；B.1.234(20)；B.1.236(3)；B.1.237(3)；B.1.240(7)；B.1.240.1(14)；B.1.241(1)；B.1.243(34)；B.1.256(1)；B.1.258(61)；B.1.258.11(1)；B.1.258.17(17)；B.1.258.2(1)；B.1.258.22(1)；B.1.258.23(1)；B.1.260(2)；B.1.273(1)；B.1.277(1)；B.1.279(1)；B.1.281(4)；B.1.289(1)；B.1.291(2)；B.1.3(1)；B.1.306(1)；B.1.308(1)；B.1.311(5)；B.1.324(1)；B.1.329(1)；B.1.334(1)；B.1.338(1)；B.1.346(1)；B.1.349(2)；B.1.351(199)；B.1.356(3)；B.1.357(1)；B.1.36(56)；B.1.36.1(5)；B.1.36.10(2)；B.1.36.16(33)；B.1.36.17(1)；B.1.36.18(12)；B.1.36.19(1)；B.1.36.21(1)；B.1.36.22(6)；B.1.36.29(6)；B.1.36.31(5)；B.1.36.34(3)；B.1.36.38(1)；B.1.36.8(3)；B.1.360(1)；B.1.361(3)；B.1.362(8)；B.1.367(3)；B.1.369(12)；B.1.369.1(1)；B.1.370(1)；B.1.371(1)；B.1.375(1)；B.1.379(1)；B.1.380(9)；B.1.393(1)；B.1.396(2)；B.1.398(11)；B.1.399(1)；B.1.400(4)；B.1.404(2)；B.1.409(5)；B.1.411(19)；B.1.416(16)；B.1.420(6)；B.1.426(1)；B.1.427(25)；B.1.428(4)；B.1.429(58)；B.1.438(4)；B.1.441(4)；B.1.451(1)；B.1.456(4)；B.1.459(15)；B.1.462(1)；B.1.465(1)；B.1.466(4)；B.1.466.1(1)；B.1.466.2(34)；B.1.468(7)；B.1.469(1)；B.1.470(11)；B.1.471(5)；B.1.476(1)；B.1.478(1)；B.1.479(1)；B.1.480(2)；B.1.492(1)；B.1.497(28)；B.1.499(24)；B.1.504(1)；B.1.505(1)；B.1.509(3)；B.1.517(6)；B.1.517.1(16)；B.1.523(3)；B.1.524(21)；B.1.525(16)；B.1.526(8)；B.1.526.1(6)；B.1.526.2(2)；B.1.527(2)；B.1.530(9)；B.1.535(2)；B.1.540(1)；B.1.541(1)；B.1.544(8)；B.1.547(1)；B.1.551(1)；B.1.558(3)；B.1.560(1)；B.1.561(6)；B.1.564(2)；B.1.565(6)；B.1.568(3)；B.1.575(4)；B.1.576(1)；B.1.577(5)；B.1.581(1)；B.1.582(7)；B.1.587(1)；B.1.588(4)；B.1.595.4(1)；B.1.596(17)；B.1.596.1(1)；B.1.600(8)；B.1.603(2)；B.1.605(1)；B.1.609(6)；B.1.617.1；B.1.617.2；B.1.617.3；B.1.619(1)；B.1.620(12)；B.1.621(65)；B.1.67(1)；B.1.84(1)；B.1.91(4)；B.1.94(1)；B.12(1)；B.27(3)；B.28(1)；B.3(6)；B.31(2)；B.35(4)；B.4(13)；B.4.1(1)；B.4.2(1)；B.4.6(2)；B.4.7(2)；B.40(3)；B.42(2)；B.43(1)；B.45(1)；B.53(2)；B.55(2)；B.56(1)；B.6(23)；B.6.3(1)；B.6.6(5)；B.6.7(1)；B.6.8(29)；C.1(2)；C.1.1(1)；C.11(5)；C.12(3)；C.13(1)；C.14(4)；C.16(18)；C.17(2)；C.18(1)；C.2(5)；C.2.1(11)；C.23(2)；C.26(5)；C.29(1)；C.30(1)；C.32(1)；C.35(10)；C.36(14)；C.36.1(1)；C.36.3(10)；C.4(3)；C.8(2)；C.37(54)；D.2(33)；L.3(8)；N.2(1)；N.3(4)；N.4(14)；N.5(8)；N.6(3)；N.7(4)；N.9(4)；P.1(57)；P.2(47)；P.6(2)；P.7(3)；Q.1(6),Q.3(7)；Q.4(2)；Q.5(1)；Q.6(1).Q.8(7),R.1(9)；S.1(1)；U.2(1)；U.3(1)；W.1(1)；Y.1(2)；和Z.1(1)。
从流行病学的角度来看，变种通常分为目标变种(Variant of Interest，VOI)、关切变种(VOC)和高后果变种(Variant of High Consequence，VOHC)。有关将特定变种分类为VOI、VOC或VOHC的信息，请参见例如cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/cases-updates/variant-surveillance/variant-info.html。
VOI可以具有某些遗传标志物，这些遗传标志物与受体结合的变化、针对先前感染或疫苗接种产生的抗体的中和作用降低、治疗功效降低、潜在的诊断影响或预计的传播性或疾病严重程度增加相关。在某些情况下，VOI具有特定的遗传标志物，预计这些遗传标志物会影响传播、诊断、治疗或免疫逃逸，或导致病例比例增加或独特的爆发集群。SARS-CoV-2VOI包括例如PANGO谱系B.1.1.7(Alpha)、B.1.351(Beta)、B.1.427/429(Epsilon)、B.1.526(Iota)、B.1.525(Eta)、B.1.617.1(Kappa)、B.1.617.2(Delta)、B.1.621(Mu)、C37(Lamba)、P.1(Gamma)和P.2。
VOC可以包括有证据表明传播性增加、疾病更严重(住院或死亡增加)、先前感染或疫苗接种期间产生的抗体的中和作用显著降低、治疗或疫苗有效性降低或诊断检测失败的变种。在某些情况下，VOC有证据表明对诊断、治疗和疫苗有影响，对诊断测试靶标的广泛干扰，有证据表明对一类或多类疗法的抗性大幅增加，有证据表明先前感染或疫苗接种期间产生的抗体的中和作用显著降低，有证据表明疫苗诱导的对严重疾病的保护作用降低、有证据表明传播性增加或有证据表明疾病严重程度增加。SARS-CoV-2VOC可以包括例如PANGO谱系B.1.1.7(Alpha)、P.1(Gamma)、B.1.351(Beta)、B.1.427和B.1.429(Epsilon)、B.1.526(Iota)、B.1.525(Eta)、B.1.617.1(Kappa)、B.1.617.2(Delta)、B.1.621(Mu)和C37(Lamba)。
VOHC可以有明确的证据表明，预防措施或医疗对策(medical countermeasures，MCM)相对于先前流行的变种而言具有显著降低的有效性。在某些情况下，VOHC对医疗对策(MCM)有影响，证明诊断失败，有证据表明疫苗有效性显著降低，疫苗突破病例数不成比例得高，疫苗诱导的针对严重疾病的保护非常低，对多种紧急使用授权(EUA)或已批准的治疗方法的敏感性显著降低，更严重的临床疾病和住院人数增加。
本文公开的核酸疫苗可以编码本文所述的任何SARS-CoV-2变种的一种或多种多肽，例如一种或多种蛋白质、肽、其片段或变体。在一些实施方案中，本文公开的核酸疫苗可以编码SARS-CoV-2VOI、VOC和/或VOHC的一种或多种多肽，例如一种或多种蛋白质、肽、其片段或变体。在一些实施方案中，核酸疫苗编码包含称为D614G的特定突变的多肽。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码一种或多种多肽，其包含在B.1.526SARS-CoV-2变种(即，Iota变种)中存在的一个或多个突变或取代，例如以下的一个或多个：刺突蛋白取代L5F、T95I、D253G、S477N、E484K、D614G和/或A701V；ORF1a取代L3201P、T265I和/或Δ3675/3677；ORF1b取代P314L和/或Q1011H；ORF3a取代P42L、Q57H；ORF8取代T11I；和/或5’UTR取代R81C。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码一种或多种多肽，其包含在B.1.525SARS-CoV-2变种(即，Eta变种)中存在的一个或多个突变或取代，例如以下的一个或多个：刺突蛋白取代A67V、Δ69/70、Δ144、E484K、D614G、Q677H和/或F888L；ORF1b取代P314F；ORF1a取代T2007I；M蛋白取代I82T；N蛋白取代A12G和/或T205I；和/或5’UTR取代R81C。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码一种或多种多肽，其包含在P.2SARS-CoV-2变种中存在的一个或多个突变或取代，例如以下的一个或多个：刺突蛋白取代E484K、D614G和/或V1176F；ORF1a取代L3468V和/或L3930F；ORF1b取代P314L；N蛋白取代A119S、R203K、G204R和/或M234I；5’UTR取代R81C。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码一种或多种多肽，其包含在B.1.1.7SARS-CoV-2变种(即，Alpha变种)中存在的一个或多个突变或取代，例如以下的一个或多个：刺突蛋白取代Δ69/70、Δ144Y、E484K、S494P、N501Y、A570D、D614G和/或P681H。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码一种或多种多肽，其包含在P.1SARS-CoV-2变种(即，Gamma变种)中存在的一个或多个突变或取代，例如以下的一个或多个：刺突蛋白取代K417N/T、E484K、N501Y和/或D614G。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码一种或多种多肽，其包含在B.1.351SARS-CoV-2变种(即，Beta变种)中存在的一个或多个突变或取代，例如以下的一个或多个：刺突蛋白取代K417N、E484K、N501Y和/或D614G。B.1.351变种也称为南非变种，因为它最初起源于南非。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码一种或多种多肽，其包含在B.1.427SARS-CoV-2变种中存在的一个或多个突变或取代，例如以下的一个或多个：刺突蛋白取代L452R和/或D614G。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码一种或多种多肽，其包含在B.1.429SARS-CoV-2变种中存在的一个或多个突变或取代，例如以下的一个或多个：刺突蛋白取代S13I、W152C、L452R和/或D614G。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码一种或多种多肽，其包含在B.1.617.1SARS-CoV-2变种中存在的一个或多个突变或取代，例如以下的一个或多个：刺突蛋白取代G142D、E154K、L452R、E484Q、D614G、P681R和/或Q1071H。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码一种或多种多肽，其包含在B.1.617.2SARS-CoV-2变种(即，Delta变种)中存在的一个或多个突变或取代，例如以下的一个或多个：刺突蛋白取代T19R、T95I、G142D、Δ156/157、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R和/或D950N。在其他实施方案中，核酸疫苗编码一种或多种多肽，其包含在B.1.617.2SARS-CoV-2变种中存在的一个或多个进一步的突变或取代，例如以下的一个或多个：刺突蛋白取代V70F、A222V、W258L和/或K417N。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码一种或多种多肽，其包含在B.1.617.3SARS-CoV-2变种中存在的一个或多个突变或取代，例如以下的一个或多个：刺突蛋白取代T19R、G142D、L452R、E484Q、D614G、P681R和/或D950N。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2刺突蛋白，例如蛋白质、肽、片段或变体，其包含选自以下的一个或多个取代和/或缺失：A570D、A67V、A701V、D253G、D614G、E484K、F888L、K417N/T、L452R、L5F、N501Y、P681H、Q677H、S13I、S477N、S494P、T95I、V1176F、W152C、Δ144、Δ144Y和Δ69/70。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2ORF1a，其包含选自以下的一个或多个取代和/或缺失：L3201P、T265I、T2007I、L3468V、Δ3675-3677和L3930F。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2ORF1b，其包含选自以下的一个或多个取代：P314F,P314L和Q1011H。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2ORF3a，其包含选自以下的一个或多个取代：P42L和Q57H。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码包含T11I取代的SARS-CoV-2ORF8。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码包含R81C取代的SARS-CoV-25’UTR。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码包含I82T取代的SARS-CoV-2M蛋白，例如蛋白质、肽、片段或变体。
在一些实施方案中，核酸疫苗编码SARS-CoV-2N蛋白，例如蛋白质、肽、片段或变体，其包含选自以下的一个或多个取代：A12G、A119S、R203K、G204R、T205I和M234I。
核酸疫苗的组分
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种目标多肽，例如SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、肽、其片段或变体。本公开的SARS-CoV-2的蛋白质、肽、其片段或变体可以是源自感染性物质的野生型，或是经修饰的(例如，结构蛋白或其片段和变体是经工程化、经设计或是人造的)。它们可以具有本文所述特征的任何组合。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗的多核苷酸编码一种或多种目标肽或目标多肽。此类肽或多肽是用于预防、缓解和/或治疗COVID-19的SARS-CoV-2的结构蛋白或其片段或变体。作为一个非限制性实例，这些肽或多肽可以用作抗原或抗原分子(也优选用作免疫原性分子)。术语“核酸(nucleic acid)”在其广义上包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。这些聚合物经常被称为多核苷酸。
示例性核酸或多核苷酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有a-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2'-氨基官能化的2'-氨基-LNA和具有2'-氨基官能化的2'-氨基-a-LNA)、乙烯核酸(ENA)、环己烯基核酸(CeNA)或其杂合体或组合。
在一些实施方案中，体外转录(IVT)酶促合成方法可以用于制备编码本公开的SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、肽、其片段或变体的线性多核苷酸(称为“IVT多核苷酸”)。
在一些实施方案中，核酸疫苗可以包括“嵌合多核苷酸(chimericpolynucleotide)”，其具有大小和/或编码的蛋白质(例如，SARS-CoV-2的结构蛋白)不同的部分或区域。“嵌合体(chimera)”是具有两个或更多个不协调或异质部分或区域的实体。如本文所用，多核苷酸的“部分(part)”或“区域(region)”被定义为多核苷酸的小于多核苷酸全长的任何部分。
在一些实施方案中，核酸疫苗包括长度为约30至约100,000个核苷酸(例如，30至50、30至100、30至250、30至500、30至1,000、30至1,500、30至3,000、30至5,000、30至7,000、30至10,000、30至25,000、30至50,000、30至70,000、100至250、100至500、100至1,000、100至1,500、100至3,000、100至5,000、100至7,000、100至10,000、100至25,000、100至50,000、100至70,000、100至100,000、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至3,000、500至5,000、500至7,000、500至10,000、500至25,000、500至50,000、500至70,000、500至100,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至3,000、1,000至5,000、1,000至7,000、1,000至10,000、1,000至25,000、1,000至50,000、1,000至70,000、1,000至100,000、1,500至3,000、1,500至5,000、1,500至7,000、1,500至10,000、1,500至25,000、1,500至50,000、1,500至70,000、1,500至100,000、2,000至3,000、2,000至5,000、2,000至7,000、2,000至10,000、2,000至25,000、2,000至50,000、2,000至70,000和2,000至100,000个核苷酸)的多核苷酸。
在一些实施方案中，核酸疫苗包括编码至少一种目标肽或目标多肽的至少一种多核苷酸。在另一个实施方案中，多核苷酸可以是非编码的。
在一些实施方案中，编码核酸疫苗的多核苷酸的至少一种目标肽或目标多肽的区域的长度大于约30个核苷酸(例如，至少或大于约35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、and 3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或最多至且包括100,000个核苷酸)。如本文所用，这样的区域可以称为“编码区(coding region)”或“编码……的区域(region encoding)”。
在一些实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸是信使RNA(mRNA)或起信使RNA(mRNA)的作用。如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”是指编码至少一种目标肽或目标多肽并且能够被翻译以在体外、体内、原位或离体产生编码的目标肽或目标多肽的任何多核苷酸。
核酸疫苗的多核苷酸的区域的最短长度可以是足以编码二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽或十肽的核酸序列的长度。在另一个实施方案中，该长度可以足以编码2-30个氨基酸例如5-30、10-30、2-25、5-25、10-25或10-20个氨基酸的肽。该长度可以足以编码至少11、12、13、14、15、17、20、25或30个氨基酸的肽，或不超过40个氨基酸，例如不超过35、30、25、20、17、15、14、13、12、11或10个氨基酸的肽。多核苷酸序列可以编码的二肽的实例包括但不限于肌肽和鹅肌肽。
用于预防、缓解和/或治疗COVID-19的编码SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、肽、其片段或变体的核酸疫苗的多核苷酸的区域的长度可以大于约30个核苷酸。所述长度可以是但不限于至少或大于约30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或最多至且包括100,000个核苷酸。在一些实施方案中，该区域包括约30至约100,000个核苷酸(例如，30至50、30至100、30至250、30至500、30至1,000、30至1,500、30至3,000、30至5,000、30至7,000、30至10,000、30至25,000、30至50,000、30至70,000、100至250、100至500、100至1,000、100至1,500、100至3,000、100至5,000、100至7,000、100至10,000、100至25,000、100至50,000、100至70,000、100至100,000、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至3,000、500至5,000、500至7,000、500至10,000、500至25,000、500至50,000、500至70,000、500至100,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至3,000、1,000至5,000、1,000至7,000、1,000至10,000、1,000至25,000、1,000至50,000、1,000至70,000、1,000至100,000、1,500至3,000、1,500至5,000、1,500至7,000、1,500至10,000、1,500至25,000、1,500至50,000、1,500至70,000、1,500至100,000、2,000至3,000、2,000至5,000、2,000至7,000、2,000至10,000、2,000至25,000、2,000至50,000、2,000至70,000以及2,000至100,000个核苷酸)。
mRNA组分
本文所述的核酸疫苗可以是mRNA疫苗。mRNA疫苗包括至少一种mRNA分子，其在被翻译时产生至少一种目标肽或目标多肽用于预防、缓解和/或治疗COVID-19。一般而言，mRNA分子通常至少包括编码区、5'非翻译区(UTR)、3'UTR、5'帽和poly-A尾。
mRNA组分：起始密码子和终止密码子
在一些实施方案中，mRNA包括起始翻译的区域。这一区域可以包括包含起始密码子的任何翻译起始序列或信号。作为一个非限制性示例，该区域包括起始密码子。在一些实施方案中，起始密码子可以是“ATG”、“ACG”、“AGG”、“ATA”、“ATT”、“CTG”、“GTG”、“TTG”、“AUG”、“AUA”、“AUU”、“CUG”、“GUG”或“UUG”。
在一些实施方案中，mRNA包括终止翻译的区域。这一区域可以包括包含终止密码子的任何翻译终止序列或信号。作为一个非限制性示例，该区域包括终止密码子。在一些实施方案中，终止密码子可以是“TGA”、“TAA”、“TGA”、“TAG”、“UGA”、“UAA”、“UGA”或“UAG”。
在一些实施方案中，起始或终止翻译的区域的长度可以独立地为3至40个，例如5-30个、10-20个、15个或至少4个、或30个或更少的核苷酸。此外，除了起始和/或终止密码子之外，这些区域可以包含一个或多个信号和/或限制序列。
在一些实施方案中，掩蔽剂(masking agent)可以用于掩蔽第一起始密码子或替代起始密码子，以便增加翻译将在起始密码子或掩蔽起始密码子下游的替代起始密码子或替代起始密码子上起始的机会。
在一些实施方案中，可以从多核苷酸序列中去除起始密码子以使多核苷酸在不是起始密码子的密码子上开始翻译。多核苷酸的翻译可以在去除的起始密码子之后的密码子上开始，或者在下游起始密码子或替代起始密码子上开始。去除起始密码子的多核苷酸序列还可以包含用于下游起始密码子和/或替代起始密码子的至少一种掩蔽剂，以便控制或试图控制翻译的起始、多核苷酸的长度和/或多核苷酸的结构。
mRNA组分：编码区
在一些实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸的编码区可以编码至少一种目标肽或目标多肽。目标肽或目标多肽的非限制性实例包括用于预防、缓解和/或治疗COVID-19的SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、肽、其片段或变体。
mRNA组分：非翻译区
本文所述的核酸疫苗的多核苷酸可以包含充当非翻译区(UTR)或作为非翻译区(UTR)发挥作用的一个或多个区域或部分。基因的野生型UTR被转录但不被翻译。在mRNA中，5'UTR开始于转录起始位点并且继续至起始密码子但不包括起始密码子；而3'UTR紧随终止密码子开始并且继续直到转录终止信号。不希望受到理论的束缚，UTR可以在核酸分子的稳定性和翻译方面起作用。可以使用UTR的变体，其中一个或多个核苷酸(包括A、T、C或G)被添加至末端或去除。
在一些实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸的UTR的长度可以独立地为15-1,000个核苷酸(例如，大于30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800和900个核苷酸或至少30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900和1,000个核苷酸)。
野生型5'UTR包括在翻译起始中发挥作用的特征，因为这些5'UTR包括已知参与核糖体如何启动许多基因的翻译的序列如Kozak序列。还已知5'UTR形成参与延伸因子结合的二级结构。其他非UTR序列(例如，内含子或内含子序列的部分)也可以用作可以增加蛋白质产量以及多核苷酸水平的区域或子区域。
已知天然或野生型3'UTR具有嵌入它们之中的腺苷和尿苷段。这些富含AU的标签(signature)在具有高更新率的基因中是特别普遍的。3'UTR的富含AU的元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节核酸疫苗的多核苷酸的稳定性。
来自任何基因的UTR可以掺入到核酸疫苗的多核苷酸的区域中。或者，不是野生型区域的变体的人工UTR也可以用于核酸疫苗的多核苷酸。这些UTR或其部分可以放置在与它们选自的转录物中相同的方向上，或者可以改变方向或位置。如本文所用，术语“改变(altered)”在其涉及UTR序列时是指UTR相对于参考序列已经以某种方式改变。作为一个非限制性实例，5'或3'UTR可以被倒置、缩短、延长、由来自不同亲本序列的一个或多个其他5'UTR或3'UTR制成。
在一些实施方案中，侧翼区选自其蛋白质共有共同功能、结构、性质特征的转录物家族。例如，目标多肽可以属于在特定细胞、组织中或在发育期间的某个时间表达的蛋白质家族。来自任何这些基因的UTR可以与相同或不同蛋白质家族的任何其他UTR交换，以产生新的多核苷酸。如本文所用，“蛋白质家族”以最广泛的意义使用，是指共有至少一种功能、结构、特征、定位、起源或表达模式的两种或更多种目标多肽的组。
本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含具有SEQ ID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)序列的5'UTR。在一些实施方案中，本文公开的核酸疫苗的多核苷酸的5'UTR由SEQID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)的核酸序列组成。在一些实施方案中，5'UTR直接是编码核酸疫苗的SARs-CoV-2多肽的序列的起始密码子的5'。在一些实施方案中，5'UTR距离编码核酸疫苗的SARs-CoV-2多肽的序列的起始密码子5'有1、2、3、4、5、6个或更多个核苷酸；例如，1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸的间隔序列将5'UTR与编码核酸疫苗的SARs-CoV-2多肽的序列的起始密码子分隔开。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)的核酸序列具有至少80％序列同一性的5'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)的核酸序列具有至少85％序列同一性的5'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)的核酸序列具有至少90％序列同一性的5'UTR。本文所公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)的核酸序列具有至少91％序列同一性的5'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)的核酸序列具有至少92％序列同一性的5'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)的核酸序列具有至少93％序列同一性的5'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)的核酸序列具有至少94％序列同一性的5'UTR。本文所公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)的核酸序列具有至少95％序列同一性的5'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)的核酸序列具有至少96％序列同一性的5'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)的核酸序列具有至少97％序列同一性的5'UTR。本文所公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)的核酸序列具有至少98％序列同一性的5'UTR。本文所公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)的核酸序列具有至少99％序列同一性的5'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：13(DNA)或SEQ ID NO：47(RNA)的核酸序列具有至少100％序列同一性的5'UTR。
本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含具有SEQ ID NO：14(DNA)或SEQ ID NO：48(RNA)的序列的3'UTR。在一些实施方案中，本文公开的核酸疫苗的多核苷酸的3'UTR由SEQ ID NO：14(DNA)或SEQ ID NO：48(RNA)的核酸序列组成。在一些实施方案中，3'UTR直接是编码核酸疫苗的SARs-CoV-2多肽的序列的起始密码子的3'。在一些实施方案中，3'UTR距离编码核酸疫苗的SARs-CoV-2多肽的序列的起始密码子3'有1、2、3、4、5、6个或更多个核苷酸；例如，1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸的间隔序列将3'UTR与编码核酸疫苗的SARs-CoV-2多肽的序列的起始密码子分隔开。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ IDNO：14(DNA)或SEQ ID NO：48(RNA)的核酸序列具有至少80％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：14(DNA)或SEQ ID NO：48(RNA)的核酸序列具有至少85％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：14(DNA)或SEQ ID NO：48(RNA)的核酸序列具有至少90％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可包含序列与SEQ ID NO：14(DNA)或SEQ ID NO：48(RNA)的核酸序列具有至少91％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：14(DNA)或SEQ ID NO：48(RNA)的核酸序列具有至少92％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：14(DNA)或SEQ ID NO：48(RNA)的核酸序列具有至少93％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：14(DNA)或SEQ ID NO：48(RNA)的核酸序列具有至少94％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可包含序列与SEQ ID NO：14(DNA)或SEQ IDNO：48(RNA)的核酸序列具有至少95％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：14(DNA)或SEQ ID NO：48(RNA)的核酸序列具有至少96％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：14(DNA)或SEQ ID NO：48(RNA)的核酸序列具有至少97％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：14(DNA)或SEQ ID NO：48(RNA)的核酸序列具有至少98％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：14(DNA)或SEQ ID NO：48(RNA)的核酸序列具有至少99％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：14(DNA)或SEQ ID NO：48(RNA)的核酸序列具有至少100％序列同一性的3'UTR。
本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含具有SEQ ID NO：52(DNA)或SEQ ID NO：53(RNA)的序列的3'UTR。在一些实施方案中，本文公开的核酸疫苗的多核苷酸的3'UTR由SEQ ID NO：52(DNA)或SEQ ID NO：53(RNA)的核酸序列组成。在一些实施方案中，3'UTR直接是编码核酸疫苗的SARs-CoV-2多肽的序列的起始密码子的3'。在一些实施方案中，3'UTR距离编码核酸疫苗的SARs-CoV-2多肽的序列的起始密码子3'有1、2、3、4、5、6个或更多个核苷酸；例如，1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸的间隔序列将3'UTR与编码核酸疫苗的SARs-CoV-2多肽的序列的起始密码子分隔开。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ IDNO：52(DNA)或SEQ ID NO：53(RNA)的核酸序列具有至少80％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：52(DNA)或SEQ ID NO：53(RNA)的核酸序列具有至少85％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可包含3'UTR，其具有与SEQ ID NO：52(DNA)或SEQ ID NO：53(RNA)的核酸序列具有至少90％序列同一性的序列。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：52(DNA)或SEQ ID NO：53(RNA)的核酸序列具有至少91％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：52(DNA)或SEQ ID NO：53(RNA)的核酸序列具有至少92％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：52(DNA)或SEQID NO：53(RNA)的核酸序列具有至少93％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：52(DNA)或SEQ ID NO：53(RNA)的核酸序列具有至少94％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：52(DNA)或SEQ ID NO：53(RNA)的核酸序列具有至少95％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：52(DNA)或SEQ ID NO：53(RNA)的核酸序列具有至少96％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：52(DNA)或SEQ ID NO：53(RNA)的核酸序列具有至少97％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：52(DNA)或SEQ ID NO：53(RNA)的核酸序列具有至少98％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQID NO：52(DNA)或SEQ ID NO：53(RNA)的核酸序列具有至少99％序列同一性的3'UTR。本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含序列与SEQ ID NO：52(DNA)或SEQ ID NO：53(RNA)的核酸序列具有至少100％序列同一性的3'UTR。
mRNA组分：Cap和IRES序列
在一些实施方案中，本文公开的核酸疫苗的多核苷酸可以包含5'帽结构。天然mRNA的5'帽结构参与核输出，从而增加mRNA的稳定性，并结合mRNA帽结合蛋白(CBP)，所述mRNA帽结合蛋白通过CBP与聚(A)结合蛋白缔合以形成成熟的环状mRNA种类来负责细胞中的mRNA稳定性和翻译能力。所述帽进一步有助于在mRNA剪接期间去除5′近端内含子。
在一些实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸的5'末端加帽区可以包含单个帽或形成帽的一系列核苷酸。加帽区的长度可以是1至10个，例如2-9个、3-8个、4-7个、1-5个、5-10个、或至少2个、或10个或更少的核苷酸。在一些实例中，加帽区可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，帽不存在。
在一些实施方案中，在核酸疫苗中可以使用帽类似物，其在本文还被称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物或结构或功能帽类似物。可以化学(例如，非酶促)或酶促合成的帽类似物在其化学结构上与天然(即内源性、野生型或生理性)5'帽不同，但是它们保留帽功能。
在一些实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸的5'末端帽可以包括内源帽或帽类似物。作为一个非限制性实例，5'末端帽可以包含鸟嘌呤类似物。有用的鸟嘌呤类似物包括但不限于肌苷、N1-甲基-鸟苷(m1G)、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
本领域技术人员将理解，5'加帽可以经由酶促或其他合成方法产生。内源性mRNA分子是5'-端加帽的，从而在末端鸟苷帽残基和mRNA分子的5'-末端转录有义核苷酸之间产生5'-ppp-5'-三磷酸键。然后可以将该5'-鸟苷酸帽甲基化以产生N7-甲基-鸟苷酸残基。mRNA的5'端的末端和/或前末端(ante-terminal)转录核苷酸的核糖也可以任选地被2'-O-甲基化。通过水解和裂解鸟苷酸帽结构的5'-去帽可以靶向核酸分子，如mRNA分子，以进行降解。
本文所述的核酸疫苗的多核苷酸，例如mRNA，可以被修饰以包括非水解帽结构，防止脱帽并因此增加mRNA半衰期。因为帽结构水解需要裂解5'-ppp-5'磷酸二酯键，所以在加帽反应期间可以使用修饰的核苷酸。例如，可以根据制造商的说明将可从例如New EnglandBiolabs(Ipswich，MA)获得的牛痘病毒加帽酶与α-硫代-鸟苷核苷酸一起使用以在5'-ppp-5'帽中产生硫代磷酸酯键。可以使用另外的修饰的鸟苷核苷酸，如α-甲基-膦酸酯和硒代-磷酸酯核苷酸。
另外的修饰包括但不限于在糖环的2'-羟基上mRNA(如上所述的)的5'-末端和/或5'-前末端核苷酸的核糖的2'-O-甲基化。多种不同的5'帽结构可用于产生核酸分子如mRNA分子的5'帽。
帽类似物，在本文还被称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物或结构或功能帽类似物，在其化学结构上与天然(即内源性、野生型或生理性)5'帽不同，然而仍保留帽功能。帽类似物可以是化学(例如，非酶促)或酶促合成的和/或连接至核酸分子，如mRNA分子。
例如，抗-反向帽类似物(ARCA)帽含有通过5'-5'-三磷酸酯基团连接的两个鸟嘌呤，其中一个鸟嘌呤含有N7甲基以及3'-O-甲基(即N7,3'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸酯-5'-鸟苷(m7G-3'mppp-G；其可以等效地指定为3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G)。另一未修饰的鸟嘌呤的3'-O原子变成连接至加帽的核酸分子(例如mRNA)的5'末端核苷酸。N7-和3'-O-甲基化的鸟嘌呤提供加帽的核酸分子(例如mRNA)的末端部分。
另一种示例性帽是mCAP，其与ARCA类似但在鸟苷上具有2'-O-甲基(即N7,2'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸酯-5'-鸟苷，m7Gm-ppp-G)。
虽然帽类似物允许核酸分子在体外转录反应中的伴随加帽，但高达20％的转录物可仍保持未加帽。这种情况以及帽类似物与内源性5'帽结构的结构差异可以导致降低的翻译能力和降低的细胞稳定性。
在本公开的示例性方面，多核苷酸，例如mRNA，可以在转录后使用酶进行加帽。例如，重组牛痘病毒加帽酶和重组2′-O-甲基转移酶可在mRNA的5′末端核苷酸与鸟嘌呤帽核苷酸之间形成规范的5′-5′-三磷酸酯键，其中所述帽鸟嘌呤含有N7甲基化并且mRNA的5′末端核苷酸含有2′-O-甲基。这种结构被称为Cap 1结构。在一些实施方案中，Cap 1结构与例如本领域已知的其他5′帽类似物结构相比提供更高的翻译能力和细胞稳定性以及减少的细胞促炎细胞因子的激活。帽结构包括7mG(5′)ppp(5′)N,pN2p(Cap 0)、7mG(5′)ppp(5′)N1mpNp(Cap 1)和7mG(5′)-ppp(5′)N1mpN2mp(Cap 2)。
在一个实施方案中，本文所述的核酸疫苗的多核苷酸包含Cap 1结构。
因为多核苷酸，例如mRNA，可以在转录后加帽，并且因为这种方法是更有效的，所以最多至100％的多核苷酸例如mRNA可以被加帽。这与在体外转录反应过程中帽类似物被连接至mRNA时的约80％形成对比。
在一些实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。不希望受到理论的束缚，IRES在不存在5'帽结构的情况下在启动蛋白质合成中起重要作用。IRES可以作为唯一的核糖体结合位点，或者可以作为mRNA的多个核糖体结合位点之一。
mRNA组分：加尾区
在一些实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸例如mRNA包括加尾区。加尾区的非限制性实例包括poly-A序列、poly-C序列和/或polyA-G四连体(quartet)。
在一些实施方案中，mRNA包括链终止核苷。链终止核苷的非限制性实例包括2'-O甲基、F和锁核酸(LNA)。
在一些实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸的加尾区序列的长度范围可以从不存在到500个核苷酸(例如，至少60、70、80、90、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸)。如果加尾区是poly-A尾，所述长度可以以poly-A结合蛋白结合的单元或作为poly-A结合蛋白结合的函数来描述。
在一些实施方案中，还可以在构建体从细胞核中输出之后添加poly-A尾。
在一些实施方案中，可以在RNA加工期间将长链腺嘌呤核苷酸(poly-A尾)添加至多核苷酸如mRNA分子以便增加稳定性。紧随转录之后，转录物的3'端可以被裂解以释放3'羟基。然后poly-A聚合酶将腺嘌呤核苷酸链添加至RNA。该过程被称为多腺苷酸化，其添加长度可在例如大约80至大约250个残基之间，包括长度为大约80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个残基的poly-A尾。
在一些实施方案中，当存在poly-A尾时，poly-A尾的长度大于30个核苷酸(例如，至少或大于约30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000个核苷酸)。在一些实施方案中，其poly-A尾区包括约30至约3,000个核苷酸(例如，30至50、30至100、30至250、30至500、30至750、30至1,000、30至1,500、30至2,000、30至2,500、50至100、50至250、50至500、50至750、50至1,000、50至1,500、50至2,000、50至2,500、50至3,000、100至500、100至750、100至1,000、100至1,500、100至2,000、100至2,500、100至3,000、500至750、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至2,500、500至3,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至2,500、1,000至3,000、1,500至2,000、1,500至2,500、1,500至3,000、2,000至3,000、2,000至2,500以及2,500至3,000个核苷酸)。
在一些实施方案中，poly-A尾的长度为大约99个核苷酸(SEQ ID NO:44)。
在一些实施方案中，相对于总体多核苷酸的长度或多核苷酸的特定区域的长度来设计poly-A尾。这种设计可以是基于编码区的长度、特定特征或区域的长度或基于从多核苷酸表达的最终产物的长度。
在这种背景下，poly-A尾的长度可以比多核苷酸或其特征长10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。poly-A尾还可以被设计为它所属的多核苷酸的一部分。在这种背景下，poly-A尾可以是构建体的总长度、构建体区域或构建体减去poly-A尾的总长度的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。此外，多核苷酸针对Poly-A结合蛋白的工程化的结合位点和缀合可以增强表达。
信号序列
在一些实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸还可以编码可以促进多肽运输至治疗相关位点的额外特征。有助于蛋白质运输的一种此类特征是信号序列。如本文所用，“信号序列(signal sequence)”或“信号肽(signal peptide)”分别是长度为约9至200个核苷酸(3-60个氨基酸)的多核苷酸或多肽，它们分别在编码区的5'末端或所编码的N末端多肽并入。在一些实施方案中，这些序列的添加导致所编码的多肽通过一种或多种分泌途径运输至内质网。一些信号肽在蛋白质被转运后被信号肽酶从蛋白质上裂解下来。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗的多核苷酸包括包含SEQ ID NO：45(DNA)或SEQ ID NO：49(RNA)的信号序列。
密码子优化
核酸疫苗的多核苷酸、它们的区域或部分或子区域可以进行密码子优化。密码子优化方法是本领域已知的并且可用于实现数个目标中的一个或多个的工作中。这些目标包括但不限于匹配靶标和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠，改变GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构，最小化可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基运行，定制转录和翻译控制区域，插入或去除蛋白质运输序列，在编码的蛋白质中去除/添加翻译后修饰位点(例如糖基化位点)，添加、去除或移变(shuffle)蛋白质结构域，插入或缺失限制性位点，修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点，以便调整翻译速率从而允许蛋白质的各种结构域正确地折叠，或以便减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域已知的，非限制性实例包括来自GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park Calif.)的服务和/或专有方法。在一些实施方案中，使用优化算法优化ORF序列。每种氨基酸的密码子选择在表4中给出。
表4.密码子选择
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在一些实施方案中，核酸疫苗在密码子优化后被载体化。载体的非限制性实例包括但不限于质粒、病毒、粘粒和人工染色体。
修饰
本公开的核酸疫苗，包括mRNA疫苗，可以包括一个或多个修饰。术语“修饰(modification)”或在适当时“修饰的(modified)”是指相对于A、G、U或C核糖核苷酸的修饰。一般来说，在本文中，这些术语并非旨在指代天然存在的5′末端mRNA帽部分中的核糖核苷酸修饰。在多肽中，术语“修饰”是指与20个氨基酸部分的规范组相比的修饰。
如本文所述，“核苷(nucleoside)”定义为含有糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中也称为“核碱基(nucleobase)”)的组合的化合物。如本文所述，“核苷酸(nucleotide)”定义为包括磷酸酯基团或其他主链键(核苷间键)的核苷。
修饰可以是各种不同的修饰。在一些实施方案中，编码区、非翻译区、侧翼区和/或末端或加尾区可以含有一个、两个或更多个(任选地不同的)核苷或核苷酸修饰。在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗包含一个或多个修饰，所述修饰使得核酸分子在被引入细胞时与未修饰的多核苷酸相比在细胞中更抗降解和/或在细胞中更稳定。
本文所述的核酸疫苗的多核苷酸可以包括任何有用的修饰，例如对糖、核碱基或核苷间键(例如，对连接磷酸酯/磷酸二酯键/磷酸二酯主链)的修饰。嘧啶核碱基的一个或多个原子可以例如被任选取代的氨基、任选取代的硫醇、任选取代的烷基(例如甲基或乙基)、任选取代的卤素(例如氯或氟)原子或基团替代或取代。在某些实施方案中，在糖和核苷间键的每一个中都存在修饰(例如，一个或多个修饰)。根据本公开的修饰可以是将核糖核酸(RNA)修饰为脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂合体。本文描述了另外的修饰。
在一些实施方案中，修饰包括2'-O-甲基修饰的核苷酸或2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸(分别为2’-OMe和2’-MOE修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗的多核苷酸可以包含至少一个本文所述的修饰。
本文所述的核酸疫苗的多核苷酸可包括对糖、核碱基和/或核苷间键的修饰的组合。
可用于本公开的疫苗的多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)的修饰包括但不限于如PCT公开WO2017070626(其内容通过引用以其整体并入本文)中描述的任何修饰，包括例如编码翻译多肽中的一个或多个N-连接糖基化位点的核苷酸(或密码子)的修饰或缺失。可用于本公开的疫苗的修饰还可以包括如PCT公开WO2018200892(其内容通过引用以其整体并入本文)中描述的任何修饰。本公开的疫苗还可以包含如以下文献中所述的特征或修饰：PCT专利申请公开WO2020255063、WO2020182869、WO2016011222、WO2016011226、WO2016005004、WO2016000792、WO2015176737、WO2015085318、WO2015048744和WO2015034925，以及美国专利申请公开US20200254086、US20200206362、US20180311336和US20180303929；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。
例如，多核苷酸，包括本文所述的核酸疫苗的mRNA分子，可以包括如下修饰。多核苷酸的核苷间键可以被部分或完全修饰。多核苷酸可以包含对一种或多种核碱基的修饰。多核苷酸可以包含5-甲基胞嘧啶代替所有胞嘧啶核碱基/胞苷核苷酸。进一步地，多核苷酸可以具有对核苷的一个或多个糖亚基的一个或多个修饰。糖修饰可以是一个或多个锁核酸(LNA)或2'-O-甲氧基乙基修饰的(“2'-MOE”)修饰。可以用糖、核碱基或键修饰的模式化阵列来设计多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸可以包含修饰以使稳定性最大化。在一些实施方案中，多核苷酸可以是完全2'-MOE-糖修饰的。
修饰的核碱基
修饰的核苷和核苷酸可以包括修饰的核碱基。在RNA中发现的核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。DNA中发现的核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的尿嘧啶。具有修饰的尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨基甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，即具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷(也称为1-甲基假尿苷(m1ψ))、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸腺嘧啶、2'-F-ara-尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-ara-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的胞嘧啶。具有修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲酰基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羟甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖胞苷(k2C)、α-硫代-胞苷、2′-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2′-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2′-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2′-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2′-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2′-O-三甲基-胞苷(m4 2Cm)、1-硫代-胞苷、2'-F-ara-胞苷、2'-F-胞苷和2'-OH-ara-胞苷。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的腺嘌呤。具有修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤代-嘌呤(例如，2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤代-嘌呤(例如，6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲基硫代-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲基硫代-N6-异戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲基硫代-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘氨酰氨基甲酰基-腺苷(g6A)、N6-苏氨酰氨基甲酰基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰基-腺苷(m6t6A)、2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨基甲酰基-腺苷(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m6 2A)、N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基-腺苷(hn6A)、2-甲基硫代-N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2′-O-甲基-腺苷(Am)、N6,2′-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2′-O-三甲基-腺苷(m6 2Am)、1,2′-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2'-F-ara-腺苷、2'-F-腺苷、2'-OH-ara-腺苷和N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺苷。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的鸟嘌呤。具有修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌酐(I)、1-甲基-肌酐(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OHyW)、修饰不足的羟基怀丁苷(OHyW*)、7-脱氮-鸟苷、辫苷(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m1G)、N2-甲基-鸟苷(m2G)、N2,N2-二甲基-鸟苷(m2 2G)、N2,7-二甲基-鸟苷(m2,7G)、N2、N2,7-二甲基-鸟苷(m2,2,7G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、α-硫代-鸟苷、2′-O-甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2 2Gm)、1-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2,7Gm)、2′-O-甲基-肌酐(Im)、1,2′-O-二甲基-肌酐(m1Im)和2′-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)(Gr(p))。
核苷酸的核碱基可以独立地选自嘌呤、嘧啶、嘌呤或嘧啶类似物。例如，核碱基可以各自独立地选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或次黄嘌呤。在另一个实施方案中，核碱基还可以包括例如碱基的天然存在和合成衍生物，包括吡唑并[3,4-d]嘧啶、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代(例如，8-溴)、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、脱氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、脱氮腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、吡唑并[3,4-d]嘧啶、咪唑并[1,5-a]1,3,5-三嗪酮、9-脱氮嘌呤、咪唑并[4,5-d]吡嗪、噻唑并[4,5-d]嘧啶、吡嗪-2-酮、1,2,4-三嗪、哒嗪；和1,3,5-三嗪。
不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间键(例如，主链结构)可以在本文所述的多核苷酸的不同位置处引入。本领域普通技术人员将理解，核苷酸类似物或其他修饰可以位于多核苷酸的任何位置，使得多核苷酸的功能不会实质降低。本公开的多核苷酸可以含有约1％至约100％的修饰的核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、T/U或C中的任何一种或多种)或任何中间百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％以及95％至100％)。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗的多核苷酸可以被修饰为环状核酸。多核苷酸的末端可以通过化学试剂或酶连接，产生没有游离末端的环状多核苷酸。预期环状多核苷酸比线性对应物更稳定，并且能够抵抗外切核酸酶的消化。环状多核苷酸还可以包含相对于A、G、T/U或C核糖核苷酸/脱氧核糖核苷酸的其他结构和/或化学修饰。
在一些实施方案中，多核苷酸是至少50％修饰的，例如至少50％的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，多核苷酸是至少75％修饰的，例如至少75％的核苷酸被修饰。应当理解，由于核苷酸(糖、碱基和磷酸酯部分，例如键)可以各自被修饰，对核苷酸或核苷的任何部分的任何修饰将构成修饰。
在一些实施方案中，多核苷酸仅在核苷酸的一种组分中是至少10％修饰的，这种组分是核碱基、糖或核苷之间的键。例如，可以对本文所述的多核苷酸的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的核碱基、糖或键进行修饰。
作为非限制性实例，核酸疫苗的多核苷酸的尿嘧啶核苷全部被修饰。修饰可以相同或不同。在一些实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸的鸟嘌呤核苷全部被修饰。修饰可以相同或不同。在一些实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸的鸟嘌呤核苷全部被修饰。修饰可以相同或不同。在一些实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸的胞嘧啶核苷全部被修饰。修饰可以相同或不同。在一些实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸的腺嘌呤核苷全部被修饰。修饰可以相同或不同。
在本公开的一个实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸被修饰为包含N1-甲基-假尿苷核苷酸。
糖修饰
可以掺入到多核苷酸(例如，RNA或mRNA，如本文所述)中的修饰的核苷和核苷酸可在核糖核酸的糖上进行修饰。例如，2'羟基(OH)可被许多不同的取代基修饰或替代。2'-位的示例性取代包括但不限于H、卤素、任选取代的C1-6烷基；任选取代的C1-6烷氧基；任选取代的C6-10芳氧基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的C3-8环烷氧基；任选取代的C6-10芳氧基；任选取代的C6-10芳基-C1-6烷氧基，任选取代的C1-12(杂环基)氧基；糖(例如，核糖、戊糖或本文所述的任何糖)；聚乙二醇(PEG)、-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，其中R是H或任选取代的烷基，且n是0至20的整数(例如，0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16和4至20)；“锁(locked)”核酸(LNA)，其中2'-羟基通过C1-6亚烷基或C1-6杂亚烷基桥接至相同核糖的4'-碳，其中示例性桥包括亚甲基、亚丙基、醚或氨基桥；氨基烷基；氨基烷氧基；氨基；和氨基酸。
在一些实施方案中，多核苷酸，例如本文所述的核酸疫苗的mRNA，包含至少一个糖修饰。通常，RNA包括糖基核糖，它是具有氧的5元环。示例性的非限制性的修饰的核苷酸包括置换核糖中的氧(例如，用S、Se或亚烷基，如亚甲基或亚乙基)；添加双键(例如，用环戊烯基或环己烯基代替核糖)；核糖的环收缩(例如，形成环丁烷或氧杂环丁烷的四元环)；核糖的环扩展(例如，形成具有额外碳或杂原子的6元或7元环，如对于也具有氨基磷酸酯骨架的失水己糖醇、阿卓糖醇、甘露糖醇、环己基、环己烯基和吗啉代)；多环形式(例如，三环；和“未锁定(unlocked)”形式，如二醇核酸(GNA)(例如，R-GNA或S-GNA，其中核糖被连接至磷酸二酯键的二醇单元替代)、苏糖核酸(TNA，其中核糖被α-L-苏呋喃糖基-(3'→2')替代)和肽核酸(PNA，其中2-氨基-乙基-甘氨酸键替代核糖和磷酸二酯骨架)。糖基团还可以含有一个或多个具有与核糖中的相应碳相反的立体化学构型的碳。因此，如本文所述的多核苷酸分子，包括mRNA，可以包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。
糖修饰的非限制性实例可以包括表5中提供的修饰。本公开的多核苷酸可具有一个或多个携带如表5中提供的修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸的每个核苷酸携带表5中提供的任何一个修饰，或不携带表5中提供的任何修饰。
表5.核苷酸糖修饰
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在一些实施方案中，多核苷酸的核苷酸的糖的至少一个2'位置(RNA中的OH或DNA中的H)被-OMe取代，称为2'-OMe。在一些实施方案中，多核苷酸的核苷酸的糖的至少一个2'位置(RNA中的OH或DNA中的H)被-F取代，称为2'-F。
核苷间键
本公开的多核苷酸可包括对核苷间键(例如，对连接磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)的任何修饰。在多核苷酸主链的上下文中，短语“磷酸酯(phosphate)”和“磷酸二酯(phosphodiester)”可互换使用。可以通过用不同的取代基替代一个或多个氧原子来修饰主链磷酸酯基团。进一步地，修饰的核苷和核苷酸可包括用如本文所述的另一个核苷间键对未修饰的磷酸酯部分进行整体替换。修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸酯(boranophosphates)、硼代磷酸酯(boranophosphate esters)、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫替代。磷酸酯接头也可以通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)代替连接氧来进行修饰。
提供α-硫代取代的磷酸酯部分以通过非天然硫代磷酸酯主链连接赋予RNA和DNA多核苷酸稳定性。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增加的核酸酶抗性，因此在细胞环境中的半衰期更长。预期硫代磷酸酯连接的多核苷酸分子还通过细胞先天免疫分子的较弱结合/激活来减少先天免疫应答。
在具体实施方案中，修饰的核苷包括α-硫代核苷(例如，5'-O-(1-硫代磷酸酯)-腺苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-胞苷(α-硫代-胞苷)、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-鸟苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-尿苷或5'-O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷)。
在一些实施方案中，多核苷酸包含在核苷酸之间的至少一个硫代磷酸酯键或甲基膦酸酯键。
在一些实施方案中，多核苷酸包含至少一个5'-(E)-乙烯基膦酸酯(5'-E-VP)(一种磷酸酯模拟物)作为修饰。
在本公开的一个实施方案中，可以修饰COVID-19核酸疫苗的多核苷酸(例如，mRNA)。
效价
本公开的核酸疫苗的效价可以不同。“效价(valency)”是指核酸疫苗或核酸疫苗的多核苷酸中的抗原组分的数量。核酸疫苗的抗原组分可以在相同的多核苷酸上，或者它们可以在不同的多核苷酸上。在一些实施方案中，核酸疫苗可以是一价的。在一些实施方案中，核酸疫苗可以是二价的。在一些实施方案中，核酸疫苗可以是三价的。在一些实施方案中，核酸疫苗可以是多价的，其可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25种或超过25种抗原或抗原部分，例如但不限于抗原肽。作为一个非限制性实例，抗原肽可以是SARS-CoV-2的结构蛋白的一个或多个片段或变体。
合成
酶促方法
体外转录-酶促合成
可以使用体外转录(IVT)系统转录编码本文所述核酸疫苗的多核苷酸的cDNA。所述系统通常包含转录缓冲液、三磷酸核苷酸(NTP)、RNase抑制剂和聚合酶。NTP可以在内部制造，可以选自供应商，或可以如本文所述合成。NTP可以选自但不限于本文所述的那些，包括天然和非天然(修饰的)NTP。聚合酶可以选自但不限于T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和聚合酶变体。
在一些实施方案中，使用DNase I酶从IVT反应中去除DNA模板。然后在mRNA的寡dT纯化期间去除消化的DNA和核苷酸。这种纯化方法基于mRNA的poly-A尾对poly-dT柱床的亲和力。可以使用离心，但可能不需要离心来去除消化的DNA和核苷酸。在通过反相柱(例如SDVB)纯化以从mRNA中去除双链RNA后，可以使用超滤，然后进行一个或多个过滤步骤。纯化后，可以测量残留的DNA，以确认对于转录成mRNA区域之外的质粒区域已使用PCR去除了DNA。在一些实施方案中，在需要一定浓度的产物的情况下，可以使用渗滤(diafiltration)方法，随后进行一个或多个过滤步骤以去除任何生物负荷(例如，生物分子或其他生物材料)。
在本文所述核酸疫苗的多核苷酸的合成中可以使用任何数量的RNA聚合酶或变体。可以通过插入或缺失RNA聚合酶序列的氨基酸来修饰RNA聚合酶。
多核苷酸或核酸合成反应可以通过利用聚合酶的酶促方法进行。聚合酶催化在多核苷酸或核酸链中的核苷酸之间产生磷酸二酯键。目前已知的DNA聚合酶可以根据氨基酸序列比较和晶体结构分析而分为不同的家族。DNA聚合酶I(pol I)或A聚合酶家族，包括大肠杆菌的克列诺(Klenow)片段、芽孢杆菌DNA聚合酶I、水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶以及T7 RNA和DNA聚合酶，是这些家族中研究最好的。另一个大家族是DNA聚合酶a(pol a)或B聚合酶家族，包括所有真核复制DNA聚合酶和来自噬菌体T4和RB69的聚合酶。尽管它们采用相似的催化机制，但这些聚合酶家族在底物特异性、底物类似物掺入效率、引物延伸的程度和速率、DNA合成方式、外切核酸酶活性和对抑制剂的敏感性方面不同。
固相化学合成
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗的多核苷酸可以使用固相技术整体或部分地制造。多核苷酸或核酸的固相化学合成是一种自动化方法，其中分子被固定在固体支持物上并在反应物溶液中逐步合成。杂质和多余的试剂被洗掉，每一步之后都不需要纯化。该过程的自动化依从于计算机控制的固相合成器。固相合成允许以相对较大的规模快速生产多核苷酸或核酸，从而导致一些多核苷酸或核酸的商业可用性。
在一些实施方案中，使用自动化固相合成，其中链在3'至5'方向上合成。核苷3'端的羟基经由化学可裂解或光可裂解的接头连接至固体支持物。将激活的核苷单体，如2'-脱氧核苷(dA、dC、dG和dT)、核糖核苷(A、C、G和U)或化学修饰的核苷，依次添加到与支持物结合的核苷中。在合成结束时，添加裂解剂如氨或氢氧化铵以去除所有保护基团并从固体支持物上释放多核苷酸链。也可以应用光来裂解多核苷酸链。然后可以用高压液相色谱法(HPLC)或电泳进一步纯化产物。
液相化学合成
通过连续添加单体合成构件(building block)来合成本文所述的核酸疫苗的多核苷酸可以在液相中进行。在单体之间或在生长链的末端官能团和进入的单体之间形成共价键。必须暂时保护不参与反应的官能团。在添加每个单体合成构件之后，反应混合物必须进行纯化，然后添加下一个单体合成构件。必须将链的一个末端的官能团脱保护才能够与下一个单体合成构件反应。液相合成既费力又费时，而且不能自动化。尽管存在这些限制，液相合成仍可用于大规模制备短的多核苷酸。由于该系统是均质的，因此不需要大量过量的试剂并且在这方面具有成本效益。
定量和纯化
在一些实施方案中，可以在外泌体(exosome)中或当源自一种或多种体液时定量本文所述的核酸疫苗的多核苷酸。如本文所用，“体液(bodily fluid)”包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊髓液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢(cerumen)、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper's fluid)或预射精液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、水样粪便、胰液、来自鼻窦腔的灌洗液、支气管肺吸出物、胚泡腔液以及脐带血。或者，可以从选自以下的器官取回外泌体：肺、心脏、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结肠、乳房、前列腺、脑、食道、肝以及胎盘。
在外泌体定量方法中，从受试者获得不超过2mL的样品，并通过尺寸排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合来分离外泌体。在分析中，多核苷酸的水平或浓度可以是所施用构建体的表达水平、存在、不存在、截短或改变。将所述水平与一种或多种临床表型或与人类疾病生物标志物的测定相关联是有利的。该测定可以使用构建体特异性探针、细胞计数、qRT-PCR、实时PCR、PCR、流式细胞术、电泳、质谱或其组合进行，而外泌体可以使用免疫组织化学方法如酶联免疫吸附测定(ELISA)方法来分离。还可以通过尺寸排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合来分离外泌体。
这些方法使研究人员能够实时监测剩余或递送的多核苷酸水平。这是可能的，因为本文所述的多核苷酸由于结构修饰而不同于内源形式。
在一些实施方案中，可以使用诸如但不限于紫外可见光谱法(UV/Vis)的方法来定量多核苷酸。UV/Vis光谱仪的一个非限制性实例是光谱仪(ThermoFisher,Waltham,Mass.)。可以分析经定量的多核苷酸以便确定多核苷酸是否具有恰当的大小，检查多核苷酸没有发生降解。可以通过例如但不限于琼脂糖凝胶电泳、基于HPLC的纯化方法例如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)、液相色谱法-质谱法(LCMS)、毛细管电泳(CE)和毛细管凝胶电泳(CGE)等方法来检查多核苷酸的降解。/>
本文所述核酸疫苗的多核苷酸的纯化可以包括但不限于多核苷酸清理(clean-up)、质量保证和质量控制。可以通过本领域已知的方法进行清理，例如但不限于珠(Beckman Coulter Genomics，Danvers，Mass.)、poly-T珠、LNATMoligo-T捕获探针(/>Inc，Vedbaek，丹麦)或基于HPLC的纯化方法，例如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)。术语“纯化的(purified)”在用于多核苷酸如“纯化的多核苷酸(purifiedpolynucleotide)”时是指与至少一种污染物分离的多核苷酸。如本文所用，“污染物(contaminant)”是使另一种物质不合适、不纯或劣质的任何物质。因此，纯化的多核苷酸(例如，DNA和RNA)以不同于它在自然界中发现的形式或环境的形式或环境存在，或者以不同于对其进行处理或纯化方法之前存在的形式或环境的形式或环境存在。
质量保证和/或质量控制检查可以使用例如但不限于凝胶电泳、UV吸光度或分析HPLC的方法进行。
III.药物组合物和递送
本文所述的核酸疫苗可以用作治疗剂或预防剂。在一些实施方案中，本公开提供了药物组合物，其包含至少一种药学上可接受的载体和核酸疫苗，即COVID-19核酸疫苗。因此，包含本文所述核酸疫苗的药物组合物可用于预防、缓解和/或治疗COVID-19。
本文提供了可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合使用的核酸疫苗及其药物组合物。药物组合物可以任选地包含一种或多种额外的活性物质，例如治疗性和/或预防性活性物质。本文所述的核酸疫苗的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。
在一些实施方案中，将组合物施用于人类、人类患者或受试者。出于本公开的目的，短语“活性成分(active ingredient)”一般是指待如本文所述递送的核酸疫苗或其中所含的多核苷酸，例如编码用于预防、缓解和/或治疗COVID-19的SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、肽、片段或变体的多核苷酸。
尽管本文所提供的药物组合物的描述主要针对适合施用于人的药物组合物，但本领域技术人员将理解，此类组合物通常适合施用于任何其他动物，例如施用于非人动物，例如，非人哺乳动物。对适合施用于人的药物组合物进行修饰以使该组合物适合施用于各种动物是众所周知的，并且普通兽医药理学家可以仅仅通过普通实验(如果有的话)来设计和/或进行此类修饰。考虑对其施用药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或禽类，包括商业相关的禽类，例如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
制剂
药物制剂可以额外地包含药学上可接受的赋形剂，如本文所用，其包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物(liquid vehicle)、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等，以适合于所需的特定剂型。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备该组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；通过引用以其整体并入本文)。在本公开的范围内可以考虑使用常规赋形剂介质，除非任何常规赋形剂介质可以与物质或其衍生物不相容，如通过产生任何不希望的生物效应或在其他方面以有害方式与药物组合物的任何其他组分相互作用。
本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，并且然后如果必要和/或希望，将产品分割、成型和/或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
根据本公开的药物组合物可以作为一个单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量批量制备、包装和/或出售。如本文所用，“单位剂量(unit dose)”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将要施用于受试者的活性成分的剂量和/或此类剂量的合宜分数，例如此类剂量的二分之一或三分之一。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量将根据所治疗受试者的身份、大小和/或状况以及进一步根据施用组合物的途径而变化。例如，组合物可以包含0.1％至100％，例如0.5至50％、1-30％、5-80％、至少80％(w/w)的活性成分。
在一些实施方案中，本文所述的制剂可以含有至少一种核酸疫苗组合物，例如COVID-19核酸疫苗，例如一种COVID-19mRNA疫苗。作为一个非限制性实例，制剂可以含有具有不同序列的1、2、3、4或5种核酸疫苗组合物，例如具有不同序列的1、2、3、4或5种mRNA疫苗组合物。在一些实施方案中，制剂含有具有不同序列的至少两种核酸疫苗(例如，mRNA疫苗)组合物。在一些实施方案中，制剂含有具有不同序列的至少三种核酸疫苗(例如，mRNA疫苗)组合物。在一些实施方案中，制剂含有具有不同序列的至少四种核酸疫苗(例如，mRNA疫苗)组合物。在一些实施方案中，制剂含有具有不同序列的至少五种核酸疫苗(例如，mRNA疫苗)组合物。
可以使用一种或多种赋形剂来配制本公开的核酸疫苗组合物以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如，从核酸疫苗组合物的贮库制剂(depotformulation)中)；(4)改变生物分布(例如，将核酸疫苗组合物靶向特定组织或细胞类型)；(5)增加编码蛋白质在体内的翻译；和/或(6)改变编码蛋白质在体内的释放曲线。
除了诸如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等传统赋形剂之外，本公开的赋形剂可包括但不限于类脂质(lipidoids)、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合物(lipoplexes)、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用核酸疫苗组合物转染的细胞(例如，用于移植到受试者中)、透明质酸酶、纳米颗粒模拟物及其组合。因此，本公开的制剂可以包括一种或多种赋形剂，每种赋形剂的量共同增加核酸疫苗组合物的稳定性和/或增加核酸疫苗组合物的细胞转染。进一步地，本公开的核酸疫苗组合物可以使用自组装的核酸纳米颗粒来配制。PCT专利申请公开WO 2013/090648(其内容通过引用以其整体并入本文)中公开了可以用于与本公开的核酸疫苗组合物一起配制的核酸的药学上可接受的载体、赋形剂和递送剂。
类脂质
本公开的核酸疫苗组合物可以使用一种或多种类脂质来配制。
类脂质的合成已被广泛描述，并且含有这些化合物的制剂特别适用于寡核苷酸或核酸的递送(参见Mahon等,Bioconjug Chem.2010,21:1448-1454；Schroeder等,J InternMed.2010,267:9-21；Akinc等,Nat Biotechnol.200,826:561-569；Love等,Proc NatlAcad Sci U S A.2010,107:1864-1869；Siegwart等,Proc Natl Acad Sci U S A.2011,108:12996-3001；所有这些文献的内容通过引用以其整体并入本文)。
虽然这些类脂质已用于在啮齿动物和非人灵长类动物中有效递送双链小干扰RNA分子(参见Akinc等,Nat Biotechnol.2008,26:561-569；Frank-Kamenetsky等,Proc NatlAcad Sci U S A.2008,105:11915-11920；Akinc等,Mol Ther.2009,17:872-879；Love等,Proc Natl Acad Sci U S A.2010,107:1864-1869；Leuschner等,Nat Biotechnol.2011,29:1005-1010；所有这些文献的内容通过引用以其整体并入本文)，本公开考虑了它们的配制和用于递送至少一种药学上可接受的载体，包括核酸疫苗。可制备含有这些类脂质的复合物、胶束、脂质体或颗粒，因此，可以在经由局部和/或全身施用途径注射类脂质制剂后有效递送核酸疫苗组合物。含有核酸疫苗组合物的类脂质复合物可以通过多种方式施用，包括但不限于静脉内(IV)、肌内(IM)、皮下(SC)、实质内(IPa)、鞘内(IT)或脑室内(ICV)施用。
核酸的体内递送可能受到许多参数的影响，这些参数包括但不限于制剂组成、颗粒聚乙二醇化的性质、负载程度、多核苷酸与脂质的比例和生物物理参数，例如但不限于粒径(Akinc等,Mol Ther.2009,17:872-879；其内容通过引用以其整体并入本文)。作为一个实例，聚(乙二醇)(PEG)脂质锚链长度的小变化可能对体内功效产生显著影响。可以测试具有不同类脂质的制剂的体内活性，所述类脂质包括但不限于五[3-(1-月桂基氨基丙酰基)]-三亚乙基四胺盐酸盐(TETA-5LAP；也称为98N12-5，参见Murugaiah等,AnalyticalBiochemistry,2010,401:61；其内容通过引用以其整体并入本文)、C12-200(包括衍生物和变体)和MD1。
本文称为“98N12-5”的类脂质由Akinc等,Mol Ther.2009,17:872-879公开，其内容通过引用以其整体并入本文。
本文称为“C12-200”的类脂质被Love等,Proc Natl Acad Sci U S A.2010,107:1864-1869以及Liu和Huang,Molecular Therapy.2010,669-670公开；这两篇文献的内容均通过引用以其整体并入本文。除了核酸疫苗组合物之外，类脂质制剂可以包括包含3种或4种或更多种组分的颗粒。作为一个实例，具有某些类脂质的制剂包括但不限于98N12-5，并且可以含有42％的类脂质、48％的胆固醇和10％的PEG(C14烷基链长度)。作为另一个实例，具有某些类脂质的制剂包括但不限于C12-200，并且可以含有50％的类脂质、10％的二硬脂酰磷脂酰胆碱、38.5％的胆固醇和1.5％的PEG-DMG。
在一些实施方案中，用类脂质配制的核酸疫苗组合物用于全身静脉内施用。例如，最终优化的静脉内制剂使用核酸疫苗组合物并且包含42％98N12-5、48％胆固醇和10％PEG-脂质的脂质摩尔组合物，总脂质与核酸疫苗组合物的最终重量比为约7.5:1，PEG脂质上具有C14烷基链长度，平均粒径为约50-60nm，这样的静脉内制剂可导致制剂在肝脏中的分布大于90％。(参见，Akinc等,Mol Ther.2009,17:872-879；其内容通过引用以其整体并入本文)。在另一个实例中，使用C12-200类脂质的静脉内制剂(参见PCT专利申请公开WO2010129709，其内容通过引用以其整体并入本文)可以具有摩尔比为50/10/38.5/1.5的C12-200/二硬脂酰磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-DMG，总脂质与核酸的重量比为7:1，平均粒径为80nm，可以有效递送核酸疫苗组合物(参见Love等,Proc Natl Acad Sci U S A.2010,107:1864-1869，其内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，含有MD1类脂质的制剂可以用于有效地在体内将核酸疫苗组合物递送至肝细胞。用于肌内或皮下途径的优化的类脂质制剂的特性可以根据靶细胞(targeT-cell)类型和制剂通过细胞外基质扩散到血流中的能力而显著变化。由于内皮窗(endothelial fenestrae)的大小，对于有效的肝细胞递送可能需要小于150nm的粒径(参见Akinc等,Mol Ther.2009,17:872-879，其内容通过引用以其整体并入本文)，使用类脂质配制的核酸疫苗组合物将制剂递送至其他细胞类型，包括但不限于内皮细胞、骨髓细胞和肌肉细胞，可能没有类似的大小限制。
已报告了使用类脂质制剂在体内将siRNA递送至其他非肝细胞细胞如骨髓细胞和内皮细胞(参见Akinc等,Nat Biotechnol.2008,26:561-569；Leuschner等,NatBiotechnol.2011,29:1005-1010；Cho等Adv.Funct.Mater.2009,19:3112-3118；第八届国际Judah Folkman会议，Cambridge，MA，2010年10月8日至9日；其中每一篇的内容通过引用以其整体并入本文)。为了有效递送至骨髓细胞，如单核细胞，类脂质制剂可以具有相似的组分摩尔比。不同比例的类脂质和其他组分，包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-DMG，可以用于优化核酸疫苗组合物的制剂，以递送至不同的细胞类型，包括但不限于肝细胞、骨髓细胞、肌肉细胞等。例如，组分摩尔比可以包括但不限于，50％ C12-200、10％二硬脂酰磷脂酰胆碱、38.5％胆固醇和1.5％ PEG-DMG(参见Leuschner等,Nat Biotechnol2011,29:1005-1010；其内容通过引用以其整体并入本文)。使用类脂质制剂经由皮下或肌内递送将核酸局部递送至细胞，可能不需要全身递送所需的所有制剂组分，因此可以仅包含类脂质和核酸疫苗组合物。
脂质体
可使用一种或多种脂质体来配制本公开的核酸疫苗组合物。
在一些实施方案中，核酸疫苗组合物的药物组合物包括脂质体。脂质体是人工制备的囊泡，其主要可以由脂质双层组成，并且可以用作递送媒介物来施用营养物质和药物制剂。脂质体可以具有不同的大小，例如但不限于多层囊泡(MLV)，其直径可以为数百纳米，并且可以含有一系列由狭窄的水性隔室隔开的同心双层、直径可以小于50nm的小单细胞囊泡(SUV)，以及直径可以在50至500nm之间的大单层囊泡(LUV)。脂质体设计可以包括但不限于调理素(opsonin)或配体，以便改善脂质体对不健康组织的附着或激活事件，例如但不限于内吞作用。脂质体可以含有低或高pH以改善药物制剂的递送。
脂质体的形成可以取决于物理化学特性，例如但不限于包埋的药物制剂和脂质体成分、脂质囊泡分散在其中的介质的性质、包埋物质的有效浓度及其潜在毒性、在囊泡的应用和/或递送期间涉及的任何其他过程、针对预期应用的囊泡的优化尺寸、多分散性和保质期，以及批次间的再现性和大规模生产安全且高效的脂质体产品的可能性。
在一些实施方案中，包含本文所述核酸疫苗的药物组合物可以包括但不限于脂质体，如由以下形成的那些脂质体：1,2-二油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)脂质体、来自Marina Biotech(Bothell,WA)的DiLa2脂质体、(MarinaBiotech,Bothell)、1,2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)和MC3(美国专利申请公开US20100324120；其内容通过引用以其整体并入本文)、基于中性DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)的脂质体(例如，用于卵巢癌的siRNA递送(Landen等Cancer Biology&Therapy 2006,5(12):1708-1713)；其内容通过引用以其整体并入本文)，透明质酸包被的脂质体(Quiet Therapeutics，以色列)，以及可以递送小分子药物的脂质体，例如但不限于来自Janssen Biotech,Inc.(Horsham，PA)的/>。
在一些实施方案中，包含本文所述的核酸疫苗的药物组合物可以包括但不限于脂质体，例如由先前已描述并且示出适用于体外和体内寡核苷酸递送的稳定化质粒-脂质颗粒(SPLP)或稳定化核酸脂质颗粒(SNALP)的合成形成的那些(参见Wheeler等GeneTherapy.1999,6:271-281；Zhang等Gene Therapy.1999,6:1438-1447；Jeffs等PharmRes.2005,22:362-372；Morrissey等,Nat Biotechnol.2005,2:1002-1007；Zimmermann等,Nature.2006,441:111-114；Heyes等J Contr Rel.2005,107:276-287；Semple等NatureBiotech.2010,28:172-176；Judge等J Clin Invest.2009,119:661-673；deFougerollesHum Gene Ther.2008,19:125-132；其中每一篇的内容以其整体并入本文中)。Wheeler等人的原始制造方法为清洁剂透析方法，其后来被Jeffs等人改进并且称为自发囊泡形成方法。除了核酸疫苗组合物之外，脂质体制剂可以包含3至4种脂质组分。作为一个非限制性实例，脂质体可含有但不限于如Jeffs等人所述的55％胆固醇、20％二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、10％PEG-S-DSG和15％1,2-二油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)。作为另一个实例，某些脂质体制剂可以含有但不限于如Heyes等人所述的48％胆固醇、20％ DSPC、2％ PEG-c-DMA以及30％阳离子脂质，其中阳离子脂质可为1,2-二硬脂氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DSDMA)、DODMA、DLin-DMA或1,2-二亚麻酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)。在另一个实例中，核酸-脂质颗粒可以包含阳离子脂质，其占颗粒中存在的总脂质的约50mol％至约85mol％；非阳离子脂质，占存在于颗粒中的总脂质的约13mol％至约49.5mol％；如Maclachlan等人的WO2009127060中所述的抑制颗粒聚集的缀合脂质，其占颗粒中存在的总脂质的约0.5mol％至约2mol％；所述文献内容通过引用以其整体并入本文。在另一个实例中，核酸-脂质颗粒可以是Maclachlan等人的US2006008910中公开的任何核酸-脂质颗粒；所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。作为一个非限制性实例，核酸-脂质颗粒可以包含式I的阳离子脂质、非阳离子脂质和抑制颗粒聚集的缀合脂质。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以配制在脂质囊泡中，该脂质囊泡可以在官能化脂质双层之间具有交联。
在一些实施方案中，脂质体可以包含Bally等人的美国专利号US5595756中公开的糖修饰的脂质，所述文献的内容通过引用整体并入本文。脂质可以是约10mol％的量的神经节苷脂和脑苷脂。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以配制在包含阳离子脂质的脂质体中。脂质体的阳离子脂质中的氮原子与核酸疫苗组合物中的磷酸酯的摩尔比(N:P比)可以在1:1至20:1之间，如PCT专利申请公开号WO2013006825中所述，其内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，脂质体可以具有大于20:1或小于1:1的N:P比。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以配制在脂质-聚阳离子复合物中。脂质-聚阳离子复合物的形成可以通过本领域已知的方法和/或如美国公开号20120178702所述的方法来完成，所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。作为一个非限制性实例，聚阳离子可以包括阳离子肽或多肽，例如但不限于聚赖氨酸、聚鸟氨酸和/或聚精氨酸以及PCT专利申请公开号WO2012013326中描述的阳离子肽；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，核酸疫苗组合物可以配制在脂质-聚阳离子复合物中，该复合物还可以包括中性脂质，例如但不限于胆固醇或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
脂质体制剂可以受到但不限于阳离子脂质组分的选择、阳离子脂质饱和的程度、聚乙二醇化的性质、所有组分的比例和生物物理参数如大小的影响。在Semple等人(Semple等Nature Biotech.2010,28:172-176；其内容通过引用以其整体并入本文)的一个实例中，脂质体制剂包含57.1％阳离子脂质、7.1％二棕榈酰磷脂酰胆碱、34.3％胆固醇和1.4％PEG-c-DMA。
在一些实施方案中，药物组合物可以与Panzner的PCT专利申请公开号：WO2008043575和Essler等人(Marina Biotech)的美国专利号：US 8,580,297中公开的任何两性脂质体一起配制，所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。两性脂质体可以包含脂质混合物，包括阳离子两亲物、阴离子两亲物和任选的一种或多种中性两亲物。两性脂质体可以包含基于两性分子的两性化合物，其头部基团被一个或多个两性基团取代。在一些实施方案中，药物组合物可以与两性脂质一起配制，所述两性脂质包含具有4至9之间的等电点的一个或多个两性基团，如Essler等人(Marina Biotech)的美国专利申请公开号：US20140227345中所公开的，其内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，药物组合物可以与Panzner等人(Novosom)的美国专利号US7312206中所公开的包含固醇衍生物的脂质体一起配制，所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，药物组合物可以与包含至少一种两亲阳离子脂质、至少一种两亲阴离子脂质和至少一种中性脂质的两性脂质体一起配制，或脂质体包含具有正电荷和负电荷两者的至少一种两亲脂质，和至少一种中性脂质，其中脂质体在pH 4.2和pH7.5下是稳定的，如Panzner等人(Novosom)的美国专利号7780983所公开的，其内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，药物组合物可以与脂质体一起配制，所述脂质体包含Panzner等人的美国专利申请公开号：US20110076322(其内容通过引用以其整体并入本文)中教导的血清稳定的脂质混合物，其能够包封本公开的核酸疫苗组合物。脂质混合物包含比例在约0.5至约8范围内的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。脂质混合物还可以包括pH敏感的阴离子和阳离子两亲物，使得混合物是两性的，在pH 7.4时带负电荷或为中性并且在pH 4下带正电荷。可以调整药物/脂质比例以将脂质体靶向特定器官或身体的其他部位。在一些实施方案中，装载有本公开的核酸疫苗组合物作为负荷(cargo)的脂质体通过Panzner等人的美国专利申请公开号：US20120021042中公开的方法制备，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。该方法包括混合聚阴离子活性剂的水性溶液和一种或多种两亲物的醇溶液并将所述混合物缓冲至酸性pH的步骤，其中所述一种或多种两亲物易于在酸性pH下形成两性脂质体，从而在包封活性剂的悬浮液中形成两性脂质体。
脂质复合物
可使用一种或多种脂质复合物来配制本公开的核酸疫苗组合物。
在一些实施方案中，核酸疫苗组合物可以配制成脂质复合物，例如但不限于来自Silence Therapeutics(伦敦，英国)的ATUPLEXTM系统、DACC系统、DBTC系统和其他siRNA-脂质复合物技术，来自(Cambridge,MA)的STEMFECTTM和聚乙烯亚胺(PEI)或基于鱼精蛋白的靶向和非靶向递送核酸(Aleku等Cancer Res.2008,68:9788-9798；Strumberg等Int J Clin Pharmacol Ther,2012,50:76-78；Santel等,Gene Ther,2006,13:1222-1234；Santel等,Gene Ther.,2006,13:1360-1370；Gutbier等,PulmPharmacol.Ther.2010,23:334-344；Kaufmann等Microvasc Res.,2010,80:286-293；Weide等J Immunother.,2009,32:498-507；Weide等JImmunother.,2008,31:180-188；Pascolo.,Expert Opin.Biol.Ther.4:1285-1294；Fotin-Mleczek等,J.Immunother.,2011,34:1-15；Song等,Nature Biotechnol.2005,23:709-717；Peer等,Proc Natl Acad Sci U SA.2007,6；104:4095-4100；deFougerolles Hum Gene Ther.2008,19:125-132；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文)。
脂质纳米颗粒(LNP)
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。通常，LNP可表征为具有以下的小固体或半固体颗粒：具有暴露于非LNP环境的亲水性外表面的外部脂质层，可以是水性(囊泡样)或非水性(胶束样)的内部空间和至少一个疏水性膜间空间。LNP膜可以是层状的或非层状的并且可以包含1、2、3、4、5层或更多层。在一些实施方案中，LNP可以包括进入其内部空间、进入膜间空间、位于其外表面上或其任何组合的负荷或有效载荷(payload)。
可用于本文的LNP是本领域中已知的并且通常包含胆固醇(有助于稳定性并促进膜融合)、磷脂(其为LNP双层提供结构并且还可以有助于内体逃逸)、聚乙二醇(PEG)衍生物(其减少LNP聚集并“掩护(shield)”LNP免受免疫细胞的非特异性内吞作用)和可电离脂质(复合带负电荷的RNA并增强内体逃逸)，它们形成了形成LNP的组合物。
可以基于期望的靶标、向性(tropism)、负荷、大小或其他期望的特征或性质来选择LNP的组分。
LNP可以是PCT专利申请公开号WO2012170930中描述的脂质纳米颗粒，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以配制在包含至少一种阳离子脂质的LNP中。
在一些实施方案中，可以用于本公开的制剂中的阳离子脂质可以选自但不限于以下文献中描述的阳离子脂质：PCT专利申请公开号WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724、WO201021865和WO2008103276，US专利号7,893,302、7,404,969和8,283,333以及US专利公开号US20100036115和US20120202871，其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。阳离子脂质还可以选自但不限于PCT专利申请公开号WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365和WO2012044638中描述的式A；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。或者，阳离子脂质可以选自但不限于PCT专利申请号WO2008103276的式CLI-CLXXIX、美国专利号7,893,302的式CLI-CLXXIX、美国专利号7,404,969的式CLI-CLXXXXII和美国专利公开号US20100036115的式I-VI；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。阳离子脂质可以是多价阳离子脂质，如Gaucheron等人的美国专利号7,223,887中公开的阳离子脂质，其内容通过引用以其整体并入本文。如Gaucheron等人的美国专利号7,223,887中所述，阳离子脂质可以具有包括两个季胺基团的带正电荷的头部基团，和包括四个烃链的疏水部分。阳离子脂质可以是生物可降解的，例如在Maier等人的美国专利申请公开号：US20130195920中公开的生物可降解的脂质，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。阳离子脂质可以具有位于阳离子脂质的脂质部分中的一个或多个生物可降解的基团，如在Maier等人的US20130195920中的式I-IV中所述的。
在一些实施方案中，阳离子脂质还可以是在Manoharan等人的US20130156845和Manoharan等人的US20130129785、Wasan等人的WO 2012047656、Chen等人的WO2010144740、Ansell等人的WO 2013086322或Manoharan等人的WO 2012016184中公开的阳离子脂质，所述文献每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文。
作为一个非限制性实例，阳离子脂质可以选自(20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九-20,23-二烯-10-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六-17,20-二烯-9-胺、(1Z,19Z)-N5N-二甲基二十五-16,19-二烯-8-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基二十二-13,16-二烯-5-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基二十一-12,15-二烯-4-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三-14,17-二烯-6-胺、(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四-15,18-二烯-7-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七-18,21-二烯-10-胺、(15Z,18Z)-Ν,Ν-二甲基二十四-15,18-二烯-5-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三-14,17-二烯-4-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八-19,22-二烯-9-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七-18,21-二烯-8-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六-17,20-二烯-7-胺、(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五-16,19-二烯-6-胺、(22Z,25Z)-N,N-二甲基三十一-22,25-二烯-10-胺、(21Z,24Z)-N,N-二甲基三十-21,24-二烯-9-胺、(18Z)-N,N-二甲基二十七-18-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十六-17-烯-9-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八-19,22-二烯-7-胺、N,N-二甲基二十七烷-10-胺、(20Z,23Z)-N-乙基-N-甲基二十九-20,23-二烯-10-胺、1-[(11Z,14Z)-1-壬基二十-11,14-二烯-1-基]吡咯烷、(20Z)-N,N-二甲基二十七-20-烯-10-胺、(15Z)-N,N-二甲基二十七-15-烯-10-胺、(14Z)-N,N-二甲基二十九-14-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十九-17-烯-10-胺、(24Z)-N,N-二甲基三十三-24-烯-10-胺、(20Z)-N,N-二甲基二十九-20-烯-10-胺、(22Z)-N,N-二甲基三十一-22-烯-10-胺、(16Z)-N,N-二甲基二十五-16-烯-8-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一-12,15-二烯-1-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二-13,16-二烯-1-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺、1-[(1S,2R)-2-己基环丙基]-N,N-二甲基十九烷-10-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十九烷-10-胺、N,N-二甲基-21-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]二十一烷-10-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]十九烷-10-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十六烷-8-胺、Ν,Ν-二甲基-[(1R,2S)-2-十一烷基环丙基]十四烷-5-胺、N,N-二甲基-3-{7-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]庚基}十二烷-1-胺、1-[(1R,2S)-2-庚基环丙基]-Ν,Ν-二甲基十八烷-9-胺、1-[(1S,2R)-2-癸基环丙基]-N,N-二甲基十五烷-6-胺、N,N-二甲基-1-[(lS,2R)-2-辛基环丙基]十五烷-8-胺、R-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]-3-(辛基氧基)丙烷-2-胺、S-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]-3-(辛基氧基)丙烷-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛基氧基)甲基]乙基}吡咯烷、(2S)-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]-3-[(5Z)-辛-5-烯-1-基氧基]丙烷-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛基氧基)甲基]乙基}氮杂环丁烷、(2S)-1-(己基氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-2-胺、(2S)-1-(庚基氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-2-胺、Ν,Ν-二甲基-1-(壬基氧基)-3-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-2-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(9Z)-十八-9-烯-1-基氧基]-3-(辛基氧基)丙烷-2-胺；(2S)-N,N-二甲基-1-[(6Z,9Z,12Z)-十八-6,9,12-三烯-1-基氧基]-3-(辛基氧基)丙烷-2-胺、(2S)-1-[(11Z,14Z)-二十-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(戊基氧基)丙烷-2-胺、(2S)-1-(己基氧基)-3-[(11Z,14Z)-二十-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基丙烷-2-胺、1-[(11Z,14Z)-二十-11,14-二烯-1-基氧基]-Ν,Ν-二甲基-3-(辛基氧基)丙烷-2-胺、1-[(13Z,16Z)-二十二-13,16-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛基氧基)丙烷-2-胺、(2S)-1-[(13Z,16Z)-二十二-13,16-二烯-1-基氧基]-3-(己基氧基)-N,N-二甲基丙烷-2-胺、(2S)-1-[(13Z)-二十二-13-烯-1-基氧基]-3-(己基氧基)-N,N-二甲基丙烷-2-胺、1-[(13Z)-二十二-13-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛基氧基)丙烷-2-胺、1-[(9Z)-十六-9-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛基氧基)丙烷-2-胺、(2R)-N,N-二甲基-H(1-甲基辛基)氧基]-3-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-2-胺、(2R)-1-[(3,7-二甲基辛基)氧基]-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-2-胺、N,N-二甲基-1-(辛基氧基)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]辛基}氧基)丙烷-2-胺、N,N-二甲基-1-{[8-(2-辛基环丙基)辛基]氧基}-3-(辛基氧基)丙烷-2-胺和(11E,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九-11,20,2-三烯-10-胺，或其药学上可接受的盐或立体异构体。在一些实施方案中，脂质可以是可裂解脂质，如PCT专利申请公开号WO2012170889中描述的那些，其内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒可以包含本文所述和/或本领域已知的至少一种阳离子聚合物。
在一些实施方案中，阳离子脂质可以通过本领域已知的和/或以下文献中描述的方法合成：PCT专利申请公开号WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724和WO201021865；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，核酸疫苗组合物的药物组合物可以包括PCT专利申请公开号WO2012099755中描述的聚乙二醇化脂质中的至少一种，其内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒(LNP)制剂中PEG的比例可以增加或减少和/或PEG脂质的碳链长度可以从C14修改为C18以改变LNP制剂的药代动力学和/或生物分布。作为一个非限制性实例，LNP制剂可以含有与阳离子脂质、DSPC和胆固醇相比脂质摩尔比为1-5％的PEG-c-DOMG。在一些实施方案中，核酸疫苗组合物的LNP制剂可以含有3％脂质摩尔比的PEG-c-DOMG。在一些实施方案中，核酸疫苗组合物的LNP制剂可以含有1.5％脂质摩尔比的PEG-c-DOMG。
在一些实施方案中，PEG-c-DOMG可以被PEG脂质替代，例如但不限于PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)或PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)。阳离子脂质可以选自本领域已知的任何脂质，例如但不限于DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200和DLin-KC2-DMA。
在一些实施方案中，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000])，一种本领域已知的阳离子脂质。在一些实施方案中，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000和至少一种其他组分。在一些实施方案中，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000、DSPC和胆固醇。作为一个非限制性实例，LNP制剂可以含有PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC和胆固醇。作为另一个非限制性实例，LNP制剂可以含有摩尔比为2:40:10:48的PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC和胆固醇(参见例如Geall等,Nonviraldelivery of self-amplifying RNA vaccines,PNAS,2012,109(36):14604-14609；通过引用以其整体并入本文)。
作为另一个非限制性实例，本文所述的核酸疫苗组合物可以配制在纳米颗粒中以通过胃肠外途径递送，如美国专利申请公开号US20120207845中所述；其内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以与多种阳离子脂质一起配制，如在Hope等人的美国专利申请公开号：US20130017223中描述的第一和第二阳离子脂质，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。可以基于第一性质选择第一阳离子脂质并且可以基于第二性质选择第二阳离子脂质，其中可以如US20130017223中概述的那样测定这些性质。在一些实施方案中，第一和第二性质是互补的。
本文所述的核酸疫苗组合物可以用脂质颗粒配制，该脂质颗粒包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种第二脂质，以及一种或多种核酸，其中该脂质颗粒包含固体核心，如Cullis等人的美国专利公开号US20120276209中所述，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以在水包油(o/w)乳液中与阳离子两亲物复合，如Satishchandran等人的欧洲公开号：EP2298358中所述，其内容通过引用以其整体并入本文。阳离子两亲物可以是阳离子脂质、修饰或未修饰的精胺、丁哌卡因(bupivacaine)或苯扎氯铵(benzalkonium chloride)，油可以是植物油或动物油。作为一个非限制性实例，至少10％的核酸-阳离子两亲物复合物在水包油乳液的油相中(参见例如Satishchandran等人的EP2298358中描述的复合物，该文献的内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以与包含阳离子化合物和中性脂质的混合物的组合物一起配制。作为一个非限制性实例，阳离子化合物可以是在Ansell等人的PCT专利申请公开号：WO 1999010390中公开的式(I)，该文献的内容通过引用以其整体描述在本文中，中性脂质可以选自二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺和鞘磷脂。在另一个非限制性实例中，脂质制剂可以包含Akinc等人的美国专利公开号：US20120101148中公开的式A的阳离子脂质、中性脂质、固醇和PEG或PEG修饰的脂质，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，LNP制剂可以通过国际公开号WO2011127255或WO2008103276中描述的方法来配制。作为一个非限制性实例，本公开的核酸疫苗组合物可以包封在WO2011127255和/或WO2008103276中描述的任何脂质纳米颗粒(LNP)制剂中；其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的LNP制剂可以包含聚阳离子组合物。作为一个非限制性实例，聚阳离子组合物可以选自美国专利公开号US20050222064的式1-60；其内容通过引用以其整体并入本文。包含聚阳离子组合物的LNP制剂可以用于体内和/或体外递送本文所述的核酸疫苗组合物。
在一些实施方案中，本文所述的LNP制剂可以另外包含渗透性增强剂分子。非限制性的渗透性增强剂分子描述于美国专利公开号US20050222064；其内容通过引用以其整体并入本文。
纳米颗粒制剂可以是包含碳水化合物载体和核酸疫苗组合物的碳水化合物纳米颗粒(例如，COVID-19核酸疫苗)。作为一个非限制性实例，碳水化合物载体可以包括但不限于酸酐修饰的植物糖原或糖原类型物质、植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐修饰的植物糖原β-糊精。(参见例如PCT专利申请公开号WO2012109121；其内容通过引用以其整体并入本文)。
可以通过用称为快速消除型脂质纳米颗粒(reLNP)的生物可降解阳离子脂质替代阳离子脂质来改进脂质纳米颗粒制剂。已显示可电离的阳离子脂质如但不限于DLinDMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA随时间推移在血浆和组织中积累并且可能是潜在的毒性来源。快速消除型脂质的快速代谢可使脂质纳米颗粒在大鼠中的耐受性和治疗指数从1mg/kg剂量提高至10mg/kg剂量的数量级。包括酶促降解的酯键可改善阳离子组分的降解和代谢概况，同时仍维持reLNP制剂的活性。酯键可位于脂质链的内部或它可以最终位于脂质链的末端上。内酯键可以替代脂质链中的任何碳。
在一些实施方案中，核酸疫苗组合物被配制为固体脂质纳米颗粒。固体脂质纳米颗粒(SLN)可以是平均直径在10至1000nm之间的球形。SLN具有固体脂质核心基质，其可溶解亲脂性分子，并且可以用表面活性剂和/或乳化剂稳定。脂质纳米颗粒可以是自组装脂质-聚合物纳米颗粒(参见Zhang等,ACS Nano,2008,2(8):1696–1702；其内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，还可以构建或改变包含本文所述核酸疫苗组合物的制剂，使得它们在体内被动或主动地针对不同的细胞类型，包括但不限于免疫细胞、内皮细胞、抗原呈递细胞和白细胞(Akinc等Mol Ther.2010,18:1357-1364；Song等,NatBiotechnol.2005,23:709-717；Judge等,J Clin Invest.2009,119:661-673；Kaufmann等,Microvasc Res,2010,80:286-293；Santel等,Gene Ther 2006,13:1222-1234；Santel等,Gene Ther,2006,13:1360-1370；Gutbier等,Pulm Pharmacol.Ther.2010,23:334-344；Basha等,Mol.Ther.2011,19:2186-2200；Fenske和Cullis,Expert Opin DrugDeliv.2008,5:25-44；Peer等,Science.2008,319:627-630；Peer和Lieberman,GeneTher.2011,18:1127-1133；其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文)。将制剂被动靶向肝细胞的一个实例包括基于DLin-DMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA的脂质纳米颗粒制剂，已显示其与载脂蛋白E结合并促进这些制剂在体内结合和被摄取到肝细胞中(Akinc等Mol Ther.2010,18:1357-1364；其内容通过引用以其整体并入本文)。还可以通过在其表面上表达不同的配体例如但不限于叶酸、转铁蛋白、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和抗体靶向方法来使制剂选择性地靶向(Kolhatkar等,Curr Drug Discov Technol.2011,8:197-206；Musacchio and Torchilin,Front Biosci.2011,16:1388-1412；Yu等,Mol MembrBiol.2010,27:286-298；Patil等,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.2008,25:1-61；Benoit等,Biomacromolecules.2011,12:2708-2714；Zhao等,Expert Opin DrugDeliv.2008,5:309-319；Akinc等,Mol Ther.2010,18:1357-1364；Srinivasan等,MethodsMol Biol.2012,820:105-116；Ben-Arie等,Methods Mol Biol.2012,757:497-507；Peer JControl Release.2010,20:63-68；Peer等,Proc Natl Acad Sci U S A.2007,104:4095-4100；Kim等,Methods Mol Biol.2011,721:339-353；Subramanya等,Mol Ther.2010,18:2028-2037；Song等,Nat Biotechnol.2005,23:709-717；Peer等,Science.2008,319:627-630；Peer和Lieberman,Gene Ther.2011,18:1127-1133；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可被配制用于控制释放和/或靶向递送。如本文所用，“控制释放(controlled release)”是指遵循用于影响治疗结果的具体释放模式的药物组合物或化合物释放概况。在一些实施方案中，可以将核酸疫苗组合物包封到本文描述和/或本领域中已知用于控制释放和/或靶向递送的递送剂中。如本文所使用，术语“包封(encapsulate)”意指封住、包围或包住。在它涉及本公开组合物的制剂时，包封可以为基本上的、完全的或部分的。术语“基本上包封(substantially encapsulated)”意指至少大于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.999％的本公开的药物组合物可以在递送剂内被封住、包围或包住。“部分包封(partially encapsulated)”意指小于10％、20％、30％、40％、50％或更少的本公开的药物组合物或化合物可以在递送剂内被封住、包围或包住。有利地，可以通过使用荧光和/或电子显微照片测量本公开的药物组合物的逃逸或活性来确定包封。例如，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％的本公开的药物组合物被包封在递送剂中。
核酸疫苗组合物可以被包封到脂质纳米颗粒或快速消除型脂质纳米颗粒中，并且脂质纳米颗粒或快速消除型脂质纳米颗粒然后可以被包封到本文描述和/或本领域中已知的聚合物、水凝胶和/或外科密封剂中。作为一个非限制性实例，聚合物、水凝胶或外科密封剂可以是PLGA、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、(Nanotherapeutics,Inc.Alachua,FL)、/>(Halozyme Therapeutics,San Diego CA)、外科密封剂如纤维蛋白原聚合物(Ethicon Inc.Cornelia,GA)、/>(BaxterInternational,Inc.,Deerfield,IL)、基于PEG的密封剂以及/>(BaxterInternational,Inc.,Deerfield,IL)。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒可以被包封到本领域已知的任何聚合物中，当注射到受试者中时该聚合物可以形成凝胶。作为另一个非限制性实例，脂质纳米颗粒可以被包封到聚合物基质中，所述聚合物基质可以是生物可降解的。
在一些实施方案中，包含用于控制释放和/或靶向递送的核酸疫苗组合物的制剂还可以包括至少一种控制释放包衣。控制释放包衣包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、/> 和纤维素衍生物，如乙基纤维素水性分散体(/>和/>)。
在一些实施方案中，控制释放和/或靶向递送制剂可以包含至少一种可降解聚酯，其可以含有聚阳离子侧链。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)，及其组合。在一些实施方案中，可降解聚酯可以包括PEG缀合以形成聚乙二醇化聚合物。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以与具有靶向部分的靶向脂质一起配制，如Manoharan等人的美国专利申请公开号：US20130202652中公开的靶向部分，其内容通过引用以其整体并入本文。作为一个非限制性实例，可以选择Manoharan等人的US20130202652的式I的靶向部分，以有利于脂质定位于目标器官、组织、细胞、细胞类型或亚型或细胞器。本公开中考虑的非限制性靶向部分包括转铁蛋白、茴香酰胺、RGD肽、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、岩藻糖、抗体或适体。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以被包封在治疗性纳米颗粒中。治疗性纳米颗粒可以通过本文描述的和本领域已知的方法配制，例如但不限于PCT专利申请公开号WO2010005740、WO2010030763、WO2010005721、WO2010005723和WO2012054923，美国公开号US20110262491、US20100104645、US20100087337、US20100068285、US20110274759、US20100068286和US20120288541，以及美国专利号8,206,747、8,293,276、8,318,208和8,318,211；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。治疗性聚合物纳米颗粒可以通过美国公开号US20120140790中描述的方法来鉴定，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，治疗性纳米颗粒可以被配制用于持续释放。如本文所用，“持续释放(sustained release)”是指在特定时间段内遵循释放速率的药物组合物或化合物。时间段可以包括但不限于数小时、数天、数周、数个月和数年。作为一个非限制性实例，持续释放纳米颗粒可以包含聚合物和治疗剂例如但不限于本公开的核酸疫苗(参见PCT专利申请公开号WO2010075072以及US公开号US20100216804、US20110217377和US20120201859，其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，治疗性纳米颗粒可以被配制为靶特异性的。作为一个非限制性实例，治疗性纳米颗粒可以包括皮质类固醇(参见PCT专利申请公开号WO2011084518；其内容通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中，治疗性纳米颗粒可以配制为癌症特异性的。作为一个非限制性实例，治疗性纳米颗粒可以配制在以下文献中描述的纳米颗粒中：PCT专利申请公开号WO2008121949、WO2010005726、WO2010005725和WO2011084521，以及美国公开号US20100069426、US20120004293和US20100104655，其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的纳米颗粒可以包含聚合物基质。作为一个非限制性实例，纳米颗粒可以包含两种或更多种聚合物，例如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羟基酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)，或其组合。
在一些实施方案中，治疗性纳米颗粒包含二嵌段共聚物。在一些实施方案中，二嵌段共聚物可以包括与聚合物组合的PEG，所述聚合物例如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羟基酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)，或其组合。
作为一个非限制性实例，治疗性纳米颗粒包含PLGA-PEG嵌段共聚物(参见美国公开号US20120004293和美国专利号8,236,330，其每一篇通过引用以其整体并入本文)。在另一个非限制性实例中，治疗性纳米颗粒是隐形(stealth)纳米颗粒，其包含PEG和PLA或PEG和PLGA的二嵌段共聚物(参见美国专利号8,246,968和PCT专利申请公开号WO2012166923，其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，治疗性纳米颗粒可以包含多嵌段共聚物，例如但不限于美国专利号8,263,665和8,287,910中描述的多嵌段共聚物；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物可以包含在包含非聚合胶束和嵌段共聚物的聚离子复合物中。(参见例如美国公开号US20120076836；其内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，用于递送本文所述核酸疫苗的纳米颗粒包括嵌段共聚物。嵌段共聚物的非限制性实例包括PCT专利申请公开号WO2015017519的式I、式II、式III、式IV、式V、式VI和式VII的那些，其内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，治疗性纳米颗粒可以包含至少一种丙烯酸聚合物。丙烯酸聚合物包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯，及其组合。
在一些实施方案中，治疗性纳米颗粒可以包含至少一种含胺聚合物，例如但不限于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(酰氨基胺)树枝状大分子(poly(amidoamine)dendrimer)、聚(β-氨基酯)(参见例如美国专利号8,287,849；其内容通过引用以其整体并入本文)，及其组合。
在一些实施方案中，治疗性纳米颗粒可以包含至少一种可降解聚酯，所述可降解聚酯可以包含聚阳离子侧链。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)，及其组合。可降解聚酯可以包括PEG缀合以形成聚乙二醇化聚合物。
在一些实施方案中，治疗性纳米颗粒可以包括至少一种靶向配体的缀合。靶向配体可以是本领域已知的任何配体，例如但不限于单克隆抗体。(Kirpotin et al,CancerRes.2006,66:6732-6740；其内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，治疗性纳米颗粒可以配制在可用于靶向癌症的水性溶液中(参见PCT专利申请公开号WO2011084513和美国公开号US20110294717，其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，核酸疫苗组合物可以包封在合成纳米载体中、连接至合成纳米载体和/或与合成纳米载体缔合(associate)。合成纳米载体包括但不限于以下文献中所述的那些：PCT专利申请公开号WO2010005740、WO2010030763、WO201213501、WO2012149252、WO2012149255、WO2012149259、WO2012149265、WO2012149268、WO2012149282、WO2012149301、WO2012149393、WO2012149405、WO2012149411、WO2012149454和WO2013019669，以及美国公开号US20110262491、US20100104645、US20100087337和US20120244222，其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文。可以使用本领域已知的和/或本文描述的方法来配制合成纳米载体。作为一个非限制性实例，合成纳米载体可以通过以下文献中描述的方法进行配制：PCT专利申请公开号WO2010005740、WO2010030763和WO201213501以及美国公开号US20110262491、US20100104645、US20100087337和US2012024422，其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文。合成纳米载体制剂可以通过PCT专利申请公开号WO2011072218和美国专利号8,211,473中描述的方法进行冻干；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，合成纳米载体可以含有反应性基团以释放本文所述的核酸疫苗组合物(参见PCT专利申请公开号WO20120952552和美国公开号US20120171229，其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，合成纳米载体可以被配制用于靶向释放。在一些实施方案中，合成纳米载体可以配制为在指定pH和/或在期望时间间隔后释放核酸疫苗组合物。作为一个非限制性实例，合成纳米颗粒可以被配制为在24小时后和/或在pH 4.5下释放核酸疫苗组合物(参见PCT专利申请公开号WO2010138193和WO2010138194以及US公开号US20110020388和US20110027217，其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，合成纳米载体可以被配制用于本文描述的核酸疫苗组合物的控制释放和/或持续释放。作为一个非限制性实例，用于持续释放的合成纳米载体可以通过本领域已知的、本文描述的和/或如PCT专利申请公开号WO2010138192和美国公开号US20100303850中所述的方法配制，其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，可以优化纳米颗粒以用于口服施用。纳米颗粒可以包含至少一种阳离子生物聚合物，例如但不限于壳聚糖或其衍生物。作为一个非限制性实例，纳米颗粒可以通过美国公开号US20120282343中描述的方法来配制；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以配制在模块化组合物(modularcomposition)中，如Manoharan等人的美国专利号US 8,575,123中描述的，其内容通过引用以其整体并入本文。作为一个非限制性实例，模块化组合物可以包含核酸如本公开的核酸疫苗组合物、至少一种内体溶解(endosomolytic)组分和至少一种靶向配体。模块化组合物可以具有诸如Manoharan等人的US 8,575,123中描述的任何配方的配方。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以被包封在脂质制剂中以形成稳定的核酸-脂质颗粒(SNALP)，如de Fougerolles等人的美国专利号US8,546,554中描述的，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。脂质可以是阳离子的或非阳离子的。在一个非限制性实例中，脂质与核酸的比(质量/质量比)(例如脂质与核酸疫苗组合物的比)将在约1:1至约50:1、约1:1至约25:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围内，或者是5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或11:1。在另一个实例中，SNALP包括40％2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(脂质A)、10％二油酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、40％胆固醇、10％聚乙二醇(PEG)-C-DOMG(摩尔百分比)，粒径为63.0±20nm，核酸/脂质比为0.027。
本公开的核酸疫苗组合物可以与包含如Lam等人的美国专利号US 7,189,705中所公开的内体膜去稳定剂的核酸-脂质颗粒一起配制，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。作为一个非限制性实例，内体膜去稳定剂可以是Ca2+离子。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以与Akinc等人的美国专利号US8,148,344中公开的配制的脂质颗粒(FLiP)一起配制，所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。Akinc等人教导FLiP可以包含其中寡核苷酸已经与亲脂体(lipophile)缀合的单链或双链寡核苷酸中的至少一种，以及已经与缀合的寡核苷酸聚集、混合或缔合的乳液或脂质体中的至少一种。如Akinc等人的US 8148344中所公开的，已令人惊讶地显示出这些颗粒有效地将寡核苷酸递送至心脏、肺和肌肉。
在一些实施方案中，可以使用如Tam等人的美国专利号US 6,086,913中所述的包含在脂质制剂中的表达载体的组合物将本公开的核酸疫苗组合物递送至细胞，所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。Tam公开的组合物是血清稳定的并且包含表达载体，该表达载体包含来自腺相关病毒(AAV)的第一和第二反向重复序列、来自AAV的rep基因和核酸片段。Tam中的表达载体与脂质复合。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以与de Fougerolles等人的美国公开号US20120270921中公开的脂质制剂一起配制，所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。在一个非限制性实例中，脂质制剂可以包括具有描述于US20120270921中的式A的阳离子脂质。在另一个非限制性实例中，US20120270921的表A中公开的示例性核酸-脂质颗粒的组合物可以与本公开的核酸疫苗组合物一起使用。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以完全包封在Maurer等人的US公开号US20120276207中公开的脂质颗粒中，所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。颗粒可以包含脂质组合物，该脂质组合物包含预先形成的脂质囊泡、带电荷的治疗剂和去稳定剂以在去稳定溶剂中形成预先形成的囊泡和治疗剂的混合物，其中去稳定溶剂有效地使预先形成的脂质囊泡的膜去稳定而不破坏囊泡。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以与缀合脂质一起配制。在一个非限制性实例中，缀合脂质可以具有诸如Lin等人的US公开号US20120264810中描述的配方，所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。缀合物脂质可以形成脂质颗粒，该脂质颗粒还包含阳离子脂质、中性脂质和能够减少聚集的脂质。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以配制在中性脂质体制剂中，例如Fitzgerald等人的美国公开号US20120244207中所公开的，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。短语“中性脂质体制剂”是指在生理pH下具有近中性或中性表面电荷的脂质体制剂。生理pH可以是例如约7.0至约7.5，或例如约7.5，或例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，或例如7.3，或例如7.4。中性脂质体制剂的一个实例是可电离脂质纳米颗粒(iLNP)。中性脂质体制剂可包括可电离阳离子脂质，例如DLin-KC2-DMA。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以与带电荷的脂质或氨基脂质一起配制。如本文所用，术语“带电荷的脂质(charged lipid)”意为包括具有一个或两个脂肪酰基或脂肪烷基链和季氨基头基的那些脂质。季胺带有永久正电荷。头基可任选地包括可电离基团，如可以在生理pH下质子化的伯胺、仲胺或叔胺。相对于缺少季胺(例如，季胺被叔胺替代)的结构相似化合物中的可电离基团的pKa，季胺的存在可改变该可电离基团的pKa。在一些实施方案中，带电荷的脂质被称为“氨基脂质”。在一个非限制性实例中，氨基脂质可以是Hope等人的美国公开号US20110256175中描述的任何氨基脂质，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。例如，氨基脂质可以具有Hope的表3-7中公开的结构，如结构(II)、DLin-K-C2-DMA、DLin-K2-DMA、DLin-K6-DMA等。得到的药物制备物可以根据Hope进行冻干。在另一个非限制性实例中，氨基脂质可以是Hope等人的US 20110117125(该文献的内容通过引用以其整体并入本文)中描述的任何氨基脂质，如结构(I)的脂质、DLin-K-DMA、DLin-C-DAP、DLin-DAC、DLin-MA、DLin-S-DMA等。在另一个非限制性实例中，氨基脂质可以具有Manoharan等人的PCT专利申请公开号WO2009132131中所述的结构(I)、(II)、(III)或(IV)、或4-(R)-DLin-K-DMA(VI)、4-(S)-DLin-K-DMA(V)，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。在另一个非限制性实例中，在本文所述的任何制剂中使用的带电荷的脂质可以是Manoharan等人的EP2509636中描述的任何带电荷的脂质，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以用缔合复合物(associationcomplex)配制。在一个非限制性实例中，缔合复合物包含Manoharan等人的美国专利号US8,034,376中公开的各自具有式(I)定义的结构的一种或多种化合物、具有式(XV)定义的结构的PEG-脂质、类固醇和核酸，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。核酸疫苗组合物可以与美国专利号US8,034,376中描述的任何缔合复合物一起配制，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以与反向头基脂质一起配制。作为一个非限制性实例，核酸疫苗组合物可以与包含头基的两性离子脂质一起配制，其中正电荷位于酰基链区域附近并且负电荷位于头基的远端，如Leung等人的PCT专利申请公开号WO2011056682中描述的具有结构(A)或结构(I)的脂质，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以配制在脂质双层载体中。作为一个非限制性实例，核酸疫苗组合物可以与脂质-去污剂混合物组合，该脂质-去污剂混合物包含约5mol％至约20mol％的量的防止聚集剂、约0.5mol％至约50mol％的量的阳离子脂质、以及融合脂质和去污剂的脂质混合物，以提供核酸-脂质-去污剂混合物；然后用缓冲盐溶液透析核酸-脂质-去污剂混合物以去除去污剂并将核酸包封在脂质双层载体中并提供脂质双层-核酸组合物，其中缓冲盐溶液具有足以包封约40％至约80％的核酸的离子强度，如Cullis等人的PCT专利申请公开号WO1999018933中所述的，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以包含(a)核酸；(b)1.0摩尔％至45摩尔％的阳离子脂质；(c)0.0摩尔％至90摩尔％的另一种脂质；(d)1.0摩尔％至10摩尔％的双层稳定组分；(e)0.0摩尔％至60摩尔％的胆固醇；(f)0.0摩尔％至10摩尔％的阳离子聚合物脂质，如Cullis等人的EP1328254中所述的，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用较小的LNP递送核酸疫苗。这样的颗粒的直径可以为低于0.1μm或高达100nm，例如但不限于小于0.1μm，小于1.0μm，小于5μm，小于10μm，小于15μm，小于20μm，小于25μm，小于30μm，小于35μm，小于40μm，小于50μm，小于55μm，小于60μm，小于65μm，小于70μm，小于75μm，小于80μm，小于85μm，小于90μm，小于95μm，小于100μm，小于125μm，小于150μm，小于175μm，小于200μm，小于225μm，小于250μm，小于275μm，小于300μm，小于325μm，小于350μm，小于375μm，小于400μm，小于425μm，小于450μm，小于475μm，小于500μm，小于525μm，小于550μm，小于575μm，小于600μm，小于625μm，小于650μm，小于675μm，小于700μm，小于725μm，小于750μm，小于775μm，小于800μm，小于825μm，小于850μm，小于875μm，小于900μm，小于925um，小于950μm，小于975μm。
在另一个实施方案中，核酸疫苗可以使用较小的LNP递送，该较小的LNP的直径可以为约1nm至约100nm，约1nm至约10nm，约1nm至约20nm，约1nm至约30nm，约1nm至约40nm，约1nm至约50nm，约1nm至约60nm，约1nm至约70nm，约1nm至约80nm，约1nm至约90nm，约5nm至约from 100nm，约5nm至约10nm，约5nm至约20nm，约5nm至约30nm，约5nm至约40nm，约5nm至约50nm，约5nm至约60nm，约5nm至约70nm，约5nm至约80nm，约5nm至约90nm，约10nm至约50nm，约20nm至约50nm，约30nm至约50nm，约40nm至约50nm，约20nm至约60nm，约30nm至约60nm，约40nm至约60nm，约20nm至约70nm，约30nm至约70nm，约40nm至约70nm，约50nm至约70nm，约60nm至约70nm，约20nm至约80nm，约30nm至约80nm，约40nm至约80nm，约50nm至约80nm，约60nm至约80nm，约20nm至约90nm，约30nm至约90nm，约40nm至约90nm，约50nm至约90nm，约60nm至约90nm和/或约70nm至约90nm。
在一些实施方案中，核酸疫苗可以配制在脂质纳米颗粒中，该脂质纳米颗粒的直径为约10nm至约100nm，例如但不限于约10nm至约20nm，约10nm至约30nm，约10nm至约40nm，约10nm至约50nm，约10nm至约60nm，约10nm至约70nm，约10nm至约80nm，约10nm至约90nm，约20nm至约30nm，约20nm至约40nm，约20nm至约50nm，约20nm至约60nm，约20nm至约70nm，约20nm至约80nm，约20nm至约90nm，约20nm至约100nm，约30nm至约40nm，约30nm至约50nm，约30nm至约60nm，约30nm至约70nm，约30nm至约80nm，约30nm至约90nm，约30nm至约100nm，约40nm至约50nm，约40nm至约60nm，约40nm至约70nm，约40nm至约80nm，约40nm至约90nm，约40nm至约100nm，约50nm至约60nm，约50nm至约70nm约50nm至约80nm，约50nm至约90nm，约50nm至约100nm，约60nm至约70nm，约60nm至约80nm，约60nm至约90nm，约60nm至约100nm，约70nm至约80nm，约70nm至约90nm，约70nm至约100nm，约80nm至约90nm，约80nm至约100nm和/或约90nm至约100nm。
在一些实施方案中，核酸疫苗可以配制在直径为10-1000nm的脂质纳米颗粒中。纳米颗粒可以为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000nm。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的直径可以为约10至500nm。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的直径可以为大于100nm，大于150nm，大于200nm，大于250nm，大于300nm，大于350nm，大于400nm，大于450nm，大于500nm，大于550nm，大于600nm，大于650nm，大于700nm，大于750nm，大于800nm，大于850nm，大于900nm，大于950nm或大于1000nm。
聚合物、生物可降解纳米颗粒和核-壳纳米颗粒
本公开的核酸疫苗组合物可以使用天然和/或合成聚合物来配制。可以用于递送的聚合物的非限制性实例包括但不限于来自Bio(Madison,WI)和RocheMadison(Madison,WI)的DYNAMIC/>(Arrowhead Research Corp.,Pasadena,CA)制剂、PHASERXTM聚合物制剂，例如但不限于SMARTT POLYMER TECHNOLOGYTM(Seattle,WA)、DMRI/DOPE、泊洛沙姆、来自Vical(San Diego,CA)的佐剂、壳聚糖、来自Calando Pharmaceuticals(Pasadena,CA)的环糊精、树枝状大分子和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)聚合物、RONDELTM(RNAi/寡核苷酸纳米颗粒递送)聚合物(Arrowhead Research Corporation,Pasadena,CA)和pH响应性共嵌段聚合物，例如但不限于/>(Seattle,WA)。
基于壳聚糖的制剂的一个非限制性实例包括带正电荷的壳聚糖核心和带负电荷的底物的外部部分(美国公开号US20120258176；其内容通过引用以其整体并入本文)。壳聚糖包括但不限于N-三甲基壳聚糖、单-N-羧甲基壳聚糖(MCC)、N-棕榈酰基壳聚糖(NPCS)、EDTA-壳聚糖、低分子量壳聚糖、壳聚糖衍生物，或其组合。
在一些实施方案中，本公开中使用的聚合物已经经历处理以减少和/或抑制不想要的物质例如但不限于细菌对聚合物表面的附着。可以通过本领域已知和/或描述的和/或PCT专利申请公开号WO2012150467中描述的方法来处理聚合物；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
基于PLGA的制剂的一个非限制性实例包括但不限于基于PLGA的可注射储库(例如，通过将PLGA溶解在66％ N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)且其余为水性溶剂和亮丙瑞林中形成的一旦注射，PLGA和亮丙瑞林肽沉淀到皮下间隙中)。基于PLGA的可注射储库可以是长效的。
已证明了这些聚合物方法中的许多方法在体内将寡核苷酸递送到细胞质中的功效(综述于de Fougerolles Hum Gene Ther.2008,19:125-132；其内容通过引用以其整体并入本文)。已产生核酸(即，在这种情况下为小干扰RNA(siRNA))的稳健体内递送的两种聚合物方法为动态多缀合物(dynamic polyconjugate)和基于环糊精的纳米颗粒。这些递送方法中的第一种使用动态多缀合物并且已显示在体内在小鼠中有效递送siRNA并使肝细胞中的内源性靶mRNA沉默(Rozema等,Proc Natl Acad Sci U S A.2007,104:12982-12887；其内容通过引用以其整体并入本文)。这个具体方法为多组分聚合物系统，其关键特征包括膜活性聚合物，核酸(在这种情况下为siRNA)经由二硫键与其共价偶联并且其中PEG(用于电荷掩蔽)和N-乙酰半乳糖胺(用于肝细胞靶向)基团都经由pH敏感的键连接(再次参见Rozema等,Proc Natl Acad Sci U S A.2007,104:12982-12887)。在结合到肝细胞并进入内体时，聚合物复合物在低pH环境下分解，聚合物暴露出其正电荷，导致内体逃逸并且siRNA从聚合物释放到细胞质。通过用甘露醇基团替代N-乙酰半乳糖胺基团，已表明可将靶向从表达脱唾液酸糖蛋白受体的肝细胞改变为肝窦内皮和Kupffer细胞。另一种聚合物方法涉及使用转铁蛋白靶向的含环糊精的聚阳离子纳米颗粒。这些纳米颗粒已证明使表达转铁蛋白受体的尤因氏肉瘤肿瘤细胞中的EWS-FLI1基因产物靶向沉默(Hu-Lieskovan等,Cancer Res.2005,65:8984-8982；通过引用以其整体并入本文)并且配制在这些纳米颗粒中的siRNA在非人灵长类动物体内耐受良好(Heidel等,Proc Natl Acad Sci USA 2007,104:5715-21；通过引用以其整体并入本文)。这两种递送策略都结合了使用靶向递送和内体逃逸机制的合理方法。
聚合物制剂可允许核酸疫苗组合物的持续或延迟释放(例如，在肌内、皮下、实质内、鞘内、脑室内施用之后)。核酸疫苗组合物的释放曲线改变可导致例如编码的蛋白质或多肽或肽在延长的时间段内的翻译。生物可降解的聚合物先前已被用于保护核酸免于降解，并已显示导致了体内有效载荷的持续释放(Rozema等,Proc Natl Acad Sci U SA.2007,104:12982-12887；Sullivan等,Expert Opin Drug Deliv.2010,7:1433-1446；Convertine等,Biomacromolecules.2010,Oct 1；Chu等,Acc Chem Res.2012,Jan 13；Manganiello等,Biomaterials.2012,33:2301-2309；Benoit等,Biomacromolecules.2011,12:2708-2714；Singha等,Nucleic Acid Ther.2011,2:133-147；de Fougerolles HumGene Ther.2008,19:125-132；Schaffert and Wagner,Gene Ther.2008,16:1131-1138；Chaturvedi等,Expert Opin Drug Deliv.2011,8:1455-1468；Davis,Mol Pharm.2009,6:659-668；Davis,Nature,2010,464:1067-1070；其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗可以被配制用于控制释放。一种形式的控制释放制剂含有分散或包封在缓慢降解、无毒、非抗原性聚合物如共聚(乳酸/乙醇酸)中的治疗化合物或其盐，如Kent等人的开创性工作美国专利号4,675,189中所述，其内容通过引用以其整体并入本文。化合物或它们的盐也可以配制在胆固醇或其他脂质基质微丸，或硅塑料(silastomer)基质植入物中。作为一个非限制性实例，本公开的核酸疫苗可以分散或包封在美国专利号4,675,189中公开的聚合物中用于控制释放。另一种形式的控制释放制剂包含生物可降解聚合物如共聚(乳酸/乙醇酸)或乳酸和PEG的嵌段共聚物的溶液，将其皮下或肌内注射以实现用于控制释放的储库制剂。
在一些实施方案中，药物组合物可以是持续释放制剂。在进一步的实施方案中，持续释放制剂可以用于皮下递送。持续释放制剂可以包括但不限于PLGA微球、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、(Nanotherapeutics,Inc.Alachua,FL)、(Halozyme Therapeutics,San Diego CA)、外科密封剂如纤维蛋白原聚合物(Ethicon Inc.Cornelia,GA)、/>(Baxter International,Inc Deerfield,IL)、基于PEG的密封剂和/>(Baxter International,Inc Deerfield,IL)。
作为一个非限制性实例，可以通过制备具有可调释放速率(例如，数天和数周)的PLGA微球并将核酸疫苗组合物包封在PLGA微球中同时保持核酸疫苗组合物在包封过程期间的完整性在PLGA微球中配制核酸疫苗组合物。EVAc是非生物可降解的生物相容性聚合物，其广泛用于临床前持续释放植入物应用。泊洛沙姆F-407NF是聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯的亲水性非离子表面活性剂三嵌段共聚物，在低于5℃的温度下具有低粘度，在高于15℃的温度下形成固体凝胶。基于PEG的外科密封剂包含混合在递送装置中的两种合成的PEG组分，其可在一分钟内制备，在3分钟内密封并在30天内重新吸收。和天然聚合物能够在施用部位原位凝胶化。已显示它们通过离子相互作用与蛋白质和肽治疗候选物相互作用以提供稳定作用。
聚合物制剂还可通过不同配体的表达而选择性靶向，例如但不限于叶酸、转铁蛋白和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)(Benoit等,Biomacromolecules.2011,12:2708-2714；Rozema等,Proc Natl Acad Sci U S A.2007,104:12982-12887；Davis,Mol Pharm.2009,6:659-668；Davis,Nature,2010 464:1067-1070；其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文)。
本公开的核酸疫苗组合物可以与聚合化合物一起配制或配制在聚合化合物中。聚合化合物可以包括至少一种聚合物，例如但不限于聚乙烯、聚乙二醇(PEG)、聚(l-赖氨酸)(PLL)、接枝到PLL的PEG、阳离子脂质聚合物、生物可降解的阳离子脂质聚合物、聚乙烯亚胺(PEI)、交联支化聚(亚烷基亚胺)、聚胺衍生物、改性泊洛沙姆、生物可降解聚合物、弹性生物可降解聚合物、生物可降解嵌段共聚物、生物可降解无规共聚物、生物可降解聚酯共聚物、生物可降解聚酯嵌段共聚物、生物可降解聚酯嵌段无规共聚物、多嵌段共聚物、线性生物可降解共聚物、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸)(PAGA)、生物可降解的交联阳离子多嵌段共聚物、聚碳酸酯、聚酐、聚羟基酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、丙烯酸聚合物、含胺聚合物、葡聚糖聚合物、葡聚糖聚合物衍生物或其组合。
作为一个非限制性实例，本公开的核酸疫苗组合物可以与如美国专利号6,177,274中所述的用PLL接枝的PEG的聚合化合物一起配制；该文献通过引用以其整体并入本文。该制剂可以用于体外转染细胞或用于体内递送核酸疫苗组合物。在另一个实例中，核酸疫苗组合物可以悬浮在具有阳离子聚合物的溶液或介质中，处于干燥药物组合物中，或处在能够如在美国公开号US20090042829和US20090042825中所述进行干燥的溶液中；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。
作为另一个非限制性实例，本公开的核酸疫苗组合物可以与PLGA-PEG嵌段共聚物(参见美国公开号US20120004293和美国专利号8,236,330，通过引用以其整体并入本文)或PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物(参见美国专利号6,004,573，通过引用以其整体并入本文)一起配制。作为一个非限制性实例，本公开的核酸疫苗组合物可以与PEG和PLA或PEG和PLGA的二嵌段共聚物一起配制(参见美国专利号8,246,968，通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，核酸疫苗组合物可以与如PCT专利申请公开号WO20180126084中所述的或通过该文献中所述的方法制备的支化PEG分子一起配制；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。作为一个非限制性实例，可以用于本文所述制剂中的支化PEG可以具有PCT公开号WO20180126084的式I、式II、式III、式IV、式V、式VI，其内容通过引用以其整体并入本文。
可以使用多胺衍生物递送核酸或治疗和/或预防疾病或被包括在可植入或可注射装置中(美国公布号US20100260817；其内容通过引用以其整体并入本文)。作为一个非限制性实例，可以使用US公开号US20100260817中描述的多胺衍生物来配制本公开的核酸疫苗组合物；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。作为另一个非限制性实例，可以使用聚酰胺聚合物例如但不限于包含通过将碳水化合物二叠氮化物单体与包含低聚胺的二炔单元组合而制备的1,3-偶级加成聚合物的聚合物(美国专利号8,236,280；其内容通过引用以其整体并入本文)来递送本公开的核酸疫苗组合物。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以与PCT专利申请公开号WO2011115862、WO2012082574和WO2012068187以及美国公开号US20120283427中描述的至少一种聚合物和/或其衍生物一起配制，其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。本公开的核酸疫苗组合物可以与如WO2011115862中所述的式Z聚合物一起配制；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。核酸疫苗组合物可以与如PCT专利申请公开号WO2012082574或WO2012068187以及美国公开号US2012028342中描述的式Z、Z’或Z”的聚合物一起配制；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。与本公开的核酸疫苗组合物一起配制的聚合物可以通过PCT专利申请公开号WO2012082574或WO2012068187中描述的方法合成，其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文。
本公开的核酸疫苗组合物可以与至少一种丙烯酸聚合物一起配制。丙烯酸聚合物包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯及其组合。
本公开的核酸疫苗组合物的制剂可以包括至少一种含胺聚合物，例如但不限于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(酰氨基胺)树枝状大分子或其组合。
例如，本公开的核酸疫苗组合物可以配制在药物化合物中，包括聚(亚烷基亚胺)、生物可降解阳离子脂质聚合物、生物可降解嵌段共聚物、生物可降解聚合物、或生物可降解无规共聚物、生物可降解聚酯嵌段共聚物、生物可降解聚酯聚合物、生物可降解聚酯无规共聚物、线性生物可降解共聚物、PAGA、生物可降解交联阳离子多嵌段共聚物或其组合。生物可降解阳离子脂质聚合物可以通过本领域已知的方法和/或美国专利号6,696,038以及美国公开号US20030073619和US20040142474中描述的方法制备；其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文。可以使用本领域已知的方法和/或如美国公开号US20100004315中描述的方法制备聚(亚烷基亚胺)，该文献通过引用以其整体并入本文。可以使用本领域已知的方法和/或如美国专利号6,517,869和6,267,987中所述的方法制备生物可降解聚合物、生物可降解嵌段共聚物、生物可降解无规共聚物、生物可降解聚酯嵌段共聚物、生物可降解聚酯聚合物或生物可降解聚酯无规共聚物，其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文。可以使用本领域已知的方法和/或如美国专利号6,652,886中所述的方法制备线性生物可降解共聚物；其内容通过引用以其整体并入本文。可以使用本领域已知的方法和/或如美国专利号6,217,912中所述的方法制备PAGA聚合物；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。PAGA聚合物可以与聚合物共聚形成共聚物或嵌段共聚物，所述聚合物例如但不限于聚-L-赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、组蛋白、抗生物素蛋白、鱼精蛋白、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)。可以通过本领域已知的方法和/或如美国专利号8,057,821或美国公开号US2012009145中所述的方法制备生物可降解交联阳离子多嵌段共聚物；其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文。例如，可以使用与支化聚乙烯亚胺相比具有不同模式的线性聚乙烯亚胺(LPEI)嵌段来合成多嵌段共聚物。进一步地，可以通过本领域已知的、本文所述的或如美国公开号US20100004315或美国专利号6,267,987和6,217,912中所述的方法制备组合物或药物组合物；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。
本公开的核酸疫苗组合物可以与至少一种可以包含聚阳离子侧链的可降解聚酯一起配制。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)及其组合。在一些实施方案中，可降解聚酯可以包括PEG缀合以形成聚乙二醇化聚合物。
本公开的核酸疫苗组合物可以与至少一种可交联聚酯一起配制。可交联聚酯包括本领域已知的和美国公开号US20120269761中描述的那些可交联聚酯；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的聚合物可以缀合至脂质封端的PEG。作为一个非限制性实例，PLGA可以与脂质封端的PEG缀合，形成PLGA-DSPE-PEG。作为另一个非限制性实例，与本公开一起使用的PEG缀合物包括PCT专利申请公开号WO2008103276中描述的那些PEG缀合物；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。可以使用配体缀合物例如但不限于美国专利号8,273,363中描述的缀合物来缀合聚合物；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗组合物可以与另一种化合物缀合。缀合物的非限制性实例描述于美国专利号7,964,578和7,833,992中；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以与如美国专利号7,964,578和7,833,992中所述的式1-122的缀合物缀合；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。本文所述的核酸疫苗组合物可以与金属例如但不限于金缀合。(参见例如，Giljohann等Journ.Amer.Chem.Soc.2009,131(6):2072-2073；其内容通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗组合物可以缀合和/或包封在金纳米颗粒中(PCT申请公开号WO201216269和美国公开号US20120302940；其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文)。
如美国公开号US20100004313中所述，基因递送组合物可以包括核苷酸序列和泊洛沙姆。作为一个非限制性实例，本公开的核酸疫苗组合物可以用于具有美国公开号US20100004313中描述的泊洛沙姆的基因递送组合物中；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，可以通过使可以包含阳离子载体的聚合物制剂与可以与胆固醇和聚乙二醇基团共价连接的阳离子脂质聚合物接触来稳定包含本公开的核酸疫苗的聚合物制剂。可以使用US公开号US20090042829中描述的方法使聚合物制剂与阳离子脂质聚合物接触；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
阳离子载体可以包括但不限于聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-聚胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚(2-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子明胶、树枝状大分子、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1-[2-(油酰氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟基乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵(DOSPA)、3B-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇HCl)、双十七烷基酰氨基甘氨酰亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)及其组合。
在一些实施方案中，本公开的核酸疫苗组合物可以配制在一种或多种聚合物的聚合复合物(polyplex)(美国公开号US20120237565和US20120270927；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文)中。在一些实施方案中，聚合复合物包含两种或更多种阳离子聚合物。阳离子聚合物可以包括聚(乙烯亚胺)(PEI)，如线性PEI。
还可以使用聚合物、脂质和/或其他生物可降解的试剂例如但不限于磷酸钙的组合将本公开的核酸疫苗组合物配制为纳米颗粒。组分可以在核-壳、杂交体和/或叠层结构(layer-by-layer architecture)中组合，以允许微调纳米颗粒，从而可以增强核酸疫苗组合物的递送(Wang等,Nat Mater.2006,5:791-796；Fuller等,Biomaterials.2008,29:1526-1532；DeKoker等,Adv Drug Deliv Rev.2011,63:748-761；Endres等,Biomaterials.2011,32:7721-7731；Su等,Mol Pharm.2011；8(3):774-87；其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文)。作为一个非限制性实例，纳米颗粒可以包含多种聚合物，例如但不限于亲水-疏水聚合物(例如，PEG-PLGA)、疏水聚合物(例如，PEG)和/或亲水聚合物(PCT申请公开号WO20120225129；其内容通过引用以其整体并入本文)。
可以使用与脂质和/或聚合物组合的生物可降解的磷酸钙纳米颗粒体内递送核酸疫苗组合物。在一些实施方案中，脂质包被的磷酸钙纳米颗粒也可以含有靶向配体如茴香酰胺，可以用于递送本公开的核酸疫苗组合物。例如，为了在小鼠转移性肺模型中有效递送siRNA，使用了脂质包被的磷酸钙纳米颗粒(Li等,J Contr Rel.2010,142:416-421；Li等,JContr Rel.2012,158:108-114；Yang等,Mol Ther.2012,20:609-615；其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文)。这种递送系统结合了靶向纳米颗粒和增强内体逃逸的组分磷酸钙，以改善siRNA的递送。
在一些实施方案中，可以使用具有PEG-聚阴离子嵌段共聚物的磷酸钙来递送本公开的核酸疫苗组合物(Kazikawa等,J Contr Rel.2004,97:345-356；Kazikawa等,J ContrRel.2006,111:368-370；每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，可以使用PEG-电荷转换聚合物(Pitella等,Biomaterials.2011,32:3106-3114；其内容通过引用以其整体并入本文)形成纳米颗粒以递送本公开的核酸疫苗组合物。在PEG-聚阴离子嵌段共聚物通过在酸性pH下裂解成聚阳离子时，PEG-电荷转换聚合物可以改进，从而增强内体逃逸。
在一些实施方案中，核-壳纳米颗粒可以用于形成纳米颗粒以递送本公开的核酸疫苗组合物。核-壳纳米颗粒的使用另外集中在高通量方法上来合成阳离子交联纳米凝胶核和各种壳(Siegwart等,Proc Natl Acad Sci U S A.2011,108:12996-13001；其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文)。聚合物纳米颗粒的复合、递送和内化可以通过改变纳米颗粒的核和壳组分中的化学组成来精确控制。例如，核-壳纳米颗粒在它们将胆固醇共价结合到纳米颗粒上后，可以有效地将核酸疫苗组合物递送至小鼠肝细胞。
在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒可以是包含至少一种配体的纳米颗粒，并且所述配体可以是肽、核酸适体，其是小分子量(8-13Kda)单链RNA或DNA，对它们的靶标、肽适体、抗体、小分子配体(例如但不限于叶酸、茴香酰胺和半乳糖)具有低的纳摩尔结合亲和力。(Leng等Journal of Drug Delivery.2017,17,Article ID 6971297；其内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，可以使用包含中间PLGA层和含有PEG的外部中性脂质层的中空脂质核心来递送本公开的核酸疫苗组合物。作为一个非限制性实例，可以使用脂质-聚合物-脂质杂合纳米颗粒来递送本文所述的核酸疫苗组合物(Shi等,Angew Chem IntEd.2011,50:7027-7031；其内容通过引用以其整体并入本文)。
可以通过美国专利号8,313,777中描述的方法形成与本公开的核酸疫苗组合物一起使用的核-壳纳米颗粒；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，核-壳纳米颗粒可以包含本文所述的核酸疫苗组合物的核和聚合物壳。聚合物壳可以是本文所述的任何聚合物并且是本领域已知的。在另一个实施方案中，聚合物壳可以用于保护核中的核酸疫苗组合物。(参见例如美国公开号20120321719；其内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，与本文所述的制剂一起使用的聚合物可以是如PCT申请公开号WO2011120053中所述的改性聚合物(例如但不限于改性聚缩醛)；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，可以通过使细胞与膜去稳定聚合物和核酸疫苗组合物、靶向配体和任选的接头的缀合物接触，将核酸疫苗组合物递送至靶细胞的细胞或胞浆。国际PCT申请公开号WO2020093061(该文献的内容通过引用以其整体并入本文)中教导了膜去稳定聚合物的非限制性实例，例如但不限于其中式XX的膜去稳定聚合物。
赋形剂
在一些实施方案中，药物制剂可以另外包含药学上可接受的赋形剂，如本文所用，其包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、pH调节剂等，以适合于所需的特定剂型。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备该组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science andPractice of Pharmacy,21"Edition,A.R.Gennaro Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,Md.,2006；通过引用以其整体并入本文)。在本公开的范围内可以考虑使用常规赋形剂介质，除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不希望的生物作用或在其他方面以有害方式与药物组合物的任何其他组分相互作用，其使用被认为是在本公开的范围内。
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。在一些实施方案中，赋形剂被批准用于人类和兽医使用。在一些实施方案中，赋形剂可以由美国食品和药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂可以是药用级的。在一些实施方案中，赋形剂可以符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
用于制备药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、分散剂和/或成粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂、和/或油。此类赋形剂可以任选地包含在药物组合物中。组合物还可以包括赋形剂，如可可脂和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。
示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等，和/或其组合。
示例性成粒剂和/或分散剂包括但不限于马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘浆、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯吡咯烷酮)(交聚维酮)、羧甲基淀粉钠(羟乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、甲基纤维素、预胶化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸铝镁十二烷基硫酸钠、季铵化合物等，和/或其组合。
示例性的表面活性剂和/或乳化剂包括但不限于天然乳化剂(例如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄蓍胶、chon-drux、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶体粘土(例如膨润土(硅酸铝)和(硅酸铝镁))、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、三醋精单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、甘油单硬脂酸酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(例如羧基聚亚甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合物)、角叉菜胶、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素钠、粉状纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(/>20)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇(/>60)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(/>80)、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(/>40)、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(/>60)、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯(/>65)、甘油基单油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯(/>80))、聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯单硬脂酸酯(/>45)、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚氧甲烯硬脂酸酯和/>)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如)、聚氧乙烯醚(例如聚氧乙烯月桂基醚(/>30))、聚(乙烯基吡咯烷酮)、二甘醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸钠、/>F 68、/>188、西曲溴铵、氯化十六烷基吡啶、苯扎氯铵、多库酯钠等和/或其组合。
示例性粘合剂包括但不限于淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇)；氨基酸(例如甘氨酸)；天然和合成胶(例如阿拉伯胶、海藻酸钠、爱尔兰苔藓提取物、panwar胶、印度树胶、isapol皮的粘液、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、硅酸镁铝和落叶松阿拉伯半乳聚糖)；海藻酸盐；聚环氧乙烷；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇等；及其组合。
示例性防腐剂可以包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其他防腐剂。氧化是mRNA的潜在降解途径，特别是对于液体mRNA制剂。为了防止氧化，可以在制剂中添加抗氧化剂。示例性抗氧化剂包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、苯甲醇、丁基羟基茴香醚、EDTA、间甲酚、甲硫氨酸、丁基羟基甲苯、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代甘油和/或亚硫酸钠。示例性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。示例性抗微生物防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、溴硝丙二醇、西曲溴铵、氯化十六烷基吡啶、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶、咪脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞。示例性抗真菌防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。示例性醇防腐剂包括但不限于乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚类化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯乙醇。示例性酸性防腐剂包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其他防腐剂包括但不限于生育酚、乙酸生育酚、甲磺酸去氧肟酯(deteroxime mesylate)、西曲溴铵、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、乙二胺、十二烷基硫酸钠(SLS)、十二烷基醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、GLYDANT 对羟基苯甲酸甲酯、115、/>NEOLONETM、KATHONTM和/或/>
在一些实施方案中，药物溶液的pH保持在pH 5至pH 8之间以改善稳定性。控制pH的示例性缓冲剂可以包括但不限于磷酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠、组氨酸(或组氨酸-HCl)、碳酸钠和/或苹果酸钠。在另一个实施方案中，上面列出的示例性缓冲液可以与另外的一价抗衡离子(包括但不限于钾)一起使用。二价阳离子也可以用作缓冲抗衡离子；然而，由于复合物形成和/或mRNA降解，这些不是优选的。
示例性缓冲剂还可以包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、D-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、氢氧化磷酸钙、乙酸钾、氯化钾、葡糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格溶液、乙醇等，和/或其组合。
示例性润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石粉、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、十二烷基硫酸钠等，以及其组合。
示例性油包括但不限于扁桃、杏仁、鳄梨、巴巴苏、佛手柑、黑加仑籽、琉璃苣、杜松、洋甘菊、芥花、葛缕子、棕榈蜡、蓖麻、肉桂、可可脂、椰子、鱼肝、咖啡、玉米、棉籽、鸸鹋、桉树、月见草、鱼、亚麻籽、香茅醇、葫芦、葡萄籽、榛子、海索草、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴、夏威夷核果、杂薰衣草、薰衣草、柠檬、山苍子、澳洲坚果、锦葵、芒果籽、白芒花籽、水貂、肉豆蔻、橄榄、柑橘、橙连鳍鲑、棕榈、棕榈仁、桃仁、花生、罂粟籽、南瓜籽、油菜籽、米糠、迷迭香、红花、檀香木、山茶花、香薄荷、沙棘、芝麻、牛油树脂、硅酮、大豆、向日葵、茶树、蓟、椿、岩兰草、胡桃以及小麦胚芽油。示例性油包括但不限于硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、环甲硅油、癸二酸二乙酯、聚二甲基硅氧烷360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油和/或其组合。
根据配方师的判断，在组合物中可存在赋形剂如可可脂和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。
示例性添加剂包括在生理学上生物相容的缓冲剂(例如，盐酸三甲胺)、螯合剂(例如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合物复合物(例如DTPA钙、CaNaDTPA-双酰胺)的添加物，或任选的钙或钠盐的添加物(例如氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
在本公开的一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗组合物可以包含至少一种配制在脂质纳米颗粒(LNP)中的核酸疫苗和至少一种赋形剂。作为非限制性实例，赋形剂可以是糖，如蔗糖。
佐剂
佐剂也可以与本文所述的一种或多种核酸疫苗，例如mRNA疫苗一起施用或组合施用。佐剂可以用于增强核酸疫苗的免疫原性、改变免疫应答、减少免疫所需的核酸疫苗量、减少所需的或为在那些免疫系统较弱或免疫功能低下的人或老年人中产生改善的免疫应答的额外或“加强(booster)”免疫的频率。佐剂可以是含有核酸疫苗的制剂的组分，或者它们可以与核酸疫苗组合物共同施用。佐剂的共同施用可以是本领域已知的或本文描述的任何方法，例如但不限于静脉内(IV)、肌内(IM)、皮下(SC)或皮内(ID)。
在一些实施方案中，佐剂是天然的或合成的。佐剂也可以是有机的或无机的。
在一些实施方案中，与核酸疫苗一起使用的佐剂来自一类佐剂，例如但不限于碳水化合物、微生物、矿物盐(例如氢氧化铝、磷酸铝凝胶或磷酸钙凝胶)、乳剂(例如、油乳剂、基于表面活性剂的乳剂、纯化皂苷和水包油乳剂)、惰性媒介物、颗粒佐剂(例如，单层脂质体媒介物，如病毒体或者皂苷和脂质如聚丙交酯共乙交酯(PLG)的结构化复合物)、微生物衍生物、内源性人类免疫调节剂和张力活性(tensoactive)化合物。可以与本文所述的核酸疫苗一起使用的佐剂的列表可以在基于网络的疫苗佐剂数据库Vaxjo上找到(参见例如violinet.org/vaxjo或Sayers等,Journal of Biomedicine and Biotechnology.2012；2012:831486.PMID:22505817；其内容通过引用以其整体并入本文)。
本领域普通技术人员可以选择与核酸疫苗一起使用的佐剂。佐剂可以是干扰素、TNF-α、TNF-β、趋化因子(例如，CCL21、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、HMGB1、SA100-8α、GCSF、GMCSF、粒溶素、乳铁蛋白、卵清蛋白、CD40L、CD28激动剂、PD1、可溶性PD1、PDL1、PDL2)或白细胞介素(例如，IL1、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL13、IL15、IL17、IL18、IL21和IL23)。佐剂的非限制性实例包括Abisco-100疫苗佐剂、金刚烷基酰胺二肽疫苗佐剂、AdjumerTM、AF03、白蛋白-肝素微粒疫苗佐剂、藻类葡聚糖、Algammulin、alhydrogel、氢氧化铝疫苗佐剂、磷酸铝疫苗佐剂、硫酸铝钾佐剂、铝疫苗佐剂、无定形羟基磷酸硫酸铝佐剂、Arlacel A、AS0、AS04、AS03、AS-2疫苗佐剂、B7-2疫苗佐剂、Bay R1005、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)组分疫苗佐剂、布比卡因疫苗佐剂、磷酸钙凝胶、磷酸钙疫苗佐剂、阳离子脂质体疫苗佐剂、阳离子脂质体-DNA复合物JVRS-100、霍乱毒素、霍乱毒素B亚基、棒状杆菌源性P40疫苗佐剂、CpG DNA疫苗佐剂、CRL1OO5、CTA1-DD基因融合蛋白、DDA佐剂、DHEA疫苗佐剂、DL-PGL(聚酯聚(DL-丙交酯-共-乙交酯))疫苗佐剂、DOC/Alum复合物、大肠杆菌(E.coli)不耐热毒素、Etx B亚基佐剂、鞭毛蛋白、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、伽玛菊粉、Gerbu佐剂、GM-CSF、GMDP、咪喹莫特、含有针对共刺激分子的抗体的免疫脂质体、ISCOM(s)TM、/>灭活的短小棒杆菌(Corynebacteriumparvum)疫苗佐剂、脂多糖、脂质体、洛索立宾、LTK63疫苗突变体佐剂、LTK72疫苗佐剂、LTR192G疫苗佐剂、Matrix-S、MF59、Montanide不完全Seppic佐剂、Montanide ISA 51、Montanide ISA 720佐剂、MPL-SE疫苗佐剂、MPLTM佐剂、MTP-PE脂质体、Murametide、胞壁酰二肽佐剂、Murapalmitine、D-Murapalmitine、NAGO、纳米乳液疫苗佐剂、非离子表面活性剂囊泡、霍乱毒素的无毒突变体E112K mCT-E112K、PMMA、聚(LC)、Polygen疫苗佐剂、ProteinCochleates、QS-21、Quil-A疫苗佐剂、RC529疫苗佐剂、重组hlFN-γ/干扰素-g、RehydragelEV、Rehydragel HPA、瑞喹莫德(Resiquimod)、Ribi疫苗佐剂、SAF-1、皂苷疫苗佐剂、Sclavo肽、仙台蛋白脂质体(Sendai Proteoliposome)、含仙台的脂质基质(Sendai-containingLipid Matrice)、Specol、SPT(抗原制剂)、基于角鲨烯的佐剂、硬脂酪氨酸、苏氨酰胞壁酰二肽(TMDP)、Titer-Max Gold佐剂、Ty Particles疫苗佐剂和VSA-3佐剂。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗可以用作疫苗并且还可以包含可以使疫苗能够引发更高免疫应答的佐剂。作为一个非限制性实例，佐剂可以是亚微米水包油乳剂，其可以在人类儿童群体中引发更高的免疫应答(参见例如，美国专利公开号US20120027813和美国专利号8,506,966中描述的佐剂疫苗，其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文)。
给药和施用
本公开包括考虑到药物递送科学的可能进展，通过任何适当的途径递送核酸疫苗组合物，包括例如COVID-19核酸疫苗用于任何治疗、预防、药物、诊断或成像用途。递送可以是裸露的或配制的。
本公开的核酸疫苗组合物可以裸露地递送至细胞。如本文所用，“裸露(naked)”是指递送不含促进转染的试剂的核酸疫苗组合物。例如，递送至细胞的核酸疫苗组合物可以不含有修饰。可以使用本领域已知和本文描述的施用途径将裸露的核酸疫苗组合物递送至细胞。
可以使用本文所述的制剂组分和方法来配制本公开的核酸疫苗组合物。制剂可以含有可以修饰和/或未修饰的核酸疫苗组合物。制剂还可以包括但不限于细胞渗透剂、药学上可接受的载体、递送剂、生物可侵蚀或生物相容性聚合物、溶剂和持续释放递送贮库。可以使用本领域已知和本文描述的施用途径将配制的核酸疫苗组合物递送至细胞。
核酸疫苗组合物也可以配制用于以本领域中的多种方式中的任何一种方式直接递送至器官或组织，包括但不限于直接浸泡或浸浴、经由导管、通过凝胶、粉末、软膏、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂，通过使用基材如织物或涂有或浸渍有组合物的生物可降解材料等。本公开的核酸疫苗组合物也可以克隆到逆转录病毒复制载体(RRV)中并转导至细胞。
给药
本文提供的还包括包括将本文所述的核酸疫苗施用于有此需要的受试者的方法。所需的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄、健康和整体状况；疾病的严重程度；特定的组合物、其施用方式、其活性方式等。组合物通常以剂量单位形式配制，以便于施用和剂量的均匀性。然而，应当理解，组合物的每日总用量可以由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者，具体的治疗有效、预防有效或适当的成像剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用具体化合物的活性；采用的具体组合物；患者的年龄、体重、整体健康状况、性别和饮食；所用具体化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所使用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；以及医学领域中众所周知的类似因素。
本公开考虑了约0.001至约500mg核酸疫苗(例如，COVID-19核酸疫苗，例如，COVID-19mRNA疫苗)/kg体重/天、约0.001至约200mg/kg、约0.001至约100mg/kg、0.01至约100mg/kg、优选约0.005至约50mg/kg、0.01至约50mg/kg、0.01至约40mg/kg、0.01至约30mg/kg、0.01至约10mg/kg、0.05至约50mg/kg、0.05至约30mg/kg、0.05至约10mg/kg、0.05至约5mg/kg、0.1至约50mg/kg、0.1至约30mg/kg、0.1至约10mg/kg、0.1至约1mg/kg、1.0至约50mg/kg、1.0至约40mg/kg、1.0至约30mg/kg、10至约50mg/kg体重的剂量水平。其他实施方案考虑约0.001-0.010、0.010-0.050、0.050-0.100、0.1-0.5、0.5-1.0、1.0-5.0、5.0-10、10-50mg/kg、10-100mg/kg体重的剂量。可以大约每小时、每天多次、每天、每隔一天、每周、每隔一周、每月、每隔一个月或根据需要施用剂量。
在一些实施方案中，可以以足以递送每天约0.0001mg/kg至约100mg/kg、约0.001mg/kg至约0.05mg/kg、约0.005mg/kg至约0.05mg/kg、约0.001mg/kg至约0.005mg/kg、约0.05mg/kg至约0.5mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约25mg/kg、约1mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约100mg/kg、约10mg/kg至约50mg/kg受试者体重的剂量水平，每天一次或多次施用核酸疫苗的组合物，以获得所需的治疗、诊断、预防或成像效果。可以每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天、每三天、每周、每两周、每三周或每四周递送所需的剂量。在某些实施方案中，可以使用多次施用(例如，二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或更多次施用)来递送所需剂量。当采用多次施用时，可以使用分次给药方案，如本文所述的那些分次给药方案。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗的组合物可以以足以递送至受试者约1μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg或100μg核酸组合物的剂量水平施用。
在一些实施方案中，核酸疫苗可以以分次剂量方案施用。如本文所用，“分次剂量(split dose)”是将单个单位剂量或总每日剂量分成两个或更多个剂量，例如两次或更多次施用单个单位剂量。如本文所用，“单个单位剂量”是以一剂/一次/单一途径/单一接触点施用(即单次施用事件)的任何治疗剂的剂量。如本文所用，“总每日剂量(total dailydose)”是在24小时时间内给予或规定的量。它可以作为单个单位剂量施用。在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗以分次剂量施用于受试者。核酸疫苗可以仅在缓冲液中配制或在本文所述的制剂中配制。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗组合物可以在两个单独的阶段：负荷给药阶段(loading dosing phase)和维持给药阶段(maintenance dosing phase)施用于受试者。给药方案可以包含在预防、缓解和/或治疗过程开始时首次给予受试者的核酸疫苗的初始较高负荷剂量，例如用于预防COVID-19的第一剂量，以及在第一负荷剂量后较低的维持剂量。在一些实施方案中，负荷剂量和维持剂量具有相同量的本公开的核酸疫苗。在一些实施方案中，向受试者施用多于一个维持剂量。可以每两周、每三周、每四周、每月、每两个月、每三个月、每四个月、每五个月或每六个月施用多个维持剂量。在用于预防病症的疫苗接种如COVID-19核酸(例如，mRNA)疫苗的背景下，核酸疫苗的维持剂量也可以称为加强剂量。如本文所用，“加强剂量(booster dose)”(或“加强注射(booster shot)”)是在初始引发剂量(initial primer dose)之后的额外或补充剂量的疫苗。加强剂量可以具有与初始负荷剂量相同量的核酸疫苗。或者，加强剂量的核酸疫苗量小于初始剂量中核酸疫苗的最初量。在一些实施方案中，受试者可以接受一、二、三、四或更多个加强剂量。
这样的施用可用作临床相关状况的慢性或急性治疗或预防。可以与载体组合以产生单一剂型的药物的量将根据所治疗的宿主和特定的施用方式而变化。典型的制备物将含有约5％至约95％的活性化合物(w/w)。优选地，此类制备物含有约20％至约80％、30％至约70％、40％至约60％或约50％的活性化合物。在其他实施方案中，本公开中使用的制备物将是约5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-99％或大于99％的活性成分。
在患者状况改善后，必要时，可以施用维持剂量的本公开的化合物、组合物或组合。随后，可以根据症状将施用的剂量或频率或这两者减少到维持改善的状况的水平，当症状已经减轻到期望的水平时，治疗应该停止。然而，一旦疾病症状复发，患者可能需要长期间歇性治疗。
如本领域技术人员将理解的，可能需要比上述那些更低或更高的剂量。任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性；年龄、体重、整体健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合；感染的严重程度和病程；患者的易感染性和主治医师的判断。
递送
在一些实施方案中，核酸疫苗的递送可以是裸露的或配制的。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗可以裸露地递送至细胞。如本文所用，“裸露(naked)”是指递送不含促进转染的试剂的核酸疫苗。例如，递送至细胞的核酸疫苗可以不含有修饰。可以使用本领域已知和本文描述的施用途径将裸露的核酸疫苗递送至细胞。
在一些实施方案中，可以使用本文所述的方法配制本文所述的核酸疫苗。制剂还可以包括但不限于细胞渗透剂、药学上可接受的载体、递送剂、生物可侵蚀或生物相容性聚合物、溶剂和缓释递送贮库。可以使用本领域已知和本文描述的施用途径将配制的核酸疫苗递送至细胞。
组合物也可以被配制用于以本领域中的多种方式中的任何一种方式直接递送至器官或组织，包括但不限于直接浸泡或浸浴；经由导管；通过凝胶、粉末、软膏、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂；通过使用基材如织物或涂有或浸渍有组合物的生物可降解材料等。
施用
在一些实施方案中，可以通过产生预防或治疗有效结果的任何途径施用本公开的核酸疫苗组合物。这些包括但不限于肠内(进入肠道)、胃肠道、硬脑膜外(进入硬脑膜)、经口(经由口腔)、透皮、硬膜外、脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、表皮(涂敷到皮肤上)、皮内(进入皮肤本身)、皮下(在皮肤下)、经鼻施用(通过鼻)、静脉内(进入静脉)、静脉推注(intravenous bolus)、静脉滴注、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、心脏内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、腹膜内(输注或注射到腹膜中)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼睛)、海绵体内注射(进入病理腔)、腔内(进入阴茎底部)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、透皮(通过完整皮肤进行扩散以进行全身性分布)、透粘膜(通过粘膜扩散)、经阴道、吹入(嗅吸)、舌下、唇下、灌肠、滴眼剂(到结膜上)、滴耳剂、耳廓(在耳朵内或经由耳朵)、经颊(面向脸颊)、结膜、皮肤、牙齿(到牙齿)、电渗、宫颈内、鼻窦内、气管内、体外、血液透析、浸润、间质、腹腔内、羊膜内、关节内、胆管内、支气管内、囊内、软骨内(在软骨内)、尾部内(马尾内)、脑池内(小脑延髓内)、角膜内(在角膜内)、牙冠内、冠状动脉内(在冠状动脉内)、海绵体内(阴茎海绵体的可扩张空间内)、椎间盘内(在椎间盘内)、管内(腺管内)、十二指肠内(在十二指肠内)、硬膜内(在硬膜内或硬膜下)、表皮内(至表皮)、食管内(至食管)、胃内(在胃内)、牙龈内(在牙龈内)、回肠内(小肠远端部分内)、病灶内(局部病灶内或直接引入局部病灶)、腔内(管腔内)、淋巴内(在淋巴内)、髓内(骨髓腔内)、脑膜内(在脑膜内)、眼内(眼睛内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(肺或其支气管内)、鼻内(鼻或眶周窦内)、脊柱内(在脊柱内)、滑膜内(关节滑膜腔内)、肌腱内(在肌腱内)、睾丸内(在睾丸内)、鞘内(脑脊髓任何水平的脑脊液内)、胸内(胸腔内)、管内(器官小管内)、瘤内(肿瘤内)、鼓室内(中耳内)、血管内(在血管内)、心室内(在心室内)、离子电渗疗法(借助于电流，其中可溶性盐的离子迁移到身体组织中)、冲洗(清洗或冲洗开放的伤口或体腔)、喉(直接在喉上)、鼻胃(通过鼻子进入胃)、包扎疗法技术、眼科(至外眼)、口咽(直接到口腔和咽)、胃肠外、经皮、关节周围、硬膜外、神经周围、牙周、直肠、呼吸(通过经口或经鼻吸入呼吸道内起局部或全身性作用)、球后(脑桥后或眼球后)、心肌内(进入心肌)、软组织、蛛网膜下、结膜下、粘膜下、经胎盘(通过或穿过胎盘)、经气管壁(通过气管壁)、经鼓室(穿过或通过鼓室)、输尿管(至输尿管)、尿道(至尿道)、阴道、骶管阻滞(caudal block)、诊断性、神经阻滞、胆道灌注、心脏灌注、光照疗法或脊柱。在具体实施方案中，组合物可以以允许它们穿过血脑屏障、血管屏障或其他上皮屏障的方式施用。
可以通过在期望的释放期单次施用含有足够活性成分的控制释放系统来实现将本文所述的核酸疫苗在延长的时间段，如一周至一年的时间段内递送至受试者。各种控制释放系统，如整体或储池型微胶囊、储库植入物、聚合水凝胶、渗透泵、囊泡、胶束、脂质体、透皮贴剂、离子电渗装置和另外的可注射剂型可以用于这种目的。在需要将活性成分递送到的部位的定位是一些控制释放装置的另外特征，其可以证明有益于某些病症的治疗。
在一些实施方案中，可以类似于活疫苗的施用来鼻内施用本文所述的核酸疫苗。在另一个方面，可以类似于本领域已知的灭活疫苗的施用来肌内或皮内施用多核苷酸。
在透皮施用的某些实施方案中，使用电极(例如，离子电渗疗法)、电穿孔或向皮肤施加短的高电压电脉冲、射频、超声(例如，超声波导入法)、显微投影(例如微针)、喷射注射器、热消融、磁导入、激光、速度或光机械波将增强穿过皮肤屏障的递送。药物可以包括在单层药物置于粘合剂层型、多层药物置于粘合剂层型、储池、基质或蒸汽式贴剂中，或者可以使用无贴剂技术。也可以使用包封、皮肤脂质流化剂或中空或实心微结构透皮系统(MTS，如由3M制造的MTS)、喷射注射器来增强穿过皮肤屏障的递送。用于帮助治疗化合物通过皮肤的制剂添加剂包括前药、化学品、表面活性剂、细胞穿透肽、渗透增强剂、包封技术、酶、酶抑制剂、凝胶、纳米颗粒和肽或蛋白质伴侣。
额外的缓释、储库植入物或可注射制剂对于熟练的技术人员将是显而易见的。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,JR Robinsoned.,Marcel Dekker Inc.,New York,1978；和Controlled Release of BiologicallyActive Agents,RW Baker,John Wiley&Sons,New York,1987。前述文献通过引用以其整体并入。
将本文所述的核酸疫苗与在施用时可形成储库制剂的包含生物可降解的聚合物的聚合物制剂混合，适合于获得非常长的作用持续时间的制剂。
当配制用于经鼻施用时，可以通过表面活性剂，例如甘氨胆酸、胆酸、牛磺胆酸、乙胆酸、脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、脱氢胆酸、甘氨脱氧胆酸、环糊精等以约0.1至15重量％、约0.5至4重量％或约2重量％的量进一步增强穿过鼻粘膜的吸收。据报道在降低的刺激性下表现出更大的功效的另一类吸收增强剂是烷基麦芽糖苷类，如十四烷基麦芽糖苷(Arnold,JJ等,JPharm Sci,2004,93:2205-13；Ahsan,F等,Pharm Res,2001,18:1742-46，以及其中的参考文献，所有这些都通过引用以其整体并入本文)。
药物组合物可以是无菌可注射制备物的形式，例如作为无菌可注射水性或油质悬浮液。可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂(例如吐温80)和悬浮剂来配制这种悬浮液。无菌可注射制备物也可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂包括甘露醇、水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备可注射剂，正如天然的药学上可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化形式。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，如Ph.Helv或类似的醇。
本公开的药物组合物可以以任何口服可接受的剂型经口施用，所述剂型包括但不限于胶囊、片剂和水性悬浮液和溶液。在口服片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当经口施用水性混悬液时，活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，可以添加某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。
本公开的药物组合物还可以以用于直肠施用的栓剂形式施用。可以通过使本公开的活性成分与合适的非刺激性赋形剂混合来制备这些组合物，所述非刺激性赋形剂在室温下为固体但在直肠温度下为液体，并因此将在直肠中熔化以释放活性组分。此类材料包括但不限于可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
当期望的治疗涉及通过局部施用容易到达的区域或器官时，本公开的药物组合物的局部施用是特别有用的。为了局部施用于皮肤，药物组合物应与含有悬浮或溶解在载体中的活性组分的合适软膏一起配制。用于本公开的化合物的局部施用的载体包括但不限于矿物油、液体石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，药物组合物可与含有悬浮或溶解在载体中的活性化合物的合适洗剂或乳膏一起配制。合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。本公开的药物组合物也可以通过直肠栓剂制剂或以合适的灌肠剂制剂局部应用于下肠道。本公开还包括局部透皮贴剂。
本公开的药物组合物可以通过鼻气雾剂或吸入施用。根据药物制剂领域公知的技术制备此类组合物，并且可以将其制备成盐水溶液，使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、吸收促进剂以提高生物利用度、碳氟化合物和/或本领域已知的其他增溶剂或分散剂。
当配制用于通过吸入递送时，许多制剂具有优势。将治疗剂吸附到易于分散的固体如二酮哌嗪(例如，Technosphere颗粒(Pfutzner,A and Forst,T,2005,Expert OpinDrug Deliv 2:1097-1106)或类似结构，产生导致治疗化合物的快速初期摄入的制剂。含有治疗化合物和赋形剂的冻干粉末，尤其是玻璃状颗粒，可用于以良好的生物利用度递送至肺，例如，参见(吸入胰岛素，Pfizer,Inc.和Aventis Pharmaceuticals Inc.)和/>(吸入胰岛素，Mannkind,Corp.)。
剂型
本文所述的药物组合物可被配制成本文所述的剂型，如局部、鼻内、气管内或可注射(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、心内、腹膜内、皮下)剂型。
液体剂型
用于胃肠外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬液、糖浆剂和/或酏剂。除活性成分外，液体剂型可以包含本领域常用的惰性稀释剂，包括但不限于水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，及其混合物。在用于胃肠外施用的某些实施方案中，组合物可以与增溶剂如醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合混合。
可注射形式
可注射制备物，例如无菌可注射水性或油性混悬液可以根据已知技术进行配制并且可以包括合适的分散剂、润湿剂和/或悬浮剂。无菌可注射制备物可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂包括但不限于水、林格溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。出于这种目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可用于制备可注射剂。
可注射制剂可被灭菌，例如，通过细菌截留过滤器过滤，和/或通过掺入灭菌剂以无菌固体组合物的形式，所述无菌固体组合物可在使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。
为了延长活性成分的作用，可能期望减缓对来自皮下或肌内注射的活性成分的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体混悬液来实现。核酸疫苗的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率又可能取决于晶体大小和晶形。或者，通过将核酸疫苗溶解或悬浮于油媒介物中来实现胃肠外施用的核酸疫苗的延迟吸收。可注射储库形式通过在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成核酸疫苗的微胶囊基质来制得。取决于核酸疫苗与聚合物的比率和所采用的具体聚合物的性质，可控制多核苷酸释放的速率。其他生物可降解聚合物的实例包括但不限于聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库可注射制剂可以通过将核酸疫苗包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。
经肺剂型
本文所述的可用于经肺递送的制剂也可以用于药物组合物的鼻内递送。适合鼻内施用的另一种制剂可以是包含活性成分并具有约0.2pm至500pm的平均颗粒的粗粉末。这样的制剂可以以鼻吸的方式施用，例如通过鼻通道从靠近鼻子的粉末容器中快速吸入。
适用于经鼻施用的制剂可以例如包含从少至约0.1％(w/w)到多达100％(w/w)的活性成分，并且可以包含一种或多种本文所述的另外成分。可以以适合经颊施用的制剂制备、包装和/或销售药物组合物。这样的制剂可以例如是使用常规方法制成的片剂和/或锭剂的形式，并且可以例如包含约0.1％至20％(w/w)的活性成分，其中余量可以包含口服可溶解和/或可降解的组合物和任选的一种或多种本文所述的另外成分。或者，适用于经颊施用的制剂可以包括包含活性成分的粉末和/或气雾化和/或雾化溶液和/或悬浮液。这样的粉末化、气雾化和/或雾化制剂在分散时可以具有约0.1nm至约200nm范围内的平均颗粒和/或液滴尺寸，并且可以进一步包含本文所述的任何另外成分中的一种或多种。
药剂制剂和/或制造中的一般考虑可以例如在Remington:The Science andPractice of Pharmacy 21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,2005中找到。
固体剂型：包衣或壳
片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以制备有包衣和壳，如肠溶衣和药物配制领域熟知的其他包衣。它们可以任选地包含遮光剂并且可具有它们仅仅或优选地在肠道的某一部分中任选地以延迟的方式释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。类似类型的固体组合物可以使用如乳糖或奶糖的赋形剂以及高分子量聚乙二醇等来用作软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。
药物组合物的性质
本文所述的核酸疫苗药物组合物可以使用生物利用度、治疗窗、分布容积、生物效应和通过质谱法检测多核苷酸中的一种或多种来表征。
生物利用度
当与本文所述的递送剂配制成组合物时，核酸疫苗可展现出与缺乏本文所述的递送剂的组合物相比增加的生物利用率。如本文所用，术语“生物利用度”是指向哺乳动物施用的给定量的核酸疫苗的全身性利用度。可通过测量将化合物施用至哺乳动物之后未改变形式的化合物的曲线下面积(AUC)或最大血清或血浆浓度来评估生物利用度。AUC为沿着纵坐标(Y轴)的化合物的血清或血浆浓度相对于沿着横坐标(X轴)的时间作图的曲线下面积的测定。通常，可使用本领域普通技术人员已知的和如G.S.Banker,Modem Pharmaceutics,Drugs and the Pharmaceutical Sciences,v.72,Marcel Dekker,N.Y,Inc.,1996中所述的方法来计算具体化合物的AUC，所述参考文献通过引用以其整体并入本文。
Cmax值是在将化合物施用于哺乳动物后哺乳动物血清或血浆中达到的化合物最大浓度。可使用本领域普通技术人员已知的方法测量特定化合物的Cmax值。如本文所用，短语“增加生物利用度”或“改善药代动力学”意指在与本文所述的递送剂共同施用时在哺乳动物中作为AUC、Cmax或Cmin测量的第一核酸疫苗的全身性利用度比在没有进行这种共同施用时更大。在一些实施方案中，核酸疫苗的生物利用度可增加至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
在一些实施方案中，核酸疫苗的液体制剂可以具有不同的体内半衰期，需要调节剂量以产生预防或治疗效果。为了解决这个问题，在一些实施方案中，可以设计核酸疫苗制剂以提高重复施用期间的生物利用度和/或预防或治疗效果。这样的制剂可以使核酸疫苗能够持续释放和/或降低核酸酶对核酸疫苗的降解率。在一些实施方案中，提供包含核酸疫苗、水不混溶性油储库、表面活性剂和/或助表面活性剂和/或助溶剂的悬浮液制剂。油和表面活性剂的组合可以使具有核酸疫苗的悬浮液制剂成为可能。在水不混溶性储库中递送核酸疫苗可以用于通过多核苷酸从储库到周围生理环境的持续释放来提高生物利用度和/或防止多核苷酸被核酸酶降解。
在一些实施方案中，包含二价和一价阳离子组合的阳离子纳米颗粒可以与核酸疫苗一起配制。这样的纳米颗粒可以在给定时间段(例如，数小时、数天等)内在溶液中自发形成。这样的纳米颗粒不会在单独存在二价阳离子或单独存在一价阳离子的情况下形成。在阳离子纳米颗粒中或在包含阳离子纳米颗粒的一个或多个储库中递送核酸疫苗可以通过充当长效储库和/或降低核酸酶的降解速率来提高核酸疫苗的生物利用度。
治疗窗
核酸疫苗在与本文所述的递送剂配制成组合物时，与施用的缺乏本文所述的递送剂的核酸疫苗组合物的治疗窗相比，可表现出施用的核酸疫苗组合物的治疗窗增加。如本文所用，“治疗窗(therapeutic window)”是指具有高的引发预防或治疗效果的可能性的血浆浓度范围，或作用部位的治疗活性物质水平范围。在一些实施方案中，当与本文所述的递送剂共同施用时，核酸疫苗的治疗窗可增加至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
分布容积
核酸疫苗，在与本文所述的递送剂一起配制成组合物时，相对于缺乏如本文所述的递送剂的组合物，可以表现出改善的分布容积(Vdist)，例如降低的或靶向的。分布容积(Vdist)将体内药物(例如，本公开的核酸疫苗)的量与血液或血浆中的药物浓度联系起来。如本文所用，术语“分布容积(volume of distribution)”是指在体内以与血液或血浆中相同的浓度含有药物总量所需要的流体体积：Vdist等于体内的药物量/血液或血浆中的药物浓度。例如，针对10mg剂量和10mg/L的血浆浓度，分布容积将为1升。分布容积反映出药物存在于血管外组织中的程度。大的分布容积反映出与血浆蛋白结合相比，化合物结合组织组分的倾向。在临床环境中，Vdist可用来确定达到稳态浓度的负载剂量。在一些实施方案中，当与本文所述的递送剂共同施用时，核酸疫苗的分布容积可减少至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％。
生物效应
在一些实施方案中，递送至动物的核酸疫苗的生物效应可以通过分析动物的蛋白质表达来分类。可以通过分析从施用了本文所述核酸疫苗的哺乳动物收集的生物样品来确定蛋白质表达。
质谱法检测多核苷酸
质谱法(MS)是一种分析技术，其可在分子转化为离子后提供关于分子的结构和分子质量/浓度信息。分子首先被电离以获取正电荷或负电荷，然后它们行进通过质量分析器以根据其质/荷(m/z)比到达检测器的不同区域。
使用包括离子源的质谱仪进行质谱分析，该离子源用于电离分级分离的样品并产生带电荷分子以供进一步分析。例如，样品的电离可以通过电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、光致电离、电子电离、快速原子轰击(FAB)/液体二次电离(LSIMS)、基质辅助激光解吸/电离(MALDI)、场致电离、场解吸、热喷雾/等离子体喷雾电离和粒子束电离来进行。本领域技术人员将理解，电离方法的选择可基于待测量的分析物、样品类型、检测器类型、正对负模式的选择等来确定。
在样品被离子化之后，可以分析由此产生的带正电荷或带负电荷的离子以确定质荷比(即，m/z)。用于确定质荷比的合适的分析仪包括四极分析仪、离子阱分析仪和飞行时间分析仪。可以使用多种检测模式来检测离子。例如，可以检测选择的离子(即，使用选择性离子监测模式(SIM))，或者，可以使用扫描模式检测离子，例如，多反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)。
已表明与稳定的同位素标记的肽标准物稀释物偶联的液相色谱法-多反应监测(LC-MS/MRM)是用于蛋白质验证的有效方法(例如，Keshishian等,Mol Cell Proteomics,2009,8:2339-2349；Kuhn等,Clin Chem 2009,55:1108-1117；Lopez等,Clin Chem,2010,56:281-290；其每一篇的内容均通过引用以其整体并入本文)。不像频繁用于生物标志物发现研究中的未靶向的质谱法，靶向的MS方法是基于肽序列的MS模式，其使仪器的全部分析能力集中于复杂混合物中的数十至数百种选择的肽。通过将检测和分级分离仅限于来源于目标蛋白质的那些肽，灵敏度和可再现性与发现模式的MS方法相比显著改进。这种基于质谱法的多反应监测(MRM)定量蛋白质的方法可经由临床样品的快速、靶向、多重蛋白质表达谱显著地影响生物标志物的发现和定量。
在一些实施方案中，生物样品一旦从受试者获得就可以进行酶消化。如本文所用，术语“消化(digest)”意指分解成更短的肽。如本文所使用，短语“处理样品以消化蛋白质(treating a sample to digest proteins)”意指以分解样品中的蛋白质的方式操纵样品。这些酶包括但不限于胰蛋白酶、内切蛋白酶Glu-C和胰凝乳蛋白酶。
在一些实施方案中，可以使用电喷雾电离分析生物样品的蛋白质。电喷雾电离(ESI)质谱法(ESIMS)使用电能来帮助离子从溶液转移至气相，然后通过质谱法对它们进行分析。可以使用本领域中已知的方法分析样品(例如，Ho等,Clin Biochem Rev.2003,24(1):3-12；通过引用以其整体并入本文)。可以通过分散电荷液滴的细小喷雾、蒸发溶剂以及使离子从带电荷液滴射出以产生带高电荷液滴雾，来将溶液中含有的离子种类转移到气相中。可以使用至少1个、至少2个、至少3个或至少4个质量分析仪例如但不限于四极质量分析仪来分析带高电荷液滴雾。进一步地，质谱方法可以包括纯化步骤。作为一个非限制性实例，可以设置第一四极杆(quadrapole)以选择单一m/z比，这样它可以滤掉具有不同m/z比的其他分子离子，这可以在MS分析之前消除复杂且耗时的样品纯化程序。
在一些实施方案中，可以在串联ESIMS系统(例如，MS/MS)中分析生物样品的蛋白质。作为非限制性实例，可以使用产物扫描(或子扫描)、前体扫描(母扫描)、中性丢失或多反应监测来分析液滴。
在一些实施方案中，可以使用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱法(MALDIMS)分析生物样品。MALDI提供大分子和小分子(如蛋白质)的非破坏性汽化和电离。在MALDI分析中，分析物首先与大量摩尔过量的基质化合物共结晶，所述基质化合物还可以包括但不限于吸收紫外线的弱有机酸。MALDI中使用的基质的非限制性实例是α-氰基-4-羟基肉桂酸、3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸和2,5-二羟基苯甲酸。分析物-基质混合物的激光辐射可以导致基质和分析物的汽化。激光诱导的解吸提供完整分析物的高离子产率，并允许以高精度测量化合物。可以使用本领域已知的方法分析样品(例如，Lewis,Wei and Siuzdak,Encyclopedia of Analytical Chemistry 2000:5880-5894；其内容通过引用以其整体并入本文)。作为非限制性实例，MALDI分析中使用的质量分析器可以包括线性飞行时间(TOF)、TOF反射器或傅里叶变换质量分析器。
表达系统
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗可以与一种或多种调节性核苷酸序列有效连接并在表达构建体中编码。调节核苷酸序列通常适合于用于表达的宿主细胞。对于多种宿主细胞，本领域已知多种类型的适当的表达载体和合适的调节序列。通常，一种或多种调节性核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导或信号序列、转录起始和终止序列以及增强子或激活子序列。还考虑了本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子，或结合了多于一个启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可以在细胞中存在于附加体上，例如质粒，或者表达构建体可以插入染色体中。在一个具体实施方案中，表达载体包括选择标记基因以允许选择转化的宿主细胞。某些实施方案包括编码与至少一个调节序列有效连接的COVID-19序列的核酸疫苗的表达载体。用于本文的调节序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。在某些实施方案中，表达载体的设计考虑了待转化的宿主细胞的选择、待表达的特定核酸疫苗序列、载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力或载体编码的其他蛋白质的表达，如抗生素标志物的表达。
在一些实施方案中，本文所述的核酸可以在微生物中表达。作为一个非限制性实例，核酸可以在细菌系统中表达，例如在短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和它们的衍生物中表达。示例性启动子包括l-阿拉伯糖诱导型araBAD启动子(PBAD)、lac启动子、l-鼠李糖诱导型rhaP BAD启动子、T7RNA聚合酶启动子、trc和tac启动子、λ噬菌体启动子P1和脱水四环素诱导型tetA启动子/操纵子。
在一些实施方案中，本文所述的核酸可以在酵母表达系统中表达。可以用于酵母载体的启动子的非限制性实例包括3-磷酸甘油酸酯激酶(Hitzeman等,J.Biol.Chem.255:2073(1980))；其他糖解酶(Hess等,J.Adv.Enzyme Res.7:149(1968)；Holland等,Biochemistry 17:4900(1978))的启动子。其他启动子来自例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、葡萄糖激酶醇氧化酶I(AOX1)、醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶，和上述3-磷酸甘油醛脱氢酶，以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。任何含有酵母相容的启动子和终止序列的质粒载体，无论有或没有复制起点，都是合适的。某些酵母表达系统可从例如Clontech Laboratories,Inc.(Palo Alto,Calif.，例如，用于酿酒酵母(S.cerevisiae)的Pyex 4T载体家族)、Invitrogen(Carlsbad,Calif.，例如，Ppicz series Easy Select Pichia ExpressionKit)和Stratagene(La Jolla,Calif.，例如，用于粟酒裂殖酵母(S.pombe)的ESP.TM.酵母蛋白表达和纯化系统和用于酿酒酵母的Pesc载体)商购获得的。
在一些实施方案中，本文所述的核酸可以在哺乳动物表达系统中表达。哺乳动物启动子的非限制性实例包括例如来自以下基因的启动子：仓鼠的泛素/S27a启动子(WO 97/15664)、猿猴空泡病毒40(SV40)早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复区、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(MMTV)、莫洛尼鼠白血病病毒长末端重复区和人巨细胞病毒(CMV)的早期启动子。其他异源哺乳动物启动子的实例是肌动蛋白、免疫球蛋白或热休克启动子。在一个具体实施方案中，使用酵母醇氧化酶启动子。
在一些实施方案中，用于哺乳动物宿主细胞的启动子可以从病毒的基因组中获得，所述病毒如多瘤病毒、鸡痘病毒(UK 2,211,504，公开于1989年7月5日)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒病毒和猿猴病毒40(SV40)。在进一步的实施方案中，使用异源哺乳动物启动子。实例包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子和热休克启动子。SV40的早期和晚期启动子作为SV40限制性片段方便地获得，该限制性片段也含有SV40病毒复制起点。Fiers等,Nature 273:113-120(1978)。人巨细胞病毒的立即早期启动子作为HindIII E限制性片段方便地获得。Greenaway,P.J.等,Gene 18:355-360(1982)。前述参考文献通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的核酸可以在昆虫细胞表达系统中表达。使用昆虫细胞宿主的真核表达系统可以依赖于质粒或杆状病毒表达系统。典型的昆虫宿主细胞来源于秋粘虫(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))。为了表达外源蛋白质，用重组形式的杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒感染这些细胞，所述病毒具有在病毒多角体启动子控制下表达的目标基因。被这种病毒感染的其他昆虫包括商业上称为“High 5”(Invitrogen)的细胞系，其来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。有时使用的另一种杆状病毒是家蚕核型多角体病毒，它感染家蚕(Bombyx mori)。许多杆状病毒表达系统可例如从Thermo Fisher(Bac-N-BlueTMk或BAC-TO-BACTM系统)、Clontech(BacPAKTM杆状病毒表达系统)、Novagen(Bac Vector SystemTM)商购获得或是来自Pharmingen或QuantumBiotechnologies的其他杆状病毒表达系统。另一种昆虫细胞宿主是常见的果蝇黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，其的一种瞬时或稳定的基于质粒的转染试剂盒由ThermoFisher(DESTM系统)在商业上提供。
在一些实施方案中，用表达本文所述核酸的载体转化细胞。用于将新遗传物质插入真核细胞(包括动物和植物细胞)中的转化技术是众所周知的。病毒载体可以用于将表达盒插入宿主细胞基因组中。或者，可以将载体转染到宿主细胞中。转染可以通过本领域中描述的方法来完成，例如但不限于磷酸钙沉淀、电穿孔、光学转染、原生质体融合、穿刺转染(impalefection)和流体动力学递送。
IV.使用方法
本公开的一个方面提供了使用本公开的核酸疫苗以及包含所述核酸疫苗和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物和制剂的方法。本文提供了用于诊断、治疗、缓解或预防人或其他哺乳动物的疾病或病况的组合物、方法、试剂盒和试剂，其中活性剂是核酸疫苗、含有核酸疫苗的细胞或从核酸疫苗多核苷酸翻译的多肽。
在一些实施方案中，可以使用表明对受试者有益的任何终点来评估使用方法，包括但不限于(1)在一定程度上抑制疾病进展，包括稳定、减慢和完全阻止；(2)减少疾病发作和/或症状的次数；(3)抑制(即减少、减慢或完全停止)疾病细胞浸润到邻近的外周器官和/或组织中；(4)抑制(即减少、减慢或完全停止)疾病传播；(5)降低自身免疫病况；(6)与病症相关的生物标志物表达的有利变化；(7)在一定程度上缓解与病症相关的一种或多种症状；(8)治疗后无疾病表现时间延长；(9)治疗后给定时间点的死亡率降低。
治疗或预防用途
本文所述的核酸疫苗可以用于保护、治疗或治愈由与感染性物质例如但不限于病毒、细菌、真菌、寄生虫和原生动物接触引起的感染。作为一个非限制性实例，感染性物质是病毒并且病毒是SARS-CoV-2和/或其变体。在一些实施方案中，SARS-CoV-2的变体是VOI、VOC和VOHC变体。
本文所述的核酸疫苗可以用作预防剂，其中将核酸疫苗施用于受试者，并且其中核酸疫苗多核苷酸在体内翻译以产生用于预防COVID-19的SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、肽、其片段或变体。
本文所述的核酸疫苗可以用作治疗剂，其中将核酸疫苗施用于受试者，并且其中核酸疫苗多核苷酸在体内翻译以产生用于缓解COVID-19的一种或多种症状的SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、肽、其片段或变体。
在一些实施方案中，提供了通过施用包含编码病毒多肽的一种或多种多核苷酸的核酸疫苗治疗或预防受试者的病毒感染和/或与病毒感染或其症状相关的疾病、病症或病况的方法。施用可以与本文所述或本领域已知的抗病毒剂或抗细菌剂或小分子化合物组合。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗可以用于保护抵抗和/或防止可能已知或未知的新出现或工程化的威胁的传播。
在一些实施方案中，本文提供了使用本文所述的核酸多核苷酸在细胞、组织或生物体中诱导多肽(例如，SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、肽、其片段或变体)翻译的方法。翻译的多肽可以用于预防、缓解和/或治疗COVID-19。这种翻译可以是体外、体内、离体或在培养中。细胞、组织或生物体可以与有效量的含有核酸疫苗的组合物或药物组合物接触，所述核酸疫苗包括具有编码目标多肽(例如，用于治疗和/或预防COVID-19的SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、多肽、肽、其片段或变体)的至少一个区域的多核苷酸。
在一些实施方案中，提供给细胞、组织或受试者的本文所述核酸疫苗的有效量可以足以用于免疫预防。
至少部分地基于靶组织、靶细胞类型、施用方式、多核苷酸的物理特性(例如大小以及未修饰的和修饰的核苷的数量)和核酸疫苗的其他组分提供核酸疫苗组合物的“有效量(effective amount)”。含有本文所述的核酸疫苗的组合物的有效量是与未经处理的细胞相比提供诱导或加强的免疫应答作为在细胞中SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、多肽、肽、其片段或变体的产量的函数的量。增加的产量可以通过增加的细胞转染(即，用核酸疫苗转染的细胞的百分比)、增加的来自多核苷酸的蛋白质翻译或改变的宿主细胞的先天免疫应答来证明。
本文提供了涉及在有此需要的哺乳动物受试者中诱导SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、多肽、肽、其片段或变体的体内翻译的方法。使用本文所述的递送方法将有效量的含有多核苷酸的核酸疫苗组合物施用于受试者，所述多核苷酸具有编码多肽(例如，SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、多肽、肽、其片段或变体)的至少一个可翻译区。以使得多核苷酸在细胞中被翻译的量和其他条件提供多核苷酸。可以用一轮或多轮核酸疫苗施用靶向多核苷酸所在的细胞或细胞存在的组织。
在某些实施方案中，所施用的包含多核苷酸的核酸疫苗指导一种或多种多肽的产生，所述多肽提供该多肽在其中被翻译的细胞、组织或生物体中基本上不存在的功能性免疫系统相关活性。例如，缺失的功能活性在本质上可以是酶促的、结构的或基因调节的。在相关实施方案中，施用的多核苷酸指导一种或多种多肽的产生，所述多肽增加与免疫系统有关的功能活性，所述功能活性在多肽被翻译的细胞中是存在的但基本上缺乏。
此外，从核酸疫苗翻译的多肽可以直接或间接拮抗存在于细胞中、细胞表面上的或从细胞分泌的生物部分的活性。可以被拮抗的生物部分的非限制性实例包括核酸、碳水化合物、蛋白质毒素例如志贺和破伤风毒素、脂质(例如胆固醇)、脂蛋白(例如低密度脂蛋白)或小分子毒素(例如，霍乱、肉毒杆菌和白喉毒素)。在一些实施方案中，可以被拮抗的生物分子可以是可能具有不期望的活性例如但不限于细胞毒性或细胞抑制活性的内源性蛋白质。本文所述的蛋白质可以被工程化以在细胞内定位，可能在特定区室如细胞质或细胞核内定位，或被工程化以从细胞分泌或易位至细胞的质膜。
在一些实施方案中，核酸疫苗的多核苷酸及其编码的多肽可以用于治疗多种疾病、病症和/或病况中的任一种，包括但不限于病毒感染(例如，由SARS-CoV-2和/或其变体引起的感染)。
可以向其施用核酸疫苗的受试者患有疾病、病症或有害病况或可能处于发展疾病、病症或有害病况的风险中。提供了在这些基础上鉴定、诊断和分类受试者的方法，其可以包括临床诊断、生物标志物水平、全基因组关联研究(GWAS)和本领域已知的其他方法。
药剂(例如，核酸疫苗和任何另外部分的组合物)可以同时施用，例如以组合单位剂量(例如，提供两种药剂的同时递送)。还可以以特定的时间间隔施用药剂，例如但不限于数分钟、数小时、数天或数周的间隔。通常，药剂在受试者中可以同时具有生物可利用性，例如可检测性。在一些实施方案中，药剂可以基本上同时施用，例如在相同时间施用两个单位剂量，或两种药剂的组合单位剂量。在其他实施方案中，可以以单独的单位剂量递送药剂。药剂可以以任何顺序施用，或作为一种或多种包括两种或更多种药剂的制剂施用。在一个优选的实施方案中，一种药剂例如第一药剂的至少一次施用可以与另一种药剂例如第二药剂相隔数分钟、一小时、两小时、三小时或四小时，或甚至一天或两天。在一些实施方案中，组合可以实现协同结果，例如，大于相加结果，例如，比相加结果大至少25、50、75、100、200、300、400或500％。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗可以与其他预防性或治疗性化合物一起施用。作为一个非限制性实例，预防性或治疗性化合物可以是佐剂或加强剂。如本文所用，当提及预防性组合物如疫苗时，术语“加强剂(booster)”是指额外施用的预防性组合物。可以在较早施用预防性组合物后给予加强剂(或加强疫苗)。初始施用的预防性组合物和加强剂之间的施用时间可以是但不限于1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、14天、21天、28天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或多于99年。
在一些实施方案中，核酸疫苗可以通过本文所述的方法进行配制。一方面，制剂可以包含可对一种以上的疾病、病症或病况具有治疗和/或预防作用的核酸疫苗或多核苷酸。作为一个非限制性实例，该制剂可以包含编码用于治疗和/或预防COVID-19的SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、多肽、肽、其片段或变体的多核苷酸。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗可以用于许多应用中的研究，例如但不限于鉴定和定位细胞内和细胞外蛋白质、蛋白质相互作用、信号通路和细胞生物学。
免疫应答的调节
在一些实施方案中，包含本文所述的多核苷酸的核酸疫苗可以作为单一组合物用作疫苗。如本文所用，“疫苗(vaccine)”是指在生物体例如动物生物体例如哺乳动物生物体(例如人)中刺激、诱导、引起或改善免疫的组合物、物质或制剂。优选地，疫苗针对生物体中的一种或多种疾病或病症提供免疫，包括预防性和/或治疗性免疫。示例性疫苗包括一种或多种类似于感染性物质如致病微生物(disease-causing microorganism)的药剂，并且可例如由致病微生物的活的、减毒的、修饰的、减弱的或灭活的形式，或由其衍生的抗原，包括抗原组分的组合制成。在示例性实施方案中，疫苗刺激、诱导、导致或改善生物体中的免疫或导致或模拟生物体中的感染而不诱导任何疾病或病症。疫苗将抗原引入受试者的组织、细胞外空间或细胞中并引发免疫应答，从而保护受试者免受特定疾病或病原体感染。本文所述的核酸疫苗可以编码抗原，并且当多核苷酸在细胞中表达时，实现所需的免疫应答。作为一个非限制性实例，本文所述的核酸疫苗可以编码SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、多肽、肽、其片段或变体，并且当多核苷酸在细胞中表达时，实现期望的针对SARS-CoV-2的免疫应答以治疗和/或预防COVID-19。
核酸疫苗可以作为主动免疫方案的一部分对健康个体进行预防性或治疗性施用，或在感染早期在潜伏期期间或在症状发作后的主动感染期间施用。
在标准一线治疗如抗生素和抗病毒药物未能诱导被动免疫后，也可以施用本文所述的核酸疫苗作为二线治疗。在这方面，本文所述的核酸疫苗可用于对一线治疗产生抗性且疾病持续存在并诱发慢性疾病的环境。
核酸疫苗可以作为针对潜伏病毒感染如SARS-CoV-2感染的治疗方案的一部分而施用。在该实施方案中，施用一种或多种多核苷酸，其最终产生蛋白质，所述蛋白质产生期望的针对SARS-CoV-2的免疫应答，从而治疗和/或预防COVID-19。
在安全性、可行性、适用性和产生免疫应答的有效性方面，在疫苗中或作为疫苗使用RNA克服了涉及将DNA掺入细胞中的传统基因疫苗接种的缺点。RNA分子被认为比DNA疫苗显著更安全，因为RNA更容易降解。它们被迅速清除出有机体，无法整合到基因组中，无法以不可控的方式影响细胞的基因表达。RNA疫苗也不太可能引起严重的副作用，如产生自身免疫性疾病或抗DNA抗体(Bringmann A.等,Journal of Biomedicine and Biotechnology(2010),vol.2010，文章ID623687)。用RNA转染只需插入细胞的细胞质中，这比进入细胞核更容易实现。然而，RNA易受RNA酶降解和细胞质中其他自然分解的影响。
为增加RNA疫苗稳定性和保质期所做的各种尝试。Von Der Mulbe等人的美国公开号US20050032730公开了通过增加mRNA分子的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量来改善mRNA疫苗组合物的稳定性。Feigner等人的美国专利号5,580,859教导了掺入编码调节性蛋白质的多核苷酸序列，所述调节性蛋白质与mRNA结合并调节mRNA的稳定性。不希望受到理论的束缚，据信，至少部分是由于构建体设计的特异性、纯度和选择性，本文所述的核酸疫苗可以导致稳定性和治疗功效的改善。此外，可以将修饰的核苷或其组合引入本文所述的核酸疫苗中以激活先天免疫应答。当与多肽和/或其他疫苗组合时，此类激活分子可用作佐剂。在某些实施方案中，激活分子含有可翻译区，该区编码可用作疫苗的多肽序列，因此提供成为自佐剂的能力。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗可以用于预防、治疗和诊断由感染性物质例如但不限于SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的VOC、VOI或VOHC引起的疾病和身体障碍。本文所述的核酸疫苗可以编码至少一种目标多肽(例如，SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、多肽、肽、其片段或变体)并且可以提供给个体以刺激免疫系统从而针对致病剂提供保护。作为一个非限制性实例，可以通过提供具有结合和中和感染性物质的能力的中和抗体来抑制和/或消除来自感染性物质的生物活性和/或作用；所述中和抗体由从核酸疫苗翻译的多肽刺激的免疫系统产生。
作为一个非限制性实例，编码免疫原的多核苷酸可以被递送至细胞以触发多种先天应答途径(参见PCT专利申请公开号WO2012006377和美国专利公开号US20130177639；其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文)。作为另一个非限制性实例，本文所述的核酸疫苗可以以足以对脊椎动物具有免疫原性的剂量量递送至脊椎动物(参见PCT专利申请公开号WO2012006372和WO2012006369以及美国公开号US20130149375和US20130177640；其每一篇的内容都通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗可以以足够大而具有免疫原性从而刺激哺乳动物的免疫应答的剂量递送至哺乳动物(例如，人)。免疫应答可以抵御病毒感染，从而预防和/或治疗疾病。作为一个非限制性实例，本文所述的核酸疫苗可以治疗和/或预防感染性疾病，包括病毒感染性疾病，如由SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的VOC、VOI或VOHC引起的COVID-19。
根据感染的流行程度或未满足的医疗需求的程度或水平，本文所述的核酸疫苗可以用于各种环境。作为一个非限制性实例，本文所述的核酸疫苗可以用于治疗和/或预防COVID-19感染，包括与COVID-19感染(包括由SARS-CoV-2的原始形式和突变形式引起的感染)相关的疾病和病症。
随着对该疾病的了解越来越多，COVID-19感染的症状正在发生变化，但目前的症状包括发热或发冷、咳嗽、气短或呼吸困难、疲劳、身体疼痛、肌肉疼痛、头痛、喉咙痛、充血或流鼻涕、恶心和/或呕吐、腹泻和新的味觉或嗅觉丧失。
在一些实施方案中，与当前的抗病毒治疗相比，可以更好地设计本文所述的核酸疫苗，以在翻译时产生适当的蛋白质构象，因为核酸疫苗采用天然细胞机制。与离体制造并可能触发不想要的细胞反应的传统疫苗不同，核酸疫苗以更天然的方式呈递至细胞系统。在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗是针对COVID-19定制的活性疫苗，不仅可预防SARS-CoV-2感染，还可限制SARS-CoV-2的传播。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗可以用于通过以非常快速的基于核酸的疫苗生产过程对新出现的毒株作出反应来预防大流行性COVID-19。
在一些实施方案中，核酸疫苗的单次注射可以提供持续一整季的保护。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗可以是免疫刺激性的。核酸疫苗的多核苷酸序列可以进一步包含编码促进免疫应答的细胞因子的序列区，所述细胞因子例如单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INF-a、INF-γ、GM-CFS、LT-a，或生长因子如hGH。
COVID-19的治疗和/或预防
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗编码SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、多肽、肽、其片段或变体，并可以用于治疗和/或预防COVID-19。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗可产生高得多的中和抗体滴度，并且它们可以比市售的抗病毒药物更早地产生应答。作为一个非限制性实例，本文所述的核酸疫苗可产生比其他疫苗高10倍、或9X、或8X、或7X、或6X、或5X、或4X或3X的中和抗体滴度。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗采用天然细胞机制以在翻译时产生适当的蛋白质构象。与离体制造并可能触发不想要的细胞反应的传统疫苗不同，本文所述的核酸疫苗以更接近天然方式的方式或发生正常细胞加工的方式引入细胞系统。此外，可以使用制剂来屏蔽或靶向递送核酸疫苗至受试者的特定细胞或组织。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗代表靶向活性疫苗，其不仅可预防感染还可限制COVID-19的传播。
在一些实施方案中，核酸疫苗可以用于通过以非常快速的疫苗生产过程对新出现的毒株作出反应来预防大流行性SARS-CoV-2感染或COVID-19。
在一些实施方案中，单次注射编码SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、多肽、肽、其片段或变体的核酸疫苗可以提供至少6个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年、至少10年、至少11年、至少12年、至少13年、至少15年或超过15年的保护。
作为COVID-19或由SARS-CoV-2引起的其他疾病的疫苗接种计划的一部分，还可以使用本文所述的核酸疫苗来维持或康复受试者或群体的抗原记忆。
在一些实施方案中，可以产生核酸疫苗组合物，其包括编码SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、多肽、肽、其片段或变体的多核苷酸，所述SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、多肽、肽、其片段或变体显示出当年的感染率增加的流行性。已显示SARS-CoV-2的蛋白质序列随着时间的推移而发生变化或突变，其中一些突变已显示出增加的感染率。作为一个非限制性实例，可以产生核酸疫苗组合物，其包括编码SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、多肽、肽、其片段或变体的多核苷酸，所述SARS-CoV-2的一种或多种蛋白质、多肽、肽、其片段或变体显示出当年的感染率增加的流行性，例如但不限于刺突蛋白中的D614G突变。
在一些实施方案中，核酸疫苗可以用于在受试者中诱导中和抗体。由本发明核酸疫苗诱导的中和抗体的中和活性可能与本文所述疫苗的所得有效性(例如，免疫保护)相关。在一些方面，由本发明核酸疫苗提供的免疫保护可能大于在康复期受试者中提供的免疫保护。本发明核酸疫苗所诱导的中和活性可以增加那些暴露于SARS-CoV-2或处于康复期的人的恢复率(recovery rate)。与其他可用的mRNA疫苗如BNT162b2和mRNA-1273相比，本发明核酸疫苗在治疗的受试者中诱导更高的中和抗体滴度。在一些实施方案中，核酸疫苗包括比其他COVID-19疫苗高至少10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍或4倍的中和抗体滴度。
在一些实施方案中，开发了疫苗接种方案或计划，其不仅允许在当年持续进行疫苗接种，而且允许跨年、跨毒株或其组的记忆加强疫苗接种以在群体中建立和维持记忆。以这种方式，群体不太可能死于任何涉及旧毒株复发的大流行或爆发。先前疫苗组分毒株的任何组合都可用于产生或设计记忆加强疫苗。
在一些实施方案中，施用为记忆加强疫苗的核酸疫苗以在跨2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年、23年、24年、25年、26年、27年、28年、29年、30年、35年、40年、45年、50年或超过50年的时间段增强记忆。
在一些实施方案中，在交替的历史年内，包括每个另一年，施用作为记忆加强疫苗的核酸疫苗，以从相对于当前年的过去疫苗组分毒株增强记忆。在一些实施方案中，疫苗组分的选择可以来自每个第2年、每个第3年、每个第4年、每个第5年、每个第6年、每个第7年、每个第8年、每个第9年、每个第10年或每个10年以上。
在一些实施方案中，施用为记忆加强疫苗的核酸疫苗以在十年时间段内加强记忆。
在一些实施方案中，可以在群体中一次或定期使用核酸加强疫苗以产生群体免疫，所述群体免疫意指群体中超过30％受到保护。
在一些实施方案中，可以在人群中一次或定期使用核酸加强疫苗以产生针对COVID-19的群体免疫，所述群体免疫意指群体中超过30％受到保护。
在一些实施方案中，使用核酸疫苗以靶向处于COVID-19风险的群体，如具有既往病况的那些群体，所述既往病况包括但不限于癌症、慢性肾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、因实体器官移植、血液或骨髓移植、免疫缺陷、HIV以及使用皮质类固醇或其他免疫削弱药物造成的免疫受损状态(免疫系统变弱)、肥胖(体重指数(BMI)为30或更高)、心脏状况如心脏衰竭、冠状动脉疾病或心肌病、镰状细胞病、1型或2型糖尿病、哮喘(中度至重度)、脑血管疾病、囊性纤维化、高血压、神经系统状况如痴呆、肝病、怀孕、肺纤维化、吸烟和地中海贫血。
在一些实施方案中，核酸疫苗用于保护有暴露于SARS-CoV-2风险的医护人员。
作为非限制性实例，本公开的核酸疫苗包含LNP配制的多核苷酸，其编码具有D614G的全长S蛋白(SEQ ID NO：27)(也称为“PTX-B”)。提供了使用PTX-B疫苗在受试者中诱导保护性免疫应答的方法。保护性免疫应答可保护受试者免于病毒感染，如SARS-CoV-2的原始毒株及其变种引起的感染。SARS-CoV-2变种可以是任何VOC、VOI和/或VOHC毒株。作为非限制性实例，变种是Alpha变种、Beta变种或Delta变种。
在一些实施方案中，核酸疫苗PTX-B用于针对Alpha变种进行保护。
在一些实施方案中，核酸疫苗PTX-B用于针对Beta变种进行保护。
在一些实施方案中，核酸疫苗PTX-B用于针对Delta变种进行保护。
在一些实施方案中，核酸疫苗PTX-B用于在受试者中诱导中和抗体。核酸疫苗PTX-B诱导具有高中和滴度的抗体。例如，所诱导抗体的中和滴度是来自感染受试者或康复期受试者的血清中滴度的至少100倍、90倍、80倍、70倍、60倍、50倍、40倍、30倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍。
在一些实施方案中，提供核酸疫苗PTX-B的给药方案。PTX-B的剂量范围为1μg至500μg/kg受试者体重、1μg至1mg/kg受试者体重、1mg至10mg/kg受试者体重、1mg至100mg/kg受试者体重或10mg至100mg/kg受试者体重。在一些实例中，一个剂量的PTX-B可达到约10μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg或100μg核酸疫苗的剂量水平。施用至少一个剂量的核酸疫苗PTX-B。在一些实施方案中，施用至少一个加强剂量的PTX-B。加强剂量可在受试者接受第一剂PTX-B后一个月、两个月、三个月、四个月、六个月或一年或更长时间内施用于受试者。在一些情况下，向受试者施用多于一个加强剂量，例如两个、三个、四个或更多个加强剂量。
在另一个实施方案中，本公开的核酸疫苗包含LNP配制的多核苷酸，其编码SARS-CoV-2变种B.1.351(南非变种(SEQ ID NO:43))的全长S蛋白。
V.试剂盒和装置
试剂盒
本公开提供了用于方便和/或有效地实施本公开的方法的多种试剂盒。通常，试剂盒将包含足够量和/或数量的组分以允许使用者对受试者进行多次治疗和/或进行多次实验。
在一些实施方案中，本公开提供了在体外或体内调节基因表达的试剂盒，包括本公开的核酸疫苗组合物或本公开的核酸疫苗组合物的组合、调节其他基因的核酸疫苗组合物的组合、siRNA、miRNA或其他寡核苷酸分子。
试剂盒可以进一步包含包装和说明书和/或递送剂以形成制剂，例如，用于使用本文所述的核酸疫苗组合物施用于需要治疗的受试者。递送剂可以包含盐水、缓冲溶液、类脂质、树枝状大分子或任何合适的递送剂。
在一个非限制性实例中，缓冲溶液可以包括氯化钠、氯化钙、磷酸盐和/或EDTA。在另一个非限制性实例中，缓冲溶液可以包括但不限于盐水、含2mM钙的盐水、5％蔗糖、含2mM钙的5％蔗糖、5％甘露醇、含2mM钙的5％甘露醇、乳酸林格液、氯化钠、含有2mM钙和甘露糖的氯化钠(参见美国公开号20120258046；通过引用以其整体并入本文)。在又一个非限制性实例中，缓冲溶液可以发生沉淀或者它可以被冻干。可以改变每种组分的量，以实现一致的、可再现的更高浓度盐水或简单的缓冲液配方。还可以改变组分以增加缓冲溶液中核酸疫苗组合物在一段时间内和/或在各种条件下的稳定性。
装置
本公开提供了可以并入本公开的核酸疫苗组合物的装置。这些装置可以含有可用于立即递送给有此需要的受试者例如人类患者的稳定制剂。
装置的非限制性实例包括泵、导管、针、透皮贴剂、加压嗅觉递送装置、电穿孔装置、离子电渗装置、多层微流体装置。该装置可以用于根据单次、多次或分次给药方案递送本公开的核酸疫苗组合物。该装置可以用于递送本公开的核酸疫苗组合物穿过生物组织、皮内、皮下或肌内。适用于递送寡核苷酸的装置的更多实例在国际公开WO 2013/090648中公开，其内容通过引用以其整体并入本文。
VI.定义
在本说明书中的各个地方，本公开的化合物的取代基以基团或以范围公开。明确旨在本公开包括此类基团和范围的成员的每一个单独的子组合。
约：如本文所用，术语“约(about)”意指所述值的+/-10％。
组合施用：如本文所使用，术语“以组合施用(administered in combination)”或“组合施用(combined administration)”意指同时或在使得每种药剂对患者的作用可以存在重叠的间隔内向受试者施用两种或更多种药剂。在一些实施方案中，它们在距彼此约60、30、15、10、5或1分钟内施用。在一些实施方案中，药剂施用的间隔足够靠近以使得实现组合(例如，协同)作用。
佐剂：如本文所用，术语“佐剂(adjuvant)”意指增强受试者对抗原的免疫应答的物质。本文所述的核酸疫苗可以任选地包含一种或多种佐剂。
动物：如本文所用，术语“动物(animal)”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施方案中，非人类动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、禽类、爬行动物、两栖动物、鱼和蠕虫。在一些实施方案中，动物是转基因动物、基因工程动物或克隆。
抗原：如本文所定义，术语“抗原(antigen)”是指组合物，例如，在生物体中引起免疫应答的物质或剂，例如，引起生物体的免疫应答以产生针对该物质或剂的抗体，特别是，其在生物体中引发适应性免疫应答。抗原可以是任何免疫原性物质，尤其包括蛋白质、多肽、多糖、核酸、脂质等。示例性抗原衍生自感染性物质。这样的感染性物质可包括感染性物质的部分或亚单位，例如，感染性物质(例如细菌、病毒和其他微生物)的外壳、外壳组分，例如外壳蛋白或多肽；表面组分，例如表面蛋白或多肽；荚膜组分；细胞壁组分；鞭毛、菌毛和/或毒素或类毒素)。某些抗原，例如脂质和/或核酸是抗原性的，优选地，当与蛋白质和/或多糖组合时。
大约：如本文所用，在应用于一个或多个目标值时，术语“大约(approximately)”或“约”是指类似于所述的参考值的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指落入所述的参考值的任一方向上(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的一系列值，除非另外说明或以另外的方式从上下文显而易见(除了这样的数字将超过可能值的100％)。
缔合：如本文所使用，在关于两个或更多个部分使用时，术语“缔合(associatedwith)”、“缀合(conjugated)”、“连接(linked)”、“附着(attached)”和“栓系(tethered)”意指所述部分直接或经由充当连接剂的一个或多个另外的部分彼此物理缔合或连接以形成足够稳定的结构，从而使得所述部分在使用所述结构的条件例如生理条件下保持物理缔合。“缔合(association)”不需要是严格地通过直接共价化学键合。还可以表明离子键合或氢键合或基于杂交的连接足够稳定以使得“缔合的(associated)”实体保持物理缔合。
双功能的：如本文所使用，术语“双功能的(bifunctional)”是指能够或维持至少两种功能的任何物质、分子或部分。所述功能可以实现相同结果或不同结果。产生功能的结构可以为相同的或不同的。
生物相容：如本文所使用，术语“生物相容(biocompatible)”意指与活细胞、组织、器官或系统相容，造成很少或没有损伤、毒性或被免疫系统排斥的风险。
生物可降解：如本文所用，术语“生物可降解(biodegradable)”是指能够通过活物的作用分解成无害的产物。
生物活性的：如本文所用，短语“生物活性(biologically active)”是指在生物系统和/或有机体中具有活性的任何物质的特征。例如，当施用于生物体时，对该生物体具有生物学效应的物质被认为具有生物活性。在特定实施方案中，如果即使是多核苷酸的一部分具有生物学活性或模拟被认为生物学相关的活性，则本文所述的多核苷酸也可以被认为具有生物学活性。
嵌合体：如本文所用，“嵌合体(chimera)”是具有两个或更多个不协调或异质部分或区域的实体。
化合物：如本文所用，术语“化合物(compound)”意在包括所描绘结构的所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。
本文所述的化合物可以是不对称的(例如，具有一个或多个立体中心)。除非另有说明，否则所有立体异构体，如对映异构体和非对映异构体都旨在包括在本发明中。含有不对称取代的碳原子的本公开的化合物可以以光学活性或外消旋形式分离。关于如何从光学活性起始材料制备光学活性形式的方法是本领域已知的，如通过外消旋混合物的拆分或通过立体选择性合成。烯烃、C＝N双键等的许多几何异构体也可以存在于本文所述的化合物中，并且所有这些稳定的异构体都包含在本公开中。本公开的化合物的顺式和反式几何异构体被描述并且可以被分离为异构体的混合物或分离的异构体形式。
本公开的化合物还包括互变异构形式。互变异构形式是由一个单键与一个相邻的双键交换以及伴随的质子迁移产生的。互变异构形式包括质子移变互变异构体，它们是具有相同经验公式和总电荷的异构质子化状态。
本公开的化合物还包括出现于中间体或最终化合物中的原子的所有同位素。“同位素(isotope)”是指具有相同原子数但具有由原子核中的中子数不同而产生的不同质量数的原子。例如，氢的同位素包括氚和氘。
本公开的化合物和盐可通过常规方法与溶剂或水分子组合以形成溶剂化物和水合物来制备。
保守的：如本文所用，术语“保守的(conserved)”是指分别在比较的两个或更多个序列的相同位置上未发生改变的多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基。相对保守的核苷酸或氨基酸为在比出现于该序列其他地方的核苷酸或氨基酸更为相关的序列中保守的那些核苷酸或氨基酸。
在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此100％相同，则称它们是“完全保守的(completely conserved)”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，则称它们是“高度保守的(highly conserved)”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性、约95％、约98％或约99％同一性，则称它们是“高度保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有至少30％同一性、至少40％同一性、至少50％同一性、至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，则称它们是“保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有约30％同一性、约40％同一性、约50％同一性、约60％同一性、约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性、约95％同一性、约98％同一性或约99％同一性，则称它们是“保守的”。序列保守可以应用于多核苷酸或多肽的整个长度，或者可以应用于其部分、区域或特征。
控制释放：如本文所用，术语“控制释放(controlled release)”是指遵循用于实现治疗结果的特定释放模式的药物组合物或化合物释放概况。
细胞抑制：如本文所用，“细胞抑制(cytostatic)”是指抑制、减少、阻止细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合的生长、分裂或增殖。
细胞毒性：如本文所用，“细胞毒性(cytotoxic)”是指对细胞(例如哺乳动物细胞(例如人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合杀死或造成伤害、毒性或致命作用。
递送：如本文所用，“递送(delivery)”是指递送化合物、物质、实体、部分、负荷或有效载荷的行为或方式。
递送剂：如本文所用，“递送剂(delivery agent)”是指至少部分地促进多核苷酸在体内递送至靶细胞的任何物质。
去稳定：如本文所用，术语“去稳定的(destable)”、“去稳定(destabilize)”或“去稳定区(destabilizing region)”意指比相同区域或分子的起始野生型或天然形式的稳定性更差的区域或分子。
可检测标记：如本文所用，“可检测标记(detectable label)”是指连接、并入或缔合另一个通过本领域中已知的方法容易检测的实体的一种或多种标志物、信号或部分，所述方法包括射线照相术、荧光、化学发光、酶活性、吸光度等。可检测标记包括放射性同位素、荧光团、发色团、酶、染料、金属离子、配体如生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和半抗原、量子点等。可检测标记可以位于本文公开的肽或蛋白质中的任何位置上。它们可以在氨基酸、肽或蛋白质内，或位于N-末端或C-末端上。
消化：如本文所使用，术语“消化(digest)”意指分解成更小的块或组分。在提到多肽或蛋白质时，消化导致肽的产生。
给药方案：如本文所用，“给药方案(dosing regimen)”为施用计划或医师确定的治疗、预防或姑息治疗方案。
包封：如本文所用，术语“包封(encapsulate)”意指封住、包围或包住。
编码的蛋白质裂解信号：如本文所用，“编码的蛋白质裂解信号(encoded proteincleavage signal)”是指编码蛋白质裂解信号的核苷酸序列。
工程化的：如本文所用，核酸疫苗的实施方案在它们被设计为具有不同于起始点、野生型或天然分子的特征或性质(无论是结构的还是化学的)时是“工程化的(engineered)”。
有效量：如本文所用，药剂的术语“有效量(effective amount)”是足以实现有益或期望结果(例如临床结果)的量，因此，“有效量”取决于其被应用的背景。例如，在施用治疗癌症的药剂的情况下，药剂的有效量是例如与不施用药剂获得的反应相比足以实现如本文所定义的治疗癌症的量。
外泌体：如本文所用，“外泌体(exosome)”为哺乳动物细胞分泌的囊泡或参与RNA降解的复合物。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达(expression)”是指以下事件中的一种或多种：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'端加工)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；和(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
特征：如本文所用，“特征(feature)”是指特性、性质或独特要素。
制剂：如本文所用，“制剂(formulation)”至少包括核酸疫苗的多核苷酸和递送剂。
片段：如本文所用，“片段(fragment)”是指一部分。例如，蛋白质片段可以包含通过消化从培养细胞中分离的全长蛋白质而获得的多肽。
功能性：如本文所用，“功能性(functional)”生物分子为呈表现出可借以对其进行表征的性质和/或活性的形式的生物分子。
同源性：如本文所用，术语“同源性(homology)”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同或相似，则认为它们是彼此“同源的”。术语“同源的(homologous)”必定是指至少两个序列(多核苷酸序列或多肽序列)之间的比较。如果两个多核苷酸序列编码的多肽在至少约20个氨基酸的至少一段上至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％相同，则认为这两个多核苷酸序列是同源的。在一些实施方案中，同源多核苷酸序列的特征在于编码一段至少4-5个独特指定的氨基酸的能力。对于长度小于60个核苷酸的多核苷酸序列，通过编码一段至少4-5个独特指定的氨基酸的能力来确定同源性。如果两个蛋白质对于至少约20个氨基酸的至少一段为至少约50％、60％、70％、80％或90％相同，则认为这两个蛋白质序列是同源的。
同一性：如本文所用，术语“同一性(idenity)”是指聚合分子之间，例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。
两个多核苷酸序列的同一性百分比的计算例如可通过出于最佳比较目的比对两个序列来进行(例如，为了最佳比对可在第一核酸序列和第二核酸序列之一或两者中引入空位并且出于比较目的可忽视不相同的序列)。在某些实施方案中，出于比较目的比对的序列的长度为参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较对应核苷酸位置上的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的核苷酸占据时，则分子在该位置上相同。两个序列之间的同一性百分比为将空位数和每个空位的长度考虑在内的序列共有的相同位置数的函数，所述空位需要被引入用于两个序列的最佳比对。可使用数学算法来完成序列比较和确定两个序列之间的同一性百分比。例如，可使用如描述于以下文献中的那些方法确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M,ed.,Oxford University Press,N.Y.,1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,N.Y,1993；Sequence Analysis inMolecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M,和Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,N.J.,1994；以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,N.Y,1991；其每一篇都通过引用并入本文。例如，可使用Meyers和Miller(CABIOS,1989,4:11-17)的算法确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比，所述算法已结合到ALIGN程序(2.0版本)中，使用PAM 120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。或者可使用GCG软件包中的GAP程序、使用NWSgapdna.CMP矩阵确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。经常采用的确定序列之间的同一性百分比的方法包括但不限于在Carillo,H.,和Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48:1073(1988)中公开的那些；所述参考文献通过引用并入本文。用于确定同一性的技术编写在公众可获得的计算机程序中。确定两个序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG程序包，Devereux,J.,等,Nucleic Acids Research,12(1),387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA Altschul,S.F.et al,J.Molec.Biol.,215,403(1990))。
感染性物质：如本文所用，短语“感染性物质(infectious agent)”意指能够在生物体例如动物中产生感染的物质。感染性物质可以是指任何微生物、病毒、感染物质或生物产品，其可以是通过生物技术工程改造的，或任何此类微生物、病毒、感染物质或生物产品的任何天然存在或生物工程化的组分，可导致人类、动物、植物或其他生物体中的新发疾病和接触传染病、死亡或其他生物功能障碍。
体外：如本文所用，术语“体外(in vitro)”是指在人工环境中发生的事件，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在培养皿中等，而不是在生物体内(例如，动物、植物或微生物)。
体内：如本文所用，术语“体内(in vivo)”是指在生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。
分离的：如本文所用，术语“分离的(isolated)”是指已从其缔合(无论在自然中或在实验环境中)的至少一些组分中分离的物质或实体。分离的物质相对于它们缔合的物质可以具有不同水平的纯度。分离的物质和/或实体可以与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的它们最初缔合的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的剂为大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或多于约99％纯。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则它为“纯的(pure)”。基本上分离的：“基本上分离的(substantiallyisolated)”意指化合物与形成或检测其的环境基本上分离。部分分离可包括例如富集本公开化合物的组合物。基本上分离可包括含有至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％、至少约90重量％、至少约95重量％、至少约97重量％或至少约99重量％的本公开化合物或其盐的组合物。用于分离化合物和它们的盐的方法是本领域常规的。
接头：如本文所用，“接头(linker)”是指一组原子，例如10-1,000个原子，并且可包含原子或基团例如但不限于碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺。接头可在第一端连接至核碱基或糖部分上的修饰核苷或核苷酸，并且在第二端连接至有效载荷例如可检测剂或治疗剂。接头可以具有足够的长度以便不干扰并入核酸序列中。
修饰的：如本文所用，“修饰的(modified)”是指本文所述分子的改变的状态或结构。分子可以通过多种方式包括化学上、结构上和功能上的方式进行修饰。
粘液：如本文所用，“粘液(mucus)”是指粘性的并包含粘蛋白糖蛋白的天然物质。
天然存在的：如本文所用，“天然存在的(naturally occurring)”意指在没有人工帮助的情况下存在于自然界中。
中和抗体：如本文所用，“中和抗体(neutralizing antibody)”是指与其抗原结合并通过中和或消除细胞具有的任何生物活性来保护细胞免受抗原或感染性物质侵害的抗体。
非人类脊椎动物：如本文所用，“非人类脊椎动物(non-human vertebrate)”包括除智人之外的所有脊椎动物，包括野生和驯养物种。非人类脊椎动物的实例包括但不限于哺乳动物，如羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、猫、牛、鹿、狗、驴、大额牛、山羊、豚鼠、马、美洲驼、骡、猪、兔、驯鹿、绵羊、水牛以及牦牛
核酸疫苗：如本文所用，“核酸疫苗(nucleic acid vaccine)”是指疫苗或疫苗组合物，其包括编码抗原(例如，抗原蛋白或多肽)的核酸或核酸分子(例如，多核苷酸)。在示例性实施方案中，核酸疫苗包括核糖核酸(“RNA”)多核苷酸、核糖核酸(“RNA”)或核糖核酸(“RNA”)分子。这样的实施方案可被称为核糖核酸(“RNA”)疫苗。
脱靶：如本文所用，“脱靶(off target)”是指对任何一个或多个靶标、基因或细胞转录物的任何非预期作用。
开放阅读框：如本文所用，术语“开放阅读框(open reading frame)”或“ORF”是指包含起始密码子、包含多个氨基酸编码密码子的随后区域和末端终止密码子的连续多核苷酸序列，例如，DNA序列或RNA序列(例如mRNA序列)，其中包含多个氨基酸编码密码子的区域不含有终止密码子。
有效连接：如本文所用，短语“有效连接(operably linked)”是指两个或更多个分子、构建体、转录物、实体、部分等之间的功能连接。
部分：如本文所用，多核苷酸的“部分(part)”或“区域(region)”定义为多核苷酸的小于多核苷酸全长的任何部分。
肽：如本文所用，“肽(peptide)”为小于或等于50个氨基酸长，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
互补位：如本文所用，“互补位(paratope)”是指抗体的抗原结合位点。
患者：如本文所用，“患者(patient)”是指可能寻求或有治疗需要、要求治疗、正在接受治疗、将接受治疗的受试者，或针对特定疾病或病况在受过训练的专业人员的护理下的受试者。
药学上可接受的：本文使用的短语“药学上可接受的(pharmaceuticallyacceptable)”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
药学上可接受的赋形剂：如本文所用，短语“药学上可接受的赋形剂(pharmaceutically acceptable excipient)”是指除本文所述的化合物之外的任何成分(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的媒介物)并具有在患者中基本上无毒和非炎性的性质。赋形剂可以包括，例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣剂、压缩助剂、崩解剂、染料(颜料)、软化剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣剂、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂以及水合水。示例性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二碱式)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶凝淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、淀粉羟基乙酸钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C以及木糖醇。
药学上可接受的盐：本公开还包括本文描述的化合物的药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐(pharmaceutically acceptable salts)”是指公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有酸或碱部分转化为其盐形式(例如，通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)来修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱盐或有机盐等。代表性酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、双葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括例如从无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。可通过常规化学方法从含有碱性部分或酸性部分的母体化合物合成本公开的药学上可接受的盐。通常，可通过使这些化合物的游离酸或游离碱形式与化学计量量的适当碱或酸在水或在有机溶剂中或者在水与有机溶剂的混合物中反应来制备此类盐；通常，像乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈的非水性介质为优选的。合适的盐的列表见于Remington’s PharmaceuticalSciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(eds.),Wiley-VCH,2008；以及Beige等,Journal of Pharmaceutical Science,66,1-19(1977)，其每一篇通过引用以其整体并入本文。
药学上可接受的溶剂化物：如本文所用，术语“药学上可接受的溶剂化物(pharmaceutically acceptable solvate)”意指其中合适溶剂的分子掺入晶格中的本发明的化合物。合适的溶剂在所施用的剂量下为生理上可耐受的。例如，可以通过从包括有机溶剂、水或其混合物的溶液中结晶、重结晶或沉淀来制备溶剂化物。合适溶剂的实例为乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N’-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。当水为溶剂时，溶剂化物称为“水合物(hydrate)”。
药代动力学：如本文所用，“药代动力学(pharmacokinetic)”是指当涉及确定施用于活生物体的物质的命运时，分子或化合物的任何一种或多种性质。药代动力学分成若干领域，包括吸收、分布、代谢和排泄的程度和速率。这通常被称为ADME，其中：(A)吸收为物质进入血液循环的过程；(D)分布为物质在整个身体的体液和组织中的分散或散布；(M)代谢(或生物转化)为母体化合物不可逆转化成子代谢物；并且(E)排泄(或消除)是指物质从身体消除。在极少数情况下，一些药物不可逆地在身体组织中积累。
物理化学：如本文所用，“物理化学(physicochemical)”意指或涉及物理和/或化学性质。
多肽/单位药物(PUD)：如本文所用，PUD或产物/单位药物定义为总每日剂量的细分部分，通常如在体液或组织中所测量的1mg、pg、kg等的产物(如多肽)，通常以除以体液中的测量值的浓度如pmol/mL、mmol/mL等定义。
预防：如本文所用，术语“预防(preventing)”是指部分或完全延迟感染、疾病、病症和/或病况的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或病况的一个或多个症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或病况的一个或多个症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟感染、特定疾病、病症和/或病况的进展；和/或降低发展与感染、疾病、病症和/或病况相关的病理的风险。
增殖：如本文所用，术语“增殖(proliferate)”意指生长、扩增或增加或引起快速生长、扩增或增加。“增殖性的(proliferative)”意指具有增殖的能力。“抗增殖性的(anti-proliferative)”意指具有与增殖性质相反或不适合的性质。
预防性：如本文所用，“预防性(prophylactic)”是指用于防止疾病传播的治疗或作用过程。
预防：如本文所用，“预防(prophylaxis)”是指为维持健康和防止疾病传播而采取的措施。“免疫预防(immune prophylaxis)”是指产生主动或被动免疫以防止疾病传播的措施。
蛋白质裂解位点：如本文所用，“蛋白质裂解位点(protein cleavage site)”是指其中可通过化学方式、酶促或光化学方式完成氨基酸链的控制裂解的位点。
蛋白质裂解信号：如本文所用，“蛋白质裂解信号(protein cleavage signal)”是指标志或标记多肽进行裂解的至少一种氨基酸。
目标蛋白质：如本文所用，术语“目标蛋白质(protein of interest)”或“期望蛋白质(desired protein)”包括本文提供的那些及其片段、突变体、变体和改变。
纯化的：如本文所用，“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”、“纯化(purification)”意指使之为基本上纯的或清除不想要的组分、材料污物、混合物或瑕疵。
重复转染：如本文所用，术语“重复转染(repeated transfection)”是指用多核苷酸多次转染同一细胞培养物。细胞培养物可被转染至少两次，至少3次，至少4次，至少5次，至少6次，至少7次，至少8次，至少9次，至少10次，至少11次，至少12次，至少13次，至少14次，至少15次，至少16次，至少17次，至少18次，至少19次，至少20次，至少25次，至少30次，至少35次，至少40次，至少45次，至少50次或更多次。
样品：如本文所用，术语“样品(sample)”或“生物样品(biological sample)”是指其组织、细胞或组分部分的子集(例如体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊髓液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液)。样品进一步可以包括从整个生物体或其组织、细胞或组分部分的子集或其级分或部分制备的匀浆、裂解物或提取物，包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤的外部部分、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、眼液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官。样品还指培养基，如营养肉汤或凝胶，其可以含有细胞组分，如蛋白质或核酸分子。
信号序列：如本文所用，短语“信号序列(signal sequence)”是指可指导蛋白质转运或定位的序列。
单个单位剂量：如本文所用，“单个单位剂量(single unit dose)”是以一剂/一次/单一途径/单一接触点施用(即单次施用事件)的任何治疗剂的剂量。
相似性：如本文所用，术语“相似性(similarity)”是指聚合分子之间例如多核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。可以与同一性百分比的计算相同的方式进行聚合分子彼此的相似性百分比的计算，除了相似性百分比计算考虑到如本领域中所理解的保守取代。
分次剂量：如本文所用，“分次剂量(split dose)”是将单个单位剂量或总每日剂量分成两个或更多个剂量。
稳定的：如本文所用，“稳定的(stable)”是指足够稳健以经受住从反应混合物中分离成有用的纯度并且优选能够配制成有效治疗剂的化合物。
稳定化：如本文所用，术语“稳定化(stabilize)”、“稳定化的(stabilized)”、“稳定化区域(stabilized region)”意指使稳定或变得稳定。
受试者：如本文所用，术语“受试者(subject)”或“患者(patient)”是指例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的可以向其施用组合物的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人)。
基本上：如本文所用，术语“基本上(substantially)”是指表现出目标特征或性质的全部或接近全部的范围或程度的定性条件。生物领域普通技术人员将理解，生物现象和化学现象很少(如果有的话)会完成和/或进行到底或达到或避免绝对结果。因此，本文使用术语“基本上”来体现在许多生物现象和化学现象中固有的潜在完全性缺乏。
基本上相等(substantially equal)：如本文所用，当它涉及剂量之间的时间差时，该术语表示正/负2％。
基本上同时(substantially simultaneously)：如本文所用，并且当其涉及多个剂量时，该术语是指在2秒内。
患有：“患有(suffering from)”疾病、病症和/或病况的个体已被诊断患有或表现出疾病、病症和/或病况的一种或多种症状。
易感：“易感(susceptible to)”疾病、病症和/或病况的个体尚未诊断具有和/或可能未表现出疾病、病症和/或病况的症状但怀疑有发展疾病或其症状的倾向。在一些实施方案中，易感疾病、病症和/或病况(例如，癌症)的个体可以具有以下的一个或多个特征：(1)与发展疾病、病症和/或病况相关的基因突变；(2)与发展疾病、病症和/或病况相关的遗传多态性；(3)与疾病、病症和/或病况相关的蛋白质和/或核酸的表达和/或活性增加和/或减少；(4)与发展疾病、病症和/或病况相关的习惯和/或生活方式；(5)疾病、病症和/或病况的家族史；以及(6)暴露于与发展疾病、病症和/或病况相关的微生物和/或被所述微生物感染。在一些实施方案中，易感疾病、病症和/或病况的个体将发展疾病、病症和/或病况。在一些实施方案中，易感疾病、病症和/或病况的个体将不会发展疾病、病症和/或病况。
持续释放：如本文所用，术语“持续释放(sustained release)”是指在特定时间段内遵循释放速率的药物组合物或化合物释放概况。
合成：术语“合成(synthetic)”意指通过人工生产、制备和/或制造的。本文所述的多核苷酸或多肽或其他分子的合成可以为化学或酶促的。
疫苗：如本文所用，疫苗是包含编码至少一种抗原的至少一种多核苷酸的化合物或组合物。
靶细胞：如本文所用，“靶细胞(targeted cell)”是指任何一种或多种目标细胞。可以在体外、体内、原位或在生物体的组织或器官中发现这些细胞。生物体可以是动物，优选哺乳动物，更优选人，最优选患者。
治疗剂：术语“治疗剂(therapeutic agent)”是指当施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引发期望的生物学和/或药理学作用的任何药剂。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量(therapeutically effectiveamount)”意指在向患有或易感感染、疾病、病症和/或病况的受试者施用时足以治疗感染、疾病、病症和/或病况、改善其症状、诊断、预防其和/或延迟其发作的待递送的药剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量。
治疗有效结果：如本文所用，术语“治疗有效结果(therapeutically effectiveoutcome)”是指在患有或易患感染、疾病、病症和/或病症的受试者中足以治疗、改善症状、诊断、预防和/或延迟感染、疾病、病症和/或病况的发作的结果。
总每日剂量：如本文所用，“总每日剂量(total daily dose)”是在24小时时期内给予或规定的量。它可以作为单个单位剂量施用。
转染：如本文所用，术语“转染(transfection)”是指将外源核酸引入细胞中的方法。转染方法包括但不限于化学方法、物理处理和阳离子脂质或混合物。
翻译：如本文所用，“翻译(translation)”是多核苷酸分子通过核糖体或核糖体样机器(例如细胞或人工)加工以产生肽或多肽的过程。
转录：如本文所用，“转录(transcription)”是多核苷酸分子被聚合酶或其他酶加工以产生多核苷酸例如RNA多核苷酸的过程。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treating)”是指部分或完全地缓解、改善、改进、减轻特定感染、疾病、病症和/或病况的一个或多个症状或特征、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或减少其发生率。可以出于降低发展与疾病、病症和/或病况相关的病理的风险的目的，向没有表现出疾病、病症和/或病况的体征的受试者和/或仅表现出疾病、感染、病症和/或病况的早期体征的受试者施用治疗。
未修饰的：如本文所用，“未修饰的(unmodified)”是指在以任何方式变化之前的任何物质、化合物或分子。未修饰的可以但不总是指生物分子的野生型或天然形式。分子可以经历一系列修饰，由此每个修饰的分子可以作为“未修饰的”起始分子进行后续修饰。
疫苗：如本文所用，短语“疫苗(vaccine)”是指在特定疾病、病症或病况的情况下提高免疫的生物制剂。
病毒蛋白：如本文所用，短语“病毒蛋白(viral protein)”意指源自病毒的任何蛋白。
实施例
实施例1.LNP配制的mRNA的体内研究
如表6所述向5组雌性C57bl/6小鼠(8只小鼠/组(6周龄))施用制剂。在第1和22天通过肌内施用接受20微克(“μg”)的表6中的其中一种制剂之前，即在第0和21天将小鼠放血。在第43天，将小鼠安乐死，通过心脏穿刺收集血液，收获脾并分离脾细胞。
表6.制剂表
对来自第21天的活体出血的合并样品进行临床分离物病毒中和测定。在终止时(第43天)，测量结合SARS-CoV-2RBD和S蛋白的血清抗体、假病毒中和、临床分离物病毒中和和T细胞应答(通过酶联免疫斑点法(ELIspot)和流式细胞术测定)。
小鼠没有明显的不良反应。来自初始初步出血的数据显示，所有三种构建体均具有中和活性。第3组制剂(全长S蛋白mRNA)是最好的，紧接着是第4组制剂(具有突变弗林蛋白酶位点的全长S蛋白)；第2组制剂(S蛋白RBD结构域)表现最低，在阴性对照处理组中均没有观察到活性。
用SARS-CoV抗原(RBD肽库加上S蛋白)刺激脾细胞，通过在ELISpot中计数分泌IFN-γ的T细胞，或在流式细胞仪中计数产生Th1细胞因子(IFN-γ/TNF-α/IL-2)和Th2细胞因子(IL-4/IL-5)的T细胞，来测量抗原特异性T细胞应答。还通过多重小鼠细胞因子测定，在SARS-CoV抗原刺激的T细胞的上清液中测量了Th1细胞因子(IFN-γ/TNF-α/IL-2)和Th2细胞因子(IL-4/IL-5)。
ELISpot测定
ELISpot测定证明，用第2组、第3组和第4组制剂处理的小鼠的脾细胞产生了响应于肽库而分泌IFN-γ的T细胞，所述肽库包含在S蛋白的RBD和保守S2区域内重叠的肽。第2组、第3组和第4组的应答是相似的，并且两个对照组都没有显示出对所述肽库的显著应答。与两个对照组相比，流式细胞术测定在所述三个组中均没有检测到显著的Th1或Th2应答。
直接结合ELISA用于确定是否有任何抗体被引发以与S蛋白结合。使RBD结构域或全长S蛋白与板结合，并使来自经处理小鼠的不同血清稀释液在板中孵育，然后洗涤并通过抗小鼠抗体检测。来自第2组、第3组和第4组的血清对于能结合RBD和全长S蛋白两者的抗体是阳性的，而对照对于结合是阴性的。
SARS-CoV-2中和测定
为了确定从第2组、第3组和第4组制剂中引发的抗体是否是中和性的，使用两种不同的测定。第一种测定使用从安大略省的首批COVID-19患者之一分离的SARS-CoV-2病毒，该测定的读数是已经与活病毒和来自经处理小鼠的不同血清稀释液孵育的Vero2E6细胞的健康状况的显微读数。该测定已经用于表征来自康复期患者的血清，其中ID50值为1:80至1:320，因此选择用于测试这些小鼠血清的稀释系列为1:20至1:2560。来自第1组小鼠的血清具有最小的可检测的中和活性。第2组显示一些中等活性，其中8个样品中有6个的ID50在1:20和1:80之间。第3组和第4组显示强的中和活性，大多数血清样品甚至在1:2560的最高稀释度下仍保持100％中和活性。结果提供于图1中。
假病毒中和测定
第二中和测定由假病毒测定组成。该测定利用了SARS-CoV-2S蛋白假型慢病毒，其编码荧光素酶基因并可以感染HEK293T细胞，所述HEK293T细胞表达hACE2和TMPRSS2以获得更好的转导效率。通过测定来自～50个康复期患者的血清滴度来表征该测定，其中该血清具有～1:500的平均ID50，范围为1:1～1:10,000，但是对于该研究，使用了1:40～1:24,400的稀释范围。来自两个对照组(第1组和第5组)的血清具有最小活性至无活性。第2组具有显著的但低的中和活性。第3组和第4组的活性高于该实验的定量范围。数值经外推得到，平均ID50值为～1:50,000(第3组)和～1:45,000(第4组)。结果提供于图2中。
结论
本研究证明在三周时间段内肌内注射到小鼠中两次时，LNP配制的mRNA疫苗能够引发T细胞应答和能够结合SARS-CoV-2的S蛋白的抗体。经处理的小鼠产生了能够中和SARS-CoV-2的临床分离物以及SARS-CoV-2假型慢病毒的抗体。这对于第3组和第4组制剂尤其如此，其导致在每个测定中的滴度均高于定量范围。
实施例2.小鼠中的中和抗体研究
选择疫苗候选物，LNP配制的编码具有D614G突变的全长S蛋白(SEQ ID NO：27；编码区SEQ ID NO：7)的疫苗(应用于表6中第3组的疫苗制剂，下文称为“PTX-B”)作为进一步研究的候选物。评价PTX-B在小鼠中产生中和抗体和T细胞应答的能力。在第1和22天，如下对三(3)组雌性C57BL/6小鼠(10只小鼠/组)进行疫苗接种：
第1组：10μg LNP配制的tdTomato mRNA(阴性对照)
第2组：1μg PTX-B
第3组：10μg PTX-B
在该研究中评估的参数包括对来自第一次免疫后三周(第22天)的活体出血的合并样品进行的临床分离物病毒中和测定和假病毒中和测定；和在第二次免疫后在终止时(第43天)的以下评估：血清抗体对来自SARS-CoV-2的S蛋白的结合、假病毒中和、临床分离物病毒中和，通过ELISpot和流式细胞术测定脾细胞T细胞应答以及细胞因子分泌。
实验的活体阶段在小鼠中没有显示明显的不良反应。第22天的初始初步出血数据显示，10μg剂量水平产生了中和抗体，而1μg剂量水平仅与阴性对照组略有不同。
在终止时(第二次免疫(加强)后三周)，在ELISpot测定中1μg和10μg剂量组显示大致相等的T细胞应答，但在基于抗体的测定中，10μg剂量水平组表现好得多，有证据显示高水平的IgG同种型(总IgG、IgG1、IgG2b和IgG2c)。在给药1μg的小鼠中的IgM水平高于给药10μg的小鼠，这可能是由于10μg组中的较强刺激导致的早的类别转换(class switching)。有IgGA的证据，特别是在10μg剂量，但是这种同种型没有被诱导至与IgG同种型一样高的水平。1和10μg PTX-B都引发非常强的S-特异性IgG、IgG1、IgG2b、IgG2c(1和10μg PTX-B的终点滴度分别为：IgG的2.7±0.9E6、3.0±0.5E7；IgG1的1.1±0.2E6、2.8±0.8E6；IgG2b的9.4±2.0E5、9.7±3.4E6；IgG2c的3.5±1.8E7、1.95±0.0E8)。1和10μg PTX-B也都引发强的S-特异性IgA(1和10μg PTX-B的终点滴度分别为3.3±3.1E4、1.7±0.6E7)，尽管该滴度低于IgG的滴度。10μg PTX-B的剂量通常比1μg的剂量诱导更高的S-特异性结合抗体。Th1抗体(IgG2b和IgG2c)比Th2抗体(IgG1)占更多数也表明，PTX-B诱导了偏向Th1的抗体应答。在接受tdTomato mRNA的对照小鼠的血清中检测到非常低或很少的S-特异性结合抗体。
如实施例1中所述，第一中和测定使用从安大略省的第一批COVID-19患者之一分离的SARS-CoV-2病毒，第二测定是使用SARS-CoV-2S蛋白假型慢病毒的假病毒中和测定。在这两种抗体中和测定中，10μg剂量组的表现大大优于1μg剂量组，尽管该剂量组确实显示出相当大的中和活性(与用来自康复患者的血清所观察到的相当)。图3显示了SARS-CoV-2临床分离物和假病毒中和测定两者的ID50(在该稀释度下观察到50％的感染性抑制)。来自阴性对照组的血清在任一测定中都没有显示活性。来自10μg组的血清具有剂量反应性效应，证明有显著更高的中和活性，尤其是在SARS-CoV-2临床分离物测定中。通过Kruskal-Wallis检验使用多重比较进行统计；在图3中，**＝P＜0.01，***＝P＜0.001，****＝P＜0.0001。在假病毒测定中，在阴性对照组中没有显著活性，在1μg剂量组中有中等活性，在10μg组中有非常强的中和活性，ID50高达1:90,000。
通过ELISpot进行IFN-γ分析，以确定对用疫苗免疫的T细胞应答。用SARS-CoV-2S蛋白的肽库(315个15mer肽，具有11mer重叠)刺激小鼠脾细胞。通过ELISpot分析测量产生IFN-γ的T细胞。与接种阴性对照的小鼠相比，用PTX-B免疫的小鼠的T细胞产生IFN-γ的频率更高(图4)。在第1天和第22天给小鼠疫苗接种PTX-B的初免和加强免疫。在第43天处死小鼠，在预包被抗IFN-γ抗体的96孔ELISpot平板上，在SARS-CoV-2肽库存在下刺激脾细胞过夜。孵育后，对板进行洗涤、染色、用抗IFN-γHRP抗体处理，并在ELISpot仪上读数。使用Kruskal-Wallis检验和多重比较分析，进行统计学分析。
通过Luminex的细胞因子分析显示，用PTX-B免疫的小鼠以剂量依赖性方式产生高水平的IL-2、IFN-γ和GM-CSF，但产生低水平的IL-4和IL-10(图5)。在第1天和第22天给小鼠疫苗接种PTX-B的初免和加强免疫。在第43天处死小鼠，在SARS-CoV-2肽库存在的情况下刺激脾细胞过夜。用Luminex分析上清液中IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-4、IL-5和IL-10的存在。通过Kruskal-Wallis检验和多重比较，进行统计学分析。在测定中，用PTX-B免疫的小鼠或对照中均未检测到TNF-α水平。有趣的是，在用PTX-B免疫的小鼠中可检测到IL-5水平，但不随疫苗接种而增加。
细胞免疫应答
PTX-B也引发强细胞免疫应答。在加强疫苗接种后3周制备小鼠脾细胞，用S肽库进行刺激，并通过IFN-γ/IL-4ELISpot、流式细胞术分析CD4+和CD8+T细胞的细胞因子产生以及检测所刺激的脾细胞上清液中的细胞因子的多重免疫测定，来测量S特异性细胞应答。这些测定表明，1μg和10μg PTX-B都诱导稳健的S-特异性细胞免疫应答，其是Th1-偏倚性的，如CD4+T-细胞中Th1细胞因子(IFN-γ/TNF-α/IL-2)产生相对于Th2细胞因子(IL-4/IL-5)来说主占所表明的。值得注意的是，PTX-B诱导了显著量的S特异性CD8+T细胞。与体液应答，特别是nAb应答相反，由1μg和10μgPTX-B引起的细胞应答通常是相当的。通过流式细胞术的细胞因子谱分析显示，在经PTX-B免疫的小鼠中检测到有显著比例的产生IL-2和IFN-γ的CD4+(图6A)和CD8+(图6B)细胞，特别是产生IFN-γ的CD8+细胞。相反，与对照小鼠相比，免疫小鼠中产生IL-4和IL-5的细胞没有显著差异。在第1天和第22天给小鼠进行PTX-B的初免和加强疫苗接种。在第43天处死小鼠，在SARS-CoV-2肽库存在的情况下刺激脾细胞过夜。过夜刺激后，用抗CD3、抗CD4和抗CD8抗体对细胞进行表面染色。然后将细胞进行固定，透化并针对IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-5染色。使用流式细胞术评估细胞。图6A和图6B显示，产生TNF-α的细胞略高于对照小鼠，但不是以剂量依赖方式持续地高。这些结果证明，用PTX-B进行疫苗接种诱导了S蛋白特异性Th1应答。
确定了用1μg或10μg PTX-B进行免疫导致类似的T细胞应答，两者都大大高于阴性对照组中的背景。对于基于抗体的测定(抗体水平和中和能力)，10μg剂量表现优于1μg剂量。
实施例3.小鼠AAV6-hACE2攻击模型
在AAV6-hACE2(SARS-CoV-2的受体)转染的C57BL/6小鼠中进行非GLP攻击研究，以研究PTX-B的保护效力。在第1天和第22天，如下用PTX-B接种四组雌性C57BL/6小鼠(12只小鼠/组)：
第1组：制剂缓冲液(阴性对照)
第2组：20μg PTX-B
第3组：4μg PTX-B
第4组：1μg PTX-B
在第29天，用每只小鼠1×1011个载体基因组拷贝的AAV-hACE2转导动物，然后在第38天用每只小鼠2.5×104TCID50的SARS-CoV-2鼻内攻击。研究在第42天终止。本研究中评估的参数包括肺匀浆的感染性、肺中病毒RNA水平和肺组织病理学。将小鼠安乐死，取一个肺用于组织学，并将第二个肺分成两半，分别在培养基中匀浆用于感染性试验和在RNA提取缓冲液中匀浆用于病毒载量测定。
实验的活体阶段显示，在小鼠中没有明显的不良反应。在攻击时(第38天)测量体重，然后在即将处死前(第42天)再次测量体重。在1μg PTX-B疫苗接种组中观察到统计学上显著的体重减轻(20.39vs 18.54，9.07％p＝0.0016)(图7)。C57BL/6小鼠用PTX-B初免-加强免疫，并用AAV6-hACE2转导。在攻击时(第38天)和即将处死前(第42天)测量体重。通过双向ANOVA和多重比较进行分析。在图7中，**p＜0.01。在20μg或4μg组中，或在制剂对照组中，没有观察到显著的重量损失。
如图8所示，PTX-B在所有三个测试剂量水平下都提供了保护效力。在用20μg或4μg疫苗免疫的小鼠中没有发现感染性病毒(TCID50＝0)，用1μg免疫的12只小鼠中有10只也没有感染性病毒(平均TCID50＝1.25±2.93)，而制剂缓冲液阴性对照组中的12只小鼠有11只具有容易检测到的感染性SARS-CoV-2。在图8中，TCID50表示组织培养物50％感染剂量。如所示，PTX-B中和了SARS-CoV-2。在AAV6-hACE2转导的C57BL/6小鼠中测量了TCID50，所述小鼠用3个不同剂量的PTX-B或制剂缓冲液阴性对照进行初免-加强免疫。小鼠在加强免疫后7天用AAV6-hACE2进行转导，并在9天后进行攻击。所有小鼠在用SARS-CoV-2攻击后4天处死，并从肺匀浆物中测量病毒(每组n＝12)(****p＜0.0001)。
另外，通过PCR对肺中病毒RNA的检测显示出剂量响应性降低，高剂量和阴性对照组的平均值之间的差异超过100倍。在感染的小鼠中对一个肺的切片进行肺组织病理学分级。所有小鼠都表现出显著的组织病理学。不清楚有多少病理是由于SARS-CoV-2引起的，有多少是由于用于表达hACE2的AAV6病毒引起的；然而，显现出用两种较高剂量水平PTX-B处理的小鼠组中组织病理学评分较低的趋势(图9)。总之，小鼠用所示量的PTX-B免疫，用AAV6-hACE2转导，并在9天后用SARS-CoV-2攻击。攻击后4天，对小鼠进行免疫，将左肺固定在福尔马林中，处理以进行组织学，并由对处理条件不知情的合格病理学家在显微镜下检查。以1-5的组织学评分(最低分表示正常)，对每个样品进行评分。随着疫苗剂量的增加，观察到病理评分降低的趋势。
总之，使用AAV6-hACE2转导小鼠模型，PTX-B(1、4和20μg)的施用赋予了抗SARS-CoV-2感染的保护作用并且对肺病理具有正面作用，这表明PTX-B具有保护或预防损伤的特征。安乐死时，肺中的SARS-CoV-2mRNA总量也有所减少。在低剂量(1μg)疫苗接种组中观察到攻击后体重减轻。
实施例4.仓鼠攻击模型
在6-8周龄的雄性Syrian Golden仓鼠中进行攻击研究，攻击用SARS-CoV-2进行，以确定疫苗是否保护其免于感染。
Syrian Golden仓鼠对SARS-CoV-2感染敏感，并已证明可用于评估候选疫苗。
第1组仓鼠接受20μg LNP配制的全长S蛋白mRNA(PTX-B)。
第2组仓鼠接受4μg LNP配制的全长S蛋白mRNA(PTX-B)。
第3组仓鼠接受1μg LNP配制的全长S蛋白mRNA(PTX-B)。
第4组仓鼠接受制剂缓冲液(PBS假/阴性疫苗对照组)。
在第0天，将所有仓鼠预先放血用于基线分析。在第1天，所有仓鼠接受第一次肌内注射(疫苗或对照，根据第1组-第4组)。在接受第一次疫苗剂量之前，允许动物适应7天。在第21天，所有仓鼠都进行活体出血。在第22天，所有仓鼠根据第1组-第4组接受第二次(加强)疫苗接种。在第29天，所有仓鼠鼻内接受AAV6-hACE2(参见例如实施例3)，以促进SARS-CoV-2感染。在第38天，所有仓鼠都通过鼻内感染用SARS-CoV-2感染。通过反滴定(back-titration)确定所有动物均接受7.5×10^5TCID50的总剂量。此后，每天监测动物的体重减轻和疾病或痛苦的体征。另外，通过每两天收集口腔拭子，来监测病毒散播(viralshedding)。在第42天对仓鼠实施安乐死，用于终点分析：(i)肺匀浆物的感染性；和(ii)肺中的病毒RNA水平；(iii)肺组织病理学。在研究期间监测动物在疫苗接种期期间的任何可观察到的临床体征。没有观察到明显的不良反应。全部实验设计示于表7中。
表7.实验概述
在感染后4天和8天(dpi)，随机选择每组中的四只动物并实施安乐死。收集组织，用于通过qRT-PCR测定病毒载量和测定感染性病毒滴度水平以及用于组织病理学。在实验终点(8dpi)，还从两组动物中收集血液以评价中和抗体的滴度。
疫苗接种组中的动物在实验过程中没有显示平均体重减轻。相反，假疫苗组中的仓鼠显示了中等的平均体重减轻，这种减轻开始于3dpi。总之，在实验终点平均体重减轻为11％。对于任一组均没有报道其它显著的疾病临床体征。
在4dpi和8dpi时对动物实施安乐死后，将一半肺置于福尔马林中以进行组织固定。组织随后经历H&E染色，并由对这些组不知情的病理学家进行评价。对照组(假疫苗接种)在两个时间点的病理学评分都显著高于疫苗接种组。这表明在未进行疫苗接种的组中的疾病更严重。
在实验过程中收集口腔拭子用于评价病毒散播。有趣的是，尽管在整个实验中在两组中都检测到病毒RNA，但经疫苗接种的动物中的实际感染病毒的水平显著较低(2-3个对数级减少，如图14中所示)。这表明在整个实验过程中疫苗接种组中的病毒散播较低，PTX-B可减少病毒散播，从而提供治疗益处。
对鼻甲(nasal turbinate)中病毒负荷的检测表明，在疫苗接种组中在4dpi的感染性病毒的量显著较低，而在8dpi时未检测到感染性病毒的水平。在肺中观察到类似的趋势，尽管一个显著的差异是在经疫苗接种动物的肺中在任一时间点都没有检测到感染性病毒。在两个时间点在疫苗接种组和未进行疫苗接种的组的肺中均检测到病毒RNA。
这些数据表明，在仓鼠感染模型中，疫苗接种PTX-B提供了对抗SARS-CoV2-2鼻内攻击的保护作用。
实施例5.小鼠中的免疫原性和局部耐受研究
这种2-剂量免疫原性和耐受性研究的目的是，获得与mRNA疫苗有关的基本安全性数据，以及在与其它临床前实验所用不同的小鼠品系中的免疫数据。在第1和22天，通过IM注射，以表8中列出的0、4或20μg剂量水平，向BALB/c小鼠的组施用PTX-B。通过改进的Draize评分，评价主要研究动物的临床体征、体重变化和皮肤观察结果。血液学组的动物在第24天(第二次剂量后两天)处死，抽取血液用于血液学，记录器官重量，评价总体病理学，并用显微镜检查肝、脾和注射部位组织。细胞因子组在第22天处死，以测定血清细胞因子浓度。主要研究动物在第43天(第二次剂量后三周)终止，并评估免疫原性终点、血液学、临床化学、肝功能测试、总体病理学和器官重量。
表8.小鼠中的免疫原性和局部耐受研究-研究设计
安全相关终点
在20μg PTX-B的第二次剂量后，在两个性别中观察到暂时的轻度体重减轻；然而，在研究结束时，各组之间的平均体重没有明显差异(数据未显示)。
在临床观察、肉眼检查和显微镜检查时，记录注射部位处的与测试物质相关的发现；所有发现都是可逆的。基于Draize评分，在4和20μg下在注射部位处观察到偶尔发现发红和/或肿胀，并且在第一次剂量后一到两天在少数雌性小鼠中观察到毛发直立，但是这些不被认为是显著的发现。在第二次剂量后两天结束后，在注射部位处的组织病理学发现包括在两种性别中在4和20μg下的最小至中度的混合细胞炎症；所述发现伴有水肿，并且在20μg下的一只雌性中还伴有矿化物质(mineralized material)。在雌性中观察到该发现的发生率和严重程度具有剂量相关性。炎症与牢固的异常硬度(firm abnormal consistency)和肿胀大致相关。此外，在两种剂量下在少数动物中观察到最小至轻微的出血，这与注射部位或皮下组织的暗病灶(dark focus)大致相关；没有明显的剂量相关性。在研究结束时，在注射部位未观察到肉眼可见的发现。
在第二次剂量(第22天)后6小时进行血清细胞因子分析，以监测细胞因子释放综合征，它是LNP配制的mRNA的已知的潜在副作用。使用有效的免疫测定方法分析IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10、MCP-1和TNF-α。在两种剂量水平下，在两种性别中均观察到IL-6血清浓度的PTX-B相关性增加(在雄性和雌性中分别达到对照的53倍和266倍)和MCP-1血清浓度的PTX-B相关性增加(在雄性和雌性中分别达到对照的20倍和15倍)。总体来说，应答的大小是剂量相关的。对于MCP-1，应答没有明显的性别相关性差异。对于IL-6，雌性中的增加大于雄性。在两个性别的某些动物中观察到IFN-γ血清浓度的轻微增加(至多2.5倍)。IL-1β、IL-10和TNF-α没有明显的PTX-B相关性变化。观察到的细胞因子变化模式与细胞因子释放综合征不一致。
在研究期间每周测定体重。20μg组的雄性和雌性均观察到体重轻微下降。到研究结束时各组的体重均已恢复(数据未显示)。
在第二次疫苗接种后两天(第24天)和三周(第43天)测定血液学参数。在第一时间点，两种性别中以剂量响应方式改变的唯一变化是白细胞(雄性在4和20μg时分别是对照的264％和420％，雌性在4和20μg时分别为对照的329％和514％)和网织红细胞(雄性在4和20μg时分别为对照的69％和41％，雌性在4和20μg时分别为对照的53％和27％)；没有观察到对红细胞参数的影响。在第43天，所有血液学参数都在正常范围内(白细胞：雄性在4和20μg时分别为对照的77％和77％，雌性在4和20μg时分别为对照的67％和75％。网织红细胞：雄性在4和20μg时分别为对照的107％和117％，雌性在4和20μg时分别为对照的122％和129％)。
在第二次剂量后两天(第24天)，注意到20μg下的雌性肝脏显示出极小的肝细胞胞质改变，表现为糖原样物质的积累。该变化与重量增加(绝对重量和相对于脑重的重量，24％至27％)和苍白失色相关。然而，在第43天，所有肝功能测试均在正常范围内，并且与对照组没有显著不同。
在第24天，在两种性别中在4和20μg时均观察到脾重增加(绝对重量和相对于脑重的重量，32％至49％)。这种增加是统计学上显著的，并且与雌性中的增大大致相关。没有确定微观相关性。
在研究结束时(第43天，第二次剂量后三周)，没有观察到PTX-B相关的总体发现。尽管20μg时绝对脾重保持增加(14％至18％)，但增加的幅度显著低于第二次剂量后两天的幅度，并且所有血液学参数均正常。
总之，在第1和22天以4和20μg的剂量水平通过IM注射向BALB/c小鼠施用的PTX-B得到了良好的耐受。第二次剂量后观察到的结果主要限制在IL-6和MCP-1血清浓度的增加、白细胞的剂量相关性增加和网织红细胞的减少、剂量相关性注射部位反应和脾重增加(没有显微相关性)。仅在20μg/剂量下注意到的其它发现，包括轻微的体重减轻和肝细胞胞质改变。所有发现均是完全或部分可逆的；到第43天，与测试物质相关的作用限于20μg/剂量下脾重的轻微增加。
免疫原性相关的终点
在研究结束时收集脾细胞，用于通过ELISpot进行分析(图10，来自经PTX-B免疫的小鼠的脾细胞的IFN-γ和IL-4ELISpot)。在存在SARS-CoV-2S蛋白肽库S158和S157(例如，可获自德国柏林的JPT Peptide Technologies公司)的情况下，在IFN-γ和IL-4多重ELISpot平板上，刺激从PTX-B小鼠收集的脾细胞。过夜刺激后对斑点进行计数。通过双向ANOVA进行统计学分析。如图10所示，在用S158肽库刺激的雄性和雌性小鼠中都观察到IFN-γ表达的显著增加。类似地，S157肽库诱导了雄性小鼠中IFN-γ表达的显著增加。用任一种肽库刺激时，IL-4表达没有显著增加。这种结果组合显示出向Th1偏斜的应答(Th1 skewed response)。
在SARS-CoV-2中和测定中，来自用制剂缓冲液处理的雌性和雄性小鼠的血清作为阴性对照，在任何测试稀释度下都没有提供对SARS-CoV-2临床分离物感染的保护作用(图11)。相反，来自用4μg PTX-B免疫的雌性和雄性小鼠的血清的平均ID50滴度分别为1353和480。来自用20μg PTX-B免疫的小鼠的血清提供了甚至更大的保护，平均ID50滴度为7645(雌性)和5118(雄性)，显示出剂量响应性效应(图11)。
为了证实来自用PTX-B处理的小鼠的血清的强中和作用，进行第二次独立的假病毒中和测定。来自阴性对照组的血清没有显示出中和能力(图12)。来自用4μg PTX-B处理的雌性和雄性小鼠的血清提供了保护活性，ID50值分别为4048和1863。来自用20μg PTX-B免疫的小鼠的血清显示平均ID50值为16390(雌性)和1414(雄性)。
用4和20μg PTX-B免疫，导致BALB/C小鼠中产生强的中和抗体应答(图13A-图13C)。对用PTX-B处理的小鼠的血清进行系列稀释，用抗-同种型HRP抗体测定抗-SARS-CoV-2刺突蛋白IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM和IgA。中值使用具有晶须的箱线图表示，晶须表示四分位距的Q1和Q3的Tukey分析，其中统计离群值用单独的点表示。结果是剂量响应性的，与前述实验中在C57BL/6小鼠中证明的结果一致。通过PTX-B初始-加强接种诱导的抗SARS-CoV-2抗刺突蛋白抗体谱图显示，这种配制的疫苗促进了针对SARS-CoV-2刺突蛋白的血清转化。在测试的两个剂量水平下均诱导了SARS-CoV-2刺突蛋白特异性IgG(图13A，左图)、IgG1(图13A，右图)、IgG2a(图13B，左图)、IgG2b(图13B，右图)、IgM(图13C，左图)和IgA(图13C，右图)。
实施例6.SARS-CoV-2N、M、N/M蛋白核酸疫苗的效力
通过将荧光T细胞(用CFSE标记)与用具有或不具有分泌信号的N、M或N/M杂合体的mRNA(如下表9所述)转染的活化树突细胞(DC)混合，进行共培养测定。具体地，在第1天从COVID-19康复期患者的外周血单核细胞(PBMC)中分离单核细胞。单核细胞衍生的树突细胞(MDDC)也从相同康复病人的PBMC中分化。MDDC在第4天用RNA疫苗转染，并将转染的MDDC与PBMC共培养，以诱导共培养物中T细胞的自体刺激。
表9.实施例6和图15中使用的核酸疫苗的描述
组 mRNA疫苗描述 SEQ ID NO
A tdTomato(阴性对照) 46
B N–编码N蛋白的序列 30
C M–编码M蛋白的序列 28
D NM–编码N和M蛋白的序列 29
E sNM–具有信号肽且编码N和M蛋白的序列 31
使用包含TNF-α、IL-1b、IL-6和PGE2因子的细胞因子混合物使共培养中的树突细胞成熟。在第5天，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞，以监测淋巴细胞增殖(参见，例如，Lyons AB,Parish CR(May 1994)."Determination of lymphocyte division byflow cytometry".Journal of Immunological Methods.171(1):131–7，通过引用并入本文)。
随后，在第11天，使用荧光抗体针对CD4或CD8将细胞染色以鉴定CD4+/CD8+T细胞，并测定抗体标记的细胞中CFSE标记的量以确定T细胞增殖。
被DC刺激的细胞由于多次细胞分裂而具有低水平的CSFE。建立阈值以鉴定低CFSE染色的细胞，即，已经经历1次或更多次分裂的细胞(例如，在已分裂1次的细胞中CFSE信号降低1/2；在已分裂超过1次的细胞中CFSE信号降低高于1/2)。通常，将已分裂1至7次的细胞鉴定为“低CFSE”细胞。因此，[mRNA转染细胞中的低CFSE染色]与[对照细胞中的低CFSE染色]的比率提供了T细胞刺激指数(SI)。SI值增加表明mRNA疫苗刺激T细胞应答的程度。
T细胞的刺激，即刺激指数(SI)计算如下：SI＝[用mRNA转染的DC刺激的T细胞的增殖(％CFSE-lo)]除以[用DC对照(培养基中的DC)刺激的T细胞的增殖(％CFSE-lo)]。SI值大于2被认为是生物学上显著的增殖。数据示于图15。
实施例7.使用针对VOC的PTX-B的假病毒中和测定
使用假病毒中和测定(参见，例如，实施例2)测试各种患者血清的中和能力，所述假病毒中和测定使用了针对野生型SARS-CoV-2关切变种(VOC)和表10中所述的其它变种的S蛋白假型化的假病毒。
表10.实施例7和图16-18中假病毒编码的S蛋白的描述
组 假病毒ID 所编码的S蛋白的描述
A WT WT S蛋白(SEQ ID NO:1)
B D614G 具有D614G突变的WT S蛋白
C UK变种 PANGO谱系B.1.17S蛋白
D SA变种 PANGO谱系B.1.351S蛋白
E D614G+L452R 具有D614G和L452R的WT S蛋白
F UK+L452R 具有L452R突变的PANGO谱系B.1.17S蛋白
G SA+L452R 具有L452R突变的PANGO谱系B.1.351S蛋白
H BR变种 PANGO谱系P.1S蛋白
测试的血清包括CBS13和CBS 5(来自COVID-19患者的加拿大血液服务中心(Canadian Blood Services)样品)、O132(来自双重mRNA接种的患者的血清)、含有NRCVHH72抗体的血清(靶向S蛋白RBD)。如图16所示，各种测试血清的中和能力针对编码不同的SARS-CoV-2变种S蛋白的假病毒而降低。通常，与WT和D614G变体相比，针对编码UK和南非S蛋白变种的变体的中和能力下降。南非变种S蛋白和包括L452R突变的南非变种S蛋白一致地显示最低水平的中和作用。
接下来，测试来自用1μg或10μg PTX-B或10μg编码TdTomota的对照mRNA疫苗接种的小鼠的血清对VOC假病毒的对抗作用，并测量ID50。如图17所示，来自接种对照mRNA疫苗(TdTomato)的小鼠的血清没有显示出对感染的保护作用。来自接种1μg PTX-B的小鼠的血清显示出对感染的保护作用，对于10μg剂量观察到保护效力的剂量依赖性增加。通常，图17中2至3之间的ID50值可能产生抗感染的保护，大于3的ID值被认为是保护性的。可以看出，针对WT(A)、UK(C)、UK+L452R(F)和D614G+L452R(E)假病毒S蛋白变体的保护水平最高，对于BR(H)、SA(D)和SA+L452R(G)假病毒S蛋白变体观察到保护效力降低。在图17中，连接点的线表示来自相同小鼠的血清。图18显示了每种变体(表10中提供的C、F、E、H、D和G)针对WTSARS-CoV-2假型化假病毒(表10中的A)的保护效力的比较，并证实了图17中显示的趋势。
实施例8.人体中的安全性、耐受性和免疫原性
研究概述
进行Ia/Ib期的人体首次的、观察者不知情的、随机化的、安慰剂作对照的递增剂量研究，以评价PTX-B疫苗在年龄为18-64岁和≥65岁的健康的血清阴性成人中的安全性、耐受性和免疫原性。
研究的目的是评估2个剂量的PTX-B疫苗在18-64岁和≥65岁的健康的血清阴性成人中的安全性和耐受性，以及评估2个剂量的PTX-B疫苗在18-64岁和≥65岁的健康的血清阴性成人中的免疫原性。
评价的安全性和耐受性终点是：使用符合方案(PP)和安全性的群体在每次疫苗接种后的随访期间多个事件的发生，包括：在每次疫苗接种后的随访期间的生命体征和施用部位反应(例如，手臂检查评估，包括疼痛、触痛、红斑/发红、硬结/肿胀)；以及在每次疫苗接种后到第三天每天设定记录的不良事件(solicited adverse event)(AE；例如，发热、寒战、恶心/呕吐、腹泻、头痛、疲劳、肌痛)。
使用改良的意向治疗(mITT)和安全群体，分析总体安全性。如果与PP群体的差异是每个治疗组的≤5％受试者，则不执行使用mITT群体的分析。分析第1天至第56天的未设定记录的的不良事件(unsolicited adverse event)，以及医疗相关AE(medicallyattended AE)(第1天至第56天)、新发慢性疾病(NOCD)、严重不良事件[SAE]、特别感兴趣的不良事件[AESI]和潜在免疫介导的医学状况(PIMMC)在第1天至第395天(最后一次疫苗接种后约1年)分析。还记录了来自针对性身体检查、生命体征评估和临床安全性实验室测试的结果。
所评估的免疫应答终点包括：使用mITT和安全性群体两者的免疫原性分析。如果与PP群体的差异是每个治疗组的≤5％受试者，则不执行使用mITT群体的分析。分析抗体(免疫球蛋白(Ig)M、IgG、IgA[酶联免疫吸附测定]；和中和作用)，并使用血液/外周血单核细胞(PBMC[流式细胞术，酶联免疫斑点测定])分析细胞介导的免疫。
本研究是用年龄-递增和剂量-递增设计的，并且在没有证据显示近期暴露于严重急性呼吸道综合征(SARS)-CoV-2或不被鉴定为流感或呼吸道合胞病毒(RSV)(发热性或下呼吸道感染)的病毒性呼吸道疾病的血清阴性成人受试者中进行。
本研究分如下2期进行：
1a期(～60名受试者)受试者间隔4周接受2个剂量的PTX-B肌内(IM)疫苗或安慰剂。
第1组包括20名18-64岁的健康受试者，施用16μg PTX-B IM疫苗或安慰剂；5名前哨受试者(sentinel subject)(4名PTX-B:1名安慰剂)，然后是剩余的11名PTX-B:4名安慰剂(组扩充)受试者。
第2组包括20名18-64岁的健康受试者，施用40μg PTX-B IM疫苗或安慰剂；5名前哨受试者(4名PTX-B:1名安慰剂)，然后是剩余的11名PTX-B:4名安慰剂(组扩充)受试者。
第3组包括20名18-64岁的健康受试者，施用100μg PTX-B IM疫苗或安慰剂；5名前哨受试者(4名PTX-B:1名安慰剂)，然后是剩余的11名PTX-B:4名安慰剂(组扩充)受试者。
对前哨组的评估包括在疫苗接种后到第三天的安全性随访评估(包括设定记录的和未设定记录的AE和安全性实验室评估)。
1b期(～60名受试者)受试者间隔4周接受2个剂量的PTX-B疫苗(15名接受安慰剂和45名积极治疗)。
第4组包括20名≥65岁的健康受试者；15名受试者施用PTX-B IM疫苗，其中1个剂量水平是基于先前1a期的结果确定的，5名受试者施用安慰剂。
第5组包括20名≥65岁的健康受试者；15名受试者施用PTX-B IM疫苗，其中1个剂量水平是基于先前1a期的结果确定的，5名受试者施用安慰剂。
第6组包括20名≥65岁的健康受试者，施用PTX-B IM疫苗，其中1个剂量水平是基于先前1a期的结果确定的，5名受试者施用安慰剂。
在登记下一个组之前，每个组之间经过了约14天用于独立的安全性检查。
受试者拜访了临床地点进行筛选(第-21至-1天)，并在第1、8、28±2、36、56±2、90±3、180±5和395-14天拜访临床地点。在第2和29天对受试者进行安全性电话访问。筛选程序包括知情同意、入选标准评估、人口统计、身高、体重、体重指数、医疗和手术史、安全性评估(包括SAE评估、记录先前用药和程序、身体检查、生命体征评估、临床血液和尿样品、鼻咽[NP]拭子(诊所具有通过另外的床边检测确认合格性的选项))以及血液样品用于免疫原性分析(抗体)。在第1天，进行随机化(总共15:5个研究疫苗:安慰剂疫苗，用于1a期和1b期组)。在第1天和第28天，确认合格性并进行安全性评价、免疫原性和细胞介导免疫的血样采集、书面日志训练和分配、以及疫苗或安慰剂施用。直至研究访问结束期间进行安全性评价，用于安全性评价的血液和尿样品，以及用于免疫原性分析和细胞介导免疫的血液样品。在第1天至第56天进行设定记录的AE的评价。在第1天至第56天期间，当受试者在家时进行医疗相关的AE评价。从第1天至研究结束，进行NOCD、AESI(包括增强性疾病的COVID 19病例)和PIMMC的评价。在整个研究中评估SAE。
疫苗和安慰剂由知情的现场药剂师制备，并由知情的CPU人员在临床研究站点通过IM注射在非优势侧的上臂三角肌。在施用疫苗后约1小时观察受试者的即刻AE和/或反应原性。向受试者提供日记卡，并训练其具体记录在每次疫苗接种后的随访期间每天引发的全身和局部症状以及任何其他AE。要求受试者拍摄完成的日记卡的照片并将该照片以短信/电子邮件发送到研究站点以确保密切监督反应。
对每个受试者，受试者的持续监测的持续时间为约14个月。
研究的纳入标准
要求受试者满足所有纳入标准(下文编号1-8)以符合参与研究的资格。此外，寻求种族和少数民族以获得多样化的研究群体。
1.受试者已经阅读、理解和签署了知情同意书。
2.筛选时，健康成年男性和女性为18至64岁(1a期)，或≥65岁(1b期)，包括端值。
3.筛选时为SARS-CoV-2血清阴性和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)阴性，没有证据表明近期接触或不被鉴定为流感或RSV(发热性或下呼吸道感染)的病毒性呼吸道疾病。
4.筛选时体重指数≥18且≤30kg/m2。
5.在参与研究之前必须整体健康良好，而没有可能干扰研究评估的临床相关异常。老年(≥65岁)参与者可具有稳定的共病(在过去3个月内用药或严重度没有变化)。
6.在研究期间，育龄期女性(WOCBP)和性伴侣为WOCBP的男性必须能够并愿意使用至少1种高效的避孕方法(即，包括子宫切除术、双侧输卵管切除术和双侧卵巢切除术、口服激素[与具有杀精子剂的男性避孕套组合]、经皮、植入或注射、屏障[即，避孕套、具有杀精子剂的隔膜]；子宫内设备；输精管切除的伴侣[最少6个月]、临床不育伴侣；或禁欲)。女性受试者在初潮后直到她处于连续12个月的绝经后状态(没有其它医学原因)或其它永久不育状态才被认为是WOCBP。在研究期间，不具有生育能力的受试者不需要使用任何其它形式的避孕。不具有生育能力定义为受试者被证实：手术绝育(例如，双侧卵巢切除术、双侧输卵管切除术、通过烧灼术的双侧闭塞[不接受Essure]、子宫切除术或输卵管结扎)、绝经后(定义为在筛查之前至少连续12个月的月经永久停止)；如果绝经后状态不清楚，则在疫苗接种之前进行妊娠测试。
7.具有生育能力的女性在每次疫苗接种之前必须进行阴性妊娠测试。如果绝经状态不清楚，则需要进行妊娠测试。
8.必须能够在研究期间参加所有访问(定期和不定期，如果适用)并遵守所有研究程序，包括在每次注射后每日完成日记卡。
研究排除标准
包括≥65岁受试者(1b期)的受试者如果满足任何排除标准(下文编号1-35)则不符合参与研究的条件，或者如果他们在研究期间形成任何排除标准则根据研究者的判断停止。
1.急性或慢性医学病症的历史，包括痴呆，在研究者看来，这将使疫苗接种不安全或将干扰对应答的评价。
2.将排除将受试者置于由SARS-CoV-2引起的严重疾病的较高风险中的任何医学病症的历史，包括：慢性肾病；COPD(慢性阻塞性肺病)；心脏病，例如心力衰竭、冠状动脉疾病或心肌病；任何免疫受损状态，包括来自移植、历史性免疫缺陷、HIV、免疫抑制药物摄入的免疫受损状态；镰状细胞病；当前吸烟者或吸烟史为>5包/年的吸烟者；2型糖尿病。
排除了COVID-19并发症的风险增加的具有任何下列病症史的受试者：哮喘(中度至重度)；脑血管疾病(影响血管和脑的血液供应)；囊性纤维化；高血压或血压高；神经系统疾病，例如痴呆；肝病；肺纤维化(具有受损或瘢痕的肺组织)；地中海贫血(一种血液疾病)；1型糖尿病。
3.可能不利地影响免疫系统的正在进行的临床病症或用药或治疗史。
4.对SARS-CoV-2血清阳性或RT-PCR阳性的个体，包括在第二次剂量的PTX-B疫苗之前。
5.暴露于SARS-CoV-2的风险增加的个体(例如，医护人员、紧急事件响应者)。
6.在疫苗施用前30天内，与已知患有SARS-CoV-2感染的任何人密切接触。
7.在小组环境中或小组护理机构(例如宿舍、辅助生活或疗养院)中生活。
8.在筛选时由研究者评估为年龄/性别在临床上显著的，具有任何升高的(1级或更高)实验室测试的个体。
9.在筛选时具有任何升高的年龄/性别(1级或更高)肝功能酶的个体，而不考虑临床显著性的评价(允许一次再测试)。排除肝酶升高的受试者的标准如下：碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶或γ-谷氨酰转移酶＞1.5×正常上限(ULN)；总胆红素＞1.5×ULN。
10.活性瘤性疾病(不包括成功治疗的非黑素瘤皮肤癌)或任何血液恶性肿瘤病史。“活性”定义为在过去5年内接受过治疗。
11.在筛选前6个月内长期(＞2周)使用口服或胃肠外类固醇或高剂量吸入类固醇(＞800μg/天的二丙酸倍氯米松或等同物)(允许使用经鼻和局部类固醇)。
12.自身免疫、炎性疾病或PIMMC的病史(附录B)。
13.目前怀孕、哺乳或计划在入选和随机化后181天之间怀孕的女性。
14.Guillain-Barré综合征或任何神经退行性疾病的病史。
15.对任何注射疫苗的过敏型反应的病史。
16.已知或怀疑对疫苗的1种或多种组分过敏。
17.在12个月的筛选内有酒精滥用、违法用药、对任何阿片样物质的身体依赖性的历史或任何药物滥用或成瘾史。
18.在研究招募前3天内的急性疾病或发热(温度＞37.5℃)(如果研究者接受，则招募可延迟至完全恢复)。
19.当前参与或计划参与涉及实验药剂(疫苗、药物、生物制品、装置或用药)的研究的个体；或在入选本研究前1个月内(对于免疫球蛋白为3个月)接受实验药剂的个体；或在参与本研究期间预期接受另一实验药剂的个体。
20.在入选本研究之前3个月内接受免疫球蛋白或另一种血液制品或在本研究期间预期接受免疫球蛋白或另一种血液制品的人。
21.打算在第一次疫苗接种后6个月内献血的个体。
22.使用处方药预防SARS-CoV-2的个体。
23.计划在研究的前3个月内接受除了流感疫苗(所述流感疫苗不应在本疫苗的2周内给予)以外的另一种疫苗的个体。
24.在研究之前或研究期间的任何时间，接受任何其他SARS-CoV-2或其他实验性冠状病毒(中东呼吸综合征，SARS等)疫苗。
25.在入选1个月内至研究结束时(最后一次疫苗接种后1年)接受任何研究用疫苗或研究用药物。
26.计划从入选到第56天在加拿大以外的地方旅行。
27.在筛选的12周内有手术或大创伤的历史，或在研究期间计划手术。
28.在参与研究前6周内显著失血(＞400mL)或捐献1个或更多个单位的血液或血浆。
29.在安全性实验室样品收集前72小时内有剧烈活动或显著的酒精摄入(由研究者评估)。
30.药物滥用尿液筛查或酒精呼气测试器检测结果呈阳性。
31.人免疫缺陷病毒-1和-2抗体、乙型肝炎表面抗原或丙型肝炎病毒抗体筛选呈阳性。
32.涉及本研究的计划或实施。
33.不愿意或不可能遵守研究要求。
34.受试者是雇员，承包商，或赞助商、CRO、研究站点、或站点附属机构的任何雇员的朋友或亲属。
35.受试者的血氧含量＜90％。
研究组合物
疫苗产品以0.2mg/mL、体积2mL装入3mL的美国药典/欧洲药典I型硼硅酸盐玻璃小瓶中，该小瓶具有氟树脂层压的溴丁基橡胶塞以及使用红色塑料翻盖的铝盖。PTX-B信使核糖核酸体液疫苗是可注射的IM 0.2mg/mL 0.5mL溶液，具有所述的多个剂量水平。
安慰剂是市售的0.9％氯化钠IM注射液0.0mg/mL 0.5mL。
研究结果总结
该1期人体首次、观察者不知情的、随机化的、安慰剂对照的、递增剂量研究评价了PTX-B疫苗在年龄为18至64岁的血清阴性健康成人中的安全性、耐受性和免疫原性。这项研究是根据剂量递增设计的，在没有证据表明最近暴露于SARS-CoV-2的血清阴性成年受试者中进行。
安全性群体包括提供同意的所有受试者，进行随机化，并且接受任何量的疫苗/安慰剂。将安全性群体用于所有安全性分析和免疫原性分析，并作为实际接受治疗而进行分析。
符合方案的群体包括安全性群体中根据方案接受指定剂量的疫苗/安慰剂的所有受试者，其具有血清学结果，并且没有影响主要免疫原性结果的主要方案偏差，这由主办者在数据库锁定和解除不知情之前确定。PP群体是用于分析安全性终点的主要群体。
改良的意图治疗群体(Modified Intent-to-Treat Population)包括安全性群体中提供任何血清学数据的所有受试者。mITT群体用于分析免疫原性终点。如果与PP群体的差异为每个治疗组≤5％的受试者，则进行使用mITT群体的分析。
列出了每个组和每个研究阶段的免疫原性数据，并使用适当的描述统计学根据阶段、组和时间点进行总结。
列出了生命体征、临床实验室测试和身体检查结果，并使用适当的描述统计学根据研究阶段、组和时间点进行总结。
对报告有任何治疗突发不良事件(TEAE)或反应原性的受试者的数目和百分比根据研究阶段和组进行总结，并通过系统器官分类和优选项(使用MedDRA编码)进行列表。TEAE进一步根据严重程序和关系进行分类为SAE、医疗相关AE、NOCD和AESI。
另外，还显示了在疫苗接种后感染的受试者的数量以及接种疫苗是否使疾病更不严重或更严重。
受试者以3:1的比例随机接受PTX-B疫苗或安慰剂。组中给药从16μg开始，剂量接着是40μg，然后是100μg。每组首先开始5个患者的前哨组给药，然后是组的其余部分。以频繁的间隔收集不良事件，并且由感染性疾病专家和统计学家组成的独立安全性评审委员会(iSRC)以频繁的间隔会面以评审和批准下一组的给药。
总共招募了60名受试者，58名受试者接受两次剂量的研究用药。两个受试者在接受一次剂量的研究用药治疗后由于与研究药物无关的个人原因而退出研究。总的来说，男性与女性的比例精确地为50:50，其中83.3％是白种人，13.3％是亚洲人，3.3％是其它人种。
根据工业标准FDA关于疫苗反应的指导，将收集的不良事件分级为局部(在注射部位)或全身性。总体上PTX-B是安全的，并且在16μg、40μg和100μg的所有三种剂量水平下都具有良好的耐受性。没有严重的不良事件。所记录的唯一局部不良事件是注射部位的疼痛，这是有预期的。在每剂40μgPTX-B后都没有发红或肿胀。这与其它mRNA疫苗相比是有利的，而其它mRNA疫苗的发红和肿胀已经在临床试验以及一般使用中有记录。全身反应包括疲劳、寒战和发热，并且通常是轻度至中度的，并且耐受性良好，头痛是第二剂后发生的最常见反应，发生率高达60％。这些结果与已批准的紧急应用mRNA疫苗的已公布不良事件相比非常有利。
PTX-B疫苗接种诱导高的抗-S IgG抗体：临床试验的参与者在第零天和第28天接种疫苗。在第零天(预筛选)、第8天、第28天(第2次剂量前)和第42天收集血浆样品，以根据Meso Scale Discovery(MSD)平台的电化学发光(ECL)读数，使用多重夹心免疫实验测定抗-S蛋白IgG的水平。所有三个疫苗剂量组(16、40和100μg)中的所有研究参与者都产生了针对刺突蛋白的强IgG抗体应答，该应答在第28天检测到并在第42天加强。在注射安慰剂的参与者中未检测到抗S蛋白的抗体。而且，在中等和高剂量中发现了最高水平的抗体。到第42天，PTX-B接种的参与者的抗体水平比在相同测定中评估的康复期受试者血浆的抗体水平高一个对数级以上。分析受试者的总IgG水平。在恰好第一剂量后(第28天)所有剂量水平均诱导高水平的抗刺突蛋白(图19中所示)和抗RBD(图19)。所述水平在第二剂量后两周(第42天)甚至升高到比来自康复期患者的5份血清样品的平均值高10倍以上的水平(图19)。还在SARS-CoV-2康复患者中测量抗刺突蛋白IgG(Au/mL)(图20)。
抗体水平与Stanford大学最近报道中发表的相当，该报道评价了接种COVID-19mRNA疫苗的个体与SARS-CoV-2感染患者的IgG应答的比较(等(2021年4月7日).mRNA Vaccination Compared to Infection Elicits an IgG-Predominant Responsewith Greater SARS-CoV-2Specificity and Similar Decrease in Variant SpikeRecognition.2021年5月11日再版下载于doi.org/10.1101/2021.04.05.21254952)。
用ELISA进一步证实了在所有三个不同剂量诱导的高水平的抗-S蛋白IgG抗体。将来自经疫苗接种的受试者的血清样品添加到刺突蛋白包被的ELISA板中，然后使用过氧化物酶标记的抗IgG二抗检测结合的IgG抗体。在单一剂量的PTX-B后(第28天)，通过校准曲线上插值法确定的IgG抗体浓度高达约1000ELISA单位/毫升(图23)。第二剂量后IgG浓度继续增加，超过10,000ELISA单位/毫升(图23)。
PTX-B疫苗接种诱导了高水平中和抗体：通过S-ACE2阻断MSD测定评价了研究参与者血浆的中和活性。这里，抗体阻断S蛋白与ACE2受体之间的相互作用，并且ECL信号的降低用于计算相同稀释度下的血浆抑制百分比。研究中来自3种剂量水平的所有参与者均在第28天显示阻断活性，并且所有参与者在第42天达到100％阻断活性，使用的样品稀释度为1:100或更大。这些结果表明PTX-B诱导了强的中和抗体应答。此外，用参考标准品定量的抗体水平(ng/mL)显示，所有参与者在第一次免疫后在第28天产生中和抗体，并在第二次免疫后两周即第42天增加十倍。通过评估在体外阻断刺突蛋白和hACE2之间的相互作用的能力，在受试者中分析中和抗体。使用基于MSD技术的S:ACE2受体阻断测定，PTX-B疫苗接种参与者在第28天和第42天在血浆中显示高水平的中和活性(图21)。当在稀释等于或大于100倍的样品中评价抑制百分比时，所有参与者到第42天都具有100％抑制。由et al发表的其中的个体用BioNTech/Pfizer mRNA疫苗接种的数据表明，使用相同的MSD测定在第42天(1:100稀释)显示75％的平均抑制。这些数据表明PTX-B在所有剂量下均具有更强的中和能力。
中和活性通过S-ACE2阻断MSD测定来评价。以ng/mL为单位定量的抗体水平是基于参考标准品的活性。所有参与者在第一次免疫后在第28天产生中和抗体，并在第二次免疫后两周即第42天增加十倍(图22)。
实施例9.PTX-B诱导的抗COVID19抗体在人体中的假病毒中和作用
进一步通过假病毒中和测定来评价中和活性。按照Bewley K.R.报道的方案(Bewley等,Quantification of SARS-CoV-2neutralizing antibody by wild-typeplaque reduction neutralization,microneutralization and pseudotyped virusneutralization assays；Nature Protocols,2021,16,3114-3140)，在ES-293细胞中产生刺突蛋白假型化ΔG-萤光素酶rVSV病毒。对假病毒的储备物进行观测程序，以获得最佳的假病毒稀释液。
将经PTX-B疫苗接种的受试者的血清样品热处理至无活性成分。连续稀释灭活的血清样品和参考血清。将预稀释的测试血清和参考血清与假病毒稀释液以1:1的比例在37℃下孵育1小时。然后将血清和假病毒混合物转移至铺板的Vero E6细胞，并在37℃和5％CO2下再孵育18-22小时。
向细胞平板中添加ONE-GLO EX萤光素酶测定试剂。将反应平板在室温下孵育3分钟，读取萤光素酶水平。使用SoftMax Pro方案，使用4PL回归测定每条曲线的中点，并将输出值报告为每个样品的中值中和滴度(NT50)。PTX-B疫苗在第一剂量后(第28天)产生的中和滴度可与从康复期患者获得的中和滴度相当。在第二剂量的PTX-B后两周(第42天)，中和滴度进一步增加，高于从康复期患者获得的中和滴度(图24)。
在第一次剂量后(第28天；在接受第二剂量前)，中位中和水平可分别达到康复患者中水平的0.3倍(16μg剂量和40μg剂量)和0.8倍(100μg剂量)。第二次剂量后两周(第42天)，中位中和水平分别增加至康复患者中水平的4.0倍(16μg剂量)、8.5倍(40μg剂量)和23.0倍(100μg剂量)。100μg剂量比较低剂量诱导更高的结合和中和抗体滴度。
将PTX-B疫苗诱导的中和抗体的中和活性与COVID19 mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273进行比较。如表11和12所示，PTX-B疫苗诱导的中和抗体的平均中和水平与BNT162b2相当。
表11.PTX-B的平均中和水平(康复患者(n＝33)的倍数)
表12.BNT162b2*的平均中和水平(康复患者的倍数)
天 10μg 20μg 30μg
21 0.2 0.2 0.1
28 1.7 3.9 3.8
35 1.0 3.1 1.7
*数据来自Walsh,E.E.等,Safety and immunogenicity of two RNA basedCOVID-19vaccine candidates,N Engl.J.Med.,2020,383(25):2439-2450。
类似地，与Anderson E.J.,等,Safety and immunogenicity of SARS-CoV-2mRNA1273vaccine in older adults.N Engl.J.Med.,2020,383:2427-2438报道的数据相比，PTX-B疫苗诱导的中和抗体的中和活性与mRNA-1273疫苗诱导的中和抗体的中和活性相当。
使用Khoury，D.S.等人(Khoury,D.S.,et al,Neutralizing antibody levelsare highly predictive of immune protection from symptomatic SARS-CoV-2infection.Nat.Med.,2021,27:1205-1211)开发的模型进行的PTX-B疫苗保护效力预测表明，PTX-B与核酸疫苗BNT162b2和mRNA-1273相当(图25)。PTX-B疫苗的中和活性高于BNT162b2和mRNA-1273疫苗(图25)。结果表明，PTX-B在人体中可引发比BNT162b2和mRNA-1273疫苗更强的应答。
实施例10：针对不同SAR-CoV-2关切变种(VOC)的中和能力
测试来自接受2次剂量(第0天和第28天)的16μg、40μg或100μgPTX-B疫苗的受试者组的相同血清针对病毒变种的假病毒中和活性。制备SAR-CoV-2原始病毒及其变种、α、β和δVOC的假病毒，用于中和测定。图26所示的结果表明，PTX-B疫苗在所有三个剂量组中诱导了针对SAR-CoV-2原始毒株和α、β和δVOC的相当的中和活性(图26)。由高剂量PTX-B(100μg)诱导的中和活性整体高于由低剂量(16μg)和中剂量(40μg)PTX-B诱导的中和活性。针对原始毒株、α和δ变种的中和能力也与Ade K.T等(Ade K.T.等,Neutralizing antibodyresponses to SARS-CoV-2variants in vaccinated Ontario long-term care homeresidents and workers,August 8,2021；MedRxiv preprint doi:https://doi.org/10.1101/2021.08.06.2126172)报道的BNT162b2疫苗接种获得的中和能力相当。
等同方案和范围
本领域技术人员将认识到，或仅使用常规实验就能够确定本文描述的具体实施方案的许多等同方案。本发明的范围并不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书所阐述。
在权利要求中，除非相反指出或另外从上下文明显看出，否则冠词如“一个”、“一种”以及“所述/该(the)”可以意指一个或多于一个。除非相反指出或另外从上下文明显看出，否则如果一个、多于一个或所有组成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定的产品或方法，那么认为包括在组的一个或多个成员之间的“或”的权利要求或描述得到了满足。本公开包括其中该组中的精确一个成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定的产品或方法的实施方案。本公开包括其中多于一个或所有的组成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定的产品或方法的实施方案。
还应注意，术语“包含”旨在为开放的并且允许但并非要求包括另外的要素或步骤。当本文中使用术语“包含”时，因此还涵盖并且公开术语“由……组成”。
在给出范围时，端点被包括在内。此外，应理解，除非另外指出或另外从上下文和本领域普通技术人员的理解明显看出，否则表述为范围的值可假定为在不同实施方案中所述范围内的任何特定值或子范围，到所述范围的下限的单位的十分之一，除非在上下文中另有明确规定。
此外，应理解，落入现有技术内的任何具体实施方案可以从任何一个或多个权利要求中明确排除。因为认为此类实施方案为本领域普通技术人员所已知的，即使本文没有明确阐述排除，也可以排除它们。本文所述的组合物的任何具体实施方案(例如，任何治疗或活性成分；任何生产方法；任何使用方法；等)可出于任何原因(无论是否与现有技术的存在相关)而从任何一个或多个权利要求中排除。
应理解，已经使用的词语是描述性词语而不是限制性词语，并且可以在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下在其更广泛的方面在所附权利要求的范围内进行改变。
尽管已经相对于几个所描述的实施方案以一定的长度和一定的特殊性描述了本公开，但并不旨在将其限制于任何这样的细节或实施方案或任何特定的实施方案，而是通过参考所附权利要求对其进行解释，以便根据现有技术提供对这些权利要求的最广泛可能的解释，并因此有效地涵盖本公开的预期范围。
序列表
<110> 普罗维登斯治疗控股公司（PROVIDENCE THERAPEUTICS HOLDINGS INC.）
<120> 用于预防和/或治疗COVID-19的组合物和方法
<130> 2092.1004PCT
<140>
<141> 2021-10-08
<150>
<151> 2021-09-28
<150> CA 3,128,660
<151> 2021-08-19
<150> CA 3,128,078
<151> 2021-08-09
<150> CA 3,118,329
<151> 2021-05-12
<150> CA 3,116,932
<151> 2021-04-30
<150> CA 3,116,284
<151> 2021-04-23
<150> CA 3,113,094
<151> 2021-03-23
<150> CA 3,107,232
<151> 2021-01-26
<150> CA 3,096,009
<151> 2020-10-09
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1273
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
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Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
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Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
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Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
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Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
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565 570 575
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His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
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<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 2
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385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
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915 920 925
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Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
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1010 1015 1020
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1025 1030 1035
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1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
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1070 1075 1080
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Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
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1160 1165 1170
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Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 3
<211> 75
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 3
Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser
1 5 10 15
Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala
20 25 30
Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn
35 40 45
Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn
50 55 60
Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val
65 70 75
<210> 4
<211> 222
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 4
Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Thr Trp Ile
20 25 30
Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile
35 40 45
Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys
50 55 60
Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile
65 70 75 80
Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe
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<211> 419
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 5
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100 105 110
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165 170 175
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195 200 205
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Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
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385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 6
<211> 1273
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 6
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Gly Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Ile Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
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610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Val Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 7
<211> 3822
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列（Artificial Sequence）的描述: 合成多核苷酸（Syntheticpolynucleotide）"
<400> 7
auguuugugu uucugguccu ccugccccug gugucaagcc aaugcgucaa ccugacuaca 60
cggacccagc ugcccccugc uuauaccaac ucauuuacua gaggggugua cuacccagau 120
aaaguguuca gaucaagcgu gcuccacagc acccaggacc ucuuccugcc cuucuuuuca 180
aacgugaccu gguuccaugc cauccaugug agcggaacca acgggaccaa gcgguucgau 240
aauccagugc uccccuucaa cgauggggug uauuuugcaa gcacugaaaa gucaaauauu 300
auccgcggau ggauuuucgg gacaacacuc gauagcaaga cccagucacu gcucaucgug 360
aacaacgcua caaauguggu caucaaggug ugcgaguuuc aguucugcaa ugacccuuuu 420
cucggcgucu acuaccacaa gaacaacaag agcuggaugg aaucagaauu ccggguguau 480
agcucagcua auaauugcac cuucgaguau gugagccagc cuuuccucau ggaccuggag 540
gggaagcagg gcaacuucaa gaaucugaga gaauucgugu uuaaaaacau cgauggauau 600
uucaaaaucu auagcaagca cacuccuauc aaccucgucc gggaccugcc acaaggcuuu 660
agcgcacugg agccccucgu ggaccugccc aucgggauca auaucaccag auuucagacu 720
cugcuggcuc uccaccgcag cuaccugacu ccaggggaua gcucaagcgg cuggaccgcu 780
ggagccgcug ccuauuacgu gggguaccug cagccuagga cuuuucugcu gaaguacaau 840
gagaacggga caauuacuga cgcugucgau ugugcacucg acccccucag cgagacaaaa 900
uguacccuga aaagcuuuac uguggaaaaa gggauuuacc agacuagcaa uuucagaguc 960
cagccaacag agucaaucgu gcgguuuccu aacaucacaa accucugccc auucggggag 1020
gucuucaaug ccacccgcuu cgccagcgug uacgcuugga auagaaagcg gaucagcaac 1080
ugcguggccg acuacagcgu gcucuacaau agcgcuagcu ucucaacauu uaaaugcuac 1140
ggggugagcc ccacaaaacu gaaugaccug uguuucacca auguguaugc cgauagcuuc 1200
gugauuagag gcgacgaggu gcgccaaauc gcaccuggcc aaaccggaaa gauugcagau 1260
uauaacuaua agcugcccga ugauuuuacu ggcuguguca ucgcuuggaa cagcaacaac 1320
cucgauucaa aagucggagg aaacuauaac uaccuguaua gacuguucag aaagagcaac 1380
cugaagcccu uugaaaggga uaucagcaca gaaauuuacc aggccgggag caccccaugc 1440
aacggggucg aaggguuuaa cuguuauuuc ccccugcaga gcuacggguu ucaacccacc 1500
aauggggugg gguaucagcc uuaccgcgug gucgugcuga gcuucgaacu gcugcacgcc 1560
cccgccaccg ugugcggccc uaaaaagagc acaaaccucg ucaagaacaa gugcgugaac 1620
uucaauuuca acggccugac uggcacaggc guccucaccg aaagcaauaa aaaguuccuc 1680
ccuuuccagc aauucggcag agacauugca gacacaacug augcugugag ggacccccag 1740
acacuggaga uccuggauau uacccccugu ucauucggcg gagugucagu caucaccccu 1800
ggcacuaaca caucaaauca gguggcaguc cuguaucagg gcgugaacug caccgaagug 1860
ccugucgcca uucaugcaga ccagcugacc cccacuugga gaguguacuc aacuggcagc 1920
aaugucuuuc aaaccagagc cggcugucuc aucggcgcag aacaugucaa caacagcuau 1980
gagugugaca ucccaaucgg agcuggcauc ugugccagcu aucagacaca gaccaacagc 2040
ccucggaggg cuagaagcgu ggccagccag agcauuaucg cuuacaccau gucacugggc 2100
gccgagaaua gcguggccua uagcaacaau agcaucgcca uucccaccaa uuuuaccauc 2160
agcgugacca cagagauccu cccagugagc augaccaaga caagcgucga uugcacaaug 2220
uacauuugcg gcgacagcac ugaauguagc aaccuccugc ugcaguacgg gagcuuuugu 2280
acccaacuga aucgggcacu caccgggauc gccguggagc aggauaaaaa cacucaggag 2340
gucuuugcuc aggucaaaca gaucuacaaa accccaccaa uuaaagacuu cggaggcuuc 2400
aacuucucac agauucugcc agacccuuca aagccaagca agcgcagcuu cauugaagau 2460
cuccuguuca acaaggugac ucuggcugac gcuggguuca ucaagcagua uggagacugc 2520
cugggggaca ucgcagcaag ggaucugauc ugugcucaga aguuuaaugg ccucacagug 2580
cugcccccuc uccugacuga cgagaugauu gcucaguaca ccagcgcccu gcuggcugga 2640
acuaucacau caggguggac auucggggcc ggggcugcuc ugcagauucc uuucgcaaug 2700
caaauggcau auagguucaa cgggaucggc gucacacaga acgugcugua ugagaaucag 2760
aaacugaucg caaaucaauu uaauucagca aucgggaaaa uccaggacuc acugucauca 2820
accgcaucag cccugggcaa gcugcaggac gucgucaacc aaaacgccca ggcacucaac 2880
acacugguga agcagcuguc aagcaauuuc ggagcaauca gcagcguccu gaaugauauc 2940
cugagcaggc uggauaaggu ggaggcagaa gugcagaucg accgccugau caccggccgg 3000
cuccagagcc ugcaaaccua ugucacucag caacugauca gagcugcaga aauccgggca 3060
agcgccaauc uggccgccac caagauguca gaaugcgugc ucggccagag caagagggug 3120
gacuucugcg gcaaaggcua ccaccugaug agcuucccuc agagcgcccc ccacggcgug 3180
gucuuccucc augugacuua ugugcccgca caggaaaaga acuucacuac ugccccagcc 3240
aucugccacg acggaaaggc ucauuuccca cgcgaggggg uguucgucag caauggaacc 3300
cacugguucg ugacccagcg gaacuucuau gagccucaga uuauuaccac agacaacaca 3360
uuugugucag gaaauugcga ugucgugauc gggaucguca acaauacugu cuaugacccc 3420
cuccagccag aacucgauag cuucaaagag gaacucgaua aguauuuuaa aaaucacacc 3480
agcccugaug uggaucuggg cgauaucagc ggaaucaaug cuagcguggu gaacauccag 3540
aaggagauug acaggcucaa cgaagucgca aagaaccuga acgagucacu gaucgaccuc 3600
caggaacugg gcaaguacga acaguacauc aaguggcccu gguacaucug gcucggguuc 3660
aucgcuggcc ugauugcuau cgugauggug acaaucaugc ucugcuguau gaccagcugc 3720
ugcagcugcc ugaagggaug cugcucaugc ggcagcugcu guaaguucga ugaggacgac 3780
ucagagcccg ugcucaaagg cgugaaacug cauuauacuu ga 3822
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列（Artificial Sequence）的描述: 合成多核苷酸（Syntheticpolynucleotide）"
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aggaaactta agtcaacaca acatatacaa aacaaacgaa tctcaagcaa tcaagcattc 60
tacttctatt gcagcaattt aaatcatttc ttttaaagca aaagcaattt tctgaaaatt 120
ttcaccattt acgaacgata gccaccatgg ccgactcaaa cggcacaatt accgtggagg 180
agctgaagaa gctcctggag cagtggaatc tggtcattgg ctttctgttc ctgacctgga 240
tctgcctgct gcagttcgct tacgctaacc gcaaccggtt cctctatatc attaaactca 300
tttttctgtg gctgctctgg cctgtgacac tggcctgttt cgtgctcgcc gccgtctacc 360
gcattaactg gatcacagga gggattgcta tcgctatggc ttgcctggtc gggctgatgt 420
ggctctcata cttcatcgca agctttaggc tctttgcccg gactcggagc atgtggtcat 480
tcaaccccga gacaaacatt ctgctcaatg tgcctctgca cgggaccatc ctgaccaggc 540
ccctcctgga gagcgagctg gtgatcgggg ccgtgatcct gaggggacat ctgaggatcg 600
ccggccatca tctgggcagg tgtgacatca aggatctccc taaggagatc actgtggcaa 660
ctagccggac actgagctat tacaaactcg gcgcaagcca gcgcgtcgct ggggactcag 720
gcttcgcagc ttacagcaga tataggatcg ggaactacaa gctgaatacc gatcacagct 780
caagcagcga taacatcgct ctgctcgtcc agtgactcga gctagtgact gactaggatc 840
tggttaccac taaaccagcc tcaagaacac ccgaatggag tctctaagct acataatacc 900
aacttacact tacaaaatgt tgtcccccaa aatgtagcca ttcgtatctg ctcctaataa 960
aaagaaagtt tcttcacatt ctagaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaa 1084
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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aggaaactta agtcaacaca acatatacaa aacaaacgaa tctcaagcaa tcaagcattc 60
tacttctatt gcagcaattt aaatcatttc ttttaaagca aaagcaattt tctgaaaatt 120
ttcaccattt acgaacgata gccaccatga ggccccaggg gctgccaaac aacaccgcaa 180
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gggtgcctat taacactaac tcaagccctg acgatcagat cggctattat cgcagggcta 300
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cagccaacaa cgccgctatc gtgctccagc tccctcaggg caccactctg cccaaggggt 540
tctacgccga gggctcaaga ggggggagcc aggcctcaag cagaagcggc agcggcccca 600
ggcagaagag aacagctact aaagcatata atgtgacaca ggccttcggc cgcagagggc 660
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ctctcagcta ctacaagctg ggggccagcc agcgggtcgc aggggatagc ggatttgccg 1200
cctactcaag atatagaatc ggaaactata aactcaacac cgaccattca agcagcagcg 1260
acaacattgc actgctggtc cagtgactcg agctagtgac tgactaggat ctggttacca 1320
ctaaaccagc ctcaagaaca cccgaatgga gtctctaagc tacataatac caacttacac 1380
ttacaaaatg ttgtccccca aaatgtagcc attcgtatct gctcctaata aaaagaaagt 1440
ttcttcacat tctagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1555
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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tacttctatt gcagcaattt aaatcatttc ttttaaagca aaagcaattt tctgaaaatt 120
ttcaccattt acgaacgata gccaccatgt cagataacgg cccacagaat cagagaaacg 180
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ttcttcacat tctagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1675
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
a 1621
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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aggaaactta agtcaacaca acatatacaa aacaaacgaa tctcaagcaa tcaagcattc 60
tacttctatt gcagcaattt aaatcatttc ttttaaagca aaagcaattt tctgaaaatt 120
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tcaagccaat gcgtcaactt cactacacgg acccagctgc cccctgctta taccaactca 240
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tatcagggcg tgaactgcac cgaagtgcct gtcgccattc atgcagacca gctgaccccc 2040
acttggagag tgtactcaac tggcagcaat gtctttcaaa ccagagccgg ctgtctcatc 2100
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acacagaacg tgctgtatga gaatcagaaa ctgatcgcaa atcaatttaa ttcagcaatc 2940
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 4238
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<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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gaacgata 128
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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ctcgagctag tgactgacta ggatctggtt accactaaac cagcctcaag aacacccgaa 60
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<211> 1270
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 15
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro
65 70 75 80
Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser
85 90 95
Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val
115 120 125
Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr His Lys
130 135 140
Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu
165 170 175
Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys
180 185 190
Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn
195 200 205
Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val
210 215 220
Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala
225 230 235 240
Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr
245 250 255
Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe
260 265 270
Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys
275 280 285
Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr
290 295 300
Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr
305 310 315 320
Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly
325 330 335
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
340 345 350
Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser
355 360 365
Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu
370 375 380
Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg
385 390 395 400
Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala
405 410 415
Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala
420 425 430
Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr
435 440 445
Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp
450 455 460
Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
465 470 475 480
Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro
485 490 495
Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe
500 505 510
Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr
515 520 525
Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr
530 535 540
Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln
545 550 555 560
Gln Phe Gly Arg Asp Ile Asp Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro
565 570 575
Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val
580 585 590
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Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
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<211> 1273
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 19
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列（Artificial Sequence）的描述: 合成多核苷酸（Syntheticpolynucleotide）"
<400> 20
auguuugugu uucugguccu ccugccccug gugucaagcc aaugcgucaa cuucacuaca 60
cggacccagc ugcccccugc uuauaccaac ucauuuacua gaggggugua cuacccagau 120
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aauccagugc uccccuucaa cgauggggug uauuuugcaa gcacugaaaa gucaaauauu 300
auccgcggau ggauuuucgg gacaacacuc gauagcaaga cccagucacu gcucaucgug 360
aacaacgcua caaauguggu caucaaggug ugcgaguuuc aguucugcaa ugacccuuuu 420
cucggcgucu acuaccacaa gaacaacaag agcuggaugg aaucagaauu ccggguguau 480
agcucagcua auaauugcac cuucgaguau gugagccagc cuuuccucau ggaccuggag 540
gggaagcagg gcaacuucaa gaaucugaga gaauucgugu uuaaaaacau cgauggauau 600
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cugcuggcuc uccacaucag cuaccugacu ccaggggaua gcucaagcgg cuggaccgcu 780
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gagaacggga caauuacuga cgcugucgau ugugcacucg acccccucag cgagacaaaa 900
uguacccuga aaagcuuuac uguggaaaaa gggauuuacc agacuagcaa uuucagaguc 960
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gucuucaaug ccacccgcuu cgccagcgug uacgcuugga auagaaagcg gaucagcaac 1080
ugcguggccg acuacagcgu gcucuacaau agcgcuagcu ucucaacauu uaaaugcuac 1140
ggggugagcc ccacaaaacu gaaugaccug uguuucacca auguguaugc cgauagcuuc 1200
gugauuagag gcgacgaggu gcgccaaauc gcaccuggcc aaaccggaaa cauugcagau 1260
uauaacuaua agcugcccga ugauuuuacu ggcuguguca ucgcuuggaa cagcaacaac 1320
cucgauucaa aagucggagg aaacuauaac uaccuguaua gacuguucag aaagagcaac 1380
cugaagcccu uugaaaggga uaucagcaca gaaauuuacc aggccgggag caccccaugc 1440
aacgggguca aaggguuuaa cuguuauuuc ccccugcaga gcuacggguu ucaacccacc 1500
uauggggugg gguaucagcc uuaccgcgug gucgugcuga gcuucgaacu gcugcacgcc 1560
cccgccaccg ugugcggccc uaaaaagagc acaaaccucg ucaagaacaa gugcgugaac 1620
uucaauuuca acggccugac uggcacaggc guccucaccg aaagcaauaa aaaguuccuc 1680
ccuuuccagc aauucggcag agacauugca gacacaacug augcugugag ggacccccag 1740
acacuggaga uccuggauau uacccccugu ucauucggcg gagugucagu caucaccccu 1800
ggcacuaaca caucaaauca gguggcaguc cuguaucagg gcgugaacug caccgaagug 1860
ccugucgcca uucaugcaga ccagcugacc cccacuugga gaguguacuc aacuggcagc 1920
aaugucuuuc aaaccagagc cggcugucuc aucggcgcag aacaugucaa caacagcuau 1980
gagugugaca ucccaaucgg agcuggcauc ugugccagcu aucagacaca gaccaacagc 2040
ccucggaggg cuagaagcgu ggccagccag agcauuaucg cuuacaccau gucacugggc 2100
gucgagaaua gcguggccua uagcaacaau agcaucgcca uucccaccaa uuuuaccauc 2160
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gucuuugcuc aggucaaaca gaucuacaaa accccaccaa uuaaagacuu cggaggcuuc 2400
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cuccuguuca acaaggugac ucuggcugac gcuggguuca ucaagcagua uggagacugc 2520
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ucagagcccg ugcucaaagg cgugaaacug cauuauacuu ga 3822
<210> 21
<211> 669
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
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<400> 21
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acacuggccu guuucgugcu cgccgccguc uaccgcauua acuggaucac aggagggauu 240
gcuaucgcua uggcuugccu ggucgggcug auguggcucu cauacuucau cgcaagcuuu 300
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<211> 1140
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
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<400> 22
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<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
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<400> 23
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列（Artificial Sequence）的描述: 合成多核苷酸（Syntheticpolynucleotide）"
<400> 43
tcaacacaac atatacaaaa caaacgaatc tcaagcaatc aagcattcta cttctattgc 60
agcaatttaa atcatttctt ttaaagcaaa agcaattttc tgaaaatttt caccatttac 120
gaacgatagc caccatgttt gtgtttctgg tcctcctgcc cctggtgtca agccaatgcg 180
tcaacttcac tacacggacc cagctgcccc ctgcttatac caactcattt actagagggg 240
tgtactaccc agataaagtg ttcagatcaa gcgtgctcca cagcacccag gacctcttcc 300
tgcccttctt ttcaaacgtg acctggttcc atgccatcca tgtgagcgga accaacggga 360
ccaagcggtt cgccaatcca gtgctcccct tcaacgatgg ggtgtatttt gcaagcactg 420
aaaagtcaaa tattatccgc ggatggattt tcgggacaac actcgatagc aagacccagt 480
cactgctcat cgtgaacaac gctacaaatg tggtcatcaa ggtgtgcgag tttcagttct 540
gcaatgaccc ttttctcggc gtctactacc acaagaacaa caagagctgg atggaatcag 600
aattccgggt gtatagctca gctaataatt gcaccttcga gtatgtgagc cagcctttcc 660
tcatggacct ggaggggaag cagggcaact tcaagaatct gagagaattc gtgtttaaaa 720
acatcgatgg atatttcaaa atctatagca agcacactcc tatcaacctc gtccggggcc 780
tgccacaagg ctttagcgca ctggagcccc tcgtggacct gcccatcggg atcaatatca 840
ccagatttca gactctgctg gctctccaca tcagctacct gactccaggg gatagctcaa 900
gcggctggac cgctggagcc gctgcctatt acgtggggta cctgcagcct aggacttttc 960
tgctgaagta caatgagaac gggacaatta ctgacgctgt cgattgtgca ctcgaccccc 1020
tcagcgagac aaaatgtacc ctgaaaagct ttactgtgga aaaagggatt taccagacta 1080
gcaatttcag agtccagcca acagagtcaa tcgtgcggtt tcctaacatc acaaacctct 1140
gcccattcgg ggaggtcttc aatgccaccc gcttcgccag cgtgtacgct tggaatagaa 1200
agcggatcag caactgcgtg gccgactaca gcgtgctcta caatagcgct agcttctcaa 1260
catttaaatg ctacggggtg agccccacaa aactgaatga cctgtgtttc accaatgtgt 1320
atgccgatag cttcgtgatt agaggcgacg aggtgcgcca aatcgcacct ggccaaaccg 1380
gaaacattgc agattataac tataagctgc ccgatgattt tactggctgt gtcatcgctt 1440
ggaacagcaa caacctcgat tcaaaagtcg gaggaaacta taactacctg tatagactgt 1500
tcagaaagag caacctgaag ccctttgaaa gggatatcag cacagaaatt taccaggccg 1560
ggagcacccc atgcaacggg gtcaaagggt ttaactgtta tttccccctg cagagctacg 1620
ggtttcaacc cacctatggg gtggggtatc agccttaccg cgtggtcgtg ctgagcttcg 1680
aactgctgca cgcccccgcc accgtgtgcg gccctaaaaa gagcacaaac ctcgtcaaga 1740
acaagtgcgt gaacttcaat ttcaacggcc tgactggcac aggcgtcctc accgaaagca 1800
ataaaaagtt cctccctttc cagcaattcg gcagagacat tgcagacaca actgatgctg 1860
tgagggaccc ccagacactg gagatcctgg atattacccc ctgttcattc ggcggagtgt 1920
cagtcatcac ccctggcact aacacatcaa atcaggtggc agtcctgtat cagggcgtga 1980
actgcaccga agtgcctgtc gccattcatg cagaccagct gacccccact tggagagtgt 2040
actcaactgg cagcaatgtc tttcaaacca gagccggctg tctcatcggc gcagaacatg 2100
tcaacaacag ctatgagtgt gacatcccaa tcggagctgg catctgtgcc agctatcaga 2160
cacagaccaa cagccctcgg agggctagaa gcgtggccag ccagagcatt atcgcttaca 2220
ccatgtcact gggcgtcgag aatagcgtgg cctatagcaa caatagcatc gccattccca 2280
ccaattttac catcagcgtg accacagaga tcctcccagt gagcatgacc aagacaagcg 2340
tcgattgcac aatgtacatt tgcggcgaca gcactgaatg tagcaacctc ctgctgcagt 2400
acgggagctt ttgtacccaa ctgaatcggg cactcaccgg gatcgccgtg gagcaggata 2460
aaaacactca ggaggtcttt gctcaggtca aacagatcta caaaacccca ccaattaaag 2520
acttcggagg cttcaacttc tcacagattc tgccagaccc ttcaaagcca agcaagcgca 2580
gcttcattga agatctcctg ttcaacaagg tgactctggc tgacgctggg ttcatcaagc 2640
agtatggaga ctgcctgggg gacatcgcag caagggatct gatctgtgct cagaagttta 2700
atggcctcac agtgctgccc cctctcctga ctgacgagat gattgctcag tacaccagcg 2760
ccctgctggc tggaactatc acatcagggt ggacattcgg ggccggggct gctctgcaga 2820
ttcctttcgc aatgcaaatg gcatataggt tcaacgggat cggcgtcaca cagaacgtgc 2880
tgtatgagaa tcagaaactg atcgcaaatc aatttaattc agcaatcggg aaaatccagg 2940
actcactgtc atcaaccgca tcagccctgg gcaagctgca ggacgtcgtc aaccaaaacg 3000
cccaggcact caacacactg gtgaagcagc tgtcaagcaa tttcggagca atcagcagcg 3060
tcctgaatga tatcctgagc aggctggata aggtggaggc agaagtgcag atcgaccgcc 3120
tgatcaccgg ccggctccag agcctgcaaa cctatgtcac tcagcaactg atcagagctg 3180
cagaaatccg ggcaagcgcc aatctggccg ccaccaagat gtcagaatgc gtgctcggcc 3240
agagcaagag ggtggacttc tgcggcaaag gctaccacct gatgagcttc cctcagagcg 3300
ccccccacgg cgtggtcttc ctccatgtga cttatgtgcc cgcacaggaa aagaacttca 3360
ctactgcccc agccatctgc cacgacggaa aggctcattt cccacgcgag ggggtgttcg 3420
tcagcaatgg aacccactgg ttcgtgaccc agcggaactt ctatgagcct cagattatta 3480
ccacagacaa cacatttgtg tcaggaaatt gcgatgtcgt gatcgggatc gtcaacaata 3540
ctgtctatga ccccctccag ccagaactcg atagcttcaa agaggaactc gataagtatt 3600
ttaaaaatca caccagccct gatgtggatc tgggcgatat cagcggaatc aatgctagcg 3660
tggtgaacat ccagaaggag attgacaggc tcaacgaagt cgcaaagaac ctgaacgagt 3720
cactgatcga cctccaggaa ctgggcaagt acgaacagta catcaagtgg ccctggtaca 3780
tctggctcgg gttcatcgct ggcctgattg ctatcgtgat ggtgacaatc atgctctgct 3840
gtatgaccag ctgctgcagc tgcctgaagg gatgctgctc atgcggcagc tgctgtaagt 3900
tcgatgagga cgactcagag cccgtgctca aaggcgtgaa actgcattat acttgactcg 3960
agctagtgac tgactaggat ctggttacca ctaaaccagc ctcaagaaca cccgaatgga 4020
gtctctaagc tacataatac caacttacac ttacaaaatg ttgtccccca aaatgtagcc 4080
attcgtatct gctcctaata aaaagaaagt ttcttcacat tctagaaaaa aaaaaaaaaa 4140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 4225
<210> 44
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
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<400> 44
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 99
<210> 45
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列（Artificial Sequence）的描述: 合成多核苷酸（Syntheticpolynucleotide）"
<400> 45
atggacatga gagctccagc ccagatcttt ggctttctgc tcctgctgtt tccaggcact 60
aggtgcga 68
<210> 46
<211> 1729
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列（Artificial Sequence）的描述: 合成多核苷酸（Syntheticpolynucleotide）"
<400> 46
ucaacacaac auauacaaaa caaacgaauc ucaagcaauc aagcauucua cuucuauugc 60
agcaauuuaa aucauuucuu uuaaagcaaa agcaauuuuc ugaaaauuuu caccauuuac 120
gaacgauagc caccaugguc agcaaagggg aggaggucau uaaagaauuc augagauuua 180
aagucagaau ggagggcagc augaacggcc acgaguucga aaucgagggc gaaggagagg 240
gccgcccaua ugaagggacc cagacagcca agcugaaagu gaccaagggc ggaccacugc 300
cuuucgcuug ggacauccug ucaccccaau uuauguacgg gucaaaggcc uacgugaaac 360
auccagccga caucccagau uacaagaaac ugagcuuucc ugaaggguuu aagugggaac 420
gggucaugaa cuucgaggau ggcggacugg ugacugucac ccaagauagc agccuccagg 480
acggcacucu gaucuauaag gugaagaugc gcggaacuaa cuuuccaccc gacgggccag 540
ucaugcagaa gaagacaaug ggcugggaag cuucaaccga aaggcucuau cccagagaug 600
ggguccugaa gggcgaaauc caccaggccc ugaagcucaa ggauggaggg cacuaccugg 660
uggaguuuaa aaccaucuau auggccaaaa agcccgugca acugccagga uauuauuacg 720
uggacacaaa gcucgauauc accagccaca acgaagauua cacaauuguc gaacaguaug 780
agcggucaga aggaaggcau caccucuuuc ugggacaugg gaccggcuca acuggcagcg 840
gcucaucagg caccgccuca ucagaagaca acaauauggc cgugaucaag gaguucauga 900
gauucaaggu gagaauggag gggagcauga acggccacga auucgaaauc gagggcgagg 960
gggagggcag acccuaugaa ggcacccaga cugcaaaacu gaaggucaca aaaggcggcc 1020
cccugccauu cgcuugggac auccugagcc cccaauucau guauggauca aaggccuaug 1080
ugaagcaccc ugccgauauu ccagauuaua agaagcucag cuuccccgag ggcuuuaagu 1140
gggagagggu gaugaacuuc gaggauggcg gccucgugac cgucacccag gauucaagcc 1200
ugcaggacgg aacacugauc uacaaaguca agaugagagg aaccaacuuu cccccagaug 1260
gccccgugau gcaaaaaaaa acaaugggcu gggaggcuag cacugaacgg cuguacccac 1320
gcgacggggu gcugaaaggg gaaauucacc aggcucugaa acugaaagau ggaggacauu 1380
accucgugga guucaagacc auuuacaugg cuaaaaagcc ugugcaacug cccggcuauu 1440
auuaugugga cacaaaacug gauauuaccu cacacaacga agacuauaca auuguggaac 1500
aguaugagag gagcgagggg cgccaccacc uguuucucua cggcauggau gaacucuaca 1560
agugacucga gcuagugacu gacuaggauc ugguuaccac uaaaccagcc ucaagaacac 1620
ccgaauggag ucucuaagcu acauaauacc aacuuacacu uacaaaaugu ugucccccaa 1680
aauguagcca uucguaucug cuccuaauaa aaagaaaguu ucuucacau 1729
<210> 47
<211> 128
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 47
ucaacacaac auauacaaaa caaacgaauc ucaagcaauc aagcauucua cuucuauugc 60
agcaauuuaa aucauuucuu uuaaagcaaa agcaauuuuc ugaaaauuuu caccauuuac 120
gaacgaua 128
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<211> 164
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 48
cucgagcuag ugacugacua ggaucugguu accacuaaac cagccucaag aacacccgaa 60
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agccauucgu aucugcuccu aauaaaaaga aaguuucuuc acau 164
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<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 49
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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cataatacca acttacactt acaaaatgtt gtcccccaaa atgtagccat tcgtatctgc 4080
tcctaataaa aagaaagttt cttcacattc tagaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<223> /note="人工序列（Artificial Sequence）的描述: 合成多核苷酸（Syntheticpolynucleotide）"
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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aaccagccuc aagaacaccc gaauggaguc ucuaagcuac auaauaccaa cuuacacuua 60
caaaauguug ucccccaaaa uguagccauu cguaucugcu ccuaauaaaa agaaaguuuc 120
uucac 125

Claims (43)

1.多核苷酸，其编码SARS-CoV-2的至少一种结构蛋白或其变体，其中所述至少一种结构蛋白是刺突(S)蛋白，其中所述多核苷酸包含第一序列区，所述第一序列区包含与SEQ IDNO：7、20、26、27和32中之一具有至少80％同一性的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第一序列区与SEQ ID NO：7具有至少95％同一性。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其中所述第一序列区与SEQ ID NO：7具有至少99％同一性。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述第一序列区由SEQ ID NO：7组成。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中编码的刺突蛋白具有SEQ ID NO：2的蛋白质序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列的至少50％是密码子优化的。
7.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA。
8.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是mRNA。
10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其包含5'UTR和3'UTR，其中所述5'UTR包含SEQ IDNO：47，所述3'UTR包含SEQ ID NO：48。
11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中至少一个尿嘧啶核苷被修饰为N1-甲基假尿苷。
12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中所有尿嘧啶核苷都被修饰为N1-甲基假尿苷。
13.核酸疫苗，其包含权利要求12所述的多核苷酸。
14.根据权利要求13所述的核酸疫苗，其被配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。
15.药物组合物，其包含权利要求14所述的核酸疫苗和药学上可接受的赋形剂。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其包含约0.2mg/mL的权利要求9所述的mRNA。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其适合于肌内(IM)注射。
18.根据权利要求16所述的药物组合物，其被包装为3mL玻璃小瓶中的2mL填充物。
19.一种在受试者中诱导免疫应答的方法，其包括施用权利要求13至14中任一项所述的核酸疫苗或权利要求15至18中任一项所述的药物组合物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述免疫应答包括T细胞应答。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述免疫应答包括B细胞应答。
22.根据权利要求19所述的方法，其还包括在第一次施用后施用加强剂。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述受试者中的免疫应答是剂量依赖性的。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述剂量依赖性免疫应答包括在所述受试者中诱导SARS-CoV-2刺突蛋白特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM和IgA抗体中的一种或多种。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述剂量依赖性免疫应答包括诱导IL-2+T细胞、IL-4+T细胞和IFN-γ+T细胞中的一种或多种。
26.一种治疗受试者的COVID-19的方法，包括施用权利要求13至14中任一项所述的核酸疫苗或权利要求15至18中任一项所述的药物组合物。
27.一种预防受试者的COVID-19的方法，包括向所述受试者施用权利要求13至14中任一项所述的核酸疫苗或权利要求15至18中任一项所述的药物组合物。
28.一种减轻或缓解受试者中COVID-19的生理效应或症状的方法，包括向所述受试者施用权利要求13至14中任一项所述的核酸疫苗或权利要求15至18中任一项所述的药物组合物。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中施用给所述受试者的剂量为约5μg至约100μg的mRNA。
30.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中施用给所述受试者的剂量为约16μg的mRNA。
31.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中施用给所述受试者的剂量为约40μg的mRNA。
32.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中施用给所述受试者的剂量为约100μg的mRNA。
33.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中施用于所述受试者的药物组合物的体积为约0.025mL至约0.5mL。
34.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中施用于所述受试者的药物组合物的体积为约0.025mL、0.05mL、0.08mL、0.2mL或0.5mL。
35.根据权利要求26至34中任一项所述的方法，包括在施用第一剂量后的约1至约5周，施用第二剂量的所述核酸疫苗或所述药物组合物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述第二剂量在所述第一剂量后的约4周施用。
37.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中在接受第一剂量的所述核酸疫苗或所述药物组合物后至少第28天，在所述受试者中检测到抗刺突蛋白IgG抗体。
38.根据权利要求37所述的方法，其中在接受第二剂量的所述核酸疫苗或所述药物组合物后在至少第42天，所述抗刺突蛋白IgG抗体以增强量存在于所述受试者中。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述受试者中的抗刺突蛋白IgG抗体是来自SARS-CoV-2康复期患者的血清样品中抗刺突蛋白IgG抗体值的10倍以上。
40.一种诱导受试者产生SARS-CoV-2中和抗体的方法，包括向所述受试者施用权利要求13至14中任一项所述的核酸疫苗或权利要求15至18中任一项所述的药物组合物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述SARS-CoV-2中和抗体可在施用后至少第28天在所述受试者中检测到。
42.根据权利要求41所述的方法，其中在接受第二剂量的所述核酸疫苗或所述药物组合物后在第42天，所述受试者中的所述SARS-CoV-2中和抗体的产生得到增强。
43.根据权利要求41所述的方法，其中针对SARS-CoV-2的中和抗体的水平在至少第42天增加了10倍。
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