TW202222821A - 用於預防及/或治療covid-19之組合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於核酸疫苗之製備、製造及治療用途的組合物及方法，該等核酸疫苗包含編碼SARS-CoV-2之一或多種結構蛋白及變異體的聚核苷酸序列，用於治療、緩解、改善及/或預防COVID-19。
Description
本發明大體上係關於核酸疫苗，特定言之編碼SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體之核酸疫苗(例如RNA、mRNA、DNA疫苗)的組合物、調配物方法及/或用途，用於預防、緩解及/或治療及/或預防COVID-19，包括減輕感染及/或症狀之生理效應。
嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)為一種新型冠狀病毒株，其於2019年在中國開始感染哺乳動物且已蔓延至大流行。SARS-CoV-2感染會引起2019年冠狀病毒病(稱為「COVID-19」)，其以不同方式影響哺乳動物，包括無症狀的個體至具有在輕度症狀至嚴重疾病或死亡範圍內之廣泛症狀的個體。
疫苗為提供針對傳染病之預防性保護的有效方式。目前，可用於預防、緩解及/或治療COVID-19的疫苗有限。COVID-19之治療僅限於管理疾病之症狀及/或副作用。因此，仍強烈需要COVID-19疫苗，包括將疫苗遞送至一系列不同目標T細胞的調配物。
本發明提供核酸疫苗、包含核酸疫苗之組合物及調配物，以及使用其預防冠狀病毒感染以預防、緩解及治療COVID-19的方法。核酸疫苗可包括編碼SARS-CoV-2之至少一種抗原蛋白、其片段或變異體的聚核苷酸。SARS-CoV-2抗原蛋白為SARS-CoV-2之結構蛋白。結構蛋白可為刺突蛋白、膜蛋白、核衣殼磷蛋白或包膜蛋白。此等結構蛋白之胺基酸序列的非限制性實例展示於表1中(SEQ ID No: 1-6及15-19)。
本文提供了用於為個體接種COVID-19疫苗之方法的COVID-19核酸疫苗，其中該核酸疫苗可包括至少一種編碼SARS-CoV-2之至少一種結構蛋白或其片段的聚核苷酸。
本文提供藉由以產生免疫反應之有效量投與本文所述之核酸疫苗而在個體中誘導免疫反應的方法。免疫反應可為但不限於T細胞反應或B細胞反應。作為非限制性實例，免疫反應可藉由單次投與本文所述之核酸疫苗而產生。作為另一非限制性實例，免疫反應可藉由加強投與本文所述之核酸疫苗而產生。投與醫藥組合物可在個體中產生劑量反應性免疫反應。作為非限制性實例，劑量反應性免疫反應可包含在個體中誘導SARS-CoV-2刺突蛋白特異性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM及IgA抗體中之一或多者。作為另一非限制性實例，劑量反應性免疫反應可包含誘導IL-2+ T細胞、IL-4+ T細胞及IFN-γ+ T細胞中之一或多者。在一些實施例中，投與醫藥組合物不會在個體中誘導顯著不良反應。
本文提供藉由投與本文所述之核酸疫苗來治療及/或預防個體之COVID-19的方法。
本文提供用於治療及預防COVID-19之核酸疫苗的醫藥組合物及調配物。
本文所述之核酸疫苗可在一或多種脂質奈米粒子(LNP)中調配。
本文亦提供用於COVID-19之核酸疫苗，其包含約0.2 mg/mL mRNA，其中mRNA包含具有與SEQ ID NO: 7至少95%一致之核酸序列的編碼區。在一些實施例中，本文所揭示之核酸疫苗的mRNA包含具有如SEQ ID NO: 7中所闡述之核酸序列的編碼區。核酸疫苗可調配為3 mL玻璃小瓶中之2 mL填充物。
在一些實施例中，向個體投與核酸疫苗包含向個體投與約5 µg至約100 µg mRNA。舉例而言，方法可包含向個體投與約16 µg mRNA。或者，方法可包含向個體投與約40 µg mRNA。或者，方法可包含向個體投與約100 µg mRNA。
在一些實施例中，向個體投與核酸疫苗包含向個體投與約0.025 mL至約0.5 mL核酸疫苗。舉例而言，方法可包含向個體投與約0.025 mL核酸疫苗、向個體投與約0.05 mL核酸疫苗、向個體投與約0.08 mL核酸疫苗、向個體投與約0.2 mL核酸疫苗或向個體投與約0.5 mL核酸疫苗。
在所提供方法之一些實施例中，投與包含向個體肌內(IM)注射核酸疫苗。
核酸疫苗可以第一劑核酸疫苗，接著在約1至約5週後第二劑核酸疫苗的形式向個體投與。在一些實施例中，第二劑核酸疫苗在第一劑後約4週投與。
在一些實施例中，在接受第一劑核酸疫苗後截至第28天在個體中偵測到抗刺突蛋白IgG抗體。
在一些實施例中，在接受第一劑核酸疫苗後截至第28天在個體中偵測到抗刺突蛋白IgG抗體，且其在接受第二劑核酸疫苗後截至第42天在個體中增強。
在一些實施例中，相比於來自SARS-CoV-2恢復期患者之血清樣品之抗刺突蛋白IgG抗體的平均值，個體中之抗刺突蛋白IgG抗體增加至高10倍。
在一些實施例中，在第一劑核酸疫苗後截至第28天在個體中偵測到SARS-CoV-2中和抗體。
在一些實施例中，SARS-CoV-2中和抗體在第二劑核酸疫苗後截至第42天在個體中增強。
因此，本發明提供用於為個體接種COVID-19疫苗之方法的COVID-19核酸疫苗，其中核酸疫苗包含約0.2 mg/mL mRNA，其中mRNA包含與SEQ ID NO: 7具有至少95%一致性之核酸序列，且其中核酸疫苗經調配用於肌內(IM)注射且在脂質奈米粒子(LNP)中調配。
各種實施例之細節闡述於以下實施方式中。其他特徵、目標及優點根據實施方式及申請專利範圍將為顯而易見的。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2020年10月9日申請之加拿大申請案第3,096,009號；2021年1月26日申請之第3,107,232號；2021年3月23日申請之第3,113,094號；2021年4月23日申請之第3,116,284號；2021年4月30日申請之第3,116,932號；2021年5月12日申請之第3,118,329號；2021年8月9日申請之第3,128,078號；2021年8月19日申請之第3,128,660號；2021年9月28日申請之第3,132,188號的優先權，該等申請案之內容各自以全文引用之方式併入。
序列表
本申請案與電子格式之序列表一起申請。名稱為2092_1004PCT_SL.txt之序列表檔案創建於2021年10月1日，且大小為198,523位元組。電子格式之序列表中之資訊以全文引用之方式併入本文中。
I. 簡介
以下描述闡述例示性組合物、方法、參數及類似者。然而，應認識到此描述並不意欲限制本發明之範疇，而是替代地經提供作為例示性實施例之描述。
本文描述核酸疫苗，特定言之包含編碼SARS-CoV-2之一或多種抗原蛋白、其片段或變異體之聚核苷酸之核酸疫苗的聚核苷酸(例如mRNA)、組合物、調配物、方法及/或用途，用於預防、緩解及/或治療COVID-19。抗原蛋白可為SARS-CoV-2之結構蛋白。結構蛋白可為刺突(S)蛋白、膜(M)蛋白、核衣殼(N)磷蛋白或包膜(E)蛋白。
在一些實施例中，核酸疫苗之至少一種組分為編碼SARS-CoV-2之抗原蛋白或抗原蛋白之片段或變異體中之至少一者的聚核苷酸。抗原蛋白可為SARS-CoV-2之結構蛋白。聚核苷酸可為RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸。
在一些實施例中，核酸疫苗包括至少一種編碼SARS-CoV-2之結構蛋白或結構蛋白之片段或變異體中之至少一者的mRNA聚核苷酸。
在一些實施例中，聚核苷酸可經設計以編碼來自SARS-CoV-2之一或多種所關注多肽，或其片段或變異體。SARS-CoV-2之此類所關注多肽可包括但不限於完整多肽、複數個多肽或多肽片段或多肽變異體，其獨立地可由來自SARS-CoV-2之聚核苷酸的一或多個區域或部分或全部編碼。如本文所用，術語「所關注多肽」係指經選擇以在本文所述之聚核苷酸內編碼或其功能受本文所述之聚核苷酸影響的任何多肽。本文所述之肽或多肽中之任一者可為具抗原性(亦稱為免疫原性)。
如本文所用，「多肽」意謂最通常藉由肽鍵連接在一起的胺基酸殘基(天然或非天然)之聚合物。如本文所用，該術語係指具有任何尺寸、結構或功能或來源之蛋白質、多肽及肽。在一些實施例中，所關注多肽為由如本文所述之聚核苷酸編碼的抗原。
在一些實施例中，所編碼之多肽小於約50個胺基酸，且該多肽隨後稱為肽。若多肽為肽，則其長度將為至少約2、3、4或至少5個胺基酸殘基。因此，多肽包括基因產物、天然存在之多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段及前述各者之其他等效物、變異體及類似物。多肽可為單分子或可為多分子複合物，諸如二聚體、三聚體或四聚體。其亦可包含單鏈或多鏈多肽，諸如抗體或胰島素，且可相關聯或連接。最常在多鏈多肽中發現二硫鍵。術語多肽亦適用於其中一或多個胺基酸殘基為對應天然存在之胺基酸之人工化學類似物的胺基酸聚合物。
術語「多肽變異體」係指胺基酸序列與天然或參考序列不同之分子。相較於天然或參考序列，胺基酸序列變異體可在胺基酸序列內某些位置處具有取代、缺失及/或插入。通常，變異體將與天然或參考序列具有至少約50%一致性(同源性)，且更佳地，其將與天然或參考序列至少約80%，或至少約85%，更佳至少約90%，甚至更佳至少約95%一致(同源)。
在一些實施例中，提供「變異體模擬物」。如本文所用，術語「變異體模擬物」為含有將模擬活化序列之一或多個胺基酸之模擬物。舉例而言，麩胺酸酯可充當偶磷基-蘇胺酸及/或偶磷基-絲胺酸之模擬物。在某些實施例中，提供「胺基酸序列變異體」。
在應用於胺基酸序列時，「同源性」定義為在比對序列且視需要引入空位以達成最大同源性百分比之後，候選胺基酸序列中之殘基與第二序列之胺基酸序列中之殘基之一致性百分比。用於比對之方法及電腦程式為此項技術中熟知的。應理解，同源性視一致性百分比之計算而定，但其值可能由於在計算中引入之空位及罰分而不同。
當應用於多肽序列時，「同源物」係指與第二物種之第二序列具有基本一致性之其他物種的相應序列。
如本文所用，「類似物」意欲包括多肽變異體，其不同之處在於一或多個胺基酸改變，例如仍維持親本或起始多肽之一或多種特性的胺基酸殘基取代、添加或缺失。
在一些實施例中，本發明涵蓋若干類型之基於多肽之組合物，包括變異體及衍生物。此等包括取代型、插入型、缺失型及共價變異體及衍生物。術語「衍生物」與術語「變異體」同義使用，但通常係指相對於參考分子或起始分子以任何方式修飾及/或改變的分子。
例如，可向本文所述之肽序列中(例如在N端或C端處)添加序列標籤或胺基酸，諸如一或多個離胺酸。序列標籤可用於肽純化或定位。離胺酸可用於提高肽溶解性或允許生物素標記。或者，位於肽或蛋白質之胺基酸序列的羧基及胺基端區域的胺基酸殘基可視情況缺失，從而提供截短型序列。或者可視序列之用途而定，例如序列表現為可溶的或與固體載體連接之較大序列的一部分，缺失某些胺基酸(例如，C端或N端殘基)。
當提及多肽時，「取代型變異體」為將天然或起始序列中之至少一個胺基酸殘基移除且替代其將不同胺基酸插入於同一位置處之變異體。取代可為單取代，其中分子中僅一個胺基酸經取代，或取代可為多取代，其中同一個分子中兩個或更多個胺基酸經取代。
如本文所用，術語「保守型胺基酸取代」係指用具有類似大小、電荷或極性之不同胺基酸取代通常存在於序列中之胺基酸。保守型取代之實例包括以諸如異白胺酸、纈胺酸及白胺酸之非極性(疏水性)殘基取代另一非極性殘基。類似地，保守型取代之實例包括用一種極性(親水性)殘基取代另一極性殘基，諸如在精胺酸與離胺酸之間、在麩醯胺酸與天冬醯胺酸之間及在甘胺酸與絲胺酸之間。另外，以諸如離胺酸、精胺酸或組胺酸之鹼性殘基取代另一鹼性殘基，或以一種諸如天冬胺酸或麩胺酸之酸性殘基取代另一酸性殘基為保守型取代之額外實例。非保守型取代之實例包括將諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸之非極性(疏水性)胺基酸殘基取代為諸如半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸或離胺酸之極性(親水性)殘基及/或將極性殘基取代為非極性殘基。
當提及多肽時，「插入型變異體」為將一或多個胺基酸緊鄰天然或起始序列中之特定位置處之胺基酸插入的變異體。「緊鄰(Immediately adjacent)」胺基酸意謂與該胺基酸之α-羧基或α-胺基官能基連接。
當提及多肽時，「缺失型變異體(Deletional variants)」為在天然或起始胺基酸序列中移除一或多個胺基酸之變異體。通常，缺失型變異體將在分子之特定區域中具有一或多個胺基酸缺失。
當提及多肽時，「共價衍生物」包括用有機蛋白質或非蛋白質衍生劑對天然或起始蛋白質之修飾及/或轉譯後修飾。共價修飾在傳統上藉由使蛋白質之所靶向胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或末端殘基反應之有機衍生劑反應，或藉由利用在所選重組宿主細胞中起作用的轉譯後修飾機制而引入。所得共價衍生物適用於針對鑑別對生物學活性、免疫分析法或製備抗蛋白質抗體用於重組醣蛋白之免疫親和力純化而言重要之殘基的程式。此類修飾在一般熟習此項技術者之能力範圍內，且在無不當實驗之情況下進行。
當提及多肽時，「特徵」定義為分子之獨特的基於胺基酸序列之組分。由本文所述之聚核苷酸編碼之多肽的特徵包括表面表現、局部構形形狀、摺疊、環、半環、域、半域、位點、末端或其任何組合。
如本文所用，當提及多肽時，術語「表面表現」係指出現於最外表面上的蛋白質之基於多肽之組分。
如本文所用，當提及多肽時，術語「局部構形形狀」意謂位於可界定蛋白質空間內的基於多肽之蛋白質結構表現。
如本文所用，在提及多肽時，術語「摺疊」係指在能量最小化時所得的胺基酸序列之構形。摺疊可出現於摺疊過程之二級或三級時。二級摺疊之實例包括β摺疊及α螺旋。三級摺疊之實例包括由於能量較高之力的聚集或分離而形成的域及區域。以此方式形成之區域包括疏水性及親水性袋，及其類似物。
如本文所用，在與多肽構形相關時，術語「轉角」意謂改變肽或多肽之主鏈方向且可涉及一個、兩個、三個或更多個胺基酸殘基的彎曲。
如本文所用，當提及多肽時，術語「環」係指多肽之結構特徵，其可用於反轉肽或多肽的主鏈方向。當在多肽中發現環且僅改變主鏈之方向時，其可包含四個或更多個胺基酸殘基。Oliva等人已鑑別出至少5類蛋白質環(
J. Mol Bio.,l266 (4): 814-830; 1997)。環可為開放的或封閉的。閉環或「環狀」環可在橋接部分之間包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸。此類橋接部分可包含在具有二硫鍵之多肽中典型的半胱胺酸-半胱胺酸橋(Cys-Cys)，或者橋接部分可為非基於蛋白質的，例如本文使用之二溴醯基劑。
如本文所用，當提及多肽時，術語「半環」係指所鑑別環之一部分，其具有衍生該部分之環之至少半數胺基酸殘基。應理解，環可能並非始終含有偶數個胺基酸殘基。因此，在其中環含有或鑑別為包含奇數個胺基酸之彼等情況下，奇數編號之環的半環將包含該環之整數部分或下一整數部分(環之胺基酸數目/2 +/- 0.5個胺基酸)。
如本文所用，當提及多肽時，術語「域」係指具有一或多種可鑑別結構或功能特徵或特性(例如，結合力、充當蛋白質-蛋白質相互作用位點)的多肽基元。
如本文所用，當提及多肽時，術語「半域」意謂所鑑別域之一部分，其具有衍生該部分之域之至少半數胺基酸殘基。應理解，域可能並非始終含有偶數個胺基酸殘基。因此，在其中域含有或鑑別為包含奇數個胺基酸之彼等情況下，奇數編號之域的半域將包含該域之整數部分或下一整數部分(域之胺基酸數目/2+/-0.5個胺基酸)。舉例而言，鑑別為7個胺基酸域的域可產生3個胺基酸或4個胺基酸之半域(7/2=3.5+1-0.5為3或4)。亦應理解，可在域或半域內鑑別子域，此等子域並不完全具有在其所衍生自之域或半域中所鑑別的全部結構或功能特性。亦應理解，包含本文中之任何域類型的胺基酸不必沿著多肽主鏈相連(亦即，非相鄰胺基酸可在結構上摺疊以產生域、半域或子域)。
如本文所用，當提及多肽時，術語「位點」在涉及基於胺基酸之實施例時與「胺基酸殘基」及「胺基酸側鏈」同義使用。位點表示可在本文所述之基於多肽之分子內經修飾、操縱、改變、衍生或變化之肽或多肽內的位置。
如本文所用，當提及多肽時，術語「端(termini)」或「端(terminus)」係指肽或多肽之末端。此類末端並非僅限於肽或多肽之第一或最末位點，而可包括末端區域中之其他胺基酸。本文所述之基於多肽之分子之特徵可在於具有N端(由具有游離胺基(NH2)之胺基酸封端)及C端(由具有游離羧基(COOH)之胺基酸封端)。在一些情況下，本文所述之蛋白質由藉由二硫鍵或藉由非共價力結合在一起之多個多肽鏈組成(多聚體、寡聚物)。此等類別的蛋白質將具有多個N端及C端。或者，多肽之端可經修飾以使得視具體情況，其以基於非多肽之部分(諸如有機結合物)起始或結束。
一旦任何特徵被鑑定或定義為將由本文所述之聚核苷酸編碼之多肽的所需組分，可藉由移動、交換、反轉、缺失、隨機化或複製來執行此等特徵之若干操縱及/或修飾中之任一者。此外，應理解，特徵操縱可產生與本文所述之分子修飾相同的結果。舉例而言，涉及域缺失之操縱將引起分子長度之變化，正如修飾核酸以編碼小於全長分子一樣。
在多肽中，術語「修飾」係指相比於20個胺基酸之標準組的修飾。修飾可為各種不同修飾。在一些實施例中，該等區域可含有一個、兩個或更多個(視情況不同的)修飾。
修飾及操縱可藉由此項技術中已知之方法實現，諸如但不限於定點突變誘發或在化學合成期間之先驗併入。隨後可使用活體外或活體內分析，諸如本文所描述之彼等分析或此項技術中已知之任何其他適合的篩選分析，測試所得經修飾之分子的活性。
在一些實施例中，多肽可包含經由數輪實驗發現之共同序列。如本文所用，「共同」序列為單一序列，其表示允許一或多個位點發生變化之序列集合。
如熟習此項技術者認識到，蛋白質片段、功能性蛋白質域及同源蛋白質亦視為在相關多肽之範疇內。例如，本文提供任何蛋白質片段(意謂比參考多肽序列短至少一個胺基酸殘基但另外與參考蛋白質相同的多肽序列。蛋白質片段之長度可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或超過100個胺基酸。在另一實例中，包括約20、約30、約40、約50或約100個胺基酸或更多個胺基酸之伸長段的任何蛋白質可根據本文所述之核酸疫苗使用，該等胺基酸與本文所述之序列中之任一者約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%一致。在某些實施例中，根據本文所述之核酸疫苗使用之多肽包括2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個如本文提供或參考之任一序列中所示的突變。
因此，本發明之聚核苷酸編碼含有相對於參考序列，詳言之本文所揭示之肽或多肽序列之取代、插入及/或添加、缺失及共價修飾的肽或多肽。聚核苷酸亦可含有相對於聚核苷酸參考序列之取代、插入及/或添加、缺失及共價修飾。
參考分子(多肽或聚核苷酸)可與設計之分子(多肽或聚核苷酸)共用某種一致性。如此項技術中已知之術語「一致性」係指兩個或更多個肽、多肽或聚核苷酸之序列之間的關係，如藉由比較該等序列所測定。在此項技術中，一致性亦意謂其之間的序列相關性程度，如由兩個或多個胺基酸殘基或核苷之串之間的匹配數所確定。一致性用間隙比對(若存在)量測兩個或更多個序列之較小者之間的一致匹配的百分比，該等間隙比對藉由特定數學模型或電腦程式((例如，「演算法」)處理。相關肽之一致性可藉由已知方法容易地計算。此類方法包括但不限於以下者中所述之彼等：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.編, Oxford University Press, N.Y., 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.編, Academic Press, N.Y., 1993；Computer Analysis of Sequence Data, 第1部分, Griffin, A. M.及Griffin, H. G.編, Humana Press, N.J., 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編, M. Stockton Press, N.Y, 1991；及Carillo等人, SIAM J. Applied Math. 48: 1073;1988)。
在一些實施例中，編碼之多肽變異體可具有與參考多肽相同或類似的活性。或者，變異體相對於參考多肽可具有改變的活性(例如，增加或降低)。一般而言，如藉由本文所述及熟習此項技術者已知之序列比對程式及參數所測定，本文所述之特定聚核苷酸或多肽之變異體將與特定參考聚核苷酸或多肽具有至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%但小於100%的序列一致性。此類比對工具包括BLAST程式組之彼等工具(Stephen F. Altschul等人, Gapped BLAST and PSLBLAST: a new generation of protein database search programs,
Nucleic Acids Res. 1997, 25:3389-3402)。其他工具描述於本文中，特定而言描述於「一致性」之定義中。
II. 本發明之組合物
SARS-CoV-2
嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)為一種新型冠狀病毒株，可引起稱為「COVID-19」之冠狀病毒病2019。COVID-19以不同的方式影響哺乳動物，包括無症狀的個體至具有在輕度症狀至嚴重疾病或死亡範圍內之廣泛症狀的個體。迄今為止，約80%之COVID-19患者具有輕度至中度症狀，而約20%可出現併發症，諸如重度肺炎、急性呼吸窘迫症候群、敗血症以及甚至死亡。隨著醫生及科學家更多地瞭解COVID-19及其如何對身體產生影響，與COVID-19相關的症狀清單不斷變化，但迄今為止公認的一些症狀包括發熱或發冷、咳嗽、呼吸急促或呼吸困難、疲勞、身體酸痛、肌肉酸痛、頭痛、喉嚨痛、充血或流鼻涕、噁心及/或嘔吐、腹瀉以及新的味覺或嗅覺喪失。
SARS-CoV-2之基因體編碼四種結構蛋白：刺突(S)、包膜(E)、膜(M)及核衣殼(N)，及非結構蛋白(命名為nsp1至nsp16)及輔助蛋白。病毒表面刺突蛋白通常為病毒進入細胞之主要介體。SARS-CoV-2刺突經由其受體結合域(RBD)結合至其受體人類ACE2 (hACE2)，且藉由人類蛋白酶以蛋白分解方式活化。SARS-CoV-2刺突蛋白之另一特徵為該蛋白在S1-S2邊界處(S1為受體結合單元且S2為膜融合單元)具有功能性弗林蛋白酶裂解位點，該位點可預活化許多病毒，包括SARS-CoV-2的進入。SARS-CoV-2刺突已被用作保護性抗原，可在各種疫苗開發策略中引發中和抗體。膜蛋白及包膜蛋白用於病毒組裝。包膜蛋白(E)可形成對病毒致病性重要的同型五聚體陽離子通道，Mandala等人,
Nature Structural and Molecular Bio.2020, 27: 1202-1208)。核衣殼蛋白將病毒基因體包裝成螺旋狀核糖核衣殼(RNP)，且在病毒自組裝中發揮作用(Chang等人; The SARS coronavirus nucleocapsid protein - Forms and functions;
Antiviral Res. 2014; 103:39-50；其內容以全文引用之方式併入本文中)。此外，SARS-CoV-2中之核衣殼蛋白可調節宿主細胞機制，且可參與病毒生命週期中的調節作用。
儘管不希望受理論束縛，但似乎SARS-CoV-2結合至人類受體ACE2 (hACE2)。刺突蛋白中之受體結合域(RBD)似乎為冠狀病毒基因體的最可變部分。有六種RBD胺基酸已被證明對與ACE2受體結合至關重要，且SARS-CoV-2基因體似乎具有RBD，該RBD與人類、雪貂、貓及其他具有高受體同源性之物種的ACE2具有高親和力結合(Anderson等人; The Proximal Origin of SARS-CoV-2;
Nature Medicine, 2020; 26(4): 450-452；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸編碼結構蛋白之全長多肽，或SARS-CoV-2之結構蛋白的片段或變異體，諸如刺突蛋白、核衣殼蛋白、包膜蛋白或膜蛋白。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸編碼SARS-CoV-2之結構蛋白的超過一個片段或變異體，諸如刺突蛋白、核衣殼蛋白、包膜蛋白及/或膜蛋白。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸編碼結構蛋白之一的突變變異體，或SARS-CoV-2之結構蛋白之突變變異體的片段。作為非限制性實例，變異體可為SARS-CoV-2之結構蛋白之一的天冬胺酸變為甘胺酸的單一胺基酸變化。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗的聚核苷酸編碼刺突蛋白之全長多肽，或SARS-CoV-2之刺突蛋白的片段或變異體。作為非限制性實例，變異體可為SARS-CoV-2之刺突蛋白中天冬胺酸變為甘胺酸之單一胺基酸變化。作為非限制性實例，變異體可為SARS-CoV-2之刺突蛋白中之位置614處天冬胺酸變為甘胺酸(D614G)之單一胺基酸變化(Korber等人; Tracking Changes in SARS-CoV-2 Spike: Evidence that D614G Increases Infectivity of the COVID-19 Virus;
Cell; 2020, 182(4): 812-827；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可編碼SARS-CoV-2之結構蛋白的一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體。SARS-CoV-2之結構蛋白之蛋白質、肽、片段或變異體的非限制性實例提供於表1中。在表中，若已知，則亦提供NCBI參考號。
表1. SARS-CoV-2之結構蛋白序列
| 序列標識符 (SEQ ID NO) | 描述 | 序列類型 |
| 1 | 刺突蛋白(NCBI參考號：YP_009724390.1) (「S蛋白」) | 蛋白質 |
| 2 | 具有D614G突變之刺突蛋白 | 蛋白質 |
| 3 | 包膜蛋白(NCBI參考號：YP_009724392.1) | 蛋白質 |
| 4 | 膜蛋白(NCBI參考號：YP_009724393.1) | 蛋白質 |
| 5 | 核衣殼磷蛋白(NCBI參考號：YP_009724397.2) | 蛋白質 |
| 6 | B.1.351 (南非)變異體刺突蛋白 | 蛋白質 |
| 15 | B.1.17 (UK)變異體刺突蛋白 | 蛋白質 |
| 16 | 具有D614G及L452R突變之刺突蛋白 | 蛋白質 |
| 17 | 具有L452R突變之B.1.17 (UK)變異體刺突蛋白 | 蛋白質 |
| 18 | 具有L452R突變之B.1.351 (南非)變異體刺突蛋白 | 蛋白質 |
| 19 | P.1 (巴西)變異體刺突蛋白 | 蛋白質 |
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可編碼至少一種結構蛋白，該至少一種結構蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的表1中之任一序列或表1中之任一序列之片段或表1中之任一序列之變異體。
在一些實施例中，核酸疫苗可為當轉譯時產生SARS-CoV-2之結構蛋白之一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體的mRNA疫苗。因此，mRNA疫苗之聚核苷酸為編碼SARS-CoV-2之結構蛋白之一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體的mRNA聚核苷酸。
在一個實施例中，本文所述之mRNA疫苗的編碼序列可基於來自SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1分離株(Genbank：NM908947.3，完全基因體序列)之基因體的刺突(S)蛋白之編碼序列。在一些實施例中，引入自D614至G614之單一胺基酸變化的代碼變化以匹配當前主要流行病毒株的胺基酸。
編碼SARS-CoV-2之結構蛋白之蛋白質、肽、片段或變異體之RNA序列的非限制性實例提供於表2中。
表2. SARS-CoV-2之刺突蛋白的序列
| 序列標識符 (SEQ ID NO) | 描述 | 序列類型 |
| 7 | 具有D614G突變之刺突蛋白的編碼區 | RNA |
| 20 | SARS-CoV-2變異體B.1.351 (南非變異體)刺突蛋白之編碼區 | RNA |
| 21 | M蛋白之編碼區 | RNA |
| 22 | N及M蛋白之編碼區 | RNA |
| 23 | N蛋白之編碼區 | RNA |
| 24 | 信號肽且編碼N及M蛋白之編碼區 | RNA |
| 25 | 編碼S蛋白受體結合域(RBD)之序列 | RNA |
| 26 | 編碼具有突變弗林蛋白酶位點mRNA之S蛋白的序列 | RNA |
| 27 | 編碼具有D614G突變之刺突蛋白的序列 | RNA |
| 28 | 編碼M蛋白之序列 | RNA |
| 29 | 編碼N及M蛋白之序列 | RNA |
| 30 | 編碼N蛋白之序列 | RNA |
| 31 | 具有信號肽且編碼N及M蛋白之序列 | RNA |
| 32 | 編碼SARS-CoV-2變異體B.1.351 (南非變異體)刺突蛋白之序列 | RNA |
在一些實施例中，編碼具有SARS-CoV-2之D614G突變之刺突蛋白的mRNA序列包含SEQ ID NO: 7或其片段或變異體之編碼區。
在一些實施例中，編碼具有SARS-CoV-2之D614G突變之刺突蛋白的mRNA序列包含SEQ ID NO: 27，或其片段或變異體。
在一些實施例中，核酸疫苗可包含編碼表1中所列之任一序列或其片段或變異體的區域。核酸疫苗可包含雜交或嵌合區，或模擬物或變異體。在一些實施例中，核酸疫苗可包含表3中所列之任一聚核苷酸序列。
表3. 用於治療或預防COVID-19之核酸疫苗中之例示性序列
| 序列標識符 (SEQ ID NO) | 描述 | 序列類型 |
| 8 | 編碼M蛋白之序列 | DNA |
| 9 | 編碼N及M蛋白之序列 | DNA |
| 10 | 編碼N蛋白之序列 | DNA |
| 11 | 具有信號肽且編碼N及M蛋白之序列 | DNA |
| 12 | 編碼SARS-CoV-2變異體B.1.351 (南非變異體)刺突蛋白之序列 | DNA |
| 33 | SARS-CoV-2變異體B.1.351 (南非變異體)刺突蛋白之編碼區 | DNA |
| 34 | M蛋白之編碼區 | DNA |
| 35 | N及M蛋白之編碼區 | DNA |
| 36 | N蛋白之編碼區 | DNA |
| 37 | 信號肽且編碼N及M蛋白之編碼區 | DNA |
| 38 | 編碼M蛋白之序列 | DNA |
| 39 | 編碼N及M蛋白之序列 | DNA |
| 40 | 編碼N蛋白之序列 | DNA |
| 41 | 具有信號肽且編碼N及M蛋白之序列 | DNA |
| 42 | 編碼具有D614G突變之刺突蛋白的序列 | DNA |
| 43 | 編碼SARS-CoV-2變異體B.1.351 (南非變異體)刺突蛋白之序列 | DNA |
| 50 | 編碼S蛋白受體結合域(RBD)之序列 | DNA |
| 51 | 編碼具有突變弗林蛋白酶位點之S蛋白的序列 | DNA |
表1-3中提及之任何序列或其變異體亦可用於本文所述之記憶加強疫苗。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗編碼與由表1中之胺基酸序列提供之蛋白質至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致的蛋白質或其片段或變異體。在兩個或更多個多肽序列之情況下，術語「一致」或百分比「一致性」係指相同的兩個或更多個序列。多肽序列之間的百分比一致性可使用此項技術中已知之演算法，諸如BLAST及CLUSTAL進行。
SARS-CoV-2蛋白或其片段或變異體之序列可獲自任何來源。在一些實施例中，SARS-CoV-2蛋白或其片段或變異體之序列來自能夠感染人類個體或有感染人類個體之風險的菌株。
在一些實施例中，SARS-CoV-2蛋白或其片段或變異體之序列可經修飾或最佳化(諸如密碼子最佳化)以在特定細胞或宿主生物體中表現。
在一些實施例中，本文中所述之核酸疫苗可為多價疫苗。多價疫苗可包括編碼SARS-CoV-2之至少兩種不同的一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體之聚核苷酸。作為非限制性實例，聚核苷酸可編碼相同或不同結構蛋白。作為非限制性實例，聚核苷酸可編碼相同結構蛋白，但結構蛋白之不同變異體。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之全長S蛋白。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之S蛋白片段。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之刺突蛋白之受體結合域(RBD)片段。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之刺突蛋白之變異體。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之S蛋白序列(例如全長、片段或變異體)，其中S蛋白具有突變之弗林蛋白酶裂解位點。S蛋白弗林蛋白酶裂解位點突變體將移除或禁用S蛋白中之弗林蛋白酶裂解位點(例如在S1與S2邊界之間)。在一些病毒包膜蛋白中，發現破壞弗林蛋白酶裂解位點會增強表現及穩定性。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之S蛋白序列(例如全長、片段或變異體)，其中S蛋白包括D614G突變。編碼SARS-CoV-2之S蛋白、其片段或變異體的核酸疫苗亦可包括信號肽及/或至少一個連接子(例如GSG連接子)序列且核酸疫苗中之一或多個序列可經密碼子最佳化。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之全長M蛋白。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之M蛋白片段。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之M蛋白的拓樸域(例如病毒粒子表面或病毒粒子內區域)。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之M蛋白的跨膜域。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之M蛋白(例如全長蛋白或片段)之變異體。編碼SARS-CoV-2之M蛋白、其片段或變異體的核酸疫苗亦可包括信號肽及/或至少一個連接子(例如GSG連接子)序列且核酸疫苗中之一或多個序列可經密碼子最佳化。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之全長N蛋白。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之N蛋白片段。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之N蛋白的RNA結合域。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之N蛋白的二聚域。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之N蛋白(例如全長蛋白或片段)之變異體。編碼SARS-CoV-2之N蛋白、其片段或變異體的核酸疫苗亦可包括信號肽及/或至少一個連接子(例如GSG連接子)序列且核酸疫苗中之一或多個序列可經密碼子最佳化。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之全長E蛋白。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之E蛋白片段。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之E蛋白的拓樸域(例如病毒粒子表面或病毒粒子內區域)。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之E蛋白的跨膜域。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之E蛋白(例如全長蛋白或片段)之變異體。編碼SARS-CoV-2之E蛋白、其片段或變異體的核酸疫苗亦可包括信號肽及/或至少一個連接子(例如GSG連接子)序列且核酸疫苗中之一或多個序列可經密碼子最佳化。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之兩種不同結構蛋白。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之S蛋白、其片段或變異體及SARS-CoV-2之M蛋白、其片段或變異體。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之S蛋白、其片段或變異體及SARS-CoV-2之N蛋白、其片段或變異體。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之S蛋白、其片段或變異體及SARS-CoV-2之E蛋白、其片段或變異體。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之M蛋白、其片段或變異體及SARS-CoV-2之N蛋白、其片段或變異體。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之M蛋白、其片段或變異體及SARS-CoV-2之E蛋白、其片段或變異體。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之N蛋白、其片段或變異體及SARS-CoV-2之E蛋白、其片段或變異體。編碼SARS-CoV-2之兩種不同結構蛋白、其片段或變異體的核酸疫苗亦可包括信號肽及/或至少一個連接子(例如GSG連接子)序列且核酸疫苗中之一或多個序列可經密碼子最佳化。在一些實施例中，編碼核酸疫苗之SARS-CoV-2之兩種不同結構蛋白或其片段或變異體的序列構築為單一聚核苷酸。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之結構蛋白片段或其變異體之至少三種不同序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之兩種不同S蛋白、片段或變異體序列及SARS-CoV-2之M蛋白、片段或變異體序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之兩種不同S蛋白、片段或變異體序列及SARS-CoV-2之N蛋白、片段或變異體序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之兩種不同S蛋白、片段或變異體序列及SARS-CoV-2之E蛋白、片段或變異體序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之兩種不同M蛋白、片段或變異體序列及SARS-CoV-2之S蛋白、片段或變異體序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之兩種不同N蛋白、片段或變異體序列及SARS-CoV-2之S蛋白、片段或變異體序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之兩種不同E蛋白、片段或變異體序列及SARS-CoV-2之S蛋白、片段或變異體序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之兩種不同M蛋白、片段或變異體序列及SARS-CoV-2之N蛋白、片段或變異體序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之兩種不同M蛋白、片段或變異體序列及SARS-CoV-2之E蛋白、片段或變異體序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之兩種不同N蛋白、片段或變異體序列及SARS-CoV-2之M蛋白、片段或變異體序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之兩種不同N蛋白、片段或變異體序列及SARS-CoV-2之E蛋白、片段或變異體序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之兩種不同E蛋白、片段或變異體序列及SARS-CoV-2之N蛋白、片段或變異體序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之S蛋白、片段或變異體序列，SARS-CoV-2之M蛋白、片段或變異體序列，及SARS-CoV-2之N蛋白、片段或變異體序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之S蛋白、片段或變異體序列，SARS-CoV-2之M蛋白、片段或變異體序列，及SARS-CoV-2之E蛋白、片段或變異體序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之S蛋白、片段或變異體序列，SARS-CoV-2之N蛋白、片段或變異體序列，及SARS-CoV-2之E蛋白、片段或變異體序列。在一些實施例中，核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之M蛋白、片段或變異體序列，SARS-CoV-2之N蛋白、片段或變異體序列，及SARS-CoV-2之E蛋白、片段或變異體序列。編碼SARS-CoV-2之結構蛋白片段或其變異體之至少三個不同序列的核酸疫苗亦可包括信號肽及/或至少一個連接子(例如GSG連接子)序列，且核酸疫苗中之一或多個序列可經密碼子最佳化。
SARS -CoV-2 變異體
SARS-CoV-2係大冠狀病毒科的成員。已在全球範圍內鑑定出SARS-CoV-2之多種變異體(有時稱為「病毒株」或「譜系」)。本說明書中所用之SARS-CoV-2變異體的命名法與新病毒譜系的PANGO命名法一致(Rambaut, Andrew等人, A dynamic nomenclature proposal for SARS-CoV-2 lineages to assist genomic epidemiology.
Nature microbiology, 2020, 5:: 1403-1407，其內容以全文引用之方式併入本文中)。可使用Nextstrain之SARS-CoV-2分析使用者介面(nextstrain.org/ncov/global)在線訪問與PANGO SARS-CoV-2譜系或變異體相關的接近即時資料。
截至本發明，已鑑定出SARS-CoV-2之多種PANGO譜系變異體，包括以下(括號中的數字代表每個提交的PANGO譜系之病例數：A (37)；A.1 (8)；A.11 (2)；A.12 (1)；A.19 (5)；A.2 (6)；A.2.2 (9)；A.2.4 (5)；A.2.5 (12)；A.21 (8)；A.22 (1)；A.23 (2)；A.23.1 (40)；A.24 (2)；A.25 (1)；A.28 (4)；A.3 (3)；A.5 (5)；A.6 (1)；AD.2 (1)；AE.1 (1)；AE.2 (2)；AE.4 (1)；AE.5 (1)；AE.7 (1)；AE.8 (1)；AG.1 (1)；AY.1；AY.2；AY.3；B (47)；B.1 (374)；B.1.1 (237)；B.1.1.1 (40)；B.1.1.10 (2)；B.1.1.111 (2)；B.1.1.121 (1)；B.1.1.133 (2)；B.1.1.141 (5)；B.1.1.142 (6)；B.1.1.153 (6)；B.1.1.157 (1)；B.1.1.159 (3)；B.1.1.160 (1)；B.1.1.161 (1)；B.1.1.163 (8)；B.1.1.170 (1)；B.1.1.174 (1)；B.1.1.176 (2)；B.1.1.180 (1)；B.1.1.186 (2)；B.1.1.189 (4)；B.1.1.198 (2)；B.1.1.200 (1)；B.1.1.204 (2)；B.1.1.207 (6)；B.1.1.214 (22)；B.1.1.216 (9)；B.1.1.219 (1)；B.1.1.222 (32)；B.1.1.226 (1)；B.1.1.230 (1)；B.1.1.231 (4)；B.1.1.232 (1)；B.1.1.241 (1)；B.1.1.243 (1)；B.1.1.25 (26)；B.1.1.263 (2)；B.1.1.265 (1)；B.1.1.27 (6)；B.1.1.273 (1)；B.1.1.274 (7)；B.1.1.28 (34)；B.1.1.280 (3)；B.1.1.284 (5)；B.1.1.294 (7)；B.1.1.297 (1)；B.1.1.300 (1)；B.1.1.301 (1)；B.1.1.304 (1)；B.1.1.306 (5)；B.1.1.312 (3)；B.1.1.315 (2)；B.1.1.316 (4)；B.1.1.317 (8)；B.1.1.318 (1)；B.1.1.326 (1)；B.1.1.328 (3)；B.1.1.33 (14)；B.1.1.330 (6)；B.1.1.331 (1)；B.1.1.333 (4)；B.1.1.337 (2)；B.1.1.344 (2)；B.1.1.345 (1)；B.1.1.348 (29)；B.1.1.350 (1)；B.1.1.351 (2)；B.1.1.354 (7)；B.1.1.355 (2)；B.1.1.359 (2)；B.1.1.365 (1)；B.1.1.366 (1)；B.1.1.368 (1)；B.1.1.37 (1)；B.1.1.372 (2)；B.1.1.374 (5)；B.1.1.375 (9)；B.1.1.381 (1)；B.1.1.383 (1)；B.1.1.388 (1)；B.1.1.389 (17)；B.1.1.39 (3)；B.1.1.394 (3)；B.1.1.397 (4)；B.1.1.398 (2)；B.1.1.40 (2)；B.1.1.404 (1)；B.1.1.410 (3)；B.1.1.411 (3)；B.1.1.413 (3)；B.1.1.416 (6)；B.1.1.419 (2)；B.1.1.420 (4)；B.1.1.428 (2)；B.1.1.429 (2)；B.1.1.430 (1)；B.1.1.432 (8)；B.1.1.434 (1)；B.1.1.447 (1)；B.1.1.448 (2)；B.1.1.451 (1)；B.1.1.464 (2)；B.1.1.485 (1)；B.1.1.487 (5)；B.1.1.50 (16)；B.1.1.514 (2)；B.1.1.516 (2)；B.1.1.517 (1)；B.1.1.519 (106)；B.1.1.521 (1)；B.1.1.54 (2)；B.1.1.56 (1)；B.1.1.57 (1)；B.1.1.63 (7)；B.1.1.7 (534)；B.1.1.70 (10)；B.1.1.71 (1)；B.1.1.99 (1)；B.1.108 (1)；B.1.110.3 (1)；B.1.111 (29)；B.1.116 (1)；B.1.126 (2)；B.1.128 (3)；B.1.13 (1)；B.1.139 (2)；B.1.146 (1)；B.1.149 (1)；B.1.153 (2)；B.1.160 (65)；B.1.160.14 (1)；B.1.160.15 (1)；B.1.160.25 (1)；B.1.160.28 (1)；B.1.160.8 (1)；B.1.160.9 (1)；B.1.164 (2)；B.1.170 (2)；B.1.177 (71)；B.1.177.11 (1)；B.1.177.12 (1)；B.1.177.15 (1)；B.1.177.18 (1)；B.1.177.21 (7)；B.1.177.32 (4)；B.1.177.35 (1)；B.1.177.4 (1)；B.1.177.40 (2)；B.1.177.42 (1)；B.1.177.43 (1)；B.1.177.44 (2)；B.1.177.46 (3)；B.1.177.49 (1)；B.1.177.51 (1)；B.1.177.52 (3)；B.1.177.53 (1)；B.1.177.54 (2)；B.1.177.59 (1)；B.1.177.6 (1)；B.1.177.60 (23)；B.1.177.68 (1)；B.1.177.73 (6)；B.1.177.76 (1)；B.1.177.77 (1)；B.1.177.78 (1)；B.1.177.79 (1)；B.1.177.81 (5)；B.1.177.82 (1)；B.1.177.83 (1)；B.1.177.86 (3)；B.1.189 (2)；B.1.192 (7)；B.1.195 (4)；B.1.2 (222)；B.1.210 (2)；B.1.214 (6)；B.1.214.2 (1)；B.1.219 (5)；B.1.22 (3)；B.1.22.1 (16)；B.1.220 (1)；B.1.221 (27)；B.1.221.1 (1)；B.1.223 (1)；B.1.229 (1)；B.1.23 (2)；B.1.232 (1)；B.1.234 (20)；B.1.236 (3)；B.1.237 (3)；B.1.240 (7)；B.1.240.1 (14)；B.1.241 (1)；B.1.243 (34)；B.1.256 (1)；B.1.258 (61)；B.1.258.11 (1)；B.1.258.17 (17)；B.1.258.2 (1)；B.1.258.22 (1)；B.1.258.23 (1)；B.1.260 (2)；B.1.273 (1)；B.1.277 (1)；B.1.279 (1)；B.1.281 (4)；B.1.289 (1)；B.1.291 (2)；B.1.3 (1)；B.1.306 (1)；B.1.308 (1)；B.1.311 (5)；B.1.324 (1)；B.1.329 (1)；B.1.334 (1)；B.1.338 (1)；B.1.346 (1)；B.1.349 (2)；B.1.351 (199)；B.1.356 (3)；B.1.357 (1)；B.1.36 (56)；B.1.36.1 (5)；B.1.36.10 (2)；B.1.36.16 (33)；B.1.36.17 (1)；B.1.36.18 (12)；B.1.36.19 (1)；B.1.36.21 (1)；B.1.36.22 (6)；B.1.36.29 (6)；B.1.36.31 (5)；B.1.36.34 (3)；B.1.36.38 (1)；B.1.36.8 (3)；B.1.360 (1)；B.1.361 (3)；B.1.362 (8)；B.1.367 (3)；B.1.369 (12)；B.1.369.1 (1)；B.1.370 (1)；B.1.371 (1)；B.1.375 (1)；B.1.379 (1)；B.1.380 (9)；B.1.393 (1)；B.1.396 (2)；B.1.398 (11)；B.1.399 (1)；B.1.400 (4)；B.1.404 (2)；B.1.409 (5)；B.1.411 (19)；B.1.416 (16)；B.1.420 (6)；B.1.426 (1)；B.1.427 (25)；B.1.428 (4)；B.1.429 (58)；B.1.438 (4)；B.1.441 (4)；B.1.451 (1)；B.1.456 (4)；B.1.459 (15)；B.1.462 (1)；B.1.465 (1)；B.1.466 (4)；B.1.466.1 (1)；B.1.466.2 (34)；B.1.468 (7)；B.1.469 (1)；B.1.470 (11)；B.1.471 (5)；B.1.476 (1)；B.1.478 (1)；B.1.479 (1)；B.1.480 (2)；B.1.492 (1)；B.1.497 (28)；B.1.499 (24)；B.1.504 (1)；B.1.505 (1)；B.1.509 (3)；B.1.517 (6)；B.1.517.1 (16)；B.1.523 (3)；B.1.524 (21)；B.1.525 (16)；B.1.526 (8)；B.1.526.1 (6)；B.1.526.2 (2)；B.1.527 (2)；B.1.530 (9)；B.1.535 (2)；B.1.540 (1)；B.1.541 (1)；B.1.544 (8)；B.1.547 (1)；B.1.551 (1)；B.1.558 (3)；B.1.560 (1)；B.1.561 (6)；B.1.564 (2)；B.1.565 (6)；B.1.568 (3)；B.1.575 (4)；B.1.576 (1)；B.1.577 (5)；B.1.581 (1)；B.1.582 (7)；B.1.587 (1)；B.1.588 (4)；B.1.595.4 (1)；B.1.596 (17)；B.1.596.1 (1)；B.1.600 (8)；B.1.603 (2)；B.1.605 (1)；B.1.609 (6)；B. 1.617.1；B.1.617.2；B.1.617.3；B.1.619 (1)；B.1.620 (12)；B. 1. 621 (65)；B.1.67 (1)；B.1.84 (1)；B.1.91 (4)；B.1.94 (1)；B.12 (1)；B.27 (3)；B.28 (1)；B.3 (6)；B.31 (2)；B.35 (4)；B.4 (13)；B.4.1 (1)；B.4.2 (1)；B.4.6 (2)；B.4.7 (2)；B.40 (3)；B.42 (2)；B.43 (1)；B.45 (1)；B.53 (2)；B.55 (2)；B.56 (1)；B.6 (23)；B.6.3 (1)；B.6.6 (5)；B.6.7 (1)；B.6.8 (29)；C.1 (2)；C.1.1 (1)；C.11 (5)；C.12 (3)；C.13 (1)；C.14 (4)；C.16 (18)；C.17 (2)；C.18 (1)；C.2 (5)；C.2.1 (11)；C.23 (2)；C.26 (5)；C.29 (1)；C.30 (1)；C.32 (1)；C.35 (10)；C.36 (14)；C.36.1 (1)；C.36.3 (10)；C.4 (3)；C.8 (2)；C. 37 (54)；D.2 (33)；L.3 (8)；N.2 (1)；N.3 (4)；N.4 (14)；N.5 (8)；N.6 (3)；N.7 (4)；N.9 (4)；P.1 (57)；P.2 (47)；P.6 (2)；P.7 (3)；Q.1 (6), Q.3 (7)；Q.4 (2)；Q.5 (1)；Q.6 (1). Q.8 (7), R.1 (9)；S.1 (1)；U.2 (1)；U.3 (1)；W.1 (1)；Y.1 (2)；及Z.1 (1)。
自流行病學角度來看，變異體通常分類為所關注之變異體(VOC)、關注變異體(VOC)及後果嚴重的變異體(VOC)。有關將特定變異體分類為VOI、VOC或VOHC的相關資訊，參見例如cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/cases-updates/variant-surveillance/variant-info.html。
VOI可具有與受體結合的變化、針對先前感染或疫苗接種產生之抗體的中和作用降低、治療功效降低、潛在診斷影響或傳播性或疾病嚴重程度的預測增加相關的某些遺傳標記。在一些情況下，VOI具有預測會影響傳播、診斷、治療或免疫逃逸，或導致病例比例增加或獨特的爆發群的特定遺傳標記。SARS-CoV-2 VOI包括例如PANGO譜系B.1.1.7 (α)、B.1.351 (β)；B.1.427/429 (ε)；B.1.526 (ι)；B.1.525 (η)；B.1.617.1 (κ)；B.1.617.2 (δ)；B.1.621 (μ)；C37 (λ)；P.1 (γ)及P.2。
VOC可包括有證據表明傳播性增加、疾病更嚴重(住院或死亡增加)、先前感染或疫苗接種期間產生之抗體之中和作用顯著降低、治療或疫苗之有效性降低或診斷檢測失敗的變異體。在某些情況下，VOC具有影響診斷、治療及疫苗的證據；對診斷測試目標的廣泛干擾；對一或多類療法之抗性顯著增加的證據；先前感染或疫苗接種期間產生之抗體之中和作用顯著降低的證據；疫苗誘導之嚴重疾病保護降低的證據；傳播性增加的證據；或疾病嚴重程度增加的證據。SARS-CoV-2 VOC可包括例如PANGO譜系B.1.1.7 (α)、P.1 (γ)、B.1.351 (β)、B.1.427及B.1.429 (ε)、B.1.526 (ι)、B.1.525 (η)、B.1.617.1 (κ)、B.1.617.2 (δ)、B.1.621 (μ)及C37 (λ)。
VOHC可能有明確的證據表明預防措施或醫療對策(MCM)相對於先前流行的變異體已經顯著降低了有效性。在某些情況下，VOHC對醫療對策(MCM)產生影響，證明診斷失敗，有證據表明疫苗有效性顯著降低、疫苗突破病例數量高得不成比例、疫苗誘導之嚴重疾病保護極低、對多種緊急使用授權(EUA)或批准之治療劑的敏感性顯著降低、臨床疾病更嚴重及住院率增加。
本文所揭示之核酸疫苗可編碼本文所述之任一SARS-CoV-2變異體的一或多種多肽，例如一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體。在一些實施例中，本文所揭示之核酸疫苗可編碼SARS-CoV-2 VOI、VOC及/或VOHC之一或多種多肽，例如一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體。在一些實施例中，核酸疫苗編碼包含稱為D614G之特異性突變的多肽。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼一或多種多肽，該一或多種多肽包含存在於B.1.526 SARS-CoV-2變異體(亦即，ι變異體)中之一或多種突變或取代，諸如以下中之一或多者：刺突蛋白取代L5F、T95I、D253G、S477N、E484K、D614G及/或A701V；ORF1a取代L3201P、T265I及/或Δ3675/3677；ORF1b取代P314L及/或Q1011H；ORF3a取代P42L、Q57H；ORF8取代T11I；及/或5'UTR取代R81C。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼一或多種多肽，該一或多種多肽包含存在於B.1.525 SARS-CoV-2變異體(亦即，η變異體)中之一或多種突變或取代，諸如以下中之一或多者：刺突蛋白取代A67V、Δ69/70、Δ144、E484K、D614G、Q677H及/或F888L；ORF1b取代P314F；ORF1a取代T2007I；M蛋白取代I82T；N蛋白取代A12G及/或T205I；及/或5'UTR取代R81C。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼一或多種多肽，該一或多種多肽包含存在於P.2 SARS-CoV-2變異體中之一或多種突變或取代，諸如以下中之一或多者：刺突蛋白取代E484K、D614G及/或V1176F；ORF1a取代L3468V及/或L3930F；ORF1b取代P314L；N蛋白質取代A119S、R203K、G204R及/或M234I；5'UTR取代R81C。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼一或多種多肽，該一或多種多肽包含存在於B.1.1.7 SARS-CoV-2變異體(亦即，α變異體)中之一或多種突變或取代，諸如以下中之一或多者：刺突蛋白取代Δ69/70、Δ144Y、E484K、S494P、N501Y、A570D、D614G及/或P681H。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼一或多種多肽，該一或多種多肽包含存在於P.1 SARS-CoV-2變異體(亦即，γ變異體)中之一或多種突變或取代，諸如以下中之一或多者：刺突蛋白取代K417N/T、E484K、N501Y及/或D614G。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼一或多種多肽，該一或多種多肽包含存在於B.1.351 SARS-CoV-2變異體(亦即，β變異體)中之一或多種突變或取代，諸如以下中之一或多者：刺突蛋白取代K417N、E484K、N501Y及/或D614G。B.1.351變異體亦稱為南非變異體，因為其首先源於南非。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼一或多種多肽，該一或多種多肽包含存在於B.1.427 SARS-CoV-2變異體中之一或多種突變或取代，諸如以下中之一或多者：刺突蛋白取代L452R及/或D614G。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼一或多種多肽，該一或多種多肽包含存在於B.1.429 SARS-CoV-2變異體中之一或多種突變或取代，諸如以下中之一或多者：刺突蛋白取代S13I、W152C、L452R及/或D614G。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼一或多種多肽，該一或多種多肽包含存在於B.1.617.1 SARS-CoV-2變異體中之一或多種突變或取代，諸如以下中之一或多者：刺突蛋白取代G142D、E154K、L452R、E484Q、D614G、P681R及/或Q1071H。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼一或多種多肽，該一或多種多肽包含存在於B.1.617.2 SARS-CoV-2變異體(亦即，δ變異體)中之一或多種突變或取代，諸如以下中之一或多者：刺突蛋白取代T19R、T95I、G142D、Δ156/157、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R及/或D950N。在其他實施例中，核酸疫苗編碼一或多種多肽，該一或多種多肽包含存在於B.1.617.2 SARS-CoV-2變異體中之一或多種突變或取代，諸如以下中之一或多者：刺突蛋白取代V70F、A222V、W258L及/或K417N。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼一或多種多肽，該一或多種多肽包含存在於B.1.617.3 SARS-CoV-2變異體中之一或多種突變或取代，諸如以下中之一或多者：刺突蛋白取代T19R、G142D、L452R、E484Q、D614G、P681R及/或D950N。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼包含選自以下之一或多種取代及/或缺失的SARS-CoV-2刺突蛋白，例如蛋白質、肽、片段或變異體：A570D、A67V、A701V、D253G、D614G、E484K、F888L、K417N/T、L452R、L5F、N501Y、P681H、Q677H、S13I、S477N、S494P、T95I、V1176F、W152C、Δ144、Δ144Y及Δ69/70。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼包含選自以下之一或多種取代及/或缺失的SARS-CoV-2 ORF1a：L3201P、T265I、T2007I、L3468V、Δ3675-3677及L3930F。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼包含選自以下之一或多種取代的SARS-CoV-2 ORF1b：P314F、P314L及Q1011H。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼包含選自以下之一或多種取代的SARS-CoV-2 ORF3a：P42L及Q57H。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼包含T11I取代之SARS-CoV-2 ORF8。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼包含R81C取代之SARS-CoV-2 5'UTR。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼包含I82T取代之SARS-CoV-2 M蛋白，例如蛋白質、肽、片段或變異體。
在一些實施例中，核酸疫苗編碼包含選自以下之一或多種取代的SARS-CoV-2 N蛋白，例如蛋白質、肽、片段或變異體：A12G、A119S、R203K、G204R、T205I及M234I。
核酸疫苗之組分
在一些實施例中，本文所述之聚核苷酸編碼至少一種所關注多肽，例如SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體。本發明之SARS-CoV-2之蛋白質、肽、其片段或變異體可為野生型，其中其源自感染物或經修飾(例如，結構蛋白或其片段及變異體為工程化、設計或人工的)。其可具有本文所述之特徵的任何組合。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸編碼一或多種所關注肽或多肽。此類肽或多肽為SARS-CoV-2之結構蛋白或其片段或變異體，用於預防、緩解及/或治療COVID-19。作為非限制性實例，此等肽或多肽可充當抗原或抗原分子(亦較佳作為免疫原性分子)。術語「核酸」就其最廣義而言，包括任何包含核苷酸聚合物之化合物及/或物質。此等聚合物通常稱為聚核苷酸。
例示性核酸或聚核苷酸包括但不限於核糖核酸(RNA)、去氧核糖核酸(DNA)、蘇糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA，包括具有β-D-核糖組態之LNA、具有a-L-核糖組態之α-LNA (LNA之非對映異構體)、具有2'-胺基官能化之2'-胺基-LNA及具有2'-胺基官能化之2'-胺基-a-LNA)、乙烯核酸(ENA)、環己烯基核酸(CeNA)或其混雜物或組合。
在一些實施例中，活體外轉錄(IVT)酶合成方法可用於製備編碼本發明之SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體的線性聚核苷酸(稱為「IVT聚核苷酸」)。
在一些實施例中，核酸疫苗可包括「嵌合聚核苷酸」，其具有大小及/或編碼蛋白質(例如SARS-CoV-2之結構蛋白質)不同的部分或區域。「嵌合體」為具有兩個或更多個不協調或異質部分或區域的實體。如本文所用，聚核苷酸之「部分」或「區域」定義為聚核苷酸中任何小於聚核苷酸之整個長度的部分。
在一些實施例中，核酸疫苗包括長度為約30至約100,000個核苷酸的聚核苷酸(例如30至50、30至100、30至250、30至500、30至1,000、30至1,500、30至3,000、30至5,000、30至7,000、30至10,000、30至25,000、30至50,000、30至70,000、100至250、100至500、100至1,000、100至1,500、100至3,000、100至5,000、100至7,000、100至10,000、100至25,000、100至50,000、100至70,000、100至100,000、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至3,000、500至5,000、500至7,000、500至10,000、500至25,000、500至50,000、500至70,000、500至100,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至3,000、1,000至5,000、1,000至7,000、1,000至10,000、1,000至25,000、1,000至50,000、1,000至70,000、1,000至100,000、1,500至3,000、1,500至5,000、1,500至7,000、1,500至10,000、1,500至25,000、1,500至50,000、1,500至70,000、1,500至100,000、2,000至3,000、2,000至5,000、2,000至7,000、2,000至10,000、2,000至25,000、2,000至50,000、2,000至70,000及2,000至100,000個核苷酸)。
在一些實施例中，核酸疫苗包括至少一種編碼至少一種所關注肽或多肽之聚核苷酸。在另一實施例中，聚核苷酸可為非編碼的。
在一些實施例中，編碼核酸疫苗之聚核苷酸之至少一種所關注肽或多肽之區域的長度為大於約30個核苷酸(例如至少或大於約35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500及3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或至多且包括100,000個核苷酸)。如本文所用，此類區域可稱為「編碼區」或「區域編碼」。
在一些實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸為或充當信使RNA (mRNA)。如本文所用，術語「信使RNA (mRNA)」係指編碼至少一種所關注肽或多肽且能夠轉譯以在活體外、活體內、原位或離體產生編碼之所關注肽或多肽的任何聚核苷酸。
核酸疫苗之聚核苷酸區域之最短長度可為足以編碼二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽或十肽之核酸序列之長度。在另一實施例中，該長度可足以編碼2-30個胺基酸，例如5-30、10-30、2-25、5-25、10-25或10-20個胺基酸之肽。該長度可足以編碼至少11、12、13、14、15、17、20、25或30個胺基酸之肽，或不長於40個胺基酸，例如不長於35、30、25、20、17、15、14、13、12、11或10個胺基酸之肽。聚核苷酸序列可編碼之二肽之實例或包括但不限於肌肽及甲肌肽。
用於預防、緩解及/或治療COVID-19之編碼SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體之核酸疫苗之聚核苷酸區域的長度可為大於約30個核苷酸。長度可為但不限於至少或大於約30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500及3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或至多且包括100,000個核苷酸。在一些實施例中，該區域包括約30至約100,000個核苷酸(例如30至50、30至100、30至250、30至500、30至1,000、30至1,500、30至3,000、30至5,000、30至7,000、30至10,000、30至25,000、30至50,000、30至70,000、100至250、100至500、100至1,000、100至1,500、100至3,000、100至5,000、100至7,000、100至10,000、100至25,000、100至50,000、100至70,000、100至100,000、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至3,000、500至5,000、500至7,000、500至10,000、500至25,000、500至50,000、500至70,000、500至100,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至3,000、1,000至5,000、1,000至7,000、1,000至10,000、1,000至25,000、1,000至50,000、1,000至70,000、1,000至100,000、1,500至3,000、1,500至5,000、1,500至7,000、1,500至10,000、1,500至25,000、1,500至50,000、1,500至70,000、1,500至100,000、2,000至3,000、2,000至5,000、2,000至7,000、2,000至10,000、2,000至25,000、2,000至50,000、2,000至70,000及2,000至100,000個核苷酸)。
mRNA組分
本文所述之核酸疫苗可為mRNA疫苗。mRNA疫苗包括至少一個mRNA分子，其在轉譯時產生至少一種所關注肽或多肽，用於預防、緩解及/或治療COVID-19。一般而言，mRNA分子總體上包括至少編碼區、5'非轉譯區(UTR)、3' UTR、5'端帽及poly-A尾。
mRNA 組分：起始密碼子及終止密碼子
在一些實施例中，mRNA包括起始轉譯之區域。此區域可包括任何轉譯起始序列或信號，包括起始密碼子。作為非限制性實例，該區域包括起始密碼子。在一些實施例中，起始密碼子可為「ATG」、「ACG」、「AGG」、「ATA」、「ATT」、「CTG」、「GTG」、「TTG」、「AUG」、「AUA」、「AUU」、「CUG」、「GUG」或「UUG」。
在一些實施例中，mRNA包括終止轉譯之區域。此區域可包括任何轉譯終止序列或信號，包括終止密碼子。作為非限制性實例，該區域包括終止密碼子。在一些實施例中，終止密碼子可為「TGA」、「TAA」、「TGA」、「TAG」、「UGA」、「UAA」、「UGA」或「UAG」。
在一些實施例中，起始或終止轉譯之區域的長度可獨立地在3至40，例如5-30、10-20、15或至少4，或30個或更少個核苷酸範圍內。另外，除起始及/或終止密碼子以外，此等區域亦可包含一或多個信號及/或限制序列。
在一些實施例中，掩蔽劑可用於掩蔽第一起始密碼子或替代起始密碼子以增加轉譯將在經掩蔽起始密碼子或替代起始密碼子下游之起始密碼子或替代起始密碼子上起始的機率。
在一些實施例中，可自聚核苷酸序列移除起始密碼子以使聚核苷酸之轉譯在並非起始密碼子之密碼子上開始。聚核苷酸之轉譯可在移除之起始密碼子之後的密碼子上或在下游起始密碼子或替代起始密碼子上開始。移除起始密碼子之聚核苷酸序列可進一步包含至少一種用於下游起始密碼子及/或替代起始密碼子之掩蔽劑，以便控制或嘗試控制轉譯之起始、聚核苷酸之長度及/或聚核苷酸之結構。
mRNA 組分： 編碼區域
在一些實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸之編碼區可編碼至少一種所關注肽或多肽。所關注肽或多肽之非限制性實例包括SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體，用於預防、緩解及/或治療COVID-19。
mRNA 組分：非轉譯區
本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸可包含一或多個充當或用作非轉譯區(UTR)之區域或部分。基因之野生型UTR經轉錄但未經轉譯。在mRNA中，5 'UTR在轉錄起點處開始且繼續至起始密碼子，但不包括起始密碼子；而3' UTR緊接在終止密碼子之後開始且繼續直至轉錄終止信號。儘管不希望受理論束縛，但UTR可在核酸分子之穩定性及轉譯以及轉譯方面有作用。可利用UTR之變異體，其中一或多個核苷酸被添加或移除至末端，包括A、T、C或G。
在一些實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸之UTR的長度可獨立地在15-1,000個核苷酸範圍內(例如大於30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800及900個核苷酸或至少30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900及1,000個核苷酸)。
野生型5' UTR包括在轉譯起始中起作用的特徵，因為此等5' UTR包括諸如Kozak序列之類的序列，已知該等序列涉及核糖體如何啟動許多基因的轉譯。亦已知5' UTR形成涉及延長因子結合之二級結構。其他非UTR序列(例如內含子或內含子序列之部分)亦可用作可增加蛋白質產量以及聚核苷酸含量的區域或子區。
已知天然或野生型3' UTR具有嵌入其中之腺苷及尿苷伸長段。此等富AU標籤在周轉率較高之基因中尤其普遍。富3' UTR AU元件(ARE)之引入、移除或修飾可用於調節核酸疫苗之聚核苷酸的穩定性。
來自任何基因之UTR可併入至核酸疫苗之聚核苷酸的區域中。或者，並非野生型區域之變異體的人工UTR亦可用於核酸疫苗之聚核苷酸中。此等UTR或其部分之置放取向可與其所選自之轉錄本中相同，或其取向或位置可變化。如本文所用，術語「改變」在與UTR序列有關時，意謂UTR已相對於參考序列以某種方式進行變化。作為非限制性實例，5'或3' UTR可倒置、縮短伸長，由來自不同親本序列之一或多個其他5' UTR或3' UTR進行。
在一些實施例中，側接區域係選自蛋白質具有共同功能、結構、特性特徵的轉錄本家族。舉例而言，所關注多肽可屬於在特定細胞、組織中或在發育期間之某一時間表現的蛋白質家族。來自任何此等基因之UTR可與相同或不同蛋白質家族子任何其他UTR交換以產生新的聚核苷酸。如本文所用，「蛋白質家族」在最廣泛的意義上用於指共用至少一種功能、結構、特徵、定位、起源或表現模式的一組兩種或更多種所關注多肽。
本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含具有SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之序列的5'UTR。在一些實施例中，本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸的5' UTR由SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之核酸序列組成。在一些實施例中，5'UTR直接在編碼核酸疫苗之SARS-CoV-2多肽之序列之起始密碼子的5'。在一些實施例中，5'UTR與編碼核酸疫苗之SARS-CoV-2多肽之序列之起始密碼子的5'相距1、2、3、4、5、6個或更多個核苷酸；例如1、2、3、4、5、6個或更多個核苷酸之間隔序列將5'UTR與編碼核酸疫苗之SARS-CoV-2多肽之序列之起始密碼子隔開。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含5'UTR，該5'UTR具有與SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之核酸序列具有至少80%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含5'UTR，該5'UTR具有與SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之核酸序列具有至少85%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含5'UTR，該5'UTR具有與SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之核酸序列具有至少90%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含5'UTR，該5'UTR具有與SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之核酸序列具有至少91%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含5'UTR，該5'UTR具有與SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之核酸序列具有至少92%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含5'UTR，該5'UTR具有與SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之核酸序列具有至少93%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含5'UTR，該5'UTR具有與SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之核酸序列具有至少94%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含5'UTR，該5'UTR具有與SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之核酸序列具有至少95%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含5'UTR，該5'UTR具有與SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之核酸序列具有至少96%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含5'UTR，該5'UTR具有與SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之核酸序列具有至少97%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含5'UTR，該5'UTR具有與SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之核酸序列具有至少98%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含5'UTR，該5'UTR具有與SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之核酸序列具有至少99%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含5'UTR，該5'UTR具有與SEQ ID NO: 13 (DNA)或SEQ ID NO: 47 (RNA)之核酸序列具有至少100%序列一致性的序列。
本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含具有SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之序列的3'UTR。在一些實施例中，本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸的3' UTR由SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之核酸序列組成。在一些實施例中，3'UTR直接在編碼核酸疫苗之SARS-CoV-2多肽之序列之起始密碼子的3'。在一些實施例中，3'UTR與編碼核酸疫苗之SARS-CoV-2多肽之序列之起始密碼子的3'相距1、2、3、4、5、6個或更多個核苷酸；例如1、2、3、4、5、6個或更多個核苷酸之間隔序列將3'UTR與編碼核酸疫苗之SARS-CoV-2多肽之序列之起始密碼子隔開。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之核酸序列具有至少80%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之核酸序列具有至少85%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之核酸序列具有至少90%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之核酸序列具有至少91%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之核酸序列具有至少92%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之核酸序列具有至少93%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之核酸序列具有至少94%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之核酸序列具有至少95%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之核酸序列具有至少96%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之核酸序列具有至少97%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之核酸序列具有至少98%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之核酸序列具有至少99%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 14 (DNA)或SEQ ID NO: 48 (RNA)之核酸序列具有至少100%序列一致性的序列。
本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含具有SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之序列的3'UTR。在一些實施例中，本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸的3' UTR由SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之核酸序列組成。在一些實施例中，3'UTR直接在編碼核酸疫苗之SARS-CoV-2多肽之序列之起始密碼子的3'。在一些實施例中，3'UTR與編碼核酸疫苗之SARS-CoV-2多肽之序列之起始密碼子的3'相距1、2、3、4、5、6個或更多個核苷酸；例如1、2、3、4、5、6個或更多個核苷酸之間隔序列將3'UTR與編碼核酸疫苗之SARS-CoV-2多肽之序列之起始密碼子隔開。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之核酸序列具有至少80%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之核酸序列具有至少85%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之核酸序列具有至少90%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之核酸序列具有至少91%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之核酸序列具有至少92%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之核酸序列具有至少93%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之核酸序列具有至少94%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之核酸序列具有至少95%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之核酸序列具有至少96%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之核酸序列具有至少97%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之核酸序列具有至少98%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之核酸序列具有至少99%序列一致性的序列。本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含3'UTR，該3'UTR具有與SEQ ID NO: 52 (DNA)或SEQ ID NO: 53 (RNA)之核酸序列具有至少100%序列一致性的序列。
mRNA 組分： Cap 及 IRES 序列
在一些實施例中，本文所揭示之核酸疫苗之聚核苷酸可包含5'端帽結構。天然mRNA之5'端帽結構參與核輸出，增加mRNA穩定性且結合mRNA端帽結合蛋白(CBP)，該蛋白經由CBP與poly(A)結合蛋白締合形成成熟環狀mRNA物種而負責mRNA在細胞中的穩定性及轉譯能力。端帽進一步有助於在mRNA剪接期間移除5'近端內含子移除。
在一些實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸之5'末端加端帽區可包含單個端帽或形成該端帽之一系列核苷酸。加端帽區之長度可為1至10個，例如2-9、3-8、4-7、1-5、5-10或至少2個，或10個或更少個核苷酸。在一些實例中，加端帽區可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在一些實施例中，端帽不存在。
在一些實施例中，本文中亦稱為合成端帽類似物、化學端帽、化學端帽類似物或結構性或功能性端帽類似物的端帽類似物可用於核酸疫苗。端帽類似物可為化學(例如非酶)或酶合成的，化學結構與天然(例如內源性、野生型或生理性) 5'-端帽不同，但其保留端帽功能。
在一些實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸之5'端端帽可包括內源性端帽或端帽類似物。作為非限制性實例，5'端端帽可包含鳥嘌呤類似物。適用之鳥嘌呤類似物包括但不限於肌苷、N1-甲基-鳥苷(m1G)、2'氟-鳥苷、7-去氮-鳥苷、8-側氧基-鳥苷、2-胺基-鳥苷、LNA-鳥苷及2-疊氮基-鳥苷。
熟習此項技術者應瞭解，5'加端帽可經由酶或其他合成方法產生。內源性mRNA分子為5'-端加端帽的，在末端鳥苷端帽殘基與mRNA分子之5'-末端轉錄之有義核苷酸之間產生5'-ppp-5'-三磷酸鍵。此5'-鳥苷酸端帽可接著經甲基化以產生N7-甲基-鳥苷酸殘基。mRNA之5'端之末端及/或前末端轉錄之核苷酸的核糖可視情況亦經2'-O-甲基化。經由水解及裂解鳥苷酸端帽結構進行之5'-脫端帽可靶向核酸分子，諸如mRNA分子，以進行降解。
本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸，例如mRNA可經修飾以包括不可水解的端帽結構，從而防止脫端帽且因此增加mRNA半衰期。由於端帽結構水解需要裂解5'-ppp-5'磷酸二酯鍵，因此可在加端帽反應期間使用經修飾之核苷酸。舉例而言，購自例如New England Biolabs (Ipswich, MA)之痘瘡病毒加端帽酶可根據製造商說明書用於α-硫基-鳥苷核苷酸，以在5'-ppp-5'端帽中產生硫代磷酸酯鍵。可使用額外經修飾鳥苷核苷酸，諸如α-甲基-膦酸酯及硒基-磷酸酯核苷酸。
額外修飾包括但不限於糖環之2'-羥基上之mRNA之5'-末端及/或5'前末端核苷酸之核糖的2'-O-甲基化(如上所述)。多個獨特5'-端帽結構可用於產生核酸分子，諸如mRNA分子之5'-端帽。
在本文中亦稱為合成端帽類似物、化學端帽、化學端帽類似物或結構性或功能性端帽類似物之端帽類似物在其化學結構方面不同於天然(亦即，內源性、野生型或生理性) 5'-端帽，同時保留端帽功能。端帽類似物可化學(例如非酶)或酶合成且連接至核酸分子，諸如mRNA分子。
舉例而言，抗反向端帽類似物(ARCA)端帽含有兩個由5'-5'-三磷酸基團連接之鳥嘌呤，其中一個鳥嘌呤含有N7甲基以及3'-O-甲基(亦即，N7,3'-O-二甲基-鳥苷-5'-三磷酸-5'-鳥苷(m7G-3'mppp-G；其可等效地指定為3' O-Me-m7G(5')ppp(5')G)。另一未修飾之鳥嘌呤的3'-O原子與加端帽核酸分子(例如mRNA)之5'-末端核苷酸連接。N7-及3'-O-甲基化鳥嘌呤提供加端帽核酸分子(例如mRNA)之末端部分。
另一例示性端帽為mCAP，其類似於ARCA但在鳥苷上具有2'-O-甲基(亦即，N7,2'-O-二甲基-鳥苷-5'-三磷酸-5'-鳥苷、m7Gm-ppp-G)。
儘管端帽類似物允許在活體外轉錄反應對核酸分子伴隨加端帽，但高達20%之轉錄本可保持未加端帽。此連同端帽類似物與內源性5'-端帽結構的結構差異可導致轉譯能力降低及細胞穩定性降低。
在本發明之例示性態樣中，聚核苷酸(例如mRNA)可使用酶在轉錄後加端帽。舉例而言，重組痘瘡病毒加端帽酶及重組2'-O-甲基轉移酶可在mRNA之5'-末端核苷酸與鳥嘌呤端帽核苷酸之間產生典型5'-5'-三磷酸鍵，其中端帽鳥嘌呤含有N7甲基化且mRNA之5'-末端核苷酸含有2'-O-甲基。此類結構稱為Cap 1結構。在一些實施例中，相比於例如此項技術中已知之其他5'端帽類似物結構，Cap 1結構提供更高的轉譯能力及細胞穩定性及降低的細胞促炎性細胞介素活化。Cap結構包括7mG(5')ppp(5')N,pN2p (Cap 0)、7mG(5')ppp(5')N1mpNp (Cap 1)及7mG(5')-ppp(5')N1mpN2mp (Cap 2)。
在一個實施例中，本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸包含Cap 1結構。
由於聚核苷酸，例如mRNA可在轉錄後加端帽，且由於此過程更高效，因此多達100%的聚核苷酸，例如mRNA可經加端帽。此與端帽類似物在活體外轉錄反應過程中連接至mRNA時的約80%形成對比。
在一些實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸可含有內部核糖體進入位點(IRES)序列。雖然不希望受理論束縛，但IRES在不存在5'端帽結構之情況下引發蛋白質合成中發揮重要作用。IRES可充當唯一核糖體結合位點，或可充當mRNA之多個核糖體結合位點之一。
mRNA 組分：加尾區
在一些實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸，例如mRNA包括加尾區。加尾區之非限制性實例包括poly-A序列、poly-C序列及/或polyA-G四聯體。
在一些實施例中，mRNA包括鏈終止核苷。鏈終止核苷之非限制性實例包括2'-O甲基、F及鎖核酸(LNA)。
在一些實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸之加尾區的序列的長度範圍可為不存在至500個核苷酸(例如至少60、70、80、90、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500個核苷酸)。若加尾區為poly-A尾，則長度可以poly-A結合蛋白結合的單位或作為poly-A結合蛋白結合的函數來描述。
在一些實施例中，poly-A尾亦可在構築體自核輸出之後添加。
在一些實施例中，可在RNA加工期間將腺嘌呤核苷酸之長鏈(poly-A尾)添加至聚核苷酸(諸如mRNA分子)以增加穩定性。緊接在轉錄之後，轉錄本之3'端可經裂解以釋放3'羥基。接著，poly-A聚合酶將腺嘌呤核苷酸鏈添加至RNA。稱為聚腺苷酸化之過程添加poly-A尾，該poly-A尾之長度可為例如約80至約250個殘基，包括長度為約80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250個殘基。
在一些實施例中，poly-A尾(當存在時)之長度為大於30個核苷酸(例如至少或大於約30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500及3,000個核苷酸)。在一些實施例中，其poly-A尾區包括約30至約3,000個核苷酸(例如30至50、30至100、30至250、30至500、30至750、30至1,000、30至1,500、30至2,000、30至2,500、50至100、50至250、50至500、50至750、50至1,000、50至1,500、50至2,000、50至2,500、50至3,000、100至500、100至750、100至1,000、100至1,500、100至2,000、100至2,500、100至3,000、500至750、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至2,500、500至3,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至2,500、1,000至3,000、1,500至2,000、1,500至2,500、1,500至3,000、2,000至3,000、2,000至2,500及2,500至3,000個核苷酸)。
在一些實施例中，poly-A尾之長度為約99個核苷酸(SEQ ID NO: 44)。
在一些實施例中，poly-A尾係相對於整個聚核苷酸的長度或聚核苷酸之特定區域的長度設計。此設計可基於編碼區之長度、特定特徵或區域之長度或基於自聚核苷酸表現之最終產物之長度。
在此情形下，poly-A尾之長度可比聚核苷酸或其特徵大10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。poly-A尾亦可設計為其所屬之聚核苷酸的一部分。在此情形下，poly-A尾可為構築體之總長度、構築體區域或構築體之總長度減去poly-A尾的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%或更大。另外，poly-A結合蛋白之工程化結合位點及聚核苷酸結合可增強表現。
信號序列
在一些實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸亦可編碼額外特徵，該等特徵可促進將多肽運輸至治療相關位點。有助於蛋白質運輸之一種此類特徵為信號序列。如本文所用，「信號序列」或「信號肽」分別係長度為約9至200個核苷酸(3-60個胺基酸)的聚核苷酸或多肽，其分別併入編碼區之5'末端或編碼之N端多肽。在一些實施例中，添加此等序列使得經由一或多種分泌途徑將編碼之多肽運輸至內質網。在轉運蛋白質之後，藉由信號肽酶使一些信號肽自蛋白質上裂解。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸包括包含SEQ ID NO: 45 (DNA)或SEQ ID NO: 49 (RNA)之信號序列。
密碼子最佳化
核酸疫苗之聚核苷酸、其區域或部分或子區可經密碼子最佳化。密碼子最佳化方法為此項技術中已知的且可適用於努力達成若干目標中之一或多者。此等目標包括但不限於匹配目標生物體及宿主生物體中的密碼子頻率以確保正確摺疊；改變GC含量以增加mRNA穩定性或減少二級結構；最大限度地減少可能損害基因構築或表現之串聯重複密碼子或鹼基運行；定製轉錄及轉譯控制區；插入或移除蛋白質運輸序列；移除/添加編碼蛋白質中的轉譯後修飾位點(例如醣基化位點)；添加、移除或改組蛋白質域；插入或缺失限制位點；修改核糖體結合位點及mRNA降解位點；調節轉譯速率以允許蛋白質的各個域恰當摺疊；或減少或消除聚核苷酸內有問題的二級結構。密碼子最佳化工具、演算法及服務為此項技術中已知，非限制性實例包括但不限於來自GeneArt (Life Technologies)、DNA2.0 (Menlo Park Calif.)及/或專用方法的服務。在一些實施例中，ORF序列使用最佳化算法最佳化。各胺基酸之密碼子選擇在表4中給出。
表4. 密碼子選擇
| 單字母命名法 | 胺基酸名稱 | 密碼子選擇 |
| A | 丙胺酸 | GCT、GCC、GCA、GCG |
| C | 半胱胺酸 | TGT、TGC |
| D | 天冬胺酸 | GAT、GAC |
| E | 麩胺酸 | GAA、GAG |
| F | 苯丙胺酸 | TTT、TTC |
| G | 甘胺酸 | GGT、GGC、GGA、GGG |
| H | 組胺酸 | CAT、CAC |
| I | 異白胺酸 | ATT、ATC、ATA |
| K | 離胺酸 | AAA、AAG |
| L | 白胺酸 | CTT、CTC、CTA、CTG、TTA、TTG |
| M | 甲硫胺酸 | ATG |
| N | 天冬醯胺 | AAT、AAC |
| P | 脯胺酸 | CCT、CCC、CCA、CCG |
| Q | 麩醯胺酸 | CAA、CAG |
| R | 精胺酸 | CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG |
| s | 絲胺酸 | TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC |
| Sec | 硒半胱胺酸 | 在硒半胱胺酸插入元件(SECTS)存在下之mRNA中的UGA |
| 終止 | 終止密碼子 | TAA、TAG、TGA |
| T | 蘇胺酸 | ACT、ACC、AC A、ACG |
| V | 纈胺酸 | GTT、GTC、GTA、GTG |
| w | 色胺酸 | TGG |
| γ | 酪胺酸 | TAT、TAC |
在一些實施例中，核酸疫苗在密碼子最佳化之後載體化。載體之非限制性實例包括但不限於質體、病毒、黏質體及人工染色體。
修飾
本發明之核酸疫苗(包括mRNA疫苗)可包括一或多種修飾。術語「修飾」或適當時「經修飾」係指對A、G、U或C核糖核苷酸之修飾。一般而言，本文中，此等術語並不意欲指天然存在之5'-末端mRNA端帽部分中的核糖核苷酸修飾。在多肽中，術語「修飾」係指相比於20個胺基酸之標準組的修飾。
如本文所述，「核苷」定義為含有糖分子(例如戊醣或核糖)或其衍生物與有機鹼(例如嘌呤或嘧啶)或其衍生物(「核鹼基」)之組合的化合物。如本文所述，「核苷酸」定義為包括磷酸基或其他主鏈鍵(核苷間鍵)之核苷。
修飾可為各種不同修飾。在一些實施例中，編碼區、非轉譯區、側接區及/或末端或加尾區可含有一個、兩個或更多個(視情況不同的)核苷或核苷酸修飾。在一些實施例中，本發明之核酸疫苗包含一或多種修飾，與未修飾之聚核苷酸相比，該等修飾使得核酸分子在引入至細胞時對細胞中之降解更具抗性及/或在細胞中更穩定。
本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸可包括任何有用的修飾，諸如對糖、核鹼基或核苷間鍵(例如對連接磷酸酯/磷酸二酯鍵/磷酸二酯主鏈)之修飾。嘧啶核鹼基之一或多個原子可例如經視情況經取代之胺基、視情況經取代之硫醇、視情況經取代之烷基(例如甲基或乙基)、視情況經取代之鹵基(例如氯或氟)原子或基團置換或取代。在某些實施例中，修飾(例如一或多個修飾)存在於糖及核苷間鍵中之每一者中。根據本發明之修飾可為核糖核酸(RNA)修飾成去氧核糖核酸(DNA)、蘇糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)或其混雜物。本文描述了額外修飾。
在一些實施例中，修飾包括經2'-O-甲基修飾或經2'-O-甲氧基乙基修飾之核苷酸(分別為2'-OMe及2'-MOE修飾)。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸可包含至少一個本文所述之修飾。
本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸可包括對糖、核鹼基及/或核苷間鍵之修飾的組合。
可用於本發明之疫苗的聚核苷酸(例如RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)修飾包括但不限於如PCT公開案WO2017070626中所述之任何修飾，該案之內容以全文引用之方式併入本文中，包括例如編碼經轉譯多肽中之一或多個N-連接醣基化位點之核苷酸(或密碼子)的修飾或缺失。可用於本發明之疫苗的修飾亦可包含如PCT公開案WO2018200892中所述之任何修飾，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。本發明之疫苗可進一步包含如PCT專利申請公開案WO2020255063、WO2020182869、WO2016011222、WO2016011226、WO2016005004、WO2016000792、WO2015176737、WO2015085318、WO2015048744及WO2015034925，以及美國專利申請公開案US20200254086、US20200206362、US20180311336及US20180303929中所述之特徵或修飾；該等公開案之內容各自以全文引用之方式併入本文中。
例如，包括本文所述之核酸疫苗之mRNA分子的聚核苷酸可包括如下修飾。聚核苷酸之核苷間鍵可經部分或完全修飾。聚核苷酸可包含對一或多個核鹼基之修飾。聚核苷酸可包含5-甲基胞嘧啶替代所有胞嘧啶核鹼基/胞苷核苷酸。此外，聚核苷酸可具有對核苷之一或多個糖次單元的一或多種修飾。糖修飾可為一或多種鎖核酸(LNA)或2'-O-甲氧基乙基修飾之(「2'-MOE」)修飾。聚核苷酸可設計成具有糖、核鹼基或鍵修飾之圖案化陣列。在一些實施例中，聚核苷酸可包含使穩定性最大化的修飾。在一些實施例中，聚核苷酸可完全經2'-MOE-糖修飾。
經修飾之核鹼基
經修飾之核苷及核苷酸可包括經修飾之核鹼基。見於RNA中之核鹼基之實例包括但不限於腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶。見於DNA中之核鹼基之實例包括但不限於腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶。
在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之尿嘧啶。具有經修飾之尿嘧啶的例示性核鹼基及核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核苷、5-氮雜-尿苷、6-氮雜-尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-尿苷(s
2U)、4-硫基-尿苷(s
4U)、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羥基-尿苷(ho
5U)、5-胺基烯丙基-尿苷、5-鹵基-尿苷(例如5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m
3U)、5-甲氧基-尿苷(mo
5U)、尿苷5-氧基乙酸(cmo
5U)、尿苷5-氧基乙酸甲酯(mcmo
5U)、5-羧甲基-尿苷(cm
5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧甲羥甲基-尿苷(chm
5U)、5-羧甲羥甲基-尿苷甲酯(mchm
5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm
5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫基-尿苷(mcm
5s
2U)、5-胺基甲基-2-硫基-尿苷(nm
5s
2U)、5-甲胺基甲基-尿苷(mnm
5U)、5-甲胺基甲基-2-硫基-尿苷(mnm
5s
2U)、5-甲胺基甲基-2-硒基-尿苷(mnm
5se
2U)、5-胺甲醯基甲基-尿苷(ncm
5U)、5-羧甲基胺基甲基-尿苷(cmnm
5U)、5-羧甲基胺基甲基-2-硫基-尿苷(cmnm
5s
2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm
5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫基-尿苷(τm
5s
2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫基-假尿苷、5-甲基-尿苷(m
5U，亦即具有核鹼基脫氧胸腺嘧啶)、1-甲基假尿苷(m
1ψ)、5-甲基-2-硫基-尿苷(m
5s
2U)、1-甲基-4-硫基-假尿苷(m
1s
4ψ)、4-硫基-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m
3ψ)、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷(D)、二氫假尿苷、5,6-二氫尿苷、5-甲基-二氫尿苷(m
5D)、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、N1-甲基-假尿苷(亦稱為1-甲基假尿苷(m
1ψ))、3-(3-胺基-3-羧丙基)尿苷(acp
3U)、1-甲基-3-(3-胺基-3-羧丙基)假尿苷(acp
3ψ)、5-(異戊烯基胺基甲基)尿苷(inm
5U)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2-硫基-尿苷(inm
5s
2U)、α-硫基-尿苷、2'-O-甲基-尿苷(Um)、5,2'-O-二甲基-尿苷(m
5Um)、2'-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫基-2'-O-甲基-尿苷(s
2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(mcm
5Um)、5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm
5Um)、5-羧甲基胺基甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm
5Um)、3,2'-O-二甲基-尿苷(m
3Um)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm
5Um)、1-硫基-尿苷、去氧胸苷、2'-F-阿糖-尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷及5-[3-(1-E-丙烯基胺基)尿苷。
在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之胞嘧啶。具有經修飾之胞嘧啶的例示性核鹼基及核苷包括5-氮雜-胞苷、6-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷(m
3C)、N4-乙醯基-胞苷(ac
4C)、5-甲醯基-胞苷(f
5C)、N4-甲基-胞苷(m
4C)、5-甲基-胞苷(m
5C)、5-鹵基-胞苷(例如5-碘-胞苷)、5-羥甲基-胞苷(hm
5C)、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫基-胞苷(s
2C)、2-硫基-5-甲基-胞苷、4-硫基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-1-去氮-假異胞苷、1-甲基-1-去氮-假異胞苷、澤布拉林(zebularine)、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫基-澤布拉林、2-硫基-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、賴西啶(k
2C)、α-硫基-胞苷、2'-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2'-O-二甲基-胞苷(m
5Cm)、N4-乙醯基-2'-O-甲基-胞苷(ac
4Cm)、N4,2'-O-二甲基-胞苷(m
4Cm)、5-甲醯基-2'-O-甲基-胞苷(f
5Cm)、N4,N4,2'-O-三甲基-胞苷(m
4 2Cm)、1-硫基-胞苷、2'-F-阿糖-胞苷、2'-F-胞苷及2'-OH-阿糖-胞苷。
在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之腺嘌呤。具有經修飾之腺嘌呤的例示性核鹼基及核苷包括2-胺基-嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基-6-鹵基-嘌呤(例如2-胺基-6-氯-嘌呤)、6-鹵基-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-胺基-6-甲基-嘌呤、8-疊氮基-腺苷、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-胺基-嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-胺基-嘌呤、7-去氮-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基-腺苷(m
1A)、2-甲基-腺嘌呤(m
2A)、N6-甲基-腺苷(m
6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺苷(ms
2m
6A)、N6-異戊烯基-腺苷(i
6A)、2-甲硫基-N6-異戊烯基-腺苷(ms
2i
6A)、N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷(io
6A)、2-甲硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷(ms
2io
6A)、N6-甘胺醯基胺基甲醯基-腺苷(g
6A)、N6-蘇胺醯基胺基甲醯基-腺苷(t
6A)、N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺基甲醯基-腺苷(m
6t
6A)、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺基甲醯基-腺苷(ms
2g
6A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m
6 2A)、N6-羥基正纈胺醯基胺基甲醯基-腺苷(hn
6A)、2-甲硫基-N6-羥基正纈胺醯基胺基甲醯基-腺苷(ms
2hn
6A)、N6-乙醯基-腺苷(ac
6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫基-腺苷、2'-O-甲基-腺苷(Am)、N6,2'-O-二甲基-腺苷(m
6Am)、N6,N6,2'-O-三甲基-腺苷(m
6 2Am)、1,2'-O-二甲基-腺苷(m
1Am)、2'-O-核糖基腺苷(磷酸)(Ar(p))、2-胺基-N6-甲基-嘌呤、1-硫基-腺苷、8-疊氮基-腺苷、2'-F-阿糖-腺苷、2'-F-腺苷、2'-OH-阿糖-腺苷及N6-(19-胺基-五氧雜十九烷基酯)-腺苷。
在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之鳥嘌呤。具有經修飾之鳥嘌呤的例示性核鹼基及核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m
1I)、懷俄苷(imG)、甲基懷俄苷(mimG)、4-去甲基-懷俄苷(imG-14)、異懷俄苷(imG2)、懷俄丁苷(yW)、過氧基懷俄丁苷(o
2yW)、羥基懷俄丁苷(OHyW)、欠修飾之羥基懷俄丁苷(OHyW*)、7-去氮-鳥苷、Q核苷(Q)、環氧Q核苷(oQ)、半乳糖基-Q核苷(galQ)、甘露糖基-Q核苷(manQ)、7-氰基-7-去氮-鳥苷(preQ
0)、7-胺基甲基-7-去氮-鳥苷(preQ
1)、古嘌苷(G
+)、7-去氮-8-氮雜-鳥苷、6-硫基-鳥苷、6-硫基-7-去氮-鳥苷、6-硫基-7-去氮-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷(m
7G)、6-硫基-7-甲基-鳥苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基-鳥苷(m
1G)、N2-甲基-鳥苷(m
2G)、N2,N2-二甲基-鳥苷(m
2 2G)、N2,7-二甲基-鳥苷(m
2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鳥苷(m
2,2,7G)、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷、1-甲基-6-硫基-鳥苷、N2-甲基-6-硫基-鳥苷、N2,N2-二甲基-6-硫基-鳥苷、α-硫基-鳥苷、2'-O-甲基-鳥苷(Gm)、N2-甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m
2Gm)、N2,N2-二甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m
2 2Gm)、1-甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m
1Gm)、N2,7-二甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m
2,7Gm)、2'-O-甲基-肌苷(Im)、1,2'-O-二甲基-肌苷(m
1Im)及2'-O-核糖鳥苷(磷酸)(Gr(p))。
核苷酸之核鹼基可獨立地選自嘌呤、嘧啶、嘌呤類似物或嘧啶類似物。舉例而言，核鹼基可各自獨立地選自腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶或次黃嘌呤。在另一實施例中，核鹼基亦可包括例如鹼基之天然存在及合成的衍生物，包括吡唑并[3,4-d]嘧啶、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶及2-硫胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵基(例如8-溴)、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基(特定言之5-溴)、5-三氟甲基及其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、去氮鳥嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、3-去氮鳥嘌呤、去氮腺嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮腺嘌呤、吡唑并[3,4-d]嘧啶、咪唑并[1,5-a]1,3,5三𠯤酮、9-去氮嘌呤、咪唑并[4,5-d]吡𠯤、噻唑并[4,5-d]嘧啶、吡𠯤-2-酮、1,2,4-三𠯤、嗒𠯤；及1,3,5三𠯤。
可在本文所述之聚核苷酸中之各種位置引入不同糖修飾、核苷酸修飾及/或核苷間鍵(例如主鏈結構)。一般熟習此項技術者應瞭解，核苷酸類似物或其他修飾可位於聚核苷酸之任何位置，使得聚核苷酸之功能實質上不降低。本發明之聚核苷酸可含有約1%至約100%經修飾之核苷酸(相對於總核苷酸含量，或相對於一或多種類型之核苷酸，亦即A、G、T/U或C中之任一或多者)或任何中間百分比(例如1%至20%、1%至25%、1%至50%、1%至60%、1%至70%、1%至80%、1%至90%、1%至95%、10%至20%、10%至25%、10%至50%、10%至60%、10%至70%、10%至80%、10%至90%、10%至95%、10%至100%、20%至25%、20%至50%、20%至60%、20%至70%、20%至80%、20%至90%、20%至95%、20%至100%、50%至60%、50%至70%、50%至80%、50%至90%、50%至95%、50%至100%、70%至80%、70%至90%、70%至95%、70%至100%、80%至90%、80%至95%、80%至100%、90%至95%、90%至100%及95%至100%)。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸可經修飾為環狀核酸。聚核苷酸之末端可藉由化學試劑或酶連接，從而產生無自由端之環狀聚核苷酸。預期環狀聚核苷酸比線性對應物更穩定且對外切核酸酶消化具有抗性。環狀聚核苷酸可進一步包含關於A、G、T/U或C核糖核苷酸/去氧核糖核苷酸之其他結構及/或化學修飾。
在一些實施例中，聚核苷酸為至少50%經修飾，例如至少50%之核苷酸經修飾。在一些實施例中，聚核苷酸為至少75%經修飾，例如至少75%之核苷酸經修飾。應理解，由於核苷酸(糖、鹼基及磷酸部分，例如鍵)可各自經修飾，因此對核苷酸或核苷之任何部分的任何修飾將構成修飾。
在一些實施例中，聚核苷酸僅在核苷酸之一種組分中至少10%經修飾，其中此類組分為核鹼基、糖或核苷之間的鍵。舉例而言，可對本文所述之聚核苷酸之核鹼基、糖或鍵的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%進行修飾。
作為非限制性實例，核酸疫苗之聚核苷酸之尿嘧啶核苷全部經修飾。該等修飾可相同或不同。在一些實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸之鳥嘌呤核苷全部經修飾。該等修飾可相同或不同。在一些實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸之鳥嘌呤核苷全部經修飾。該等修飾可相同或不同。在一些實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸之胞嘧啶核苷全部經修飾。該等修飾可相同或不同。在一些實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸之腺嘌呤核苷全部經修飾。該等修飾可相同或不同。
在本發明之一個實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸經修飾以包含N1-甲基-假尿苷核苷酸。
糖修飾
可併入聚核苷酸(例如RNA或mRNA，如本文所述)中之經修飾之核苷及核苷酸可在核糖核酸之糖上經修飾。舉例而言，2'羥基(OH)可經多個不同取代基修飾或置換。2'-位置處之例示性取代包括但不限於H、鹵基、視情況經取代之C1-6烷基；視情況經取代之C1-6烷氧基；視情況經取代之C6-10芳氧基；視情況經取代之C3-8環烷基；視情況經取代之C3-8環烷氧基；視情況經取代之C6-10芳氧基；視情況經取代之C6-10芳基-C1-6烷氧基、視情況經取代之C1-12(雜環基)氧基；糖(例如核糖、戊醣或本文所述之任何糖)；聚乙二醇(PEG)、-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，其中R為H或視情況經取代之烷基，且n為0至20 (例如0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16及4至20)之整數；「鎖」核酸(LNA)，其中2'-羥基由C1-6伸烷基或C1-6伸雜烷基橋鍵連接至相同核糖之4'-碳，其中例示性橋鍵包括亞甲基、伸丙基、醚或胺基橋鍵；胺基烷基；胺基烷氧基；胺基；及胺基酸。
在一些實施例中，聚核苷酸，諸如本文所述之核酸疫苗之mRNA包含至少一個糖修飾。一般而言，RNA包括作為具有氧之5員環之糖基核糖。例示性的非限制性經修飾之核苷酸包括置換核糖中之氧(例如，用S、Se或伸烷基，諸如亞甲基或伸乙基)；添加雙鍵(例如，以用環戊烯基或環己烯基置換核糖)；核糖之縮環(例如，以形成環丁烷或氧呾之4員環)；核糖之擴環(例如，以形成具有額外碳或雜原子之6員環或7員環，諸如無水己糖醇、阿卓糖醇(altritol)、甘露糖醇、環己烷基、環己烯基及N-𠰌啉基(亦具有胺基磷酸酯主鏈))；多環形式(例如，三環及「未鎖定」形式，諸如乙二醇核酸(GNA) (例如，R-GNA或S-GNA，其中核糖經連接至磷酸二酯鍵之乙二醇單元置換)、蘇糖核酸(TNA，其中核糖經α-L-蘇糖呋喃糖基-(3'→2')置換)及肽核酸(PNA，其中2-胺基-乙基-甘胺酸鍵置換核糖及磷酸二酯主鏈)。糖基亦可含有一或多個碳，其具有與核糖中之相應碳相反的立體化學構型。因此，如本文所述之聚核苷酸分子(包括mRNA)可包括含有例如阿拉伯糖作為糖的核苷酸。
糖修飾之非限制性實例可包括表5中提供之修飾。本發明之聚核苷酸可具有一或多個攜帶如表5中所提供之修飾的核苷酸。在一些實施例中，本文所述之聚核苷酸中之每一者攜帶如表5中所提供之修飾中之任一者，或不攜帶如表5中所提供之修飾中之任一者。
表5. 核苷酸糖修飾
| 核苷酸 | 結構描述 |
| DNA |  |
| 2'- O-甲基(2'-OMe) |  |
| 2'F-RNA |  |
| 2'F-ANA |  |
| 4'S-RNA |  |
| UNA |  |
| LNA |  |
| 4'S-FANA |  |
| 2'- O-甲氧基乙基(2'-MOE) |  |
| 2'- O-烯丙基 |  |
| 2'- O-乙胺 |  |
| 2'- O-氰基乙基 |  |
| 2'- O-縮醛酯 |  |
| 4'- C-胺甲基-2'- O-甲基RNA |  |
| 2'-疊氮基 |  |
| 亞甲基-cLNA |  |
| N-MeO-胺基BNA |  |
| N-Me-胺氧基BNA |  |
| 2',4'-BNA NC[NMe] |  |
| MC |  |
| ONA |  |
| tc-DNA |  |
| CeNA |  |
| ANA |  |
| HNA |  |
在一些實施例中，聚核苷酸之核苷酸之糖的至少一個2'位置(RNA中之OH或DNA中之H)經-OMe取代，稱為2'-OMe。在一些實施例中，聚核苷酸之核苷酸之糖的至少一個2'位置(RNA中之OH或DNA中之H)經-F取代，稱為2'-F。
核苷間鍵
本發明之聚核苷酸可包括對核苷間鍵(例如對連接磷酸酯/磷酸二酯鍵/磷酸二酯主鏈)之任何修飾。在聚核苷酸主鏈之上下文中，片語「磷酸酯」及「磷酸二酯」可互換使用。主鏈磷酸酯基可藉由用不同的取代基置換一或多個氧原子來修飾。此外，經修飾之核苷及核苷酸可包括用如本文所述之另一核苷間鍵全盤置換未經修飾之磷酸酯部分。經修飾之磷酸酯基之實例包括但不限於硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、硼烷磷酸酯(borano phosphate ester)、氫膦酸酯、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯。二硫代磷酸酯之兩個非連接氧均經硫置換。磷酸酯連接子亦可藉由用氮(橋接胺基磷酸酯)、硫(橋接硫代磷酸酯)及碳(橋接亞甲基-膦酸酯)置換連接氧而修飾。
提供經α-硫基取代之磷酸酯部分以經由非天然硫代磷酸酯主鏈鍵聯賦予RNA及DNA聚核苷酸穩定性。硫代磷酸酯DNA及RNA具有增加的核酸酶抗性，隨後在細胞環境中具有更長的半衰期。預期硫代磷酸酯連接之聚核苷酸分子亦經由細胞先天性免疫分子之較弱結合/活化而減少先天性免疫反應。
在特定實施例中，經修飾之核苷包括α-硫基-核苷(例如5'-O-(1-硫代磷酸酯)-腺苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-胞苷(α-硫基-胞苷)、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-鳥苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-尿苷或5'-O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷)。
在一些實施例中，聚核苷酸在核苷酸之間包含至少一個硫代磷酸酯鍵或甲基膦酸酯鍵。
在一些實施例中，聚核苷酸包含至少一種5'-(
E)-膦酸乙烯酯(5'-
E-VP)，一種磷酸酯模擬物作為修飾。
在本發明之一個實施例中，COVID-19之核酸疫苗之聚核苷酸(例如mRNA)可經修飾。
價數
本發明之核酸疫苗的價數可變化。「價數」係指核酸疫苗或核酸疫苗之聚核苷酸中之抗原組分的數目。核酸疫苗之抗原組分可在相同聚核苷酸上或其可在不同聚核苷酸上。在一些實施例中，核酸疫苗可為單價。在一些實施例中，核酸疫苗可為二價。在一些實施例中，核酸疫苗可為三價。在一些實施例中，核酸疫苗可為多價，其可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25種或超過25種抗原或抗原部分，諸如但不限於抗原肽。作為非限制性實例，抗原肽可為SARS-CoV-2之結構蛋白的一或多個片段或變異體。
合成酶方法 活體外轉錄酶合成
可使用活體外轉錄(IVT)系統轉錄編碼本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸的cDNA。該系統通常包含轉錄緩衝液、核苷酸三磷酸酯(NTP)、核糖核酸酶抑制劑及聚合酶。NTP可內部製造、可選自供應商或可如本文所述地合成。NTP可選自但不限於本文所述之NTP，包括天然及非天然(經修飾) NTP。聚合酶可選自但不限於T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶及聚合酶變異體。
在一些實施例中，使用DNase I酶自IVT反應移除DNA模板。消化之DNA及核苷酸接著在mRNA之oligo dT純化期間移除。此純化方法係基於mRNA之poly-A尾與poly-dT管柱床之親和力。可使用離心，但可能不需要離心來移除消化之DNA及核苷酸。在藉由逆相管柱(例如SDVB)純化以自mRNA移除雙股RNA之後，可利用超濾繼之以一或多個過濾步驟。純化後，可藉由使用PCR來量測殘餘DNA，以確認轉錄為mRNA之區域之外的質體區域的DNA已被移除。在一些實施例中，在需要產物濃縮之情況下，可使用透濾方法繼之以一或多個過濾步驟以移除任何生物負荷(例如生物分子或其他生物材料)。
任何數目之RNA聚合酶或變異體可用於本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸的合成。可藉由插入或缺失RNA聚合酶序列之胺基酸來修飾RNA聚合酶。
可藉由使用聚合酶之酶方法進行聚核苷酸或核酸合成反應。聚合酶催化聚核苷酸或核酸鏈中之核苷酸之間的磷酸二酯鍵的產生。當前已知的DNA聚合酶可基於胺基酸序列比較及晶體結構分析而分成不同家族。DNA聚合酶I (pol I)或A聚合酶家族，包括大腸桿菌之Klenow片段、芽孢桿菌DNA聚合酶I、水生棲熱菌(Taq) DNA聚合酶以及T7 RNA及DNA聚合酶為此等家族中研究最徹底的家族之一。另一大型家族為DNA聚合酶a (pol a)或B聚合酶家族，包括所有真核複製DNA聚合酶及來自噬菌體T4及RB69之聚合酶。儘管此等聚合酶家族採用類似的催化機制，但其在受質特異性、受質類似物結合效率、引子延伸之程度及速率、DNA合成模式、外切核酸酶活性及對抑制劑之敏感性方面存在差異。
固相化學合成
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗的聚核苷酸可完全或部分使用固相技術製造。聚核苷酸或核酸之固相化學合成係一種自動化方法，其中分子固定於固體支撐物上且在反應物溶液中逐步合成。洗掉雜質及過量試劑且在各步驟之後不需要純化。該過程之自動化可在電腦控制的固相合成器上進行。固相合成允許以相對較大規模快速生產聚核苷酸或核酸，使一些聚核苷酸或核酸具有商業可用性。
在一些實施例中，使用自動化固相合成，其中鏈沿3'至5'方向合成。核苷之3'端中的羥基經由化學可裂解或光可裂解連接子繫栓至固體支撐物。活化之核苷單體，諸如2'-去氧核苷(dA、dC、dG及dT)、核糖核苷(A、C、G及U)或化學修飾之核苷依序添加至支撐物結合之核苷。在合成結束時，添加諸如氨或氫氧化銨之類的裂解劑以移除所有保護基且自固體支撐物釋放聚核苷酸鏈。亦可施加光以裂解聚核苷酸鏈。產物接著可用高壓液相層析(HPLC)或電泳進一步純化。
液相化學合成
藉由依序添加單體建構嵌段來合成本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸可在液相中進行。共價鍵形成於單體之間或生長鏈之末端官能基與進入單體之間。不參與反應之官能基必須暫時保護。在添加各單體建構嵌段之後，必須在添加下一單體建構嵌段之前純化反應混合物。鏈之一端處之官能基必須脫除保護基才能與下一個單體建構嵌段反應。液相合成為費時且費力的，且無法自動化。儘管有限制，但液相合成仍可用於大規模製備短聚核苷酸。由於該系統為同質的，因此不需要大量過量的試劑且就此而言具有成本效益。
定量及純化
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸可在外泌體中或當衍生自一或多種體液時定量。如本文所用，「體液」包括周邊血液、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊髓液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考氏液(cowper's fluid)或射精前液、汗液、糞便、毛髮、淚液、囊液、胸膜及腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、膽汁、間質液、月經、膿液、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、黏膜分泌物、糞便水、胰液、竇腔灌洗液、支氣管肺抽出物、囊胚腔液及臍帶血。或者，外泌體可取自選自由以下組成之群的器官：肺、心臟、胰臟、胃、腸、膀胱、腎、卵巢、睾丸、皮膚、結腸、乳房、前列腺、腦、食道、肝及胎盤。
在外泌體定量方法中，自個體獲得不超過2 mL之樣品，且藉由尺寸排阻層析、密度梯度離心、差速離心、奈米膜超濾、免疫吸附捕獲、親和純化、微流體分離或其組合來分離外泌體。在分析中，聚核苷酸之水準或濃度可為所投與構築體之表現量、存在、不存在、截短或改變。該水準與一或多種臨床表型或與人類疾病生物標記的分析具有有利的相關性。該分析可使用構築體特異性探針、細胞計數法、qRT-PCR、即時PCR、PCR、流動式細胞測量術、電泳、質譜法或其組合進行，而外泌體可使用免疫組織化學方法，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)方法分離。亦可藉由尺寸排阻層析、密度梯度離心、差速離心、奈米膜超濾、免疫吸附捕獲、親和純化、微流體分離或其組合來分離外泌體。
此等方法使研究人員能夠即時監測剩餘或遞送之聚核苷酸的水準。此係可能的，因為本文所述之聚核苷酸由於結構修飾而不同於內源形式。
在一些實施例中，可使用諸如但不限於紫外線可見光譜法(UV/Vis)之方法來定量聚核苷酸。UV/Vis光譜儀之非限制性實例為NANODROP®光譜儀(ThermoFisher, Waltham, Mass.)。可分析定量之聚核苷酸以確定聚核苷酸是否可具有合適的大小，檢查聚核苷酸未發生降解。聚核苷酸降解可藉由諸如但不限於以下之方法檢查：瓊脂糖凝膠電泳；基於HPLC之純化方法，諸如但不限於強陰離子交換HPLC、弱陰離子交換HPLC、逆相HPLC (RP-HPLC)及疏水相互作用HPLC (HIC-HPLC)；液相層析-質譜法(LCMS)；毛細管電泳(CE)；及毛細管凝膠電泳(CGE)。
本文所述之核酸疫苗之聚核苷酸的純化可包括但不限於聚核苷酸清理、品質保證及品質控制。清理可藉由此項技術中已知之方法進行，諸如但不限於AGEN-COURT®珠粒(Beckman Coulter Genomics, Danvers, Mass.)、poly-T珠粒、LNA™ oligo-T捕獲探針(EX- IQON® Inc, Vedbaek, Denmark)或基於HPLC之純化方法，諸如但不限於強陰離子交換HPLC、弱陰離子交換HPLC、逆相HPLC (RP-HPLC)及疏水相互作用HPLC (HIC-HPLC)。術語「純化的」當與聚核苷酸關聯使用時，諸如「純化的聚核苷酸」係指與至少一種污染物分離的聚核苷酸。如本文所用，「污染物」為使另一者不合適、不純或較差的任何物質。因此，純化的聚核苷酸(例如，DNA及RNA)以不同於其在自然界中發現的形式或設定存在，或以與在對其進行處理或純化方法之前存在的形式或設定不同的形式或設定存在。
品質保證及/或品質控制檢查可使用諸如但不限於凝膠電泳、UV吸光度或分析型HPLC之方法進行。
III. 醫藥組合物及遞送
本文所述之核酸疫苗可用作治療劑或預防劑。在一些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含至少一種醫藥學上可接受之載劑及核酸疫苗，亦即用於COVID-19之核酸疫苗。因此，包含本文所述之核酸疫苗的醫藥組合物可用於預防、緩解及/或治療COVID-19。
本文提供可與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑組合使用的核酸疫苗及其醫藥組合物。醫藥組合物可視情況包含一或多種額外活性物質，例如治療性及/或預防性活性物質。本文所述之核酸疫苗之醫藥組合物可為無菌及/或無熱原質的。
在一些實施例中，向人類、人類患者或個體投與組合物。出於本發明之目的，片語「活性成分」通常係指如本文所述遞送之核酸疫苗或其中所含之聚核苷酸，例如編碼SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體的聚核苷酸，用於預防、緩解及/或治療COVID-19。
儘管本文中所提供之醫藥組合物之說明主要針對適用於向人類投與之醫藥組合物，但熟習此項技術者應理解，此類組合物通常適用於向任何其他動物投與，例如向非人類動物，例如非人類哺乳動物投與。應充分理解，為使組合物適用於向各種動物投與，對適用於向人類投與之醫藥組合物進行修改，且一般熟練的獸醫藥理學家可僅用一般實驗(若存在)設計及/或進行此類修改。醫藥組合物之投與所涵蓋的個體包括但不限於人類及/或其他靈長類動物；哺乳動物，包括商業相關之哺乳動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、貓、狗、小鼠及/或大鼠；及/或禽類，包括商業相關之禽類，諸如家禽、雞、鴨、鵝及/或火雞。
調配物
醫藥調配物可另外包含醫藥學上可接受之賦形劑，其如本文所用，包括但不限於任何及所有適合於所需特定劑型之溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體媒劑、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等張劑、增稠或乳化劑、防腐劑及其類似物。用於調配醫藥組合物之各種賦形劑及用於製備該組合物之技術為此項技術中已知的(參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006；以全文引用之方式併入本文中)。除非任何習知載劑介質與物質或其衍生物不相容，諸如產生任何不良生物效應或另外以有害方式與醫藥組合物之任何其他組分相互作用，否則本發明之範疇內可涵蓋使用習知賦形劑介質。
本文所描述之醫藥組合物的調配物可藉由藥理學技術中已知或此後研發之任何方法來進行製備。一般而言，此類製備方法包括以下步驟：使活性成分與賦形劑及/或一或多種其他附屬成分結合，且隨後視需要及/或期望地將產物分割、塑形及/或封裝成所需單劑量或多劑量單元。
根據本發明之醫藥組合物可以批量、以單個單位劑量形式及/或以複數個單個單位劑量形式製備、封裝及/或出售。如本文所用，「單位劑量」為包含預定量之活性成分之醫藥組合物的離散量。活性成分之量通常等於將向個體投與之活性成分之劑量及/或此劑量之適宜分數，諸如此類劑量之一半或三分之一。
根據本發明之醫藥組合物中活性成分、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何額外成分之相對量將視治療之個體之身分、體型及/或病狀且進一步視組合物投與之途徑而變化。舉例而言，組合物可包含0.1%與100%之間、例如0.5與50%之間、1-30%之間、5-80%之間、至少80% (w/w)的活性成分。
在一些實施例中，本文所述之調配物可含有至少一種核酸疫苗組合物，例如用於COVID-19之核酸疫苗，例如用於COVID-19之一種mRNA疫苗。作為非限制性實例，調配物可含有1、2、3、4或5種具有不同序列之核酸疫苗組合物，例如1、2、3、4或5種具有不同序列之mRNA疫苗組合物。在一些實施例中，調配物含有至少兩種具有不同序列之核酸疫苗(例如mRNA疫苗)組合物。在一些實施例中，調配物含有至少三種具有不同序列之核酸疫苗(例如mRNA疫苗)組合物。在一些實施例中，調配物含有至少四種具有不同序列之核酸疫苗(例如mRNA疫苗)組合物。在一些實施例中，調配物含有至少五種具有不同序列之核酸疫苗(例如mRNA疫苗)組合物。
本發明之核酸疫苗組合物可使用一或多種賦形劑調配以：(1)增加穩定性；(2)增加細胞轉染；(3)允許持續或延遲釋放(例如自核酸疫苗組合物之儲庫調配物)；(4)改變生物分佈(例如使核酸疫苗組合物靶向特定組織或細胞類型)；(5)增加活體內編碼蛋白質之轉譯；及/或(6)改變活體內編碼蛋白質之釋放特徵。
除傳統賦形劑(諸如任何及所有溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體媒劑)之外，本發明之分散或懸浮助劑、表面活性劑、等張劑、增稠或乳化劑、防腐劑、賦形劑可包括但不限於類脂質、脂質體、脂質奈米粒子、聚合物、脂複合體、核-殼奈米粒子、肽、蛋白質、經核酸疫苗組合物轉染(例如用於移植至個體中)之細胞、玻尿酸酶、奈米粒子模擬物及其組合。因此，本發明之調配物可包括一或多種賦形劑，其各自呈在一起增加核酸疫苗組合物之穩定性及/或增加核酸疫苗組合物之細胞轉染的量。另外，本發明之核酸疫苗組合物可使用自組裝之核酸奈米粒子調配。用於可用於調配本發明之核酸疫苗組合物之核酸的醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及遞送劑揭示於PCT專利申請公開案WO 2013/090648中，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
類脂質
本發明之核酸疫苗組合物可使用一或多種類脂質調配。
已廣泛描述類脂質之合成且含有此等化合物之調配物尤其適合於遞送寡核苷酸或核酸(參見Mahon等人,
Bioconjug Chem. 2010, 21:1448-1454；Schroeder等人, J
Intern Med.2010, 267:9-21；Akinc等人,
Nat Biotechnol.200,8 26:561-569；Love等人,
Proc Natl Acad Sci U S A.2010, 107:1864-1869；Siegwart等人,
Proc Natl Acad Sci U S A.2011, 108:12996-3001；其內容均以全文引用的方式併入本文中)。
儘管此等類脂質已用於在嚙齒動物及非人類靈長類動物中有效地遞送雙股小干擾RNA分子(參見Akinc等人,
Nat Biotechnol.2008, 26:561-569；Frank-Kamenetsky等人,
Proc Natl Acad Sci U S A.2008, 105:11915-11920；Akinc等人,
Mol Ther.2009, 17:872-879；Love等人,
Proc Natl Acad Sci U S A.2010, 107:1864-1869；Leuschner等人,
Nat Biotechnol.2011, 29:1005-1010；其內容均以全文引用之方式併入本文中)，但本發明涵蓋其調配物及在遞送至少一種醫藥學上可接受之載劑，包括核酸疫苗中的用途。可製備含有此等類脂質，且因此可在經由局部及/或全身性投與途徑注射類脂質調配物之後有效遞送核酸疫苗組合物的複合物、膠束、脂質體或粒子。含有核酸疫苗組合物之類脂質複合物可藉由各種方式投與，包括但不限於靜脈內(IV)、肌內(IM)、皮下(SC)、實質內(IPa)、鞘內(IT)或腦室內(ICV)投與。
核酸之活體內遞送可受許多參數影響，包括但不限於調配物組成、粒子聚乙二醇化之性質、負載程度、聚核苷酸與脂質之比及生物物理學參數，諸如但不限於粒度(Akinc等人
, Mol Ther.2009, 17:872-879；其內容以全文引用之方式併入本文中)。舉例而言，聚(乙二醇) (PEG)脂質之錨鏈長度的微小變化可對活體內功效產生顯著影響。可對於具有不同類脂質，包括但不限於五[3-(1-月桂胺基丙醯基)]-三伸乙基四胺鹽酸鹽(TETA-5LAP；亦稱為98N12-5，參見Murugaiah等人,
Analytical Biochemistry, 2010, 401:61；其內容以全文引用之方式併入本文中)、C12-200 (包括衍生物及變異體)及MD1之調配物測試活體內活性。
在本文中稱為「98N12-5」之類脂質由Akinc等人,
Mol Ther.2009, 17:872-879揭示，且該文獻之內容以全文引用之方式併入本文中。
在本文中稱為「C12-200」之類脂質由Love等人,
Proc Natl Acad Sci U S A.2010, 107:1864-1869以及Liu及Huang,
Molecular Therapy. 2010, 669-670揭示；該等文獻之內容均以全文引用之方式併入本文中。類脂質調配物可包括除核酸疫苗組合物以外亦包含3或4種或更多種組分之粒子。舉例而言，具有某些類脂質之調配物包括但不限於98N12-5且可含有42%類脂質、48%膽固醇及10% PEG (C14烷基鏈長度)。作為另一實例，具有某些類脂質之調配物包括但不限於C12-200且可含有50%類脂質、10%二硬脂醯磷脂醯膽鹼、38.5%膽固醇及1.5% PEG-DMG。
在一些實施例中，用類脂質調配之核酸疫苗組合物用於全身性靜脈內投與。舉例而言，最終最佳化靜脈內調配物可使得大於90%之調配物分佈至肝臟，該調配物使用核酸疫苗組合物且包含42% 98N12-5、48%膽固醇及10% PEG-脂質之脂質莫耳組成，具有約7.5:1總脂質:核酸疫苗組合物之最終重量比及PEG脂質上之C14烷基鏈長度，平均粒度為大致50-60 nm。(參見Akinc等人,
Mol Ther.2009, 17:872-879；其內容以全文引用的方式併入本文中)。在另一實例中，使用C12-200類脂質之靜脈內調配物(參見PCT專利申請公開案WO2010129709，其內容以全文引用之方式併入本文中)可具有50/10/38.5/1.5之C12-200/二硬脂醯磷脂醯膽鹼/膽固醇/PEG-DMG莫耳比，其中7:1之總脂質:核酸重量比及80 nm之平均粒度可有效遞送核酸疫苗組合物(參見Love等人,
Proc Natl Acad Sci U S A.2010, 107:1864-1869，其內容以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，含MD1類脂質之調配物可用於在活體內將核酸疫苗組合物有效遞送至肝細胞。用於肌內或皮下途徑之最佳化類脂質調配物的特性可取決於目標細胞類型及調配物經由細胞外基質擴散至血流中的能力而顯著變化。雖然由於內皮窗孔的大小，可能需要小於150 nm的粒度以用於有效的肝細胞遞送(參見Akinc等人,
Mol Ther.2009,17:872-879，其內容以全文引用之方式併入本文中)，但使用類脂質調配之核酸疫苗組合物將調配物遞送至其他細胞類型(包括但不限於內皮細胞、骨髓細胞,肌肉細胞)可能不受類似的大小限制。
已報導使用類脂質調配物將siRNA活體內遞送至其他非肝細胞，諸如骨髓細胞及內皮細胞(參見Akinc等人,
Nat Biotechnol.2008, 26:561-569；Leuschner等人,
Nat Biotechnol.2011, 29:1005-1010；Cho等人
Adv. Funct. Mater.2009, 19:3112-3118; 8
thInternational Judah Folkman Conference, Cambridge, MA 2010年10月8-9日；該等文獻之內容各自以全文引用的方式併入本文中)。為有效遞送至骨髓細胞，諸如單核球，類脂質調配物可具有類似的組分莫耳比。類脂質與其他組分(包括但不限於二硬脂醯磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG-DMG)之不同比率可用於最佳化核酸疫苗組合物之調配物，以遞送至不同細胞類型，包括但不限於肝細胞、骨髓細胞、肌肉細胞等。舉例而言，組分莫耳比可包括但不限於50% C12-200、10%二硬脂醯磷脂醯膽鹼、38.5%膽固醇及1.5% PEG-DMG (參見Leuschner等人,
Nat Biotechnol2011, 29:1005-1010；其內容以全文引用之方式併入本文中)。使用類脂質調配物經由皮下或肌內遞送將核酸局部遞送至細胞可能不需要全身遞送所需之所有調配物組分，且因此可僅包含類脂質及核酸疫苗組合物。
脂質體
本發明之核酸疫苗組合物可使用一或多種脂質體調配。
在一些實施例中，核酸疫苗組合物之醫藥組合物包括脂質體。脂質體為人工製備之囊泡，其可主要由脂質雙層構成，且可用作投與營養物及醫藥調配物之遞送媒劑。脂質體可具有不同尺寸，諸如但不限於直徑可為數百奈米且可含有由狹窄水性隔室分離之一系列同心雙層的多層囊泡(MLV)、直徑可小於50 nm之小單細胞囊泡(SUV)及直徑可在50 nm與500 nm之間的大單層囊泡(LUV)。脂質體設計可包括但不限於調理素或配位體，以便改良脂質體與不健康組織的附著或激活事件，諸如但不限於內吞作用。脂質體可含有低或高pH以便改良醫藥調配物之遞送。
脂質體之形成可取決於物理化學特徵，諸如但不限於包覆之醫藥調配物及脂質體成分；脂質囊泡所分散之介質的性質；所包覆物質之有效濃度及其潛在毒性；在囊泡之應用及/或遞送期間所涉及之任何其他過程；用於預期應用之囊泡的最佳化大小、多分散性及存放期；及批次間再現性及大規模生產安全且高效之脂質體產品的可能性。
在一些實施例中，包含本文所述之核酸疫苗的醫藥組合物可包括但不限於脂質體，諸如由1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DODMA)脂質體形成之脂質體、來自Marina Biotech (Bothell, WA)之DiLa2脂質體、SMARTICLES®/NOV340 (Marina Biotech, Bothell)、1,2-二亞油醇基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-KC2-DMA)及MC3 (美國專利申請公開案US20100324120；其內容以全文引用之方式併入本文中)、中性DOPC (1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼)基脂質體(例如siRNA遞送用於卵巢癌(Landen等人
Cancer Biology & Therapy2006, 5(12): 1708-1713)；其內容以全文引用之方式併入本文中)、塗有玻尿酸之脂質體(Quiet Therapeutics, Israel)及可遞送小分子藥物之脂質體，諸如但不限於來自Janssen Biotech, Inc. (Horsham, PA)之DOXIL®。
在一些實施例中，包含本文所述之核酸疫苗的醫藥組合物可包括但不限於脂質體，諸如由合成穩定質體-脂質粒子(SPLP)或穩定核酸脂質粒子(SNALP)形成之脂質體，該等粒子先前已被描述且證明適用於活體外及活體內寡核苷酸遞送(參見Wheeler等人
Gene Therapy. 1999, 6:271-281；Zhang等人
Gene Therapy. 1999, 6:1438-1447；Jeffs等人
Pharm Res. 2005, 22:362-372；Morrissey等人,
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Nature. 2006, 441:111-114；Heyes等人
J Contr Rel. 2005, 107:276-287；Semple等人
Nature Biotech. 2010, 28:172-176；Judge等人
J Clin Invest. 2009, 119:661-673；deFougerolles
Hum Gene Ther.2008, 19:125-132；其內容各自以全文併入本文中)。Wheeler等人之原始製造方法為清潔劑透析方法，其隨後由Jeffs等人改良且被稱為自發性囊泡形成方法。除核酸疫苗組合物以外，脂質體調配物可由3至4種脂質組分構成。作為非限制性實例，脂質體可含有但不限於55%膽固醇、20%二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、10% PEG-S-DSG及15% 1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DODMA)，如Jeffs等人所描述。在另一實例中，某些脂質體調配物可含有但不限於48%膽固醇、20% DSPC、2% PEG-c-DMA及30%陽離子脂質，其中陽離子脂質可為1,2-二硬脂氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DSDMA)、DODMA、DLin-DMA或1,2-二亞麻氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)，如Heyes等人所描述。在另一實例中，核酸-脂質粒子可包含占粒子中存在之總脂質之約50 mol%至約85 mol%的陽離子脂質；占粒子中存在之總脂質之約13 mol%至約49.5 mol%的非陽離子脂質；及占粒子中存在之總脂質之約0.5 mol%至約2 mol%的抑制粒子聚集之結合脂質，如頒予Maclachlan等人之WO2009127060中所述；該案之內容以全文引用之方式併入本文中。在另一實例中，核酸-脂質粒子可為頒予Maclachlan等人之US2006008910中所揭示之任何核酸-脂質粒子；該案之內容以全文引用之方式併入本文中。作為非限制性實例，核酸-脂質粒子可包含式I之陽離子脂質、非陽離子脂質及抑制粒子聚集之結合脂質。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可在脂質囊泡中調配，該脂質囊泡可在官能化脂質雙層之間具有交聯。
在一些實施例中，脂質體可含有頒予Bally等人之美國專利第US5595756號中所揭示之糖修飾脂質，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。脂質可為約10 mol%之量的神經節苷脂及腦甘脂。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可在包含陽離子脂質之脂質體中調配。脂質體可具有1:1與20:1之間的陽離子脂質中之氮原子與核酸疫苗組合物中之磷酸鹽的莫耳比(N:P比)，如PCT專利申請公開案第WO2013006825號中所述，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，脂質體可具有大於20:1或小於1:1之N:P比。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可在脂質-聚陽離子複合物中調配。脂質-聚陽離子複合物之形成可藉由此項技術中已知及/或如美國公開案第20120178702號中所述之方法實現，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。作為非限制性實例，聚陽離子可包括陽離子肽或多肽，諸如但不限於聚離胺酸、聚鳥胺酸及/或聚精胺酸，及PCT專利申請公開案第WO2012013326號中所述之陽離子肽；其內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，核酸疫苗組合物可在脂質-聚陽離子複合物中調配，該複合物可進一步包括中性脂質，諸如但不限於膽固醇或二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)。
脂質體調配物可受不限於以下之因素影響：陽離子脂質組分之選擇、陽離子脂質飽和度、聚乙二醇化之性質、所有組分之比及生物物理學參數，諸如大小。在Semple等人(Semple等人
Nature Biotech.2010, 28:172-176；該案之內容以全文引用之方式併入本文中)之一個實例中，脂質體調配物由57.1%陽離子脂質、7.1%二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、34.3%膽固醇及1.4% PEG-c-DMA構成。
在一些實施例中，醫藥組合物可用以下各者中所揭示之任何兩性脂質體調配：頒予Panzner之PCT專利申請公開案第WO 2008043575及頒予Essler等人(Marina Biotech)之美國專利第US 8,580,297號，該等文獻之內容以全文引用之方式併入本文中。兩性脂質體可包含脂質之混合物，該等脂質包括陽離子兩親分子、陰離子兩親分子及視情況選用之一或多種中性兩親分子。兩性脂質體可包含基於兩親媒性分子之兩性化合物，該等兩親媒性分子之頭基經一或多個兩性基團取代。在一些實施例中，醫藥組合物可用包含一或多個具有4至9之等電點之兩性基團的兩性脂質調配，如頒予Essler等人(Marina Biotech)之美國專利申請公開案第US20140227345號中所揭示，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，醫藥組合物可用包含如頒予Panzner等人(Novosom)之美國專利第US7312206號中所揭示之固醇衍生物的脂質體調配，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，醫藥組合物可用包含至少一種兩親媒性陽離子脂質、至少一種兩親媒性陰離子脂質及至少一種中性脂質之兩性脂質體，或包含至少一種具有正電荷及負電荷兩者之兩親媒性脂質及至少一種中性脂質之脂質體調配，其中脂質體在pH 4.2及pH 7.5下穩定，如頒予Panzner等人(Novosom)之美國專利第7780983號中所揭示，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，醫藥組合物可用能夠囊封本發明之核酸疫苗組合物的脂質體調配，該等脂質體包含頒予Panzner等人之美國專利申請公開案第US 20110076322號中教示之脂質的血清穩定混合物，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。脂質混合物包含比率在約0.5至約8範圍內的磷脂醯膽鹼及磷脂醯乙醇胺。脂質混合物亦可包括pH敏感性陰離子及陽離子兩親分子，使得混合物為兩性的，在pH 7.4處帶負電或中性且在pH 4處帶正電。可調節藥物/脂質比以將脂質體靶向至體內的特定器官或其他部位。在一些實施例中，負載有本發明之核酸疫苗組合物作為負荷的脂質體係藉由頒予Panzner等人之美國專利申請公開案第US 20120021042號中所揭示之方法製備，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。方法包含將聚陰離子活性劑之水溶液及一或多種兩親分子之醇溶液混合且將該混雜物緩衝至酸性pH的步驟，其中一或多種兩親分子易在酸性pH下形成兩性脂質體，從而在囊封活性劑之懸浮液中形成兩性脂質體。
脂複合體
本發明之核酸疫苗組合物可使用一或多種脂複合體調配。
在一些實施例中，核酸疫苗組合物可調配為脂複合體，諸如但不限於ATUPLEX
TM系統、DACC系統、DBTC系統及其他來自Silence Therapeutics (London, United Kingdom)之siRNA-脂複合體技術、來自STEMGENT® (Cambridge, MA)之STEMFECT
TM及基於聚伸乙亞胺(PEI)或魚精蛋白之靶向及非靶向核酸遞送(Aleku等人
Cancer Res.2008, 68:9788-9798；Strumberg等人
Int J Clin Pharmacol Ther, 2012, 50:76-78；Santel等人,
Gene Ther,2006, 13:1222-1234；Santel等人,
Gene Ther.,2006, 13:1360-1370；Gutbier等人,
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Microvasc Res., 2010, 80:286-293, Weide等人
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Hum Gene Ther.2008, 19:125-132；其內容各自以全文引用之方式併入本文中)。
脂質奈米粒子(LNP)
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可在脂質奈米粒子(LNP)中調配。一般而言，LNP之特徵可為小固體或半固體粒子，其具有外部脂質層，該外部脂質層具有暴露於非LNP環境之親水性外表面；可為水性(囊泡樣)或非水性(膠束樣)的內部空間；及至少一個疏水性膜間空間。LNP膜可層狀或非層狀的，且可由1、2、3、4、5或更多個層構成。在一些實施例中，LNP可包含進入其內部空間、進入膜間空間、進入其外表面或其任何組合的負荷或有效負載。
適用於本文中之LNP為此項技術中已知的且通常包含膽固醇(有助於穩定性及促進膜融合)、磷脂(其為LNP雙層提供結構且亦可幫助內體逃逸)、聚乙二醇(PEG)衍生物(其降低LNP聚集且「保護」LNP免受免疫細胞之非特異性內吞作用)及可離子化脂質(與帶負電RNA複合且增強內體逃逸)，其形成LNP形成組合物。
可基於所需目標、向性、負荷、尺寸或其他所需特徵或特性選擇LNP之組分。
LNP可為PCT專利申請公開案第WO2012170930號中所述之脂質奈米粒子，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可在包含至少一種陽離子脂質之LNP中調配。
在一些實施例中，可用於本發明之調配物的陽離子脂質可選自但不限於以下各者中所述之陽離子脂質：PCT專利申請公開案第WO2012040184號、第WO2011153120號、第WO2011149733號、第WO2011090965號、第WO2011043913號、第WO2011022460號、第WO2012061259號、第WO2012054365號、第WO2012044638號、第WO2010080724號、第WO201021865號及第WO2008103276號，美國專利第7,893,302號、第7,404,969號及第8,283,333號，及美國專利公開案第US20100036115號及第US20120202871號；其內容各自以全文引用之方式併入本文中。陽離子脂質亦可選自但不限於以下各者中所述之式A：PCT專利申請公開案第WO2012040184號、第WO2011153120號、第WO2011149733號、第WO2011090965號、第WO2011043913號、第WO2011022460號、第WO2012061259號、第WO2012054365號及第WO2012044638號；其內容各自以全文引用之方式併入本文中。或者，陽離子脂質可選自但不限於PCT專利申請案第WO2008103276號之式CLI-CLXXIX、美國專利第7,893,302號之式CLI-CLXXIX、美國專利第7,404,969號之式CLI-CLXXXXII及美國專利公開案第US20100036115號之式I-VI；其內容各自以全文引用之方式併入本文中。陽離子脂質可為多價陽離子脂質，諸如頒予Gaucheron等人之美國專利第7,223,887號中所揭示之陽離子脂質，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。陽離子脂質可具有包括兩個四級胺基之帶正電荷之頭基及包括四條烴鏈之疏水性部分，如頒予Gaucheron等人之美國專利第7,223,887號中所述。陽離子脂質可為可生物降解的，如頒予Maier等人之美國專利申請公開案第US20130195920號中所揭示之可生物降解脂質，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。陽離子脂質可具有一或多個位於陽離子脂質之脂質部分中的可生物降解基團，如頒予Maier等人之US20130195920的式I-IV中所述。
在一些實施例中，陽離子脂質亦可為頒予Manoharan等人之US20130156845及頒予Manoharan等人之US 20130129785、頒予Wasan等人之WO 2012047656、頒予Chen等人之WO 2010144740、頒予Ansell等人之WO 2013086322或頒予Manoharan等人之WO 2012016184中所揭示之陽離子脂質，該等文獻之內容各自以全文引用之方式併入本文中。
作為非限制性實例，陽離子脂質可選自(20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-9-胺、(1Z,19Z)-N5N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-8-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基二十二碳-13,16-二烯-5-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基二十一碳-12,15-二烯-4-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-6-胺、(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-7-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-10-胺、(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-5-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-4-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-9-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-8-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-7-胺、(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-6-胺、(22Z,25Z)-N,N-二甲基三十一碳-22,25-二烯-10-胺、(21Z,24Z)-N,N-二甲基三十碳-21,24-二烯-9-胺、(18Z)-N,N-二甲基二十七碳-18-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十六碳-17-烯-9-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-7-胺、N,N-二甲基二十七烷-10-胺、(20Z,23Z)-N-乙基-N-甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺、1-[(11Z,14Z)-l-壬基二十碳-11,14-二烯-l-基]吡咯啶、(20Z)-N,N-二甲基二十七碳-20-烯-l0-胺、(15Z)-N,N-二甲基二十七碳-15-烯-10-胺、(14Z)-N,N-二甲基二十九碳-14-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十九碳-17-烯-10-胺、(24Z)-N,N-二甲基三十三碳-24-烯-10-胺、(20Z)-N,N-二甲基二十九碳-20-烯-10-胺、(22Z)-N,N-二甲基三十一碳-22-烯-10-胺、(16Z)-N,N-二甲基二十五碳-16-烯-8-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-l3,16-二烯-l-胺、N,N-二甲基-l-[(lS,2R)-2-辛基環丙基]十七碳-8-胺、1-[(1S,2R)-2-己基環丙基]-N,N-二甲基十九碳-10-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十九碳-10-胺、N,N-二甲基-21-[(lS,2R)-2-辛基環丙基]二十一碳-l0-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2S)-2-{[(lR,2R)-2-戊基環丙基]甲基}環丙基]十九碳-10-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十六碳-8-胺、N,N-二甲基-[(lR,2S)-2-十一基環丙基]十四碳-5-胺、N,N-二甲基-3-{7-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]庚基}十二碳-1-胺、1-[(1R,2S)-2-庚基環丙基]-N,N-二甲基十八碳-9-胺、1-[(1S,2R)-2-癸基環丙基]-N,N-二甲基十五碳-6-胺、N,N-二甲基-l-[(lS,2R)-2-辛基環丙基]十五碳-8-胺、R-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、S-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吡咯啶、(2S)-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-[(5Z)-辛-5-烯-1-基氧基]丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}氮雜環丁烷、(2S)-1-(己氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、(2S)-1-(庚氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-(壬氧基)-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-N,N-二甲基-1-[(6Z,9Z,12Z)-十八碳-6,9,12-三烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(戊氧基)丙-2-胺、(2S)-1-(己氧基)-3-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基丙-2-胺、1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]- N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(13Z,16Z)-二十二碳-l3,16-二烯-l-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z,16Z)-二十二碳-13,16-二烯-1-基氧基]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧基]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(9Z)-十六碳-9-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2R)-N,N-二甲基-H(1-甲基辛基)氧基]-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、(2R)-1-[(3,7-二甲基辛基)氧基]-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-(辛氧基)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基環丙基]甲基}環丙基]辛基}氧基)丙-2-胺、N,N-二甲基-1-{[8-(2-辛基環丙基)辛基]氧基}-3-(辛氧基)丙-2-胺及(1lE,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-l1,20,2-三烯-10-胺，或其醫藥學上可接受之鹽或立體異構體。在一些實施例中，脂質可為可裂解脂質，諸如PCT專利申請公開案第WO2012170889號中所述之彼等，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本文所述之奈米粒子可包含至少一種本文所述及/或此項技術中已知之陽離子聚合物。
在一些實施例中，陽離子脂質可藉由此項技術中已知及/或如以下各者中所述之方法合成：PCT專利申請公開案第WO2012040184號、第WO2011153120號、第WO2011149733號、第WO2011090965號、第WO2011043913號、第WO2011022460號、第WO2012061259號、第WO2012054365號、第WO2012044638號、第WO2010080724號及第WO201021865號；其內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，核酸疫苗組合物之醫藥組合物可包括PCT專利申請案公開案第WO2012099755號中所述之聚乙二醇化脂質中之至少一者，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，脂質奈米粒子(LNP)調配物中PEG之比率可增加或降低及/或PEG脂質之碳鏈長度可在C14至C18內修改以改變LNP調配物之藥物動力學及/或生物分佈。作為非限制性實例，相比於陽離子脂質、DSPC及膽固醇，LNP調配物可含有1-5% PEG-c-DOMG之脂質莫耳比。在一些實施例中，核酸疫苗組合物之LNP調配物可含有3%脂質莫耳比之PEG-c-DOMG。在一些實施例中，核酸疫苗組合物之LNP調配物可含有1.5%脂質莫耳比之PEG-c-DOMG。
在一些實施例中，PEG-c-DOMG可用PEG脂質，諸如但不限於用PEG-DSG (1,2-二硬脂醯基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇)或PEG-DPG(1,2-二軟脂醯基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇)置換。陽離子脂質可選自此項技術中已知之任何脂質，諸如但不限於DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200及DLin-KC2-DMA。
在一些實施例中，LNP調配物可含有PEG-DMG 2000 (1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)，一種此項技術中已知之陽離子脂質。在一些實施例中，LNP調配物可含有PEG-DMG 2000及至少一種其他組分。在一些實施例中，LNP調配物可含有PEG-DMG 2000、DSPC及膽固醇。作為非限制性實例，LNP調配物可含有PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC及膽固醇。作為另一非限制性實例，LNP調配物可含有莫耳比為2:40:10:48之PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC及膽固醇(參見例如Geall等人, Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines,
PNAS, 2012, 109(36): 14604-14609；以全文引用之方式併入本文中)。
作為另一非限制性實例，本文所描述之核酸疫苗組合物可調配為藉由非經腸途徑遞送之奈米粒子，如美國專利申請公開案第US20120207845號中所述；其內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可用複數種陽離子脂質，諸如頒予Hope等人之美國專利申請公開案第US20130017223號中所述之第一及第二陽離子脂質來調配，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。第一陽離子脂質可基於第一特性選擇且第二陽離子脂質可基於第二特性選擇，其中特性可如US20130017223中所概述地確定。在一些實施例中，第一及第二特性為互補的。
本文所描述之核酸疫苗組合物可用包含一或多種陽離子脂質及一或多種第二脂質及一或多種核酸之脂質粒子調配，其中脂質粒子包含如頒予Cullis等人之美國專利公開案第US20120276209號中所述的固體核心，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可在水包油(o/w)乳液中與陽離子兩親分子複合，諸如頒予Satishchandran等人之歐洲公開案第EP2298358號中所述，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。陽離子兩親分子可為陽離子脂質、改質或未改質精胺、布比卡因(bupivacaine)或苯紮氯銨，且油可為植物或動物油。作為非限制性實例，至少10%之核酸-陽離子兩親分子複合物在水包油乳液之油相中(參見例如頒予Satishchandran等人之EP2298358中所述之複合物)，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可用包含陽離子化合物及中性脂質之混合物的組合物調配。作為非限制性實例，陽離子化合物可為頒予Ansell等人之PCT專利申請公開案第WO 1999010390號中所揭示之式(I)，該案之內容以全文引用之方式描述於本文中，且中性脂質可選自由二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、神經醯胺及神經鞘磷脂組成之群。在另一非限制性實例中，脂質調配物可包含頒予Akinc等人之美國專利公開案第US 20120101148號中所揭示之式A之陽離子脂質、中性脂質、固醇及PEG或經PEG修飾之脂質，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，LNP調配物可藉由國際公開案第WO2011127255或WO2008103276號中所述之方法調配。作為非限制性實例，本發明之核酸疫苗組合物可囊封於WO2011127255及/或WO2008103276中所述之脂質奈米粒子(LNP)調配物中之任一者中；該等文獻之內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本文所述之LNP調配物可包含聚陽離子組合物。作為非限制性實例，聚陽離子組合物可選自美國專利公開案第US20050222064號之式1-60；該案之內容以全文引用之方式併入本文中。包含聚陽離子組合物之LNP調配物可用於活體內及/或活體外遞送本文所描述之核酸疫苗組合物。
在一些實施例中，本文所述之LNP調配物可另外包含滲透性增強劑分子。非限制性滲透性增強劑分子描述於美國專利公開案第US20050222064號中；該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
奈米粒子調配物可為包含碳水化合物載劑及核酸疫苗組合物(例如用於COVID-19之核酸疫苗)之碳水化合物奈米粒子。作為非限制性實例，碳水化合物載劑可包括但不限於經酸酐修飾之植物糖原或糖原型材料、植物糖原辛烯基丁二酸鹽、植物糖原β-糊精及經酸酐修飾之植物糖原β-糊精。(參見例如PCT專利申請公開案第WO2012109121號；該案之內容以全文引用之方式併入本文中)。
脂質奈米粒子調配物可藉由用稱為快速消除之脂質奈米粒子(reLNP)之可生物降解陽離子脂質置換陽離子脂質來改良。諸如但不限於DLinDMA、DLin-KC2-DMA及DLin-MC3-DMA之可離子化陽離子脂質已展示隨時間推移積聚於血漿及組織中且可為潛在毒性來源。快速消除之脂質之快速代謝可藉由在大鼠中1 mg/kg劑量至10 mg/kg劑量之數量級改良脂質奈米顆粒之耐受性及治療指數。包括酶促降解之酯鍵可改良陽離子組分之降解及代謝曲線，同時仍維持reLNP調配物之活性。酯鍵可內部位於脂鏈內或其可端部位於脂鏈之末端。內部酯鍵可置換脂鏈中之任何碳。
在一些實施例中，核酸疫苗組合物調配為固體脂質奈米粒子。固體脂質奈米粒子(SLN)可為平均直徑在10至1000 nm之間的球形。SLN具有固體脂質核心基質，其可溶解親脂性分子且可用界面活性劑及/或乳化劑穩定。脂質奈米粒子可為自組裝脂質-聚合物奈米粒子(參見Zhang等人,
ACS Nano, 2008, 2 (8):1696-1702；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，包含本文所描述之核酸疫苗組合物的調配物亦可經構築或改變以使其被動地或主動地針對活體內不同的細胞類型，包括但不限於免疫細胞、內皮細胞、抗原呈遞細胞及白血球(Akinc等人
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Gene Ther. 2011, 18:1127-1133；其內容各自以全文引用之方式併入本文中)。調配物被動靶向肝細胞之一個實例包括基於DLin-DMA、DLin-KC2-DMA及DLin-MC3-DMA之脂質奈米粒子調配物，該等調配物已被證明與脂蛋白元E結合且促進此等調配物活體內結合及吸收至肝細胞中(Akinc等人
Mol Ther.2010, 18:1357-1364；其內容以全文引用之方式併入本文中)。調配物亦可經由在其表面上表現不同配位體來選擇性靶向，如由但不限於葉酸、運鐵蛋白、N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)及抗體靶向方法所例示(Kolhatkar等人,
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Gene Ther.2011, 18:1127-1133；其內容各自以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可經調配以用於控制釋放及/或靶向遞送。如本文所用，「控制釋放」係指符合特定釋放模式以實現治療結果的醫藥組合物或化合物釋放特徵。在一些實施例中，核酸疫苗組合物可囊封至本文所述及/或此項技術中已知之遞送劑中以用於控制釋放及/或靶向遞送。如本文所用，術語「囊封」意謂封閉、包圍或包覆。由於囊封涉及本發明之組合物的調配物，因此囊封可為實質性、完全或部分的。術語「實質上囊封」意謂至少大於50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.9或大於99.999%之本發明之醫藥組合物可封閉、包圍或包覆於遞送劑內。「部分囊封」意謂小於10、10、20、30、40、50或更少的本發明之醫藥組合物或化合物可封閉、包圍或包覆於遞送劑內。有利地，可藉由使用螢光及/或電子顯微圖量測本發明之醫藥組合物之逃逸或活性來確定囊封。舉例而言，至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99或大於99.99%之本發明之醫藥組合物係囊封於遞送劑中。
核酸疫苗組合物可囊封至脂質奈米粒子或快速消除之脂質奈米粒子中，且脂質奈米粒子或快速消除之脂質奈米粒子可接著囊封至本文所述及/或此項技術中已知之聚合物、水凝膠及/或外科密封劑中。作為非限制性實例，聚合物、水凝膠或外科密封劑可為PLGA、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL)、HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA)、外科密封劑諸如血纖維蛋白原聚合物(Ethicon Inc. Cornelia, GA)、TISSELL® (Baxter International, Inc., Deerfield, IL)、基於PEG之密封劑及COSEAL® (Baxter International, Inc., Deerfield, IL)。
在一些實施例中，脂質奈米粒子可囊封至此項技術中已知的任何當注射至個體體內時可形成凝膠的聚合物中。作為另一非限制性實例，脂質奈米粒子可囊封至可生物降解的聚合物基質中。
在一些實施例中，包含用於控制釋放及/或靶向遞送之核酸疫苗組合物的調配物亦可包括至少一種控制釋放包衣。控制釋放包衣包括但不限於OPADRY®、聚乙烯吡咯啶酮/乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯啶酮、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、EUDRAGIT RL®、EUDRAGIT RS®及纖維素衍生物，諸如乙基纖維素水性分散液(AQUACOAT®及SURELEASE®)。
在一些實施例中，控制釋放及/或靶向遞送調配物可包含至少一種可降解聚酯，其可含有聚陽離子側鏈。可降解聚酯包括但不限於聚(絲胺酸酯)、聚(L-交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)及其組合。在一些實施例中，可降解聚酯可包括PEG結合以形成聚乙二醇化聚合物。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可用具有靶向部分，諸如頒予Manoharan等人之美國專利申請公開案第US20130202652號中所揭示之靶向部分的靶向脂質調配，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。作為非限制性實例，頒予Manoharan等人之US 20130202652之式I的靶向部分可經選擇以有利於定位於所需器官、組織、細胞、細胞類型或亞型或細胞器的脂質。本發明中涵蓋之非限制性靶向部分包括運鐵蛋白、對甲氧苯甲醯胺、RGD肽、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、岩藻醣、抗體或適體。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可囊封於治療性奈米粒子中。治療性奈米粒子可藉由本文所描述及此項技術中已知之方法調配，諸如但不限於PCT專利申請公開案第WO2010005740號、第WO2010030763號、第WO2010005721號、第WO2010005723號及第WO2012054923號，美國公開案第US20110262491號、第US20100104645號、第US20100087337號、第US20100068285號、第US20110274759號、第US20100068286號及第US20120288541號，及美國專利第8,206,747號、第8,293,276號、第8,318,208號及第8,318,211號；其內容各自以全文引用之方式併入本文中。治療性聚合物奈米粒子可藉由美國公開案第US20120140790號中所述之方法鑑定，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可調配用於持續釋放。如本文所用，「持續釋放」係指在特定時段內符合釋放速率之醫藥組合物或化合物。該時段可包括但不限於數小時、數天、數週、數月及數年。作為非限制性實例，持續釋放奈米粒子可包含聚合物及治療劑，諸如但不限於本發明之核酸疫苗組合物(參見PCT專利申請公開案第WO2010075072號及美國公開案第US20100216804號、第US20110217377號及第US20120201859號，該等公開案之內容各自以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可調配為靶標特異性的。作為非限制性實例，治療性奈米粒子可包括皮質類固醇(參見PCT專利申請公開案第WO2011084518號；該案之內容以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，治療性奈米粒子可調配為癌症特異性的。作為非限制性實例，治療性奈米粒子可調配為以下各者中所述之奈米粒子：PCT專利申請公開案第WO2008121949號、第WO2010005726號、第WO2010005725號及第WO2011084521號，及美國公開案第US20100069426號、第US20120004293號及第US20100104655號，該等公開案之內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之奈米粒子可包含聚合基質。作為非限制性實例，奈米粒子可包含兩種或更多種聚合物，諸如但不限於聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羥基酸、聚反丁烯二酸丙酯、聚己內酯、聚醯胺、聚縮醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚胺基甲酸酯、聚磷氮烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚離胺酸、聚(乙烯亞胺)、聚(絲胺酸酯)、聚(L-交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)或其組合。
在一些實施例中，治療性奈米粒子包含二嵌段共聚物。在一些實施例中，二嵌段共聚物可包括PEG與聚合物之組合，聚合物諸如但不限於聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羥基酸、聚反丁烯二酸丙酯、聚己內酯、聚醯胺、聚縮醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚胺基甲酸酯、聚磷氮烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚離胺酸、聚(乙烯亞胺)、聚(絲胺酸酯)、聚(L-交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)或其組合。
作為非限制性實例，治療性奈米粒子包含PLGA-PEG嵌段共聚物(參見美國公開案第US20120004293號及美國專利第8,236,330號，其各自以全文引用之方式併入本文中)。在另一非限制性實例中，治療性奈米粒子為包含PEG及PLA或PEG及PLGA之二嵌段共聚物的隱形奈米粒子(參見美國專利第8,246,968號及PCT專利申請公開案第WO2012166923號，該等文獻之內容各自以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含多嵌段共聚物，諸如但不限於美國專利第8,263,665號及第8,287,910號中所述之多嵌段共聚物；其內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本文所述之嵌段共聚物可包括於包含非聚合膠束及嵌段共聚物之聚離子複合物中。(參見例如美國公開案第US20120076836號；該案之內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，用於遞送本文所述之核酸疫苗的奈米粒子包括嵌段共聚物。嵌段共聚物之非限制性實例包括PCT專利申請公開案第WO2015017519號之式I、式II、式III、式IV、式V、式VI及式VII之彼等，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含至少一種丙烯酸聚合物。丙烯酸聚合物包括但不限於丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸及甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸胺基烷酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯及其組合。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含至少一種含胺聚合物，諸如但不限於聚離胺酸、聚乙烯亞胺、聚(醯胺基胺)樹枝狀聚合物、聚(β-胺基酯) (參見例如美國專利第8,287,849號；其內容以全文引用之方式併入本文中)及其組合。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含至少一種可降解聚酯，其可含有聚陽離子側鏈。可降解聚酯包括但不限於聚(絲胺酸酯)、聚(L-交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)及其組合。可降解聚酯可包括PEG結合以形成聚乙二醇化聚合物。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可包括至少一種靶向配位體之結合。靶向配位體可為此項技術中已知之任何配位體，諸如但不限於單株抗體。(Kirpotin等人,
Cancer Res. 2006, 66:6732-6740；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可在可用於靶向癌症之水溶液中調配(參見PCT專利申請公開案第WO2011084513號及美國公開案第US20110294717號，其內容各自以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，核酸疫苗組合物可囊封於合成奈米載劑中、與其連接及/或與其結合。合成奈米載劑包括但不限於以下各者中所述之彼等：PCT專利申請公開案第WO2010005740號、第WO2010030763號、第WO201213501號、第WO2012149252號、第WO2012149255號、第WO2012149259號、第WO2012149265號、第WO2012149268號、第WO2012149282號、第WO2012149301號、第WO2012149393號、第WO2012149405號、第WO2012149411號、第WO2012149454號及第WO2013019669號，及美國公開案第US20110262491號、第US20100104645號、第US20100087337號及第US20120244222號，該等公開案之內容各自以全文引用之方式併入本文中。合成奈米載劑可使用此項技術中已知及/或本文所述之方法調配。作為非限制性實例，合成奈米載劑可藉由PCT專利申請公開案第WO2010005740號、第WO2010030763號及第WO201213501號，及美國公開案第US20110262491號、第US20100104645號、第US20100087337號及第US2012024422號中所述之方法調配，該等公開案之內容各自以全文引用之方式併入本文中。合成奈米載劑調配物可藉由PCT專利申請公開案公開號WO2011072218及美國專利第8,211,473號中所述之方法凍乾；該等文獻之內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，合成奈米載劑可含有反應性基團以釋放本文所述之核酸疫苗組合物(參見PCT專利申請公開案第WO20120952552號及美國公開案第US20120171229號，其內容各自以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，合成奈米載劑可調配用於靶向釋放。在一些實施例中，合成奈米載劑可經調配以在指定pH下及/或在所需時間間隔之後釋放核酸疫苗組合物。作為非限制性實例，合成奈米粒子可經調配以在24小時之後及/或在4.5之pH下釋放核酸疫苗組合物(參見PCT專利申請公開案第WO2010138193號及第WO2010138194號，及美國公開案第US20110020388號及第US20110027217號，其內容各自以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，合成奈米載劑可調配用於控制釋放及/或持續釋放本文所述之核酸疫苗組合物。作為非限制性實例，用於持續釋放之合成奈米載劑可藉由此項技術中已知、本文所述及/或如PCT專利申請公開案第WO2010138192號及美國公開案第US20100303850號中所述之方法調配，該等公開案之內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，奈米粒子可經最佳化以供經口投與。奈米粒子可包含至少一種陽離子生物聚合物，諸如但不限於聚葡萄胺糖或其衍生物。作為非限制性實例，奈米粒子可藉由美國公開案第US20120282343號中所述之方法調配；該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可在諸如頒予Manoharan等人之美國專利第US 8,575,123號中所述之模組化組合物中調配，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。作為非限制性實例，模組化組合物可包含核酸(例如本發明之核酸疫苗組合物)、至少一種內體裂解組分及至少一種靶向配位體。模組化組合物可具有一式，諸如頒予Manoharan等人之US 8,575,123中所述之任何式。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可囊封於脂質調配物中以形成穩定核酸-脂質粒子(SNALP)，諸如頒予de Fougerolles等人之美國專利第US8,546,554號中所述，該專利之內容以全文引用之方式併入本文。脂質可為陽離子或非陽離子的。在一個非限制性實例中，脂質:核酸比(質量/質量比) (例如脂質:核酸疫苗組合物比)將在以下範圍內：約1:1至約50:1、約1:1至約25:1、約3:1至約15:1、約4:1至約10:1、約5:1至約9:1或約6:1至約9:1，或5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、或11:1。在另一實例中，SNALP包括40% 2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(脂質A)、10%二油醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、40%膽固醇、10%聚乙二醇(PEG)-C-DOMG(莫耳百分比)，粒度為63.0±20 nm，且核酸/脂質比為0.027。
本發明之核酸疫苗組合物可用包含內體膜去穩定劑之核酸-脂質粒子調配，如頒予Lam等人之美國專利第US 7,189,705中所揭示，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。作為非限制性實例，內體膜去穩定劑可為Ca
2+離子。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可用頒予Akinc等人之美國專利第US 8,148,344號中所揭示之經調配脂質粒子(FLiPs)調配，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。Akinc等人教示FLiP可包含單股或雙股寡核苷酸中之至少一者，其中寡核苷酸已結合至親脂體及已與結合之寡核苷酸一起聚集、摻合或結合的乳液或脂質體中之至少一者。如頒予Akinc等人之US 8148344中所揭示，此等粒子已出人意料地顯示出有效地將寡核苷酸遞送至心臟、肺及肌肉。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可使用在脂質調配物中包含表現載體之組合物遞送至細胞，如頒予Tam等人之美國專利第US 6,086,913號中所述，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。Tam所揭示之組合物為血清穩定的且包含表現載體，該表現載體包含來自腺相關病毒(AAV)之第一及第二反向重複序列、來自AAV之rep基因及核酸片段。Tam中之表現載體與脂質複合。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可用頒予de Fougerolles等人之美國公開案第US 20120270921號中所揭示之脂質調配物調配，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。在一個非限制性實例中，脂質調配物可包括具有US 20120270921中所述之式A的陽離子脂質。在另一非限制性實例中，US20120270921之表A中所揭示之例示性核酸-脂質粒子的組合物可與本發明之核酸疫苗組合物一起使用。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可完全囊封於頒予Maurer等人之美國公開案第US 20120276207號中所揭示之脂質粒子，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。粒子可包含脂質組合物，該脂質組合物包含預先形成之脂質囊泡、帶電治療劑及去穩定劑以在去穩定溶劑中形成預先形成之囊泡及治療劑的混合物，其中去穩定溶劑有效地使預先形成之脂質囊泡的膜去穩定而不破壞囊泡。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可用結合脂質調配。在非限制性實例中，結合脂質可具有諸如頒予Lin等人之美國公開案第US 20120264810號中所述之式，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。結合物脂質可形成脂質粒子，其進一步包含陽離子脂質、中性脂質及能夠減少聚集之脂質。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可在諸如頒予Fitzgerald等人之美國公開案第US 20120244207號中所揭示之中性脂質體調配物中調配，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。片語「中性脂質體調配物」係指在生理pH下具有接近中性或中性表面電荷的脂質體調配物。生理pH可為例如約7.0至約7.5，或例如約7.5，或例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，或例如7.3，或例如7.4。中性脂質體調配物之實例為可離子化脂質奈米粒子(iLNP)。中性脂質體調配物可包括可離子化陽離子脂質，例如DLin-KC2-DMA。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可用帶電脂質或胺基脂質調配。如本文所用，術語「帶電脂質」意欲包括具有一或兩個脂肪醯基或脂肪烷基鏈及四級胺基頭基的彼等脂質。四級胺攜帶永久正電荷。頭基可視情況包括可離子化基團，諸如可在生理pH下質子化之一級、二級或三級胺。相對於不具有四級胺(例如四級胺經三級胺置換)之結構類似化合物中之基團的pKa，四級胺之存在可改變可離子化基團之pKa。在一些實施例中，帶電脂質稱為「胺基脂質」。在非限制性實例中，胺基脂質可為頒予Hope等人之美國公開案第US20110256175號中所述之任何胺基脂質，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。舉例而言，胺基脂質可具有Hope之表3-7中所揭示之結構，諸如結構(II)、DLin-K-C2-DMA、DLin-K2-DMA、DLin-K6-DMA等。所得醫藥製劑可根據Hope凍乾。在另一非限制性實例中，胺基脂質可為頒予Hope等人之US 20110117125中所述之任何胺基脂質，該案之內容以全文引用之方式併入本文中，諸如結構(I)、DLin-K-DMA、DLin-C-DAP、DLin-DAC、DLin-MA、DLin-S-DMA等脂質。在另一非限制性實例中，胺基脂質可具有如頒予Manoharan等人之PCT專利申請公開案第WO2009132131號中所述之結構(I)、(II)、(III)或(IV)，或4-(R)-DLin-K-DMA (VI)、4-(S)-DLin-K-DMA (V)，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。在另一非限制性實例中，本文所述之任何調配物中所用之帶電脂質可為頒予Manoharan等人之EP2509636中所述之任何帶電脂質，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可用締合複合物調配。在非限制性實例中，締合複合物包含頒予Manoharan等人之美國專利第US8,034,376號中所揭示之一或多種各自具有由式(I)所定義之結構的化合物、具有由式(XV)定義之結構的PEG-脂質、類固醇及核酸，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。核酸疫苗組合物可用美國專利第US8,034,376號中所述之任何締合複合物調配，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可用反向頭基脂質調配。作為非限制性實例，核酸疫苗組合物可用包含頭基之兩性離子脂質調配，其中正電荷位於醯基鏈區域附近且負電荷位於頭基遠端，諸如具有頒予Leung等人之PCT專利申請公開案第WO2011056682號中所述之結構(A)或結構(I)的脂質，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可在脂質雙層載劑中調配。作為非限制性實例，核酸疫苗組合物可與脂質-清潔劑混合物組合以提供核酸-脂質-清潔劑混合物，該脂質-清潔劑混合物包含約5 mol%至約20 mol%之量的防聚集劑、約0.5 mol%至約50 mol%之量的陽離子脂質及促融脂質之脂質混合物及清潔劑；且接著用緩衝鹽溶液滲吸核酸-脂質-清潔劑混合物以移除清潔劑且將核酸囊封於脂質雙層載劑中，且提供脂質雙層-核酸組合物，其中緩衝鹽溶液之離子強度足以囊封約40%至約80%之核酸，如頒予Cullis等人之PCT專利申請公開案第WO1999018933號中所述，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可包含(a)核酸；(b) 1.0莫耳%至45莫耳%之陽離子脂質；(c) 0.0莫耳%至90莫耳%之另一脂質；(d) 1.0莫耳%至10莫耳%之雙層穩定組分；(e) 0.0莫耳%至60莫耳%膽固醇；及(f) 0.0莫耳%至10莫耳%陽離子聚合物脂質，如頒予Cullis等人之EP1328254中所述，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，核酸疫苗可使用較小LNP來遞送。此類粒子可包含低於0.1 µm直至100 nm之直徑，諸如但不限於小於0.1 µm、小於1.0 µm、小於5 µm、小於10 µm、小於15 µm、小於20 µm、小於25 µm、小於30 µm、小於35 µm、小於40 µm、小於50 µm、小於55 µm、小於60 µm、小於65 µm、小於70 µm、小於75 µm、小於80 µm、小於85 µm、小於90 µm、小於95 µm、小於100 µm、小於125 µm、小於150 µm、小於175 µm、小於200 µm、小於225 µm、小於250 µm、小於275 µm、小於300 µm、小於325 µm、小於350 µm、小於375 µm、小於400 µm、小於425 µm、小於450 µm、小於475 µm、小於500 µm、小於525 µm、小於550 µm、小於575 µm、小於600 µm、小於625 µm、小於650 µm、小於675 µm、小於700 µm、小於725 µm、小於750 µm、小於775 µm、小於800 µm、小於825 µm、小於850 µm、小於875 µm、小於900 µm、小於925 um、小於950 µm、小於975 µm。
在另一實施例中，核酸疫苗可使用較小LNP來遞送，該等LNP之直徑可為約1 nm至約100 nm、約1 nm至約10 nm、約1 nm至約20 nm、約1 nm至約30 nm、約1 nm至約40 nm、約1 nm至約50 nm、約1 nm至約60 nm、約1 nm至約70 nm、約1 nm至約80 nm、約1 nm至約90 nm、約5 nm至約100 nm、約5 nm至約10 nm、約5 nm至約20 nm、約5 nm至約30 nm、約5 nm至約40 nm、約5 nm至約50 nm、約5 nm至約60 nm、約5 nm至約70 nm、約5 nm至約80 nm、約5 nm至約90 nm、約10 nm至約50 nm、約20 nm至約50 nm、約30 nm至約50 nm、約40 nm至約50 nm、約20 nm至約60 nm、約30 nm至約60 nm、約40 nm至約60 nm、約20 nm至約70 nm、約30 nm至約70 nm、約40 nm至約70 nm、約50 nm至約70 nm、約60 nm至約70 nm、約20 nm至約80 nm、約30 nm至約80 nm、約40 nm至約80 nm、約50 nm至約80 nm、約60 nm至約80 nm、約20 nm至約90 nm、約30 nm至約90 nm、約40 nm至約90 nm、約50 nm至約90 nm、約60 nm至約90 nm及或約70 nm至約90 nm。
在一些實施例中，核酸疫苗可在具有以下直徑之脂質奈米粒子中調配：約10 nm至約100 nm，例如(但不限於)、約10 nm至約20 nm、約10 nm至約30 nm、約10 nm至約40 nm、約10 nm至約50 nm、約10 nm至約60 nm、約10 nm至約70 nm、約10 nm至約80 nm、約10 nm至約90 nm、約20 nm至約30 nm、約20 nm至約40 nm、約20 nm至約50 nm、約20 nm至約60 nm、約20 nm至約70 nm、約20 nm至約80 nm、約20 nm至約90 nm、約20 nm至約100 nm、約30 nm至約40 nm、約30 nm至約50 nm、約30 nm至約60 nm、約30 nm至約70 nm、約30 nm至約80 nm、約30 nm至約90 nm、約30 nm至約100 nm、約40 nm至約50 nm、約40 nm至約60 nm、約40 nm至約70 nm、約40 nm至約80 nm、約40 nm至約90 nm、約40 nm至約100 nm、約50 nm至約60 nm、約50 nm至約70 nm、約50 nm至約80 nm、約50 nm至約90 nm、約50 nm至約100 nm、約60 nm至約70 nm、約60 nm至約80 nm、約60 nm至約90 nm、約60 nm至約100 nm、約70 nm至約80 nm、約70 nm至約90 nm、約70 nm至約100 nm、約80 nm至約90 nm、約80 nm至約100 nm及或約90 nm至約100 nm。
在一些實施例中，核酸疫苗可在具有10-1000 nm之直徑的脂質奈米粒子中調配。奈米粒子可為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000 nm。
在一些實施例中，脂質奈米粒子可具有約10至500 nm之直徑。
在一些實施例中，脂質奈米粒子之直徑可為大於100 nm、大於150 nm、大於200 nm、大於250 nm、大於300 nm、大於350 nm、大於400 nm、大於450 nm、大於500 nm、大於550 nm、大於600 nm、大於650 nm、大於700 nm、大於750 nm、大於800 nm、大於850 nm、大於900 nm、大於950 nm或大於1000 nm。
聚合物、可生物降解奈米粒子及核-殼奈米粒子
本發明之核酸疫苗組合物可使用天然及/或合成聚合物調配。可用於遞送之聚合物之非限制性實例包括但不限於DYNAMIC POLYCONJUGATE® (Arrowhead Research Corp., Pasadena, CA)、獲自MIRUS® Bio (Madison, WI)及Roche Madison (Madison, WI)之調配物、PHASERX
TM聚合物調配物(諸如但不限於SMARTT POLYMER TECHNOLOGY™ (PHASERX®, Seattle, WA))、DMRI/DOPE、泊洛沙姆、獲自Vical (San Diego, CA)之VAXFECTIN®佐劑、聚葡萄胺糖、獲自Calando Pharmaceuticals (Pasadena, CA)之環糊精、樹枝狀聚合物及聚(乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)聚合物、RONDEL
TM(RNAi/寡核苷酸奈米粒子遞送)聚合物(Arrowhead Research Corporation, Pasadena, CA)及pH反應性共嵌段共聚物，諸如但不限於PHASERX® (Seattle, WA)。
基於聚葡萄胺糖之調配物之非限制性實例包括帶正電聚葡萄胺糖之核心及帶負電基質之外部部分(美國公開案第US20120258176號；該案之內容以全文引用之方式併入本文中)。聚葡萄胺糖包括但不限於N-三甲基聚葡萄胺糖、單-N-羧甲基聚葡萄胺糖(MCC)、N-軟脂醯基聚葡萄胺糖(NPCS)、EDTA-聚葡萄胺糖、低分子量聚葡萄胺糖、聚葡萄胺糖衍生物或其組合。
在一些實施例中，本發明中所用之聚合物已經歷處理以減少及/或抑制非所需物質，諸如但不限於細菌附著至聚合物表面。聚合物可藉由此項技術中已知及/或描述及/或PCT專利申請公開案第WO2012150467號中描述之方法處理；該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
基於PLGA之調配物的非限制性實例包括但不限於基於PLGA之可注射儲存物(例如ELIGARD®，其係藉由將PLGA溶解於66% N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)及其餘部分之水溶劑及亮丙瑞林中形成。一旦注射，PLGA及亮丙瑞林肽便沈澱至皮下空間中。基於PLGA之可注射儲存物可為長效的。
許多此等聚合物方法已證明在將寡核苷酸活體內遞送至細胞質中的功效(綜述於Fougerolles
Hum Gene Ther.2008, 19:125-132中；其內容以全文引用之方式併入本文中)。在小干擾RNA (siRNA)之情況下，兩種聚合物方法產生了穩固的核酸活體內遞送，亦即動態多結合物及基於環糊精之奈米粒子。此等遞送方法中之第一者使用動態多結合物且已顯示在小鼠活體內有效地遞送siRNA且使肝細胞中之內源性目標mRNA沉默(Rozema等人,
Proc Natl Acad Sci U S A.2007, 104:12982-12887；其內容以全文引用之方式併入本文中)。此特定方法為一種多組分聚合物系統，其主要特徵包括經由二硫鍵與核酸(在此情況下為siRNA)共價偶聯之膜活性聚合物，其中PEG (用於電荷掩蔽)及
N-乙醯基半乳糖胺(用於肝細胞靶向)基團經由pH敏感鍵連接(再次參見Rozema等人,
Proc Natl Acad Sci U S A. 2007, 104:12982-12887)。在與肝細胞結合且進入內體後，聚合物複合物在低pH環境中分解，聚合物暴露其正電荷，導致內體逃逸及siRNA自聚合物的細胞質釋放。經由用甘露糖基團替換
N-乙醯基半乳糖胺基團，顯示可改變自表現去唾液酸醣蛋白受體之肝細胞至竇內皮細胞及庫弗細胞的靶向性。另一聚合物方法涉及使用運鐵蛋白靶向的含環糊精之聚陽離子奈米粒子。此等奈米粒子已證明在表現運鐵蛋白受體之尤文氏肉瘤腫瘤細胞中靶向沉默
EWS-FLI1基因產物(Hu-Lieskovan等人,
Cancer Res.2005, 65: 8984-8982；以全文引用之方式併入本文中)，且在此等奈米粒子中調配之siRNA在非人類靈長類動物中具有良好耐受性(Heidel等人,
Proc Natl Acad Sci USA2007, 104:5715-21；以全文引用之方式併入本文中)。此兩種遞送策略均結合了使用靶向遞送及內體逃逸機制的合理方法。
聚合物調配物可允許核酸疫苗組合物的持續或延遲釋放(例如在肌內、皮下、實質內、鞘內、腦室內投與後)。核酸疫苗組合物之經改變釋放特徵可引起例如編碼蛋白質或多肽或肽在延長時段內的轉譯。可生物降解聚合物先前已用於保護核酸免於降解且已顯示引起有效負載之活體內持續釋放(Rozema等人,
Proc Natl Acad Sci U S A.2007, 104:12982-12887；Sullivan等人,
Expert Opin Drug Deliv.2010, 7:1433-1446；Convertine等人,
Biomacromolecules.2010年10月1日；Chu等人,
Acc Chem Res.2012年1月13日；Manganiello等人,
Biomaterials.2012, 33:2301-2309；Benoit等人,
Biomacromolecules. 2011, 12:2708-2714；Singha等人,
Nucleic Acid Ther.2011, 2:133-147；de Fougerolles
Hum Gene Ther.2008, 19:125-132；Schaffert及Wagner,
Gene Ther.2008, 16:1131-1138；Chaturvedi等人,
Expert Opin Drug Deliv.2011, 8:1455-1468；Davis,
Mol Pharm.2009, 6:659-668；Davis,
Nature,2010, 464:1067-1070；其內容各自以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗可調配用於控制釋放。一種形式的控釋調配物含有分散或囊封於緩慢降解、無毒、非抗原性聚合物，諸如共聚(乳酸/乙醇酸)中的治療化合物或其鹽，如Kent等人，美國專利第4,675,189號之開創性工作中所述，該專利之內容以全文引用的方式併入本文中。化合物或其鹽亦可調配為膽固醇或其他脂質基質丸粒，或矽彈性體基質植入物。作為非限制性實例，本發明之核酸疫苗可分散或囊封於美國專利第4,675,189號中所揭示之聚合物中以用於控制釋放。控制釋放調配物之另一形式包含可生物降解聚合物之溶液，諸如共聚(乳酸/乙醇酸)或乳酸及PEG之嵌段共聚物，其經皮下或肌內注射以獲得用於控制釋放之儲庫調配物。
在一些實施例中，醫藥組合物可為持續釋放調配物。在其他實施例中，持續釋放調配物可用於皮下遞送。持續釋放調配物可包括但不限於PLGA微球、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL)、HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA)、外科密封劑諸如血纖維蛋白原聚合物(Ethicon Inc. Cornelia, GA)、TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL)、基於PEG之密封劑及COSEAL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL)。
作為非限制性實例，可藉由以可調釋放速率(例如數天及數週)製備PLGA微球且將核酸疫苗組合物囊封於PLGA微球中，同時在囊封過程期間維持核酸疫苗組合物之完整性而在PLGA微球中調配核酸疫苗組合物。EVAc為不可生物降解的生物相容性聚合物，其廣泛用於臨床前持續釋放植入物應用中。泊洛沙姆F-407 NF為一種聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯之親水性、非離子界面活性劑三嵌段共聚物，其在小於5℃之溫度下具有低黏度且在大於15℃之溫度下形成固體凝膠。基於PEG之外科密封劑包含在遞送裝置中混合的兩種合成PEG組分，該裝置可在一分鐘內製備、在3分鐘內密封且在30天內再吸收。GELSITE®及天然聚合物能夠在投與部位處原位膠凝。已顯示其經由離子相互作用與蛋白質及肽治療候選物相互作用以提供穩定效應。
亦可經由不同配位體之表現選擇性靶向聚合物調配物，該等配位體如由但不限於葉酸、運鐵蛋白及N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)所例示(Benoit等人,
Biomacromolecules.2011, 12:2708-2714；Rozema等人,
Proc Natl Acad Sci U S A.2007, 104:12982-12887；Davis,
Mol Pharm.2009, 6:659-668；Davis,
Nature,2010 464:1067-1070；該等文獻之內容各自以全文引用之方式併入本文中)。
本發明之核酸疫苗組合物可用聚合化合物調配或在聚合化合物中調配。聚合化合物可包括至少一種聚合物，諸如但不限於聚乙烯、聚乙二醇(PEG)、聚(l-離胺酸) (PLL)、接枝至PLL之PEG、陽離子脂質聚合物、可生物降解陽離子脂質聚合物、聚乙烯亞胺(PEI)、交聯分支鏈聚(伸烷基亞胺)、聚胺衍生物、改質泊洛沙姆、可生物降解聚合物、彈性可生物降解聚合物、可生物降解嵌段共聚物、可生物降解無規共聚物、可生物降解聚酯共聚物、可生物降解聚酯嵌段共聚物、可生物降解聚酯嵌段無規共聚物、多嵌段共聚物、直鏈可生物降解共聚物、聚[α-(4-胺基丁基)-L-乙醇酸) (PAGA)、可生物降解交聯陽離子多嵌段共聚物、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羥基酸、聚反丁烯二酸丙酯、聚己內酯、聚醯胺、聚縮醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚胺基甲酸酯、聚磷氮烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚離胺酸、聚(乙烯亞胺)、聚(絲胺酸酯)、聚(L-交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)、丙烯酸聚合物、含胺聚合物、聚葡萄糖聚合物、聚葡萄糖聚合物衍生物或其組合。
作為非限制性實例，本發明之核酸疫苗組合物可用如美國專利第6,177,274號中所述之接枝有PLL之PEG的聚合化合物調配；該專利以全文引用之方式併入本文中。調配物可用於活體外轉染細胞或活體內遞送核酸疫苗組合物。在另一實例中，核酸疫苗組合物可懸浮於具有陽離子聚合物之溶液或介質、乾燥醫藥組合物或能夠如美國公開案第US20090042829號及第US20090042825號中所述進行乾燥的溶液中；該等公開案之內容各自以全文引用之方式併入本文中。
作為另一非限制性實例，本發明之核酸疫苗組合物可用PLGA-PEG嵌段共聚物(參見美國公開案第US20120004293號及美國專利第8,236,330，以全文引用的方式併入本文中)或PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物(參見美國專利第6,004,573號，以全文引用之方式併入本文中)調配。作為非限制性實例，本發明之核酸疫苗組合物可用PEG及PLA或PEG及PLGA之二嵌段共聚物調配(參見美國專利第8,246,968號，以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，核酸疫苗組合物可用如PCT專利申請公開案第WO20180126084中所述或藉由其中所述之方法製得的分支鏈PEG分子調配；該案之內容以全文引用之方式併入本文中。作為非限制性實例，可用於本文所述之調配物的分支鏈PEG可具有PCT公開案第WO20180126084號之式I、式II、式III、式IV、式V、式VI，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
聚胺衍生物可用於遞送核酸或治療及/或預防疾病或包括於可植入或可注射裝置中(美國公開案第US20100260817號；該案之內容以全文引用之方式併入本文中)。作為非限制性實例，本發明之核酸疫苗組合物可使用美國公開案第US20100260817號中所述之聚胺衍生物調配；該案之內容以全文引用之方式併入本文中。作為另一非限制性實例，本發明之核酸疫苗組合物可使用聚醯胺聚合物遞送，該聚醯胺聚合物諸如但不限於包含藉由將碳水化合物二疊氮化物單體與包含低聚胺之二炔烴單元組合製備之1,3-偶極加成聚合物的聚合物(美國專利第8,236,280號；該專利之內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可用PCT專利申請公開案第WO2011115862號、第WO2012082574號及第WO2012068187號以及美國公開案第US20120283427號中所述之至少一種聚合物及/或其衍生物調配，該等文獻之內容各自以全文引用的方式併入本文中。本發明之核酸疫苗組合物可用如WO2011115862中所述之式Z的聚合物調配；其內容以全文引用之方式併入本文中。核酸疫苗組合物可用如PCT專利申請公開案第WO2012082574號或第WO2012068187號及美國公開案第US2012028342號中所述之式Z、Z'或Z''的聚合物調配；該等文獻之內容各自以全文引用的方式併入本文中。用本發明之核酸疫苗組合物調配之聚合物可藉由PCT專利申請公開案第WO2012082574號或第WO2012068187號中所述之方法合成，該等公開案之內容各自以全文引用的方式併入本文中。
本發明之核酸疫苗組合物可用至少一種丙烯酸聚合物調配。丙烯酸聚合物包括但不限於丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸及甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸胺基烷酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯及其組合。
本發明之核酸疫苗組合物的調配物可包括至少一種含胺聚合物，諸如但不限於聚離胺酸、聚乙烯亞胺、聚(醯胺基胺)樹枝狀聚合物或其組合。
舉例而言，本發明之核酸疫苗組合物可在包括以下各者之醫藥化合物中調配：聚(乙烯亞胺)、可生物降解陽離子脂質聚合物、可生物降解嵌段共聚物、可生物降解聚合物或可生物降解無規共聚物、可生物降解聚酯嵌段共聚物、可生物降解聚酯聚合物、可生物降解聚酯無規共聚物、直鏈可生物降解共聚物、PAGA、可生物降解交聯陽離子多嵌段共聚物或其組合。可生物降解陽離子脂質聚合物可藉由此項技術中已知及/或美國專利第6,696,038號及美國公開案第US20030073619號及第US20040142474號中所述之方法製得；該等文獻之內容各自以全文引用的方式併入本文中。聚(伸烷基亞胺)可使用此項技術中已知及/或如美國公開案第US20100004315號中所述之方法製得，該案以全文引用之方式併入本文中。可生物降解聚合物、可生物降解嵌段共聚物、可生物降解無規共聚物、可生物降解聚酯嵌段共聚物、可生物降解聚酯聚合物或可生物降解聚酯無規共聚物可使用此項技術中已知及/或如美國專利第6,517,869及第6,267,987號中所述之方法製得，該等專利中之各者之內容各自以全文引用之方式併入本文中。直鏈可生物降解共聚物可使用此項技術中已知及/或如美國專利第6,652,886號中所述之方法製得；該專利之內容各自以全文引用之方式併入本文中。PAGA聚合物可使用此項技術中已知及/或如美國專利第6,217,912號中所述之方法製得；其內容以全文引用之方式併入本文中。PAGA聚合物可與聚合物共聚合以形成共聚物或嵌段共聚物，該等聚合物諸如但不限於聚-L-離胺酸、聚精胺酸、聚鳥胺酸、組蛋白、抗生物素蛋白、魚精蛋白、聚丙交酯及聚(交酯-共-乙交酯)。可生物降解交聯陽離子多嵌段共聚物可藉由此項技術中已知及/或如美國專利第8,057,821號或美國公開案第US2012009145號中所述之方法製得；該等文獻之內容各自以全文引用的方式併入本文中。舉例而言，多嵌段共聚物可使用相比於分支鏈聚乙二亞胺具有不同模式之直鏈聚乙烯亞胺(LPEI)嵌段合成。另外，組合物或醫藥組合物可藉由此項技術中已知、本文所述或如美國公開案第US20100004315號或美國專利第6,267,987號及第6,217,912號中所述之方法製得；該等文獻之內容各自以全文引用的方式併入本文中。
本發明之核酸疫苗組合物可用至少一種可含有聚陽離子側鏈之可降解聚酯調配。可降解聚酯包括但不限於聚(絲胺酸酯)、聚(L-交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)及其組合。在一些實施例中，可降解聚酯可包括PEG結合以形成聚乙二醇化聚合物。
本發明之核酸疫苗組合物可用至少一種可交聯聚酯調配。可交聯聚酯包括此項技術中已知及美國公開案第US20120269761號中所述之彼等；該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本文所述之聚合物可結合至脂質封端PEG。作為非限制性實例，PLGA可結合至脂質封端PEG，形成PLGA-DSPE-PEG。作為另一非限制性實例，用於本發明之PEG結合物包括PCT專利申請公開案第WO2008103276號中所述之彼等；其內容以全文引用之方式併入本文中。聚合物可使用配位體結合物，諸如但不限於美國專利第8,273,363號中所述之結合物結合；其內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗組合物可與另一化合物結合。結合物之非限制性實例描述於美國專利第7,964,578號及第7,833,992號中；該等專利之內容各自以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可與如美國專利第7,964,578號及第7,833,992號中所述之式1-122的結合物結合；該等專利之內容各自以全文引用的方式併入本文中。本文所述之核酸疫苗組合物可與金屬，諸如但不限於金結合。(參見例如Giljohann等人
Journ. Amer. Chem. Soc.2009, 131(6): 2072-2073；其內容以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗組合物可結合及/或囊封於金奈米粒子中(PCT申請公開案第WO201216269號及美國公開案第US20120302940號；該等公開案之內容各自以全文引用之方式併入本文中)。
如美國公開案第US20100004313號中所述，基因遞送組合物可包括核苷酸序列及泊洛沙姆。作為非限制性實例，本發明之核酸疫苗組合物可用於美國公開案第US20100004313號中所述之具有泊洛沙姆的基因遞送組合物中；該案之內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，包含本發明之核酸疫苗的聚合物調配物可藉由使可包括陽離子載劑之聚合物調配物與可共價連接至膽固醇及聚乙二醇基團之陽離子脂質聚合物接觸來穩定。聚合物調配物可使用美國公開案第US20090042829號中所述之方法與陽離子脂質聚合物接觸；該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
陽離子載劑可包括但不限於聚伸乙亞胺、聚(三亞甲基亞胺)、聚(四亞甲基亞胺)、聚伸丙亞胺、胺基醣苷-聚胺、雙脫氧-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、甲基丙烯酸聚(2-二甲胺基)乙酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子化明膠、樹枝狀聚合物、聚葡萄胺糖、1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、1-[2-(油醯基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺鎓三氟乙酸鹽(DOSPA)、3B-[N-(N',N'-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基]膽固醇鹽酸鹽(DC-膽固醇HCl)、二十七烷基醯胺基甘胺醯亞精胺(DOGS)、N,N-二硬脂醯基-N,N-二甲基溴化胺(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化胺(DODAC)及其組合。
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可在一或多種聚合物之聚合複合體中調配(美國公開案第US20120237565號及第US20120270927號；該等公開案之內容各自以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，聚合複合體包含兩種或更多種陽離子聚合物。陽離子聚合物可包含聚(乙烯亞胺) (PEI)，諸如直鏈PEI。
本發明之核酸疫苗組合物亦可使用聚合物、脂質及/或其他可生物降解藥劑，諸如但不限於磷酸鈣之組合調配為奈米粒子。組分可在核-殼、混合及/或逐層結構中組合，以允許微調奈米粒子，從而可增強核酸疫苗組合物之遞送(Wang等人,
Nat Mater.2006, 5:791-796；Fuller等人,
Biomaterials. 2008, 29:1526-1532；DeKoker等人,
Adv Drug Deliv Rev. 2011, 63:748-761；Endres等人,
Biomaterials. 2011, 32:7721-7731；Su等人,
Mol Pharm.2011;8(3):774-87；該等文獻之內容各自以全文引用之方式併入本文中)。作為非限制性實例，奈米粒子可包含複數種聚合物，諸如但不限於親水性-疏水性聚合物(例如PEG-PLGA)、疏水性聚合物(例如PEG)及/或親水性聚合物(PCT申請公開案第WO20120225129號；該案之內容以全文引用之方式併入本文中)。
可生物降解磷酸鈣奈米粒子與脂質及/或聚合物之組合可用於活體內遞送核酸疫苗組合物。在一些實施例中，亦可含有諸如對甲氧苯甲醯胺之靶向配位體的塗有脂質之磷酸鈣奈米粒子可用於遞送本發明之核酸疫苗組合物。舉例而言，為了在小鼠轉移性肺模型中有效地遞送siRNA，使用塗有脂質之磷酸鈣奈米粒子(Li等人,
J Contr Rel.2010, 142: 416-421；Li等人,
J Contr Rel. 2012, 158:108-114；Yang等人,
Mol Ther.2012, 20:609-615；該等文獻之內容各自以全文引用之方式併入本文中)。此遞送系統組合靶向奈米粒子及增強內體逃逸之組分磷酸鈣兩者，以便改良siRNA之遞送。
在一些實施例中，具有PEG-聚陰離子嵌段共聚物之磷酸鈣可用於遞送本發明之核酸疫苗組合物(Kazikawa等人,
J Contr Rel.2004, 97:345-356；Kazikawa等人,
J Contr Rel.2006, 111:368-370；該等文獻之內容各自以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，PEG-電荷轉換聚合物(Pitella等人,
Biomaterials.2011, 32:3106-3114；其內容以全文引用之方式併入本文中)可用於形成奈米粒子以遞送本發明之核酸疫苗組合物。PEG-電荷轉換聚合物可藉由在酸性pH下裂解為聚陽離子來改進PEG-聚陰離子嵌段共聚物，從而增強內體逃逸。
在一些實施例中，核-殼奈米粒子可用於形成奈米粒子以遞送本發明之核酸疫苗組合物。核-殼奈米粒子之使用另外聚焦於高通量方法以合成陽離子交聯奈米凝膠核及各種殼(Siegwart等人,
Proc Natl Acad Sci U S A. 2011, 108:12996-13001；其內容以全文引用之方式併入本文中)。聚合奈米粒子之複合、遞送及內化可藉由改變奈米粒子之核及殼組分兩者的化學組成來精確控制。舉例而言，核-殼奈米粒子可在將膽固醇共價連接至奈米粒子之後有效地遞送核酸疫苗組合物至小鼠肝細胞。
在一些實施例中，本文所述之奈米粒子可為包括至少一個配位體之奈米粒子，且該配位體可為肽、核酸適體(其為對其靶標具有低奈莫耳結合親和力之小分子量(8-13 Kda)單股RNA或DNA)、肽適體、抗體、小分子配位體，諸如但不限於葉酸、對甲氧苯甲醯胺及半乳糖。(Leng等人
Journal of Drug Delivery.2017, 17, 文章編號6971297；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，包含中間PLGA層及含有PEG之外部中性脂質層的中空脂質核可用於遞送本發明之核酸疫苗組合物。作為非限制性實例，脂質-聚合物-脂質雜化奈米粒子可用於遞送本文所述之核酸疫苗組合物(Shi等人,
Angew Chem Int Ed.2011, 50:7027-7031；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
用於本發明之核酸疫苗組合物的核-殼奈米粒子可藉由美國專利第8,313,777號中所述之方法形成；其內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，核-殼奈米粒子可包含本文所述之核酸疫苗組合物的核及聚合物殼。聚合物殼可為本文所述之聚合物中之任一者且為此項技術中已知的。在另一實施例中，聚合物殼可用於保護核中之核酸疫苗組合物。(參見例如美國公開案第20120321719號；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，用於本文所述之調配物的聚合物可為如PCT申請公開案第WO2011120053號中所述之經修飾聚合物(諸如但不限於經修飾聚縮醛)；該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，可藉由使細胞與膜去穩定聚合物及核酸疫苗組合物、靶向配位體及視情況選用之連接子的結合物接觸而將核酸疫苗組合物遞送至目標細胞之細胞或胞質液。膜去穩定聚合物之非限制性實例教示於國際PCT申請公開案第WO2020093061號中，該案之內容以全文引用之方式併入本文中，諸如但不限於其中之式XX的膜去穩定聚合物。
賦形劑
在一些實施例中，醫藥調配物可另外包含醫藥學上可接受之賦形劑，如本文所用，其包括但不限於適於所需之特定劑型的任何及所有溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體媒劑、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等張劑、增稠或乳化劑、防腐劑、固體黏合劑、潤滑劑、調味劑、穩定劑、抗氧化劑、重量莫耳滲透濃度調節劑、pH調節劑及其類似物。用於調配醫藥組合物之各種賦形劑及用於製備該組合物之技術為此項技術中已知的(參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, Md., 2006；以全文引用之方式併入本文中)。習知賦形劑介質的使用可涵蓋於本發明之範疇內，除非任何習知賦形劑介質與物質或其衍生物不相容，諸如藉由產生任何非所需生物效應或另外以有害方式與醫藥組合物之任何一或多種其他組分相互作用，該一或多種其他組分的使用涵蓋於本發明之範疇內。
在一些實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑可為至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%純。在一些實施例中，賦形劑經批准用於人類使用及獸醫使用。在一些實施例中，賦形劑可經美國食品及藥物管理局(the United States Food and Drug Administration)批准。在一些實施例中，賦形劑可為醫藥級。在一些實施例中，賦形劑可滿足美國藥典(the United States Pharmacopoeia，USP)、歐洲藥典(the European Pharmacopoeia，EP)、英國藥典及/或國際藥典之標準。
在製造醫藥組合物中使用之醫藥學上可接受之賦形劑包括但不限於惰性稀釋劑、分散及/或成粒劑、表面活性劑及/或乳化劑、崩解劑、黏合劑、防腐劑、緩衝劑、潤滑劑及/或油。此類賦形劑可視情況包括於醫藥組合物中。組合物亦可包括賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟、著色劑、包衣劑、甜味劑、調味劑及/或芳香劑。
例示性稀釋劑包括但不限於碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸二鈣、硫酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈉乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化鈉、乾澱粉、玉米澱粉、粉糖等及/或其組合。
例示性成粒劑及/或分散劑包括但不限於馬鈴薯澱粉、玉米澱粉、木薯澱粉、羥基乙酸澱粉鈉、黏土、褐藻酸、瓜爾膠、柑桔渣、瓊脂、膨潤土、纖維素及木製品、天然海綿、陽離子交換樹脂、碳酸鈣、矽酸鹽、碳酸鈉、交聯聚乙烯吡咯啶酮)(交聯聚維酮)、羧甲基澱粉鈉(羥基乙酸澱粉鈉)、羧甲基纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉(交聯羧甲纖維素)、甲基纖維素、預膠凝化澱粉(澱粉1500)、微晶澱粉、水不溶性澱粉、羧甲基纖維素鈣、矽酸鎂鋁(VEEGUM®)、月桂基硫酸鈉、四級銨化合物等，及/或其組合。
例示性表面活性劑及/或乳化劑包括但不限於天然乳化劑(例如阿拉伯膠、瓊脂、褐藻酸、褐藻酸鈉、黃蓍、角叉菜屬(chondrux)、膽固醇、三仙膠、果膠、明膠、蛋黃、酪蛋白、羊毛脂、膽固醇、蠟及卵磷脂)、膠體黏土(例如膨潤土(矽酸鋁)及VEEGUM® (矽酸鎂鋁))、長鏈胺基酸衍生物、高分子量醇(例如硬脂醇、鯨蠟醇、油醇、三乙酸甘油酯單硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、單硬脂酸甘油酯及丙二醇單硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(例如羧基聚亞甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物及羧基乙烯基聚合物)、角叉菜膠、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素鈉、粉末纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素)、脫水山梨糖醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯(TWEEN®20)、聚氧乙烯脫水山梨糖醇(TWEEN®60)聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(TWEEN®80)、脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯(SPAN®40)、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯(SPAN®60)、脫水山梨糖醇三硬脂酸酯(SPAN®65)、單油酸甘油酯、脫水山梨糖醇單油酸酯(SPAN®80))、聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯單硬脂酸酯(MYRJ®45)、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚甲醛硬脂酸酯及SOLUTOL®)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如CREMOPHOR®)、聚氧乙烯醚(例如聚氧乙烯月桂醚(BRIJ®30))、聚(乙烯吡咯啶酮)、二乙二醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸鈉、油酸鉀、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸鈉、PLUORINC®F 68、POLOXAMER® 188、溴化十六烷基三甲基銨、氯化十六烷基吡錠、苯紮氯銨、多庫酯鈉等，及/或其組合。
例示性黏合劑包括但不限於澱粉(例如玉米澱粉及澱粉糊)；明膠；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露糖醇)；胺基酸(例如甘胺酸)；天然及合成樹膠(例如阿拉伯膠、褐藻酸鈉、鹿角菜提取物、龐沃膠(panwar gum)、哥地膠(ghatti gum)、依莎貝果殼(isapol husk)之黏液、羧甲基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素、乙酸纖維素、聚(乙烯吡咯啶酮)、矽酸鎂鋁(VEEGUM®)及落葉松阿拉伯半乳聚糖(larch arabogalactan))；褐藻酸鹽；聚氧化乙烯；聚乙二醇；無機鈣鹽；矽酸；聚甲基丙烯酸酯；蠟；水；醇等；及其組合。
例示性防腐劑可包括但不限於抗氧化劑、螯合劑、抗微生物防腐劑、抗真菌防腐劑、醇防腐劑、酸性防腐劑及/或其他防腐劑。氧化為mRNA之潛在降解途徑，尤其對於液體mRNA調配物而言。為了防止氧化，可將抗氧化劑添加至調配物中。例示性抗氧化劑包括但不限於α生育酚、抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、苯甲醇、丁基化羥基大茴香醚、EDTA、間甲酚、甲硫胺酸、丁基化羥基甲苯、單硫代甘油、偏亞硫酸氫鈉、丙酸、沒食子酸丙酯、抗壞血酸鈉、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、硫代甘油及/或亞硫酸鈉。例示性螯合劑包括乙二胺四乙酸(EDTA)、單水合檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀、乙二胺四乙酸、反丁烯二酸、蘋果酸、磷酸、乙二胺四乙酸鈉、酒石酸及/或乙二胺四乙酸三鈉。例示性抗微生物防腐劑包括但不限於苯紮氯銨、苄索氯銨、苯甲醇、溴硝丙二醇、西曲溴銨、氯化鯨蠟基吡錠、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、咪唑啶基脲、苯酚、苯氧基乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇及/或硫柳汞。例示性抗真菌防腐劑包括但不限於對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯甲酸鉀、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、丙酸鈉及/或山梨酸。例示性醇防腐劑包括但不限於乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚化合物、雙酚、氯丁醇、羥基苯甲酸酯及/或苯乙醇。例示性酸性防腐劑包括但不限於維生素A、維生素C、維生素E、β-胡蘿蔔素、檸檬酸、乙酸、去氫乙酸、抗壞血酸、山梨酸及/或植酸。其他防腐劑包括但不限於生育酚、生育酚乙酸酯、去鐵胺甲磺酸酯、西曲溴銨、丁基化羥基茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸鈉(SLS)、月桂基醚硫酸鈉(SLES)、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鉀、偏亞硫酸氫鉀、GLYDANT PLUS®、PHENONIP®、對羥基苯甲酸甲酯、GERMALL®115、GERMABEN®!!、NEOLONE™、KATHON™及/或EUXYL®。
在一些實施例中，醫藥溶液之pH維持在pH 5與pH 8之間以改良穩定性。控制pH之例示性緩衝液可包括但不限於磷酸鈉、檸檬酸鈉、丁二酸鈉、組胺酸(或組胺酸-HCl)、碳酸鈉及/或蘋果酸鈉。在另一實施例中，以上列出之例示性緩衝液可與額外單價相對離子(包括但不限於鉀)一起使用。二價陽離子亦可用作緩衝相對離子；然而，由於複雜的形成及/或mRNA降解，此等並非較佳的。
例示性緩衝劑包括但不限於檸檬酸鹽緩衝溶液、乙酸鹽緩衝溶液、磷酸鹽緩衝溶液、氯化銨、碳酸鈣、氯化鈣、檸檬酸鈣、葡乳醛酸鈣、葡庚糖酸鈣、葡糖酸鈣、D-葡萄糖酸、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、丙酸、乙醯丙酸鈣、戊酸、磷酸氫二鈣、磷酸、磷酸三鈣、氫氧化鈣磷酸鹽、乙酸鉀、氯化鉀、葡糖酸鉀、鉀混合物、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鉀混合物、乙酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉混合物、緩血酸胺、氫氧化鎂、氫氧化鋁、褐藻酸、無熱原質水、等張生理鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、乙醇等，及/或其組合。
例示性潤滑劑包括但不限於硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸、二氧化矽、滑石、麥芽、山崳酸甘油酯、氫化植物油、聚乙二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉、白胺酸、月桂基硫酸鎂、月桂基硫酸鈉等，及其組合。
例示性油包括但不限於杏仁、杏核、鱷梨、巴巴蘇(babassu)、佛手柑、黑加侖籽、琉璃苣、杜松(cade)、洋甘菊、芥花、葛縷子、棕櫚蠟、蓖麻、肉桂、可可脂、椰子、鱈魚肝、咖啡、玉米、棉籽、鴯鶓、桉樹、晚櫻草、魚、亞麻籽、香草醇、葫蘆、葡萄籽、榛子、牛膝草、十四烷酸異丙酯、荷荷芭、夏威夷胡桃、醒目薰衣草、薰衣草、檸檬、山蒼子、夏威夷果仁、錦葵、芒果籽、白池花籽、貂、肉豆蔻、橄欖、橙子、大西洋胸棘鯛、棕櫚、棕櫚仁、桃仁、花生、罌粟籽、南瓜籽、油菜籽、米糠、迷迭香、紅花、檀香木、山茶花、香薄荷、沙棘、芝麻、牛油樹油、聚矽氧、大豆、向日葵、茶樹、薊、椿本、岩蘭草、胡桃及小麥胚油。例示性油包括但不限於硬脂酸丁酯、辛酸三甘油酯、癸酸三甘油酯、環甲聚矽氧烷、癸二酸二乙酯、二甲聚矽氧烷360、肉豆蔻酸異丙酯、礦物油、辛基十二烷醇、油醇、聚矽氧油及/或其組合。
根據調配者之判斷，賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟、著色劑、包衣劑、甜味劑、調味劑及/或芳香劑可存在於組合物中。
例示性添加劑包括生理生物相容性緩衝液(例如三甲胺鹽酸鹽)、添加螯合劑(諸如DTPA或DTPA-雙醯胺)或鈣螯合物(例如DTPA鈣、CaNaDTPA-雙醯胺)或視情況添加鈣或鈉鹽(例如氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡糖酸鈣或乳酸鈣)。此外，可使用抗氧化劑及懸浮劑。
在本發明之一些實施例中，本文所述之核酸疫苗組合物可包含至少一種在脂質奈米粒子(LNP)中調配之核酸疫苗及至少一種賦形劑。作為非限制性實例，賦形劑可為糖，諸如蔗糖。
佐劑
佐劑亦可與本文所述之一或多種核酸疫苗，例如mRNA疫苗一起投與或組合投與。佐劑可用於增強核酸疫苗之免疫原性、改變免疫反應、減少免疫所需之核酸疫苗的量、減少所需之額外或「加強」免疫的頻率或在免疫系統減弱或免疫功能不全的人群或老年人中產生改善的免疫反應。佐劑可為含有核酸疫苗之調配物的組分，或其可與核酸疫苗組合物共投與。佐劑之共投與可為此項技術中已知或本文所述之任何方法，諸如但不限於靜脈內(IV)、肌內(IM)、皮下(SC)或皮內(ID)。
在一些實施例中，佐劑為天然或合成的。佐劑亦可為有機或無機的。
在一些實施例中，用於核酸疫苗之佐劑來自一類佐劑，諸如但不限於碳水化合物、微生物、礦物質鹽(例如氫氧化鋁、磷酸鋁凝膠或磷酸鈣凝膠)、乳液(例如油乳液、基於界面活性劑之乳液、純化皂苷及水包油乳液)、惰性媒劑、微粒佐劑(例如單層脂質體媒劑，諸如病毒體或皂苷及脂質之結構化複合物，諸如聚丙交酯共乙交酯(PLG))、微生物衍生物、內源性人類免疫調節劑及張力活性化合物。可用於本文所述之核酸疫苗之佐劑的清單可見於基於網路之疫苗佐劑資料庫Vaxjo (參見例如violinet.org/vaxjo或Sayers等人.,
Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012; 2012:831486. PMID: 22505817；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
可由一般熟習此項技術者選擇用於核酸疫苗之佐劑。佐劑可為干擾素、TNF-α、TNF-β、趨化因子(例如CCL21、伊紅趨素、HMGB1、SA100-8α、GCSF、GMCSF、顆粒溶素、乳鐵蛋白、卵白蛋白、CD40L、CD28促效劑、PD1、可溶性PD1、PDL1、PDL2)或介白素(例如IL1、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL13、IL15、IL17、IL18、IL21及IL23)。佐劑之非限制性實例包括Abisco-100疫苗佐劑、金剛烷基醯胺二肽疫苗佐劑、Adjumer™、AF03、白蛋白-肝素微粒疫苗佐劑、海藻葡聚糖、Algammulin、鋁膠、氫氧化鋁疫苗佐劑、磷酸鋁疫苗佐劑、硫酸鋁鉀佐劑、鋁疫苗佐劑、無定形鋁羥基磷酸化硫酸鋁佐劑、Arlacel A、AS0、AS04、AS03、AS-2疫苗佐劑、Avridine®、B7-2疫苗佐劑、Bay R1005、百日咳博德特氏菌成分疫苗佐劑、布比卡因疫苗佐劑、磷酸鈣凝膠、磷酸鈣疫苗佐劑、陽離子脂質體疫苗佐劑、陽離子脂質體-DNA複合物JVRS-100、霍亂毒素、霍亂毒素B次單元、棒狀桿菌衍生之P40疫苗佐劑、CpG DNA疫苗佐劑、CRL1OO5、CTA1-DD基因融合蛋白、DDA佐劑、DHEA疫苗佐劑、DL-PGL (聚酯聚(DL-丙交酯-共-乙交酯))疫苗佐劑、DOC/Alum複合物、大腸桿菌不耐熱毒素、Etx B次單元佐劑、鞭毛蛋白、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、γ菊糖、Gerbu佐劑、GM-CSF、GMDP、咪喹莫特、含有協同刺激分子抗體之免疫脂質體、ISCOM(s)™、ISCOMA-TRIX®、滅活的短小棒狀桿菌疫苗佐劑、脂多醣、脂質體、洛索立賓、LTK63疫苗突變體佐劑、LTK72疫苗佐劑、LTR192G疫苗佐劑、Matrix-S、MF59、Montanide Incomplete Seppic佐劑、Montanide ISA 51、Montanide ISA 720佐劑、MPL-SE疫苗佐劑、MPL™佐劑、MTP-PE脂質體、胞壁肽、胞壁醯二肽佐劑、木帕米啶(Murapalmitine)、D-木帕米啶、NAGO、奈米乳液疫苗佐劑、非離子界面活性劑囊泡、霍亂毒素無毒突變體E112K mCT-E112K、PMMA、Poly(LC)、Polygen疫苗佐劑、蛋白質脂質卷、QS-21、Quil-A疫苗佐劑、RC529疫苗佐劑、重組hlFN-γ/干擾素-g、Rehydragel EV、Rehydragel HPA、雷西莫特(Resiquimod)、Ribi疫苗佐劑、SAF-1、皂苷疫苗佐劑、胸腺肽、仙台蛋白脂質體、含仙台之脂質極致、Specol、SPT (抗原調配物)、基於角鯊烯之佐劑、硬脂醯酪胺酸、Theramide®、羥丁胺醯基胞壁醯二肽(TMDP)、Titer-Max Gold佐劑、Ty Particles疫苗佐劑及VSA-3佐劑。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可用作疫苗且可進一步包含可使得疫苗能夠引發更高免疫反應的佐劑。作為非限制性實例，佐劑可為亞微米水包油乳液，其可在人類小兒群體中引發更高免疫反應(參見例如美國專利公開案第US20120027813號及美國專利第8,506,966號中所述之佐劑疫苗，該等文獻之內容各自以全文引用之方式併入本文中)。
給藥及投與
本發明涵蓋藉由考慮藥物遞送科學之可能發展的任何適當途徑遞送核酸疫苗組合物，包括例如用於任何治療、預防、醫藥、診斷或成像用途的COVID-19核酸疫苗。遞送可為裸式的或調配的。
本發明之核酸疫苗組合物可裸式地遞送至細胞。如本文所用，「裸式」係指遞送不含促進轉染之試劑的核酸疫苗組合物。舉例而言，遞送至細胞之核酸疫苗組合物可不含修飾。裸核酸疫苗組合物可使用此項技術中已知及本文所述之投與途徑遞送至細胞。
本發明之核酸疫苗組合物可使用本文所述之調配物組分及方法調配。調配物可含有核酸疫苗組合物，該等組合物可經修飾及/或未經修飾。調配物可進一步包括但不限於細胞穿透劑、醫藥學上可接受之載劑、遞送劑、生物溶蝕性或生物相容性聚合物、溶劑及持續釋放遞送儲存物。所調配核酸疫苗組合物可使用此項技術中已知及本文所述之投與途徑遞送至細胞。
核酸疫苗組合物亦可經調配用於以此項技術之若干方式中之任一者直接遞送至器官或組織，該等方式包括但不限於：直接浸泡或沐浴，經由導管，藉由凝膠、粉末、軟膏、乳膏、凝膠、洗劑及/或滴劑，藉由使用塗佈或浸漬有組合物之基板，諸如織物或可生物降解材料，及其類似方式。本發明之核酸疫苗組合物亦可選殖至反轉錄病毒複製載體(RRV)中且轉導至細胞。
給藥
本文所提供的亦包括包含向有需要之個體投與本文所述之核酸疫苗的方法。視個體之物種、年齡、健康及一般狀況、疾病之嚴重程度、特定組合物、其投與模式、其活動模式及類似因素而定，所需之精確量將因個體而異。出於易於投與及劑量之均勻性考慮，組合物通常以單位劑型調配。然而，應理解，組合物之每天總用量將由主治醫師在合理的醫學判斷範疇內決定。用於任何特定患者之特定治療有效、預防有效或適當成像劑量水準將視多種因素而定，該等因素包括所治療病症及病症嚴重度；所用特定化合物之活性；所用特定組合物；患者之年齡、體重、一般健康、性別及膳食；所用特定化合物之投與時間、投與途徑及排泄率；治療持續時間；與所用特定化合物組合或同時使用之藥物；及醫學技術中熟知之類似因素。
本發明涵蓋以下劑量水準：約0.001至約500 mg核酸疫苗(例如COVID-19核酸疫苗，例如COVID-19 mRNA疫苗)/kg體重/天、約0.001至約200 mg/kg、約0.001至約100 mg/kg、0.01至約100 mg/kg，較佳約0.005至約50 mg/kg、0.01至約50 mg/kg、0.01至約40 mg/kg、0.01至約30 mg/kg、0.01至約10 mg/kg、0.05至約50 mg/kg、0.05至約30 mg/kg、0.05至約10 mg/kg、0.05至約5 mg/kg、0.1至約50 mg/kg、0.1至約30 mg/kg、0.1至約10 mg/kg、0.1至約1 mg/kg、1.0至約50 mg/kg、1.0至約40 mg/kg、1.0至約30 mg/kg、10至約50 mg/kg體重。其他實施例涵蓋約0.001-0.010、0.010-0.050、0.050-0.100、0.1-0.5、0.5-1.0、1.0-5.0、5.0-10、10-50 mg/kg、10-100 mg/kg體重的劑量。劑量可大約每小時、每天多次、每天、每隔一天、每週、每隔一週、每月、每隔一個月或根據需要投與。
在一些實施例中，核酸疫苗之組合物可以足以遞送約0.0001 mg/kg至約100 mg/kg、約0.001 mg/kg至約0.05 mg/kg、約0.005 mg/kg至約0.05 mg/kg、約0.001 mg/kg至約0.005 mg/kg、約0.05 mg/kg至約0.5 mg/kg、約0.01 mg/kg至約50 mg/kg、約0.1 mg/kg至約40 mg/kg、約0.5 mg/kg至約30 mg/kg、約0.01 mg/kg至約10 mg/kg、約0.1 mg/kg至約10 mg/kg、約1 mg/kg至約25 mg/kg、約1 mg/kg至約50 mg/kg、約10 mg/kg至約100 mg/kg、約10 mg/kg至約50 mg/k個體體重/天，一天一或多次之劑量水準投與，以獲得所需治療、診斷、預防或成像效應。所需劑量可一天三次、一天兩次、一天一次、每隔一天、每三天、每週、每兩週、每三週或每四週遞送。在某些實施例中，所需劑量可使用多次投藥進行遞送(例如兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次投藥)。當採用多次投藥時，可使用分次給藥方案，諸如本文中所述之彼等方案。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗之組合物可以足以向個體遞送約1 µg、10 µg、15 µg、20 µg、25 µg、30 µg、35 µg、40 µg、50 µg、60 µg、70 µg、80 µg、90 µg或100 µg核酸組合物之劑量水準投與。
在一些實施例中，核酸疫苗可以分次劑量方案投與。如本文所用，「分次劑量」係將單一單位劑量或每日總劑量分為兩次或更多次劑量，例如單一單位劑量之兩次或更多次投與。如本文所用之「單一單位劑量」為以一個劑量/一次性/單一途徑/單一接觸點、亦即單一投藥事件投與的任何治療劑的劑量。如本文所用，「每日總劑量」為24小時時段中給與或開處之量。其可以單一單位劑量形式進行投與。在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗以分次劑量向個體投與。核酸疫苗可僅在緩衝液中或在本文所述之調配物中調配。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗組合物可在兩個獨立階段(起始給藥階段及維持給藥階段)向個體投與。給藥方案可包含在預防、緩解及/或治療過程開始時首次給與個體之核酸疫苗的初始較高起始劑量，例如用於預防COVID-19之第一劑量，及在第一起始劑量之後的較低維持劑量。在一些實施例中，起始劑量及維持劑量具有相同量的本發明之核酸疫苗。在一些實施例中，向個體投與超過一個維持劑量。可每兩週、每三週、每四週、每個月、每兩個月、每三個月、每四個月、每五個月或每六個月投與多個維持劑量。在疫苗接種用於預防病症，例如用於COVID-19之核酸(例如mRNA)疫苗的情形下，核酸疫苗之維持劑量亦可稱為加強劑量。如本文所用，「加強劑量」(或「加強注射」)為初始引子劑量之後的額外或補充劑量之疫苗。加強劑量之核酸疫苗的量可與初始起始劑量相同。或者，加強劑量之核酸疫苗的量小於初始劑量中之核酸疫苗的原始量。在一些實施例中，個體可接受一個、兩個、三個、四個或更多個加強劑量。
此類投藥可用作臨床相關病狀之慢性或急性治療或預防。可與載劑組合以產生單一劑型之藥物的量將視所治療之宿主及特定投與模式而變化。典型的製劑將含有約5%至約95%活性化合物(w/w)。較佳地，此類製劑含有約20%至約80%、30%至約70%、40%至約60%或約50%活性化合物。在其他實施例中，本發明中所用之製劑將為約5-10%、10-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-99%或大於99%之活性成分。
在個體之病狀改善時，必要時可投與維持劑量之本發明之化合物、組合物或組合。隨後，投與劑量或頻率或兩者可隨症狀而減少至在症狀已緩解至所需水準時保持病狀改善的水準，治療應停止。然而，患者可在任何疾病症狀復發時要求長期間歇性治療。
熟習此項技術者應瞭解，可能需要比上述劑量更低或更高的劑量。任何特定患者之特定劑量及治療方案將視多種因素而定，該等因素包括所用特定化合物之活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、投與時間、排泄率、藥物組合、感染之嚴重程度及病程、患者對感染之處置及治療醫師之判斷。
遞送
在一些實施例中，核酸疫苗之遞送可為裸式的或調配的。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可裸式地遞送至細胞。如本文所用，「裸式」係指遞送不含促進轉染之試劑的核酸疫苗。舉例而言，遞送至細胞之核酸疫苗可不含修飾。裸核酸疫苗可使用此項技術中已知及本文所述之投與途徑遞送至細胞。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可使用本文所述之方法調配。調配物可進一步包括但不限於細胞穿透劑、醫藥學上可接受之載劑、遞送劑、生物溶蝕性或生物相容性聚合物、溶劑及持續釋放遞送儲存物。所調配核酸疫苗可使用此項技術中已知及本文所述之投與途徑遞送至細胞。
組合物亦可經調配用於以此項技術之若干方式中之任一者直接遞送至器官或組織，該等方式包括但不限於：直接浸泡或沐浴，經由導管，藉由凝膠、粉末、軟膏、乳膏、凝膠、洗劑及/或滴劑，藉由使用塗佈或浸漬有組合物之基板，諸如織物或可生物降解材料，及其類似方式。
投與
在一些實施例中，本發明之核酸疫苗組合物可藉由產生預防或治療有效結果之任何途徑投與。此等包括但不限於腸內(至腸中)、胃腸道、硬膜外(至硬腦膜中)、口服(經由口腔)、經皮、硬膜外、腦內(至大腦中)、腦室內(至腦室中)、上表皮(施用至皮膚上)、皮內(至皮膚本身中)、皮下(皮膚下)、經鼻投與(經由鼻子)、靜脈內(至靜脈中)、靜脈內彈丸注射、靜脈內滴瀝、動脈內(至動脈中)、肌內(至肌肉中)、心內(至心臟中)、骨內輸注(至骨髓中)、鞘內(至脊椎管中)、腹膜內(輸注或注射至腹膜中)、膀胱內輸注、玻璃體內(經由眼睛)、海綿竇內注射(至病理腔中)、腔內(至陰莖根部中)、陰道內投與、子宮內、羊膜外投與、經皮(經由完整的皮膚擴散用於全身分佈)、經黏膜(經由黏膜擴散)、經陰道、吹入(鼻吸)、舌下、唇下、灌腸、滴眼液(至結膜上)、滴耳液、耳道(在耳朵內或經由耳朵)、頰內(針對臉頰)、結膜、皮膚、牙科(針對一顆或多顆牙齒)、電滲透、子宮頸內、鼻竇內、氣管內、體外、血液透析、浸潤、間質、腹內、羊膜內、關節內、膽管內、支氣管內、囊內、軟骨內(在軟骨內)、尾部內(在馬尾內)、腦池內(在大腦延髓池內)、角膜內(在角膜內)、牙科角膜內、冠狀動脈內(在冠狀動脈內)、陰莖海綿體內(在陰莖海綿體的可擴張空間內)、椎間盤內(在椎間盤內)、管內(在腺管內)、十二指腸內(在十二指腸內)、硬膜內(在硬腦膜內或下方)、表皮內(至表皮)、食管內(至食道)、胃內(在胃內)、齦內(在齒齦內)、迴腸內(在小腸遠端部分內)、病灶內(在局部病灶內或直接引入局部病灶)、管腔內(在管腔內)、淋巴管內(在淋巴內)、髓內(在骨的骨髓腔內)、腦膜內(在腦膜內)、眼內(在眼內)、卵巢內(在卵巢內)、心包內(在心包內)、胸膜內(在胸膜內)、前列腺內(在前列腺內)、肺內(在肺或其支氣管內)、竇內(在鼻竇或眶周竇內)、脊柱內(在脊柱內)、滑膜內(在關節滑液腔內)、肌腱內(在肌腱內)、睾丸內(在睾丸內)、鞘內(在腦脊髓軸任何水準的腦脊髓液內)、胸腔內(在胸腔內)、小管內(在器官的小管內)、腫瘤內(在腫瘤內)、鼓室內(在耳中層內)、血管內(在一或多個血管內)、心室內(在心室內)、離子導入療法(藉助於電流，其中可溶性鹽離子遷移至身體組織中)、灌洗(沖刷或沖洗開放的傷口或體腔)、喉(直接在喉部)、鼻胃(經由鼻子且進入胃中)、封閉敷裹技術、經眼(至外眼)、口咽(直接至口咽)、非經腸、經皮、關節周圍、硬膜外、神經周、牙周、經直腸、呼吸(藉由口服或經鼻吸入呼吸道內，用於局部或全身作用)、球後(在腦橋或眼球後)、心肌內(進入心肌)、軟組織、蛛網膜下、結膜下、黏膜下、經胎盤(穿過或越過胎盤)、經氣管(穿過氣管壁)、經鼓膜(越過或穿過鼓腔)、輸尿管(至輸尿管)、尿道(至尿道)、陰道、骶管阻滯、診斷、神經阻滯、膽管灌注、心臟灌注、光除去法或脊髓。在特定實施例中，組合物可以允許其穿過血腦障壁、血管障壁或其他上皮障壁之方式進行投與。
本文所述之核酸疫苗經延長時段，例如一週至一年時段向個體遞送可藉由單次投與含有足夠活性成分之控制釋放系統持續所需釋放時段來實現。出於此目的，可利用各種控制釋放系統，諸如單片或儲集型微膠囊、儲槽式植入物、聚合水凝膠、滲透泵、囊泡、膠束、脂質體、經皮貼片、離子導入裝置及替代性可注射劑型。定位於需要遞送活性成分的部位係一些控制釋放裝置的額外特徵，可證明對治療某些病症有益。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可與活疫苗之投與類似地鼻內投與。在另一態樣中，聚核苷酸可與此項技術中已知之不活化疫苗之投與類似地肌內或皮內投與。
在經皮投與之某些實施例中，將使用電極(例如離子導入療法)、電穿孔或向皮膚施加短的高壓電脈衝、射頻、超音波(例如超音波電滲法)、微投射(例如微針)、噴射注射器、熱消融、磁泳、雷射、速度或光機械波來增強穿過皮膚障壁的遞送。藥物可包含於單層含藥黏合劑、多層含藥黏合劑、儲庫、基質或蒸汽型貼片中，或者可利用無貼片技術。亦可使用囊封、皮膚脂質流化劑或中空或實心微結構化經皮系統(MTS，諸如由3M製造的MTS)、噴射注射器來增強穿過皮膚障壁的遞送。用於幫助治療化合物穿過皮膚之調配物添加劑包括前藥、化學品、界面活性劑、細胞穿透肽、滲透增強劑、囊封技術、酶、酶抑制劑、凝膠、奈米粒子及肽或蛋白質伴隨蛋白。
其他緩慢釋放、儲庫式植入物或可注射調配物對於熟習此項技術者將為顯而易見的。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, JR Robinson編, Marcel Dekker Inc., New York, 1978；及Controlled Release of Biologically Active Agents, RW Baker, John Wiley & Sons, New York, 1987。前述者以全文引用之方式併入。
混合本文所述之核酸疫苗與聚合調配物適合於獲得極長作用持續時間的調配物，該聚合調配物包含可在投與後形成儲庫調配物之可生物降解聚合物。
當調配用於經鼻投與時，跨越鼻黏膜之吸收可藉由界面活性劑進一步增強，該等界面活性劑諸如甘膽酸、膽酸、牛膽酸、乙膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氫膽酸、甘胺去氧膽酸、環糊精及類似物，其量在約0.1與15重量%之間、約0.5與4重量%之間的範圍內或為約2重量%。據報導，另一類表現出更大功效與減少之刺激的吸收促進劑為烷基麥芽糖苷類，諸如十四烷基麥芽糖苷(Arnold, JJ等人,
J Pharm Sci,2004, 93: 2205-13；Ahsan, F等人,
Pharm Res, 2001,18:1742-46)及其中之參考文獻，該等文獻均特此以全文引用之方式併入。
醫藥組合物可呈無菌可注射製劑形式，例如作為無菌可注射水性或油性懸浮液。此懸浮液可根據此項技術中已知之技術，使用適合之分散劑或濕潤劑(諸如Tween 80)及懸浮劑調配。無菌可注射製劑亦可為於無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液，例如於1,3-丁二醇中之溶液。在可接受之媒劑及溶劑中，可採用的有甘露醇、水、林格氏溶液及等張氯化鈉溶液。另外，無菌不揮發性油習用作溶劑或懸浮介質。出於此目的，可採用任何溫和不揮發性油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。諸如油酸及其甘油酯衍生物之脂肪酸適用於製備可注射劑，天然醫藥學上可接受之油(諸如橄欖油或蓖麻油，尤其呈其聚氧乙基化型式)亦然。此等油溶液或懸浮液亦可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，諸如Ph. Helv或類似醇。
本發明之醫藥組合物可以任何經口可接受之劑型經口投與，該劑型包括但不限於膠囊、錠劑及水性懸浮液及溶液。在用於口服之錠劑之情況下，常用載劑包括乳糖及玉米澱粉。亦典型地添加潤滑劑，諸如硬脂酸鎂。對於以膠囊形式經口投與，適用的稀釋劑包括乳糖及乾燥玉米澱粉。當經口投與水性懸浮液時，將活性成分與乳化劑及懸浮劑組合。若需要，可添加某些甜味劑及/或調味劑及/或著色劑。
本發明之醫藥組合物亦可以用於經直腸投與之栓劑形式投與。此等組合物可藉由將本發明之活性成分與適合之無刺激性賦形劑混合來製備，該賦形劑在室溫下為固體但在直腸溫度下為液體且因此將在直腸中融化以釋放活性組分。此類材料包括但不限於可可脂、蜂臘及聚乙二醇。
當所需治療涉及藉由局部施用容易進入之區域或器官時，本發明之醫藥組合物之局部投與尤其適用。對於局部施用至皮膚，醫藥組合物應用含有懸浮於或溶解於載劑中之活性組分之適合的軟膏調配。用於局部投與本發明化合物之載劑包括但不限於礦物油、液體石油、白色石油、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟及水。或者，醫藥組合物可用含有懸浮於或溶解於載劑中之活性化合物之適合的洗劑或乳膏調配。適合的載劑包括但不限於礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六酯蠟、十六醇十八醇、2-辛基十二醇、苯甲醇及水。本發明之醫藥組合物亦可藉由直腸栓劑調配物或以適合的灌腸調配物形式局部施用至下腸道。本發明中亦包括局部經皮貼片。
本發明之醫藥組合物可藉由鼻氣霧劑或吸入投與。該等組合物根據藥物調配技術中熟知之技術製備，且可採用苯甲醇或其他適合的防腐劑、增強生物可用性之吸收促進劑、碳氟化合物及/或此項技術中已知之其他溶解劑或分散劑製備為於生理鹽水中之溶液。
當調配用於藉由吸入遞送時，多種調配物提供優點。將治療劑吸附至容易分散的固體，諸如二酮哌𠯤(例如Technosphere粒子(Pfutzner, A及Forst, T, 2005, Expert Opin Drug Deliv 2:1097-1106)或類似結構上得到一種使得治療化合物被快速初始吸收的調配物。含有治療化合物及賦形劑之凍乾粉末，尤其玻璃狀粒子可用於以良好生物可用性遞送至肺，例如參見Exubera
®(inhaled insulin, Pfizer, Inc.及Aventis Pharmaceuticals Inc.)及Afrezza
®(inhaled insulin, Mannkind, Corp.)。
劑型
本文所述之醫藥組合物可調配成本文所述之劑型，諸如局部、鼻內、氣管內或可注射(例如靜脈內、眼內、玻璃體內、肌內、心內、腹膜內、皮下)劑型。
液體劑型
用於非經腸投與之液體劑型包括但不限於醫藥學上可接受之乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿及/或酏劑。除活性成分以外，液體劑型亦可包含此項技術中常用之惰性稀釋劑，包括但不限於水或其他溶劑、增溶劑及乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油(特定言之，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及脫水山梨糖醇脂肪酸酯，及其混合物。在用於非經腸投與之某些實施例中，可將組合物與增溶劑混合，該等增溶劑諸如CREMO- PHOR®、醇、油、改質油、二醇、聚山梨醇酯、環糊精、聚合物及/或其組合。
可注射形式
可根據已知技術調配可注射製劑，例如無菌可注射水性或油性懸浮液，且可包括適合之分散劑、濕潤劑及/或懸浮劑。無菌可注射製劑可為含在無毒非經腸可接受之稀釋劑及/或溶劑中之無菌可注射溶液、懸浮液及/或乳液，例如1,3-丁二醇中之溶液。可採用的可接受媒劑及溶劑中包括但不限於水、林格氏溶液、U.S.P.及等張氯化鈉溶液。習知採用無菌不揮發性油作為溶劑或懸浮介質。出於此目的，可採用任何溫和的不揮發性油，包括合成單酸甘油酯或二酸甘油酯。可採用諸如油酸之脂肪酸製備可注射劑。
可注射調配物可例如藉由通過截留細菌之過濾器過濾來滅菌，及/或藉由併入滅菌劑，呈無菌固體組合物形式，在使用之前可溶解或分散於無菌水或其他無菌可注射介質中來滅菌。
為了延長活性成分之作用，可能需要減緩來自皮下或肌內注射之活性成分之吸收。此可藉由使用具有低水溶性之結晶或非晶形材料之液體懸浮液來達成。核酸疫苗之吸收速率則視其溶解速率而定，而溶解速率又可視晶體大小及結晶形式而定。或者，可由核酸疫苗溶解或懸浮於油性媒劑中來延遲非經腸投與之核酸疫苗之吸收。可注射積存形式係藉由在可生物降解聚合物(諸如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成核酸疫苗之微膠囊基質而製得。視核酸疫苗與聚合物之比例及所採用特定聚合物之性質而定，可控制聚核苷酸釋放速率。其他可生物降解聚合物之實例包括但不限於聚(原酸酯)及聚(酸酐)。可注射積存調配物可藉由將核酸疫苗囊封於與身體組織相容之脂質體或微乳液中來製備。
經肺
本文描述為適用於經肺遞送之調配物亦可用於鼻內遞送醫藥組合物。適於鼻內投與之另一調配物可為包含活性成分且具有約0.2 pm至500 pm之平均粒子的粗糙粉末。此類調配物可以採用鼻吸的方式投與，例如經由鼻孔快速自靠近鼻子之容器吸入粉末。
適合於經鼻投與之調配物可例如包含少至約0.1% (w/w)且多至100% (w/w)之活性成分，且可包含本文所述之額外成分中之一或多者。醫藥組合物可以適合於經頰投藥之調配物形式製備、封裝及/或出售。此類調配物可例如呈使用習知方法製得之錠劑及/或口含錠形式，且可例如含有約0.1%至20% (w/w)活性成分，其餘部分可包含經口可溶解的及/或可降解的組合物，且視情況包含本文所述之額外成分中之一或多者。或者，適於頰內投與之調配物可包含含有活性成分的粉末及/或氣溶膠化及/或霧化溶液及/或懸浮液。此類粉末狀、氣溶膠化及/或氣溶膠化調配物當分散時，可具有約0.1 nm至約200 nm範圍內的平均粒度及/或液滴尺寸，且可進一步包含本文所述之任何一或多種額外成分。
調配及/或製造醫藥劑中之一般考慮因素可見於例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第21版, Lippincott Williams & Wilkins, 2005中。
固體劑型：包衣或殼層
錠劑、糖衣藥丸、膠囊、丸劑及顆粒劑之固體劑型可製備有包衣及外殼，諸如腸溶包衣及醫藥調配技術中熟知之其他包衣。其可視情況包含乳濁劑，且可具有其僅在或優先在腸道之某一部分中釋放、視情況以延遲方式釋放活性成分之組成。可使用之包埋組合物之實例包括聚合物質及蠟。類似類型之固體組合物可用作使用諸如乳糖(lactose或milk sugar)以及高分子量聚乙二醇及其類似物之賦形劑之軟填充及硬填充明膠膠囊中的填充劑。
醫藥組合物之特性
本文所述之核酸疫苗醫藥組合物可使用生物可用性、治療窗、分佈體積、生物效應及藉由質譜法偵測聚核苷酸中之一或多者來表徵。
生物可用性
與缺乏如本文所述之遞送劑的組合物相比，核酸疫苗在與如本文所述之遞送劑一起調配成組合物時可展現生物可用性的增加。如本文所用，術語「生物可用性」係指向哺乳動物投與之給定量核酸疫苗的全身可用性。生物可用性可藉由量測在向哺乳動物投與化合物後，化合物之不變形式的曲線下面積(AUC)或最大血清或血漿濃度來評估。AUC為繪製沿縱座標之化合物之血清或血漿濃度(Y軸)相對於沿橫座標(X軸)之時間的曲線下面積測定。一般而言，特定化合物之AUC可使用一般技術者已知且如以全文引用之方式併入本文中之G. S. Banker, Modem Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, N.Y, Inc., 1996中所述之方法來計算。
Cmax值為在向哺乳動物投與化合物後，在哺乳動物之血清或血漿中達成的化合物最大濃度。特定化合物之Cmax值可使用一般技術者已知之方法來量測。如本文所用之片語「增加生物可用性」或「改良藥物動力學」意謂當與如本文所述之遞送劑共投與時，以AUC、Cmax或Cmin形式量測的第一核酸疫苗在哺乳動物中之全身可用性比在不進行此類共投與時的全身可用性更大。在一些實施例中，核酸疫苗之生物可用性可增加至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。
在一些實施例中，核酸疫苗之液體調配物可具有不同活體內半衰期，需要調節劑量以產生預防或治療效果。為解決此問題，在一些實施例中，核酸疫苗調配物可經設計以改良重複投與期間之生物可用性及/或預防或治療效果。此類調配物可使得核酸疫苗能夠持續釋放及/或降低核酸疫苗由核酸酶降解之速率。在一些實施例中，提供懸浮液調配物，其包含核酸疫苗、水不混溶的油儲庫、界面活性劑及/或共界面活性劑及/或共溶劑。油及界面活性劑之組合可實現核酸疫苗之懸浮液調配物。在水不混溶儲庫中遞送核酸疫苗可用於經由聚核苷酸自儲庫持續釋放至周圍生理環境來改良生物可用性及/或防止聚核苷酸由核酸酶降解。
在一些實施例中，包含二價及單價陽離子之組合的陽離子奈米粒子可用核酸疫苗調配。此類奈米粒子可在給定時段(例如，數小時、數天等)內在溶液中自發地形成。此類奈米粒子不在單獨的二價陽離子存在下或單獨的單價陽離子存在下形成。在陽離子奈米粒子中或在一或多種包含陽離子奈米粒子之儲庫中遞送核酸疫苗可藉由充當長效儲庫及/或降低核酸酶之降解速率來改良核酸疫苗生物可用性。
治療窗
與缺少如本文所述之遞送劑之所投與核酸疫苗組合物的治療窗相比，核酸疫苗在與本文所述之遞送劑一起調配成組合物時可展現所投與核酸疫苗組合物之治療窗的增加。如本文所用，「治療窗」係指引發預防或治療效果之機率較高的血漿濃度範圍或治療活性物質在作用部位之水準範圍。在一些實施例中，當與如本文所述之遞送劑共投與時，核酸疫苗之治療窗可增加至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。
分佈體積
與缺少如本文所述之遞送劑的組合物相比，核酸疫苗在與如本文所述之遞送劑一起調配成組合物時可展現改良的分佈體積(Vdist)，例如降低的或靶向的。分佈容積(Vdist)將體內藥物(例如，本發明之核酸疫苗)的量與血液或血漿中之藥物濃度相關聯。如本文所用之術語「分佈體積」係指體內含有與血液或血漿中濃度相同的藥物總量所需的液體體積：Vdist等於體內藥物量/血液或血漿中之藥物濃度。舉例而言，對於10 mg劑量及10 mg/L之血漿濃度，分佈體積將為1公升。分佈體積反映藥物存在於血管外組織中的程度。較大分佈體積反映與血漿蛋白質結合相比，化合物傾向於與組織組分結合。在臨床配置中，Vdist可用於確定達成穩態濃度之起始劑量。在一些實施例中，當與如本文所述之遞送劑共投與時，核酸疫苗之分佈體積可降低至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%。
生物效應
在一些實施例中，遞送至動物之核酸疫苗之生物效應可藉由分析動物中之蛋白質表現來分類。蛋白質表現可由分析自投與本文所述之核酸疫苗的哺乳動物收集之生物樣品確定。
藉由質譜分析偵測聚核苷酸
質譜分析(MS)為可在分子轉化為離子之後提供關於分子之結構及分子質量/濃度資訊的分析技術。分子首先經電離以獲取正電荷或負電荷，且接著其穿過質量分析儀，根據其質荷比(m/z)到達偵測器之不同區域。
使用質譜儀進行質譜分析，該質譜儀包括用於電離分級樣品且產生帶電分子用於進一步分析的離子源。例如，樣品的電離可藉由電噴霧電離(ESI)、大氣壓化學電離(APCI)、光電離、電子電離、快速原子轟擊(FAB)/液體二次電離(LSIMS)、基質輔助雷射解吸/電離(MALDI)、場電離、場解吸、熱噴霧/電漿噴霧電離及粒子束電離來進行。熟習此項技術者應理解，電離方法的選擇可基於待量測之分析物、樣品類型、偵測器類型、正模式相對於負模式的選擇等來確定。
在樣品已被電離之後，可分析由此產生之帶正電或帶負電離子以確定質荷比(亦即，m/z)。用於確定質荷比之合適分析儀包括四極分析儀、離子阱分析儀及飛行時間分析儀。可使用若干偵測模式偵測離子。例如，可偵測選定離子(亦即，使用選擇性離子監測模式(SIM))，或者，可使用掃描模式，例如多反應監測(MRM)或選擇反應監測(SRM)偵測離子。
液相層析-多反應監測(LC-MS/MRM)結合穩定同位素標記之肽標準稀釋液已被證明是一種有效的蛋白質驗證方法(例如Keshishian等人,
Mol Cell Proteomics,2009, 8: 2339-2349；Kuhn等人,
Clin Chem2009, 55:1108-1117；Lopez等人,
Clin Chem, 2010, 56:281- 290；其內容各自以全文引用之方式併入本文中)。與生物標記發現研究中經常使用之非靶向質譜法不同，靶向MS方法為基於肽序列之MS模式，其將儀器之全部分析能力集中於複雜混合物中之數十至數百個選定肽上。與發現模式MS方法相比，藉由將偵測及片段化限制於僅來自所關注蛋白質之彼等肽，靈敏度及再現性得到顯著提高。此基於質譜法之多反應監測(MRM)蛋白質定量方法可經由對臨床樣品之快速、靶向、多重蛋白質表現分析顯著影響生物標記之發現及定量。
在一些實施例中，生物樣品一旦獲自個體，即可經受酶消化。如本文所用，術語「消化」意謂分解成較短肽。如本文所用，片語「處理樣品以消化蛋白質」意謂以分解樣品中之蛋白質的方式處理樣品。此等酶包括但不限於胰蛋白酶、內切蛋白酶Glu-C及胰凝乳蛋白酶。
在一些實施例中，可使用電噴霧電離分析生物樣品之蛋白質。電噴霧電離(ESI)質譜法(ESIMS)使用電能幫助離子自溶液轉移至氣相，隨後藉由質譜分析對離子進行分析。可使用此項技術中已知之方法(例如Ho等人,
Clin Biochem Rev.2003, 24(1):3-12；以全文引用之方式併入本文中)分析樣品。通過分散帶電液滴之細噴霧、蒸發溶劑及自帶電液滴中噴射離子以產生高度帶電液滴霧，可將溶液中包含的離子物質轉移至氣相中。可以使用至少1個、至少2個、至少3個或至少4個質量分析儀，諸如但不限於四極質量分析儀來分析高度帶電液滴霧。此外，質譜法可包括純化步驟。作為非限制性實例，第一個四極可設置為選擇單一m/z比，因此其可濾出具有不同m/z比的其他分子離子，此可消除MS分析之前複雜且耗時的樣品純化程序。
在一些實施例中，可在串聯ESIMS系統(例如，MS/MS)中分析生物樣品之蛋白質。作為非限制性實例，可使用產物掃描(或子掃描)、前驅體掃描(母掃描)、中性損失或多反應監測來分析液滴。
在一些實施例中，可使用基質輔助雷射解吸/電離(MALDI)質譜法(MALDIMS)分析生物樣品。MALDI提供大分子及小分子(諸如蛋白質)之非破壞性汽化及電離。在MALDI分析中，分析物首先與大量莫耳過量的基質化合物共結晶，該基質化合物亦可包括但不限於吸收紫外線之弱有機酸。MALDI中所用之基質之非限制性實例為a-氰基-4-羥基肉桂酸、3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸及2,5-二羥基苯甲酸。分析物-基質混合物之雷射輻射可導致基質及分析物蒸發。雷射誘導之解吸提供完整分析物之高離子產率，且允許以高精度量測化合物。可使用此項技術中已知之方法分析樣品(例如Lewis, Wei及Siuzdak,
Encyclopedia of Analytical Chemistry2000:5880-5894；其內容以全文引用之方式併入本文中)。作為非限制性示例，MALDI分析中所用之質量分析儀可包括線性飛行時間(TOF)、TOF反射器或傅立葉變換質量分析儀。
表現系統
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可以可操作方式連接於一或多種調節核苷酸序列且在表現構築體中編碼。調節核苷酸序列一般將適合於用於表現之宿主細胞。對於多種宿主細胞，此項技術中已知許多類型之適當表現載體及適合調節序列。通常，一或多個調節核苷酸序列可包括但不限於啟動子序列、前導或信號序列、轉錄起始及終止序列及強化子或活化子序列。亦考慮如此項技術中已知之組成型或可誘導型啟動子。啟動子可為天然存在之啟動子，或組合超過一種啟動子之元件之雜合啟動子。表現構築體可存在於細胞中之游離基因體(諸如質體)上，或表現構築體可插入染色體中。在一特定實施例中，表現載體包括允許選擇經轉化宿主細胞之可選標記基因。某些實施例包括表現載體，該表現載體編碼可操作地連接於至少一個調節序列之COVID-19序列的核酸疫苗。用於本文中之調節序列包括啟動子、強化子及其他表現控制元件。在某些實施例中，考慮待轉化之宿主細胞的選擇、待表現之特定核酸疫苗序列、載體之複本數、控制該複本數之能力或由載體編碼之其他蛋白質，諸如抗生素標記的表現來設計表現載體。
在一些實施例中，本文所述之核酸可在微生物中表現。作為非限制性實例，核酸可在細菌系統中，例如在短乳桿菌(
Bacillus brevis)、巨大芽孢桿菌(
Bacillus megaterium)、枯草芽孢桿菌(
Bacillus subtilis)、新月柄桿菌(
Caulobacter crescentus)、大腸桿菌(
Escherichia coli)及其衍生物中表現。例示性啟動子包括l-阿拉伯糖誘導性araBAD啟動子(PBAD)、lac啟動子、l-鼠李糖誘導型rhaP BAD啟動子、T7 RNA聚合酶啟動子、trc及tac啟動子、λ噬菌體啟動子Pl及無水四環素誘導型tetA啟動子/操縱子。
在一些實施例中，本文所述之核酸可在酵母表現系統中表現。可用於酵母載體中之啟動子之非限制性實例包括3-磷酸甘油酸激酶之啟動子(Hitzeman等人,
J. Biol. Chem. 255:2073 (1980))；其他糖酵解酶之啟動子(Hess等人
, J. Adv. Enzyme Res. 7:149 (1968)；Holland等人,
Biochemistry17:4900 (1978)。其他啟動子來自例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸葡萄糖異構酶、葡萄糖激酶醇氧化酶I (AOX1)、醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關之降解酶及前述甘油醛-3-磷酸脫氫酶，及負責麥芽糖及半乳糖利用之酶。任何含有酵母相容性啟動子及終止序列，有或無複製起點之質體載體均為合適的。某些酵母表現系統為市售的，例如獲自Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.，例如用於釀酒酵母之Pyex 4T載體家族)、Invitrogen (Carlsbad, Calif.，例如Ppicz系列Easy Select Pichia Expression Kit)及Stratagene (La Jolla, Calif.，例如用於粟酒裂殖酵母之ESP.TM. Yeast Protein Expression and Purification System及用於釀酒酵母之Pesc載體)。
在一些實施例中，本文所述之核酸可在哺乳動物表現系統中表現。哺乳動物啟動子之非限制性實例包括例如來自以下基因之啟動子：倉鼠之泛素/S27a啟動子(WO 97/15664)、猴空泡病毒40(SV40)早期啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動子、勞氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)(RSV)之長末端重複區、小鼠乳房腫瘤病毒啟動子(MMTV)、莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)長末端重複區及人類巨細胞病毒(CMV)的早期啟動子。其他異源哺乳動物啟動子之實例為肌動蛋白、免疫球蛋白或熱休克啟動子。在一特定實施例中，使用酵母醇氧化酶啟動子。
在一些實施例中，用於哺乳動物宿主細胞之啟動子可獲自病毒之基因體，該等病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒(UK 2,211,504，1989年7月5日公開)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猴病毒40 (SV40)。在其他實施例中，使用異源哺乳動物啟動子。實例包括肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子及熱休克啟動子。SV40之早期及晚期啟動子宜以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制性片段形式獲得。Fiers等人,
Nature273: 113-120 (1978)。人類巨細胞病毒之即刻早期啟動子適宜以HindIII E限制性片段形式獲得。Greenaway, P. J.等人,
Gene18: 355-360 (1982)。前述參考文獻以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本文所述之核酸可在昆蟲細胞表現系統中表現。採用昆蟲細胞宿主之真核表現系統可依賴於質體或桿狀病毒表現系統。典型的昆蟲宿主細胞衍生自草地夜蛾(草地黏蟲(
Spodoptera frugiperda))。對於異質蛋白質之表現，用桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾(
Autographa californica)核型多角體病毒之重組型形式感染此等細胞，該病毒具有在病毒多角體蛋白啟動子控制下表現之所關注基因。受此病毒感染之其他昆蟲包括商業上稱為「High 5」 (Invitrogen)之細胞株，其衍生自甘藍銀紋夜蛾(粉紋夜蛾(
Trichoplusia ni))。有時使用之另一桿狀病毒為家蠶(Bombyx mori)核型多角體病毒，其感染蠶(家蠶)。許多桿狀病毒表現系統為市售的，例如獲自Thermo Fisher (Bac-N- Blue
TMk或BAC-TO-BAC
TM系統)、Clontech (BacPAK
TM桿狀病毒表現系統)、Novagen (Bac Vector System
TM)或獲自Pharmingen或Quantum Biotechnologies之其他者。另一種昆蟲細胞宿主為常見的果蠅黑腹果蠅(
Drosophila melanogaster)，Thermo Fisher (The DESTM System)為其商業提供了一種瞬時或穩定的基於質體之轉染套組。
在一些實施例中，細胞用表現本文所述之核酸的載體轉化。用於將新遺傳物質插入至真核細胞(包括動物及植物細胞)中之轉化技術為熟知的。病毒載體可用於將表現卡匣插入至宿主細胞基因體中。或者，載體可轉染至宿主細胞中。轉染可藉由如此項技術中所述之方法實現，諸如但不限於磷酸鈣沈澱、電穿孔、光學轉染、原生質體融合、刺穿感染及流體動力學遞送。
IV. 使用方法
本發明之一個態樣提供使用本發明之核酸疫苗及包含核酸疫苗及至少一種醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物及調配物的方法。本文提供用於診斷、治療、緩解或預防人類或其他哺乳動物之疾病或病狀的組合物、方法、套組及試劑，其中活性劑為核酸疫苗、含有核酸疫苗之細胞或自核酸疫苗聚核苷酸轉譯之多肽。
在一些實施例中，可使用任何表明對個體有益之終點來評估使用方法，包括但不限於(1)在一定程度上抑制疾病進展，包括穩定、減緩及完全遏制；(2)減少疾病發作及/或症狀之數目；(3)抑制(亦即減少、減緩或完全停止)疾病細胞浸潤至鄰近的周邊器官及/或組織中；(4)抑制(亦即減少、減緩或完全停止)疾病傳播；(5)自體免疫病狀的減輕；(6)與病症相關之生物標記之表現的有利變化；(7)在一定程度上緩解與病症相關之一或多種症狀；(8)增加治療後無病表現之時長；或(9)在治療後之給定時間點降低死亡率。
治療或預防用途
本文所述之核酸疫苗可用於保護、治療或治癒由與諸如但不限於病毒、細菌、真菌、寄生蟲及原生動物之感染物接觸引起的感染。作為非限制性實例，感染物為病毒且病毒為SARS-CoV-2及/或其變異體。在一些實施例中，SARS-CoV-2之變異體為VOI、VOC及VOHC變異體。
本文所述之核酸疫苗可用作預防劑，其中向個體投與核酸疫苗，且其中核酸疫苗聚核苷酸活體內轉譯以產生SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體，用於預防COVID-19。
本文所述之核酸疫苗可用作治療劑，其中向個體投與核酸疫苗，且其中核酸疫苗聚核苷酸活體內轉譯以產生SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體，用於緩解COVID-19之一或多種症狀。
在一些實施例中，提供用於治療或預防個體之病毒感染及/或與病毒感染或其症狀相關之疾病、病症或病狀的方法，該等方法藉由投與包含一或多種編碼病毒多肽之聚核苷酸的核酸疫苗。投與可與本文所述或此項技術中已知之抗病毒劑或抗細菌劑或小分子化合物組合。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可用於保護免於及/或防止可能已知或未知的新興或工程化威脅的傳播。
在一些實施例中，本文提供使用本文所述之核酸聚核苷酸在細胞、組織或生物體中誘導多肽(例如SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、肽、其片段或變異體之轉譯的方法。轉譯之多肽可用於預防、緩解及/或治療COVID-19。此類轉譯可為活體外、活體內、離體或在培養物中。細胞、組織或生物體可與有效量之含有核酸疫苗之組合物或醫藥組合物接觸，該核酸疫苗包括具有至少一個編碼所關注多肽之區域的聚核苷酸(例如，SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、多肽、肽、其片段或變異體，用於治療及/或預防COVID-19。
在一些實施例中，向細胞、組織或個體提供的本文所述之核酸疫苗之有效量可足以用於免疫預防。
核酸疫苗之組合物之「有效量」至少部分地基於以下各者提供：目標組織、目標細胞類型、投與方式、聚核苷酸之物理特徵(例如未經修飾及經修飾之核苷的大小及數目)及核酸疫苗之其他組分。含有本文所述之核酸疫苗之組合物的有效量為相比於未處理細胞，隨細胞中產生之SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、多肽、肽、其片段或變異體而變地提供誘導或加強免疫反應的量。增加的產量可藉由增加的細胞轉染(亦即經核酸疫苗轉染之細胞的百分比)、增加的來自聚核苷酸之蛋白質轉譯或改變的宿主細胞之先天性免疫反應來證明。
本文所提供的係關於在有需要之哺乳動物個體中誘導SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、多肽、肽、其片段或變異體之活體內轉譯的方法。使用本文所述之遞送方法向個體投與有效量之核酸疫苗組合物，該核酸疫苗組合物含有具有至少一個編碼多肽(例如SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、多肽、肽、其片段或變異體)之可轉譯區的聚核苷酸。聚核苷酸以使得聚核苷酸在細胞中轉譯之量及其他條件提供。聚核苷酸所位於的細胞，或細胞所存在的組織可用一或多輪核酸疫苗投與來靶向。
在某些實施例中，投與之包含聚核苷酸之核酸疫苗指導一或多種多肽的產生，該一或多種多肽提供在轉譯該多肽之細胞、組織或生物體中基本上不存在的功能性免疫系統相關活性。例如，缺失的功能活性本質上可為酶、結構或基因調節的。在相關實施例中，投與之聚核苷酸指導一或多種多肽的產生，該一或多種多肽增加與免疫系統相關的功能活性，該免疫系統存在於轉譯多肽之細胞中但基本上缺乏。
另外，自核酸疫苗轉譯之多肽可直接或間接地拮抗存在於細胞中、細胞表面上或自細胞分泌之生物部分的活性。可被拮抗之生物部分的非限制性實例包括核酸、碳水化合物、蛋白質毒素(諸如志賀及破傷風毒素)、脂質(例如膽固醇)、脂蛋白(例如低密度脂蛋白)或小分子毒素(例如，霍亂、肉毒桿菌及白喉毒素)。在一些實施例中，可被拮抗之生物分子可為內源性蛋白質，其可能具有非所需活性，諸如但不限於細胞毒性或細胞抑制活性。本文所述之蛋白質可經工程化以定位於細胞內，可能在特定區室，諸如細胞質或細胞核內，或經工程化以自細胞分泌或易位至細胞的質膜。
在一些實施例中，核酸疫苗之聚核苷酸及其編碼之多肽可用於治療多種疾病、病症及/或病狀中之任一者，包括但不限於病毒感染(例如，由SARS-CoV-2及/或其變異體引起之感染)。
可投與核酸疫苗的之個體罹患或可處於患上疾病、病症或有害病狀的風險下。提供了在此等基礎上對個體進行鑑別、診斷及分類之方法，其可包括臨床診斷、生物標記水準、全基因組關聯研究(GWAS)及此項技術中已知之其他方法。
藥劑(例如，核酸疫苗及任何額外部分之組合物)可同時投與，例如以組合單位劑量(例如，提供兩種藥劑之同時遞送)。藥劑亦可以指定的時間間隔，諸如但不限於數分鐘、數小時、數天或數週之間隔投與。一般而言，藥劑可在個體中同時生物可用，例如可偵測。在一些實施例中，藥劑可基本上同時投與，例如同時投與兩個單位劑量，或兩種藥劑之組合單位劑量。在其他實施例中，藥劑可以分開的單位劑量遞送。藥劑可按任何次序投與，或者作為包括兩種或更多種藥劑之一或多種製劑投與。在一較佳實施例中，藥劑中之一者(例如第一藥劑)之至少一次投與可在另一藥劑(例如第二藥劑)之幾分鐘、一小時、兩小時、三小時或四小時內，或甚至一或兩天內進行。在一些實施例中，組合可達成協同結果，例如大於相加結果，例如比相加結果大至少25、50、75、100、200、300、400或500%。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可與其他預防或治療化合物一起投與。作為非限制性實例，預防或治療化合物可為佐劑或加強劑。如本文所用，當提及預防組合物，諸如疫苗時，術語「加強劑」係指額外投與預防組合物。加強劑(或加強疫苗)可在預防組合物之早先投與之後投與。初始投與預防組合物與加強劑之間的投與時間可為但不限於1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、1天、36小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、14天、21天、28天、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、18個月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或超過99年。
在一些實施例中，核酸疫苗可藉由本文所述之方法調配。在一個態樣中，調配物可包含核酸疫苗或聚核苷酸，該核酸疫苗或聚核苷酸可對超過一種疾病、病症或病狀具有治療及/或預防作用。作為非限制性實例，調配物可包含編碼SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、多肽、肽、其片段或變異體的聚核苷酸，用於治療及/或預防COVID-19。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可用於許多應用中之研究，諸如但不限於鑑別及定位細胞內及細胞外蛋白質、蛋白質相互作用、信號路徑及細胞生物學。
免疫反應調節
在一些實施例中，包含本文所述之聚核苷酸的核酸疫苗可充當疫苗形式之單一組合物。如本文所用，「疫苗」係指在生物體，例如動物生物體，例如哺乳動物生物體(例如人類)中刺激、誘發、引起或提高免疫的組合物、物質或製劑。較佳地，疫苗提供針對生物體中之一或多種疾病或病症的免疫，包括預防性及/或治療性免疫。例示性疫苗包括一或多種類似於感染物(例如致病微生物)的藥劑，且可由例如活、減毒、修飾、減弱或滅活形式之致病微生物或由其衍生之抗原製成，包括抗原成分的組合。在例示性實施例中，疫苗刺激、誘發、引起或提高生物體的免疫或引起或模擬生物體中之感染而不誘發任何疾病或病症。疫苗將抗原引入個體之組織、細胞外間隙或細胞中且引發免疫反應，從而保護個體免受特定疾病或病原體感染。本文所述之核酸疫苗可編碼抗原，且當聚核苷酸在細胞中表現時，達成所需免疫反應。作為非限制性實例，本文所述之核酸疫苗可編碼SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、多肽、肽、其片段或變異體，且當聚核苷酸在細胞中表現時，達成針對SARS-CoV-2之所需免疫反應以治療及/或預防COVID-19。
可預防性或治療性投與核酸疫苗作為健康個體之主動免疫接種方案之一部分，或該等核酸疫苗在培育階段期間之感染早期或在症狀發作之後的活動性感染期間投與。
在標準的第一線治療，諸如抗生素及抗病毒劑未能誘導被動免疫之後，本文所述之核酸疫苗亦可作為第二線治療投與。就此而言，本文所述之核酸疫苗可用於已對第一線治療產生抗性且疾病持續存在且誘發慢性疾病的情況。
核酸疫苗可作為潛伏病毒感染(諸如SARS-CoV-2感染)之治療方案的一部分進行投與。在此實施例中，投與一或多種聚核苷酸以治療及/或預防COVID-19，該一或多種聚核苷酸最終產生達成針對SARS-CoV-2之所需免疫反應的蛋白質。
RNA用於疫苗中或用作疫苗克服了涉及將DNA併入細胞中之習知基因疫苗接種的缺點(就安全性、可行性、適用性及產生免疫反應的有效性而言)。RNA分子被認為比DNA疫苗安全得多，因為RNA更容易降解。其迅速自生物體中清除，且無法整合至基因體中且以不可控制的方式影響細胞之基因表現。RNA疫苗亦不太可能引起嚴重的副作用，例如產生自體免疫疾病或抗DNA抗體(
Bringmann A.等人,
Journal of Biomedicine and Biotechnology(2010), 第2010卷, 文章編號623687)。用RNA轉染僅需插入細胞之細胞質中，其比插入細胞核中更容易達成。然而，RNA容易受到細胞之細胞質中之RNase降解及其他自然分解的影響。
增加RNA疫苗之穩定性及存放期的各種嘗試。頒予
Von Der Mulbe等人之美國公開案第US 20050032730號揭示藉由增加mRNA分子之G(鳥苷)/C(胞嘧啶)含量來改良mRNA疫苗組合物的穩定性。頒予Feigner等人之美國專利第5,580,859號教示併入編碼與mRNA結合且調節mRNA穩定性之調節蛋白的聚核苷酸序列。雖然不希望受理論束縛，但咸信本文所述之核酸疫苗可至少部分由於構築體設計之特異性、純度及選擇性而改良穩定性及治療功效。另外，可將經修飾核苷或其組合引入本文所述之核酸疫苗中以活化先天性免疫反應。當與多肽及/或其他疫苗組合時，此類活化分子適用作佐劑。在某些實施例中，活化分子含有編碼可用作疫苗之多肽序列的可轉譯區，從而提供作為自佐劑的能力。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可用於預防、治療及診斷由感染物，諸如但不限於SARS-CoV-2或SARS-CovV-2之VOC、VOI或VOHC引起的疾病及身體障礙。本文所述之核酸疫苗可編碼至少一種所關注多肽(例如，SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、多肽、肽、其片段或變異體)且可提供給個體以刺激免疫系統來防止病原體。作為非限制性實例，來自感染物的生物活性及/或作用可藉由提供以下者而抑制及/或消除：具有結合及中和感染物之能力的中和抗體；由核酸疫苗轉譯之多肽刺激之免疫系統所產生的中和抗體。
作為非限制性實例，可將編碼免疫原之聚核苷酸遞送至細胞以觸發多種先天性反應途徑(參見PCT專利申請公開案第WO2012006377號及美國專利公開案第US20130177639號；該等專利之內容各自以全文引用之方式併入本文中)。作為另一非限制性實例，本文所述之核酸疫苗可以足以對脊椎動物具有免疫原性之劑量遞送至脊椎動物(參見PCT專利申請公開案第WO2012006372號及第WO2012006369號以及美國公開案第US20130149375號及第US20130177640號；該等公開案之內容各自以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可以足夠大以對刺激哺乳動物之免疫反應具有免疫原性的劑量遞送至哺乳動物(例如，人類)。免疫反應可防禦病毒感染，從而預防及/或治療疾病。作為非限制性實例，本文所述之核酸疫苗可治療及/或預防感染性疾病，包括病毒感染性疾病，諸如由SARS-CoV-2或SARS-CoV-2之VOC、VOI或VOHC引起的COVID-19。
本文所述之核酸疫苗可根據感染之流行率或未滿足之醫療需求的程度或水準而在各種環境中使用。作為非限制性實例，本文所述之核酸疫苗可用於治療及/或預防COVID-19感染，包括與COVID-19感染(包括由SARS-CoV-2之原始及突變型式引起的感染)相關之疾病及病狀。
隨著對該疾病愈來愈瞭解，COVID-19感染之症狀正在發生變化，但當前的症狀包括發熱或發冷、咳嗽、呼吸短促或呼吸困難、疲勞、身體酸痛、肌肉酸痛、頭痛、喉嚨痛、充血或流鼻涕、噁心及/或嘔吐、腹瀉以及新的味覺或嗅覺喪失。
在一些實施例中，與當前的抗病毒治療相比，本文所述之核酸疫苗可更好地設計以在轉譯時產生適當蛋白質構形，因為核酸疫苗共同選擇天然細胞機制。與離體製造且可引發非所需細胞反應之傳統疫苗不同，核酸疫苗以更天然的方式呈現給細胞系統。在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗為針對COVID-19定製的活性疫苗，其不僅可預防SARS-CoV-2感染，且亦可限制SARS-CoV-2的傳播。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可用於藉由以極快速的基於核酸之疫苗生產過程對新出現的病毒株起反應來預防大流行性COVID-19。
在一些實施例中，核酸疫苗之單次注射可為整個季節提供保護。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可為免疫刺激性的。核酸疫苗之聚核苷酸序列可進一步包含編碼促進免疫反應之細胞介素的序列區，該細胞介素諸如單核球激素、淋巴激素、介白素或趨化激素，諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INF-a、INF-γ、GM-CFS、LT-a或生長因子，諸如hGH。
COVID-19之治療及/或預防
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗編碼SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、多肽、肽、其片段或變異體，且可用於治療及/或預防COVID-19。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗可產生高得多的中和抗體效價，且其可比市售抗病毒劑更早地產生反應。作為非限制性實例，本文所述之核酸疫苗可產生比其他疫苗多10倍、或9倍、或8倍、或7倍、或6倍、或5倍、或4倍、或3倍的中和抗體效價。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗共同選擇天然細胞機制以在轉譯時產生適當蛋白質構形。與離體製造且可觸發非所需細胞反應之傳統疫苗不同，本文所述之核酸疫苗以更接近天然方式或正常細胞加工發生方式的方式引入至細胞系統中。另外，調配物可用於保護或靶向遞送核酸疫苗至個體之特定細胞或組織。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗代表一種不僅可預防感染且亦可限制COVID-19之傳播的靶向活性疫苗。
在一些實施例中，核酸疫苗可用於藉由以極快速的疫苗生產過程對新出現的病毒株起反應來預防大流行性SARS-CoV-2感染或COVID-19。
在一些實施例中，單次注射編碼SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、多肽、肽、其片段或變異體的核酸疫苗可提供保護至少6個月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年、至少10年、至少11年、至少12年、至少13年、至少15年或超過15年。
本文所述之核酸疫苗亦可用於維持或恢復個體或群體之抗原記憶，作為針對COVID-19或其他由SARS-CoV-2引起之疾病之疫苗接種計劃的一部分。
在一些實施例中，可產生核酸疫苗組合物，其包括編碼顯示出流行率增加全年感染率之SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、多肽、肽、其片段或變異體的聚核苷酸。SARS-CoV-2之蛋白質序列已顯示隨時間推移而變化或突變，其中一些突變顯示出感染率增加。作為非限制性實例，可產生核酸疫苗組合物，其包括編碼顯示出流行率增加全年感染率之SARS-CoV-2之一或多種蛋白質、多肽、肽、其片段或變異體的聚核苷酸，諸如但不限於刺突蛋白中之D614G突變。
在一些實施例中，核酸疫苗可用於在個體中誘導中和抗體。由本發明核酸疫苗誘導之中和抗體之中和活性可與本文所述之疫苗之所得有效性(例如免疫保護)相關。在一些態樣中，本發明核酸疫苗提供之免疫保護可大於恢復期個體中提供之免疫保護。本發明核酸疫苗誘導之中和活性可提高暴露於SARS-CoV-2或處於恢復期之個體的恢復率。與其他可用的mRNA疫苗，諸如BNT162b2及mRNA-1273相比，本發明核酸疫苗在所治療個體中誘導更高的中和抗體效價。在一些實施例中，核酸疫苗包括比其他COVID-19疫苗高至少10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍或4倍的中和抗體效價。
在一些實施例中，開發了疫苗接種方案或計劃，其不僅允許在當前年份進行疫苗接種，且亦允許跨年份、病毒株或其群組的記憶加強疫苗接種，以在群體中建立及維持記憶。以此方式，群體不太可能死於任何涉及舊病毒株復發的大流行或爆發。可利用先前疫苗組分病毒株之任何組合來產生或設計記憶加強疫苗。
在一些實施例中，投與作為記憶加強疫苗之核酸疫苗，以在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50年或超過50年之時段內加強記憶。
在一些實施例中，投與作為記憶加強疫苗之核酸疫苗以加強交替歷史年份的記憶，包括相對於當前年份之過去疫苗組分病毒株的每隔一年。在一些實施例中，疫苗組分之選擇可來自每第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10年或更多年。
在一些實施例中，投與作為記憶加強疫苗之核酸疫苗以在十年期間加強記憶。
在一些實施例中，核酸加強疫苗可一次或定期用於群體以產生群體免疫，此意謂大於30%之群體受到保護。
在一些實施例中，核酸加強疫苗可一次或定期用於群體以產生針對COVID-19之群體免疫，此意謂大於30%之群體受到保護。
在一些實施例中，核酸疫苗用於針對COVID-19之風險群體，諸如具有包括但不限於以下之預先存在病狀的群體：癌症；慢性腎病；慢性阻塞性肺病(COPD)；來自實體器官移植、血液或骨髓移植、免疫缺陷、HIV以及使用皮質類固醇或其他免疫弱化藥物的免疫功能不全狀態(免疫系統減弱)；肥胖(身體質量指數(BMI)為30或更高)；心臟病狀，諸如心衰竭、冠狀動脈疾病或心肌病；鐮狀細胞病；1型或2型糖尿病；哮喘(中度至重度)；腦血管疾病；囊性纖維化；高血壓症或高血壓；神經病狀，諸如癡呆症、肝病、懷孕、肺纖維化、吸菸及地中海貧血症。
在一些實施例中，核酸疫苗用於保護處於暴露於SARS-CoV-2之風險下的醫護人員。
作為非限制性實例，本發明之核酸疫苗包含LNP調配之聚核苷酸，其編碼具有D614G之全長S蛋白(SEQ ID NO: 27) (稱為「PTX-B」)。提供了使用PTX-B疫苗在個體中誘導保護性免疫反應的方法。保護性免疫反應可保護個體免受病毒感染，諸如SAR-CoV-2原始病毒株及其變異體的感染。SARS-CoV-2變異體可為任何VOC、VOI及/或VOHC病毒株。作為非限制性實例，變異體為α變異體、β變異體或δ變異體。
在一些實施例中，核酸疫苗PTX-B用於針對α變異體提供保護。
在一些實施例中，核酸疫苗PTX-B用於針對β變異體提供保護。
在一些實施例中，核酸疫苗PTX-B用於針對δ變異體提供保護。
在一些實施例中，核酸疫苗PTX-B用於在個體中誘導中和抗體。核酸疫苗PTX-B誘導具有高中和效價之抗體。舉例而言，所誘導抗體之中和效價為來自受感染個體或恢復期個體之血清之效價的至少100倍、90倍、80倍、70倍、60倍、50倍、40倍、30倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍。
在一些實施例中，提供核酸疫苗PTX-B之給藥方案。PTX-B之劑量範圍介於每kg個體體重1 µg至500 µg、1 µg至1 mg、1 mg至10 mg、1 mg至100 mg或10 mg至100 mg。在一些實例中，PTX-B之劑量可達成約10 µg、20 µg、25 µg、30 µg、35 µg、40 µg、45 µg、50 µg、60 µg、70 µg、80 µg、90 µg或100 µg核酸疫苗之劑量水準。投與至少一個劑量之核酸疫苗PTX-B。在一些實施例中，投與至少一個加強劑量之PTX-B。可在個體接受PTX-B之第一劑量之後一個月、兩個月、三個月、四個月、六個月或一年或超過一年向個體投與加強劑量。在一些情況下，向個體投與超過一個，例如兩個、三個、四個或超過四個加強劑量。
在另一實施例中，本發明之核酸疫苗包含LNP調配之聚核苷酸，該聚核苷酸編碼SARS-CoV-2變異體B.1.351 (南非變異體(SEQ ID NO: 43)之全長S蛋白。
V. 套組及裝置套組
本發明提供用於便利地及/或有效地進行本發明之方法的多種套組。通常，套組將包含足以允許使用者對個體進行多個治療及/或進行多個實驗的組分量及/或數目。
在一些實施例中，本發明提供用於活體外或活體內調節基因表現之套組，其包含本發明之核酸疫苗組合物或本發明之核酸疫苗組合物、調節其他基因、siRNA、miRNA或其他寡核苷酸分子之核酸疫苗組合物之組合。
套組可進一步包含包裝及說明書及/或遞送劑以形成調配物，例如用於向需要使用本文所述之核酸疫苗組合物治療之個體投與。遞送劑可包含生理鹽水、緩衝溶液、類脂質、樹枝狀聚合物或任何適合之遞送劑。
在一個非限制性實例中，緩衝溶液可包括氯化鈉、氯化鈣、磷酸鹽及/或EDTA。在另一非限制性實例中，緩衝溶液可包括但不限於生理鹽水、含2 mM鈣之生理食鹽水、5%蔗糖、含2 mM鈣之5%蔗糖、5%甘露糖醇、含2 mM鈣之5%甘露糖醇、乳酸林格氏液(Ringer's lactate)、氯化鈉、含2 mM鈣之氯化鈉及甘露糖(參見美國公開案第20120258046號；以全文引用的方式併入本文中)。在另一非限制性實例中，緩衝溶液可經沈澱或其可經凍乾。各組分之量可變化以實現一致、可再現更高濃度生理鹽水或單一緩衝液調配物。亦可改變該等組分以便增加核酸疫苗組合物在一段時間內及/或在多種條件下在緩衝溶液中之穩定性。
裝置
本發明提供可併入本發明之核酸疫苗組合物之裝置。此等裝置可含有可用於立即遞送至有需要之個體，諸如人類患者之穩定調配物。
裝置之非限制性實例包括泵、導管、針、經皮貼片、加壓嗅覺遞送裝置、電穿孔裝置、離子導入療法裝置、多層微流體裝置。裝置可用於根據單次、多次或分次給藥方案遞送本發明之核酸疫苗組合物。該等裝置可用於至生物組織、皮內、皮下或肌內遞送本發明之核酸疫苗組合物。適用於遞送寡核苷酸之裝置之更多實例揭示於國際公開案WO 2013/090648中，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
VI. 定義
在本說明書中各個位置處，本發明之化合物的取代基以群組或範圍形式揭示。特別要表明的是，本發明包括該等群組及範圍之成員的每一個單獨的子組合。
約：如本文所用，術語「約」意謂所述值之+/-10%。
以組合形式投與：如本文所用，術語「以組合形式投與」或「組合投與」意謂同時或在一定時間間隔內向個體投與兩種或更多種藥劑，使得每種藥劑對患者之作用可能發生重疊。在一些實施例中，各藥劑彼此間隔約60、30、15、10、5或1分鐘之內投與。在一些實施例中，藥劑之投藥以在一起足夠緊密的程度間隔開以使得達成組合(例如協同)作用。
佐劑：如本文所用，術語「佐劑」意謂增強個體對抗原之免疫反應的物質。本文所述之核酸疫苗可視情況包含一或多種佐劑。
動物：如本文所使用之術語「動物」係指動物界之任何成員。在一些實施例中，「動物」係指處於任何發育階段之人類。在一些實施例中，「動物」係指處於任何發育階段之非人類動物。在某些實施例中，非人類動物為哺乳動物(例如，嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、羊、牛、靈長類動物或豬)。在一些實施例中，動物包括但不限於哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚類及蠕蟲。在一些實施例中，動物可為基因轉殖動物、經基因工程改造之動物或純系。
抗原：如本文所定義，術語「抗原」係指組合物，例如物質或試劑，其在生物體中引起免疫反應，例如引起生物體的免疫反應以產生針對該物質或試劑的抗體，特別是在生物體中引起適應性免疫反應。抗原可為任何免疫原性物質，尤其包括蛋白質、多肽、多醣、核酸、脂質及其類似物。例示性抗原衍生自感染物。此類試劑可包括感染物之部分或次單元，例如感染物，例如細菌、病毒及其他微生物之外殼；外殼成分，例如外殼蛋白或多肽；表面成分，例如表面蛋白質或多肽；莢膜成分；細胞壁成分；鞭毛；菌毛；及/或毒素或類毒素)。某些抗原，例如脂質及/或核酸為抗原性的，較佳在與蛋白質及/或多醣組合時。
大致：如本文所用，如應用於所關注之一或多個值之術語「大致」或「約」係指類似於所陳述參考值之值。在某些實施例中，除非另外說明或另外自上下文顯而易見，否則術語「大致」或「約」係指在任一方向上(大於或小於)處於所陳述參考值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小百分比之內之一系列值(但該等數值將超出可能值之100%的情況除外)。
與……締合：如本文所用，當關於兩個或更多個部分使用時，術語「與……締合」、「結合」、「連接」、「附接」及「繫留」意謂該等部分直接或經由一或多個充當連接劑之額外部分而在物理上彼此締合或連接以形成足夠穩定之結構，使得該等部分在使用該結構之條件(例如生理學條件)下保持在物理上締合。「締合」不必嚴格經由直接共價化學鍵結進行。其亦可表示離子鍵結或氫鍵結或基於雜化之連接性足夠穩定以使得「締合的」實體保持實體締合。
雙功能性：如本文所用，術語「雙功能性」係指任何能夠具有或維持至少兩種功能的物質、分子或部分。該等功能可實現相同結果或不同結果。產生功能之結構可相同或不同。
生物相容性：如本文所用，術語「生物相容性」意謂與活細胞、組織、器官或系統相容，幾乎不引起損傷、毒性或被免疫系統排斥的風險。
生物可降解：如本文所用，術語「生物可降解」意謂能夠藉由活物之作用分解成無害產物。
生物活性：如本文所用，片語「生物活性」係指任何在生物系統及/或生物體中具有活性之物質的特徵。舉例而言，當向生物體投與時對彼生物體具有生物學作用之物質視為具有生物學活性。在特定實施例中，若甚至聚核苷酸之一部分亦具有生物活性或模擬被視為生物相關的活性，則可認為本文所述之聚核苷酸具有生物活性。
嵌合體：如本文所用，「嵌合體」為具有兩個或更多個不協調或異質部分或區域的實體。
化合物：如本文所用，術語「化合物」意欲包括所描繪之結構的所有立體異構體、幾何異構體、互變異構體及同位素。
本文所述之化合物可不對稱(例如具有一或多個立體中心)。除非另外指明，否則意指所有立體異構體，諸如對映異構體及非對映異構體。含有經不對稱取代之碳原子之本發明化合物可以光學活性或外消旋形式分離。此項技術中已知如何自光學活性起始物質製備光學活性形式之方法，諸如藉由解析外消旋混合物或立體選擇性合成。本文中所述之化合物中亦可存在烯烴、C=N雙鍵及其類似物之許多幾何異構體，且所有此類穩定異構體均涵蓋於本發明中。描述本發明之化合物的順式及反式幾何異構體，且可以異構體混合物或以分開之異構形式對其進行分離。
本發明化合物亦包括互變異構形式。互變異構形式由單鍵與相鄰雙鍵之調換及質子的伴隨遷移而產生。互變異構形式包括處於具有相同經驗式及總電荷之異構質子化狀態的質子轉移互變異構體。
本發明之化合物亦包括存在於中間物或最終化合物中之原子的所有同位素。「同位素」係指具有相同原子數但因為原子核中之中子數不同而具有不同質量數的原子。舉例而言，氫之同位素包括氚及氘。
本發明之化合物及鹽可藉由常規方法與溶劑或水分子組合製備以形成溶劑合物及水合物。
保守：如本文所用，術語「保守(conserved)」聚核苷酸序列或多肽序列之核苷酸或胺基酸殘基分別為在所比較之兩個或更多個序列之相同位置未發生改變的核苷酸或胺基酸殘基。相對保守之核苷酸或胺基酸為與序列中其他地方出現之核苷酸或胺基酸相比而言相關性較高之序列中之保守性核苷酸或胺基酸。
在一些實施例中，若兩個或更多個序列彼此100%相同，則將其稱為「完全保守」。在一些實施例中，若兩個或更多個序列彼此至少70%相同、至少80%相同、至少90%相同或至少95%相同，則將其稱為「高度保守」。在一些實施例中，若兩個或更多個序列彼此約70%相同、約80%相同、約90%相同、約95%、約98%或約99%相同，則將其稱為「高度保守」。在一些實施例中，若兩個或更多個序列彼此至少30%相同、至少40%相同、至少50%相同、至少60%相同、至少70%相同、至少80%相同、至少90%相同或至少95%相同，則將其稱為「保守」。在一些實施例中，若兩個或更多個序列彼此約30%相同、約40%相同、約50%相同、約60%相同、約70%相同、約80%相同、約90%相同、約95%相同、約98%相同或約99%相同，則將其稱為「保守」。序列之保守可應用於聚核苷酸或多肽之整個長度或可應用於其一部分、區域或特徵。
控制釋放：如本文所用，術語「控制釋放」係指符合特定釋放模式以實現治療作用之醫藥組合物或化合物釋放特徵。
細胞抑制：如本文所用，「細胞抑制」係指抑制、減少、抑止細胞(例如哺乳動物細胞(例如人類細胞))、細菌、病毒、真菌、原生動物、寄生蟲、朊病毒或其組合之生長、分裂或增值。
細胞毒性：如本文所用，「細胞毒性」係指將細胞(例如哺乳動物細胞(例如人類細胞))、細菌、病毒、真菌、原生動物、寄生蟲、朊病毒或其組合殺死或對其造成有害、有毒或致命的影響。
遞送：如本文所用，「遞送」係指遞送化合物、物質、實體、部分、負荷或有效負載的行為或方式。
遞送劑：如本文所用，「遞送劑」係指任何至少部分地有助於將聚核苷酸活體內遞送至所靶向細胞的物質。
去穩定化：如本文所用，術語「去穩定」、「去穩定化」或「去穩定化區域」意謂使某個區域或分子之穩定性比相同區域或分子之起始、野生型或原生形式小。
可偵測標記：如本文所用，「可偵測標記」係指一或多種與另一實體附接、併入另一實體中或與另一實體締合的標記物、信號或部分，該另一實體易於藉由此項技術中已知之方法偵測，該等方法包括放射線照相術、螢光、化學發光、酶活性、吸光度及其類似方法。可偵測標記包括放射性同位素、螢光團、發色團、酶、染料、金屬離子、配位體(諸如生物素、抗生物素蛋白、鏈黴親和素及半抗原)、量子點及其類似物。可偵測標記可位於本文中所揭示之肽或蛋白質中之任何位置。其可在胺基酸、肽或蛋白質內，或位於N端或C端。
分解：如本文所用，術語「分解」意謂分裂成較小的碎片或組分。在提及多肽或蛋白質時，消化引起產生肽。
給藥方案：如本文所用，「給藥方案」為投藥時程或由醫師確定之治療、預防或姑息劑照護方案。
囊封：如本文所用，術語「囊封」意謂封閉、包圍或包覆。
經編碼之蛋白質裂解信號：如本文所用，「經編碼之蛋白質裂解信號」係指編碼蛋白質裂解信號之核苷酸序列。
工程化：如本文所用，當核酸疫苗之實施例經設計以具有與起始點、野生型或天然分子不同的特徵或特性(無論結構上抑或化學上)時，該等實施例經「工程化」。
有效量：如本文所用，術語藥劑之「有效量」為足以實現有益的或所需的結果，例如臨床結果的量，且因此「有效量」視其應用情形而定。舉例而言，在投與治療癌症之藥劑的情形下，藥劑之有效量為例如相比於在未投與藥劑之情況下所獲得的反應，足以實現對癌症進行如本文所定義之治療的量。
胞外體：如本文所用，「胞外體」為由哺乳動物細胞分泌之囊泡或參與RNA降解之複合物。
表現：如本文所用，核酸序列之「表現」係指以下事件中之一或多者：(1)自DNA序列產生RNA模板(例如，藉由轉錄)；(2)處理RNA轉錄本(例如，藉由剪接、編輯、5'端帽形成及/或3'端處理)；(3)將RNA轉譯成多肽或蛋白質；及(4)多肽或蛋白質之轉譯後修飾。
特徵(feature)：如本文所用，「特徵」係指特徵(characteristic)、特性或獨特要素。
調配物：如本文所用，「調配物」包括核酸疫苗之至少一種聚核苷酸及遞送劑。
片段：如本文所用，「片段」係指一部分。舉例而言，蛋白質之片段可包含藉由使自經培養細胞分離之全長蛋白質分解而獲得的多肽。
功能性：如本文所用，「功能性」生物分子為展現出其特性及/或活性之生物分子之形式，其特徵在於該特性及/或活性。
同源性：如本文所用，術語「同源性(homology)」係指聚合分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的整體相關性。在一些實施例中，若聚合物分子之序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%相同或相似，則將其視為彼此「同源」。術語「同源(homologous)」必然係指在至少兩個序列(聚核苷酸或多肽序列)之間的比較。若對於具有至少約20個胺基酸的至少一個延伸部，兩個聚核苷酸序列編碼之多肽為至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至99%一致，則認為其同源。在一些實施例中，同源聚核酸苷序列之特徵在於能夠編碼具有至少4至5個特別指定之胺基酸的序列段。對於長度小於60個核苷酸之聚核苷酸序列，同源性由編碼具有至少4至5個特別指定之胺基酸的延伸部的能力來確定。若對於具有至少約20個胺基酸的至少一個延伸部，蛋白質為至少約50%、60%、70%、80%或90%一致，則認為兩個蛋白質序列同源。
一致性：如本文所用，術語「一致性」係指聚合分子之間，例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。
舉例而言，兩個聚核苷酸序列之一致性百分比的計算可藉由出於最佳比較目的而比對兩個序列來進行(例如，可將間隙引入第一及第二核酸序列中之一者或兩者中以便最佳比對且出於比較目的可忽略非一致序列)。在某些實施例中，出於比較目的比對之序列的長度為參考序列之長度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。接著比較在對應核苷酸位置處之核苷酸。當第一序列中之位置被與第二序列中之對應位置相同的核苷酸佔據時，則該等分子在該位置相同。在考慮到為求兩個序列之最佳比對而需要引入之間隙數目及各間隙長度的情況下，該兩個序列之間的一致性百分比與該等序列共有的一致位置之數目有關。可使用數學算法達成序列比較及測定兩個序列之間的一致性百分比。舉例而言，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用一些方法來確定，諸如以下各者中所述之方法：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M編, Oxford University Press, N.Y., 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.編, Academic Press, N.Y., 1993；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Computer Analysis of Sequence Data, 第I部分, Griffin, A. M及Griffin, H. G.編, Humana Press, N.J., 1994；及Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編, M Stockton Press, N.Y, 1991，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。舉例而言，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用Meyers及Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17)之演算法來確定，該演算法已併入使用PAM 120權重殘基表、空隙長度罰分12及空隙罰分4之ALIGN程式(2.0版)中。或者，可使用GCG套裝軟體中之GAP程式，使用NWSgapdna.CMP矩陣確定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比。常用於確定序列之間的一致性百分比的方法包括但不限於Carillo, H.及Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988)中所揭示之方法，該文獻以引用之方式併入本文中。用於測定一致性之技術編碼於公開可獲得之電腦程式中。用於測定兩個序列之間的同源性之例示性電腦軟體包括但不限於GCG套裝程式(Devereux, J.等人, Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA (Altschul, S. F.等人, J. Molec. Biol., 215, 403 (1990))。
感染物：如本文所用，片語「感染物」意謂能夠在生物體，例如在動物中產生感染的試劑。感染物可指可由於生物技術工程化的任何微生物、病毒、感染性物質或生物製品，或任何此類微生物、病毒、感染性物質或生物製品的任何天然存在或生物工程化成分，可導致人類、動物、植物或另一活有機體之新發及觸染性疾病、死亡或其他生物故障。
活體外：如本文所用，術語「活體外」係指發生在人工環境中(例如試管或反應容器中、細胞培養物中、皮氏培養皿(Petri dish)中等)而非發生在生物體(例如動物、植物或微生物)內的事件。
活體內：如本文所用，術語「活體內」係指發生在生物體(例如動物、植物或微生物或其細胞或組織)中之事件。
經分離：如本文所用，術語「經分離」係指物質或實體已與至少一些與其締合之組分(無論在自然界中或在實驗環境中)分離。經分離之物質關於其曾締合之物質的純度水準可不同。經分離之物質及/或實體可與其最初締合之其他組分的至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或更大分離。在一些實施例中，經分離之試劑為約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或超過約99%純。如本文所用，物質在其實質上不含其他組分時為「純的」。實質上經分離：「實質上經分離」意謂化合物自形成或偵測到該化合物之環境基本上分離。部分分離可包括例如富含本揭示案之化合物的組合物。實質上分離可包括含有至少約50重量%、至少約60重量%、至少約70重量%、至少約80重量%、至少約90重量%、至少約95重量%、至少約97重量%或至少約99重量%之本發明化合物或其鹽之組合物。用於分離化合物及其鹽之方法為此項技術中之工藝路線。
連接子：如本文所用，「連接子」係指一組原子，例如約10-1,000個原子，且可包含諸如但不限於碳、胺基、烷基胺基、氧、硫、亞碸、磺醯基、羰基及亞胺之原子或基團。連接子可在第一端附接至核鹼基或糖部分上之經修飾之核苷或核苷酸，且在第二端附接至有效負載，例如可偵測或治療劑。連接子可具有足夠的長度，以不干擾併入至核酸序列中。
經修飾：如本文所用，「經修飾」係指改變本文所述之分子的狀態或結構。可以多種方式修飾分子，包括在化學上、結構上及功能上修飾分子。
黏液：如本文所用，「黏液」係指黏性且包含黏液素醣蛋白之天然物質。
天然存在：如本文所用，「天然存在」意謂在無人工輔助之情況下存在於自然界中。
中和抗體：如本文所用，「中和抗體」係指與其抗原結合且藉由中和或消除抗原或感染物具有的任何生物活性來保護細胞免受抗原或感染物侵害的抗體。
非人類脊椎動物：如本文所用，「非人類脊椎動物」包括除了智人(Homo sapiens)之外的所有脊椎動物，包括野生及家養物種。非人類脊椎動物之實例包括但不限於哺乳動物，諸如羊駝、爪哇牛(banteng)、野牛、駱駝、貓、牛、鹿、狗、驢、大額牛(gayal)、山羊、豚鼠、馬、駱馬、騾、豬、兔、馴鹿、綿羊、水牛及犛牛(yak)。
核酸疫苗：如本文所用，「核酸疫苗」係指包括編碼抗原(例如抗原蛋白質或多肽)之核酸或核酸分子(例如聚核苷酸)的疫苗或疫苗組合物。在例示性實施例中，核酸疫苗包括核糖核酸(「RNA」)聚核苷酸、核糖核酸(「RNA」)或核糖核酸(「RNA」)分子。此類實施例可稱為核糖核酸(「RNA」)疫苗。
脫靶：如本文所用，「脫靶(off target)」係指對任何一或多個目標、基因或細胞轉錄本之任何非預期作用。
開放閱讀框架：如本文所用，術語「開放閱讀框架」或「ORF」係指連續聚核苷酸序列，例如DNA序列或RNA序列(例如mRNA序列)，其包含起始密碼子、包含複數個胺基酸編碼密碼子之後續區域及末端終止密碼子，其中包含複數個胺基酸編碼密碼子之區域不含終止密碼子。
可操作地連接：如本文所用，片語「可操作地連接」係指兩個或更多個分子、構築體、轉錄本、實體、部分或其類似物之間的功能性連接。
部分：如本文所用，聚核苷酸之「部分」或「區域」定義為聚核苷酸中任何小於聚核苷酸之整個長度的部分。
肽：如本文所用，「肽」之長度為小於或等於50個胺基酸，例如長度為約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸。
互補位：如本文所用，「互補位」係指抗體之抗原結合位點。
患者：如本文所用，「患者」係指可能尋求或需要治療、要求治療、正在接受治療、即將接受治療之個體，或受到經過訓練的專業人員針對特定疾病或病狀之照護之個體。
醫藥學上可接受：片語「醫藥學上可接受」在本文中用於指在合理醫學判斷範疇內，適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理益處/風險比相匹配的彼等化合物、材料、組合物及/或劑型。
醫藥學上可接受之賦形劑：如本文所用，片語「醫藥學上可接受之賦形劑」係指除本文所述之化合物以外的任何成分(例如，能夠懸浮或溶解活性化合物之媒劑)，且具有在患者中實質上無毒性及無炎性的特性。賦形劑可包括例如：抗黏劑、抗氧化劑、黏合劑、包衣、壓縮助劑、崩解劑、染料(顏料)、潤膚劑、乳化劑、填充劑(稀釋劑)、成膜劑或包衣、調味劑、芳香劑、助滑劑(流動增強劑)、潤滑劑、防腐劑、印刷油墨、吸附劑、懸浮劑或分散劑、甜味劑及水合用水。例示性賦形劑包括但不限於：丁基化羥基甲苯(BHT)、碳酸鈣、磷酸鈣(磷酸氫二鈣)、硬脂酸鈣、交聯羧甲纖維素、交聯聚乙烯吡咯啶酮、檸檬酸、交聯聚維酮、半胱胺酸、乙基纖維素、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露糖醇、甲硫胺酸、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯、微晶纖維素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚維酮、預膠凝化澱粉、對羥基苯甲酸丙酯、棕櫚酸視黃酯、蟲膠、二氧化矽、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、羥基乙酸澱粉鈉、山梨糖醇、澱粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化鈦、維生素A、維生素E、維生素C及木糖醇。
醫藥學上可接受之鹽：本發明亦包括本文所述之化合物的醫藥學上可接受之鹽。如本文所用，「醫藥學上可接受之鹽」係指所揭示之化合物之衍生物，其中母體化合物藉由將現有酸或鹼部分轉化為其鹽形式(例如藉由使游離鹼基與適合有機酸反應)來改性。醫藥學上可接受之鹽的實例包括但不限於鹼性殘基(諸如胺)之無機酸鹽或有機酸鹽；酸性殘基(諸如羧酸)之鹼金屬鹽或有機鹽；及其類似物。代表性酸加成鹽包括乙酸鹽、乙酸、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯磺酸、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙烷磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及其類似物。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂及其類似物，以及無毒性銨、四級銨及胺陽離子，包括但不限於銨、四甲銨、四乙銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺及其類似物。本發明的醫藥學上可接受之鹽包括例如由無毒無機酸或有機酸形成的母體化合物之習知無毒鹽。本發明之醫藥學上可接受之鹽可藉由習知化學方法由含有鹼性或酸性部分之母體化合物合成。一般而言，此類鹽可藉由使游離酸或鹼形式之此等化合物與化學計算量之適當鹼或酸於水中或於有機溶劑中或於兩者之混合物中反應來製備。一般而言，非水性介質為較佳，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。適合之鹽的清單見於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, 第1418頁；Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl及C.G. Wermuth (編), Wiley-VCH, 2008，及Beige等人, Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977)中；該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。
醫藥學上可接受之溶劑合物：如本文所用，術語「醫藥學上可接受之溶劑合物」意謂在晶格中併有適合之溶劑分子的本文所述之化合物。適合之溶劑在所投予之劑量下為生理學上可耐受的。舉例而言，溶劑合物可藉由自包括有機溶劑、水或其混合物之溶液結晶、再結晶或沈澱來加以製備。適合之溶劑的實例為乙醇、水(例如單水合物、二水合物及三水合物)、N-甲基吡咯啶酮(NMP)、二甲亞碸(DMSO)、N,N'-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N'-二甲基乙醯胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯啶酮、苯甲酸苯甲酯及其類似物。當水為溶劑時，溶劑合物稱作「水合物」。
藥物動力學：如本文所用，「藥物動力學」係指分子或化合物在涉及確定向活有機體投與之物質的結局時的任何一或多種特性。藥物動力學分成若干領域，包括吸收、分佈、代謝及排泄之程度及速率。此通常稱為ADME，其中：(A)吸收為物質進入血液循環之過程；(D)分佈為物質在整個體液及身體組織中之分散或擴散；(M)代謝(或生物轉化)為母體化合物變成子體代謝物之不可逆轉化；及(E)排泄(或消除)係指自身體消除物質。在罕見情況下，一些藥物在身體組織中不可逆地累積。
物理化學：如本文所用，「物理化學」意謂具有或涉及物理及/或化學性質。
每單位藥物(PUD)之多肽：如本文所用，PUD或每單位藥物之產物定義為在體液或組織中所量測之產物(諸如多肽)之每日總劑量(通常為1 mg、pg、kg等)的細分部分(通常以諸如pmol/mL、mmol/mL等之濃度定義)除以體液中之量測值。
預防：如本文所用，術語「預防」係指部分或完全地延遲感染、疾病、病症及/或病狀之發作；部分或完全地延遲特定感染、疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀、特徵或臨床表現的發作；部分或完全地延遲特定感染、疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀、特徵或表現的發作；部分或完全地延遲感染、特定疾病、病症及/或病狀之進展；及/或降低患上與感染、疾病、病症及/或病狀相關之病變的風險。
增殖：如本文所用，術語「增殖」意謂生長、擴增或增加或引起快速生長、擴增或增加。「增殖性」意謂具有增殖能力。「抗增殖性」意謂具有與增殖特性相反或不相稱的特性。
預防性：如本文所用，「預防性」係指用於預防疾病擴散之治療或作用過程。
預防：如本文所用，「預防」係指為維持健康並預防疾病擴散而採用之措施。「免疫預防」係指產生主動或被動免疫以防止疾病傳播的措施。
蛋白質裂解位點：如本文所用，「蛋白質裂解位點」係指可藉由化學、酶或光化學手段實現胺基酸鏈之控制裂解的位點。
蛋白質裂解信號：如本文所用，「蛋白質裂解信號」係指至少一個標示或標記用於裂解之多肽的胺基酸。
所關注蛋白質：如本文所用之術語「所關注蛋白質」或「所需蛋白質」包括本文所提供之蛋白質及其片段、突變體、變異體及改變形式。
經純化：如本文所用，「純化(purify)」、「經純化(purified)」、「純化(purification)」意謂自非所需組分、材料污物、混雜物或缺陷品變得實質上純的或乾淨的。
重複轉染：如本文所用，術語「重複轉染」係指用聚核苷酸轉染相同細胞培養物複數次。細胞培養物可轉染至少兩次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少11次、至少12次、至少13次、至少14次、至少15次、至少16次、至少17次、至少18次、至少19次、至少20次、至少25次、至少30次、至少35次、至少40次、至少45次、至少50次或更多次。
樣品：如本文所用，術語「樣品」或「生物樣品」係指其組織、細胞或組成部分之子組(例如體液，包括但不限於血液、黏液、淋巴液、滑液、腦脊髓液、唾液、羊水、羊膜臍帶血、尿液、陰道液及精液)。樣品進一步可包括由完整生物體或其組織、細胞或組分部分之子集或其級分或部分製備的勻漿、溶胞物或提取物，包括但不限於例如血漿；血清；脊髓液；淋巴液；皮膚、呼吸道、腸道及生殖泌尿道之外部切片；淚液；唾液；乳汁；血球；腫瘤；器官。樣品亦指培養基，諸如營養培養液或凝膠，其可含有細胞組分，諸如蛋白質或核酸分子。
信號序列：如本文所用，片語「信號序列」係指可引導蛋白質之轉運或定位之序列。
單一單位劑量：如本文所用之「單一單位劑量」為以一個劑量/一次性/單一途徑/單一接觸點、亦即單一投藥事件投與的任何治療劑的劑量。
類似性：如本文中所使用，術語「類似性」係指聚合分子之間，例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的整體相關性。聚合物分子彼此之類似性百分比的計算可以與一致性百分比之計算相同的方式進行，不同之處在於計算類似性百分比時要考慮如此項技術中所理解之保守性取代。
分次劑量：如本文所用，「分次劑量」為將單一單位劑量或每日總劑量分成兩個或更多個劑量。
穩定的：如本文所用，「穩定的」係指化合物足夠穩固以經受住自反應混合物分離達到適用純度且較佳能夠調配成有效治療劑。
穩定化：如本文所用，術語「使……穩定」、「穩定化」、「穩定化區域」意謂使之穩定或變得穩定。
個體：如本文所用，術語「個體」或「患者」係指可例如出於實驗、診斷、預防及/或治療目的向其投與組合物的任何生物體。典型個體包括動物(例如哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類及人類)。
實質上：如本文所用，術語「實質上」係指展現所關注之特徵或特性之全部或接近全部界限或程度的定性病症。生物技術中之一般技術者所瞭解，生物及化學現象很少(若曾有)進行完全及/或繼續進行完整或很少達成或避免絕對結果。因而本文中使用術語「實質上」以獲得許多生物及化學現象中所固有的完整性之潛在缺乏。
實質上相等：如本文所用，在其與各劑量之間的時間差異相關時，該術語意謂加上/減去2%。
實質上同時：如本文所用且在其與複數個劑量相關時，該術語意謂在2秒之內。
罹患：「罹患」疾病、病症及/或病狀之個體已診斷患有該疾病、病症及/或病狀或呈現其一或多種症狀。
易患：「易患」疾病、病症及/或病狀之個體尚未診斷患有該疾病、病症及/或病狀及/或可能未展現其症狀，但具有患上疾病或產生其症狀之傾向。在一些實施例中，易患疾病、病症及/或病狀(例如癌症)之個體的特徵可為以下中之一或多者：(1)與患上疾病、病症及/或病狀相關之基因突變；(2)與患上疾病、病症及/或病狀相關之遺傳多態性；(3)與患上疾病、病症及/或病狀之蛋白質及/或核酸的表現及/或活性增加及/或減少；(4)與患上疾病、病症及/或病狀相關之習慣及/或生活方式；(5)疾病、病症及/或病狀之家族史；及(6)暴露於與患上疾病、病症及/或病狀相關之微生物及/或經該微生物感染。在一些實施例中，易患疾病、病症及/或病狀之個體將患上該疾病、病症及/或病狀。在一些實施例中，易患疾病、病症及/或病狀之個體將不患上該疾病、病症及/或病狀。
持續釋放：如本文所用，術語「持續釋放」係指在特定時間段內符合釋放速率之醫藥組合物或化合物釋放特徵。
合成：術語「合成」意謂藉由人工生產、製備及/或製造。本文所述之聚核苷酸或多肽或其他分子的合成可為化學合成或酶合成。
疫苗：如本文所用，疫苗為包含至少一種編碼至少一個抗原之聚核苷酸的化合物或組合物。
目標細胞：如本文所用，「目標細胞」係指任何一或多個相關細胞。該等細胞可見於活體外、活體內、原位或生物體之組織或器官中。生物體可為動物，較佳為哺乳動物，更佳為人類，且最佳為患者。
治療劑：術語「治療劑」係指當向個體投與時，具有治療、診斷及/或預防作用及/或引發所需生物學及/或藥理學作用之任何藥劑。
治療有效量：如本文所用，術語「治療有效量」意謂當向罹患或易患感染、疾病、病症及/或病狀之個體投與時，足以治療該感染、疾病、病症及/或病狀，改良其症狀、對其進行診斷、預防及/或延遲其發作的所遞送之藥劑(例如核酸、藥物、治療劑、診斷劑、預防劑等)之量。
治療有效結果：如本文所用，術語「治療有效結果」意謂在罹患或易患感染、疾病、病症及/或病狀之個體中足以治療該感染、疾病、病症及/或病狀、改善其症狀、對其進行診斷、預防及/或延遲其發作的結果。
總日劑量：如本文所用，「總日劑量」為24小時時段內給予或以處方開具之量。其可以單一單位劑量形式進行投與。
轉染：如本文所用，術語「轉染」係指將外源性核酸引入至細胞中之方法。轉染方法包括但不限於化學方法、物理處理及陽離子脂質或混合物。
轉譯：如本文所用，「轉譯」為藉以使得聚核苷酸分子由核糖體或核糖體樣機構，例如細胞或人工加工以產生肽或多肽的過程。
轉錄：如本文所用，「轉錄」為藉以使得聚核苷酸分子由聚合酶或其他酶加工以產生聚核苷酸，例如RNA聚核苷酸的過程。
治療：如本文所用，術語「治療」係指部分或完全緩解、改善、改良、減輕特定感染、疾病、病症及/或病狀、延遲其發作、抑制其進展、降低其嚴重程度及/或降低其一或多種症狀或特徵之發生率。出於降低出現與某種疾病、感染、病症及/或病狀相關之病變的風險的目的，可向未展現該疾病、感染、病症及/或病狀之病徵的個體及/或向僅展現該疾病、感染、病症及/或病狀之早期病徵的個體投與治療。
未經修飾：如本文所用，「未經修飾」係指以任何方式改變之前的任何物質、化合物或分子。未經修飾可指，但並不始終指生物分子之野生型或天然形式。分子可經歷一系列修飾，由此，各經修飾之分子可充當後續修飾之「未經修飾」之起始分子。
疫苗：如本文所用，片語「疫苗」係指在特定疾病、病症或病狀之情況下改善免疫性的生物製劑。
病毒蛋白：如本文所用，片語「病毒蛋白」意謂源自病毒之任何蛋白。
實例 實例1. LNP調配之mRNA的活體內研究
如表6中所述地向五(5)組雌性C57bl/6隻小鼠，8隻小鼠/組(6週齡)投與調配物。在第0天及第21天對小鼠抽血，隨後在第1天及第22天經由肌內投與接受20微克(「µg」)表6之調配物中之一者。在第43天，使小鼠安樂死，且藉由心臟穿刺收集血液，收集脾臟且分離脾細胞。
表6. 調配物表
| 組 | 調配物之描述 |
| 1 | LNP調配之TdTomato mRNA陰性對照(SEQ ID NO: 46) |
| 2 | LNP調配之S蛋白受體結合域(RBD) mRNA (SEQ ID NO: 25) |
| 3 | LNP調配之全長S蛋白mRNA (「PTX-B」) (SEQ ID NO: 27) |
| 4 | LNP調配全長S蛋白，具有突變之弗林蛋白酶位點mRNA (SEQ ID NO: 26) |
| 5 | 杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，DPBS)對照 |
對來自第21天活體抽血之彙集樣品進行臨床分離病毒中和分析。在終止時(第43天)，量測血清抗體與SARS-CoV-2 RBD及S蛋白的結合、假病毒中和、臨床分離病毒中和及T細胞反應(藉由酶聯免疫斑點(ELIspot)及流動式細胞測量術測定)。
小鼠不存在明顯不良反應。來自初始初步抽血的資料顯示所有三種構築體均具有中和活性。第3組調配物(全長S蛋白mRNA)係最佳的，緊隨其後的為第4組調配物(具有突變之弗林蛋白酶位點的全長S蛋白)；第2組調配物(S蛋白RBD域)表現最差；且在任一陰性對照治療組中均未發現活性。
脾細胞用SARS-CoV抗原(RBD肽池加上S蛋白)刺激，且抗原特異性T細胞反應係藉由以ELISpot計數分泌IFN-γ之T細胞，或以流動式細胞測量術計數產生Th1細胞介素(IFN-γ/TNF-α/IL-2)及Th2細胞介素(IL-4/IL-5)之T細胞來量測。亦藉由多重小鼠細胞介素分析在SARS-CoV抗原刺激之T細胞的上清液中量測Th1細胞介素(IFN-γ/TNF-α/IL-2)及Th2細胞介素(IL-4/IL-5)。
ELISpot分析
ELISpot分析表明來自用第2組、第3組及第4組調配物治療之小鼠的脾細胞產生T細胞，該等T細胞回應於肽池而分泌IFN-γ，該肽池在S蛋白之RBD及保守S2區內含有重疊肽。第2組、第3組及第4組之反應類似，且兩個對照組均不顯示對肽池之顯著反應。相比於兩個對照組，流動式細胞測量術分析未在三組中偵測到顯著Th1或Th2反應。
直接結合ELISA用於確定任何抗體是否被引發與S蛋白結合。RBD域或全長S蛋白結合至盤，且將來自經治療小鼠之血清的不同稀釋液在盤中培育，隨後洗滌且藉由抗小鼠抗體偵測。來自第2組、第3組及第4組之血清對可結合RBD及全長S蛋白兩者之抗體呈陽性，且對照對結合呈陰性。
SARS-CoV-2中和分析
為確定自第2組、第3組或第4組調配物引發之抗體是否中和，使用兩種不同的分析。第一分析使用自安大略省(Ontario)首批COVID-19患者之一分離出的SARS-CoV-2病毒，且此分析之讀數為關於與活病毒及來自經治療小鼠之血清的不同稀釋液一起培育之Vero2 E6細胞健康狀況的顯微讀數。此分析已用於表徵來自恢復期患者的血清，其中ID50值範圍為1:80至1:320，因此選擇用於測試此等小鼠血清之稀釋系列介於1:20與1:2560之間。來自第1組小鼠之血清具有最小的可偵測中和活性。第2組顯示出一些中等活性，8個樣品中有6個的ID50介於1:20與1:80之間。第3組及第4組顯示出很強的中和活性，即使在1:2560之最高稀釋度下，大多數血清樣品亦保持100%的中和活性。結果提供於圖1中。
假病毒中和分析
第二中和分析由假病毒分析組成。此分析利用SARS-CoV-2 S蛋白假型慢病毒，該慢病毒編碼螢光素酶基因，且可感染表現hACE2及TMPRSS2之HEK293T細胞，以獲得更好的轉導效率。此分析之特徵在於確定來自約50名恢復期患者之血清效價，其中血清之平均ID50為約1:500，範圍為1:1至約1:10,000，但對於此研究，使用1:40至1:24,400之稀釋度範圍。來自兩個對照組(第1組及第5組)之血清活性極低或無活性。第2組具有顯著但較低的中和活性。第3組及第4組之活性高於分析之定量範圍。值經外推且平均ID50值為約1:50,000 (第3組)及約1:45,000 (第4組)。結果提供於圖2中。
結論
此研究表明，LNP調配之mRNA疫苗在三週時段內兩次向小鼠肌內注射時能夠引發可結合SARS-CoV-2之S蛋白的T細胞反應及抗體。經治療小鼠產生可中和SARS-CoV-2臨床分離株以及SARS-CoV-2假型慢病毒的抗體。此對於第3組及第4組調配物尤其如此，該等調配物導致各分析中之效價高於定量範圍。
實例2. 小鼠之中和抗體研究
候選疫苗，LNP調配之編碼具有D614G突變之全長S蛋白的疫苗(SEQ ID NO: 27；編碼區提供為SEQ ID NO: 7) (應用於表6中之第3組的疫苗調配物，下文稱為「PTX-B」)被選為進一步研究的候選物。評估了PTX-B在小鼠中產生中和抗體及T細胞反應的能力。三(3)組雌性C57BL/6小鼠(10隻小鼠/組)在第1天及第22天如下進行疫苗接種：
第1組：10 μg LNP調配之tdTomato mRNA (陰性對照)
第2組：1 μg PTX-B
第3組：10 μg PTX-B
在此研究中評估之參數包括對來自第一次免疫接種後三週(第22天)之活體抽血之彙集樣品的臨床分離病毒中和分析及假病毒中和分析；以及第二次免疫接種後終止(第43天)時的以下評估：血清抗體與SARS-CoV-2之S蛋白的結合、假病毒中和、臨床分離病毒中和、根據ELISpot及流動式細胞測量術之脾細胞T細胞反應以及細胞介素分泌。
小鼠在實驗的活體期未顯示出明顯的不良反應。來自第22天初始初步抽血之資料顯示，10 µg劑量水準產生中和抗體，而1 µg劑量水準與陰性對照組僅略有不同。
在終止時，在第二次免疫接種(加強)後三週，1 μg及10 μg劑量組在ELISpot分析中顯示出大致相等的T細胞反應，但10 μg劑量水準組在基於抗體之分析中之表現好得多，有證據表明IgG同型(總IgG、IgG1、IgG2b及IgG2c)水準較高。以1 µg給藥之小鼠的IgM水準高於以10 µg給藥之小鼠，可能歸因於10 µg組中更強的刺激所致的早期類別轉換。有IgGA之證據，尤其在10 µg劑量下，但此同型未被誘導至與IgG同型一樣高的水準。1及10 μg PTX-B均引發極強S特異性IgG、IgG1、IgG2b、IgG2c (1及10 μg PTX-B之終點效價分別為：對於IgG為2.7±0.9E6、3.0±0.5E7；對於IgG1為1.1±0.2E6、2.8±0.8E6；對於IgG2b為9.4±2.0E5、9.7±3.4E6；對於IgG2c為3.5±1.8E7、1.95±0.0E8)。1及10 μg PTX-B亦均引發強S特異性IgA (1及10 μg PTX-B之終點效價分別為：3.3±3.1E4、1.7±0.6E7)，不過效價低於IgG之效價。10 μg PTX-B之劑量通常誘導比1 μg之劑量更高的S特異性結合抗體。Th1抗體(IgG2b及IgG2c)優於Th2抗體(IgG1)亦表明PTX-B誘導了偏向Th1之抗體反應。在接受tdTomato mRNA之對照小鼠的血清中偵測到極低或極少的S特異性結合抗體。
與實例1一樣，第一中和分析使用自安大略省首批COVID-19患者之一分離出的SARS-CoV-2病毒，且第二分析為使用SARS-CoV-2 S蛋白假型慢病毒之假病毒中和分析。在兩個抗體中和試驗中，10 µg劑量組之表現均大大勝過1 µg劑量組，儘管此劑量組確實顯示出相當大的中和活性(與恢復期患者的血清所見的中和活性相比)。圖3示出SARS-CoV-2臨床分離株及假病毒中和分析之ID50 (可見50%感染性抑制的稀釋度)。來自陰性對照組之血清在任一分析中均未顯示活性。來自10 µg組之血清具有劑量反應性效應，顯示出顯著更高的中和活性，尤其在SARS-CoV-2臨床分離株分析中。使用多重比較藉由克拉斯卡-瓦立斯檢定(Kruskal-Wallis test)進行統計；在圖3中，**=P＜0.01，***=P＜0.001，****=P＜0.0001。在假病毒分析中，陰性對照組無顯著活性，1 µg劑量組有中等活性，且10 µg組有極強的中和活性，ID50至多為1:90,000。
藉由ELISpot進行IFN-γ分析以確定T細胞對疫苗免疫接種的反應。來自小鼠之脾細胞用SARS-CoV-2 S蛋白之肽池(315個具有11聚體重疊之15聚體肽)刺激。藉由ELISpot分析來量測產生IFN-γ之T細胞。與來自接種陰性對照之小鼠的T細胞相比，來自PTX-B免疫小鼠之T細胞產生IFN-γ的頻率更高(圖4)。小鼠在第1天及第22天接種PTX-B之初打及加打。在第43天處死小鼠，且在存在SARS-CoV-2肽池之情況下，在預先塗有抗IFN-γ抗體之96孔ELISpot盤上刺激脾細胞隔夜。培育後，將盤洗滌染色且用抗IFN-γ HRP抗體處理且在ELISpot讀數器上讀取。使用克拉斯卡-瓦立斯檢定與多重比較分析進行統計。
藉由Luminex之細胞介素分析顯示，用PTX-B免疫接種之小鼠以劑量依賴性方式產生高水準之IL-2、IFN-γ及GM-CSF，但產生低水準之IL-4及IL-10 (圖5)。小鼠在第1天及第22天接種PTX-B之初打及加打。在第43天處死小鼠，且在存在SARS-CoV-2肽池之情況下刺激脾細胞隔夜。藉由Luminex分析上清液中是否存在IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-4、IL-5及IL-10。藉由多重比較藉由克拉斯卡-瓦立斯檢定進行統計。在用PTX-B或對照免疫接種之小鼠的分析中不可偵測到TNF-α水準。有趣的是，在PTX-B免疫小鼠中可偵測到IL-5水準，但不會隨著疫苗接種而增加。
細胞免疫反應
PTX-B亦引發強細胞免疫反應。在加強疫苗接種後3週製備小鼠脾細胞，用S肽池刺激，且藉由IFN-γ/IL-4 ELISpot、CD4+及CD8+ T細胞之細胞介素產生的流動式細胞測量術分析，以及偵測經刺激脾細胞上清液中之細胞介素的多重免疫分析來量測S特異性細胞反應。此等分析顯示，1 μg及10 μg PTX-B均誘導穩固的S特異性細胞免疫反應，該誘導為偏向Th1的，如由CD4+ T細胞產生之主要Th1細胞介素(IFN-γ/TNF-α/IL-2)超過Th2細胞介素(IL-4/IL-5)所指示。值得注意的是，大量S特異性CD8+ T細胞被PTX-B誘導。與體液反應，尤其是nAb反應相比，1 μg及10 μg PTX-B引發之細胞反應通常相當。藉由流動式細胞測量術進行之細胞介素分析顯示，在PTX-B免疫小鼠中偵測到顯著比例的產生IL-2及IFN-γ之CD4+ (圖6A)及CD8+ (圖6B)細胞，尤其是產生CD8+ IFN-γ之細胞。相比之下，與對照小鼠相比，免疫小鼠中產生IL-4及IL-5之細胞無顯著差異。小鼠在第1天及第22天接種PTX-B之初打及加打。在第43天處死小鼠，且在存在SARS-CoV-2肽池之情況下刺激脾細胞隔夜。在隔夜刺激後，針對抗CD3、抗CD4及抗CD8抗體對細胞進行表面染色。接著將細胞固定且透化且針對IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4及IL-5進行染色。使用流動式細胞測量術評估細胞。圖6A及圖6B顯示產生TNF-α之細胞略高於對照小鼠，但並非始終以劑量依賴性方式高。此等結果表明接種PTX-B誘導了S蛋白特異性Th1反應。
確定用1 μg或10 μg PTX-B進行免疫接種產生相似的T細胞反應，均遠高於陰性對照組中的背景。對於基於抗體之分析(抗體水準及中和能力)，10 µg劑量勝過1 µg劑量。
實例3. 小鼠AAV6-hACE2攻擊模型
在AAV6-hACE2 (SARS-CoV-2之受體)轉染之C57BL/6小鼠中進行了一項非GLP攻擊研究，以研究PTX-B之保護功效。四組雌性C57BL/6小鼠(12隻小鼠/組)在第1天及第22天如下地接種PTX-B：
第1組：調配物緩衝液(陰性對照)
第2組：20 μg PTX-B
第3組：4 μg PTX-B
第4組：1 μg PTX-B
在第29天，動物用每隻小鼠1×10
11個AAV-hACE2載體基因體複本轉導，且接著在第38天用每隻小鼠2.5×10
4個TCID50與SARS-CoV-2進行鼻內攻擊。研究終止於第42天。此研究中評估之參數包括肺勻漿之感染性、肺中之病毒RNA水準及肺組織病理學。對小鼠實施安樂死，且取出一個肺進行組織學檢查，而將第二個肺一分為二，在培養基中進行均質化以用於感染性測試，及在RNA提取緩衝液中進行均質化以用於病毒負荷測定。
小鼠在實驗的活體期未顯示出明顯的不良反應。在第38天，在攻擊時量測體重，且接著在第42天，在即將處死前再次量測體重。在1 μg PTX-B疫苗接種組中觀測到統計顯著的體重減輕(20.39相對於18.54，9.07% p=0.0016) (圖7)。C57BL/6小鼠用PTX-B初打-加打免疫且經AAV6-hACE2轉導。在攻擊時(第38天)及即將處死前(第42天)量測體重。藉由雙因子變異數分析與多重比較進行分析。在圖7中，** p＜0.01。在20 µg或4 µg組或調配物對照組中未觀測到顯著體重減輕。
如圖8中所示，PTX-B在測試之所有三個劑量水準下均提供保護功效。在用20或4 µg疫苗(TCID50=0)免疫之小鼠中未發現感染性病毒，且用1 µg免疫接種之12隻小鼠中有10隻亦無感染性病毒(平均TCID50=1.25±2.93)，而調配物緩衝液陰性對照組之12隻小鼠中有11隻可容易地偵測到感染性SARS-CoV-2。在圖8中，TCID50意謂組織培養50%感染劑量。如所繪示，PTX-B中和SARS-CoV-2。在AAV6-hACE2轉導之C57BL/6小鼠中量測TCID50，該等小鼠藉由用3種不同劑量之PTX-B或調配物緩衝液陰性對照的初打-加打進行免疫。在加強免疫後7天用AAV6-hACE2轉導小鼠且在9天後進行攻擊。在用SARS-CoV-2攻擊後4天處死所有小鼠，且自肺勻漿中量測病毒(每組n=12) (**** p＜0.0001)。
此外，藉由PCR偵測肺中之病毒RNA證明了劑量反應性降低，高劑量組與陰性對照組之平均值之間的差異超過100倍。對感染小鼠之一個肺切片進行肺組織病理學分級。所有小鼠均展現顯著組織病理學。不清楚多少病理學歸因於SARS-CoV-2以及多少歸因於用於表現hACE2之AAV6病毒；然而，在用兩種更高劑量水準之PTX-B治療之小鼠組中存在組織病理學評分降低的趨勢(圖9)。總而言之，小鼠用指定量之PTX-B免疫，用AAV6-hACE2轉導，且九天後用SARS-CoV-2進行攻擊。攻擊後四天，對小鼠進行免疫且將左肺固定於福馬林中，進行組織學處理且由對治療條件不知情的認證病理學家在顯微鏡下檢查。為各樣品分配一個1-5的組織學評分，其中最低分為正常的。隨著疫苗劑量的增加，可見病理學降低的趨勢。
總之，使用AAV6-hACE2轉導小鼠模型，投與PTX-B (1、4及20 μg)賦予了針對SARS-CoV-2感染的保護，且對肺病理學具有積極影響，表明PTX-B具有保護性或損害預防特徵。安樂死時肺中之SARS-CoV-2 mRNA的總量亦減少。在低劑量(1 µg)疫苗接種組中觀測到攻擊後體重減輕。
實例4. 倉鼠攻擊模型
對用SARS-CoV-2攻擊之6-8週齡雄性敘利亞金倉鼠進行攻擊研究，以確定疫苗是否能保護免受感染。
敘利亞金倉鼠易受SARS-CoV-2感染，且已證明可用於評估候選疫苗。
第1組倉鼠接受20 µg LNP調配之全長S蛋白mRNA (PTX-B)。
第2組倉鼠接受4 µg LNP調配之全長S蛋白mRNA (PTX-B)。
第3組倉鼠接受1 µg LNP調配之全長S蛋白mRNA (PTX-B)。
第4組倉鼠接受調配物緩衝液(PBS假/陰性疫苗對照組)。
在第0天，對所有倉鼠進行預抽血以用於基線分析。在第1天，所有倉鼠接受第一次肌內注射(疫苗或對照，根據第1組-第4組)。使動物適應7天，隨後接受第一疫苗劑量。在第21天，對所有倉鼠進行活體抽血。在第22天，所有倉鼠根據第1組-第4組接受第二(加強)疫苗接種。在第29天，所有倉鼠經鼻內接受AAV6-hACE2 (參見例如實例3)以促進SARS-CoV-2感染。在第38天，所有倉鼠經由鼻內感染而感染SARS-CoV-2。所有動物接受7.5 × 10^5 TCID
50之總劑量，如由反滴定所確定。在此之後，每日監測動物之體重減輕及疾病或窘迫跡象。另外，藉由每隔一天收集口腔拭子來監測病毒脫落。倉鼠在第42天被安樂死以用於終點分析：(i)肺勻漿之感染性；(ii)肺中的病毒RNA水準；(iii)肺組織病理學。在研究期間監測動物在疫苗接種階段期間的任何可觀測臨床徵象。未觀測到明顯不良反應。完整實驗設計說明於表7中。
表7. 實驗概述
| 疫苗接種途徑 | 倉鼠在後腿的兩個部位肌內接種疫苗，使用23-25號、3/8-1吋針頭，總共接種200 μL(每個部位100 μL) |
| 疫苗接種時間 | 在第1天及第22天的2個劑量，在第43天攻擊 |
| 攻擊病毒 劑量 途徑 | SARS-CoV-2 |
| 7.5 × 10 5TCID50 | |
| 鼻內 |
在感染後4天及8天(dpi)時，自各組隨機選擇四隻動物且使其安樂死。收集組織以用於藉由qRT-PCR及感染性病毒效價水準確定病毒負荷以及用於組織病理學。在實驗的終點(8 dpi)，亦自兩組動物收集血液以評估中和抗體之效價。
接種疫苗組之動物在實驗過程期間平均未顯示體重減輕。相比之下，假疫苗組之倉鼠在3 dpi開始顯示中度平均體重減輕。總體而言，實驗終點時之平均體重減輕為11%。任一組均未報導其他顯著的疾病臨床徵象。
在4 dpi及8 dpi對動物進行安樂死之後，將一半肺置於福馬林中以用於組織固定。隨後對組織進行H&E染色，且由對各組不知情的病理學家進行評估。與接種疫苗組相比，對照組(假疫苗接種)在兩個時間點之病理學評分均顯著更高。此表明未接種疫苗組之疾病更嚴重。
在實驗過程中收集口腔拭子用於評估病毒脫落。有趣的是，雖然在整個實驗過程中在兩組中均偵測到病毒RNA，但疫苗接種動物之實際感染性病毒的水準顯著降低(範圍為2-3對數降低，如圖14中所示)。此表明在整個實驗過程中，接種疫苗組之病毒脫落較低，且PTX-B可減少病毒脫落，從而提供治療益處。
對鼻甲中之病毒負荷的檢查表明，接種疫苗組在4 dpi時之感染性病毒的量顯著降低，且在8 dpi時不可偵測到感染性病毒水準。在肺中可見類似趨勢，但顯著的差異為在接種疫苗動物的肺中在任一時間點均未偵測到感染性病毒。在兩個時間點，接種疫苗及未接種疫苗組的肺中均偵測到病毒RNA。
此等資料表明，在倉鼠感染模型中，接種PTX-B可提供針對SARS-CoV2-2鼻內攻擊的保護。
實例5. 小鼠免疫原性及局部耐受性研究
此2劑量免疫原性及耐受性研究之目標為獲得與mRNA疫苗相關的基本安全性資料外加用於其他臨床前實驗之不同小鼠品系的免疫學資料。在第1天及第22天，藉由IM注射以0、4或20 µg之劑量水準向BALB/c小鼠組投與PTX-B，如表8中所概述。藉由改良的Draize評分評估主要研究動物之臨床徵象、體重變化及皮膚觀測結果。在第24天(第二劑量後兩天)處死血液學群組的動物，抽取血液用於血液學且記錄器官重量，評估總體病理學，且用顯微鏡檢查肝臟、脾臟及注射部位組織。在第22天處死細胞介素群組用於測定血清細胞介素濃度。主要研究動物在第43天(第二劑量後三週)終止且評估免疫原性終點、血液學、臨床化學、肝功能測試、總體病理學及器官重量。
表8. 小鼠免疫原性及局部耐受性研究-研究設計
安全性相關終點
| 組號 | 測試物質 | 劑量(µg) | 劑量體積(µl) | 劑量濃度(µg /mL) | 動物數量 | ||||||
| 主要研究 | 血液學 | 細胞介素 | |||||||||
| 雄性 | 雌性 | 雄性 | 雌性 | 雄性 | 雌性 | ||||||
| 1 | 對照 | 0 | 50 | 0 | 10 | 10 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| 2 | PTX-B | 4 | 50 | 0.08 | 10 | 10 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| 3 | PTX-B | 20 | 50 | 0.4 | 10 | 10 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
在第二次給藥20 μg PTX-B後，在兩種性別中均觀測到短暫的、略微的體重減輕；然而，在研究結束時，各組之間的平均體重無明顯差異(資料未示出)。
在臨床觀測及總體及顯微鏡檢查中注意到注射部位的測試材料相關發現；所有發現均為可逆的。基於Draize評分，在注射部位偶爾觀測到4及20 µg的發紅及/或腫脹，且在第一劑量後的一至兩天內在少數雌性小鼠中可見豎毛，但此等不被視為重要的發現。在第二劑量後兩天終止時，注射部位之組織病理學發現包括兩種性別在4及20 µg時出現輕微至中度混合細胞炎症；該發現伴隨著水腫，且在一隻雌性中在20 µg下伴隨著礦化物質。在雌性中注意到該發現之發生率及嚴重程度的劑量關係。炎症與堅硬的異常稠度及腫脹密切相關。另外，在兩種劑量下，少數動物均出現輕微至輕度出血，此與注射部位或皮下組織的暗灶密切相關；無明顯的劑量關係。在研究結束時，在注射部位未觀測到宏觀發現。
在第二劑量後6小時(第22天)進行血清細胞介素分析以監測細胞介素釋放症候群，其為LNP調配之mRNA的已知潛在副作用。使用經過驗證的免疫分析方法來分析IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10、MCP-1及TNF-α。在兩個劑量水準下在兩種性別中均觀測到IL-6 (雄性及雌性分別為對照之至多53倍及266倍)及MCP-1 (雄性及雌性分別為對照之至多20倍及15倍)之血清濃度的PTX-B相關增加。一般而言，反應之幅度與劑量相關。對於MCP-1，反應不具有有意義的性別相關差異。對於IL-6，雌性之增加幅度大於雄性。在兩種性別的一些動物中觀測到IFN-γ之血清濃度輕度增加(至多2.5倍)。IL-1β、IL-10及TNF-α無明顯的PTX-B相關變化。觀測到的細胞介素變化模式與細胞介素釋放症候群不一致。
在研究期間每週測定體重。在20 µg組中，雄性及雌性之體重均略有下降。到研究結束時，各組之體重均已恢復(資料未示出)。
在第二次疫苗接種之後兩天(第24天)及三週(第43天)測定血液學參數。在第一個時間點，兩種性別中唯一發生劑量反應性改變的變化為白血球(雄性在4及20 µg下分別為對照之264%及420%，雌性在4及20 µg下分別為對照之329%及514%)及網狀紅血球(雄性在4及20 µg下分別為對照之69%及41%，雌性在4及20 µg下分別為對照之53%及27%)；未觀測到對紅血球參數的影響。所有血液學參數在第43天均在正常範圍內(白血球：雄性在4及20 µg下分別為對照之77%及77%，雌性在4及20 µg下分別為對照之67%及75%，網狀紅血球(雄性在4及20 µg下分別為對照之107%及117%，雌性在4及20 µg下分別為對照之122%及129%)。
在第二劑量後兩天(第24天)，注意到雌性之肝臟在20 μg下表現出最小的肝細胞細胞質改變，其特徵為肝醣樣物質的積累。該變化與體重增加(絕對及相對於腦重量，24%至27%)及淺變色相關。然而，在第43天，所有肝功能測試均在正常範圍內，且與對照組無顯著差異。
在第24天，在4及20 μg下，在兩種性別中均注意到脾臟重量增加(絕對及相對於腦重量，32%至49%)。此增加為統計顯著的，且與雌性的腫大密切相關。無法建立微觀相關性。
到研究結束時(第43天，第二劑量後三週)，未發現PTX-B相關的總體發現。儘管絕對脾臟重量在20 µg時仍然增加(14%至18%)，但增加的幅度明顯低於第二劑量後兩天，且所有血液學參數均正常。
總之，在第1天及第22天以4及20 μg之劑量水準藉由IM注射向BALB/c小鼠投與的PTX-B具有良好耐受性。在第二劑量後觀測到的結果有限，主要為IL-6及MCP-1之血清濃度的增加、白血球之劑量相關增加及網狀紅血球的減少、劑量相關的注射部位反應及脾臟重量增加，但無微觀相關性。僅在20 μg/劑量下注意到的其他發現包括略微的體重減輕及肝細胞細胞質改變。所有發現均為完全或部分可逆的；截至第43天，測試材料相關的影響僅限於脾臟重量在20 μg/劑量下的略微增加。
免疫原性相關終點
在研究結束時收集脾細胞用於藉由ELISpot進行分析(圖10，來自PTX-B免疫小鼠之脾細胞的IFN-γ及IL-4 ELISpots)。在SARS-CoV-2 S蛋白肽池S158及S157(可獲自例如JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany)存在下，在IFN-γ及IL-4多重ELISpot盤上刺激自PTX-B小鼠收集的脾細胞。在隔夜刺激後對斑點進行計數。藉由雙因素變異數分析執行統計。如圖10中所示，自用S158肽池刺激之雄性及雌性小鼠中均觀測到IFN-γ表現的顯著增加。類似地，S157肽池誘導雄性小鼠IFN-γ表現的顯著增加。IL-4表現未因用任一肽池刺激而顯著增加。此結果組合指示偏向Th1之反應。
在SARS-CoV-2中和分析中，來自用調配物緩衝液處理、作為陰性對照之雌性及雄性小鼠的血清在任何測試稀釋度下均未提供針對SARS-CoV-2臨床分離株感染的保護(圖11)。相反，來自用4 µg PTX-B免疫接種之雌性及雄性小鼠之血清的平均ID50效價分別為1353及480。來自用20 μg PTX-B免疫接種之小鼠的血清提供更大保護，平均ID50效價為7645 (雌性)及5118 (雄性)，表明劑量反應性效應(圖11)。
為了證實來自用PTX-B治療之小鼠之血清的強力中和作用，進行了第二獨立假病毒中和分析。來自陰性對照組的血清未顯示中和能力(圖12)。來自用4 µg PTX-B治療之雌性及雄性小鼠的血清提供了ID50值分別為4048及1863之保護活性。來自用20 µg PTX-B免疫接種之小鼠的血清顯示16390 (雌性)及1414 (雄性)之平均ID50值。
用4及20 μg之PTX-B免疫接種均導致BALB/c小鼠產生強中和抗體反應(圖13A-圖13C)。對來自PTX-B治療之小鼠的血清進行連續稀釋，且使用抗同型HRP抗體量測抗SARS-CoV-2刺突IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM及IgA。中值使用盒狀圖表示，其中須表示四分位數範圍之Q1及Q3的Tukey分析，統計離群值用單個點表示。結果為劑量反應性的，且與先前實驗中在C57BL/6小鼠中所證明的一致。由PTX-B之初打-加打誘導之抗SARS-CoV-2抗刺突蛋白抗體概況表明，此調配之疫苗促進針對SARS-CoV-2刺突蛋白之血清轉化。在兩個測試劑量水準下誘導了SARS-CoV-2刺突蛋白特異性IgG (圖13A，左圖)、IgG1 (圖13A，右圖)、IgG2a (圖13B，左圖)、IgG2b (圖13B，右圖)、IgM (圖13C，左圖)及IgA (圖13C，右圖)。
實例6. SARS-CoV-2 N、M、N/M蛋白核酸疫苗之功效
藉由將螢光T細胞(用CFSE標記)與經N、M或N/M混雜物之mRNA轉染的活化樹突細胞(DC)混合進行共培養分析，該混雜物有或無分泌信號，如下表9中所述。特定言之，在第1天從來自COVID-19恢復期患者之周邊血液單核細胞(PBMC)分離單核球。單核球源性樹突狀細胞(MDDC)亦從來自相同恢復期患者之PBMC分化而來。在第4天用RNA疫苗轉染MDDC，且將轉染之MDDC與PBMC共培養以在共培養物中誘導T細胞之自體刺激。
表9. 實例6及圖15中所用之核酸疫苗的描述
| 組 | mRNA疫苗描述 | SEQ ID NO |
| A | tdTomato (陰性對照) | 46 |
| B | N - 編碼N蛋白之序列 | 30 |
| C | M - 編碼M蛋白之序列 | 28 |
| D | NM - 編碼N及M蛋白之序列 | 29 |
| E | sNM - 具有信號肽且編碼N及M蛋白之序列 | 31 |
使用包含TNF-a、IL-1b、IL-6及PGE2因子之細胞介素混合液使共培養物中之樹突狀細胞成熟。在第5天，用羧基螢光素丁二醯亞胺酯(CFSE)對細胞進行標記以監測淋巴細胞增殖(參見例如
Lyons AB, Parish CR(1994年5月). 「Determination of lymphocyte division by flow cytometry」. Journal of Immunological Methods. 171 (1): 131-7，以引用的方式併入本文中)。
隨後，在第11天，使用CD4或CD8之螢光抗體對細胞進行染色以鑑定CD4+/CD8+T細胞，且測定抗體標記之細胞中之CFSE標記的量以確定T細胞增殖。
由於多次細胞分裂，被DC刺激之細胞具有低水準之CSFE。建立臨限值以鑑定低CFSE染色之細胞，亦即已經歷1次或多次分裂的細胞(例如，分裂1次之細胞中的CFSE信號降低至½；分裂超過1次之細胞中的CFSE信號降低超過½)。通常，分裂1至7次之細胞被鑑定為「低CFSE」細胞。因此，[mRNA轉染細胞中之低CFSE染色]與[對照細胞中之低CFSE染色]之比提供了T細胞刺激指數(SI)。增加的SI值指示mRNA疫苗刺激T細胞反應之程度。
T細胞之刺激，亦即刺激指數(SI)計算如下：SI＝[用經mRNA轉染之DC刺激之T細胞的增殖(% CFSE-lo)]除以[用DC對照(含培養基之DC)刺激之T細胞的增殖(% CFSE-lo)]。大於2之SI值被認為指示生物學上顯著之增殖。資料在圖15中示出。
實例7. 使用PTX-B對VOC進行的假病毒中和分析
使用假病毒中和分析(參見例如實例2)測試各種患者血清之中和能力，該分析採用假型至野生型SARS-CoV-2關注變異體(VOC)及如表10中所述之其他變異體之S蛋白的假病毒。
表10. 實例7及圖16-18中之假病毒編碼之S蛋白的描述
| 組 | 假病毒 ID | 經編碼 S 蛋白之 描述 |
| A | WT | 來自中國武漢之原始病毒株的S蛋白 |
| B | D614G | 具有D614G突變之WT S蛋白 |
| C | UK變異體 | PANGO譜系B.1.17 S蛋白 |
| D | SA變異體 | PANGO譜系B.1.351 S蛋白 |
| E | D614G+L452R | 具有D614G及L452R之WT S蛋白 |
| F | UK+L452R | 具有L452R突變之PANGO譜系B.1.17 S蛋白 |
| G | SA+L452R | 具有L452R突變之PANGO譜系B.1.351 S蛋白 |
| H | BR變異體 | PANGO譜系P.1 S蛋白 |
測試之血清包括CBS 13及CBS 5 (來自COVID-19患者之Canadian Blood Services樣品)、O132 (來自雙重mRNA疫苗接種患者之血清)、含有NRC VHH72抗體(靶向S蛋白RBD)之血清。如圖16中所示，各種測試血清對編碼不同SARS-CoV-2變異體S蛋白之假病毒的中和能力降低。通常，與WT及D614G變異體相比，對編碼英國及南非S蛋白變異體之變異體的中和能力下降。南非變異體S蛋白及包括L452R突變之南非變異體S蛋白始終顯示出最低中和水準。
接下來，針對VOC假病毒測試來自接種1 μg或10 μg PTX-B或10 μg編碼TdTomato之對照mRNA疫苗之小鼠的血清，且量測ID50。如圖17中所示，接種對照mRNA疫苗(TdTomato)之小鼠的血清顯示無感染保護。來自接種1 µg PTX-B之小鼠的血清顯示出感染保護，10 µg劑量可見保護效率呈劑量依賴性增加。通常，圖17中之2與3之間的ID50值可能針對感染有保護作用，且推測大於3之ID值具有保護作用。如可見，針對WT (A)、UK (C)、UK+L452R (F)及D614G+L452R (E)假病毒S蛋白變異體展現了最高保護水準，觀測到針對BR (H)、SA (D)及SA+L452R (G)假病毒S蛋白變異體之保護功效降低。在圖17中，連接點之線表示來自同一小鼠之血清。圖18示出各變異體(表10中提供之C、F、E、H、D及G)相對於WT SARS-CoV-2假型假病毒(表10中之A)之保護效率的比較，且證實了圖17中所示之趨勢。
實例8. 在人體內之安全性、耐受性及免疫原性
研究概述
進行了Ia/Ib期、首次用於人體、觀測者不知情、隨機化、安慰劑對照、遞增劑量研究，以評估PTX-B疫苗在18-64歲及≥65歲之健康血清陰性成人體內的安全性、耐受性及免疫原性。
該研究之目的為評估2劑PTX-B疫苗在18-64歲及≥65歲之健康血清陰性成人體內的安全性及耐受性，以及評估2劑PTX-B疫苗在18-64歲及≥65歲之健康血清陰性成人體內的免疫原性。
評估之安全性及耐受性終點為：使用符合方案(PP)及安全群體，在各疫苗接種後之隨訪期間事件的發生率，該等事件包括：各疫苗接種後之隨訪期間的生命徵象及投與部位反應(例如手臂檢查評估，包括疼痛、壓痛、紅斑/發紅、硬結/腫脹)；以及直至各疫苗接種後第三天每天要求記錄的不良事件(AE；例如發熱、發冷、噁心/嘔吐、腹瀉、頭痛、疲勞、肌痛)。
使用調整意向治療(mITT)及安全群體兩者來分析總體安全。若各治療組之個體與PP群體的差異≤ 5%，則不使用mITT群體進行分析。分析了第1天至第56天之未要求記錄的不良事件，以及就醫的AE (第1天至第56天)、新發慢性病(NOCD)、嚴重不良事件[SAE]、特別受關注的不良事件[AESI]及第1天至第395天(最後一次疫苗接種後大約1年)之潛在免疫介導醫學病狀(PIMMC)。亦記錄有針對性的體格檢查、生命徵象評估及臨床安全實驗室測試的結果。
評估之免疫反應終點包括：使用mITT及安全群體之免疫原性分析。若各治療組之個體與PP群體的差異≤ 5%，則不使用mITT群體進行分析。分析了抗體(免疫球蛋白(Ig) M、IgG、IgA [酶聯免疫吸附分析]；及中和)，且分析了使用血液/周邊血液單核細胞(PBMC [流動式細胞測量術、酶聯免疫斑點分析])之細胞介導的免疫。
該研究設計成具有年齡及劑量遞增，且在血清陰性成年個體中進行，無證據表明該等個體近期暴露於嚴重急性呼吸道症候群(SARS)-CoV-2或未被鑑定為流感或呼吸道融合病毒(RSV) (發熱性或下呼吸道感染)的病毒性呼吸道疾病。
該研究分以下2期進行：
1a期(約60名個體)個體間隔4週接受2劑PTX-B肌內(IM)疫苗或安慰劑。
群組1包括20名18至64歲之健康個體，向其投與16 μg PTX-B IM疫苗或安慰劑；5名哨兵個體(4名PTX-B:1名安慰劑)，接著為剩餘的11名PTX-B:4名安慰劑(群組擴展)個體。
群組2包括20名18至64歲之健康個體，向其投與40 μg PTX-B IM疫苗或安慰劑；5名哨兵個體(4名PTX-B:1名安慰劑)，接著為剩餘的11名PTX-B:4名安慰劑(群組擴展)個體。
群組3包括20名18至64歲之健康個體，向其投與100 μg PTX-B IM疫苗或安慰劑；5名哨兵個體(4名PTX-B:1名安慰劑)，接著為剩餘的11名PTX-B:4名安慰劑(群組擴展)個體。
哨兵群組之評估包括安全隨訪評估(包括要求記錄的及未要求記錄的AE以及安全實驗室評估)直至疫苗接種後第三天。
1b期(約60名個體)個體間隔4週接受2劑PTX-B疫苗(15名接受安慰劑且45名積極治療)。
群組4包括20名≥65歲之健康個體；向15名個體投與PTX-B IM疫苗，其中1個劑量水準基於1a期之先前結果而確定，且向5名個體投與安慰劑。
群組5包括20名≥65歲之健康個體；向15名個體投與PTX-B IM疫苗，其中1個劑量水準基於1a期之先前結果而確定，且向5名個體投與安慰劑。
群組6包括20名≥65歲之健康個體，向其投與PTX-B IM疫苗，1個劑量水準基於先前結果而確定，且向5名個體投與安慰劑。
在登記下一群組之前，各群組之間經過了大約14天的獨立安全審查。
個體前往臨床站點進行篩選(第-21至-1天)以及在第1、8、28±2、36、56±2、90±3、180±5及395-14天前往。在第2天及第29天對個體進行安全電話呼叫。篩選程序包括知情同意、進入標準評估、人口統計資料、身高、體重、身體質量指數、醫療及手術史、安全評估(包括SAE評估、記錄先前藥物治療及手術、體格檢查、生命徵象評估、臨床血液及尿液樣品、鼻咽[NP]拭子，診所可選擇經由額外的即時檢驗來確認是否符合條件)，以及用於免疫原性分析之血液樣品(抗體)。在第1天，進行隨機分組(總體15:5研究疫苗:1a期及1b期群組之安慰劑疫苗)。在第1天及第28天，確認合格且進行安全評估、免疫原性及細胞介導免疫採血、紙質日記培訓及分發以及疫苗或安慰劑投與。進行安全評估、用於安全評估之血液及尿液樣品以及用於免疫原性分析及細胞介導免疫之血液樣品，直至研究問診結束。在第1天至第56天進行未要求記錄的AE的評估。當個體在第1天至第56天在家時，進行就醫的AE評估。自第1天至研究結束，對NOCD、AESI (包括COVID 19增強型疾病病例)及PIMMC進行了評估。將在整個研究期間評估SAE。
疫苗及安慰劑由非盲的站點藥劑師製備，且由非盲的CPU人員在臨床研究站點藉由IM注射在非優勢側之上臂三角肌中投與。在投與疫苗後大約1小時內觀測個體之即時AE及/或反應原性。在每次接種疫苗後之隨訪期內，向個體提供日記卡且經過訓練以每天記錄具體引起的全身及局部症狀，以及任何額外的AE。要求個體拍下完成的日記卡的照片且將照片經由簡訊/電子郵件發送至站點，以確保密切監督反應。
對於每一個體，持續監測個體之持續時間為大約14個月。
研究納入標準
個體必須滿足所有納入標準(以下編號1-8)才有資格參與研究。另外，尋求少數種族及族裔以獲得多樣化的研究群體。
1. 個體已閱讀、理解且簽署知情同意書。
2. 在篩選時18至64歲(1a期)或≥65歲(1b期) (包括端點)的健康成年男性及女性。
3. 篩選時呈SARS-CoV-2血清陰性且呈逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)陰性，無證據表明近期暴露或未鑑定為流感或RSV (發熱性或下呼吸道感染)的病毒性呼吸道疾病。
4. 篩選時之身體質量指數≥18及≤30 kg/m2。
5. 在參與研究之前必須身體健康，無可能干擾研究評估之臨床相關異常。年齡較大(≥65歲)的參與者可患有穩定的共患病(過去3個月內無藥物變化或惡化)。
6. 有生育潛力的女性(WOCBP)及性伴侶為WOCBP之男性必須能夠且願意在研究期間使用至少1種高效的避孕方法(亦即，包括子宮切除術、雙側輸卵管切除術及雙側卵巢切除術、激素口服[結合含殺精子劑之男用保險套]、經皮、植入或注射、阻障[亦即，保險套、含殺精子劑的隔膜]；子宮內節育器；輸精管切除的伴侶[最少6個月]，臨床上不育的伴侶；或禁慾)。女性個體在初潮後被視為WOCBP，且直至其連續12個月處於絕經後狀態(無其他醫學原因)或以其他方式永久不育。無生育潛力的個體在研究期間不需要使用任何其他形式的避孕措施。無生育潛力被定義為個體確認：手術絕育(例如，雙側卵巢切除術、雙側輸卵管切除術、雙側燒灼閉塞[Essure System®不可接受]、子宮切除術或輸卵管結紮)、絕經後(定義為在篩選前至少連續12個月永久停經)；若絕經後狀態不明確，則在疫苗接種前進行妊娠測試。
7. 育齡女性在每次疫苗接種前必須妊娠測試呈陰性。若絕經狀態不明確，則需要進行妊娠測試。
8. 必須能夠參加研究期間的所有問診(計劃及計劃外，如適用)且遵守所有研究程序，包括每天在每次注射後完成日記卡。
研究排除標準
包括≥65歲個體(對於1b期)之個體若滿足任何排除標準(以下編號1-35)則不符合參與研究的條件，或者若其在研究期間出現任何排除標準，則由研究者酌情中止。
1. 在研究者看來，將使疫苗接種不安全或將干擾對反應之評估的急性或慢性醫學病狀(包括癡呆症)史。
2. 任何使個體歸因於SARS-CoV-2之嚴重疾病之風險更高的醫學病狀史將被排除在外，包括：慢性腎病；COPD (慢性阻塞性肺疾病)；心臟病，諸如心衰竭、冠狀動脈疾病或心肌病；任何免疫功能不全的狀態，包括移植、歷史免疫缺陷、HIV、免疫抑制藥物攝入；鐮狀細胞病;當前吸菸者或＞5包/年之吸菸史；2型糖尿病。
具有以下任何病狀史、COVID-19併發症風險可能增加之個體被排除在外：哮喘(中度至重度)；腦血管疾病(影響血管及大腦的血液供應)；囊性纖維化；高血壓(Hypertension)或高血壓(high blood pressure)；神經病狀，諸如癡呆症；肝病；肺纖維化(肺組織受損或有疤痕)；地中海貧血症(一種血液病症)；1型糖尿病。
3. 可能對免疫系統產生不利影響的正在進行的臨床病狀或藥物或治療史。
4. SARS-CoV-2血清陽性或RT-PCR陽性的個體，包括在第二劑PTX-B疫苗之前。
5. 暴露於SARS-CoV-2之風險增加的個體(例如，醫護人員、急救人員)。
6. 在疫苗投與前30天內密切接觸過已知感染SARS-CoV-2的任何人。
7. 住在團體環境或團體照護設施(例如，宿舍、輔助生活設施或療養院)中。
8. 具有任何在篩選時被研究者評估為對年齡/性別具有臨床意義之升高(1級或更高)實驗室測試的個體。
9. 篩選時任何肝功能酶對於年齡/性別而言升高(1級或更高)的個體，無論臨床意義的評估如何(允許進行一次複驗)。排除肝酶升高個體之標準如下：鹼性磷酸酶、丙胺酸轉胺酶、天冬胺酸轉胺酶或γ-麩胺醯轉移酶＞1.5×正常值上限(ULN)；總膽紅素＞1.5×ULN。
10. 活動性贅生性疾病(不包括成功治療的非黑色素瘤皮膚癌)或任何血液惡性腫瘤病史。「活動性」定義為在過去5年內接受過治療。
11. 篩選前6個月內長期(＞2週)使用口服或非經腸類固醇或高劑量吸入類固醇(＞800 μg/天二丙酸倍氯米松或等效物) (允許經鼻及局部類固醇)。
12. 自體免疫疾病、發炎性疾病或PIMMC的病史(附錄B)。
13. 在登記與隨機分組後181天之間，目前懷孕、哺乳或計劃懷孕的女性。
14. 格－巴二氏症候群(Guillain-Barré Syndrome)或任何退化性神經學病症的病史。
15. 對任何注射疫苗之過敏型反應史。
16. 已知或疑似對疫苗之一或多種組分過敏。
17. 在篩選後12個月內有酗酒史、非法藥物使用、對任何類鴉片的身體依賴，或任何藥物濫用或成癮史。
18. 研究加入前3天內出現急性疾病或發熱(體溫＞37.5C) (若研究人員可接受，則加入可能會延遲以完全康復)。
19. 當前參與或計劃參與涉及實驗藥劑(疫苗、藥物、生物製劑、裝置或藥物)之研究的個體；或在加入此研究前1個月內(免疫球蛋白為3個月)內接受過實驗藥劑的個體；或預期在參與此研究期間接受另一種實驗藥劑的個體。
20. 加入本研究前3個月內接受過免疫球蛋白或另一血液製品，或預期在此研究期間接受免疫球蛋白或另一血液製品的個體。
21. 意欲在第一次接種疫苗後6個月內獻血的個體。
22. 使用處方藥預防SARS-CoV-2的個體。
23. 計劃在研究之前3個月內接受另一疫苗的個體，不應在疫苗後2週內給與之流感疫苗除外。
24. 在研究之前或研究期間的任何時間接受任何其他SARS-CoV-2或其他實驗性冠狀病毒(中東呼吸症候群、SARS等)疫苗。
25. 在加入後1個月內至研究結束(最後一次疫苗接種後1年)接受任何研究性疫苗或研究性藥物。
26. 計劃自加入至第56天前往加拿大境外旅行。
27. 篩選後12週內有手術史或重大外傷史，或研究期間計劃進行手術。
28. 大量失血(＞ 400 mL)或在參與研究前6週內捐獻了1個或更多個單位的血液或血漿。
29. 在安全實驗室樣品收集前72小時內進行劇烈活動或大量飲酒(由研究人員評估)。
30. 尿液藥物濫用篩檢或酒精呼氣分析儀測試結果呈陽性。
31. 人類免疫缺陷病毒-1及-2抗體、B型肝炎表面抗原或C型肝炎病毒抗體篩查呈陽性。
32. 參與此研究之計劃或實施。
33. 不願意或不太可能遵守研究的要求。
34. 個體為發起人、CRO、研究站點或站點附屬機構之雇員、承包人或任何雇員的朋友或親戚。
35. 個體血氧測定＜90%。
研究組合物
疫苗產品呈現為3 mL美國藥典/歐洲藥典I型硼矽酸鹽玻璃小瓶中之0.2 mg/mL、2mL填充物，該玻璃小瓶具有氟樹脂層壓溴丁基橡膠塞及帶有紅色、塑膠易拉蓋的鋁製封蓋。PTX-B信使核糖核酸體液疫苗為0.2 mg/mL 0.5 mL可注射溶液，具有如所描述之多個劑量水準。
安慰劑為市售氯化鈉0.9%可注射IM溶液0.0 mg/mL 0.5 mL。
研究結果概述
此1期首次用於人體的觀測者不知情、隨機化、安慰劑對照、遞增劑量研究評估了PTX-B疫苗在18至64歲的健康血清陰性成人中的安全性、耐受性及免疫原性。該研究設計成具有劑量遞增，且在無證據表明近期接觸過SARS-CoV-2之血清陰性成年個體中進行。
安全群體包括所有提供同意書的個體，該等個體被隨機分組，且接受任何量的疫苗/安慰劑。安全群體用於所有安全分析及免疫原性分析，且按實際治療進行分析。
符合方案群體包括安全群體中根據方案接受指定劑量之疫苗/安慰劑，具有血清學結果，且無影響主要免疫原性結果之重大方案偏差的所有個體，如由發起人在資料庫鎖定及揭盲前所確定。PP群體為用於安全終點分析之主要群體。
調整意向治療群體包括安全群體中提供任何血清學資料之所有個體。mITT群體用於免疫原性終點的分析。若各治療組之個體與PP群體的差異≤ 5%，則使用mITT群體進行分析。
使用適當的描述性統計按階段、群組及時間點列出及概述各群組及研究階段的免疫原性資料。
使用適當的描述性統計，按研究階段、群組及時間點列出及概述生命徵象、臨床實驗室測試及體格檢查結果。
報告任何治療出現的不良事件(TEAE)或反應原性之個體的數量及百分比按研究階段及群組進行概述，且按系統器官類別及優先項(使用MedDRA編碼)列表。TEAE根據嚴重性及關係進一步分類，且對於SAE，分為就醫的AE、NOCD及AESI。
此外，亦呈現疫苗接種後被感染之個體數量以及疫苗接種是否使疾病減輕或加重。
個體經隨機分組以接受3:1比率之PTX-B疫苗或安慰劑。給藥在群組中如下地發生：自16 µg劑量開始，接著為40 µg，且接著為100 µg。各群組自5名個體的哨兵組開始，首先給藥，接著為群組之其餘部分。頻繁收集不良事件，且由感染性疾病專家及統計學家組成的獨立安全審查委員會(iSRC)經常開會審查及批准下一組的給藥。
總共招募了60名個體且58名個體接受了兩種劑量的研究藥物。由於與研究藥物無關的個人原因，兩名個體在接受一劑研究藥物後退出研究。總體而言，男女比例正好為50:50，其中83.3%為白人，13.3%為亞洲人，且3.3%為其他。
收集的不良事件根據關於疫苗反應的行業標準FDA指南分級為局部(在注射部位)或全身。總體而言，PTX-B在16 µg、40 µg及100 µg之所有三個劑量水準下均為安全且耐受良好的。不存在嚴重不良事件。所記錄之唯一局部不良事件為注射部位處之疼痛，正如所預期。任何劑量的40 μg PTX-B均無發紅或腫脹。此與在臨床試驗以及一般使用中記錄到發紅及腫脹之其他mRNA疫苗相比具有優勢。全身反應包括疲勞、發冷及發熱，且一般為輕度至中度，且耐受性良好，其中頭痛是最常見的反應，在第二劑量後發生率高達60%。此等結果與已批准的緊急使用mRNA疫苗的已公佈不良事件相比非常有利。
PTX-B疫苗接種誘導高抗-S IgG抗體：臨床試驗的參與者在第0天及第28天接種疫苗。在第0天(預篩選)、第8天、第28天(第2劑量前)及第42天收集血漿樣品，以使用基於多重夾心之免疫分析與來自Meso Scale Discovery (MSD)平台之電化學發光(ECL)讀數測定IgG抗S蛋白之水準。所有三個疫苗劑量組(16、40及100 µg)之所有研究參與者均對刺突蛋白產生了強烈的IgG抗體反應，該反應截至第28天被偵測到且截至第42天增強。在注射安慰劑之參與者中未偵測到針對S蛋白之抗體。此外，在中劑量及高劑量中發現了最高抗體水準。截至第42天，接種PTX-B之參與者的抗體水準比在同一分析中評估之恢復期個體之血漿高一個對數以上。分析個體之總IgG水準。剛好在第一劑量(第28天)後，在所有劑量水準下均誘導高水準之抗刺突(在圖19中示出)及抗RBD (圖19)。在第二劑量後兩週(第42天)，水準增加至甚至更高，達到比來自恢復期患者之5個血清樣品之平均值高10倍以上的水準(圖19)。亦在SARS-CoV-2恢復期患者中量測抗刺突IgG (Au/mL) (圖20)。
抗體水準與Stanford University最近的一份報告中發表的抗體水準相當，該報告中評估了接種COVID-19 mRNA疫苗的個體與SARS-CoV-2感染患者相比的IgG反應(
Röltgen 等人(2021年4月7日). mRNA Vaccination Compared to Infection Elicits an IgG-Predominant Response with Greater SARS-CoV-2 Specificity and Similar Decrease in Variant Spike Recognition. 預印本於2021年5月11日自doi.org/10.1101/2021.04.05.21254952下載)。
使用ELISA進一步證實了在所有三種不同劑量下誘導的高水準抗S蛋白IgG抗體。將來自接種個體之血清樣品添加至塗有刺突蛋白之ELISA盤上，且接著使用過氧化物酶標記之二級抗IgG抗體偵測結合的IgG抗體。藉由在校準曲線上插值確定之IgG抗體濃度在單劑量PTX-B (第28天)後高達約1000 ELISA單位/毫升(圖23)。IgG濃度在第二劑量後繼續增加，超過10,000 ELISA單位/毫升(圖23)。
PTX-B疫苗接種誘導高中和抗體水準：藉由S-ACE2阻斷MSD分析評估來自研究參與者血漿的中和活性。此處，抗體阻斷了S蛋白與ACE2受體之間的相互作用，且ECL信號的降低用於計算相同稀釋度下血漿之抑制百分比。研究中3個劑量水準之所有參與者截至第28天均顯示阻斷活性，且截至第42天在1:100或更高稀釋度樣品之情況下，所有參與者均達到100%阻斷活性。此等結果表明PTX-B誘導了強烈的中和抗體反應。此外，以ng/mL為單位之參考標準抗體水準的定量表明，所有參與者截至第一次免疫接種後第28天均產生中和抗體，且截至第二次免疫接種後兩週的第42天增加10倍。藉由評估活體外阻斷刺突蛋白與hACE2之間相互作用的能力來分析個體中之中和抗體。使用基於MSD技術之S:ACE2受體阻斷分析，接種PTX-B之參與者在第28天及第42天在血漿中顯示出高水準的中和活性(圖21)。當在稀釋100倍或超過100倍之樣品中評估抑制百分比時，所有參與者截至第42天之抑制率為100%。Röltgen等人公佈之資料顯示，接種BioNTech/Pfizer mRNA疫苗之個體使用相同MSD分析在第42天(1:100稀釋度)時顯示出75%平均抑制。此等資料表明PTX-B在所有劑量下均具有更強的中和能力。
中和活性藉由S-ACE2阻斷MSD分析來評估。以ng/mL為單位之抗體水準定量係基於參考標準之活性。所有參與者截至第一次免疫接種後第28天均產生中和抗體，且截至第二次免疫接種後兩週的第42天增加10倍(圖22)。
實例9. 人體內PTX-B誘導之抗COVID19抗體的假病毒中和
藉由假病毒中和分析進一步評估中和活性。遵循Bewley K.R.報導之方案，在ES-293細胞中產生了刺突假型ΔG-螢光素酶rVSV病毒(Bewley等人, Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by wild-type plaque reduction neutralization, microneutralization and pseudotyped virus neutralization assays; Nature Protocols, 2021, 16, 3114-3140)。使假病毒庫存經受觀測程序以獲得最佳假病毒稀釋度。
將來自接種PTX-B之個體之血清樣品熱處理為無活性成分。不活化血清樣品及參考血清經連續稀釋。在37℃下將預稀釋之測試血清及參考血清與假病毒稀釋劑以1:1比率一起培育1小時。接著將血清及假病毒混合物轉移至塗鋪之Vero E6細胞中，且在37℃及5% CO2下培育18-22小時。
將ONE-Glo EX螢光素酶分析試劑添加至細胞盤中。將反應盤在室溫下培育3分鐘且讀取螢光素酶水準。各曲線之中點使用SoftMax Pro方案使用4PL回歸確定，且輸出報導為各樣品之中和效價(NT
50)。PTX-B疫苗產生之中和效價與在第一劑量(第28天)後自恢復期患者獲得之中和效價相當。在第二劑PTX-B後兩週(第42天)，中和效價進一步增加，高於自恢復期患者獲得之中和效價(圖24)。
在第一劑量後(第28天；在接受第二劑量之前)，中值中和水準可分別達到恢復期患者水準之0.3 (16 μg劑量及40 μg劑量)及0.8 (100 μg劑量)倍。在第二劑量後兩週(第42天)，中值中和水準分別增加至恢復期患者水準之4.0倍(16 μg劑量)、8.5倍(40 μg劑量)及23.0倍(100 μg劑量)。相比於較低劑量，100 μg劑量誘導更高的結合及中和抗體效價。
將PTX-B疫苗誘導之中和抗體的中和活性與COVID19 mRNA疫苗BNT162b2及mRNA-1273進行比較。如表11及12所示，PTX-B疫苗誘導之中和抗體的平均中和水準與BNT162b2相當。
表11. PTX-B之平均中和水準(恢復期之倍數(n=33))
表12. BNT162b2之平均中和水準*(恢復期之倍數)
* 資料來自
Walsh, E.E.等人, Safety and immunogenicity of two RNA based COVID-19 vaccine candidates,
N Engl. J. Med., 2020, 383(25): 2439-2450。
| 天 | 16µg (n=15) | 40µg (n=14) | 100µg (n=15) |
| 28 | 0.3 | 0.3 | 0.8 |
| 42 | 4.0 | 8.6 | 23.0 |
| 天 | 10µg | 20µg | 30µg |
| 21 | 0.2 | 0.2 | 0.1 |
| 28 | 1.7 | 3.9 | 3.8 |
| 35 | 1.0 | 3.1 | 1.7 |
類似地，與
Anderson E.J.等人, Safety and immunogenicity of SARS-CoV-2 mRNA 1273 vaccine in older adults.
N Engl. J. Med., 2020, 383: 2427-2438報導之資料相比，PTX-B疫苗誘導之中和抗體的中和活性與mRNA-1273疫苗誘導之中和活性相當。
使用Khoury, D.S.等人(
Khoury, D.S.等人, Neutralizing antibody levels are highly predictive of immune protection from symptomatic SARS-CoV-2 infection.
Nat. Med.,2021, 27: 1205-1211)開發之模型預測PTX-B疫苗之保護功效表明PTX-B與核酸疫苗BNT162b2及mRNA-1273相當(圖25)。PTX-B疫苗之中和活性高於BNT162b2及mRNA-1273疫苗(圖25)。結果表明，與BNT162b2及mRNA-1273疫苗相比，PTX-B可在人體內引發更強的反應。
實例 10 ：不同 SAR-CoV-2 關注變異體 (VOC) 之中和能力
測試來自接受2劑(第0天及第28天) 16 μg、40 μg或100 μg PTX-B疫苗之個體組的相同血清對病毒變異體的假病毒中和活性。製備了SAR-CoV-2原始病毒及其變異體α、β及δ VOC之假病毒用於中和分析。如圖26中所示之結果表明PTX-B疫苗對所有三個劑量群組中之SAR-CoV-2原始病毒株以及α、β及δ VOC誘導了相當的中和活性(圖26)。高劑量PTX-B (100 μg)誘導之中和活性一般高於低劑量(16 μg)及中劑量(40 μg) PTX-B誘導之中和活性。針對原始病毒株、α及δ變異體之中和能力亦與Ade K.T.等人(
Ade K.T. 等人, Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 variants in vaccinated Ontario long-term care home residents and workers, 2021年8月8日; MedRxiv預印本doi: https://doi.org/10.1101/2021.08.06.2126172)報導之BNT162b2疫苗接種獲得的中和能力相當。
等效物及範疇
熟習此項技術者將認識到或最多使用常規實驗便能夠確定本文所述之特定實施例之許多等效物。範疇不意欲限於以上描述，而是如所附申請專利範圍中所闡述。
在申請專利範圍中，除非相反地指示或以其他方式自上下文顯而易見，否則諸如「一(a/an)」及「該」之冠詞可意謂一或大於一。除非相反地指示或以其他方式自上下文顯而易見，否則若一個、超過一個或所有群組成員存在於給定產物或方法中、用於給定產物或方法中或以其他方式與給定產物或方法相關，則在該群組的一或多個成員之間包括「或」的申請專利範圍或描述視為滿足。本發明包括群組中恰好一個成員存在於、用於給定產物或方法中或另外與給定產物或方法相關之實施例。本發明包括超過一個或所有的群組成員存在於、用於給定產物或製程中或以其他方式與給定產物或製程有關的實施例。
亦應注意，術語「包含」意欲為開放的且准許但不要求包括額外要素或步驟。當本文中使用術語「包含」時，亦因此涵蓋並揭示術語「由……組成」。
在給出範圍的情況下，包括端點。此外，應理解，除非另外指示或以其他方式自上下文及一般技術者之理解顯而易見，否則表示為範圍之值可在本發明之不同實施例中採用所陳述範圍內之任何具體值或子範圍，除非上下文另外明確規定，否則達到該範圍下限之單位的十分之一。
另外，應理解，屬於先前技術內之任何特定實施例可自任何一或多個技術方案中明確排除。因為認為此類實施例為一般熟習此項技術者已知的，所以可對其進行排除，即使未在本文中明確地闡述該排除亦可。出於任何原因，無論是否與先前技術之存在有關，組合物之任何特定實施例(例如任何治療或活性成分；任何產生方法；任何使用方法；等)可自任一或多個技術方案中排除。
應理解，已使用之文字係描述性而非限制性文字，且可在不背離本發明在其較廣泛態樣中之真實範疇及精神之情況下，在隨附申請專利範圍之範圍內作出改變。
儘管已經相對於所描述之若干實施例以一定的長度及一些特殊性描述了本發明，但並非意指本發明應受限於任何此類細節或實施例或任何特定實施例，而是應參考隨附申請專利範圍進行解釋，以便考慮到先前技術提供對此類申請專利範圍之儘可能最廣泛的解釋，並因此有效地涵蓋本發明之預期範疇。
圖1示出使用自安大略省一名患者分離之病毒進行SARS-CoV-2中和分析的結果。第1-5組與投與之疫苗調配物相關(見表6)。
圖2示出使用SARS-CoV-2假型慢病毒進行中和分析的結果，該病毒編碼螢光素酶基因且可感染HEK293T細胞。第1-5組與投與之疫苗調配物相關(見表6)。
圖3示出SARS-CoV-2臨床分離株及假病毒中和分析之ID50 (可見50%感染性抑制的稀釋度)。
圖4示出藉由ELISpot進行的IFN-γ分析以確定T細胞對PTX-B免疫接種的反應。
圖5示出在第1天及第22天接種PTX-B之初打及加打之小鼠藉由Luminex進行的細胞介素分析。
圖6A-圖6B示出在第1天及第22天接種PTX-B之初打及加打之小鼠藉由流動式細胞測量術進行的細胞介素分析。
圖7示出用SARS-CoV-2攻擊之小鼠的體重變化。
圖8示出AAV6-hACE2轉導小鼠模型中之保護功效。
圖9示出AAV6-hACE2轉導小鼠模型中之肺組織病理學評分。
圖10示出對來自PTX-B免疫小鼠之脾細胞的IFN-γ及IL-4 ELISpot分析。
圖11示出在SARS-CoV-2中和分析中針對SARS-CoV-2臨床分離株感染的保護。
圖12示出在假病毒中和分析中針對感染的保護。
圖13A-圖13C示出抗SARS-CoV-2抗刺突蛋白抗體概況。
圖14示出在倉鼠之SARS-CoV-2攻擊研究中，接種疫苗之動物的感染性病毒水準顯著降低。
圖15示出使用SARS-CoV-2 N、M及N/M蛋白核酸疫苗之共培養實驗中T細胞刺激指數的計算。
圖16示出使用編碼來自SARS-CoV-2關注變異體(VOC)及其他變異體之S蛋白變異體的假病毒進行血清/抗體中和分析之表徵。
圖17示出PTX-B對SARS-CoV-2 VOC假病毒及其他假病毒變異體感染的保護效率(ID50)。
圖18示出PTX-B對個別SARS-CoV-2 VOC假病毒及其他假病毒變異體感染的保護效率(ID50)。
圖19示出在接種16、40或100 μg劑量後第8、28及42天，接種PTX-B之個體中的抗刺突蛋白IgG水準。
圖20示出與SARS-CoV-2恢復期患者血漿中之水準相比，安慰劑治療之對照個體中之抗刺突蛋白IgG水準。
圖21示出在接種16、40或100 μg劑量後第8、28及42天，來自接種PTX-B之個體之樣品中的中和活性。
圖22示出在接種16、40或100 μg劑量後第8、28及42天，來自接種PTX-B之個體之樣品中的抗COVID-19中和抗體水準。
圖23示出在接種16、40或100 μg劑量後第28及42天，來自接種PTX-B之個體的抗COVID-19中和抗體濃度。
圖24示出在接種16、40或100 μg劑量後第28及42天，來自接種PTX-B之個體之抗COVID-19中和抗體的假型病毒中和。
圖25示出基於Khoury模型之PTX-B保護功效的預測。
圖26示出PTX-B誘導的針對SAR-CoV-2原始病毒株以及α、β及δ VOC的中和活性。
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1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
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Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
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Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
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Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
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Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
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Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
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370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
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900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
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1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
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Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
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1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
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Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
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Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
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Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
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Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
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Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
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Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn
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Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn
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Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val
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<![CDATA[<400> 4]]>
Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu
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35 40 45
Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys
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Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile
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Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe
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Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe
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Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
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290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
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325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
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Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
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Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
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Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Gly Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Ile Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
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405 410 415
Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
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Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
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580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
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625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Val Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
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Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
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Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
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900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
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930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
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Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
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Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
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<![CDATA[<220>]]>
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auguuugugu uucugguccu ccugccccug gugucaagcc aaugcgucaa ccugacuaca 60
cggacccagc ugcccccugc uuauaccaac ucauuuacua gaggggugua cuacccagau 120
aaaguguuca gaucaagcgu gcuccacagc acccaggacc ucuuccugcc cuucuuuuca 180
aacgugaccu gguuccaugc cauccaugug agcggaacca acgggaccaa gcgguucgau 240
aauccagugc uccccuucaa cgauggggug uauuuugcaa gcacugaaaa gucaaauauu 300
auccgcggau ggauuuucgg gacaacacuc gauagcaaga cccagucacu gcucaucgug 360
aacaacgcua caaauguggu caucaaggug ugcgaguuuc aguucugcaa ugacccuuuu 420
cucggcgucu acuaccacaa gaacaacaag agcuggaugg aaucagaauu ccggguguau 480
agcucagcua auaauugcac cuucgaguau gugagccagc cuuuccucau ggaccuggag 540
gggaagcagg gcaacuucaa gaaucugaga gaauucgugu uuaaaaacau cgauggauau 600
uucaaaaucu auagcaagca cacuccuauc aaccucgucc gggaccugcc acaaggcuuu 660
agcgcacugg agccccucgu ggaccugccc aucgggauca auaucaccag auuucagacu 720
cugcuggcuc uccaccgcag cuaccugacu ccaggggaua gcucaagcgg cuggaccgcu 780
ggagccgcug ccuauuacgu gggguaccug cagccuagga cuuuucugcu gaaguacaau 840
gagaacggga caauuacuga cgcugucgau ugugcacucg acccccucag cgagacaaaa 900
uguacccuga aaagcuuuac uguggaaaaa gggauuuacc agacuagcaa uuucagaguc 960
cagccaacag agucaaucgu gcgguuuccu aacaucacaa accucugccc auucggggag 1020
gucuucaaug ccacccgcuu cgccagcgug uacgcuugga auagaaagcg gaucagcaac 1080
ugcguggccg acuacagcgu gcucuacaau agcgcuagcu ucucaacauu uaaaugcuac 1140
ggggugagcc ccacaaaacu gaaugaccug uguuucacca auguguaugc cgauagcuuc 1200
gugauuagag gcgacgaggu gcgccaaauc gcaccuggcc aaaccggaaa gauugcagau 1260
uauaacuaua agcugcccga ugauuuuacu ggcuguguca ucgcuuggaa cagcaacaac 1320
cucgauucaa aagucggagg aaacuauaac uaccuguaua gacuguucag aaagagcaac 1380
cugaagcccu uugaaaggga uaucagcaca gaaauuuacc aggccgggag caccccaugc 1440
aacggggucg aaggguuuaa cuguuauuuc ccccugcaga gcuacggguu ucaacccacc 1500
aauggggugg gguaucagcc uuaccgcgug gucgugcuga gcuucgaacu gcugcacgcc 1560
cccgccaccg ugugcggccc uaaaaagagc acaaaccucg ucaagaacaa gugcgugaac 1620
uucaauuuca acggccugac uggcacaggc guccucaccg aaagcaauaa aaaguuccuc 1680
ccuuuccagc aauucggcag agacauugca gacacaacug augcugugag ggacccccag 1740
acacuggaga uccuggauau uacccccugu ucauucggcg gagugucagu caucaccccu 1800
ggcacuaaca caucaaauca gguggcaguc cuguaucagg gcgugaacug caccgaagug 1860
ccugucgcca uucaugcaga ccagcugacc cccacuugga gaguguacuc aacuggcagc 1920
aaugucuuuc aaaccagagc cggcugucuc aucggcgcag aacaugucaa caacagcuau 1980
gagugugaca ucccaaucgg agcuggcauc ugugccagcu aucagacaca gaccaacagc 2040
ccucggaggg cuagaagcgu ggccagccag agcauuaucg cuuacaccau gucacugggc 2100
gccgagaaua gcguggccua uagcaacaau agcaucgcca uucccaccaa uuuuaccauc 2160
agcgugacca cagagauccu cccagugagc augaccaaga caagcgucga uugcacaaug 2220
uacauuugcg gcgacagcac ugaauguagc aaccuccugc ugcaguacgg gagcuuuugu 2280
acccaacuga aucgggcacu caccgggauc gccguggagc aggauaaaaa cacucaggag 2340
gucuuugcuc aggucaaaca gaucuacaaa accccaccaa uuaaagacuu cggaggcuuc 2400
aacuucucac agauucugcc agacccuuca aagccaagca agcgcagcuu cauugaagau 2460
cuccuguuca acaaggugac ucuggcugac gcuggguuca ucaagcagua uggagacugc 2520
cugggggaca ucgcagcaag ggaucugauc ugugcucaga aguuuaaugg ccucacagug 2580
cugcccccuc uccugacuga cgagaugauu gcucaguaca ccagcgcccu gcuggcugga 2640
acuaucacau caggguggac auucggggcc ggggcugcuc ugcagauucc uuucgcaaug 2700
caaauggcau auagguucaa cgggaucggc gucacacaga acgugcugua ugagaaucag 2760
aaacugaucg caaaucaauu uaauucagca aucgggaaaa uccaggacuc acugucauca 2820
accgcaucag cccugggcaa gcugcaggac gucgucaacc aaaacgccca ggcacucaac 2880
acacugguga agcagcuguc aagcaauuuc ggagcaauca gcagcguccu gaaugauauc 2940
cugagcaggc uggauaaggu ggaggcagaa gugcagaucg accgccugau caccggccgg 3000
cuccagagcc ugcaaaccua ugucacucag caacugauca gagcugcaga aauccgggca 3060
agcgccaauc uggccgccac caagauguca gaaugcgugc ucggccagag caagagggug 3120
gacuucugcg gcaaaggcua ccaccugaug agcuucccuc agagcgcccc ccacggcgug 3180
gucuuccucc augugacuua ugugcccgca caggaaaaga acuucacuac ugccccagcc 3240
aucugccacg acggaaaggc ucauuuccca cgcgaggggg uguucgucag caauggaacc 3300
cacugguucg ugacccagcg gaacuucuau gagccucaga uuauuaccac agacaacaca 3360
uuugugucag gaaauugcga ugucgugauc gggaucguca acaauacugu cuaugacccc 3420
cuccagccag aacucgauag cuucaaagag gaacucgaua aguauuuuaa aaaucacacc 3480
agcccugaug uggaucuggg cgauaucagc ggaaucaaug cuagcguggu gaacauccag 3540
aaggagauug acaggcucaa cgaagucgca aagaaccuga acgagucacu gaucgaccuc 3600
caggaacugg gcaaguacga acaguacauc aaguggcccu gguacaucug gcucggguuc 3660
aucgcuggcc ugauugcuau cgugauggug acaaucaugc ucugcuguau gaccagcugc 3720
ugcagcugcc ugaagggaug cugcucaugc ggcagcugcu guaaguucga ugaggacgac 3780
ucagagcccg ugcucaaagg cgugaaacug cauuauacuu ga 3822
<![CDATA[<210> 8]]>
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<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
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<![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸]]>
<![CDATA[<400> 8]]>
aggaaactta agtcaacaca acatatacaa aacaaacgaa tctcaagcaa tcaagcattc 60
tacttctatt gcagcaattt aaatcatttc ttttaaagca aaagcaattt tctgaaaatt 120
ttcaccattt acgaacgata gccaccatgg ccgactcaaa cggcacaatt accgtggagg 180
agctgaagaa gctcctggag cagtggaatc tggtcattgg ctttctgttc ctgacctgga 240
tctgcctgct gcagttcgct tacgctaacc gcaaccggtt cctctatatc attaaactca 300
tttttctgtg gctgctctgg cctgtgacac tggcctgttt cgtgctcgcc gccgtctacc 360
gcattaactg gatcacagga gggattgcta tcgctatggc ttgcctggtc gggctgatgt 420
ggctctcata cttcatcgca agctttaggc tctttgcccg gactcggagc atgtggtcat 480
tcaaccccga gacaaacatt ctgctcaatg tgcctctgca cgggaccatc ctgaccaggc 540
ccctcctgga gagcgagctg gtgatcgggg ccgtgatcct gaggggacat ctgaggatcg 600
ccggccatca tctgggcagg tgtgacatca aggatctccc taaggagatc actgtggcaa 660
ctagccggac actgagctat tacaaactcg gcgcaagcca gcgcgtcgct ggggactcag 720
gcttcgcagc ttacagcaga tataggatcg ggaactacaa gctgaatacc gatcacagct 780
caagcagcga taacatcgct ctgctcgtcc agtgactcga gctagtgact gactaggatc 840
tggttaccac taaaccagcc tcaagaacac ccgaatggag tctctaagct acataatacc 900
aacttacact tacaaaatgt tgtcccccaa aatgtagcca ttcgtatctg ctcctaataa 960
aaagaaagtt tcttcacatt ctagaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaa 1084
<![CDATA[<210> 9]]>
<![CDATA[<211> 1555]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
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<![CDATA[<400> 9]]>
aggaaactta agtcaacaca acatatacaa aacaaacgaa tctcaagcaa tcaagcattc 60
tacttctatt gcagcaattt aaatcatttc ttttaaagca aaagcaattt tctgaaaatt 120
ttcaccattt acgaacgata gccaccatga ggccccaggg gctgccaaac aacaccgcaa 180
gctggttcac tgccctgact caacacggaa aggaggacct caagttcccc aggggacagg 240
gggtgcctat taacactaac tcaagccctg acgatcagat cggctattat cgcagggcta 300
caaggcgcat tagaggagga gatgggaaaa tgaaggacct gagccctcgg tggtattttt 360
attacctggg cactgggcca gaggccggac tgccatacgg cgctaataaa gacgggatta 420
tctgggtggc cactgaaggc gctctgaata cccccaagga tcacattggg actcggaacc 480
cagccaacaa cgccgctatc gtgctccagc tccctcaggg caccactctg cccaaggggt 540
tctacgccga gggctcaaga ggggggagcc aggcctcaag cagaagcggc agcggcccca 600
ggcagaagag aacagctact aaagcatata atgtgacaca ggccttcggc cgcagagggc 660
ccgaacaaac ccagggaaac ttcggcgatc aggagctgat ccggcagggc actgattaca 720
agcactggcc tcagattgcc cagttcgctc catcagccag cgctttcttc ggaatgagcc 780
ggatcgggat ggaggtgacc ccttcaggga catggctgac ttataccgga gcaatcaagc 840
tggatgacaa ggaccccaat ttcaaagacc aggtgatcct gctgaacaaa catattgatg 900
cctacaaagg gtcaggcaga ctcttcgccc gcactagatc aatgtggtca tttaacccag 960
aaactaacat cctgctgaac gtgcctctgc atggcacaat tctcaccaga cccctgctgg 1020
aaagcgaact ggtcattggc gctgtgatcc tgagaggcca cctgagaatt gctggacacc 1080
atctcggcag atgtgatatt aaggatctgc caaaggagat caccgtggct acaagcagaa 1140
ctctcagcta ctacaagctg ggggccagcc agcgggtcgc aggggatagc ggatttgccg 1200
cctactcaag atatagaatc ggaaactata aactcaacac cgaccattca agcagcagcg 1260
acaacattgc actgctggtc cagtgactcg agctagtgac tgactaggat ctggttacca 1320
ctaaaccagc ctcaagaaca cccgaatgga gtctctaagc tacataatac caacttacac 1380
ttacaaaatg ttgtccccca aaatgtagcc attcgtatct gctcctaata aaaagaaagt 1440
ttcttcacat tctagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1555
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<![CDATA[<211> 1675]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
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<![CDATA[<220>]]>
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<![CDATA[<400> 10]]>
aggaaactta agtcaacaca acatatacaa aacaaacgaa tctcaagcaa tcaagcattc 60
tacttctatt gcagcaattt aaatcatttc ttttaaagca aaagcaattt tctgaaaatt 120
ttcaccattt acgaacgata gccaccatgt cagataacgg cccacagaat cagagaaacg 180
ccccacggat cacttttggc gggcctagcg attcaaccgg gtcaaatcag aatggggaac 240
gcagcggggc ccggagcaag cagagacggc cccaagggct gcctaacaat acagcatcat 300
ggttcacagc cctgacccag catggcaagg aagatctcaa gtttcctcgc ggacagggcg 360
tgcctattaa caccaattca agccctgacg atcagatcgg ctactacaga agggctactc 420
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acctgggaac tggccctgag gcaggactgc cctatggcgc caacaaggat ggcattattt 540
gggtcgcaac tgaaggagca ctgaacacac caaaggatca catcggaaca aggaaccccg 600
caaacaatgc cgctatcgtg ctccagctgc ctcaagggac taccctgccc aaagggtttt 660
atgccgaagg gagcaggggc gggagccagg caagcagcag aagctcatca cggtcaagaa 720
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ccgaggcaag caagaagccc aggcaaaagc gcactgcaac caaggcttac aatgtcactc 960
aagcattcgg cagaaggggc ccagaacaga cccagggcaa tttcggcgac caggagctga 1020
ttagacaagg cactgattac aaacactggc ctcagatcgc tcagtttgcc cccagcgctt 1080
cagccttttt tgggatgagc cggatcggca tggaggtgac accatcaggg acctggctca 1140
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agaagaagaa agcagatgag acacaggctc tgccccagcg ccagaagaag cagcagactg 1320
tgacactgct gcccgctgca gatctggacg acttcagcaa acagctgcaa caatcaatga 1380
gctcagctga ctcaactcag gcttgactcg agctagtgac tgactaggat ctggttacca 1440
ctaaaccagc ctcaagaaca cccgaatgga gtctctaagc tacataatac caacttacac 1500
ttacaaaatg ttgtccccca aaatgtagcc attcgtatct gctcctaata aaaagaaagt 1560
ttcttcacat tctagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1675
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<![CDATA[<211> 1621]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
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<![CDATA[<400> 11]]>
aggaaactta agtcaacaca acatatacaa aacaaacgaa tctcaagcaa tcaagcattc 60
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ttctgctcct gctgtttcca ggcactaggt gcgacaggcc ccaggggctg ccaaacaaca 240
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ttgccgccta ctcaagatat agaatcggaa actataaact caacaccgac cattcaagca 1320
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ttaccactaa accagcctca agaacacccg aatggagtct ctaagctaca taataccaac 1440
ttacacttac aaaatgttgt cccccaaaat gtagccattc gtatctgctc ctaataaaaa 1500
gaaagtttct tcacattcta gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
a 1621
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<![CDATA[<211> 4238]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
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<![CDATA[<400> 12]]>
aggaaactta agtcaacaca acatatacaa aacaaacgaa tctcaagcaa tcaagcattc 60
tacttctatt gcagcaattt aaatcatttc ttttaaagca aaagcaattt tctgaaaatt 120
ttcaccattt acgaacgata gccaccaatg tttgtgtttc tggtcctcct gcccctggtg 180
tcaagccaat gcgtcaactt cactacacgg acccagctgc cccctgctta taccaactca 240
tttactagag gggtgtacta cccagataaa gtgttcagat caagcgtgct ccacagcacc 300
caggacctct tcctgccctt cttttcaaac gtgacctggt tccatgccat ccatgtgagc 360
ggaaccaacg ggaccaagcg gttcgccaat ccagtgctcc ccttcaacga tggggtgtat 420
tttgcaagca ctgaaaagtc aaatattatc cgcggatgga ttttcgggac aacactcgat 480
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tggatggaat cagaattccg ggtgtatagc tcagctaata attgcacctt cgagtatgtg 660
agccagcctt tcctcatgga cctggagggg aagcagggca acttcaagaa tctgagagaa 720
ttcgtgttta aaaacatcga tggatatttc aaaatctata gcaagcacac tcctatcaac 780
ctcgtccggg gcctgccaca aggctttagc gcactggagc ccctcgtgga cctgcccatc 840
gggatcaata tcaccagatt tcagactctg ctggctctcc acatcagcta cctgactcca 900
ggggatagct caagcggctg gaccgctgga gccgctgcct attacgtggg gtacctgcag 960
cctaggactt ttctgctgaa gtacaatgag aacgggacaa ttactgacgc tgtcgattgt 1020
gcactcgacc ccctcagcga gacaaaatgt accctgaaaa gctttactgt ggaaaaaggg 1080
atttaccaga ctagcaattt cagagtccag ccaacagagt caatcgtgcg gtttcctaac 1140
atcacaaacc tctgcccatt cggggaggtc ttcaatgcca cccgcttcgc cagcgtgtac 1200
gcttggaata gaaagcggat cagcaactgc gtggccgact acagcgtgct ctacaatagc 1260
gctagcttct caacatttaa atgctacggg gtgagcccca caaaactgaa tgacctgtgt 1320
ttcaccaatg tgtatgccga tagcttcgtg attagaggcg acgaggtgcg ccaaatcgca 1380
cctggccaaa ccggaaacat tgcagattat aactataagc tgcccgatga ttttactggc 1440
tgtgtcatcg cttggaacag caacaacctc gattcaaaag tcggaggaaa ctataactac 1500
ctgtatagac tgttcagaaa gagcaacctg aagccctttg aaagggatat cagcacagaa 1560
atttaccagg ccgggagcac cccatgcaac ggggtcaaag ggtttaactg ttatttcccc 1620
ctgcagagct acgggtttca acccacctat ggggtggggt atcagcctta ccgcgtggtc 1680
gtgctgagct tcgaactgct gcacgccccc gccaccgtgt gcggccctaa aaagagcaca 1740
aacctcgtca agaacaagtg cgtgaacttc aatttcaacg gcctgactgg cacaggcgtc 1800
ctcaccgaaa gcaataaaaa gttcctccct ttccagcaat tcggcagaga cattgcagac 1860
acaactgatg ctgtgaggga cccccagaca ctggagatcc tggatattac cccctgttca 1920
ttcggcggag tgtcagtcat cacccctggc actaacacat caaatcaggt ggcagtcctg 1980
tatcagggcg tgaactgcac cgaagtgcct gtcgccattc atgcagacca gctgaccccc 2040
acttggagag tgtactcaac tggcagcaat gtctttcaaa ccagagccgg ctgtctcatc 2100
ggcgcagaac atgtcaacaa cagctatgag tgtgacatcc caatcggagc tggcatctgt 2160
gccagctatc agacacagac caacagccct cggagggcta gaagcgtggc cagccagagc 2220
attatcgctt acaccatgtc actgggcgtc gagaatagcg tggcctatag caacaatagc 2280
atcgccattc ccaccaattt taccatcagc gtgaccacag agatcctccc agtgagcatg 2340
accaagacaa gcgtcgattg cacaatgtac atttgcggcg acagcactga atgtagcaac 2400
ctcctgctgc agtacgggag cttttgtacc caactgaatc gggcactcac cgggatcgcc 2460
gtggagcagg ataaaaacac tcaggaggtc tttgctcagg tcaaacagat ctacaaaacc 2520
ccaccaatta aagacttcgg aggcttcaac ttctcacaga ttctgccaga cccttcaaag 2580
ccaagcaagc gcagcttcat tgaagatctc ctgttcaaca aggtgactct ggctgacgct 2640
gggttcatca agcagtatgg agactgcctg ggggacatcg cagcaaggga tctgatctgt 2700
gctcagaagt ttaatggcct cacagtgctg ccccctctcc tgactgacga gatgattgct 2760
cagtacacca gcgccctgct ggctggaact atcacatcag ggtggacatt cggggccggg 2820
gctgctctgc agattccttt cgcaatgcaa atggcatata ggttcaacgg gatcggcgtc 2880
acacagaacg tgctgtatga gaatcagaaa ctgatcgcaa atcaatttaa ttcagcaatc 2940
gggaaaatcc aggactcact gtcatcaacc gcatcagccc tgggcaagct gcaggacgtc 3000
gtcaaccaaa acgcccaggc actcaacaca ctggtgaagc agctgtcaag caatttcgga 3060
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 4238
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<![CDATA[<211> 128]]>
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gaacgata 128
<![CDATA[<210> 14]]>
<![CDATA[<211> 164]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸]]>
<![CDATA[<400> 14]]>
ctcgagctag tgactgacta ggatctggtt accactaaac cagcctcaag aacacccgaa 60
tggagtctct aagctacata ataccaactt acacttacaa aatgttgtcc cccaaaatgt 120
agccattcgt atctgctcct aataaaaaga aagtttcttc acat 164
<![CDATA[<210> 15]]>
<![CDATA[<211> 1270]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2]]>
<![CDATA[<400> 15]]>
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro
65 70 75 80
Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser
85 90 95
Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val
115 120 125
Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr His Lys
130 135 140
Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu
165 170 175
Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys
180 185 190
Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn
195 200 205
Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val
210 215 220
Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala
225 230 235 240
Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr
245 250 255
Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe
260 265 270
Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys
275 280 285
Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr
290 295 300
Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr
305 310 315 320
Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly
325 330 335
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
340 345 350
Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser
355 360 365
Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu
370 375 380
Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg
385 390 395 400
Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala
405 410 415
Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala
420 425 430
Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr
435 440 445
Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp
450 455 460
Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
465 470 475 480
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465 470 475 480
Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
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Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
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675 680 685
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755 760 765
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820 825 830
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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645 650 655
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auguuugugu uucugguccu ccugccccug gugucaagcc aaugcgucaa cuucacuaca 60
cggacccagc ugcccccugc uuauaccaac ucauuuacua gaggggugua cuacccagau 120
aaaguguuca gaucaagcgu gcuccacagc acccaggacc ucuuccugcc cuucuuuuca 180
aacgugaccu gguuccaugc cauccaugug agcggaacca acgggaccaa gcgguucgcc 240
aauccagugc uccccuucaa cgauggggug uauuuugcaa gcacugaaaa gucaaauauu 300
auccgcggau ggauuuucgg gacaacacuc gauagcaaga cccagucacu gcucaucgug 360
aacaacgcua caaauguggu caucaaggug ugcgaguuuc aguucugcaa ugacccuuuu 420
cucggcgucu acuaccacaa gaacaacaag agcuggaugg aaucagaauu ccggguguau 480
agcucagcua auaauugcac cuucgaguau gugagccagc cuuuccucau ggaccuggag 540
gggaagcagg gcaacuucaa gaaucugaga gaauucgugu uuaaaaacau cgauggauau 600
uucaaaaucu auagcaagca cacuccuauc aaccucgucc ggggccugcc acaaggcuuu 660
agcgcacugg agccccucgu ggaccugccc aucgggauca auaucaccag auuucagacu 720
cugcuggcuc uccacaucag cuaccugacu ccaggggaua gcucaagcgg cuggaccgcu 780
ggagccgcug ccuauuacgu gggguaccug cagccuagga cuuuucugcu gaaguacaau 840
gagaacggga caauuacuga cgcugucgau ugugcacucg acccccucag cgagacaaaa 900
uguacccuga aaagcuuuac uguggaaaaa gggauuuacc agacuagcaa uuucagaguc 960
cagccaacag agucaaucgu gcgguuuccu aacaucacaa accucugccc auucggggag 1020
gucuucaaug ccacccgcuu cgccagcgug uacgcuugga auagaaagcg gaucagcaac 1080
ugcguggccg acuacagcgu gcucuacaau agcgcuagcu ucucaacauu uaaaugcuac 1140
ggggugagcc ccacaaaacu gaaugaccug uguuucacca auguguaugc cgauagcuuc 1200
gugauuagag gcgacgaggu gcgccaaauc gcaccuggcc aaaccggaaa cauugcagau 1260
uauaacuaua agcugcccga ugauuuuacu ggcuguguca ucgcuuggaa cagcaacaac 1320
cucgauucaa aagucggagg aaacuauaac uaccuguaua gacuguucag aaagagcaac 1380
cugaagcccu uugaaaggga uaucagcaca gaaauuuacc aggccgggag caccccaugc 1440
aacgggguca aaggguuuaa cuguuauuuc ccccugcaga gcuacggguu ucaacccacc 1500
uauggggugg gguaucagcc uuaccgcgug gucgugcuga gcuucgaacu gcugcacgcc 1560
cccgccaccg ugugcggccc uaaaaagagc acaaaccucg ucaagaacaa gugcgugaac 1620
uucaauuuca acggccugac uggcacaggc guccucaccg aaagcaauaa aaaguuccuc 1680
ccuuuccagc aauucggcag agacauugca gacacaacug augcugugag ggacccccag 1740
acacuggaga uccuggauau uacccccugu ucauucggcg gagugucagu caucaccccu 1800
ggcacuaaca caucaaauca gguggcaguc cuguaucagg gcgugaacug caccgaagug 1860
ccugucgcca uucaugcaga ccagcugacc cccacuugga gaguguacuc aacuggcagc 1920
aaugucuuuc aaaccagagc cggcugucuc aucggcgcag aacaugucaa caacagcuau 1980
gagugugaca ucccaaucgg agcuggcauc ugugccagcu aucagacaca gaccaacagc 2040
ccucggaggg cuagaagcgu ggccagccag agcauuaucg cuuacaccau gucacugggc 2100
gucgagaaua gcguggccua uagcaacaau agcaucgcca uucccaccaa uuuuaccauc 2160
agcgugacca cagagauccu cccagugagc augaccaaga caagcgucga uugcacaaug 2220
uacauuugcg gcgacagcac ugaauguagc aaccuccugc ugcaguacgg gagcuuuugu 2280
acccaacuga aucgggcacu caccgggauc gccguggagc aggauaaaaa cacucaggag 2340
gucuuugcuc aggucaaaca gaucuacaaa accccaccaa uuaaagacuu cggaggcuuc 2400
aacuucucac agauucugcc agacccuuca aagccaagca agcgcagcuu cauugaagau 2460
cuccuguuca acaaggugac ucuggcugac gcuggguuca ucaagcagua uggagacugc 2520
cugggggaca ucgcagcaag ggaucugauc ugugcucaga aguuuaaugg ccucacagug 2580
cugcccccuc uccugacuga cgagaugauu gcucaguaca ccagcgcccu gcuggcugga 2640
acuaucacau caggguggac auucggggcc ggggcugcuc ugcagauucc uuucgcaaug 2700
caaauggcau auagguucaa cgggaucggc gucacacaga acgugcugua ugagaaucag 2760
aaacugaucg caaaucaauu uaauucagca aucgggaaaa uccaggacuc acugucauca 2820
accgcaucag cccugggcaa gcugcaggac gucgucaacc aaaacgccca ggcacucaac 2880
acacugguga agcagcuguc aagcaauuuc ggagcaauca gcagcguccu gaaugauauc 2940
cugagcaggc uggauaaggu ggaggcagaa gugcagaucg accgccugau caccggccgg 3000
cuccagagcc ugcaaaccua ugucacucag caacugauca gagcugcaga aauccgggca 3060
agcgccaauc uggccgccac caagauguca gaaugcgugc ucggccagag caagagggug 3120
gacuucugcg gcaaaggcua ccaccugaug agcuucccuc agagcgcccc ccacggcgug 3180
gucuuccucc augugacuua ugugcccgca caggaaaaga acuucacuac ugccccagcc 3240
aucugccacg acggaaaggc ucauuuccca cgcgaggggg uguucgucag caauggaacc 3300
cacugguucg ugacccagcg gaacuucuau gagccucaga uuauuaccac agacaacaca 3360
uuugugucag gaaauugcga ugucgugauc gggaucguca acaauacugu cuaugacccc 3420
cuccagccag aacucgauag cuucaaagag gaacucgaua aguauuuuaa aaaucacacc 3480
agcccugaug uggaucuggg cgauaucagc ggaaucaaug cuagcguggu gaacauccag 3540
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caggaacugg gcaaguacga acaguacauc aaguggcccu gguacaucug gcucggguuc 3660
aucgcuggcc ugauugcuau cgugauggug acaaucaugc ucugcuguau gaccagcugc 3720
ugcagcugcc ugaagggaug cugcucaugc ggcagcugcu guaaguucga ugaggacgac 3780
ucagagcccg ugcucaaagg cgugaaacug cauuauacuu ga 3822
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<![CDATA[<400> 21]]>
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aaucugguca uuggcuuucu guuccugacc uggaucugcc ugcugcaguu cgcuuacgcu 120
aaccgcaacc gguuccucua uaucauuaaa cucauuuuuc uguggcugcu cuggccugug 180
acacuggccu guuucgugcu cgccgccguc uaccgcauua acuggaucac aggagggauu 240
gcuaucgcua uggcuugccu ggucgggcug auguggcucu cauacuucau cgcaagcuuu 300
aggcucuuug cccggacucg gagcaugugg ucauucaacc ccgagacaaa cauucugcuc 360
aaugugccuc ugcacgggac cauccugacc aggccccucc uggagagcga gcuggugauc 420
ggggccguga uccugagggg acaucugagg aucgccggcc aucaucuggg caggugugac 480
aucaaggauc ucccuaagga gaucacugug gcaacuagcc ggacacugag cuauuacaaa 540
cucggcgcaa gccagcgcgu cgcuggggac ucaggcuucg cagcuuacag cagauauagg 600
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guccaguga 669
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<![CDATA[<400> 22]]>
augaggcccc aggggcugcc aaacaacacc gcaagcuggu ucacugcccu gacucaacac 60
ggaaaggagg accucaaguu ccccagggga cagggggugc cuauuaacac uaacucaagc 120
ccugacgauc agaucggcua uuaucgcagg gcuacaaggc gcauuagagg aggagauggg 180
aaaaugaagg accugagccc ucggugguau uuuuauuacc ugggcacugg gccagaggcc 240
ggacugccau acggcgcuaa uaaagacggg auuaucuggg uggccacuga aggcgcucug 300
aauaccccca aggaucacau ugggacucgg aacccagcca acaacgccgc uaucgugcuc 360
cagcucccuc agggcaccac ucugcccaag ggguucuacg ccgagggcuc aagagggggg 420
agccaggccu caagcagaag cggcagcggc cccaggcaga agagaacagc uacuaaagca 480
uauaauguga cacaggccuu cggccgcaga gggcccgaac aaacccaggg aaacuucggc 540
gaucaggagc ugauccggca gggcacugau uacaagcacu ggccucagau ugcccaguuc 600
gcuccaucag ccagcgcuuu cuucggaaug agccggaucg ggauggaggu gaccccuuca 660
gggacauggc ugacuuauac cggagcaauc aagcuggaug acaaggaccc caauuucaaa 720
gaccagguga uccugcugaa caaacauauu gaugccuaca aagggucagg cagacucuuc 780
gcccgcacua gaucaaugug gucauuuaac ccagaaacua acauccugcu gaacgugccu 840
cugcauggca caauucucac cagaccccug cuggaaagcg aacuggucau uggcgcugug 900
auccugagag gccaccugag aauugcugga caccaucucg gcagauguga uauuaaggau 960
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augucagaua acggcccaca gaaucagaga aacgccccac ggaucacuuu uggcgggccu 60
agcgauucaa ccgggucaaa ucagaauggg gaacgcagcg gggcccggag caagcagaga 120
cggccccaag ggcugccuaa caauacagca ucaugguuca cagcccugac ccagcauggc 180
aaggaagauc ucaaguuucc ucgcggacag ggcgugccua uuaacaccaa uucaagcccu 240
gacgaucaga ucggcuacua cagaagggcu acucgcagaa uccgcggagg cgauggaaaa 300
augaaagacc ugagcccaag gugguacuuc uauuaccugg gaacuggccc ugaggcagga 360
cugcccuaug gcgccaacaa ggauggcauu auuugggucg caacugaagg agcacugaac 420
acaccaaagg aucacaucgg aacaaggaac cccgcaaaca augccgcuau cgugcuccag 480
cugccucaag ggacuacccu gcccaaaggg uuuuaugccg aagggagcag gggcgggagc 540
caggcaagca gcagaagcuc aucacgguca agaaauucaa gcaggaauag caccccagga 600
agcucaaggg gaacaagccc agcccggaug gcaggcaacg gcggggaugc agcacucgca 660
cugcuccugc uggaccgccu gaaucagcug gaaucaaaaa ugagcgggaa gggacagcaa 720
cagcagggac aaacugucac uaagaaguca gccgccgagg caagcaagaa gcccaggcaa 780
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cagacccagg gcaauuucgg cgaccaggag cugauuagac aaggcacuga uuacaaacac 900
uggccucaga ucgcucaguu ugcccccagc gcuucagccu uuuuugggau gagccggauc 960
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<![CDATA[<211> 1206]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸]]>
<![CDATA[<400> 24]]>
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ucaagcccug acgaucagau cggcuauuau cgcagggcua caaggcgcau uagaggagga 240
gaugggaaaa ugaaggaccu gagcccucgg ugguauuuuu auuaccuggg cacugggcca 300
gaggccggac ugccauacgg cgcuaauaaa gacgggauua ucuggguggc cacugaaggc 360
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aaagcauaua augugacaca ggccuucggc cgcagagggc ccgaacaaac ccagggaaac 600
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<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
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<![CDATA[<400> 25]]>
ucaacacaac auauacaaaa caaacgaauc ucaagcaauc aagcauucua cuucuauugc 60
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gaacgauagc caccauggac augcgggcuc ccgcccagau cuucggguuc cugcugcucc 180
uguuccccgg caccagaugc gaucgcgugc agcccaccga gagcaucguc cgcuucccca 240
acauuaccaa ccugugcccc uucggcgagg ucuuuaacgc cacaagauuc gcaucagugu 300
augccuggaa caggaagaga aucucaaacu guguggcaga cuauucaguc cuguauaaua 360
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gcuuuaccaa ugucuacgca gacagcuucg ucauuagggg agaugaagug agacagauug 480
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cucugcagag cuacggcuuc cagcccacua auggcgucgg cuaucagccc uacagggugg 780
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
aaaa 1144
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acugcaccga agugccuguc gccauucaug cagaccagcu gacccccacu uggagagugu 2040
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ugccacaagg cuuuagcgca cuggagcccc ucguggaccu gcccaucggg aucaauauca 840
ccagauuuca gacucugcug gcucuccacc gcagcuaccu gacuccaggg gauagcucaa 900
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ugagcuauua caaacucggc gcaagccagc gcgucgcugg ggacucaggc uucgcagcuu 720
acagcagaua uaggaucggg aacuacaagc ugaauaccga ucacagcuca agcagcgaua 780
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agcaauuuaa aucauuucuu uuaaagcaaa agcaauuuuc ugaaaauuuu caccauuuac 120
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gaggaggaga ugggaaaaug aaggaccuga gcccucggug guauuuuuau uaccugggca 360
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accccaauuu caaagaccag gugauccugc ugaacaaaca uauugaugcc uacaaagggu 900
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gucccccaaa auguagccau ucguaucugc uccuaauaaa aagaaaguuu cuucacauuc 1440
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1543
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<![CDATA[<211> 1663]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
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ucaacacaac auauacaaaa caaacgaauc ucaagcaauc aagcauucua cuucuauugc 60
agcaauuuaa aucauuucuu uuaaagcaaa agcaauuuuc ugaaaauuuu caccauuuac 120
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atcgggaact acaagctgaa taccgatcac agctcaagca gcgataacat cgctctgctc 660
gtccagtga 669
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<![CDATA[<211> 1140]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
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<![CDATA[<400> 35]]>
atgaggcccc aggggctgcc aaacaacacc gcaagctggt tcactgccct gactcaacac 60
ggaaaggagg acctcaagtt ccccagggga cagggggtgc ctattaacac taactcaagc 120
cctgacgatc agatcggcta ttatcgcagg gctacaaggc gcattagagg aggagatggg 180
aaaatgaagg acctgagccc tcggtggtat ttttattacc tgggcactgg gccagaggcc 240
ggactgccat acggcgctaa taaagacggg attatctggg tggccactga aggcgctctg 300
aataccccca aggatcacat tgggactcgg aacccagcca acaacgccgc tatcgtgctc 360
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gatcaggagc tgatccggca gggcactgat tacaagcact ggcctcagat tgcccagttc 600
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<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
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<![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸]]>
<![CDATA[<400> 36]]>
atgtcagata acggcccaca gaatcagaga aacgccccac ggatcacttt tggcgggcct 60
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<![CDATA[<400> 37]]>
atggacatga gagctccagc ccagatcttt ggctttctgc tcctgctgtt tccaggcact 60
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tcaacacaac atatacaaaa caaacgaatc tcaagcaatc aagcattcta cttctattgc 60
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ttcacattct agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1072
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tcaacacaac atatacaaaa caaacgaatc tcaagcaatc aagcattcta cttctattgc 60
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1663
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<![CDATA[<400> 41]]>
tcaacacaac atatacaaaa caaacgaatc tcaagcaatc aagcattcta cttctattgc 60
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atggcctcac agtgctgccc cctctcctga ctgacgagat gattgctcag tacaccagcg 2760
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actcactgtc atcaaccgca tcagccctgg gcaagctgca ggacgtcgtc aaccaaaacg 3000
cccaggcact caacacactg gtgaagcagc tgtcaagcaa tttcggagca atcagcagcg 3060
tcctgaatga tatcctgagc aggctggata aggtggaggc agaagtgcag atcgaccgcc 3120
tgatcaccgg ccggctccag agcctgcaaa cctatgtcac tcagcaactg atcagagctg 3180
cagaaatccg ggcaagcgcc aatctggccg ccaccaagat gtcagaatgc gtgctcggcc 3240
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tcagcaatgg aacccactgg ttcgtgaccc agcggaactt ctatgagcct cagattatta 3480
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ttaaaaatca caccagccct gatgtggatc tgggcgatat cagcggaatc aatgctagcg 3660
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attcgtatct gctcctaata aaaagaaagt ttcttcacat tctagaaaaa aaaaaaaaaa 4140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 4225
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ccacagacaa cacatttgtg tcaggaaatt gcgatgtcgt gatcgggatc gtcaacaata 3540
ctgtctatga ccccctccag ccagaactcg atagcttcaa agaggaactc gataagtatt 3600
ttaaaaatca caccagccct gatgtggatc tgggcgatat cagcggaatc aatgctagcg 3660
tggtgaacat ccagaaggag attgacaggc tcaacgaagt cgcaaagaac ctgaacgagt 3720
cactgatcga cctccaggaa ctgggcaagt acgaacagta catcaagtgg ccctggtaca 3780
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agctagtgac tgactaggat ctggttacca ctaaaccagc ctcaagaaca cccgaatgga 4020
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attcgtatct gctcctaata aaaagaaagt ttcttcacat tctagaaaaa aaaaaaaaaa 4140
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<![CDATA[<400> 46]]>
ucaacacaac auauacaaaa caaacgaauc ucaagcaauc aagcauucua cuucuauugc 60
agcaauuuaa aucauuucuu uuaaagcaaa agcaauuuuc ugaaaauuuu caccauuuac 120
gaacgauagc caccaugguc agcaaagggg aggaggucau uaaagaauuc augagauuua 180
aagucagaau ggagggcagc augaacggcc acgaguucga aaucgagggc gaaggagagg 240
gccgcccaua ugaagggacc cagacagcca agcugaaagu gaccaagggc ggaccacugc 300
cuuucgcuug ggacauccug ucaccccaau uuauguacgg gucaaaggcc uacgugaaac 360
auccagccga caucccagau uacaagaaac ugagcuuucc ugaaggguuu aagugggaac 420
gggucaugaa cuucgaggau ggcggacugg ugacugucac ccaagauagc agccuccagg 480
acggcacucu gaucuauaag gugaagaugc gcggaacuaa cuuuccaccc gacgggccag 540
ucaugcagaa gaagacaaug ggcugggaag cuucaaccga aaggcucuau cccagagaug 600
ggguccugaa gggcgaaauc caccaggccc ugaagcucaa ggauggaggg cacuaccugg 660
uggaguuuaa aaccaucuau auggccaaaa agcccgugca acugccagga uauuauuacg 720
uggacacaaa gcucgauauc accagccaca acgaagauua cacaauuguc gaacaguaug 780
agcggucaga aggaaggcau caccucuuuc ugggacaugg gaccggcuca acuggcagcg 840
gcucaucagg caccgccuca ucagaagaca acaauauggc cgugaucaag gaguucauga 900
gauucaaggu gagaauggag gggagcauga acggccacga auucgaaauc gagggcgagg 960
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cccugccauu cgcuugggac auccugagcc cccaauucau guauggauca aaggccuaug 1080
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gccccgugau gcaaaaaaaa acaaugggcu gggaggcuag cacugaacgg cuguacccac 1320
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auuaugugga cacaaaacug gauauuaccu cacacaacga agacuauaca auuguggaac 1500
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agccauucgu aucugcuccu aauaaaaaga aaguuucuuc acau 164
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<![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸]]>
<![CDATA[<400> 52]]>
aaccagcctc aagaacaccc gaatggagtc tctaagctac ataataccaa cttacactta 60
caaaatgttg tcccccaaaa tgtagccatt cgtatctgct cctaataaaa agaaagtttc 120
ttcac 125
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<![CDATA[<211> 125]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸]]>
<![CDATA[<400> 53]]>
aaccagccuc aagaacaccc gaauggaguc ucuaagcuac auaauaccaa cuuacacuua 60
caaaauguug ucccccaaaa uguagccauu cguaucugcu ccuaauaaaa agaaaguuuc 120
uucac 125
Claims (43)
- 一種聚核苷酸，其編碼SARS-CoV-2之至少一種結構蛋白或其變異體，其中該至少一種結構蛋白為刺突(S)蛋白，且其中該聚核苷酸包含第一序列區域，該第一序列區域包含與由SEQ ID NO: 7、20、26、27及32組成之群的成員具有至少80%一致性的核酸序列。
- 如請求項1之聚核苷酸，其中該第一序列區域與SEQ ID NO: 7至少95%一致。
- 如請求項2之聚核苷酸，其中該第一序列區域與SEQ ID NO: 7至少99%一致。
- 如請求項3之聚核苷酸，其中該第一序列區域由SEQ ID NO: 7組成。
- 如請求項4之聚核苷酸，其中該經編碼刺突蛋白具有SEQ ID NO: 2之蛋白質序列。
- 如請求項1至5中任一項之聚核苷酸，其中至少50%之該聚核苷酸序列經密碼子最佳化。
- 如請求項5之聚核苷酸，其中該聚核苷酸為DNA。
- 如請求項5之聚核苷酸，其中該聚核苷酸為RNA。
- 如請求項8之聚核苷酸，其中該聚核苷酸為mRNA。
- 如請求項9之聚核苷酸，其包含5'UTR及3'UTR，其中該5'UTR包含SEQ ID NO: 47且該3'UTR包含SEQ ID NO: 48。
- 如請求項10之聚核苷酸，其中至少一個尿嘧啶核苷經修飾為N1-甲基假尿苷。
- 如請求項11之聚核苷酸，其中所有尿嘧啶核苷經修飾為N1-甲基假尿苷。
- 一種核酸疫苗，其包含如請求項12之聚核苷酸。
- 如請求項13之核酸疫苗，其在脂質奈米粒子(LNP)中調配。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項14之核酸疫苗及醫藥學上可接受之賦形劑。
- 如請求項15之醫藥組合物，其包含約0.2 mg/mL如請求項9之mRNA。
- 如請求項16之醫藥組合物，其適於肌內(IM)注射。
- 如請求項16之醫藥組合物，其以2 mL填充物封裝在3 mL玻璃小瓶中。
- 一種誘導個體之免疫反應之方法，其包含投與如請求項13至14中任一項之核酸疫苗或如請求項15至18中任一項之醫藥組合物。
- 如請求項19之方法，其中該免疫反應包含T細胞反應。
- 如請求項19之方法，其中該免疫反應包含B細胞反應。
- 如請求項19之方法，其進一步包含在該第一次投與之後投與加強劑。
- 如請求項19之方法，其中該個體之該免疫反應為劑量依賴性。
- 如請求項23之方法，其中該劑量依賴性免疫反應包含在該個體中誘導SARS-CoV-2刺突蛋白特異性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM及IgA抗體中之一或多者。
- 如請求項23之方法，其中該劑量依賴性免疫反應包含誘導IL-2+ T細胞、IL-4+ T細胞及IFN-γ+ T細胞中之一或多者。
- 一種治療個體之COVID-19之方法，其包含投與如請求項13至14中任一項之核酸疫苗或如請求項15至18中任一項之醫藥組合物。
- 一種預防個體之COVID-19之方法，其包含向該個體投與如請求項13至14中任一項之核酸疫苗或如請求項15至18中任一項之醫藥組合物。
- 一種減輕或改善個體體內COVID-19之生理效應或症狀之方法，其包含向該個體投與如請求項13至14中任一項之核酸疫苗或如請求項15至18中任一項之醫藥組合物。
- 如請求項26至28中任一項之方法，其中向該個體投與之該mRNA之劑量為約5 µg至約100 µg。
- 如請求項26至28中任一項之方法，其中向該個體投與之該mRNA之劑量為約16 µg。
- 如請求項26至28中任一項之方法，其中向該個體投與之該mRNA之劑量為約40 µg。
- 如請求項26至28中任一項之方法，其中向該個體投與之該mRNA之劑量為約100 µg。
- 如請求項26至28中任一項之方法，其中向該個體投與之該醫藥組合物之體積為約0.025 mL至約0.5 mL。
- 如請求項26至28中任一項之方法，其中向該個體投與之該醫藥組合物之體積為約0.025 mL、0.05 mL、0.08 mL、0.2 mL或0.5 mL。
- 如請求項26至34中任一項之方法，其包含在第一劑量之約1週至約5週後投與該核酸疫苗或醫藥組合物之第二劑量。
- 如請求項35之方法，其中該第二劑量在該第一劑量後約4週投與。
- 如請求項26至28中任一項之方法，其中在接受該核酸疫苗或醫藥組合物之第一劑量後截至第28天，在該個體體內偵測到抗刺突蛋白IgG抗體。
- 如請求項37之方法，其中在接受該核酸疫苗或醫藥組合物之第二劑量後截至第42天，該個體體內存在之該等抗刺突蛋白IgG抗體的量增加。
- 如請求項37之方法，其中該個體體內之該等抗刺突蛋白IgG抗體為來自SARS-CoV-2恢復期患者之血清樣品中之抗刺突蛋白IgG抗體之值的10倍以上。
- 一種在個體體內誘導SARS-CoV-2中和抗體產生之方法，其包含向該個體投與如請求項13至14中任一項之核酸疫苗或如請求項15至18中任一項之醫藥組合物。
- 如請求項40之方法，其中可在投與後截至第28天在該個體體內偵測到該等SARS-CoV-2中和抗體。
- 如請求項41之方法，其中在接受該核酸疫苗或醫藥組合物之第二劑量之後第42天，該個體體內之該SARS-CoV-2中和抗體產量增加。
- 如請求項41之方法，其中SARS-CoV-2中和抗體之水準截至第42天增加十倍。
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