JPS6371195A - 新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、モチリンの１３位メチオニン（Ｍｅｔ）をロ
イシン（ｔｅｕ）　に置換した新規ペプチド、該ペプチ
ドをコードするＤＮＡ５該ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ
およびこれらの製造法に関する。

本発明の新規ペプチド（以下　”Ｌｅｕ−モチリンとい
う）は、天然のモチリンと同等の活性を有するので医薬
品としての用途が期待できる。

従来技術 モチリン（Ｍｏｔｉｌｉｎ）　は哺乳類の血中に存在す
る生理活性ペプチドで腸管螺動を活発にする作用を持つ
ことが知られているＣｌ３．　Ｙ、　Ｃｈｅｙおよびに
、　Ｙ。

Ｌｅｅ、　　り’）ニツクス・イン・ガストロエンテロ
ロジイ（Ｃ１ｉｎｉｃｓ　ｉｎ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅ
ｒｏｌｏｇｙ、　　３．６４５（１９８０）　）。

開腹手術を受けた患者の血中モチリン濃度は低下する。

術後の血中モチリン濃度の正常値への復帰は患者の腸管
の情動運動の回復と相関関係があり、術後にモチリンを
投与すると腸の螺動運動が活発化す、ることが知られて
いる。

発明が解決しようとする問題点 天然のモチリンは動物臓器から抽出する方法で得ること
ができるが、この方法では量的に不十分である。そこで
、現在用いられているモチリンは大部分がペプチド化学
合成法で作られたものである。しかし、この方法では、
モチリンがアミノ酸２２個からなる比較的長鎖のペプチ
ドであるため高価にならざるをえない。従って、モチリ
ンの活性を有する物質を安価に大量に供給することが望
まれている。

問題点を解決するための手段 モチリンの１３位アミノ酸はＭｅｔであって、これは酸
化されやすく、酸化されてスルホキシド体になるとモチ
リンの活性は低下するＣＭ、　Ｆｕｊｉｎ。

ら、ケミカル・ファーマシューティカル・ブリテア　（
Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、）、　２６　、１
（１０）（１９７Ｂ）　］。

本発明者は、活性低下を防ぐ方法について研究を行った
結果、モチリンの１３位Ｎｅｔをｌｅｕに変換したペプ
チド（＋３１．ｅｕ−モチリン）がモチリンと同等の活
性を有し、酸化による活性の低下がないことを見出した
。

さらにこの＋３Ｌｅｕ−モチリンを安価に大量に供給す
る方法について研究した結果、遺伝子組換え技法で供給
することができることを見出した。

遺伝子組換え技法で小分子のペプチドを大量生産するこ
とは一般に困難とされている。その理由は、微生物など
の宿主細胞中で作られた小分子のペプチドは細胞中で酵
素作用により容易に分解されてしまうためであると考え
られている。この分解を防ぐために、他の蛋白質と目的
ペプチドとを融合させ高分子量の融合蛋白質として生産
させ、ついでこれを酵素的または化学的方法で分解して
目的のペプチドを得る方法が報告されている〔三国俊亮
ら、生化学、足、　８５４（１９８５）　）。

しかし、この方法では、生産される融合蛋白質中の目的
ペプチドはごく一部分であるため、目的ペプチドの生産
量は低くならざるを得ない。

本発明者は、目的ペプチドをコードする遺伝子を複数個
連結してベクターに組み込み、得られる組換え体ＤＮＡ
を大腸菌に入れ、形質転換体を培養する方法によれば、
目的ペプチドが重合した高分子ペプチドとして得られ、
この重合ペプチドを切断することにより目的ペプチドを
製造することができることを見出した。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明は下記式１のアミノ酸配列を有する新規ペプチド
Ｃ３Ｌｅｕ−モチリン）を提供する。

ＰｈｅＶａ　１Ｐｒｏ　Ｉ　１ｅＰｈｅＴｈｒＴｙｒＧ
　１ｙＧ　］　ｕＬｅｕＧ　１ｎＡｒ　ｇＬｅｕＧ　１
ｎ−ＧｌｕＬｙｓＧ］ｕＡｒｇＡｓｎＬｙｓＧＩｙＧｌ
ｎ　　　　（式１）（式中、記号は下記アミノ酸残基を
示す。

Ｐｈｅ　：　フェニルアラニン、Ｖａｔ：　バリン、Ｐ
ｒｏ　：　プロリン、Ｉｌｅ　：　イソロイシン、Ｐｈ
ｅ　：　フェニルアラニン、Ｔｈｒ：　スレオニン、Ｔ
ｙｒ　：　チロシン、ｃｒｙ　：　グリシン、Ｇｌｕ　
：グルタミン酸、Ｌｅｕ：ロイシン、Ｇｉｎ　：　グル
タミン、＾ｒｇ：　アルギニン、Ｌｙｓ　：リジン、Ａ
ｓｎ　　＋アスパラギン以下間じ） 目Ｌｅｕ−モチリンは、ペプチド固相合成法ＣＧ。

Ｂａｒａｎｇら、ザ・ペプチド：アナリシス・シンセシ
スーバイオロジイ（”Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ：＾ｎａ
ｌｙｓｉｓ、　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ。

［１ｉｏ１ｏｇｙ”）　、　［１，ＧｒｏｓｓおよびＪ
、　Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｎ！。

ＶＯＩ、２．　ｐｉ、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　
（１９８２））によりペプチド自動合成機（Ｂｅｃｋｍ
ａｎ　９９０Ｂ型）を用いて合成することができる。

遺伝子組換え法による”Ｌｅｕ−モチリンの製造は下記
のとおり行うことができる。

工程１（第１図参照） まず、下記式３．４．５および６で示されるＤＮＡを化
学合成する。

５’　　　　ＣＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＴＴＣ
ＧＴＴＣＣＧＡＴＴＴＴＣ人ＣＴＴＡＣＧＧＴＧＡＡＣ
ＴＧＣ＾＾Ｃ３’（式３） ％式％ （式４） ５’　　ＧＴＣＴＧＣ＾＾ＧＡＧ＾＾＾Ｇ＾＾ＣＧＴ＾
＾Ｃ＾＾＾ＧＧＴＣＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡ
ＧＣＴ　　３’く式５） ％式％ （式中、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃはそれぞれヌクレオチド中の塩
基アデニン、チミン、グアニン、シトシンを示す。以下
同じ） これらＤＮＡの合成は、リン酸アミダイド法による面相
合成法に従い、ＤＮＡ自動合成機により行う。

式３で示されるＤＮＡ　（以下ＤＮΔ３という）と式４
で示されるＤＮＡ　（以下ＤＮＡ４という）および式５
で示されるＤＮＡ　（以下ＤＮＡ５という）と弐６で示
されるＤＮＡ　（以下ＤＮＡ６という）から形成される
二重鎖ＤＮＡ断片をリガーゼで結合して下記式２で示さ
れる二重鎖Ｄ　Ｎ　Ａ断片（以下遺伝子２という）を造
成する。

［：１ａＩ　ＢｇｌＩ［ （式中ＣＩａＩ、ＢｇｌＩ［、ＢａｍＨＩＳＳａｃ　Ｉ
に向かう引き出し線は、これら制限酵素による切断部位
を示す。） この遺伝子２は”Ｌｅｕ−モチリンのアミノ末端側にア
スパラギン酸（＾ｓｐ）　−グルタミン（Ｇｌｎ）　−
インロイシン（Ｉｌｅ）　−フェニルアラニン（Ｐｈｅ
）　　−メチオニン（Ｍｅｔ）が、カルボキシル末端側
にアルギニン（Ａｒｇ）　　−イソロイシン（Ｉｌｅ）
　　−ロイシン（Ｌｅｕ）が結合した３０個のアミノ酸
からなるペプチドをコードする塩基配列を持っている。

このアミノ末端側およびカルボキシル末端側に結合した
アミノ酸をコードするＤＮＡには、遺伝子２を用いて”
Ｌｅｕ−モチリン重合体をコードする遺伝子を作るため
に制限酵素ＢｇｌＩ［とＢａｍＨＩの認識部位が配置さ
れている。またその遺伝子により生産される重合体中の
”　Ｌｅｕ−モチリン単量体間はＡｒｇ−１１ｅ−Ｐｈ
ｅ−Ｍｅｔの４アミノ酸からなるペプチド（スペーサー
ペプチド）で連結するように設計されている。

このスペーサーペプチドは臭化シアン、カルボキシペプ
チダーゼＡおよびＢで順次処理することにより除去され
、′３Ｌｅｕ−モチリン単量体を与える。

遺伝子２の両端には、ベクターへの導入のため制限酵素
Ｃ１ａＩと５ａｃｌの認識部位を配置しである。遺伝子
２のＤＮΔコドンは、大腸菌で大量に生産される蛋白質
の遺伝子に高頻度で出現するコドン（Ｍ、　Ｇｏｕｇ　
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　　１０
７０５５　（１９８２）　：ｌを主として用いである。

また、遺伝子２はＤＮＡ３とＤＮＡ４との二重鎖ＤＮＡ
断片およびＤＮＡ５とＤＮＡ６との二重鎖ＤＮＡ断片を
リガーゼで結合して合成するが、この結合反応が効率よ
く進行するように遺伝子２の塩基配列にある長さ以上の
同一の配列が存在しないように設計しである。

工程２（第１図参照） 遺伝子２を含むプラスミドの造成ニ ブラスミドｐＴｒｓ２０　（参考例１の方法で製造）を
制限酵素ＣＩａＩとＳａｃ　Ｉとで切断後、大きい方の
ＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ７という）を単離する。ＤＮＡ
７と工程１で得た遺伝子をリガーゼで結合してプラスミ
ドｐＭＴＡ１を造成する。

工程３（第２５図参照） ”　Ｌｅｕ−モチリン遺伝子を２個含むプラスミドの造
成ニ プラスミドｐＭＴＡ１を制限酵素ＰｓｔｌとＢｇｌｎで
切断し、”　Ｌｅｕ−モチリン遺伝子を含むＤＮＡ断片
８（以下ＤＮＡ８という）を単離する。

別にｐＭＴＡｌをＰｓｔｌとＢａｍＨＩで切断し、”　
Ｌｅｕ−モチリン遺伝子を含むＤＮＡ断片９（以下ＤＮ
Ａ９という）を単離する。ＤＮＡ８とＤＮＡ９とをリガ
ーゼで結合することにより１３Ｌｅｕ−モチリン遺伝子
を２個含むプラスミドｐＭＴＡ２を得る。制限酵素Ｂｇ
ｌｎとＢａｍＨＩとは同一の切断末端を生じるため結合
することができるが、結合部位（第２図中Ｂｇ／Ｂａｍ
と表示）は両制限酵素の認識部位と異なる塩基配列とな
るため、いずれの制限酵素でも切断されない。

工程４（第３図参照） ＋１１ｅｕ−モチリン遺伝子を４個含むプラスミドの造
成： ｐＭＴＡ２をＰｓｔｌとＢｇｌＩＩで切断する。

前述のとおりＢｇ／Ｂａｍの部位は切断されないので２
個の”Ｌｅｕ−モチリン遺伝子を含むＤＮＡ断片が得ら
れる。別にｐＭＴＡ２をＰＳｔｌとＥ３ａｍＨＩで切断
して同様に”　Ｌｅｕ−モチリン遺伝子２個を含むＤＮ
、Ａ断片が得られる。両ＤＮＡ断片をリガーゼで結合す
ると１３Ｌ６　ｕ−モチリン遺伝子を４個含むプラスミ
ドｐＭＴＡ４が得られる。

ｐＭＴＡ２からｐＭＴＡ４を作製するのと同様の方法で
”Ｌｅｕ−モチリン遺伝子を８個、１６個、３２個含む
プラスミドｐＭＴΔ８、ｐＭＴＡ１６ふよびｐＭＴＡ３
２を得る。これらを以下ｐＭＴＡと総称する。

工程５（第４図参照） 目Ｌｅｕ−モチリン遺伝子の蛋白質発現用ベクターへの
組み込み： シロザケ成長ホルモン（ＳＧＨ）遺伝子の発現に用いた
プラスミドｐｓＧＨＩＭ１　（参考例２の方法で製造）
を制限酵素Ｂｇｌｎと５ａｃＩで切断し、大きい方のＤ
ＮＡ断片（以下ＤＮＡ１０という）を単離する。別にプ
ラスミドｐＭＴＡ４をＢｇｌＩＩと５ａｃＩで切断し、
”Ｌｅｕ−ｖ−チリンを４個含むＤＮＡ断片（以下ＤＮ
ＡＩＩという）を単離する。ＤＮＡｌ０とＤＮＡＩＩと
をリガーゼで結合して発現プラスミドｐＭＴＫ４を得る
。

ｐＭＴＡ４に替えてｐＭＴＡ８またはｐＭＴＡ１６を用
いて同様に行うことにより”　Ｌｅｕ−モチリン遺伝子
を８個または１６個含む発現プラスミドｐＭＴＫ８ま、
たはｐＭＴＫ１６を得ることができる。これらを以下ｐ
ＭＴＫと総称する。

工程６（第５図参照） 発現プラスミドへのターミネータ−の導入ニブラスミド
ｐｓＧＨＩＭ１を制限酵素ｐｓｔＩとＢａｍＨＩで切断
してプロモーターを含むＤＮＡ断片を得る。別にプラス
ミドｐＣＨＤ７　（参考例４）をｐｓｔＩとＢａｍＨＩ
で切断してターミネータ−を含むＤＮＡ断片を得る。両
ＤＮＡ断片をリガーゼで結合して、ターミネータ−の下
流に制限酵素ＢｇｌｌＩの認識部位を持たず、Ｍａｕｌ
の認識部位を持つプラスミドｐｓＧＨＩＭＥ１を造成す
る。

ｐｓＧＨＩＭＥｌをＢｇｌＩ［と５ａｃｌで切断して得
た大きい方のＤＮＡ断片とプラスミドｐＭＴΔ４をＢｇ
ｌＩＩと５ａｃＩで切断しテ１等たｌ３Ｌｅｕ−モチリ
ン遺伝子を含むＤＮＡ切断とをリガーゼで結合して”Ｌ
ｅｕ−モチリン遺伝子を４個含むプラスミドｐＭＴＬ４
を得る。ｐＭＴＡ４に替えてｐＭＴＫ８またはｐＭＴＫ
１６を用いて同様に行い、”　Ｌｅｕ−モチリン遺伝子
を８個または１６個有するプラスミドｐＭＴＬ８または
ｐＭＴＬ１６を得る。これらを以下ｐＭＴＬと総称する
。

プラスミドｐＭＴＫおよびｐＭＴＬには各々トリプトフ
ァンプロモーターの下流にシロザケ成長ホルモンのアミ
ノ末端から１０４個のアミノ酸をコードする遺伝子があ
り、この遺伝子の下流に”Ｌｅｕ−モチリン遺伝子を含
む遺伝子が連結している。またＩ′Ｌｅｕ−モチリン遺
伝子の下流にリポ蛋白質遺伝子のターミネータ−が導入
されている。プラスミドｐＭＴＫとｐＭＴＬとの相違は
、ｐＭＴＫはターミネータ−の下流に制限酵素Ｂｇ１ｍ
の認識部位を持つがｐＭＴＬはこれを持たないことにあ
る。

工程７ ”Ｌｅｕ−モチリン遺伝子の発現： １３Ｌｅｕ−モチリン遺伝子発現プラスミドｐＭＴＫお
よびｐＭＴＬを大腸菌に導入する。形質転換株は、”Ｌ
ｅｕ−モチリンの４，８または１６量体とシロザケ成長
ホルモンとの融合蛋白質を生産する。

これら融合蛋白質は、いずれも大腸菌内で頚粒として存
在している。１３Ｌｅｕ−モチリンの４量体の融合蛋白
の生産量が最も多く、全菌体蛋白質の約１０％程度であ
る。顧粒中の１ｓｌｅｕ−モチリンの割合はそれぞれｐ
ＭＴＬ４　：　４２％、ｐＭＴＬ８：５６％ｐＭＴＬ１
６：６８％である。

工程８（第６図参照） ”Ｌｅｕ−モチリン生産量の向上（１）：ブラスミ［ｐ
ＭＴＫおよびｐＭＴＬを用いる上記方法においては、シ
ロザケ成長ホルモンの１０４個アミノ酸からなる蛋白質
との融合蛋白質として生産される。このシロザケ成長ホ
ルモン部分はより小さいことが望まれる。下記の方法に
よってシロザケ成長ホルモン部分をより小さくしたプラ
スミドを造成し、′５Ｌｅｕ−モチリンの製造を行うこ
とができる。

下記式１３で示されるデオキシオリゴヌクレオチド（以
下ＤＮＡ１３という）と式１４で示されるデオキシオリ
ゴヌクレオチド（以下ＤＮＡ１４という）を化学合成す
る。合成はリン酸アミダイト法による固相合成法に従い
、ＤＮＡ自動合成機により行う。

５　’　　ＡＧＣＴＴＡＴＧＡＴＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡ
ＣＧＧＣＴＣ丁ＴＣＣＡ　　　３’（式１３） ％式％ （式１４） 両ＤＮＡを混合して下記式１２で示されるリンカ−１２
を造成する。

５　’　ＡＧＣＴＴＡＴＧ＾ＴＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＣ
ＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡ３’　　　ＡＴＡＣＴＡＴＣＴＴ
ＴＴＧＧＴＴＧＣＣＧＡＧ＾＾ＧＧＴＣＴＡＧ（式１２
） リンカ−１２はシロザケ成長ホルモンのアミノ末端から
８番目までのアミノ酸をコードする遺伝子とこの遺伝子
の両側に制限酵素ＨｉｎｄＩＩ［とＢｇｌ■の切断末端
を持っている。

＋３１ｅｕ−モチリン遺伝子４個を持つプラスミドｐＭ
ＴＬ４を制限酵素ＰｓｔｌとＢｇｌＩＩで切断し、”Ｌ
ｅｕ−モチリン遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ１
５という）を単離する。別にｐＭＴＬ　４を制限酵素Ｐ
ｓｔＩとＨｉｎｄＩ［［で切断し、プロモーターを含む
ＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ１６という）を単離する。ＤＮ
Ａ１５．ＤＮＡ１６およびリンカ−１２をリガーゼで結
合してプラスミドｐＭＴＮ４を造成する。

ｐＭＴＬ４に替えてｐＭＴＬ８を用いて上記と同様に行
い、ｐＭＴＭ８を作製する。プラスミドｐＭＴＮ４とｐ
ＭＴＭ８はともに”Ｌｅｕ−＋−チリン重合体のアミノ
末端にＭｅｔ−１１ｅ−Ｇｌｎ−＾５ｎ−Ｇｌｎ−＾「
ｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ
の１２個のアミノ酸が結合した蛋白質をコードする遺伝
子を持ち、ｐＭＴＭ４は”　Ｌｅｕ−モチリン遺伝子を
４個、ｐＭＴＭ８は”Ｌｅｕ−モチリン遺伝子を８個持
つ。プラスミドｐＭＴＮ４およびｐＭＴＭ８を大腸菌に
導入する。

これら形質転換株はプラスミドｐＭＴＫまたはｐＭＴＬ
を含む形質転換株と同程度の蛋白質を生産する。これら
蛋白質は大腸菌中で顆粒の状態で存在し、この顆粒中の
”　Ｌｅｕ−モチリンの含量は７７−８０％でｐ、ＭＴ
ＫおよびｐＭＴＬを含む形質転換株の生産量を大きく越
えている。

工程８（第７図参照） ’　”Ｌｅｕ−モチリン生産量の向上（２）ニブラスミ
ドｐＭＴＫ、　ｐＭＴＬＳｐＭＴＮを大腸菌に導入して
ｌ３Ｌｅｕ−モチリンを大量に生産することができるが
、プラスミド中の一部のＤＮＡを除去することによりさ
らに高生産できる方法を下記に示す。

プラスミドｐＭＴＬは”Ｌｅｕ−モチリン遺伝子の下流
にターミネータ−を持つ。このターミネータ−と”Ｌｅ
ｕ−モチリンの間にある非翻訳領域のＤＮＡを除去した
プラスミドを造成する。

プラスミドｐＡｒｇ４　（参考例５）を制限酵素ＰＳｔ
■とＢａｍＨＩで切断してプロモーターを含むＤＮＡ断
片を得る。別にプラスミドｐＧＨＤ７をＰＳｔｌとＢａ
ｍＨＩで切断してターミネータ−を含むＤＮＡ断片を得
る。両ＤＮＡ断片をリガーゼで結合して、ターミネータ
−の下流にＢｇｊ！　ＩＩの認識部位を持たないプラス
ミドｐＡｒｇＥ１を造成する。

ｐＡｒｇＥｌをＰＳｔｌとＥｃｏＲＶで切断してターミ
ネータ−を含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ１７という）を
単離する。

プラスミドｐＭＴＫ４を制限酵素Ｓａｃ　Ｉで切断し、
切断部分の一本鎮領域をＤＮＡポリポリーゼ■の・Ｋｌ
ｅｎｏｗフラグメントを用いて加水分解し、平滑末端（
Ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）とする。さらにこのＤＮＡ断片を
Ｐｓｔｌで切断後、＋３Ｌｅｕ−モチリン遺伝子を含む
ＤＮＡ断片（以下ＤＮΔ１８という）を単離する。ＤＮ
Ａ１７とＤＮＡ１８をリガーゼで結合してプラスミドｐ
ＭＴＭ４を得る。

プラスミドｐＭＴＫ４の代わりにｐＭＴＬ４を用いて同
様に行ってｐＭＴＭ４が得られる。

ｐＭＴＫ４に替えてｐＭＴＬ８を用いて同様に行って＋
３シｅｕ−モチリン遺伝子８個を有するプラスミドｐＭ
ＴＭ８が得られる。

ｐＭＴＡ４からｐＭＴＡ８を作製したのと同様の方法で
ｐＭＴＭ４からｐＭＴＭ８を造成することができる。す
なわち、ｐＭＴＭ４を制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌｎで切
断して”Ｌｅｕ−ｔ−チリン遺伝子を含むＤＮＡ断片を
単離し、このＤＮＡ断片をｐＭＴＭ４をＰｓｔｌとＢａ
ｍＨＩで切断して得られる”　Ｌｅｕ−モチリン遺伝子
を含むＤＮＡ断片とりガーゼで結合してｐＭＴＭ８を得
る。

さらにプラスミドｐＡｒｇＥｌに替えてｐＡｒｇ４を用
いて、ｐＭＴＭ４、ｐＭＴＭ８の造成と同様に行ってプ
ラスミドｐＭＴｍ４．９Ｍ７ｍ８を造成する。ｐ、ＭＴ
ＭとｐＭＴｍの相違は、ｐＭＴＭはターミネータ−の下
流に制限酵素ＢｇｌＩＩの認識部位を持つがｐＭＴｍは
これを持たないことである。

工程９ ｐＭＴＭを用いる”　Ｌｅｕ−モチリン遺伝子の発現ニ
ブラスミドｐ　Ｍ　Ｔ　ＭとｐＭＴｍはｐＭＴＫおよび
ｐＭＴＬのターミネータ−上流の非翻訳領域の遺伝子が
約１６０塩基対（以下ｂｐという）除去された構造を持
つ。

ｐＭＴＭ４を大腸菌ＨＢＩＯＩに導入した場合、”　Ｌ
ｅｕ−モチリン重合体の蛋白質量は全蛋白質量の１７％
を占める。

工程１０（第８図参照） ”Ｌｅｕ−モチリン生産の向上（３）ニブラスミドｐＭ
ＴＮは”Ｌｅｕ−モチリン遺伝子の下流にターミネータ
−を持つ。このターミネータ−と’Ｑ、ｅｕ−モチリン
の間にある非翻訳領域の遺伝子を除去したプラスミドを
以下の通り作製する。

プラスミドｐＡｒｇＥ１をＰｓｔＩとＥｃｏＲＶで切断
してターミネータ−を含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ１９
という）を単離する。プラスミドｐＭＴＮ４を制限酵素
５ａｃＩで切断し、切断末端の一木鎮領域をＤＮＡポリ
ポリーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いて加水分
解して平滑末端とし、さらに制限酵素Ｐｓｔｌで切断後
、”Ｌｅｕ−モチリンを含むＤＮＡ断片（以下ＤＮＡ２
０という）を単離する。両ＤＮＡ断片をリガーゼで結合
することによりプラスミドｐＭＴＯ４を得る。

ｐＭＴＮ４に替えてｐＭＴＮ８を用いて同様に行うこと
によりｐＭＴＯ８を造成する。ｐＭＴＯ８はｐＭＴＭ８
と同様に、ｐＭＴＡ４からｐＭＴＡ８を造成した方法で
も作れる。

ｐＡＴｇＥｌに替えてｐＡｒｇ４を用いて同様に行いｐ
ＭＴＯを造成する。ｐ　Ｍ　Ｔ　ＯとｐＭＴ。

との違いは、ｐＭＴｏはターミネータ−の下流に制限酵
素Ｂｇｌ［の認Ｍｉｌｋ部位を持つが、ｐＭＴＯはこれ
を持たないことにある。

プラスミドｐＭＴＯとｐＭＴｏはｐ　Ｍ　Ｔ　Ｎのター
ミネータ−上流の非翻訳領域の遺伝子が約１６０ｂｐ除
去された構造を持っている。ｐＭＴＯ４を大腸菌に導入
して蛋白質を発現させる。形質転換株は、ｐＭＴＮ４を
用いる場合と同程度の大量の蛋白質を生産する。該蛋白
質は形質転換株中で顆粒の状態で存在し、顆粒中の”Ｌ
ｅｕ−モチリン含量は７７％である。

工程１１　プロモーターの変換 プラスミドｐＭＴＯ４はシャイン−ダルガノ（ＳＤ）配
列と開始コドン（ＡＴＧ”）の距離（ＳＯ−ＡＴＧ）が
１０塩基で二連結のトリプトファンプロモーター（Ｐｔ
ｒｐＸ２）を持っている。プラスミドｐＭＴＯ４を制限
酵素ＨｉｎｄｌＩ［とＰｓｔ　１で切断して＋３Ｌｅｕ
−モチリンを含むＤＮＡ断片（以下Ｄ　Ｎ　Ａ２１とい
う）を単離する。別にプラスミドｐＫＹＰ１０（特開昭
５８−１１０６００）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩ［とｐｓ
ｔｒで切断してプロモーターを含むＤＮＡ断片（以下Ｄ
ＮＡ２２という）を単離する。ＤＮＡ２１とＤＮＡ２２
とをリガーゼで結合し゛ζプラスミドｐＭＴＯＩ４を得
る（第９図参照）。プラスミドｐＭＴＯＩ４は一つのト
リプトファンプロモーター（Ｐｔｒｐ）と５Ｄ−Ａ７０
間が１４塩基である。

プラスミドｐＫＹＰ　１０にかえてプラスミドｐＧＥＬ
１　（特開昭６１−９３１９７、ＦＥＲＭＢＰ−６１２
）を制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩとＰｓｔｌで切断してプロ
モーターを含むＤＮＡ断片（以下ＤＮΔ２３という）を
単離する。プラスミドｐＭＴＯ４より得たＤＮＡ２１と
ＤＮＡ２３をリガーゼで結合してプラスミドｐＭＴＯｎ
４を得る（第１Ｏ図参照）。プラスミドｐＭＴＯＩＩ４
はプロモーターｐｒｔｐｘ２を持ち５Ｄ−Ａ７０間は１
４塩基である。

プラスミドｐＧＥＬにかえてプラスミドｐＧＨ＾２（特
開昭６０−２２１０９１．ＩＧ）Ｉ＾２　ＦＢＲＭ　Ｂ
Ｆ−４００）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで切
断してプロモーターを含むＤ　Ｎ　Ａ断片（以下ＤＮＡ
２４という）を単離する。プラスミドｐＭＴＯ４より得
たＤＮＡ２１とＤＮＡ２４をリガーゼで結合してプラス
ミドｐＭＴＯＩ［Ｉ４を得る（第１１図）。プラスミド
ｐ　Ｍ　Ｔ　ＯＩ［［４はレフトプロモーター（Ｐｌｅ
ｔ）を持ち５Ｄ−Ａ７０間は１４塩基である。

以上の遺伝子組換え手法を用いて多量に生産された”　
Ｌｅｕ−モチリン重合体は菌体内に顆粒として蓄積して
いる。菌体を破砕後、遠心分離にかけると膜成分と可溶
性画分から顆粒が容易に分離され、＋　２　Ｌ　ｅ叶モ
チリン重合体が高純度で収率良く得られる。この”Ｌｅ
ｕ−モチリン重合体の顆粒を臭化シアンで分解するとス
ペーサーペプチドのメチオニンの部分で切断され、”　
Ｌｅｕ−モチリン単量体のカルボキシル側にＡｒｇ−１
１ｅ−Ｐｈｅ−Ｈｓｅ　　（／＋１チオニンが分解して
ホモセリン（Ｈｓｅ）に変換した〕の結合した２６アミ
ノ酸からペプチド２５が得られる。このペプチド２５を
カルボキシペプチダーゼＡで消化するとカルボキシル側
から順次水解されｕｓｅ、　Ｐｈｅ。

Ｉｌｅが除去され”Ｌｅｕ−モチリンのカルボキシル基
末端にＡｒｇの結合したペプチド２６が単一の生成物と
して１辱られる。

次にペプチドをカルボキシペプチダーゼＢで消化すると
Ａｒｇが除去され”Ｌｅｕ−モチリン（式２）が単一の
生成物として高収率で得られる。

以上の如く本発明の製造法により”Ｌｅｕ−モチリンが
遺伝子組換え手法により極めて高い生産量で製造される
。本発明の製造法は化学的、酵素的に除去できるスペー
サーペプチドを介して目的のペプチドを連結したペプチ
ド重合体をコードする遺伝子を作製し、この遺伝子を有
効なプロモーターとターミネークーを持ったプラスミド
に挿入し、このプラスミドを微生物に導入してペプチド
重合体を著量生産させ、得られたペプチド重合体を化学
的、酵素的に処理して高収率で単量体ペプチドに変換す
る方法である。スペーサーペプチドの除去に本発明では
臭化シアン、カルボキシペプチダーゼＡおよびＢを用い
たが、生産を目的とするペプチドを分解しない方法であ
ればいかなる除去法も用いることができる。化学的分解
法としては例えばギ酸を用いるとＡｓｐ−Ｐｒｏ結合が
切断され、ヒドロキシルアミンでＡｓｎ−Ｘ（Ｘはｅｔ
ｙ。

Ｌｅｕ、＾ｌａ）結合が切断される。酵素的分解法とし
てはエンテロキナーゼによる（Ａｓｐ）ｎ−Ｌｙｓ（ｎ
　＝　２〜４）の切断、コラゲナーゼによるＰｒｏ−Ｘ
−Ｇｌｙ−Ｐｒ。

（Ｘは任意のアミノ酸残基）、カリクレインＢによるＰ
ｈｅ−＾ｒｇ結合の切断が例としてあげられる。

本発明のスペーサーペプチドはこれらの切断法のうち生
産を目的とするペプチドを分解しない切断法により切断
される構造を持ち、その結果生じたスペーサーペプチド
の断片を別の方法で除去しろる構造であれば良い。ペプ
チドを連結した重合体を生産し、これを切断してペプチ
ド単量体を得る製造法において一般にスペーサーペプチ
ドは必須である。スペーサーペプチドを必要としない場
合は生産しようとするペプチドのアミノ末端とカルボキ
シル末端のアミノ酸の間を切る選択的な切断法がある場
合で、例えばアミノ末端がＰｒｏでカルボキシル末端が
Ａｓｐであればこのペプチド重合体は単量体が＾５ｐ−
Ｐｒｏで連結しているのでギ酸で処理すれば単量体が得
られるが、このような構造を持ったペプチドは極めて稀
である。従ってスペーサーペプチド、が一般に必須であ
り、その設計は切断と除去が高収率で容易に行なえるも
のでなくてはならない。本発明に用いたスペーサーペプ
チドはメチオニンを含有しない全てのペプチドの生産に
用いることができる。すなわち目的ペプチドのカルボキ
シル末端のアミノ酸が塩基性アミノ酸以外の場合には本
発明のスペーサーペプチドを用いることができ、切断、
除去も本発明の方法で実施される。ペプチドのカルボキ
シル末端のアミノ酸が塩基性アミノ酸Ｌｙｓまたは＾ｒ
ｇの場合には本発明のスペーサーペプチド中の塩基性ア
ミノ酸＾ｒｇは不要で臭化シアンによる切断後のスペー
サーペプチドの除去反応はカルボキシペプチダーゼＡの
みでよくＢは必要ない。本発明のスペーサーペプチドを
コードする遺伝子には制限酵素ＢｇｌｎとＢａｍＨＩの
認識部位があり、この同一の切断末端を生じる酵素を用
いた遺伝子を多数個連結する方法の有用性が実証された
。遺伝子を多数個連結する際に用いる制限酵素は本発明
Ｂｇｌ　ＩＩとＢａｍＨＩの組合せの他に多数の酵素の
利用が可能で、上記の切断と除去の条件を満足するスペ
ーサーペプチドをコードする塩基配列にそれらの制限酵
素の切断部位を作ることができれば良い。本発明では１
３Ｌｅｕ−モチリン遺伝子が１．２．４．　８．１６．
３２個と２’　（ｎ＝０〜５）個連結した遺伝子の製造
法を例示したが、本発明の方法を用いたペプチドをコー
ドする遺伝子を任意の個数連結することが容易なことは
明らかである。本発明で”　Ｌｅｕ−モチリン重合体の
遺伝子はシロザケ成長ホルモンのアミノ末端側の一部の
遺伝子やＩＦＮ−ｒのアミノ末端側の一部の遺伝子の下
流に連結し、融合型の蛋白質として生産させたが、シロ
ザケ成長ホルモンやＩＦＮ−ｒの一部の遺伝子は目的と
する”Ｌｅｕ−モチリン重合体の生産に必須ではない。

しかし、遺伝子の開始コドン、ＡＴＧ周辺の塩基配列が
蛋白質の生産量に大きな影響を与えるため高い生産量が
得られているシロザケ成長ホルモン遺伝子の開始コドン
のＡＴＧ周辺の塩基配列を持った遺伝子を用いて１２シ
ｅｕ−モチリン重合体遺伝子を高発現させることができ
る。この方法は”　Ｌｅｕ−モチリン以外のペプチド重
合体の遺伝子を用いても高発現が可能で一般性の高い製
造法である。

上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。

ＤＮＡの制限酵素による消化反応は、通常０．１〜２０
■のＤＮＡを２〜２００＋ｔ＋Ｍ　（好ましくは１０〜
４０ｍＭ）のトリス−ＨＣｌ（＋）８６．０〜９．５好
ましくはｐＨ７，０〜８．０　）、０〜２００ｆｆ１Ｍ
のＮａＣｊ！またはＫ（Ｊ！、、２〜３０ｍＭ（好まし
くは５〜１０ｍＭ）のＭｇＣ１ｚ　、０〜２０ｍＭのメ
ルカプトエタノールを含む反応液中で、制限酵素０．１
〜１００単位（好ましくは１■のＤＮＡに対して１〜３
単位）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵
素により異なる）において、１５分間〜２４時間行う。

制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、ＬＧ
Ｔ法やポリアクリルアミドゲル電気泳動性などによって
行う。

ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２０　ＱｍＭ　（好まし
くは１０〜４０ｍＭ）のトリス−Ｈ（１（ｐＨ６，１〜
９．５、好ましくはｐ　Ｈ７，０〜８．０）、２〜２０
ｍＭ　（好ましくは５〜ＩＯＩＩＩＭ）のＭｇＣｊ！２
．０．１〜１（１０）０ｌＴｌ好ましくは０．５〜２．
０ｍＭ）のＡＴＰ。

１〜５０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のジチオスレ
イトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ０．
３〜１０単位を用い、１〜３７℃（好ましくは３〜２０
℃）で１５分間〜７２時間（好ましくは２〜２０時間）
行う。

結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりコーエンらの形質転換法〔ニス・エヌ−、：
ｌ−ｘ　ｙ　（Ｓ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ）ら：プロシー
ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ中
サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ
、）、ｔｌｓＡ、旦、　２１１０（１９７２））　１．
：よッテ、大腸菌に導入する。

組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、セシウム・クロライド−エチジウム・プロミド
密度勾配超遠心法〔ディー・ビー・クレウｚル（Ｄ、　
Ｂ、　Ｃｌｅｗｅｌｌ）　　ら：プロシーティング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（
Ｐｒａｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、ＩＪＳＡ
　、　６２゜１１５９（１９６９）　）あるいはバーン
ボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）らの方法〔エイチ・シー・
バーンポイム（１，（：、９ｉｒｎｂｏｉｍ）ら：ヌク
レオチド・アシド・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉＣ＾ｃｉｄ
ｓ　Ｒｅｓ、）　７　　、１５１３（１９７９））など
を用いて行う。

プラスミドＤＮＡを制限酵素で消化後アガロースゲル電
気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動により
切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩基配列を決定する
必要がある時はマキサム・ギルバート法〔プロシーディ
ング・オブ・ヂ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、　７４　、５６０
（１９７７）　）またはＭ１３ファージを用いたサンガ
ー（Ｓａｎｅｅｒ）法〔サンガー　（Ｓａｎｇｅｒ）ら
：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　、Ｓｃｉ、）、　ＩＪＳＡ、　
７４．５４６３（１９７７）：　アマ−シャＡ　（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）社Ｍ１３クローニング・アンド・シーフ
ェンシング・ハンドブック（ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄ　ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｈａｎｄｂｏｏｋ）　）によって
決定する。

本発明のペプチドは以下のとおりに製造できる。

すなわち、プラスミドを用いて大腸菌に一１２ｃ６００
やＨＢＩＯＩを形質転換させ、アンピシリン耐性のコロ
ニーの中からプラスミドを有する大腸菌を選びだす。プ
ラスミドを有する大腸菌を培地に培養することにより培
養物中にペプチドを生成させることができる。

ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびにペプチ
ドの生産に好適なものならば合成培地、天然培地のいず
れも使用できる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、クリセロール、マンニトール、ソルビトールなどが
、窒素源としては、ＮＨ４Ｃｌ。

（ＮＨ４）ｉｓＯ４、カヂミノ酸、酵母エキス、ポリペ
プトン、肉エキス、バクトドリプトン、コーン・ステイ
ープ・リカーなどが、その他の栄養源としては、Ｋ２Ｈ
Ｐ　０４　、Ｋ　ＨｓＰ　Ｏｓ　、Ｎ　ａ　Ｃｊ！　５
Ｍｇ５０４、ビタミンＢｔ　ＳＭｇＣＬなどが使用でき
る。

培養はｐＨ５，５〜８．５、温度１８〜４０℃で通気攪
拌培養により行われる。

培養５〜９０時間で培養菌体中にペプチドが蓄積するの
で、培養物から菌体を集菌し、菌体をリゾチーム処理後
、凍結、融解を繰り返して菌体を破砕し、遠心して得ら
れる上清から通常のペプチドの抽出方法に従ってペプチ
ドを採取する。

また該ペプチドの検出は培養菌体を直接レムリ（Ｌａｅ
ｍｍｌｉ）のサンプルバッファー〔レムリ（Ｌａｅｍｍ
ｌｉ）　、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７　、６
８０（１９７０）　）に加熱、溶解後、ＳＯ３−ポリア
クリルアミドゲル〔レム’）　（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方
法：同上文献〕にかけ、クマシブリリアントブルー（Ｃ
ｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）色素
〔バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製）を用いて染
色して行った。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１゜ ＤＮＡ３〜６．１３および１４の製造：ＤＮＡ３〜６．
１３および１４の合成はリン酸アミダイド法による固相
合成法（Ｓ、Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇｅら、テトラヘドロ
ン・レターズ（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、）　
　２２　、　１８５９（１９８１）、Ｌ、ＪｌＭｃＢｒ
ｉｅ　　ら、同Ｂ。

２４５（１９８３）　）に従い、アプライドバイオシス
テム社のＤＮＡ自動合成機３８０Ａを用いて下記のとお
り行った。

シリカゲルを固相担体とし、これに３′水酸基を介して
結合したヌクレオチドの５′水酸基に〔１）ヌクレオチ
ドをリン酸アミダイド法で縮合し、（２）縮合したヌク
レオチドの亜リン酸結合を沃素で酸化してリン酸結合に
し、（３）縮合したヌクレオチドの５′水酸基上の保護
基をトリフルオロ酢酸で除去した。次に（１）の工程に
戻って次のヌクレオチドを同様に縮合した。こうして（
１）〜（３）の工程が繰り返されてＤＮＡが担体上に合
成された。合成終了後、ＤＮＡの結合した担体をチオフ
ェノール溶液中に室温で１時間放置してリン酸の保護基
を除去した後、濃アンモニア水中に室温で１時間放置し
てＤＮＡを担体から遊離させた。ＤＮＡを含む濃アンモ
ニア水を密封容器中６０℃にて１２時間加熱して塩基上
の保護基を除去した。

ＤＮＡ３を例にとると、１μＭのヌクレオチドの結合し
た担体を用いて合成を行い通算収￥−８１％で縮合反応
を完了し、次いで保護基の除去と固相からの遊離反応を
行ってＤＮＡ３の粗生成物２４２０．０．単位（２６Ｏ
ｎｌ！ｌで測定）を得た。この粗生成物の２２　０．０
．単位を７Ｍ尿素を含むトリス−硼酸緩衝液（ｐＨ８）
を用いて１０％ポリアクリルアミドゲル（２ｍｍ厚、１
３ｃｍＸ　ｌ　３ｃ１１＞の電気泳動で精製し、ＤＮＡ
３を含むゲルの領域をとり、０．２Ｍ炭酸トリエチルア
ミン緩衝液（ｐＨ８）（以下ＴＥＡＢという）１ｍＭで
ＤＮＡ３を１８時間かけて抽出し、ついでその抽出液を
セファデックスＤＥ５２０カラム（径５ｍｍ、長さ５０
ｍ）に通してＤＮＡ３を吸着させた。２Ｍ　　ＴＥＡＢ
２ｎｌで溶出して３．９　０．０．単位のＤＮＡ３の純
品を得た。

ＤＮＡ３以外のＤＮＡも同程度の収率で合成された。

これらＤＮＡの５′水酸基をファージＴ４ポリヌチレオ
チドキナーゼと〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰを用いる常法〔＾
、　Ｍ、Ｍａｘａｍら、メソッヅ・イン・エンチモロジ
イ（“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”
）　Ｖｏｌ。

６５、　Ｐａｒｔ　Ｉ　、　Ｉ）、　４９９．　Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９３Ｑ））でリン酸化して
放射性ラベルをつけた。ラベルをつけたＤＮＡを７Ｍ尿
素を含むトリス−硼酸緩衝液で２０％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行い、ＤＮＡの純度と鎖長を確認した
。さらにラベルをつけたＤＮＡの塩基配列をマキサム−
ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法（前記文
献）で決定し、各ＤＮＡが所望の塩基配列を持つことを
確認した。

実施例２．　プラスミドｐＭＴＡ　１の作製ニブラスミ
ドｐＴｒ３２０　２ｇを制限酵素Ｃ１ａ　Ｉ（バーリン
ガー・マンハイム社製）１０単位、３ａｃｌ（全酒造社
製）１５単位を含む溶液〔１０ｍＭ）リス−Ｈ＝Ｃ１（
ｐＨ７，５）、？ａ１Ｍ　　ＭｇＣ１ｚ　、（ｉｍＭ　
　２−メルカプトエタノール〕　３０ｇに溶解し、３７
℃２時間消化反応を行った。この反応液をエチジウムプ
ロミドを含むアガロースゲル電気泳動にかけ、紫外線（
波長３０２ｎｍ）で検出して約３．３ｋｂのＤＮＡ１を
含むゲル片を切り出した。

ゲル片にフェノールＱ、５ｎｌを加えて凍結・溶解し、
水層をクロロホルム洗浄後、エタノール沈澱によりＤＮ
ＡＴを回収した。

ＤＮＡ３〜６各ＩＱｐｍｏｌｅを各々Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ反応用緩衝液（５０ｍＭ　　）’ＪスーＨ
ＣＩ　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣＬ　、５ｍ
Ｍジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）、１ｍ
Ｍ　　ＡＴＰ、０．１ｍＭスペルミジン、０．１ｍＭ　
　ＥＯＴＡ）３０ｇに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（全酒造社製）３単位を加え、３７℃４０分間に
リン酸化反応を行った後、６５℃で１５分間加熱して酵
素を失活させた。この反応液を４屑ずつ混合し、上記で
得たＤＮＡ７　０．０８ｐｍｏｌｅを加え、２８ｍＭ）
リス−ＨＣ１（ｐｔ１７．５）、９ｍＭ　　ＭｇＣ１ｘ
　、１０ｍＭ　　ＤＴＴｌｏ、０３ｍＭ　　ＥＤＴＡ、
　０．７ｍＭ　　ＡＴＰ、　０．０３ａ＋Ｍ　　スペル
ミジンの組成になるよう調整し、Ｔ４ＤＮＡ！Ｉガーゼ
（宝酒造社！ｌ）２単位を加え、５０ｍとした。４℃で
１６時間結合反応を行った。

この反応液を用いて大腸菌８８１（１０）株〔ポリバー
（Ｂｏｌｉｖａｒ）　　ら；ジーン（Ｇｅｎｅ）　、２
　、７５（１９７７）　）ヲｌ：ｏｈｅｎうの方法〔ニ
ス・エヌ・コーエン（Ｓ、　Ｎ。

Ｃｏｈｅｎ）ら；プロシーディング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ。

＾ｃａ’ｄ、Ｓｃｉ、）、ｔｌｓＡ　６９．２１１０（
１９７２））により形質転換し、アンピシリン耐性（＾
ｐつのコロニーを得た。このコロニーよりアルカリ処理
法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）　ラ１４　；モ
レキユラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）　、Ｐ、　３６８．　　コールド・スプリ
ングハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
）社刊〕によってプラスミドＤＮＡを回収し、ｐＭＴΔ
１を得た。（）ＭＴＡＩの構造は、ＢｇｌＩ［、Ｐ　ｓ
　ｔ　１５Ｓａｃ　Ｉ、ＢａｍＨＩで切断してアガロー
スゲル電気泳動により確認した。制限酵素の切断反応は
１０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ！　（ｐＨ７，５）、７ｍＭ
　　ＭｇＣ１ｚ　、６ｍＭ　　２−メルカプトエタノー
ルの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう０〜２０
（１０）１１ＭＮａＣ１あるいはＫ（Ｊを加えて反応液
（制限酵素用反応液、以下ＮａＣ１またはＫＣｌの濃度
だけを示す。）とした。

さらに、文献〔＾、　Ｊ、　Ｈ，Ｓｍ１ｔｈ、メソッヅ
・インーエンチモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ”）、ｅｄ、　ｂｙ　Ｌ、Ｇｒｏｓｓ
ｍｅｎ　ａｎｄ　Ｋ、　Ｍｏ１ｄａｖｅ　Ｖｏｌ、５５
．　ｐ。

５６０（１９８０）　、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
）記載の方法によって、ＤＮＡ３〜６に由来する部分を
含む１１５塩基の配列を決定して、目的とするｌ３Ｌｅ
ｕ−モチリン遺伝子を確認した。

実施例３．　プラスミドｐＭＴＡ２の作製：実施例２で
得たプラスミドｐＭＴＡＩ　　０．２ｇを実施例２に示
した制限酵素用反応液（１００ｍＭＮａＣ１）　１　！
ｌ！に溶解し、Ｐｓｔｌ（全酒造社製）６単位、Ｂｇｌ
ｌｌ（東洋醜造社製）６単位を加え３７℃で２時間消化
反応を行った。これを実施例２と同様のアガロースゲル
電気泳動で分画し、約２．８ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ
８）を得た。

別にｐＭＴΔ１０．２ｇを制限酵素用反応液（１００ｍ
Ｍ　　ＫＣｊり１５ｍに溶解し、Ｐｓｔｌ　　６単位、
ＢａｍＨＩ（全酒造社製）６単位を加え３７℃で２時間
消化反応を行った。アガロースゲル電気泳動によりこれ
を分画し、約１．２ｋｔｌのＤＮＡ断片（ＤＮＡ　９　
’）を得た。

こうして得たＤＮＡ８とＤＮＡ９を各々５０ｎｇずつ混
合し、Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ用反応液〔２０ｍＭ　　）
リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣ１ｔ
　、１０＋ｎＭ　　ＤＴＴ、０．３ｍＭＡＴＰ３３０ｍ
に溶解し、Ｔ４ＤＮＡ！ｌガーゼ（全酒造社製）１単位
を加えて４℃１８時間結時間部を行った。この反応液を
用いて大腸菌８８１（１０）株を形質転換し、Ａｐ’の
コロニーを得た。このコロニーよりプラスミドＤＮＡを
回収し、ｐＭＴΔ２を得た。このプラスミドの構造は、
Ｐｓ　ｔ　Ｌ　ＢａｍＨＩＳＢｇ　ｌＩＩで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動により確認した。

実施例４．　プラスミドｐＭＴＡ４の作製：実施例３で
得たプラスミドｐＭＴＡ２　０．２１１ｇを実施例３と
同様に実施例２に示した制限酵素用反応液（１００ｍＭ
　　ＮａＣ１）　１５ＡＩ＋に溶解し、Ｐｓｔ１６単位
、ＢｇｌＩＩ５単位を加え３７℃で２時間消化し、アガ
ロースゲル電気泳動で分画し約２．８ｋｂのＤＮＡ断片
を得た。また、ｐＭＴＡ２０．２肩を制限酵素用反応液
（１００ｍＭ　ＫＣｌ）　１５顧に溶解し、ＰｓｔＩ６
単位、ＢａｍＨＩ６単位を加え３７℃で２時間消化し、
アガロースゲル電気泳動により分画して約１．３ｋｂの
ＤＮＡ断片を得た。

これらのＤＮＡ断片を各々０．２　ｐｍｏｌｅずつ混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用反応液３０ＪＩＪ！に溶解し
、Ｔ　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼ１単位を加えて４℃１８
時間結時間部させた。この反応液で大腸菌８８１（１０
）株を形質転換し、＾ｐ１のコロニーを得、プラスミド
ＤＮＡを回収しｐＭＴＡ４を得た。このプラスミドの構
造（よＰｓ　ｔ　Ｉ、ＢａｍＨＩＳＢｇ　ｌ　Ｕで切断
し、アガロースゲル電気泳動により確認した。

実施例５．　プラスミドｐＭＴＬ４の作製ニブラスミド
ｐｓＣ；ＨＩＭＩ　　ＩＡｇを制限酵素用反応液（１０
０ｍＭ　ＫＣｊ！　）　３（１０）１１に溶解し、Ｐｓ
ｔ　Ｉ６６単、Ｂａｍ８１６単位を加え、３７℃２時間
消化反応させ、アガロースゲル電気泳動で約２．１ｋｂ
のＤＮＡ断片を分画して回収した。

プラスミドｐＧＨＤ７　１絽をｐ　ｓＧＨＩ　Ｍ　１と
同様にＰ　ｓ　ｔ　Ｉ　％　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩで消化し
、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。

これらのＤＮＡ断片を０．０３Ｊ］ｍｏｌｅずつ混合し
、Ｔ４ＤＮΔリガーゼ用反応液３０ｍに溶解し、Ｔ４Ｄ
ＮＡ！ｊガーゼ１単位を加えて４℃１８時間結時間部さ
せ、この反応液で大腸菌８８１（１０）株を形質転換し
、Ａｐｒのコロニーを得てプラスミドＤＮＡを回収しｐ
ｓＧＨＩＭＥｌを得た。

こうして得たプラスミドｐ　ｓＧＨＩ　ＭＥ　１０．５
■を制限酵素用反応液（ＮａＣ１、ＫＣｌは加えない）
３０ｇに溶解し、５ａｃｌ（全酒造社製）５０単位を加
え、３７℃で２時間消化反応させた。

次に２Ｍ　　ＮａＣ１を２４添加し、ＢｇｌＩ［１５単
位を加え３７℃で２時間消化反応を続けた。これをアガ
ロースゲル電気泳動で分画し、約３ＪｋｂのＤＮＡ断片
を回収した。

実施例４で得たｐＭＴＡ４　０．５■をｐｓＧＨＩＭＥ
Ｉと全く同様に５ａｃｌ消化後Ｂｇ１ｍ消化し、アガロ
ースゲル電気泳動で約Ｑ、３ｋｂのＤＮＡ断片を回収し
た。

これらのＤＮＡ断片を０．０３　ｐｍｏｌｅずつ混合し
、Ｔ４ＤＮΔリガーゼ用反応液３０Ａｌ！に溶解し、Ｔ
４ＤＮＡ！Ｊガーゼ１単位を加えて４℃１５時間結時間
芯を行い、この反応液で大腸菌８８１（１０）株を形質
転換し＾ｐ１のコロニーを辱てプラスミドＤＮＡを回収
しｐＭＴＬ４を得た。

実施例６．　プラスミドｐＭＴＮ４０作製：実施例５で
得たプラスミドｐＭＴＬ４の１．５ｇを制限酵素用反応
液（１００ｍＭ　Ｎａ　Ｃ１）　２０ｍｌ：溶解し、Ｐ
ｓｔｌ　　８単位、ＢｇｌＩ［７単位を加え、３７℃で
２時間消化反応させ、アガロースゲル電気泳動で分画し
て約２．２ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ１５）を回収した
。また、ｐＭＴＬ４を制限酵素用反応液（１００ｍＭ　
Ｎ　ａ　Ｃ１）　２０Ｊ１！！に溶解し、ｐｓｔＩ８単
位とＨｉｎｄＩｎ（全酒造社製）６単位を加えて３７℃
で２時間消化反応させ、アガロースゲル電気泳動で分画
し約１．（ｌｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ１６）を回収し
た。

ＤＮＡ１５とＤＮＡ１６の各２１　ｐｍｏｌｅを実施例
２に示したＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応用緩衝液
５０Ａ１１に溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ４
単位を加え、３７℃４０分間リン酸化反応を行った後、
６５℃で１５分間加熱して酵素を失活させた。この反応
液２屑ずつを混合し、ＤＮＡ１５および１６を加え、２
８ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、９ｍＭ　　Ｍｇ
ＣＡ’２．１０ｍＭＤＴＴ、０．０３ｍＭ　　ＥＤＴΔ
、０．７ｍＭ　　ＡＴＰ。

０．０３ｍＭスペルミジンの組成になるよう調整し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ２単位を加え、４（ｌｄとした。

４℃で１６時間結合反応を行った。この反応液を用いて
大腸菌８８１（１０）株を形質転換し、Ａ　Ｉ］　ｒ　
コロニーを？’４てプラスミドＤＮＡを回収し、ｐＭＴ
Ｎ４を得た。

実施例７．　プラスミドｐＭＴＯ４の作製ニブラスミド
ｐＭＴＮ４　２．５ＡＣをＴｒｉｔｏｎＸ　Ｏ，（１１
％を含む制限酵素用反応液（Ｎａ（Ｊ！５ＫＣｆは加え
なイ）４０Ｊｌ！！に溶解し、５ａｃ１　１２単位を加
え、３７℃２時間消化反応を行った。この反応液をフェ
ノール−クロロホルム抽出後エタノール沈澱によりＳａ
ｃ■切断したｐＭＴＮ４を回収し、２（１０）１１Ｍ　
）すｘ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ７，８）、’７ｍＭ　　Ｍ
ｇＣＬ。

５ｍＭ　　２−メルカプトエタノール、ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ
　（ｄＡＴＰ。

ｄＴＴＰ、　ｄｃＴＰ、　ｄＧＴＰ）各０．２５＋ｎＭ
の組成の溶液４０ｗ１に溶解し、大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼｌ　　ｌ（ｌｅｎｏｗフラグメント（宝酒造社製）
４単位を加えて２０ｔ、１時間反応を行った。この反応
液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱
でポリメラーゼ処理したｐＭＴＮ４断片を回収した。こ
れを制限酵素用反応液＜１００ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃ１）　
３　ｏｎに溶解し、ＰｓｔＩ　　５単位を加え２時間消
化反応を行い、アガロースゲル電気泳動により分画して
約１．３ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ２０）を得た。

プラスミドｐＡｒｇＥｌ　　２Ａｇを制限酵素用反応液
（１５０ｄ　Ｎ　ａ　Ｃｊ２　）　２０ＡＩ＋に溶解し
、Ｐｓｔ　１１０単位、ＥｃｏＲＶ　（宝酒造社製）１
０単位を加えて３７℃２時間消化反応を行い、アガロー
スゲル電気泳動により分画して約１，７ｋｂのＤＮＡ断
片（ＤＮＡ　１９　）を得た。

このＤＮＡ　１９とＤＮＡ２０を各々０．０６　ｐｍｏ
ｌｅ混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用反応液２５ｍに溶解
し、Ｔ４ＤＮΔリガーゼ３単位を加え４℃２０時間結合
反応させた。この反応液を用いて大腸菌８８１（１０）
株を形質転換し、Ａｐｒのコロニーを得た。このコロニ
ーよりプラスミドＤＮＡを回収し、ｐＭＴｏ４を得た。

ｐＭＴｏ４の構造はｐ　ｓ　ｔ　Ｉ　５ＥｃｏＲＩ、Ｈ
ｉｎｄｌ、５ａｌｌ、Ｂｇｌｌｌ、Ｍｌｕｌで切断して
確認した。

実施例８．　プラスミドｐＭＴｏＩ　４の作製ニブラス
ミドｐＭＴ０４　２■を制限酵素反応液（１００ｍＭ　
Ｎ　ａ　Ｃ１）　３０ｎに溶解し、）ｌｉｎｄＩＩＩ６
単位、ｐｓｔ１６単位を加え、３７℃２時間消化反応さ
せ、アガロースゲル電気泳動で分画し、”Ｌｅｕ−モチ
リン重合体遺伝子を含む約３．ＱｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ
ＮＡ２１）を回収した。また、プラスミドｐＫＹＰ１０
　（特開昭５８−１１０６００）　　３■を制限酵素反
応液（１００ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃ１）　３　ｆｂｃｌ！に
溶解し、ＨｉｎｄＩＩ［９単位およびＰｓｔＴ９単位を
加え、３７℃２時間消化反応を行い、アガロースゲル電
気泳動で分画し、プロモーターを含む約１、ｌｋｂのＤ
ＮＡ断片（ＤＮＡ２２）を回収した。

これらのＤＮＡ断片約０．１■ずつをＴ４ＤＮΔリガー
ゼ用反応液３０ＪＩＪに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１
単位を加えて４℃１８時間結合反応させた。

この反応液で大腸菌８８１（１０）株を形質転換し、得
られたＡｒ１のコロニーからプラスミドＤＮＡを回収し
、トリプトファンプロモーターをもつ”Ｌｅｕ−モチリ
ン重合体発現プラスミドｐＭＴＯＩ４を得た。ｐＭＴｏ
　Ｉ　４の構造は、ＰｓｔＩ、Ｂａｎ１］ｌ、Ｈ’ｉｎ
ｄ［、ＭｌｕＩで切断して確認した。

第９図参照 実施例９．　プラスミドｐＭＴＯｎ４の作製ニブラスミ
ドｐＭＴ０４　２ｇを制限酵素反応液（１００ｄ　Ｎ　
ａ　Ｃ１）　３０ｔｔＩに溶解し、）ｌｉｎｄｌ１６単
位およびＰｓｔ１６単位を加え、３７℃２時間消化反応
させた。アガロースゲル電気泳動テ分画し、＋３１．ｅ
ｕ−モチリン重合体遺伝子を含む約３．０ｋｂのＤＮＡ
断片（ＤＮＡ２１）を回収した。また、プラスミドｐＧ
ＥＬ１　（特開昭６ｌ−９３１９７）３■を制限酵素反
応液（１００ｍＭ　　ＮａＣ１）　３０頭に溶解し、Ｈ
ｉｎｄＩ［［９単位およびＰｓｔ１９単位を加え、３７
℃２時間消化反応を行った。アガロースゲル電気泳動で
分画し、プロモーターを含む約ｌ、ｌｋｂのＤＮＡ断片
（ＤＮＡ２３）を回収した。これらのＤＮＡ断片約０．
１■ずつをＴ４ＤＮＡリガーゼ用反応液３０ｍに溶解し
、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ１単位を加えて４℃１８時間結
合反応させた。この反応液で大腸菌８８１（１０）株を
形質転換し、得られたＡｐｒのコロニーからプラスミド
ＤＮＡを回収し、２連結トリプトフアンプロモーターを
もちＳＤ配列と＾ＴＧ開始コドンの間の距離が１４塩基
のＩ″Ｌｅｕ−モチリン重合体発現プラスミドｐＭＴＯ
Ｕ４を得た。ｐＭＴＯＩＩ４の構造はＰｓｔｒ、Ｂａｎ
Ｉ［［、Ｈｉｎｄｌｌ、ＭＩｕＩで切断して確認した。

第１０図参照。

実施例１０．　　プラスミドｐＭＴＯＩＩＩ４の作製：
プラスミ）’、ｐＭＴ０４　２■を制限酵素反応液（１
００＋ｎＭ　　Ｎ　ａ　Ｃｊ！　）　３０ＡＩ２に溶解
し、Ｈｉ　ｎｄＩ［Ｉ６６単およびＰｓｔＩ６単位を加
え、３７℃２時間消化反応させた。アガロースゲル電気
泳動で分画し、”　Ｌｅｕ−モチリン重合体遺伝子を含
む約３．ＱｋｂのＤＮＡ断片を回収した。また、プラス
ミドｐＧＨＡ２（特開昭６６０−２２１０９１）３１１
を制限酵素反応液（１００ｍ１４　Ｎ　ａ　Ｃ１）　３
０に溶解し、ＨｉｎｄＩＩ［９単位およびＰｓｔ１９単
位を加え、３７℃２時間消化反応を行った。アガロース
ゲル電気泳動で分画し、プロモーターを含む約０，９ｋ
ｂのＤＮＡ断片を回収した。これらのＤＮＡ断片約０．
１μｇずつをＴ４ＤＮＡリガーゼ用反応液３０ｊｄｌに
溶解し、Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ１単位を加えて４℃１８
時間結合反応させた。この反応液で大腸菌８８１（１０
）株を形質転換し、得られたＡｒ１のコロニーからプラ
スミドＤＮＡを回収し、ｌｅｔプロモーターをもつ”　
Ｌｅｕ−モチリン重合体発現プラスミドｐＭＴＯＩＩ［
４を得た。ｐＭＴＯＩ［［４の構造は、ｐｓｔＩ、Ｂａ
ｎＩ［Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｍｌｕｌ、ＢｇｌＩＩで切
断して確認した。第１１図参照。

実施例１１．プラスミドｐＭＴＯ４を用いた大腸菌によ
る”Ｌｅｕ−モチリン重合体蛋白質の生産：実施例７で
得られたｐＭＴＯ４を用いて大腸菌Ｗ３１１０ｓｔｒ八
株（ＦＥ！Ｒへ　ＢＰ−７３２）を形質転換した。得ら
れたＡｐｒコロニーを８ｍｌのＬＧ培地（１％バクトド
リプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣ１，０
，１％　グルコース、５０．ｑ／ｍｌ）リブトファン、
５０趨／＋ｎｌ　　アンピシリン、ｐＨ７，５）に接種
し、３０℃１６時間培養した。この培養液４００薦をｌ
　ＱｍｌのＭＣＧ培地（０，６％　Ｎａ２）ＩＰＯｎ、
０．３％ＫＨ２ＰＯ４，０，５％　ＮａＣｊ！、０．１
％　ＮＨ，ＣＪ、０．５％グルコース、０．５％カザミ
ノ酸、１ｍＭ　　ＭｇＳＯ４，４ｇ／ｍｌ　　ビタミン
Ｂ＋　５ｐ）１７．２）に５０■／ｍＩ　）リプトファ
ンおよび５０■／ｍｌのアンピシリンを添加した培地に
接種し、３０℃で培養した。培養液の濁度（ＯＤｓｓｏ
）を測定し０．９に達した時点（約４時間後）で、イン
ドール酢酸２００ｇを加え、さらに培養を４時間継続し
た。培養液を７，０００　ｒｐｍ　、　５分間遠心して
菌体を回収した。この菌体をレムリらの方法〔レムリ（
Ｌａｅｍ＋ｎ１ｉ）ら；ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）
、　２２７　、６８０（１９７０）　）にふけるサンプ
ルバッファーに溶解、加熱後、同法に従って５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリ
アントブルーを用いて染色した結果、分子量約１５．　
ＤＯＯの部位にポリペプチドバンドを検出した。ｐＭＴ
Ｏ４を含まない大腸菌Ｗ　３１１０　５ｔｒＡ株には相
当するバンドは存在しなかったのでｐＭＴＯ４を保有す
る大腸菌Ｗ３１１０５ｔｒＡがシロザケ成長ホルモンの
一部分と融合した”Ｌｅｕ−モチリン重合体蛋白質を生
産していることが明らかになった。

実施例１２．　　プラスミドｐＭＴＯＩ４を用いた大腸
菌による”　Ｌｅｕ−モチリン重合体蛋白質の生産：実
施例８で得られたｐＭＴＯＩ４を用いて大腸菌Ｗ　３　
Ｌ　１０ｓｔｒＡ株を形質転換した。得られたＡｐｒコ
ロニーを実施例１１と同様の培養方法で培養し、培養液
を７．　ＯＯＯｒｐｍ　５分間遠心して菌体を回収した
。この菌体をレムリらの方法に右けるサンプルバッファ
ーに溶解、加熱後、同法に従って５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブル
ーを用いて染色した結果、分子量約１５．０００の部位
にポリペプチドバンドを検出した。ｐＭＴＯＩ４を含ま
ない大腸菌Ｗ　３１１０ｓｔｒＡ株には相当するバンド
（ま存在しなかっだので、ｐＭＴＯ４を保有する大腸菌
Ｗ３１１０皿がシロザケ成長ホルモンの一部分と融合し
た’　”Ｌｅｕ−モチリン重合体蛋白質を生産している
こと明らかになった。

実施例１３．　　プラスミドｐＭＴＯｎ４を用いた大腸
菌による１３Ｌｅｕ−モチリン重合体蛋白質の生産：実
施例９で得られたｐＭＴＯＩ４を用いて大腸菌Ｗ　３１
１０ｓｔｒＡ株を形質転換した。得られた＾ｐ１コロニ
ーを実施例１２と同様の培養方法で培養し、培養液を７
．００　Ｏｒｐｍ　５分間遠心して菌体を回収した。こ
の菌体をレムリらの方法におけるサンプルバッファーに
溶解、加熱後、同法に従って５ＯＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーを
用いて染色した結果、分子量約１５．　（１００の部位
にポリペプチドバンドを検出した。ｐＭＴＯＩＩ４を含
まない大腸菌Ｗ３１１０　ｓｔｒ＾株には相当するバン
ドは存在しなかったので、ＰＭＴＯ４を保有する大腸菌
１１３１１０ｓｔｒＡがシロザケ成長ホルモンの一部分
と融合したｌ３Ｌｅｕ−モチリン重合体蛋白質を生産し
ていることが明らかになった。

実施例１４．　　プラスミドｐＭＴＯＩ［Ｉ４を用いた
大腸菌による１３Ｌｅｕ−モチリン重合体蛋白質の生産
：実施例１１で得られたｐＭＴＯＩ［Ｉ４を用いて大腸
菌１１３１１０里が株を形質転換した。得られた＾ｐ’
コロニーを実施例１２と同様の培養方法で培養し、培養
液を７．　ＯＯＯｒｐｍ　５分間遠心して菌体を回収し
た。この菌体をレムリらの方法におけるサンプルバッフ
ァーに溶解、加熱後、同法に従ってＳＯ３−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブ
ルーを用いて染色した結果、分子量約１５．　ＱＯＯの
部位にポリペプチドバンドを検出した。ｐＭＴＯＩＩＩ
４を含まない大腸菌１１３１１０ｓｔｒ＾株には相当す
るバンドは存在しなかったので、ｐＭＴＯ４を保有する
大腸菌Ｗ３１１ＯｓｔｒＡ株がシロザケ成長ホルモンの
一部分と融合した”Ｌｅｕ−モチリン重合体蛋白質を生
産していることが明らかになった。

実施例１５．　　プラスミドｐＭＴＮ４を用いた大腸菌
による”Ｌｅｕ−モチリン重合体蛋白質の生産と精製： 実施例６によって得られたｐＭＴＮ４を用いて大腸Ｗ３
１１０ｓｔｒＡ株を形質転換した。得られた＾ｐ’のコ
ロニーを３＋ｎｌのＬＧ培地に接種し、３０℃で８時間
培養し、この一部を１０ｍ１のＬＧ培地に接種し、３０
℃で１６時間培養した。これを１ｊ２のＭＣＧ培地に１
００■／ｍ＋のトリプトファンおよび５０■／ｍｌのア
ンピシリンを添加した培地に接種し、ジャーファーメン
タ−で３０℃４８時間培養した。

この培養液１００ｆｆｌｌをとり、７．００　Ｏｒｐｍ
で遠心して菌体を回収した。この菌体をＰ　Ｓ　Ｇ　（
９７＋＋＋Ｍリン酸二ナトリウム、１．５ｄ　　リン酸
二水素カリウム、１３７ｍＭ　　ＮａＣ１，２，１ｍＭ
　　ＭＣｌ１）ｔ’洗浄した後５ＱｍｌのＰＢＳに溶解
し、超音波（３０分間）により菌体を破砕した。１０．
００Ｏｒｐｍで４０分間遠心して沈澱をとり、２０ｍＭ
のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　３．４８ｍ
Ｍに溶し、蒸留水３ｍｌ、　１．５　Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ
１３，６＋ｔ１１．パー：２−／ｌ／（７アルマシア・
ファイン・ケミカルズ社製）２５ｆ１１１を加え、１５
分間１７．００Ｏｒｐｍで遠心した。沈澱はパーコール
の密度勾配に従い２つに分画されるので、密度の高い分
画を回収した。これに蒸留水を５倍量加えて１１．　Ｏ
ＯＯｒｐｍで７分間遠心し沈殿を得、さらに蒸留水で洗
浄し４７ｍｇの頚粒を得た。蛋白質はプロティン・アッ
セイキット（バイオ・ラッド社製）を用いて定量した。

実施例１６．　　”Ｌｅｕ−モチリン単量体の製造：実
施例９で得たモチリン重合体の頴粒約５■を７０％ギ酸
２．９ｍＭに溶解し、これに４２ｍｇの臭化シアンを７
０％ギ酸Ｑ、４ｍｌに溶解した溶液を加え３７℃で一日
放置した。再び４２■の臭化シアンを含む７０％ギ酸溶
液Ｑ、４ｍｌを加えた後、更に３７℃で一夜放置した。

生成したスペーサーペプチドの結合した”　Ｌｅｕ−モ
チリン単量体（ペプチド２５）を高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）により単離した。単離したペプチド
２５の一部約１００■を０．２ＭのＮ−エチルモルホリ
ン・酢酸緩衝液（ｐＨ８，０）０．４ｍＭに溶解し３７
℃で２１時間放置してペブチ、ド２５のカルボキシル末
端のホモセリンのラクトン環を開裂させた後、２■のカ
ルボキシペプチダーゼＡ（Ｓｉｇｍａ社）を加え３７℃
で３０分放置して１３Ｌｅｕ−モチリンのカルボキシル
末端にアルギニンの結合したペプチド２６を得た。この
ペプチド２６の一部約２２■を０．２ＭＮ−エチルモル
ホリン・酢酸緩衝液（ｐＨ８，０）０．２ｍＭに溶解し
カルボキシペプチダーゼＢ　（Ｓｉｇｍａ社）１■を加
え３７℃で１０分間放置した後、０．１％トリフルオロ
酢酸溶液Ｑ、２ｍｌを加えて反応を停止して定量的収率
で１３Ｌｅｕ−モチリンを得た。このｌ　３Ｌｅ　ｕ　
−モチリンの構造はアミノ酸配列の決定と質量分析によ
り確認した。

実施例１６゜ １３Ｌｅｕ−モチリンの腸管収縮作用 体重２．３〜２．８　ｋｇの雄性ウサギを放血致死させ
てから十二指腸を約１．５０ｍ摘出した。これを３０ａ
＋１のマグヌス（Ｍａｇｎｕｓ）槽中に懸垂し、下端を
等損性トランスデニーサ−（ｉｓｏｔｏｎｉｃｔｒａｎ
ｓｄｕｃｅｒ）（日本光電、ＴＯ−１１２Ｓ）に結び、
十二指腸の収縮反応を記録計（ＹＯＫＯＧＡＷＡ　）Ｉ
ＯＫｔｌＳＨＩＮ　［：ＬＢＣＴＲＩＣ。

Ｔｙｐｅ　３０６６）上に記録した。十二指腸には張力
１ｇを負荷した。

実験は、栄養液としてＴｙｒｏｄｅ氏液（ＮａＣｊ２８
、Ｏｇ／Ｒ５ＫＣｌ　　０．２ｇ／ｌ５ＣａＣ１ｚ０．
２ｇ／Ｌ　ＭｇＣＬ　０．１ｇ＃！、ＮａＨ２ＰＯ５０
６０５ｇ、ＮａＨＣＯｓ　１．Ｏｇ／ｊ！、グルコース
１．０ｇ／β）を用い、温度２８±１℃で、９５％０２
と５％ＣＯ２との混合ガスを通気して行った。

”　Ｍｅｔ−モチリンおよび１３Ｌｅｕ−モチリンの収
縮作用は、これらを１０４〜３　ｘｉｏ−’　ｇ　／ｍ
ｌまでの濃度で累積的にＴｙｒｏｄｅ液に添加して得ら
れる収縮張力を測定し、この測定値とアセチルコリン１
０−’　ｇ　／ｍ１を添加したときの収縮張力とを比較
し、後者を１００％として算出した。結果を第１７図に
示す。

この結果、”Ｌｅｕ−モチリンは天然型ウシモチリンと
同等の腸管収縮活性を示すことがわかった。

参考例１．　　ＡＴＧベクターｐＴｒｓ２０の造成：第
１２図に示した手順に従い、ＳＤ配列と＾ＴＧ開始コド
ンの間の距離が１４塩基で、かつＡＴＧコドンの直後に
５ａｃｌサイトを有するＡＴＧベクターｐＴｒｓ２０を
造成した。

まず、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で潤
製したｐＫＹＰｌｏ　　３ｇをＹ−１００緩衝液３０ｍ
に溶かし、制限酵素ＢａｎＩ［［と制限酵素ＮｒｕＩに
ューイングランド・バイオラブズ社製）をそれぞれ６単
位ずつ加え、３７℃で３時間切断反応を行った。この反
応液からＬＧＴ法によりＰ　ｔ　ｒ、ｐを含む約３．８
ｋｂのＤＮＡ断片（ＢａｎＩＩＩ−Ｎｒｕｌ断片）約０
．５Ｎを得た。

一方、Ｐｔｒｐの下流にＡＴＧ開始コドンを付与するた
めに下記のＤＮＡリンカ−をリン酸トリエステル法によ
り合成した。

５′ １９−ｍａｒとＩＴ−ｍａｒの合成りＮＡ　（各々１０
　ｐｍｏｌｅずつ）を５０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７
，５）、１０＋１１＋Ｊ　　ＭｇＣ１ｚ　、５ｍＭジチ
オスレイトーノへ０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび１ｍＭ
　　ＡＴＰを含む全量２０ｄの溶液に溶かし、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ３単位（宝酒造社製）を加えて、
３７℃で６０分間リン酸化反応を行った。

次に上記で得たｐＫＹＰ　Ｉ　Ｑ由来のＢａｎｌ１ｌ−
ＮｒｕＩ断片（約３．８ｋｂ）　０．１　ＪＬｇと上記
（Ｄ　Ｄ　Ｎ　Ａリンカ−約Ｑ、５２ｍｏｌｅをＴ４リ
ガーゼ緩緩衝液０ｍに溶かし、さらにＴ　４　ＤＮＡ　
’Ｊガーゼ２単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行
った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌８
８１（１０）株〔ポリバー（Ｂｏｌ　１ｖｅｒ）　　ら
ニジ−ン（Ｇｅｎｅ）　２　、７５（１９７７＞）を形
質転換し、Ａｐｒのコロニーを得た。このコロニーの培
養菌体からプラスミドＤＮＡを回収した。１辱られたプ
ラスミドの構造は制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｂａｎｍ、Ｈｉ
ｎｄｌＩＩ、５ａｃｌ、Ｎｒｕｌで切断後、アガロース
ゲル電気泳動により確認した。このプラスミドをｐＴｒ
ｓ２０と名付けた。ｐＴｒｓ２０のＢａｎＩ［［、Ｈｉ
ｎｄ］ＩＩサイト付近の塩基配列は下記のとおりである
ことをＭ１３ファージを用いたディデオキシ・シーフェ
ンス法を用い確認した。

参考例２．　サケ成長ホルモン発現プラスミドｐｓＧＨ
ＩＭ１の造成（第１５．１６図）：ｐＧＥＬｌ　（約３
．４ｋｂ）３ｇを２０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐ）１７．
５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ　　Ｎ
ａＣｊ！を含む溶液（以下“Ｙ−１００緩衝液”と略記
する）４０ｍに溶かし、Ｂａｎｎ１（東洋紡績社製）５
単位を加え３７℃、３時間消化反応を行った。該反応液
をフェノール抽出し、エタノール沈澱にてＢａｎ１１１
部位−ケ所で切断されたｐＧＥＬｌ　　約２．４■を得
た。このＤＮＡ断片約２．４■を５０ｍＭ）リス−ＨＣ
Ａ　（ｐ）１７．８）、７ｆｆ１Ｍ　ＭｇＣｌ２および
６ｍＭメルカプトエタノールを含む溶液（以下“ＤＮＡ
ポリメラーゼ緩衝液”と略記する）、５０ｍに溶かし、
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ１ｍＭになるように加え
、さらに５単位のＤＮ人ポポリラーゼ■にニューイング
ランド・バイラブズ社製）を加えて、３７℃、３０分間
反応させて、突出末端を削った。フェノール抽出、エタ
ノール沈澱により、ＤＮＡ断片約２．０ｇを回収した。

該ＤＮＡ断片１■を２０ｍＭ）リス−ＨＣβ（ｐＨ７，
６）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭジチオスレイ
トールおよびＩＩＩＩＭ　　ＡＴＰを含む緩衝液（以下
“Ｔ　４１Ｊガーゼ緩衝液Ｉ”と略記する）３０屑に溶
かし、２単位のＴ　４　ＤＮＡ　’）ガーゼ（全酒造社
製：以下同じ）を加え４℃、１８時間結合反応を行った
。該反応液を用い、大腸菌８８１（１０）株（Ｂｏｌｉ
ｖｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、　：　Ｇｅｎｅ、　２　、７５
（１９７７））をＣｏｈｅｎ　らの方法［Ｓ、Ｎ、Ｃｏ
ｈｅｎ　ｅｔ、ａｌ　：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　６９．２１１０（１９
７２））により形質転換し、Ａｐｒのコロニーを得た。

この形質転換株よリブラスミドＤＮＡを公知の方法［）
１．　Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍｅｔ、　ａｌ、　’：　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７　　、１５１
３（１９７９））に従って分離し、ｐＧＥＬｌｏ（約３
．４ｋｂ）を得た。

ｐＧＥＬｌ　０の構造はＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＪ。

）（ｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで切断してアガロースゲ
ル電気泳動にて確認した。またｔｒｐプロモータ４−下
流のＳＤ配列からインターフェロン−γ遺伝子の翻訳開
始コドンΔＴＧに至る塩基配列はマキサム・ギルバート
法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　、、二４　、５６０（１９７７）　）により決
定し、ＡΔＧＧＧＴＡＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧ　　の１０
ｂｐ−ゴ「−］■− であることが確認された。

上記で得たｐＧＥＬｌｏ　　５ｇｇをＹ−１００緩衝液
４０誠に溶かし、）（ｉｎｄＩ［［、ＢａｍＨＩ各々１
０単位を加え３７℃３時間切断反応を行った。

該反応液からｔｒｐプロモータ一部分および複製開始点
、リポプロテインターミネ・−夕を含む約２．７ｋｂの
ＤＮＡ断片約２ｉｔｇを凍結融解法にて回収した。

別にｐｓＣ，ＨＩＢ２　（参考例３の方法で製造〕（約
３．８ｋｂ）約５肩を４０ｍのＹ−１００緩衝液に溶か
し１０単位のＢａｍＨＩを加え３７℃３時間反応を行い
、完全に切断し、さらにＨｉｎｄＩ［１１単位を加え３
７℃３０分間反応を行いＨｉｎｄｌＩＩ法による成熟型
サケ成長ホルモンをコードする約１、ｌｋｂのＤＮＡ断
片約０．７■を回収した。

上記のように回収したｐＧ、ＥＬｌｏのＤ　Ｎ　Ａ断片
約０．１ｇとｐｓＧＨＩＢ２のＤＮＡ断片約０．２席と
を３０ｆｉ１のＴ４１Ｊガーゼ緩衝液Ｉに溶かし、２単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃、１８時間結合反
応を行った。該反応液を用いて大腸菌８８１（１０）株
を形質転換し、得られたコロニーよりプラスミドＤＮＡ
を回収し、ｐｓＧＨＩＭｌを辱た。ｐｓＧＨＩＭｌの構
造はＥＣ０ＲＩ。

Ｈｉｎｄｌｌｉ、ＢａｍＨＩ、Ｐｓｔ　ｉで切断してア
ガロースゲル電気泳動にて確認した。

参考例３．成熟サケ成長ホルモンをコードする組換え体
プラスミドｐｓＧＨＩＢ２の造成：サケ成長ホルモンを
コードするＤＮＡを含むプラスミドｐｓＧＨ１（特開昭
６１−１５６９９記載の方法で製造）５埒を２０ｍＭト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｊ！
２および１０ｍＭＮａＣ１を含む溶液（以下“Ｙ−１０
緩衝液”と略記する）４０ｄに溶かし、制限酵素Ｍ　ｂ
　ｏ　］１〔ニューイングランド・バイオラプス（Ｎｅ
ｗ　（！ｎｇｌａｎｄＢｉｏ　Ｌａｂｓ）社製〕１０単
位を加え３７℃、３時間消化反応を行った。つづいて該
溶液のＮａＣ１Ｎ１１度を１７５ｍＭとなるよう調製し
、５ａｌｌｌＯ単位を加え、３７℃、３時間消化反応を
行った。この反応液からＬＧＴ法により、Ｎ末端付近に
相当する１６３ｂｐのＤＮＡ断片約０．２鱈を得た。

次にｐｓＧＨｌの５■をＹ−１００！Ｉｆｆ液４０譚に
溶かし、ＢａｍＨｌ　　１０単位を加え、３７℃、３時
間消化反応を行った。つづいて該反応液のＮａＣ１濃度
を１７５ｍＭに調整し、５ａｌｌｌＯ単位を加え３７℃
、３時間消化反応を行った。該反応液からＬＧＴ法によ
り、Ｃ末端側と３′−非翻訳領域を含む約９００ｂｐの
ＤＮＡ断片約０．５ｕｇを得た。

別にｐＧＥＬｌ　　５■を４０ｄのＹ−１００緩衝液に
溶かし、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとを各々１０単位
加え、３０℃、３時間消化反応を行った。

この反応液からトリプトファンプロモーターを含む約２
．７ｋｂのＤＮＡ断片約１屑を得た。

一方成熟サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡの発現に
必要な翻訳開始コドンＡＴＧを付加し、さらにベクター
ＤＮＡと上記Ｄ　Ｎ　Ａとを連結する目的で下記のＤＮ
ＡＩＪンカーを合成した。

１１−Ａ頴υへ八、ｌ’ｌ−ｍｅｒと１ｚ−ｍｅｒ−’
２ａ’ｉのトリエステル法〔アール・フレア（Ｒ，Ｃｒ
ｅａ）　　ラ：ブロシーディング・オプ・ザ・ナショナ
ル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、）　ＩＪＳ＾、、遷、　５７６５　（１９７８
）　〕により合成した。

１７−ｍｅｒおよび１２−ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡ各々１
２ｐｍｏｌｅを５０ｍＭ　）リス−ＨＣｊ！　（ｐＨ７
，５）、１０ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｃ１゜１０ｍＭジチオス
レイトールおよび１ｄＡＴＰを含む溶液２０ｍに溶かし
、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（全酒造社製）６単位
を加え、３７℃、６０分間リン酸化反応を行った。

上記で得たｐｓＧｆｌｌ由来のＭｂｏＩＩ−３ａｊ？Ｉ
断片（１６３ｂｐ）　　０．１ｐｍｏｌｅ　５Ｓａｌ［
−Ｂａｍ旧断片（約９００ｂｐ）０．０６ｐｍｏｌｅ　
ＳｐＧ［！Ｌｌの旧ｎｄｌ　−Ｂａｍ旧断片（約２．７
ｋｂ）　０．０２ｐｍｏｌｅ　を５０ｍＭ　）リス−Ｈ
Ｃ／　　（ｐＨ７，５）　　、１０＋ｎＭ　　Ｍ　ｇ　
Ｃ１２，１０ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭ　　
ＡＴＰを含む溶液３０ｍに溶かし、これに上記の合成り
　Ｎ　Ａ　ＩＪン酸化反応液５パを加えた。

この混合液にＴ４１Ｊガーゼ（全酒造社製）６単位を加
え、４℃、１８時間結合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌８８１（１０）株を形質転換し
＾ｐ′のコロニーをｉＬ　このコロニーよりプラスミド
ＤＮＡを回収し、第１６図に示したｐｓＧＨＩＢ２を得
た。ｐｓＧＨＩＢ２の構造はＢｃｏＲＩ　、　Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ、Ｃ１ａｌ、ＢｇｌＩ［、Ｓａｌ　ＩＳＢａｍＨ
Ｉで切断してアガロースゲル電気永動にて確認した。ｐ
ｓＧｆｌｌＢ２中のサケ成長ホルモンをコードするＤＮ
ＡのＮ末端付近の配列はであることをＭ１３ファージを
用いたサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）法に従って決定した。

その結果ｐｓＧ）！１Ｂ２は成熟型サケ成長ホルモンポ
リペプチドをコードするＤＮＡを含むことがわかった。

プラスミドｐｓＧＨＩＢ２を含む大腸菌はＢｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　［！５ＧＨＩＢ２（ＥＦＲ＋Ｊ
　ＢＰ−６１２）　として昭和５９年９月２０日付で工
業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に寄託されて
いる。

参考例４．　プラスミドｐＧＨＤ７の造成（第１３図）
：Ｉｅｃ）プロモーター（特開昭６０−２２１０９１参
照）、大腸菌リボプロティン遺伝子（１ｐｐ）のターミ
ネータ−、ヒトインターフェロン−γｃＤＮＡを運ぶプ
ラスミドｐＧＨＢ３（特開昭６Ｏ−２２１０９１（ＩＧ
ＨＢ３　ＦＥＲＭ　ＢＰ−４０３））約２■を３０４の
Ｙ−５０緩衝液（ｌＱｍＭ　　）リス−ＨＣｊ２　（ｐ
１４７．５　）　、５０ｍＭＮａＣｊ！、７ｍＭ　　Ｍ
ｇＣｊ’２および６ｍＭ　　２−メルカプトエタノール
を含む緩衝液〕に溶かし、８単位のＰｖｕＩｒを加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。

次いでＮａ（Ｊを１５０ｍＭとなるように加え、８単位
の５ａｌＩを加えて３７℃でさらに２時間消化反応を行
った。続いて、フェノールおよびクロロホルム抽出とエ
タノール沈澱の後、ＤＮＡ断片を全量３０薦の５３ｍＭ
　　）リス−ＨＣｌ　（ＩＩＨ７，６）、７ｍＭ　　Ｍ
ｇＣ１ｚ　、６ｍＭ　　２−メルカプトエタノール、０
．２５ｍＭ　　ｄＡＴＰ、０．２５ｍＭ　　ｄｃＴＰ。

０．２５ｍｔＪ　　ｄＧＴＰおよび０．２５ｗ＋Ｍ　　
ｄＴＴＰを含む緩衝液に溶かし、４単位の大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ　ＳＫｌｅｎｏｗ断片（全酒造社製）を
加え、１５℃で２時間反応させ、生じた突出末端を平坦
末端に変えた。６５℃、１０分間の熱処理後、低融点ア
ガロースゲル電気泳動法を用い、大きい方のＤＮＡ断片
（３，６ｋｂ）を精製した。

このようにして得たＤＮＡ断片（約０．ＩＪｔｇ）を２
０ｍＭ　　）リス−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，６）、１０ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｊ！２．１０ｍＭ　　ジチオスＬ／イトー
ルフよび０．５ｍＭ　　ＡＴＰを含む緩衝液（以下この
緩衝液を“Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼ緩衝液ｎ″
と略称する）２０Ｉ中、２単位のＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪ
ガーゼにより、４℃で１８時間結合反応を行った。

このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡで大腸
菌８８１（１０）株を形質転換し、アンピシリン耐性株
を得た。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離し
、その構造解析を行ったところ、目的の構造を存するプ
ラスミドｐＧＨＤ７が造成されたことを確認した。

参考例５．　プラスミドｐＡｒｇ　４の造成（第１４図
）　：ｔｒｐポータプル・プロモーターヲ持つｐにＹｆ
’ｌＯＯプラスミド（Ｔ、　Ｎ１５ｈｉら：Ａｇｒｉｃ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

４８、　６６９−６７５（１９８４）　）約３Ｉｉｇを
３０ｍの緩衝液（ｌＱｍＭ　）リス−ＨＣＩＩ　（ｐＨ
７，５）、５０ｍＭ　　ＮａＣ１，７ｍＭ　　ＭｇＣｌ
２および６ｆｆＩＭ２−メルカプトエタノールを含む緩
衝液〕に溶かし、ｌＯ単位のＰｓｔｌと１０単位のＨｉ
ｎｄｌｌｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理後、低融点アガロースゲル電
気泳動を用い、小さい方のＤＮＡ断片（０，８８ｋｂ）
を精製した。

さらに、ヒトインターフェロン−Ｔ発現プラスミドｐＧ
ＥＬ１　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−６１２、特開昭６１−９
３１９７１約３■を３０屑のＹ−１００緩衝液に溶かし
、１０単位のＰｓｔＩと１０単位のＮｃｏ　Ｉを加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の
熱処理後、低融点アガロースゲル電気泳動を用い、大き
い方のＤＮＡ断片（１，７ｋｂ　）を精製した。

次に、上で精製した２つのＤＮＡ断片を連結するための
ＤＮＡリンカ−（ＥｃｏＲＶサイトと５ａｌＩサイトを
内部に有する）をデザインした。

上図に示した２種の一本鎖ＤＮＡ　（それぞれ３６−ｍ
ａｒ）を通常のトリエステル法（ＲｏＣｒｅａ　ら：　
Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｉ！、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　７５．５７６５
（１９７８））により合成した。続い、て各々２Ｑｐｍ
ｏｌｅを５０＋ｎＭ）リス−ＨＣｊ　（ｐＨ７，５）、
１０ｍＭ　　ＭｇＣ１ｍ　、５ｍＭジチオスレイトール
、０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび１ａ＋ＭＡＴＰを含む
全ｌ１２０ＡＩ２の溶液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ４単位を加えて、３７℃で３０分間リン酸化
反応を行った。これらの−木調ＤＮＡを等量ずつ混合し
、６５℃で５分間加熱後、室温で徐冷することにより、
上記の構造を有するＤＮＡリンカ−を得た。

このＤＮＡリンカ−（ｌ　ｐｍｏｌｅ）と上で精製した
２種のＤＮＡ断片（それぞれ０．１■ずつ）を前記Ｔ４
１Ｊガーゼ緩衝液１１２Ｏｄ中、２単位のＴ４ＤＮＡ　
リガーゼにより、４℃で１８時間結合反応を行った。

このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡで大腸
菌８８１（１０）株を形質転換し、アンピシリン耐性株
を得た。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離し
、その構造解析を行ったところ、目的の構造を有するプ
ラスミドｐΔｒｇ４が造成されたことを確認した。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＭＴＡ１の造成工程を示す。 第２図はプラスミドｐＭＴＡ２の造成工程を示す。図中
Ｂｇ、Ｂａｍ、ＰはそれぞれＢｇｌｕ、ＢａｍＨｌ５Ｐ
ｓ　ｔ　１の認識部位を示す。ＭＴは”Ｌｅｕ−モチリ
ン遺伝子を示す。以下同じ。 第３図はプラスミドｐＭＴＡ４の造成工程を示す。 第４図はプラスミドｐＭＴＫ４の造成工程を示す。図中
ＳＧＨはシロザケ成長ホルモン遺伝子を示す。以下同じ
。 第５図はプラスミドｐＭＴＬ４の造成工程を示す。図中
Ｔｌｐｐはりボブロチインターミネータ−を示す。Ｔｒ
ｐはトリプトファンプロモーターを示す。 第６図はプラスミドｐＭＴＮ４の造成工程を示す。 第７図はプラスミドｐＭＴＭ４の造成工程を示す。 第８図はプラスミドｐＭＴＯ４−■■■■■■ｌの造成
工程を示す。 第９図はプラスミドｐＭＴＯＩ４の造成工程を示す。 第１０図はプラスミドｐＭＴＯＩ［４の造成工程を示す
。 第１１図はプラスミドｐＭＴＯＩＩＩ４の造成工程を示
す。 第１２図はプラスミドｐＴｒｓ２０の造成工程を示す。 第１３図はプラスミドｐＧＨＤ７の造成工程を示す。 第１４図はプラスミドｐＡｒｇ４の造成工程を示す。 第１５図はプラスミドｐＧＥＬ１０の造成工程を示す。 第１６図はプラスミドｐｓＧＨＩＭ１の造成工程を示す
。 第１７図は１３Ｍｅｔ−モチリンおよび”１ｅｕ−％チ
リンの腸管収縮作用を示す。図中０は１３Ｌｅｕ−モチ
リン、・は”　Ｍｅｔ−モチリンを示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社ＤＮＡ４　
　　　　　　　　　　　　ＤＮＡ６ＤＮＡ７ １図 ■ 第３図 第４図 第６図 第１２図 ｃｏＲＩ Ｓｏ列 第１５図 第１６図 Ｔ７ｐｐ 第」７　図 １０′１ｏ１（１０）０６ 毛チリン　（３７ｄ）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記式１のアミノ酸配列を有する新規ペプチド。 【アミノ酸配列があります】（式１） （式中、記号は下記アミノ酸残基を示す。 Ｐｈｅ：フェニルアラニン、Ｖａｌ：バリン、Ｐｒｏ：
   プロリン、Ｉｌｅ：イソロイシン、Ｐｈｅ：フェニルア
   ラニン、Ｔｈｒ：スレオニン、Ｔｙｒ：チロシン、Ｇｌ
   ｙ：グリシン、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ｌｅｕ：ロイシ
   ン、Ｇｌｎ：グルタミン、Ａｒｇ：アルギニン、Ｌｙｓ
   ：リジン、Ａｓｎ：アスパラギン以下同じ）
2. （２）下記式１のアミノ酸配列を有するペプチドをコー
   ドするＤＮＡ。 【アミノ酸配列があります】（式１）
3. （３）下記式２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 （式２） （式中Ｃｌａ I 、ＢｇｌII、ＢａｍＨ I 、Ｓａｃ I
   に向かう引き出し線は、これら制限酵素による切断部位
   を示す。Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃはそれぞれヌクレオチド中の塩
   基アデニン、チミン、グアニン、シトシンを示す。以下
   同じ）
4. （４）下記式３のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 （式３）
5. （５）下記式４のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 （式４）
6. （６）下記式５のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 （式５）
7. （７）下記式６のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 （式６）
8. （８）式１のアミノ酸配列を有するペプチドをコードす
   るＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ。
9. （９）式１のアミノ酸配列を有するペプチドをコードす
   るＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物を培
   地に培養し、培養物中に式１のアミノ酸配列を有するペ
   プチドを蓄積させ、該培養物から該ペプチドを採取する
   ことを特徴とする式１のアミノ酸配列を有するペプチド
   の製造法。
10. （１０）下記式７のアミノ酸配列を有する新規ペプチド
    。 【アミノ酸配列があります】 （式中、Ｈｓｅはホモセリン残基を表す）（式７）（１
    １）式７のアミノ酸配列を有するペプチドをカルボキシ
    ペプチダーゼＡおよびカルボキシペプチダーゼＢで分解
    することによる式１のアミノ酸配列を有するペプチドの
    製造法。