JPS6287600A - 魚類のプロラクチンポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は魚類たとえば、シロザケのプロラクチンポリペ
プチドをコードするＤＮＡ、１ＤＮＡを組み込んだ組換
え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含む微生物および該微
生物を用いる魚類のプロラクチンポリペプチドの製造法
に関する。魚類のプロラクチンは魚類の成長促進効果を
有する。 さらにシロザケ成魚を淡水に移すと２４時間後に血’ｌ
透圧はやや低下するが、以後は一定に保たれるので、ン
ロザケ成魚は淡水適応能をもつことが知られている。こ
の浸透圧の低下に呼応して、血中プロラクチン濃度も、
２４時間後に有意に上昇することから、シロザケの淡水
適応に、プロラクチンは重要な働きをもつと考えられて
いる。 従って、本発明方法によって提供されるプロラクチンボ
リベプチドは、魚類の遷殖産業分野において広い用途が
期待される。 従来の技術 浦乳頚のプロラクチンは脳下垂体において土、帝される
がそれらの活性ならびに構造は公知である。 たとえばヒトプロラクチンについては、Ｊ、Ｂ。 Ｊｏｓｉｍｏｖｉｃｈらによってエンドクリノロシイ（
εｎｄｏ−ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）　　７１．２０９（１
９６２）　　に、Ｌ、　！Ａ、Ｓｈｅｒｗｏｏｄらによ
ってブロン−ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ｔｌｓＡ、　５８．２３０７
（１９６７）に報告されている。魚類のプロラクチンに
ついても、これまでに単離されたという報告はいくつか
見られる。 ティラピアよりの単離例：　Ｓ、　Ｗ、　Ｆａｒｍｅｒ
ら、ジェネラル・アンド・コンパラティブ・エンドクリ
ノロシイ（Ｇｅｎ、　Ｃｏｍｐ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、
）、　３１．６０〜７１（１９７７）サケよりの単離例
：　Ｄ、　Ｒ，Ｉｄｌｅｒ　ら、ジェネラル・アンド・
コンパラティブ・エンドクリノロシイ（Ｇｅｎ、Ｃｏｍ
ｐ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、）、　３５．４０９〜４１８（
１９７８）コイよりの単離例：　Ｔ、　Ｂ、　Ｎｇらジ
ェネラル・アンド・コンパラティブ・エンドクリノロシ
イ（Ｇｅｎ。 Ｃａｍｐ、　　　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ）　　４２．　　１
４１〜１４６（１９８０）シロサケよりの＊離例：　Ｈ
，Ｋａｗａｕｃｈ＋ら、ジェネラル・アンド・コンパラ
ティブ・エンドクリノロシイ（Ｇｅｎ、　　Ｃｏｍｐ、
　　Ｅｈ１ｊｏｃｒｉ！］、　）、　１１９．４．４６
〜４５８（１９ｆｔ３）一方１１１１Ｖ乳動物のプロラ
クチン遺伝子については、ラブドプロラクチン遺伝子Ｃ
Ｎ、　Ｅ、　Ｃｏｏｋｅ　ラ、ジャーナル・オブ・ハイ
昂ロジカル・今ミストリイ（Ｊ。 Ｂ＋ｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、）　２５５．　　Ｎｏ、１３
．　６５０２（１９！ｔｏ）〕　ウンブロラクチン遺伝
子ＣＪ、　Ｉｔ、　Ｎｉ　１ｓｏｎら、　ヌクレイ２．
り・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅ＋ｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、）８．　　Ｎｏ、７゜１５６１（１９８０）　
：ｌ　、　　ヒトプラクチン遺伝子（＋４．ＥＣｏｏｋ
ｅらジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストシイ
（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、）　２５６．　　Ｎｏ
、８．　４（１０７（１９８１）　　〕などが既に知ら
れているが、魚類のプロラクチン遺伝子についてはいま
だに報告がない。 発明が解決しようとする問題点 魚類のプロラクチンは魚類の成長促進効果および淡水適
応能の調節作用を有するので、篠魚用餌料の組成物とし
て有用であるが、魚類の脳下垂体からの採取は供給量が
限られている。従って魚類のプロラクチンを安価に大量
に供給する方法の開発が望まれている。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、組換えＤＮＡ技法により魚類のプロラク
チンを製造する方法について研究を行った。その結果、
魚類のプロラクチン製造に使用することができる、魚類
のプロラクチンポリペプチドに相補的なりＮＡの採取な
らびにこれを含む組換え体ＤＮＡおよび微生物の製造に
成功した。即ちシロサケ脳下垂体からメツセンジャーＲ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出し、これと相補的なり　Ｎ　Ａ
　（ｃＤＮＡ）を合成し、次いでシロサケのプロラクチ
ンのＮ末端付近のアミノ酸配列に対応するＤＮＡプロー
ブを合成し、このＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡ
を選択することにより、シロザケブロラクチン遺伝子を
クローン化し、そのｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。 本発明者らはさらに研究を進め、シロサケのプロラクチ
ンをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含
む微生物を培養することにより、培養物中にンロザケプ
ロラクチンボリベブチドが著量蓄積することを見い出し
、本発明を完成するに至った。 以下に本発明の詳細な説明する。 本発明は、魚類のプロラクチンポリペプチド、とくに第
１表に示されたペプチド配列を有するポリペプチドを提
供する。該ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法を用いて
下記のごと＜製造することができる。 即ち、魚類プロラクチンのｍＲＮＡを鋳型として用いて
該ｍＲＮＡに相補性を示すＤ　Ｎ　Ａ　（ｃＤＮＡ）を
調製し、該ｃＤＮΔを組み込んだ組換え体プラスミドを
調製する。さらに、板組換え体プラスミドを宿主微生物
に挿入する。該ＤＮＡおよび組換え体プラスミドは、と
くにエブンエリヒア・コリのような細菌中でプロラクチ
ン遺伝子の増幅に使用することができる。板組換え体プ
ラスミドを有する微生物は魚類のプロラクチンポリペプ
チドを安価に大１に製造するために有用である。 従って、本発明は、魚類のプロラクチンポリペプチドを
コードするＤ　Ｎ　Ａ　、該Ｄ　Ｎ　Ａを組み込んだ組
換え体ＤＮＡ、該組換板組ＤＮＡを含む微生物および該
微生物を用いる魚類のプロラクチンポリペプチドの製遇
法を提供する。 本発明のＤＮＡと組換え体プラスミドは下記の−ＳＱ的
手法で調製される。 シロサケ脳下垂体より全ＲＮＡを調製し、これをオリゴ
（ｄＴ）セルｏ−ス（ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｃｅｌｌｕｉ
ｏｓｅｌカラムを通すことによりポリアデニル酸〔ポリ
（Ａ）〕を有するＲＮＡＣポ’Ｊ　（Ａ）　ＲＮ　Ａ　
’Ｊを分離する。 このポリ（Ａ）　ＲＮ　Ａ　を鋳型とし、迎転写酵ムに
より二重鎖Ｄ　ＮＡを合成する。組換え体は試験管内Ｄ
ＮＡ組換え技法を用し）、大腸菌のプラスミドＤＮＡの
ようなベクターＤＮＡに合成したＤＮＡを挿入して（４
）られるっンロザケブロらクチンｍＲＮへに相補性を示
すＤ　Ｎ　Ａを有する組換え体プラスミト′は、該プラ
スミドが持つマーカー：５−もみ−づし１て選択する。 次に本発明のＤさ、＋ＡおＪび組換え体プラスミドの製
法につ′、）で具体Ｑ′Ｊに説明する。 捕獲されたシτ」ザケより脳下垂体を摘出し、即座に液
体窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体にグアニジウ
ム・イソチオ゛２／ア不−１−（ｇｕａｎｉｄｉｕｍｉ
ｓｏｔｈ　１ｏｃｙａｎａｔｅ）を加え破砕し、可溶化
する。次いてＣｓＣｆ溶液層に重層１７、超遠心後、沈
殿物とし全細胞質ＲＮＡをｉ辱ろ。またグアニジウム・
インチオンアネート可溶化物にＬｉ（１！を加えてｌマ
Ｎ　Ａのみを沈殿させ回収することもできろ。 抽出したＲＮＡをＮａＣ１またはＫＣＡの高塩濃度（た
とえば０．５　Ｍ　）溶液に溶解し、オリゴ（ｄＴ）セ
ルロースのカラムに通塔してボ１ｔ（Ａ＞を有するｍ　
ＲＮ　Ａをカラムに吸着させる。水、１０ｍ　：＋Ａ　
）　ＩＪス−ＨＣｆｆ暖衝液緩衝液な低塩濃度溶液を用
いて溶出し１、ポリ（Δ）を有するｍＲＮＡを単離する
。 以下、オカーヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−１’ｌｅ
ｒｇ）の方法〔オカヤ７−７７ド・パーク（ｎｋａｙａ
ｍａ　＆　Ｂｅｒｇ）；モレキュラー・アンド・セルラ
ー　・バイオロジイ（！、Ｉｏｌ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉ
ｏｌ、　）−之、　１６１　（１９８２）コに従い、Ｃ
ＩＩＮＡの合成および、そのベクターへの徂み込みを行
−１つ 土ずべ（ノクーー戸′ライフ・−を合成する。＜；！ク
ーとし−３は、さ！、、々、１よｐ（Ｄ　Ｖ　１を、３
　）ｌ掲ｆし容液、たとえばトｉ（ス−Ｈ（：　ｎ緩衝
液（たとえばｐＨ７、５，１０ｍ！、１）、　　＼Ａ　
ｇ　（、、ｆ’、　２　＜たとえば６　ｒｎ〜１　）　
＋　Ｎ　ａ　Ｃ２（たと鷲ぼｌ　Ｑ　「ａ　Ｍ　）を含
む溶液中てＫｐＴｌｌで処理１７、ｐＬ−Ｄ　Ｖ　ｌ　
”　Ｋ　ｐｎ　Ｉ　ｏ％　位ヲ”ＪＪ　ｌｆＪ’ｉ　ｔ
　ル。 、−のＤＮＡをトリス−１−＋　Ｃβ援衝液（たとえば
ｆ〕１（６、８，３０ｍＭ）　、　　カコジル６シナト
リウ７４、（たと、女、ば’、４０ｍＭ）、（７，′Ｎ
Ｃｆ、（たとえば１ｍＭ）、ジチオスレイｌ−外（たと
えば０．１ｍＭ）およびｄＴＴＰ　（たとえばＱ、　２
５　ｍ　Ｍ　）中、ターミナルチオキンヌクレオ−１ジ
ルトランスフエう−ゼとともに一定温度（た上えば３７
℃）で一定時間（たとλば２０分間）・イシキュベート
シ、ベクターＤ　Ｎ　Ａの両３′末端に６０個前後のチ
ミジル残基を付加ずろ。さらに、−のＤＮＡをトリス−
ＨＣ、ｅ÷ν衝液（たとえばｐ　Ｈ７，５，Ｎｏ　ｍ〜
１）、〜ＩＩｇ　Ｃ１ｐ２（たとえば６ｍ＼ｊ＞　、Ｎ
ａＣｊ　（たとえば１ｊ〕Ｏｎ１〜４）を含尤、゛溶液
中ＥＣ０ＲＩで切断後、低融点フ′ガ舅−スゲル電気泳
勃法〔ラルス・つ・イスランダ−（Ｌａｒｓ　Ｗ＋ｅｓ
ｌａｎｄｅｒ　）　：　アナリテイリル＋、Ｉ＜イオゲ
ミストリイ（４〜ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂ＋ｏｃｔ＋ｅ
＋ｎ＋５ｔｒｙ、　）９８．３０５　（１９７９）　、
　以下ｉ、Ｇ　Ｔ法といつｅにて分画し、約３．１　キ
ロベースの断片を回収する。次いで該Ｄ　Ｎ　Ａを＼ａ
ｃ１．またはＫＣｌうつ高塩濃度〈たとえ７ば０．５　
Ｍ　）溶液ｉこ溶解し７、ポリ（ｄＡ）セルロースカラ
ムに通塔して１ＶＩＪ（Ｔ）を６゛するベクタープライ
マー分子のみをカラムに吸着させろ５、水、１０　ｍ　
Ｍ　トリス−ＨＣｆｆ援所液のような低塩濃度溶液を用
いて溶出し、ボ１．１（Ｔ）の付加したベクタープライ
マー分子のみを）丘雌Ｖろ。 次：ニリン力−ＤさＪ八を合成する。たと、えばｐＬ１
■つＸＡを適当な７容液、たとえばト１１ス−１−（Ｃ
７！’ｆｌ衝ａ（た吉〕８ばｐＨ７，ｂ、　　ｌ　Ｏｍ
七４）　、　ＭｇＣｇｚ（たとえば６ｍ〜＋）　、Ｎａ
Ｃｊ！　（た、とスば５０ｍＭ）を含む溶液中でＰｓｔ
ｉで・処理し、ｐ　１−１のｐｓｔｉ部位咬−切［祈寸
５゜コ（’Ｌ）　Ｌ）Ｎ　Ａを、ｄ　Ｔ　Ｔ　Ｐの代わ
りにｄＧＴＰを加える以外はベクタープライマー合咬・
二）場合と同様に処理シ、５．１５個前後のオリゴＩＧ
）鎖を付加する。該Ｄ　Ｎ　Ａを適当な溶液たとえばト
リス用＋ＣＭ’緩衝液（たとえばｐ　１−１７．５．１
０ｍ〜、１）、＼４ｇＣＬ（たさえばｌ’ｉｍＭ）。 Ｎａ（’：＋、！（たとえば６０ｍＭ）を含か溶、夜中
ｔ−Ｉ　Ｉｎ　ａ　ＩＩＩにで切断する。アガ「）−ス
′ノー゛ル電気泳乃にて約［］、］５キロベ＝−ス、１
ＤＮＡ′・Ｈ、Ｈ４−、、又・分、・１ｊ１シ１、ＤＩ
ΣＡＩ巳ベーパーにでｐ］収すら。−のようにしてリン
カ−ＤＮ、・〜・蟲得ろ、。 以上の、よう；−ｊ７で（庫たポリ（Ａ）　ＲＮ　Ａ　
、べ・シターブらイマー、リンリーり　Ｎ　Ａを［ｆｌ
’、”、（：つＮ　Ａ合媒を行］。、ボ’、ｉ　（Ａ）
　ＲＮ△　、ベブターブ丹イマ−Ｄ　Ｎ　　Ａ　＋、、
　　１．　　リ　−’、　　　　Ｈ（１！　　ｉ′！１
？　液　（ｉ−１＆：Ｒ−１，ＤＩＡ８．３，５０ｍ：
ｖｌ）、ＭｇＣＬ　　（、ｉ＝ヒえばＬｉｍＭ）。 ＫＣｌ（たとえば３０ｍＭ）、　　ジＪオフ、　レイト
−ル（たとえば０．３ｍ＼う）、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ。 ｄＣＴＰ、、ｊ、ＧＴＰ　（たとえば各々２ｍ　Ｍ　）
を含む溶液中１、逆転写酵素を一定温度（たとえば３７
℃）、一定時１１０（たと、々−ば４０分間）反応さ廿
ろ。 こうし１て百−たＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の３’を端（て
、ｄＴＴＰがｄｃＴｐに変わる以外はベクタープライマ
・−・に（＋ＪＴ）鎖を付ｊ＝ＩコＬ／た条件と同様の
慢作でオリゴ（ｄＣ）鎖牟１；）個萌ｉ受付加士ろ１３
、−・つＤ　Ｎ　Ａをトリス−ＨＣｐ鐸衛液（たとえば
ｐ　ｌ−Ｉ　’７．５　、　１０ｍ　Ｍ　）　、　Ｍ　
ｇ　Ｃｌ　２　（たとえば６　ｍＭ）、　　Ｎ　ａ　Ｃ
１（たとえば６（］ｍ〜７１）を含む溶液中）（ｉ　Ｔ
ｌ　（ｌ　ｆｆ（で切断する。このＤ　Ｎ　Ａに、先に
調製（、た１１ンカーＤＮＡを混合し、トリス−）ｉ　
ＣＥ　ｔｌ　（ｋ液（たとえばｐＨ７，５，２０ｍＭ）
、ＭｇＣｒ＊　　（たとえば・１「ｎ〜＋）　、　　（
Ｎｌ−４ａ）；Ｓｏｎ　（たとえばｌＱｍ＼１）。 ＫＣｌ、（たとｉば０．ＩＭ＞、β−二コチ゛ノアミド
了テ゛二〕ノジスタレｔチト′（β−−〜Ａ１１）０“
こｔ辷、’Ｒ，ハ０．１會１へ１，１）をり

【も１・溶
液中、人陽閑Ｄχ＾　リノｌ′−セとともに一定時間（
たとえば１６時間）、一定温度（たとえば１２℃）でイ
ン千ユベートする。こうしてｃＤＮＡとリンカ−ＤＮＡ
との環状化が行われる。この反応液にｄＡＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ。 ｄＣＴＰを各々、終濃度４０μＭとなるよう加え、大腸
菌ＤＮＡＩＪガーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーセ１１大
腸閑リボヌクレアーゼＨを加え、ＲＮＡ部分をＤＮＡに
変換することにより、完全な二Ｍ鎖ｃＤＮＡを含む組換
えプラスミドを得る。 こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、たとえば
大腸菌Ｃ６００ＳＦ３株を、たとえばスコツ１−（Ｓｃ
ｏｔｔ）らの方法〔重定勝哉：細胞工学　２．６１６（
１９８３）　）により形質転換する。 上記で得た組換え体プラスミド上にはアンピシリン耐性
遺伝子が存在するため、形質転換した大腸菌はアンピシ
リン耐性を示す。以下の手法はこれらアンピシリン耐性
（ＡｐＲ）菌株から魚類のプロラクチンｍＲＮＡに相補
性を示す遺伝子を持つ新規組換え体プラスミドＤＮＡを
保有する菌株を選択するのに一般的に用いられる。すな
わち、上記で得られた形質転換株をニトロセルロースフ
ィルター上に固定し、既知のシロザケブロラクチンのア
ミノ酸配列より予想されるＤＮＡ配列を有する合成りＮ
Ａプローブと会合させ、強く会合するものを選択する〔
グルンステインーホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　−１
１ｏｇｎｅｓｓ）の方法、プロシープ・イング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイｘンス（Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ、Ｓｃ＋、）、　　ＩＪｓＡ
、、　　７２゜３９６１（１９７５）　〕。プローブ［
）　Ｎ　Ａは通常のトリエステル法〔ジャーナル・オブ
・アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ（Ｊ、Ａｍ、　
Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　）　、刀。 ７３２７　（１９７５）　）で合成される。合成りＮＡ
プローブによる選択はサザーン（３ｏｕｔｈｅｒｎ）　
；の方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジイ（Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、）、部、　５０３　
（１９７５））によってさらに確実にでき、この方法で
シロザケブロラクチンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子を
有する組換え体プラスミドＤＮＡを同定できる。 このようにして得られる組換え体プラスミドの一例がｐ
ＳＰＲＬ１である。このプラスミドをシロザケブロラタ
チンをコードするＤＮＡの供給源として用いることがで
きる。 シロザケプロラクチンをコードするＤ　Ｎ　Ａを含むプ
ラスミドから該ＤＮＡを切り出し、これをベクターＤＮ
Ａに組み込み、得られる組換え体ＤＮＡを微生物に導入
し、得られる形質転換体を培養することによってシロザ
ケプロラクチンボリベプチドを培養物中に生成蓄積させ
、これを採取することによってンロザケブロラクチンポ
リペプチドを製造することができる。 シロザケプロラクチンをコードするＤＮＡを含むプラス
ミドとしては、上記ｐｓＰＲＬ１が好適な例としてあげ
られる。 ベクターＤＮＡとしては、挿入したＤ　Ｎ　、Ａ、を微
生物中で発現させることができるものなら、いかなるも
のでも用いることができる。好まし　は、適当なプロモ
ーター、たとえばトリプトファン（ｔｒｐ）系、ラクト
−ｘ　（ｌａｃ）系、Ｐ（、系などのプロモーターを持
ち、その下流にＤＮＡを挿入でき、しかも内在するシャ
インダルガーノ配列（以下ＳＤ配列と略記する）と翻訳
開始コドン（ＡＴＧ）との間を適当な距離たとえば６〜
１８塩基対に調節したベクターＤＮＡが用いられる。具
体的に好適なベクターＤＮＡとしては、プラスミドｐＧ
ＢＬ１をあげることができる。ｐＧＥＬ　１は第３図に
示すプラスミドで、それを含む大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａヨ旦　ＩＧＥＬＩ（ＦＥＲＭ　　ＢＰ’−６２
９）として昭和５９年１０月６日付で工業技術院微生物
工業技術研究所（微工研）に寄託されている。ポリペプ
チドをコードするＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換えは
、制限酵素を用いて両ＤＮＡを消化後、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて結合する一般的組換えＤＮＡ手法を用いて
行うことができる。 具体例として示したｐＳＰＲＬ１とｐＧＥＬ　１の場合
は第３図に示したごとく２段階の造成を行う。すなわち
ｐＳＰＲＬ１よりンロザケプロラクチン成熟ペプチドＮ
末端付近をコードするＨａｅＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片と、ｃ　ＤＮＡの残りの部分およびベクタ一部分を含
む旧ｎｄｌＩ［−Ｂａｎｌｌ断片を別々に得る。一方、
以下のような合成り　Ｎ　Ａ　ＩＪンカーを作製する。 上記ＤＮＡ断片と合成り　Ｎ　Ａ　’ＪンカーとをＴ４
ＤＮΔリガーゼで結合し、第３図に示した組換え体プラ
スミドρ５ＰＲＬＡ６を得る。 次にｐＳＰＲＬＡ６よりシロザケプロラクチン成熟ペプ
チドをコードするＢａｎ　ＩＩＩ　−ＢａｍＨＩ消化断
片を得、ｐＧＥＬｌからはトリブトファンプＶ］モータ
ーを含むＢａｎ　■−Ｂａｍ１ｌ　Ｉ消化断片を得る。 上記２つのＤＮＡ断甲をＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　＋Ｊガー
ゼて結合し、第３図に示した組換え体プラスミドｐｓＰ
ＲＬＢｌを得る。本プラスミドはトリプトファンプロモ
ーター下流に、成熟ンロザケプロラクチンをコードする
領域が連結した形を有する。 上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。 ＤＮＡの制限酵素による消化反応は、通常０，１〜２０
μｇのＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜４０
ｍＭ）のトリス−Ｈ（１！　（ｐＨ６，０〜９．５好ま
しくはｐ　Ｈ７，０〜８．０＞、０〜２００ｍＭのＮａ
ＣＲ，２〜３０ｍＭ　（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭ
　ｇ　ＣＲ２を含む反応液中で、制限酵素０．１〜１０
０単位（好ましくは１μｇのＤＮＡに対して１〜３単位
）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素に
より異なる）において、１５分間〜２４時間行う。反応
の停止は、通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱する
ことによるが、フェノールまたはジエチルピロカーボネ
ートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法も用い
ることができる。 制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、ＬＯ
Ｔ法やポリアクリルアミドゲル電気泳動法などによって
行う。 ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍＭ（好ましくは
１０〜４０ｍＭ）のトリ、７．−Ｈ（１（ｐ　Ｈ６，１
〜９．５、好ましくはｐ　）Ｉ　７．　Ｏ〜８．０）、
２〜２０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇＣＲ２
，０，１〜１０ｍＭ　（好ましくは０．５〜２、　Ｑ　
ｍ　′Ｖ′りのＡＴＰ、１〜５０ｍＭ（好ましくは５〜
１０ｍＭ）のジチオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ
４ＤＮＡ、リガーゼ０．３〜１０−’４１位を用い、１
〜３７℃（好ましくは３〜２０℃）で１５分間〜７２時
間（好ましくは２〜２０時間）行う。 結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤ　Ｎ　Ａ
は、必要により（：ｏｈｅｎ　らの形質転換法〔ニス・
エヌ−コ−ｘ　７　（Ｓ、Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ）ら：プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　）　。 ＵＳＡ、　６９．２１１０　（１９７２）　〕によって
、大腸閑に導入する。 組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、後に述べる実施例１に示した方法あるいはバー
ンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　）らの方法〔エイチ・シ
ー・バーンボイム（Ｈ，ＣｏＢｉｒｎｂｏｉｍ　）ら：
ヌクレイック・アンド・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓ　Ｒｅｓ、　）　７　、１５１３（１９７９）］
などを用いて行う。 プラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で消化後ア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。 さらにＤＮＡの塩基配列を決定する必要がある時はマキ
サム・ギルバード法〔プロシーディング・オブ・ザ・ナ
ンヨナル・アカデミイ・オブ・サイｘンｘ　（Ｐｒｏｃ
、　　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　）、　　７
４．　５６０（１９７７）　〕またはＭ１３ファージを
用いたサンガー（Ｓａｎｇｅｒ　）法〔サンガー（Ｓａ
ｎｇｅｒ　）ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミイ・オブ・サイｘンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ＋、）　ＬＩＳＡ。 ７４、５４６３（１９７７）；　アマーンヤム（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ　）社１４１３クローニング・アンド・ンー
クエンシング・ハンドブック　（ｃｒａｎｉｎｇ　ａｎ
ｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｈａｎｄｂｏｏｋ）：］に
よって決定する。 本発明の魚類のプロラクチンペプチドは以下のとおりに
製造できる。 すなわち、プラスミド（例えばｐｓＰＲＬＢｌ　＞を用
いて大腸菌に−１２ＨＢＩＯＩを形質転換させ、アンピ
シリン耐性のコロニーの中からｐｓＰＲＬＢｌを有する
大腸菌を選びだす。ｐｓＰＲＬＢｌを有する大腸菌を培
地に培養することにより培養物中に魚類のプロラクチン
ポリペプチドを生成させることができる。 にこて用いる培地としては大腸菌の生育ならびに魚類の
プロラクチンポリペプチドの生産に好適なものならば合
成培地、天然培地のいずれも使用できる。 炭素源としては、グルコース、フラクトース。 ラクトース、クリセロール、マンニトール、ンルビトー
ルなどが、窒素源として：ま、ＮＨ，Ｃｎ。 ＜Ｎ）（４）２Ｓ○４．カザミノ酸、酵母エキス、ポリ
ペプトン、肉エキス、バタトトリブトン、コーン・°ス
テイープ・リカーなどが、その他の栄養源としては、Ｋ
、ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ，、ＮａＣｐ。 Ｍｇ５Ｏａ、ヒ゛タミンＢ＋　　、　＞Ａ　ｇ　ＣＬ　
なと”が（重用できる。 培養はｐ　Ｈ５，〜８．５．温度１８〜４０℃で通気攪
拌培養により行われる。 培養５〜９０時間で培養閑体中にンロザケブロラクチン
ボリベブチドが蓄債するので、培養物かろ菌体を集菌し
、閑体をリソチーム鷺理後、凍結、融解を繰り返して閑
体を破砕し、遠心してえられる上清から通常のポリペプ
チドの抽出方法に従ってポリペプチドを採取する。 また該ポリペプチドの検出は培養菌体を直接レム’Ｊ　
（Ｌａｅｍｍｌｉ）のサンプルバッファー〔レムリ（Ｌ
ａｅｍｍｌ　ｉ）、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、　
　２２７　、６８０（１９７０）　〕に１！１０熱、溶
解後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル〔レムｒ）　（
ｌａｅｍｍｌｉ）の方法二同上文献〕にかけ、クマシー
ブリリアントブルー染色によって行う。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例１．７０サゲ脳下重体よりのポ’Ｊ（Ａ）ＲＮ　
Ａの調製。 １０ザケｌ脳下垂体よりクアニンウムチオ７・ア不−ト
ーセンウムク１コライド法〔マニアティス（！Ｊａｎ＋
ａｔｉｓ　）ら鳩、モレキュラー−７ｏ−ニンク（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、　ｐ１９６．　　
コールド′・スプリングＨハーバ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ａｎｇ　１ｌａｒｂＯｒ　）刊。 重定勝哉、細胞工学、　２　、６１６（１９８３＞　〕
に従いポリ（Ａ）を有するＲＮＡを下記のごとく調製し
た。 シロザケの凍結脳下垂体２ｇ（約３０個体分）を４Ｍグ
アニンウムチオシアネート、０５％ザルコンン、５ｍＭ
クエン酸ナトリウム（ｐＨ７’ｌおよび０．ＩＭβ−メ
ルカプトエタノールからなる溶液１０１Ｔ１１中でテフ
ロンホモゲナイザー（５ｒ　ｐｍ）にて破砕し可溶化し
た。このホモジネートを１８Ｇ注射針に数回通してＤ　
Ｎ　Ａを分断した。５．７ＭＣ５（１，０，１Ｍ　　Ｅ
ＤＴＡ　（ｐＨ８）の溶液各１．２ｍｌを超遠心管中に
分注しておき、前記ホモジネートを重層した。旧ｔａｃ
ｈｉ　ＲＰＳ　４０　ｏ−ターにて３５，０００ｒｐｍ
　、　　１５時間遠心後、ＲＮＡを沈殿として回収した
。ＲＮＡの沈殿を１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含むトリスート
ＩＣ！（ｐＨ８，０）溶液１０１Ｔｌｌに溶解し、フェ
ノール−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿により
回収した。得られたＲＮＡ約１、ｌＴｇヲｌ　Ｑ　ｍＭ
　）　’Ｊ　、７　　Ｈ’−，２（４ｉＨ３，０）　に
ヨヒ１１ｎＭ！らｒ）　ｉ’　Ａか’）　ｊ＞　Ｌ　’
ｌ容＋ｆｔ１ｍ１に溶か（、た。 ６５℃、５分間イ〕゛←ユベー　卜シ２．０．ｉ：ｎし
）、５＼、ｌＮ２１　ＣＲを加を−たｐ　ｆ見合゛吻を
オｌｌ：′、Ｊ＜１汀）ゴールロース・カラー／＝　（
Ｐ　−、１−１Ｂ＋ｏｃｈｅｍｔｃａｉｓ社裂）７ｏマ
トクうフィー（カラム体積０．５ｍ１）にかげた３吸首
したポリ　（Ａ　）をイ］するｍ　ＲＮ　ＡをＩ　Ｃｌ
　ｍ　）ｉ　トリス−ｔ（ＣＩ！　（ｐＨ７，５）およ
び１　ｍ　Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａからなる溶液で溶出し
Ｑ、２ｍｌずつ分画した。３〜・５番目の両分を回収し
、ボＩＪ（Ａ）を杓するｍ　ＲＮ　Ａ約１０１．１ｇを
篩たつ 実施例２．　　ｃＤＮＡ合成と該ｌ［）Ｎ　Ａのベクタ
ーへの挿入。 オカヤマーハーグ（Ｏｋａｙａｍａ−ＢｓｒｌＢ　）の
方法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ
（Ｍｏｌ、ＩＪＩＩ、３　ｉ　０　ｌ、）　、　２　、
１６１（１９１３２）　）に従い、ｃＤＮＡの合成とそ
れを組み込んだ゛打換え体プラスミドの造成を行−っだ
。その工程の４Ａ１略庖・第１［スに示す。 ｐｃＤＶＩ　　Ｃオカヤ？・アンド・ハーグ（Ｏｋａｙ
ａ−ｍａ　＆　Ｂｅｒｇ　）　：　モレキュラー・アン
ド・セルラー・バイオロジイ（’、、ｌｏ１．Ｃｅ１ｌ
、Ｂｉｏ１．）、　　３．２８０（１９８３＞　　）　
　４　０　０　μｇ　を１０ｍＭ）　　リ　ス−−ｉ（
ＣＲ（ｐＨ７，５）　、６ｍＭ　　ＭｇＣＡｚおよびｌ
ｏｍ〜１Ｎ　ａ　Ｃ２からなる溶液３００μＲに加え、
さろに５００爪位のＫｐｎｉ（宝酒造社製、以不特記し
なし）限り制限酵素はすべて宝酒造社製）を加えて、３
７℃、６時間反応させ、プラスミド中のＫｐｎ１部位で
切断した。フエ／−ルークロロホルム抽出後、エタノー
ル沈殿によりＤ　Ｎ　Ａを回収した。 Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉ切断した該Ｄ　Ｎ　Ａ約２００μｇを４
０　ｍＭカコジル酸ナトリウム、３ＱｍＭ）リス−Ｈ（
１（ｐＨ６，８）、１ｍＭ　　ＣａＣＬおよびＱ、　ｌ
　ｍ　Ｍジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）
からなる緩衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する）にｄＴ
ＴＰを０．２５　ｍ　＋’Ａとなるよう加えた溶液２０
０μ正に加え、さらに８１単位のターミナルア゛オキソ
ヌクし・オチシルトランスフェラーセ（以下ＴｄＴと略
記する＞　　（Ｐ　−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社
製）を加えて、３７℃、１１分間反応させた。ここで、
ｐＣＤＶＩのＫｐｎＩ切断部位の３′末端にポリ（ｔｌ
Ｔ）鎖が約６７個付加された。該溶液からフェノール−
クロロホルム抽出、−クノール沈殿に、より、ポリ（ｄ
Ｔ）鎖の付加したｐｃＤＶＩＤＮＡ約１００　、”　ｇ
を回収した。該ＤＮｒ〜をｌＱｍＭトリスート！　Ｃｐ
（ｐＨ７，５＞、６ｍＭ　　Ｍｇ（、Ｌ、ｌ　ＯＱｍＭ
　　ＮａＣｐからなる緩衝液１．５０μｒに加ん、さら
に３６０ｔＰ位のＥＣ０ＲＩを加え、３７℃２時間反応
させた。該反応物をＬ　Ｇ　Ｔ？去で処理後、約３．　
Ｉ　Ｋ　ｂ　ｖ）ＤＮＡ断片を［弓収（−７、約６０μ
ｇのポリ（ｄ］’）口付和ｐＣＤＶ　ｉを得た。５　Ｄ
　Ｎ　Ａをｌ　ｌ）　ｍ　＞、１　トリス−＋（ｃｐ　
（ｐＨ８，［ｌｌ）および１ｍＭ　　Ｅ’ＤＴＡかみな
る溶液５００４に溶解し、６５℃５分間１．／千ユベー
ト後、・ｋ冷して５０．ｍの；）〜’ｌ　　ＮａＣ＆を
加えた。混合物を」リボ（ｄ、Ａ）セ・しＬ】−スカラ
ム（コラボラディプリサーチ社製）・７０マドグラフイ
ーにかけた。ボ’Ｊ（ｄＴ）鎖長が充分なものは力うム
に吸容し、これを１０　ｍ　Ｍ　）リス−）（Ｃ４Ｌ２
（ｐｌ（８，０）および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液で
溶出し、ポリ（ｄＴ）鎖の付加したｐＣＤＶｌ（以下べ
・′７クーブライ７−と略記する）２７μｇを７５だ、
３次にリンカ−１つＮ　Ａの調製を行った。 ｐＬｌｌ：、４カヤマ・ア〕２・ド・ハーグ（Ｏｋａｙ
ａｍａ＆　Ｂｅｒｇ）　：　モレキ２−−・アンド・セ
ルラー・ハイオロジイ（！、Ｉｏｌ、　Ｃｅ１ｌ、Ｂｉ
ｏｌ、）、　　３．２８０（１９８３）　Ｅ約１４μｇ
を１．Ｏｍ〜１トリス−１−Ｉｃｅ　（ｐＨ７，５）。 ６ｍ）、＋　　Ｍ　ｇ　ＣＲ２および５　（ｌ　ｍ〜ｊ
　　ＮａＣ，”かろなる緩衝液２ＯＬ１μＰに加え、さ
らＨ（’、　５　Ｑ　、ｉｌｊ位（７）Ｐｓｔｉを加え
、３　Ｔ”ｃ　：１時間反応させ、ｒ〕ｌ、ＩＤ　Ｎ　
Ａ中のＰｓｔ１部位で切断さけた。、＆反応物をフエ、
／−ルー　グロロホノＬム４ＢＪ　出後、了−、’Ｊ／
　−／し沈没を行い、Ｐｓｔｉで切断した１３　ｌ、ｌ
　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｌｉ’ｌ１３ｐｇを回収した。該ＤＮＡ
約１３μｇをＴｄＴ緩衝液に柊濃度０．２５ｍＭのｄＧ
ＴＰを含む溶液５０μＡに加え、さらにＴ　ｄ　Ｔ　（
Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製＞５４℃位を加
えて３７℃１３分間インキュベートし、ｐＬｌのＰｓｔ
Ｉ切断部位３′末端に（ｄＧ）鎖を約１４個付加した。 フェノール−クロロホルム抽出後エタノール沈殿にてＤ
ＮＡを回収した。 該ＤＮＡを１００．ｃｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｆ（ｐ
Ｈ７，５）　、６　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃｊ！　２およ
び６０ｍ１ＪＮａｃ！！からなる暖衡液１００μβに加
え、さらに８０単位の旧ｎｄＩＩＩを加えて３７℃３時
間インキュベートし、ｐＬ　ｌＤＮＡのＨｉ　ｎ　ｄ　
Ｉ［Ｉ部位で切断した。該反応物をアガロースゲル電気
泳動にて分画し、約０．５　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片をＤＥ
ＡＥペーパー法〔ドレツエン（Ｄｒｅｔｚｅｎ）ら、ア
ナリテイカル・バイオケミストリイ（八ｎａｌ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　）　。 １１２、２９５（１９８１）　］にて回収し、オリゴ（
ｄＧ）鎖付きのリンカ−ＤＮＡ（以下単にリンカ−ＤＮ
Ａと略記する）を得た。 上記で調製したポＩＪ（Ａ）ＲＮＡ約２μｇ、ベクター
ブライマー約１．４μｇを５３ｍＭトリス−ＨＣｆ（ｐ
Ｈ８，３）、８ｒｒ＋Ｍ　　ＭｇＣ１ｚ　、３０ｍＭ　
　Ｋ（１！、０．３ｍＭ　　ＤＴＴ、２ｍＭｄＮＴＰ　
（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）およ
び１０単位のりボスクレアー七イ：／　ヒヒ９−　（Ｐ
　−Ｌ　　Ｂ＋ｏｃｔ＋ｃｏ＋＋ｃａｌｓＰｒ、！りか
らなる溶液２２．３μｌに溶解し、１０単位の逆転写酵
素（生化学工業社製）を加え、３７℃４０分間インキュ
ベートし、ｍＲＮＡに相補的なりＮＡを合成させた。該
反応物をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈
殿を行い、ＲＮ　Ａ−Ｄ　Ｎ　Ａ二重鎖の付加したベク
タープライマーＤ　Ｎ　Ａを回収した。該ＤＮＡを６６
ｐＭｄｃＴＰおよび０．２μｇポリ（Δ）を含むＴｄＴ
緩衝液２０μｐに溶かし、１４単位のＴ　ｄ　Ｔ　（Ｐ
　−Ｌ　　Ｉｌｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加えて３
７℃８分間インキュベートし、ｃＤＮΔ３′ＤＮＡ１２
個の（ｄＣ）鎖を付加した。 該反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタノー
ル沈殿により（ｄｃ）鎖の付加したｃＤＮΔ−ベクター
プライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭトリ
ス−Ｈ（１（ｐｔ（７，５）、６ｍＭＭ　ｇ　Ｃ１２２
および６０ｍＭ　　ＮａＣｐからなる液４００μｆに溶
かし、２１位のＨｉｎｄｌｌＩを加え、３７℃２時間イ
ンキクベートし、Ｈｉｎｄｕ部位で切断したａ該反応物
をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿して
Ｑ、　５　ｐｍｏｌｅの（ｄＣ）鎖付加ｃＤＮＡ−ベク
ターブライマーＤ　Ｎ　Ａを得た。該Ｄ　Ｎ　Ａ　０．
０８　ｐｍｏｌｅおよび前記のリンカ−ＤＮＡ０．１６
　ｐｍｏｌｅをｌＱｍＭ）リス−ＨＣ１１！（ｐＨ７，
５）、０．ＩＭ　　ＮａＣ１！および１ｍＭＥＤＴＡか
らなる溶液４０μβに溶かし、６５℃。 ４２℃、０℃でそれぞれ１０分、２５分、３０分間イン
キュベートした。２０ｍＭ）リス−Ｈ（１２（ｐ　Ｈ７
，５）、４ｍ！４　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２．　１０ｄ　＜Ｎ
＋（、）２ＳＯ４，０，１Ｍ　ＫＣＩ！および０．１ｍ
Ｍβ−ＮΔＤの組成で、全通４００μβとなるよう反応
液を調製した。該反応液に１０屯位の大腸菌ＤＮＡ’Ｊ
ガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ＋ｏｌａｂｓ　ｐ
３＝製）を加え、１１℃−夜インキユベートした。該反
応液を各４０μＭのｄＮＴＰ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤ
となるよう成分を追加調製し、５単位の大腸菌ＤＮＡリ
ガーゼ、７単位の大腸菌Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ　（
Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）および２単
位の大腸菌リボヌクレアーゼＨ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ社製）を加え、１２℃、２５℃で順次１時
間ずつインキュベートした。 上記反応で、ｃＤＮΔを含む組換えＤＮＡの環状化と、
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎮のＲＮΔＮｅがＤＮＡに買換され
、完全な二重鎖ＤＮＡの組換えプラスミドが生成した。 実施例３．　シロザケブロラクチンｃＤＮＡを含む組換
えＤＮＡの選択二 実施例２で得た組換えプラスミドを用い、大腸菌Ｃ６０
０ＳＦ３株〔カメロン（Ｃａｍｅｒｎｎ）　：　プロン
−ティング・オブ・ザ・ナンヨナル・アカデミイ・オブ
・サイｘ　ンｘ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃ＋、　）　ｌｌ５Ａ。 ７２．３４１６（１，９７５）　：］を５ｃｏｔｔらの
方法〔重定勝哉：細胞工学、　２．６１６　（１９８３
）　〕に従い形質転換した。得られた約１，７００個の
コロニ・−をニトロセルロース上に固定した。ンロザケ
プロラクチンのＮ末端から１２２番目−１２７番目のア
ミノ酸配列に対応する合成りＮＡ　、すなわち （ｌＪ） （Ｃ） （６番目の塩基はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか、７番目の
塩基はＡまたはＧ１ ９番目の塩基はＴまたはＣ１ １２番目の塩基はＡまたはＧであり、 組み合わせて３２通りの合成りＮＡの混合物となる。） を３２ｐで標識したプローブに４２℃で強く会合した７
閑株を選んだ〔グルンステイン・ホブ不ス（Ｇｒ［Ｉｎ
ｓｔｅｉｎ−）Ｉｏｇｎｅｓｓ）の方法、ブロン−ディ
ング・オブ・ザ・ナンヨナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス（ＰｒＯｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、Ｓｃ
＋、）　ＩＪｓＡ、　　７２．３９ｆｉｌ（１９７５）
　〕。得られた７閑株についてサザーン（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ）の方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（Ｊ、！、Ｉｏｌ、Ｂｉｏ１．）、　９８　、
５０３（１９７５）　）により、上記プローブでの会合
が確認された。これらのプラスミドはρ５ＰＲＬ１．２
．４．　７゜８、　１０．　１１　と命名したが、いず
れもシロザケブロラクチンのアミノ酸配列から予想され
るＤ　Ｎ　Ａ、配列を有することから、プロラクチンｃ
ＤＮＡを含んでいるものと考えられた。 実施例４．　プラスミドｐｓＰＲＬ１の塩基配列：上記
で得られたプラスミド７種につき、種々の制限酵素で消
化し、ｃＤＮΔ部分の切断地図を決定した。プラスミド
ｐＳＰＲＬ１中のｃＤＮＡ（以下５ＰＲＬＩ　という）
の制限酵素地図を第２図に示す。 次に実施例３で行った合成りＮＡプローブと最も強い会
合を示し、かつほぼ完全長のｃＤＮＡを含むと考えられ
るｐＳＰＲＬ１について、その翻訳領域の全ヌクレオチ
ド配列をＭ１３ファージを用いたサンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ）法（Ｓａｎｇｅｒら：プロシーデイング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイｘ　７　ス（Ｐ
ｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　
）、　　ｔｌｓＡ。 ７４、　５４６３（１９７７）　　＋　Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ社Ｍ１３　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ　ｈａｎｄｂｏｏｋ　）に従って決定した。ヌクレ
オチド配列を第−表に示す。第一表中、塩基数１−６９
力（ン・グナルペプ千ドを、７０＝６３０がシロザケプ
ロラクチンの成熟ベブ千ドをコードする。 ｐＳＰＲＬ１に含まれるｃＤＮＡ配列から予想されるア
ミノ酸配列は、天然のンロザケブロラクチンかみ決定さ
れているアミノ酸配列の一部と完全ｊニ一致し、該ｃ　
Ｉ）　Ｎ　Ａはシロザケプロラクチンをコードしている
ことが確認された。 ｐｓＰＲｌ、ｌを含む大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉＥＳＰＲＬＩ（旺ＲＭ　ＢＰ−７７６）と
して工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に昭和
６０年４月２６日付で寄託しである。 （以下余白） 実施例５．　ンロザケブロラタチンをコードする組換え
体プラスミドの造成： （１）　　ｐｓＰＲｌｌから成熟シロザケブロラクチン
をコードする組換え体プラスミドｐｓＰＲＬＢ１の造成
コンロサケプロラクチンをコードするＤＮＡを含むブー
ｙＺ　ミｔ’　ｐＳＰＲＬ１　　１０ｇを１［）ｍＭ）
リスＨＣｎ　（ｐＨ７，５）、　７ｍ１Ａ　　ＭｇＣｊ
’２、および１００ｍＭ　　ＮａＣ１を含む溶液（以下
”ｌ−１００緩衝液と略す）１００ｍに溶かし、制限酵
素Ｈｉｎｄｌｌｌ（東洋紡績社製）３０単位を加え、３
７℃２時間消化反応を行った。該反応液からＬＧＴ法に
より、ｐＳＰＲＬ１でコードされるプロラクチンのＮ末
端側、５′非闘訳領域およびベクタ一部分を含む約０．
７ＫｂのＤＮＡ断片約１ＪｕＺを得た。この０．７Ｋｂ
のＤＮＡをＹｉ００緩衝液２０ρに溶かし、制限酵素Ｈ
ａ　ｅＩ１１３単位を加え３７℃２時間消化反応を行っ
た。この反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳動後、
ガラスフィルタール適法でＮ末端付近に相当する４３ｂ
ｐのＤＮＡ断片約０．１ｌＩｇを得た。 次にｐｓＰＲｌｌ　　２■をＹ−１００緩衝液３０ｍに
溶かし、Ｂａｎ１１１（３単位、ＨｉｎｄＩＩ［１６単
位を加え、３７℃で２時間消化反応を行った。 該反応液からＬ　Ｇ　Ｔ法により、ｐｓＰＲｌｌでコー
ドされるシロザケプロラクチンのＣ末端側、３′−非翻
訳領域およびベクタ一部分を含む約３．７ＫｂのＤＮＡ
断片約１．０■を得た。 一方成熟シロザケブロラクチンをコードするＤＮＡの発
現に必要な翻訳開始コドンΔＴＯを付加し、さらにベク
ターＤＮＡと上記ＤＮＡを連結する目的で下記のＤＮＡ
リンカ−を合成した。 まず−末鎖ＤＮＡ　１８ｍｅｒと１６ｍｅｒを通常のト
リエステル法〔アール・フレア（Ｒ，Ｃｒｅａ）ら：プ
ロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカテ′ミイ
’オブ・サイエンス（Ｐｒｏｅ、　　Ｎａｔｌ、八ｃａ
ｄ。 Ｓｃｉ、　）、　［ＩＳＡ、ユ５７６５（１９７８）　
’］により合成した。 １３ｍｅｒおよび１５ｍｅｒの一本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ各々４
０ｐｍｏｌｅを５０ｍ＋ａトリスーＨＣβ　（ｐＨ７，
５）　　ｌ　Ｏｍｌ、１ＭｇＣβ２　、１０ｍＭ　　Ｄ
ＴＴおよび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む溶液２０薦に溶かし
、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼく宝酒造社製）６単位
を加え、３７℃、３０分間リン酸化反応を行った。 上記で得たｐｓＰＲＬ１由来のＨａｅ［−Ｈ１ｎｄ！Ｉ
Ｉ断片（４３ｂｐ）　０．０８ｐｍｏｌｅ　、　Ｂ　ａ
　ｎ　ＩＩＩ　−Ｈ＋ｎｄＩＩＩ断片（約３．７Ｋｂ＞
　０．０２ｐｍｏｌｅを５ｆ）ｍ＋、！トリフ１（ＣＡ
（ｐ）（７，５）、１０ｍＭＭｇＣρ２．１０ｍ１Ｊ　
　ＤＴＴおよび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む溶液３０層に溶
かし、これに上記の合成りＮＡ！Ｊン酸化反応液５犀を
加えた。この混合液にＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ（宝酒造社
製）６単位を加え、４℃１８時間結合反応を行った。該
反応液を用いて大腸菌に２９４株を形質転換しＡｐＲの
コロニーを得、このコロニーよりプラスミドＤＮＡを回
収し、第３図に示したｐＳＰＲＬＡ６を得た。ｐＳＰＲ
ＬＡ６の構造は、Ｐｓｔ　Ｉ　、　ＢａｍＨＩ　。 ＥｃｏＲ丁、３ａｎ　■、Ｂｇｌ　ＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断して、アガロースゲル電気泳動にて確認した。 （２）　　ｐｓＰＲＬＡ６の成熟シロザケブロラクチン
をコードする領域の発現ベクターｐＧＥＬ１への組み込
み＝ｐＳＰＲＬＡ６　２■を３０４のＹ−１００緩衝液
に溶かし、ＢａｍＨＩとＢａｎ　ＩＩＩを各々８単位加
え、３７℃３時間消化反応を行った。該反応液からＬＧ
Ｔ法により、成熟ンロヂケブロラクチン全体をコードす
る約１．２ＫＭ’）ＤＮＡ断片約０．１μｇを得た。 別にｐＧＥＬｌ　　２μｇを４０４のＹ−１００緩衝液
に溶かし、Ｂａｍ）ＩＩ　（！：　Ｂａｎ１ｌＩとを各
々１０単位加え、３７℃３時間消化反応を行った。この
反応液からＬＧＴ法によりトリプトファンプロモーター
を含む約２，７ＫｂのＤＮＡ断片約０，２■を得た。 上記で得たｐＳＰＲＬＡ６のＢａｎ　ｍ　−ＢａｍＨＩ
　断片約１．２Ｋｂ　　０．０１ｇとｐＧＥＬｌのＢａ
ｎ　ＩＩＩ　−ＢａｍＨ！断片（約２．７Ｋｂ）　０．
０１５ｌＩｇを５０ｍ＋、ＩトリスーＨＣｆ　（ｐＨ７
，５）　、　１０ｍ１Ｊ　　ＭｇＣｊ２２．１０耐ＩＤ
ＴＴおよび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む溶液２０城に溶かし
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ６、ＩＩ位を加え、４℃、１８時
間結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌に２９４株を形質転換しＡｐ″
のコロニーを得、このコロニーよりプラスミドＤＮＡを
回収し、第３図に示したｐｓＰＲＬＢｌを得た。ｐｓＰ
ＲＬＢｌの構造はＥｃｏＲＩ　。 旧ｎｄｎＩ、Ｂａｎ　ＩＩＩ、Ｐｓｔ　Ｉ　、ＢａｍＨ
Ｉで切断してアガロースゲル電気泳動にて確認した。 実施例６．　　ｐｓＰＲＬＢｌを含む大腸菌によるシロ
ザケブロラクチンベブチドの生産： 実施例５で得た組換え体プラスミドｐｓＰＲＬＢ１を用
い常法により大腸ｍＷ　３１１０ｓｔｒＡ株（Ｆ　８Ｒ
ＭＢＰ−７３２）を形質転換した。得られたＡｐＨコロ
ニーを８＋ｎｌのＭＣＧ培地〔０，６％Ｎａ２１１ＰＯ
＜、０．３％ＫＨ２ＰＯ４，０，５％ＮａＣβ、０，１
　％ＮＨ，ｌＪ、　０．５％グルコース、０４５　％　
カザミノ酸、　　１ｍ！、１１．１ｇ５０４゜４ｕｇ／
ｍ！ビタミン３．　　、　ｐＨ７，２：ｌに接手重し、
３０℃で１８時間培養した。得られた培養液をｇ、　ｏ
ｏ。 ｒｐｍ、　１０分間遠心して菌体を回収した。この菌体
をＬａｅｍｍｌｉの勺ンプルバッファーに懸濁後、５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマンー
ブリリアントブルーにて染色して、分子量約２７．００
０の部位にポリペプチドバンドを検出した。このハンド
は該プラスミドを含まない大腸菌を用いた場合には存在
しなかった。この結果、ｐｓＰＲＬＢｌを保有する大腸
菌はシロザケブロラクチンボリペプチドを大量に生産し
ていることがわかった。 ｐｓＰＲＬＢｌを含む大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉＥＳＰＲＬＢＩ（ＦＩＥＲＭ　ＢＰ−７７
７）として、微工研に昭和６０年４月２６日付で寄託し
である。 発明の効果 本発明によれば、魚類のプロラクチンペプチドをコード
するＤ　Ｎ　Ａを組み込んだ組換え体ＤＮＡ。 板組換え体ＤＮＡを含む微生物が得られ、これらは魚類
のプロラクチンポリペプチドの大量生産に利用すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図（１）および（２）はオカヤマーハーグ法による
ｃｌ）ＮＡ合成と該ＤＮＡを含む組換え体プラスミドの
造成過程の慨略を示す。 第２図はｐＳＰＲＬ１に含まれるンロザ゛ケブロラクチ
ンをコードするｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。 第３図は組換え体プラスミドｐＳＰＲＬＡ６．　ｐｓＰ
ＲＬＢｌの造成過程を示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵上業株式会社￥ＪＩ ＩＫｐｎｒ哨化　　　　　　　　　　ｔｐｓｔＪｉ仁ｌ
　ＥｃｏＲＬ：？％’ｌｌヒ　　　　　　　　　　　　
　　　１ＨｌｎｄＬＩび肖ＩＬベアクーブライマーＤＩ
すＡ ゛「口”Ｔ　　　　　ｍＲＮＡ ＡＡＡＡ　　−−−−−−−−−−−−手続ネｍ正書（
方式） 昭和６１年２月　７日 １　事件の表示 昭和６０年特許願第２２７５３１号 ２　発明の名称 魚類のプロラクチンポリペプチド ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　　１００ 住　所　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名　称　
（１０２）協和醗酵工業株式会社昭和６１年１月８日（
発送日二同６１年１月２８日）５　補正の対象

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１表に示したペプチド配列を有する魚類のプロ
   ラクチンポリペプチド
2. （２）魚類のプロラクチンがニシン類（Ｃｌｕｐｅｉｆ
   ｏｒｍｅｓ）の成長促進効果を有するホルモンである特
   許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
3. （３）魚類のプロラクチンポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡ。
4. （４）魚類のプロラクチンポリペプチドが第１表に示し
   たペプチド配列を有する特許請求の範囲第３項記載のＤ
   ＮＡ。
5. （５）第１表に示したペプチド配列を有する魚類のプロ
   ラクチンポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ
   組換え体ＤＮＡ。
6. （６）プラスミドｐＳＰＲＬ１と名づけた特許請求の範
   囲第５項記載の組換え体ＤＮＡ。
7. （７）第１表に示したペプチド配列を有する魚類のプロ
   ラクチンポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ
   組換え体ＤＮＡを含む微生物。
8. （８）該微生物がエッシェリヒア・コリに属する特許請
   求の範囲第７項記載の微生物。
9. （９）魚類のプロラクチンポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物を栄養培
   地に培養し、該培養物中に魚類のプロラクチンポリペプ
   チドを蓄積せしめ、該培養物から該ポリペプチドを採取
   することを特徴とする魚類のプロラクチンポリペプチド
   の製造法。