JP2533470B2 - 豚成長ホルモンを生産するためのｄｎａ配列，組換ｄｎａ分子および生産方法 - Google Patents
豚成長ホルモンを生産するためのｄｎａ配列，組換ｄｎａ分子および生産方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
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Description
【発明の詳細な説明】 豚成長ホルモンの成長促進性生物学的活性を示すポリ
ペプチドを生産するDNA配列、組換DNA分子ならびにそれ
らにより形質転換される宿主につき開示する。これらの
ポリペプチドは、豚の成長速度ならびに豚の肉生産およ
び品質を改善するのに有用である。
ペプチドを生産するDNA配列、組換DNA分子ならびにそれ
らにより形質転換される宿主につき開示する。これらの
ポリペプチドは、豚の成長速度ならびに豚の肉生産およ
び品質を改善するのに有用である。
本発明は、豚成長ホルモンおよび豚成長ホルモン用ポ
リペプチドを生産するためのDNA配列、組換DNA分子およ
びその生産方法に関するものである。さらに詳細には、
本発明は適当な宿主において発現されるDNA配列および
その発現により生成される生産物に関するものである。
本発明のDNA配列および組換DNA分子は、豚成長ホルモン
の成長促進性生物学的活性を有するポリペプチドを暗号
化することを特徴とする。以下の記載から判るように、
本発明のDNA配列、組換DNA分子および方法は豚における
一般的同化作用剤として有用なポリペプチドの生産にお
いて、特にこれらの動物の成長速度、体重増加および肉
生産を増大させるために使用することができる。
リペプチドを生産するためのDNA配列、組換DNA分子およ
びその生産方法に関するものである。さらに詳細には、
本発明は適当な宿主において発現されるDNA配列および
その発現により生成される生産物に関するものである。
本発明のDNA配列および組換DNA分子は、豚成長ホルモン
の成長促進性生物学的活性を有するポリペプチドを暗号
化することを特徴とする。以下の記載から判るように、
本発明のDNA配列、組換DNA分子および方法は豚における
一般的同化作用剤として有用なポリペプチドの生産にお
いて、特にこれらの動物の成長速度、体重増加および肉
生産を増大させるために使用することができる。
豚成長ホルモン（「SGH」）は、脳下垂体の前葉で合
成され、そこから分泌されるポリペプチドホルモンであ
る。SGHは、先駆蛋白質（豚前成長ホルモン）として合
成されかつホルモンが血流中へ分泌されかつ放出される
際に豚成長ホルモンまで成熟すると信じられる。豚成長
ホルモンの部分的アミノ酸配列は既に報告されている
〔ジエー・ビー・ミルス等、「豚成長ホルモンの臭化シ
アノ−ゲン開裂および部分的アミノ酸配列」、ジヤーナ
ル・バイオロジカル・ケミストリー、第245巻、第3407-
15頁（1970）；エー・イー・ウイルヘルムおよびジエー
・ビー・ミルス、「豚成長ホルモンの主構造に関する研
究」、グロース・アンド・グロースホルモン、エー・ペ
シルおよびイー・イー・ミユラー編、アムステルダム、
エクセルプダメジカ・フアンデーシヨン（1972）、第38
-41頁、インターナシヨナル・コングレス・シリーズ
第244号〕。
成され、そこから分泌されるポリペプチドホルモンであ
る。SGHは、先駆蛋白質（豚前成長ホルモン）として合
成されかつホルモンが血流中へ分泌されかつ放出される
際に豚成長ホルモンまで成熟すると信じられる。豚成長
ホルモンの部分的アミノ酸配列は既に報告されている
〔ジエー・ビー・ミルス等、「豚成長ホルモンの臭化シ
アノ−ゲン開裂および部分的アミノ酸配列」、ジヤーナ
ル・バイオロジカル・ケミストリー、第245巻、第3407-
15頁（1970）；エー・イー・ウイルヘルムおよびジエー
・ビー・ミルス、「豚成長ホルモンの主構造に関する研
究」、グロース・アンド・グロースホルモン、エー・ペ
シルおよびイー・イー・ミユラー編、アムステルダム、
エクセルプダメジカ・フアンデーシヨン（1972）、第38
-41頁、インターナシヨナル・コングレス・シリーズ
第244号〕。
成長ホルモンは一般に生命サイクル全体にわたつて生
産されるが、明らかに成体前の期間において多量に生産
される。これらホルモンは骨格の成長、窒素保持、蛋白
質合成を促進し、さらにグルコースおよび脂質の代謝に
影響を与えることが知られている。したがつて、成長ホ
ルモンは一般的な同化作用剤として認識されている。
産されるが、明らかに成体前の期間において多量に生産
される。これらホルモンは骨格の成長、窒素保持、蛋白
質合成を促進し、さらにグルコースおよび脂質の代謝に
影響を与えることが知られている。したがつて、成長ホ
ルモンは一般的な同化作用剤として認識されている。
成長ホルモンは若干特異的な種類のものである。しか
しながら、或る種の動物からの成長ホルモンは、他の種
類の動物において発生規模に関し生物学的に活性が低い
ことがある。成長ホルモン活性のメカニズムは充分には
理解されていないが、成長ホルモンの投与は動物の成長
速度、体重増加および肉生産を著しく増大させることが
示されている。たとえば、或る試験において、精製豚成
長ホルモンを毎日注射した豚における体重増加の平均速
度は１日当り2.26ポンドであつた（これは比較豚におけ
る2.19ポンド／日の平均体重増加に対比される）。より
重要なことに、処理された豚は比較豚よりも１日当りの
餌消費量が著しく少ない（8.40ポンドに比較して7.03ポ
ンド）。さらに、処理した豚は死体品質における著しい
改善を示した。成長ホルモンで処理した豚の死体は平均
して30.57インチの長さを示し、かつ背脂肪の厚さは1.4
0インチを有したのに対し、比較豚のそれは平均して29.
33インチの長さおよび1.77インチの背脂肪を有した。可
食肉の化学組成も成長ホルモン処理した動物において著
しく改善され、すなわち蛋白質13.50％、水分49.13％お
よび脂肪36.76％であるのに対し、比較群においては蛋
白質10.8％、水分39.43％および脂肪49.27％であつた
〔イー・ジエー・ターマン、「豚に対する脳下垂体前葉
成長ホルモンの効果」、論文；ブルジユ大学（1953年４
月）〕。
しながら、或る種の動物からの成長ホルモンは、他の種
類の動物において発生規模に関し生物学的に活性が低い
ことがある。成長ホルモン活性のメカニズムは充分には
理解されていないが、成長ホルモンの投与は動物の成長
速度、体重増加および肉生産を著しく増大させることが
示されている。たとえば、或る試験において、精製豚成
長ホルモンを毎日注射した豚における体重増加の平均速
度は１日当り2.26ポンドであつた（これは比較豚におけ
る2.19ポンド／日の平均体重増加に対比される）。より
重要なことに、処理された豚は比較豚よりも１日当りの
餌消費量が著しく少ない（8.40ポンドに比較して7.03ポ
ンド）。さらに、処理した豚は死体品質における著しい
改善を示した。成長ホルモンで処理した豚の死体は平均
して30.57インチの長さを示し、かつ背脂肪の厚さは1.4
0インチを有したのに対し、比較豚のそれは平均して29.
33インチの長さおよび1.77インチの背脂肪を有した。可
食肉の化学組成も成長ホルモン処理した動物において著
しく改善され、すなわち蛋白質13.50％、水分49.13％お
よび脂肪36.76％であるのに対し、比較群においては蛋
白質10.8％、水分39.43％および脂肪49.27％であつた
〔イー・ジエー・ターマン、「豚に対する脳下垂体前葉
成長ホルモンの効果」、論文；ブルジユ大学（1953年４
月）〕。
残念ながら、豚成長ホルモンを使用する豚における前
記の改善された成長および肉生産は、SGHの入手が不充
分であるため広く実現化することができない。今日、SG
Hは豚の脳下垂体腺から抽出される。要するに、この原
料は、SGHの必要とされる産業的量を与えるには殆ど不
充分である。
記の改善された成長および肉生産は、SGHの入手が不充
分であるため広く実現化することができない。今日、SG
Hは豚の脳下垂体腺から抽出される。要するに、この原
料は、SGHの必要とされる産業的量を与えるには殆ど不
充分である。
分子生物学における最近の進歩は、特異的な非細菌性
蛋白質を暗号化するDNAを細菌細胞中へ導入することを
可能にした。一般に、化学合成で製造されるもの以外の
DNAをもちいるこの種の組換DNA分子の作成は、所望蛋白
質を暗号化するメツセンジヤRNA（mRNA）の単一鎖DNAコ
ピー（cDNA）を生成させ、このcDNAを二重鎖DNAに変換
し、この二重鎖cDNAを適当なクローン化ベヒクルにおけ
る適当な部位に結合させて組換DNA分子を生成させ、か
つこの組換DNA分子により適当な宿主を形質転換させる
工程からなつている。かくして、形質転換宿主の培養
は、この宿主がDNA配列を発現しかつ所望蛋白質を生産
することを可能にする。
蛋白質を暗号化するDNAを細菌細胞中へ導入することを
可能にした。一般に、化学合成で製造されるもの以外の
DNAをもちいるこの種の組換DNA分子の作成は、所望蛋白
質を暗号化するメツセンジヤRNA（mRNA）の単一鎖DNAコ
ピー（cDNA）を生成させ、このcDNAを二重鎖DNAに変換
し、この二重鎖cDNAを適当なクローン化ベヒクルにおけ
る適当な部位に結合させて組換DNA分子を生成させ、か
つこの組換DNA分子により適当な宿主を形質転換させる
工程からなつている。かくして、形質転換宿主の培養
は、この宿主がDNA配列を発現しかつ所望蛋白質を生産
することを可能にする。
組換DNA技術を用いる幾つかの非細菌性蛋白質の生産
が報告されている。これらには、牛前成長ホルモン〔た
とえば、ダブリユー・エル・ミラー等「ウシ成長ホルモ
ンmRNAに対して相補的なDNAの分子クローン化」、ジヤ
ーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第255巻、第7
521-24頁（1980）、ヨーロツパ特許出願第47600号およ
び英国特許出願第2073245A号〕およびひと前成長ホルモ
ン〔たとえば、ジエー・エー・マーシヤル等、「ひと成
長ホルモン：細菌における補完的DNAクローン化および
発現」、サイエンス誌、第205巻、第602-06頁（1979）
およびヨーロツパ特許出願第20147号〕が包含される。
が報告されている。これらには、牛前成長ホルモン〔た
とえば、ダブリユー・エル・ミラー等「ウシ成長ホルモ
ンmRNAに対して相補的なDNAの分子クローン化」、ジヤ
ーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第255巻、第7
521-24頁（1980）、ヨーロツパ特許出願第47600号およ
び英国特許出願第2073245A号〕およびひと前成長ホルモ
ン〔たとえば、ジエー・エー・マーシヤル等、「ひと成
長ホルモン：細菌における補完的DNAクローン化および
発現」、サイエンス誌、第205巻、第602-06頁（1979）
およびヨーロツパ特許出願第20147号〕が包含される。
しかしながら、これら組換DNAはいずれも本発明にお
けるような豚成長ホルモンポリペプチドもしくは豚成長
ホルモン様ポリペプチド或いはこれら豚成長ホルモンも
しくは豚成長ホルモン様ポリペプチドが産業的量で入手
しえれば達成されるような肉生産における著しい改善に
関するものでない。
けるような豚成長ホルモンポリペプチドもしくは豚成長
ホルモン様ポリペプチド或いはこれら豚成長ホルモンも
しくは豚成長ホルモン様ポリペプチドが産業的量で入手
しえれば達成されるような肉生産における著しい改善に
関するものでない。
本発明は、SGHまたはSGH様ポリペプチドを暗号化する
DNA配列を単離しかつこれら配列を適当な宿主中で発現
させてSGHの成長促進性生物学的活性を示すポリペプチ
ドを生産させることにより上記の問題を解決する。
DNA配列を単離しかつこれら配列を適当な宿主中で発現
させてSGHの成長促進性生物学的活性を示すポリペプチ
ドを生産させることにより上記の問題を解決する。
本発明によれば、豚の成長速度および肉生産を増大さ
せる種々の用途に使用するため、SGHの活性を示すポリ
ペプチドを産業的量で得ることが初めて可能になつた。
せる種々の用途に使用するため、SGHの活性を示すポリ
ペプチドを産業的量で得ることが初めて可能になつた。
以下の記載から判るように、本発明のDNA配列および
組換DNA分子は、適当な宿主における豚成長ホルモンま
たは豚成長様ポリペプチド、すなわちSGHの成長促進性
生物学的活性を示すポリペプチドの生産を可能にする。
本発明のポリペプチドは、宿主中で生産されたままの形
態において、或いは組成および豚における成長速度およ
び肉生産の改善方法を改変した後に使用することができ
る。
組換DNA分子は、適当な宿主における豚成長ホルモンま
たは豚成長様ポリペプチド、すなわちSGHの成長促進性
生物学的活性を示すポリペプチドの生産を可能にする。
本発明のポリペプチドは、宿主中で生産されたままの形
態において、或いは組成および豚における成長速度およ
び肉生産の改善方法を改変した後に使用することができ
る。
したがつて、上記から判かるように、本発明の基本的
面は、SGHの成長促進性生物学的活性を示すポリペプチ
ドを暗号化することを特徴とするDNA配列の製造であ
る。この種のDNA配列はpBR322（Pst）/SGH-9D,pSGH−Δ
7,pSGH-（Met-Phe）のDNA挿入物、これら挿入物にヒブ
リド化しかつSGH様ポリペプチドを暗号化するDNA配列な
らびに前記DNA配列もしくは挿入物のいずれかにより発
現の際に暗号化されたポリペプチドを発現に際し暗号化
するDNA配列よりなる群から選択される。
面は、SGHの成長促進性生物学的活性を示すポリペプチ
ドを暗号化することを特徴とするDNA配列の製造であ
る。この種のDNA配列はpBR322（Pst）/SGH-9D,pSGH−Δ
7,pSGH-（Met-Phe）のDNA挿入物、これら挿入物にヒブ
リド化しかつSGH様ポリペプチドを暗号化するDNA配列な
らびに前記DNA配列もしくは挿入物のいずれかにより発
現の際に暗号化されたポリペプチドを発現に際し暗号化
するDNA配列よりなる群から選択される。
本発明を一層よく理解するよう、以下詳細に説明す
る。
る。
以下の説明において、次の用語を使用する： ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐酸と含窒素
複素環塩基とよりなるDNAもしくはRNAのモノマー単位。
この塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を
介して糖成分に結合される。塩基と糖との組合せをヌク
レオチドと呼ぶ。各ヌクレオチドはその塩基により特性
化される。４種のDNA塩基はアデニン（「Ａ」）、グア
ニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）およびチミン
（「Ｔ」）である。４種のRNA塩基はA,G,Cおよびウラシ
ル（「Ｕ」）である。
複素環塩基とよりなるDNAもしくはRNAのモノマー単位。
この塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を
介して糖成分に結合される。塩基と糖との組合せをヌク
レオチドと呼ぶ。各ヌクレオチドはその塩基により特性
化される。４種のDNA塩基はアデニン（「Ａ」）、グア
ニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）およびチミン
（「Ｔ」）である。４種のRNA塩基はA,G,Cおよびウラシ
ル（「Ｕ」）である。
DNA配列：隣接ペントースと３′炭素と５′炭素との
間でホスホジエステル結合により互いに結合されたヌク
レオチドの線状列。
間でホスホジエステル結合により互いに結合されたヌク
レオチドの線状列。
コドン:mRNAを介してアミノ酸、翻訳開始信号または
翻訳停止信号を暗号化する３個のヌクレオチド（トリプ
レツト）のDNA配列。たとえば、ヌクレオチドトリプレ
ツトTTA,TTG,CTT,CTC,CTAおよびCTGはアミノ酸ロイシン
（「Leu」）を暗号化し、TAG,TAAおよびTGAは翻訳停止
信号であり、またATGは翻訳開始信号である。
翻訳停止信号を暗号化する３個のヌクレオチド（トリプ
レツト）のDNA配列。たとえば、ヌクレオチドトリプレ
ツトTTA,TTG,CTT,CTC,CTAおよびCTGはアミノ酸ロイシン
（「Leu」）を暗号化し、TAG,TAAおよびTGAは翻訳停止
信号であり、またATGは翻訳開始信号である。
読枠:mRNAをアミノ酸配列まで翻訳する際のコドンの
グループ化。翻訳の際、適正な読枠を維持しなければな
らない。たとえば、配列GCTGGTTGTAAGは３つの読枠もし
くは相で翻訳することができる。これら相のそれぞれは
次の異なるアミノ酸配列を与える：GCT GGT TGT AAG‐‐Ala-Gly-Cys-Lys ＧCTG GTT GTAAG--Leu-Val-Val GCTGG TTG TAAG--Trp-Leu-（停止） ポリペプチド：隣接アミノ酸のα−アミノ基とカルボ
キシ基との間でペプチド結合により互いに接続されたア
ミノ酸の線状列。
グループ化。翻訳の際、適正な読枠を維持しなければな
らない。たとえば、配列GCTGGTTGTAAGは３つの読枠もし
くは相で翻訳することができる。これら相のそれぞれは
次の異なるアミノ酸配列を与える：GCT GGT TGT AAG‐‐Ala-Gly-Cys-Lys ＧCTG GTT GTAAG--Leu-Val-Val GCTGG TTG TAAG--Trp-Leu-（停止） ポリペプチド：隣接アミノ酸のα−アミノ基とカルボ
キシ基との間でペプチド結合により互いに接続されたア
ミノ酸の線状列。
ゲノム：細胞またはウイルスの全DNA。これは特に物
質のポリペプチドを暗号化する遺伝子、ならびにオペレ
ータ、プロモータおよびリボソホーム結合かつ相互作用
配列を包含し、たとえばシヤイン−ダルガルノ配列のよ
うな配列をも含む。
質のポリペプチドを暗号化する遺伝子、ならびにオペレ
ータ、プロモータおよびリボソホーム結合かつ相互作用
配列を包含し、たとえばシヤイン−ダルガルノ配列のよ
うな配列をも含む。
遺伝子：雛型またはメツセンジヤーRNA（「mRNA」）
を介して特定のポリペプチドに特性的なアミノ酸の配列
を暗号化するDNA配列。
を介して特定のポリペプチドに特性的なアミノ酸の配列
を暗号化するDNA配列。
転写：遺伝子からmRNAを生産する過程。
翻訳:mRNAからポリペプチドを生産する過程。
発現:DNA配列もしくは遺伝子によりポリペプチドを生
産するために受ける過程。これは転写と翻訳との組合せ
である。
産するために受ける過程。これは転写と翻訳との組合せ
である。
プラスミド：プラスミドが宿主細胞で複製されるよう
な完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎖DNA配
列。プラスミドを単細胞生物内に挿入すると、この生物
の特性はプラスミドのDNAの結果として変化し、或いは
形質転換することができる。たとえば、テトラサイクリ
ン耐性（TetR）に対する遺伝子を有するプラスミドは、
予めテトラサイクリンに対し感受性の細胞をテトラサイ
クリンに対し耐性の細胞まで形質転換することができ
る。プラスミドにより形質転換された細胞を「形質転換
体」と呼ぶ。
な完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎖DNA配
列。プラスミドを単細胞生物内に挿入すると、この生物
の特性はプラスミドのDNAの結果として変化し、或いは
形質転換することができる。たとえば、テトラサイクリ
ン耐性（TetR）に対する遺伝子を有するプラスミドは、
予めテトラサイクリンに対し感受性の細胞をテトラサイ
クリンに対し耐性の細胞まで形質転換することができ
る。プラスミドにより形質転換された細胞を「形質転換
体」と呼ぶ。
フアージまたはバクテリオフアージ：細菌性ウイルス
であつて、その多くは蛋白質エンベロプまたはコート
（「カプシド」）にカプセル化されたDNA配列よりなつ
ている。
であつて、その多くは蛋白質エンベロプまたはコート
（「カプシド」）にカプセル化されたDNA配列よりなつ
ている。
クローン化ベヒクル：宿主細胞において複製しうるプ
ラスミド、フアージDNAまたはその他のDNA配列であつ
て、これはDNAの本質的生物学機能、たとえば複製、コ
ート蛋白質の生成の喪失を伴なわずに、或いはプロモー
タもしくは結合部位の喪失を伴なわずに決定可能に前記
DNA配列を切断することができ、かつ形質転換細胞の同
定に使用するのに適する標識、たとえばテトラサイクリ
ン耐性またはアンピシリン耐性を有する１個もしくは少
数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とする。クロー
ン化ベヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。
ラスミド、フアージDNAまたはその他のDNA配列であつ
て、これはDNAの本質的生物学機能、たとえば複製、コ
ート蛋白質の生成の喪失を伴なわずに、或いはプロモー
タもしくは結合部位の喪失を伴なわずに決定可能に前記
DNA配列を切断することができ、かつ形質転換細胞の同
定に使用するのに適する標識、たとえばテトラサイクリ
ン耐性またはアンピシリン耐性を有する１個もしくは少
数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とする。クロー
ン化ベヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。
クローン化：前記１種の生物もしくは配列から誘導さ
れる生物またはDNA配列の集落を無性繁殖によつて得る
過程。
れる生物またはDNA配列の集落を無性繁殖によつて得る
過程。
組換DNA分子またはヒブリドDNA:生細胞の外部で端部
結合されておりかつ或る種の宿主細胞に感染してそこに
維持される能力を有する異なるゲノムからのDNA断片よ
りなる分子。
結合されておりかつ或る種の宿主細胞に感染してそこに
維持される能力を有する異なるゲノムからのDNA断片よ
りなる分子。
発現制御配列:DNA配列もしくは遺伝子の発現を、これ
ら配列に作用結合された際、制御かつ調整するヌクレオ
チドの配列。これらはフアージλのlac系、trp系、主オ
ペレータおよびプロモータ領域、fdコート蛋白質の制御
領域、ならびに原子核もしくは成熟核細胞およびそのウ
イルスの遺伝子の発現を制御することが知られたその他
の配列またはそれらの組合せを包含する。
ら配列に作用結合された際、制御かつ調整するヌクレオ
チドの配列。これらはフアージλのlac系、trp系、主オ
ペレータおよびプロモータ領域、fdコート蛋白質の制御
領域、ならびに原子核もしくは成熟核細胞およびそのウ
イルスの遺伝子の発現を制御することが知られたその他
の配列またはそれらの組合せを包含する。
SGH:豚成長ホルモン。
SGH様ポリペプチド:SGHの成長促進性生物学的活性を
示すポリペプチド。
示すポリペプチド。
第１図は組換DNA分子の混合物を製造するための方法
の１具体例の略図であり、これら組換DNA分子の幾つか
はSGHまたはSGH様ポリペプチドを暗号化する挿入DNA配
列を特徴とする。
の１具体例の略図であり、これら組換DNA分子の幾つか
はSGHまたはSGH様ポリペプチドを暗号化する挿入DNA配
列を特徴とする。
ポリA+RNA含有の豚成長ホルモンmRNA（SGH-mRNA）の製
造 ドライアイス中で凍結された４〜6gの豚脳下垂体前葉
腺（ペルフリーズ社、アーカンサス州）を、5Mのチオシ
アン酸グアニジウムと50mMのクエン酸ナトリウムと、0.
5％のナトリウムラウリルサルコシルと0.1Mのβ−メル
カプトエタノールとからなる溶液へ加えた（10mg/g脳下
垂体腺）〔ジエー・エム・チヤーグウイン等、バイオケ
ミストリー、第18巻、第5294-99頁（1979）〕。次い
で、これらの脳下垂体腺をその溶液中で４℃まで解凍さ
せ、かつこの混合物を20秒間６回破裂させてホモジナイ
ズした（ポリトロン）。このホモジナイズ物を遠心分離
した後（ソルバール型遠心分離器、6000rpm、5min、室
温）、7.0mlの核酸含有上澄液を2.5mlのCsCl（0.1MのED
TA中0.5M）の上に層状化させ、これをパラフイン油で覆
つた。次いで、この試験管を遠心分離して（SW41型、30
000rpm、18時間、20℃）RNA含有フラクシヨンをペレツ
ト化させた。
造 ドライアイス中で凍結された４〜6gの豚脳下垂体前葉
腺（ペルフリーズ社、アーカンサス州）を、5Mのチオシ
アン酸グアニジウムと50mMのクエン酸ナトリウムと、0.
5％のナトリウムラウリルサルコシルと0.1Mのβ−メル
カプトエタノールとからなる溶液へ加えた（10mg/g脳下
垂体腺）〔ジエー・エム・チヤーグウイン等、バイオケ
ミストリー、第18巻、第5294-99頁（1979）〕。次い
で、これらの脳下垂体腺をその溶液中で４℃まで解凍さ
せ、かつこの混合物を20秒間６回破裂させてホモジナイ
ズした（ポリトロン）。このホモジナイズ物を遠心分離
した後（ソルバール型遠心分離器、6000rpm、5min、室
温）、7.0mlの核酸含有上澄液を2.5mlのCsCl（0.1MのED
TA中0.5M）の上に層状化させ、これをパラフイン油で覆
つた。次いで、この試験管を遠心分離して（SW41型、30
000rpm、18時間、20℃）RNA含有フラクシヨンをペレツ
ト化させた。
上澄液を捨てかつRNA含有ペレツトを全部水中へ再懸
濁させた後、水溶液を同容量のフエノール−クロロホル
ム（1:1）で２回および同容量のエーテルで２回それぞ
れ抽出した。次いで、RNAを３倍容量のエタノールで水
相から沈澱させ、生じた沈澱物を遠心分離により回収し
た。全RNAの収量:8mg。
濁させた後、水溶液を同容量のフエノール−クロロホル
ム（1:1）で２回および同容量のエーテルで２回それぞ
れ抽出した。次いで、RNAを３倍容量のエタノールで水
相から沈澱させ、生じた沈澱物を遠心分離により回収し
た。全RNAの収量:8mg。
上記の全RNA4mgを1mlのトリス−HCl（10mM、pH7.5）
−EDTA（1mM）（「TE緩衝液」）に再懸濁し、そしてこ
の溶液を65℃にて10分間加熱した。2MのKClを0.5Mの最
終濃度まで加えた後、この混合物をオリゴ−dT−セルロ
ースカラムに加え、そしてこのカラムを0.5MのKClで洗
浄してリボソームRNAの全部を除去した。最後に、カラ
ムに結合したポリA+RNAを10mMのトリス−HCl（pH7.5）
にて室温で溶出させ、このポリA+RNA含有フラクシヨン
を貯蔵した。上記のように、合したフラクシヨンからRN
Aを、エタノールおよび塩での沈澱、遠心分離および水
中への再懸濁によつて回収した。ポリA+RNAの収量:200
μｇ。
−EDTA（1mM）（「TE緩衝液」）に再懸濁し、そしてこ
の溶液を65℃にて10分間加熱した。2MのKClを0.5Mの最
終濃度まで加えた後、この混合物をオリゴ−dT−セルロ
ースカラムに加え、そしてこのカラムを0.5MのKClで洗
浄してリボソームRNAの全部を除去した。最後に、カラ
ムに結合したポリA+RNAを10mMのトリス−HCl（pH7.5）
にて室温で溶出させ、このポリA+RNA含有フラクシヨン
を貯蔵した。上記のように、合したフラクシヨンからRN
Aを、エタノールおよび塩での沈澱、遠心分離および水
中への再懸濁によつて回収した。ポリA+RNAの収量:200
μｇ。
単離したポリA+RNAの活性を検査するため、２μｇの
このポリA+RNAをうさぎ網様細胞溶解物S35−メチオニン
無細胞系（NEN）を用いて試験管中で翻訳し〔エツチ・
アール・ビー・ペルハムおよびアール・ジエー・ジヤク
ソン、ヨーロピアン・ジヤーナル・バイオケミストリ
ー、第67巻、第247頁以降（1976）〕、そしてこの生成
物をオートラジオグラフイーによりSDS/ポリアクリルア
ミドゲルで分析した。この分析は、単離したポリA+RNA
が翻訳されて豚前成長ホルモンにつき予想される寸法
（約24,000）に相当する分子量を有するポリペプチドを
生産することを示した。
このポリA+RNAをうさぎ網様細胞溶解物S35−メチオニン
無細胞系（NEN）を用いて試験管中で翻訳し〔エツチ・
アール・ビー・ペルハムおよびアール・ジエー・ジヤク
ソン、ヨーロピアン・ジヤーナル・バイオケミストリ
ー、第67巻、第247頁以降（1976）〕、そしてこの生成
物をオートラジオグラフイーによりSDS/ポリアクリルア
ミドゲルで分析した。この分析は、単離したポリA+RNA
が翻訳されて豚前成長ホルモンにつき予想される寸法
（約24,000）に相当する分子量を有するポリペプチドを
生産することを示した。
勿論、ポリA+RNAは多数の異なるRNAの混合物であるこ
とを理解すべきである（第１図）。SGHまたはSGH様ポリ
ペプチドに対し特異的なmRNAを除いて、これらRNAは望
ましくない不純物である（第１図）。残念ながら、これ
ら不純RNAはクローン化工程の残部においてSGH-mRNAと
同様に挙動する。したがつて、ポリA+RNAにおけるその
存在は多数の無用のクローンを生ずると共に、正確なク
ローン、すなわちSGHを暗号化するクローンを極めて多
数の不純物から選択するという複雑な選別問題を提起す
る。
とを理解すべきである（第１図）。SGHまたはSGH様ポリ
ペプチドに対し特異的なmRNAを除いて、これらRNAは望
ましくない不純物である（第１図）。残念ながら、これ
ら不純RNAはクローン化工程の残部においてSGH-mRNAと
同様に挙動する。したがつて、ポリA+RNAにおけるその
存在は多数の無用のクローンを生ずると共に、正確なク
ローン、すなわちSGHを暗号化するクローンを極めて多
数の不純物から選択するという複雑な選別問題を提起す
る。
SGH-cDNAを含有するcDNA混合物の合成 ポリA+RNAに補完的な単一鎖DNAを調製するため、20μ
ｌのポリA+RNA（10μｇ、水中）を２μｌの0.15MCH3Hg
とを混合し、得られた溶液を室温にて15分間静置した。
次いで、この溶液へ10μｌのオリゴdT（１μg/ml）と10
0μｌのdNTP（2.5mM、すなわち最終濃度0.5mMまで）と2
0μｌのα−P32−dATP（10mCi/ml）と50μｌの逆転写酵
素（16単位/ml、ライフ・サイエンス社）と同容量の緩
衝液（100mMトリス−HCl（pH8.5）、20mMMgCl2、140mM
KCl、50mM DTT水中）とを加えた。溶液の全容量は404.4
μｌであつた。この溶液を42℃にて90分間培養した後、
これを100℃にて数分間加熱し、そしてこれを遠心分離
した（10000G、5min.）。上澄液はポリA+RNAに補完的な
単一鎖cDNAを含有した。cDNAの収量:1438μｇ（少量のT
CA沈澱による）。
ｌのポリA+RNA（10μｇ、水中）を２μｌの0.15MCH3Hg
とを混合し、得られた溶液を室温にて15分間静置した。
次いで、この溶液へ10μｌのオリゴdT（１μg/ml）と10
0μｌのdNTP（2.5mM、すなわち最終濃度0.5mMまで）と2
0μｌのα−P32−dATP（10mCi/ml）と50μｌの逆転写酵
素（16単位/ml、ライフ・サイエンス社）と同容量の緩
衝液（100mMトリス−HCl（pH8.5）、20mMMgCl2、140mM
KCl、50mM DTT水中）とを加えた。溶液の全容量は404.4
μｌであつた。この溶液を42℃にて90分間培養した後、
これを100℃にて数分間加熱し、そしてこれを遠心分離
した（10000G、5min.）。上澄液はポリA+RNAに補完的な
単一鎖cDNAを含有した。cDNAの収量:1438μｇ（少量のT
CA沈澱による）。
ここでも、単一鎖cDNAは実際上ポリA+RNA混合物中に
存在する対応のmRNAから転写された多数の異なるcDNAの
複雑な混合物であることを理解すべきである（第１
図）。他の因子も作用して、このcDNA混合物を複雑化す
る。ポリA+RNAの各mRNA種は完全には転写することがで
きない。寧ろ、各mRNA種から多くの種類のcDNAが生成さ
れうる（第１図に図示せず）。これら不完全cDNAのそれ
ぞれは、工程の残部において所望のcDNAと同様に挙動す
るので、cDNA混合物におけるその存在はさらに最終的ク
ローン選別工程を複雑化するだけである。
存在する対応のmRNAから転写された多数の異なるcDNAの
複雑な混合物であることを理解すべきである（第１
図）。他の因子も作用して、このcDNA混合物を複雑化す
る。ポリA+RNAの各mRNA種は完全には転写することがで
きない。寧ろ、各mRNA種から多くの種類のcDNAが生成さ
れうる（第１図に図示せず）。これら不完全cDNAのそれ
ぞれは、工程の残部において所望のcDNAと同様に挙動す
るので、cDNA混合物におけるその存在はさらに最終的ク
ローン選別工程を複雑化するだけである。
二重鎖cDNAの製造 上記で調製したcDNAを二重鎖cDNAまで変換するため、
前記cDNAの1/2（0.7μｇ）を採取し、そして50μｌのク
レノー（0.7単位／μｌ）と1.5μｇのMgCl2（1M）と同
容量のDNAポリメラーゼ緩衝液（400mM トリス−HCl（p
H6.9）、150mM KCl、1mM dNTP、20mM β−メルカプトエ
タノール）とを加え、そして混合物を16℃にて17時間培
養し、次いでさらに37℃にて30分間培養した。次いで、
1/8容量の2M酢酸ナトリウム（pH5.5）と2.5容量のエタ
ノールとを加えかつ−70℃まで15分間冷却することによ
りDNAを沈澱させた。遠心分離（10000G、10min）により
沈澱物を回収した後、このペレツトをエタノールで洗浄
し、これを水中に再懸濁させそしてこれをセフアデツク
スＧ−75カラムに加えた。DNAを10mMトリス−HCl−0.1m
M EDTAによつて溶出させ、そしてDNA含有フラクシヨン
を貯蔵した。DNA含有フラクシヨンの全容量は377μｌで
あつた。
前記cDNAの1/2（0.7μｇ）を採取し、そして50μｌのク
レノー（0.7単位／μｌ）と1.5μｇのMgCl2（1M）と同
容量のDNAポリメラーゼ緩衝液（400mM トリス−HCl（p
H6.9）、150mM KCl、1mM dNTP、20mM β−メルカプトエ
タノール）とを加え、そして混合物を16℃にて17時間培
養し、次いでさらに37℃にて30分間培養した。次いで、
1/8容量の2M酢酸ナトリウム（pH5.5）と2.5容量のエタ
ノールとを加えかつ−70℃まで15分間冷却することによ
りDNAを沈澱させた。遠心分離（10000G、10min）により
沈澱物を回収した後、このペレツトをエタノールで洗浄
し、これを水中に再懸濁させそしてこれをセフアデツク
スＧ−75カラムに加えた。DNAを10mMトリス−HCl−0.1m
M EDTAによつて溶出させ、そしてDNA含有フラクシヨン
を貯蔵した。DNA含有フラクシヨンの全容量は377μｌで
あつた。
貯蔵したDNA含有フラクシヨンへ2M NaCl、500mM酢酸
ナトリウム（pH4.5）、10mM硫酸亜塩および８μlSI（10
00単位／μｌ、ベーリンガーマンハイム社）よりなる溶
液42μｌを加え、そしてこの溶液を30℃にて30分間静置
した。次いで、混合物を同容量のフエノールおよび次い
でエタノールで３回抽出し、得られた水相をセフアテツ
クス（登録商標）Ｇ−75カラムに加え、DNAを5mMのKCl
で溶出させた。DNA含有フラクシヨンを貯蔵し、そして
これを前記と同様にエタノールで沈澱させた。
ナトリウム（pH4.5）、10mM硫酸亜塩および８μlSI（10
00単位／μｌ、ベーリンガーマンハイム社）よりなる溶
液42μｌを加え、そしてこの溶液を30℃にて30分間静置
した。次いで、混合物を同容量のフエノールおよび次い
でエタノールで３回抽出し、得られた水相をセフアテツ
クス（登録商標）Ｇ−75カラムに加え、DNAを5mMのKCl
で溶出させた。DNA含有フラクシヨンを貯蔵し、そして
これを前記と同様にエタノールで沈澱させた。
二重鎖DNAのクローン化 多種類の宿主／クローン化ベヒクル組合物を、二重鎖
cDNAのクローン化および発現に使用することができる。
さらに、それぞれ特定のクローン化ベヒクルにおいて、
二重鎖cDNAを挿入するため種々の部位を選択することが
できる。クローン化および発現の特定の選択は、本発明
の範囲を逸脱することなく当業者により容易に行なうこ
とができる。
cDNAのクローン化および発現に使用することができる。
さらに、それぞれ特定のクローン化ベヒクルにおいて、
二重鎖cDNAを挿入するため種々の部位を選択することが
できる。クローン化および発現の特定の選択は、本発明
の範囲を逸脱することなく当業者により容易に行なうこ
とができる。
最初のクローン化において、細菌性プラスミドpBR322
を選択した〔エフ・ボリバール等、「新規クローン化ベ
ヒクルIIの作成および特定化。多目的クローン化系」、
ジーン誌、第95-113頁（1977）；ジエー・ジイー・サツ
トクリフ、「DNA配列から誘導されたpBR322制限地図、
長さ4361ヌクレオチド対までの正確なDNA寸法標識」、
ヌクレイツク・アシツド・リサーチ、第５巻、第2721-2
8頁（1978）〕、さらにそのPstＩ部位〔エル・ビラ−コ
マロフ等、「プロインシユリンを合成する細菌クロー
ン」、プロシーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第75巻、第3727-31頁（1978）〕、およ
びイー・コリK12MC1061〔エム・カサダバンおよびエス
・エヌ・コーヘン、ジヤーナル・モレキユラー・バイオ
ロジー、第138巻、第179-207頁（1980）〕を選択した。
を選択した〔エフ・ボリバール等、「新規クローン化ベ
ヒクルIIの作成および特定化。多目的クローン化系」、
ジーン誌、第95-113頁（1977）；ジエー・ジイー・サツ
トクリフ、「DNA配列から誘導されたpBR322制限地図、
長さ4361ヌクレオチド対までの正確なDNA寸法標識」、
ヌクレイツク・アシツド・リサーチ、第５巻、第2721-2
8頁（1978）〕、さらにそのPstＩ部位〔エル・ビラ−コ
マロフ等、「プロインシユリンを合成する細菌クロー
ン」、プロシーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第75巻、第3727-31頁（1978）〕、およ
びイー・コリK12MC1061〔エム・カサダバンおよびエス
・エヌ・コーヘン、ジヤーナル・モレキユラー・バイオ
ロジー、第138巻、第179-207頁（1980）〕を選択した。
1.PstI-開裂したdG−末端pBR322の製造 ２回の連続するCsCl濃度勾配でプラスミドpBR322を精
製し、かつその25μｇを標準条件下でPstＩエンドヌク
レアーゼによつて分解した（第１図）。次いで、Pst−
Ｉ開裂したプラスミドへ50μｌの水と３μｌのDTT（10m
M）と1.5μｌのdGTP（10mM）と10μｌのゼラチン（1mg/
ml）と10μｌの末端トランスフエラーゼ緩衝液（10mM C
oCl2、1.4Mカコジル酸カリウムおよび0.3Mトリス−HCl
（pH7.6））と0.9μｌの末端デオキシヌクレオチジルト
ランスフエラーゼ（160単位/ml、ラツトクリフ・バイオ
ケミカルス社）とを加えた。この溶液を10℃にて13分間
培養した後、５μｌのEDTA（250mM）を加え、そして得
られた混合物を同容量のフエノール−クロロホルム（1:
1）で２回および同容量のエーテルで３回抽出した。水
相をdC−末端二重鎖cDNAと後に組合せるため保存した。
製し、かつその25μｇを標準条件下でPstＩエンドヌク
レアーゼによつて分解した（第１図）。次いで、Pst−
Ｉ開裂したプラスミドへ50μｌの水と３μｌのDTT（10m
M）と1.5μｌのdGTP（10mM）と10μｌのゼラチン（1mg/
ml）と10μｌの末端トランスフエラーゼ緩衝液（10mM C
oCl2、1.4Mカコジル酸カリウムおよび0.3Mトリス−HCl
（pH7.6））と0.9μｌの末端デオキシヌクレオチジルト
ランスフエラーゼ（160単位/ml、ラツトクリフ・バイオ
ケミカルス社）とを加えた。この溶液を10℃にて13分間
培養した後、５μｌのEDTA（250mM）を加え、そして得
られた混合物を同容量のフエノール−クロロホルム（1:
1）で２回および同容量のエーテルで３回抽出した。水
相をdC−末端二重鎖cDNAと後に組合せるため保存した。
2.dC−末端化cDNAの製造 前記のように調製したcDNAの約1/5（100ng）を25μｌ
の水中に再懸濁し、50μｌのH2Oと３μｌのDTT（10mM）
と1.5μｌのdCTP（10mM）と10μｌのゼラチン（1mg/m
l）と10μｌの末端トランスフエラーゼ緩衝液（10mM Co
Cl2、1.4Mカコジル酸カリウム、0.3Mトリス−HCl（pH7.
6））と0.9μｌの末端デオキシヌクレオチジルトランス
フエラーゼ（160単位/ml、ラツトクリフ・バイオケミカ
ルス社）とを加えることにより二重鎖cDNAへdC末端を加
えた（第１図）。この混合物を10℃にて13分間培養した
後、５μｌのEDTA（250mM）を加え、そして得られた混
合物を同容量のフエノール−クロロホルム（1:1）で２
回および同容量のエーテルで３回抽出した。ここでも、
水相をdG末端化されたPst−開裂pBR322と組合せるため
に保存した。
の水中に再懸濁し、50μｌのH2Oと３μｌのDTT（10mM）
と1.5μｌのdCTP（10mM）と10μｌのゼラチン（1mg/m
l）と10μｌの末端トランスフエラーゼ緩衝液（10mM Co
Cl2、1.4Mカコジル酸カリウム、0.3Mトリス−HCl（pH7.
6））と0.9μｌの末端デオキシヌクレオチジルトランス
フエラーゼ（160単位/ml、ラツトクリフ・バイオケミカ
ルス社）とを加えることにより二重鎖cDNAへdC末端を加
えた（第１図）。この混合物を10℃にて13分間培養した
後、５μｌのEDTA（250mM）を加え、そして得られた混
合物を同容量のフエノール−クロロホルム（1:1）で２
回および同容量のエーテルで３回抽出した。ここでも、
水相をdG末端化されたPst−開裂pBR322と組合せるため
に保存した。
3.dG末端pBR322とdC末端cDNAの融合 dG末端Pst−Ｉ開裂pBR322（50ng）１μｌとdC末端cDN
A（1ng）2.5μｌとを融合用緩衝液（1M NaCl、200mMト
リス−HCl（pH7.6）、10mM EDTA）５μｌ中で合し、そ
して最終容量50μｌまで水を加えた。混合物を80℃にて
３分間および45℃にてさらに２時間加熱した後、溶液の
温度を４℃まで降下させ、これを１晩静置した。
A（1ng）2.5μｌとを融合用緩衝液（1M NaCl、200mMト
リス−HCl（pH7.6）、10mM EDTA）５μｌ中で合し、そ
して最終容量50μｌまで水を加えた。混合物を80℃にて
３分間および45℃にてさらに２時間加熱した後、溶液の
温度を４℃まで降下させ、これを１晩静置した。
ここでも、この融合により生成された極めて僅かの組
換DNA分子のみが、SGHに関連するcDNA挿入物を含有する
ことを理解すべきである（第１図）。
換DNA分子のみが、SGHに関連するcDNA挿入物を含有する
ことを理解すべきである（第１図）。
4.ヒブリドによるイー・コリK12MC1061のトランスフエ
クシヨン 上記で融合させたdG末端pBR322とdC末端DNAとをコロ
ジオン酸（UH100-25）中で1/10の融合用緩衝液（上記）
に対し４℃で２時間透析して、全ての低分子量のものを
除去した。次いで、この混合物を200μｌのイー・コリK
12MC1061〔予めジー・エム・ブエル等、ジヤーナル・バ
イオロジカル・ケミストリー、第254巻、第9279-83頁
（1979）に実質的に記載されたように作成〕へ加えた。
クシヨン 上記で融合させたdG末端pBR322とdC末端DNAとをコロ
ジオン酸（UH100-25）中で1/10の融合用緩衝液（上記）
に対し４℃で２時間透析して、全ての低分子量のものを
除去した。次いで、この混合物を200μｌのイー・コリK
12MC1061〔予めジー・エム・ブエル等、ジヤーナル・バ
イオロジカル・ケミストリー、第254巻、第9279-83頁
（1979）に実質的に記載されたように作成〕へ加えた。
プラスミドpBR322はテトラサイクリン耐性を暗号化す
る遺伝子とアンピシリン耐性を暗号化する遺伝子とを含
むので（第１図）、また後者の遺伝子はcDNAがPstＩ部
位に挿入されると失活されるので、PstＩ部位にDNA挿入
物を有する組換DNA分子で形質転換された集落を、この
ように形質転換されていない集落から選別することがで
きる（第１図）。1ngのcDNAから約10000個の形質転換さ
れた集落を単離した。
る遺伝子とアンピシリン耐性を暗号化する遺伝子とを含
むので（第１図）、また後者の遺伝子はcDNAがPstＩ部
位に挿入されると失活されるので、PstＩ部位にDNA挿入
物を有する組換DNA分子で形質転換された集落を、この
ように形質転換されていない集落から選別することがで
きる（第１図）。1ngのcDNAから約10000個の形質転換さ
れた集落を単離した。
これら集落は、ポリA+RNAにおけるRNAの混合物の完全
もしくは部分コピーを示す種々の組換DNA分子を含有す
る（第１図）。これら分子の大部分はSGH関連DNA挿入物
を含有しない。
もしくは部分コピーを示す種々の組換DNA分子を含有す
る（第１図）。これら分子の大部分はSGH関連DNA挿入物
を含有しない。
SGH-cDNAを含有するクローンの選別 特定組換DNA分子を含有するクローン、すなわちSGH関
連DNA挿入物を含有するクローンにつき、クローンの保
存物を選別するには幾つかの方法がある。最初のクロー
ン選別法において、牛成長ホルモンを暗号化するcDNAの
400bpPstＩ断片を使用した〔たとえばミラー等、ジヤー
ナル・バイオロジカル・ケミストリー、第255巻、第752
1-24頁（1980）〕（第２図）。この配列も、1982年８月
16日付けでアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシ
ヨンに寄託され、ATCC番号39173を付与されたpBGH-（Me
t-Ala）のPstＩ制限によつて得ることができる。
連DNA挿入物を含有するクローンにつき、クローンの保
存物を選別するには幾つかの方法がある。最初のクロー
ン選別法において、牛成長ホルモンを暗号化するcDNAの
400bpPstＩ断片を使用した〔たとえばミラー等、ジヤー
ナル・バイオロジカル・ケミストリー、第255巻、第752
1-24頁（1980）〕（第２図）。この配列も、1982年８月
16日付けでアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシ
ヨンに寄託され、ATCC番号39173を付与されたpBGH-（Me
t-Ala）のPstＩ制限によつて得ることができる。
上記と同様に調製されたクローンの保存物につきヒブ
リド化選択を行なうためこの試料を使用した（第２
図）。先ず、この試料をエム・グルンシユタインおよび
デイー・デイー・ホグネスにより「コロニーヒブリド
化：特定遺伝子を含有するクローン化DNAの単離方
法」、プロシーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第72巻、第3961-65頁（1975）に記載さ
れているようにこの試料を標識し、次いでこれを使用し
て下記するようにSGH-Msp断片試料を用いてクローンの
保存物を選別した。
リド化選択を行なうためこの試料を使用した（第２
図）。先ず、この試料をエム・グルンシユタインおよび
デイー・デイー・ホグネスにより「コロニーヒブリド
化：特定遺伝子を含有するクローン化DNAの単離方
法」、プロシーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第72巻、第3961-65頁（1975）に記載さ
れているようにこの試料を標識し、次いでこれを使用し
て下記するようにSGH-Msp断片試料を用いてクローンの
保存物を選別した。
ヒブリド化陽性クローンの１種から、挿入cDNA断片を
有する組換DNA分子を単離し、前記断片はSGHのアミノ酸
配列の１部を暗号化するヌクレオチド配列決定により決
定した（報告される部分アミノ酸配列（上記）との比較
による）（第２図）。
有する組換DNA分子を単離し、前記断片はSGHのアミノ酸
配列の１部を暗号化するヌクレオチド配列決定により決
定した（報告される部分アミノ酸配列（上記）との比較
による）（第２図）。
次いで、この陽性cDNAの200bp断片を調製し（Mspによ
る分解、第２図参照）かつこれを標識し（グルンシユタ
インおよびホグネス、上記）、10000個のクローンの保
存物に対するヒブリド化試料として使用した（第２
図）。ヒブリド化するため、10000個の集落をニトロセ
ルロースフイルタ（ミリポア社）に移し、これらフイル
タを37℃にて１晩培養した。これら集落を0.5MのNaOHで
７分間溶解させた後、フイルタを1Mのトリス−HCl（pH
7.5）と0.6MのNaCl（それぞれ３分間２回）で中和し、
そしてフイルタを2XSSC（0.15M NaCl-0.015Mクエン酸ナ
トリウム（pH7））中に浸漬した。フイルタを空気乾燥
した後、これを80℃にて減圧オーブン内で２時間加熱
し、次いでこれらを4XSSC（上記）、10Xデンハルト溶液
および0.1％SDS中で65℃にて２時間２回浸漬した。次い
で、25000P32カウント／フイルタの上記200bp試料（２
分間煮沸しかつ急速に冷却する）および4XSSCと10Xデン
ハルト溶液と0.1％SDSとを加え、これらフイルタを65℃
にて12〜14時間ヒブリド化させ、これらを4XSSC、10Xデ
ンハルト溶液および0.1％SDSにて65℃で２時間洗浄し、
さらにこれらを2XSSCにて65℃で30分間洗浄し、そして
乾燥させた。Ｘ線フイルムに１日間露出させた後、前記
試料にヒブリド化されたDNA挿入物を含有する約100個の
集落を同定した。
る分解、第２図参照）かつこれを標識し（グルンシユタ
インおよびホグネス、上記）、10000個のクローンの保
存物に対するヒブリド化試料として使用した（第２
図）。ヒブリド化するため、10000個の集落をニトロセ
ルロースフイルタ（ミリポア社）に移し、これらフイル
タを37℃にて１晩培養した。これら集落を0.5MのNaOHで
７分間溶解させた後、フイルタを1Mのトリス−HCl（pH
7.5）と0.6MのNaCl（それぞれ３分間２回）で中和し、
そしてフイルタを2XSSC（0.15M NaCl-0.015Mクエン酸ナ
トリウム（pH7））中に浸漬した。フイルタを空気乾燥
した後、これを80℃にて減圧オーブン内で２時間加熱
し、次いでこれらを4XSSC（上記）、10Xデンハルト溶液
および0.1％SDS中で65℃にて２時間２回浸漬した。次い
で、25000P32カウント／フイルタの上記200bp試料（２
分間煮沸しかつ急速に冷却する）および4XSSCと10Xデン
ハルト溶液と0.1％SDSとを加え、これらフイルタを65℃
にて12〜14時間ヒブリド化させ、これらを4XSSC、10Xデ
ンハルト溶液および0.1％SDSにて65℃で２時間洗浄し、
さらにこれらを2XSSCにて65℃で30分間洗浄し、そして
乾燥させた。Ｘ線フイルムに１日間露出させた後、前記
試料にヒブリド化されたDNA挿入物を含有する約100個の
集落を同定した。
これら陽性クローンの40種を選択して制限分析および
寸法決定に使用した（PvuI/BglＩ）（第３図）。この分
析から、これらクローンの１種が約750bpのDNA挿入物を
有することが確認された。このクローンをイー・コリK1
2MC1061（pBR322（Pst/SGH-9D）と命名し、その組換DNA
分子をpBR322（pst）/SGH-9Dと命名し、さらにその挿入
物をSGH-9Dと命名した。この名称は、クローンが、pBR3
22およびSGH-9Dよりなる組換DNA分子で形質転換された
イー・コリK12MC1061からなることを示し、挿入物SGH-9
DはpBR322におけるPstＩ部位に存在する（第３図）。
寸法決定に使用した（PvuI/BglＩ）（第３図）。この分
析から、これらクローンの１種が約750bpのDNA挿入物を
有することが確認された。このクローンをイー・コリK1
2MC1061（pBR322（Pst/SGH-9D）と命名し、その組換DNA
分子をpBR322（pst）/SGH-9Dと命名し、さらにその挿入
物をSGH-9Dと命名した。この名称は、クローンが、pBR3
22およびSGH-9Dよりなる組換DNA分子で形質転換された
イー・コリK12MC1061からなることを示し、挿入物SGH-9
DはpBR322におけるPstＩ部位に存在する（第３図）。
挿入物SGH-9Dのヌクレオチド配列決定 SGHを暗号化するDNA配列およびその推定信号配列は約
648ヌクレオチドからなることが予想されたので、制限
地図化およびヌクレオチド配列決定による分析のため挿
入物SGH-9Dを選択した。
648ヌクレオチドからなることが予想されたので、制限
地図化およびヌクレオチド配列決定による分析のため挿
入物SGH-9Dを選択した。
第３図は、SGH-9Dのヌクレオチド配列を決定するため
に使用した方法を示している。DNA配列決定するため、
エー・エム・マキサムおよびダブリユー・ギルバートに
より実質的に記載された方法を使用した〔「DNAの新規
な配列決定方法」、プロシーデイング・ナシヨナル・ア
カデミー・サイエンス・USA、第74巻、第560-64頁（197
7）〕。挿入物SGH-9Dの全長を両ストランドから配列決
定し、標識末端（第３図における黒点）として作用する
殆んどの制限部位をこれらを離間する断片によつて配列
決定した。このように得られたヌクレオチド配列を第４
図乃至第５図に示す。
に使用した方法を示している。DNA配列決定するため、
エー・エム・マキサムおよびダブリユー・ギルバートに
より実質的に記載された方法を使用した〔「DNAの新規
な配列決定方法」、プロシーデイング・ナシヨナル・ア
カデミー・サイエンス・USA、第74巻、第560-64頁（197
7）〕。挿入物SGH-9Dの全長を両ストランドから配列決
定し、標識末端（第３図における黒点）として作用する
殆んどの制限部位をこれらを離間する断片によつて配列
決定した。このように得られたヌクレオチド配列を第４
図乃至第５図に示す。
第４図および第５図を参照して、５′末端における11
G残基および10A残基（恐らくmRNAのポリA+末端を反映す
る）および次いで３′末端における24C残基により挿入
物を整列させた。対照のため、挿入物をdG末端に続く最
初のヌクレオチドからポリA+残基の前の最後のヌクレオ
チドまで番号を付した。
G残基および10A残基（恐らくmRNAのポリA+末端を反映す
る）および次いで３′末端における24C残基により挿入
物を整列させた。対照のため、挿入物をdG末端に続く最
初のヌクレオチドからポリA+残基の前の最後のヌクレオ
チドまで番号を付した。
SGHにつき報告された部分アミノ酸配列と比較して判
かるように、ヌクレオチド１−570はSGHを暗号化し、ヌ
クレオチド571-573は停止コマンドである。したがつ
て、SGHは190個のアミノ酸の蛋白質であることが判る。
さらに、この配列から判るように、豚前成長ホルモンが
存在する。しかしながら、SGHの推定信号もしくは予備
配列の正確な長さまたは組成はまだ決定していない。何
故なら、SGH-9Dは豚前成長ホルモンの５′暗号化および
非暗号化末端の全部を含まないと思われるからである。
推定信号配列の最初の３個のアミノ酸を酸−1,−２およ
び−３として記載した（第４図および第５図）。SGH-9D
は、ポリＡ残基が存在するため３′非暗号化領域の全部
を含まないと思われる。
かるように、ヌクレオチド１−570はSGHを暗号化し、ヌ
クレオチド571-573は停止コマンドである。したがつ
て、SGHは190個のアミノ酸の蛋白質であることが判る。
さらに、この配列から判るように、豚前成長ホルモンが
存在する。しかしながら、SGHの推定信号もしくは予備
配列の正確な長さまたは組成はまだ決定していない。何
故なら、SGH-9Dは豚前成長ホルモンの５′暗号化および
非暗号化末端の全部を含まないと思われるからである。
推定信号配列の最初の３個のアミノ酸を酸−1,−２およ
び−３として記載した（第４図および第５図）。SGH-9D
は、ポリＡ残基が存在するため３′非暗号化領域の全部
を含まないと思われる。
勿論、全５′暗号化および非暗号化領域を含有するク
ローンの選択および豚前成長ホルモンの完全予備配列の
同定は、本発明の範囲を逸脱することなく当業者により
なしうることが了解されよう。たとえば、同定された陽
性クローンは上記と同様に挿入SGH-9Dの５′末端から採
取された試料を用いて選別することができる。たとえ
ば、この種の試料はSGH-9DをNarＩによつて分解しかつ
ヌクレオチド−５および−60の間の断片を単離すること
によつて調製することができる（第４図）。次いで、こ
の断片を前記と同様に標識し、そしてこれをSGHのより
完全な５′部分を含有するクローンを選択するために使
用することができる。このクローンは、SGH-9Dの完全
３′端部を含まなければ、当業界で周知されているよう
に共通の制限部位を介してSGH-9Dの全部もしくは１部と
組合せて、SGHの全暗号化および非暗号化領域からなる
単一DNA配列を生成させることができる。
ローンの選択および豚前成長ホルモンの完全予備配列の
同定は、本発明の範囲を逸脱することなく当業者により
なしうることが了解されよう。たとえば、同定された陽
性クローンは上記と同様に挿入SGH-9Dの５′末端から採
取された試料を用いて選別することができる。たとえ
ば、この種の試料はSGH-9DをNarＩによつて分解しかつ
ヌクレオチド−５および−60の間の断片を単離すること
によつて調製することができる（第４図）。次いで、こ
の断片を前記と同様に標識し、そしてこれをSGHのより
完全な５′部分を含有するクローンを選択するために使
用することができる。このクローンは、SGH-9Dの完全
３′端部を含まなければ、当業界で周知されているよう
に共通の制限部位を介してSGH-9Dの全部もしくは１部と
組合せて、SGHの全暗号化および非暗号化領域からなる
単一DNA配列を生成させることができる。
勿論、SGH-9Dにつき第４図および第５図に図示したポ
リペプチドの構造は、生体内酵素との相互作用、たとえ
ばグリコシル化により生体内で生ずる蛋白質に対する改
変を考慮していない。したがつて、この構造は豚中で生
成されるSGHとは同一でないと理解されるが、生成促進
性生物学的特性が同一でないにしても極めて類似してい
ると了解される。第４図および第５図に図示した蛋白質
構造は、遺伝子レベルまたはアミノ酸自身における他の
改変、たとえば突然変異、単一もしくは多重の塩基交
換、削除、挿入もしくは転換、化学的誘導化またはこれ
ら構造の活性断片の選択がSGHの活性を示さない化合物
を生成することを意味しない。さらに、コンピユータに
よりSGH-9Dのヌクレオチド配列を分析して制限エンドヌ
クレアーゼ部位の幾つかの本体および位置を決定した。
この分析の結果を第６図に示す。
リペプチドの構造は、生体内酵素との相互作用、たとえ
ばグリコシル化により生体内で生ずる蛋白質に対する改
変を考慮していない。したがつて、この構造は豚中で生
成されるSGHとは同一でないと理解されるが、生成促進
性生物学的特性が同一でないにしても極めて類似してい
ると了解される。第４図および第５図に図示した蛋白質
構造は、遺伝子レベルまたはアミノ酸自身における他の
改変、たとえば突然変異、単一もしくは多重の塩基交
換、削除、挿入もしくは転換、化学的誘導化またはこれ
ら構造の活性断片の選択がSGHの活性を示さない化合物
を生成することを意味しない。さらに、コンピユータに
よりSGH-9Dのヌクレオチド配列を分析して制限エンドヌ
クレアーゼ部位の幾つかの本体および位置を決定した。
この分析の結果を第６図に示す。
SGH様ポリペプチドの合成 蛋白質の生産レベルは、２つの主要な因子により支配
される：すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数、ならび
にこれら遺伝子コピーが転写かつ翻訳される効率であ
る。転写および翻訳の効率（これは一緒になつて発現を
構成する）は、一般に所望の暗号化配列の前方に位置す
るヌクレオチド配列に依存する。これらのヌクレオチド
配列または発現制御配列は、特にRNAポリメラーゼが相
互作用して転写を開始する位置（プロモータ配列）と、
リボソームがmRNA（転写の生成物）と結合して相互作用
し翻訳を開始する位置とを規定する。必らずしも全ての
発現制御配列が同じ効率を持つて機能するとは限らな
い。したがつて、所望の蛋白質に対して特異的な暗号化
配列をそれらの隣接するヌクレオチド配列から分離して
これらを他の発現制御配列に融合させ、より高いレベル
の発現を生ぜしめるのが有利である。これが達成された
後、新たに作成されたDNA断片を複数コピーのプラスミ
ドまたはバクテリオフアージ誘導体中へ挿入して、細胞
内の遺伝子コピー数を増加させ、かつそれによりさらに
発現蛋白質の収量を向上させることができる。
される：すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数、ならび
にこれら遺伝子コピーが転写かつ翻訳される効率であ
る。転写および翻訳の効率（これは一緒になつて発現を
構成する）は、一般に所望の暗号化配列の前方に位置す
るヌクレオチド配列に依存する。これらのヌクレオチド
配列または発現制御配列は、特にRNAポリメラーゼが相
互作用して転写を開始する位置（プロモータ配列）と、
リボソームがmRNA（転写の生成物）と結合して相互作用
し翻訳を開始する位置とを規定する。必らずしも全ての
発現制御配列が同じ効率を持つて機能するとは限らな
い。したがつて、所望の蛋白質に対して特異的な暗号化
配列をそれらの隣接するヌクレオチド配列から分離して
これらを他の発現制御配列に融合させ、より高いレベル
の発現を生ぜしめるのが有利である。これが達成された
後、新たに作成されたDNA断片を複数コピーのプラスミ
ドまたはバクテリオフアージ誘導体中へ挿入して、細胞
内の遺伝子コピー数を増加させ、かつそれによりさらに
発現蛋白質の収量を向上させることができる。
したがつて、本発明の方法にしたがいSGH様ポリペプ
チドを生産する際、多種類の宿主−発現制御配列ベクタ
ーの組合せを使用することができる。たとえば、有用な
ベクターは染色体、非染色体および合成のDNA配列の断
片、たとえばcolEI、pCRI、pBR322およびそれらの誘導
体を含むイー・コリからの各種公知の細菌性プラスミ
ド、より広範な宿主範囲のプラスミド、たとえばRP4、
フアージDNA、たとえばフアージλの多数の誘導体なら
びに上記の組合せから誘導されるベクター、たとえばpB
R322の１部、フアージλの１部および合成部分を含むベ
クターから構成することができる。有用な宿主は、たと
えばイー・コリK12MC1061、イー・コリHB101、イー・コ
リX1776、イー・コリX2282、イー・コリMRCIの菌株およ
びシユードモナス、枯草菌、高熱細菌およびその他の細
菌類のような細菌性宿主、酵母およびその他の真菌類、
動物もしくは植物宿主、たとえば動物（ひとを含む）も
しくは植物細胞の培養物、或いはその他の宿主を包含す
る。有用な発現制御配列は、イー・コリの乳糖オペロン
のオペレータ、プロモータおよびリボソーム結合および
相互作用配列（たとえばシヤイン−ダルガルノ配列のよ
うな配列を含む）（「lac系」）、イー・コリのトリプ
トフアン合成酵素系の対応する配列（「trp系」）、フ
アージλの主オペレータおよびプロモータ領域（OLPLお
よびORPI R）、フアージfdコート蛋白質の制御領域、或
いは原始核もしくは成熟核細胞およびそのウイルスの発
現を制御しまたは促進するその他の配列、或いはこれら
の各種の組合せを包含する。
チドを生産する際、多種類の宿主−発現制御配列ベクタ
ーの組合せを使用することができる。たとえば、有用な
ベクターは染色体、非染色体および合成のDNA配列の断
片、たとえばcolEI、pCRI、pBR322およびそれらの誘導
体を含むイー・コリからの各種公知の細菌性プラスミ
ド、より広範な宿主範囲のプラスミド、たとえばRP4、
フアージDNA、たとえばフアージλの多数の誘導体なら
びに上記の組合せから誘導されるベクター、たとえばpB
R322の１部、フアージλの１部および合成部分を含むベ
クターから構成することができる。有用な宿主は、たと
えばイー・コリK12MC1061、イー・コリHB101、イー・コ
リX1776、イー・コリX2282、イー・コリMRCIの菌株およ
びシユードモナス、枯草菌、高熱細菌およびその他の細
菌類のような細菌性宿主、酵母およびその他の真菌類、
動物もしくは植物宿主、たとえば動物（ひとを含む）も
しくは植物細胞の培養物、或いはその他の宿主を包含す
る。有用な発現制御配列は、イー・コリの乳糖オペロン
のオペレータ、プロモータおよびリボソーム結合および
相互作用配列（たとえばシヤイン−ダルガルノ配列のよ
うな配列を含む）（「lac系」）、イー・コリのトリプ
トフアン合成酵素系の対応する配列（「trp系」）、フ
アージλの主オペレータおよびプロモータ領域（OLPLお
よびORPI R）、フアージfdコート蛋白質の制御領域、或
いは原始核もしくは成熟核細胞およびそのウイルスの発
現を制御しまたは促進するその他の配列、或いはこれら
の各種の組合せを包含する。
勿論、必らずしも全ての宿主−発現制御配列−ベクタ
ー組合せが、特定のDNA暗号化配列につき同等の効率を
有するとは限らない。しかしながら、本発明で説明した
ように、生物安全性、特定の作成につき本発明のSGH暗
号化DNA配列に使用しうる部位、発現すべきSGH様ポリペ
プチドの寸法、宿主細胞酵素による蛋白質分解に対する
これらポリペプチドの感受性、精製の際に除去するのが
困難な宿主細胞蛋白質によるこれらポリペプチドの汚
染、SGHおよびSGH様暗号化配列の発現特性、たとえばDN
A配列の構造ならびに発現制御配列に関する開始および
停止コドンの位置、ならびに当業者により認識されたそ
の他の因子を考慮して、適当な組合せを選択することが
できる。
ー組合せが、特定のDNA暗号化配列につき同等の効率を
有するとは限らない。しかしながら、本発明で説明した
ように、生物安全性、特定の作成につき本発明のSGH暗
号化DNA配列に使用しうる部位、発現すべきSGH様ポリペ
プチドの寸法、宿主細胞酵素による蛋白質分解に対する
これらポリペプチドの感受性、精製の際に除去するのが
困難な宿主細胞蛋白質によるこれらポリペプチドの汚
染、SGHおよびSGH様暗号化配列の発現特性、たとえばDN
A配列の構造ならびに発現制御配列に関する開始および
停止コドンの位置、ならびに当業者により認識されたそ
の他の因子を考慮して、適当な組合せを選択することが
できる。
さらに、DNA配列および発現制御配列をベクター中へ
挿入するには、各種の方法が当業界で知られている。こ
れらは、たとえば直接結合、合成リンカー、エキソヌク
レアーゼおよびポリメラーゼ結合した修復反応に続く結
合、或いはDNAポリメラーゼおよび適当な単一鎖雛型に
よるDNA鎖の延長に続く結合を包含する。本発明のSGH様
ポリペプチドを合成するには、これらのいずれを選択し
てもよい。
挿入するには、各種の方法が当業界で知られている。こ
れらは、たとえば直接結合、合成リンカー、エキソヌク
レアーゼおよびポリメラーゼ結合した修復反応に続く結
合、或いはDNAポリメラーゼおよび適当な単一鎖雛型に
よるDNA鎖の延長に続く結合を包含する。本発明のSGH様
ポリペプチドを合成するには、これらのいずれを選択し
てもよい。
さらに、選択された宿主−発現制御配列−ベクター組
合せで発現される実際のDNA配列は、成熟SGHとは同一で
ない生産物を生成しうることを了解すべきである。たと
えば、発現されるDNA配列は、成熟SGH＋メチオニンまた
はSGHの推定信号配列の１部もしくは全部、或いはSGHに
関連のない他のアミノ酸を暗号化することもある。或い
は、発現DNA配列はSGHの１部のみ或いはメチオニンもし
くはその他のアミノ酸を共に暗号化することもある。い
ずれの場合も本発明に包含される。たとえば、豚前成長
ホルモン、もしくはf-met-SGHを暗号化するヌクレオチ
ド配列で形質転換された宿主は、そのSGH様化合物を単
独で生産することができ、或いは他のアミノ酸に融合す
ることもでき、さらに成熟SGH生成物を分泌することも
できる。必要なことは、発酵培養物から単離した後に或
いはたとえば開裂、合成結合またはその他周知の方法の
ような慣用の処理の後に得られる生産物がSGHの成長促
進性生物学的活性を示すことだけである。※ ※ ｆ−metもしくはその他の非SGH関連アミノ酸または
SGH自身の非活性必須アミノ酸は、生産物を使用する前
に化学的または酵素的に除去しうることを了解すべきで
ある。さらに、これらは発現の際に宿主細胞により開裂
することもできる。
合せで発現される実際のDNA配列は、成熟SGHとは同一で
ない生産物を生成しうることを了解すべきである。たと
えば、発現されるDNA配列は、成熟SGH＋メチオニンまた
はSGHの推定信号配列の１部もしくは全部、或いはSGHに
関連のない他のアミノ酸を暗号化することもある。或い
は、発現DNA配列はSGHの１部のみ或いはメチオニンもし
くはその他のアミノ酸を共に暗号化することもある。い
ずれの場合も本発明に包含される。たとえば、豚前成長
ホルモン、もしくはf-met-SGHを暗号化するヌクレオチ
ド配列で形質転換された宿主は、そのSGH様化合物を単
独で生産することができ、或いは他のアミノ酸に融合す
ることもでき、さらに成熟SGH生成物を分泌することも
できる。必要なことは、発酵培養物から単離した後に或
いはたとえば開裂、合成結合またはその他周知の方法の
ような慣用の処理の後に得られる生産物がSGHの成長促
進性生物学的活性を示すことだけである。※ ※ ｆ−metもしくはその他の非SGH関連アミノ酸または
SGH自身の非活性必須アミノ酸は、生産物を使用する前
に化学的または酵素的に除去しうることを了解すべきで
ある。さらに、これらは発現の際に宿主細胞により開裂
することもできる。
本発明の合成において、豚成長ホルモン用ポリペプチ
ドを発現するため次の構造を選択した:SGH−Δ７。この
組換DNA分子は第７図に示したように作成した。
ドを発現するため次の構造を選択した:SGH−Δ７。この
組換DNA分子は第７図に示したように作成した。
先ず、イー・コリK12λ（pBGH−Δ９（Ser））〔ゲー
リー・ブエルの寄贈物であり、1982年８月16日付けでア
メリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに寄託
し、寄託番号39174が付与された〕からpBGH−Δ９（Se
r）を単離し、その場合実質的にアール・デイー・クラ
イン等、プラスミド、第３巻、第88-91頁（1980）に記
載されたプラスミド単離法を使用した。次いで、このプ
ラスミドを制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびBamHIに
よつて開裂させ、そしてEcoRI−BamHI断片（断片Ａ）を
単離した（第７図）。さらに、同じプラスミドをEcoRI
およびHgiA1で開裂させ、そして約88塩基対のEcoRI−Hg
iA1断片（断片Ｂ）を単離した（第７図）。さらに、同
じプラスミドをPvuIIおよびBamHIで開裂させ、そして約
103塩基対のPvuII−BamHI断片（断片Ｃ）を単離した
（第７図）。
リー・ブエルの寄贈物であり、1982年８月16日付けでア
メリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに寄託
し、寄託番号39174が付与された〕からpBGH−Δ９（Se
r）を単離し、その場合実質的にアール・デイー・クラ
イン等、プラスミド、第３巻、第88-91頁（1980）に記
載されたプラスミド単離法を使用した。次いで、このプ
ラスミドを制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびBamHIに
よつて開裂させ、そしてEcoRI−BamHI断片（断片Ａ）を
単離した（第７図）。さらに、同じプラスミドをEcoRI
およびHgiA1で開裂させ、そして約88塩基対のEcoRI−Hg
iA1断片（断片Ｂ）を単離した（第７図）。さらに、同
じプラスミドをPvuIIおよびBamHIで開裂させ、そして約
103塩基対のPvuII−BamHI断片（断片Ｃ）を単離した
（第７図）。
次いで、上記のpSGH-9DをHgiA1およびPvuIIにより実
質的に同じ条件下で制限し、そしてHgiA1部位（GTGCT↓
Ｃ）からPvuII部位（CAG↓CTG）まで延在するSGH暗号化
配列のその部分を単離した（第７図および第８図）。次
いで、この断片をpBGH−Δ９（Ser）から予め作成した
３種の断片（A,BおよびＣ）と結合させ、その際標準条
件とT4DNAリガーゼとを16℃にて１晩使用した。
質的に同じ条件下で制限し、そしてHgiA1部位（GTGCT↓
Ｃ）からPvuII部位（CAG↓CTG）まで延在するSGH暗号化
配列のその部分を単離した（第７図および第８図）。次
いで、この断片をpBGH−Δ９（Ser）から予め作成した
３種の断片（A,BおよびＣ）と結合させ、その際標準条
件とT4DNAリガーゼとを16℃にて１晩使用した。
pBGH−Δ９（Ser）およびpSGH−9DのBGH暗号化配列と
遺伝子暗号の退化との間には類似性が存在するので、上
記の結合から生ずる組換DNA分子はｆ−Met開始の後にそ
の最初の７個のアミノ酸を喪失するSGH様ポリペプチド
を暗号化する（第７図および第８図）。
遺伝子暗号の退化との間には類似性が存在するので、上
記の結合から生ずる組換DNA分子はｆ−Met開始の後にそ
の最初の７個のアミノ酸を喪失するSGH様ポリペプチド
を暗号化する（第７図および第８図）。
この分子を特性化するSGH暗号化配列は、pSGH-9Dにお
けるSGHを暗号化するものとは異なる３個のヌクレオチ
ドを有する（第４図および第５図）。これらの差のうち
２つは、BGH暗号化配列とSGH暗号化配列との間の差から
生ずる（ＡおよびＣ、第８図）。第３の差は、pBGH−Δ
９（Ser）を生成させるために使用した特定の構造に起
因する（Ｃ、第８図）。これらのヌクレオチドの差はい
ずれも、pSGH−Δ７の挿入DNA配列により暗号化されるS
GH様ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない。
けるSGHを暗号化するものとは異なる３個のヌクレオチ
ドを有する（第４図および第５図）。これらの差のうち
２つは、BGH暗号化配列とSGH暗号化配列との間の差から
生ずる（ＡおよびＣ、第８図）。第３の差は、pBGH−Δ
９（Ser）を生成させるために使用した特定の構造に起
因する（Ｃ、第８図）。これらのヌクレオチドの差はい
ずれも、pSGH−Δ７の挿入DNA配列により暗号化されるS
GH様ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない。
次いで、競合イー・コリK12λ（ワルター・フアイエ
ルスの寄贈物）200μｌを10μｌの0.1MMgCl2の存在下で
形質転換させ、その際これら細胞を氷中で15分間急冷
し、42℃で２分間培養しかつ室温で10分間培養した。2m
lのＬ−ブロスを加えた後、細胞を37℃にて１時間増殖
させ、200μｌ部分を50μg/mlのアンピシリンが補充さ
れたＬ−ブロスを含有するペトリ皿に接植した。37℃で
16時間集落を増殖させ、そしてアンピシリン耐性の24種
のクローンをランダムに選択した。
ルスの寄贈物）200μｌを10μｌの0.1MMgCl2の存在下で
形質転換させ、その際これら細胞を氷中で15分間急冷
し、42℃で２分間培養しかつ室温で10分間培養した。2m
lのＬ−ブロスを加えた後、細胞を37℃にて１時間増殖
させ、200μｌ部分を50μg/mlのアンピシリンが補充さ
れたＬ−ブロスを含有するペトリ皿に接植した。37℃で
16時間集落を増殖させ、そしてアンピシリン耐性の24種
のクローンをランダムに選択した。
これらクローンのそれぞれの培養物を、50μg/mlのア
ンピシリンが補充されたＬ−ブロス5ml中で37℃にて12
時間増殖させ、そしてクライン等（上記）により記載さ
れたミニ調製法により各培養物の細胞1mlからプラスミ
ドDNAを精製した。次いで、EcoRI−BamHI制限およびポ
リアクリルアミドゲル分別によつて24種のプラスミドに
おけるEcoRI−BamHI挿入物を寸法決定した。適当な寸法
の挿入物を有する９個の断片を選択した。次いで、ジー
・エヌ・ブエル等、ジヤーナル・バイオロジカル・ケミ
ストリー・第254巻、第9279-83頁（1979）に実質的に記
載されたように、イー・コリMC1061をpSGH−Δ７と命名
したこれらクローンの１種により形質転換させた。さら
に、これら細胞をpcI857（ダブリユー・フアイエルスの
寄贈物）により形質転換させた。※集落をアンピシリン
（50μg/ml）およびカナマイシン（40μg/ml）が補充さ
れたＬ−ブロス中で30℃にて16時間増殖させることによ
りpSGH−Δ７およびpcI857で形質転換された細胞を選択
した。
ンピシリンが補充されたＬ−ブロス5ml中で37℃にて12
時間増殖させ、そしてクライン等（上記）により記載さ
れたミニ調製法により各培養物の細胞1mlからプラスミ
ドDNAを精製した。次いで、EcoRI−BamHI制限およびポ
リアクリルアミドゲル分別によつて24種のプラスミドに
おけるEcoRI−BamHI挿入物を寸法決定した。適当な寸法
の挿入物を有する９個の断片を選択した。次いで、ジー
・エヌ・ブエル等、ジヤーナル・バイオロジカル・ケミ
ストリー・第254巻、第9279-83頁（1979）に実質的に記
載されたように、イー・コリMC1061をpSGH−Δ７と命名
したこれらクローンの１種により形質転換させた。さら
に、これら細胞をpcI857（ダブリユー・フアイエルスの
寄贈物）により形質転換させた。※集落をアンピシリン
（50μg/ml）およびカナマイシン（40μg/ml）が補充さ
れたＬ−ブロス中で30℃にて16時間増殖させることによ
りpSGH−Δ７およびpcI857で形質転換された細胞を選択
した。
※ pcI857は感温性PLリプレツサおよびカナマイシン耐
性を暗号化する遺伝子を有する小型プラスミドである。
性を暗号化する遺伝子を有する小型プラスミドである。
次いで、アンピシリン耐性かつカナマイシン耐性の集
落をランダムに吊上げ、そしてこれらを前記と同様にア
ンピシリンおよびカナマイシンが補充されたＬ−ブロス
5ml中で30℃にて１晩増殖させた。次いで、培養物を25m
lのＬ−ブロスで42℃にて希釈し、そしてこれら細胞を4
2℃で２時間増殖させた（O.D.＝１）。
落をランダムに吊上げ、そしてこれらを前記と同様にア
ンピシリンおよびカナマイシンが補充されたＬ−ブロス
5ml中で30℃にて１晩増殖させた。次いで、培養物を25m
lのＬ−ブロスで42℃にて希釈し、そしてこれら細胞を4
2℃で２時間増殖させた（O.D.＝１）。
形質転換された細胞により生産されたSGH様ポリペプ
チドを単離するため、細胞1mlを採取し、これを遠心分
離し（8000rpm.4min）、50μｌのレムリ緩衝液（１％SD
S）〔レムリ、ネイチヤー誌、第227巻、第681頁以降（1
970）〕を加え、混合物を15分間煮沸し、そして再び細
胞を遠心分離して（8000rpm.4min）細胞の残骸を除去し
た。標準BGHに対するうさぎ抗血清を使用するSGH競合放
射免疫分析により上澄液を分析した。収率:SGH活性（mg
/l）32;細胞１個当りのSGH様分子1.6×106。
チドを単離するため、細胞1mlを採取し、これを遠心分
離し（8000rpm.4min）、50μｌのレムリ緩衝液（１％SD
S）〔レムリ、ネイチヤー誌、第227巻、第681頁以降（1
970）〕を加え、混合物を15分間煮沸し、そして再び細
胞を遠心分離して（8000rpm.4min）細胞の残骸を除去し
た。標準BGHに対するうさぎ抗血清を使用するSGH競合放
射免疫分析により上澄液を分析した。収率:SGH活性（mg
/l）32;細胞１個当りのSGH様分子1.6×106。
したがつて、本発明のDNA配列および組換DNA分子は、
SGH様ポリペプチドの生産を高収率で可能にする。さら
に、本発明の配列、分子および方法は、慣用の方法を使
用する精製の後に豚における一般的同化作用剤としてこ
れら動物における成長速度、体重増加および肉生産を特
に増加させるのに有用な新規なSGH様ポリペプチドの生
産を可能にする。
SGH様ポリペプチドの生産を高収率で可能にする。さら
に、本発明の配列、分子および方法は、慣用の方法を使
用する精製の後に豚における一般的同化作用剤としてこ
れら動物における成長速度、体重増加および肉生産を特
に増加させるのに有用な新規なSGH様ポリペプチドの生
産を可能にする。
本発明によるSGH様ポリペプチドの生産方法の上記具
体例は標準SGHに比較してその最初の７個のアミノ酸を
喪失しかつｆ−Metを有するSGH様ポリペプチドを与える
が、当業者はその他の作成を用いて本発明の範囲を逸脱
することなくその他のSGH様ポリペプチドを生成させる
こともできる。たとえば、ATG開始コドンまたはATG開始
コドンとその他のコドンを標準SGHの最初のアミノ酸を
暗号化するTTCコドンに直接に融合させるような作成を
行なうこともできる。この種の作成は、ｆ−Metに融合
された、または他のアミノ酸を介してｆ−Metに融合さ
れた成熟SGHの生産を可能にする。※しかしながら、本
発明のSGH様ポリペプチドを生産するには、ずつと高い
収率が得られるためpSGH−Δ７をイー・コリHB101にお
いて使用するのが好ましい。
体例は標準SGHに比較してその最初の７個のアミノ酸を
喪失しかつｆ−Metを有するSGH様ポリペプチドを与える
が、当業者はその他の作成を用いて本発明の範囲を逸脱
することなくその他のSGH様ポリペプチドを生成させる
こともできる。たとえば、ATG開始コドンまたはATG開始
コドンとその他のコドンを標準SGHの最初のアミノ酸を
暗号化するTTCコドンに直接に融合させるような作成を
行なうこともできる。この種の作成は、ｆ−Metに融合
された、または他のアミノ酸を介してｆ−Metに融合さ
れた成熟SGHの生産を可能にする。※しかしながら、本
発明のSGH様ポリペプチドを生産するには、ずつと高い
収率が得られるためpSGH−Δ７をイー・コリHB101にお
いて使用するのが好ましい。
※ 成熟SGHの一部でない任意のアミノ酸或いはSGH自身
の非活性必須アミノ酸を発現の際、或いはそれに続いて
除去した後、ポリペプチドを使用して動物を処理しうる
ことを了解すべきである。
の非活性必須アミノ酸を発現の際、或いはそれに続いて
除去した後、ポリペプチドを使用して動物を処理しうる
ことを了解すべきである。
ｆ−Met−成熟SGHを暗号化する構造の有用な製造方法
の１つを第９図および第10図に示す。この具体例におい
ては、pSGH-9DをHaeIIにより制限し、成熟SGHのアミノ
酸１を暗号化するTTCコドンの前方に残存するヌクレオ
チドを除去し、かつ残存する断片をAvaＩにより制限し
てTTCで初まる成熟SGHの５′暗号化末端を単離した。次
いで、この断片を、成熟SGHの３′暗号化末端を暗号化
するpSGH−Δ７からのAvaＩ−BamHI断片と組合せた。次
いで、この断片を上記したpBGH−Δ９（Ser）から誘導
したクローン化ベクター中へ挿入し、TTCコドンをATGコ
ドンに対し鈍端化させた。したがつて、この構造（pSGH
-（Met-Phe））は、適当な宿主においてｆ−Met−成熟S
GHの生産を可能にする。
の１つを第９図および第10図に示す。この具体例におい
ては、pSGH-9DをHaeIIにより制限し、成熟SGHのアミノ
酸１を暗号化するTTCコドンの前方に残存するヌクレオ
チドを除去し、かつ残存する断片をAvaＩにより制限し
てTTCで初まる成熟SGHの５′暗号化末端を単離した。次
いで、この断片を、成熟SGHの３′暗号化末端を暗号化
するpSGH−Δ７からのAvaＩ−BamHI断片と組合せた。次
いで、この断片を上記したpBGH−Δ９（Ser）から誘導
したクローン化ベクター中へ挿入し、TTCコドンをATGコ
ドンに対し鈍端化させた。したがつて、この構造（pSGH
-（Met-Phe））は、適当な宿主においてｆ−Met−成熟S
GHの生産を可能にする。
或いは、標準SGHからの削去を含む、或いは標準SGHか
らのアミノ酸改変を含むその他の新規のSGH様ポリペプ
チドを、DNAレベルに対する適当な構造により或いはポ
リペプチド生成後の化学的もしくは酵素的反応により作
成することもできる。たとえば、上記の技術を用いてΔ
３−SGHを作成した。これらの構造およびポリペプチド
も本発明の一部である。
らのアミノ酸改変を含むその他の新規のSGH様ポリペプ
チドを、DNAレベルに対する適当な構造により或いはポ
リペプチド生成後の化学的もしくは酵素的反応により作
成することもできる。たとえば、上記の技術を用いてΔ
３−SGHを作成した。これらの構造およびポリペプチド
も本発明の一部である。
必らずしも全てこれら構造が本発明の所望SGH様ポリ
ペプチドの生産において同等に有効であるとは限らな
い。しかしながら、当業者はここに記載した方法および
分析を用いて、特定の発現系、宿主および使用に適する
構造およびポリペプチドを選択することができる。
ペプチドの生産において同等に有効であるとは限らな
い。しかしながら、当業者はここに記載した方法および
分析を用いて、特定の発現系、宿主および使用に適する
構造およびポリペプチドを選択することができる。
精製後の上記SGH様ポリペプチドを使用しかつ成長ホ
ルモンを動物へ投与するために従来知られた手段および
方法〔たとえば、イー・ジエー・ターマン、上記〕によ
り豚を処理して、それらの成長速度および肉生産を改善
した。たとえば、上記のように生成されたSGH−Δ７
は、ラツトの試験における天然のSGHと同様な体重増加
活性を示した。
ルモンを動物へ投与するために従来知られた手段および
方法〔たとえば、イー・ジエー・ターマン、上記〕によ
り豚を処理して、それらの成長速度および肉生産を改善
した。たとえば、上記のように生成されたSGH−Δ７
は、ラツトの試験における天然のSGHと同様な体重増加
活性を示した。
本発明の方法により作成された微生物および組換DNA
分子は1982年９月15日付けでメリーランド州・ロツクビ
ル在のアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
に寄託された培養物を例とし、これら培養物はSGH−Ａ
およびＢとして同定された： A:イー・コリK12MC1061（pSGH-9D） B:イー・コリK12λ（pSGH−Δ７） これら培養物には、それぞれ寄託番号ATCC39191および3
9192が付与された。
分子は1982年９月15日付けでメリーランド州・ロツクビ
ル在のアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
に寄託された培養物を例とし、これら培養物はSGH−Ａ
およびＢとして同定された： A:イー・コリK12MC1061（pSGH-9D） B:イー・コリK12λ（pSGH−Δ７） これら培養物には、それぞれ寄託番号ATCC39191および3
9192が付与された。
以上、本発明の多くの具体例につき説明したが、この
基本構成を改変して本発明の方法および構成を利用する
その他の具体例も提供することができる。したがつて、
本発明はその思想および範囲を逸脱することなく多くの
変更および改変をなしうることが了解されよう。
基本構成を改変して本発明の方法および構成を利用する
その他の具体例も提供することができる。したがつて、
本発明はその思想および範囲を逸脱することなく多くの
変更および改変をなしうることが了解されよう。
第１図は本発明のポリペプチドを暗号化する挿入DNA配
列を特徴とする組換DNA分子の混合物を製造するための
本発明の方法の１具体例を示す略図であり、 第２図は本発明のDNA配列を選択するためのクローン選
別法の２つの例を示す略図であつて、第１のものは牛成
長ホルモンからの試料へヒブリド化させてSGH関連cDNA
配列を選択するものであり、第２のものはSGH関連cDNA
の処理により作成された試料を使用するものであり、 第３図は本発明のDNA配列SGH-9Dのヌクレオチド配列を
決定するために使用される配列決定法の略図であり、 第４〜５図は本発明のDNA配列SGH-9Dのヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列を示す配列図であり、 第６図は第４図および第５図に示されたヌクレオチド配
列のコンピユータ分析により決定された制限部位の部分
図であり、 第７図は本発明の組換DNA分子pSGH−Δ７の作成におけ
る１具体例を示す略図であり、 第８図はpSGH−Δ９（Ser）、pSGH-9DおよびpSGH−Δ７
の適切なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す配
列図であり、 第９図および第10図は本発明の組換DNA分子pSGH-（Met-
Phe）の作成の１具体例を示す略図である。
列を特徴とする組換DNA分子の混合物を製造するための
本発明の方法の１具体例を示す略図であり、 第２図は本発明のDNA配列を選択するためのクローン選
別法の２つの例を示す略図であつて、第１のものは牛成
長ホルモンからの試料へヒブリド化させてSGH関連cDNA
配列を選択するものであり、第２のものはSGH関連cDNA
の処理により作成された試料を使用するものであり、 第３図は本発明のDNA配列SGH-9Dのヌクレオチド配列を
決定するために使用される配列決定法の略図であり、 第４〜５図は本発明のDNA配列SGH-9Dのヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列を示す配列図であり、 第６図は第４図および第５図に示されたヌクレオチド配
列のコンピユータ分析により決定された制限部位の部分
図であり、 第７図は本発明の組換DNA分子pSGH−Δ７の作成におけ
る１具体例を示す略図であり、 第８図はpSGH−Δ９（Ser）、pSGH-9DおよびpSGH−Δ７
の適切なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す配
列図であり、 第９図および第10図は本発明の組換DNA分子pSGH-（Met-
Phe）の作成の１具体例を示す略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ［255］（1980）Ｐ．7521− 7524 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．［245 ］（1970）Ｐ．3402
Claims (7)
- 【請求項１】豚成長ホルモンの生物学的活性を示すポリ
ペプチドをコードするDNA配列であって、 からの５′末端欠失を特徴とするDNA配列、 （ｅ） 遺伝子コードの結果として前記DNA配列のいず
れかに縮重し、かつ豚成長ホルモンの生物学的活性を示
すポリペプチドをコードするDNA配列、 よりなる群から選択されることを特徴とする遺伝子。 - 【請求項２】豚成長ホルモンの生物学的活性を示すポリ
ペプチドをコードし、かつDNA配列： からの５′末端欠失を特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の遺伝子。 - 【請求項３】豚成長ホルモンの生物学的活性を示すポリ
ペプチドをコードし、かつDNA配列： からの５′末端欠失を特徴とする特許請求の範囲第２項
記載の遺伝子。 - 【請求項４】豚成長ホルモンの生物学的活性を示すポリ
ペプチドをコードするDNA配列であって、 からの５′末端欠失を特徴とするDNA配列、 （ｅ） 遺伝子コードの結果として前記DNA配列のいず
れかに縮重し、かつ豚成長ホルモンの生物学的活性を示
すポリペプチドをコードするDNA配列、 よりなる群から選択されるDNA配列を含む組換DNA分子で
あって、前記DNA配列は前記組換DNA分子中で発現制御配
列に作用結合されることを特徴とする組換DNA分子。 - 【請求項５】豚成長ホルモンの生物学的活性を示すポリ
ペプチドをコードし、かつDNA配列： からの５′末端欠失を有するDNA配列を含む組換DNA分子
であって、前記DNA配列は前記組換DNA分子中で発現制御
配列に作用結合されることを特徴とする特許請求の範囲
第４項記載の組換DNA分子。 - 【請求項６】豚成長ホルモンの生物学的活性を示すポリ
ペプチドをコードし、かつDNA配列： からの５′末端欠失を有するDNA配列を含む組換DNA分子
であって、前記DNA配列は前記組換DNA分子中で発現制御
配列に作用結合されることを特徴とする特許請求の範囲
第５項記載の組換DNA分子。 - 【請求項７】発現制御配列がlac系、trp系、ファージλ
の主オペレータおよびプロモータ領域、fdコート蛋白質
の制御領域ならびに原核もしくは真核細胞およびそれら
のウィルスの遺伝子の発現を制御するその他の配列なら
びにそれらの組合せよりなる群から選択されることを特
徴とする特許請求の範囲第４項ないし第６項のいずれか
に記載の組換DNA分子。
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