JPS6384500A - ヒト２０ｋ成長ホルモンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、約２０にダルトンの分子量を有するヒト成長
ホルモン（ヒト２ＯＫ成長ホルモン）の製造方法に関す
る。

ヒト成長ホルモンは、成長促進作用を有する蛋白質で、
ヒト下垂体前葉あるいは血中に見出される。このヒト成
長ホルモンとしては、１９１個のアミノ酸からなり、２
２にダルトンの分子量を有する成長ホルモン（以下２２
ＫｈＧＨと略称する）が知られていたが、近年この２２
ＫｈＧｌ（の他に約２０にダルトンの分子量を有するヒ
ト２０に成長ホルモン（以下２０ＫｈＧＨと略称する）
が存在することが判明した。

この２０ＫｈＧ）Ｉは、ヒト成長ホルモン中に正常人お
よび末端肥大症患者を問わず、５〜１０％程度存在して
おり、そのアミノ酸配列は、２２ＫｈＧＨの配列のＮ−
末端より３２番目から４６番目までの配列が欠落した第
１図に示す配列を有すると推定されている（Ｌｅｗｉｓ
、　Ｕ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏａｕ＋＋ｕｎ、、　９２．５１１−５１８　（１９
８０）およびＣｈａｐｍａｎ。

Ｇ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｌｌ、、　２５６．２３９５−２４０１（１９８１）参
照）。

この２０ＫｈＣＨは、成長促進作用においては２２Ｋｈ
ＣＨと同様であるが、２２ＫｈＧＨが有している初期イ
ンスリン様活性、後期脂質分解作用および糖尿病原性活
性などに由来する副作用がなし゛という特長を有してお
り、小人症、火傷、潰瘍、骨折等の治療薬として２２Ｋ
ｈＧＨより優れた性質を有するものと期待されている。

しかしながら、２０ＫｈＧ）ｌを天然から得ることは、
次の点で困難であり、収率も極めて悪い。

（１）　２０ＫｈＧＨを含むヒト成長ホルモンを充分な
量をもって得るには、ヒト下垂体が大量に必要であるが
、ヒト下垂体の入手は容易でない。

（２）加えて、ヒト成長ホルモンから２０ＫｈＧＨを単
離するには、これを性質の近似した２２ＫｈＧＨから分
離しなければならず、収率が悪い。

これらの事情から、従来、２０ＫｈＧＨは、その優れた
性質が治療薬として期待されているにもかかわらず、入
手することが困難であった。

本発明者等は、２０ＫｈＧ）Ｉを大量生産することがで
きる技術を提供すべく研究を重ね、ヒト細胞から２０Ｋ
ｈＧＨをコードするＤＮＡを得ることに成功し、このＤ
ＮＡを用いて遺伝子組換え技術に基づき微生物に２０Ｋ
ｈＧＨを生産せしめることに成功して本発明を完成する
に至った。

本発明は、２０ＫｈＧ）ｌをコードするヒト細胞由来の
ＤＮＡ配列を含む発現ベクターにより形質転換された微
生物を培養し、培養物中にヒト２０に成長ホルモンを生
成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする２０Ｋ
ｈＧＨの製造方法を提供するものである。

本発明の製造方法に用いる２０ＫｈＧＨ遺伝子は、ヒト
下垂体前葉から得たポリ囚”　ＲＮＡを用いてｃＤＮＡ
のライブラリーを作成し、このライブラリーから２２Ｋ
ｈＧＨ遺伝子の断片をプローブに用いてハイブリダイゼ
ーション法により得られたものである。この２０ＫｈＧ
Ｈ遺伝子は、２２ＫｈＧＨが有している３２番目のトリ
プレットコドン力）ら４６番目のトリプレットコドンま
での４５ｂｐのＤＮＡ配列が欠落している点で２２Ｋｈ
ＧＨ遺伝子とは異なる。

ヒト下垂体前葉からのポリ（Ｎ”　ＲＮＡの調製は、オ
リゴｄＴクロマトグラフィ等により行なうことができる
。　ｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）　”　ＲＮＡよりオリゴｄ
Ｔをブライマーとして逆転写酵素を用いて合成すること
ができる。このｃＤＮＡに必要に応じてｄＣ連鎖を付加
し、適当な制限酵素により前記ｃＤＮＡを含む断片を得
、これをリンカ−［ＩＮＡと共に環状化せしめることに
より前記ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを得ることが
できる。

このプラスミドを大腸菌等に導入して形質転換体を得、
この形質転換体からハイブリダイゼーション法等を使用
して前記２０ＫｈＧＨ遺伝子が組込まれたプラスミ１を
有する菌株を選択することにより、２０ＫｈＧＨ遺伝子
のライブラリーが得られる。ハイブリダイゼーション法
を適用する場合には、２２ＫｈＧＨ遺伝子のｃＤＮＡま
たはその断片をプローブとして使用することができる。

このプローブを用いてクローンを選択した場合、そのプ
ラスミドは２０ＫｈＧＨ遺伝子をもつものと２２ＫｈＧ
Ｈ遺伝子をもつものとが混在しているため、更にハイブ
リッドダイゼーション法等による選択が必要である。

本発明においては、２０ＫｈＧＨ遺伝子と２２ＫｈＧ）
Ｉ遺伝子とを分離するために、２２ＫｈＧＨ遺伝子では
欠落していると推定されているＤＮＡ配列中のＭｂ。

■とＰｓｔｒとで切断される３１ｂｐの断片をプローブ
として用いた。そしてこのプローブにハイブリダイズし
ないプラスミドを有する菌株を選択し、目的とする２０
ＫｈＧＨ遺伝子を有する形質転換体を得た。

上記のクローニングにより得られた２０ＫｈＧＨ遺伝子
の塩基配列は、例えばＭａｘａｍ−Ｇ１１ｂｅｒｔ法（
Ｍａｘａｍ、　Ａ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、、
　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ−ｍｏｌｏｇｙ　６５
．４９９−５６０　（１９７９））ニＪニッチ決定する
ことができる。

得られたクローンから２０ＫｈＧＨ遺伝子の全部または
一部を取り出し、適当なプロモーター、ＳＤ配列等の制
御因子の下流に位置するように発現ベクターに組込み、
このベクターで適当な宿主微生物を形質転換することに
より、２０ＫｈＧ）ｌ産生能を有する形質転換体が得ら
れる。この形質転換体を適当な培地で培養し、培養物か
ら２０ＫｈＧＨを単離することにより２０ＫｈＧＨを得
ることができる。

前記発現ベクターに用いるプロモーターとしては、　ｔ
ｒｐプロモーター、Ｉａｃプロモーター、ＳＶ４０プロ
モーター、入ファージプロモーターおよびそれらのハイ
ブリッドプロモーターなどが使用できる。また、宿主と
しては、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、昆虫細胞、動
物細胞等が挙げられ、前記発現ベクターに用いたプロモ
ーターに対して適切な宿主を選択して使用できる。

形質転換体の培養は、宿主に対して適切な公知の培地を
用いて行なうことができる。

培養物からの２０ＫｈＧＨの単離、精製は、例えば培養
物から微生物を実収し、超音波処理、塩酸グアニジン処
理等を用いて微生物を破壊して遠心分離等により細胞蛋
白質を含む上澄を得、これに公知の蛋白質の精製方法を
適用して行なう。この蛋白質の精製は１例えば、塩析、
ＨＰＬＣ等のクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を組
合わせて行なうことができる。

本発明により得られる２０ＫｈＧＨは、２２ＫｈＧＨを
含まないヒト成長ホルモンである。この２０ＫｈＧＨは
、産生に使用する宿主によっては、そのＮ−末端に翻訳
開始コドンに対応するアミノ酸メチオニンが結合した蛋
白質として得られるが、このＮ−末端のメチオニンが、
宿主微生物内で発現後切断され、成熟蛋白として得られ
る場合もある。

本発明により、２０ＫｈＧ）Ｉを大量に入手することが
可能となり、２２ＫｈＧＨが有するインスリン様活性、
糖尿病原性などに由来する副作用を低減し得るヒト成長
ホルモンとして臨床への応用が可能となる。

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、
本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例１ ヒト　　　　寸−か　の　ポリＩ１０”　ＲＮＡ　　・
　。

ヒトの脳下垂体前葉１．７層５ｇを液体窒素中で凍結さ
せた後、乳ばち中で組織を粉砕し、これを消泡剤、　５
Ｍグアニジン−塩酸、２ｚザルコシル、５０ｍＭ　）リ
ス−塩酸（ｐＨ７，９）、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５
％β−メルカプトエタノールからなる溶液５０戚中に分
散せしめた。ポリトロン　ホモジナイザーを用いて２分
間処理し１組織を完全に破砕した。これを室温に３０分
間放置し、泡が消失した後、７ｍＱの５．７Ｍ塩化セシ
ウム溶液を含むクイックシールチューブに２層になるよ
うに注入した。その上層には、パラフィンオイルを注入
し、クイックシールを完全に満たし、チューブを封じた
。ベックマンＶＴｉ　５０ローターを用いて２０℃、４
００００ｒｐｍで２０時間遠心分離を行なった。

遠心分離後、得られた沈殿を５戚蒸留水に４５℃で溶解
した。得られた全ＲＮＡを遠心チューブに移し、　３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ７）Ｏ，，５ｍＱとエタノール１
２．５１１Ｑを加え、−２０℃に１時間放置した。これ
をベックマンＪＳ−１３０−ターを用いてｅｏｏｏｒｐ
＋ｉ、４℃、３０分間遠心分離を行ない、得られた沈殿
を減圧下で乾燥させた。得られた全ＲＮＡを、５０℃で
５雄蒸留水に溶解した。

次に、Ｍａｎｉａｔｉｓ等の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ他
編、　Ｎｏ−１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、１９７−１９９
頁参照）を用いて、上記の全ＲＮＡからポリ■“ＲＮＡ
の分離を行なった。これには、まず全ＲＮＡを２ｍＭ　
ＥＤＴＡと０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，８）から
なる溶液に溶解し、２ｍｇ／ａＱの濃度に調製した。こ
れを６−のオリゴｄＴセルロースを詰めたカラムに通し
ざらにカラムバッファー（０，５Ｍ酢酸ナトリウムＰＨ
５，６，０，５％う’７１Ｊ　ル硫酸ナトリウム、２ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ）で洗浄した６次に蒸留水を用′いてポリ
■十ＲＮＡを溶出した。この操作を再度繰り返した後、
溶出したポリ■＋ＲＮＡをエタノール沈殿により回収し
、最終的に２４．５Ｊｊ９の全ポリＩＡＩ”　ＲＮＡを
得た。

実施例２ ポリ囚＋ＲＮＡから２　　　ＤＮＡ　　　！ポリ（Ａ３
”ＲＮＡから２本鎖ＤＮＡの作製は、Ｈ，０ｋａ−ｙａ
　ｍａとＰ、　Ｂｅｒｇに報告されている方法（Ｎｏｌ
ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、　２Ｌ１８１−１７０頁（１９Ｂ２））を用いた。

ｚｊ二Ｌし１　　ｃＤＮＡｃ７）合を 実施例１で得た全ポリ■＋ＲＮＡ　１．４．を１．４叩
の３°−オリゴ（ｄＴ）−ティルトｐｃＤＶ　ｌプラス
ミド（３’−ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−Ｔａｉｌｅｄ　ｐｃ
ＤＶ　１　ｐｌａｓｍｉｄ；７　フルマシア製の市販品
）と５単位の逆転写酵素を１０蔵の反応液（５０ｍＭト
リス−塩酸（ｐｌ（８，３）、８ｍＮ塩化マグネシウム
、３０ｍＭ塩化カリウム、０．３ｍＭジチオス１／イト
ール、各２ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＧＴＰお
よびｕＣＴＰ）に加え、４００分間反応せた０反応は、
０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）　Ｉ　Ａ　ト１０
＄　ラウＩＪ　ル硫酸ナトリウム０．５　ｄを加えるこ
とにより停止させた０次に。

１０ｄのフェノール／クロロホルム混液（１：　１）を
加えて振とうし、遠心分離を行い、水層を得た。これに
１０ｄの４Ｎ＃酸アンモニウムと４０戚のエタノールを
加え、ドライアイス−エタノール中で１５分間冷却し、
次に沈殿したデオキシヌクレオチド　トリホスフェート
を溶解させるために１０分間放置した後、遠心分＃　（
１５ＱＯＯｒｐｍ　１０分間）を行ナイ、沈殿を得た。

エタノール沈殿を再度繰り返し、沈殿をエタノールで洗
浄した。

７．９シ仁メヱ　ｄＣテーリング ステップ１で得られた沈殿を１５戚の１４ｈ＋Ｍカコジ
ルナトリウム、３０ｍにトリス−塩酸（ｐＨｅ、ｅ）、
１ｍＷ塩化コバル）、０．１ｍＭジチオスレードール、
および８８ＩＬＭｄＣＴＰ溶液に溶解した。　１８単位
のターミナル　デオキシヌクレオチジル転移酵素（市販
品：ファルマシア製）を加えて３７℃、５分間反応させ
た後１反応を停止させた。　１５ｄのフェノール／クロ
ロホルム混液（１：１）を加えて撹拌後、遠心分離を行
ない水層を得た。これに１５蛾の４Ｍ酢酸アンモニウム
を加え、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿を３０４の０．３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５，８）に溶解し、６０戚の冷エ
タノールを加え、ドライアイス−エタノール中で１０分
間冷却した後、遠心分離を行ない、ＤＮＡの沈殿を得た
。沈殿を更にエタノールで洗浄した。

五ｉユｌユ　Ｈｉｎｄ　［ＩＩを用いた消化ステップ２
で得られた沈殿を２０１１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７，４
）、７ｍＭ塩化マグネシウム、６０ｍＭ塩化ナトリウム
およびＯ，Ｉｒａｇのウシ血清アルブミンから成る溶液
ＩＯ戚に溶解した。次に、２．５単位の旧ｎｄｍを３７
℃で１時間作用させた後、反応を停止させた。

等容量のフェノール／クロロホルム（ｔｉｔ）混液を用
いて抽出を行なった後、水層を分離し、これに１０ｄの
儲酢酸アンモニウムと４０戚のエタノールを加え、１０
分間ドライアイス／エタノール中で冷却し、遠心分離す
ることによりＤＮＡの沈殿を得た。

エタノールを加えて沈殿を洗浄し、１０戚の１ｈＭ　ト
リス−塩酸（ｐＨ７，３）とｌ　ｍＷ　ＥＤＴＡに溶解
した。

ニニュフ」３°−オリゴ（ｄＧ）　−ティルトｐｓｖ　
１９３２Ｈ４ｎｄＩ［Ｉリンカ−を用いたプラスミドの
環状化 ステップ３で得られたＨｉｎｄ　ＩＩＩ消化オリゴ（ｄ
Ｃ）ティルトプラスミド１戚（０，０２ｐｍｏｌ）を、
１０ＩＩＭ　）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、ｌ　ｍＭ　
ＥＤＴＡおよび７載ｇの３゛−オリゴ（ｄＧ）−ティル
トｐＳＶ　１９３２　ＨｉｎｄＩＩＩリンカ−（３’−
０！ｉｇｏ（ｄＧ）−Ｔａｉｌｅｄ　ｐＳＶ　１９３２
　Ｈｉｎｄｍ　ｌ１ｎｋｅｒ：市販品、ファルマシア製
）を含む溶液１０戚に加え、６５°Ｃで２分間加熱し、
次いで４２℃に３０分間保った後に０℃に冷却して両Ｄ
ＮＡをアニールさせた。

次にｌｉｄのＤＮＡ溶液に最終的に２０ＩＩＭトリスー
塩酸（ｐＨ７，５）、４鱈塩化マグネシウム、　１０ｍ
Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍ塩化カリウム、５０ｑ／
ｍウシ血清アルブミン、０．１ｍＭβ−ＮＡＤになるよ
うに、これらの試薬を加え、全量を１００ｄとした。こ
れに１単位のＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ連結酵素（市阪品：
ニューイングランド　バイオラポス）を加え、１２℃で
一夜反応させ、両ＤＮＡを連結させた。

困えニア’５　　ＲＮＡ鎖のＤＮＡ鎖への着換プラスミ
ド上の挿入ＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置換するために、４種
類のデオキシヌクレオチド　トリホスフェート各１ｍＭ
を含む溶液４鴻、１．２５ｗＭβ−ＭＡＤ、１単位のＥ
、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ連結酵素、１単位のＥ、ｃｏｌｉ　
ＲＮａｓｅ　Ｈ（市販品：　　ＢＲＬ製）およびＱ、３
ｓ　Ｃ１８単位）のＤＮＡポリメラーゼ１を加え、１２
℃で１時間反応させた。これに冷却１０１Ｍ　）リス−
塩酸（ｐＨ７，３）を０．９緘加え、反応液を０．１ｍ
Ｑづつエッペンドルフチューブに分注し、０℃で保存し
た。

実施例３ ｃＯＮＡライブラリーの Ｃｏｈｅｎ等（Ｐｒｏｃ、　Ｗａｔｔ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、　。

柱、　２１１０−２１１４（１９７２））による方法に
従って大腸菌ＨＢＩＯＩのＤＮＡ取込能力を有する細胞
（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓ）を調製した。大腸菌
ＨＢＩＯＩを３７℃で１００畦のし一ブロスを用いて８
００ｄｍの吸光度０．５となるまで培養し、遠心分離に
より集菌した０次に５０ｍＱのｆＯｍＮ　トリス−塩酸
（ｐ）Ｉ　７．３）、５０顛塩化カルシウムに菌液を懸
濁し、０℃で５分間遠心分離を行った。沈殿した大腸菌
を２薊の上記緩衝液に懸濁した後、５分間θ℃に放置し
た。　　０．２ｍ１ｌの大腸菌ＨＢ１０１懸濁液と０．
１載の実施例２のステップ５で調製したＤＮＡとを混合
し、０℃に１５分間放置した。

次に、この混合液を３７℃で２分間培養し、室温に１０
分間放置した後、０．５ｍ１ｌのＬ−ブロスを添加して
３７°Ｃで３０分間培養した。菌液を４２℃に保持した
２、５戚のＬ−／ロス軟寒天と混合し、５０ｓ／ｎｆｆ
１のアンピシリンを有するし一プロス寒天上にスプレッ
ドし、３７°Ｃで１４時間培養した。１０枚のプレート
から合計５０００株のアンピシリン耐性株を得ることに
より、ヒト脳下垂体前葉のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ
ライブラリーを作製した。

実施例４ ４枚のプレートから形質転換体１７００株を０．４５竿
のボーアサイズを有するニトロセルロースフィルターに
移した。このフィルターを０．５Ｎ水酸化ナトリウムと
１．５Ｍ塩化ナトリウムとを浸した口紙上に３０分間行
き、次に０．５Ｍ　ｌ−リス−塩酸ｐ）＋７，１Ｍ塩化
ナトリウムを浸した口紙上に置いて溶菌と中和を行った
。フィルターを風乾した後、８０℃減圧下に２時間放着
し、　ＤＮＡをフィルターに固定した。

２２ＫｈＧ）ｌ遺伝子（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｎａｔｕｒｅ　２８１５４４−５４８（１９７９）
参照）の５００塩基対からなるＰｖｕ■断片をニックト
ランスレーション法（Ｒｉｇｂｙ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１１
３．２３７−２５１（１９７７）参照）を用いて２２Ｐ
−ｄＣＴＰで標識することによりＤＮＡプローブを作成
した。

次いで、公知の方法により、以下のようにしてヒト成長
ホルモン遺伝子を有するクローンを選択した（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（前出）　３１２−３２
３頁参照）。

ＤＮＡプローブを９５℃で５分間加熱して変性せしめ、
これを１０ｆｉのハイブリダイゼーション緩衝液（５ｏ
ｚホルムアミド、５倍濃度デンハート溶液、５倍濃度５
ＳＰＥ溶液、０．１ｚラウリルｖｔ、ｍナトリウム。

１００４７ｍＱ変性サケ精子ＤＮＡを含む）に加え、ビ
ニルバッグに入れた４枚のニトロセルロースフィルター
（プレウォッシュしたもの）と共に３７℃で一晩振とう
した。フィルターを取り出し、Ｏ，１５Ｍ塩化ナトリウ
ム−０，０５Ｍクエン酸ナトリウム溶液中で振とうしな
がらフィルターの洗浄を行った。このフィルターをＸ線
フィルムと密着させ、−８０℃で１日放置後、Ｘ線フィ
ルムを現像した。この結果、５００　ｂ、ｐ、のＰマｕ
ＩＩ断片とハイブリダイズするプラスミドを持った５３
株を選出した。

これらの５３株は、２０ＫｈＧＨ遺伝子および２２Ｋｈ
ＧＨ遺伝子のいずれかを含む大腸菌であるため、更に２
０ＫｈＧＨ遺伝子を有するクローンを選別する必要があ
る。そこで、２ＱＫｈＧＨ遺伝子には欠けており、２２
ＫｈＧＨ遺伝子にのみ見出される３２番目から４６番目
までのアミノ酸をコードする塩基配列からＭｂｏｌＴと
Ｐｓｔ　Ｉで切断される３１塩基対の断片を調製した。

この断片を前述した方法と同様にしてニックトランスレ
ーション法により３２Ｐ−ｄＣ：ＴＰを用いて標識した
。これにより得られたＤＮＡプローブを用い、前述した
５３株についてハイブリダイゼーション法により検討し
た結果、このＤＮＡプローブとハイブリダイズしないプ
ラスミドを持った菌株８個が得られた。これらの菌株は
、いずれも２０ＫｈＧ）Ｉ遺伝子が組込まれた第３図に
示すプラスミドｐｈＧＨ２０−ｆｌｔを有していた。

実施例５ ２０ＫｈＧＨプラスミド　ＤＫ２− ２０ＫｈＧＨ発現用プラスミドを第４図及び第５図に示
す方法により構築した。

２０ＫｈＧＨの５゛末端近傍をコードする下記１１式に
示す５７塩基のオリゴヌクレオチドと、それに相補的な
下記ｍ式に示す５１塩基のオリゴヌクレオチドとを化学
合成した。

５°値紅筐匝ＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴ
ＣＣＡＧＧＣＴ丁ＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧＣＴＡＧＴＧＴ
ＣＣＧＣ：Ｇ−３°　　　　　　　　　　（ＩＩ）５°
−ＣＧＧＡＧＡＣＴＡＧＣＧＴＴＧＴＣＡＡＡＡＡＣＣ
ＣＴＧＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＡＡＣＡ
ＴＧ−３°　　　　　　　　　（ｍ）これらをそれぞれ
下記成分を有する反応液１において３７℃で３０分間反
応させることにより５°末端をリン酸化した６反応液ｌ
を水飽和フェノール／クロロホルム混液及び水飽和エー
テルで抽出した後、エタノール沈殿によりリン酸化オリ
ゴヌクレオチドを得た。

〔反応液ｌ〕

合成［］ＮＡ　　　　　　　　　　（１即）１０戚０．
１ｍＭＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　２戚キナーゼ
バツフγ富　　　　　　　　　５戚ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（４単位）２戚Ｈ２０１戚 寡キナーゼバツフアは、０．２Ｍグリシン（ｐＨ１１，
５）、０．０４Ｍ　ＭｇＣｌ□、　０．０２Ｍジチオス
レードールを含む。

次に１両ＤＮＡを７ニールさせた後、プラスミドｐｈＧ
Ｈ２０−８をＨｈａ　ＩとＨｉｎｆＩとで切断して得ら
れた７８ｂｐの断片と下記成分を有する反応液２中で４
℃にて一晩反応させることにより連結し、さらに得られ
たＤＮＡをＥｃｏＲＩと旧ｎｆＩとで消化し、１３１ｂ
ｐの断片を得た。

〔反応液２〕 ｐｈＧＨ２０−８ＨｈａＩ／Ｈｉｎｆ　Ｉ断片（７８ｂ
ｐ）約１１００ｎ　　　　　　　　　　　　４Ｊアニー
ルさせた合成りＮＡ　　　　　　　　４成１０倍濃度リ
ガーゼ　バッファ木本１戚Ｔ４　［ＩＮＡリガーゼ　　
　　　　　　　　１戚＊本１０倍濃度リガーゼ　バッフ
ァは１ｍＭ　ＡＴＰ、０、ＥｔＭ　トリス−塩酸（ｐＨ
７，５）、０．１Ｍ　ＭｇＣｌ２　。

０．１Ｍジチオスレードールを含む。

次いで、上記１３１ｂｐ　（７）断片と、ｐｈＧＨ２０
−６を旧ｎｆＩとＡｃｃ　Ｉとで消化して得られた？！
３０ｂｐの断片とを反応液３中で４℃にて一晩反応させ
ることにより連結した。

〔反応液３〕 １３１ｂｐ　ＥｃａＲＩ　／Ｈｉｎｆ　Ｉ断片（約５０
ｎｇ）　　３ＪｐｈＧＨ２０−８、Ｈｉｎｆ　Ｉ　／Ａ
ｃｃ　Ｉ断片、７ａｏｂｐ　　（約３００ｎｇ）　　　
　　　　　　　５ｍ１０倍濃度９ガーゼ　バッファ　　
　　　ＩＪＪ！ＩＴ４　ＤＮＡリガーゼ（１０００単位
）　　　　　１戚これにより得られたＤＮＡをＥｃｏＲ
ＩとＡｃｃ　Ｉとで消化し、　９２０ｂｐの断片を得た
。この断片は、２０ＫｈＧＨ遺伝子をＡＴＧ　（開始コ
ドン）に続き有している。

次いで、９２０ｂＰの断片と、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲ
ＩとＡｃｃ　Ｉで切断して得られた２、ＩＫｂのベクタ
ープラスミド断片とを、下記反応液中で、　４℃にて一
晩反応させることにより連結した。

〔反応液４〕 ９２０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　／Ａｃｃ　Ｉ断片（約１０１
００ｎ　　５ＪｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ　／Ａｃｃ　Ｉ
断片（約５ｏｎｇ）　　Ｄｍ１０倍濃度９ガーゼ　バッ
ファ　　　　　１ｄＴ４　ＤＮＡリガーゼ（１０００単
位）　　　　　１戚連結反応後、７０℃にて５分間加熱
し、酵素を失活させた。次に、ＰＢＲ３２２に由来する
形質転換株の出現を抑えるために、　ＨｉｎｄＩＩＩを
用いて３７℃にて１時間処理し、これを用いてＥ、ｃｏ
ｌｉ　ＰＲＩを形質転換した。その結果、　３７００株
の形質転換体が得られた。これらのうち、２４個の菌株
についてミニブレツブ法によりプラスミドＤＮＡを抽出
し、　ＥｃｏＲＩとＡｃｃ　Ｉとによる消化で８２０ｂ
ｐの断片を生ずるプラスミドをスクリーニングした結果
、１クローンが目的のプラスミド（第４図中のｐＤＫＯ
）を有していた。

２０ＫｈＧＨ発現ベクターとして、ｔｒｐプロモーター
を有するｐＤＲ７２０（市販品：ファルマシア製）を用
いた。ｔｒｐプロモーターの作用の最適化のために、以
下に詳述するように２０ＫｈＧＨをコードする塩基配列
の上流と下流とにそれぞれＳＤ配列とターミネータ−を
挿入した。

ＳＤ配列として、５ａｌＩとＥｃｏＲＩ部位を有する下
記（ＩＶ）式のＤＮＡと合成した。

５’　−ＴＣＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧ　　　　　　　（
ＩＶ）ＧＣＣＴ（Ｃ：ＴＴＣＴＴＡＡ−５’ また、ターミネータ−としてＡｃｃ　ＩとＢａｗｌ　Ｉ
部位を有する下記（Ｖ）式のＤＮＡを合成した。

５’　−ＡＴＡＣＡＧＣＣＣＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧ
ＴＣＧＣＧＣＧＧＡＴＴＡＣＴＯ ＣＧＧＧＣＴ丁ＴＴＴＴＴＴＧ　　　　　　　　　　　
　（Ｖ）ＧＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＧ−５’
まず、上記のターミネータ−と、ｐＤＫｏをＥｃｏＲＩ
とＡｃｃＩとにより切断して得られた２０ＫｈＧＨをコ
ードする９２０ｂｐの断片とをリガーゼ　バッファ中で
７４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、さらに得られた
ＤＮＡをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとを用いて消化し、　
ａｓｏｂｐのＥｃｏＲＩ　／　Ｂａｗｌ　Ｉ断片を得た
。次いで、の９５０ｂＰの断片と、ｐＢＲ３２２をＥｃ
ｏＲＩとＢａｍＨＩとで切断して得た４Ｋｂのベクター
プラスミド断片とをリガーゼバッファ中で７４　［ＩＮ
Ａリガーゼを用いて連結した。

得られた反応液を用いてＥ、ｃｏｌｉ　０Ｈ−５株を形
質転換し、２０００株の形質転換体を得た。

上記の形質転換体について、（Ｖ）式に示したターミネ
ータ−をコードする３３塩基からなるＤＮＡをプローブ
としてハイブリダイゼーション法を適用した結果、ター
ミネータ−を含むプラスミドを有する形質転換体１５株
を同定した。これらの形質転換体について、ミニプレツ
ブ法でプラスミドを抽出し、　ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ
による消化テロ５０ｂｐノ断片が生ずるプラスミドを検
索した結果、すべてのクローンが目的のプラスミド（第
５図中に示すｐＤＫｌ）を有していた。

上記クローン中の１株（大腸菌ＤＨ−５株）よりプラス
ミドｐＤＫ　ｌを調製した。こｃ７）ｐＤＫｌをＥｃｏ
ＲＩとＢａｍＨＩを用いて消化した後、アガロースゲル
電気泳動により９５０ｂＰの断片を分離し、これをＥｌ
ｕ−ｔ　ｉ　ｐ　（Ｓ＆Ｓ社製、　　ＤＮＡ精製用カラ
ム）を用いて精製し、２０ＫｈＧＨをコードする遺伝子
とターミネータ−とを有するａｓｏｂｐのＥｃｏＲＩ　
／　ＢａｍＨＩ断片を得た。

次に、前記ＥｃｏＲＩ　／　ＢａｍＨＩ断片（９５０ｂ
ｐ）を（ＩＶ）式に示したＳＤ配列を有するＤＮＡ断片
（ＳａｌＩ部位とＥｃｏＲＩ部位を有する）とをリガー
ゼ　バッファ中で丁４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。この反応液を５ａｌＩとＢａ＋＊ＨＩとにより処理
し、エタノール沈殿により　ＤＡＭを回収した。得られ
た５ａｌＩ／Ｂａｍｈ工断片（９ＢＯｂｐ）　と、プラ
スミドｐＤＲ７２０を５ａｌＩとＢａｍＨＩにより消化
して得られた約４Ｋｂの断片とをリガー−１／　　／＜
ッファ中で↑４１１ＮＡリガーゼを用いて連結した。

上記の反応液を用いてＥ、ｃａｌｉ　ＤＨ−５を形質転
換せしめ、２５２０株の形質転換体を得た。これらの形
質転換体について前述と同様な方法でコロニーハイブリ
ダイゼーション法により目的とするクローンの選択を行
った。ここではプローブとして前述したターミネータ−
をコードする３３塩基からなるＤＮＡを３２ｐで標識し
たものを用い、このプローブとハイブリダイズしたクロ
ーン１２個を選択した。

これらのクローンからミニプレツブ法でプラスミドＩＩ
ＮＡを抽出した。ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩによる消化で
９５０ｂＰの断片を生じ、かつＢａｍＨＩと５ａｌＩに
よる消化で９８０ｂｐの断片を生ずるプラスミドを検索
した結果、１０株のクローンが目的とするプラスミド（
第５図中に示すｐＤＫ−２）を有していた。

実施例６ ２０ＫｈＧＨ−プラスミド　ＤＫ　３　　の（築トリプ
トファンプロモーターの塩基配列に関してはＢｅｎｎｅ
ｔｔ等による報告がある（Ｂｅｒｃｒ＋ｅｔｔ　ｅｔａ
ｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　７３．２３５１−２３５５（１９７［１））、　　
この塩基配列に基づき、トリプトファンプロモーターの
一１０％域とＳＯ配列とを含む下記（ｖｒ）式に示され
るＤＮＡ断片を合成法により作成した。

５°−ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴ３
’　−ＴＴＧＡＴＣＡＴＩＩ、ＣＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣ
Ａ上記のＨｐａＩ部位とＥｃｏＲ１部位とを有するＩＩ
ＮＡ断片と、　ｐＤＫｌより調製した９５０ｂＰのＥｃ
ｏＲＩ　／　ＢａｍＨ工断片とをリガーゼ　バッファ中
でＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結した０反応液から
エタノール沈殿によすＤＮＡを回収し、このＤＮＡにつ
いて、　Ｈｐａ　ＩおよびＢａｍＨＩを順次用いて消化
し、反応液から水飽和フェノール−クロロホルム混液お
よび水飽和エーテルで抽出を行ない、エタノール沈殿に
より９８０ｂｐ　（１）　Ｈｐａ　Ｉ　／ＢａｍＨＩ断
片を得た。このＨｐａ　ｒ／　Ｂａ１１）Ｉ　Ｉ断片と
、ｐ［］Ｒ７２０とＨｐａ　ＩとＢａｍＨＩとで切断し
て調製したベクター断片とをリガーゼ　バッファ中で７
４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。

これにより得られた連結反応液を用いてＥ、ｃｏｌｉＯ
Ｈ−５株を形質転換したところ、形質転換体約５０００
コロニーが得られた。これらの中からランダムに２４株
を選択し、ミニブレツブ法でプラスミドＤＮＡを抽出し
た。　　ＨｐａＩとＢａｍＨＩによる消化で９８０ｂＰ
の断片が生ずるプラスミドを検索した結果、１９クロー
ンが目的のプラスミド（ｐＤＫ３と命名、第５図参照）
を有していた。

なお、上記ｐ［ｌＫ３と実施例５で得たｐＤＫ２とは、
開始コドン（ＡＴＧ）より上流側のＳＤ配列を含む塩基
配列において、下記（ｒｖ’）式および（Ｖｌ’）式に
示す差異がある。

ｐＤＫ２　　：　　５’　−ＧＴＴＡＡＣＴＡＧＴ、Ａ
ＣＧＧＡＧＣＴ丁ＣＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡ
ＧＧＡＡＧＡＡＴＴＧ困　　　　　（ＩＶ’） ｐＤＫ３　：　５’　−ＧＴＴＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣ
ＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＧＡＡＴＴ
Ｃ回（ｖｒ゛）（上記式中上線を付した部分はＳＤ配列
を示す、） 実施例７ による２０ＫｈＧ）Ｉの 実施例５で得られたｐＤＫ２を用いてＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ
ｆｉＯＯｇａｌＫ−株を形質転換し、形質転換体Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　０８００ｇａｌＫ−（ｐＤＫ２）を得た。また
、実施例６で得られたｐＤＫ３を用いてＥ、ｃｏｌｉ　
Ｃｌ３００　ｇａｌＫ−株およびＥ、ｃｏｌｉＨＢ　１
０１株を形質転換し、形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ８０
０ｇＣ８０Ｏ（ｐＤＫ３）およびＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩ
ＯＩ（ｐＤＫ３）を得た。

これらの形質転換体をそれぞれ５００緘三角フラスコに
含まれる１００ｍＱのＭａｃＣｏｎｋｅｙ培地を用いて
２２Ｏｒｐｍ回転振とう培養器により３７℃で培養し、
８００ｎｍの０．Ｄ、値０．５まで増殖させた１次いで
、各培養液ニインドーＪｌ／　７　’）　リに％　（Ｉ
ＡＡ）を５０１Ｌ９／ａＱの濃度となるように添加し、
さらに培養を続けた。　ｐＤＫ２を有するＥ、ｃｏｌｉ
　Ｃ８００ｇａｌＫ−株は、１８時間培養後、２．８謄
／ｍＱの２０ＫｈＧＨを生成した。　ｐＤＫ３を有する
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６ｔＯＯｇａｌＫ−株は、６時間培養
後１’ｌ’　、ｈ９　／　ＩＩＩＱ　＋７）　２０Ｋｈ
ＧＩ（を生成した。マタ、ｐ［ｌＫ３を有するＥ、ｃｏ
ｌｉ　０８１０１株は、２１時間培養後、ｌＩ３．４即
／戚の２０ＫｈＧＨを生成した。

実施例８ 跋■四辺潴１ ２文のＭａｃＣａｎｋｅｙ培地を有する５文三角フラス
コを用い、１８（ｌｒｐｍの回転振とう培養器にてｐＯ
Ｋ３を有するＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ８００ｇａｌＫ−株を培
養した。　Ｂｏｏｎｓの０．Ｄ、値が０．５に到達した
時にＩＡＡを５０ＪＩＱ／緘になるように加え、さらに
６時間培養を行なった。

培養液から遠心分離により菌体を実収し、８０戚の３０
ｍＭリン酎カルシウム＋１緩衝液（ｐＨ７，０）　−１
ｍＭ　ＰＨ９Ｆに懸濁し、超音波処理を２分間づつ４回
行なった。この溶液に最終濃度０．２２になるようにポ
リエチレンイミンを加え、４℃ｔ、　３０，０ＯＯｒｐ
１１で１時間遠心分離を行なった。

次に、上澄から２０％飽和ないし６０％飽和の硫安で沈
殿する両分を集め、これを４０緘の３０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７，０）　−１ｍＭ　ＰＭＳＦに溶解
し、透析チューブに入れ、同溶液に対して透析を行なっ
た。得られた標品をＯＮセファ０−スＣＬ−６８のカラ
ムに供すると、非吸着画分と０〜０．１３Ｍ　Ｎａ１ｌ
で溶出される両分とに２０ＫｈＧＨが検出された０両両
分について、それぞれＤＥＡＥセファロース０Ｌ−８Ｂ
、セファロースＣＬ−ｆ３Ｂおよび逆相カラムを用いた
ＨＰＬＣのクロマトグラフィーにより精製を行なった。

　５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲルで判定した結果、８
５ｚ以上の輔度を有する２０ＫｈＧＨを高収量で得るこ
とができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、２０ＫｈＧＨのアミノ酸配列を示す図、第２
図は、２０ＫｈＧＨをコードするＤＮＡの塩基配列を示
す図、第３図は２０ＫｈＧＨ遺伝子のクローこングに用
いたプラスミドを示す図、第４図および第５図は、２０
ＫｂＧＨを発現するベクターの構築方法を示す図である
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト２０に成長ホルモンをコードするヒト細胞由来
   のＤＮＡ配列を含む発現ベクターにより形質転換された
   微生物を培養し、培養物中にヒト２０に成長ホルモンを
   生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするヒト
   ２０に成長ホルモンの製造方法。 ２、ヒト２０に成長ホルモンをコードするＤＮＡが式（
   I ）で示されるＤＮＡまたはその機能的に同等な誘導
   体であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
   の製造方法。 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＴＡＡ、ＴＡＧなたはＴＧＴを表す。） ３、微生物が大腸菌であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項または第２項に記載の製造方法。