JPH07101993A - 新規抗腫瘍性ペプチド - Google Patents
新規抗腫瘍性ペプチドInfo
- Publication number
- JPH07101993A JPH07101993A JP5277269A JP27726993A JPH07101993A JP H07101993 A JPH07101993 A JP H07101993A JP 5277269 A JP5277269 A JP 5277269A JP 27726993 A JP27726993 A JP 27726993A JP H07101993 A JPH07101993 A JP H07101993A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tumor
- lymphotoxin
- peptide
- blood pressure
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
(57)【要約】
【目的】本発明は、将来の癌治療分野で有用であり、遺
伝子工学によって得られる新規リンホトキシン類ペプチ
ドを提供することを目的とする。 【構成】本発明は、抗腫瘍活性が高く、毒性が少ないと
同時に、致命的な欠点である血圧低下作用の無い新規リ
ンホトキシン類ペプチドおよび当該ペプチドを有効成分
とする抗腫瘍剤である。
伝子工学によって得られる新規リンホトキシン類ペプチ
ドを提供することを目的とする。 【構成】本発明は、抗腫瘍活性が高く、毒性が少ないと
同時に、致命的な欠点である血圧低下作用の無い新規リ
ンホトキシン類ペプチドおよび当該ペプチドを有効成分
とする抗腫瘍剤である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な抗腫瘍性ペプチ
ドに関するものである。
ドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術および課題】従来知られている抗腫瘍ペプ
チドとしては、ＴＮＦ、リンホトキシン等があり、ＴＮ
Ｆでは、その副作用として血圧降下が問題となり、実際
の治療では適応が限定されるのが現状であり、またリン
ホトキシンでは、その遺伝子組換え生産における発現量
の少なさが問題となって、研究自体が進んでいないのが
現状であった。特許公開平成４年４５７８９号において
森田らは、大量生産可能で安定性の高いリンホトキシン
誘導体を発明し、その高発現と有効性を示したが、ＴＮ
Ｆで問題とされた血圧降下作用については言及されてい
ない。
チドとしては、ＴＮＦ、リンホトキシン等があり、ＴＮ
Ｆでは、その副作用として血圧降下が問題となり、実際
の治療では適応が限定されるのが現状であり、またリン
ホトキシンでは、その遺伝子組換え生産における発現量
の少なさが問題となって、研究自体が進んでいないのが
現状であった。特許公開平成４年４５７８９号において
森田らは、大量生産可能で安定性の高いリンホトキシン
誘導体を発明し、その高発現と有効性を示したが、ＴＮ
Ｆで問題とされた血圧降下作用については言及されてい
ない。
【０００３】本発明者は、森田らのペプチドについて、
その有効性と血圧降下作用について検討した結果、有効
投与量において血圧降下作用を示さないという特徴を見
いだしたが、一方で有効性においては、ＴＮＦの化学療
法係数の３倍程度と十分ではないことを見いだした。
その有効性と血圧降下作用について検討した結果、有効
投与量において血圧降下作用を示さないという特徴を見
いだしたが、一方で有効性においては、ＴＮＦの化学療
法係数の３倍程度と十分ではないことを見いだした。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の事実
に鑑み、森田らのペプチドのＮ末部分に着目し、検討を
加えた結果、森田らのペプチドのＮ末より３アミノ欠失
させたペプチドが血圧降下作用を示さず、さらに毒性が
軽減され、ＴＮＦの化学療法係数の７倍という十分な有
効性を示すことならびに本発明のペプチドと構造的に類
似のペプチドとして、特開昭６３−２７０６９８号に開
示のペプチドのように天然型リンホトキシンのＮ末より
１０アミノ酸欠失したものにフェニルアラニン若しくは
プロリンを付加したものや、単に１０アミノ酸欠失した
ものがあるが、いずれも有効投与量において血圧降下作
用を示すという致命的な欠点を有することを見いだし、
本発明のペプチドが類い無い有用なペプチドであること
も確認し本発明を完成させるに至った。
に鑑み、森田らのペプチドのＮ末部分に着目し、検討を
加えた結果、森田らのペプチドのＮ末より３アミノ欠失
させたペプチドが血圧降下作用を示さず、さらに毒性が
軽減され、ＴＮＦの化学療法係数の７倍という十分な有
効性を示すことならびに本発明のペプチドと構造的に類
似のペプチドとして、特開昭６３−２７０６９８号に開
示のペプチドのように天然型リンホトキシンのＮ末より
１０アミノ酸欠失したものにフェニルアラニン若しくは
プロリンを付加したものや、単に１０アミノ酸欠失した
ものがあるが、いずれも有効投与量において血圧降下作
用を示すという致命的な欠点を有することを見いだし、
本発明のペプチドが類い無い有用なペプチドであること
も確認し本発明を完成させるに至った。
【０００５】 で表されるアミノ酸配列（但し、Ｒは、ＭｅｔまたはＨ
を表す。）を有するペプチドを抗腫瘍剤として提供する
ものである。
を表す。）を有するペプチドを抗腫瘍剤として提供する
ものである。
【０００６】本発明の新規抗腫瘍性ペプチドは、天然型
のヒトリンホトキシン（ＬＴ）遣伝子の先頭部分より、
１０アミノ酸分のＤＮＡ（３０塩基）を除き、代わりに
Ｐｈｅ（Ｆ）およびＰｒｏ（Ｐ）の２アミノ酸で形成す
るアミノ酸配列を有するように調製した塩基配列を常法
に従い発現ベクターに組み込むことにより調製される。
のヒトリンホトキシン（ＬＴ）遣伝子の先頭部分より、
１０アミノ酸分のＤＮＡ（３０塩基）を除き、代わりに
Ｐｈｅ（Ｆ）およびＰｒｏ（Ｐ）の２アミノ酸で形成す
るアミノ酸配列を有するように調製した塩基配列を常法
に従い発現ベクターに組み込むことにより調製される。
【０００７】具体的には、例えば図１に示す手順によっ
て構築することができる。図１に示された方法によれ
ば、本発明のペプチドを発現するベクターは、公知の改
変ＬＴベクターからプロモーター部分ＳＤ領域をコード
する塩基配列（遣伝子１）とＬＴ構造遺伝子の大部分を
コードする塩基配列（遺伝子２）を切り出し、これら
と、開始コドンとアミノ酸配列を含むように合成した塩
基配列（合成遺伝子）とベクター（遣伝子３）とをライ
ゲーションするこにより構築することができる。
て構築することができる。図１に示された方法によれ
ば、本発明のペプチドを発現するベクターは、公知の改
変ＬＴベクターからプロモーター部分ＳＤ領域をコード
する塩基配列（遣伝子１）とＬＴ構造遺伝子の大部分を
コードする塩基配列（遺伝子２）を切り出し、これら
と、開始コドンとアミノ酸配列を含むように合成した塩
基配列（合成遺伝子）とベクター（遣伝子３）とをライ
ゲーションするこにより構築することができる。
【０００８】なお、図１に示された手順において用いら
れる改変ＬＴベクターは、森田らが先に開発したベクタ
ー（特開平４−４５７８９）であり、これを利用すると
リンホトキシン類を有利に発現させることができる。こ
のものは、−１０領域の塩基配列がＴＴＡＡＣＴ、−３
５領域の塩基配列がＴＴＧＡＣＡであるプロモーターを
用い、ＳＤ領域（リポソーム結合部位）と開始コドン
（ＡＴＧ）の間を１３塩基とし、これにリンホトキシン
類遣伝子を結合せしめ、かつ、リンホトキシン類構造遣
伝子以外のベクターの塩基長を２．７〜３．１ｋｂとす
ることにより構築することができる。
れる改変ＬＴベクターは、森田らが先に開発したベクタ
ー（特開平４−４５７８９）であり、これを利用すると
リンホトキシン類を有利に発現させることができる。こ
のものは、−１０領域の塩基配列がＴＴＡＡＣＴ、−３
５領域の塩基配列がＴＴＧＡＣＡであるプロモーターを
用い、ＳＤ領域（リポソーム結合部位）と開始コドン
（ＡＴＧ）の間を１３塩基とし、これにリンホトキシン
類遣伝子を結合せしめ、かつ、リンホトキシン類構造遣
伝子以外のベクターの塩基長を２．７〜３．１ｋｂとす
ることにより構築することができる。
【０００９】上記のようにして得られた改変ＬＴベクタ
ーは、常法に従いこれを用いて宿主微生物を形質転換
し、形質転換された微生物を培養することによりＬＴを
製造させることができる。
ーは、常法に従いこれを用いて宿主微生物を形質転換
し、形質転換された微生物を培養することによりＬＴを
製造させることができる。
【００１０】形質転換体の培養も常法にしたがって行う
ことができ、Ｌ−培地、Ｍ９培地、Ｍ９−カザミノ酸培
地、高リン酸培地、高リン酸−カザミノ酸培地等を利用
することができる。
ことができ、Ｌ−培地、Ｍ９培地、Ｍ９−カザミノ酸培
地、高リン酸培地、高リン酸−カザミノ酸培地等を利用
することができる。
【００１１】特に高い改変ＬＴの発現を得るには、培地
中に３β−インドールアクリル酸を添加することが好ま
しい。３β−インドールアクリル酸の添加量としては、
培地１ｍｌ当たり２０〜１００μｇ程度である。
中に３β−インドールアクリル酸を添加することが好ま
しい。３β−インドールアクリル酸の添加量としては、
培地１ｍｌ当たり２０〜１００μｇ程度である。
【００１２】培養により得られた改変ＬＴを培養物中よ
り分離精製するには、微生物菌体を例えば超音波処理等
で破砕した後、遠心分離等によって上清を得、この上清
を硫安沈澱、透析、疎水クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー等の精製手段を組み合わせて
精製することで実施される。
り分離精製するには、微生物菌体を例えば超音波処理等
で破砕した後、遠心分離等によって上清を得、この上清
を硫安沈澱、透析、疎水クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー等の精製手段を組み合わせて
精製することで実施される。
【００１３】
【実施例】次に実施例および試験例を挙げ、本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら
制約されるものではない。
らに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら
制約されるものではない。
【００１４】実施例 １ 組換え改変型ＬＴ（ＦＰΔ１０ＬＴ）の遣伝子構築と発
現： （１）ｐＢｔｒｐ ＭＬＴ ベクターからｔｒｐプロモ
ーター部分およびＬＴ構造遺伝子の取得：特開平４−４
５７８９号に開示のｐＢｔｒｐ ＭＬＴ ＤＮＡに、制
限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡社）およびＣｌａＩ（ファル
マシア社）を反応させ、低融点アガロースゲルにより泳
動後、１２９ｂｐからなるｔｒｐプロモーター部分（遺
伝子１）を回収した。また、ｐＢｔｒｐ ＭＬＴ ＤＮ
Ａに制限酵素ＮｓｉＩ（ＮＥＢ社）およびＨｉｎｄ（東
洋紡社）を反応させ、低融点アガロースゲルにより泳動
後、ＬＴ構造遺伝子４６５ｂｐ（遣伝子２）を回収し
た。
現： （１）ｐＢｔｒｐ ＭＬＴ ベクターからｔｒｐプロモ
ーター部分およびＬＴ構造遺伝子の取得：特開平４−４
５７８９号に開示のｐＢｔｒｐ ＭＬＴ ＤＮＡに、制
限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡社）およびＣｌａＩ（ファル
マシア社）を反応させ、低融点アガロースゲルにより泳
動後、１２９ｂｐからなるｔｒｐプロモーター部分（遺
伝子１）を回収した。また、ｐＢｔｒｐ ＭＬＴ ＤＮ
Ａに制限酵素ＮｓｉＩ（ＮＥＢ社）およびＨｉｎｄ（東
洋紡社）を反応させ、低融点アガロースゲルにより泳動
後、ＬＴ構造遺伝子４６５ｂｐ（遣伝子２）を回収し
た。
【００１５】（２）ＬＴ先頭部分の構築：下に示す４つ
のオリゴヌクレオチドから、ＳＤ領域と開始コドンを１
３塩基の距離を保ち、同様にＬＴの先頭部分をコードす
る遺伝子（合成遣伝子１）を調製した。
のオリゴヌクレオチドから、ＳＤ領域と開始コドンを１
３塩基の距離を保ち、同様にＬＴの先頭部分をコードす
る遺伝子（合成遣伝子１）を調製した。
【００１６】（合成遣伝子１調製のためのオリゴヌクレ
オチド） １）５´ＣＧＡ ＴＡＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＴＴＴ Ｃ
ＣＡ ＧＣＣ ＣＡＧ ２）３´Ｔ ＡＴＴ ＣＧＡ ＴＡＣ ＡＡＡ ＧＧＴ
ＣＧＧ ＧＴＣ ＴＧＡ ＣＧＧ ３）５´ＡＣＴ ＧＣＣ ＣＧＴ ＣＡＧ ＣＡＣ Ｃ
ＣＣ ＡＡＧ ＡＴＧＣＡ ４）３´ＧＣＡ ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＧＧ ＴＴＣ Ｔ
オチド） １）５´ＣＧＡ ＴＡＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＴＴＴ Ｃ
ＣＡ ＧＣＣ ＣＡＧ ２）３´Ｔ ＡＴＴ ＣＧＡ ＴＡＣ ＡＡＡ ＧＧＴ
ＣＧＧ ＧＴＣ ＴＧＡ ＣＧＧ ３）５´ＡＣＴ ＧＣＣ ＣＧＴ ＣＡＧ ＣＡＣ Ｃ
ＣＣ ＡＡＧ ＡＴＧＣＡ ４）３´ＧＣＡ ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＧＧ ＴＴＣ Ｔ
【００１７】上記オリゴヌクレオチドのうち（２）およ
び（３）のオリゴヌクレドの各々０．２ＯＤを滅菌水１
５μｌに溶解し、これにＴ４ポリヌクレオシドキナーゼ
（東洋紡社）４００ｍＭ ＡＴＰ、１０倍量のカイネー
ション緩衝液を加えて３０μｌとし、３７℃で、２時間
反応させた。反応終了後、６５℃で１０分間熱処理し、
酵素を失活させた。その後、オリゴヌクレオチド（１）
〜（４）の各々０．０５ＯＤを１本のチューブにまと
め、９０℃で３分間反応させ、ゆっくり冷却した。
び（３）のオリゴヌクレドの各々０．２ＯＤを滅菌水１
５μｌに溶解し、これにＴ４ポリヌクレオシドキナーゼ
（東洋紡社）４００ｍＭ ＡＴＰ、１０倍量のカイネー
ション緩衝液を加えて３０μｌとし、３７℃で、２時間
反応させた。反応終了後、６５℃で１０分間熱処理し、
酵素を失活させた。その後、オリゴヌクレオチド（１）
〜（４）の各々０．０５ＯＤを１本のチューブにまと
め、９０℃で３分間反応させ、ゆっくり冷却した。
【００１８】これにＴ４ＤＮＡリガーゼ２０００単位
（東洋紡社）と１Ｍ ＤＴＴ ０．５μｌ １０ｍＭ
ＡＴＰ ５μｌ、アニーリング緩衝液５μｌおよび水
７．５ｕｌとを入れ５０μｌとした。その後１６℃で１
６時間反応させ１０％ポリアクリルアミドにて泳動後、
ＥｔＢｒ染色し、目的の遣伝子を切り出し、溶出緩衝液
（０．５Ｍアンモニウムアセテート、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）中で溶出した後、脱塩した。得られた合成遺伝子１
は次の塩基配列を有していた。
（東洋紡社）と１Ｍ ＤＴＴ ０．５μｌ １０ｍＭ
ＡＴＰ ５μｌ、アニーリング緩衝液５μｌおよび水
７．５ｕｌとを入れ５０μｌとした。その後１６℃で１
６時間反応させ１０％ポリアクリルアミドにて泳動後、
ＥｔＢｒ染色し、目的の遣伝子を切り出し、溶出緩衝液
（０．５Ｍアンモニウムアセテート、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）中で溶出した後、脱塩した。得られた合成遺伝子１
は次の塩基配列を有していた。
【００１９】
【００２０】（３）ブルースクリプトＳＫＩＩ（＋）の
切断：ブルースクリプトＭ１３ＳＫＩＩ（＋）２μｇ
（東洋紡社）を制限酵素ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩに
て切断後、０．８％低融点アガロースゲルにて泳動し、
ＥｔＢｒ染色後、目的の２．９Ｋｂからなるプラスミド
ＤＮＡ（遣伝子３）を得た。
切断：ブルースクリプトＭ１３ＳＫＩＩ（＋）２μｇ
（東洋紡社）を制限酵素ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩに
て切断後、０．８％低融点アガロースゲルにて泳動し、
ＥｔＢｒ染色後、目的の２．９Ｋｂからなるプラスミド
ＤＮＡ（遣伝子３）を得た。
【００２１】（４）ｔｒｐプロモーターを保有するプラ
スミドの構築 遣伝子１、２、３、および合成遣伝子１の混合物にＴ４
ＤＮＡリガーゼを作用させＦＰΔ１０ＬＴ（式（１）の
もの）の遣伝子を有するプラスミド（ｐＢｔｒｐ ＦＰ
Δ１０ＬＴ）を得た。更に−７０℃で冷蔵保存しておい
た形質転換用ＨＢ１０１株菌体を融解し、この懸濁液１
００μｌに、ｐＢｔｒｐ ＦＰΔ１０ＬＴを２０μｌ添
加した。
スミドの構築 遣伝子１、２、３、および合成遣伝子１の混合物にＴ４
ＤＮＡリガーゼを作用させＦＰΔ１０ＬＴ（式（１）の
もの）の遣伝子を有するプラスミド（ｐＢｔｒｐ ＦＰ
Δ１０ＬＴ）を得た。更に−７０℃で冷蔵保存しておい
た形質転換用ＨＢ１０１株菌体を融解し、この懸濁液１
００μｌに、ｐＢｔｒｐ ＦＰΔ１０ＬＴを２０μｌ添
加した。
【００２２】４５分間氷冷後、４２℃で９０分間ヒート
ショックを与え、更に２分間氷冷した。ＳＯＣ培地９０
０ｕｌを添加し、３７℃で１時間培養後、懸濁液を０．
１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地プレー
ト上にまき、３７℃で一夜培養し、ｐＢｔｒｐ ＦＰΔ
１０ＭＬＴを有する形質転換体を得た。この形質転換体
からＤＮＡを分離し、制限酵素ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断した後、１％アガロースゲルにて泳動し、Ｅ
ｔＢｒ染色にて、６３４ｂｐのフラグメントを確認し
た。
ショックを与え、更に２分間氷冷した。ＳＯＣ培地９０
０ｕｌを添加し、３７℃で１時間培養後、懸濁液を０．
１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地プレー
ト上にまき、３７℃で一夜培養し、ｐＢｔｒｐ ＦＰΔ
１０ＭＬＴを有する形質転換体を得た。この形質転換体
からＤＮＡを分離し、制限酵素ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断した後、１％アガロースゲルにて泳動し、Ｅ
ｔＢｒ染色にて、６３４ｂｐのフラグメントを確認し
た。
【００２３】（５）ｐＢｔｒｐ ＦＰΔ１０ＬＴの発
現：上記（４）で得たｐＢｔｒｐ ＦＰΔ１０ＬＴにつ
いて、３７℃の条件での蛋白質の発現を確認した。ｐＢ
ｔｒｐ ＦＰΔ１０ＬＴの単一コロニーを１００μｇ／
ｍｌトリプトファンを含有するＭ９ＣＡ／Ｈｅｐｅｓ培
地（Ｍ９最小培地、１％グルコース、１ｍＭ ＭｇＳＯ
４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５％カザミノ酸、
０．１ｍｇ／ｍｌチアミン塩酸塩、０．１ｍｇ／ｍｌ
アンピシリン、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ）１０ｍｌに植
え付け、３０℃にて一夜培養した。翌日新しいＭ９ＣＡ
／Ｈｅｐｅｓ培地１０ｍｌに１／５０量植え、ＯＤ
５５０＝０．５まで培養後、３−βインドールアクリル
酸を２０μｇ／ｍｌになる様に添加し、培養温度を３７
℃に変更後１６時間培養した。
現：上記（４）で得たｐＢｔｒｐ ＦＰΔ１０ＬＴにつ
いて、３７℃の条件での蛋白質の発現を確認した。ｐＢ
ｔｒｐ ＦＰΔ１０ＬＴの単一コロニーを１００μｇ／
ｍｌトリプトファンを含有するＭ９ＣＡ／Ｈｅｐｅｓ培
地（Ｍ９最小培地、１％グルコース、１ｍＭ ＭｇＳＯ
４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５％カザミノ酸、
０．１ｍｇ／ｍｌチアミン塩酸塩、０．１ｍｇ／ｍｌ
アンピシリン、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ）１０ｍｌに植
え付け、３０℃にて一夜培養した。翌日新しいＭ９ＣＡ
／Ｈｅｐｅｓ培地１０ｍｌに１／５０量植え、ＯＤ
５５０＝０．５まで培養後、３−βインドールアクリル
酸を２０μｇ／ｍｌになる様に添加し、培養温度を３７
℃に変更後１６時間培養した。
【００２３】培養終了後、１ｍｌの菌体夜を１．５ｍｌ
の遠心管に移し、遠心にて菌体を得た。この菌体を２０
０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用緩衝液にて溶解し、９０℃
で５分間熱処理後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動し
た。泳動後、クマシーブルーにて染色し、ついで脱色し
た。脱色後、ファルマシア レーザースキャナーにて全
蛋白質当たりＦＰΔ１０ＬＴの発現量を測定したとこ
ろ、３７℃の培養条件で全蛋白質当たり１０％のＦＰΔ
１０ＬＴ蛋白質の発現が確認された。これは、３７℃の
培養条件で１ｌ当たり１０〜２０ｍｇの蛋白質量に相当
する。
の遠心管に移し、遠心にて菌体を得た。この菌体を２０
０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用緩衝液にて溶解し、９０℃
で５分間熱処理後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動し
た。泳動後、クマシーブルーにて染色し、ついで脱色し
た。脱色後、ファルマシア レーザースキャナーにて全
蛋白質当たりＦＰΔ１０ＬＴの発現量を測定したとこ
ろ、３７℃の培養条件で全蛋白質当たり１０％のＦＰΔ
１０ＬＴ蛋白質の発現が確認された。これは、３７℃の
培養条件で１ｌ当たり１０〜２０ｍｇの蛋白質量に相当
する。
【００２４】（６）蛋白質（ＦＰΔ１０ＬＴ）の生産お
よび精製：ｐＢｔｒｐ ＦＰΔ１０ＬＴを、１００μｇ
／ｍｌトリプトファンを含有するＭ９ＣＡ／Ｈｅｐｅｓ
培地２００ｍｌにて一晩培養し、この培養液を７ｌのＭ
９ＣＡ／Ｈｅｐｅｓ培地に接種し、ＯＤ５５０＝０．５
まで３０℃にて培養した。その後、３−βインドールア
クリル酸を最終濃度２０ｕｇ／ｍｌになる様に加え、更
に培養温度を３７℃に変更後、１６時間培養した。培養
後、遠心分離により菌体１７．８１ｇ／ｗｅｔを得た。
そのうち菌体８．８３ｇを３０ｍＭ ＮａＣｌおよび２
ｍＭ ｐ−ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍ
Ｍトリス塩酸塩（ｐＨ８．０）２５０ｍｌに懸濁し、こ
の菌体懸濁液を高圧ホモジナイザー（ＲＡＮ ＮＩＥ
社）に、６０００ｐｓｉで３回通し、菌体を破壊した。
更に遠心分離により菌体残渣を除き上清を得た。
よび精製：ｐＢｔｒｐ ＦＰΔ１０ＬＴを、１００μｇ
／ｍｌトリプトファンを含有するＭ９ＣＡ／Ｈｅｐｅｓ
培地２００ｍｌにて一晩培養し、この培養液を７ｌのＭ
９ＣＡ／Ｈｅｐｅｓ培地に接種し、ＯＤ５５０＝０．５
まで３０℃にて培養した。その後、３−βインドールア
クリル酸を最終濃度２０ｕｇ／ｍｌになる様に加え、更
に培養温度を３７℃に変更後、１６時間培養した。培養
後、遠心分離により菌体１７．８１ｇ／ｗｅｔを得た。
そのうち菌体８．８３ｇを３０ｍＭ ＮａＣｌおよび２
ｍＭ ｐ−ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍ
Ｍトリス塩酸塩（ｐＨ８．０）２５０ｍｌに懸濁し、こ
の菌体懸濁液を高圧ホモジナイザー（ＲＡＮ ＮＩＥ
社）に、６０００ｐｓｉで３回通し、菌体を破壊した。
更に遠心分離により菌体残渣を除き上清を得た。
【００２５】得られた上清２７２ｍｌに最終濃度が０．
０７５％になるようにポリエチレンイミンを添加し、遠
心分離を行い、除核酸を行った。この上清２６８ｍｌを
回収し、硫酸アンモニウムを５０％飽和となる様に添加
後、４℃にて２時間攪拌後、遠心分離を行い沈殿として
粗蛋白質を得た。
０７５％になるようにポリエチレンイミンを添加し、遠
心分離を行い、除核酸を行った。この上清２６８ｍｌを
回収し、硫酸アンモニウムを５０％飽和となる様に添加
後、４℃にて２時間攪拌後、遠心分離を行い沈殿として
粗蛋白質を得た。
【００２６】この粗蛋白質を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）７０ｍｌに溶解後、同一緩衝液を、用いて一
晩透析した。翌日、この粗蛋白質溶液を遠心分離によ
り、不溶性蛋白質を除去し、上清７７ｍｌを回収した。
その回収液７７ｍｌをあらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したＣＭセファロースファース
トフロー（ファルマシア社）のカラムに吸着させ、２０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄後、１Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて
段階的濃度勾配により溶出した。
Ｈ７．０）７０ｍｌに溶解後、同一緩衝液を、用いて一
晩透析した。翌日、この粗蛋白質溶液を遠心分離によ
り、不溶性蛋白質を除去し、上清７７ｍｌを回収した。
その回収液７７ｍｌをあらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したＣＭセファロースファース
トフロー（ファルマシア社）のカラムに吸着させ、２０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄後、１Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて
段階的濃度勾配により溶出した。
【００２７】この溶出液をアミコン社製限外ろ過機（Ｕ
−１０）により濃縮し、１７ｍｌの濃縮液を得た。この
濃縮液をあらかじめ生理食塩水で十分に平衡化したゲル
ろ過担体であるセファクリルＳ−２００（ファルマシア
社）φ２６×６００ｍｍに付した。
−１０）により濃縮し、１７ｍｌの濃縮液を得た。この
濃縮液をあらかじめ生理食塩水で十分に平衡化したゲル
ろ過担体であるセファクリルＳ−２００（ファルマシア
社）φ２６×６００ｍｍに付した。
【００２８】溶出液からペプチドを含む分画を回収し、
Ｌ−９２９試験による活性を求め、各精製過程における
比活性および回収率を求めた。なお、蛋白質量は、バイ
オラット社製プロテインアッセイシステムを用いて測定
し、活性を有する画分より本発のペプチド４９．４ｍｇ
を得た。この結果を表１に示す。
Ｌ−９２９試験による活性を求め、各精製過程における
比活性および回収率を求めた。なお、蛋白質量は、バイ
オラット社製プロテインアッセイシステムを用いて測定
し、活性を有する画分より本発のペプチド４９．４ｍｇ
を得た。この結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】（７）精製した蛋白質の純度検定および分
子量、部分構造の確認：精製した蛋白質２μｇを１５％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動後、クマシーブルーにて染色
し、脱色した後、ファルマシア レーザースキャナーに
て純度検定した。その結果、本発明にて精製した蛋白質
は、純度９５％以上で回収されていた。
子量、部分構造の確認：精製した蛋白質２μｇを１５％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動後、クマシーブルーにて染色
し、脱色した後、ファルマシア レーザースキャナーに
て純度検定した。その結果、本発明にて精製した蛋白質
は、純度９５％以上で回収されていた。
【００３１】また、このペプチドの分子量は、約１７８
００であり、気相プロテインシークエンサー（アプライ
ドバイオシステム社製・モデル４７７Ａ）によりＮ末端
のアミノ酸分折をしたところ、本発明のペプチドのＮ末
端のアミノ酸配列は、Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓで
あり本発明のペプチドの構造を証明するものであった。
００であり、気相プロテインシークエンサー（アプライ
ドバイオシステム社製・モデル４７７Ａ）によりＮ末端
のアミノ酸分折をしたところ、本発明のペプチドのＮ末
端のアミノ酸配列は、Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓで
あり本発明のペプチドの構造を証明するものであった。
【００３２】実施例 ２ 抗腫瘍作用の検討：治療係数（担癌体における毒性と有
効性の比）を算出することを目的に以下の実験を行っ
た。１群５匹から１０匹とした６週齢の雌性Ｂａｌｂ／
ｃマウスの背部皮下に、２ｘ１０５個のＭｅｔｈ Ａマ
ウス肉腫細胞を移植した。腫瘍移植７日後、本発明のペ
プチドを含む組換え型ＬＴ誘導体を生理食塩水に溶解
し、これをマウスに１週あたり２回で、合計１５回、静
脈内に投与した。対照群には生理食塩水のみを静脈内投
与した。
効性の比）を算出することを目的に以下の実験を行っ
た。１群５匹から１０匹とした６週齢の雌性Ｂａｌｂ／
ｃマウスの背部皮下に、２ｘ１０５個のＭｅｔｈ Ａマ
ウス肉腫細胞を移植した。腫瘍移植７日後、本発明のペ
プチドを含む組換え型ＬＴ誘導体を生理食塩水に溶解
し、これをマウスに１週あたり２回で、合計１５回、静
脈内に投与した。対照群には生理食塩水のみを静脈内投
与した。
【００３３】移植後２１日経過したところで、生存動物
を屠殺し、腫瘍のみを摘出した。摘出した腫瘍は重量を
測定し、各群での平均腫瘍重量を算出した。各投与群で
の平均腫瘍重量は、対照群における平均腫瘍重量と対比
し、腫瘍増殖抑制率を求めた。
を屠殺し、腫瘍のみを摘出した。摘出した腫瘍は重量を
測定し、各群での平均腫瘍重量を算出した。各投与群で
の平均腫瘍重量は、対照群における平均腫瘍重量と対比
し、腫瘍増殖抑制率を求めた。
【００３４】ここで得られた各濃度での腫瘍増殖抑制率
を基に、腫瘍増殖を５０％抑制する濃度（５０％ Ｅｆ
ｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ； ＥＤ５０ ｍｇ／ｋｇ）
を算出した。各投与群において、毒性死が認められた場
合、腫瘍増殖抑制同様、５０％致死量（５０％ Ｌｅａ
ｔｈａｌ Ｄｏｓｅ； ＬＤ５０ ｍｇ／ｋｇ）を算出
した。更に、この５０％致死量（ＬＤ５０）と５０％腫
瘍増殖抑制量（ＥＤ５０）の比を持って、治療係数とし
た。
を基に、腫瘍増殖を５０％抑制する濃度（５０％ Ｅｆ
ｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ； ＥＤ５０ ｍｇ／ｋｇ）
を算出した。各投与群において、毒性死が認められた場
合、腫瘍増殖抑制同様、５０％致死量（５０％ Ｌｅａ
ｔｈａｌ Ｄｏｓｅ； ＬＤ５０ ｍｇ／ｋｇ）を算出
した。更に、この５０％致死量（ＬＤ５０）と５０％腫
瘍増殖抑制量（ＥＤ５０）の比を持って、治療係数とし
た。
【００３５】試験に用いた組換え型ＬＴ誘導体は、実施
例１で調製した本発明の組み換え型ＬＴであるＦＰΔ１
０ＬＴおよび特開平４−４５７８９号に開示のＭＬＴ、
特開昭６３−２７０６９８号に開示のＰΔ１０ＬＴ、Ｆ
Δ１０ＬＴならびにΔ１０ＬＴならびに特開昭６０−１
８５７９９開示のＴＮＦである。この結果を表２に示
す。
例１で調製した本発明の組み換え型ＬＴであるＦＰΔ１
０ＬＴおよび特開平４−４５７８９号に開示のＭＬＴ、
特開昭６３−２７０６９８号に開示のＰΔ１０ＬＴ、Ｆ
Δ１０ＬＴならびにΔ１０ＬＴならびに特開昭６０−１
８５７９９開示のＴＮＦである。この結果を表２に示
す。
【００３６】
【００３７】上記の結果から、本発明のペプチドである
ＦＰΔ１０ＬＴによるＭｅｔｈ Ａに対する抗腫瘍活性
は、比較品であるＴＮＦａ、ＭＬＴ、ＦΔ１０ＬＴと同
程度であるが、それらに比較して治療係数では、２倍か
ら７倍に改善された。また、比較品であるＰΔ１０Ｌ
Ｔ、Δ１０ＬＴよりも、抗腫瘍活性が高いことも確認さ
れた。
ＦＰΔ１０ＬＴによるＭｅｔｈ Ａに対する抗腫瘍活性
は、比較品であるＴＮＦａ、ＭＬＴ、ＦΔ１０ＬＴと同
程度であるが、それらに比較して治療係数では、２倍か
ら７倍に改善された。また、比較品であるＰΔ１０Ｌ
Ｔ、Δ１０ＬＴよりも、抗腫瘍活性が高いことも確認さ
れた。
【００３８】試験例 １ 血圧に対する検討 体重３５０〜４００ｇの、１１週令雄Ｃｒｊ：ＣＤ（Ｓ
Ｄ）系ラット（日本チャールスリバー）を用い、次の様
にして組換え型リンホトキシンが血圧に対し与える作用
を調べた。すなわち、上記ラットにエーテル麻酔を施し
た後、右大腿部の毛をバリカンを用いてカットし、小ハ
サミを使用して皮膚を切開した。その後、キシロカイン
ゼリー（局所麻酔）を切開した皮膚に塗り、ピンセット
を用いて注意深く各血管を剥離する。剥離後、動静脈へ
三方コックをつけたＳＰ１０カニュレーションチューブ
（夏目社２００ｕ／ｍｌヘパリン含有）を挿入した。
Ｄ）系ラット（日本チャールスリバー）を用い、次の様
にして組換え型リンホトキシンが血圧に対し与える作用
を調べた。すなわち、上記ラットにエーテル麻酔を施し
た後、右大腿部の毛をバリカンを用いてカットし、小ハ
サミを使用して皮膚を切開した。その後、キシロカイン
ゼリー（局所麻酔）を切開した皮膚に塗り、ピンセット
を用いて注意深く各血管を剥離する。剥離後、動静脈へ
三方コックをつけたＳＰ１０カニュレーションチューブ
（夏目社２００ｕ／ｍｌヘパリン含有）を挿入した。
【００３９】挿入後、皮膚を自動縫合機を用いて縫合
し、ラットを固定台（夏目社 ボールマンケージ）に固
定した。固定後、動脈カニューレの三方コック内の空気
を完全に抜き、ポリグラフ（モデル３６３システム 日
本電気三栄）の圧力トランスジュサーに接続した。接続
後ポリグラフをセットアップし、血圧測定を開始し、血
圧、心拍数が安定した時点で、試験例１で用いたのと同
じ組換え型リンホトキシン誘導体を投与し、投与後２４
時間の収縮期血圧を測定した。
し、ラットを固定台（夏目社 ボールマンケージ）に固
定した。固定後、動脈カニューレの三方コック内の空気
を完全に抜き、ポリグラフ（モデル３６３システム 日
本電気三栄）の圧力トランスジュサーに接続した。接続
後ポリグラフをセットアップし、血圧測定を開始し、血
圧、心拍数が安定した時点で、試験例１で用いたのと同
じ組換え型リンホトキシン誘導体を投与し、投与後２４
時間の収縮期血圧を測定した。
【００４０】また測定開始後、各ポイントの１時間前に
フラッシュ（ヘパリン処理）を行った。なお各サンプル
ともＮ＝４で行ない、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ
／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇにて静脈内投与した。またデー
タの解析は、投与時を１００％として収縮期血圧の低下
をマイナスとして示した。この結果を表３に示す。
フラッシュ（ヘパリン処理）を行った。なお各サンプル
ともＮ＝４で行ない、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ
／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇにて静脈内投与した。またデー
タの解析は、投与時を１００％として収縮期血圧の低下
をマイナスとして示した。この結果を表３に示す。
【００４１】
【００４２】上記の結果から、本発明のペプチドＦＰΔ
１０ＬＴおよびＭＬＴでは抗腫瘍活性を示す、有効投与
量において、リンホトキシン類において最も致命的な副
作用と考えられている血圧低下作用は、認められなかっ
たが、治療係数において本発明のペプチドＦＰΔ１０Ｌ
Ｔと同等以上の有用性が示されたＰΔ１０ＬＴおよびΔ
１０ＭＬＴを含めて、既存の物はすべて、有意な血圧低
下作用を示し、治療に供しえないものであることが示さ
れた。
１０ＬＴおよびＭＬＴでは抗腫瘍活性を示す、有効投与
量において、リンホトキシン類において最も致命的な副
作用と考えられている血圧低下作用は、認められなかっ
たが、治療係数において本発明のペプチドＦＰΔ１０Ｌ
Ｔと同等以上の有用性が示されたＰΔ１０ＬＴおよびΔ
１０ＭＬＴを含めて、既存の物はすべて、有意な血圧低
下作用を示し、治療に供しえないものであることが示さ
れた。
【００４５】
【発明の効果】上記のように、本発明のペプチドは、従
来報告されている組換え型リンホトキシンおよび組換え
型リンホトキシン誘導体に比べ、抗腫瘍活性が高く、か
つ副作用も改善されたので、抗腫瘍剤等の医薬として有
利に利用ができるものである。
来報告されている組換え型リンホトキシンおよび組換え
型リンホトキシン誘導体に比べ、抗腫瘍活性が高く、か
つ副作用も改善されたので、抗腫瘍剤等の医薬として有
利に利用ができるものである。
【００４６】
【図１】 本発明のペプチドを生産するプラスミドの構
築手順を示す図面。
築手順を示す図面。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｌ 9282−4Ｂ
Claims (2)
- 【請求項１】次の式（Ｉ）、 で表されるアミノ酸配列を有するペプチド。（但し、Ｒ
は、ＭｅｔまたはＨを表す。） - 【請求項２】請求項１で示したアミノ酸配列を有するペ
プチドを含有してなる抗腫瘍剤。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5277269A JPH07101993A (ja) | 1993-10-01 | 1993-10-01 | 新規抗腫瘍性ペプチド |
| EP94927818A EP0672681B1 (en) | 1993-10-01 | 1994-09-30 | Novel antitumor peptide |
| US08/446,848 US5639728A (en) | 1993-10-01 | 1994-09-30 | Antineoplastic peptide |
| DE69429650T DE69429650T2 (de) | 1993-10-01 | 1994-09-30 | Neues antitumor-peptid |
| PCT/JP1994/001632 WO1995009871A1 (fr) | 1993-10-01 | 1994-09-30 | Nouveau peptide antitumoral |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5277269A JPH07101993A (ja) | 1993-10-01 | 1993-10-01 | 新規抗腫瘍性ペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07101993A true JPH07101993A (ja) | 1995-04-18 |
Family
ID=17581174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5277269A Pending JPH07101993A (ja) | 1993-10-01 | 1993-10-01 | 新規抗腫瘍性ペプチド |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5639728A (ja) |
| EP (1) | EP0672681B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07101993A (ja) |
| DE (1) | DE69429650T2 (ja) |
| WO (1) | WO1995009871A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6625634B1 (en) | 1999-10-01 | 2003-09-23 | Sun Microsystems, Inc. | Efficient implementation of multiprecision arithmetic |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60185799A (ja) * | 1984-03-06 | 1985-09-21 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
| JPS638399A (ja) * | 1986-06-30 | 1988-01-14 | Denki Kagaku Kogyo Kk | 生理活性ポリペプチド |
| JPS638398A (ja) * | 1986-06-30 | 1988-01-14 | Denki Kagaku Kogyo Kk | 生理活性ポリペプチド |
| JPS62181298A (ja) * | 1986-02-05 | 1987-08-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ヒトリンホトキシンポリペプチド誘導体 |
| EP0272894A3 (en) * | 1986-12-24 | 1989-06-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Recombinant human lymphotoxin |
| JPS6416298A (en) * | 1987-07-09 | 1989-01-19 | Sharp Kk | Malfunction detector for pulse motor |
| JPH0380082A (ja) * | 1989-08-21 | 1991-04-04 | Sankyo Co Ltd | ヒトリンホトキシン誘導体 |
| JPH03184994A (ja) * | 1989-09-12 | 1991-08-12 | Tsumura & Co | ペプチド |
| JPH0445789A (ja) * | 1990-06-14 | 1992-02-14 | Tsumura & Co | リンホトキシン類発現ベクターおよびこれを利用したリンホトキシン類の製造法 |
| WO1993014203A1 (en) * | 1992-01-21 | 1993-07-22 | Tsumura & Co. | Lymphotoxins, expression vector therefor, and production of lymphotoxins with said vector |
| JPH0641196A (ja) * | 1992-07-28 | 1994-02-15 | Tsumura & Co | 新規リンホトキシン類 |
-
1993
- 1993-10-01 JP JP5277269A patent/JPH07101993A/ja active Pending
-
1994
- 1994-09-30 WO PCT/JP1994/001632 patent/WO1995009871A1/ja active IP Right Grant
- 1994-09-30 US US08/446,848 patent/US5639728A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-30 EP EP94927818A patent/EP0672681B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-30 DE DE69429650T patent/DE69429650T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1995009871A1 (fr) | 1995-04-13 |
| DE69429650T2 (de) | 2002-09-12 |
| EP0672681B1 (en) | 2002-01-16 |
| EP0672681A4 (en) | 1997-02-26 |
| DE69429650D1 (de) | 2002-02-21 |
| US5639728A (en) | 1997-06-17 |
| EP0672681A1 (en) | 1995-09-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040309 |