HU220193B - Expressziós rendszer apolipoprotein AI-M előállításához - Google Patents

Expressziós rendszer apolipoprotein AI-M előállításához Download PDF

Info

Publication number
HU220193B
HU220193B HU9501680A HU9501680A HU220193B HU 220193 B HU220193 B HU 220193B HU 9501680 A HU9501680 A HU 9501680A HU 9501680 A HU9501680 A HU 9501680A HU 220193 B HU220193 B HU 220193B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
apolipoprotein
promoter
apo
culture
protein
Prior art date
Application number
HU9501680A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT71697A (en
HU9501680D0 (en
Inventor
Lars Abrahmsén
Erik Holmgren
Christina Kalderén
Mats Lake
Ása Mikaelsson
Torsten Sejlitz
Original Assignee
Esperion Therapeutics Inc.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Esperion Therapeutics Inc., filed Critical Esperion Therapeutics Inc.,
Publication of HU9501680D0 publication Critical patent/HU9501680D0/hu
Publication of HUT71697A publication Critical patent/HUT71697A/hu
Publication of HU220193B publication Critical patent/HU220193B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A találmány olyan expressziós rendszerre vonatkozik, melynek révén Escherichia coli tenyészettel magas koncentrációban állítható elő apolipoprotein AI-M Milano (Apó AI-M). Ez a tennék eredményesen alkalmazható arterioszklerózis és más kardiovaszkuláris betegségek kezelésére.
A szérumkoleszterin megemelkedett szintje és a szívkoszorúér-megbetegedések (CHD) kifejlődése közötti egyértelmű összefüggést epidemiológiai és hosszú távú vizsgálatok ismétlődően igazolták. A plazmában történő koleszterintranszport komplex mechanizmusának felderítése azonban lehetővé tette a keringésben előforduló lipoproteinek szelektív szerepének felismerését a koszorúér-megbetegedések (CHD) kockázatának előidézésében.
A keringésben a lipoproteinek négy fontosabb csoportja vesz részt: a kilomikronok (CM), valamint a nagyon alacsony sűrűségű (VLDL), az alacsony sűrűségű (LDL) és a nagy sűrűségű (HDL) lipoproteinek. Míg a CM csoport tagjai a bélben történő zsírfelszívódás rövid élettartamú termékei, a VLDL és különösen az LDL csoport képviselői felelősek a szövetekbe, így az artériák falába történő koleszterintranszportért. Ezzel ellentétben a HDL lipoproteinek a perifériás szövetekből való koleszterineltávolítás közvetlen résztvevői, melynek során a „fordított koleszterintranszport” (RCT) néven ismert mechanizmussal a koleszterint visszaviszik a májba vagy más lipoproteineknek adják át.
A HDL csoport „védő” szerepét egy sor vizsgálat igazolta [például Miller et al., Láncét 965-968 (1977), és Whayne et al., Atherosclerosis 39, 411-419 (1981)]. Ezen vizsgálatok tanúsága szerint az LDL lipoproteinek magas szintje, kevésbé pedig a VLDL lipoproteineké összefüggésben van a kardiovaszkuláris betegségek megnövekedett kockázatával, a HDL lipoproteinek magasabb koncentrációja viszont a kardiovaszkuláris védőhatásért felelős. A HDL védő szerepét igazolják azok az in vivő vizsgálatok is, melyek szerint nyulaknál a HDL infúzió gátolja a koleszterin által indukált artériás sérülések kialakulását [Badimon et al., Láb. Invest. 60, 455-461 (1989)] és/vagy elősegíti ezek gyógyulását [Badimon et al., J. Clin. Invest. 85, 1234-1241 (1990)].
A HDL védőhatásának mechanizmusára vonatkozó vizsgálatok során az érdeklődés mostanában az apolipoprotein ΑΙ-re (Apó AI), a HDL csoport főbb tagjára irányult. Az Apó AI magas plazmakoncentrációja összefüggésben van a CHD kockázatának és a koszorúérsérülések előfordulásának mérséklődésével [Maciejko et al., New England J. Med. 309, 385-389 (1983); Sedlis et al., Circulation 73, 978-984 (1986)].
A humán apolipoprotein AI-Milano (Apó AI-M) az Apó AI természetes variánsa [Weisgraber et al., J. Clin. Invest. 66, 901-907 (1980)]. Az Apó AI-M molekulában az Argl73 aminosav helyett Cysl73 aminosav szerepel. Mivel az Apó AI-M polipeptidlánconként egyetlen Cys aminosavat tartalmaz, monomer vagy dimer alakban fordulhat elő. E két alak kémiailag egymássá átalakulhat, így az Apó AI-M kifejezés - jelen értelemben - nem tesz különbséget a két megjelenési forma között. DNS-szinten a mutáció csupán egy C-T cserét jelent, azaz egy CGC kodon változását TGC kodonra. Ez az Apó AI variáns azonban a legérdekesebbek egyike, mivel a HDL koleszterinszint jelentős mértékű csökkenését idézi elő, az artériás megbetegedések kockázatának látható növekedése nélkül [Franceschini et al., J. Clin. Invest. 66, 892-900 (1980)]. Származásiam vizsgálatok megerősítették ezt az arterioszklerózis elleni védőhatást. Az érett humán Apó AI és Apó AI-M egyaránt 243 aminosavból áll. Szintézisük prekurzor fehérjékből, 267 aminosavból álló prepro-Apo ΑΙ-ből, illetve prepro-Apo AI-M-ből történik. A 18 aminosavból álló prepeptid lehasítása a szekréciós mechanizmus során megy végbe, melynek révén egy 6 aminosavtöbbletű proprotein keletkezik. A pro-Apó AI és a pro-Apó AI-M átalakítását érett formává a plazma proteolitikus aktivitása segíti elő.
Történtek kísérletek a humán Apó AI előállítására rekombináns DNS-technológia alkalmazásával. A 0267703 számon közzétett európai szabadalmi bejelentés az Apó AI E. coli tenyészettel való előállítására vonatkozik. Az eljárásban ismertetett kiméra polipeptid az Apó ΑΙ-nek a β-galaktozidáz N-terminális részével vagy a Protein A egy, esetleg több IgG-kötő helyével, illetve a humán Apó AI proszekvenciával alkotott fúziós terméke.
Az Apó AI és az Apó AI-M élesztőben történő expresszióját, valamint a termékek arterioszklerózis és más kardiovaszkuláris megbetegedések kezelésében való alkalmazását a WO 90/12879 számú leírás ismerteti. Az Apó AI és Apó AI-M fehéijéket kódoló génekként az érett fehérjék génjei elé élesztőben felismerhető szekréciós (módosított MF alfa-1 vezérszekvenciát tartalmazó) és feldolgozást biztosító szignálszekvenciát fúzionáltattak.
Apó AI E. coli rendszerrel való előállítását ismertetik Hoppé és munkatársai [J. Bioi. Chem. 372, 225-234 (1991)]. Az általuk közölt expressziós szint 0,3 és 4,8 mg/1 közötti tartományban van, a tenyészet térfogatára vonatkoztatva. Ez a rendszer intracelluláris expresszión alapszik.
Intracelluláris expressziós rendszerben állítottak már elő Apó AI fehéijét β-galaktozidázzal alkotott fúziós pepiidként is [Lorenzetti et al., FEBS Letters 194, 343-346 (1986)]. Ebben az esetben a termelési szint a tenyészetben elérte az 5 mg/1 értéket. A szerzők részletesen vizsgálták a gén 5’ végének hatását az E. coli rendszerben végzett expresszió hatékonyságára vonatkozóan. A vizsgálatok során lacZ gént használtak markerként az Apó AI expresszió analízisére. A lacZ gént az Apó AI gén 3’ végéhez kapcsolták [Isacchi et al., Gene 81, 129-137 (1989)]. A fentiekben közölt 5 mg/1 körüli termékkoncentráció túl alacsony ahhoz, hogy az ismertetett Apó AI, illetve Apó AI-M eljárások gazdaságosak lehessenek.
Apolipoprotein E előállítására szolgáló expressziósszekréciós rendszerre vonatkozik az EP-A-345155 számon közrebocsátott szabadalmi bejelentés. Az ebben leírtaknak megfelelően az apolipoprotein E szintézise Escherichia coli sejtekben történik, a termék pedig a periplazmatikus térből nyerhető ki. A termékkoncentrá2
HU 220 193 Β cióra vonatkozó - jóllehet példával alá nem támasztott - adat 0,15-0,45 g/1.
Az Apó AI-M kifejezést a jelen találmányban tágabb értelemben használjuk, értelmezésünk szerint vonatkozik ez a kifejezés az Apó AI-M fehérje funkcionális variánsaira és fragmenseire is. Az Apó AI-M-et kódoló DNS-szekvencia minden olyan cDNS-szekvencia lehet, mely a prepro-fehérjét, a pro-fehérjét, illetve
- előnyösen - az érett fehérjét kódolja.
Erős indukálható E. coli promoterek, mint olyanok, a szakmában jártasak számára ismertek. Példaként említhető a lac promoter, mely IPTG-vel (izopropil-P-tiogalaktozid) indukálható; a trp promoter, mely triptofánnal represszálható, 3-indolil-ecetsawal pedig indukálható; a trc vagy tac promoter (a trp és a lac promoterek hibridje), mely IPTG-vel indukálható; a lambda-PL vagy lambda-PR promoterek, melyek a hőérzékeny cI857 lambda represszorral kombinálva 30 °C felett indukálhatok; valamint ezen promoterek funkcionális származékai. A találmány kivitelezése szempontjából előnyös promoter a trc promoter.
Ugyancsak ismertek a találmány megvalósítására alkalmas szignálpeptidek, melyeket a szakmában jártasak tetszés szerint választhatnak meg az itt szereplő információk ismeretében. Ilyenre szolgáló példaként említhetők az ompA szignálszekvencia származékai.
A találmány megvalósítására alkalmas terminátorok a szakmában jártasak által tetszés szerint választhatók az irodalomban ismertek közül.
A találmány az expressziós vektorral transzformált E. coli gazdaorganizmusra, azaz expressziós rendszerre is vonatkozik. Az alkalmas E. coli törzsek a szakmában jártasak számára ismertek.
Tárgya továbbá a találmánynak az Apó AI-M előállítására szolgáló eljárás is, mely a következő lépésekből áll:
- a transzformált gazdaorganizmust megfelelő tápközegben tenyésztjük;
- az exponenciális növekedési fázisban lévő tenyészetben, még a stacionárius fázis elérése előtt, az Apó AI-M expresszióját indukáljuk;
- a terméket a tenyészetből elkülönítjük.
Az indukció, a hőmérsékletváltoztatás és a termék elkülönítésének optimális időpontját az alábbiak szerint választjuk meg.
A találmány egy előnyös kiviteli módja szerint a tenyésztést 29 és 31 °C közötti alacsony hőmérsékleten, előnyösen 30 °C-on kezdjük, majd a növekedés stacionárius fázisának elérése előtt (még az exponenciális növekedés fázisában) a hőmérsékletet 37 °C-ra emeljük. A hőmérséklet emelése elvégezhető az expressziós vektor indukciójával egyidejűleg, de történhet az indukció előtt vagy után is, mintegy 3-3 órás eltéréssel.
Az Apó AI-M expresszió indukálása és a hőmérséklet emelése előnyösen akkor végzendő el, midőn a tenyészet optikai denzitása (O. D.) meghaladja az 50 egységet, például amikor 50 és 100 közötti. Jelen összefüggésben ez rendszerint azt jelenti, hogy az indukcióra és a hőmérséklet emelésére a tenyésztés kezdetétől számított 15 és 20 óra közötti időszakban kerül sor.
A találmány úgy is kivitelezhető, hogy a fermentációt állandó hőfokon, például 25 és 37 °C közötti hőmérsékleten végezzük.
A fermentáció befejezése, azaz a termék elkülönítése előnyösen a tenyészet optimális állapotának elérésekor történik.
A tenyésztéshez használt tápközeg előnyösen élesztőkivonatot tartalmaz, és adott esetben triptonnal is kiegészítjük. A termelő táptalaj adott esetben antibiotikummentes is lehet.
Abrajegyzék
- Az 1. ábra azt a két oligonukleotidot mutatja, melyeket az Apó AI-M gén cDNS-kópiájának a bakteriális szignálszekvenciát kódoló DNS-fragmenssel való fúziójához használtunk. Az oligonukleotidok bázissorrendjén jeleztük az EcoRI, Bbsl és Ncol restrikciós enzimek egyedi hasítási helyeit, valamint megadtuk az E. coli szignálpeptidáz feltételezett hasítási helyének környezetét (-1 +1) felépítő kikövetkeztetett aminosavszekvenciát. Az Apó AI-M amino-terminális végének jelzése+1.
- A 2. ábra a pKP764 plazmidon kialakított új stopkodonok konstrukciója során felhasznált két oligonukleotidot mutatja. A nukleotidszekvenciák mellett megadtuk az Apó AI-M kikövetkeztetett C-terminális aminosavat, valamint a két új TAA stopkodont.
- A 3. ábrán a pKP683 plazmid 957 bázispár méretű Notl-Hindlll szegmense, valamint a belőle levezetett aminosavsorrend és az átírt Apó AI-M fehéije molekulatömege szerepel. Az Apó AI-M N-terminális aminosavát +1 jelöli. Az Apó AI-M dimerizációjához nélkülözhetetlen egyetlen ciszteint (Cys 173) aláhúzással jelöltük.
- A 4. ábrán a pKP764 plazmid 856 bázispár méretű Notl-Hindlll szegmense, valamint a belőle levezetett aminosavsorrend és az átírt Apó AI-M fehéije molekulatömege szerepel. Az Apó AI-M N-terminális aminosavát +1 jelöli. Az Apó AI-M dimerizációjához nélkülözhetetlen egyetlen ciszteint (Cysl73) aláhúzással jelöltük.
- Az 5. ábra a pKP683 expressziós vektort mutatja. A fontosabb szerkezeti és szabályozószakaszokat bekeretezéssel emeltük ki, nyilakkal jelölve a transzláció, illetve a replikáció irányát. A restrikciós enzimek egyedi hasítási helyeinek némelyikét a plazmid körívén kívül bejelöltük. Szintén megadtuk a két Nrul hasítási helyet. A bekeretezett részekben lévő rövidítések magyarázata: S=szignálszekvencia; Apó AI-M=Apolipoprotein AI-Milano; TI és T2=az fd bakteriofágból származó Rho független terminátorok tandem ismétlődésű szekvenciái; Km=Tn903 transzpozonból származó kanamycin rezisztenciamarker; Őri=replikációs origó; lac IQ, (lacN)=a konstitutívan képződő lacrepresszor génje; Ptrc=a trp/lac hibrid trc promoter.
- A 6. ábra a pKP764 expressziós vektort mutatja. A fontosabb szerkezeti és szabályozószakaszokat bekeretezéssel emeltük ki, nyilakkal jelölve a transzláció, illetve a replikáció irányát. A restrikciós enzimek egyedi hasítási helyeinek némelyikét a plaz3
HU 220 193 Β mid körívén kívül bejelöltük. Az ábrában használt rövidítések azonosak az 5. ábrán szereplőkkel.
- A 7. ábra Apó AI-M előállítását mutatja 3,5 liter térfogatú bioreaktorban, E. coli RV308/pKP683 törzs alkalmazásával. Jelmagyarázat: O=optikai denzitás 600 nm hullámhosszon mérve; Q=Apo AI-M koncentráció (g/1) a tenyészetben. Az indukció időpontját (1PTG hozzáadása) nyíl jelöli.
- A 8. ábra Apó AI-M előállítását mutatja 3,5 liter térfogatú bioreaktorban, E. coli RV308/pKP764 törzs alkalmazásával. A jelmagyarázat a 7. ábrán szereplővel azonos.
- A 9. ábra Apó AI-M előállítását mutatja 3,5 liter térfogatú bioreaktorban, E. coli BC50/pKP683 törzs alkalmazásával. A jelmagyarázat a 7. ábrán szereplővel azonos.
- A 10. ábra Apó AI-M előállítását mutatja 3,5 liter térfogatú bioreaktorban, E. coli BC50/pKP764 törzs alkalmazásával. A jelmagyarázat a 7. ábrán szereplővel azonos.
- All. ábra Apó AI-M előállítását mutatja 75 liter térfogatú bioreaktorban, E. coli BC50/pKP764 törzs alkalmazásával. A jelmagyarázat a 7. ábrán szereplővel azonos.
- A 12. ábra Apó AI-M előállítását mutatja 300 liter térfogatú bioreaktorban, E. coli BC50/pKP764 törzs alkalmazásával. A jelmagyarázat a 7. ábrán szereplővel azonos.
- A 13. ábra Apó AI-M előállítását mutatja 3,5 liter térfogatú bioreaktorban, E. coli BC50/pKJP764 törzs alkalmazásával. A jelmagyarázat a 7. ábrán szereplővel azonos.
- A 14. ábra Apó AI-M előállítását mutatja 3,5 liter térfogatú bioreaktorban, E. coli RV308/pKP683 törzs alkalmazásával. A jelmagyarázat a 7. ábrán szereplővel azonos.
- A 15. ábra a rekombináns Apó AI-M (vastag vonal) és a humán Apó Al (vékony vonal) CD (cirkuláris dikroizmus) spektrumát mutatja.
A következő példákkal részletesen ismertetjük a találmányt, anélkül azonban, hogy ezzel tárgykörét bármi módon korlátoznánk. Megadjuk azoknak a plazmidvektoroknak az előállítását, melyek expressziója révén Apó AI-M jelentős mennyiségben szekretálódik az E. coli sejtek periplazmatikus terébe, illetve választódik ki a tápközegbe. Ezenkívül közöljük az Apó AI-M bioreaktorban való előállításának részleteit is.
1. példa
Vektorok előállítása, és E. coli transzformációja
A felhasznált Escherichia coli K12 törzsek az alábbiak voltak:
HB101 F-, hsdS20 (rB~, mB), supE44, aral4, lambda-, galK2, lacYl, proA2, rspL20, xyl5, mtl-1, recA13, mcrA(+), mcrB(-) [Boyer et al., J. Mól. Bioi. 41, 459-472 (1969)];
DH5alfa F , F80dlacZDM15, D(lacZYA-argF)U169, recAl, endAI, gyrA, lambda-, thi-1, hsdR17, (rk~, mk +), supE44, relAI [BRL, Amerikai Egyesült Államok];
RV308 DlacX74, galOP::IS2(galOP308), strA, lambda- [Maurer et al., J. Mól. Bioi. 139, 147-161 (1980)];
BC50 xyl-7, ara-14, T4-R, lambda- [Kabi Pharmacia AB, Svédország].
A HB 101 és DH5alfa törzsek a DNS-fragmensek szubklónozására szolgáltak.
A pUC9 plazmidot [Vieira et al., Gene 19,
259-268 (1982)] az A. Sidoli professzortól (Milánói Egyetem, Olaszország) kapott humán Apó Al cDNSkópia [Sharp et al., Nucl. Acid Rés. 12, 3917-3932 (1984)] 847 bázispár méretű BamHI fragmensének szubklónozására használtuk. A humán Apó Al cDNSnukleotidszekvenciája hozzáférhető a GenBank adatbázisban, X02162 nyilvántartási számon [Seilhammer et al., DNA 3, 309-317 (1984)]. Az így készített vektor a pKP575 jelzést kapta. A humán Apó AI-M DNS (mely az Apó Al cDNS-kópiájának helyspecifikus mutagenezisével készült, és A. Sidoli professzortól származik, Milánói Egyetem, Olaszország) 882 bázispár méretű EcoRI - PstI fragmensét szintén szubklónoztuk a pUC9 plazmidban. Az így keletkezett származék a pKP576 jelzést kapta. A későbbiekben ismertetendő pKP683 és pKP764 plazmid elkészítése során az alábbi genetikai elemeket használtuk fel: pTrc99 plazmid [Amann et al., Gene 69, 301-315 (1988); beszerezhető: Pharmacia P-L Biochemicals, Inc., Milwaukee, Amerikai Egyesült Államok]; egy pUC plazmidszármazék, mely tartalmazza a pUC4-K plazmid [Vieira et al., Gene 19, 259-268 (1982); és Oka et al., J. Mól. Bioi. 147, 217 (1981)] Tn903 transzpozon eredetű kanamycin rezisztenciamarkerét; valamint a bakteriofág fd eredetű T1T2 transzkripciós terminátorok, melyek a pUEX2 plazmidból [Bressan et al., Nucl. Acid Rés. 15, 10056 (1987)] származnak.
A baktériumtörzsek tenyésztésére Luria - Bertani (LB) vagy élesztő-tripton (2xYT) tápközeget használtunk 50 pg/ml ampicillin (Ap), illetve 70 pg/ml kanamycin (Km) kiegészítéssel a plazmid DNS előállítására, valamint a kisléptékű expressziós analízishez [Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. A sejtek agarlemezen történő növesztéséhez 50 pg/ml ampicillin (Ap), illetve 70 pg/ml kanamycin (Km) antibiotikummal kiegészített „Tryptose blood agar base” (Difco, Amerikai Egyesült Államok) készítményt használtunk. A rekombináns DNS-technikákat a Sambrook és munkatársai által leírtak [Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] szerint végeztük. A restrikciós endonukleázokat és a T4 ligázt a következő cégektől szereztük be: Boehringer Mannheim (Német Szövetségi Köztársaság), New England Biolabs (Beverly, Amerikai Egyesült Államok), Pharmacia LKB Biotechnology AB (Uppsala, Svédország). Az izopropil-P-D-tiogalaktozidot (IPTG) a Sigma cég (St. Louis, Amerikai Egyesült Államok) szállította. Alacsony olvadás- és fagyáspontú agarózt (NuSieve GTG, FMC Bioproducts, Amerikai Egyesült Államok) használtunk a DNS-fragmensek izolálására. A PCR amplifikálást a Perkin-Elmer/Cetus Instruments (Norwalk, Amerikai Egyesült Államok) cégtől származó DNA Thermal Cycler és Taq DNS-poli4
HU 220 193 Β meráz alkalmazásával végeztük. Az oligonukleotid linkereket és primereket Pharmacia-LKB Gene Assembler Plus (Pharmacia-LKB Biotechnology AB, Uppsala, Svédország) készüléken, szilárd fázisú foszfít-triészter módszerrel szintetizáltuk. A nukleotidszekvenciák meghatározása Applied Biosystems 373A DNS-szekvenátor és Taq DyeDeoxy™ Terminátor Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával történt.
A plazmidtérképek rajzolásához a Macintosh gépen futó PlasmidARTIST 1.2 programot (Clontech, Amerikai Egyesült Államok), a DNS-szekvenciákkal való munkához pedig a Digital VAX gépen futó GCG Sequence Analysis Software Package programot (Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok) használtuk.
Két oligonukleotidot szintetizáltunk (1. ábra) abból a célból, hogy az Apó AI és Apó AI-M cDNS-kópiákat bakteriális szignálszekvenciákat kódoló DNS-fragmensekkel fuzionáltassuk. A pKP575 plazmid 14 bázispár méretű EcoRl-Ncol fragmensét, valamint 40 bázispár méretű Ncol fragmensét szintetikus, 37 bázispár méretű EcoRI -Ncol fragmenssel (1. ábra) cseréltük ki, előállítva így a pKP58O plazmidot. A szintetikus DNS-fragmensben lévő Bbsl hasítási hely az Miül hasítási helylyel megegyezik, és így elősegíti különböző bakteriális szignálszekvenciákat kódoló fragmensek klónozását. A pKP631 plazmid előállítása érdekében a pKP575 (Apó AI) plazmid 702 bázispár méretű Acol-Dralll fragmensét a pKP576 (Apó AI-M) plazmid 702 bázispár méretű Ncol-Dralll fragmensére cseréltük. A pKP631 plazmidból 846 bázispár méretű BbslHindlll fragmenst izoláltunk, és ezt egy plazmidvektor Mlul-Hindlll helyére illesztettük be, mely így a pKP682 jelzést kapta. Ez a vektor tartalmazta már a tac promotert (Ptac), az ompA szignálszekvencia származékát, a két transzkripciós terminátort, valamint a kanamycin rezisztenciamarkert. A pKP682 plazmidból izoláltuk az 1541 bázispár méretű Nrul-Nrul fragmenst, melyet egy hasonló vektorba építettünk be, mely azonban a Ptac helyett Ptrc promotert tartalmazott. Az így előállított expressziós vektor a pKP683 jelzést (5. ábra) kapta.
A pKP764 plazmidot (6. ábra) oly módon hoztuk létre, hogy a fentiek szerint előállított pKP683 plazmid 115 bázispár méretű Dralll-HindlII fragmensét egy 14 bázispár méretű szintetikus DNS-ffagmensre (2. ábra) cseréltük - mely erősebb transzlációs terminátorokat tartalmaz -, és megszüntettük a Dralll hasítási helyet egy A beépítésével a Dralll hasítási hely túlnyúló 3’ végén (a 2. ábrán eztDra IIID jelöli).
A fentiek szerint előállított pKP683 és pKP764 plazmidokkal E. coli RV308 és BC50 törzseket transzformáltunk a Sambrook és munkatársai által [Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] leírtak szerint. Az így kapott, bioreaktorban felhasználandó RV308/pKP683 és RV308/pKP764 E. coli törzsek elkészítése az alábbiak szerint történt.
A sejteket egy éjszakán át kanamycinnel kiegészített LB vagy 2xYT tápközegben, 30 °C-on rázott lombikban növesztettük, majd a tenyészetet centrifugáltuk, és a biomasszát 1/2 térfogatú, mélyhűtött tárolásra szolgáló közegben [Gergen et al., Nucl. Acis Rés. 7, 2115 (1979)] szuszpendáltuk. A szuszpenzió 1 ml térfogatú aliquotjait mélyhűtésre alkalmas fiolákba mértük és a felhasználásig -75 °C hőmérsékleten tároltuk.
Az expressziós kísérletekhez, valamint az Apó AIM termeléshez használt plazmidkonstrukciókat restrikciós enzimekkel végzett térképezéssel analizáltuk, az Apó AI-M strukturgén jelenlétét pedig nukleotidszekvencia meghatározással igazoltuk.
A kisléptékű Apó AI-M expressziós kísérletekhez 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő, 20 ml térfogatú, kanamycinnel kiegészített LB vagy 2xYT tápközeget beoltottunk E. coli RV308/pKP683, illetve RV308/ pKP764 törzzsel. A sejteket intenzív rázatással, egy éjszakán át 30 °C-on elszaporítottuk. Az így kapott tenyészetet friss tápközeggel (20 ml) százszorosára hígítva 37 °C-on folytattuk a tenyésztést 1 egységnyi optikai denzitás (O. D. 600 nm) eléréséig, amikor IPTG-t adagoltunk hozzá 0,5-1,0 mM végkoncentrációra számítva. Ezt követően a tenyészetet 90 percen át, illetve egy éjszakán át inkubáltuk, majd a sejteket centrifugálással elkülönítettük, és a felülúszóban vizsgáltuk az Apó AIM-képződést. A tenyészet felülúszójának aliquotmintáit nitrocellulóz-membránon szűrtük, a membránt eltávolítottuk, és a keletkezett Apó AI-M mennyiségét anti-Apo AI antitestekkel meghatároztuk. Úgyszintén meghatároztuk a különböző konstrukciók alkalmazása esetén képződő Apó AI-M mennyiségét SDS poli(akril-amid) gélelektroforézissel, valamint Westem-blotanalízissel a sejtekből, illetve a tápközegből származó fehérjék között.
2. példa
Apó AI-M előállítása bioreaktorban „A” tápközeg: 16 g/1 tripton (Difco, Amerikai Egyesült
Államok), 8 g/1 élesztőkivonat (Difco, Amerikai Egyesült Államok), 5 g/1 nátrium-klorid, és 0,05 g/1 kanamycin.
„B” tápközeg: 2,5 g/1 ammónium-szulfát, 3 g/1 káliumdihidrogén-foszfát, 2 g/1 dikálium-hidrogén-foszfát, 0,5 g/1 trinátrium-citrát, 5 g/1 élesztőkivonat (Difco, Amerikai Egyesült Államok).
Sterilezés után a tápközeghez az alábbi kiegészítőket méijük hozzá: 10 g/1 glükóz, 0,05 g/1 kanamycin, 1 g/1 magnézium-szulfát-víz (1:7), 0,07 g/1 tiamin-hidroklorid, 1 ml/1 nyomelemoldat és 0,65 ml/1 vitaminoldat. A nyomelemoldat összetétetle a következő: 27 g/1 vas(III)-klorid-víz (1:6), 4 g/1 cink-szulfát-víz (1:7), 7 g/1 kobalt(II)-klorid-víz (1:6), 7 g/1 nátrium-molibdenát-víz (1:2), 8 g/1 réz(II)-szulfát-víz (1:5), 2 g/1 bórsav, 5 g/1 mangán(II)-szulfát-víz (1:4), 11 g/1 kalcium-klorid-víz (1:2) és 50 ml/1 sósav. A vitaminoldat összetétele a következő: 0,5 g/1 kalcium-pantotenát, 0,5 g/1 kolin-klorid, 0,5 g/1 folsav, 1 g/1 inozit, 0,5 g/1 nikotinamid, 0,5 g/1 piridoxin-hidroklorid, 0,05 g/1 riboflavin, és 0,5 g/1 tiamin-hidroklorid. Habzásgátlóként
HU 220 193 Β adekanolt (0,2 ml/1) használtunk, melyet a tenyésztés során szükség szerint további mennyiségben is a tenyészethez adagoltunk.
A fermentáció során a tenyészetből vett mintákat centrifugáltuk, és a sejtmentes felülúszó Apó AI-M koncentrációját radioimmun módszerrel (Apolipoprotein Al RIA 100 kit, Art. No. 109152-01, Kabi Pharmacia AB, Svédország) határoztuk meg.
A mélyhűtött sejttenyészettel 2 literes horpasztott Erlenmeyer-lombikban sterilezett 500 ml „A” táptalajt oltottunk, és a lombikokat 30 °C-on 8-10 órán át rázattuk. A bioreaktorban lévő táptalajt térfogatára számított 10%-nyi inokulumtenyészettel oltottuk be.
A fermentációt 3,5 liter össztérfogatú bioreaktorban (Belach AB, Svédország) végeztük, melynek hasznos térfogata 2,5 liter. Az indukció előtt a tenyésztés fázisában a hőmérséklet 30 °C volt, melyet az indukció után 37 °C-ra emeltünk. A tenyészet pH-értékét 7,0 értéken tartottuk 25%-os ammóniaoldat adagolásával. A tenyészeten átáramoltatott levegő mennyisége 1 térfogat/térfogat/perc volt, az oldott oxigén koncentrációját pedig a keverés szabályozásával a telítési érték 30%-án tartottuk. Miután az induláskor beadott glükóz elfogyott, 60%-os glükózoldatot kezdtünk adagolni, és a tenyésztést glükózlimitált körülmények között folytattuk le. A glükózadagolás kezdeti sebessége 0,04 g/ml volt, melyet 3 órán át ezen az értéken tartottunk, majd 3 óra alatt 0,4 g/ml értékre emeltünk. A sejtszaporodást az optikai denzitás 600 nm hullámhosszon való mérésével követtük nyomon.
A tenyésztés 16. órájában, 58 egységnyi optikai denzitás elérésekor, a fehérjeszintézist 0,5 mM IPTG hozzáadásával indukáltuk, és a hőmérsékletet 37 °C értékre emeltük. 4 órával az indukció után az Apó AI-M koncentráció 2,3 g/1, további 2 óra elteltével pedig
2.5 g/1 értéket ért el. A mérési eredmények a 7. ábrán láthatók.
3. példa
RV308/pKP764 törzs tenyésztése 3,5 literes bioreaktorban
A táptalajösszetétel és a növesztés körülményei megegyeztek a 2. példában leírtakkal. 58 egységnyi optikai denzitás elérésékor, a tenyésztés kezdete után
15.5 órával IPTG-t adagoltunk és megemeltük a hőmérsékletet. Öt órával később a tenyészet felülúszójában mért Apó AI-M koncentráció 1,6 g/1 volt. A mérési eredmények a 8. ábrán láthatók.
4. példa
BC50/pKP683 törzs tenyésztése 3,5 literes bioreaktorban
A fermentáció kivitelezése a 2. példában leírtak szerint történt, azzal az eltéréssel, hogy az indukcióhoz használt IPTG mennyisége 1 mM volt. A tenyésztés 15. órájában, 74 egységnyi optikai denzitás elérésekor IPTG-t adtunk a tenyészethez, és a hőmérsékletet megemeltük. 7,5 órával később a tenyészet felülúszójában mért Apó AI-M koncentráció 2,0 g/1 volt. A mérési eredmények a 9. ábrán láthatók.
5. példa
BC50/pKP764 törzs tenyésztése 3,5 literes bioreaktorban
A fermentáció kivitelezése a 2. példában leírtak szerint történt, azzal az eltéréssel, hogy kanamycint nem adagoltunk a bioreaktorban lévő tápközegbe. A tenyésztés 15. órájában, 60 egységnyi optikai denzitás elérésekor IPTG-t adtunk a tenyészethez, és a hőmérsékletet megemeltük. Az indukció után tíz órával a tenyészet felülúszójában mért Apó AI-M koncentráció 3,7 g/1, további 12 órával ezután pedig 4,4 g/1 volt. A mérési eredmények a 10. ábrán láthatók.
6. példa
BC50/pKP764 törzs tenyésztése 75 literes bioreaktorban
A fermentációt 75 liter össztérfogatú bioreaktorban (Chemap AG, Svájc) végeztük, melynek hasznos térfogata 35 liter. Az alkalmazott tápközeg és a tenyésztés körülményei megegyeztek a 2. példában leírtakkal. Annak érdekében, hogy az oldott oxigén tenzióját a telítési érték 30%-án tartsuk, a készülékben uralkodó nyomást az indukció utáni két órán át 1,4 bar értékre növeltük. A tenyésztés 16. órájában, 57 egységnyi optikai denzitás elérésekor adagoltunk IPTG-t a tenyészetbe. Az indukció után 4,5 órával a tenyészet felülúszójában mért Apó AI-M koncentráció 1,9 g/1 volt. A mérési eredmények all. ábrán láthatók.
7. példa
BC50/pKP764 törzs tenyésztése 300 literes bioreaktorban
A fermentációt 300 liter össztérfogatú bioreaktorban (Chemoferm AB, Svédország) végeztük, melynek hasznos térfogata 180 liter. Az inokulumkészítés a 2. példában leírtak szerint történt, azzal az eltéréssel, hogy a rázott lombikos előtenyésztés ideje 14 óra volt. Az így készült előinokulummal 50 liter össztérfogatú bioreaktort oltottunk, melynek hasznos térfogata 18 liter. A rázott lombikokban és a bioreaktorban egyaránt „A” tápközeget használtunk. A bioreaktorban lévő táptalajhoz 5 g/1 glükózt adtunk, és a tenyésztést 30 °C-on végeztük. A pH-szabályzás és a levegőztetés megegyezett a 2. példában leírtakkal, az oldott oxigén tenzióját végig a telítési érték 30%-a felett tartottuk. Midőn a tenyészet optikai denzitása elérte a 4 egységet, a bioreaktor tartalmának teljes mennyiségével beoltottuk a 300 literes készüléket. Ebben a bioreaktorban a hőmérsékletet, a pH-t és a levegőztetést a 2. példában leírtak szerint állítottuk be. Az indukció előtt az oldott oxigén tenzióját a keverés maximumra való emelésével, ezt követően pedig a nyomás emelésével a telítési érték 30%án, illetve ezen érték felett tartottuk. Az indukció után a készülékben uralkodó nyomást 2 bar értékre emeltük, amivel a telítési érték 15-20%-ának megfelelő oxigéntenziót sikerült biztosítani. A temyésztés 16. órájában, 51 egységnyi optikai denzitás elérésekor IPTG-t adtunk a tenyészethez, és a hőmérsékletet 37 °C-ra emeltük. Öt órával az indukció után a tenyészet felülúszójában mért Apó AI-M koncentráció 1,3 g/1 volt,
HU 220 193 Β mely az ezt követő egyórás hűtés hatására 1,5 g/1 értékre emelkedett. A mérési eredmények a 12. ábrán láthatók.
8. példa
BC50/pKP764 törzs tenyésztése 3.5 literes bioreaktorban
A fermentációt a 2. példában leírtak szerint végeztük, a következő eltérésekkel: a kezdetben beadott glükóz (15 g/1) 12 órás korra elfogyott. Ezt követően 60%-os glükózoldatot adagoltunk programozott módon, lineáris adagolási profil szerint. Az oldott oxigén tenzióját a keverés emelésével a telítési érték 30%-án tartottuk. A glükózrátáplálást 0,09 ml/perc áramlási sebességgel indítottuk, és négy óra alatt 0,72 ml/perc értékre emeltük, majd ezután 48 percen át ezen az értéken tartottuk. Ezután 96 perc alatt 0,57 ml/percre mérsékeltük, majd 108 perc alatt 0,32 ml/percre csökkentettük, utóbb pedig 54 perc alatt 0,22 ml/percre fogtuk vissza a glükózoldat adagolási sebességét. Végül a glükózadagolást 5 óra 54 perc alatt 0,18 ml/percre minimalizáltuk, és ezen az értéken tartottuk a fermentáció végéig (41 órás kor). A tenyésztés 18. órájában, 61 egységnyi optikai denzitás elérésekor IPTG-t adagoltunk, és a hőmérsékletet megemeltük. 23 órával az indukció után a tenyészet felülúszójában mért Apó AIM koncentráció 1,9 g/1 volt. A mérési eredmények a 13. ábrán láthatók.
9. példa
RP308/pKP683 törzs tenyésztése 3,5 literes bioreaktorban
A fermentációt a 2. példában leírtak szerint végeztük, azzal az eltéréssel, hogy a hőmérsékletet mindvégig 30 °C-on tartottuk. A tenyésztés 18. órájában, 80 egységnyi optikai denzitás elérésekor IPTG-t adagoltunk. 17,5 órával az indukció után a tenyészet felülúszójában mért Apó AI-M koncentráció 1,4 g/1 volt. A mérési eredmények a 14. ábrán láthatók.
10. példa
A sértetlen rekombináns Apó AI-Mjellemzése
A 6. példában leírtak szerint £. coli tenyészettel előállított Apó AI-M fehérjét ismert módon, kromatográfiás módszerrel tisztítottuk. A terméket a 4. ábrán szereplő kikövetkeztetett aminosavszekvenciával hasonlítottuk össze.
A sértetlen fehérje N-terminális szekvenciájának meghatározása Edman-lebontással (20 ciklus), Milligen Biosearch Prosequencer Type 6000 készülékkel történt. A szekvenciát azonosnak találtuk az Apó AI-M Nterminális szekvenciájával.
A rekombináns Apó AI-M fehérjét karboxi-peptidáz P enzimmel (Boehringer Mannheim) emésztettük, majd a keletkező aminosavakat Picotaq™ módszerrel (Waters) analizáltuk. A C-terminális aminosavat sikerült egyértelműen glutaminként azonosítani.
A sértetlen fehérje aminosav-összetételét Beckman 6300 aminosavanalizátorral határoztuk meg savas hidrolízist követően. A eredményt az 1. táblázat tartalmazza. A kapott összetétel megfelel az Apó AI-M összetételének.
1. táblázat
Aminosav Várt Talált
Asx 21 20,8
Thr 10 9,2
Ser 15 13,9
Glx 46 47,0
Gly 10 10,4
Alá 19 19,3
Cys 1 n.d.*
Val 13 11,4
Met 3 n.d.
Ile 0 0,0
Leu 37 36,8
Tyr 7 6,6
Phe 6 5,8
His 5 4,9
Lys 21 20,2
Arg 15 14,8
Pro 10 10,6
Trp 4 n.d.
*=nem mértük
A sértetlen rekombináns fehérje, valamint a humán Apó AI standard (Sigma) CD (cirkuláris dikroizmus) spektrumát 20 mM nátrium-foszfát-pufferben (pH=7,5) felvettük. A megfigyelhető eltérések a kísérleti hibán belüliek (15. ábra).
11. példa
A C-terminális szakasz jellemzése
Hidroxil-aminos hasítással 59 aminosavmaradékból álló (185-243) C-terminális fragmenst készítettünk. A rekombináns Apó AI-M fehérjét (480 pg) feloldottuk 0,5 ml térfogatú hasítóelegyben, mely 2 M hidroxilamint, 3 M guanidínium-kloridot, 0,2 M nátrium-hidroxidot, és 2 mM etilén-diamin-tetraacetátot tartalmazott. A hasítóoldat kezdeti pH-értéke 9,4 volt. A reakcióelegyet 5 órán át 40 °C-on tartottuk. A C-terminális fragmenst reverz fázisú HPLC-vel tisztítottuk YMCpack protein RP kolonna (YMC Co., Inc., Japán) alkalmazásával, az elúciót 0,25% pentafluor-propionsav tartalmú 10-60%-os vizes acetonitriloldat gradienssel végeztük. A C-terminális fragmens egységes, nem fluoreszkáló, éles csúcsként eluálódott 36-38% acetonitriltartalomnál.
A C-terminális fragmens teljes aminosavszekvenciáját meghatároztuk Edman-lebontással, a 8. példában is7
HU 220 193 Β mertetett módon. A szekvencia azonosnak mutatkozott az Apó AI-M fehéqe szekvenciájával, a 185-243 savmaradékokat illetően.
A C-terminális fragmens C-terminális aminosavmaradékát sikerült egyértelműen glutaminként azonosítani, amint az a 10. példában is történt.
A C-terminális fragmens aminosav-összetételének meghatározását a 10. példában leírtak szerint végeztük, és az eredmény a 2. táblázatban látható. A talált összetétel megegyezik az Apó AI-M fehérje összetételével, a 185-243 aminosavakat illetően.
2. táblázat
Aminosav Várt Talált
Asx 2 2,6
Thr 4 3,6
Ser 5 5,0
Glx 9 9,7
Gly 3 3,7
Alá 7 6,8
Cys 0 nd.*
Val 2 1,9
Met 0 n.d.
Ile 0 0,0
Leu 11 10,6
Tyr 2 2,0
Phe 2 2,1
His 2 1,8
Lys 6 5,6
Arg 2 2,1
Pro 2 2,2
Trp 0 n.d.
*=nem mértük

Claims (16)

1. Expressziós vektor apolipoprotein AI-M (Milano) extracelluláris előállítására E. coli baktérium alkalmazásával, amely egy, a következő elemeket hordozó plazmidot tartalmaz: replikációs origó, indukálható promoterszekvencia, amely lehet lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter vagy ezek funkcionális származéka, egy szignálpeptidet kódoló DNS-szekvencia, egy, apolipoprotein AI-M fehérjét kódoló DNSszekvencia és transzkripciós terminátor.
2. Az 1. igénypont szerinti expressziós vektor, amely apolipoprotein AI-M fehérjét kódoló DNS-szekvenciaként érett fehérjét kódoló szekvenciát tartalmaz.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti expressziós vektor, amely indukálható promoterként trc promotert vagy ennek funkcionális származékát tartalmazza.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektor, amely szignálszekvenciaként ompA szignálszekvencia származékát tartalmazza.
5. E. coli törzs, amely az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektorral van transzformálva.
6. Eljárás apolipoprotein AI-M előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) alkalmas táptalajban olyan E. coli törzset tenyésztünk, amely olyan expressziós vektorral van transzformálva, amely egy replikációs origót, indukálható promoterszekvenciát - éspedig lac promoter-, trp promoter-, tac promoter-, trc promoterszekvenciát vagy ezek funkcionális származékát -, egy szignálpeptidet kódoló DNS-szekvenciát, egy apolipoprotein AI-M fehérjét kódoló DNS-szekvenciát - ahol az apolipoprotein AI-M lehet az érett protein vagy az apolipoprotein AI-M prepro-proteinje vagy proproteinje - és egy transzkripciós terminátort tartalmaz,
b) az apolipoprotein AI-M fehérje expresszióját a szaporodás stacionárius fázisának elérése előtt, az expo nenciális növekedési fázisban indukáljuk; és
c) a terméket a tenyészetből elkülönítjük, ahol az apolipoprotein AI-M 1,5 g/l-nél nagyobb koncentrációban szekretálódik a tenyészközegbe.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) tenyésztési lépést alacsony hőmérsékleten kezdjük, majd az exponenciális növekedési fázisban, az apolipoprotein AI-M expressziójának indukálása előtt, után vagy azzal egyidejűleg a hőmérsékletet megemeljük.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 29 és 31 °C közötti hőmérsékleten kezdjük, majd a növekedés exponenciális fázisában a hőmérsékletet 37 °C körüli értékre emeljük.
9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést állandó, 25 és 37 °C közötti hőmérsékleten végezzük.
10. A 6-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az apolipoprotein AI-M expreszsziójának indukálását akkor végezzük, amikor a tenyészet optikai denzitása legalább 50 egységnyi értéket ér el.
11. A 6-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztőkivonatot tartalmazó és adott esetben triptonnal kiegészített tápközeget alkalmazunk.
12. A 6-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termeléshez antibiotikummentes tápközeget használunk.
13. A 6-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy apolipoprotein AI-M fehérjét kódoló DNS-szekvenciaként az érett fehérjét kódoló szekvenciát alkalmazunk.
14. A 6-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy indukálható promoterként trc promotert vagy annak funkcionális származékát alkalmazzuk.
HU 220 193 Β lac promotert vagy annak funkcionális származékát alkalmazzuk.
17. A 6-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szignálszekvenciaként ompA szignálszekvenciát alkalmazunk.
15. A 6-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy indukálható promoterként tac promotert vagy annak funkcionális származékát alkalmazzuk.
16. A 6-13. igénypontok bármelyike szerinti eljá- 5 rás, azzal jellemezve, hogy indukálható promoterként
HU9501680A 1992-12-11 1993-12-09 Expressziós rendszer apolipoprotein AI-M előállításához HU220193B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9203753A SE9203753D0 (sv) 1992-12-11 1992-12-11 Expression system for producing apolipoprotein ai-m
PCT/SE1993/001061 WO1994013819A1 (en) 1992-12-11 1993-12-09 Expression system for producing apolipoprotein ai-m

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9501680D0 HU9501680D0 (en) 1995-08-28
HUT71697A HUT71697A (en) 1996-01-29
HU220193B true HU220193B (hu) 2001-11-28

Family

ID=20388112

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9501680A HU220193B (hu) 1992-12-11 1993-12-09 Expressziós rendszer apolipoprotein AI-M előállításához

Country Status (22)

Country Link
US (1) US5721114A (hu)
EP (1) EP0677109B1 (hu)
JP (1) JP3899121B2 (hu)
AT (1) ATE191930T1 (hu)
AU (1) AU5663794A (hu)
CA (1) CA2150928C (hu)
CZ (1) CZ290865B6 (hu)
DE (1) DE69328442T2 (hu)
DK (1) DK0677109T3 (hu)
ES (1) ES2146646T3 (hu)
FI (1) FI952847A (hu)
GR (1) GR3033966T3 (hu)
HU (1) HU220193B (hu)
IL (1) IL107896A (hu)
MX (1) MX9307855A (hu)
NO (1) NO319497B1 (hu)
PL (1) PL175955B1 (hu)
PT (1) PT677109E (hu)
SE (1) SE9203753D0 (hu)
SK (1) SK76695A3 (hu)
WO (1) WO1994013819A1 (hu)
ZA (1) ZA939266B (hu)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9500778D0 (sv) 1995-03-03 1995-03-03 Pharmacia Ab Process for producing a protein
DE69636907T2 (de) * 1995-11-09 2007-11-22 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Verwendung von lezithin-cholesterin-azetyltransferase für die behandlung von atherosklerose
SE9603068D0 (sv) * 1996-08-23 1996-08-23 Pharmacia & Upjohn Ab Process for purifying a protein
SE9603304D0 (sv) * 1996-09-11 1996-09-11 Pharmacia & Upjohn Ab Process for purifying a compound
SE9603303D0 (sv) 1996-09-11 1996-09-11 Pharmacia & Upjohn Ab Process for purifying a protein
US6306433B1 (en) 1997-08-12 2001-10-23 Pharmacia Ab Method of preparing pharmaceutical compositions
US6004925A (en) 1997-09-29 1999-12-21 J. L. Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6518412B1 (en) 1997-09-29 2003-02-11 Jean-Louis Dasseux Gene therapy approaches to supply apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6037323A (en) 1997-09-29 2000-03-14 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6046166A (en) 1997-09-29 2000-04-04 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
CN1297932A (zh) * 1999-11-30 2001-06-06 上海博容基因开发有限公司 一种新的多肽——人脂蛋白前体蛋白信号肽11和编码这种多肽的多核苷酸
US20020064820A1 (en) * 2000-03-13 2002-05-30 Jean-Michel Dayer Apo-A-I regulation of T-cell signaling
JP4344136B2 (ja) * 2000-11-10 2009-10-14 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・リミテッド アポリポタンパク質類似体
US7217785B2 (en) * 2001-05-09 2007-05-15 The Regents Of The University Of California Cysteine-containing peptides having antioxidant properties
JP2005504085A (ja) * 2001-09-28 2005-02-10 エスペリオン セラピューティクス，インコーポレイテッド 薬剤の局所投与による再狭窄の予防および治療
US20030162758A1 (en) * 2001-12-07 2003-08-28 Schwartz Daniel M. Treatment for age-related macular degeneration (AMD)
US20030229062A1 (en) * 2001-12-07 2003-12-11 The Regents Of The University Of California Treatments for age-related macular degeneration (AMD)
US7470659B2 (en) * 2001-12-07 2008-12-30 The Regents Of The University Of California Methods to increase reverse cholesterol transport in the retinal pigment epithelium (RPE) and Bruch's membrane (BM)
US7223726B2 (en) * 2002-01-14 2007-05-29 The Regents Of The University Of California Apolipoprotein A-I mutant proteins having cysteine substitutions and polynucleotides encoding same
US7691965B2 (en) * 2002-05-08 2010-04-06 The Regents Of The University Of California Helical synthetic peptides that stimulate cellular cholesterol efflux
US20100204103A1 (en) * 2002-05-08 2010-08-12 The Regents Of The University Of California Helical synthetic peptides that stimulate cellular cholesterol efflux
WO2003096983A2 (en) 2002-05-17 2003-11-27 Esperion Therapeutics, Inc. Method of treating dyslipidemic disorders
US20040038891A1 (en) * 2002-05-17 2004-02-26 Bisgaier Charles L. Methods and compositions for the treatment of ischemic reperfusion
HUE036646T2 (hu) 2003-01-23 2018-07-30 Esperion Therapeutics Inc Hidroxilvegyületek és kompozícióik koleszterin szabályozására és kapcsolódó alkalmazásokra
ATE486936T1 (de) * 2003-03-05 2010-11-15 Chemo Sero Therapeut Res Inst Verfahren zur herstellung eines heterologen proteins in e. coli
EP1732383A4 (en) * 2004-04-06 2007-05-02 Cedars Sinai Medical Center PREVENTION AND TREATMENT OF VASCULAR DISEASES WITH VIRUS VECTORS ASSOCIATED WITH RECOMBINANT ADENOVIRUS CODING APOLIPOPROTEIN A-I AND APOLIPOPROTEIN A-I MILANO
KR100560102B1 (ko) 2004-06-25 2006-03-13 한국생명공학연구원 프로아포리포단백질 ａ－ⅰ 변이체와, 이를 포함하는고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제
CN1320119C (zh) * 2004-12-09 2007-06-06 复旦大学 人载脂蛋白ApoAⅠ在毕赤氏酵母胞内表达的方法
JP5113752B2 (ja) 2005-08-22 2013-01-09 メリオール・ファーマスーティカルズ・ワン・インコーポレイテッド Ｌｙｎキナーゼの活性を調節し、関連する疾患を治療するための方法および製剤
JP2009505652A (ja) * 2005-08-26 2009-02-12 セレニス セラピューティクス ホールディング エスア 乳酸菌においてアポリポタンパク質遺伝子生成物を生成するための組成物および方法
DE102006004871A1 (de) 2006-02-02 2007-08-09 Wacker Chemie Ag Mikroorganismenstamm zur Produktion von rekombinanten Proteinen
US20070254832A1 (en) * 2006-02-17 2007-11-01 Pressler Milton L Methods for the treatment of macular degeneration and related eye conditions
MX2008015337A (es) 2006-06-01 2009-11-26 Inst Cardiologie Montreal Metodo y compuesto para el tratamiento de estenosis valvular.
DK1903115T3 (da) 2006-09-22 2011-05-23 Wacker Chemie Ag Fremgangsmåde til fermentativ fremstilling af antistoffer
DE102006044841A1 (de) 2006-09-22 2008-04-03 Wacker Chemie Ag Signalpeptid zur Produktion von rekombinanten Proteinen
DE102006050332A1 (de) 2006-10-25 2008-04-30 Wacker Chemie Ag DNS-Konstrukt und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Fusionsproteinen
AU2008210586B2 (en) * 2007-01-31 2013-07-04 Nutrition 21, Inc. Use of chromium histidinate for treatment of cardiometabolic disorders
CN101686686A (zh) * 2007-02-20 2010-03-31 梅里奥尔医药I公司 鉴别Lyn激酶激活剂的方法
ES2579229T3 (es) 2007-03-13 2016-08-08 Jds Therapeutics, Llc Procedimientos y composiciones para la liberación sostenida de cromo
WO2009002867A2 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Nutrition 21, Inc. Multiple unit dosage form having a therapeutic agents in combination with a nutritional supplement
EP2180894A4 (en) * 2007-07-23 2012-08-29 Melior Pharmaceuticals I Inc METHOD OF ACTIVATING IRS-1 AND ACT
EA201070517A1 (ru) * 2007-10-23 2010-12-30 Дзе Кливленд Клиник Фаундейшн Устойчивый к окислителям аполипопротеин а-1 и пептиды-миметики
US8552184B2 (en) * 2008-07-03 2013-10-08 Melior Pharmaceuticals I, Inc. Compounds and methods for treating disorders related to glucose metabolism
KR20220138415A (ko) 2008-11-10 2022-10-12 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
CA3036963A1 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Arbutus Biopharma Corporation Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid
ES2620478T3 (es) 2009-02-16 2017-06-28 Cerenis Therapeutics Holding Sa Miméticos de la apolipoproteína A-I
JP6032724B2 (ja) 2009-03-12 2016-11-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 脂質製剤組成物およびＥｇ５遺伝子とＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害する方法
KR102229618B1 (ko) 2009-05-05 2021-03-18 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 지질 조성물
HRP20211619T1 (hr) 2009-06-10 2022-02-04 Arbutus Biopharma Corporation Poboljšana formulacija lipida
US9029338B2 (en) 2009-08-14 2015-05-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
DE102009053566B4 (de) 2009-11-11 2014-08-14 Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt Mikroorganismen mit gesteigerter Sucrosemutaseaktivität
EP3296398A1 (en) 2009-12-07 2018-03-21 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
NZ600725A (en) 2009-12-18 2015-08-28 Univ British Colombia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
WO2011139911A2 (en) 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated single stranded rna
US20130137628A1 (en) 2010-05-11 2013-05-30 Esperion Therapeutics, Inc. Dimeric Oxidation-Resistant Apolipoprotein A1 Variants
WO2011150300A1 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Melior Pharmaceuticals I, Inc. Prevention of pancreatic beta cell degeneration
IL300109A (en) 2010-06-03 2023-03-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Biodegradable lipids for the transfer of active substances
US20130202652A1 (en) 2010-07-30 2013-08-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
US20130323269A1 (en) 2010-07-30 2013-12-05 Muthiah Manoharan Methods and compositions for delivery of active agents
BR112013004396A2 (pt) * 2010-08-30 2016-05-17 Hoffmann La Roche alimentação alcalina
CN103370054A (zh) 2010-11-09 2013-10-23 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制Eg5和VEGF基因的表达的脂质配制的组合物和方法
AU2012207606B2 (en) 2011-01-11 2017-02-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pegylated lipids and their use for drug delivery
CN103443123B (zh) 2011-02-07 2020-05-29 塞勒尼斯医疗控股公司 脂蛋白复合物及其制备和用途
CN103702672B (zh) 2011-03-01 2016-04-27 Jds治疗有限公司 用于预防和治疗糖尿病、低血糖症及相关病症的胰岛素和铬组合物
US9701623B2 (en) 2011-09-27 2017-07-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
JP6152387B2 (ja) 2011-12-12 2017-06-21 メリオール・ファーマスーティカルズ・ワン・インコーポレイテッド Ｉ型およびｉｉ型糖尿病の処置
WO2014011908A1 (en) 2012-07-11 2014-01-16 Esperion Therapeutics, Inc. Apolipoprotein mixtures
MX2016014306A (es) 2014-05-02 2017-06-12 Cerenis Therapeutics Holding Sa Marcadores para terapia con lipoproteinas de alta densidad (hdl).
US11865121B2 (en) 2016-02-11 2024-01-09 Nutrition21, LLC Chromium containing compositions for improving health and fitness
US10426817B2 (en) * 2017-01-24 2019-10-01 Macregen, Inc. Treatment of age-related macular degeneration and other eye diseases with apolipoprotein mimetics
BR112019021140A2 (pt) 2017-04-10 2020-05-19 Univ Louisiana State composição, método para reduzir os níveis de glicose no sangue, ganho de peso ou níveis de depósito de gordura, ou tratamento, método de indução do bege de adipócitos ou prevenção da degeneração das células beta do pâncreas, e, ativador de lyn cinase e agonista de trpm8 para uso na redução dos níveis de glicose no sangue, ganho de peso ou níveis de depósito de gordura, ou tratamento.

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8625435D0 (en) * 1986-10-23 1986-11-26 Erba Farmitalia Human apolipoprotein ai
DE68917379T2 (de) * 1988-05-31 1994-12-01 Mitsubishi Chem Ind Verfahren zur Herstellung von Proteinen, die ähnlich dem natürlich-menschlichen Apolipoprotein-E sind.
DE3819463A1 (de) * 1988-06-08 1989-12-14 Behringwerke Ag Expressionsvektoren zur herstellung unfusionierter proteine in mikroorganismen
US5223407A (en) * 1988-08-31 1993-06-29 Allelix Inc. Excretion of heterologous proteins from e. coli
IT1229996B (it) * 1989-04-20 1991-09-20 Cesare Sirtori Espressione di apolipoproteina ai e apolipoproteina ai-milano in lievito e composizioni farmaceutiche che contengono dette apolipoproteine.
EP0497757B1 (en) * 1989-10-31 1994-06-22 Schering Corporation E. coli secretory strains
DE4009268A1 (de) * 1990-03-22 1991-09-26 Consortium Elektrochem Ind Sekretion von hirudinderivaten
SE9103701D0 (sv) * 1991-12-13 1991-12-13 Kabi Pharmacia Ab Apolipoprotein

Also Published As

Publication number Publication date
JPH08506723A (ja) 1996-07-23
HUT71697A (en) 1996-01-29
GR3033966T3 (en) 2000-11-30
NO952297L (no) 1995-06-09
ES2146646T3 (es) 2000-08-16
HU9501680D0 (en) 1995-08-28
NO952297D0 (no) 1995-06-09
EP0677109B1 (en) 2000-04-19
MX9307855A (es) 1994-06-30
AU5663794A (en) 1994-07-04
WO1994013819A1 (en) 1994-06-23
CZ148795A3 (en) 1996-01-17
PL309292A1 (en) 1995-10-02
ATE191930T1 (de) 2000-05-15
DE69328442T2 (de) 2000-09-07
FI952847A0 (fi) 1995-06-09
JP3899121B2 (ja) 2007-03-28
PT677109E (pt) 2000-07-31
US5721114A (en) 1998-02-24
DK0677109T3 (da) 2000-07-17
CA2150928A1 (en) 1994-06-23
CZ290865B6 (cs) 2002-11-13
PL175955B1 (pl) 1999-03-31
CA2150928C (en) 2005-02-08
FI952847A (fi) 1995-06-09
DE69328442D1 (de) 2000-05-25
ZA939266B (en) 1994-08-08
SE9203753D0 (sv) 1992-12-11
SK76695A3 (en) 1996-02-07
EP0677109A1 (en) 1995-10-18
IL107896A (en) 2004-06-01
NO319497B1 (no) 2005-08-22
IL107896A0 (en) 1994-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU220193B (hu) Expressziós rendszer apolipoprotein AI-M előállításához
JP3359638B2 (ja) 肺界面蛋白質ｓｐ−ｃの合成ペプチド類似体
EP0131843B1 (en) Expression vectors for enhanced production of polypeptides, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids, products manufactured thereby and related methods
US5288852A (en) Human tumor necrosis factor polypeptides
US5100784A (en) Process for the preparation of mature human serum albumin
KR940005585B1 (ko) 과립구 대식세포 콜로니 촉진 인자(gm-csf)단백질의 제조방법
JPH05227951A (ja) Ｌ−フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ変異体、その製造法および非タンパク質誘発性アミノ酸のペプチドまたはタンパク質へのインビボでの組込みのためのその使用
JP2001008697A (ja) Ｅ．コリでの非融合タンパク質の調製方法
JPH08289792A (ja) ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼｃＤＮＡ、その細菌中での発現及び酵素活性ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの回収方法
JP2634132B2 (ja) 新規ペプチド
JP2549504B2 (ja) Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物
JPH08103279A (ja) 組換え人ミオグロビンの製造方法
JPH0710900A (ja) 成長ホルモン放出因子を含むハイブリドポリペプチド
HU214698B (hu) Eljárás rekombináns deszulfátó-hirudin HV-1 peptidek előállítására
FI104429B (fi) Ilmentämisplasmidit, jotka sisältävät deo-promoottorin, ja bakteeri-isännät, jotka sisältävät näitä plasmideja
NZ229960A (en) Expression vector and process for producing human epidermal growth factor (hegf)
CA2000368A1 (en) Plasmid constructions for high level production of eukaryotic proteins
JPH08103278A (ja) 活性型ヒトａｌｔの製造方法
JPS62181799A (ja) 発酵工学により製造したカルジオジラチンを含む医薬およびその製造方法
JPS63226297A (ja) 新規生理活性ポリペプチド
JPH0383586A (ja) 新規生理活性ポリペプチド
JPH07101993A (ja) 新規抗腫瘍性ペプチド
JPS62248498A (ja) 新規生理活性ポリペプチド
JPS63279799A (ja) 新規生理活性ポリペプチド
JPH0387198A (ja) 新規生理活性ポリペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: ESPERION THERAPEUTICS INC.,, US

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees