PL175955B1

PL175955B1 - Wektor ekspresyjny, szczep E. coli transformowany tym wektorem oraz sposób produkcji apolipoproteiny Ai-M (Milano)

Info

Publication number: PL175955B1
Application number: PL93309292A
Authority: PL
Inventors: Lars Abrahmsén; Erik Holmgren; Christina Kalderén; Mats Lake; Asa Mikaelsson; Torsten Sejlitz
Original assignee: Pharmacia Ab
Priority date: 1992-12-11
Filing date: 1993-12-09
Publication date: 1999-03-31
Also published as: JPH08506723A; HUT71697A; GR3033966T3; NO952297L; ES2146646T3; HU9501680D0; NO952297D0; EP0677109B1; HU220193B; MX9307855A; AU5663794A; WO1994013819A1; CZ148795A3; PL309292A1; ATE191930T1; DE69328442T2; FI952847A0; JP3899121B2; PT677109E; US5721114A

Abstract

1. Wektor ekspresyjny dajacy zewnatrzkomórkowa produkcje apolipoproteiny AI-M (Milano) przy uzyciu E. coli, znamienny tym, ze obejmuje plazmid posiadajacy poczatek replikacji, indukowalna sekwencje promotorowa, sekwencje DNA kodujaca peptyd sygnalowy, sekwencje DNA kodujaca apolipoproteine AI-M i terminator trans- krypcji. PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy układu ekspresyjnego pozwalającego uzyskać wysokie poziomy białka w pożywce hodowlanej Escherichia coli produkującej apolipoproteinę AI Milano (Apo AI-M). Produkt może być użyty do leczenia miażdżycy i chorób sercowo-naczyniowych.

Wielokrotnie udowodniono, w oparciu o badania epidemiologiczne i długofalowe, bezpośredni związek między podwyższonym poziomem cholesterolu w surowicy i rozwojem choroby wieńcowej (CHD). Jednakże, określenie złożonego mechanizmu transportu

175 955 cholesterolu w osoczu, umożliwiło docenienie szczególnej roli krążących lipoprotein w ryzyku CHD.

W rzeczywistości istnieją cztery główne lipoproteiny krążące: chylomikrony (CM), lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL), niskiej gęstości (LDL) i wysokiej gęstości (HDL). Podczas gdy CM stanowią krótko żyjący produkt wchłaniania tłuszczów w jelicie, VLDL i szczególnie LDL odpowiadają za transport cholesterolu do tkanek, a w tym, do ścian naczyń. W przeciwieństwie do powyższego, HDL są bezpośrednio zaangażowane w usuwanie cholesterolu z tkanek obwodowych, przenosząc go z powrotem do wątroby lub innych lipoprotein, w mechanizmie znanym jako odwrotny transport cholesterolu (RCT).

Zabezpieczająca rola HDL potwierdzona została w wielu badaniach (np. Miller i in. (1977) Lancet 965-968 i Whayne i in. (1981) Atherosclerosis 39: 411419). W badaniach tych, podwyższone poziomy LDL, w mniejszym stopniu VLDL, związane są ze zwiększonym ryzykiem chorób sercowonaczyniowych, podczas gdy wysokie poziomy HDL wydają się odpowiadać za ochronę sercowonaczyniową. Ochronna rola HDL poparta została badaniami in vivo, pokazującymi, że infuzja z- HDL podana 'królikom może powstrzymywać rozwój zmian naczyniowych wywołanych cholesterolem (Badimon i in., (1989) Lab. Invest. 60: 455-461) i/lub wywoływać regresję tychże (Badimon i in. (1990) J. Qin. Invest. 85: 1234-1241).

Ostatnio, zainteresowanie badających ochronny mechanizm(y) HDL skupiło się na apolipoproteinie AI (Apo AI), głównej składowej białkowej HDL. Wysokie poziomy Apo Al w surowicy związane są ze zmniejszonym ryzykiem CHD i obecności zmian w naczyniach wieńcowych (Maciejko i in. (1983) N. Engl. J. Med. 309: 385-389; Sedlis i in. (1986) Circulation 73: 978-984).

Ludzka apolipoproteina AI-Milano (Apo AI-M) jest naturalnym wariantem Apo Al (Weisgraber i in. (1980) J. Clin. Invest. 66: 901-907). W APO AL-M aminokwas' Arg 173 zastąpiony jest przez aminokwas Cys 173. Ponieważ Apo AI-M posiada jedną resztę cysteiny w łańcuchu polipepydowym, może występować w postaci monomeru jak i dimeru. Te dwie postaci są chemicznie zamienne, i określenie Apo AI-M, w niniejszym kontekście, nie rozróżnia tych dwóch postaci. Na poziomie DNA mutację stanowi tranzycja C ->T tzn. kodon CGC zmienia się w TGC. Jednakże, tenże wariant Apo AI jest jednym z najbardziej interesujących, przez to, że osobnicy o fenotypie Apo AI-M charakteryzują się znacznie zmniejszonym poziomem cholesterolu związanego z HDL bez widocznego zwiększenia ryzyka choroby tętnic. (Franceschini i in. (1980) J. Clin. Invest. 66: 892-900). W badaniu drzewa genealogicznego, osobnicy ci wydają się być chronieni przed miażdżycą. Ludzkie dojrzałe Apo AI i Apo AI-M składają się z 243 aminokwasów. Produkowane są one jako białka prekursorowe: preproApo AI i preproApo AI-M długości 267 aminokwasów. 18-aminokwasowy polipeptyd odcinany jest przez maszynerię sekrecyjną pozostawiając probiałko przedłużone o 6 aminokwasów. ProApo AI i proApo AI-M przetwarzane są do dojrzałej postaci białka przez aktywność proteolityczną osocza.

Podejmowano próby produkcji ludzkiej Apo Al drogą technologii rekombinowanacji DNA. W Europejskim wniosku patentowym Nr. 0267703 opisano uzyskiwanie Apo AI z E. coli. Proces opisuje polipeptyd chimeryczny, w którym domena Apo AI poddana jest fuzji z aminokwasami końca N β-galaktozydazy lub z jedną lub wieloma domenami wiążącymi IgG białka A, lub z prosekwencjami ludzkiej Apo Al.

Ekspresja Apo Al i Apo AI-M w szczepach drożdży i użycie wytworzonych składników do leczenia miażdżycy i chorób sercowonaczyniowych ujawnione jest w WO90/12879. Geny kodujące Apo AI i Apo AI-M wprowadzone zostały wraz z sekwencjami DNA kodującymi sygnały wydzielnicze (obejmujące zmodyfikowaną sekwencję liderową MF alfa-1) i obróbki połączone powyżej genu kodującego dojrzałe białka.

Układ oparty na E. coli, produkujący Apo Al opisany jest przez Hoppe i in. (1991) J. Biol. Chem. 372:225-234. Poziomy ekspresji opisane w tym układzie zawierają się pomiędzy 0.3 a 4.8 mg na litr pożywki. Układ oparty jest na ekspresji wewnątrzkomórkowej.

175 955

Apo AI produkowano również jako białko fuzyjne z β-galaktozydazą w wewnątrzkomórkowym układzie ekspresyjnym (Lorenzetti i in. (1986) FEBS Letters 194: 343-346). Poziomy produkcji wynosiły około 5 mg/l pożywki. W badaniu tym analizowano Wpływ końca 5' genu na wydajność ekspresji u E. coli. Gen lacZ użyto jako znacznika do badania ekspresji Apo Al u E. coli. Gen lacZ poddano fuzji z końcem 3' Apo AI (Isacchi i ih. (1989) Gene 81: 129-137).

Opisane uprzednio poziomy produkcji apolipoproteiny AI i AI-M, wynoszące około 5 mg na litr pożywki są zbyt niskie by uczynić je atrakcyjnymi komercjalnie.

Układ ekspresyjny oparty na produkcji wydzielniczej apolipoproteiny E opisany jest w EP-A-345 155. W układzie tym apolipoproteina E produkowana jest przez E. coli, po czym może być odzyskiwana w periplazmie. Przewidziano, choć nie przedstawiono wydajność dochodzącą do 0.15-0.45 g na litr.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu produkcji apoliporoteiny AI-M (Milano), zwanej dalej Apo AI-M, drogą technologii rekombinowanego DNA, ze znacząco wyższą wydajnością niż uprzednio uzyskane. Zgodnie z wynalazkiem, odkryto nieoczekiwanie, że uzyskuje się ponad 1000 razy więcej Apo AI-M na litr, tzn. około 4.5 g/l, przy użyciu indukowalnego układu ekspresyjnego u E. coli, w którym Apo AI-M wydzielana jest do pożywki bakteryjnej, z której produkt może być oczyszczany standardowymi metodami biochemicznymi.

Cechą charakterystyczną wynalazku jest indukowalny promotor sterujący genem strukturalnym, składającym się z genu Apo AI-M poprzedzonego sekwencją sygnałową umożliwiającą polipeptydowi wydzielenie go do podłoża hodowlanego. Po zaindukowaniu, układ charakteryzuje niespotykanie wysoki poziom ekspresji, w granicach 1.5-4.5 g Apo AI-M na litr pożywki. W celu utrzymania optymalnej jakości produktu, pozyskiwanie może być wykonane zanim osiągnięta zostanie maksymalna wydajność.

Analiza biochemiczna wykazała, że N- i C-końcowe sekwencje aminokwasów oraz całkowity skład aminokwasowy produkowanego białka jest identyczny z ludzką Apo AI-M uzyskaną z osocza. Badanie spektrum dichroizmu kołowego sugeruje podobne fałdowanie rekombinowanej Apo AI-M i ludzkiej Apo AI.

Jeden z aspektów niniejszego wynalazku odnosi się do nowego wektora ekspresyjnego dającego zewnątrzkomórkową produkcję Apo AI-M przy użyciu E. coli, który to wektor obejmuje plazmid posiadający odpowiedni początek replikacji, indukowalną sekwencję promotorową, sekwencję DNA kodującą peptyd sygnałowy, sekwencję DNA kodującą Apo AI-M i terminator transkrypcji.

Odpowiednie plazmidy podstawowe, które mogą być zmodyfikowane w zgodzie z niniejszym wynalazkiem mogą być wybrane spośród dobrze znanych plazmidów opisanych uprzednio i używanych w technikach rekombinacyjnych.

Określenie Apo AI-M w znaczeniu tu użytym winno być interpretowane w szerokim znaczeniu i obejmuje również odmiany funkcjonalne oraz fragmenty białka Apo AI-M. Sekwencja DNA kodująca Apo AI-M może być sekwencją cDNA kodującą białko prepro, pro- lub najkorzystniej białko dojrzałe.

Silne, indukowalne promotory E. coli znane są per se osobom kompetentnym. Przykładowo wymienione być mogą: promotor lac indukowany IPTG (izopropylo-β-D-tiogalaktozyd), promotor trp, ulegający represji pod wpływem tryptofanu i indukcji kwasem 3-indolilooctowym, promotory trc i tac (hybrydy powstałe z promotorów trp i lac) ulegające indukcji IPTG, i promotory lambda-PL i lambda PR, które w połączeniu z wrażliwym na temperaturę represorem lambda cI857, może być indukowany w temperaturze pokojowej powyżej 30°C, jak również funkcjonalne pochodne tych promotorów. Obecnie najkorzystniejszym promotorem jest trc.

Peptydy sygnałowe możliwe do zastosowania w niniejszym wynalazku, znane są dobrze osobom kompetentnym i mogą być łatwo wybrane przez , wprawną osobę jak tylko zostanie ona poinformowana o niniejszym wynalazku. Jako przykład podać można pochodną sekwencji sygnałowej ompA.

175 955

Terminatory możliwe do zastosowania w niniejszym wynalazku łatwo mogą być wybrane przez osobę kompetentną spośród powszechnie używanych.

Inny aspekt wynalazku odnosi się do organizmów gospodarza E. coli transformowanych wektorem ekspresyjnym, tzn. układu ekspresyjnego. Odpowiednie szczepy E. coli są oczywiste dla osoby kompetentnej.

Jeszcze inny aspekt wynalazku dotyczy sposobu produkcji Apo AI-M, obejmującego etapy:

-hodowli transformowanych organizmów gospodarza w pożywce;

-indukowania ekspresji Apo AI-M w logarytmicznej fazie wzrostu zanim osiągnięta zostanie faza stacjonarna; i

-izolowania produktu z pożywki.

Odpowiedni okres inkubacji, możliwe zmiany temperatury i pozyskiwania wybrane zostały tak jak to opisano poniżej.

W jednym z wykonań, hodowla zaczęta została w niskiej temperaturze około 29 do 31°C, najkorzystniej około 30°C następnie temperaturą podwyższano (w logarytmicznej fazie wzrostu) do około 37°C, zanim osiągnięto fazę stacjonarną. Podwyższanie temperatury może być wykonane w połączeniu z indukcją wektora ekspresyjnego, ale może być dokonane przed indukcją, przykładowo około 3 godziny przed lub po indukcji.

Najkorzystniej, ekspresja Apo AI-M jest indukowana, a temperatura podnoszona gdy gęstość optyczna (OD) osiągnie przynajmniej 50, przykładowo OD jest rzędu 50 do 100. W niniejszym kontekście, oznacza to, że indukcja i podwyższenie temperatury następuje pomiędzy 15 a 20 godzin od początku hodowli.

W innym wykonaniu, fermentacja przeprowadzana jest w stałej temperaturze pomiędzy około 25 a 37°C.

Pozyskiwanie wykonywane jest w optymalnej fazie hodowli.

Pożywka najkorzystniej zawiera ekstrakt drożdżowy, z ewentualnym dodatkiem tryptonu. Ewentualnie pożywka do produkcji wolna jest od antybiotyków.

Krótki opis rysunków. '

Figura 1 przedstawia dwa oligonukleotydy użyte do fuzji kopii cDNA geny Apo AI-M z fragmentem DNA kodującym sekwencje sygnałowe bakterii. Pokazane są również sekwencje nukleotydowe oligonukleotydów, unikalne miejsca restrykcyjne EcoRI, BbsI i NcoI oraz domniemana sekwencja aminokwasowa wokół domniemanego miejsca cięcia peptydazy sygnału E. coli. Koniec aminowy Apo Al-M pokazany jest jako +1.

Figura 2 pokazuje dwa oligonukleotydy użyte do konstrukcji nowych stop kodonów dla plazmidu pKP764. Pokazana jest sekwencja nukleotydowa wraz z domniemanym aminokwasem końca karboksylowego Apo Al-M i dwa nowe stop kodony TAA, TAA.

Figura 3 pokazuje segment DNA długości 957 bp (NotI - HindIII) pochodzący z plazmidu pKP683 z domniemaną sekwencją aminokwasową i masą cząsteczkową translowanego białka Apo AI-M. Aminokwas końca aminowego Apo AI-M zaznaczono jako +1. Unikalną cysteinę (Cys 173), która jest niezbędna do dimeryzacji Apo AI-M podkreślono.

Figura 4 pokazuje segment DNA długości 856 bp (NotI - HindIII) pochodzący z plazmidu pKP764 z domniemaną sekwencją aminokwasową i masą cząsteczkową translowanego białka Apo AI-M. Aminokwas końca aminowego Apo AI-M zaznaczono jako +1. Unikalną cysteinę (Cys173), która jest niezbędna do dimeryzacji Apo AI-M podkreślono.

Figura 5 pokazuje wektor ekspresyjny pKP683. Ważne elementy strukturalne i regulatorowe wyszczególniono jako ramki ze strzałkami pokazującymi kierunki, odpowiednio, translacji i replikacji. Niektóre z unikalnych miejsc restrykcyjnych zaznaczono poza kręgiem plazmidu. Zaznaczono również oba miejsca Nrul. Skróty wewnątrz ramek oznaczają: S, sekwencja sygnałowa; Apo AI-M, apolipoproteina AI-Milano; T1 i T2, powtórzenia tandemowe niezależnych terminatorów Rho bakteriofaga fd; Km, marker oporności na kanamycynę pochodzący z transpozonu Tn903; Ori, początek replikacji, IacIQ, (Lacl^q) gen konstytutywnie produkujący represor lac; Ptrc, hybryda trp/lac promotora trc.

175 955

Figura 6 pokazuje wektor ekspresyjny pKP764. Ważne elementy strukturalne i regulatorowe wyszczególniono jako ramki ze strzałkami pokazującymi kierunki, odpowiednio, translacji i replikacji. Niektóre z unikalnych miejsc restrykcyjnych zaznaczono poza kręgiem plazmidu. Skróty użyte dla Figury 6 są te same co dla Figury 5.

Figura 7 przedstawia produkcję Apo AI-M w 3.5 litrowym bioreaktorze, przy użyciu szczepu E. coli RV308/pKP683. Symbole: (otwarte kółka), gęstość optyczna przy 600 nm; (otwarte kwadraty), stężenie Apo AI-M (g/l pożywki). Moment indukcji (przez dodanie IPTG) zaznaczono strzałką.

Figura 8 pokazuje produkcję Apo AI-M w 3.5 litrowym bioreaktorze, przy użyciu szczepu E. coli RV308/pKP764. Symbole jak w figurze 7.

Figura 9 przedstawia produkcję Apo AI-M w 3.5 litrowym bioreaktorze, przy użyciu szczepu E. coli BC50/pKP683. Symbole jak w figurze 7.

Figura 10 przedstawia produkcję Apo AI-M w 3.5 litrowym bioreaktorze, przy użyciu szczepu E. coli BC50/pKP764. Symbole jak w figurze 7.

Figura 11 pokazuje produkcję Apo AI-M w 75 litrowym bioreaktorze, przy użyciu szczepu E. coli BC50/pKP764. Symbole jak w figurze 7.

Figura 12 pokazuje produkcję Apo AI-M w 300 litrowym bioreaktorze, przy użyciu szczepu E. coli BC50/pKP764. Symbole jak w figurze 7.

Figura 13 pokazuje produkcję Apo AI-M w 3.5 litrowym bioreaktorze, przy użyciu szczepu E. coli BC50/pKP764. Symbole jak w figurze 7.

Figura 14 pokazuje produkcję Apo AI-M w 3.5 litrowym bioreaktorze, przy użyciu szczepu E. coli RV308/pKP683. Symbole jak w figurze 7.

Figura 15 pokazuje spektra dichroizmu kołowego rekombinowanej Apo AI-M (linia gruba) i ludzkiej Apo AI (linia cienka).

W następujących nie ograniczających Przykładach, w których wynalazek został opisany w sposób szczegółowy, w sposób wyłącznie przykładowy, zostanie opisana konstrukcja wektora plazmidowego do bezpośredniej sekrecji Apo AI-M do przestrzeni periplazmatycznej E. coli i wydzielania do pożywki na bardzo wysokim poziomie, jak również produkcja Apo AI-M w bioreaktorach.

Przykład 1. Konstrukcja wektorów i transformacja E. coli Szczepy i wektory

Używano niżej wymienionych szczepów K2 Escherichia coli: HB101F-, hsdS20(rB', mB-) supE44, ara!4, lambda) galK2, lacY1, proA2, rspL20, xyl-5, mtl-1, recA13, mcrA(+), mcrB(-) (Boyer i in., (1969) J. Mol. Biol. 41: 459-472); DH5alpha F-, F80dlacZDM15, D(lacZYA-argF)U169, recAI, endAI, gyrA, lambda- thi-I, hsdR17, (r k, m⁺k), supE44, relAI, (BRLUSA); RV308 DlacX74, galOP::IS2(galOP308), strA, lambda', (Maurer i in., (1980) J. Mol. Biol. 139: 147-161; i BC50 xyl-7, ara-14, T4-R, lambda’ (Kabi Pharmacia AB, Sweden). Szczepów HB101 i DH5alpha użyto do wklonowania fragmentów DNA.

Plazmidu pUC9 (Vieira i in., (1980) Gene 19: 259-268) użyto do wklonowania fragmentu Bam HI cDNA długości 847 bp, ludzkiej Apo AI otrzymanej od A. Sidoli, Uniwersytet Mediolański, Włochy, i opisany przez Sharp i in., Nucl. Acids Res. (1984) 12: 3917-3932. Sekwencję nukleotydową cDNA ludzkiej Apo Al można uzyskać z bazy danych GenBank pod numerem Χ02162 (Seilhammer i in., DNA 3: 309-317). Wektor ten oznaczono pKP575. Również fragment Eco Rl-Pstl ludzkiego DNA długości 882 bp (kopia cDNA Apo A i zamieniona do Apo AI-M przez kierowaną mutagenezę, uzyskaną od A. Sidoli, Uniwersytet Mediolański, Włochy) wklonowano do plazmidu pUC9. Pochodna ta oznaczona została pKP576. Plazmidy pKP683 i pKP764 przygotowane jak to opisano poniżej są pochodnymi plazmidów pTrc 99 (opisanych przez Amann i in., (1988) Gene 69: 301-15; możliwe do uzyskania z Pharmacia P-L Biochemicals, Inc. Milwaukee, USA) i pochodnej pUC, pUC4-k, z markerem oporności na kanamycynę pochodzącym z transpozonu (Tn903) (Vieira i in., (1982) Gene 19: 259-268, i Oka i in., (1981) J. Mol. Biol.

175 955

147: 217) i terminatorami transkrypcji (T1T2) bakteriofaga fd, z pUEX2, (Bressan i in., (1987) Nuci. Acids Res. 15:10056).

Użyte metody

Do przygotowania DNA plazmidowego i do badania ekspresji na małą skalę szczepy bakterii hodowano w pożywce Luria-Bertani (LB) lub pożywce z tryptonem drożdżowym (2xYT) z ampicyliną (Ap) 50 μ g/ml lub kanamycyną (Km) 70 μ g/ml (Sambrook i in., (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Podłoże z agarem krwawym (Difco, USA) z dodatkiem Ap 50 gg/ml lub Km 70 g g/ml używano do hodowli bakterii na płytkach agarowych. Techniki rekombinacji DNA przeprowadzono zgodnie z Sambrook i in., (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press. Endonukleazy restrykcyjne i ligazę DNA T4 uzyskano z Boehringer Mannheim (Germany), New England Biolabs (Beverly, USA) i Pharmacia LKB Biotechnology AB (Uppsala, Sweden). Izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG) uzyskano z Sigma (St. Louis, USA). Agarozy o niskiej temperaturze krzepnięcia i topnienia (NuSieve GTG, FMC Bioproducts, USA) użyto do wyizolowania fragmentów DNA. Amplifikację PCR wykonano przy użyciu urządzenia DNA thermal cycler i polimerazy DNA Taq z Perkin-Elmer/Cetus Instruments (Norwalk, USA). Łączniki oligonukleotydowe i startery zsyntetyzowno na Pharmacia LKB Gene Assembler Plus firmy Pharmacia LKB Biotechnology AB (Uppsala, Sweden) metodą syntezy na podłożu stałym przy użyciu trójestrów fosforanu. Określenie sekwencji nukleotydowej dokonano na urządzeniu Applied Biosystems 373A DNA sequencer, przy użyciu zestawu Taq DyeDeoxy™ Terminator Cycle Sequencing Kit z Applied Biosystems, Inc. (USA).

Użyty program komputerowy

Do wykreślenia map plazmidów użyto komputera Macintosh i programu PlasmidARTIST (wersja 1.2) (Clontech, USA), zaś do opracowania sekwencji DNA użyto komputera Digital VAX i oprogramowania GCG Sequence Analysis Software Package (Genetics Computer Group, Inc, Madison wiiconsin USA).

Konstrukcja plazmidu pKP683

Zsyntetyzowano dwa oligonukleotydy (Figura 1) do połączenia kopii cDNA kodującego Apo AI i Apo AI-M z fragmentami DNA kodującymi bakteryjne sekwencje sygnałowe. Fragment EcoRI - Neol długości 14 bp i fragment Ncol długości 40 bp plazmidu pKP575 zamieniono na syntetyczny fragment EcoRI - Ncol długości 37 bp (Figura 1) uzyskując plazmid oznaczony pKP580. Miejsce cięcia BbsI w syntetycznym fragmencie DNA dało takie samo miejsce jak Mlul, co ułatwiło klonowanie różnych fragmentów kodujących bakteryjne sekwencje sygnałowe. Plazmid pKP631 skonstruowano przez zastąpienie fragmentu Ncol - DraIII długości 702 bp plazmidu pKP575 (Apo AI) przez fragment Ncol - DraIII długości 702 bp plazmidu pKP576 (Apo AI-M). Wyizolowano z plazmidu pKP631 fragment BbsI - HindIII długości 846 bp, i wprowadzono go w miejsce Mlul i HindIII wektora plazmidowego, który oznaczono pKP682. Wektor ten zawierał promotor tac (Ptac), pochodną sekwencji sygnałowej ompA, dwa terminatory transkrypcji i marker oporności na kanamycynę. Fragment Nrul - Nrul długości 1541 bp wyizolowano z pKP682 i wprowadzono do podobnego wektora ale z Ptac zastąpionym przez promotor Ptrc. Ten wektor ekspresyjny oznaczono pKP683 (Figura 5).

Konstrukcja plazmidu pKP764

Plazmid pKP764 (Figura 6) skonstruowano przez zastąpienie fragmentu DraIII HindIII długości 115 bp plazmidu pKP683 przygotowanego jak to opisano powyżej, przez syntetyczny fragment DNA długości 14 bp (Figura 2), zawierający mocniejsze terminatory translacji i usuwający miejsce DraIII przez wprowadzenie A w końcu 3' miejsca DraIII (oznaczone w Figurze 2 jako DraIIID).

175 955

Transformacja szczepów E. coli plazmidami pKP683 i pKP764

Plazmidów pKP683 i pKP764, przygotowanych jak to opisano powyżej, użyto do transformowania szczepów E. coli RV308 i BC50 tak jak to opisano w Sambrook i in., (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press. Uzyskane szczepy E. coli RV308/pKP683 i RV308/pKP764 użyte zostały do hodowli w bioreaktorach przygotowanych w sposób opisany poniżej. Komórki hodowano przez noc w pożywce LB lub 2xYT z dodatkiem Km w butelkach wytrząsanych w temperaturze 30°C. Po odwirowaniu, komórki zawieszono w 1/2 objętości pożywki do przechowywania w zamrożeniu zgodnie z Gergen i in., (1979) Nucl. Acids Res. 7:2115. Porcje rozdzielono do 1 ml probówek i przechowywano w temperaturze -75°C do momentu użycia.

Analiza plazmidów

Konstrukcje plazmidowe użyte do eksperymentów nad ekspresją i do produkcji Apo AI-M badane były przy użyciu mapowania restrykcyjnego, zaś strukturalny gen Apo AI-M potwierdzono przez oznaczenie sekwencji nukleotydowej.

Produkcja Apo AI-M na małą skalę

Do ekspresji Apo AI-M na małą skalę, 20 ml LB lub 2xYT z dodatkiem Km zakażono szczepami RV308/pKP683 lub RV308/pKP764 w 250 ml butelce. Komórki hodowano w temperaturze 30°C przez noc energicznie wytrząsając. Komórki te rozcieńczono 1/100 w świeżej pożywce (20 ml) i hodowano w temperaturze 37°C do gęstości optycznej przy 600 nm (OD) rzędu 1, po czym dodano IPTG do stężenia końcowego 0.5 lub 1 mM. Komórki inkubowano przez dodatkowe 90 minut lub przez noc. Komórki oddzielono od pożywki przez odwirowanie i badano pożywkę na obecność Apo AI-M. Porcje pożywki przepuszczano przez urządzenie do filtrowania, wyjmowano filtr nitrocelulozowy wyjmowano i oznaczano ilość Apo AI-M przy użyciu przeciwciał anty-Apo AI-M. Apo AI-M wyprodukowaną przy użyciu różnych konstrukcji oznaczano przez elektroforezę na żelu poliakrylamidowym z SDS (SDS PAGE) i analizą Western blot, przy użyciu białek uzyskanych z całych komórek i pożywki.

Przykład 2. Produkcja Apo AI-M w bioreaktorach

Pożywki do hodowli komórek w bioreaktorach

Pożywka A: 16 g/l tryptonu (Difco, USA), 8 g/l ekstraktu drożdżowego (Difco, USA) 5 g/l NaCl i 0.05 g/l kanamycyny.

Pożywka B: 2.5 g/l (NH^SOa, 3 g/l KH2PO4, 2 g/l K2HPO4, 0.5 g/l octanu-N₃, 5 g/l ekstraktu drożdżowego (Difco, USA). Po sterylizacji, pożywkę uzupełniono przez dodanie: 10 g/l glukozy początkowej, 0.05 g/l kanamycyny, 1 g/l MgS04 x 7 H2O, i 0.07 g/l chlorowodorku tiaminy. Dodano roztwór zawierający pierwiastki śladowe (1 ml/l) i roztwór witamin (0.65 ml/l). Roztwór pierwiastków śladowych zawierał: 27 g/l FeCl₃ x 6 H2O, 4 g/l ZnSO4 x 7 H₂0,7 g/l C0CI2 x 6 H2O, 7 g/l Na₂M.oO4 x 2 H₂0, 8 g/l CuSO4 x 5 H 20, 2 g/l H₃BO₃, 5 g/l MnSO4 x 4 H 2O, 11 g/l CaCl2 x 2 H 2O i 50 ml/l HCl. Roztwór witamin zawierał: 0.5 g/l pantotenianu wapnia, 0.5 g/l chlorku choliny, 0.5 g/l kwasu foliowego, 0.5 g/l inozytolu, 0.5 g/l amidu kwasu nikotynowego, 0.5 g/l chlorowodorku pirydoksyny, 0.05 g/l ryboflawiny i 0.5 g/l chlorowodorku tiaminy. Jako czynnika zapobiegającego pienieniu użyto Adecanol'u (0.2 ml/l). W razie konieczności, w trakcie hodowli, używano kolejnych dodatków czynnika zapobiegającego pienieniu.

Analiza Apo AI-M w pożywce fermentacyjnej

Próbki pożywki fermentacyjnej odwirowywano i oznaczano stężenie Apo AI-M w nadsączu oznaczano testem radioimmunologicznym (Apolipoprotein AI RLA 100 Kit, Nr. kat. 109152-01, Kabi Pharmacia AB, Sweden).

175 955

Hodowla RV308/pKP683 w 3.5 litrowym bioreaktorze

Zamrożone porcje hodowli użyto do zakażenia 500 ml pożywki A i wstępnej hodowli w 2 litrowym naczyniu Erlenmeyera w temperaturze 30°C przez 8-10 godzin. Inokulum o objętości równej 10% objętości roboczej bioreaktora przeniesiono do bioreaktora.

Hodowlę prowadzono w 3.5 litrowym bioreaktorze (Belach AB, Sweden) o objętości roboczej 2.5 litra. Temperatura równa 30°C podczas fazy wzrostu podniesiona została po indukcji do 37°C. Utrzymywano pH równe 7.0 przy użyciu 25% amoniaku. Stopień napowietrzania utrzymywano na poziomie 1 vvm a ciśnienie parcjalne rozpuszczonego tlenu (D. O. T.) utrzymywano na poziomie 30% przez dostrajanie prędkości mieszadła. Po zuzyciu początkowej glukozy, rozpoczęto uzupełnianie glukozy, utrzymując układ w warunkach ograniczenia glukozy, przez wprowadzanie jej 60% roztworu. Początkowe tempo uzupełniania, wynoszące 0.04 g/min, utrzymywano przez 3 godziny, po czym stopniowo zwiększano do 0.4 g/min. przez 3 godziny. Wzrost komórek śledzono przez mierzenie gęstości optycznej przy długości fali 600 nm.

Po 16 godzinach hodowli, przy OD równej 58, indukowano syntezę białka przez dodanie 0.5 mM IPTG i podwyższono temperaturę do 37°C. Cztery godziny po indukcji stężenie Apo AI-M wynosiło 2.3 g/l, zaś po dalszych dwóch godzinach 2.5 g/l. Wyniki przedstawiono w Figurze 7.

Przykład 3. Hodowla RV308/pKP764 3.5 litrowym bioreaktorze

Pożywka i warunki hodowli były takie same jak opisane w Przykładzie 2. Przy OD równej 58, po 15.5 godzinie hodowli, dodano IPTG i podwyższono temperaturę. Pięć godzin później stężenie Apo AI-M w nadsączu wynosiło 1.6 g/l. Wyniki pokazano w Figurze 8.

Przykład 4. Hodowla BC50/pKP683 w 3.5 litrowym bioreaktorze

Fermentację prowadzono zgodnie z Przykładem 2, z wy’ątkiem użycia do indukcji 1.0 mM IPTG. Po 15 godz. przy OD równej 74, dodano IPTG i podwyższono temperaturę.

7.5 godziny po indukcji stężenie Apo AI-M w nadsączu wynosiło 2.0 g/l. Wyniki pokazano w Figurze 9.

Przykład 5. Hodowla BC50/pKP764 w 3.5 litrowym bioreaktorze

Hodowlę prowadzono jak to opisano w Przykładzie 2, z wyjątkiem nie używania kanamycyny w pożywce. Po 15 godz. przy OD równej 60, dodano IPTG i podwyższono temperaturę. 10 godzin po indukcji stęŻenie Apo AI-M w nadsączu wynosiło 3.7 g/l, zaś 22 godziny po indukcji stężenie wynosiło 4.4 g/l. Wyniki pokazano w Figurze 10.

Przykład 6. Hodowla BC50/pKP764 w 75 litrowym bioreaktorze

Hodowlę prowadzono w 75 litrowym bioreaktorze (Chemap AG, Switzerland) o pojemności roboczej 35 litrów. Pożywka i warunki hodowli były takie same jak opisane w Przykładzie 2. By utrzymać wartość D. O. T. powyżej 30%, ciśnienie powietrza zwiększono do 1.4 bar przez 2 godziny po indukcji. IPTG dodano i podwyższono temperaturę po 16 godzinach fermentacji przy OD równej 57. Stężenie Apo AI-M wynosiło 1.9 g/l, po 4.5 godz. po indukcji. Wyniki przedstawiono w Figurze 11.

Przykład 7. Hodowla BC50/pKP764 w 300 litrowym bioreaktorze

Użyto 300 litrowego bioreaktora (Chemoferm AB, Sweden) o objętości roboczej równej 180 litrów. Inokulum przygotowano w sposób opisany w przykładzie 2, z wyjątkiem tego, że hodowlę wstępną w wytrząsanych butelkach prowadzono przez 14 godzin. Inokulum przeniesiono do 50 litrowego bioreaktora wstępnego o objętości roboczej równej 18 litrów. Pożywką używaną w butelkach jak i w bioreaktorze była Pożywka A. Pożywkę w bioreaktorze wstępnym uzupełniono 5 g/l glukozy i utrzymywano temperaturę 30°C. pH i stopień napowietrzania były jak w Przykładzie 2, zaś D. O. T. nigdy nie spadało poniżej 30%.

175 955

Gdy hodowla osiągnęła OD równą 4, zawartość bioreaktora wstępnego przeniesiono do bioreaktora 300 litrowego. W tym bioreaktorze temperatura, pH i napowietrzanie pożywki były jak w Przykładzie 2. Przed indukcją D. O. T. było utrzymywane równe lub powyżej 30% przez zwiększanie prędkości mieszadła do maksimum a następnie przez podwyższenie ciśnienia powietrza. Po indukcji ciśnienie powietrza zwiększono do 2 bar, co spowodowało D. O. T. równe 15-20%. Po 16 godzinach hodowli w bioreaktorze, gdy hodowla osiągnęła OD równą 51, dodano IPTG i podwyższono temperaturę do 37°C. Stężenie Apo AI-M po 5 godzinach od indukcji wynosiło 1.3 g/l, zaś w trakcie stygnięcia bioreaktora wzrosło do 1.5 g/l. Wyniki przedstawiono w Figurze 12.

Przykład 8. Hodowla BC50/pKP764 w 3.5 litrowym bioreaktorze

Hodowlę prowadzono jak to opisano w Przykładzie 2 z następującymi wyjątkami: początkowa ilość glukozy (15 g/l) zużyta została po 12 godzinach. Zaczęto uzupełniać 60% roztwór glukozy, przy użyciu uprzednio zaprogramowanego profilu, zmieniając tempo dostarczania w sposób liniowy w określonych przedziałach czasu. D.O.T. utrzymywano na stałym poziomie 30%, kontrolując je prędkością wytrząsania. Uzupełnianie rozpoczęto przepływem 0.09 ml/min a następnie zwiększano do 0.72 ml/min przez 4 godziny, po czym utrzymywano na stałym poziomie przez 48 minut. Następnie zmniejszono je do 0.58 ml/min. przez 1 godz. 36 min., po czym zmniejszono do 0.32 przez 1 godz. 48 min., a następnie do 0.22 ml/min przez 54 minuty. Wreszcie uzupełnianie zmniejszono do 0.18 ml/min. przez 5 godzin i 54 minuty i utrzymywano na stałym poziomie do końca fermentacji w 41 godzinie. Po 18 godzinach, przy OD równej 61, dodano IPTG i podwyższono temperaturę. Stężenie Apo AI-M w nadsączu, 23 godziny po indukcji, wynosiło 1.9 g/l. Wyniki pokazano w Figurze 13.

Przykład 9. Hodowla RV308/pKP683 w 3.5 litrowym bioreaktorze

Hodowlę przeprowadzono jak to opisano w Przykładzie 2 z wyjątkiem tego, że fermentacja prowadzona była w stałej temperaturze 30°C. Po 18 godzinach, przy OD równej 80, dodano IPTG. 17.5 godziny później stężenie Apo AI-M w nadsączu wynosiło 1.4 g/l. Wyniki przedstawiono w Figurze 14.

Przykład 10. Charakteryzowanie kompletnej rekombinowanej Apo AI-M

Apo AI-M wytworzono używając E. coli, jak to opisano w Przykładzie 6, a następnie oczyszczano używając standardowych metod chromatograficznych. Produkt porównywano z domniemaną sekwencją aminokwasową pokazaną w Figurze 4.

Określenie sekwencji N-końcowej

Sekwencję N-końcową kompletnego białka określono degradacją Edmana (20 cykli) przy użyciu urządzenia Milligen Bioresearch Prosequecer type 6000. Sekwencja była identyczna z N-końcową Apo Al.

Określenie sekwencji C-końcowej

Rekombinowana Apo AI-M trawiona była karboksypeptydazą P (Boehringer Mannheim) po czym uwolnione aminokwasy analizowano przy użyciu metody Picotag (Waters). Reszta C-końcowa zidentyfikowana została jednoznacznie jako glutamina.

Skład aminokwasowy

Skład aminokwasowy kompletnego białka określono przy użyciu urządzenia Beckman 6300 analizującego aminokwasy po hydrolizie kwaśnej. Wynik przedstawiono w Tabeli 1 poniżej. Oznaczony skład był zgodny ze składem Apo AI-M.

175 955

TABELA 1

Aminokwas	Oczekiwany	Znaleziony
Asx	21	20.8
Thr	10	9.2
Ser	15	13.9
Glx	46	47.0
Gly	10	10.4
Ala	19	19.3
Cys	1	n.d.¹)
Val	13	11.4
Met	3	n.d.
Ile	0	0.0
Leu	37	36.8
^Ty^r	7	6.6
Phe	6	5.8
His	5	4.9
Lys	21	20.2
Arg	15	14.8
Pro	10	10.6
^TrP	4	n.d.

d = nie stwierdzono

Spektrum dichroizmu kołowego (CD)

Widma CD kompletnego rekombinowanego białka i standardu ludzkiej Apo Al (Sigma) rejestrowano w 20 mM buforze fosforanu sodu, pH 7.5. Obserwowane różnice zawierały się w granicach błędu pomiaru (Figura 15).

Przykład 11. Charakteryzacja fragmentu C-końcowego

C-końcowy fragment długości 59 reszt aminokwasowych (reszty 158-243) przygotowano przez cięcie hydroksylaminą. Rekombinowaną Apo AI-M (480 μ g) rozpuszczono w 0.5 ml roztworu tnącego zawierającego 2 M hydroksylaminę, 3 M chlorku guanidyny, 0.2 M NaOH i 2 mM EDTA. Początkowe pH roztworu wynosiło 9.4. Mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 5 godzin w 40°C. C-końcowy fragment oczyszczono na HPLC o odwróconej fazie, przy użyciu kolumny YMC-pack protein RP (YMC Co., Inc., Japan), wypłukiwano gradientem od 10 do 60% acetonitrylu w wodzie, zawierającym 0.25% kwas pentafluoropropionowy. C-końcowy fragment wypłukano jako pojedynczy, nie fluoryzujący, ostry pik przy 36-38% acetonitrylu.

Sekwencja N-końcowa

Sekwencję całego C-końcowego fragmentu określono degradacją Edmana jak to opisano w Przykładzie 8. Sekwencja znaleziona była identyczna z resztami 158-243 Apo AI-M.

175 955

Reszta C-końcowa

Resztę C-końcową fragmentu C-końcowego zidentyfikowano jednoznacznie jako glutaminę, jak to opisano w Przykładzie 10.

Skład aminokwasowy

Skład aminokwasowy fragmentu C-końcowego określono w sposób opisany w Przykładzie 10, zaś wynik przedstawiono w Tabeli 2 poniżej. Skład znaleziony był zgodny ze składem reszt 185-243 Apo AI-M.

TABELA 2

Aminokwas	Oczekiwany	Znaleziony
Asx	2	2.6
Thr	4	3.6
Ser	5	5.0
Glx	9	9.7
Gly	3	3.7
Ala	7	6.8
Cys	0	md.¹)
Val	2	1.9
Met	0	n.d.
Ile	0	0.0
Leu	11	10.6
Tyr	2	2.0
Phe	2	2.1
His	2	1.8
Lys	6	5.6
Arg	2	2.1
Pro	2	2.2
Trp	4	n.d.

1/ n.d = nie stwierdzono

175 955

Segment Not-I-Hind III pKP683 i domniemana sekwencja aminokwasowa Apo AI-M

The DNA segment Not I - Hind III of pKP683 and deduced amino acid seguence of Apo AI-M.

< <0	υ κι	υ 3	O C	υ α	CD Φ	CD tO	CD >.	CD 3	CD a	<
CD r-t	gf?	A Φ	ni tn	2 tn	CD r—1	CD r—l	CD r-l	A Φ	CD X	i
CD <	O A)	-i 2	o 2	CD <	CD <	CD CD	CD X	ri A	•i
CD r-4	O ·-<	o tn	A CL	O 3	CD >,	cd α	CD >	CD CL	CD 3	-i
A (0	A ic	2 >	<C tn	A Φ	CD r-i	< ω	CD ·-!	< tn	< O
CD >	CD >	2 x	O 2	U X	CD CD	CD <	CD CD	CD <	< *i	2
< (0	A A	2 3	CD CL	O A	CD 3	CD r-l	CD C	CD d	CD 3	rt
O r-l	O X	A Φ	O A	ii	,—i	A <0	n£ tn	»ΐ r-t	A Φ	<
O -t	< A	cd j	A A	CD CD	CD >	< nC	CD CD	CD X
A Φ	υ rn	υ c	O Φ	U 0	< C	A tn	CD 3	CD 3	CD tn	rf.
A r-l	o H	< tn	A X	CD a	rf r-l	< -rt	ni r-l	A Φ	-i Dt	rf
< M	o <	2 2	A O,	CD Cc	CD CD	CD X	CD CD	CD X	< X	2
U <0	o 3	< 3	O a	o c	CD 3	CD to	CD <n	CD <0	CD cn	ri
U X	A Φ	A Φ	2 ·—¹	ri	A Φ	O «-t	n£ >,	CD --i	< Dt	<
o <	O X	O X	CD O	CD CD	CD X	CD <	2 X	CD <	< X	ri
U Φ	υ o.	o c	cd c	CD r-l	CD 3	cd σι	CD 3	CD 0	A A	ra·
A r—ł	< tn	2 r-l	2 r-t	A O	ηζ .—l	CD A	A Φ	CD A	CD X	<Z
i I-I	o <	υ o	O O	CD >	CD CD	CD <	CD X	CD CL	< A	ni
A (0	O tn	<c tn	CD A	CD tn	< (0	CD tO	A <0	CD cn	CD A	rt
cd .-i	2 >t	2 >	υ x	2 Dt	CD ,—i	CD r-t	CD r-t		nt Dt
cd <	< X	2 X	< A	2 X	CD <	CD <	CD <	2 X	A A	<
rt A	O r-l	*3«	O r-l	υ to	cd σ>	cd σ,	CD 3	CD tO	CD 3	-i
υ x	A Φ	CD r-t	A <0	CD r-t	CD A	CD A	ri r-l	CD r-t	< -<	<
<C A*	U >	CD O	O >	CD 2	CD <	CD <	CD CD	CD nt	CD CD	CD
Ο tn	< CO	O 3	A O	CD tn	CD 3	CD CL	A 3	cd tn	CD 3	CD
2 >	CD A	A Φ	cd a	<5 Dt	A Φ	< tn	A Φ	ni >,	C —-1	CD
2 X	υ 2	A X	O cc	2 X	CD X	CD <	CD X	2 x	CD CD	A
<£ tn	A Q<	O <0	u Dt	CD r-l	CD 0	cd σι	CD CP	CD 3	CD 3	CD
2 >	< tn	CD r—1	O r-t	A <0	CD A	CD A	CD A	<C r-t	A Φ	<
2 X	CD <	O 2	o o	CD >	CD Cl,	CD <	CD -i	CD CD	CD X	<
CD 4-1	o α	υ a	U 3	CD 3	CD 3	O 4->	CD Φ	CD A	A tO
Αι Φ	O A	O Φ	A Φ	r-l	<C r—l	A Φ	CD r-t	CD Φ	CD —Ί	CD
2	A A	A to	O X	CD CD	CD CD	< 2	CD -i	ri CO	CD <	CD
2	< o	o >,	o c	CD 3	CD r-i	CD 3	CD <0	CD 3	CD A	A
	U A	O r-l	2 '—1	ri ,—1	A io		CD r-t	A Φ	CD Φ	A
<	α o.	CD CD	o u	CD CD	CD >	CD CD	CD <	CD X	< CO	A
2	CD A	*3 ³	2 3	CD 3	CD tn	CD 3	CD 3	CD A	CD 3	CD
2 o	O Φ	2 r-l	2 r-t	A Φ	< >	i—i	A Φ	CD X	A Φ	CD
< co	O O	o o	U X	<2 x	CD CD	A X	ri A	CD X
o	o c	A Φ	o cn	A CL	CD C	CD >,	CD tni	CD A	CD Φ	2
o	2 r-l	A X	O A	2 tn	r—t	CD r-l	CD	CD Φ	A X	2
o	υ o	A Cl,	o <	CD 2	U CD	CD CD	A ćdI	ri CZ)	A tA	A
o	o o	O C	CD 3	CD tn	cd σι	CD 3	CD C	CD 3	CD A	<
<	υ a	ri r-l	A Φ	2 Dt	CD A	A Φ	ri «—1	A Φ	CD Φ	rt
o	O CL	υ o	O X	<2 x	CD <	CD X	CD CD	CD X	< to	CD
o	2 0	CD A	CD tn	CD A	CD A	< O	cd σ	A <n	CD r-l	rt
	O A	υ φ	2 Dt	CD Φ	ii	CD A	CD A	nt -rt	A tO	O
2	U CL,	A to	-i X	2 Ui	CD CL	CD <C	CD X	CD >	A
A	o 3	O r-l	U A	CD J->	CD 3	CD A	CD 3	CD 3	cd tn	u
<	< r-l	A <0	O Φ	A Φ	A Φ	CD Φ	A Φ	*i i—i	CD Dt	CD
CD	o o	o >	< ω	2 X	CD X	< CO	CD X	CD CD	nt X	A
A	υ o.	A A	O Φ	CD 3	CD 3	CD 3	CD 3	CD A	CD Φ	CD
<	< tn r-\|		A X	<C i—1	< r-l	A Φ	*i ,—1	CD X	A X	, CD
CD	O < Ί-	A Cc	CD CD	CD CD	CD X	CD CD	< A	A X	' CD
O	ο io	O o,	O A	CD 3	CD u	CD tn	CD CL	CD 10	CD A'	CD
A	O r-l r—1	< tn	O X	2 r-l	A Φ		ri tn	CD r—l	CD Φ	CD
A	O 2 '	O 2	2 A	CD CD	< S	»2 x	CD «i	CD <	nt U~i	A
A	υ c	2 cn	CD A	CD σ	CD 3	CD 3	CD A	CD w	CD 3
A	rt tn	O A	Ο Φ	CD A	«—ι	ni r-t	CD Φ	•i >,	< r-t	CD
<	2 2	-t <c	A co	2 2	CD CD	CD CD	nt co	2 x	CD CD	CD
A	O Φ	υ >	O A	CD 3	CD 3	nC C	CD A	CD <0	CD 3	U
O	U H	O r-I	O X	A Φ	r-l	raj r-l	ri >,	CD r-t	A Φ	U
CD	O 2	o o	2 A	U X	CD CD	CD CD	A A	CD nt	CD X	CD
CD	2 r-t	O A	O r-t	O Dt	CD C	CD 3	CD O	CD tn	CD r-l	O
O	A Φ	O Φ	A (0	CD r-l	<£ r—l	A Φ	CD A	<i -Η	A O.	CD
A	o >	< CO	o >	CD CD	CD CD	CD X	CD CL	CD X	CD >	CD
<	O A	o o,	O A	CD 3	cd α	CD 3	CD <0	CD A	CD 0	CD
CD	U X	< tn	O Φ	ri r-t	CD A	nC <—i	CD r-l	< >1	CD a	CD
<	2 A	CD <	2 ω	CD CD	A A	CD CD	CD <	A A	CD CL	CD
O	A to	<C tn	u α	< A	CD tn	CD ω	CD 3	CD 3	CD 3	CD
A	O ,—1	2 >,	< tn	O X	< >y	ni H	A Φ	< r-\|	A Φ	CD
A	cd <	2 X	o <	2 A	< X	CD I	CD X	CD CD	CD X	O
<	U Φ	υ 3	o a	CD 3	CD tn	CD 3	A tn	CD <0	CD 3	O
<	A X	A Φ	CD A	2 ,—1	< >r	A Φ	<i -r\|	CD r-t	A a¹	CD
A	A CL,	o X	A A	CD CD	< X	CD X	CD X	CD <	O X	CD
O	A >,	CD r—1	o c	CD tn	CD C	CD tn	CD A	CD 3	CD >,	CD
O	CD r-i	A io	2 tn	2 Dt	C ,—i	ni >	CD X	A Φ	CD -i	CD
CD	CD CD	O >	2 2	2 X	CD CD	2 x	< A	α x	CD CD	CD
O	A <0	A CL	u α	*i	CD Φ	CD C	CD Oi	< οι-	< 3	<
o	CD r-1	< w	2 tn	<1, r—ł	A X	ni »—¹	CD A	cd A	< —i	CD
o	O <	O <	o 2	CD CD	E-, CL	CD CD	CD >i	•i -a.	CD CD	A
o	O 3	O r-l	A 3	CD 3	CD ii,	CD Cn	CD 3	CD to	CD σ>	CD	c
o	A Φ	A i0	A Φ	A Φ	< W	CD A	A Φ	CD r-t	CD A	<i	·—<
o υ cd	U X	O >	O X	U X	CD <	CD	υ x	CD <	CD ni	CD CD

AAA.AAAAĄAACTGGATCCGTCGACC fGCAGCCAAGCTΓ

Translated Mol. Weight of Apo AI-M = 28025.33 +1 = N-terminal amino acid of Apo AI-M

Translowana Masa Cząsteczkowa Apo AI-M = 28025.33 + 1 = N-końcowy aminokwas Apo AI-M

Fig. 3

175 955

Segment Not I - Hind III pKP 764 i domniemana sekwencja aminokwasowa Apo AI-M The DNA segment Not I - Hind III of pKP764 and deduced amino acid seguence of Apo AI-M.

2 «5	U k	U 3
U x O 2	££	E- (U U X
u χ	p —1	U OT
E- (0	E- (0	2 >
O >	O >	2 J
2 <0	E- ki	2 3
O X	U JZ	E- <U
o 2	2 Ε-	u X
E- (U	υ <0	u c
E- x	U X	f£ OT
2 w	O <	2 2
O <0	U O	2 3
O x	Ε- <u	E- tu
O <	U X	U X
u tu	u a	o c
Ε- X	2 «0	2 x
2 x	u 2	u o
E- <0	U OT	2 tn
O x	2 >	2 >,
O 2	2 x	2 χ
2 kl	o -i	2 >,
U p.	Ε- <0	O X
< E-	O >	u o
O ot	2 a	U 3
2 >	U ki	Ε- Q)
2 X	U <	E- X
<=c ot	E- a	U <0
2 >	2 OT	U x
2 X	o <	o 2
U xj	o a	U Ε-
Ε- tU	U ki	υ <U
2 2	E- E-	E- cn
ri.	2 o	u >.
rif	U ki	οχ
«tf	u a	u u
ri.	U ki	2 3
ri.	o tu	ri; X
U	2 tn	U O
U	o c	e- <u
U	itf <—1	ε- χ:
u	u u	E- a
u	u o	o c
2	U ki	2 X
o	u a	u u
u	< o	U kl
2	U k	u <u
-i	u a	E- cn
E-	u 3	O x
2	2 —-1	E- <o
U	u u	U >
E-	u a	E- k
<	2 OT X	££
U	U 2 +
U	U <0	u a
E-	U ^r—	2 OT
E-	U 2 '	O 2
E-	u c	2 a
E-	2 ot	O ki
2	2 2	2 2
E-	U (0	U >1
U	U x	u χ
u	U 2	u u
o	2.—i	U k
o	E- io	u tu
e-	U >	2 cn
2	U ki	u a
o	U X	2 OT
<	2 E-	O 2
u	E- <0	rij OT
E-	U x	2 >
E-	u 2	2 x
2	U 0)	P 3
2	E- X	t- <u
Ε-	E— a	U X
υ	E- >,	u x
U	U x	E- <0
U	U U	o >
U	A io	E- a
O	U x	<ζ cn
U	u 2	U 2
U	u 3	U X
u	Ε- tu	E- «3
u	U u	U >
u
u

U c	u a	U to	U to
2 OT	*£ OT	u —-	u --
2 2	U <	U 2	U 2
e- a	U 3	U >,	u a
2 OT	E- tu	U Ή	2 w
U 2	U J	U U	U 2
o a	U kl	U 3	U -1
O k	< >,	2	E- <0
E- Ε-	E- ¢-	U U	u >
υ tu	u o	2 C	E- OT
E- X	U k	2 «-t	2 **—
E— a	u a	U U	U X
O 3	u c	U 3	o to
2 X	< ——	Ε- Φ	υ-t
O U	u o	U U	U 2
o c	U -t	U 3	u a
2 .X	E- <0	2 ——	U k
u. u	U >	U U	U 2
u k	U OT	2 <0	U to
u x		u ·--	U r-
< tr	2 j	U 2	U 2
O x	U <0	u a	u a
E- <0	U -t	U k	U k
p >	U 2	U 2	U 2
E- 0	U OT	U 3	u a
U k	2 >	E- (U	2 OT
u a	2 j	O J	U 2
U >1	U -t	U O	u a
u χ	E- <0	U ki	U k
o u	U >	u a	U 2
O 3	U 3	U 3	U k)
E- tu	< <-t	2 ——	E- (U
U X	U U	O U	2 2
o c	U 3	u-f	U 3
«tf ——	ri; «—i	E- (0	2 «Η
U U	u u	U >	u u
2 3	U 3	U OT	U 3
ri; ——	E- tu	2 >,	2 ——
U O	U J	2 j	u u
u a	E- a	u c	u >,
O kl	2 OT	2 --	U -t
u 2	u <	O u	u u
O 3	U ω	u a	U 3
E- tu	2 >	U k	E- tu
U u	2 j	U 2	U J
U OT	U k.	U kl	2 O
2 >	u <u		U k
2 u	ri; tn	E- H	u a
U kl	U XJ	U 3	U k
o tu	E- tu	E- tu	u <u
2 cn	2 2	u u	2 cn
u <u	U 3	U 3	U 3
e- x	2 ·—i	2 ¹—i	E- <u
E— a	U u	U u	u X
U k	u c	u XJ	U OT
U X	2 '—t	Ε- <U	2 >,
< Ε-	U u	2 2	2 χ
υ ki	u a	U 3	U 3
u tu	U ki	< ·—1	2 *—i
E- cn	2 2	U U	U u
U ki	U 3	U 3	2 C
u sz	E- tu	2 ·—t	2 x
< Ε-	U J	U U	U U
υ -1	u >,	u c	U 3
Ε- (0	U -t	2	E- <U
U >	u o	U U	U X
U kt	U 3	u a	U 3
u tu	2 *—i	U k	2 *—i
< cn	U U	Ε- Ε-	U U
u a	2 k	υ OT	U OT
*t w	U X		2 Ή
U <	2 Ε-	2 u	U X
u a	υ 3	U OT	U 3
U ki	2	2 >,	E- <U
E- Ε-	U U	2 u	U X
υ C	U Ot	U C	U OT
<c w	2 >,	κζ .—1
2 <	2 u	u u	2 χ
u a	2 3	u tu	u c
< OT	2 —i	Ε- X	«—-ł
U <	u u	E- a	u u
E- 3	U 3	u a	u a
E- <U	E- <U	2 OT	U k
U J	U u	U 2	U 2

u >,	U 3	U k
U χ	E- tu	U X
u u	U X	2 Ε-
u >,	u a	υ C
u χ	2 OT	2 tn
u u	U 2	2 2
u c	U 3	U 3
2 OT	«—(	E- tU
2 2	u u	U X
U 3	U 3	U tn
2 x	E- tu	2 >-
U U	U X	2 χ
U OT	u <0	U OT
	u χ	2 >
2 x	U 2	2 χ
U 3	u o	E- k
E- <U	U k	U X
U X	u a	2 Ε-
E- <0	U OT	υ k
U X	2 >
U 2	2 X
U 3	U <3	O 3
2 x	U X	< «—1
u u	U 2	U U
E- 3	U OT	O 3
Ε- tU	2 >>	2 x
U X	2 χ	U O
u a	U 3	U 3
U k	2 x	E- tU
U 2	U u	U X
U <0	U k	E- <o
U X	u tu	U χ
U 2	2 cn	U 2
u <0	U 3	U k
U χ	E- tU	O <U
U 2	U X	2 cn
U 3	U k	O 3
E- tu	U X	E- tu
Ε- X	2 Ε-	U X
u «i	υ k	U tu
u d	U tu	Ε- X
E- ul	2 cn	E- a
u c	U 3	U k
2 x	E- tU	O tu
U u	U X	2 cn
u a	E- OT	U X
U k	2 x	E- <0
U 2	U X	u >
U 3	U 3	O OT
Ε- <U	—4	o >,
U X	U u	2 X
U 3	U k	u tu
2 *—i	U X	Ε- X
U u	2 Ε-	E- a
u a	υ <0	U k
2 OT	U x	o tu
U 2	U 2	2 tn
U k	U OT	U 3
U <U	2 >	ri;.—i
2 tn	2 X	o u
U k	u <o	U 3
2 >,	u χ	E- tu
E- f-	U 2	U X
U O	U tn	U χ	E-
U k	2 x	E- <o	E-
U a	U X	U >	u
U <0	U k	u o	u
U X	££ c- t	U k	2
U 2	u a	2
U 3	U 3	U 3	U
E- tu	2 *—i	E- tu	U
U X	U U	U X	E-
E- OT	u <0	U 3	2
2 ·—	U X	E- tu	U
U X	U 2	U X	U
U k	U 3	U >.	2
U X	E- tu	U X	2
2 Ε-	U χ	U U	E-
υ a	2 a	^c	2
U k	U k	2 χ	ri
U 2	2 2	u u	Ε-
U 3	u <0	u a	υ C
E- <U	U X	O k	2 x
U X	U 2	U 2	U u

Translowana Masa Cząsteczkowa Apo AI-M = 28025.33 + 1 = N-kortcowy aminokwas Apo AI-M

Fig. 4

175 955

Fig. 5

Mlul

Fig. 6

175 955

Fig. 7

Fig. 8

Fig. 9

E C	£
O	c
O
VO	o
	o
	CO
N
Ul CL	cc
co
c	>1
N
O	w
>,	c
+->	Φ
CL O	TJ
Ό XD O	“5
+->
cn	a.
dP	O
CJ3

c	ε
o	c
o
NO	o
>>	o
N	<o
U
CL
	co
ro
c	>s
N	O·*
O >>	CO
-R	c
CL	Φ
O	T3
Ό
xn	CC
o	o
-R
cn	O.
CLP CD	O

e c

α o

NO >%

N

CL ω

c

N

O

-R

CL

O

Ό \n o

-R cn qp co

Time (h)

E c

o o

(D (0 >* cn c

φ

Ό

CC υ

·*-»

CL

O

(czas) m

I <

o

a.

<

cn

S

I <

o

o.

<

cn <

o

o.

<

175 955

Fig. 10

Fig. 11

Fig. 12 c E o ^c o

KO O

O >s CO N (U — Ch CO

CO

C

N — U «

C +? ® 8-·° ’δ “ ω 5 ar O CD

E

C

O £ O C \0 >.§ N <o C-C _ « co

IKI >» U — >> ca +? ^cQ_ a, o -a Ό

W 5

5 ω ~ ar o. o o

(czas)

ε c

o £ a c \O >KO N_OCL _

Ό °ś +-> Ξ tn — aj’ cico o

(czas) cn <

o

o.

<

Apo AI-M (g/l) Apo AI-M (g/l)

175 955

Fig. 13

Fig. 14

E c

° c o ^cMD :xg

N«,

a._ ro ¹⁰c

N >> O ~ >> OT +? ^c

9- «

Ό χη ° 2 ·+» .2 (n «OH O.

o o o ε

O c MD >-g

N <o CL — _m ro ro n >o — >. OT +» C

CL

O o

XI

Ό _ Χ0 ca o O +-> ·— ro F oh yCJD O

(czas)

Apo A1-M (g/l) Apo AI-M (g/l)

175 955

(δθρω) Q0

175 955

Fig. 7

Eco RI Bbs I Nco I ' -AATTCAGAAGACACCGCGGACGAGCCACCGCAGAGCC -3 ' 3'- GTCTTCTGTGGCGCCTGCTCGGTGGCGTCTCGGGTAC- 5'

AsnSerGluAspThrAlaAspGluProProGlnSerPro -1 +1

Fig. 2

Dra ΙΙΙΔ Hind III 5‘- GTAATAAGGATCCA -3’ 3'-GGTCATTATTCCTACCTTCGA-5’

GlnEndEnd

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wektor ekspresyjny dający zewnątrzkomórkową produkcję apolipoproteiny AI-M (Milano) przy użyciu E. coli, znamienny tym, że obejmuje plazmid posiadający początek replikacji, indukowalną sekwencję promotorową, sekwencję DNA kodującą peptyd sygnałowy, sekwencję DNA kodującą apolipoproteinę AI-M i terminator transkrypcji.
2. Wektor ekspresyjny według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja DNA kodująca apolipoproteinę AI-M jest sekwencją kodującą dojrzałe białko.
3. Wektor ekspresyjny według zastrz. 1, znamienny tym, że indukowalny promotor jest promotorem trc lub jego funkcjonalną pochodną.
4. Wektor ekspresyjny według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja sygnałowa jest pochodną sekwencji sygnałowej ompA.
5. Szczep E. coli transformowany wektorem ekspresyjnym według zastrz. 1.
6. Sposób produkcji apolipoproteiny AI-M (Milano), znamienny tym, że obejmuje etapy:

-hodowania transformowanego szczepuE. coli, według zastrz. 5 w pożywce hodowlanej'

-indukowania ekspresji białka apolipoproteiny AI-M w logarytmicznej fazie wzrostu zanim osiągnięty zostanie stan stacjonarny i

-oddzielenia produktu od pożywki hodowlanej.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że hodowlę rozpoczyna się w niskiej temperaturze, a podwyższa się temperaturę w logarytmicznej fazie wzrostu przed, równocześnie lub po indukcji.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że hodowlę rozpoczyna się w temperaturze od około 29°C do około 31°C, najkorzystniej 30°C, i że temperaturę podwyższa się w logarytmicznej fazie wzrostu do około 37°C.
9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w stałej temperaturze, najkorzystniej pomiędzy około 25°C a 37°C.
10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że indukcję wykonuje się gdy pożywka hodowlana osiągnie gęstość optyczną przynajmniej 50.
11. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że pozyskiwanie wykonuje się w optymalnej fazie hodowli komórkowej.
12. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą ekstrakt drożdżowy, ewentualnie wzbogacony tryptonem.
13. Sposób według zastrz. 6 albo 12, znamienny tym, że stosuje się pożywkę produkcyjną nie zawierającą antybiotyków.