WO2007080847A1 - 受容体特異性を変化させたミュータント増殖因子およびそれを含有する医薬組成物 - Google Patents

受容体特異性を変化させたミュータント増殖因子およびそれを含有する医薬組成物 Download PDF

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protein
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mutant
growth factor
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Toru Imamura
Nozomi Tsujino
Masashi Suzuki
Masahiro Asada
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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Definitions

  • the present invention relates to mutant growth with altered receptor specificity obtained by deleting an appropriate number of N-terminal amino acids of the fibroblast growth factor 18 (FGF18) protein.
  • the present invention relates to a factor protein and a pharmaceutical composition containing the protein as an active ingredient.
  • FGF fibroblast growth factor
  • FGF18 controls the formation and growth of bone and cartilage (Non-patent Documents 1 and 2). It has also been reported that FGF18 promotes hair growth by inducing the hair follicle growth phase (Non-patent Document 3).
  • the physiological activities of FGF18 including these, are exerted due to the binding and reaction of FGF18 and which FGF receptor. If the receptor specificity of naturally secreted FGF18 can be manipulated, there is a possibility that a factor that specifically shows each activity or a factor that controls the activity will be realized from the various activities of FGF18. There is no such power yet discovered.
  • Naturally secreted FGF18 is thought to react with FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, and FGFR4
  • Non-Patent Document 1 Ohbayashi N, Shibayama M, Kurotaki Y, Imanishi M, Fujimori T, Itoh N, Takada S. FGF 18 is required for normal cell proliferation and differentiation durin g osteogenesis and chondrogenesis. Genes Dev. 2002, 16 (7): 870-9
  • Non-Patent Document 2 Moore EE, Bendele AM, Thompson DL, Littau A, Waggie KS, Reardo n B, Ellsworth JL. Fibroblast growth factor— 18 stimulates chondrogenesis and cartila ge repair in a rat model of injury-induced osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage .20 05, 13 (7): 623-31
  • Non-Patent Document 3 Kawano M, Komi-Kuramochi A, Asada M, Suzuki M, Oki J, Jiang J, I mamura T. Comprehensive analysis of FGF and FGFR expression in skin: FGF18 is highly expressed in hair follicles and capable of inducing anagen from telogen stage h air follicles. J Invest Dermatol. 2005, 124 (5): 877— 885
  • FGF18 is considered to react with at least four of the seven FGF receptor subclasses (FGFRlc, FGFRlb, FGFR2c, FGFR2b, FGFR3c, FGFR3b, FGFR4), that is, FGFRlc ⁇ FGFR2c, FGFR3c, and FGFR4. Therefore, FGF18 activity is expressed differently depending on the type and amount of receptor expressed by the target cell and the nature of the target cell, and a wide range of life such as bone and cartilage formation and growth, lung formation and hair growth. It works to control the phenomenon. Therefore, when trying to selectively control any of these biological phenomena, it is useful to realize a protein that has only the desired receptor specificity and not the unwanted receptor specificity. it is conceivable that.
  • An object of the present invention is to provide a mutant protein of FGF18 having a receptor specificity different from the reaction specificity of the naturally secreted FGF18 to the receptor.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a pharmaceutical composition comprising the protein according to any one of (1) to (4).
  • a method for producing a mutant protein having altered fibroblast growth factor receptor specificity comprising deleting one or more amino acids from the N-terminus of natural secreted fibroblast growth factor 18 .
  • a mutant protein of FGF18 having a receptor specificity different from the reaction specificity of the naturally secreted FGF18 receptor is provided.
  • a pharmaceutical composition effective for positively or negatively controlling the physiological activity of FGF18 can be provided. Specifically, it has an activity similar to the hair growth or hair growth regulating activity of FGF18, which is a part of the hair production mechanism, or a specific inhibitory activity thereof, and has no other undesirable physiological activity of FGF18.
  • a pharmaceutical composition effective in regulating hair growth or hair growth can be provided. It also has the same activity as FGF18 for promoting bone formation or inhibiting chondrogenesis, or its specific inhibitory activity, and it has no other desired and physiological activity of FGF18, and is effective in regulating bone formation or cartilage formation.
  • a pharmaceutical composition can be provided.
  • a pharmaceutical composition effective for suppressing neuronal cell death, controlling expression of other FGF factor groups, and the like a composition effective for various regenerative medicine, and the like.
  • novel FGF18 mutant growth factor protein of the present invention has a receptor specificity different from the reaction specificity of the naturally secreted FGF18 for the receptor. Thereby, the physiological activity of FGF18 can be controlled positively or negatively.
  • FIG. 1 schematically shows the structure of a mutant FGF18 protein analyzed in this example.
  • FIG. 2 Western blotting of mutant FGF18 protein expressed and purified in an E. coli expression system.
  • FIG. 3 shows the heparinity of mutant FGF18 protein.
  • FIG. 4 Growth-promoting activity of mutant FGF18 protein on FGFR4-expressing cells
  • FIG. 5 shows the growth promoting activity of mutant FGF18 protein on FGFRlc-expressing cells.
  • FIG. 6 shows the proliferation promoting activity of mutant FGF18 protein on FGFR2b-expressing cells.
  • FIG. 7 shows the growth-promoting activity of mutant FGF18 protein on NIH3T3 cells having an endogenous FGF receptor.
  • the mutant growth factor protein of the present invention is a protein obtained by shortening the N-terminus of the FGF18 protein by an appropriate length.
  • FGF18 protein The ability of FGF18 protein to be synthesized as a 207 amino acid polypeptide in the cytoplasm of production cells in humans and mice, the N-terminal signal peptide is cleaved when it is secreted extracellularly.
  • a secretory FG F18 consisting of 182 amino acids in which methionine for translation initiation is added to the full-length amino terminal as a secretory consisting of 181 amino acids is referred to as a naturally secreted FG F18 (for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 A protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12).
  • the amino terminal force excluding the methionine is a mutant lacking 4 amino acids, 12 amino acids, 16 amino acids, 18 amino acids, 22 amino acids, 37 amino acids, 48 amino acids, 67 amino acids, 77 amino acids, 95 amino acids. It demonstrates that the protein is an active mutant growth factor protein with altered receptor specificity. Although there is a theory that a polypeptide starting from the third amino acid of SEQ ID NO: 1 is a naturally secreted secretion, there is no difference in activity due to the addition of the second amino acid of SEQ ID NO: 1.
  • the mutant growth factor protein of the present invention is substantially a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2 to 11 in humans, and an amino acid sequence of substantially SEQ ID NOs: 13 to 22 in mice.
  • the former is encoded by the DNA sequences shown in SEQ ID NOs: 24-33 and the latter are shown in SEQ ID NOs: 35-44, respectively.
  • “substantially” may include addition, deletion, substitution, and modification in a part of the amino acid sequence as long as the function is exhibited.
  • the mutant growth factor protein of the present invention includes a mutant growth factor protein substantially having a deletion within 22 amino acids from the amino terminus of the protein described in SEQ ID NOs: 1 and 13.
  • the mutant growth factor protein of the present invention is a signal required at its amino terminal when the cDNA described in the sequence listing is secreted by animal cells. It includes a protein with a peptide sequence added for secretion called a peptide. It also contains a protein with a methionine added to initiate translation in order to produce a signal peptide-free form in E. coli. In addition, it includes proteins with a tag for detection and purification added to the N-terminus or C-terminus, and those with modifications that do not affect function. Examples of tags for detection and purification include FLAG-His tag, His tag, FLAG tag, c-Myc tag, HA tag, V5 tag, GFP tag, and combinations thereof. Modifications that do not affect function include methylation of N-terminal amino acids, addition of sugar chains, and phosphorylation, which can occur naturally in production systems, but have already been applied to other proteins such as polyethylene glycol Technology to be established
  • mutant growth factor protein contained as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention in a recombinant form or in other forms does not change its usefulness even if it is produced in these forms.
  • RNA extracted from animal tissue is reverse transcribed using a random hex oligonucleotide as a primer, and this is amplified by a PCR reaction.
  • a PCR reaction if an oligonucleotide capable of amplifying the open reading frame of FG F18 is used as a primer, a DNA fragment having a size corresponding to a known FGF18 protein is generated. This is separated by gel electrophoresis, cut out from the gel cage, and incorporated into a cloning site of a cloning vector to obtain a plasmid.
  • PCR reaction was performed using various oligonucleotides designed to encode a naturally occurring FGF18 and a protein lacking its N-terminus as primers. And each protein A DNA fragment of a size corresponding to the quality is produced. This is separated by gel electrophoresis, cut out by gel force, and incorporated into a multicloning site of a cloning vector to obtain a plasmid.
  • the number of N-terminal deleted amino acids can be freely determined.
  • sequences encoding amino acid substitutions, additions and deletions can be included in the oligonucleotide sequence.
  • Any plasmid that incorporates DNA can be used as long as it can be replicated and maintained in the host.
  • Examples of the method for incorporation into a plasmid include the method described in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 239 (1982).
  • the cloned gene can be ligated downstream of a promoter in a vector suitable for expression to obtain an expression vector.
  • plasmids derived from E. coli PBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pET-3
  • plasmids derived from Bacillus subtilis pUB 110, pTP5, pC194
  • plasmids derived from yeast pSH19, pSH15
  • Plasmids, or derivatives of butteriophage such as ⁇ phage and animal viruses such as retroviruses, vaccinia viruses, or insect viruses.
  • the gene may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at its 3' end.
  • the DNA sequence encoding the tag sequence may be linked to the 3 ′ end without having a translation termination codon.
  • a promoter is connected upstream thereof.
  • the promoter used in the present invention may be any suitable promoter according to the host used for gene expression! /! /.
  • the host to be transformed is E. coli, trp promoter, lac promoter, rec A promoter, ⁇ PL promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc.
  • the host is Bacillus subtilis, the SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter motor and the like are preferable.
  • the host is yeast, the PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • examples include SV40-derived promoters and retrovirus promoters.
  • a tag sequence can be obtained by synthesizing a known sequence information nucleotide.
  • hosts include Escherichia coli [for example, BL21, BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3) pLysE], Bacillus subtilis (for example, Bacillus subtilis DB105), yeast (for example, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae)
  • vertebrate cells for example, COS cells, CHO cells, BHK cells, NIH3T3 cells, BALB / c3T3 cells, HUVE cells, LEII cells
  • insect cells for example, COS cells, CHO cells, BHK cells, NIH3T3 cells, BALB / c3T3 cells, HUVE cells, LEII cells
  • a vector containing recombinant DNA is introduced into a recombinant cell prepared by the calcium method or other methods by the temperature shock method or by the electopore position method.
  • a recombinant vector prepared by a lithium method or other method is introduced into the vector containing the DNA by the temperature shock method or the electopore position method.
  • the host is an animal cell, a vector containing recombinant DNA is introduced into cells in the growth phase or the like by the calcium phosphate method, the lipofusion method, or the electoral position method.
  • the medium used for culturing is generally used according to each host, and the medium used is V. Or, if it is not general, it can be applied. For example, if the host is E. coli, use LB medium. If the host is yeast, use YPD medium. If the host is an animal cell, move to Dulbecco's MEM. Use a product that contains serum. Cultivation is performed under conditions generally used for each host. Moreover, it is sufficient if the condition is applicable even if it is not general. As an example
  • the host is Escherichia coli, it is carried out at about 30 to 37 ° C for about 3 to 24 hours. If the host is yeast, it is carried out at about 25 to 37 ° C for about 12 hours to 2 weeks, and if necessary, aeration and agitation can be controlled. If the host is an animal cell, it is carried out at about 32 to 37 ° C under conditions of 5% C02 and 100% humidity for about 24 hours to 2 weeks. If necessary, the gas phase conditions can be changed or agitation can be added.
  • the mutant growth factor protein is extracted from cultured cells or cell force, the cells or cells are destroyed by homogenizer, French press, ultrasound, lysozyme and Z, or freeze-thaw after culturing.
  • the target protein is eluted out of the microbial cells, and the protein is also obtained with a soluble fraction.
  • the target protein is contained in the insoluble fraction, after disrupting the cells or cells, the insoluble fraction is recovered by centrifugation and then made soluble with a buffer solution containing guanidine hydrochloride, etc. Can be used.
  • the supernatant fluid strength mutant growth factor protein can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography. Graphics, isoelectric focusing, etc. can be used.
  • the affinity mouth-matography method using heparin sepharose as a carrier can be applied.
  • the tag when the tag is added for purification, the tag can be appropriately combined with known separation / purification methods.
  • the sample thus obtained can be dialyzed and freeze-dried to obtain a dry powder as long as the activity of the mutant growth factor protein is not impaired. Furthermore, storing serum albumin or the like as a carrier is effective for preventing adsorption of the preparation to the container. [0048]
  • the coexistence of a trace amount of a reducing agent in the purification process or storage process is suitable for preventing oxidation of the sample. J8-mercaptoethanol, dithiothreitol as reducing agent
  • mutant growth factor proteins of the present invention some of the FGF receptors have an action of activating FGFR4.
  • mutant growth factor proteins of the present invention some of the FGF receptors have an action of activating FGFR2b.
  • some of the FGF receptors have an action of weakly activating FGFR2b.
  • the mutant growth factor protein of the present invention has an action of exerting or regulating at least a part of the physiological function of FGF18.
  • the physiological function of FGF18 specifically refers to an action that regulates the mechanism of hair production, specifically an action that promotes or suppresses hair growth such as hair, and an action that promotes or inhibits hair growth. Can be mentioned.
  • FGF18 The physiological function of FGF18 is to regulate the formation and growth mechanism of bone and cartilage.
  • mutant growth factor protein of the present invention may have an effect of regulating other physiological functions of FGF18.
  • FGF18 Other physiological functions include regulating lung formation, and promoting or suppressing the proliferation and differentiation of fibroblasts, blood vessel endothelial cells, myoblasts, neurons, and glial cells. In addition, the function of these cells can be regulated and cell death can be suppressed.
  • the mutant growth factor protein of the present invention can regulate cell function by reacting with the fibroblast growth factor receptor fourth gene product.
  • the fibroblast growth factor receptor 4 gene product may have various modifications such as various splicing and post-translational sugar chains when mature mRNA is generated.
  • the mutant growth factor protein obtained as described above uses a pharmaceutically acceptable solvent, excipient, carrier, adjuvant, and the like, and in accordance with a conventional method for producing a pharmaceutical preparation, Pharmaceutical compositions such as pills, aerosols, injections, powders, granules, tablets, suppositories, enteric solvents and capsules.
  • content of an active ingredient mutant growth factor protein may be 0.000 0,000,001 to 1.0 weight 0/0 approximately.
  • the pharmaceutical composition includes a hair growth agent, a hair growth agent, an osteogenesis promoter, a cartilage formation inhibitor, a cranial nervous system nutrient 'function control agent, a learning effect regulator, and others such as humans, mice, rats, It can be safely administered parenterally or orally to mammals such as rabbits, dogs and cats.
  • the dosage of this pharmaceutical composition can be appropriately changed depending on the dosage form, administration route, symptoms, etc.For example, when administered to mammals including humans, 0.001 to 1000 mg of the mutant growth factor protein is applied to the affected area per day. It is exemplified that it is applied several times.
  • CDNA encoding mouse mutant FGF18 protein can be obtained as follows.
  • RNA was extracted therefrom. 120 mg of random hexanucleotide DNA (GIBCO BRL, Tokyo, Japan) is added to 1 microgram of this mouse RNA, and a cDNA mixture is obtained with 200 unit M-HLV reverse transcriptase (GIBCO BRL, Tokyo, Japan).
  • cDNA encoding the full length mouse FGF18 is amplified from the above cDNA mixture by PCR reaction.
  • the primer sequences used in the PCR reaction are as follows.
  • Anti-sense primer 5,-CTAGCCGGGGTGAGTGGGGCGGATCCGCCGGGAT-3 '(SEQ ID NO: 52)
  • FLAG-His tag a tag consisting of three consecutive FLAG tag sequences and a His tag sequence (hereinafter referred to as FLAG-His tag)
  • # 468 5, -CAG CCG CTC GAG A-3 , (SEQ ID NO: 53)
  • # 469 5 '-TGC GGG CCC TCA A-3' (SEQ ID NO: 54)
  • # 466 5,-CCG CTC GAG ACT ACA AAG ACC ATG
  • # 46 7 5,-TGC GGG CCC TCA ATG GTG ATG GTG ATG ATG ACC CTT GTC ATC GTC ATC CTT GTA GTC GA -PCR was performed in the presence of the megaprimer (3, SEQ ID NO: 56).
  • the reaction product was digested with Xho I and Apa I and cloned into pre-digested pcDNA3.1 (+) (Invitrogen Corporation), resulting in the plasmid FLAG-His / pcDNA3.1 (+) .
  • Primer with homologous sequence at the 5 'end of FGF18 ORF has EcoRV recognition sequence and Sail recognition sequence at primer with homologous sequence at 3' end, and FGF18 ORF is used as a cage, amplified by PCR, EcoRV and Sail And inserted into FLAG-His / pcDNA3.1 (+) previously digested with EcoRV and Xhol to prepare cDNA encoding FGF18 protein with FLAG-His tag.
  • the nucleotide sequence of the generated cDNA was confirmed, it was a sequence that completely contained the sequence except ATG at the beginning of the sequence shown in SEQ ID NO: 34.
  • cDNAs of naturally occurring FGF18 shown in SEQ ID NO: 34 and various mutant FGF18 shown in SEQ ID NOs: 35 to 44 were prepared by PCR reaction and cloned into vectors. The sequence was confirmed.
  • the primer sequences used in the PCR reaction are as follows.
  • the cDNA sequences of SEQ ID NOs: 34 to 44 are labeled with a translation termination codon tag. In the actual construct, this tag is missing because the tag sequence follows the FGF18 sequence (C-end).
  • the cDNA encoding the human mutant FGF18 protein can be easily obtained basically in the same manner as the mouse mutant FG F18 protein.
  • human RNA for example, Clonetech Catalog number 64020-1 Human Brain Whole RNA is used. 120 ng random hexanucleotide DNA is added to 1 microgram of this human RNA, and a cDNA mixture is obtained with 200 unit M-HLV reverse transcriptase.
  • cDNA encoding the full length of human FGF18 is amplified from the cDNA mixture by PCR reaction.
  • the generated cDNA was cloned into a pBlueScript vector, and its nucleotide sequence was confirmed. As a result, the sequence completely contained the sequence except ATG at the beginning of the sequence shown in SEQ ID NO: 23.
  • the primer sequences used in the PCR reaction are as follows. [0071] Sense primer 5,-atgtattcagcgccctcccgctgcacttgcctgt- 3, (Self column number 69)
  • Antisense primer 5 is used instead of # 325 (38bp).
  • the cDNA sequences of SEQ ID NOs: 23 to 33 have a notation with a translation termination codon tag. In the actual construct, this tag is missing because the tag sequence follows the FGF18 sequence (C-end).
  • the mouse mutant FGF18 protein cDNA was added with cDNA A encoding the FLAG-His tag (described above) at the 3rd end to create a plasmid that was incorporated downstream of the T7 promoter of the pET-3c vector (Takara Bio).
  • BL21 DE3 pLysS E. coli (Takara Bio) was transformed by a conventional method, and a protein was produced by the conventional method using the resulting E. coli.
  • the mutant FGF18 protein was purified using nickel column chromatography according to the conventional method for purifying His-tagged proteins.
  • the purified protein was separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose membrane. This membrane was incubated with an anti-His tag rabbit antibody, and antibody-bound molecules were detected by HRP-labeled anti-rabbit antibody and chemiluminescence method. The results are shown in Fig. 2. Lane 1 is full-length mouse FGF18 protein (SEQ ID NO: 12 plus SEQ ID NO: 45), Lane 2 to Lane 11 are mouse mutant growth factor proteins (SEQ ID NO: 13-22 plus SEQ ID NO: 45) ) Result. The horizontal lines indicate the mobility of molecular weight markers, and indicate 37 KDa, 25 KDa, 20 KDa, and 15 KDa from the top. While confirming that each protein had the expected molecular weight, the protein was obtained.
  • FIG. 1 schematically shows the structure of a protein in which the full-length mouse FGF18 protein (SEQ ID NO: 12) and mouse mutant FGF18 protein (SEQ ID NOs: 13 to 22) are expressed with a tag.
  • SEQ ID NO: 12 full-length mouse FGF18 protein
  • SEQ ID NOs: 13 to 22 mouse mutant FGF18 protein
  • Full-length mouse FGF18 protein (SEQ ID NO: 12) and mouse mutant FGF18 protein (SEQ ID NO: 13-22) are expressed with a tag, adsorbed with heparin sepharose beads, packed in a column, and then phosphate buffered physiology Washed with saline solution. After that, the column was washed with a phosphate buffer with increased j jet NaCl concentration, and the washing solution was recovered and dot plot was performed. The results are shown in Figure 3. From the left to the right in the figure, the NaCl concentration increases gradually. When the mutant protein contained in the eluate is detected with an antibody against the tag, black appears as a dot signal.
  • Figure 3 shows that the full-length mouse FGF18 protein has a heparin facility near 0.9 M NaCl. It can also be seen that ⁇ 4 to ⁇ 16 has a heparinity around 0.9 ⁇ NaCl to 2.0 M NaCl. From ⁇ 18 to ⁇ 95, it can be seen that there is a heterogeneity near 0.9M NaCl to l.lM NaCl.
  • FGFR cells that express only FGFR4 R4 / BaF3 cells (BaF3 cells are obtained from Riken BRC.
  • R4 / BaF3 cells are self-made (plasmids encoding the FGFR4 extracellular domain / FGFR1 intracellular domain chimeric molecule (Ornitz DM, Xu J, Colvin JS, McEwen DG, MacArthur CA, Coulier F, gao D, Goldfarb M (1996) J Biol Chem 271, 15292- 15297.), Yo neda A, Asada M, Oda Y, Suzuki M, Imamura T. (2000) Nature Biotechnology 18, 6 41-644.) 0 ) was cultured with mutant FGF18 protein, and 3H-thymidine incorporation after a certain period of time led to cellular DNA.
  • Figure 4 shows the results of measurement of synthesis (growth).
  • ⁇ 4 to ⁇ 22 mutant FGF18 protein also has a proliferation promoting activity against R4 / BaF3 cells. It can also be seen that ⁇ 37 to ⁇ 95 have little or no growth promoting activity.
  • FGFR cells expressing only FGFRlc Rlc / BaF3 cells (BaF3 cells are obtained from RIKEN BRC. Rlc / BaF3 cells are self-made (Yoneda A, Asada M, Oda Y, Suzuki M, Imamura T (2000) Nature Biotechnology 18, 641- 644. ) Was cultured with mutant FGF18 protein, and the results of measuring DNA synthesis (proliferation) of cells by 3H-thymidine incorporation after a certain period of time are shown in FIG.
  • ⁇ 4 mutant FGF18 protein also has a proliferation promoting activity against Rlc / BaF3 cells.
  • the mutant 1 ⁇ GF18 protein of ⁇ 12 to ⁇ 95 has little or no growth promoting activity.
  • the mutant 1 ⁇ 18 protein of ⁇ 12 to ⁇ 22 reacts with 1 ⁇ 1? 4 and does not react with FGFRlc.
  • FGFR cells that express only FGFR2b R2b / BaF3 cells (BaF3 cells are obtained from Riken BRC. CA, Coulier F, gao D, Goldfarb M (1996) J Biol Chem 271, 15292-15297.) And cultured in the same manner as Rlc / BaF3 cells.
  • Figure 6 shows the results of measuring DNA synthesis (proliferation) of cells by 3H-thymidine incorporation after a certain period of time.
  • NIH3T3 cells originally have FGF receptors, it was examined whether the mutant FGF1 8 protein has a growth promoting activity on the cells.
  • Fig. 7 shows the results of measuring the DNA synthesis (proliferation) of NIH3T3 cells (obtained from ATCC) after serum starvation, culturing with mutant FGF18 protein, and measuring 3H-thymidine incorporation after 3 hours.
  • the activity of the tagged mutant FGF18 protein was measured.
  • the force tag was attached after the distant C-terminal, which is considered to be the receptor binding domain of FGF18. Therefore, it is considered that the binding to the receptor is not affected.
  • the heparin-binding domain of FGF18 is also close to the receptor-binding domain, but the tagged FGF18 protein used in this experiment maintains a high level of heparin-binding affinity. Therefore, it is considered that the activity does not change depending on the presence or absence of the tag.
  • the above experimental data shows that the force of the mouse mutant FGF18 protein is the only difference between human and mouse FGF18 full-length (SEQ ID NOs: 1 and 12), the amino acid being different.
  • One amino acid that is the same and has a different force is located about 25 amino acids from the C-terminus, and is independent of the site of deletion in the series of mutant FGF18 proteins prepared in the above experiment.
  • Mutant FGF18 protein is expected to give almost the same results in humans and mice.
  • the mutant growth factor protein of the present invention has a receptor specificity different from the reaction specificity of the naturally secreted FGF18 for the receptor.
  • the mutant growth factor protein of the present invention can regulate the life phenomenon caused by naturally secreted FGF18.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of full-length human FGF18 (—signal peptide).
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of human A 4-FGF18.
  • SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence of human ⁇ 12-FGF18.
  • SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of human ⁇ 16-FGF18.
  • SEQ ID NO: 5 shows the amino acid sequence of human ⁇ 18-FGF18.
  • SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of human ⁇ 22-FGF18.
  • SEQ ID NO: 7 shows the amino acid sequence of human ⁇ 37-FGF18.
  • SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence of human A 48-FGF18.
  • SEQ ID NO: 9 shows the amino acid sequence of human ⁇ 67-FGF18.
  • SEQ ID NO: 10 shows the amino acid sequence of human ⁇ 77-FGF18. ⁇ SEQ ID NO: 11>
  • SEQ ID NO: 11 shows the amino acid sequence of human ⁇ 95-FGF18.
  • SEQ ID NO: 12 shows the amino acid sequence of mouse FGF18 full-length (one signal peptide).
  • SEQ ID NO: 13 shows the amino acid sequence of mouse A 4-FGF18.
  • SEQ ID NO: 14 shows the amino acid sequence of mouse ⁇ 12-FGF18.
  • SEQ ID NO: 15 shows the amino acid sequence of mouse ⁇ 16-FGF18.
  • SEQ ID NO: 16 shows the amino acid sequence of mouse ⁇ 18-FGF18.
  • SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of mouse ⁇ 22-FGF18.
  • SEQ ID NO: 18 shows the amino acid sequence of mouse ⁇ 37-FGF18.
  • SEQ ID NO: 19 shows the amino acid sequence of mouse A 48-FGF18.
  • SEQ ID NO: 20 shows the amino acid sequence of mouse ⁇ 67-FGF18.
  • SEQ ID NO: 21 shows the amino acid sequence of mouse ⁇ 77-FGF18.
  • SEQ ID NO: 22 shows the amino acid sequence of mouse ⁇ 95-FGF18.
  • SEQ ID NO: 23 shows the DNA sequence encoding the full-length human FGF18 (one signal peptide)
  • SEQ ID NO: 24 shows the DNA sequence encoding human ⁇ 4 -FGF18.
  • SEQ ID NO: 25 shows the DNA sequence encoding human ⁇ 12-FGF18.
  • SEQ ID NO: 26 shows the DNA sequence encoding human ⁇ 16-FGF18.
  • SEQ ID NO: 27 shows the DNA sequence encoding human ⁇ 18-FGF18.
  • SEQ ID NO: 28 shows the DNA sequence encoding human ⁇ 22-FGF18.
  • SEQ ID NO: 29 shows the DNA sequence encoding human ⁇ 37-FGF18.
  • SEQ ID NO: 30 shows the DNA sequence encoding human A48-FGF18.
  • SEQ ID NO: 31 shows the DNA sequence encoding human ⁇ 67-FGF18.
  • SEQ ID NO: 32 shows the DNA sequence encoding human ⁇ 77-FGF18.
  • SEQ ID NO: 33 shows the DNA sequence encoding human ⁇ 95-FGF18.
  • SEQ ID NO: 34 shows the DNA sequence encoding the entire mouse FGF18 (one signal peptide).
  • SEQ ID NO: 35 shows the DNA sequence encoding mouse A 4-FGF18.
  • SEQ ID NO: 36 shows the DNA sequence encoding mouse ⁇ 12-FGF18.
  • SEQ ID NO: 37 shows the DNA sequence encoding mouse ⁇ 16-FGF18.
  • SEQ ID NO: 38 shows the DNA sequence encoding mouse ⁇ 18-FGF18.
  • SEQ ID NO: 39 shows the DNA sequence encoding mouse ⁇ 22-FGF18.
  • SEQ ID NO: 40 shows the DNA sequence encoding mouse ⁇ 37-FGF18.
  • SEQ ID NO: 41 shows the DNA sequence encoding mouse ⁇ 48-FGF18.
  • SEQ ID NO: 42 shows the DNA sequence encoding mouse ⁇ 67-FGF18.
  • SEQ ID NO: 43 shows the DNA sequence encoding mouse ⁇ 77-FGF18.
  • SEQ ID NO: 44 shows the DNA sequence encoding mouse ⁇ 95-FGF18.
  • SEQ ID NO: 45 shows the amino acid sequence of the FLAG-His tag.
  • SEQ ID NO: 46 shows the DNA sequence of FLAG-His tag.
  • SEQ ID NO: 47 shows the amino acid sequence of the signal peptide of human FGF18.
  • SEQ ID NO: 48 shows the DNA sequence of the signal peptide of human FGF18.
  • SEQ ID NO: 49 shows the amino acid sequence of the signal peptide of mouse FGF18.
  • SEQ ID NO: 50 shows the DNA sequence of mouse FGF18 signal peptide.
  • SEQ ID NO: 51 is a cDNA encoding mouse FGF18 full-length (full length including signal sequence). The DNA sequence of the primer (sense primer) for amplification is shown.
  • SEQ ID NO: 52 shows the DNA sequence of a primer (antisense primer) for amplifying cDNA encoding mouse FGF18 full length (including signal sequence).
  • SEQ ID NO: 53 shows the DNA sequence of primer # 468.
  • SEQ ID NO: 54 shows the DNA sequence of primer # 469.
  • SEQ ID NO: 55 shows the DNA sequence of primer # 466.
  • SEQ ID NO: 56 shows the DNA sequence of primer # 467.
  • SEQ ID NO: 57 shows the DNA sequence of a primer (sense primer) for amplifying cDNA encoding mouse FGF18 full-length (not including signal sequence).
  • SEQ ID NO: 58 shows the DNA sequence of primer # 226.
  • SEQ ID NO: 59 shows the DNA sequence of primer # 249.
  • SEQ ID NO: 60 shows the DNA sequence of primer # 262.
  • SEQ ID NO: 61 shows the DNA sequence of primer # 268.
  • SEQ ID NO: 62 shows the DNA sequence of primer # 280.
  • SEQ ID NO: 63 shows the DNA sequence of primer # 325.
  • SEQ ID NO: 64 shows the DNA sequence of primer # 358.
  • SEQ ID NO: 65 shows the DNA sequence of primer # 415.
  • SEQ ID NO: 66 shows the DNA sequence of primer # 445.
  • SEQ ID NO: 67 shows the DNA sequence of primer # 498.
  • SEQ ID NO: 68 shows the DNA sequence of primer # 537 (antisense primer) for amplifying cDNA encoding mouse FGF18 full-length (not including signal sequence).
  • SEQ ID NO: 69 shows the DNA sequence of a primer (sense primer) for amplifying cDNA encoding the entire human FGF18 (full length including signal sequence).
  • SEQ ID NO: 70 shows the DNA sequence of a primer (antisense primer) for amplifying cDNA encoding the entire human FGF18 (full length including signal sequence).
  • SEQ ID NO: 71 shows the DNA sequence of a primer (can be used in place of primer # 325) for amplifying cDNA encoding a protein with a FLAG-His tag attached to the C-terminus of human mutant FGF18!

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Abstract

　天然分泌型繊維芽細胞増殖因子18のアミノ酸配列のN末端から１個以上のアミノ酸を欠損させることにより作製された、繊維芽細胞増殖因子受容体特異性が変化したミュータントタンパク質であり、発毛または育毛調節のための医薬組成物もしくは骨形成調節または軟骨形成調節のための医薬組成物として用いることができる。

Description

受容体特異性を変化させたミュータント増殖因子およびそれを含有する 医薬組成物
技術分野
[0001] 本発明は、繊維芽細胞増殖因子 18 [Fibroblast Growth Factor 18 (FGF18)]タンパ ク質の N末端のアミノ酸を適切な数だけ欠損させることにより得られる受容体特異性 の変化したミュータント増殖因子タンパク質、ならびにこれを有効成分とする医薬組 成物に関する。
背景技術
[0002] 従来、繊維芽細胞増殖因子 (FGF)リガンドファミリ一はヒト及びマウスで 22種類のメ ンバーからなること、これらは 7つのサブクラスから成る FGF受容体（FGFR)、すなわ ち FGFRlc,FGFRlb,FGFR2c,FGFR2b,FGFR3c,FGFR3b,FGFR4、の!、ずれか一つ または複数、との固有の反応特異性を有することが知られていた。一般に FGFリガン ドの生理機能が多岐に渡ることは、多種のリガンドと多種の受容体との組み合わせに よって説明されうることが多いと考えられている。一方、個々の FGFリガンドが固有に 有する受容体特異性を、人為的に制御する例はほとんど知られて 、な 、。
[0003] このような背景にあって、 FGF18は骨と軟骨の形成や成長を制御することが報告さ れた (非特許文献 1及び 2)。また、 FGF18が毛包の成長期を誘導して毛成長を促進 することが報告された (非特許文献 3)。し力しこれらをはじめとする多種の FGF18の 生理活性が、 FGF18といずれの FGF受容体の結合 ·反応に起因して発揮されるのか は明らかではない。天然分泌型 FGF18の有する受容体特異性を操作することが出来 れば、 FGF18の種々の活性の中から、個々の活性を特異的に示す因子や活性を制 御する因子が実現する可能性がある力 そのようなものは未だ発見されていない。天 然分泌型 FGF18は FGFRlc、 FGFR2c、 FGFR3c、 FGFR4と反応すると考えられている
[0004] 従来、受容体に対する反応特異性の異なる FGF18のミュータントタンパク質は一切 知られていなかった。また、天然分泌型 FGF18の作用を制御する FGF18のミュータン トタンパク質は、まったく知られていなかった。しかしながら、 FGF18は、毛成長の制御 因子としての活性や骨や軟骨の形成 '成長'修復の制御因子としての活性、その他 の多面的な活性を有するので、上述のような FGF18のミュータントタンパク質が存在 すればその価値は高い。
[0005] 非特許文献 1： Ohbayashi N, Shibayama M, Kurotaki Y, Imanishi M, Fujimori T, Itoh N, Takada S. FGF 18 is required for normal cell proliferation and differentiation durin g osteogenesis and chondrogenesis. Genes Dev. 2002, 16(7):870- 9
非特許文献 2 : Moore EE, Bendele AM, Thompson DL, Littau A, Waggie KS, Reardo n B, Ellsworth JL. Fibroblast growth factor— 18 stimulates chondrogenesis and cartila ge repair in a rat model of injury-induced osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 20 05, 13(7):623-31
非特許文献 3 : Kawano M, Komi-Kuramochi A, Asada M, Suzuki M, Oki J, Jiang J, I mamura T. Comprehensive analysis of FGF and FGFR expression in skin: FGF18 is highly expressed in hair follicles and capable of inducing anagen from telogen stage h air follicles. J Invest Dermatol. 2005, 124(5):877— 885
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] FGF18は 7種類ある FGF受容体サブクラス（FGFRlc、 FGFRlb、 FGFR2c、 FGFR2b 、 FGFR3c、 FGFR3b、 FGFR4)のうち少なくとも 4つ、すなわち FGFRlcゝ FGFR2c、 FG FR3c、 FGFR4と反応すると考えられている。従って標的細胞が発現する受容体の種 類や量、標的細胞の性質に応じて、 FGF18の活性は異なった表現となり、骨や軟骨 の形成や成長、肺の形成、毛の成長など広範な生命現象の制御に働く。従って、こ れら生命現象のどれかを選択的に制御しょうとする場合には、望まない受容体特異 性を持たず、望まれる受容体特異性だけを持つタンパク質が実現することが有用で あると考えられる。
[0007] 本発明は、天然分泌型 FGF18の受容体に対する反応特異性とは異なる受容体特 異性を有する FGF18のミュータントタンパク質を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段 [0008] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、従来知られて ヽた 天然分泌型 FGF18の受容体に対する反応特異性とは異なる受容体特異性を有する FGF18のミュータントタンパク質を創製することが出来た。一例として FGF受容体サブ クラスのうち FGFRlcには反応せず FGFR4に反応する FGF18のミュータントタンパク質 を創製することができた。さらに、 FGF受容体サブクラスのうち FGFRlcと FGFR4には 反応せず FGFR2bには反応する FGF18のミュータントタンパク質を創製することができ た。これらのタンパク質は天然分泌型 FGF18が惹起する生命現象の一部のみを惹起 し調節することができるので、医薬品として利用できる。本発明はこれらの知見に基 づいて完成された。
[0009] 本発明の要旨は以下の通りである。
[0010] (1)以下の (a)、（b)、（c)又は (d)のいずれかのタンパク質。
[0011] (a)天然分泌型繊維芽細胞増殖因子 18の N末端から 1個以上のアミノ酸を欠損させる ことにより、繊維芽細胞増殖因子受容体特異性が変化したミュータントタンパク質
(b) (a)のミュータントタンパク質のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ天然分泌型繊維芽細胞増殖 因子 18と比べて繊維芽細胞増殖因子受容体特異性が変化したタンパク質
(c)分泌シグナル配列及び Z又はタグ配列が付加された (a)又は (b)のタンパク質
(d)機能に影響を与えな 、修飾がなされた (a)、（b)又は (c)のタンパク質
(2) (a)のミュータントタンパク質力 配列番号 2〜： L 1又は 13〜22のいずれかのアミノ 酸配列からなる（1)記載のタンパク質。
[0012] (3) (a)のミュータントタンパク質力 配列番号 24〜33又は 35〜44のいずれかの DN
A配列にコードされる (2)記載のタンパク質。
[0013] (4) (a)のミュータントタンパク質力 天然分泌型繊維芽細胞増殖因子 18のメチォニン を除く N末端力 4個以上 22個以下のいずれかの数のアミノ酸を欠損させたものであ る（1)〜（3)の 、ずれかに記載のタンパク質。
[0014] (5) (1)〜 (4)のいずれかに記載のタンパク質を含有する医薬組成物。
[0015] (6)繊維芽細胞増殖因子受容体第 4遺伝子産物と反応して細胞機能を調節するた めの（5)記載の医薬組成物。 [0016] (7)発毛または育毛調節のための（5)記載の医薬組成物。
[0017] (8)骨形成調節または軟骨形成調節のための（5)記載の医薬組成物。
[0018] (9)天然分泌型繊維芽細胞増殖因子 18の N末端から 1個以上のアミノ酸を欠損させ ることを含む、繊維芽細胞増殖因子受容体特異性が変化したミュータントタンパク質 を作製する方法。
[0019] 本発明により、天然分泌型 FGF18の受容体に対する反応特異性とは異なる受容体 特異性を有する FGF18のミュータントタンパク質が提供された。
[0020] 本発明により、 FGF18の生理活性を正又は負に制御するのに有効な医薬組成物を 提供することができる。具体的には、毛の産生メカニズムの一部である FGF18の発毛 または育毛調節活性と同様の活性またはその特異的阻害活性を有し、 FGF18のその 他の望まれない生理活性を持たない、発毛または育毛の調節に有効な医薬組成物 を提供することができる。また、 FGF18の骨形成促進または軟骨形成抑制活性と同様 の活性またはその特異的阻害活性を有し、 FGF18のその他の望まれな 、生理活性 を持たない、骨形成または軟骨形成の調節に有効な医薬組成物を提供することがで きる。
[0021] さらに、本発明により、神経細胞死の抑制や他の FGF因子群の発現制御等に有効 な医薬組成物、各種再生医療に有効な組成物などを提供することができる。
発明の効果
[0022] 本発明の新規な FGF18ミュータント増殖因子タンパク質は、天然分泌型 FGF18の 受容体に対する反応特異性とは異なる受容体特異性を有する。これにより、 FGF18 の生理活性を正又は負に制御することが可能となる。
図面の簡単な説明
[0023] [図 1]本実施例中で解析したミュータント FGF18タンパク質の構造を模式的に示す。
[図 2]大腸菌発現系で発現させ精製したミュータント FGF18タンパク質をウェスタンブ ロッテイングで検出したものを示す。
[図 3]ミュータント FGF18タンパク質のへパリンァフィ-ティーを示す。
[図 4]ミュータント FGF18タンパク質の FGFR4発現細胞に対する増殖促進活性を示す [図 5]ミュータント FGF18タンパク質の FGFRlc発現細胞に対する増殖促進活性を示 す。
[図 6]ミュータント FGF18タンパク質の FGFR2b発現細胞に対する増殖促進活性を示 す。
[図 7]内在性 FGF受容体を有する NIH3T3細胞に対するミュータント FGF18タンパク質 の増殖促進活性を示す。
[0024] 以下、本発明を詳細に説明する。
発明を実施するための最良の形態
[0025] 本発明のミュータント増殖因子タンパク質は、 FGF18タンパク質の N末端を適切な長 さだけ短縮したタンパク質である。
[0026] FGF18タンパク質はヒトとマウスでは産生細胞の細胞質で 207アミノ酸のポリべプチ ドとして合成される力 それが細胞外に分泌される際に N末端のシグナルペプチドが 切断される。本明細書の中では 181アミノ酸より成る分泌体としての全長のァミノ末端 に翻訳開始のためのメチォニンを付加した 182アミノ酸より成るものを天然分泌型 FG F18と称する（例えば、配列番号 1のアミノ酸配列力 なるタンパク質、配列番号 12の アミノ酸配列からなるタンパク質)。これに対し、本発明では、そのメチォニンを除くァ ミノ末端力ら 4アミノ酸、 12アミノ酸、 16アミノ酸、 18アミノ酸、 22アミノ酸、 37アミノ酸 、 48アミノ酸、 67アミノ酸、 77アミノ酸、 95アミノ酸を欠損したミュータントタンパク質が 、受容体特異性の変化した活性型ミュータント増殖因子タンパク質であることを実証 している。尚、配列番号 1の第 3アミノ酸から開始するポリペプチドを天然分泌型分泌 体とする説もあるが、配列番号 1の第 2アミノ酸が付加することによる活性上の差異は ない。
[0027] 本発明のミュータント増殖因子タンパク質は、具体的には、ヒトでは実質的に配列番 号 2〜11記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、マウスでは実質的に配列番号 13 〜22記載のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、前者は配列番号 24〜33、後者 は配列番号 35〜44に示される DNA配列によりそれぞれコードされる。ここで、「実質 的に」とは、その機能を発揮する限りにおいて、そのアミノ酸配列の一部に、付加、欠 失、置換、修飾があってもよい。 [0028] さらに本発明のミュータント増殖因子タンパク質は、配列番号 1及び 13記載のタン パク質のアミノ末端から 22アミノ酸以内の欠損を実質的に有するミュータント増殖因 子タンパク質を含む。
[0029] さらに本発明のミュータント増殖因子タンパク質は、配列表に記載された cDNAが 一次的に規定するタンパク質に加えて、動物細胞等力 分泌される際にそのアミノ末 端に必要とされるシグナルペプチドと呼ばれる分泌の為のペプチド配列を付加した 形のタンパク質を含む。また、大腸菌の菌体内でシグナルペプチドを持たない形で 生産するために、翻訳開始のためのメチォニンを付加した形のタンパク質を含む。さ らに、検出や精製のためのタグを N-末端または C-末端に付加した形のタンパク質、 機能に影響を与えない修飾を受けたものを含む。検出や精製のためのタグとしては、 FLAG- Hisタグ、 Hisタグ、 FLAGタグ、 c- Mycタグ、 HAタグ、 V5タグ、 GFPタグ、これら の組み合わせなどを例示することができる。機能に影響を与えない修飾としては、 N 末端アミノ酸のメチル化、糖鎖の付加、リン酸ィ匕など生産系の中で自然に起こりうるも の、ポリエチレングリコールイ匕など既に他のタンパク質に適用する技術が確立されて
V、るものを f列示することができる。
[0030] すなわち、組み換え体その他の形で本発明の医薬組成物の有効成分として含有さ せるミュータント増殖因子タンパク質は、これらの形で製造してもその有用性には変 化がない。
[0031] 以下、本発明のミュータント増殖因子タンパク質の調製方法を具体的に述べる。
[0032] まず、動物組織より抽出した RNAを、ランダムへキサオリゴヌクレオチドをプライマ 一として逆転写し、これを PCR反応によって増幅する。その際プライマーとしては FG F18のオープンリーディングフレームを増幅することができるオリゴヌクレオチドを用い ると、既知の FGF18タンパク質に相当する大きさの DNAフラグメントを生じる。これを ゲル電気泳動によって分離後、ゲルカゝら切り出し、クロー-ングベクターのマルチクロ 一-ングサイトに組み込むことで、プラスミドが得られる。
[0033] さらに、上記で得た FGF18cDNAを含むプラスミドをテンプレートとして用い、天然分 泌型 FGF18及びその N-末端を欠損したタンパク質をコードするようにデザインした各 種オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて PCR反応を行うと、それぞれのタンパク 質に相当する大きさの DNAフラグメントを生じる。これをゲル電気泳動によって分離 後、ゲル力ら切り出し、クローユングベクターのマルチクローユングサイトに組み込む ことで、プラスミドが得られる。上記のオリゴヌクレオチドのデザインにおいて、 N-末端 の欠損アミノ酸数は自由に決めることが出来る。また、オリゴヌクレオチドの配列中に アミノ酸の置換、付加、欠失をコードする配列を含めておける。これらのデザインによ り、ミュータントタンパク質のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする DNAフラグメントを得ることが出来 る。これをゲル電気泳動によって分離後、ゲル力も切り出し、クロー-ングベクターの マルチクロー-ングサイトに組み込むことで、プラスミドが得られる。
[0034] DNAを組み込むプラスミドとしては、宿主内で複製保持されるものであれば、 、ず れも使用することができるが、例えば大腸菌由来の pBR322、 pUC18、及びこれらを 基に構築された pET-3cなどを挙げることができる。
[0035] プラスミドに組み込む方法としては、例えば T.Maniatisら、 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 239 (1982)に記載の方法などが挙げられる。
[0036] クローン化された遺伝子は、発現に適したベクター中のプロモーターの下流に連結 して発現型ベクターを得ることができる。ベクターとしては、上記の大腸菌由来のブラ スミド (PBR322、 pBR325、 pUC12、 pUC13、 pET- 3)、枯草菌由来のプラスミド (pUB 11 0、 pTP5、 pC194)、酵母由来のプラスミド (pSH19、 pSH15)由来のプラスミド、あるいは λファージなどのバタテリオファージゃこの誘導体およびレトロウイルス、ワクシニアゥ ィルスなどの動物ウィルス、あるいは昆虫ウィルスなどが挙げられる。
[0037] 該遺伝子はその 5'末端に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、また 3'末端には翻 訳終始コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有してもよい。あるいは 3'末端には翻 訳終始コドンを有さずにタグ配列をコードする DNA配列を結合しても良 、。さらに該 遺伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。本発明で用いられる プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター であれば!/、かなるものでもよ！/、。
[0038] また、形質転換する宿主が大腸菌である場合には、 trpプロモーター、 lacプロモー ター、 rec Aプロモーター、 λ PLプロモーター、 lppプロモーター、 T7プロモーターな ど力 宿主が枯草菌である場合には、 SP01プロモーター、 SP02プロモーター、 penPプ 口モーターなど、宿主が酵母である場合には、 PH05プロモーター、 PGKプロモータ 一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。また、宿主が動物細胞 である場合には、 SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーターが挙げら れる。
[0039] タグ配列は既知の配列情報力 ヌクレオチドを合成して得ることが出来る。
[0040] このようにして構築されたミュータント増殖因子タンパク質をコードする塩基配列を 有する組み換え DNAを含むベクターを用いて、該ベクターを保持する形質転換体を 製造する。
[0041] 宿主としては、大腸菌 [例えば BL21, BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pL ysE]、枯草菌（例えば Bacillus subtilis DB105)、酵母（例えば Pichia pastoris, Sacchar omyces cerevisiae)ゝ動物細胞（例えば COS cell, CHO cell, BHK cell, NIH3T3 cell, BALB/c3T3 cell, HUVE cell, LEII cell),昆虫細胞などが挙げられる。
[0042] 上記の形質転換は、それぞれの宿主につ!、て一般的に行われて 、る方法で行う。
または一般的でなくとも適用可能な方法ならばよい。例としては、宿主が大腸菌なら ばカルシウム法その他の方法により作成したコンビ一タント細胞に組み換え DNAを 含むベクターを温度ショック法ある 、はエレクト口ポレーシヨン法により導入する。宿主 が酵母であればリチウム法その他の方法により作成したコンビ一タント細胞に組み換 え DNAを含むベクターを温度ショック法あるいはエレクト口ポレーシヨン法により導入 する。宿主が動物細胞であれば、増殖期等の細胞に組み換え DNAを含むベクター をリン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法あるいはエレクト口ポレーシヨン法により導入 する。
[0043] このようにして得られた形質転換体を培地に培養することにより、ミュータント増殖因 子タンパク質を産生させる。
[0044] 形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては、それぞれの宿主に っ 、て一般的に用 、られて 、るものを用 V、る。または一般的でなくとも適用可能な培 地ならば良い。例としては、宿主が大腸菌ならば LB培地などを用いる。宿主が酵母 であれば YPD培地などを用いる。宿主が動物細胞であれば、 Dulbecco's MEMに動 物血清をカ卩えたものなどを用いる。培養は、それぞれの宿主について一般的に用い られている条件で行う。また一般的でなくとも適用可能な条件ならばよい。例としては
、宿主が大腸菌ならば約 30〜37°Cで、約 3〜24時間行い、必要により通気や攪拌を 加えることができる。宿主が酵母であれば約 25〜37°Cで、約 12時間〜 2週間行い、 必要により通気や攪拌をカ卩えることができる。宿主が動物細胞であれば約 32〜37°C で、 5% C02、 100%湿度の条件で約 24時間〜 2週間行い、必要により気相の条件を 変えたり攪拌を加えることができる。
[0045] 上記培養物力 ミュータント増殖因子タンパク質を培養菌体あるいは細胞力 抽出 するに際しては、培養後、ホモジェナイザー、フレンチプレス、超音波、リゾチームお よび Zまたは凍結融解によって菌体あるいは細胞を破壊することにより菌体外に目 的のタンパク質を溶出させ、可溶性の画分力も該タンパク質を得る。また目的のタン ノ^質が不溶性画分に含まれる場合は菌体あるいは細胞を破壊後、遠心分離により 不溶性画分を回収し、塩酸グァニジンなどを含む緩衝液などによって可溶性にして 回収する方法も用いうる。このほか塩酸グァ-ジンなどのタンパク質変性剤を含む緩 衝液によって直接菌体あるいは細胞を破壊し、菌体外に目的のタンパク質を溶出さ ·¾：る方法ちある。
[0046] 上記上澄み液力 ミュータント増殖因子タンパク質を精製するには、公知の分離 · 精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法として は、塩析、溶媒沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾過、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気 泳動、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフィー、逆相高速液体 クロマトグラフィー、等電点電気泳動などが使用されうる。さらに、多くのミュータント増 殖因子タンパク質につ 、ては、へパリンセファロースを担体としたァフィ二ティーク口 マトグラフィ一法が適用できる。また、タグを付加して精製する際には、タグについて 公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行うことができる。
[0047] このようにして得られた標品はミュータント増殖因子タンパク質の活性が損なわれな い限りにおいて透析、凍結乾燥を行い、乾燥粉末とすることもできる。さらに、担体と して血清アルブミンなどを添加して保存することは、標品の容器への吸着を防ぐのに 有効である。 [0048] また、精製過程、あるいは保存過程での微量の還元剤の共存は、該標品の酸化を 防ぐのに好適である。還元剤としては、 j8 -メルカプトエタノール、ジチオスレィトール
、ダルタチオンなどが挙げられる。
[0049] 本発明のミュータント増殖因子タンパク質には、 FGF受容体のうち FGFR4を活性化 する作用を有するものがある。
[0050] 本発明のミュータント増殖因子タンパク質には、 FGF受容体のうち FGFR2bを活性 化する作用を有するものがある。
[0051] また、本発明のミュータント増殖因子タンパク質には、 FGF受容体のうち FGFR2bを 弱く活性化する作用を有するものがある。
[0052] また、本発明のミュータント増殖因子タンパク質は、 FGF18の生理的機能の少なくと も一部を発揮したり、調節する作用を有する。
[0053] FGF18の生理的機能とは、具体的には、毛の産生メカニズムを調節する作用、具体 的には頭髪などの発毛を促進または抑制する作用、毛の成長を促進または抑制する 作用を挙げることができる。
[0054] また、 FGF18の生理的機能とは、骨や軟骨の形成と成長メカニズムを調節する作用
、具体的には骨形成や軟骨の形成を促進または抑制する作用を挙げることができる
[0055] また、本発明のミュータント増殖因子タンパク質は、その他の FGF18の生理的機能 を調節する作用を有しうる。
[0056] その他の FGF18の生理的機能としては、肺の形成を調整すること、繊維芽細胞、血 管内皮細胞、筋芽細胞、神経細胞、グリア細胞、の増殖や分化を促進または抑制す ること、また、これらの細胞の機能を調節したり細胞死を抑制することを挙げられる。
[0057] 本発明のミュータント増殖因子タンパク質は、繊維芽細胞増殖因子受容体第 4遺伝 子産物と反応して細胞機能を調節しうる。繊維芽細胞増殖因子受容体第 4遺伝子産 物としては、成熟 mRNAが生成する際の種々のスプライシングゃ翻訳後の糖鎖など各 種修飾があっても構わな 、。
[0058] 上記のようにして得られたミュータント増殖因子タンパク質は、医薬的に許容できる 溶剤、賦形剤、担体、補助剤などを使用し、製剤製造の常法に従って液剤、ローショ ン剤、エアゾール剤、注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤、坐剤、腸溶剤およびカプセル剤 などの医薬組成物とする。
[0059] 医薬組成物中、有効成分であるミュータント増殖因子タンパク質の含有量は、 0.000 0000001〜1.0重量0 /0程度とすればよい。
[0060] 該医薬組成物は、発毛剤、育毛剤、骨形成促進剤、軟骨形成抑制剤、脳神経系栄 養剤'機能制御剤、学習効果調節剤、その他として例えばヒト、マウス、ラット、ゥサギ 、ィヌ、ネコ等の哺乳動物に対して非経口的にまたは経口的に安全に投与することが できる。本医薬組成物の投与量は、剤形、投与ルート、症状等により適宜変更しうる 力 例えばヒトを含む哺乳動物に投与する場合、当該ミュータント増殖因子タンパク 質を 0.0001〜1000mgを患部に 1 日に数回適用することが例示される。
実施例
[0061] 以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制 限されるものではない。
[0062] (1)プラスミドの構築
マウスミュータント FGF18タンパク質をコードする cDNAを含むプラスミドの構築
マウスミュータント FGF18タンパク質をコードする cDNAは次のようにして取得できる。
[0063] 材料としては、 C3H/HeNマウス (Japan SLC, Hamamatsu, Japan) 7週齢ォス個体より 皮膚を摘出し、これより RNAを抽出した。このマウス RNA 1 microgramに 120 ng rand om hexanucleotide DNA(GIBCO BRL, Tokyo, Japan)をカ卩え、 200 unit M- HLV逆転 写酵素（GIBCO BRL, Tokyo, Japan)により cDNA混合物を得る。
[0064] 上記 cDNA混合物からマウス FGF18全長をコードする cDNAを PCR反応により増幅 する。 PCR反応に用いたプライマーの配列は以下の通りである。
[0065] Sense primer 5， - ATGTATTCAGCGCCCTCCGCCTGCACTTGCCTGT- 3， （配列 番号 51) ;
Anti-sense primer 5， - CTAGCCGGGGTGAGTGGGGCGGATCCGCCGGGAT- 3 ' (配列番号 52)
FLAGタグ配列 3連と Hisタグ配列を連続的に一体ィ匕したタグ (以後 FLAG-Hisタグと 称する)をコードする cDNAを作製するために、 #468(5，-CAG CCG CTC GAG A-3， (配列番号 53))と #469 (5' -TGC GGG CCC TCA A-3' (配列番号 54))をプライマ 一とし、铸型としての #466 (5，- CCG CTC GAG ACT ACA AAG ACC ATG ACG G TG ATT ATA AAG ATC ATG ACA TCG ACT ACA AG- 3， （配列番号 55))と #46 7 (5， - TGC GGG CCC TCA ATG GTG ATG GTG ATG ATG ACC CTT GTC ATC GTC ATC CTT GTA GTC GA- 3， （配列番号 56))のメガプライマーの存在下で、 P CRを行った。反応産物を Xho Iと Apa Iで消化し、予め消化した pcDNA3.1(+) (インビト ロージェン株式会社）にクロー-ングし、その結果、プラスミド FLAG- His/pcDNA3.1(+ )を得た。 FGF18 ORFの 5'末端と相同配列を持つプライマーに EcoRV認識配列及び 3'末端と相同配列を持つプライマーに Sail認識配列を担持させ、 FGF18 ORFを铸型 として用い、 PCRで増幅し、 EcoRV及び Sailで消化し、予め EcoRVと Xholで消化した F LAG- His/pcDNA3.1 (+)に挿入して、 FLAG- Hisタグ付き FGF18タンパク質をコードす る cDNAを作製した。生成した cDNAのヌクレオチド配列を確認したところ、配列番号 3 4に示す配列のはじめの ATGを除く配列を完全に含む配列であった。
[0066] 次に上記マウス FGF18全長 cDNAをテンプレートとして、配列番号 34に示す天然分 泌型 FGF18及び配列番号 35〜44に示す各種ミュータント FGF18の cDNAを PCR反 応で作製し、それぞれをベクターにクローニングして配列を確認した。 PCR反応に用 いたプライマーの配列は以下の通りである。
[0067] bense primers
#iulHength(38bp) 5， - GTGAATGCCATATGgccgaggagaatgtggacttccgc- 3，（配列番 号 57)
#226(38bp) 5，- GTGAATGCCATATGGTGGACTTCCGCATCCACGTGGAG- 3' ( 配列番号 58)；
#249(38bp) 5，- GTGAATGCCATATGAACCAGACGCGGGCTCGAGATGAT- 3' ( 配列番号 59)；
#262(38bp) 5，- GTGAATGCCATATGGCTCGAGATGATGTGAGTCGGAAG- 3' ( 配列番号 60)；
#268(38bp) 5，- GTGAATGCCATATGGATGATGTGAGTCGGAAGCAGCTG- 3' ( 配列番号 61) ; #280(38bp) 5，- GTGAATGCCATATGCGGAAGCAGCTGCGCTTGTACCAG- 3' ( 配列番号 62)；
#325(38bp) 5，- GTGAATGCCATATGAAGCACATTCAAGTCCTGGGCCGT- 3' ( 配列番号 63)；
#358(38bp) 5， - GTGAATGCCATATGGCCCGTGGCGAGGACGGGGACAAG- 3' ( 配列番号 64)；
#415(38bp) 5 ' -GTGAATGCCATATGGGGAGTCAAGTCCGGATCAAGGGC-3 ' ( 配列番号 65)；
#445(38bp) 5，- GTGAATGCCATATGACAGAATTCTACCTGTGTATGAAC- 3' ( 配列番号 66)；
#498(38bp) 5，- GTGAATGCCATATGGGTACTAGCAAGGAGTGCGTGTTC- 3' ( 配列番号 67)
Anti-sense primer
#537 (34bp) 5，- GAAGATCTCTTCAATGGTGATGGTGATGATGACC- 3' (配列番 号 68)
なお、配列番号 34〜44の cDNA配列は翻訳終止コドン tagを付カ卩した表記になって いる。実際に作製したコンストラクトでは、 FGF18配列の後（C末）にタグの配列が続く ので、この tagはない。
[0068] ヒトミュータント FGF18タンパク皙コードする cDNAの取得
ヒトミュータント FGF18タンパク質をコードする cDNAは基本的にマウスミュータント FG F18タンパク質と同様にして容易に取得することが出来る。
[0069] 材料としては、ヒト RNA、例えば、 Clonetech社 Catalog number 64020—1 Human Brai n Whole RNAを用 ヽる。このヒト RNA 1 microgramに 120 ng random hexanucleotide DNAをカ卩え、 200 unit M- HLV逆転写酵素により cDNA混合物を得る。
[0070] 上記 cDNA混合物からヒト FGF18全長をコードする cDNAを PCR反応により増幅する 。生成した cDNAを pBlueScriptベクターにクローユングし、そのヌクレオチド配列を確 認したところ、配列番号 23に示す配列のはじめの ATGを除く配列を完全に含む配列 であった。 PCR反応に用いたプライマーの配列は以下の通りである。 [0071] Sense primer 5， - atgtattcagcgccctccgcctgcacttgcctgt- 3， (酉己列番号 69)
Antisense primer 5， - ctaggcagggtgtgtgggccggatccgacgggac- 3， (酉己列番号 70) 次に上記ヒト FGF18全長 cDNAをテンプレートとして、配列番号 23に示す天然分泌 型 FGF18及び配列番号 24〜33に示す各種ミュータント FGF18タンパク質の cDNAを PCR反応で作製し、それぞれをベクターにクローユングして配列を確認した。この際、 PCR反応に用 、たプライマーの配列は #325(38bp)を除!、てマウスのときと同じである 。ヒトでは、 #325(38bp)の代わりに (38bp) 5， -GTGAATGCCATATGAAACACATCCA GGTCCTGGGCCGC- 3， （配列番号 71 )を用いる。
[0072] なお、配列番号 23〜33の cDNA配列は翻訳終止コドン tagを付カ卩した表記になって いる。実際に作製したコンストラクトでは、 FGF18配列の後（C末）にタグの配列が続く ので、この tagはない。
[0073] (2)ミュータント FGF18タンパク質の発現と同定
マウスミュータント FGF18タンパク質 cDNAの 3，端に FLAG- Hisタグをコードする cDN A (上述）を付加し、 pET-3cベクター（タカラバイオ）の T7プロモーターの下流に組み 込んだプラスミドを作製した。これを用いて BL21(DE3)pLysS大腸菌（タカラバイオ)を 常法により形質転換し、得られた大腸菌で常法によりタンパク質を生産した。大腸菌 を破壊し、水溶性画分を得た後、ニッケルカラムクロマトグラフィーを用いて、 Hisタグ 付きタンパク質精製の常法に従って、ミュータント FGF18タンパク質を精製した。精製 タンパク質を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース 膜に移した。この膜を抗 Hisタグゥサギ抗体とインキュベートし、抗体結合分子を HRP 標識抗ゥサギ抗体と化学発光方法によって検出した。その結果を図 2に示す。レーン 1に全長マウス FGF18タンパク質 (配列番号 12に配列番号 45を付カ卩したもの）、レー ン 2〜レーン 11にマウスミュータント増殖因子タンパク質（配列番号 13〜22に配列番 号 45を付加したもの）の結果を示す。横に示す線は、分子量マーカーの移動度で、 上から、 37KDa, 25KDa, 20KDa, 15KDaを示す。それぞれのタンパク質が確かに予 想される分子量を有することを確認するとともに、蛋白質を取得した。
[0074] 全長マウス FGF18タンパク質（配列番号 12)、マウスミュータント FGF18タンパク質（ 配列番号 13〜22)をタグ付きで発現させたタンパク質の構造を図 1に模式的に示す [0075] (3)ミュータント FGF18タンパク質のへパリンァフィユティー
全長マウス FGF18タンパク質（配列番号 12)、マウスミュータント FGF18タンパク質（ 配列番号 13〜22)をタグ付きで発現し、へパリンセファロースビーズと吸着させ、ビ ーズをカラムに詰めたのち、リン酸緩衝生理食塩液で洗浄した。その後カラムを j噴次 NaCl濃度を高めたリン酸緩衝液で洗浄し、洗浄液を回収してドットプロットを行った。 結果を図 3に示す。図の左から右へ向力つて、順次 NaCl濃度が高まっていることを示 す。溶出液の中に含まれているミュータントタンパク質をタグに対する抗体で検出した ものが黒 、ドットシグナルとして現れて 、る。
[0076] 図 3力ら、全長マウス FGF18タンパク質は 0.9M NaCl付近のへパリンァフィユティー を持つことがわかる。また、 Δ 4〜 Δ 16は 0.9Μ NaCl〜2.0M NaCl付近のへパリンァフ ィ-ティーを持つことがわかる。 Δ 18〜 Δ 95まで、 0.9M NaCl〜l.lM NaCl付近のへ ノ リンァフィ二ティーを持つことがわかる。
[0077] (4)ミュータント FGF18タンパク質の FGFR4発現細胞に対する増殖促進活性
FGFRとしては FGFR4のみを発現する細胞 R4/BaF3細胞（BaF3細胞は理研 BRCよ り入手。 R4/BaF3細胞は自製（FGFR4細胞外ドメイン/ FGFR1細胞内ドメインキメラ分 子をコードするプラスミド（Ornitz DM, Xu J, Colvin JS, McEwen DG, MacArthur CA, Coulier F, gao D, Goldfarb M (1996) J Biol Chem 271, 15292- 15297.)を用いて、 Yo neda A, Asada M, Oda Y, Suzuki M, Imamura T. (2000) Nature Biotechnology 18, 6 41- 644.に記載の方法と同様にして作製した。 ) 0 )をミュータント FGF18タンパク質と 共に培養し、一定時間後の 3H-チミジン取り込みによって細胞の DNA合成 (増殖)を 測定した結果を図 4示す。
[0078] 全長マウス FGF18タンパク質と同様に Δ 4〜 Δ 22ミュータント FGF18タンパク質も R4/ BaF3細胞に対する増殖促進活性を持つことがわかる。また、 Δ 37〜Δ 95はほとんど 又は全く増殖促進活性を持たな ヽことがわかる。
[0079] (5)ミュータント FGF18タンパク質の FGFRlc発現細胞に対する増殖促進活性
FGFRとしては FGFRlcのみを発現する細胞 Rlc/BaF3細胞（BaF3細胞は理研 BRC より入手。 Rlc/BaF3細胞は自製（Yoneda A, Asada M, Oda Y, Suzuki M, Imamura T . (2000) Nature Biotechnology 18, 641- 644.に記載の方法と同様にして作製した。 ) をミュータント FGF18タンパク質と共に培養し、一定時間後の 3H-チミジン取り込みに よって細胞の DNA合成 (増殖)を測定した結果を図 5に示す。
[0080] 全長マウス FGF18タンパク質と同様に Δ 4ミュータント FGF18タンパク質も Rlc/BaF3 細胞に対する増殖促進活性を持つことがわかる。しかし、 厶12〜厶95のミュータント1^ GF18タンパク質はほとんど又は全く増殖促進活性を持たな ヽことがわかる。図 4の結 果と合わせることにより、厶12〜厶22のミュータント1^^18タンパク質は1^^1?4とは反 応し、 FGFRlcとは反応しないことがわかる。
[0081] (6)ミュータント FGF18タンパク質の FGFR2b発現細胞に対する増殖促進活性
FGFRとしては FGFR2bのみを発現する細胞 R2b/BaF3細胞（BaF3細胞は理研 BRC より入手。 R2b/BaF3細胞は自製（FGFR2b分子をコードするプラスミド（Ornitz DM, X u J, Colvin JS, McEwen DG, MacArthur CA, Coulier F, gao D, Goldfarb M (1996) J Biol Chem 271, 15292-15297.)を用いて、 Rlc/BaF3細胞の作製方法と同様にして作 製した。）をミュータント FGF18タンパク質と共に培養し、一定時間後の 3H-チミジン取 り込みによって細胞の DNA合成 (増殖)を測定した結果を図 6に示す。
[0082] 全長マウス FGF18タンパク質はこれまで FGFR2bに対して反応することが報告されて いなかつたが、この実験結果から、 R2b/BaF3細胞に対する弱い増殖促進活性を持 つことがわかる。それと同様に Δ 4〜 Δ 95のミュータント FGF18タンパク質も R2b/BaF3 細胞に対する弱い増殖促進活性を持つことがわ力る。
[0083] (7)内在性 FGF受容体を有する NIH3T3細胞に対するミュータント FGF18タンパク質 の増殖促進活性
NIH3T3細胞は本来 FGF受容体を有するため、その細胞に対してミュータント FGF1 8タンパク質が増殖促進活性を有する力否かを調べた。 NIH3T3細胞 (ATCCより入手 )を血清飢餓処理したのち、ミュータント FGF18タンパク質とともに培養し、一定時間 後の 3H-チミジン取り込みによって細胞の DNA合成 (増殖)を測定した結果を図 7に 示す。
[0084] 全長マウス FGF18タンパク質と Δ 4ミュータント FGF18タンパク質は NIH3T3細胞に対 する増殖促進活性を持つことがわかる。また、 Δ 12〜Δ 37はごく弱い増殖促進活性 を持つことがわかる。また、 Δ 48〜Δ 96は増殖促進活性を持たないことがわかる。
[0085] このことから、 FGFR4とは反応し、 FGFRlcとは反応しな!ヽ Δ 12〜 Δ 22のミュータント FGF18タンパク質を用いれば、 NIH細胞に対する作用を惹起せずに FGFR4により伝 達される細胞反応を惹起できることがわかる。
[0086] 上記の実験においては、タグ付きのミュータント FGF18タンパク質の活性を測定した 力 タグは FGF18の受容体結合ドメインと考えられる領域力 離れた C末端の後に付 カロされているため、タグの有無により受容体との結合には影響がないと考えられる。さ らに、 FGF18のへパリン結合ドメインも受容体結合ドメインの近傍にあるが、本実験で 用いたタグ付きのミュータント FGF18タンパク質はへパリンとの結合ァフィユティーを 高いレベルで維持しており、このことからも、タグの有無により活性は変化しないもの と考えられる。
[0087] また、上記の実験データはマウスミュータント FGF18タンパク質のものである力 ヒト とマウスの FGF18全長（配列番号 1と 12)では、アミノ酸が異なるのはたった一力所で 、それ以外は完全に同一であり、し力も異なる 1アミノ酸は C末から 25アミノ酸程度の 位置であり、上記の実験で作製した一連のミュータント FGF18タンパク質で欠損をさ せた部位とは無関係であることから、本発明のミュータント FGF18タンパク質について は、ヒトとマウスでほぼ同じ結果が出ると考えられる。
[0088] (8)ミュータント FGF18タンパク質の発毛養毛活性
体毛が毛成長周期上で休止期（テロジ ン）にある、生後 7週令の C3H/HeNマウス (ォス）を複数用いる。それらのマウス背部の毛を短く刈り、皮下にミュータント FGF18 タンパク質を 1匹当たり 1マイクログラムを生理食塩水溶液として注射する。 3週間後 から 5週間後にかけて、背部皮膚を観察し、毛包の成長周期進行を評価する。皮膚 が黒ずんできたら毛成長周期上で成長期が開始したことがわかる。さらに外観上毛 が生えてきたら、成長期がさらに進行して 、ることがわ力る。
[0089] (9)ミュータント FGF18タンパク質の骨形成活性
マウス長管骨骨幹端部の骨欠損モデルとして、動物実験として生後 10週令の ICR マウス (ォス）を複数用いる。それらのマウスを麻酔下、頸骨近位に歯科用ドリルで直 径 lmmの円型の骨孔を穿つ。骨孔よりドリルを骨髄内に進め、海綿骨を掘削し、対側 の皮質骨の手前まで骨欠損を作製する。欠損部分に FGF18を含浸させたハイドロゲ ルを充填する。対照として生理食塩水を用いる。閉創し、回復時は特に制限無く飼育 する。 自然経過をマクロ、放射線学的、組織学的に評価する。
産業上の利用可能性
[0090] 本発明のミュータント増殖因子タンパク質は、天然分泌型 FGF18の受容体に対する 反応特異性と異なる受容体特異性を有する。本発明のミュータント増殖因子タンパク 質により、天然分泌型 FGF18が惹起する生命現象を調節することができる。
配列表フリーテキスト
[0091] <配列番号 1 >
配列番号 1は、ヒト FGF18全長（—シグナルペプチド）のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 2>
配列番号 2は、ヒト A 4-FGF18のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 3 >
配列番号 3は、ヒト Δ 12-FGF18のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 4>
配列番号 4は、ヒト Δ 16-FGF18のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 5 >
配列番号 5は、ヒト Δ 18-FGF18のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 6 >
配列番号 6は、ヒト Δ 22-FGF18のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 7>
配列番号 7は、ヒト Δ 37-FGF18のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 8 >
配列番号 8は、ヒト A 48-FGF18のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 9 >
配列番号 9は、ヒト Δ 67-FGF18のアミノ酸配列を示す。
く配列番号 10 >
配列番号 10は、ヒト Δ 77-FGF18のアミノ酸配列を示す。 <配列番号 11 >
配列番号 11は、ヒト Δ 95-FGF18のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 12〉
配列番号 12は、マウス FGF18全長（一シグナルペプチド）のアミノ酸配列を示す。 く配列番号 13〉
配列番号 13は、マウス A 4-FGF18のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 14 >
配列番号 14は、マウス Δ 12-FGF18のアミノ酸配列を示す。
く配列番号 15〉
配列番号 15は、マウス Δ 16-FGF18のアミノ酸配列を示す。
く配列番号 16 >
配列番号 16は、マウス Δ 18-FGF18のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 17 >
配列番号 17は、マウス Δ 22-FGF 18のアミノ酸配列を示す。
く配列番号 18 >
配列番号 18は、マウス Δ 37-FGF18のアミノ酸配列を示す。
く配列番号 19 >
配列番号 19は、マウス A 48-FGF18のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 20〉
配列番号 20は、マウス Δ 67-FGF18のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 21 >
配列番号 21は、マウス Δ 77-FGF18のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 22 >
配列番号 22は、マウス Δ 95-FGF18のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 23〉
配列番号 23は、ヒト FGF18全長（一シグナルペプチド）をコードする DNA配列を示す
<配列番号 24 > 配列番号 24は、ヒト Δ 4 - FGF18をコードする DNA配列を示す。
く配列番号 25 >
配列番号 25は、ヒト Δ 12-FGF18をコードする DNA配列を示す。
<配列番号 26 >
配列番号 26は、ヒト Δ 16-FGF18をコードする DNA配列を示す。
く配列番号 27 >
配列番号 27は、ヒト Δ 18-FGF18をコードする DNA配列を示す。
<配列番号 28 >
配列番号 28は、ヒト Δ 22- FGF18をコードする DNA配列を示す。
<配列番号 29 >
配列番号 29は、ヒト Δ 37-FGF18をコードする DNA配列を示す。
く配列番号 30 >
配列番号 30は、ヒト A 48-FGF18をコードする DNA配列を示す。
く配列番号 31 >
配列番号 31は、ヒト Δ 67-FGF18をコードする DNA配列を示す。
<配列番号 32 >
配列番号 32は、ヒト Δ 77-FGF18をコードする DNA配列を示す。
く配列番号 33 >
配列番号 33は、ヒト Δ 95-FGF18をコードする DNA配列を示す。
<配列番号 34 >
配列番号 34は、マウス FGF18全長（一シグナルペプチド）をコードする DNA配列を 示す。
く配列番号 35 >
配列番号 35は、マウス A 4-FGF18をコードする DNA配列を示す。
<配列番号 36 >
配列番号 36は、マウス Δ 12-FGF18をコードする DNA配列を示す。
<配列番号 37 >
配列番号 37は、マウス Δ 16-FGF18をコードする DNA配列を示す。 <配列番号 38 >
配列番号 38は、マウス Δ 18-FGF18をコードする DNA配列を示す。
<配列番号 39 >
配列番号 39は、マウス Δ 22- FGF18をコードする DNA配列を示す。
<配列番号 40 >
配列番号 40は、マウス Δ 37-FGF18をコードする DNA配列を示す。
<配列番号 41 >
配列番号 41は、マウス Δ 48- FGF18をコードする DNA配列を示す。
<配列番号 42 >
配列番号 42は、マウス Δ 67-FGF18をコードする DNA配列を示す。
<配列番号 43 >
配列番号 43は、マウス Δ 77-FGF18をコードする DNA配列を示す。
<配列番号 44 >
配列番号 44は、マウス Δ 95-FGF18をコードする DNA配列を示す。
<配列番号 45 >
配列番号 45は、 FLAG- Hisタグのアミノ酸配列を示す。
<配列番号 46 >
配列番号 46は、 FLAG- Hisタグの DNA配列を示す。
<配列番号 47 >
配列番号 47は、ヒト FGF18のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
<配列番号 48 >
配列番号 48は、ヒト FGF18のシグナルペプチドの DNA配列を示す。
<配列番号 49 >
配列番号 49は、マウス FGF18のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
<配列番号 50 >
配列番号 50は、マウス FGF18のシグナルペプチドの DNA配列を示す。
く配列番号 51 >
配列番号 51は、マウス FGF18全長（シグナル配列も含む全長）をコードする cDNAを 増幅するためのプライマー（センスプライマー）の DNA配列を示す。
く配列番号 52 >
配列番号 52は、マウス FGF18全長（シグナル配列も含む全長）をコードする cDNAを 増幅するためのプライマー（アンチセンスプライマー）の DNA配列を示す。
く配列番号 53 >
配列番号 53は、プライマー #468の DNA配列を示す。
<配列番号 54 >
配列番号 54は、プライマー #469の DNA配列を示す。
<配列番号 55 >
配列番号 55は、プライマー #466の DNA配列を示す。
<配列番号 56 >
配列番号 56は、プライマー #467の DNA配列を示す。
く配列番号 57 >
配列番号 57は、マウス FGF18全長（シグナル配列を含まな 、）をコードする cDNAを 増幅するためのプライマー（センスプライマー）の DNA配列を示す。
<配列番号 58 >
配列番号 58は、プライマー #226の DNA配列を示す。
<配列番号 59 >
配列番号 59は、プライマー #249の DNA配列を示す。
<配列番号 60 >
配列番号 60は、プライマー #262の DNA配列を示す。
<配列番号 61 >
配列番号 61は、プライマー #268の DNA配列を示す。
<配列番号 62 >
配列番号 62は、プライマー #280の DNA配列を示す。
<配列番号 63 >
配列番号 63は、プライマー #325の DNA配列を示す。
<配列番号 64 > 配列番号 64は、プライマー #358の DNA配列を示す。
<配列番号 65 >
配列番号 65は、プライマー #415の DNA配列を示す。
<配列番号 66 >
配列番号 66は、プライマー #445の DNA配列を示す。
<配列番号 67 >
配列番号 67は、プライマー #498の DNA配列を示す。
<配列番号 68 >
配列番号 68は、マウス FGF18全長（シグナル配列を含まな 、）をコードする cDNAを 増幅するためのプライマー #537 (アンチセンスプライマー）の DNA配列を示す。 <配列番号 69 >
配列番号 69は、ヒト FGF18全長（シグナル配列も含む全長）をコードする cDNAを増 幅するためのプライマー（センスプライマー）の DNA配列を示す。
<配列番号 70 >
配列番号 70は、ヒト FGF18全長（シグナル配列も含む全長）をコードする cDNAを増 幅するためのプライマー（アンチセンスプライマー）の DNA配列を示す。
く配列番号 71 >
配列番号 71は、ヒトミュータント FGF18の C末端に FLAG- Hisタグが付!、たタンパク質 をコードする cDNAを増幅するためのプライマー（プライマー #325の代わりに使える） の DNA配列を示す。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の (a)、（b)、（c)又は (d)の 、ずれかのタンパク質。
(a)天然分泌型繊維芽細胞増殖因子 18の N末端から 1個以上のアミノ酸を欠損させる ことにより、繊維芽細胞増殖因子受容体特異性が変化したミュータントタンパク質
(b) (a)のミュータントタンパク質のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ天然分泌型繊維芽細胞増殖 因子 18と比べて繊維芽細胞増殖因子受容体特異性が変化したタンパク質
(c)分泌シグナル配列及び Z又はタグ配列が付加された (a)又は (b)のタンパク質
(d)機能に影響を与えな 、修飾がなされた (a)、（b)又は (c)のタンパク質
[2] (a)のミュータントタンパク質力 配列番号 2〜： L 1又は 13〜22のいずれかのアミノ酸 配列からなる請求項 1記載のタンパク質。
[3] (a)のミュータントタンパク質力 配列番号 24〜33又は 35〜44のいずれかの DNA 配列にコードされる請求項 2記載のタンパク質。
[4] (a)のミュータントタンパク質が、天然分泌型繊維芽細胞増殖因子 18のメチォニンを 除く N末端力も 4個以上 22個以下のいずれかの数のアミノ酸を欠損させたものである 請求項 1〜3のいずれかに記載のタンパク質。
[5] 請求項 1〜4のいずれかに記載のタンパク質を含有する医薬組成物。
[6] 繊維芽細胞増殖因子受容体第 4遺伝子産物と反応して細胞機能を調節するため の請求項 5記載の医薬組成物。
[7] 発毛または育毛調節のための請求項 5記載の医薬組成物。
[8] 骨形成調節または軟骨形成調節のための請求項 5記載の医薬組成物。
[9] 天然分泌型繊維芽細胞増殖因子 18の N末端から 1個以上のアミノ酸を欠損させるこ とを含む、繊維芽細胞増殖因子受容体特異性が変化したミュータントタンパク質を作 製する方法。
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