CN113292646A - Glp-1/胰高血糖素双重激动剂融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种GLP‑1/胰高血糖素双重激动剂及其应用。具体地，本发明提供了一种GLP‑1突变蛋白，同时具有结合并激活B类G蛋白偶联受体GLP‑1R的活性和胰高血糖素受体的活性。通过施用该化合物，能够通过胰高血糖素活性增加热量消耗，有效降低体重，从而缓解或预防与肥胖相关的或其他代谢性疾病。

Description

GLP-1/胰高血糖素双重激动剂融合蛋白
技术领域
本发明属于生物技术或生物医药领域，具体涉及一种GLP-1(Glucagon-likepeptide，GLP-1)/胰高血糖素双重激动剂融合蛋白。
背景技术
肥胖症是指机体脂肪总含量过多和/或局部含量增多及分布异常，是由遗传和环境等多种因素共同作用而导致的慢性代谢性疾病。肥胖主要包括3个特征：脂肪细胞的数量增多、体脂分布的失调以及局部脂肪沉积。肥胖症是全世界重大且日益增长的健康问题，并且与许多危及生命的疾病如心血管疾病、肾脏病、高血压、中风、不育、呼吸功能障碍和2型糖尿病等相关。
目前，美国FDA批准的治疗肥胖症药物主要有环丙甲羟二羟吗啡酮(纳曲酮)/安非他酮、氯卡色林、芬特明/托吡酯、奥利司他、利拉鲁肽、马吲哚(已退市)和盐酸甲基苯丙胺(已退市)。芬特明/托吡酯
Figure BDA0003003163990000011
是FDA于2012年批准上市的减肥复方制剂，用于BMI大于30kg/m2和27kg/m2且伴有一种或多种肥胖相关疾病如高血压、2型糖尿病和血脂异常。盐酸氯卡色林是5-羟色胺5-HT2C激动剂，由Arena研发，并于2013年6月在美国首次上市，用于治疗肥胖症，但氯卡色林的潜在风险超过了其益处。马吲哚是一种拟交感神经胺，于1973年由诺华公司在美国首次上市，作为抑制肥胖症的短期食欲抑制剂。但是，由于商业原因，该产品于2002年退出市场。GLP-1受体激动剂最早用于2型糖尿病药物上市，在控制血糖的同时具有良好的减肥效果。利拉鲁肽是作为糖尿病药物上市的，能降低5％体重，FDA已批准其用于肥胖症的治疗。目前索马鲁肽(Semaglutide)和度拉糖肽(Dulaglutide)已经在3期临床用于肥胖症的治疗。GLP-1受体激动剂是较有前景的减肥药物。
虽然目前GLP-1受体激动剂具有良好的减肥效果，但在具体的临床应用中，其降低肥胖患者体重的效果仍无法满足临床需求。
因此，本领域迫切需要开发一种能够显著控制患者体重的药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能够显著控制患者体重的药物。
本发明的另一目的是提供一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物Fc融合蛋白，具有长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和胰高血糖素(GCG)双重激动剂制备减肥药物的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)突变蛋白，所述GLP-1突变蛋白的氨基酸序列是基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第2、10、18、20、21、23和/或24位具有选自下组的氨基酸残基的多肽序列：
第2位是Gly或Ser，
第10位是Leu或Tyr，
第18位是Arg或Ala，
第20位是Lys或Gln，
第21位是Glu或Asp，
第23位是Ile或Val，和
第24位是Ala或Gln；
并且，所述GLP-1突变蛋白同时具有结合并激活B类G蛋白偶联受体GLP-1R的活性和结合胰高血糖素受体的活性。
在另一优选例中，所述GLP-1突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7、8、9中任一项所示。
在另一优选例中，所述GLP-1突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在另一优选例中，所述的GLP-1突变蛋白除所述突变(如第2、10、18、20、21、23和/或24位氨基酸残基)外，其余的氨基酸序列与SEQ ID NO:3所示的序列相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的基本相同是至多有10个(较佳地为1-8个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白仍同时具有结合并激活B类G蛋白偶联受体GLP-1R的活性和结合胰高血糖素受体的活性。
在另一优选例中，所述GLP-1突变蛋白可以是被修饰的或未被修饰的。
在另一优选例中，所述GLP-1突变蛋白是经利拉鲁肽侧链修饰的，所述利拉鲁肽侧链为为Nα-棕榈酰基-L-谷氨酸-γ-琥珀酰亚胺基-A-叔丁酯(Pal-Glu-(OSu)-OtBu)。
在另一优选例中，所述利拉鲁肽侧链的结构如下所示：
Figure BDA0003003163990000031
在另一优选例中，所述GLP-1突变蛋白中，对应于SEQ ID NO:7所示序列的第12或20位的Lys被利拉鲁肽侧链修饰。
在本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白从N端到C端具有如式II所示的结构，
A-B-C-D(式II)
式中，
A为无或信号肽；
B为如本发明第一方面所述的GLP-1突变蛋白；
C为连接肽；
D为Fc片段；
“-”为肽键。
在另一优选例中，所述连接肽的氨基酸序列为(G4S)nA或其变体，其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)，优选地，n＝3。
在另一优选例中，所述(G4S)n的变体包括：将所述序列中性能相近或相似的氨基酸进行取代所获得的(G4S)nA接头序列的变体，如将一个或多个S分别突变为T；或者在所述序列中插入1-3个氨基酸。
在另一优选例中，所述接头序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一优选例中，所述Fc片段为免疫球蛋白IgG的Fc片段，所述的IgG选自下组：IgG1、IgG2、IgG4，较佳地为IgG4。
在另一优选例中，所述Fc片段包括IgG4的铰链区、CH2和CH3结构域。
在另一优选例中，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在另一优选例中，所述融合蛋白具有选自下组的氨基酸序列：
(a)如SEQ ID NO:12、13或14所示的序列；
(b)与SEQ ID NO:12、13或14所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％或90％，更佳地至少为95％，更佳地至少为98％，更佳地至少为99％的氨基酸序列；
并且，所述的融合蛋白同时具有结合并激活B类G蛋白偶联受体GLP-1R的活性和结合胰高血糖素受体的活性。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明第一方面所述的GLP-1突变蛋白或本发明第二方面所述的融合蛋白。
在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体包括如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第四方面所述的载体，或染色体中整合有外源的如本发明第三方面所述的多核苷酸，或表达如本发明第一方面所述的GLP-1突变蛋白或表达如本发明第二方面所述的融合蛋白。
在本发明的第六方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述的GLP-1突变蛋白或如本发明第二方面所述的融合蛋白的方法，包括步骤：
(i)在合适的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞，获得含有如本发明第一方面所述的GLP-1突变蛋白或如本发明第二方面所述的融合蛋白的混合物；和
(ii)对步骤(i)中得到的混合物进行纯化和/或分离，从而获得如本发明第一方面所述的GLP-1突变蛋白或如本发明第二方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述方法还包括以下步骤：
(iii)对步骤(ii)获得的如本发明第一方面所述的GLP-1突变蛋白或如本发明第二方面所述的融合蛋白进行Boc修饰；
(iv)对所述的Boc修饰的GLP-1突变蛋白或融合蛋白进行Fmoc修饰，从而制得Fmoc和Boc修饰的GLP-1突变蛋白或融合蛋白；
(v)对所述的Fmoc和Boc修饰的GLP-1突变蛋白或融合蛋白进行脱Boc处理，并将其与利拉鲁肽侧链进行反应，从而制得Fmoc修饰的GLP-1突变蛋白或融合蛋白；和
(vi)对所述的Fmoc修饰的如本发明第一方面所述的GLP-1突变蛋白或如本发明第二方面所述的融合蛋白进行脱Fmoc处理，从而制得具有利拉鲁肽侧链修饰GLP-1突变蛋白或融合蛋白。
在另一优选例中，所述Boc修饰的GLP-1突变蛋白或融合蛋白的第20位为保护赖氨酸，并且，所述的保护赖氨酸为Nε-(叔丁氧羰基)-赖氨酸。
在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(I)如本发明第一方面所述的GLP-1突变蛋白，或如本发明第二方面所述的融合蛋白；和
(II)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物中还含有其他可用于预防和/或治疗与肥胖相关的疾病的药物。
在另一优选例中，所述的与肥胖相关的疾病包括：I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、肥胖症以及非酒精性脂肪肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
在本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的GLP-1突变蛋白或如本发明第二方面所述的融合蛋白的用途，用于制备一药物，所述药物用于：
(i)控制有所需要的对象的体内的血糖含量；
(ii)降低有所需要的对象的体内的血脂含量；
(iii)降低有所需要的对象的体重，或抑制体重增长；和/或
(iv)降低有所需要的对象的肝脏脂肪含量，或降低肝脏纤维化程度。
在另一优选例中，所述的药物用于降低有所需要的对象的体重，或抑制体重增长。
在另一优选例中，所述药物用于预防和/或治疗与肥胖相关的疾病的药物。
在本发明的第九方面，提供了一种预防和/或治疗与肥胖相关的疾病的方法，向有所需要的对象施用有效量的如本发明第一方面所述的GLP-1突变蛋白、如本发明第二方面所述的融合蛋白或如本发明第七方面所述的药物组合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了分别用毛细管电泳仪测定得到的融合蛋白的非还原样品和还原样品的纯度。
图2显示了受试物反复给药对DIO小鼠随机体重的影响(Mean，n＝6)。注：SC1、SC2表示第1次、第2次皮下注射给药，并以此类推。
图3显示了受试物反复给药对DIO小鼠随机体重下降百分率的影响(Mean，n＝6)。注：SC1、SC2表示第1次、第2次皮下注射给药，并以此类推。
图4显示了受试物及对照药反复给药对DIO小鼠的摄食量影响。备注：D1、D2为首次给药后第1天、第2天，并以此类推。
图5显示了受试物及对照药反复给药对DIO小鼠的累积摄食量影响。
图6显示了受试物及对照药反复给药对DIO小鼠的饮水量的影响。
图7显示了受试物及对照药反复给药对DIO小鼠脂肪重量的影响。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种具有GLP-1和胰高血糖素双重活性的GLP-1突变体及融合蛋白。实验结果表明，具有本发明的突变的GLP-1突变体或融合蛋白同时具有结合并激活B类G蛋白偶联受体GLP-1R的活性和结合胰高血糖素受体的活性。因此，本发明的GLP-1突变蛋白和其融合蛋白能够有效增加热量消耗、降低体重，从而有效地预防和/或治疗II型糖尿病、肥胖以及非酒精性脂肪肝等与肥胖相关的疾病。在此基础上完成了本发明。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)
胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide，GLP-1)是一种胃肠多肽激素，主要由人三种组织分泌：肠道末端的L细胞、胰腺的α细胞和中枢神经系统(CNS)。GLP-1的前体高血糖素原(proglucagon)基因位于人2号染色体，转录翻译后在L细胞中被激素原转化酶PC1/3酶切为oxyntomodulin(OXM)、intervening peptide-1(IP-1)、GLP-1、GLP-2，随后GLP-1被DPP-4或者NEP-24.11酶切降解，最后在肾脏中排泄。GLP-1对血糖调节的作用主要包括：促进胰岛素合成和分泌、延缓胃排空、诱发饱腹感、抑制胰高血糖素分泌和促进胰腺β细胞再生等。GLP-1通过结合并激活B类G蛋白偶联受体(GPCR)GLP-1R发挥其效应。
在正常生理状态下，其主要生理功能是刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制胰α细胞分泌胰高血糖素，抑制食欲，延缓胃排空，尤为重要的是，GLP-1的促胰岛素分泌作用依赖于血糖浓度。在II型糖尿病病人中，GLP-1的促胰岛素和抑制胰高血糖素分泌功能受损，但没有完全消失，能够被生理浓度或者超生理浓度的GLP-1修复。给II型糖尿病病人持续注射GLP-1能改善血糖控制和降低体重。因此GLP-1是治疗II型糖尿病的很好的药物靶标。
目前已被FDA批准上市的GLP-1受体激动剂有早期的短效激动剂：艾塞那肽(一天给药两次)、利拉鲁肽、利西拉来(一天给药一次)及近期的长效激动剂(一周给药一次)艾塞那肽微球剂型、阿必鲁肽、杜拉鲁肽和索玛鲁肽。其中杜拉鲁肽是通过融合表达GLP-1与人免疫球蛋白IgG4的Fc端，从而使GLP-1在血液中的半衰期延长。IgG4在体内的半衰期大约21天，然而上市药物GLP-1-Fc融合蛋白(杜拉鲁肽)在体内的半衰期只有4.5-4.7天。杜拉鲁肽以二聚体的形式存在，单体分子量为29.8kDa，分子较小，能够通过肾小球滤过膜，加速清除。
胰高血糖素(Glucagon)
胰高血糖素同样由胰高血糖素原转化而来，通过结合并激活胰高血糖素受体(Glucagon receptor)，启动相应信号通路，调节糖异生和糖原分解来升高血糖，这与GLP-1的生理效应是相反的。胰高血糖素受体同样属于B型GPCR，属于七次跨膜蛋白，其胞外区(Extracelluar domain,ECD)是与胰高血糖素结合的主要结构域。已有研究表明胰高血糖素能够抑制食欲，较少食物摄取，同时具有降解脂肪和降低体重的效应。
本发明GLP-1突变蛋白以及融合蛋白
在本发明中，提供了一种GLP-1突变蛋白以及一种包含所述GLP-1突变蛋白的融合蛋白。
如本文所用，术语“GLP-1突变蛋白”、“GLP-1突变体”、“GLP-1突变多肽”可互换使用，均指本发明中的同时具有结合并激活B类G蛋白偶联受体GLP-1R的活性和结合胰高血糖素受体的活性的GLP-1突变蛋白。
优选地，本发明所述的GLP-1突变蛋白具有如SEQ ID NO:7、8或9所示的氨基酸序列。
如本文所用，术语“融合蛋白”、“本发明融合蛋白”、“Fc融合蛋白”可互换使用，是指包含本发明所述的GLP-1突变蛋白和Fc区的融合蛋白，同时具有结合并激活B类G蛋白偶联受体GLP-1R的活性和结合胰高血糖素受体的活性。
优选地，本发明所述的融合蛋白具有如SEQ ID NO:12、13或14所示的氨基酸序列。
如本文所用，术语“GLP-1突变蛋白”或“融合蛋白”、还包括具有上述活性的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述GLP-1突变蛋白或融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明GLP-1突变蛋白或融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与本发明的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
此外，还可以对本发明GLP-1突变蛋白或融合蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
术语“本发明的多核苷酸”可以是包括编码本发明GLP-1突变蛋白或融合蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或融合蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的GLP-1突变蛋白或融合蛋白的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
本发明的GLP-1突变蛋白或融合蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
表达载体
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明GLP-1突变蛋白或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的融合蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码本发明融合蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码融合蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞(如人参细胞)。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
Fmoc修饰
在生物医药领域中，多肽的用途越来越大，氨基酸是合成多肽技术的基本原料，氨基酸都含有α-氨基和羧基，有些还含有侧链活泼基团，如：羟基、氨基、胍基和杂环等，因此，氨基和侧链活泼基团在接肽反应中都需要保护起来，合成多肽后再脱去保护基团，否者会发生氨基酸的错接和许多副反应。
芴甲氧羰基(Fmoc)为碱敏感保护基，能在浓氨水或二氧六环-甲醇-4N Na OH(30：9：1)以及哌啶、乙醇胺、环己胺、1,4-二氧六环、吡咯烷酮等氨类的50％二氯甲烷溶液中脱去。
在碳酸钠或碳酸氢钠等弱碱性条件下，一般用Fmoc-Cl或Fmoc-OSu引入Fmoc保护基。相对Fmoc-Cl来说，Fmoc-OSu更容易控制反应条件，且副反应较少。在酸性条件下，Fmoc保护基特别稳定，而对碱性条件则非常敏感，故通常与酸敏感保护基Boc或Z一起使用保护含有活泼侧链基团的氨基酸。
Fmoc具有很强的紫外吸收，最大吸收波长为267nm(ε18950)，290nm(ε5280)，301nm(ε6200)，因此可用紫外吸收来检测，给仪器自动多肽合成带来许多方便。再者可与大范围的溶剂、试剂相兼容，机械稳定性高，可用多种载体和多种活化方式等。因此当今多肽合成中最常用的就是Fmoc保护基团。
Fmoc-OSu(芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺)
Figure BDA0003003163990000131
利拉鲁肽侧链
Pal-Glu-(OSu)-OtBu为Nα-棕榈酰基-D-谷氨酸-γ-琥珀酰亚胺基-A-叔丁酯，简称为D型-利拉鲁肽侧链。
Figure BDA0003003163990000132
利拉鲁肽的制备，是先利用基因重组技术得到20位Boc保护赖氨酸的利拉鲁肽主链，即序列Arg34GLP-1(7-37)，再连接利拉鲁肽侧链Pal-Glu-(OSu)-OtBu，从而得到利拉鲁肽。
本发明的主要优点包括：
1)本发明的化合物为Exendin-4类似物的Fc融合蛋白，具有GLP-1和Glucagon双重活性，既能通过GLP-1活性有效控制血糖和降低少量体重，同时又能通过Glucagon活性增加热量消耗，协同降低体重。
2)相对于其他融合蛋白，本发明的融合蛋白1能更有效降低体重，而降低体重，对于肥胖相关疾病患者病情的控制具有重大作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：构建基因文库
根据GLP-1和Glucagon野生型序列每个氨基酸对各自生物活性的贡献程度，设计不同序列的GLP-1/Glucagon双重激动剂，形成一个组合。该组合的氨基酸序列为以下序列：
HX1QGTFTSDX2SKYLDEQX3AX4X5FX6X7WLIAGGPSSGAPPPS(SEQ ID NO:1)
其中，X1为Gly或Ser，
X2为Leu或Tyr，
X3为Arg或Ala，
X4为Lys或Gln，
X5为Glu或Asp，
X6为Ile或Val，
X7为Ala或Gln。
在pcDNA5/FRT载体上插入表达以下氨基酸序列的DNA。在以下DNA序列中，划横线的部分为信号肽序列(MELGLRWVFLVAILEGVQC，SEQ ID NO:2)，其余部分表达GLP-1/Glucagon双重激动剂(HGQGTFTSDLSKYLDEQRAKEFIAWLIAGGPSSGAPPPS，SEQ ID NO:3)。
ATGGAGCTGGGCCTGAGGTGGGTGTTCCTGGTGGCCATCCTGGAGGGCGTGCAGTGCCACGGCCAGGGCACCTTCACCAGCGACCTGAGCAAGTACCTGGACGAGCAGAGGGCCAAGGAGTTCATCGCCTGGCTGATCGCCGGCGGCCCCAGCAGCGGCGCCCCCCCCCCCAGC(SEQ ID NO:4)
将质粒命名为命名为pcDNA5/FRT-Template。
设计一对基因文库PCR扩增引物，下划线为氨基酸多样性位点：
Library-F：GACGAGCAGRSGGCCMAGGASTTCRTHSMCTGG(SEQ ID NO:5)；
Library-R：CAGGTACTTGCTAWRGTCGCTGGTGAAGGTGCCCTGTYSGTG(SEQ ID NO:6)。
以质粒pcDNA5/FRT-Template为模板，用上述引物进行PCR扩增(
Figure BDA0003003163990000151
MaxDNA Polymerase)，胶回收DNA片段。DNA片段用试剂盒进行过末端平滑化、5’端磷酸化以及3’、5’端连接(Blunting Kination Ligation(BKL)Kit)。将连接后的DNA片段转化至感受态细胞DH5α中，于500ml摇瓶过夜培养(LB培养基，含100μg/ml AMP)。用试剂盒大量抽提质粒，命名为pcDNA5/FRT-Library。该质粒为构建完成的基因文库。
实施例2：基因文库转染Flp-In CHO细胞
将质粒pcDNA5/FRT-Library与pOG质粒以1:9比例混合，用转染试剂Lipofectamine2000将混合质粒转染至Flp-In CHO细胞中。24h后进行传代培养，培养基中含有500μg/ml Hygromycin。
待细胞活率恢复稳定后，将细胞稀释，铺板至96孔板中。一共铺板20块96孔板，每孔细胞密度为0.4细胞平均密度/孔，体积为200μl。将96孔板放于恒温CO2培养箱中培养16天。
实施例3：单克隆细胞上清活性检测
在显微镜下观察单克隆细胞形成情况，标记形成单克隆细胞的孔。分别取出相应孔的上清100μl，用培养基稀释2倍。
用表达人类GLP-1受体和CRE-荧光素酶的CHO-K1细胞检测样品的GLP-1活性，阳性对照为100ng/ml的GLP-1。用表达人类Glucagon受体和CRE-荧光素酶的CHO-K1细胞检测样品的Glucagon活性，阳性对照为100ng/ml的Glucagon。选择荧光值均大于阳性对照的克隆。
表1单克隆细胞活性检测结果
克隆编号 ％RLU<sub>GLP-1</sub> ％RLU<sub>Glucagon</sub>
3D9 286 197
6B7 123 156
12C6 183 112
从表1中的结果可以看出，所选择的三个克隆细胞表达的蛋白均具有较强的GLP-1活性和Glucagon活性。
实施例4：单克隆细胞基因测序
将克隆细胞从96孔板用胰酶消化后，使用试剂盒分别提取细胞DNA。将所提取的DNA作为PCR模板，引物CMV-F和BGH PolyA reverse进行PCR扩增，将扩增所得的DNA片段纯化后测序并翻译成氨基酸序列。
表2各克隆对应的氨基酸序列
克隆编号 氨基酸序列 SEQ ID NO:
3D9 HSQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFIAWLIAGGPSSGAPPPS 7
6B7 HSQGTFTSDYSKYLDEQRAKDFIAWLIAGGPSSGAPPPS 8
12C6 HSQGTFTSDYSKYLDEQRAKEFVAWLIAGGPSSGAPPPS 9
实施例5：Fc融合蛋白样品制备
因多肽的半衰期较短，给药频率较高，需要通过不同方式进行长效化。在本实施例中，将多肽通过Linker(SEQ ID NO:10)与Fc片段(SEQ ID NO:11)融合，形成Fc融合蛋白1(SEQ ID NO:12)、Fc融合蛋白2(SEQ ID NO:13)和Fc融合蛋白3(SEQ ID NO:14)。
根据氨基酸序列化学合成相应的基因，并克隆至pcDNA3.1载体上。大量抽提质粒后转染至ExpiCHO-S细胞中(Life Technologies)。转染24小时后加入Feed和Enhancer，并将细胞于恒温摇床中培养，条件为5％、120rpm、32℃。培养7天后将细胞液离心(10000×g)30min，取离心后上清用0.45μm的过滤器过滤。
将滤液加样到磷酸盐缓冲液平衡的MabSelect SuRe柱上。然后用10倍柱床体积的磷酸盐缓冲液淋洗柱子，用50mmol/L的柠檬酸缓冲液(pH3.0)洗脱结合的融合蛋白，并用1mol/L的Tris-HCl溶液中和至pH为7.0。
利用HPLC-SEC检测融合蛋白的纯度，紫外分光光度计测定融合蛋白在280nm处的吸收值，根据融合蛋白的消光系数和纯度计算融合蛋白的含量。
表3融合蛋白相关的氨基酸序列
Figure BDA0003003163990000161
Figure BDA0003003163990000171
实施例6：融合蛋白体外生物活性测定
使用表达人类GLP-1受体和CRE-荧光素酶的CHO-K1细胞进行融合蛋白GLP-1体外活性检测。在96孔板中接种该细胞，密度为50000个细胞/孔/100μL，在37℃、5％CO2条件下培养1小时。
对于每种待测蛋白样品，分别将蛋白溶液从浓度为15nmol/L 4倍梯度稀释9次，每个样品共有10个不同浓度的稀释物。分别取50μL加入到接种细胞的96孔板中，在37℃、5％CO2条件下培养5小时。
将96孔板从培养箱中取出放置室温平衡10分钟，在每个孔中加入100μL反应液，200转/分钟振荡10分钟后，在多功能酶标仪上检测荧光读数。以样品浓度为横坐标，以荧光读数为纵坐标，作曲线并计算每个样品的半数效应浓度(EC50)。结果见表4。
表4融合蛋白体外生物活性测定结果
Figure BDA0003003163990000172
Figure BDA0003003163990000181
实施例7：融合蛋白纯度检测
在本实施例中，用毛细管电泳检测Fc融合蛋白1的纯度。
将融合蛋白稀释至1mg/mL，取95μL稀释后蛋白溶液，加入0.8mol/L碘乙酰胺水溶液5μL，混匀，从而获得非还原检测样品。取95μL稀释后蛋白溶液，加入20巯基乙醇溶液5μL，混匀，从而获得还原检测样品。
用毛细管电泳仪分别检测非还原和还原样品的纯度。结果如图1所示，非还原CE-SDS纯度为98.0％，还原CE-SDS纯度为95.4％。
实施例8：DIO小鼠多次皮下注射给药降低体重实验
在本实施例中，研究了皮下注射Fc融合蛋白1对DIO小鼠体重的影响作用，同时与度拉糖肽和索马鲁肽作药效比较。
用7周龄C57BL/6Nju小鼠，喂养高脂饲料(蛋白质约占20％，脂肪约占60％)12周进行造模。饲养条件：每日12h/12h交替照明，自由采食，温度为20～25℃，相对湿度为40～70％，换气次数为10～15次/小时。
给药前一天根据体重、饮水量及摄食量进行随机分组。组别设计：设Dulaglutide30nmol/kg组、Semaglutide 30nmol/kg组、1个供试品分别设高剂量(30nmol/kg)和低剂量(10nmol/kg)、正常对照组、模型对照组。共6组，每组6只小鼠。
皮下注射给药处理，模型对照组、正常对照组给予0.05ml/10g体重的PBS，一周注射两次，连续4周，共给药8次。定期检测小鼠体重、摄食量、饮水量。
给药结束后，解剖动物，分离肝脏、肾脏、胰腺以及腹股沟脂肪、皮下脂肪、肩胛骨脂肪、肾周脂肪、肠系膜脂肪和附睾脂肪，称重。数据以均值±标准误(X±s)表示，采用Student-t test对数据进行统计学分析。
其中，体重变化的结果如图2、3所示，供试品YJ001A-1在低剂量时降低体重效果与Semaglutide高剂量组相当，而供试品YJ001A-1在高剂量时降低体重效果明显优于相同剂量的Semaglutide；摄食量变化的结果如图4所示；累计摄食量的结果如图5所示，供试品YJ001A-1在不同剂量下均能降低小鼠摄食量，且均低于Semaglutide；饮水量的结果如图6所示；脂肪变化的结果如图7所示，供试品YJ001A-1能显著降低DIO小鼠脂肪体重，效果与Semaglutide相当。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 东莞云璟生物技术有限公司
<120> GLP-1/胰高血糖素双重激动剂融合蛋白
<130> P2020-2650
<150> CN202010479520.0
<151> 2020-05-29
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 多肽设计模板
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X = Gly 或 Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X = Leu 或 Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X = Arg 或 Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X = Lys 或 Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X = Glu 或 Asp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> X = Ile 或 Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> X = Ala 或 Gln
<400> 1
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Gln Xaa Ala Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 信号肽
<400> 2
Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> GLP-1/Glucagon双重激动剂
<400> 3
His Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Gln Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 4
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 编码信号肽和GLP-1/Glucagon双重激动剂的核苷酸序列
<400> 4
atggagctgg gcctgaggtg ggtgttcctg gtggccatcc tggagggcgt gcagtgccac 60
ggccagggca ccttcaccag cgacctgagc aagtacctgg acgagcagag ggccaaggag 120
ttcatcgcct ggctgatcgc cggcggcccc agcagcggcg cccccccccc cagc 174
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 5
gacgagcagr sggccmagga sttcrthsmc tgg 33
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 6
caggtacttg ctawrgtcgc tggtgaaggt gccctgtysg tg 42
<210> 7
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 3D9
<400> 7
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 8
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 6B7
<400> 8
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Gln Arg Ala Lys Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 9
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 12C6
<400> 9
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Gln Arg Ala Lys Glu Phe Val Ala Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 连接序列
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ala
<210> 11
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 12
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Fc融合蛋白1
<400> 12
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
65 70 75 80
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
85 90 95
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
100 105 110
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
115 120 125
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
130 135 140
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
145 150 155 160
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
165 170 175
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
180 185 190
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
195 200 205
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
210 215 220
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
225 230 235 240
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
245 250 255
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
260 265 270
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
275 280
<210> 13
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Fc融合蛋白2
<400> 13
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Gln Arg Ala Lys Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
65 70 75 80
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
85 90 95
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
100 105 110
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
115 120 125
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
130 135 140
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
145 150 155 160
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
165 170 175
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
180 185 190
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
195 200 205
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
210 215 220
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
225 230 235 240
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
245 250 255
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
260 265 270
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
275 280
<210> 14
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Fc融合蛋白3
<400> 14
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Gln Arg Ala Lys Glu Phe Val Ala Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
65 70 75 80
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
85 90 95
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
100 105 110
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
115 120 125
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
130 135 140
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
145 150 155 160
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
165 170 175
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
180 185 190
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
195 200 205
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
210 215 220
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
225 230 235 240
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
245 250 255
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
260 265 270
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
275 280

Claims (10)

1.一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)突变蛋白，其特征在于，所述GLP-1突变蛋白的氨基酸序列是基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第2、10、18、20、21、23、24位具有选自下组的氨基酸残基的多肽序列：
第2位是Gly或Ser，
第10位是Leu或Tyr，
第18位是Arg或Ala，
第20位是Lys或Gln，
第21位是Glu或Asp，
第23位是Ile或Val，和
第24位是Ala或Gln；
并且，所述GLP-1突变蛋白同时具有结合并激活B类G蛋白偶联受体GLP-1R的活性和结合胰高血糖素受体的活性。
2.如权利要求1所述的GLP-1突变蛋白，其特征在于，所述GLP-1突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7、8、9中任一项所示。
3.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白从N端到C端具有如式II所示的结构，
A-B-C-D (式II)
式中，
A为无或信号肽；
B为如权利要求1所述的GLP-1突变蛋白；
C为连接肽；
D为Fc片段；
“-”为肽键。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有选自下组的氨基酸序列：
(a)如SEQ ID NO:12、13或14所示的序列；
(b)与SEQ ID NO:12、13或14所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％或90％，更佳地至少为95％，更佳地至少为98％，更佳地至少为99％的氨基酸序列；
并且，所述的融合蛋白同时具有结合并激活B类G蛋白偶联受体GLP-1R的活性和结合胰高血糖素受体的活性。
5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的GLP-1突变蛋白或权利要求3所述的融合蛋白。
6.一种载体，其特征在于，所述载体包括如权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有如权利要求6所述的载体，或染色体中整合有外源的如权利要求5所述的多核苷酸，或表达如权利要求1所述的GLP-1突变蛋白或表达如权利要求3所述的融合蛋白。
8.一种制备如权利要求1所述的GLP-1突变蛋白或如权利要求3所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)在合适的条件下，培养如权利要求7所述的宿主细胞，获得含有如权利要求1所述的GLP-1突变蛋白或如权利要求3所述的融合蛋白的混合物；和
(ii)对步骤(i)中得到的混合物进行纯化和/或分离，从而获得如权利要求1所述的GLP-1突变蛋白或如权利要求3所述的融合蛋白。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
(I)如权利要求1所述的GLP-1突变蛋白，或如权利要求3所述的融合蛋白；和
(II)药学上可接受的载体。
10.如权利要求1所述的GLP-1突变蛋白或如权利要求3所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备一药物，所述药物用于：降低有所需要的对象的体重，或抑制体重增长。
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