CN107106680A - 具备双受体激动剂活性的融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含两个多肽的异源二聚体融合蛋白，所述第一多肽包含第一肽(P1)、接头(L1)和Fc区(F1)，所述第二多肽包含第二肽(P2)、接头(L2)和Fc区(F2)，其中P1和P2各自独立选自GLP‑1、GLP‑1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽和毒蜥外泌肽类似物；其中F选自IgG Fc、IgA Fc、IgE Fc、IgGM Fc及其类似物；其中所述肽的C‑末端通过接头L与所述Fc区F的N‑末端相连接。在一个实施例中，本文公开的融合蛋白对GLP‑1受体、GIP受体和胰高血糖素受体中的至少两种受体有激动剂活性。

Description

具备双受体激动剂活性的融合蛋白
相关申请的交叉引用
本专利申请根据35U.S.C.§ 1 19(e)要求优先权，并有权享受2014年11月13日提交的美国临时专利申请62/079,518的申请日的权益，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中。
序列表的引用
经USPTO EFS-WEB服务器提交的以下电子版序列表的全部内容，如MPEP § 1730II.B.2(a)(C)中所授权和阐述的，在此通过引用的方式整体明确并入本文中用于所有目的。序列表在电子提交的文本文件上标识如下：文件名：3IPAG3-0004USSeqList_ST25；创建日期：2015年11月13日；大小(字节)：100KB。
介绍
据估计，全世界有超过3.7亿的糖尿病患者，其中约90％患有2型糖尿病。通常，2型糖尿病患者仍产生胰岛素，但是胰岛素不能被身体细胞有效地使用。这主要是因为响应于上升的血糖水平产生的胰岛素的量不足以允许细胞有效摄取葡萄糖并因而降低血糖水平。
前胰高血糖素原是158个氨基酸的前体多肽(参见，例如，sp|P01275|GLUC_HUMANGlucagon，2014年11月10日访问，参考序列为178个氨基酸的肽，包括20个氨基酸的信号肽)，其在不同组织中经加工形成许多不同的胰高血糖素原衍生肽，包括胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和胃泌酸调节素(OXM)。这些肽参与多种生理功能，包括葡萄糖体内平衡、胰岛素分泌、胃排空和肠生长以及食物摄取调节。胰高血糖素为对应于前胰高血糖素原的氨基酸第33至61位的29个氨基酸的肽，而GLP-1以对应于前胰高血糖素原的氨基酸第72至108位的37个氨基酸的肽形式产生。GLP-1(7-36)酰胺或GLP-1(7-37)酸是GLP-1的生物学有效形式，其对GLP-1受体表现出基本上相等的活性。
GLP-1在调节胰岛素分泌、血糖水平以及新陈代谢中发挥重要作用。遗憾的是，它由于DP IV降解以及分子量小，故具有非常短的循环半衰期。为了保持GLP-1活性同时还具有不同程度的对DP-IV降解的抵抗力，已经开发了几种形式的GLP-1类似物。例如GLP-1类似物偶联物和融合蛋白的额外修饰显著增加它们在体内的半衰期。所述修饰包括聚乙二醇化、GLP-1类似物-白蛋白融合蛋白和GLP-1类似物-Fc融合蛋白。由于GLP-1产品用于治疗糖尿病，而糖尿病是一种慢性疾病，故使免疫原性降至最弱也非常重要。
市面上已有几种GLP-1类似物成功推出，其中包括VICTOZATM(Novo Nordisc)和BYETTATM(Bristol Myers Squib)。许多GLP-1类似物处于临床开发的不同阶段。其中一个值得关注的品种是DULAGLUTIDETM(EliLilly)，其已成功完成3期临床开发，与同类品种相比具有突出的疗效数据。DULAGLUTIDETM是GLP-1类似物-Fc融合蛋白。如专利EP 1641823中所公开的，为了获得对二肽基肽酶IV(DP-IV)降解的抵抗力，其GLP-1类似物结构域在第8位的氨基酸处含有甘氨酸取代(即“Gly(8)”)。其Fc结构域是IgG4 Fc类似物。对融合蛋白进行几种修饰以使Fc功能最小化或消除并降低潜在的免疫原性。
葡萄糖依赖性促胰岛素释放多肽(又称胃抑制性多肽，下文称为“GIP”)为42个氨基酸的肽，其具有如2014年11月9日所访问的＞sp|P09681|氨基酸第52-93位序列。像GLP-1一样，GIP可诱导葡萄糖依赖性胰腺β-细胞胰岛素分泌。GIP还具有胰腺外活性，其进一步促进葡萄糖降低。虽然有相似之处，但GLP-1和GIP通过两种不同的机制起作用。在第2位氨基酸具有甘氨酸或丝氨酸取代(即“Gly(2)”或“Ser(2)”)的GIP类似物对DP-IV降解的抵抗力增强(Gault等人，Improved biological activity of Gly2-and Ser2-substitutedanalogues of glucose-dependent insulinotrophic polypeptide，J Endocrinol.176(1)：133-141，2003)。
胰高血糖素是由胰腺分泌的肽激素，其提高血糖水平。当血糖水平降至很低时，胰腺释放胰高血糖素。胰高血糖素促使肝脏将储存的糖原转化为葡萄糖，释放到血液中。高血糖水平刺激胰岛素的释放。胰岛素允许胰岛素依赖性组织摄取和使用葡萄糖。因此，胰高血糖素和胰岛素成为将血糖水平保持在稳定水平的反馈系统的一部分。
GLP-1类似物在患者中显示有限的体重减轻活性。GLP-1、GIP和/或胰高血糖素受体的双重活性激动剂在治疗糖尿病和相关疾病特别是体重减轻方面显示出优异的功效。例如，据报道对GLP-1/GIP两种受体有有效的、均衡的共激动作用的肽在动物和人类研究中显示出协同和优异的功效(Finan等人，Unimolecular dual incretins maximize metabolicbenefits in rodents，monkeys，and humans，Sci.Transl.Med.5(209)：209ra151，2013)。再例如，双重GLP-1/胰高血糖素受体(GLP1R/GCGR)激动剂在动物研究中显示显著的体重减轻，但没有高血糖症的迹象(Day等人，Anew glucagon and GLP-1 co-agonisteliminatesobesity in rodents，Nat.Chem.Biol.(10)：749-757，2009)。胃泌酸调节素对GLP-1和胰高血糖素受体都具有双重激动剂活性，不过与GLP-1和胰高血糖素相比活性较低。基于胃泌酸调节素肽的双重功能，其已被积极研究作为用于治疗肥胖的药物。然而，据报道，包括胃泌酸调节素的抗肥胖药物具有短的体内半衰期和弱的治疗功效，即使以高剂量每天施用三次。因而为改善胃泌酸调节素的体内半衰期或对肥胖的治疗效果已经作了诸多努力。例如，韩国专利925017公开了包括胃泌酸调节素作为用于治疗超重人的活性成分的药物组合物，其通过口服、胃肠外、粘膜、直肠、皮下或经皮途径施用。
在单个肽中，许多肽对GLP-1/GIP受体或GLP-1/胰高血糖素受体具有双重激动剂活性(美国专利申请公布文件2013/0090286)。所述肽通常以化学方法合成并且用聚乙二醇化修饰或与脂肪酸链连接以增加它们在体内的半衰期。所述肽也可以与Fc片段融合或偶联产生肽-Fc融合蛋白，以通过二聚化增强其活性并通过Fc结构域改善它们的体内半衰期。
IgG Fc可以用作载体以延长治疗性肽例如GLP-1类似物的体内半衰期。IgG Fc融合蛋白具有范围从几天到超过一周的体内半衰期(Aavang Tibbie等人，LongerActingGLP-1 ReceptorAgonists and the Potential for Improved CardiovascularOutcomes，A Review of Current Literature，Expert Rev.Endocrinol.Metab.8(3)：247-259，2013)。另一方面，全抗体分子也可以用作治疗性肽的载体。抗体分子可以具有3周以上的体内半衰期(Hinton等人，An engineered human lgG1 antibodywith longerserumhalf-life，J.Immunol.176(1)：346-356，2006)。此外，已对Fc结构域进行修饰以进一步延长其体内半衰期。例如，如美国专利7,217,798中所公开的，将突变T250Q/M428L引入IgG1分子导致IgG1分子的血清半衰期显著增加，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中用于所有目的。如美国专利8,394,925中所公开的，还已进行了其它突变以增加Fc与FcRN的结合亲和力并延长血清半衰期，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中用于所有目的。
Fc融合蛋白常为同源二聚体。然而，也可构建异源二聚体。例如，美国专利7,642,228公开了使用“杵和臼”理念构建抗体和Fc-融合蛋白的异源二聚体，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中用于所有目的。
融合蛋白可以通过重组技术制备。原核和真核系统都可用于表达重组蛋白。由真核系统产生的重组Fc融合蛋白通常是糖基化的，并且某些类型例如IgG1分子也可以具有Fc功能。此外，在哺乳动物系统(如CHO)中表达的分子通常分泌到培养基中。常使用信号肽，并对其进行加工，且在N-末端通常没有甲硫氨酸。
由原核系统例如大肠杆菌表达的重组融合蛋白不具有糖基化。对于在大肠杆菌中表达的融合蛋白，其也经常产生在包涵体中，需要复性变成活性分子。此外，在蛋白质的N-末端添加了甲硫氨酸残基。取决于融合蛋白的N-末端氨基酸，添加的甲硫氨酸可以加工或可以不加工。如果第二个氨基酸具有小的侧链，例如甘氨酸，甲硫氨酸氨基肽酶(MetAP)能够切割N-末端甲硫氨酸。突变MetAP的共转化会降低蛋白酶的特异性。例如，具有三重突变Y168G、M206T和Q233G的工程化大肠杆菌MetAP能够将N-末端甲硫氨酸从大体积氨基酸例如色氨酸和组氨酸上移除(Liao等人，Removal of N-terminal methionine fromrecombinant proteins by engineered E.coli methionine aminopeptidase，ProteinSci.13(7)：1802-1810，2004)。
如果通过化学方法合成，可将非天然氨基酸引入肽。例如，已经将非天然氨基酸氨基异丁酸(Aib)引入GLP-1类似物肽中。含有Gly(8)的GLP-1类似物与天然GLP-1肽相比具有增强的对DP-IV酶降解的抵抗力。然而，进一步优化也是可能的。实验结果表明，在体外猪血浆研究期间，Gly(8)类似物具有159分钟的半衰期，而Aib(8)类似物在6小时后保持完整(Deacon等人，Dipeptidyl peptidase IV resistant analogues of glucagon-likepeptide-1which have extended metabolic stability and improved biologicalactivity，Diabetologia.41(3)：271-278，1998)。Aib(8)类似物也显示更高的GLP-1受体结合亲和力(IC50；Aib8＝0.45nmol/l；Gly8＝2.8nmol/1)。在同一份报告中，结果进一步表明，在用分离胰腺进行的活性研究中，Aib(8)类似物比Gly(8)类似物显示更高的功效。因此，可以将非天然氨基酸引入GLP-1肽，以进一步增强GLP-1类似物的性能。
Gly(8)GLP-1类似物-Fc融合蛋白可以完全通过重组技术产生。通过标准重组技术在GLP-1的第8位氨基酸处将Aib(亦即“Aib(8)”)或D-氨基酸(例如D-Ala)取代引入GLP-1类似物融合蛋白可能是不可行的。可以通过肽合成将Aib(8)或D-氨基酸引入肽中。如专利申请WO2012173422中公开的，化学合成的肽可以通过化学方法偶联至载体(如白蛋白或Fc)；然而Fc上的偶联位点似乎不是特异性的，并且肽与Fc的比率也是可变的，潜在地导致偶联分子的显著异质性。位点特异性偶联和天然化学连接(NCL)可用于产生具有高均一性的GLP-1类似物-Fc融合蛋白。
可将具有期望功效的两个不同的肽(例如，GLP-1类似物和胰高血糖素类似物或GLP-1类似物和GIP类似物)与相同载体(例如，抗体分子或Fc片段)融合/偶联。具有与抗体分子或Fc片段融合/偶联的两个独立肽在选择更理想的肽以及每个靶受体的均衡活性方面允许附加灵活性。可以将重组表达、化学天然连接和/或位点特异性化学偶联的组合应用于产生具有这些双重或多重受体激动剂活性的融合蛋白。
Roche公司的Finan等人(2013)报道GLP-1/GIP受体双重激动剂肽比单独的GLP-1受体激动剂更能增强治疗效果。包括Merck、Zealand Pharmaceuticals和Hanmi ScienceCo在内的几个公司已经进行了研究(Pocai，Unraveling oxyntomodulin，GLPI′senigmatic brother，J.Endocrinol.215：335-346，2012，WO2012173422)，结果显示胃泌酸调节素类似物的治疗效果，所述胃泌酸调节素类似物是GLP-1/胰高血糖素受体共激动剂。之前也已经公开了GLP-1/胰高血糖素受体共激动剂的其它单分子形式。ZP2495在胰岛素抵抗心脏中显示增强的心脏功能(Axelsen等人，Glucagon and A Glucagon-GLP-1 Dual-Agonist Increases Cardiac Performance with Different Metabolic Effects inInsulin-Resistant Hearts，Br.J.Pharmacol.，165∶2736-2748，2012)。DiMarchi和同事的研究表明，单分子胰高血糖素和GLP-1共激动剂消除了啮齿类动物的肥胖(Day等人，A newglucagon and GLP-1 co-agonist eliminates obesity in rodents，Nat.Chem.Biol.10∶749-757，2009)。
已通过酰化(Druce等人，Investigation of structure-activityrelationships of Oxyntomodulin(Oxm)using Oxm analogs，Endocrinol.150(4)：1712-1722，2009)、与Fc结构域偶联(WO 2012/173422)及聚乙二醇化(例如Zp2929)对胃泌酸调节素类似物进行修饰以延长它们在循环中的半衰期。胃泌酸调节素及其类似物对胰高血糖素和GLP-1受体的活性已经大大降低。大多数上面提到的其它单分子共激动剂是通过化学方法合成的，并被聚乙二醇化以延长它们在体内的半衰期。它们通常是单体。
功能性二聚体例如通过与Fc融合可以显著增强上述共激动剂的活性。就GLP-1类似物而言，Lilly公司的DURAGLUTIDETM是与IgG4 Fc融合的GLP-1类似物，其中每个分子中的两个GLP-1类似物平行且是功能性二聚体；而GSK公司的ALBUGLUTIDETM是GLP-1-人血清白蛋白(HSA)融合蛋白，其中每个分子中的两个GLP-1类似物串联。正确的N-末端对GLP-1及其类似物的活性很重要，这可能降低ALBUGLUTIDETM串联中第2个GLP-1类似物的活性。即使这样，令人惊讶的还是看到DURAGLUTIDETM(达1.5mg/剂量)与ALBUGLUTIDETM(每剂量30-50mg)之间的剂量差异。DURAGLUTIDETM显著更高的疗效(或更低剂量)与GLP-1类似物的功能性二聚化的效果一致。
与上述组合物相对照，本说明书考虑了双重受体激动剂/拮抗剂/抑制剂的用途。与天然蛋白质激动剂/拮抗剂/抑制剂或针对单个受体的构建体相比，用本发明公开的双重受体激动剂/拮抗剂/抑制剂获得的功效得到了协同性改善。
概述
本说明书一方面提供了包含两个多肽的融合蛋白。本文公开的融合蛋白可包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含第一肽(P1)、接头(L1)和Fc区(F1)，所述第二多肽包含第二肽(P2)、接头(L2)和Fc区(F2)。所公开的P1和P2肽各自独立为GLP-1、GLP-1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物。所公开的F1和F2 Fc区各自独立为IgG Fc、IgAFc、IgM Fc、IgD Fc、IgE Fc、SEQ ID NO：35或其类似物。所述P1和P2肽的C-末端通过接头L1和L2与F1和F2 Fc区的N-末端相连接。本文公开的融合蛋白可为二聚体，例如同源二聚体和异源二聚体。
本说明书的其他方面提供了包含本文公开的融合蛋白的制剂以及包含本文公开的融合蛋白的药物组合物。
本说明书的其他方面提供了一种通过向需要该治疗的个体施用本文公开的融合蛋白来治疗病症的方法。本文公开的病症包括糖尿病、肥胖、在超重个体中诱导体重减轻或脂肪变性。
本说明书的其他方面提供了用于治疗病症的本文公开的融合蛋白以及本文公开的融合蛋白用于治疗病症的用途。本文公开的病症包括糖尿病、肥胖、在超重个体中诱导体重减轻或脂肪变性。
本说明书的其他方面提供了本文公开的融合蛋白在制备用于治疗病症的药物中的用途。本文公开的病症包括糖尿病、肥胖、在超重个体中诱导体重减轻或脂肪变性。
附图说明
图1显示肽-Fc融合蛋白的示意图。所述肽通过接头与Fc片段的N-末端融合。所述接头具有氨基酸序列(GGGGS)n，其中n＝2、3或4(SEQ ID NO：1)。
图2显示肽-Fc融合蛋白的示意图，所述肽其中之一含有非天然氨基酸(*)。所述肽通过接头与Fc片段的N-末端融合或偶联。所述接头具有带或不带额外修饰的氨基酸序列(GGGGS)n，其中n＝2、3或4(SEQ ID NO：1)。
图3显示肽-Fc融合蛋白的示意图，其中每个肽含有非天然氨基酸(*)。所述肽通过接头与Fc片段的N－末端融合或偶联。所述接头具有带或不带额外修饰的氨基酸序列(GGGGS)n，其中n＝2、3或4(SEQ ID NO：1)。
图4显示天然化学连接反应的示意图。在天然化学连接反应中，无保护肽2(例如，IgG4 Fc类似物)的N－末端半胱氨酸残基的硫醇基团攻击无保护肽1(例如，GLP-1类似物)的C-末端硫酯。这导致形成硫酯中间体3，其重排并导致在连接位点形成天然酰胺(“肽”)键4以形成融合蛋白。
图5显示基于cAMP诱导的活性测定柱形图。
发明详述
本文公开了含有两个肽的开放平台，其中每个肽与载体分子的N-末端融合。这种开放平台允许灵活选择可能有额外修饰的每个肽以便达到对相关受体的活性的理想比例，并实现协同治疗效果。所述肽包括GLP-1、毒蜥外泌肽、GIP、胃泌酸调节肽、胰高血糖素和上述每种肽的类似物。所述载体分子包括Fc片段，例如IgG Fc片段(包括IgG1、IgG2和/或IgG4)、IgAFc片段、IgE Fc片段、IgM Fc片段及其类似物。所述肽通过肽接头与载体分子的N-末端融合。该平台允许构建具有双重激动剂活性的以下两类融合蛋白：a)肽-Fc融合蛋白(图1)；和b)肽-Fc融合蛋白，其中一个或两个肽含有至少一个非天然氨基酸(图2和3)。
融合蛋白可以完全通过重组表达来制备；或者，它可以通过蛋白质天然化学连接(NCL)或位点特异性偶联来制备，其中所述肽通过化学方法进行合成，并且所述载体分子通过重组进行表达。所得分子具有双重受体共激动剂活性，且在某些情况下具有三重受体共激动剂活性。本发明公开的融合蛋白对肥胖、糖尿病及相关病症具有治疗作用。
本说明书公开了融合蛋白。在一个实施例中，本文公开的融合蛋白为同源二聚体融合蛋白，其包含两个多肽，第一多肽包含肽(P1)、接头(L1)和Fc区(F1)，第二多肽包含肽(P1)、接头(L2)和Fc区(F2)。在该实施例的一方面，P1包括GLP-1、GLP-1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物。在该实施例的另一方面，F1和F2各自独立包括IgG Fc、IgA Fc、IgEFc、IgGM Fc或其类似物。在该实施例的又一方面，肽P1和P2的C-末端通过接头L1和L2与Fc区F1和F2的N-末端相连接。
在另一个实施例中，本文公开的融合蛋白为异源二聚体融合蛋白，其包含两个多肽，第一多肽包含第一肽(P1)、接头(L1)和Fc区(F1)，第二多肽包含第二肽(P2)、接头(L2)和Fc区(F2)。在该实施例的一方面，P1和P2各自独立包括GLP-1、GLP-1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物。在该实施例的另一方面，F1和F2各自独立包括IgG Fc、IgAFc、IgE Fc、IgGM Fc或其类似物。在该实施例的又一方面，肽P1和P2的C-末端通过接头L1和L2与Fc区F1和F2的N-末端相连接。
在一个实施例中，所公开的多肽形成二聚体。如果二聚体的两条链相同，则本组合物可形成同源二聚体。如果组合物的各链不同，则本组合物可形成异源二聚体。链可在肽(P1/P2)区或在Fc区不同。在一个实施例中，肽P1和P2不同但Fc区相同。在另一个实施例中，P1和P2不同且Fc区也不同。最后，在一个实施例中，P1和P2链可相同，但各链的Fc区可不同。此外，接头L1和L2可相同或不同。
所公开的融合蛋白包括肽P1和/或P2。在一个实施例中，本发明中的肽P1和P2各自独立选自GLP-1、GLP-1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物。在所公开的多肽相同(P1＝P2)的方面，多肽可具有相同氨基酸序列或可具有不同氨基酸序列。
如本文所用的类似物表示与参考肽、多肽或蛋白质序列不同的肽、多肽或蛋白质序列。这些差异可以是氨基酸的添加、缺失或者取代、磷酸化、硫酸化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等、非天然氨基酸结构的使用或者此项技术中已知的其他此类修饰。
本组合物涵盖蛋白质和肽中的氨基酸取代，其一般不改变蛋白质或肽的活性(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，NewYork，1979)。在一个实施例中，这些取代为“保守”氨基酸取代。最常发生的取代为Ala/Ser、Val/lle、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/lle、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，在两个方向上都可以交换。
如本文所用的术语“非天然氨基酸”是指除了在我们人体中的蛋白质中发现的20种典型氨基酸之外的氨基酸。非天然氨基酸是天然存在或化学合成的非蛋白质氨基酸。它们可以包括但不限于氨基异丁酸(Aib)、β-氨基酸(β3和β2)、高氨基酸、脯氨酸和丙酮酸衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环-取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、线性核心氨基酸、二氨基酸、D-氨基酸和N-甲基氨基酸。
进一步可以通过将咪唑基团与多肽的N-末端氨基酸偶联来修饰N-末端氨基酸。这种咪唑基团可以是4-咪唑并丙酰基(去氨基-组氨酰基)、4-咪唑并乙酰基、5-咪唑并-α，α二甲基-乙酰基。将咪唑基团与本发明的融合肽或其部分偶联可以通过合成化学方法完成。因为本文考虑的各种有机基团中有许多含有羧酸，所以可以类似于将氨基酸添加到多肽的N-末端通过固相蛋白合成来添加咪唑基团。或者，咪唑基团的活化酯可通过标准化学反应方法加入。这些咪唑基团的符号可以用在肽或蛋白质的N-末端之前出现的“CA-”表示。在一个实施例中，咪唑基团是4-咪唑并乙酰基。
氨基酸取代可以用多种方式表示，但在本文中特别用格式“X数字”表示，其中X是取代的氨基酸，上标中的数字是待取代氨基酸的位置，或用格式“X原始数字X取代”表示，其中“X原始”是原始氨基酸(以三字母或单字母格式)，“数字”是待取代氨基酸的位置，“X取代”是取代的氨基酸(以三字母或单字母格式)。例如，Glu22-GLP-1(7-37)OH表示通常在GLP-1(7-37)OH第22位发现的甘氨酸已被谷氨酸取代的GLP-1化合物；Aib8-Glu22-GLP-1(7-37)OH表示通常在GLP-1(7-37)OH第8位发现的丙氨酸以及通常在第22位发现的甘氨酸已分别被Aib和谷氨酸取代的GLP-1化合物。这些变化也可以表示为Gly22Glu GLP-1(7-37)OH或G22E GLP-1(7-37)OH。
如本文所用的术语“序列同源性”或“序列同一性”是指两个多肽序列之间的序列同一性百分比。为了测定两个多肽序列之间的同一性百分比，将这两个序列的氨基酸序列进行比对，优先使用Clustal W算法(Thompson，J D，Higgins D G，Gibson T J，1994，Nucleic Acids Res.22(22)：4673-4680)以及BLOSUM 62评分矩阵(Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919，1992)，将空位开放罚分设为10，空位延伸罚分设为0.1，使得两个序列之间获得最高顺序匹配，其中一个序列的至少50％总长度参与了比对。其他可用于比对序列的方法为Needleman和Wunsch的比对方法(J.Mol.Biol.48：443,1970)，Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482,1981)修改了该方法，使得在两个序列之间获得最高顺序匹配，并在两个序列之间测定相同氨基酸的数目。其他计算两个氨基酸序列之间百分比同一性的方法为本领域一般公认的方法，且包括例如由Carillo和Lipton(SIAM J.Applied Math.48：1073，1988)所描述的方法以及计算分子生物学(Lesk编辑，Oxford University Press，NewYork，1988，Biocomputing：Informatics and GenomicsProiects)中所描述的方法。通常，计算机程序将用于这些计算。可用在这方面的计算机程序包括但不限于GCG(Devereux等人，NucleicAcids Res.，1984，12：387)BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，J.Molec.Biol.，1990：215：403)。在一方面，无论是基于局部序列或是基于全部序列，本发明修饰的融合蛋白与另一个序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在一个实施例中，从前胰高血糖素原获得GLP-1、胰高血糖素和胃泌酸调节素。前胰高血糖素原序列在其内含有胰高血糖素、胰高血糖素样肽1、胰高血糖素样肽2、胃泌酸调节素的肽。可将前胰高血糖素原肽分成如表1所示的各种成熟蛋白序列。在一个实施例中，前胰高血糖素原为SEQ ID NO：2。
GLP-1可在前胰高血糖素原内发现。值得注意的是GLP-1在前胰高血糖素原第115位存在变异，亦即有一个A115V取代。例如，GLP-1可为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。类似地，GLP-1可为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。
如本文所用的术语“GLP-1类似物”是指与GLP-1或GLP-1片段具有足够同源性使得所述类似物具有促胰岛素活性的多肽。文献以及专利申请和专利中已描述和公开了许多GLP-1类似物，如专利EP 1641823，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中用于所有目的。在一个实施例中，GLP-1类似物的氨基酸序列具有1个、2个、3个、4个或5个与SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8相应位置的氨基酸不同的氨基酸。GLP-1类似物序列可为HXEGTFTSDVSSYLEEQAALEFIAWL VKGGG，其中X可以为氨基异丁酸(Aib)、Gly、D-Ala、D-Ser、D-Gly或D-Val(SEQ ID NO：14)；HXEGTFTSDVSSYLEEQAALEFIAWLKNGGG，其中X选自氨基异丁酸(Aib)、Gly、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val(SEQID NO：15)；HXEGTFTSDVSSYLEEQAALEFIAWLVLGGP，其中X选自氨基异丁酸(Aib)、Gly、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val(SEQ ID NO：16)；HXEGTFTSDVSSYLEEQAALEFIAWLKNGGP，其中X选自Gly、氨基异丁酸(Aib)、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val(SEQID NO：17)；HXEGTFTSDVSSYLEEQAALEFIAWLVKGG，其中X选自Gly、氨基异丁酸(Aib)、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val(SEQ ID NO：18)；或HXEGTFTSDVSSYLEEQAALEFIAWLKNGG，其中X选自Gly、氨基异丁酸(Aib)、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val(SEQ ID NO：19)。
在一个实施例中，本文公开的P1和/或P2包含GLP-1肽或GLP-1肽类似物。在该实施例的一些方面，本文公开的P1和/或P2包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19。在该实施例的一些方面，本文公开的P1和/或P2与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有例如至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性。在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有在以下范围内的氨基酸同一性：例如约75％到约100％、约80％到约100％、约85％到约100％、约90％到约100％、约95％到约100％、约75％到约99％、约80％到约99％、约85％到约99％、约90％到约99％、约95％到约99％、约75％到约97％、约80％到约97％、约85％到约97％、约90％到约97％或约95％到约97％。
在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2相对于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2相对于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQID NO：19具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。
GIP可在GIP前体肽序列内发现。在该实施例的一些方面，GIP可为SEQ ID NO：9。如本文所用的术语“GIP类似物”是指与GIP或GIP片段(如GIP (1-30)和GIP (7-30))具有足够同源性使得所述类似物具有促胰岛素活性的多肽。在PCT公布文件WO 1998/024464、PCT公布文件WO 2003/082898以及US专利申请公布文件US 201 1/0144007已描述和/或公开相当多的GIP类似物，在此通过引用的方式明确将所述各公布文件内容全部并入本文中用于所有目的。在一个实施例中，GIP类似物具有1个、2个、3个、4个或5个与SEQ ID NO：9相应位置的氨基酸不同的氨基酸。GIP类似物包括氨基酸序列YXEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ，其中X选自Gly、Val、Lys和Ser、氨基异丁酸(Aib)、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val(SEQ ID NO：20)；或YXEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLA QK，其中X选自Gly、Val、Lys和Ser、氨基异丁酸(Aib)、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val(SEQ ID NO：21)。
在一个实施例中，本文公开的P1和/或P2包含GIP肽或GIP肽类似物。在该实施例的一些方面，本文公开的P1和/或P2包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21。在该实施例的一些方面，本文公开的P1和/或P2与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有例如至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性。在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有在以下范围内的氨基酸同一性：例如约75％到约100％、约80％到约100％、约85％到约100％、约90％到约100％、约95％到约100％、约75％到约99％、约80％到约99％、约85％到约99％、约90％到约99％、约95％到约99％、约75％到约97％、约80％到约97％、约85％到约97％、约90％到约97％或约95％到约97％。
在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2相对于SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：20或SEQID NO：21具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2相对于SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。
如本文所用的毒蜥外泌肽包括毒蜥外泌肽家族的多肽。此类多肽包括毒蜥外泌肽3和/或毒蜥外泌肽4。在一个实施例中，毒蜥外泌肽3对应于SEQ ID NO：10。在一个实施例中，毒蜥外泌肽4对应于SEQ ID NO：11。如本文所用的术语“毒蜥外泌肽类似物”是指与毒蜥外泌肽3、毒蜥外泌肽4或者毒蜥外泌肽3或毒蜥外泌肽4的片段具有足够同源性使得所述类似物能够结合其各自受体并/或结合GLP-1受体以抑制胰岛素释放和维持血糖的多肽。美国专利5,424,286已描述并/或公开许多毒蜥外泌肽类似物，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中用于所有目的。在一个实施例中，“毒蜥外泌肽类似物”包括具有1个、2个、3个、4个或5个与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或氨基酸序列SEQ ID NO：22相应位置的氨基酸不同的氨基酸的肽。
在一个实施例中，本文公开的P1和/或P2包含毒蜥外泌肽3肽、毒蜥外泌肽4肽、毒蜥外泌肽3肽类似物、毒蜥外泌肽4肽类似物。在该实施例的一些方面，本文公开的P1和/或P2包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：22。在该实施例的一些方面，本文公开的P1和/或P2与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：22具有例如至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性。在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：1 1或SEQ ID NO：22具有在以下范围内的氨基酸同一性：例如约75％到约100％、约80％到约100％、约85％到约100％、约90％到约100％、约95％到约100％、约75％到约99％、约80％到约99％、约85％到约99％、约90％到约99％、约95％到约99％、约75％到约97％、约80％到约97％、约85％到约97％、约90％到约97％或约95％到约97％。
在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2相对于SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQID NO：22具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：22具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2相对于SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：22具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：22具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。
胰高血糖素可在前胰高血糖素原肽内发现。在一个实施例中，胰高血糖素对应于SEQ ID NO：12。如本文所用的术语“胰高血糖素类似物”是指与胰高血糖素或胰高血糖素(1-29)片段具有足够同源性使得所述类似物能够激活胰高血糖素受体、抵消胰岛素作用并维持血糖水平的多肽。美国专利8,669,228中已描述并/或公开许多胰高血糖素类似物，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中用于所有目的。在一个实施例中，胰高血糖素类似物具有1个、2个、3个、4个或5个与SEQ ID NO：12相应位置的氨基酸不同的氨基酸。
在一个实施例中，本文公开的P1和/或P2包含胰高血糖素肽或胰高血糖素肽类似物。在该实施例的一些方面，本文公开的P1和/或P2包含SEQ ID NO：12。在该实施例的一些方面，本文公开的P1和/或P2与SEQ ID NO：12具有例如至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性。在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2与SEQ ID NO：12具有在以下范围内的氨基酸同一性：例如约75％到约100％、约80％到约100％、约85％到约100％、约90％到约100％、约95％到约100％、约75％到约99％、约80％到约99％、约85％到约99％、约90％到约99％、约95％到约99％、约75％到约97％、约80％到约97％、约85％到约97％、约90％到约97％或约95％到约97％。
在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2相对于SEQ ID NO：12具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：12具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2相对于SEQ ID NO：12具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：12具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。
在一个实施例中，胃泌酸调节素可在前胰高血糖素原肽内发现。在一个实施例中，胃泌酸调节素对应于SEQ ID NO：13。如本文所用的术语“胃泌酸调节素类似物”是指与胃泌酸调节素或胃泌酸调节素片段具有足够同源性使得所述类似物能够激活GIP-1和胰高血糖素受体的多肽。PCT公布文件WO2012/173422中已描述并/或公开许多胃泌酸调节素类似物，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中用于所有目的。在一个实施例中，胃泌酸调节素类似物具有1个、2个、3个、4个或5个与SEQ ID NO：13相应位置的氨基酸不同的氨基酸。进一步地，胃泌酸调节素为37个氨基酸的肽，其含有胰高血糖素的29个氨基酸序列以及紧接着的SEQ ID NO：41(KRNRNNIA)的8个氨基酸羧基末端延伸。因而，胰高血糖素类似物可进一步通过添加胃泌酸调节素的8个氨基酸羧基末端延伸来修饰是可能的。
在一个实施例中，胃泌酸调节素类似物可为以下序列之一：HXQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNT，其中X为氨基异丁酸(SEQ ID NO：23)；HXQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNT，其中X为氨基异丁酸(SEQ ID NO：24)；HXQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNT，其中X为氨基异丁酸(SEQ ID NO：25)；HXQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNT，其中X为氨基异丁酸(SEQ ID NO：26)；XXQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNT，其中第一个位置的X表示4-咪唑并乙酰基(亦即，CA)，第二个位置的X为氨基异丁酸(SEQ ID NO：27)；HXQGTFTSDYAKYLDEKRAKEFVQWLMNT，其中X为氨基异丁酸(SEQ ID NO：28)；HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA，其中氨基末端H可为或可不为组氨酸的D型对映异构体(SEQ ID NO：29)；YXQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNT，其中X为氨基异丁酸(SEQ IDNO：30)，其中加粗并带下划线的氨基酸表示成环且其中X为氨基异丁酸。
在一个实施例中，本文公开的P1和/或P2包含胃泌酸调节素肽或胃泌酸调节素肽类似物。在该实施例的一些方面，本文公开的P1和/或P2包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30。在该实施例的一些方面，本文公开的P1和/或P2与SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：29或SEQ ID NO：30具有例如至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性。在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2与SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30具有在以下范围内的氨基酸同一性：例如约75％到约100％、约80％到约100％、约85％到约100％、约90％到约100％、约95％到约100％、约75％到约99％、约80％到约99％、约85％到约99％、约90％到约99％、约95％到约99％、约75％到约97％、约80％到约97％、约85％到约97％、约90％到约97％或约95％到约97％。
在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2相对于SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：29或SEQ ID NO：30具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。在该实施例的其他方面，本文公开的P1和/或P2相对于SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQID NO：30具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。
在一个实施例中，P1和/或P2的N-末端氨基酸可为添加的或用于取代天然存在N-末端氨基酸的His或dHis(组氨酸的D型对映异构体)，且P1或P2的N-末端第二个氨基酸可为Gly、氨基异丁酸(Aib)、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val。在该实施例的一个特定方面，P1为GIP-1类似物。在该实施例的又一方面，P1为GIP、GIP类似物、胰高血糖素或胰高血糖素类似物。
本发明融合蛋白可充当双受体激动剂(dual receptor agonist，也可译为双重受体激动剂)。如本文所用的术语“双重受体激动剂”或“双重受体共激动剂”是指能够激活选自GLP-1受体、GIP受体及胰高血糖素受体的两种受体的肽或融合蛋白。
P1和/或P2可单独地或当与Fc融合时充当单分子双重受体激动剂。如本文所用的术语“单分子双重受体共激动剂”是指对至少两种不同受体具有激动剂活性的单个多肽。例如，单分子胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂已公开在美国专利8,454,971中，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中用于所有目的，并由Finan等人进行了描述(Finan等人：″Unimolecular dual incretins maximize metabolic benefits in rodents，monkeys，and humans.″Sci Transl Med.2013Oct 30；5(209)：209)。因此，本发明融合蛋白可为双重受体激动剂或甚至三重受体激动剂。例如，如果P1为单分子双重受体激动剂，P2为单个受体激动剂，那么融合蛋白可对三种受体显示激动剂活性。在该实施例的一方面，融合蛋白可为双重激动剂并对GLP-1受体、GIP受体和胰高血糖素受体中的任两种受体有激动剂活性。在该实施例的另一方面，融合蛋白可为三重激动剂且对GLP-1受体、GIP受体和胰高血糖素受体有激动剂活性。
应注意的是单个P1或P2可对第一受体显示激动剂活性，但对第二受体有拮抗或抑制活性。此外，在一个实施例中，P1可对一种受体有激动剂活性，而P2对另一种受体有拮抗剂活性。
本发明考虑了P1和P2的各种组合。在一个实施例中，P1和P2序列独立选自以下序列：SEQ ID NO：3-30中的任一序列，与SEQ ID NO：3-30相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸添加、缺失或取代的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：3-30中的一个或多个序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
在一个实施例中，融合蛋白中的肽P1或P2中的至少一个为GLP-1类似物，所述GLP-1类似物具有选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列，与SEQ ID NO：14-19相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸添加、缺失或取代的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：14-19中的一个或多个序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
在又一实施例中，融合蛋白中的P1为GLP-1类似物，且融合蛋白中的P2为GIP类似物。在该实施例的一方面，GLP-1类似物可具有选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列，且GIP类似物可含有选自PCT公布文件WO 1998/024464、PCT公布文件WO 2003/082898和US专利申请公布文件US 201 1/0144007中描述和公开的那些序列的氨基酸序列，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中用于所有目的。在该实施例的又一方面，融合蛋白中的P1肽为GLP-1类似物，且融合蛋白中的P2肽为GIP类似物，其中GLP-1类似物含有选自SEQ IDNO：14-19的氨基酸序列；且GIP类似物含有选自SEQ ID NO：20-21的氨基酸序列。
本发明组合物包括两个“Fc片段”或“Fc区”F1与F2。F1和F2可具有相同氨基酸序列或不同氨基酸序列。在一个实施例中，F1和F2能够发生二聚化。如本文所用的术语“Fc片段”或“免疫球蛋白Fc区”是指至少含有免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)的蛋白质。在一个实施例中，Fc区不包括免疫球蛋白的重轻链可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)。Fc区可以进一步包括在重链恒定区的铰链区。另外，本文公开的免疫球蛋白Fc区可以含有Fc区的一部分或全部，包括重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)，但重轻链可变区除外，只要其具有基本上与天然蛋白质相似或比天然蛋白质更佳的生理功能即可。此外，免疫球蛋白Fc区可以是在CH2和/或CH3氨基酸序列的相对长的部分中具有缺失的片段。亦即，本文公开的免疫球蛋白Fc区可以包含1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，5)一个或多个结构域和免疫球蛋白铰链区(或铰链区的一部分)的组合，以及6)重链恒定区和轻链恒定区中各结构域的二聚体。
本文公开的免疫球蛋白Fc区包括天然的氨基酸序列及其序列类似物。氨基酸序列类似物为由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而与天然氨基酸序列不同的序列。
此外，可能有其他各种类似物，包括其中缺失能够形成二硫键的区域或在天然Fc形式的N末端消除某些氨基酸残基或另外添加甲硫氨酸残基的类似物。进一步地，为了去除效应子功能，在补体结合位点例如C1q结合位点和ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)位点可以发生缺失。制备免疫球蛋白Fc区的这些序列类似物的技术公开于WO 1997/034631和WO 1996/032478中。
上述Fc类似物为生物学活性与本文公开的Fc区相同或者结构稳定性例如耐热、pH等得到改善的类似物。
此外，这些Fc区可以从分离自人和包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠的其它动物的天然形式获得，或者可以是从转化的动物细胞或微生物获得的重组体或其衍生物。本文中，它们可以通过从人或动物机体分离完整免疫球蛋白并用蛋白水解酶处理而从天然免疫球蛋白获得。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化成Fab和Fc区，而胃蛋白酶处理导致pF′c和F(ab)2片段产生。对这些片段可以进行例如尺寸排阻色谱层析以分离Fc或pF′c。优选地，人衍生的Fc区是从微生物获得的重组免疫球蛋白Fc区。
在一个实施例中，如果需要，Fc区可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等来修饰。在一个实施例中，本文公开的免疫球蛋白Fc区可以是具有天然糖链、与天然形式相比增加的糖链或与天然形式相比减少的糖链的形式，或者可以是去糖基化形式。免疫球蛋白Fc糖链的增加、减少或去除可以通过本领域常见的方法诸如化学方法、酶法和使用微生物的基因工程方法来实现。从Fc区去除糖链导致对第一补体成分C1的C1q部分的结合亲和力急剧下降，以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性降低或丧失，因此在体内不会诱导不必要的免疫反应发生。在这方面，去糖基化或非糖基化形式的免疫球蛋白Fc区可能更适合用作药物载体。
如本文所用的术语“去糖基化”是指从Fc区酶促去除糖基部分，术语“非糖基化”意指通过优选大肠杆菌的原核生物以非糖基化形式产生Fc区。
在一个实施例中，免疫球蛋白Fc区可以是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM或者通过其组合或其杂合制备的Fc区。优选地，免疫球蛋白Fc区衍生自IgG或IgM，IgG、IgM是人血液中最丰富的蛋白质之一，且免疫球蛋白Fc区最优选衍生自IgG，IgG已知可增加配体结合蛋白的半衰期。
另一方面，如本文所用的术语“Fc组合”意指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽与不同来源的单链多肽连接形成二聚体或多聚体。亦即，二聚体或多聚体可以由两个或两个以上选自由IgGFc、IgAFc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc片段组成的组的片段形成。
如本文所用的术语“lgG4 Fc类似物”是指与lgG4(218-437)具有足够同源性的多肽(参见例如，lgG4 Fc序列SEQ ID NO：31，氨基酸第101-317位)。
同时，模拟抗体的Fc片段或Fc区可经修饰以增加其与新生儿Fc受体(FcRN)的亲和力并进一步延长其体内半衰期。如上所述，Fc常用作载体来延长治疗性肽(如GLP-1类似物)的体内半衰期。Fc融合蛋白具有范围从几天到一周以上的体内半衰期。同时，全抗体分子也可以用作治疗性肽的载体。抗体分子可以具有3周以上的体内半衰期。此外，可对Fc结构域进行修饰以进一步延长抗体分子或Fc融合蛋白的体内半衰期。例如，如美国专利7,217,798中所公开的，将突变T250Q/M428L引入IgG1分子导致IgG1分子的血清半衰期显著增加，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中用于所有目的。如美国专利8,394,925中所公开的，也已进行其它突变以增加Fc与FcRN的结合亲和力并延长血清半衰期，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中用于所有目的。
必要时也可以对Fc区进行另一种被称作“杵和臼”的修饰以便形成异源二聚体。抗体分子具有重链和轻链。将两种不同的肽与抗体分子融合非常方便。Fc融合蛋白常为同源二聚体。然而也可构建异源二聚体。例如，美国专利7,642,228公开了使用杵和臼理念可以构建抗体和Fc融合蛋白的异源二聚体，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中用于所有目的。许多变体已经得到描述。例如，包含空腔的Fc多肽(又称F2)包含两个或两个以上选自由T366S、L368A或Y407V组成的组的氨基酸取代，氨基酸根据Kabat的EU编号方案进行编号；包含突起的Fc多肽(又称F1)包含用色氨酸或酪氨酸取代第366位的苏氨酸，氨基酸根据Kabat的EU编号方案进行编号。
例如，编号对应如表2所示。
用于制备异源二聚体的其他方法也可用于制备IgG Fc。例如，将双点突变F188L和R192K引入如SEQ ID NO：35所示的lgG4 Fc多肽其中之一允许其与没有这两突变的另一lgG4 Fc多肽形成异源二聚体。
在一个实施例中，lgG4 Fc包括氨基酸序列SEQ ID NO：31或其片段。在一个实施例中，lgG4 Fc包括如表3所示的SEQ ID NO：31的以下片段中的一个或多个。
在本发明Fc的一方面，Fc包括：1)lgG4 CH1结构域、lgG4 CH2结构域和lgG4 CH3结构域，2)lgG4 CH1结构域和CH2结构域，3)lgG4 CH1结构域和CH3结构域，4)lgG4 CH2结构域和CH3结构域，5)一个或多个结构域与免疫球蛋白铰链区(铰链区的一部分)的组合，或6)一个或多个lgG4 CH结构域与其他免疫球蛋白亚型的CH结构域或铰链区的组合。
在该实施例的例示性但非限制性方面，lgG4 Fc可包括以下序列中的一个或多个：SEQ ID NO：42的lgG4 CH1、SEQ ID NO：43的lgG4 CH2、SEQ ID NO：44的lgG4 CH3、SEQ IDNO：45的lgG4 CH1和CH2(无铰链)、SEQ ID NO：46的lgG4 CH1和CH3(无铰链)及/或SEQ IDNO：47的lgG4 CH2和CH3(无铰链)。
在一个实施例中，本文公开的F1和/或F2包含lgG4 Fc或lgG4 Fc片段。在该实施例的一些方面，本文公开的F1和/或F2包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47。在该实施例的一些方面，本文公开的F1和/或F2与SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47具有例如至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性。在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2与SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47具有在以下范围内的氨基酸同一性：例如约75％到约100％、约80％到约100％、约85％到约100％、约90％到约100％、约95％到约100％、约75％到约99％、约80％到约99％、约85％到约99％、约90％到约99％、约95％到约99％、约75％到约97％、约80％到约97％、约85％到约97％、约90％到约97％或约95％到约97％。
在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2相对于SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2相对于SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQID NO：47具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：31、SEQID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。
在一个实施例中，lgG1 Fc包括氨基酸序列SEQ ID NO：32或其片段。在一个实施例中，lgG4 Fc包括如表4所示的SEQ ID NO：32的以下片段中的一个或多个。
在本发明Fc的一方面，Fc包括：1)lgG1 CH1结构域、lgG1 CH2结构域和lgG1 CH3结构域，2)lgG1 CH1结构域和CH2结构域，3)lgG1 CH1结构域和CH3结构域，4)lgG1 CH2结构域和CH3结构域，5)一个或多个结构域与免疫球蛋白铰链区(铰链区的一部分)的组合，或6)一个或多个lgG1 CH结构域与其他免疫球蛋白亚型的CH结构域或铰链区的组合。
在该实施例的例示性但非限制性方面，lgG1 Fc可包括以下序列中的一个或多个：SEQ ID NO：48的lgG1：CH1、SEQ ID NO：49的lgG1：CH2、SEQ ID NO：50的lgG1：CH3、SEQ IDNO：51的lgG1：CH1和CH2(无铰链)、SEQ ID NO：52的lgG1：CH1和CH3(无铰链)及/或SEQ IDNO：53的lgG1：CH2和CH3(无铰链)。
在一个实施例中，本文公开的F1和/或F2包含lgG1 Fc或lgG1 Fc片段。在该实施例的一些方面，本文公开的F1和/或F2包含SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53。在该实施例的一些方面，本文公开的F1和/或F2与SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53具有例如至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性。在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2与SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53具有在以下范围内的氨基酸同一性：例如约75％到约100％、约80％到约100％、约85％到约100％、约90％到约100％、约95％到约100％、约75％到约99％、约80％到约99％、约85％到约99％、约90％到约99％、约95％到约99％、约75％到约97％、约80％到约97％、约85％到约97％、约90％到约97％或约95％到约97％。
在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2相对于SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2相对于SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52或SEQID NO：53具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：32、SEQID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。
在一个实施例中，lgG2 Fc包括氨基酸序列SEQ ID NO：33或其片段。在一个实施例中，IgG2 Fc包括如表5所示的SEQ ID NO：33的以下片段中的一个或多个。
在本发明Fc的一方面，Fc包括：1)lgG2 CH1结构域、lgG2 CH2结构域和lgG2 CH3结构域，2)lgG2 CH1结构域和CH2结构域，3)lgG2 CH1结构域和CH3结构域，4)lgG2 CH2结构域和CH3结构域，5)一个或多个结构域与免疫球蛋白铰链区(铰链区的一部分)的组合，或6)一个或多个lgG2 CH结构域与其他免疫球蛋白亚型的CH结构域或铰链区的组合。
在该实施例的例示性但非限制性方面，lgG2 Fc可包括以下序列中的一个或多个：SEQ ID NO：54的lgG2：CH1、SEQ ID NO：55的lgG2：CH2、SEQ ID NO：56的lgG2：CH3、SEQ IDNO：57的lgG2：CH1和CH2(无铰链)、SEQ ID NO：58的lgG2：CH1和CH3(无铰链)及/或SEQ IDNO：59的lgG2：CH2和CH3(无铰链)。
在一个实施例中，本文公开的F1和/或F2包含lgG2 Fc或lgG2 Fc片段。在该实施例的一些方面，本文公开的F1和/或F2包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQID NO：56、SEQID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59。在该实施例的一些方面，本文公开的F1和/或F2与SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59具有例如至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性。在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2与SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59具有在以下范围内的氨基酸同一性：例如约75％到约100％、约80％到约100％、约85％到约100％、约90％到约100％、约95％到约100％、约75％到约99％、约80％到约99％、约85％到约99％、约90％到约99％、约95％到约99％、约75％到约97％、约80％到约97％、约85％到约97％、约90％到约97％或约95％到约97％。
在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2相对于SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2相对于SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQID NO：59具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：33、SEQID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。
在一个实施例中，IgM Fc包括氨基酸序列SEQ ID NO：34或其片段。在一个实施例中，IgM Fc包括如表6所示的SEQ ID NO：34的以下片段中的一个或多个。
在本发明Fc的一方面，Fc包括：1)IgM CH1结构域、IgM CH2结构域和IgM CH3结构域，2)IgM CH1结构域和CH2结构域，3)IgM CH1结构域和CH3结构域，4)IgM CH2结构域和CH3结构域，5)一个或多个结构域与免疫球蛋白铰链区(铰链区的一部分)的组合，或6)一个或多个IgM CH结构域与其他免疫球蛋白亚型的CH结构域或铰链区的组合。
在该实施例的例示性但非限制性方面，lgM Fc可包括以下序列中的一个或多个：SEQ ID NO：60的IgM：CH1、SEQ ID NO：61的IgM：CH2、SEQ ID NO：62的IgM：CH3、SEQ ID NO：63的IgM：CH4、SEQ IDNO：64的IgM：CH1和CH2、SEQ IDNO：65的IgM：CH1和CH3、SEQ ID NO：66的IgM CH1和CH4、SEQ ID NO：67的IgM CH1-CH3-CH4、SEQ ID NO：68的IgM CH1-CH2-CH4、SEQ ID NO：69的IgM CH2-CH3、SEQ ID NO：70的IgM CH2-CH4、SEQ ID NO：71的IgM CH2-CH3-CH4及/或SEQ ID NO：72的IgM CH3-CH4。
在一个实施例中，本文公开的F1和/或F2包含IgM Fc或IgM Fc片段。在该实施例的一些方面，本文公开的F1和/或F2包含SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ IDNO：62、SEQID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72。在该实施例的一些方面，本文公开的F1和/或F2与SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72具有例如至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性。在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2与SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72具有在以下范围内的氨基酸同一性：例如约75％到约100％、约80％到约100％、约85％到约100％、约90％到约100％、约95％到约100％、约75％到约99％、约80％到约99％、约85％到约99％、约90％到约99％、约95％到约99％、约75％到约97％、约80％到约97％、约85％到约97％、约90％到约97％或约95％到约97％。
在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2相对于SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71或SEQ IDNO：72具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：60、SEQID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：66、SEQID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71或SEQ IDNO：72具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2相对于SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：63、SEQID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。
在一个实施例中，组合物包括修饰的Fc，其氨基酸序列与SEQ ID NO：31-34或42-72全长序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性。在另一个实施例中，组合物包括修饰的Fc，其具有与SEQ ID NO：31-34或42-72全长相比达70个、达60个、达50个、达45个、达40个、达35个、达30个、达25个、达20个、达15个、达14个、达13个、达12个、达11个、达10个、达9个、达8个、达7个、达7个、达6个、达5个、达4个、达3个、达2个或达1个氨基酸添加、缺失或取代的氨基酸序列。
在一个实施例中，Fc融合蛋白的Fc区含有氨基酸序列AESKYGPPCPPCPAPXXXGGPSVFLFPPKPKDXLXIXRXPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFXSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFXLYSXLTVDKSRWQEGNVFSCSVXHEALHXHYTQKSLSLSLGX，其中第16位的X为Pro或Glu；第17位的X为Phe、Val或A1a；第18位的X为Leu、Glu或Ala；第33位的X为Thr、Glu或Gln；第35位的X为Met或Trp；第37位的X为Ser或Thr；第39位的X为Thr或Glu；第80位的X为Asn或Ala；第188位的X为Phe或Leu；第192位的X为Lys或Arg；第211位的X为Leu、Met、Ala或Phe；第217位的X为Asn或Ser；第230位的X为Lys或不存在(SEQ ID NO：35)。
在一个实施例中，本文公开的F1和/或F2包含SEQ ID NO：35。在该实施例的一些方面，本文公开的F1和/或F2与SEQ ID NO：35具有例如至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性。在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2与SEQ ID NO：35具有在以下范围内的氨基酸同一性：例如约75％到约100％、约80％到约100％、约85％到约100％、约90％到约100％、约95％到约100％、约75％到约99％、约80％到约99％、约85％到约99％、约90％到约99％、约95％到约99％、约75％到约97％、约80％到约97％、约85％到约97％、约90％到约97％或约95％到约97％。
在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2相对于SEQ ID NO：35具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO：35具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。在该实施例的其他方面，本文公开的F1和/或F2相对于SEQ ID NO：35具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO：35具有例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代。
本发明融合肽可包括接头。在一个实施例中，所述接头为长度从约6个到约30个氨基酸的肽。在该实施例的一些方面，肽接头长度可以为例如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少1 1个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或至少30个氨基酸。在该实施例的其他方面，肽接头长度可以为例如至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多21个、至多22个、至多23个、至多24个、至多25个、至多26个、至多27个、至多28个、至多29个或至多30个氨基酸。在该实施例的其他方面，肽接头长度可以为例如约6个到约8个、约6个到约10个、约6个到约12个、约6个到约14个、约6个到约16个、约6个到约18个、约6个到约20个、约6个到约22个、约6个到约24个、约6个到约26个、约6个到约28个、约6个到约30个、约8个到约10个、约8个到约12个、约8个到约14个、约8个到约16个、约8个到约18个、约8个到约20个、约8个到约22个、约8个到约24个、约8个到约26个、约8个到约28个、约8个到约30个、约10个到约12个、约10个到约14个、约10个到约16个、约10个到约18个、约10个到约20个、约10个到约22个、约10个到约24个、约10个到约26个、约10个到约28个、约10个到约30个、约12个到约14个、约12个到约16个、约12个到约18个、约12个到约20个、约12个到约22个、约12个到约24个、约12个到约26个、约12个到约28个、约12个到约30个、约14个到约16个、约14个到约18个、约14个到约20个、约14个到约22个、约14个到约24个、约14个到约26个、约14个到约28个、约14个到约30个、约16个到约18个、约16个到约20个、约16个到约22个、约16个到约24个、约16个到约26个、约16个到约28个、约16个到约30个、约18个到约20个、约18个到约22个、约18个到约24个、约18个到约26个、约18个到约28个、约18个到约30个、约20个到约22个、约20个到约24个、约20个到约26个、约20个到约28个、约20个到约30个、约22个到约24个、约22个到约26个、约22个到约28个、约22个到约30个、约24个到约26个、约24个到约28个、约24个到约30个、约26个到约28个、约26个到约30个或约26个到约30个氨基酸。
在该实施例的一方面，接头具有氨基酸序列(GGGGS)n，其中n＝2、3或4(SEQ IDNO：1)。
在又一实施例中，含有GIP类似物的Fc融合蛋白的单体包括氨基酸序列：
YGEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGGGGGSGGGGGGGGGSAESK
YGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDXLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFXLYSXLTVDKSRWQEGNVFSCSVXHEALHNHYTQKSLSLSLG，其中第79位的X选自T和Q，第257位的X选自L和M，第234位的X选自F和L，第238位的X选自K和R(SEQ ID NO：36)。
在一个实施例中，含有GLP-1的Fc融合蛋白的单体包含氨基酸序列：
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGGGGGGSAESKYGPPCPPCP
APEAAGGPSVFLFPPKPKDXLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFXLYSXLTVDKSRWQEGNVFSCSVXHEALHNHYTQKSLSLSLG，其中第79位的X选自T和Q，第257位的X选自L和M，第234位的X选自F和L，第238位的X选自K和R(SEQ ID NO：37)。
在一个实施例中，含有GLP-1的Fc融合蛋白的单体由编码融合蛋白SEQ ID NO：74的SEQ ID NO：73编码。在一个实施例中，含有GLP-1的Fc融合蛋白的单体由编码融合蛋白SEQ ID NO：76的SEQ ID NO：75编码。
融合蛋白的活性可以在一种或多种所属领域认可为确定受体活性的体外或体内试验中通过其对GLP-1受体、胰高血糖素受体、GIP受体、瘦素受体、DPP-IV、Y5受体、黑色素聚集激素(MCH)受体、Y2/3受体、MC3/4受体、胃/胰脂肪酶、5HT2c、β3THE受体、胰淀素受体、饥饿激素、新生儿Fc受体(FcRn)和/或饥饿激素受体中的一种或多种受体的活性来测定。在一个实施例中，本发明的融合蛋白具有激动剂活性。在一方面，本发明的融合蛋白在一项或多项体外或体内试验中充当GLP-1受体、GIP受体、胰高血糖素受体、瘦素受体、Y2/3受体、MC3/4受体、5HT2c、β3A受体、胰淀素受体的激动剂。
在一个实施例中，本发明的融合蛋白对GLP-1受体、GIP受体、胰高血糖素受体中的一种或多种受体有激动剂活性。在一方面，本发明的融合蛋白对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体中的至少两种受体有激动剂活性。
在一个实施例中，通过测定融合蛋白对每种受体的活性来确定融合蛋白的选择性。可以将融合蛋白的活性与天然存在的(亦即“天然的”)蛋白质对既定受体的活性进行比较。例如，受体活性的相对比可以表示为分子相对于获得的天然第一蛋白(从其衍生P1蛋白)的活性对第一受体的活性除以分子相对于天然第二蛋白(从其衍生P2蛋白)对第二受体的活性。在一个实施例中，融合蛋白的受体活性相对比在以下范围内：约100到0.01、约50到0.1、约25到0.1、约10到0.1、约9到0.1、约8到0.1、约10到0.1、约7到0.1、约6到0.1、约5到0.1、约5到0.2、约4到0.2、约3到0.3、约2到0.5或为约1。
在一个优选实施例中，上述任何双重受体激动剂和三重受体激动剂形成二聚体，优选通过Fc结构域中的一个或多个链间共价键进行。复性过程可以用于产生二聚体，其中使激动剂分子变性和还原，然后稀释或将缓冲液更换成复性缓冲液，并在低温(例如0-8℃)孵育过夜或长达72小时。复性缓冲液任选地含有氧化还原对、金属催化剂、糖、氨基酸和/或脲。
在一个实施例中，分子对一种受体(例如，GLP-1受体)与另一种受体(例如，胰高血糖素受体)的选择性可以描述为受体1/受体2活性的相对比(例如，GLP-1受体/胰高血糖素受体活性)。该GLP-1受体/胰高血糖素受体活性可以计算为：(该分子相对于天然GLP-1对GLP-1受体的活性除以该分子相对于天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性)；并且分子对GLP-1受体与GIP受体的选择性可以描述为GLP-1受体/GIP受体活性的相对比(该分子相对于天然GLP-1对GLP-1受体的活性除以该分子相对于天然GIP对GIP受体的活性)。例如，呈现天然GLP-1对GLP-1受体的活性的60％和天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的60％的分子具有1∶1的GLP-1受体/胰高血糖素受体活性比，或相对比为1。GLP-1/胰高血糖素活性的例示性比率包括约1∶1、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1，或约1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2或1∶1.5。例如，10∶1(或10)的GLP-1受体/胰高血糖素受体活性比表明对GLP-1受体的选择性是胰高血糖素受体的10倍。类似地，1∶10(或0.1)的GLP-1受体/胰高血糖素受体活性比表明对胰高血糖素受体的选择性是GLP-1受体的10倍。
在另一个实施例中，本文公开的分子为双重GLP-1/GIP受体共激动剂，其中如上所述的GLP-1受体/GIP受体活性比在100与0.01之间，优选在10与0.1之间，进一步优选在3与0.3之间，进一步优选在2与0.5之间，且进一步优选约为1。
在另一个实施例中，本文公开的分子为双重GLP-1/胰高血糖素受体共激动剂，其中如上所述的GLP-1/胰高血糖素活性比在100与0.01之间，优选在10与0.1之间，且进一步优选在3与0.3之间。
如本文所用的术语“天然化学连接”(或NCL)是指构建通过组装两个或多个无保护的肽区段形成的大多肽的概念。NCL特别是合成天然骨架蛋白或修饰蛋白的最强有效的连接方法。在天然化学连接中，无保护肽2的N-末端半胱氨酸残基的硫醇基团在通常约7的合适pH和通常为20℃＜T＜37℃的温度下于水性缓冲液中攻击另一无保护肽1的C-末端硫酯。这种可逆的硫酯转移反应步骤具有化学选择性和区域选择性，并且导致形成硫酯中间体3。该中间体通过分子内S，N-酰基位移进行重排，导致在连接位点处形成天然酰胺(“肽”)键4(图4)。
如本文所用的术语“位点特异性偶联”是指化学合成的肽上的反应基团特异性地与通过重组技术产生的Fc片段的特定基团反应的概念。例如，如Zhang和Tam在“Thiazolidine formation as a general and site-specific conjugation method forsynthetic peptides and proteins.”(Anal.Biochem.1996 Jan 1；233(1)：87-93)中所述，含有醛基的肽可以通过形成位点特异性噻唑烷与重组Fc片段的半胱氨酸的1，2-氨基硫醇反应。这种化学合成的肽可以含有醛基。当化学合成Fc区时，可将Fc类似物的N-末端氨基酸修饰为Cys，以允许P1或P2肽与Fc区进行位点特异性偶联。
如本文所用的术语“复性”是指蛋白质结构呈现其功能形状或构象的过程。它是多肽从无规卷曲折叠成特征和功能性三维结构的物理过程，在碱性pH(通常为pH 8.0-10.0、pH8.5-10.0或pH8.5-9.6)、低温(通常为0.0℃至10.0℃或者2.0℃至8.0℃)下发生，优选在适当浓度的氧化还原对存在下，且/或在氧存在下，且/或在适宜浓度的催化剂如铜离子存在下发生。
如本文所用的术语“重组体”是指通过选自哺乳动物表达系统、昆虫细胞表达系统、酵母表达系统和细菌表达系统的生物宿主产生的多肽。
如本文所用的术语“制剂”是指组合在一起的本文公开的融合蛋白以及赋形剂，其可以施用且能够结合相应受体并启动信号转导通路，产生所需活性。只要融合蛋白保留结合相应受体的能力，制剂可任选地包含其他试剂。
术语“促胰岛素活性”是指响应升高的葡萄糖水平刺激胰岛素分泌从而导致细胞摄取葡萄糖并降低血浆葡萄糖水平的能力。促胰岛素活性可以使用本领域公认的方法在体外和/或体内进行测定。例如，促胰岛素活性可以如Deacon等人在“Dipeptidyl peptidaseIV resistant analogues of glucagon-likepeptide-1which have extended metabolicstability and improved biological activity.”(Diabetologica.1998 Mar；41(3)：271-8)中所述通过评估刺激胰岛素或抑制胰高血糖素从分离的灌注猪胰腺分泌的能力来确定。如果胰岛细胞在GLP-1分子存在下高于本底水平分泌胰岛素，则GLP-1分子具有促胰岛素活性。
本说明书也提供了一种药物组合物用于施用给受试者。本文公开的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。如本文所用的术语“药学上可接受的”意指组合物足以达到治疗效果且没有有害副作用，并可容易地根据疾病类型、患者年龄、体重、健康状况、性别以及药物敏感性、给药途径、给药模式、给药频率、治疗持续时间、与本文公开的组合物组合或同时使用的药物以及医学中已知的其他因素来确定。
包括本文公开的融合蛋白的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载剂。对于口服给药，载剂可以包括但不限于粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂和香料。对于可注射制剂，载剂可包括缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂和稳定剂。对于用于局部给药的制剂，载剂可以包括基质、赋形剂、润滑剂和防腐剂。
所公开的组合物可以与上述药学上可接受的载剂组合配制成各种剂型。例如，对于口服给药，药物组合物可以配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆或糯米纸囊剂(wafer)。对于可注射制剂，可将药物组合物配制入单剂量形式的安瓿或多剂量容器。也可将药物组合物配制成溶液、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊及长效制剂。
另一方面，用于药物组合物的载剂、赋形剂及稀释剂的实例包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。此外，药物制剂可进一步包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、保湿剂、香料和防腐剂。
本文公开的药物组合物进一步可为选自由片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊、混悬剂、内用液体、乳剂、糖浆剂、无菌水溶液、非水溶剂、冻干制剂和栓剂组成的组的任何制剂。
组合物可进一步配制成适合患者机体的单一剂型，优选地根据制药领域的经典方法配制成可用于肽药物的制剂，以便通过口服或肠胃外途径施用，例如通过皮肤、静脉内、肌内、动脉内、髓内、髓内、脑室内、肺、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、结肠内、局部、舌下、阴道或直肠给药，但不限于此。
可通过与药学上可接受的各种载剂(如生理盐水或有机溶剂)混合来使用组合物。为了提高稳定性或吸收性，可以使用碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白或其它稳定剂。
本文公开的药物组合物的给药剂量和频率通过活性成分的类型以及各种因素(例如，待治疗的疾病、给药途径、患者年龄、性别和体重以及疾病严重性)来确定。
本文公开的组合物的总有效剂量可以以单剂量施用给患者，或可以根据分次治疗方案以多个剂量施用一段时间。在本文公开的药物组合物中，活性成分的含量可根据疾病严重程度变化。优选地，本文公开的肽的总日剂量可为每1kg患者体重约0.0001μg到500mg。然而，除药物组合物的给药途径和治疗频率之外，肽有效剂量的确定需考虑各种因素包括患者年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食以及分泌率。鉴于此，所属领域的技术人员可容易确定适合本文公开的药物组合物的特定用途的有效剂量。本文公开的药物组合物不特别限制制剂、给药途径和方式，只要其显示有益效果即可。
本文公开的药物组合物预期具有更长的疗效和效价体内持续时间，从而显著减少其给药量和频率。
此外，药物组合物可单独或者与其他对肥胖显示预防或治疗作用的药物制剂组合或同时施用。对肥胖显示预防或治疗作用的药物制剂没有特别限定，且可包括GLP-1受体激动剂、瘦素受体激动剂、DPP-IV抑制剂、Y5受体拮抗剂、黑色素聚集激素(MCH)受体拮抗剂、Y2/3受体激动剂、MC3/4受体激动剂、胃/胰脂肪酶抑制剂、5HT2c激动剂、β3A受体激动剂、胰淀素受体激动剂、饥饿激素拮抗剂、新生儿Fc受体(FcRn)拮抗剂和/或饥饿激素受体拮抗剂。
在再一方面，本说明书提供一种用于预防或治疗糖尿病、肥胖、脂肪变性及相关疾病的方法，其包含向受试者施用融合蛋白或包括所述融合蛋白的药物组合物的步骤。在一个实施例中，糖尿病为非胰岛素依赖性糖尿病。在一个实施例中，将本发明组合物用在预防和/或治疗肥胖的方法中。
如本文所用的术语“预防”意指抑制或阻止疾病发生的所有行为。在本说明书中，“预防”意指通过施用本文公开的融合蛋白抑制或阻止因诸如血糖、血胰岛素水平、体重或体脂肪升高之类的因素导致的糖尿病或肥胖发生。
如本文所用的术语“治疗”意指已使疾病症状得到缓解、改善或减轻的所有行为。在本说明书中，“治疗”意指通过施用本文公开的融合蛋白缓解、改善或减轻脂肪变性、糖尿病和/或肥胖的症状。例如，在一个实施例中，治疗引起体重或体脂肪减轻或引起胰岛素增敏。
如本文所用的术语“肥胖”是指身体中过量脂肪组织的累积，体重指数(体重(kg)除以身高(m)的平方)高于25的人类受试者将被视为肥胖的。当膳食摄取量超过长期消耗的能量时，肥胖通常由能量失衡引起。肥胖是影响全身的代谢性疾病，且增加糖尿病、高脂血症、性功能障碍、关节炎和心血管疾病的风险，并在一些情况下与癌症的发生相关。
如本文所用的术语“施用(给药)”意指通过某种适当的方法将一定量的预定物质引入患者体内。本文公开的组合物可以经由任何常见途径施用，例如但不限于腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内或直肠内给药，只要组合物能够到达所需组织即可。然而，由于肽在口服给药后就被消化，因此口服给药组合物中的活性成分应当被包衣或配制成制剂以防在胃中降解。
在本说明书中，术语“受试者”为疑似患有肥胖、糖尿病、脂肪变性以及相关疾病的那些受试者，其意指肥胖或有肥胖可能性的包括人、小鼠和家畜在内的哺乳动物。但是，包括并不限于将用本文公开的融合蛋白或药物组合物治疗的任何受试者。向疑似肥胖的受试者施用包括本文公开的融合肽的药物组合物，从而有效治疗所述受试者。肥胖如上所述。
本说明书的治疗方法可包括以药学有效量施用包括融合蛋白的组合物的步骤。总日剂量应通过医师的适当医学判断来确定，并施用一次或几次。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平可以根据医学领域中熟知的各种因素而变化，所述因素包括要达成的反应的种类和程度、根据是否与其一起使用其它试剂的具体组合物、患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食、给药时间和途径、组合物的分泌速率、治疗的时间段、与本文公开的组合物组合或同时使用的其它药物以及医学领域中熟知的类似因素。
在再一方面，本说明书提供治疗性蛋白质或包括其的药物组合物在制备用于预防或治疗糖尿病、肥胖、脂肪变性和相关疾病的药物中的用途。
在一个实施例中，可以每天、每半周、每周、每两周或每月施用组合物的剂量。治疗周期可以为1周、2周、1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更长时间。初始剂量可大于维持剂量。在一个实施例中，剂量范围包括以下周剂量：至少0.01mg、至少0.25mg、至少0.3mg、至少0.5mg、至少0.75mg、至少1mg、至少1.25mg、至少1.5mg、至少2mg、至少2.5mg、至少3mg、至少4mg、至少5mg、至少6mg、至少7mg、至少8mg、至少9mg、至少10mg、至少15mg、至少20mg、至少25mg、至少30mg、至少35mg、至少40mg、至少50mg、至少55mg、至少60mg、至少65mg或至少70mg。在一个实施例中，周剂量可以为至多0.5mg、至多0.75mg、至多1mg、至多1.25mg、至多1.5mg、至多2mg、至多2.5mg、至多3mg、至多4mg、至多5mg、至多6mg、至多7mg、至多8mg、至多9mg、至多10mg、至多15mg、至多20mg、至多25mg、至多30mg、至多35mg、至多40mg、至多50mg、至多55mg、至多60mg、至多65mg或至多70mg。在一个特定方面，周剂量范围可以从0.25mg到2.0mg、从0.5mg到1.75mg。在一个替代方面，周剂量范围可以从10mg到70mg。
本说明书的各方面也可以如下所描述：
1.一种二聚体融合蛋白，其包含两个多肽或基本上由其组成或由其组成，第一多肽包含第一肽(P1)、接头(L1)和Fc区(F1)或基本上由其组成或由其组成，第二多肽包含第二肽(P2)、接头(L2)和Fc区(F2)或基本上由其组成或由其组成，其中P1和P2各自独立为GLP-1、GLP-1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物；F1和F2各自独立为IgG Fc、IgAFc、IgMFc、IgD Fc、IgE Fc、SEQ ID NO：35或其类似物；所述肽P1和P2的C-末端通过接头L1和L2与Fc区F1和F2的N-末端相连接。
2.如实施例1所述的二聚体融合蛋白，其中所述GLP-1为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。
3.如实施例1或2所述的二聚体融合蛋白，其中所述GLP-1类似物为SEQID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19；与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列；相对于SEQID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ IDNO：16、SEQ IDNO：17、SEQ IDNO：18或SEQIDNO：19具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18或SEQ ID NO：19具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18或SEQID NO：19具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；或相对于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18或SEO ID NO：19具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列。
4.如实施例1-3中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述GIP为SEQ ID NO：9。
5.如实施例1-4中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述GIP类似物为SEQIDNO：20或SEQ ID NO：21；与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：20或SEQ IDNO：21具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；或相对于SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列。
6.如实施例1-5中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述毒蜥外泌肽为毒蜥外泌肽3或毒蜥外泌肽4。
7.如实施例1-6中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述毒蜥外泌肽为SEQ IDNO：10或SEQID NO：11。
8.如实施例1-7中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述毒蜥外泌肽类似物为SEQ ID NO：22；与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：22具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：10、SEQID NO：11或SEQ ID NO：22具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：22具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ IDNO：22具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；或相对于SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：22具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列。
9.如实施例1-8中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述胰高血糖素为SEQ IDNO：12。
10.如实施例1-9中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述胰高血糖素类似物为与SEQ ID NO：12具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：12具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ IDNO：12具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：12具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；或相对于SEQ ID NO：12具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列。
11.如实施例1-10中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述胃泌酸调节素为SEQID NO：13。
12.如实施例1-11中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述胃泌酸调节素类似物为SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30；与SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；或相对于SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：29或SEQ ID NO：30具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列。
13.如实施例1-12中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述GLP-1、GLP-1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽和/或毒蜥外泌肽类似物具有一个添加的或用于取代天然存在N-末端氨基酸的N-末端氨基酸His或dHis。
14.如实施例1-13中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述GLP-1、GLP-1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽和/或毒蜥外泌肽类似物的N-末端第二个氨基酸为Gly、氨基异丁酸(Aib)、D-Ala、D-Ser、D-Gly或D-Val。
15.如实施例1-14中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述P1和P2序列各自独立选自由SEQ ID NO：3-30中的任一序列以及与SEQ ID NO：3-30中的一个或多个序列相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的氨基酸序列组成的组。
16.如实施例1-14中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述P1和P2序列各自独立选自SEQ ID NO：3-30中的任一序列以及与SEQ ID NO：3-30中的一个或多个序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
17.如实施例1-16中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中P1为GLP-1类似物，所述GLP-1类似物的N-末端为His或D-His；所述GLP-1类似物的第二个氨基酸选自Gly、氨基异丁酸(Aib)、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val；P2选自GIP、GIP类似物、胰高血糖素和胰高血糖素类似物。
18.如实施例1-17中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中P1或P2为GLP-1类似物，其包含选自由SEQ ID NO：14-19以及与SEQ ID NO：14-19中的一个或多个氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列，或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。
19.如实施例1-17中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中P1或P2为GLP-1类似物，其包含选自由以下序列组成的组的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成：SEQID NO：14-19以及与SEQ ID NO：14-19中的一个或多个序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
20.如实施例1-19中任一项所述的二聚体融合蛋白，其对所述GLP-1受体、GIP受体及胰高血糖素受体中的任两种受体有双重激动剂活性。
21.如实施例1-20中任一项所述的二聚体融合蛋白，其对GLP-1受体、GIP受体及胰高血糖素受体有激动剂活性。
22.如实施例1-21中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述双重受体激动剂或三重受体激动剂融合蛋白包含GIP类似物或基本上由其组成或由其组成，所述GIP类似物包含选自以下序列的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成：SEQ ID NO：20、21及与SEQ ID NO：20或21中的一个或多个序列相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的氨基酸序列。
23.如实施例1-22中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述双重受体激动剂或三重受体激动剂融合蛋白包含GIP类似物或基本上由其组成或由其组成，所述GIP类似物包含选自由以下序列组成的组的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成：SEQ ID NO：20、21及与SEQ ID NO：20或21中的一个或多个序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
24.如实施例1-23中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述IgG Fc为lgG1 Fc、lgG2 Fc、lgG4 Fc或其类似物。
25.如实施例1-24中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述lgG4 Fc为SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQID NO：47。
26.如实施例1-25中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述lgG4 Fc类似物为与SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：43、SEQID NO：44、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；或相对于SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ IDNO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列。
27.如实施例1-26中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述lgG1 Fc为SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52或SEQID NO：53。
28.如实施例1-27中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述lgG1 Fc类似物为与SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；或相对于SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列。
29.如实施例1-28中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述lgG2 Fc为SEQ IDNO：33、SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQ IDNO：59。
30.如实施例1-29中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述lgG2 Fc类似物为与SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：54、SEQ IDNO：55、SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；或相对于SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列。
31.如实施例1-30中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述lgG2 Fc为SEQ IDNO：34、SEQ IDNO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：65、SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ IDNO：71或SEQ ID NO：72。
32.如实施例1-31中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述lgG2 Fc类似物为与SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：34、SEQID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ IDNO：71或SEQ ID NO：72具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；或相对于SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列。
33.如实施例1-32中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述SEQ ID NO：35类似物为与SEQ ID NO：35具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：35具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：35具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO：35具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列；或相对于SEQ ID NO：35具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个非连续的氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列。
34.如实施例1-33中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述双重受体激动剂或三重受体激动剂融合蛋白包含IgG Fc类似物、IgAFc类似物、IgM Fc类似物和/或IgE Fc类似物，或基本上由其组成或由其组成。
35.如实施例1－34中任一项所述的二聚体融合蛋白，包含lgG4、lgG2、lgG1或IgMFc类似物，或基本上由其组成，或由其组成。
36.如实施例1－35中任一项所述的二聚体融合蛋白，其包含lgG4 Fc类似物或基本上由其组成或由其组成。
37.如实施例1-36中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者包含lgG4 Fc类似物或基本上由其组成或由其组成，F1或F2包含选自以下序列的氨基酸序列或者基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成：SEQ ID NO：31-35及42-71中任一序列以及与SEQID NO：31-35及42-71中的一个或多个序列相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
38.如实施例1-36中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者包含lgG4 Fc类似物或基本上由其组成或由其组成，F1或F2包含选自以下序列的氨基酸序列或者基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成：SEQ ID NO：31-35及42-71中任一序列以及与SEQID NO：31-35及42-71中的一个或多个序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
39.如实施例1-38中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者包含GLP-1类似物-Fc融合蛋白，其包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
40.如实施例1-38中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者包含GLP-1类似物-Fc融合蛋白，其包含以下氨基酸序列或基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO：37的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
41.如实施例1-38中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者包含GIP类似物-Fc融合蛋白，其包含以下氨基酸序列或基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID No.36的氨基酸序列或与SEQ ID NO：36相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
42.如实施例1-38中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者包含GIP类似物-Fc融合蛋白，其包含以下氨基酸序列或基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID No.36的氨基酸序列或与SEQ ID NO：36具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
43.如实施例1-38中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者由多核苷酸SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：75编码，或由与SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：75相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的多核苷酸编码。
44.如实施例1-38中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者由多核苷酸SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：75编码，或由与SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：75具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性的多核苷酸编码。
45.如实施例1-38中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者包含SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：76或者与SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：76相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
46.如实施例1-38中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者包含SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：76或者与SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：76具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
47.如实施例1-46中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白包含GLP-1受体与胰高血糖素受体的单分子双重激动剂或基本上由其组成或由其组成。
48.如实施例1-46中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述双重受体激动剂或三重受体激动剂分子包含GLP-1受体与GIP受体的单分子双重激动剂或基本上由其组成或由其组成。
49.如实施例1-48中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中将一个咪唑基团与P1和/或P2的N-末端相连接。
50.如实施例49所述的二聚体融合蛋白，其中所述咪唑基团选自由以下基团组成的组：4-咪唑并丙酰基(去氨基-组氨酰基)、4-咪唑并乙酰基、5-咪唑并-α，α二甲基-乙酰基。
51.如实施例50所述的二聚体融合蛋白，其中所述咪唑基团为4-咪唑并乙酰基。
52.如实施例1-51中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为双重GLP-1受体和GIP受体共激动剂，其中所述分子的GLP-1受体/GIP受体活性相对比在100到0.01范围内。
53.如实施例1-52中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为双重GLP-1受体和GIP受体共激动剂，其中所述分子的GLP-1受体/GIP受体活性相对比在10到0.1范围内。
54.如实施例1-53中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为双重GLP-1受体和GIP受体共激动剂，其中所述分子的GLP-1受体/GIP受体活性相对比在5到0.2范围内。
55.如实施例1-53中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为双重GLP-1受体和GIP受体共激动剂，其中所述分子的GLP-1受体/GIP受体活性相对比在3到0.3范围内。
56.如实施例1-53中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为双重GLP-1受体和GIP受体共激动剂，其中所述分子的GLP-1受体/GIP受体活性相对比在2到0.5范围内。
57.如实施例1-53中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为双重GLP-1受体和GIP受体共激动剂，其中所述分子的GLP-1受体/GIP受体活性相对比约为1。
58.如实施例1-53中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为双重GLP-1受体和胰高血糖素受体共激动剂，其中所述分子的GLP-1受体/胰高血糖素受体活性相对比在100到0.01范围内。
59.如实施例1-53中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为双重GLP-1受体和胰高血糖素受体共激动剂，其中所述分子的GLP-1受体/胰高血糖素受体活性相对比在10到0.1范围内。
60.如实施例1-53中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为双重GLP-1受体和胰高血糖素受体共激动剂，其中所述分子的GLP-1受体/胰高血糖素受体活性相对比在5到0.2范围内。
61.如实施例1-53中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为双重GLP-1受体和胰高血糖素受体共激动剂，其中所述分子的GLP-1受体/胰高血糖素受体活性相对比在2到0.5范围内。
62.如实施例1-53中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为双重GLP-1受体和胰高血糖素受体共激动剂，其中所述分子的GLP-1受体/胰高血糖素受体活性相对比约为1。
63.如实施例1-62中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白包含IgGFc或基本上由其组成或由其组成，其中所述IgG Fc经突变以对新生儿Fc受体(FcRn)具有与其野生型对应物相比增加的结合亲和力。
64.如实施例1-63中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白包含IgGFc或基本上由其组成或由其组成，其中所述IgG Fc经修饰以对新生儿Fc受体(FcRn)具有与其野生型对应物相比增加的结合亲和力，其中所述Fc区包含以下氨基酸残基或基本上由其组成或由其组成：在氨基酸残基第250位用谷氨酸或谷氨酰胺取代且在氨基酸残基第428位用亮氨酸或苯丙氨酸取代的第250位和第428位氨基酸残基，所述氨基酸残基由EU编号系统编号。
65.如实施例1-64中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白包含IgGFc或基本上由其组成或由其组成，其中所述分子在血清中的半衰期为6天或更长时间。
66.如实施例1-65中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述Fc多肽F2包含空腔或基本上由其组成或由其组成，所述空腔包含两个或两个以上选自由T366S、L368A和Y407V组成的组的氨基酸取代，或者基本上由所述氨基酸取代组成或由所述氨基酸取代组成，氨基酸根据Kabat的EU编号方案进行编号。
67.如实施例1-66中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述Fc多肽F1包含突起或基本上由其组成或由其组成，所述突起包含以下取代或基本上由其组成或由其组成：用色氨酸或酪氨酸取代第366位的苏氨酸，氨基酸根据Kabat的EU编号方案进行编号。
68.如实施例1-67中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为同源二聚体。
69.如实施例1-67中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为异源二聚体。
70.如实施例69所述的二聚体融合蛋白，其中：
a)所述第一肽P1与IgG Fc片段(F1)连接，所述第二肽与另一IgG Fc片段(F2)融合；
b)F1和F2衍生自相同IgG Fc，但具有不同氨基酸序列；
c)用侧链体积较大的氨基酸残基取代界面处的F1氨基酸残基，从而在F1上产生突起；或
d)用侧链体积较小的氨基酸残基取代界面处的F2氨基酸残基，从而在F2中产生空腔，其中在装配异源二聚体时，所述的F1突起可定位于所述空腔中。
71.如实施例69或70所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽包含以下氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：氨基酸序列SEQ ID NO：36或与SEQ ID NO：36相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列；所述第二多肽包含以下氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：如SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
72.如实施例69或70所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽包含以下氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：氨基酸序列SEQ ID NO：36或与SEQ ID NO：36具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同源性的氨基酸序列，所述第二多肽包含以下氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：如SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
73.如实施例69或70所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽包含以下氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：如SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列；所述第二多肽包含以下氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO：39相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
74.如实施例69或70所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽包含以下氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：如SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同源性的氨基酸序列，所述第二多肽包含以下氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：如SEQ IDNO：39所示的氨基酸序列或与SEQID NO：39具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
75.如实施例1-74中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述两个肽中的至少一个包含至少一个非天然氨基酸或基本上由其组成或由其组成；以化学方法合成所述含有非天然氨基酸的肽；所述重组Fc类似物的N-末端为Cys；所述肽通过天然化学连接与重组Fc类似物融合。
76.如实施例1-74中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述两个肽中的至少一个包含至少一个非天然氨基酸或基本上由其组成或由其组成，且以化学方法合成所述含有非天然氨基酸的肽；所述化学合成的肽包含醛基；所述重组Fc类似物的N-末端为Cys；所述肽通过形成噻唑烷与重组Fc类似物的N-末端进行位点特异性偶联。
77.如实施例1-76中任一项所述的二聚体融合蛋白，其用作药物。
78.如实施例1-76中任一项所述的二聚体融合蛋白，其用于治疗糖尿病、肥胖或脂肪变性。
79.如实施例1-76中任一项所述的二聚体融合蛋白，其用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病。
80.如实施例1-76中任一项所述的二聚体融合蛋白，其用于治疗肥胖或在超重受试者中诱导体重减轻。
81.一种制剂，其包含如实施例1-80中任一项所述的二聚体融合蛋白或基本上由其组成或由其组成。
82.一种制备如实施例1-80中任一项所述的二聚体融合蛋白的方法，其包含下述步骤或基本上由其组成或由其组成：P1或P2肽的醛基与具有N-末端半胱氨酸的Fc类似物通过醛与半胱氨酸的1，2-氨基硫醇反应进行反应。
83.一种药物组合物，其包含如实施例1-80中任一项所述的二聚体融合蛋白或基本上由其组成或由其组成。
84.一种治疗糖尿病、脂肪变性或肥胖的方法，包含向有需要的受试者施用药物组合物或基本上由其组成或由其组成，所述药物组合物包含如实施例1-80中任一项所述的二聚体融合蛋白或基本上由其组成或由其组成。
85.如实施例84所述的方法，其中每天、每半周、每周、每两周或每月施用所述组合物。
86.如实施例84或85所述的方法，其中治疗周期为约1周、2周、1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、1年、2年、3年、5年、10年或20年。
87.如实施例84-86中任一项所述的方法，其中初始剂量比维持剂量大。
88.如实施例84-87中任一项所述的方法，其中所述剂量范围包括以下周剂量：至少约0.01 mg、至少约0.25mg、至少约0.3mg、至少约0.5mg、至少约0.75mg、至少约1mg、至少约1.25mg、至少约1.5mg、至少约2mg、至少约2.5mg、至少约3mg、至少约4mg、至少约5mg、至少约6mg、至少约7mg、至少约8mg、至少约9mg、至少约10mg、至少约15mg、至少约20mg、至少约25mg、至少约30mg、至少约35mg、至少约40mg、至少约50mg、至少约55mg、至少约60mg、至少约65mg或至少约70mg。
89.如实施例84-88中任一项所述的方法，其中所述周剂量约为至多约0.5mg、至多约0.75mg、至多约1mg、至多约1.25mg、至多约1.5mg、至多约2mg、至多约2.5mg、至多约3mg、至多约4mg、至多约5mg、至多约6mg、至多约7mg、至多约8mg、至多约9mg、至多约10mg、至多约15mg、至多约20mg、至多约25mg、至多约30mg、至多约35mg、至多约40mg、至多约50mg、至多约55mg、至多约60mg、至多约65mg或至多约70mg。在一个特定方面，所述周剂量范围可以从约0.25mg到约2.0mg、从约0.5mg到约1.75mg。在一个替代方面，所述周剂量范围可以从约10mg到约70mg。
90.如实施例84-89中任一项所述的方法，其中所述周剂量范围可以从约0.25mg到约2.0mg或从约0.5mg到约1.75mg。
91.如实施例84-90中任一项所述的方法，其中所述周剂量范围为从约10mg到约70mg。
实例
提供以下非限制性实例仅用于说明性目的，以便于更全面理解所公开的主题物质。这些实例不应解释为限制本说明书中描述的任何实施例，其包括与用于治疗糖尿病、肥胖、脂肪变性和/或相关疾病的融合肽、药物组合物或方法及用途相关的那些实施例。
实例1：肽合成
天然化学连接反应可以按照以下步骤进行：
配制6M GuHCl(盐酸胍)和0.1M Na2HPO4(磷酸氢二钠...磷酸二氢钠也可使用)的储备溶液。GuHCI用于溶解肽反应物，Na2HPO4用于在pH 6.8-7附近缓冲溶液。
50mL储备溶液：称取1.42g(10mmol)磷酸钠盐(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠)置于150mL烧杯中。加入约25mL水并溶解。然后加入28.7g(300mmol)GuHCl并搅拌直至溶解，如果需要，可加入更多的水至约45mL(GuHCl将使水的体积大大膨胀)。GuHCI溶解是个非常吸热的过程，烧杯将变得很冷，为了能完全溶解可能需要加热。当固体完全溶解时，将溶液倒入50mL容量瓶中并补足至50mL。如果需要，可以将溶液任选地转移到加盖瓶中以便储存。该储备溶液可以在4℃下储存几个月。
通过加入MPAA(4-巯基苯乙酸)和TCEP.HCI(三-2-羧乙基膦盐酸盐)制备NCL缓冲溶液。尽管不知道一旦添加了TCEP.HCl，该溶液能保存多长时间，但通常的做法是使用新鲜配制的NCL缓冲液。
随后将过滤的储备溶液加入到MPAA和TCEP中以配制50mM(Johnson ECB，KentSBH.Journ.Amer.Chem.Soc.128(2006)，第6640-6646页)MPAA(硫醇催化剂)和20mM TCEP(还原剂)溶液。为了说明如何完成，可按如下所述进行5mg各肽(各约3mM)规模的连接反应：使用0.2μm针头式过滤器将5mL储备溶液过滤到20mL闪烁瓶中，该闪烁瓶含有28.7mgTCEP.HCL(0.1mmol)和42.1mg MPAA(0.26mmol)。要注意的是MPAA在低pH下溶解性差；当pH升至约7时，MPAA的溶解性增加。
注意：连接缓冲液在替代TCEP.HCL加入或与其联合使用的情况下都可任选地进行脱气。是否脱气取决于研究者的实验判断。一般说来，避免问题(溶解氧的存在)要比添加旨在消除问题的化学物质要好；反应中存在的每种化学物质可以并且通常在一定程度上会引起副反应。TCEP也不例外...例如，其显示在不存在MPAA的情况下于几小时后使Cys-肽脱硫。然而，其对于大多数NCL反应是非常有用的，并且在20mM(且有50mM MPAA)时引起很少的明显副反应。
加入最少量的2M NaOH或1M HCI，使用新校准的pH计将连接缓冲液的pH调节至约7.1；当将缓冲液加入到反应肽中时，与肽共纯化的痕量TFA将会使溶液的pH降低至所需的pH7.0。
精确称量所需量的肽-硫酯和Cys-肽，并加入到玻璃闪烁瓶或塑料离心管中。对于5mL NCL溶液，各肽的量用于获得最终浓度在1-5mM之间。当肽小(约1500Da)时，3mM浓度的各肽应算出为约5mg。另外，更亲水的肽(使用反相-LC)优选稍微(例如，约20％)过量，因为产物很可能将匹配更疏水肽的疏水性并将共洗脱出。
将缓冲溶液(磷酸盐，6M Gu.HCl，MPAA，TCEP.HCl)转移到含有适量肽-硫酯和Cys-肽的玻璃闪烁瓶或塑料离心管中。一旦肽溶解，将小瓶或管盖上。检查pH，如果需要，将pH调节至7.0。应使用更稀的NaOH溶液(我们使用0.2M NaOH)小心进行调节。如果pH上升到比7高很多，肽-硫酯将会水解。
在多数情况下，反应在不混合的情况下于环境温度(20-25℃)下进行。
反应可通过多种优选方法其中之一(例如，用于跟踪反应的LCMS或MALDI-TOF MS)来监测。在将NCL缓冲液加入肽后立即在“t＝0”时取等分试样，然后在30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、16小时时取等分试样。根据Xaa-Cys连接位点处的可变氨基酸的特性，反应在1至16小时内的任何时间后完成(在Val、Thr、Ile、Pro处的连接可能需要更长时间)。
为了取等分试样，移取10μl溶液并将其加入1.5mL塑料微量离心管中。用50∶50AcCN∶H2O(0.08％：0.1％TFA v/v)(190μl)将10μl溶液稀释20倍。稀释有效使反应停止，但为了确保反应的确停止，可以加入几微升1M HCl，同时将pH降至约4。这将使反应完全终止，且不应发生副反应。稀释的等分试样应尽快进行分析。
当反应完全时，立即使用0.1％TFA水溶液(溶剂A)将溶液稀释至约1M GuHCl，其也将降低pH，使得能够装载到制备型HPLC上(优选酸性注射液)。这将涉及到用溶剂A将NCL反应溶液稀释6倍。
实例2：具有非天然氨基酸的Fc融合蛋白的化学合成
当肽是Fc融合蛋白且两个肽中的至少一个含有至少一个非天然氨基酸时，含有非天然氨基酸的肽通过化学方法进行合成。化学合成的肽可以含有醛基，并且重组Fc类似物的N末端可以是Cys。所述肽可以通过形成噻唑烷位点特异性地偶联至重组Fc类似物的N-末端。位点特异性偶联可以如Zhang和Tam(Thiazolidine formation as a general andsite-specific conjugation method for synthetic peptides andproteins.AnalBiochem 1996Jan 1；233(1)：87-93.)所述进行。
融合蛋白的纯度可以使用包括RP-HPLC、IEX-HPLC、SEC-HPLC和CIEF的分析方法进行分析。
对融合蛋白的体外和离体活性进行评估，以使用表达克隆受体的细胞株测定融合蛋白受体结合情况以及如Diabetologia.1998年3月；41(3)：271-8中所述测定融合蛋白刺激胰岛素或抑制胰高血糖素从分离的灌注猪胰腺分泌的能力，在此通过引用的方式明确将所述文献内容全部并入本文中用于所有目的。也可以使用其他体外和离体方法。通过在小鼠、大鼠、仓鼠、猴、猪、绵羊或者糖尿病和肥胖的其它动物模型中进行动物功效研究分析融合蛋白的体内活性。
实例3：融合肽
在化学连接反应之后，获得具有Fc、接头及P1或P2的肽。例如，本发明的肽可包括一个或多个以下序列：含有SEQ ID NO：38所示融合肽的GLP-1类似物；含有SEQ ID NO：39所示肽的GIP类似物；SEQ ID NO：40所示的特定Fc区。
实例4：生物活性测定
使用大鼠胰岛素瘤细胞株RIN-m5F测定本文公开的融合肽(命名为ASKBH2)的生物活性。在GLP-1激活受体后，RIN-m5F细胞显示细胞内cAMP升高。在该测定中，RIN-m5F细胞与各种浓度的ASKBH2孵育25分钟，然后裂解细胞并使用Assay Designs cAMP ELISA试剂盒测定细胞内cAMP。数据显示诱导的cAMP高于没有GLP-1的培养基(图5)。
最后，应当理解，尽管通过参考特定实施例突出了本说明书的一些方面，但是本领域技术人员将容易了解，这些公开的实施例仅仅说明了本文公开的主题物质的原理。因此，应当理解，除非明确说明，否则所公开的主题物质决不限于本文所述的具体化合物、组合物、制品、装置、方法、方案和/或试剂等。此外，本领域普通技术人员将认识到，在不脱离本说明书的精神的情况下，可以根据本文的教导进行某些改变、修改、置换、变更、增加、删减及其子组合。因此，希望将所附权利要求和以后引入的权利要求解释为包括在其真实精神和范围内的所有这样的改变、修改、置换、变更、增加、删减及其子组合。
本文描述了本发明的某些实施例，包括发明人已知的用于执行本发明的最佳模式。当然，在阅读前述描述之后，这些所描述的实施例的变化对于本领域普通技术人员将变得显而易见。发明人希望本领域技术人员适当地采用这些变化，并且本发明人意图以不同于本文具体描述的方式实施本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中所述主题物质的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或另外上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述实施例的所有可能变化形式的任何组合。
不应将本发明的替代实施例、要素或步骤的分组解释为限制。各组成员可以单独地或者以与本文公开的其他组成员任意组合形式提及和要求保护。可以预期，出于方便和/或可专利性的原因，组中的一个或多个成员可以包括在组中或从组中删除。当发生任何这样的包括或删除时，可认为说明书含有经修饰的组，从而满足在所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示特征、项目、数量、参数、性质、术语等的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。如本文所用的术语“约”意指如此限定的特征、项目、数量、参数、性质或术语涵盖高于和低于所述特征、项目、数量、参数、性质或术语的值的正负百分之十的范围。因此，除非有相反指出，否则本说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是可以变化的近似值。例如，由于质谱仪器在确定给定分析物的质量时可以稍微变化，因此在离子质量或离子质量/电荷比的上下文中的术语“约”是指+/-0.50原子质量单位。不试图限制等同原则应用于权利要求的范围，每个数字显示起码应当至少根据所报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。
关于实施例或实施例一方面的术语“可能”或“可以”的使用还带有“可能不”或“不可以”的替代含义。因此，如果本说明书公开了可能或可以将实施例或实施例一方面包括为本发明主题物质的一部分，则也明确表示否定限制或排除性附带条件，意味着可能不或不可以将实施例或实施例一方面包括为本发明主题物质的一部分。类似地，关于实施例或实施例一方面的术语“可选择性地”的使用意味着可能将此实施例或此实施例一方面包括为本发明主题物质的一部分，或者可能不将其包括为本发明主题物质的一部分。这样的否定限制或排除性附带条件是否适用将基于在所要求保护的主题物质中是否引用否定限制或排除性附带条件。
尽管阐述本发明的宽范围的数值范围和值是近似值，但是在具体实例中还是尽可能精确报道了阐述的数值范围和值。然而，任何数值范围或值固有地含有由在它们各自的试验测量中发现的标准偏差必然导致的某些误差。本文中值的数值范围的叙述仅仅旨在用作单独提及落在该范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文另有说明，否则将数值范围的每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中被单独叙述一样。
除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则应将在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)使用的术语“一个”、“一种”、“所述”和类似表述解释为覆盖单数和复数。此外，对于标识的要素，诸如“第一”、“第二”、“第三”等的序数指示符用于在要素之间进行区分，并且不指示或暗示这些要素的所需或有限数量，不指示这些要素的特定位置或顺序，除非另有具体说明。本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序执行，除非本文另有说明或另外上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如或例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，不对所要求保护的本发明的范围构成限制。不应将本说明书中的任何语言解释为指示任何对于本发明的实践而言必要但未要求保护的要素。
当在权利要求中使用时，无论是提交还是按照修改添加，开放式过渡术语“包含”(及其等同的开放式过渡用语，如包括、含有和具有)涵盖单独的或与未记载的主题物质组合的所有明确叙述的要素、限制、步骤和/或特征；命名的要素、限制和/或特征是必要的，但是其他未命名的要素、限制和/或特征可以添加，并且仍然在权利要求的范围内。本文公开的具体实施例可以在权利要求中使用封闭式过渡性用语“由...组成”或“基本上由...组成”代替“包含”或作为对“包含”的修改来进一步限制。当在权利要求中使用时，无论是提交还是按照修改添加，封闭式过渡用语“由......组成”排除了权利要求中未明确记载的任何要素、限制、步骤或特征。封闭式过渡用语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制到明确叙述的要素、限制、步骤和/或特征以及不会实质影响所要求保护的主题物质的基本和新颖特征的任何其他要素、限制、步骤和/或特征。因此，将开放式过渡用语“包含”的含义定义为涵盖所有具体叙述的要素、限制、步骤和/或特征以及任何可选的其他未具体说明的要素、限制、步骤和/或特征。将封闭式过渡用语“由......组成”的含义定义为仅包括权利要求中具体描述的那些要素、限制、步骤和/或特征，而将封闭式过渡用语“基本上由......组成”的含义定义为仅包括在权利要求中具体描述的那些要素、限制、步骤和/或特征以及不实质影响所要求保护主题物质的基本和新颖特征的那些要素、限制、步骤和/或特征。因此，开放式过渡用语“包括”(及其等同的开放式过渡用语)在其含义内包括由封闭式过渡用语“由......组成”或“基本上由...组成”具体说明的所要求保护主题物质作为一种限制性情况。对用语“基本上由...组成”和“由...组成”，本文中清楚地或内在明确地描述、实现和支持本文以用语“包含”描述或要求保护的实施例。
将本说明书中引用和确认的所有专利、专利公布文件和其它出版物整体通过引用的方式单独和明确地并入本文中，以描述和公开例如在可能联系本发明使用的这些出版物中所述的组合物和方法。提供这些出版物仅仅是因为它们在本申请的申请日之前公开。在这方面，不应将任何内容解释为承认发明人无权由于在先发明或任何其他原因而先于这样的公开。关于这些文件内容的日期或表示的所有陈述是基于申请人可获得的信息，且并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
最后，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。因此，本发明不限于精确示出和描述的内容。
序列表
<110> 奥美药业有限公司
吕越峰
卢建丰
王爱君
<120> 具备双受体激动剂活性的融合蛋白
<130> 3IPAG3.0004WO
<150> US 62/079,518
<151> 2014-11-13
<160> 76
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 序列可重复2、3或4次
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 2
<211> 180
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Lys Ser Ile Tyr Phe Val Ala Gly Leu Phe Val Met Leu Val Gln
1 5 10 15
Gly Ser Trp Gln Arg Ser Leu Gln Asp Thr Glu Glu Lys Ser Arg Ser
20 25 30
Phe Ser Ala Ser Gln Ala Asp Pro Leu Ser Asp Pro Asp Gln Met Asn
35 40 45
Glu Asp Lys Arg His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys
50 55 60
Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn
65 70 75 80
Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala Lys Arg His Asp Glu Phe Glu
85 90 95
Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
100 105 110
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
115 120 125
Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg
130 135 140
Arg His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp
145 150 155 160
Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile
165 170 175
Thr Asp Arg Lys
180
<210> 3
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val
1 5 10 15
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
20 25 30
Val Lys Gly Arg Gly
35
<210> 4
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val
1 5 10 15
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Val Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
20 25 30
Val Lys Gly Arg Gly
35
<210> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 6
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Val Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Val Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 9
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys
1 5 10 15
Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys
20 25 30
Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln
35 40
<210> 10
<211> 39
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 11
<211> 39
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 12
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 13
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn Ile Ala
35
<210> 14
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-1类似物
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> X可为氨基异丁酸（Aib）、Gly、D-Ala、D-Ser、D-Gly或
D-Val
<400> 14
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 15
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-1类似物
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 其中X可选自氨基异丁酸（Aib）、Gly、
D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val。
<400> 15
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Asn Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 16
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-1 类似物
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 其中X选自氨基异丁酸（Aib）、Gly、
D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val
<400> 16
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Leu Gly Gly Pro
20 25 30
<210> 17
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-1 类似物
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 其中X选自 Gly、氨基异丁酸
（Aib）、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val
<400> 17
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Ala Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro
20 25 30
<210> 18
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-1类似物
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 其中X选自Gly、氨基异丁酸
（Aib）、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val
<400> 18
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Asn Gly Gly
20 25 30
<210> 19
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-1 类似物
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 其中X选自Gly、氨基异丁酸
（Aib）、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val
<400> 19
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Asn Gly Gly
20 25 30
<210> 20
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GIP 类似物
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 其中X选自 Gly、Val、Lys和Ser、氨基异丁酸（Aib）、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val
<400> 20
Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys
1 5 10 15
Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys
20 25 30
Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln
35 40
<210> 21
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GIP 类似物
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 其中X选自Gly、Val、Lys和Ser、氨基异丁酸（Aib）、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val
<400> 21
Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys
1 5 10 15
Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys
20 25 30
<210> 22
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽类似物
<400> 22
His Ser Asp Gly Thr Phe Ile Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu
1 5 10 15
Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 23
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胃泌酸调节素类似物
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 其中X为氨基异丁酸
<400> 23
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 24
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胃泌酸调节素类似物
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 其中X为氨基异丁酸
<400> 24
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 25
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胃泌酸调节素类似物
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 其中X为氨基异丁酸
<400> 25
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 26
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胃泌酸调节素类似物
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 其中X为氨基异丁酸
<400> 26
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 27
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胃泌酸调节素类似物
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> 其中X表示4-咪唑并乙酰基
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 其中X为氨基异丁酸
<400> 27
Xaa Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 28
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胃泌酸调节素类似物
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 其中X为氨基异丁酸
<400> 28
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 29
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胃泌酸调节素类似物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 其中第1位的组氨酸为组氨酸或D-组氨酸
<400> 29
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn Ile Ala
35
<210> 30
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胃泌酸调节素类似物
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 其中X为氨基异丁酸
<400> 30
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 31
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 32
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 33
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 34
<211> 452
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser
35 40 45
Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln
65 70 75 80
Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn
85 90 95
Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys
100 105 110
Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg
115 120 125
Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile
130 135 140
Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr
145 150 155 160
Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr
165 170 175
Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln
180 185 190
Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln
195 200 205
Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val
210 215 220
Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr
225 230 235 240
Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr
245 250 255
Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn
260 265 270
Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala
275 280 285
Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr
290 295 300
Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg
305 310 315 320
Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro
325 330 335
Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu
340 345 350
Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg
355 360 365
Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro
370 375 380
Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val
385 390 395 400
Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Ala His
405 410 415
Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr
420 425 430
Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala
435 440 445
Gly Thr Cys Tyr
450
<210> 35
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体Fc
<220>
<221> 变体
<222> (16)..(16)
<223> 第16位的X为Pro或Glu；
<220>
<221> 变体
<222> (17)..(17)
<223> 第17位的X为Phe、Val或Ala；
<220>
<221> 变体
<222> (18)..(18)
<223> 第18位的X为Leu、Glu或Ala；
<220>
<221> 变体
<222> (33)..(33)
<223> 第33位的X为Thr、Glu或Gln
<220>
<221> 变体
<222> (35)..(35)
<223> 第35位的X为Met或Trp；
<220>
<221> 变体
<222> (37)..(37)
<223> 第37位的X为Ser或Thr；
<220>
<221> 变体
<222> (39)..(39)
<223> 第39位的X为Thr或Glu；
<220>
<221> 变体
<222> (80)..(80)
<223> 第80位的X为Asn或Ala；
<220>
<221> 变体
<222> (188)..(188)
<223> 第188位的X为Phe或Leu；
<220>
<221> 变体
<222> (192)..(192)
<223> 第192位的X为Lys或Arg；
<220>
<221> 变体
<222> (211)..(211)
<223> 第211位的X为Leu、Met、Ala或Phe；
<220>
<221> 变体
<222> (217)..(217)
<223> 第217位的X为Asn或Ser
<220>
<221> 变体
<222> (230)..(230)
<223> 第230位的X为Lys或不存在
<400> 35
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Xaa Leu Xaa Ile Xaa Arg Xaa Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
100 105 110
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Xaa Leu Tyr Ser Xaa
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Xaa His Glu Ala Leu His Xaa His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
225 230
<210> 36
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GIP类似物Fc融合蛋白
<220>
<221> 变体
<222> (79)..(79)
<223> 第79位的X选自T和Q
<220>
<221> 变体
<222> (234)..(234)
<223> 第234位的X选自F和L
<220>
<221> 变体
<222> (238)..(238)
<223> 第238位的X选自K和R
<220>
<221> 变体
<222> (257)..(257)
<223> 第257位的X选自L和M
<400> 36
Tyr Gly Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys
1 5 10 15
Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Xaa Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Xaa Leu Tyr Ser Xaa Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Xaa His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly
275
<210> 37
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-1类似物Fc融合肽
<220>
<221> 变体
<222> (79)..(79)
<223> 第79位的X选自T和Q
<220>
<221> 变体
<222> (234)..(234)
<223> 第234位的X选自F和L
<220>
<221> 变体
<222> (238)..(238)
<223> 第238位的X选自K和R
<220>
<221> 变体
<222> (257)..(257)
<223> 第257位的X选自L和M
<400> 37
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Xaa Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Xaa Leu Tyr Ser Xaa Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Xaa His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly
275
<210> 38
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有GLP-1的融合肽
<400> 38
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly
275
<210> 39
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有GIP类似物的融合肽
<400> 39
Tyr Gly Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys
1 5 10 15
Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly
275
<210> 40
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc区
<400> 40
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
100 105 110
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Gly
225
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala
1 5
<210> 42
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 43
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
100 105
<210> 45
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 Ch1和CH2，无铰链
<400> 45
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
100 105 110
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
115 120 125
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
130 135 140
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
145 150 155 160
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
165 170 175
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
180 185 190
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
195 200 205
<210> 46
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 CH1和CH3，无铰链
<400> 46
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
100 105 110
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
115 120 125
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
130 135 140
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
145 150 155 160
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
165 170 175
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
180 185 190
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
195 200 205
<210> 47
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 CH2和CH3，无铰链
<400> 47
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 48
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 49
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 51
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH1和CH2（无铰链）
<400> 51
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
100 105 110
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
115 120 125
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
130 135 140
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
145 150 155 160
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
165 170 175
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
180 185 190
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
195 200 205
Lys Ala Lys
210
<210> 52
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH1和CH3（无铰链）
<400> 52
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
100 105 110
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
115 120 125
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
130 135 140
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
145 150 155 160
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
165 170 175
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
180 185 190
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
195 200 205
<210> 53
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH2和CH3（无铰链）
<400> 53
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 54
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val
<210> 55
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
100 105
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 57
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2 CH1和CH2（无铰链）
<400> 57
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
100 105 110
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
115 120 125
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
130 135 140
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
145 150 155 160
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
165 170 175
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
180 185 190
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
195 200 205
<210> 58
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2 CH1和CH3（无铰链）
<400> 58
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
100 105 110
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
115 120 125
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
130 135 140
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
145 150 155 160
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
165 170 175
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
180 185 190
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
195 200 205
<210> 59
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2 CH2和CH3（无铰链）
<400> 59
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro
100 105 110
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
115 120 125
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
130 135 140
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Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
165 170 175
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
180 185 190
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 60
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
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35 40 45
Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105
<210> 61
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp
1 5 10 15
Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr
20 25 30
Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp
100 105 110
<210> 62
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser
1 5 10 15
Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu
20 25 30
Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro
85 90 95
Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly
100 105
<210> 63
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu
1 5 10 15
Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Tyr
<210> 64
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgM: CH1和CH2
<400> 64
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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195 200 205
Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp
210 215
<210> 65
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgM: CH1和CH3
<400> 65
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
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Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr
130 135 140
Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn
145 150 155 160
Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala
165 170 175
Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr
180 185 190
Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Pro Lys Gly
210
<210> 66
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgM CH1和CH4
<400> 66
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser
35 40 45
Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln
65 70 75 80
Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn
85 90 95
Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Val Ala Leu His Arg Pro Asp
100 105 110
Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser
115 120 125
Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe
130 135 140
Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val
145 150 155 160
Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala
165 170 175
His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr
180 185 190
Tyr Thr Cys Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg
195 200 205
Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu
210 215 220
Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
225 230
<210> 67
<211> 340
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgM CH1-CH3-CH4
<400> 67
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser
35 40 45
Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln
65 70 75 80
Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn
85 90 95
Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val
100 105 110
Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr
115 120 125
Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr
130 135 140
Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn
145 150 155 160
Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala
165 170 175
Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr
180 185 190
Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro
210 215 220
Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu
225 230 235 240
Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg
245 250 255
Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro
260 265 270
Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val
275 280 285
Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Ala His
290 295 300
Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr
305 310 315 320
Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala
325 330 335
Gly Thr Cys Tyr
340
<210> 68
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgM CH1-CH2-CH4
<400> 68
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser
35 40 45
Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln
65 70 75 80
Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn
85 90 95
Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys
100 105 110
Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg
115 120 125
Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile
130 135 140
Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr
145 150 155 160
Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr
165 170 175
Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln
180 185 190
Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln
195 200 205
Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Val Ala Leu His Arg Pro Asp
210 215 220
Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser
225 230 235 240
Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe
245 250 255
Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val
260 265 270
Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala
275 280 285
His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr
290 295 300
Tyr Thr Cys Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu
325 330 335
Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
340 345
<210> 69
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgM CH2-CH3
<400> 69
Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp
1 5 10 15
Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr
20 25 30
Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys
35 40 45
Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys
50 55 60
Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys
65 70 75 80
Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His
85 90 95
Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp
100 105 110
Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser
115 120 125
Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu
130 135 140
Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu
145 150 155 160
Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr
165 170 175
Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser
180 185 190
Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro
195 200 205
Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly
210 215
<210> 70
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgM CH2-CH4
<400> 70
Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp
1 5 10 15
Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr
20 25 30
Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys
35 40 45
Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys
50 55 60
Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys
65 70 75 80
Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His
85 90 95
Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp
100 105 110
Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu
115 120 125
Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln
165 170 175
Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu
180 185 190
Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Ala His Glu Ala Leu
195 200 205
Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro
210 215 220
Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys
225 230 235 240
Tyr
<210> 71
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgM CH2-CH3-CH4
<400> 71
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser
35 40 45
Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln
65 70 75 80
Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn
85 90 95
Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys
100 105 110
Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg
115 120 125
Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile
130 135 140
Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr
145 150 155 160
Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr
165 170 175
Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln
180 185 190
Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln
195 200 205
Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Val Ala Leu His Arg Pro Asp
210 215 220
Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser
225 230 235 240
Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe
245 250 255
Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val
260 265 270
Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala
275 280 285
His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr
290 295 300
Tyr Thr Cys Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu
325 330 335
Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
340 345
<210> 72
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgM CH3-CH4
<400> 72
Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu
1 5 10 15
Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly
20 25 30
Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro
35 40 45
Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln
50 55 60
Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu
65 70 75 80
Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Ala His Glu Ala Leu
85 90 95
Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro
100 105 110
Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys
115 120 125
Tyr
<210> 73
<211> 908
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码融合蛋白ASKBH2的DNA
<400> 73
aagcttgccg ccaccatgga acgacattgg attttccttt tcctcttctc tgtcaccgcc 60
ggagtgcata gccacggaga gggaaccttc accagcgacg tgtcctccta cctggaagaa 120
caggccgcta aggagtttat cgcgtggttg gtcaagggtg gaggcggcgg gggagggtcc 180
ggcggcggag gctcaggcgg agggggctcc gcagagtcaa aatatgggcc gccctgcccg 240
ccgtgcccag ccccggaggc cgcgggcggt ccgagcgtgt ttttgttccc gcctaaaccg 300
aaggaccagc tgatgatttc ccgcactcct gaagtcacct gtgtggtggt ggacgtgtca 360
caagaggacc ccgaagtgca gttcaattgg tacgtcgacg gagtggaagt gcacaacgcc 420
aagactaagc ctcgcgagga gcagttcaac tccacgtacc gggtcgtgtc agtgcttact 480
gtgctgcacc aggattggct gaacggaaag gagtacaagt gcaaagtgtc caacaagggg 540
ctcccatcgt cgatcgaaaa gactatctcc aaggccaagg gtcaacctcg ggagccacaa 600
gtctacaccc tgcccccgag ccaggaagag atgaccaaga accaagtgtc cctgacatgt 660
ctcgtgaagg ggttctaccc ctccgacatc gcggtggaat gggaatcgaa cggacagccc 720
gaaaacaact acaagaccac cccccctgtc ctggatagcg atggcagctt cttcctgtac 780
tcgagactca ccgtggacaa gtcgcggtgg caggagggca acgtgttcag ctgctccgtg 840
ctgcacgaag ccctgcacaa ccactacacc caaaagtccc tgtccctgag cctgggatag 900
ttaattaa 908
<210> 74
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白ASKBH2
<400> 74
Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Glu Glu Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
65 70 75 80
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
85 90 95
Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
100 105 110
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
115 120 125
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
130 135 140
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
145 150 155 160
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
165 170 175
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
180 185 190
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
195 200 205
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
210 215 220
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
225 230 235 240
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
245 250 255
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
260 265 270
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
275 280 285
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
290
<210> 75
<211> 908
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码融合蛋白ASKBH3的DNA
<400> 75
aagcttgccg ccaccatgga acgacattgg attttccttt tcctcttctc tgtcaccgcc 60
ggagtgcata gccacggaga gggaaccttc accagcgacg tgtcctccta cctggaagaa 120
caggccgcta aggagtttat cgcgtggttg gtcaagggtg gaggcggcgg gggagggtcc 180
ggcggcggag gctcaggcgg agggggctcc gcagagtcaa aatatgggcc gccctgcccg 240
ccgtgcccag ccccggaggc cgcgggcggt ccgagcgtgt ttttgttccc gcctaaaccg 300
aaggacactc tgatgatttc ccgcactcct gaagtcacct gtgtggtggt ggacgtgtca 360
caagaggacc ccgaagtgca gttcaattgg tacgtcgacg gagtggaagt gcacaacgcc 420
aagactaagc ctcgcgagga gcagttcaac tccacgtacc gggtcgtgtc agtgcttact 480
gtgctgcacc aggattggct gaacggaaag gagtacaagt gcaaagtgtc caacaagggg 540
ctcccatcgt cgatcgaaaa gactatctcc aaggccaagg gtcaacctcg ggagccacaa 600
gtctacaccc tgcccccgag ccaggaagag atgaccaaga accaagtgtc cctgacatgt 660
ctcgtgaagg ggttctaccc ctccgacatc gcggtggaat gggaatcgaa cggacagccc 720
gaaaacaact acaagaccac cccccctgtc ctggatagcg atggcagctt cttcctgtac 780
tcgaagctca ccgtggacaa gtcgcggtgg caggagggca acgtgttcag ctgctccgtg 840
ctgcacgaag ccctgcacaa ccactacacc caaaagtccc tgtccctgag cctgggatag 900
ttaattaa 908
<210> 76
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白ASKBH3
<400> 76
Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Glu Glu Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
65 70 75 80
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
85 90 95
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
100 105 110
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
115 120 125
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
130 135 140
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
145 150 155 160
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
165 170 175
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
180 185 190
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
195 200 205
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
210 215 220
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
225 230 235 240
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
245 250 255
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
260 265 270
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
275 280 285
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
290

Claims (34)

1.一种二聚体融合蛋白，其包含两个多肽，第一多肽包含第一肽(P1)、接头(L1)和Fc区(F1)，第二多肽包含第二肽(P2)、接头(L2)和Fc区(F2)，
其中P1和P2各自独立为GLP-1、GLP-1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽(exendin)或毒蜥外泌肽类似物；
其中F1和F2各自独立为IgG Fc、IgG Fc类似物、IgA Fc、IgA Fc类似物、IgM Fc、IgM Fc类似物、IgD Fc、IgD Fc类似物、IgE Fc、IgE Fc类似物、SEQ ID NO：35和/或SEQ IDNO：35类似物；且
其中所述肽P1和P2的C-末端通过接头L1和L2与Fc区F1和F2的N-末端相连接。
2.如权利要求1所述的二聚体融合蛋白，其中所述GLP-1、GLP-1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽和/或毒蜥外泌肽类似物具有一个添加的或用于取代天然存在N-末端氨基酸的N-末端氨基酸His或dHis。
3.如权利要求1或2所述的二聚体融合蛋白，其中所述GLP-1、GLP-1类似物、胰高血糖素、胰高血糖素类似物、GIP、GIP类似物、胃泌酸调节素、胃泌酸调节素类似物、毒蜥外泌肽和/或毒蜥外泌肽类似物的N-末端第二个氨基酸为Gly、氨基异丁酸(Aib)、D-Ala、D-Ser、D-Gly或D-Val。
4.如权利要求1-3中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中P1为GLP-1类似物，所述GLP-1类似物的N-末端为His或D-His；所述GLP-1类似物的第二个氨基酸选自Gly、氨基异丁酸(Aib)、D-Ala、D-Ser、D-Gly和D-Val；P2选自GIP、GIP类似物、胰高血糖素和胰高血糖素类似物。
5.如权利要求1-3中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中P1或P2为GLP-1类似物，所述GLP-1类似物包含选自由SEQ ID NO：14-19及与SEQ ID NO：14-19中的一个或多个氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
6.如权利要求1-3中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中P1或P2为GLP-1类似物，所述GLP-1类似物包含选自由SEQ ID NO：14-19及与SEQ ID NO：14-19中的一个或多个氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中P1或P2为GIP类似物，所述GIP类似物包含选自SEQ ID NO：20、21及与SEQ ID NO：20或21中的一个或多个氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的氨基酸序列的氨基酸序列。
8.如权利要求1-6中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中P1或P2为GIP类似物，其中所述GIP类似物包含选自由SEQ ID NO：20、21及与SEQ ID NO：20或21中的一个或多个氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的二聚体融合蛋白，其对所述GLP-1受体、GIP受体及胰高血糖素受体有激动剂活性。
10.如权利要求1-8中任一项所述的二聚体融合蛋白，其对所述GLP-1受体、GIP受体及胰高血糖素受体中的任两种受体有双重激动剂活性。
11.如权利要求1-10中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述IgG Fc为lgG1 Fc、lgG2Fc或lgG4Fc。
12.如权利要求1-11中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者都包含lgG4Fc类似物，F1或F2包含选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO：31-35及42-71中的任一序列、与SEQ ID NO：31-35及42-71中的一个或多个序列相比具有l、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列、与SEQ ID NO：31-35及42-71中的一个或多个序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
13.如权利要求1-12中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者都包含GLP-1类似物-Fc融合蛋白，所述GLP-1类似物-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列、与SEQ ID NO：37相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列、与SEQ ID NO：37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
14.如权利要求1-13中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者都包含GIP类似物-Fc融合蛋白，所述GIP类似物-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列、与SEQ ID NO：36相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列、与SEQ ID NO：36具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
15.如权利要求1-14中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者由SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：75的多核苷酸编码，由与SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：75相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的多核苷酸编码，或由与SEQ IDNO：73或SEQ IDNO：75具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的多核苷酸编码。
16.如权利要求1-15中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽、第二多肽或两者都包含SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：76、与SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：76相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列、与SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：76具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
17.如权利要求1-16中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中将一个咪唑基团与P1和/或P2的N-末端相连接。
18.如权利要求1-17中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为双重GLP-1受体和GIP受体共激动剂，所述分子的GLP-1受体/GIP受体活性相对比在100到0.01范围内。
19.如权利要求1-17中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为双重GLP-1受体和胰高血糖素受体共激动剂，所述分子的GLP-1受体/胰高血糖素受体活性相对比在100到0.01范围内。
20.如权利要求1-19中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为同源二聚体。
21.如权利要求1-19中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述融合蛋白为异源二聚体。
22.如权利要求21所述的二聚体融合蛋白，其中：
a)所述第一肽P1与IgG Fc片段(F1)连接，所述第二肽与另一IgG Fc片段(F2)融合；
b)F1和F2衍生自相同IgG Fc，但具有不同氨基酸序列；
c)用侧链体积较大的氨基酸残基取代界面处的F1氨基酸残基，从而在F1上产生突起；或
d)用侧链体积较小的氨基酸残基取代界面处的F2氨基酸残基，从而在F2中产生空腔，其中在装配所述异源二聚体时，所述的F1突起可定位于所述空腔中。
23.如权利要求21或22所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽包含氨基酸序列SEQID NO.36或与SEQ ID NO.36相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列，且所述第二多肽包含如SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
24.如权利要求21或22所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽包含氨基酸序列SEQID NO.36或与SEQ ID NO.36具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同源性的氨基酸序列，且所述第二多肽包含如SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
25.如权利要求21或22所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽包含如SEQ IDNO.38中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.38相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列，且所述第二多肽包含如SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO.39相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
26.如权利要求21或22所述的二聚体融合蛋白，其中所述第一多肽包含如SEQ IDNO.38中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.38具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同源性的氨基酸序列，且所述第二多肽包含如SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：39具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
27.如权利要求1-26中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述两个肽中的至少一个包含至少一个非天然氨基酸；以化学方法合成所述含有非天然氨基酸的肽；所述重组Fc类似物的N-末端为Cys；所述肽通过天然化学连接反应与重组Fc类似物融合。
28.如权利要求1-27中任一项所述的二聚体融合蛋白，其中所述两个肽中的至少一个包含至少一个非天然氨基酸，并以化学方法合成所述含有非天然氨基酸的肽；所述化学合成的肽包含醛基；所述重组Fc类似物的N-末端为Cys；所述肽通过形成噻唑烷与所述重组Fc类似物的N-末端进行位点特异性偶联。
29.一种药物组合物，其包含如权利要求1-28中任一项所述的二聚体融合蛋白。
30.如权利要求1-28中任一项所述的二聚体融合蛋白在制备治疗病症的药物中的用途。
31.一种在个体中治疗病症的方法，所述方法包含向有需要的个体施用如权利要求1-28中任一项所述的二聚体融合蛋白、如权利要求29所述的药物组合物或如权利要求30所述的药物。
32.用于治疗病症的如权利要求1-28中任一项所述的二聚体融合蛋白、如权利要求29所述的药物组合物或如权利要求30所述的药物。
33.如权利要求1-28中任一项所述的二聚体融合蛋白、如权利要求29所述的药物组合物或如权利要求30所述的药物在治疗病症中的用途。
34.如权利要求31所述的方法、如权利要求32所述的二聚体融合蛋白或如权利要求33所述的用途，其中所述病症为糖尿病、肥胖、在超重个体中诱导体重减轻或者脂肪变性。
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