CN110225924A - 松弛素融合多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及松弛素融合多肽，具体涉及松弛素2融合多肽及其用途。因此，本发明提供了松弛素融合多肽、核酸分子、载体、宿主细胞、药物组合物和包含其的试剂盒以及其包括治疗方法的用途。本发明的多肽和组合物尤其可用于治疗心血管疾病，例如用于治疗心力衰竭。
Description
技术领域
本发明涉及松弛素融合多肽。特别地，本发明涉及松弛素2融合多肽及其用途。
背景技术
松弛素是属于胰岛素超家族的肽激素。在人类中，该松弛素肽家族包括具有高结构相似性但是低序列相似性的七种肽：松弛素1、松弛素2和松弛素3以及胰岛素样肽INSL3、INSL4、INSL5和INSL6。松弛素基因的编码区从信号肽开始，随后是B多肽链、C肽和A多肽链。信号肽和C肽通过蛋白水解除去以产生成熟的松弛素蛋白，该成熟的松弛素蛋白由通过两个链间二硫键共价连接的A链和B链组成。A链具有另外的链内二硫键。成熟的松弛素蛋白具有约6000Da的分子量。
松弛素是已知在妊娠期间介导全身血液动力学改变和肾脏适应性改变的多效激素。松弛素还示出具有抗纤维化特性并且在心力衰竭中具有有益效果。心力衰竭与显著的发病率和死亡率相关。其特征在于涉及增加的心肌细胞死亡和间质纤维化的复合组织重塑(Bathgate等人,2013；Felker等人,2014；Mentz等人,2013；Tietjens等人,2016；Wilson等人,2015)。松弛素激活大量信号传导级联，这些信号传导级联已示出在缺血-再灌注和心力衰竭的环境中是有益的(Bathgate等人,2013)。这些信号传导途径包括激活磷酸肌醇3-激酶途径和激活一氧化氮信号传导途径(Bathgate等人,2013)。
已经使用未修饰的重组人松弛素2，即serelaxin进行了临床试验。Serelaxin目前正处于急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的III期临床试验。在该研究中，通过对住院的心力衰竭患者连续静脉内输注48小时来给药serelaxin(ClinicalTrials.gov标识符：NCT02064868)。在以前完成的临床试验中，静脉内给予serelaxin改进了心脏、肾脏和肝脏损害和充血的标记(Felker等人,2014；Teerlink等人,2013；Metra等人,2013)。然而，由于serelaxin从患者循环中快速清除，治疗效果对于住院的患者是受限的，并且一旦静脉内注射停止，正面效果迅速消失。另外，在静脉内接受serelaxin后，大约三分之一的患者经历了显著的血压降低(>40mm Hg)，因此必须将剂量减少一半或甚至更多。
WO 2013/004607描述了重组单链松弛素融合多肽，其中松弛素A链多肽通过接头序列融合至松弛素B链多肽。作者们发现至少五个氨基酸和少于十五个氨基酸的接头长度对于松弛素活性是必要的。WO 2013/004607还描述了融合至抗体的Fc结构域的重组单链松弛素2融合多肽，其表现出了比野生型松弛素2改善的半衰期。
鉴于目前用未修饰的重组松弛素进行的有希望的临床研究，仍然需要另外的重组松弛素融合多肽，这些融合多肽保留了松弛素的生物活性并提供了例如延长的半衰期和方便给药等优点。
发明内容
本发明涉及松弛素融合多肽，这些融合多肽包含由接头多肽连接的松弛素A链和松弛素B链，其中该接头多肽包含至少15个氨基酸。与其相关的是，本发明提供了融合多肽、核酸分子、载体、宿主细胞、药物组合物和包含其的试剂盒以及其包括治疗方法的用途。
在所附权利要求书中陈述了本发明的多个方面和实施例。本文还描述了本发明的这些和其他的方面和实施例。
附图和序列表说明
现在将参考附图更详细地描述本发明，其中：
图1提供了根据本发明的一些实施例的松弛素2融合多肽的示意图和缩写名；
图2示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc_hRLX2_4-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列)；
图3示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc-TM_hRLX2_4-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列；加下划线且加粗的是Fc部分中的TM突变)；
图4示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc-FQQ_hRLX2_4-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列；加下划线且加粗的是Fc部分中的FQQ突变)；
图5示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc-YTE_hRLX2_4-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列；加下划线且加粗的是Fc部分中的YTE突变)；
图6示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc-YTE-TM_hRLX2_4-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列；加下划线且加粗的是Fc部分中的YTE-TM突变)；
图7示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc-YTE-FQQ_hRLX2_4-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列；加下划线且加粗的是Fc部分中的YTE-FQQ突变)；
图8示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc-G4P_hRLX2_4-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列)；
图9示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc_hRLX2_15-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列)；
图10示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc-TM_hRLX2_15-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列；加下划线且加粗的是Fc部分中的TM突变)；
图11示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc-FQQ_hRLX2_15-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列；加下划线且加粗的是Fc部分中的FQQ突变)；
图12示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc-YTE_hRLX2_15-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列；加下划线且加粗的是Fc部分中的YTE突变)；
图13示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc-YTE-TM_hRLX2_15-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列；加下划线且加粗的是Fc部分中的YTE-TM突变)；
图14示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc-YTE-FQQ_hRLX2_15-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列；加下划线且加粗的是Fc部分中的YTE-FQQ突变)；
图15示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc-G4P_hRLX2_15-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列)；
图16示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc-TMΔTHTΔK_hRLX2_21-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列；加下划线且加粗的是Fc部分中的TMΔTHTΔK突变)；
图17示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(Fc-TMΔTHTΔK_hRLX2(BA)_21-15AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列；加下划线且加粗的是Fc部分中的TMΔTHTΔK突变)；
图18示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(hRLX2_Fc-TMΔTHTΔK_15-24AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列；加下划线且加粗的是Fc部分中的TMΔTHTΔK突变)；
图19示出了根据本发明的一个实施例的松弛素2融合多肽(hRLX2(BA)_Fc-TMΔTHTΔK_15-24AA)的核苷酸(上图)序列和氨基酸(下图)序列(加下划线的分别是连接子(单下划线)序列和接头(双下划线)序列；加下划线且加粗的是Fc部分中的TMΔTHTΔK突变)；
图20示出了在表达RXFP1的细胞中的本发明的一些松弛素2融合多肽的体外活性。相对光单位(RLU)表示对cAMP产生进行的刺激；
图21示出了在表达RXFP1的细胞中的本发明的一些松弛素2融合多肽的体外活性(刺激cAMP产生)；
图22示出了本发明的一些松弛素2融合多肽对松弛素-2受体的特异性；
图23示出了通过本发明的一些松弛素2融合多肽诱导VEGF表达。在此图中，“零＝1”意味着将用模拟“无处理”对照(即，在测定中不添加RLX2或RLX2融合多肽)测量的活性用作基线(即，“无处理”对照的倍数变化值是1)；
图24示出了静脉内给予(上图)或皮下给予(下图)融合多肽Fc_hRLX2_4-15AA(4mg/kg)的大鼠PK曲线；
图25示出了静脉内给予(上图)或皮下给予(下图)融合多肽Fc_hRLX2_15-15AA(4mg/kg)的大鼠PK曲线；
图26示出了静脉内给予(“IV”，圆形)或皮下给予(“SC”，三角形)融合多肽Fc_hRLX2_15-15AA(6mg/kg)的小鼠PK曲线。“CL”表示在IV给予后的Fc-松弛素的机体总清除率并且“CL/F”表示在SC给予后的Fc-松弛素的表观机体总清除率；
图27示出了皮下给予融合多肽Fc_hRLX2_15-15AA(1mg/kg(圆形)、6mg/kg(正方形)和30mg/kg(三角形))的小鼠PK曲线。“CL”表示在IV给予后的Fc-松弛素的机体总清除率并且“CL/F”表示在SC给予后的Fc-松弛素的表观机体总清除率；
图28示出了在基于细胞的cAMP测定中，本发明的一些Fc-松弛素-2融合多肽在人(A)细胞系和小鼠(B)细胞系中的体外活性和RXFP2选择性(C)；
图29示出在用Fc_hRLX2_15-15AA处理的小鼠中对异丙肾上腺素诱导的心脏肥大的预防。(A)表示心脏重量(HW)/胫骨长度(TL)的比率(mg/mm)，(B)表示测试的6个组的胶原含量(μg/mg组织)：(1)运载体，(2)Fc_hRLX2_15-15AA，(3)异丙肾上腺素，(4)异丙肾上腺素+依那普利，(5)异丙肾上腺素+rhRLX2，(6)异丙肾上腺素+Fc_hRLX2_15-15AA。
SEQ ID NO的关键信息：
具体实施方式
本发明涉及具有结构A-L-B或B-L-A的松弛素融合多肽，其中松弛素A链(A)经由接头多肽(L)连接至松弛素B链(B)，并且其中接头多肽L为至少15个氨基酸长。在一些实施例中，松弛素融合多肽是松弛素2融合多肽。松弛素2融合多肽包含松弛素2 A链和松弛素2 B链。
本发明是基于以下令人惊讶的发现：其中的接头多肽L包含至少15个氨基酸的融合多肽具有松弛素活性。因此，本发明人发现松弛素2融合多肽(其中A链的C末端由15个氨基酸的接头连接至B链的N-末端)展示出与松弛素2蛋白相当的生物活性，该松弛素2蛋白具有成熟松弛素2多肽(即，A链和B链之间不具有接头，例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号P04090.1的松弛素2多肽)的A链和B链阵列。相似地，本发明人发现松弛素2融合多肽(其中B链的C末端由15个氨基酸的接头连接至A链的N-末端)展示出与松弛素2蛋白相当的生物活性，该松弛素2蛋白具有成熟松弛素2多肽的A链和B链阵列。鉴于PCT公开WO 2013/004607中的教导(其中发现长度少于十五个氨基酸的接头是生物活性所必需的)，这些发现是特别惊人的。
天然存在的松弛素被表示为具有结构B-C-A的激素原(其中“B”为B链，“C”为C肽，并且“A”为松弛素的A链)，并且通过用激素原-转化酶1(PC1)和激素原-转化酶2(PC2)内切蛋白水解切割激素原以除去C肽来产生成熟蛋白。应当理解的是本发明的融合多肽不经受PC1和PC2的这种内切蛋白水解切割。
本发明的融合多肽包含松弛素A链多肽或其变体和松弛素B链多肽或其变体。在一些实施例中，松弛素B链多肽在其C-末端不具有任何附着物。换言之，松弛素B链多肽具有游离C-末端。
在其他实施例中，松弛素A链多肽在其C-末端不具有任何附着物。换言之，松弛素A链多肽具有游离C-末端。
融合多肽可包含来自以下组的松弛素的松弛素A链多肽和松弛素B链多肽，该松弛素选自松弛素1、松弛素2和松弛素3。在一些实施例中，融合多肽包含来自松弛素2或松弛素3的松弛素A链多肽和松弛素B链多肽。因此，融合多肽可包含松弛素2 A链多肽或松弛素3 A链多肽或其变体和松弛素2 B链多肽或松弛素3 B链多肽或其变体。在一些其他实施例中，融合多肽包含松弛素3 A链多肽或其变体和松弛素3 B链多肽或其变体。特别地，融合多肽可包含人松弛素A链多肽和人松弛素B链多肽。
融合多肽可包含松弛素2 A链多肽或其变体和松弛素2 B链多肽或其变体。在具体的实施例中，松弛素A链多肽包含人松弛素2 A链多肽或其变体和人松弛素2 B链多肽或其变体。人松弛素2 A链多肽可具有如SEQ ID NO.42所示的序列或其变体，并且人松弛素2 B链多肽可具有如SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.46所示的序列或其变体。在另外的实施例中，人松弛素2 A链多肽具有如SEQ ID NO.42所示的序列并且人松弛素2 B链多肽具有如SEQID NO.46所示的序列。
松弛素A链变体和松弛素B链变体是本领域已知的。此外，技术人员可获得对松弛素A链变体和松弛素B链变体的设计的指导。例如，应当理解的是变体可以保留松弛素功能所必需的那些氨基酸。例如，松弛素2 B链变体可包含保守基序Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile(SEQ ID NO.55)(Claasz等人,2002，Wilkinson等人,2005)或Arg-X-X-X-Arg-X-X-Val(SEQID NO.60)(Bathgate等人,2013)。变体可包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。例如，松弛素2 B链变体与SEQ ID NO.44相比可具有一个或多个选自Val23、Ala24、Lys54、Arg55和N-末端Met的另外的氨基酸。可替代地或另外，变体可包含一个或多个氨基酸衍生物。例如，松弛素2 B链变体的第一氨基酸可以是焦谷氨酸。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可以互换使用以指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的链。
本发明的融合多肽可以是重组融合多肽，即其已由重组DNA技术产生。不同于野生型松弛素蛋白，本发明的融合多肽不需要针对生物活性进行内切蛋白水解加工。
松弛素家族肽至少部分地通过激活G蛋白偶联受体(GPCR)、以及随后分别通过Gs蛋白亚基或Gi蛋白亚基刺激或抑制cAMP信号传导途径来介导它们的生物效应。松弛素2已知激活GPCR RXFP1(也称为LGR7)并且在较小程度上激活GPCR RXFP2(也称为LGR8)，因此刺激Gs-cAMP依赖性信号传导途径，导致第二信使分子cAMP的增加。
如本文所使用的，术语“松弛素活性”是指松弛素分子结合松弛素受体、和/或激活所述松弛素受体和/或引发细胞内信号传导级联的能力。在其中松弛素活性是松弛素2的活性的实施例中，松弛素活性可以是指结合和/或激活受体RXFP1和/或RXFP2的能力。在其中松弛素活性是松弛素3的活性的实施例中，松弛素活性可以是指结合和/或激活受体RXFP1、RXFP3和/或RXFP4的能力(Bathgate等人,2013)。术语“松弛素活性”可与“生物活性”互换使用。
通过测量松弛素分子与松弛素受体的结合，和/或通过测量来自与松弛素受体结合的下游事件，可测定松弛素活性。
可测定体外和/或体内松弛素活性。在一些实施例中，松弛素活性在体外测定。
通过测量来自受体被松弛素激活的下游的分子的量和/或存在，可测定松弛素活性。例如，通过测量cAMP产生随后测量受体被松弛素激活，可测定松弛素活性。用于检测松弛素诱导的cAMP产生的方法是本领域已知的。此类方法包括cAMP ELISA和cAMP测定。还可通过测量一氧化氮(NO)产生随后测量受体被松弛素激活来测定松弛素活性。还可通过测量来自受体被松弛素激活的下游的分子的激活来测定松弛素活性。例如，通过测量p42/44 MAPK的激活，可测定松弛素活性。
可替代地或另外，通过测量已知松弛素靶基因的激活，可测定松弛素活性。例如，通过测量已知松弛素靶基因(即VEGF)在THP-1细胞中的转录的激活，可测定松弛素活性。测定基因转录的激活的方法是本领域已知的并且包括mRNA的定量PCR分析。VEGF mRNA的相对表达可通过定量实时PCR诱导VEGF转录物随后如Xiao等人(2013)所述的用松弛素孵育THP-1细胞来测量。
可替代地或另外，通过测量松弛素的一个或多个下游效应，可测定松弛素活性。例如，可根据标准方法，通过超声心动图、相对于体重的左心室重量和/或胫骨长度来测量心脏肥大的减少。在另一个实例中，通过用梅森氏三色染色(Masson’s Trichrome Stain)测量纤维化减少，可测定松弛素活性。在另一个实例中，通过测量对结缔组织代谢的调节，例如，抑制促纤维化因子(例如，TGF-β)、抑制成纤维细胞增殖和分化、和/或激活MMP介导的细胞外基质降解(Bathgate等人,2013)，可测定松弛素活性。
可测定本发明的松弛素融合多肽相对于参考松弛素蛋白的活性。在一些实施例中，参考松弛素蛋白是重组蛋白。可测定松弛素融合多肽相对于参考松弛素蛋白的活性，该参考松弛素蛋白具有成熟松弛素多肽(即，A链和B链之间不具有接头，例如，UniProtKB/Swiss-Prot登录号P04090.1的松弛素2多肽)的松弛素A链和松弛素B链阵列。此类松弛素是可商购的。例如，具有成熟人松弛素2的松弛素2 A链和松弛素2 B链阵列的重组人松弛素2可获得自R&D系统公司(R&D systems)(目录号6586-RN-025)。在一些实施例中，参考松弛素蛋白具有与本发明的融合多肽的A松弛素链和B松弛素链相同的A松弛素链和B松弛素链，或者与本发明的融合多肽的A松弛素链和B松弛素链相差多达10个氨基酸，例如1个或2个氨基酸。在其他实施例中，参考松弛素2的B链的第一氨基酸是D，并且该氨基酸在本发明的融合多肽的B链上缺失。在另外的实施例中，当融合多肽包含SEQ ID NO.42的松弛素2 A链多肽和SEQ ID NO.44或46的松弛素2 B链多肽时，参考松弛素是重组松弛素2，其具有成熟人松弛素2的A链和B链阵列并且具有UniProtKB/Swiss-Prot登录号P04090.1下披露的氨基酸序列。
如果本发明的融合多肽显示出参考松弛素蛋白的至少一部分活性，则它们可被认为具有松弛素活性。例如，如果融合多肽具有参考松弛素蛋白的至少约一半的活性，则它可被认为具有松弛素活性。可替代地，如果所述融合多肽的活性与参考松弛素蛋白的活性的比率被包括在1和约105之间、1和约104之间、约1和约103之间、约1和约100之间、约1和约50之间、约1和约20之间、约1和约15之间、约1和约10之前、或约1和约5之间，则本发明的融合多肽可被认为具有松弛素活性。可替代地，如果所述融合多肽的活性与参考松弛素蛋白的活性的比率被包括在约10-5和约1之间、约10-4和约1之间、约10-3和约1之间、约10-2和约1之间、约1/50和约1之间、约1/20和约1之间、约1/15和约1之间、约1/10和约1之间、约1/5和约1之间，则本发明的融合多肽可被认为具有松弛素活性。
在某些实施例中，本发明的融合多肽的松弛素活性与参考松弛素蛋白的松弛素活性的比率被包括在约10-5和约105之间。
在一些实施例中，本发明的融合多肽的活性与参考松弛素蛋白的活性的比率被包括在约1和约100之间，例如约1和约50之间、约1和约20之间、或约1和约15之间、或约1和约10之间、或约1和约5之间。
在其他实施例中，本发明的融合多肽的活性与参考松弛素蛋白的活性的比率被包括在约10-2和约1之间、或约1/50和约1之间，例如约1/20和约1之间、约1/15和约1之间、约1/10和约1之间、或约1/5和约1之间。
在仍其他实施例中，本发明的融合多肽的活性与参考松弛素蛋白的活性的比率是约1。
松弛素活性可作为EC50值测定。如本文所使用的，术语“EC50”(半数最大有效浓度)是指在指定的暴露时间之后诱导基线和最大值之间的一半的应答的治疗性化合物的有效浓度。
本发明人已示出，本发明的融合多肽与松弛素蛋白一样具有松弛素活性，该松弛素蛋白具有成熟松弛素2多肽(即，A链和B链之间不具有接头)的松弛素2 A链和松弛素2 B链阵列，例如，来自R&D系统公司的重组松弛素蛋白(目录号6586-RN-025)。如在实验部分所示，针对本发明的一些融合多肽测定的平均EC50值与针对来自R&D系统公司的重组松弛素蛋白(目录号6586-RN-025)测定的平均EC50值的比率被包括在约1和约100之间。因此，本发明的融合多肽的EC50值可与参考松弛素蛋白的EC50值相同或基本上相同。可替代地，融合多肽的EC50值可大于参考松弛素蛋白的EC50值。可替代地，融合多肽的EC50值可小于参考松弛素蛋白的EC50值。
本发明的融合多肽可具有如下EC50值，其使得所述融合多肽的EC50与参考松弛素蛋白的EC50的比率被包括在1和约105之间、1和约104之间、约1和约103之间、约1和约100之间、约1和约50之间、约1和约20之间、约1和约15之间、约1和约10之间、或约1和约5之间。可替代地，本发明的融合多肽可具有如下EC50值，其使得所述融合多肽的EC50与参考松弛素蛋白的EC50的比率被包括在约10-5和约1之间、约10-4和约1之间、约10-3和约1之间、约1/100和约1之间、约1/50和约1之间、约1/20和约1之间、约1/15和约1之间、约1/10和约1之间、约1/5和约1之间。在某些实施例中，本发明的融合多肽的EC50值与参考松弛素蛋白的EC50值的比率被包括在约10-5和约105之间。
在一些实施例中，松弛素融合多肽具有如下EC50值：约1.10-11和约1.10-7M之间，例如约1.10-10和约1.10-8M之间、或约1.10-10和约8.10-9M之间、或约1.10-10和约5.10-9M之间、或约1.10-10和约1.10-9M之间。
融合多肽的接头多肽L的长度为至少15个氨基酸残基。在一些实施例中，接头多肽L的长度为至少16个、17个、18个、19个或20个氨基酸残基。接头多肽L的长度可以是15个至30个氨基酸残基，例如接头多肽L的长度可以是15个至25个氨基酸残基或15个至20个氨基酸残基。在一个具体的实施例中，接头多肽L不具有102个氨基酸的氨基酸序列长度。在另一个实施例中，所述接头多肽L的氨基酸序列长度为小于100、小于90、小于80、小于70、小于60、或小于50个氨基酸。
接头多肽L可以由任何氨基酸构成。在一些实施例中，接头多肽L包含甘氨酸残基和丝氨酸残基，例如，Chen等人,2013所述的那些。在另外的实施例中，接头多肽L包含基序(GGGGS)n(SEQ ID NO.58的重复序列)，其中n可以在1和5之间，例如其中n是4。在其他实施例中，接头多肽L包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.57)或由其组成。在替代性实施例中，接头多肽L包含序列A(EAAAK)nA(SEQ ID NO.59)或由其组成，其中n是5，如Chen等人,2013中所述。
接头多肽L可具有与松弛素C肽不同的氨基酸序列，特别地，与氨基酸序列SEQ IDNO.48的人松弛素2 C肽不同的氨基酸序列。特别地，接头多肽L与松弛素C肽，例如，与氨基酸序列SEQ ID NO.48的人松弛素2 C肽可具有小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％的同一性。
接头多肽L可以是人工多肽，例如，通过化学肽合成方法合成的多肽。
本发明的融合多肽还包含半衰期延长部分。因此，在一些实施例中，本发明的融合多肽与相应的参考松弛素相比具有延长的半衰期。将认识到的是，延长的半衰期是有利的，因为它允许根据安全且便利的给药方案(例如能以更低的频率给予的更低的剂量)给予治疗性蛋白。此外，更低的剂量的实现可提供进一步的优势，例如，提供改善的安全性特征和/或激活多种体内作用机制。
本发明人已示出，具有半衰期延长部分的本发明的融合多肽具有松弛素活性并且同时与参考松弛素相比具有延长的半衰期。例如，本发明人已示出，根据本发明的一些实施例的具有半衰期延长部分的融合多肽在大鼠和小鼠模型中具有至少2天的半衰期(参见实例5和实例6)。相比之下，IV给予之后，人松弛素2在人体内的半衰期是约0.09+/-0.04小时，即5.4+/-2.4分钟(Chen等人1993)。
如本文所使用的，术语“半衰期”用于指血浆中的融合多肽浓度降低至其原始水平的50％所用的时间。血浆中多肽的“半衰期”可取决于不同的因素，例如，多肽的大小、其稳定性、其清除率、周转速率、体内蛋白水解降解、身体或具体组织的吸收率等。测定蛋白的半衰期的方法是本领域已知的并且在下面的实例中进行了描述。
半衰期延长部分可以附接在融合多肽的N-末端或C-末端。在一些实施例中，半衰期延长部分附接在融合多肽的N-末端。在其他实施例中，半衰期延长部分附接在融合多肽的C-末端。
在一些实施例中，半衰期延长部分是蛋白质半衰期延长部分。蛋白质半衰期延长部分可选自由以下组成的组：免疫球蛋白的Fc区、白蛋白结合结构域、血清白蛋白和转铁蛋白。在其他实施例中，半衰期延长部分是Fc区。
在另外的实施例中，半衰期延长部分是蛋白或肽之外的化学实体，例如，可共价或非共价附接至本发明的融合多肽的剩余部分的聚乙二醇(PEG)聚合物链。聚乙二醇化(为所述PEG聚合物链附接至分子的过程)可根据本领域熟知的方法进行。
术语“Fc区”定义了免疫球蛋白重链的C-末端区，其通过木瓜蛋白酶消化完整抗体来产生。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，即CH2结构域和CH3结构域，并且任选地包含CH4结构域。
Fc区可衍生自来自任何物种的免疫球蛋白。在一些实施例中，Fc区衍生自人类免疫球蛋白。在另外的实施例中，该Fc区衍生自人类IgG免疫球蛋白。在具体的实施例中，Fc区衍生自人类IgG1免疫球蛋白。在其他实施例中，Fc区衍生自人类IgG4免疫球蛋白。
在一些实施例中，Fc区包含天然Fc序列，即与自然界中发现的氨基酸序列同一的氨基酸序列。在替代性实施例中，Fc区包含变体Fc序列，即与所述氨基酸序列相差至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列。可修饰Fc区以例如增加IgG分子对FcRn的亲和力。PCT公开WO02/060919披露了包含具有一个或多个氨基酸修饰的Fc区的经修饰的免疫球蛋白，并且将其通过引用以其全文并入本文。对于衍生自IgG4免疫球蛋白的Fc区，还可修饰Fc区以减少Fab臂交换(IgG4抗体可交换半数分子的动态过程)，例如，通过在IgG4氨基酸序列中引入S228P修饰，其中氨基酸编号是根据如卡巴特(Kabat)中的EU索引进行的。制备具有一个或多个氨基酸修饰的Fc区的方法是本领域已知的。
在一些实施例中，Fc区包含人类IgG序列，特别地，人类IgG1序列，所述序列含有以下氨基酸修饰的组合的至少一种：
(i)Fc-YTE(M252Y、S254T、T256E)；
(ii)Fc-FQQ(L234F、L235Q、K322Q)；
(iii)Fc-TM(L234F、L235E、P331S)；
(iv)Fc-YTE-FQQ(M252Y、S254T、T256E、L234F、L235Q、K322Q)；
(v)Fc-YTE-TM((M252Y、S254T、T256E、L234F、L235E、P331S)，
(vi)Fc-TM-ΔTHT(L234F、L235E、P331S、D221G、K222G、T223G、H224S、T225A)，
(vii)Fc-TM-ΔTHTΔK(L234F、L235E、P331S、D221G、K222G、T223G、H224S、T225A、ΔK447)，
其中氨基酸编号是根据如卡巴特中的EU索引进行的。
在另外的实施例中，Fc区包含人类IgG4序列。特别地，Fc区包含人类IgG4序列，其中将位置228处的丝氨酸修饰为脯氨酸(“S228P”)，其中氨基酸编号是根据如卡巴特中的EU索引进行的，所述经修饰的Fc区在本文中缩写为“Fc-G4P”。在又另外的实施例中，衍生自IgG4的Fc区包含S228P修饰和以下氨基酸修饰的组合的至少一种：
(i)Fc-YTE(M252Y、S254T、T256E)；
(ii)Fc-FQQ(L234F、L235Q、K322Q)；
(iii)Fc-TM(L234F、L235E、P331S)；
(iv)Fc-YTE-FQQ(M252Y、S254T、T256E、L234F、L235Q、K322Q)；
(v)Fc-YTE-TM((M252Y、S254T、T256E、L234F、L235E、P331S)，
(vi)Fc-TM-ΔTHT(L234F、L235E、P331S、D221G、K222G、T223G、H224S、T225A)，
(vii)Fc-TM-ΔTHTΔK(L234F、L235E、P331S、D221G、K222G、T223G、H224S、T225A、ΔK447)，
其中氨基酸编号是根据如卡巴特中的EU索引进行的。
术语“如在卡巴特中的EU索引”是指在Kabat等人,Sequences of ImmunologicalInterest[免疫学目的的序列],第5版,Public Health Service[公共卫生服务],NationalInstitutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州(1991)中描述的人类IgGlEU抗体的编号系统。本申请引用的所有氨基酸位置均指EU索引位置。例如，“L234”和“EUL234”二者均指在根据如卡巴特提出的EU索引的位置234的氨基酸亮氨酸。
根据本发明的一个方面，提供了包含以下免疫球蛋白恒定结构域的经修饰的免疫球蛋白，该免疫球蛋白恒定结构域相对于野生型免疫球蛋白恒定结构域包含一个或多个氨基酸修饰，其中该一个或多个氨基酸修饰位于位置234、235和331中的一个或多个，其中氨基酸编号是根据如卡巴特中的EU索引进行的。根据另一方面，提供了包含以下免疫球蛋白恒定结构域的经修饰的免疫球蛋白，该免疫球蛋白恒定结构域相对于野生型免疫球蛋白恒定结构域包含一个或多个氨基酸修饰，其中该一个或多个氨基酸修饰位于位置234、235和322中的一个或多个，其中氨基酸编号是根据如卡巴特中的EU索引进行的。根据本发明的另一个方面，提供了包含以下免疫球蛋白恒定结构域的经修饰的免疫球蛋白，该免疫球蛋白恒定结构域相对于野生型免疫球蛋白恒定结构域包含一个或多个氨基酸修饰，其中该一个或多个氨基酸修饰位于位置221、222、223、224、225和447中的一个或多个，其中氨基酸编号是根据如卡巴特中的EU索引进行的。根据本发明的仍另外的方面，提供了包含以下免疫球蛋白恒定结构域的经修饰的免疫球蛋白，该免疫球蛋白恒定结构域相对于野生型免疫球蛋白恒定结构域包含一个或多个氨基酸修饰，其中该一个或多个氨基酸修饰位于位置221、222、223、224、225、234、235、331和447中的一个或多个，其中氨基酸编号是根据如卡巴特中的EU索引进行的。在一些实施例中，该一个或多个氨基酸修饰消除了Fc区的效应子功能和/或减少或规避了细胞毒性，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
根据本发明的一个方面，提供了包含以下免疫球蛋白恒定结构域的经修饰的免疫球蛋白，该免疫球蛋白恒定结构域相对于野生型免疫球蛋白恒定结构域包含一个或多个氨基酸修饰，其中该一个或多个氨基酸修饰位于位置252、254和256中的一个或多个，其中氨基酸编号是根据如卡巴特中的EU索引进行的。在一些实施例中，一个或多个氨基酸修饰提高了融合多肽的半衰期。
在一些实施例中，一个或多个氨基酸修饰是氨基酸取代。
在其他实施例中，一个或多个氨基酸修饰是氨基酸缺失。
在另外的实施例中，一个或多个氨基酸取代包括以下中的一个或多个：在位置234处被苯丙氨酸取代、在位置235处被谷氨酸取代、和/或在位置331处被丝氨酸取代。在具体的实施例中，修饰的免疫球蛋白包含在位置234处苯丙氨酸、在位置235处谷氨酸和在位置331处丝氨酸的氨基酸取代。此处提到的氨基酸编号是根据如卡巴特中的EU索引进行的。
在另外的实施例中，一个或多个氨基酸取代包括以下中的一个或多个：在位置234处被苯丙氨酸取代、在位置235处被谷氨酰胺取代、和/或在位置322处被谷氨酰胺取代。在具体的实施例中，修饰的免疫球蛋白包含在位置234处苯丙氨酸、在位置235处谷氨酰胺和在位置322处谷氨酰胺的氨基酸取代。此处提到的氨基酸编号是根据如卡巴特中的EU索引进行的。
在其他实施例中，一个或多个氨基酸取代包括以下中的一个或多个：在位置252处被酪氨酸取代、在位置254处被苏氨酸取代、和/或在位置256处被谷氨酸取代。在具体的实施例中，修饰的免疫球蛋白包含在位置252处酪氨酸、在位置254处苏氨酸和在位置256处谷氨酸的氨基酸取代。此处提到的氨基酸编号是根据如卡巴特中的EU索引进行的。
在仍其他实施例中，一个或多个氨基酸修饰包括以下中的一个或多个：在位置221处被甘氨酸取代、在位置222处被甘氨酸取代、在位置223处被甘氨酸取代、在位置224处被丝氨酸取代、在位置225处被丙氨酸取代、和/或在位置447处缺失赖氨酸，其中氨基酸编号是根据如卡巴特中的EU索引进行的。
在仍其他实施例中，一个或多个氨基酸修饰包括以下中的一个或多个：在位置221处被甘氨酸取代、在位置222处被甘氨酸取代、在位置223处被甘氨酸取代、在位置224处被丝氨酸取代、在位置225处被丙氨酸取代、在位置234处被苯丙氨酸取代、在位置235处被谷氨酸取代、在位置331处被丝氨酸取代、和/或在位置447处缺失赖氨酸，其中氨基酸编号是根据如卡巴特中的EU索引进行的。
应当理解的是，修饰的免疫球蛋白可进一步包含其他的氨基酸修饰，例如，本文详细描述的其他的氨基酸修饰或其任何组合。
将半衰期延长部分附接至融合多肽的方法是本领域已知的。例如，半衰期延长部分可通过化学缀合或重组技术附接。半衰期延长部分可直接或通过连接子多肽附接至融合多肽。当融合多肽包含蛋白质半衰期延长部分例如Fc区时，连接子多肽的使用可能是特别合适的。
连接子多肽可以是任何合适的长度，例如约1和100个氨基酸之间的长度、约1和50个氨基酸之间的长度、约1和25个氨基酸之间的长度、约1和15个氨基酸之间的长度或约4和15个氨基酸之间的长度。在一些实施例中，连接子的长度是在4和15个氨基酸之间。例如，连接子的长度可以是4个、5个、或15个氨基酸。在其他实施例中，连接子的长度是在15个和25个氨基酸之间，例如连接子的长度可以是15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸。
连接子多肽可包含任何氨基酸。适用于本发明的连接子多肽可包括Chen等人,2013中所述的那些中的任何一个。在一些实施例中，连接子包含甘氨酸残基和丝氨酸残基，例如Chen等人,2013所述。在另外的实施例中，连接子多肽包含基序GGGGS(SEQ ID NO.58)的一个或多个重复序列。例如，连接子多肽可包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.57)。在另外的实施例中，连接子多肽在C-末端和/或N-末端具有脯氨酸残基。在其他实施例中，连接子多肽在C-末端和/或N-末端具有一个或多个，例如1至3个丙氨酸残基。在一些实施例中，连接子多肽包含与融合多肽的接头多肽L相同的序列或由其组成。
连接子的实例包括：GGSP(SEQ ID NO.56)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO.69)、AAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSA(SEQ ID NO.70)。
本发明的融合多肽可以是单链松弛素融合多肽。
在一些实施例中，本发明的融合多肽具有结构：
Fc-Cn-A-L-B或Fc-Cn-B-L-A
其中A是松弛素A链多肽或其变体；B是松弛素B链多肽或其变体；L是包含至少15个氨基酸的接头多肽；Cn是连接子多肽；并且Fc是免疫球蛋白重链的Fc区。
在一些实施例中，本发明的融合多肽具有结构：
A-L-B-Cn-Fc或B-L-A-Cn-Fc
其中A是松弛素A链多肽或其变体；B是松弛素B链多肽或其变体；L是包含至少15个氨基酸的接头多肽；Cn是连接子多肽；并且Fc是免疫球蛋白重链的Fc区。
在另外的实施例中，本发明的融合多肽是如表1和图1至图19中所示的一种或多种融合多肽。在图2至图19中，接头L由双下划线表示，连接子Cn由单下划线表示，并且核苷酸取代和氨基酸取代由粗体且加粗下划线表示。
表1：本发明的示例性融合多肽
本发明的融合多肽可通过本领域已知的任何方法产生。在一些实施例中，本发明的融合多肽通过在宿主细胞中重组表达编码融合多肽的核酸分子来产生。
因此，本发明提供了编码本发明的融合多肽的核酸分子，例如DNA分子，以及包含本发明的核酸分子的载体，以及包含此类核酸分子和载体的宿主细胞。
根据一些实施例的本发明的核酸分子的序列如图2至图19和表1中所示。
可使用本领域技术人员已知的方法来构建含有本发明的核酸分子的表达载体。合适的载体包括例如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体。
含有本发明的核酸分子的载体可通过常规技术转移至宿主细胞。合适的宿主细胞是本领域已知的。在一些实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如HEK293细胞或CHO细胞。
可通过常规技术培养转染的细胞以产生本发明的融合多肽。
一旦已经例如通过重组表达产生了本发明的融合多肽，则可通过本领域已知的任何方法将其纯化。示例性蛋白质纯化技术包括色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和力色谱法和/或尺寸柱色谱法)、离心和差别溶解度。本发明提供了分离的融合多肽，其任选地通过至少一个纯化步骤从细胞培养物中分离。
本发明的融合多肽能以在药物组合物提供。
本发明的药物组合物可包含一种或多种赋形剂。药学上可接受的赋形剂是本领域已知的，参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学](JosephP.Remington编,第18版,MackPublishing Co.[麦克出版公司],宾夕法尼亚州伊斯顿)，将其以全文并入本文。
本发明涵盖如下疗法，所述涉及将本发明的融合多肽给予动物，特别地，哺乳动物，例如人，用于预防、治疗或改善与疾病、病症或感染相关联的症状。
因此，本发明的融合多肽或药物组合物可用在治疗中，例如用于治疗疾病或病症。还提供了一种治疗疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者或患者给予治疗有效量的本发明的融合多肽。该用途或方法可包括给予治疗有效的方案，该方案具有比野生型松弛素分子的治疗有效给药方案更低频率的本发明的融合多肽的剂量。
应当理解的是，本发明的融合多肽可用于治疗心血管疾病，例如用于治疗心力衰竭。
如本文所使用的，术语“心力衰竭”包括急性心力衰竭、慢性心力衰竭(CHF)和急性失代偿性心力衰竭(ADHF)。术语“心力衰竭”还可包括更具体的诊断，例如，射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)、射血分数中间值心力衰竭或射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)。
本发明的融合多肽还可用于治疗肾病、肺病和纤维化病症，例如肾、心脏、肺和肝的纤维化病症，以及用于伤口愈合(Sherwood,2004)。本发明的融合多肽还可用于逆转糖尿病患者的胰岛素抗性(Bonner等人,2013)。
本发明的融合多肽和/或药物组合物适合用于肠胃外给予受试者或患者。在一些实施例中，该受试者或患者是哺乳动物，特别地是人类。
野生型人松弛素2具有分钟级的体内半衰期。因此，它必须通过在住院患者中连续静脉输注来给予，并且呈现严重的副作用，包括血压降低。相比之下，应当理解的是，本发明的融合多肽和/或药物组合物的实施例可通过注射给予受试者或患者，例如，通过静脉内、皮下或肌内注射给予。在一些实施例中，通过皮下注射给予融合多肽和/或药物组合物。通过注射(例如通过皮下注射)进行的给予为受试者或患者提供了更好的舒适度的益处，并且提供了向医院环境之外的受试者或患者给予的机会。在一些实施例中,通过自我给予来给予融合多肽或药物组合物。
在一些实施例中，本发明的融合多肽与野生型松弛素相比具有增加的半衰期，其允许基于摩尔浓度的更低的总暴露。例如，能以比野生型松弛素更低的频率给予本发明的融合多肽，因此提供了更便利的给药方案。
本发明提供了包含本发明的药物组合物的试剂盒。该试剂盒可包括含有本发明的药物组合物和说明书的包装。在一些实施例中，本发明的药物组合物以单次剂量小瓶或容器封闭系统(例如，预填充的注射器)配制。任选地，与这样一个或多个容器相关联的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，该公告反映该机构针对人类给予，对制造、使用或销售的许可。
如本文所使用的，冠词“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”可是指该冠词的语法对象的一个/一种或多于一个/一种(例如，至少一个/一种)。
“约”通常可意味着在给定测量值的性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差程度。示例性误差程度在给定值或值范围的20％内，通常在10％内，更通常在5％内。
本文描述为“包括/包含(comprising)”一个或多个特征的实施例也可以被认为是“由这类特征组成”的相应实施例的披露。
如本文所使用的术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典、欧洲药典或其他普遍认可的药典中列出的，用于在动物体内并且更具体地在人体内使用。
浓度、量、体积、百分比和其他数值能以范围格式来呈现。还应理解的是，此类范围格式仅仅是为了方便和简洁而使用，并且应该被灵活地解释为不仅包括明确列举为范围的限值的数值而且包括包含在该范围内的所有单独的数值或子范围，就像每个数值和子范围被明确地列举一样。
上述实施例被理解为说明性实例。设想了另外的实施例。应当理解的是，关于任何一个实施例描述的任何特征可以单独使用，或者与所描述的其他特征结合使用，并且还可以与任何其他实施例的一个或多个特征，或者任何其他实施例的任何组合结合使用。此外，在不脱离由所附权利要求书限定的本发明的范围的情况下，也可以采用上面未描述的等效物和修改。
在本披露的上下文中，本文所述的融合多肽和方法的其他实例和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的。如在所附权利要求书中所示的，其他实例和变化在本披露的范围内。
本文引用的所有文献均通过引用以其全文并入本文，包括引用文献中呈现的所有数据、表、附图和文本。
实例
实例1：构建体
产生一些DNA构建体以表达多种IgG1-Fc/连接子/松弛素2 A链/接头/松弛素2 B链融合多肽。在这些构建体中，连接子长度是4个氨基酸(GGSP)或15个氨基酸(GGGGSGGGGSGGGGS)，并且接头长度是15个氨基酸(GGGGSGGGGSGGGGS)。Fc部分是天然野生型人类IgG1 Fc部分(缩写为“hFc-G1”)或人类IgG1 Fc部分的突变形式，该突变形式包含以下突变的一个或若干个组合：
(i)M252Y、S254T、T256E(缩写为“YTE”)。包含YTE突变的Fc部分缩写为“hFc-G1-YTE”。
(ii)L234F、L235Q、K322Q(缩写为“FQQ”)。包含FQQ突变的Fc部分缩写为“hFc-G1-FQQ”。包含YTE突变和FQQ突变的Fc部分缩写为“hFc-G1-YTE-FQQ”。
(iii)L234F、L235E、P331S(缩写为“TM”)。包含TM突变的Fc部分缩写为“hFc-G1-TM”。包含YTE突变和TM突变的Fc部分缩写为“hFc-G1-YTE-TM”。
在这些构建体中，A链是人松弛素2的天然野生型A链(SEQ ID NO.42)，并且B链是相对于人松弛素2的天然野生型B链(SEQ ID NO.44)缺乏第一氨基酸(D)的B链变体(SEQ IDNO.46)。
将具有天然人类IgG-1 Fc序列的融合多肽的DNA通过(德国雷根斯堡(Regensburg,Germany))合成并且将其作为质粒DNA提供。将人类IgG1 Fc基因序列从质粒中通过用XbaI和NotI进行限制性酶消化而除去，并且使用用XbaI和NotI进行的的相同限制性消化将其克隆至pHOE载体中。设计该pHOE载体用于表达人类抗体IgG1的重链。该克隆策略除去了全部载体抗体序列，但保留了信号肽和Fc序列之间的内含子。
所需的人类IgG1 Fc突变(YTE、FQQ和TM)发生在位于人类IgG1 Fc中的300bp KasI限制性片段内。将具有适当突变的KasI片段通过IDT(爱荷华州科拉尔维尔(Coralville,IA))合成为基因块(GeneBlock)。将与天然Fc融合的人松弛素-2质粒用KasI消化，并且使用NEBuilder HiFi组装主混合物(NEBuilder HiFi Assembly Master Mix)(NEB#E2621S)将KasI基因块克隆进pHOE载体中用于无缝克隆。
Fc-hRLX2-4-15AA和Fc-hRLX2-15-15AA
将Fc-hRLX2-4-15AA和Fc-hRLX2-15-15AA基因序列通过(德国雷根斯堡(Regensburg,Germany))合成，并且将其作为质粒DNA提供。将这些基因序列从质粒中通过用XbaI和NotI进行限制性酶消化而除去，并且使用相同的限制性位点将其独立地克隆到pHOE载体中，分别产生pOE-Fc-hRLX2-4-15AA质粒和pOE-Fc-hRLX2-15-15AA质粒。将pHOE载体用于表达人类IgG1的重链部分。该克隆策略除去了全部载体抗体序列，但保留了信号肽和Fc序列之间的内含子。
Fc-YTE-hRLX2-4-15AA和Fc-YTE-hRLX2-15-15AA
YTE突变(M252Y/S254T/T256E)出现在位于人类IgG1 Fc中的300bp KasI片段内。将具有适当突变的KasI片段通过IDT(爱荷华州科拉尔维尔)合成为基因块。将pOE-Fc-hRLX2-4-15AA质粒和pOE-Fc-hRLX2-15-15AA质粒独立地用KasI消化，并且使用NEBuilderHiFi组装主混合物(NEB#E2621S)将KasI基因块克隆到上述质粒中用于无缝克隆。
Fc-YTE-TM-hRLX2-4-15AA和Fc-YTE-TM-hRLX2-15-15AA
YTE-TM突变(M252Y/S254T/T256E，L234F/L235E/P331S)出现在位于人类IgG1 Fc中的300bp KasI片段内。将具有适当突变的KasI片段通过IDT(爱荷华州科拉尔维尔)合成为基因块。将pOE-Fc-hRLX2-4-15AA质粒和pOE-Fc-hRLX2-15-15AA质粒独立地用KasI消化，并且使用NEBuilderHiFi组装主混合物(NEB#E2621S)将KasI基因块克隆到空载体中用于无缝克隆。将这些质粒中的3’KasI位点破坏。
Fc-YTE-FQQ-hRLX2-4-15AA和Fc-YTE-FQQ-hRLX2-15-15AA
YTE-FQQ突变(M252Y/S254T/T256E，L234F/L235Q/K322Q)出现在位于人类IgG1 Fc中的300bp KasI片段内。将具有适当突变的KasI片段通过(爱荷华州科拉尔维尔)合成为基因块。将pOE-Fc-hRLX2-4-15AA质粒和pOE-Fc-hRLX2-15-15AA质粒独立地用KasI消化，并且使用NEBuilderHiFi组装主混合物(NEB#E2621S)将KasI基因块克隆到空载体中用于无缝克隆。
产生一些其他的DNA构建体以将松弛素2表达为具有长度长于15个氨基酸的连接子的Fc融合多肽，以及包含位于该融合蛋白的N-末端或C-末端的Fc部分并且具有对松弛素链的两个可能方向(A-L-B或B-L-A)的松弛素2融合蛋白。
在这些其他的构建体中，连接子长度是21个氨基酸(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS)或24个氨基酸(AAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSA)，并且接头长度是15个氨基酸(GGGGSGGGGSGGGGS)。
该Fc部分是人类IgG1 Fc部分的突变形式，缩写为“hFc-G1-TM-ΔTHT-ΔK”，其包含以下突变：
(i)L234F、L235E、P331S(缩写为“TM”)，
(ii)D221G、K222G、T223G、H224S、T225A(缩写为“ΔTHT”)，
(iii)K447的缺失(缩写为“ΔK”)。
在这些其他的构建体中，A链是人松弛素2的天然野生型A链(SEQ ID NO.42)，并且B链是相对于人松弛素2的天然野生型B链(SEQ ID NO.44)缺乏第一氨基酸(D)的B链变体(SEQ ID NO:46)。
构建体Fc-TMΔTHTΔK_hRLX2_21-15AA(图1中的构建体15)和hRLX2-Fc-TMΔTHTΔK_15-24AA(图1中的构建体17)的DNA插入片段通过图1中的构建体8(Fc_hRLX2_15-15AA)的DNA分子的PCR扩增来产生。构建体Fc-TMΔTHTΔK_hRLX2(BA)_21-15AA(图1中的构建体16)和hRLX2(BA)-Fc-TMΔTHTΔK_15-24AA(图1中的构建体18)的DNA插入片段通过(美国皮斯卡塔韦(Piscataway,USA))合成并且然后通过PCR进行扩增，然后用限制性酶来消化。通过限制性酶BamHI和EcoRI来消化构建体15和构建体16的PCR扩增子。通过限制性酶NgoMIV和NotI来消化构建体17和构建体18的PCR扩增子。将消化的插入片段连接到质粒pepFc(衍生自pOE)中。将这些质粒用BamHI和EcoRI消化以在Fc的C-末端融合；或者用NgoMIV和NotI消化以在N-末端融合。使用快速连接试剂盒(NEB)将DNA插入片段连接至质粒中。
通过如Daramola,等人,2014中所述的标准方法，在CHO细胞中表达松弛素Fc融合物。使用系统，通过使用MabSelectSuRe柱的亲和力色谱法，将融合蛋白从上清液中纯化。将柱在1x DPBS(Gibco，英杰公司(Invitrogen)，目录号：14190-094)中平衡。加载上清液后，用1x DPBS洗涤柱以除去不与柱特异性结合的分子。使用pH 2.7的0.1M甘氨酸溶液实现Fc融合物的洗脱。将纯化的蛋白质进行缓冲液更换，更换为1xDPBS。使用280nm下的吸光度，测定蛋白质浓度。然后通过SDS-PAGE和SEC-HPLC(TSK凝胶，G3000SWXL柱)分析纯化的蛋白质以评估纯度和单体含量。
图1提供了一些本发明的Fc人松弛素2融合多肽的示意图和缩写名。
实例2：Fc-松弛素-2融合多肽的体外活性(体外cAMP测定)
使用基于体外细胞的测定来测量实例1中产生的松弛素2融合多肽的活性。该测定测量了融合多肽(Fc-hRLX2-4-15AA和Fc-hRLX2-15-15AA)刺激cAMP产生的能力。
使用来自DiscoverX(目录号90-0075，加利福尼亚州菲蒙市(Fremont,CA))的 cAMP测定来测量配体刺激松弛素2融合多肽后产生的cAMP。基于制造商的方案进行测定。简言之，使用MultiDrop Combi分配器(赛默科技公司(Thermo Scientific)，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))，将来自RXFP1表达细胞系的细胞，即，CHO-K1 RXFP1Gs(DiscoverX目录号95-0127C2，加利福尼亚州菲蒙市)以20,000个细胞/孔接种在100μL/孔的补充了1％抗生素、0.8mg/ml遗传霉素、和10％胎牛血清的F12K培养基(Gibco，目录#21127022)中，并且允许在37℃在5％CO2培养箱中贴壁过夜。孵育后，用100μL/孔的F12K无血清培养基洗涤板。除去洗涤培养基并在添加20μL/孔的F12K无血清培养基后准备好板以进行测定。为了测试样品制剂，在单独的96-U底板中重复制备松弛素2融合多肽的三倍稀释液，以及作为阳性对照的重组人松弛素-2(R&D系统公司，目录号6586-RN-025)。从稀释和滴定的样品板中，将来自每个孔的10μL转移到测定板中，在37℃孵育30分钟。在孵育后，添加10μL/孔的抗体试剂(来自试剂盒)，随后立即添加40μL/孔的cAMP工作检测溶液(如试剂盒中所指导地进行制备)并且将其在室温下在黑暗中孵育1小时。接下来，添加40μL cAMP溶液A(来自试剂盒)。将测定板在室温下在黑暗中再孵育3小时。在标准发光读板仪(EnVision，珀金埃尔默公司(PerkinElmer))上以0.1至1秒/孔读取测定板。使用统计分析软件(GraphPadPrism,第6版)进行数据分析。
结果和结论
测试的构建体的生物活性在表2和图16(单个实验)和图17(重复实验)中提供。
表2总结了来自若干测定的重组人松弛素-2和融合多肽的平均EC50。
表2：一些松弛素2融合构建体的生物活性
*值是来自5个独立重复的平均值
#值是来自3个独立重复的平均值
这些结果表明，本发明的松弛素2融合多肽具有生物活性，如使用基于体外细胞的测定所见。
由于基于体外细胞的cAMP刺激测定的可变性，在每个测定中总是使用重组人松弛素-2作为阳性对照。作为另外的评论，活性比率计算仅对包括融合肽和重组人松弛素-2的每个测定有意义。当使用在若干个独立重复中获得的平均EC50值来确定所述比率时，将融合多肽的活性(EC50)与重组人松弛素-2的活性(EC50)进行比较以得出为约10或约50的该比率。相比之下，基于在相同测定(一个重复)内获得的EC50值计算，该比率较低，通常为包括在约10和20之间，或为约15(参见，例如，图20)。
实例3：Fc-松弛素-2融合多肽对松弛素-2受体的特异性
松弛素家族肽通过激活一组四种G蛋白偶联受体(GPCR)产生其生理作用；所述受体可以通过它们的配体而被刺激(Gs)或抑制(Gi)。松弛素2特异性地结合至受体RXFP1。
为了检查松弛素2融合多肽对RXFP1受体的结合和活化特异性，从DiscoverX公司(加利福尼亚州菲蒙市)购买以下细胞系：
·cAMP HunterTM CHO-K1 RXFP2 Gs细胞系(目录号95-0140C2，DiscoverX公司)，配体是INSL3(目录号4544-NS，R&D系统公司)
·cAMP HunterTM CHO-K1 RXFP3 Gi细胞系(目录号95-0102C2，DiscoverX公司)，配体是松弛素-3(目录号TP723377，傲锐基因公司(Origene))
·cAMP HunterTM CHO-K1 RXFP4 Gi细胞系(目录号95-0134C2，DiscoverX公司)，配体是INSL5(目录号TP723251，傲锐基因公司)
·cAMP HunterTM CHO-K1 ADCYAP1R1 Gs/Gq细胞系(目录号95-0064C2，DiscoverX公司)，配体是PACAP1-27(目录号1183，R&D系统公司)。
RXFP2细胞系天然地过表达Gs野生型GPCRRXFP2并且被设计用于检测响应于激动剂刺激的细胞内cAMP水平的提高。RXFP3和RXFP4细胞系分别天然地过表达Gi野生型GPCRRXFP3和RXFP4，并且被设计用于检测响应于拮抗剂刺激的细胞内cAMP水平的降低。CHO-K1ADCYAP1R1是不相关的GPCR过表达细胞系并且用作测定对照。
使用来自DiscoverX公司的 cAMP XS+化学发光检测试剂盒(目录号90-0075，加利福尼亚州菲蒙市)，将这些细胞系用于测量IgG1-Fc人松弛素融合多肽的活性。如实例2中所述进行cAMP测定，不同的是细胞系RXFP3和RXFP4，其中分别将25μM或20μM毛喉素(目录号1099，R&D系统公司)添加到稀释板和无血清培养基中以提高cAMP的细胞内水平，因为测定中使用的配体将抑制cAMP产生。实验至少进行两次。
结果和结论
结果示出于图22中。所测试的松弛素2融合多肽在RXFP2表达细胞系中具有最小活性，并且在其他相关RXFP表达细胞系(RXFP3和RXFP4)中无活性。如所预期的，在ADCYAP1R1Gs/Gq细胞系中没有观察到活性。
实例4.Fc-松弛素-2融合多肽诱导THP-1细胞中的VEGF表达
测定了松弛素2融合多肽诱导松弛素2的已知下游靶标VEGF的表达的能力(Xiao等人，2013)。通过定量实时PCR分析VEGF RNA在THP-1细胞(目录号TIB-202，ATCC)中的表达。将总共106个细胞/ml接种在24孔平底板(目录号353226，康宁公司(Corning))中的400μl测试培养基(无酚红的RPMI-1640，0.5％FBS，1％Pen/Strep和0.05mM的2-巯基乙醇)中。在37℃、5％CO2下孵育24h后，在37℃将人松弛素-2(目录号3956-RN，R&D系统公司)或Fc-h松弛素-2融合多肽添加到板中的细胞中持续2.5h。使用Qiagen’s QiaShredder(目录号79656，凯杰公司(Qiagen))和RNA Plus Mini试剂盒(目录号74134，凯杰公司)，按照制造商的方案，进行从THP-1细胞的RNA分离和纯化。通过NanoDrop(赛默飞世尔公司(Thermofisher))测量mRNA浓度，并将样品标准化至相同的起始浓度(RT-PCR设置之间的范围；50-20ng/μl)。使用Express One-Step Superscript qRT-PCR试剂盒(目录号11791-200，英杰公司(Invitrogen))制备RT-PCR样品，并且引物/探针设置如下：人VEGFA(Hs00900055_m1，目录号4331182，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))和人GAPDH(Hs02758991_g1，目录号4331182，赛默飞世尔科技公司)。使用7900HT快速实时PCR仪进行RT-PCR反应，循环设置为：cDNA合成：1个循环，50℃持续15min；Taq活化：1个循环，95℃持续20sec；qPCR：在两个温度下的40个循环，95℃持续1sec和60℃持续20sec。通过比较性Ct方法，使用GAPDH表达进行标准化来计算VEGF mRNA水平的相对倍数变化。结果计算为相比无处理对照的倍数变化。实验以一式三份进行，n>2。使用Prism GraphPad(第6版)，通过配对双尾t检验来分析数据。
结果和结论
如图23(上图)所示，在浓度为5ng/ml、50ng和80ng/ml下，与模拟“无处理”对照相比，测试的松弛素2融合多肽显著地刺激THP-1细胞中的VEGF转录物。相似地，在浓度为0.01、0.06和10ng/ml下，与“无处理”对照细胞相比，可商购的重组人松弛素2(R&D系统公司)也显著地增加THP-1细胞中的VEGF转录物。为了与人松弛素2进行比较，基于分子量差异(6x)和cAMP测定中观察到的活性降低(10-15倍)，调整Fc松弛素2融合多肽的浓度。
图23(下图)示出，与模拟“无处理”对照相比，测试的松弛素2融合多肽显著地刺激THP-1细胞中的VEGF转录物。
实例5：一些Fc-松弛素2融合多肽的PK曲线
使用松弛素ELISA测定法来测定本发明的一些松弛素2融合多肽的药代动力学(PK)曲线。测定了以下融合多肽的大鼠体内PK曲线：Fc_hRLX2_4-15AA和Fc_hRLX2_15-15AA。
使用SureBlueTM TMB底物(KPL，52-00-01.即用型SureBlueTM TMB微孔过氧化物酶底物)和TMB终止溶液(KPL，50-85-05)来进行这些测定。通过静脉内(IV)或皮下(SC)途径以4mg/kg，将Fc_hRLX2_4-15AA和Fc_hRLX2_15-15AA融合多肽给予8周龄威斯塔(Wistar)大鼠(查尔斯河实验室(Charles River))。在IV途径给予药物后5分钟、30分钟、3小时、8小时、1天、2天、3天、4天、7天、9天、14天和21天收集血液样品，并且在SC途径给予药物后8小时、1天、2天、3天、4天、7天、9天、14天和21天收集血液样品。将样品收集到含有EDTA的管中并立即置于冰上。在30分钟的收集期间，将样品以1000xg离心15分钟。将等分的样品储存在≤-20℃并且稍后通过ELISA进行测试。使用Fc捕获和松弛素检测ELISA测定(使用来自R&D系统公司的松弛素检测ELISA试剂盒的多克隆抗体，目录号DRL200)来评估半衰期。
结果和结论
图24示出在大鼠中皮下(SC)或静脉内(IV)给予之后Fc_hRLX2_4-15AA的体内PK曲线。在SC给予后，在8小时至24小时内，达到了峰值血浆浓度。从非隔室分析中估计的平均终末半衰期是：IV给药组为2.46天，SC给药组为3.21天。
图25示出在大鼠中SC或IV给予之后Fc_hRLX2_15-15AA的体内PK曲线。在SC给予后，在8hr至24hr内，达到了峰值血浆浓度。从非隔室分析中估计的平均终末半衰期是：IV给药组为3.59天，SC给药组为3.75天。
相比之下，IV给予之后，人松弛素2在人体内的半衰期是约0.09+/-0.04小时，即5.4+/-2.4分钟(Chen等人1993)。
实例6：FcRn转基因小鼠中的PK研究
通过PK曲线研究来确认Fc融合多肽中存在的YTE突变(M252Y/S254T/T256E)提供的延长的半衰期，该PK曲线研究是在内部产生的FcRn转基因小鼠中针对以6mg/kg的剂量静脉内或皮下给予的Fc-YTE-hRLX2-15-15AA、Fc-YTE-FQQ-hRLX2-15-15AA和Fc-YTE-TM-hRLX2-15-15AA融合多肽进行的。使用Fc捕获和松弛素检测ELISA测定(使用来自R&D系统公司的松弛素检测ELISA试剂盒的多克隆抗体，目录号DRL200)来评估延长的半衰期。
图26示出在SC或IV给予之后Fc_hRLX2_15-15AA的小鼠体内PK曲线。SC剂量组的平均终末半衰期比IV剂量组长大约26.5％。
图27示出在以1mg/kg、6mg/kg或30mg/kg的剂量SC给予之后，Fc_hRLX2_15-15AA的小鼠体内PK曲线。在SC给予之后，在24-72小时内，达到峰值血清浓度。平均终末半衰期的范围为4.59天至7.06天。剂量标准化的Cmax随着剂量的增加而降低。
实例7：一些Fc-松弛素-2融合多肽在人细胞系和小鼠细胞系中的体外活性以及RXFP2选择性(在基于细胞的cAMP活性测定中)
通过以下方法，测试了如实例1中所述(产生的一些本发明的Fc-松弛素-2融合多肽(Fc_hRLX2_15-15AA，Fc-TMΔTHTΔK_hRLX2_21-15AA，Fc-TMΔTHTΔK_hRLX2(BA)_21-15AA，hRLX2-Fc-TMΔTHTΔK_15-24AA，hRLX2(BA)-Fc-TMΔTHTΔK_15-24AA)的生物活性，例如，刺激一种或多种细胞受体应答。
表达人或小鼠RXFP1受体或人RXFP2的稳定的CHO细胞系购自DiscoverX公司并将其用于测试受体特异性。使用的细胞系如下：cAMP HunterTM CHO-K1 RXFP1 Gs细胞系(目录号95-0127C2，DiscoverX公司)、cAMP HunterTM CHO-K1 RXFP2 Gs细胞系(目录号95-0140C2，DiscoverX公司)、cAMP HunterTM CHO-K1 mRXFP1 Gs细胞系(目录号95-0180C2，DiscoverX公司)。这些受体的活化导致下游的cAMP第二信使的产生，该第二信使可以在功能活性测定中测得。
使用以下基于牛血清白蛋白(BSA)的测定缓冲液进行常规cAMP测定：补充有0.1％BSA(Sigma#A9418)和0.5mM IBMX(Sigma#I7018)的汉克氏(Hanks)平衡盐溶液(Sigma#H8264)，用1M NaOH调整至pH 7.4。
将表达目的受体的细胞的冻结的冷冻小瓶在水浴中迅速解冻，转移到预加温的细胞培养基中并且以240xg旋转5分钟。将细胞以优化的浓度(例如，hRXFP1，以3.33x104个细胞/ml)重新悬浮在细胞培养基中。
将30μL细胞悬浮液添加至聚-D-赖氨酸涂覆的384孔板(Greiner#781946)上并且允许其粘附过夜。第二天，将培养基从板中移去并用5μL测定缓冲液替换。使用非接触式液体分配器(ECHOTM，Labcyte公司)，将测试重组肽/Fc融合样品的11点连续稀释液添加到细胞中。所有样品稀释液均制作一式两份。向每个孔中添加另外的5μL测定缓冲液，并将板在室温孵育30分钟。
使用可商购的cAMP动态2 HTRF试剂盒(Cisbio公司，目录#62AM4PEJ)，遵循按照制造商的建议的两步方案来测量cAMP水平。简要地说；通过将抗cAMP穴状化合物(供体荧光团)和cAMP-d2(受体荧光团)各1/20稀释于在该试剂盒中提供的缀合与裂解缓冲液中而单独地将它们制成。将5μL抗cAMP穴状化合物添加到测定板的所有孔中，并且将5μL cAMP-d2添加到除了非特异性结合(NSB)孔之外的所有孔中，向其中添加缀合与裂解缓冲液。将板在室温孵育一小时，然后在Envision(珀金埃尔默公司)上使用320nm的激发波长以及620nm和665nm的发射波长进行读数。如制造商的指南中所述将数据转化成％ΔF并且然后转化为最大天然激动剂应答的活化％，并且通过4-参数逻辑拟合进行分析以测定EC50值。
在hRXFP1细胞的情况下，将这些结果与重组人松弛素-2(目录号6586-RN，R&D系统公司)的相应结果进行比较；在mRXFP1细胞的情况下，与m松弛素-1(目录号6637-RN，R&D系统公司)的相应结果进行比较；或在hRXFP2细胞的情况下，与INSL-3(目录号4544-NS，R&D系统公司)的相应结果进行比较。我们使用对数据、曲线中点的无约束4-参数逻辑拟合来确定EC50。
结果和结论
表3中提供了测试的融合多肽的生物活性，并且图28中示出了每种多肽的一种代表性测定的结果。
由于基于体外细胞的cAMP刺激测定的可变性，在每个测定中总是使用重组人松弛素-2作为阳性对照。
表3总结了来自若干测定的重组人松弛素-2和融合多肽的平均EC50。
表3：一些松弛素-2融合构建体的生物活性
*值是来自1个独立重复的平均值
**值是来自2个独立重复的平均值
***值是来自3个独立重复的平均值
这些结果示出：
-测试的松弛素-2融合多肽具有生物学活性，所述融合多肽包含附接在松弛素融合多肽的N-末端或松弛素融合多肽的C-末端的Fc部分。
-测试的松弛素-2融合多肽具有生物学活性，所述融合多肽包含任一链方向(B-A或A-B)。
-对于所有测试的Fc-松弛素-2融合多肽，保留了RXFP1和RXFP2之间的选择性。
结果还表明，测试的松弛素-2融合多肽在人和小鼠之间具有与人松弛素-2相似的物种交叉反应性。特别地，它们示出与Fc结构域的融合不影响人松弛素-2的物种交叉反应性。
实例8：Fc_hRLX2_15-15AA可防止小鼠中的异丙肾上腺素诱导的心脏肥大
进行总共6个研究组，其中每组n＝8只小鼠(C57BL/6J雄性小鼠)。这些组是：运载体，Fc_hRLX2_15-15AA，异丙肾上腺素，异丙肾上腺素+依那普利，异丙肾上腺素+重组人松弛素2，和异丙肾上腺素+Fc_hRLX2_15-15AA。药物和运载体通过Alzet微型泵(1002型号；速率：0.25μl/hr(±0.05)，6μl一天@37℃)递送，或皮下注射Fc_hRLX2_15-15AA。
异丙肾上腺素以如下制备：在0.0002％Na-Asc盐水中的新鲜500mM溶液(123.9mg/ml)，0.22μM过滤。微型泵中的最终[Iso]浓度：15mg/kg/天＝15mg/247.72/6μl/1000g＝10.1mM每克体重(BW)。运载体是0.0002％抗坏血酸钠，西格玛公司目录#A7631。
依那普利以如下制备：将依那普利以马来酸盐使用，MW为492.52，西格玛公司目录#E6888。在甲醇中的新鲜的200mM储备溶液(98.5mg/ml)，0.22μM过滤。微型泵中的终浓度：2.5mg/kg/天＝2.5mg/492.52/6μl/1000g＝0.846mM每克体(BW)，即，针对30克的小鼠的一微型泵将需要19.0μl的200mM Ena(150μl x 0.846/200mMx 30g BW)。
异丙肾上腺素+依那普利：将如上所述制备的异丙肾上腺素和依那普利包括在泵中。
在表4中给出了六个组和给药。
表4
在研究结束时，测量了体重、心脏重量、肺重量、和胫骨长度。另外，使用心脏样品进行组织学和胶原测定。
基于羟脯氨酸的检测(总胶原测定，QuickZyme生物科学公司(QuickZymeBiosciences))，测量纤维化。在处理2周后，还对福尔马林处理的心脏组织进行组织学(H&E和梅森氏三色(Masson Trichrome))。
结果和结论
图29A示出心脏重量(HW)与胫骨长度(TL)的比率，并且图29B示出胶原含量。
与运载体或单独的Fc_hRLX2_15-15AA相比，用异丙肾上腺素处理导致心脏肥大和纤维化显著增加，如HW/TL和胶原含量的增加所示(图29 A、B)。
当异丙肾上腺素与依那普利、rhRLX2或Fc_hRLX2_15-15AA同时给予时，用异丙肾上腺素观察到的心脏肥大和纤维化的增加显著地减弱(图29 A、B)。
来自组织学研究的数据与胶原测量值和肥大测量值一致(数据未示出)。
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Claims (29)
1.一种融合多肽，其包含A-L-B或B-L-A，
其中：
A是松弛素A链多肽或其变体；
B是松弛素B链多肽或其变体；并且
L是包含至少15个氨基酸的接头多肽，
其中该融合多肽具有松弛素活性并且进一步包含半衰期延长部分。
2.如权利要求1所述的融合多肽，其中该松弛素A链是松弛素2A链并且该松弛素B链是松弛素2B链。
3.如权利要求1或2所述的融合多肽，其中该接头多肽L的长度是15至20个氨基酸。
4.如前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中该接头多肽L包含序列GGGGS(SEQID NO.58)的三个或更多个重复序列。
5.如前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中该接头多肽L包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.57)。
6.如前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中该接头多肽L由序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.57)组成。
7.如前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中该半衰期延长部分是免疫球蛋白Fc区。
8.如权利要求7所述的融合多肽，其中该Fc区衍生自人类IgG1免疫球蛋白。
9.如权利要求7或8所述的融合多肽，其中该Fc区具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含以下氨基酸修饰的组合的至少一种：
(i)Fc-YTE(M252Y、S254T、T256E)；
(ii)Fc-FQQ(L234F、L235Q、K322Q)；
(iii)Fc-TM(L234F、L235E、P331S)；
(iv)Fc-YTE-FQQ(M252Y、S254T、T256E、L234F、L235Q、K322Q)；
(v)Fc-YTE-TM((M252Y、S254T、T256E、L234F、L235E、P331S)，
(vi)Fc-TM-ΔTHT(L234F、L235E、P331S、D221G、K222G、T223G、H224S、T225A)，
(vii)Fc-TM-ΔTHTΔK(L234F、L235E、P331S、D221G、K222G、T223G、H224S、T225A、ΔK447)，
其中氨基酸编号是根据如卡巴特中的EU索引进行的。
10.如前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中该半衰期延长部分附接到该融合多肽的N-末端。
11.如前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中该半衰期延长部分经由连接子多肽附接到该融合多肽。
12.如权利要求11所述的融合多肽，其中该连接子多肽包含氨基酸序列GGSP(SEQ IDNO.56)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.57)。
13.如权利要求11所述的融合多肽，其中该连接子多肽包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO.69)、AAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSA(SEQ ID NO.70)。
14.一种具有松弛素活性的融合多肽，其中该融合多肽具有如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、和28中任一项所示的序列。
15.如前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽的松弛素活性与参考松弛素蛋白的松弛素活性的比率被包括在约10-5和约105之间。
16.一种核酸分子，其编码如前述权利要求中任一项所述的融合多肽。
17.一种载体，其包含如权利要求16所述的核酸分子。
18.一种宿主细胞，其包含如权利要求17所述的载体或如权利要求16所述的核酸分子。
19.一种产生如权利要求1至15中任一项所述的融合多肽的方法，该方法包括培养如权利要求18所述的宿主细胞，并收集该融合多肽。
20.一种药物组合物，其包含如权利要求1至15中任一项所述的融合多肽、和药学上可接受的赋形剂。
21.如权利要求1至15中任一项所述的融合多肽或如权利要求20所述的药物组合物，用于在治疗中使用。
22.如权利要求1至15中任一项所述的融合多肽或如权利要求20所述的药物组合物，用于治疗患有心力衰竭的受试者，其中将该融合多肽或药物组合物给予该受试者。
23.如权利要求21或22所述使用的融合多肽，或如权利要求21或22所述使用的药物组合物，其中通过皮下注射将该融合多肽或药物组合物给予该受试者。
24.如权利要求21至23中任一项所述使用的融合多肽，或如权利要求21至23中任一项所述使用的药物组合物，其中通过自我给予来给予该融合多肽或药物组合物。
25.一种试剂盒，其包含如权利要求20所述的药物组合物。
26.一种治疗患有疾病或病症的受试者的方法，该方法包括将如权利要求1至15中任一项所述的融合多肽或如权利要求20所述的药物组合物给予该受试者。
27.一种治疗患有心力衰竭的受试者的方法，该方法包括将如权利要求1至15中任一项所述的融合多肽或如权利要求20所述的药物组合物给予该受试者。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中通过皮下注射将该融合多肽或药物组合物给予该受试者。
29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中通过自我给予来给予该融合多肽或药物组合物。
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