JP2021059595A - 延長組換えポリペプチドおよび延長組換えポリペプチドを含む組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、国立衛生研究所により授与されたSBIR助成金2R44GM079873−02の下、政府支援により成された。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
本願は、すべて係属中である、2009年2月3日に出願された米国仮特許出願第61/149,669号、2009年6月8日に出願された米国仮特許出願第61/268,193号、2009年6月8日に出願された米国仮特許出願第61/185,112号、2009年8月24日に出願された米国仮特許出願第61/236,493号、2009年8月25日に出願された米国仮特許出願第61/236,836号、2009年9月18日に出願された米国仮特許出願第61/243,707号、2009年9月24日に出願された米国仮特許出願第61/245,490号、2009年11月10日に出願された米国仮特許出願第61/280,955号、2009年11月10日に出願された米国仮特許出願第61/280,956号、2009年11月12日に出願された米国仮特許出願第61/281,109号の優先権の利益を主張する。これらの米国仮特許出願は、それらの全体が、本明細書中に参考として援用される。
生物活性タンパク質は、治療薬としての生物活性タンパク質を包含して、特に水性溶液において調合されるときに短い貯蔵寿命を示す、通例不安定な分子である。さらに多くの生物活性ペプチドおよびタンパク質は、限定された溶解性を有するか、または組換え産生中に凝集するようになり、複雑な可溶化および再折畳み手順が必要である。各種の化学ポリマーをこのようなタンパク質に付着させて、その特性を改変することができる。特に興味深いのは、柔軟な高次構造を有し、水溶液中で十分に水和されている親水性ポリマーである。頻繁に使用されるポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)である。これらのポリマーは、その分子量に対して大きい流体力学半径を有する傾向があり(非特許文献1)、薬物動態特性の増強をもたらすことができる。付着点によっては、ポリマーは、ポリマー改変タンパク質がその関連機能を保持するようにポリマーが付着されたタンパク質との相互作用が制限される傾向がある。しかしポリマーのタンパク質への化学的コンジュゲーションは、複雑な複数ステップのプロセスを必要とする。通例、タンパク質構成要素は、化学的コンジュゲーションステップの前に産生および精製される必要がある。さらにコンジュゲーションステップは、分離する必要のある異種生成物の混合物の形成をもたらし、かなりの生成物損失につながり得る。あるいはこのような混合物は、最終的な薬学的生成物として使用することができるが、標準化することが困難である。いくつかの例は、最近販売されている、混合物として使用されるPEG化インターフェロン−アルファ生成物である(非特許文献2;非特許文献3)。このような混合物は、治療活性の低下したまたは治療活性のない異性体を含有するために、再現性の良い製造および特徴付けが困難である。
(BP)−(S)x−(XTEN) I
式中、各出現について、独立して、BPは本明細書で上記のような生物活性タンパク質であり;Sは、(上記のような)切断配列を場合により包含できる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり;xは0または1のどちらかであり;およびXTENは(本明細書に記載するような)延長組換えポリペプチドである。該実施形態は、BPが所望の生物活性のために遊離N末端を必要とする、またはBPのC末端の融合タンパク質への連結によって生物活性が低下して、投与したBPXTENの生物活性および/または副作用を低下させることが所望される、特別の有用性を有する。
(XTEN)−(S)x−(BP) II
該実施形態は、BPが所望の生物活性のために遊離C末端を必要とする場合に、またはBPのN末端の融合タンパク質への連結によって生物活性が低下して、投与したBPXTENの生物活性および/または副作用を低下させることが所望である場合に、特に有用である。
(BP)−(S)w−(XTEN)−(S)x−(BP)−(S)y(XTEN)z III
(XTEN)−(S)w−(BP)−(S)x−(XTEN)y−(BP) IV
(BP)−(S)x−(BP)−(S)y−(XTEN) V
式中、各出現について、独立して、BPは本明細書で上記のような生物活性タンパク質であり、Sは、切断配列を場合により含む1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり;wは0または1のどちらかであり;xは0または1のどちらかであり;yは0または1のどちらかであり;zは0または1のどちらかであり;およびXTENは、XTENアミノ酸残基の累積合計が400超〜約3000残基である、(本明細書に記載するような)延長組換えポリペプチドである。
(XTEN)−(S)x−(BP)−(S)y−(XTEN) VI
式中、各出現について、独立して、BPは生物活性タンパク質であり、Sは、切断配列を場合により含む1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり;wは0または1のどちらかであり;xは0または1のどちらかであり;yは0または1のどちらかであり;zは0または1のどちらかであり;およびXTENは、XTENアミノ酸残基の累積合計が400超〜約3000残基である、(本明細書に記載するような)延長組換えポリペプチドである。
hypervolemia)に関連付けられた状態または障害、糖尿病性心筋症、および網膜神経変性プロセスから選択される。いくつかの場合において、薬学的組成物は皮下に、筋肉内に、または静脈内に投与することができる。一実施形態において、薬学的組成物は治療的有効用量で投与される。上述のいくつかの場合において、治療的有効用量は、融合タンパク質に連結されておらず、同程度の用量で被験体に投与された融合タンパク質の対応するBPと比較して、融合タンパク質の治療ウインドウ内で費やされる時間の増大を生じる。治療ウインドウ内で費やされる時間の増大は、融合タンパク質に連結されていない対応するBPよりも少なくとも3倍の長さ、または、あるいは融合タンパク質に連結されていない対応するBPよりも少なくとも4倍の、または5倍の、または6倍の、または7倍の、または8倍の、または9倍の、または少なくとも10倍の、または少なくとも20倍の長さであることが可能である。
本明細書に挙げるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み入れられることが具体的および個々に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられている。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
約400超〜約3000のアミノ酸残基を含む単離延長組換えポリペプチド(XTEN)であって:
(a)グリシン(G)残基、アラニン(A)残基、セリン(S)残基、トレオニン(T)残基、グルタメート(E)残基およびプロリン(P)残基の和が該XTENの全アミノ酸配列の約80%超を構成することと;
(b)該XTEN配列が実質的に非反復性であることと;
(c)該XTEN配列が、TEPITOPEアルゴリズムによって解析したときに予測されるT細胞エピトープを欠き、ここで、該XTEN配列内のエピトープの該TEPITOPEアルゴリズム予測が−9以上のスコアに基づくことと;
(d)該XTEN配列がGORアルゴリズムによって決定されたように、90%超のランダムコイル形成物を有することと;
(e)該XTEN配列が、Chou−Fasmanアルゴリズムによって決定されたように、2%未満のアルファらせんおよび2%のベータシートを有することと;
を特徴とするXTEN。
(項目2)
約400超〜約3000のアミノ酸残基を含む単離延長組換えポリペプチド(XTEN)であって:
(a)アスパラギン残基およびグルタミン残基の和が該XTENの全アミノ酸配列の10%未満であることと;
(b)メチオニン残基およびトリプトファン残基の和が該XTENの全アミノ酸配列の2%未満であること;
(c)該XTEN配列が5%未満の、正電荷を有するアミノ酸残基を有することと;
(d)該XTEN配列がGORアルゴリズムによって決定されたように、90%超のランダムコイル形成物を有することと;
(e)該XTEN配列が、Chou−Fasmanアルゴリズムによって決定されたように、2%未満のアルファらせんおよび2%のベータシートを有することと;
を特徴とするXTEN。
(項目3)
約400超〜約3000のアミノ酸残基を含む単離延長組換えポリペプチド(XTEN)であって:
(a)該XTEN配列の少なくとも約80%が非重複配列モチーフから成り、該配列モチーフそれぞれが約9〜約14アミノ酸残基を有し、任意の2つの連続アミノ酸残基の配列が該配列モチーフの各々において3回以上出現しないことと;
(b)該配列モチーフがグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタメート(E)およびプロリン(P)から選択される4〜6種類のアミノ酸から成ることと;
(c)該XTENが生物活性タンパク質に連結されたときに生物活性タンパク質の薬物動態特性を増強し、該薬物動態特性が、該生物活性タンパク質に連結された該XTENと比較して、該生物活性タンパク質の最終半減期を測定することによって確認されることと;
を特徴とするXTEN。
(項目4)
生物活性タンパク質に連結された前記XTENが、同程度の条件下で投与された該生物活性タンパク質と比較して、被験体において少なくとも約2倍長い最終半減期を有する、項目3に記載の単離XTEN。
(項目5)
前記XTENが生物活性タンパク質に連結されたときに、該XTENが該生物活性タンパク質の熱安定性を増強し、ここで、少なくとも約7日間にわたる約37℃の温度への曝露後、該生物活性タンパク質の生物活性の保持を、該生物活性タンパク質に連結された該XTENと比較して、測定することによって、該熱安定性が確認される、項目1から4のうちのいずれか1項に記載の単離XTEN。
(項目6)
XTENに連結された際に、前記生物活性タンパク質および前記XTENを含む得られた融合物が、前記XTENに連結されていない生物活性タンパク質の前記生物活性の少なくとも80%を保持する、項目5に記載の単離XTEN。
(項目7)
グリシン(G)残基、アラニン(A)残基、セリン(S)残基、トレオニン(T)残基、グルタメート(E)残基またはプロリン(P)残基の前記和が前記XTENの全アミノ酸配列の約90%超を構成する、項目1から6のうちのいずれか1項に記載の単離XTEN。
(項目8)
いずれの1種類のアミノ酸も前記XTEN配列の30%超を構成しない、項目1から7のうちのいずれか1項に記載の単離XTEN。
(項目9)
3個の連続アミノ酸が、該アミノ酸(単数)がセリンでない限り、同一ではない配列を含み、この場合、3個以下の連続アミノ酸がセリン残基である、項目1から8のうちのいずれか1項に記載の単離XTEN。
(項目10)
前記XTEN配列が10未満のサブ配列スコアを有する、項目1から9のうちのいずれか1項に記載の単離XTEN。
(項目11)
前記XTEN配列の少なくとも約80%が非重複配列モチーフから成り、該配列モチーフ各々が12のアミノ酸残基を有する、項目1から10のうちのいずれか1項に記載の単離XTEN。
(項目12)
前記XTEN配列が非重複配列モチーフから成り、各々の配列モチーフが12のアミノ酸残基を有する、項目1から11のうちのいずれか1項に記載の単離XTEN。
(項目13)
前記XTEN配列の少なくとも約80%が非重複配列モチーフから成り、該配列モチーフが表1の1個以上の配列からのものである、項目1から12のうちのいずれか1項に記載の単離XTEN。
(項目14)
項目1から13のうちのいずれか1項に記載の単離XTENおよび生物活性タンパク質を含み、該XTENが該生物活性タンパク質に連結されている、単離融合タンパク質。
(項目15)
前記生物活性タンパク質が表3〜8から選択される配列に対して少なくとも90%の配列同一性を示す、項目14に記載の単離融合タンパク質。
(項目16)
前記融合タンパク質が、前記XTENに連結されていない前記生物活性タンパク質と比較して少なくとも約2倍長い最終半減期を有する、項目14に記載の単離融合タンパク質。(項目17)
前記融合タンパク質が、前記XTENに連結されていない前記生物活性タンパク質と比較して免疫原性が低く、免疫原性が、被験体に同程度の用量を投与した後に、該生物活性タンパク質に選択的に結合するIgG抗体の産生を測定することによって確認される、項目14に記載の単離融合タンパク質。
(項目18)
前記融合タンパク質が生理的条件下で約6を超える見かけの分子量係数を示す、項目14に記載の単離融合タンパク質。
(項目19)
少なくとも第2の生物活性タンパク質をさらに含む、項目14に記載の単離融合タンパク質。
(項目20)
少なくとも第2のXTENポリペプチドをさらに含み、XTENアミノ酸残基の累積合計が約400超〜約3000の残基である、項目15に記載の単離融合タンパク質。
(項目21)
前記融合タンパク質が被験体において循環血中濃度を達成または維持するために、同程度の様式で被験体に投与される前記XTENに連結されていない生物活性タンパク質と比較して、より低い頻度の投薬または低下した同程度の投薬量を必要とする、項目14に記載の単離融合タンパク質。
(項目22)
前記生物活性タンパク質がグルコース調節ペプチドである、項目14に記載の単離融合タンパク質。
(項目23)
前記グルコース調節ペプチドがエキセンジン−4である項目22に記載の単離融合タンパク質。
(項目24)
前記グルコース調節ペプチドがグルカゴンである、項目22に記載の単離融合タンパク質。
(項目25)
前記生物活性タンパク質が代謝タンパク質である、項目14に記載の単離融合タンパク質。
(項目26)
前記代謝タンパク質がIL−1raである、項目25に記載の単離融合タンパク質。
(項目27)
前記生物活性タンパク質が凝固因子である、項目14に記載の単離融合タンパク質。
(項目28)
前記凝固因子が第IX因子である、項目27に記載の単離融合タンパク質。
(項目29)
前記凝固因子が第VII因子である、項目27に記載の単離融合タンパク質。
(項目30)
前記生物活性タンパク質が成長ホルモンである、項目14に記載の単離融合タンパク質。(項目31)
項目14〜30のいずれか1項に記載の単離融合タンパク質および少なくとも1つの薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物。
(項目32)
項目31に記載の組成物の使用であって、疾患症状の処置を必要とする被験体における疾患症状を処置するための薬剤の調製における、組成物の使用。
(項目33)
前記疾患が1型糖尿病、2型糖尿病、肥満、高血糖、高インスリン血症、異常インスリン産生、インスリン抵抗性、シンドロームX、食欲過多、不十分な飽満感、グルカゴノーマ、脂質異常症、網膜神経変性プロセス、第VII因子欠損、第X因子欠損、第XII因子欠損、血友病A、血友病B、フォン・ウィルブラント病、高血圧、急性冠動脈症候群、関節リウマチ、虚血後再灌流傷害、成長ホルモン欠損、ターナー症候群、プラーダー−ヴィリ症候群、特発性低身長、AIDSによるるい痩、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、または筋ジストロフィーから選択される、項目32に記載の使用。
(項目34)
生物活性タンパク質の特性を改善する方法であって、生物活性タンパク質を項目1〜13に記載のXTENに連結して(a)該XTENに連結された該生物活性タンパク質の最終半減期が、該XTENに連結されていない該生物活性タンパク質の該最終半減期と比較してより長いこと;(b)該XTENに連結された該生物活性タンパク質の貯蔵寿命が、該XTENに連結されていない該生物活性タンパク質の該貯蔵寿命と比較してより長く、貯蔵寿命はベースライン試料と比較したインターバル後の生物活性の保持によって確認されること;(c)該XTENに連結された該生物活性タンパク質の生理的条件下での溶解度が該XTENに連結されていない該生物活性タンパク質の該溶解度と比較して増加されること;(d)被験体に投与されるときに、該XTENに連結されている該生物活性タンパク質に選択的に結合するIgG抗体の産生が、該XTENに連結されていない該生物活性タンパク質が同程度の用量で被験体に投与されるときの該IgGの産生と比較して低下すること;および/または(e)被験体に投与されるときの該XTENに連結された該生物活性タンパク質の治療ウインドウ内で費やされる時間が、被験体に投与されるときの該XTENに連結されていない該生物活性タンパク質と比較してより長いことを特徴とする特性を達成するステップを含む、生物活性タンパク質の特性を改善する方法。
本明細書で使用する場合、以下の用語は、別途規定しない限り、その用語に属する意味を有する。
「見かけの分子量係数」または「見かけの分子量」は、特定のアミノ酸配列によって提示された見かけの分子量の相対的増加または減少の尺度を示す関連用語である。該見かけの分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)および同様の方法を使用して球状タンパク質標準と比較して決定され、「見かけのkD」単位で測定される。見かけの分子量係数は、見かけの分子量と実際の分子量との間の比である;実際の分子量は、アミノ酸組成に基づいて、その組成の各種類のアミノ酸の計算された分子量を加算することによって予測される。
本発明の実施は、別途示さない限り、当該技術の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えDNAの従来の技法を用いる。その内容が全体として参照により本明細書に組み入れられている、Sambrook,J.ら、“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001;”Current protocols in
molecular biology”,F.M.Ausubelら eds.,1987;the series“Methods in Enzymology,”Academic Press,San Diego,CA.;“PCR 2:a practical approach”,M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.,Oxford University Press,1995;“Antibodies,a laboratory manual”Harlow,E.and Lane,D.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory,1988;”Goodman & Gilman’s
The Pharmacological Basis of Therapeutics,”11th Edition,McGraw−Hill,2005;およびFreshney,R.I.,“Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,”4th edition,John Wiley & Sons,Somerset,NJ,2000を参照。
本発明は、延長組換えポリペプチド(「XTEN」または「XTENs」)を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、XTENは概して、主に小型親水性アミノ酸から成る天然に存在しない実質的に非反復性の配列を有する延長された長さのポリペプチドであり、該配列は生理的条件下では、低い程度で2次もしくは3次構造を有するか、または2次もしくは3次構造を有さない。
主題の組成物のXTEN配列は、実質的に非反復性であることができる。一般に、反復性アミノ酸配列は、天然反復性配列、たとえばコラーゲンおよびロイシンジッパーによって例示されるように、凝集するもしくは高次構造物(higher order structure)を形成する、または接触物を形成して結晶構造物もしくは偽結晶構造物を生じる傾向を有する。これに対して、非反復性配列は凝集する傾向が低いために、配列がそうでなければ反復性である場合には凝集しやすい荷電アミノ酸を比較的低頻度で有する、長い配列のXTENが設計できるようになる。通例、BPXTEN融合タンパク質は、約100超〜約3000のアミノ酸残基、好ましくは400超〜約3000の残基のXTEN配列を含み、該配列は実質的に非反復性である。一実施形態において、XTEN配列は、約100超〜約3000のアミノ酸残基、好ましくは400超〜約3000のアミノ酸残基を有し得、該配列において、配列内の連続する3個のアミノ酸が同じ種類のアミノ酸であることはなく(該アミノ酸(単数)がセリンでない限り)、この場合、3個以下の連続アミノ酸はセリン残基である。上述の実施形態において、XTEN配列は実質的に非反復性である。
本発明は、より短い配列の複数の単位、すなわちモチーフを含むことができるXTENを含み、ここで該モチーフのアミノ酸配列は非反復性である。XTEN配列の設計において、多量体化されてXTEN配列を生成する配列モチーフのライブラリを使用する「ビルディングブロック」手法の使用にもかかわらず、非反復性基準が満たされ得ることが見出された。それゆえXTEN配列がわずか4つの異なる種類の配列モチーフの複数単位から成り得るのは、モチーフ自体が概して非反復性アミノ酸配列から成り、XTEN配列全体が実質的に非反復性にされるためである。
他の場合において、BPXTEN組成物は約100超〜約3000のアミノ酸残基の、好ましくは400超〜約3000の残基の非反復性XTEN配列を含む組成物を含むことができ、配列の少なくとも約80%が、または少なくとも約90%が、または約91%が、または約92%が、または約93%が、または約94%が、または約95%が、または約96%が、または約97%が、または約98%が、または約99%〜約100%が、表12〜15のポリペプチド配列の1つ以上から選択される非重複36アミノ酸配列モチーフから成る。
詳細な特徴において、本発明は、延長した長さの配列を有するXTENポリペプチドを含むBPXTEN組成物を含む。本発明は、非反復性の非構造化ポリペプチドの長さを増大させることにより、XTENの非構造化の性質ならびにXTENを含む融合タンパク質の生物および薬物動態特性が増強されるという発見を利用する。実施例でさらに十分に記載するように、XTENの長さの比例的増加は、単一ファミリの配列モチーフ(たとえば表1の4種類のAEモチーフ)の固定反復順序によって生成された場合でも、GORアルゴリズムによって決定されるように、より短いXTEN長と比較して、より高いパーセンテージのランダムコイル形成物を有する配列を生じることができる。さらに実施例に記載するように、非構造化ポリペプチド融合パートナーの長さを増加させることにより、配列長がより短い非構造化ポリペプチドパートナーを有する融合タンパク質と比較して、最終半減期が非比例的に増加した融合タンパク質を得られることが見出された。
4.正味電荷
他の場合において、XTENポリペプチドは、XTEN配列への正味電荷を有するアミノ酸残基の組み入れおよび/または疎水性アミノ酸の割合の低下によって与えられた非構造化特徴を有することができる。全体の正味電荷および正味電荷密度は、XTEN配列の荷電アミノ酸の含有量を改変することによって制御され得る。いくつかの場合において、組成物のXTENの正味電荷密度は、+0.1超の電荷/残基または−0.1未満の電荷/残基であり得る。他の場合において、XTENの正味電荷は、約0%、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、または約20%以上であることができる。
別の態様において、本発明は、XTEN配列が低度の免疫原性を有するか、または実質的に非免疫原性である組成物を提供する。いくつかの因子、たとえば非反復性配列、非構造化高次構造、高度の溶解度、低度のまたは欠如した自己凝集、低度のまたは欠如した配列内のタンパク質分解部位、および低度のまたは欠如したXTEN配列のエピトープが、XTENの低い免疫原性に寄与することができる。
別の態様において、本発明により、XTENポリペプチドが、XTENを組み入れたBPXTEN融合タンパク質に対して対応する見かけの分子量の増加を与える高い流体力学半径を有することができるXTENを提供される。実施例19で詳述するように、XTENのBP配列への連結によって、XTENに連結していないBPと比較して、流体力学半径の増大、見かけの分子量の増加、および見かけの分子量係数の増加を有することができる、BPXTEN組成物を生じることができる。たとえば半減期の延長が所望である治療用途において、高い流体力学半径を有するXTENが1個以上のBPを含む融合タンパク質に組み入れられた組成物は、組成物の流体力学半径をおおよそ3〜5nmの糸球体孔サイズを超えて効果的に拡大させることができ(約70kDAの見かけの分子量に相当)(Caliceti.2003.Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)−protein conjugates.Adv Drug Deliv Rev 55:1261−1277)、循環タンパク質の腎クリアランスの低下を生じる。タンパク質の流体力学半径は、その分子量によって、ならびに形状および緻密性を包含するその構造物によって決定される。特定の理論に縛られるものではないが、XTENは、ペプチドの個々の電荷の間の静電反発力または2次構造を与える能力が欠如した配列における特定のアミノ酸によって与えられた固有の柔軟性のために、開放立体配置を取ることができる。XTENポリペプチドの開放、延長および非構造化高次構造物は、2次および/または3次構造、たとえば代表的な球状タンパク質を有する、同程度の配列長および/または分子量のポリペプチドと比較して、より大きい比例的流体力学半径を有することができる。U.S.Patent Nos.6,406,632および7,294,513に記載されているような、たとえばサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)の使用による流体力学半径を決定する方法は、当分野で周知である。実施例19の結果が証明するように、XTENの増加長の追加により、流体力学半径、見かけの分子量、および見かけの分子量係数のパラメータの比例的増大が生じて、BPXTENを所望の特徴的なカットオフの見かけの分子量または流体力学半径に適応させることが可能となる。したがって、ある実施形態において、融合タンパク質が少なくとも約5nmの、または少なくとも約8nmの、または少なくとも約10nmの、または12nmの、または少なくとも約15nmの流体力学半径を有することができるようなXTENを用いて、BPXTEN融合タンパク質を構成することができる。上述の実施形態において、BPXTEN融合タンパク質のXTENによって与えられた大きい流体力学半径は、得られた融合タンパク質の腎クリアランスの低下をもたらし、最終半減期の対応する増加、平均滞留時間の増加、および/または腎クリアランス速度の減少をもたらすことができる。
本発明は一部は、生物活性タンパク質およびXTENを含む融合タンパク質組成物ならびに被験体の疾患、障害または状態の処置のためのその使用に関するものである。
Protein Resource(UniProt)およびサブスクリプション提供データベース、たとえばGenSeq(たとえばDerwent)で入手できる。ポリヌクレオチド配列は、所与のBPをコードする野生型ポリヌクレオチド配列(たとえば全長または成熟のどちらか)であり得るか、またはいくつかの例において、配列は野生型ポリヌクレオチド配列の変異体(たとえば野生型生物活性タンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、前記ポリヌクレオチドのDNA配列は、たとえば特定の種での発現のために最適化されている;または野生型タンパク質の変異体、たとえば部位特異的変異体(mutant)または対立遺伝子変異体(variant)をコードするポリヌクレオチドであり得る。当分野で公知の方法を使用することによって、ならびに/または本明細書で提供され、実施例でさらに詳細に記載されたガイダンスおよび方法と併せて、BPの野生型もしくはコンセンサスcDNA配列またはコドン最適化変異体を使用して本発明で意図されるBPXTEN構築物を生成することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
内分泌および肥満関連疾患または障害は、大半の先進国で流行規模に達して、大半の先進国で相当な増加しつつある保健管理上の重荷となり、体の臓器、組織、および循環系に影響を及ぼす多種多様の症状を包含する。特に関心があるのは、内分泌および肥満関連疾患および障害であり、これらの中で最重要なのは、米国で主要な死亡原因の1つである糖尿病である。糖尿病は、2つの主要なサブクラス−若年性糖尿病、すなわちインスリン依存型糖尿病(IDDM)としても公知のI型、および成人発症糖尿病、すなわちインスリン非依存型糖尿病(NIDDM)としても公知の、II型に分けられる。I型糖尿病は、このような被験体における膵臓のインスリン産生細胞を完全にまたは一部破壊する自己免疫疾患の形態であり、その生涯の間、外因性インスリンの使用が必要である。十分に管理された被験体においても、偶発性合併症が出現する可能性があり、そのいくつかは生命を脅かすものである。
「アドレノメデュリン」または「ADM」は、ヒトアドレノメデュリンペプチドホルモンならびに成熟ADMの生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。ADMは、185アミノ酸プレプロホルモンから連続酵素切断およびアミド化によって生成し、22分の測定血漿半減期を有する52アミノ酸の生物活性ペプチドを生じる。本発明のADM含有融合タンパク質は、膵島細胞からのインスリン分泌に対する刺激効果ゆえにグルコース調節の必要な糖尿病において、または持続性低血圧の被験体において、特定の用途を見出し得る。ヒトAMの完全なゲノムインフラストラクチャが報告されており(Ishimitsuら、Biochem.Biophys.Res.Commun 203:631−639(1994))、およびADMペプチドの類似体は、U.S.Pat.No.6,320,022に記載されるようにクローニングされている。
「アミリン」は、アミリン、プラムリンチドと呼ばれるヒトペプチドホルモン、およびU.S.Pat.No.5,234,906に記載されているように、成熟アミリンの生物活性の少なくとも一部を有する、その種の変形を意味する。
Medicinal Chemistry 6:1067−1093(1999)に総説されている)。本発明のカルシトニン含有融合タンパク質は、骨粗鬆症の処置に、および骨のパジェット病の療法として特定の用途を見出し得る。合成カルシトニンペプチドは、U.S.Pat.Nos.5,175,146および5,364,840に記載されるように生成されている。
p.1−12に表示されている。表4は多岐にわたる種からの配列を示すが、表5は、合成GLP−1類似体のリストを示す;そのすべては、本明細書に記載するBPXTENでの使用を意図する。エキセンジン−4は、GLP−1受容体にてインスリン分泌βTC1細胞に結合して、また摘出胃でソマトスタチン放出を刺激して、ガストリン放出を抑制する(Gokeら、J.Biol.Chem.268:19650−55,1993)。エキセンジン−4は、GLP−1のミメティックとして同様の広い範囲の生物活性を呈するが、平均最終半減期が2.4時間という、GLP−1よりも長い半減期をなお有する。エクセナチドは、Byettaによって販売されているエキセンジン−4の合成版である。しかしその短い半減期のために、エクセナチドは現在、1日2回投与され、その有用性が制限されている。本発明のエキセンジン−4含有融合タンパク質は、糖尿病およびインスリン抵抗性障害の処置に特定の用途を見出し得る。
GLP天然配列は、以下に表示されている数種の配列モチーフによって記載され得る。カッコ内の文字は、各配列位置での許容され得るアミノ酸を表す:[HVY][AGISTV][DEHQ][AG][ILMPSTV][FLY][DINST][ADEKNST][ADENSTV][LMVY][ANRSTY][EHIKNQRST][AHILMQVY][LMRT][ADEGKQS][ADEGKNQSY][AEIKLMQR][AKQRSVY][AILMQSTV][GKQR][DEKLQR][FHLVWY][ILV][ADEGHIKNQRST][ADEGNRSTW][GILVW][AIKLMQSV][ADGIKNQRST][GKRSY]。さらに、GLP−1の合成類似体は、グルコース関連障害の処置で有用な生物活性を有するBPXTENを生成するための、XTENに対する融合パートナーとして有用であることができる。エキセンジン−4またはGLP−1に相同性のさらなる配列は、標準相同性検索技法によって見出され得る。
「GLP−2」は、ヒトグルカゴン様ペプチド−2および成熟GLP−2の生物活性の少なくとも一部を有するその配列変異体を意味する。”さらに詳細には、GLP−2は、小腸および大腸の腸内分泌細胞からGLP−1と共に同時分泌される、33アミノ酸ペプチドである。
the pancreatic islet neogenesis associated protein(INGAP)gene and its expression in islet neogenesis in hamsters.J Clin
Invest.1997.99(9):2100−2109に記載されるように、クローニングおよび発現されている。
ば有益な血管拡張効果を提供することによるCHFの処置を提供し得る。
代謝性疾患および心血管疾患は、大半の先進国で相当な保健管理上の重荷となり、心血管疾患は、米国および大半の欧州諸国で死亡および障害(disability)の第1の原因に今なおなっている。代謝性疾患および代謝性障害は、体の臓器、組織、および循環系に影響を及ぼす多種多様の症状を包含する。これらの中で最重要なのが、米国で主要な死亡原因の1つの糖尿病であるのは、糖尿病が脈管構造、中枢神経系、主要臓器、および末梢組織に病態および代謝障害の両方を生じるためである。インスリン抵抗性および高インスリン血症は、かなりの健康上のリスク引き起こす他の2種類の代謝性障害:グルコース寛容減損および代謝性肥満にも連結してきた。グルコース寛容減損は、摂食前の正常グルコースレベルを特徴として、食事後のグルコースレベルが上昇する(高血糖)傾向がある。このような個体は、糖尿病および冠動脈疾患のより高いリスクに瀕していると見なされる。肥満も、高血圧、冠動脈疾患(動脈硬化症)、および乳酸アシドーシス、ならびに関連疾患状態と同様に、インスリン抵抗症候群、すなわち「シンドロームX」と呼ばれる状態の群にとってのリスク因子である。肥満の病因は多因子性であると考えられるが、根底にある問題は、過剰な脂肪組織が存在するまで、肥満において栄養素利用性およびエネルギー消費が均衡していないことである。
「抗CD3」は、OKT3(ムロモナブとも呼ばれる)およびヒト化抗CD3モノクローナル抗体(hOKT31(Ala−Ala))を包含する、T細胞表面タンパク質CD3に対するモノクローナル抗体、その種および配列変異体、ならびにフラグメントを意味する(KC Heroldら、New England Journal of Medicine 346:1692−1698.2002) 抗CD3は、すべての分化T細胞に存在するT細胞受容体複合体を結合することによって、T細胞の活性化および増殖を防止する。本発明の抗CD3含有融合タンパク質は、治療エフェクタとしての抗CD3ならびにBPXTEN組成物の第2の治療BPの標的部分の使用を包含して、初発の1型糖尿病を遅らせることに特定の用途を見出し得る。可変領域の配列および抗CD3の生成は、U.S.Patent Nos 5,885,573および6,491,916に記載されている。
TNF受容体の細胞外ドメインである。TNFαおよびTNFβ(TNFリガンド)は、p55 TNF受容体およびp75 TNF受容体への結合に関して競合する。ヒトp55 TNF受容体の細胞外ドメインおよびTNFβによって形成された複合体のx線結晶構造が決定されている(参照により本明細書に組み入れられている、Bannerら、Cell 73:431,1993)。
血友病では、特定の血漿凝固因子の欠如によって、血液の凝固が妨げられる。ヒト第IX因子(FIX)は、血液凝固カスケードの内因性経路の重要な構成要素である、セリンプロテアーゼのチモーゲンである。FIX欠損のない個体では、FIXの平均半減期は短く、おおよそ18〜24時間である。男性30,000人のうち約1人に出現する、X連鎖障害による機能性FIXの欠乏によって、クリスマス病としても公知の血友病Bが生じる。第IX因子の100を超える変異が記載されている;いくつかは症状を引き起こさないが、多くは顕著な出血障害をもたらす。未処置のときには、血友病Bは筋肉、関節、および体腔への制御不能の出血を伴い、死をもたらすことがある。以前には本疾患の処置は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびC型肝炎(HCV)ウイルスを包含する血液媒介ウイルスによる感染という付帯リスクを有する、ドナープールに由来するヒト血漿から調製されたFIXの投与を包含していた。つい最近では、組換えFIX生成物が市販されるようになった。外因的に供給された第IX因子のインビボ活性は、タンパク質半減期および抗トロンビンIIIを包含する凝固抑制因子の両方によって制限される。第IX因子組成物は通例、半減期が短く、注射が頻繁に必要である。また最新のFIXに基づく治療薬は、生物学的利用能が不十分であるため、静脈内投与が必要である。それゆえ血友病Bの防止および/または治療レジメンの一部として投与されるときに、半減期が延長され、活性が保持されている第IX因子組成物への要求がある。
「第IX因子」(「FIX」)は、ヒト第IX因子タンパク質ならびに成熟第IX因子の生物受容体活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を包含する。FIXは、血液凝固第IX因子の代表的な特徴を備えた任意の形態の第IX因子分子であるものとする。FIXは、血漿からのFIXおよびたとえばFIXの欠損(たとえば血友病B)によって引き起こされた患者の出血障害を治癒することができる任意の形態の組換えFIXを包含するものとする。いくつかの実施形態において、FIXペプチドは、表7の配列を包含する、本明細書に記載するFIXペプチドの任意の構造類似体またはペプチドミメティックである。ポリペプチドの生物活性を無効にしない(すなわちその活性を野生型形態(=100%)の10%未満またはなお5%未満に低下させること)、FIXのポリペプチド配列のアミノ酸の軽度の欠損、付加および/または置換も、生物活性誘導体、とりわけ改善された比活性を有するもの(野生型形態の100%の活性を超える)として本出願に包含される。本発明によるFIXは、任意の脊椎動物、たとえば哺乳動物に由来し得る。
た第VIII因子と協調して第X因子を活性化する。あるいは、第IX因子および第X因子はどちらも、外因性経路を介して生成した、apidated組織因子と複合体化された第VIIa因子によって活性化することができる。第Xa因子は次に、プロトロンビンはトロンビンに変換され、トロンビンは今度はフィブリノーゲンをフィブリンに変換してクロットを形成する、最終共通経路に関与する。
Patent Application No.20080261886に記載されるようにクローニングされている。
「成長ホルモン」または「GH」は、ヒト成長ホルモンタンパク質ならびにその種および配列変異体を意味して、これに限定されるわけではないが、GHの191単鎖アミノ酸ヒト配列を包含する。それゆえGHは、天然の全長タンパク質であることができるか、または天然タンパク質の生物活性の少なくとも一部を保持する切断フラグメントもしくは配列変異体であることができる。体の組織に対するGHの効果は概して、同化作用として説明される。他の大半のタンパク質ホルモンと同様に、GHは、成長ホルモン受容体と呼ばれる特異的原形質膜受容体と相互作用することによって働く。下垂体に由来する公知の2種類のヒトGH(以下「hGH」):約22,000ダルトンの分子量を有するhGH(22kD hGH)および約20,000ダルトンの分子量を有するhGH(20kD
hGH)が存在する。20kDHGHは、22kD hGHの32番目から46番目の15アミノ酸残基が消失していることを除いて、191アミノ酸から成る22kD hGHのアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有する。いくつかの報告は、20kD hGHが22kD hGHよりも低いリスクおよび高い活性を示すことが見出されたことを示している。本発明は、本明細書のBPXTEN組成物の生物活性ポリペプチドとして使用するのに適切である20kD hGHの使用も意図する。
19p.844−854に表示されている。さらにヒトGHに相同性の天然配列は、標準相同性検索技法、たとえばNCBI BLASTによって見出され得る。
IV)BPXTEN構造物配置および特性
主題の組成物のBPは、天然の全長ポリペプチドに限定されないが、組換えポリペプチドならびにその生物活性変異体またはフラグメントおよび/または薬理活性変異体またはフラグメントも包含する。たとえば、各種のアミノ酸置換がGPにて行われて、BPの生物活性または薬理特性に関して、本発明の精神から逸脱することなく変異体を生成できることが認められる。ポリペプチド配列中のアミノ酸の保存的置換の例を表9に示す。しかし、本明細書で開示する特異的配列と比較して、BPの配列同一性が100%未満であるBPXTENの実施形態において、本発明は、隣接アミノ酸残基を包含する、BPの配列内の任意の位置であり得る、他の19の天然L−アミノ酸のいずれかによる所与のBPの所与のアミノ酸残基の置換を意図する。任意の1個の置換によって生物活性の所望でない変化が生じた場合、次に、本明細書に記載する方法によって、またはその内容が全体として参照により組み入れられている、たとえばU.S.Pat.No.5,364,934に記載された保存的および非保存的変異の技法およびガイドラインのいずれかを使用して、または当業者に概して公知の方法を使用して、代わりのアミノ酸1個を用いて、構築物を評価することができる。さらに、変異体はたとえば、天然ペプチドの生物活性の少なくとも一部を保持する、1個以上のアミノ酸残基がBPの全長天然アミノ酸配列のN末端またはC末端にて付加または欠失されたポリペプチドも包含することができる。
(a)BPXTEN融合タンパク質配置
本発明は、グルコース恒常性、インスリン抵抗性、または肥満に関連する疾患、障害または状態を防止、処置、媒介、または改善するのに有用な、1個以上のXTENポリペプチドに連結されたBPを含むBPXTEN融合タンパク質組成物を提供する。いくつかの場合において、BPXTENは、1個以上のXTENポリペプチドに連結されたBPを有する単量体融合タンパク質である。他の場合において、BPXTEN組成物は、1個以上のXTENポリペプチドに連結された2個のBP分子を含むことができる。本発明は、これに限定されるわけではないが、表3〜8より選択されたBP(またはそのフラグメントもしくは配列変異体)、および表2より選択されたXTENまたはその配列変異体を含むBPXTENを意図する。いくつかの場合において、それぞれのBPの生物活性の少なくとも一部は無傷のBPXTENによって保持される。他の場合において、BP構成要素は、以下でさらに十分に記載するように、スペーサ配列に組み入れられた必要に応じた切断配列の切断によるXTENのBPXTENへのその放出の際に、生物活性となるか、または活性の増加を有するかのどちらかである。
(BP)−(S)x−(XTEN) I
式中、各出現について、独立して、BPは本明細書で上記のような生物活性タンパク質であり;Sは、(以下でさらに十分に記載するような)切断配列を場合により包含することができる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり;xは0または1のどちらかであり;およびXTENは本明細書で上記のような延長組換えポリペプチドである。該実施形態は、BPが所望の生物活性のために遊離N末端を必要とする、またはBPのC末端の融合タンパク質への連結によって生物活性が低下して、投与したBPXTENの生物活性および/または副作用を低下させることが所望である、特別の有用性を有する。
(XTEN)−(S)x−(BP) II
式中、各出現について、独立して、BPは本明細書で上記のような生物活性タンパク質であり;Sは、(以下でさらに十分に記載するような)切断配列を場合により包含することができる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり;xは0または1のどちらかであり;およびXTENは本明細書で上記のような延長組換えポリペプチドである。該実施形態は、BPが所望の生物活性のために遊離C末端を必要とする場合に、またはBPのN末端の融合タンパク質への連結によって生物活性が低下して、投与したBPXTENの生物活性および/または副作用を低下させることが所望である場合に、特定の有用性を有する。
(BP)−(S)x−(XTEN)−(S)y−(BP)−(S)z−(XTEN)z III
式中、各出現について、独立して、BPは本明細書で上記のような生物活性タンパク質であり;Sは、(以下でさらに十分に記載するような)切断配列を場合により包含することができる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり;xは0または1のどちらかであり;yは0または1のどちらかであり;zは0または1のどちらかであり;およびXTENは本明細書で上記のような延長組換えポリペプチドである。
(XTEN)x−(S)y−(BP)−(S)z−(XTEN)−(BP) IV 別の実施形態において、本発明は単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は式Vの融合タンパク質(上記のような構成要素)である:
(BP)x−(S)x−(BP)−(S)y−(XTEN) V
別の実施形態において、本発明は単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は式VIの融合タンパク質(上記のような構成要素)である:
(XTEN)−(S)x−(BP)−(S)y−(BP) VI
別の実施形態において、本発明は単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は式VIIの融合タンパク質(上記のような構成要素)である:
(XTEN)−(S)x−(BP)−(S)y−(BP)−(XTEN) VII
式I〜VIIの融合タンパク質の上述の実施形態において、実施形態の治療的有効用量の融合タンパク質のそれを必要とする被験体への投与によって、XTENに連結されておらず、同程度の用量で被験体に投与された対応するBPと比較して、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも4倍、または少なくとも5倍以上の、治療ウインドウ内で費やされる時間の増大をもたらすことができる。
一実施形態において、BPXTEN融合タンパク質に組み入れられたBPは、表3〜8からの配列に対して少なくとも約80%配列同一性を、あるいは表3〜8からの配列と比較して少なくとも約81%の、または約82%の、または約83%の、または約84%の、または約85%の、または約86%の、または約87%の、または約88%の、または約89%の、または約90%の、または約91%の、または約92%の、または約93%の、または約94%の、または約95%の、または約96%の、または約97%の、または約98%の、または約99%の、または約100%の配列同一性を示す配列を有することができる。上述の実施形態のBPは、本明細書に記載するアッセイまたは測定もしくは決定されたパラメータを使用して、活性について評価することができ、対応する天然BP配列と比較して、少なくとも約40%の、または約50%の、または約55%の、または約60%の、または約70%の、または約80%の、または約90%の、または約95%以上の活性を保持する配列は、主題のBPXTENへの包含に好適と見なされる。好適な活性レベルを保持することが見出されたBPは、本明細書で上記の1個以上のXTENポリペプチドに連結させることができる。一実施形態において、好適な活性レベルを保持することが見出されたBPは、表2からの配列に対して少なくとも約80%の配列同一性を、あるいは表2の配列と比較して少なくとも約81%の、82%の、83%の、84%の、85%の、86%の、87%の、88%の、89%の、90%の、91%の、92%の、93%の、94%の、95%の、96%の、97%の、98%の、99%の、または約100%の配列同一性を有する1個以上のXTENポリペプチドに連結させて、キメラ融合タンパク質を生じることができる。
本発明は、本明細書に記載する方法によって組成物に対して決定された用量で使用されるときに、薬理学的効果を生じるが、XTENに連結されていないBPの同程度の用量と比較して延長された期間にわたって組成物の生物活性構成要素の安全範囲内になおとどまる循環濃度を達成することができる、XTENに連結されていないBPと比較して薬物動態が増強されたBPXTEN融合タンパク質を提供する。このような場合、BPXTENは、延長された期間にわたって融合タンパク質組成物の治療ウインドウ内に依然として存在する。本明細書で使用する場合、「同程度の用量」は、同程度の様式で被験体に投与される活性BPのファルマコフォアと等価のモル/kgを有する用量を意味する。BPXTEN融合タンパク質の「同程度の投薬量」は、薬剤のより大きい重量を表すが、融合タンパク質の用量におけるBPの本質的に同じモル当量を有するおよび/またはBPに対して同じおおよそのモル濃度を有することが、当分野で理解される。
本発明は、XTENに連結されていないBPと比較して増強された特性を有することができる、XTENに共有結合的に連結されたBPを含むBPXTEN組成物、ならびに組成物の2つのそれぞれのBP構成要素の治療活性または効果および/もしくは生物活性または効果を増強する方法を提供する。さらに本発明は、免疫グロブリンポリペプチドパートナー、より短い長さのポリペプチドおよび/または反復性配列を有するポリペプチドパートナーを含有する当分野で公知の融合タンパク質と比較して、増強された特性を有するBPXTEN組成物を提供する。さらにBPXTEN融合タンパク質は、化学コンジュゲート、たとえばPEG化構築物に勝る顕著な利点、注目すべきは、生成物の研究および開発段階ならびに製造段階の両方で時間および費用を低下させて、ならびにPEG化コンジュゲートと比較してBPXTENの生成物および代謝産物の両方についてより毒性の低い、より均質で明確な生成物を生じることが可能な細菌細胞発現系において、組換えBPXTEN融合タンパク質を作製することができるという事実を提供する。
別の態様において、本発明は、BPに媒介される疾患、障害または状態において有益な効果を達成するための方法を提供する。本発明は、比較的短い最終半減期および/または最小有効用量と最大許容投与量との間の狭い治療ウインドウを有するBPの欠点および/または制限に対処する。
本発明は、相同変異体を含むBPXTENキメラポリペプチドをコードするポリ核酸分子に相補的なBPXTENキメラポリペプチドおよび配列をコードする、単離ポリ核酸を提供する。別の態様において、本発明は、相同変異体を含むBPXTENキメラポリペプチドをコードするポリ核酸分子に相補的なBPXTENキメラポリペプチドおよび配列をコードするポリ核酸を産生する方法を含む。一般に、および図4〜6に例証されるように、BPXTEN融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を産生して、得られた遺伝子産物を発現する方法は、BPおよびXTENをコードするヌクレオチドを構築することと、フレーム内の構成要素を連結することと、コード遺伝子を適切な発現ベクターに組み入れることと、適切な宿主細胞を発現ベクターによって形質転換することと、および形質転換された宿主細胞で融合タンパク質を発現させることと、それにより生物活性BPXTENポリペプチドを産生することとを含む。分子生物学における標準組換え技法を使用して、本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製することができる。
別の態様において、本発明は、所望の長さおよび配列のXTENをコードする遺伝子を構築するために使用できるXTEN配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリを提供する。
XTEN−コード遺伝子のライブラリを、当分野で公知の1個以上の発現ベクターにクローニングされ得る。十分に発現するライブラリメンバの同定を容易にするために、リポータータンパク質への融合物としてライブラリを構築することができる。好適なリポーター遺伝子の非制限的な例は、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、およびベータ−ガラクトシダーゼである。スクリーニングすることによって、好ましい宿主生物にて高濃度で発現できる短いXTEN配列を同定することができる。続いて、ランダムXTENダイマーのライブラリを生成させて、高レベル発現のスクリーニングを反復することができる。続いて、得られた構築物をいくつかの特性、たとえば発現レベル、プロテアーゼ安定性、または抗血清への結合についてスクリーニングすることができる。
Wis.53711)を使用することによって都合よく決定され得る。BestFitは、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム(Advances in Applied Mathematics.1981.2:482−489)を使用して、2個の配列間の同一性または類似性が最良のセグメントを発見する。Gapは、NeedlemanおよびWunschの方法(Journal of Molecular Biology.1970.48:443−453)を使用して、1個の配列すべての、別の類似配列すべてとのグローバルアラインメントを行う。配列相同性、類似性または同一性の程度を決定するために、BestFitなどの配列アラインメントプログラムを使用するとき、デフォルト設定が使用され得るか、または適切なスコアリングマトリクスが選択されて同一性、類似性または相同性スコアが最適化され得る。
l、Hindlll、Nhel、PvuIIおよびKpn1クローニング部位、構成的hCMV最初期遺伝子プロモータ、ハイグロマイシン選択可能マーカー;Invitrogen)、pMEP4(Kpnl、Pvul、Nhel、Hindlll、NotI、Xhol、Sfil、BamHIクローニング部位、誘導性メタロチオネイン(methallothionein)Ha遺伝子プロモータ、ハイグロマイシン選択可能マーカー、Invitrogen)、pREP8(BamHI、Xhol、NotI、Hindlll、NhelおよびKpnlクローニング部位、RSV−LTRプロモータ、ヒスチジノール選択可能マーカー;Invitrogen)、pREP9(Kpnl、Nhel、Hindlll、NotI、Xho1、Sfi1、BamHIクローニング部位、RSV−LTRプロモータ、G418選択可能マーカー;Invitrogen)、およびpEBVHis(RSV−LTRプロモータ、ハイグロマイシン選択可能マーカー、ProBond樹脂によって精製可能であり、エンテロキナーゼによって切断されたN末端ペプチド;Invitrogen)が使用できる。
36,906;Van den Bergら、Bio/Technology,8:135(1990)),K.thermotolerans、およびK.marxianus;yarrowia(EP 402,226);Pichia pastoris(EP 183,070;Sreekrishnaら、J.Basic Microbiol.,28:265−278 [1988]);Candida;Trichoderma
reesia(EP 244,234);Neurospora crassa(Caseら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:5259−5263[1979]);Schwanniomyces、たとえばSchwanniomyces occidentalis(1990年10月31日に公開されたEP 394,538);および糸状菌、たとえばNeurospora、Penicillium,Tolypocladium(1991年1月10日に公開されたWO 91/00357)、およびAspergillus宿主、たとえばA.nidulans(Ballanceら、Biochem.Biophys.Res.Commun.,112:284−289[1983];Tilburnら、Gene,26:205−221[1983];Yeltonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:1470−1474[1984])およびA.niger(Kelly and Hynes,EMBO
J.,4:475−479[1985])を包含する。メチロトローフ酵母は、本明細書で好適であり、これに限定されるわけではないが、Hansenula、Candida、Kloeckera、Pichia、Saccharomyces、Torulopsis、およびRhodotorulaから成る属より選択されるメタノールでの増殖が可能な酵母を包含する。このクラスの酵母を例示する具体的な種のリストは、C.Anthony,The Biochemistry of Methylotrophs,269(1982)に見出され得る。
haemolyticus;Streptococcus agalactiae;Streptomyces griseolosporeus;Streptococcus mutans;Streptococcus pneumoniae;Streptococcus pyogenes;Thermoplasma acidophilum;Thermoplasma volcanium;Vibrio cholerae;Vibrio parahaemolyticus;およびVibrio vulnificusを包含する。
本発明は、BPXTENを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態において、薬学的組成物は、BPXTEN融合タンパク質および少なくとも1つの薬学的に許容され得るキャリアを含む。本発明のBPXTENポリペプチドは、公知の方法に従って調合されて、薬学的に有用な組成物を調製することができ、これによりポリペプチドは薬学的に許容され得るキャリアビヒクル、たとえば水溶液またはバッファー、薬学的に許容され得る懸濁物およびエマルションと混合して組み合わされる。非水性溶媒の例は、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコールおよび植物油を包含する。治療調合物は貯蔵のために、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)に記載されるように、所望の純度を有する活性成分を任意選択の生理的に許容され得るキャリア、賦形剤または安定剤と混合することによって、凍結乾燥調合物または水溶液の形態で調製される。
別の態様において、本発明は、BPXTENポリペプチドの使用を容易にするキットを提供する。一実施形態において、キットは、少なくとも第1の容器に、すぐに注射できる調合物として合わせてまたは滅菌水、バッファー、もしくはデキストロースによる再構成の準備ができている調合物として合せた:(a)それを必要とする被験体への投与の際に疾患、状態または障害を処置するのに十分な量のBPXTEN融合タンパク質組成物;および(b)ある量の薬学的に許容され得るキャリアを;BPXTEN薬物ならびに貯蔵およびに取扱い条件を明記したラベル、ならびに該薬物の承認された適応症、承認された適応症の防止および/または処置に使用するためのBPXTEN薬物の再構成および/または投与の説明、適切な投薬情報および安全性情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限(expiration)を明示した情報を共に含む。上述の別の実施形態において、キットは、被験体に送達されるBPXTENの適切な濃度を使用者に提供する、BPXTEN組成物に好適な希釈剤を収容できる第2の容器を含むことができる。
XTEN_AD36モチーフセグメントの構築
以下の実施例は、36アミノ酸のモチーフ配列をコードするコドン最適化遺伝子のコレクションの構築について記載する。第1のステップとして、スタッファベクターpCW0359を、pETベクターおよびT7プロモータを含むpETベクターに基づいて構築した。pCW0359は、セルロース結合ドメイン(CBD)およびTEVプロテアーゼ認識部位、それに続くBsaI、BbsI、およびKpnI部位がフランキングするスタッファ配列をコードする。BsaIおよびBbsI部位は、これらが消化後に適合性の突出部を生じるように挿入された。スタッファ配列には、切断型のGFP遺伝子およびHisタグが続く。スタッファ配列は停止コドンを含有し、それゆえスタッファプラスミドpCW0359を担持する大腸菌細胞は非蛍光コロニーを形成する。スタッファベクターpCW0359はBsaIおよびKpnIによって消化されて、スタッファセグメントを除去して、得られたベクターフラグメントをアガロースゲル精製によって単離する。配列はモチーフのADファミリを反映して、XTEN_AD36と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列[X]3を有し、ここでXは、配列:GESPGGSSGSES(配列番号270)、GSEGSSGPGESS(配列番号271)、GSSESGSSEGGP(配列番号272)、またはGSGGEPSESGSS(配列番号273)を有する12マーペプチドである。以下の対のリン酸化合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって、インサートを得た:
本発明者らは、リン酸化オリゴヌクレオチド3KpnIstopperFor:AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC(配列番号281)および非リン酸化オリゴヌクレオチドpr_3KpnIstopperRev:CCTCGAGTGAAGACGA(配列番号282)もアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対をライゲーションすると、1つのBbsI/KpnIセグメントにライゲーションされた可変数の12マー反復を表す可変長を有する生成物の混合物が生じた。36アミノ酸の長さに相当する生成物は、分取アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離して、BsaI/KpnI消化スタッファベクターpCW0359にライゲーションした。LCW0401と命名した得られたライブラリのクローンの大半は誘導後に緑色蛍光を示し、これはXTEN_AD36の配列がインフレームでGFP遺伝子とライゲーションされて、XTEN_AD36の大半の配列が良好な発現レベルを有したことを示している。
(実施例2)
XTEN_AE36セグメントの構築
36アミノ酸長のXTEN配列をコードするコドンライブラリを構築した。XTEN配列をXTEN_AE36と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列[X]3を有し、ここでXは、配列:GSPAGSPTSTEE(配列番号359)、GSEPATSGSETP(配列番号360)、GTSESATPESGP(配列番号361)、またはGTSTEPSEGSAP(配列番号362)を有する12マーペプチドである。以下の対のリン酸化合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって、インサートを得た:
本発明者らは、リン酸化オリゴヌクレオチド3KpnIstopperFor:AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC(配列番号371)および非リン酸化オリゴヌクレオチドpr_3KpnIstopperRev:CCTCGAGTGAAGACGA(配列番号372)もアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対をライゲーションすると、1つのBbsI/KpnIセグメントにライゲーションされた可変数の12マー反復を表す可変長を有する生成物の混合物が生じた。36アミノ酸の長さに相当する生成物は、分取アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離して、BsaI/KpnI消化スタッファベクターpCW0359にライゲーションした。LCW0402と命名した得られたライブラリのクローンの大半は誘導後に緑色蛍光を示し、これはXTEN_AE36の配列がインフレームでGFP遺伝子とライゲーションされて、XTEN_AE36の大半の配列が良好な発現を示すことを示している。
(実施例3)
XTEN_AF36セグメントの構築
36アミノ酸長の配列をコードするコドンライブラリを構築した。配列をXTEN_AF36と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列[X]3を有し、ここでXは、配列:GSTSESPSGTAP(配列番号447)、GTSTPESGSASP(配列番号448)、GTSPSGESSTAP(配列番号449)、またはGSTSSTAESPGP(配列番号450)を有する12マーペプチドである。以下の対のリン酸化合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって、インサートを得た:
本発明者らは、リン酸化オリゴヌクレオチド3KpnIstopperFor:AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC(配列番号459)および非リン酸化オリゴヌクレオチドpr_3KpnIstopperRev:CCTCGAGTGAAGACGA(配列番号460))もアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対をライゲーションすると、1つのBbsI/KpnIセグメントにライゲーションされた可変数の12マー反復を表す可変長を有する生成物の混合物が生じた。36アミノ酸の長さに相当する生成物は、分取アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離して、BsaI/KpnI消化スタッファベクターpCW0359にライゲーションした。LCW0403と命名した得られたライブラリのクローンの大半は誘導後に緑色蛍光を示し、これはXTEN_AF36の配列がインフレームでGFP遺伝子とライゲーションされて、XTEN_AF36の大半の配列が良好な発現を示すことを示している。
(実施例4)
XTEN_AG36セグメントの構築
36アミノ酸長の配列をコードするコドンライブラリを構築した。配列をXTEN_AG36と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列[X]3を有し、ここでXは、配列:GTPGSGTASSSP(配列番号549)、GSSTPSGATGSP(配列番号550)、GSSPSASTGTGP(配列番号551)、またはGASPGTSSTGSP(配列番号552)を有する12マーペプチドである。以下の対のリン酸化合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって、インサートを得た:
本発明者らは、リン酸化オリゴヌクレオチド3KpnIstopperFor:AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC(配列番号561)および非リン酸化オリゴヌクレオチドpr_3KpnIstopperRev:CCTCGAGTGAAGACGA(配列番号562)もアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対をライゲーションすると、1つのBbsI/KpnIセグメントにライゲーションされた可変数の12マー反復を表す可変長を有する生成物の混合物が生じた。36アミノ酸の長さに相当する生成物は、分取アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離して、BsaI/KpnI消化スタッファベクターpCW0359にライゲーションした。LCW0404と命名した得られたライブラリのクローンの大半は誘導後に緑色蛍光を示し、これはXTEN_AG36の配列がインフレームでGFP遺伝子とライゲーションされて、XTEN_AG36の大半の配列が良好な発現を示すことを示している。
(実施例5)
XTEN_AE864セグメントの構築
XTEN_AE864をXTEN_AE36のAE72、144,288、576および864への連続2量体化から構築した。XTEN_AE72セグメントのコレクションをXTEN_AE36の37の異なるセグメントから構築した。37すべての異なる36アミノ酸セグメントを内部に持つ大腸菌の培養物を混合して、プラスミドを単離した。このプラスミドプールをBsaI/Ncolで消化して、小型フラグメントをインサートとして生成させた。同じプラスミドプールをBbsI/Ncolで消化して、大型フラグメントをベクターとして生成させた。インサートフラグメントおよびベクターフラグメントをライゲーションすると、長さの倍増が生じ、ライゲーション混合物をBL21Gold(DE3)細胞に形質転換させて、XTEN_AE72のコロニーを得た。
XTEN_AM144の構築
XTEN_AE36の37の異なるセグメント、XTEN_AF36の44のセグメント、およびXTEN_AG36の44のセグメントから開始して、XTEN_AM144セグメントのコレクションを構築した。
(実施例7)
XTEN_AM288の構築
ライブラリLCW0462全体を実施例6に記載するように2量体化して、得られたXTEN_AM288クローンのライブラリをLCW0463と命名した。ライブラリLCW0463からの1512の単離体を実施例6に記載したプロトコルを使用してスクリーニングした。176の高発現クローンを配列決定して、288アミノ酸残基を有する複数のXTENセグメントを含有する多機能性タンパク質の構築のために、40の好ましいXTEN_AM288セグメントを選定した。
XTEN_AM432の構築
本発明者らは、XTEN_AM144セグメントのライブラリLCW0462からのセグメントおよびXTEN_AM288セグメントのライブラリLCW0463からのセグメントを組み換えることより、XTEN_AM432セグメントのライブラリを生成させた。XTEN_AM432セグメントのこの新たなライブラリをLCW0464と命名した。プラスミドは、LCW0462およびLCW0463を内部に持つ大腸菌の培養物からそれぞれを単離した。ライブラリLCW0464からの1512の単離体を実施例6に記載したプロトコルを使用してスクリーニングした。176の高発現クローンを配列決定して、より長いXTENの構築のためにおよび432アミノ酸残基を有する複数のXTENセグメントを含有する多機能性タンパク質の構築のために、39の好ましいXTEN_AM432セグメントを選定した。
XTEN_AM875の構築
スタッファベクターpCW0359をBsaIおよびKpnIによって消化して、スタッファセグメントを除去して、得られたベクターフラグメントをアガロースゲル精製によって単離した。
XTEN_AM1318の構築
本発明者らは、アミノ酸GPEPTGPAPSG(配列番号722)をコードして、制限酵素FseI認識ヌクレオチド配列GGCCGGCCを内部に有するシーケンシングアイランドB(SI−B)を導入するために、リン酸化オリゴヌクレオチドBsaI−FseI−KpnIforP:AGGTCCAGAACCAACGGGGCCGGCCCCAAGCGGAGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC(配列番号720)および非リン酸化オリゴヌクレオチドBsaI−FseI−KpnIrev:CCTCGAGTGAAGACGAACCTCCGCTTGGGGCCGGCCCCGTTGGTTCTGG(配列番号721)をアニーリングした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対を実施例9で使用したようなBsaIおよびKpnI消化スタッファベクターpCW0359とライゲーションして、SI−Bを含有するpCW0467を産した。本発明者らは次に、実施例5に記載したのと同じ2量体化プロセスを使用して、実施例8からの43の好ましいXTEN_AM432セグメントおよびpCW0467からのSI−BセグメントをC末端にて組み換えることによって、XTEN_AM443セグメントのライブラリを生成させた。XTEN_AM443セグメントのこの新たなライブラリをLCW0480と命名した。
XTEN_AD864の構築
本発明者らは2量体化を数回連続して使用して、実施例1に挙げたXTEN_AD36のセグメントから開始してXTEN_AD864配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例5に記載したように構築した。XTEN_AD864からの数個の単離体を評価して、生理的条件下で良好な発現および優れた溶解性を示すことを見出した。XTEN_AD576の1つの中間構築物を配列決定した。このクローンをカニクイザルのPK実験で評価して、約20時間の半減期を測定した。
XTEN_AF864の構築
本発明者らは2量体化を数回連続して使用して、実施例3に挙げたXTEN_AF36のセグメントから開始してXTEN_AF864配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例5に記載したように構築した。XTEN_AF864からの数個の単離体を評価して、生理的条件下で良好な発現および優れた溶解性を示すことを見出した。XTEN_AF540の1つの中間構築物を配列決定した。このクローンをカニクイザルのPK実験で評価して、約20時間の半減期を測定した。XTEN_AF864の全長クローンはカニクイザルにおいて、優れた溶解性を有し、60時間を超える半減期を示した。実施例9に記載したようなシーケンシングアイランドを含むXTEN_AF配列の第2のセットを構築した。
XTEN_AG864セグメントの構築
本発明者らは2量体化を数回連続して使用して、実施例1に挙げたXTEN_AD36のセグメントから開始してXTEN_AG864配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例5に記載したように構築した。XTEN_AG864からの数個の単離体を評価して、生理的条件下で良好な発現および優れた溶解性を示すことを見出した。XTEN_AG864の全長クローンはカニクイザルにおいて、優れた溶解性を有し、60時間を超える半減期を示した。
XTENのN末端延長物の構築−12マー付加ライブラリの構築およびスクリーニング
本実施例は、翻訳の開始を促進し、ヘルパードメインの存在なしで融合タンパク質のN末端でのXTEN融合物の発現を可能にするための、XTENタンパク質のN末端の最適化ステップについて詳述する。コドンレベルで多様性を生成するために、7アミノ酸配列を選択して、多様なコドンを用いて調製した。コドン多様性を有する12アミノ酸をコードする7対のオリゴヌクレオチドを設計、アニーリングして、NdeI/BsaI制限酵素消化スタッファベクターpCW0551(Stuffer−XTEN_AM875−GFP)にライゲーションし、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞に形質転換して、7つのライブラリのコロニーを得た。得られたクローンは、XTEN_AM875−GFPにインフレームで融合されたN末端XTEN12マーを有し、発現のスクリーニングのためにGFP蛍光を使用できるようにする。生成した7つのライブラリから個々のコロニーを選び出し、96深ウェルプレート内のスーパーブロス媒体500μl中で一晩、飽和になるまで生育させた。選び出されたコロニーの数は、ライブラリの理論的多様性の約半分から3分の1に及んだ(表17を参照)。
一晩飽和させた培養物を使用して、新鮮な培養物500μlを自己誘導媒体に接種し、そこで培養物を26℃にて一晩生育させた。次にこれらの発現培養物を蛍光プレートリーダ(励起395nm、発光510nm)を用いてアッセイして、存在するGFPレポータの量を決定した。結果により、中央値発現レベルがCBDのN末端ヘルパードメインによる発現レベルのおおよそ半分であることが示される。しかしライブラリからの最良のクローンがベンチマークにはるかに近く、これらの配列の周囲でのさらなる最適化が保証されたことが示された。アミノ酸MAで開始するライブラリがMEで始まるライブラリよりも良好な発現を産生したことも明白であった。このことは、最良のクローン(ベンチマークにより近い)がたいていMAで開始するので、その最良のクローンを見れば最も明らかであった。CBD−AM875ベンチマークの33%以内の176クローンのうち87%がMAで始まり、上記ライブラリにおける配列の75%のみがMAで始まるので、MAで始まるそれらのクローンが最高レベルでの発現を表すことは明らかであった。最良のクローンのうち96を配列決定して同一性を確認し、LCW546から4つ、LCW547から4つおよびLCW552から4つの12配列(表18を参照)をさらなる最適化のために選択した。
(実施例15)
XTENのN末端延長物の構築−コドン3および4を最適化するライブラリの構築およびスクリーニング
本実施例は、翻訳の開始を促進し、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のN末端でのXTEN融合物の発現を可能にするための、XTENタンパク質のN末端の最適化ステップについて詳述する。確立された最初の2つのコドンに対する選択性(上の例を参照)を用いて、第3および第4のコドンを無作為化して選択性を決定した。許容されるXTENコドンのすべての組合せがこれらの位置に存在するように改変された第3および第4の残基を用いて、LCW546、LCW547およびLCW552による最良のクローンに基づく3つのライブラリを設計した。許容されるすべてのXTENコドンを各ライブラリに含めるために、第3および第4の残基のコドン多様性を有する12アミノ酸をコードする9対のオリゴヌクレオチドを設計、アニーリングして、NdeI/BsaI制限酵素で消化したスタッファベクターpCW0551(Stuffer−XTEN_AM875−GFP)にライゲーションして、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞に形質変換して、3つのライブラリLCW0569−571のコロニーを得た。24XTENコドンでは、各ライブラリの理論的多様性は576のユニークなクローンである。生成した3つのライブラリから合計504の個々のコロニーを選び出し、96深ウェルプレート内のスーパーブロス媒体500μl中で一晩、飽和になるまで生育させた。これにより相対的なライブラリの性能および配列選択性を理解するために十分な適用範囲が提供される。一晩飽和させた培養物を使用して、新しい培養物500μlを自己誘導媒体に接種して、そこで培養物を26℃にて一晩生育させた。次に、これらの発現培養物を蛍光プレートリーダ(励起395nm、発光510nm)を用いてアッセイして、存在するGFPレポータの量を決定した。スクリーニングによる上位75のクローンを配列決定して、GFPリポーター発現をベンチマーク試料に対して再試験した。52のクローンが使用可能な配列決定データを産し、続いての分析に使用した。結果はライブラリによって分類され、LCW546が優位なライブラリであることを示した。結果を表19に表示する。
第3位および第4位の特定のコドンに対する選択性を示すさらなる傾向がデータに見られた。LCW569ライブラリ内では、表20に見られるように、第3位のグルタメートコドンGAAおよびトレオニンコドンACTがより高い発現に関連付けられた。
XTENのN末端延長物の構築−コンビナトリアル12マーおよび36マーライブラリの構築およびスクリーニング
本実施例は、翻訳の開始を促進し、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のN末端でのXTEN融合物の発現を可能にするための、XTENタンパク質のN末端の最適化ステップについて詳述する。確立された最初の2つのコドンに対する選択性(上の例を参照)を用いて、まさにN末端にある選択した12の12マー配列(上掲の実施例を参照)とそれに続く以前に構築した125の36マーセグメント(上掲の実施例を参照)をコンビナトリアル方式で組み合わせることによって、より広い状況でN末端を検査した。これによりXTENタンパク質のN末端に新規48マーが生成され、より長い配列の発現に対するN末端におけるより長い範囲の相互作用の影響の評価が可能となった(図11)。36マーを構築するために使用した2量体化手順(上の実施例を参照)と同様に、選択した125の36マーセグメントを含有するプラスミドを制限酵素BbsI/NcoIで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。クローンAC94(CBD−XTEN_AM875−GFP)からのプラスミドをBsaI/NcoIで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。これらのフラグメントを共にライゲーションして、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞に形質転換し、ライブラリLCW0579のコロニーを得て、該コロニーはまさにN末端において選択された12の12マーのさらなるクローニングのためのベクターとしての役割も果たした。LCW0579のプラスミドをNdeI/EcoRI/BsaIで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。選択した12の12マー配列をコードするオリゴヌクレオチドの12対を設計、アニーリングし、NdeI/EcoRI/BsaI消化LCW0579ベクターによってライゲーションして、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞に形質転換し、ライブラリLCW0580のコロニーを得た。1500のユニークなクローンの理論的多様性を用いて、生成されたライブラリから合計1512の個々のコロニーを選び出し、96深ウェルプレート内のスーパーブロス媒体500μl中で一晩、飽和になるまで生育させた。これにより相対的なライブラリの性能および配列選択性を理解するために十分な適用範囲が提供される。一晩飽和させた培養物を使用して、新しい培養物500μlを自己誘導媒体に接種して、そこで培養物を26℃にて一晩生育させた。次に、これらの発現培養物を蛍光プレートリーダ(励起395nm、発光510nm)を用いてアッセイして、存在するGFPレポータの量を決定した。上位90のクローンを配列決定して、GFPリポーター発現を再試験した。83のクローンが使用可能な配列決定データを産し、続いての分析に使用した。配列決定データを使用して各クローンに存在するリード12マーを決定して、各12マーの発現に対する影響を評価した。クローンLCW546_06およびLCW546_09は優れたN末端として突出していた(表21を参照)。
配列決定および再試験によって、同じ結果を産生するデータにおける同じ配列の非依存性複製物の数個の例も明らかとなり、それゆえアッセイの信頼度が増加した。その上、6つユニークな配列を有する10のクローンはベンチマーククローンより優位であった。これを表22に表示する。これらのクローンがこれらの配列の唯一の出現であることに注目され、いかなる場合もこれらの配列のうちの1つが出現して、ベンチマーククローンに勝てないことがなかった。この6つの配列でさらなる最適化を進めた。
(実施例17)
XTENのN末端延長物の構築−XTEN−AM875およびXTEN−AE864のコンビナトリアル12マーおよび36マーライブラリの構築およびスクリーニング
本実施例は、翻訳の開始を促進し、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のN末端でのXTEN融合物の発現を可能にするための、XTENタンパク質のN末端の最適化ステップについて詳述する。最初の4つのコドンに対する(上掲の実施例を参照、ならびに確立されたN末端12マーおよび36マーの最良の対合に対する(上掲の実施例を参照)選択性を用いて、コンビナトリアル手法に着手して、これらの選択性の組合せ(union)を検査した。これによりXTENタンパク質のN末端に新規48マーが生成され、以前の結果のコンフルエンスの試験が可能となった。その上、これらのリーダー配列がすべてのXTENタンパク質にとって普遍的な解決策となる能力を、XTEN−AE864およびXTEN−AM875の両方の前に新しい48マーを置くことによって評価した。36マーセグメントの125のクローンすべてを使用するあるいは、コンビナトリアルライブラリで最良のGFP発現を有する36マーセグメントの選択した6つのクローンからのプラスミドをNdeI/EcoRI/BsaIで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。クローンAC94(CBD−XTEN_AM875−GFP)およびAC104(CBD−XTEN_AE864−GFP)からのプラスミドをNdeI/EcoRI/BsaIで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。これらのフラグメントを共にライゲーションして、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞に形質転換し、ライブラリLCW0585(−XTEN_AM875−GFP)およびLCW0586(−XTEN_AE864−GFP)のコロニーを得て、該コロニーはまさにN末端において選択された8つの12マーのさらなるクローニングのためのベクターとしての役割も果たし得た。LCW0585およびLCW0586のプラスミドをNdeI/EcoRI/BsaIで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。以前の(第2世代)スクリーニングで最良のGFP発現を有する8つの選択された12マー配列をコードするオリゴヌクレオチドの8対を設計、アニーリングし、NdeI/EcoRI/BsaI消化LCW0585およびLCW0586ベクターによってライゲーションして、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞に形質転換し、最終ライブラリLCW0587(XTEN_AM923−GFP)およびLCW0588(XTEN_AE912−GFP)のコロニーを得た。48のユニークなクローンの理論的多様性を用いて、生成したライブラリから252の個々のコロニーを選び出し、96深ウェルプレート内のスーパーブロス媒体500μl中で一晩、飽和になるまで生育させた。これにより相対的なライブラリの性能および配列選択性を理解するために十分な適用範囲が提供された。一晩飽和させた培養物を使用して、新しい培養物500μlを自己誘導媒体に接種して、そこで培養物を26℃にて一晩生育させた。次に、これらの発現培養物を蛍光プレートリーダ(励起395nm、発光510nm)を用いてアッセイして、存在するGFPレポータの量を決定した。上位36のクローンを配列決定して、GFPリポーター発現を再試験した。36のクローンが使用可能な配列決定データを産し、これらの36のクローンを続いての分析に使用した。配列決定データにより、クローンに存在する12マー、第3コドン、第4コドンおよび36マーが決定され、それらのクローンの多くが同じ配列の非依存性複製物であることが明らかにされた。その上、これらのクローンの再試験結果は値が近接しており、スクリーニングプロセスが頑強であったことが示される。N末端における特定の組み合わせに対する選択性が見られ、ベンチマーク対照よりも高い蛍光値を一貫して産していた(表23および24を参照)。
顕著にはXTEN−AM875のN末端の好ましい組み合わせおよびXTEN−AE864の好ましい組み合わせは同じではなく(表23および24)、開始部位からの150を超えるさらに複雑な相互作用が発現レベルを左右することが示される。好ましいヌクレオチド配列についての配列は表25に挙げられており、好ましいクローンをSDS−PAGEによって分析して独立して発現を確認した。XTEN_AM923およびXTEN_AE912の完全配列をさらなる分析のために選択した。
(実施例18)
BPXTEN;例としてXTEN−Ex4を産生および評価する方法
BPXTEN組成物を産生および評価するための一般スキームが図6に表示され、本実施例の概要の基礎を形成する。開示した方法および当業者に公知の方法を例証的な実施例で提供したガイダンスと共に使用すると、当業者は当分野で公知のXTEN、BPおよびBPの変異体を含む一連のBPXTEN融合タンパク質を生成および評価することができる。したがって、本実施例は、方法の単なる例証であり、いかなるやり方でも決して方法を制限するものではないと解釈される;当業者には多くの変形が明らかとなる。本実施例において、モチーフのAEファミリのXTENに連結されたエキセンジン−4(「Ex4」)のBPXTENが生成される。
XTEN融合タンパク質の分析サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー分析を、増加する長さの各種の治療タンパク質および非構造化組換えタンパク質を含有する融合タンパク質に対して行った。例示的なアッセイはTSKGel−G4000 SWXL(7.8mm×30cm)カラムを使用して、該カラム内で40μgの、濃度1mg/mlの精製グルカゴン融合タンパク質を20mMリン酸塩pH6.8、114mM NaClにおいて流速0.6ml/分にて分離した。OD214nmおよびOD280nmを使用して、クロマトグラムプロフィールを監視した。すべてのアッセイのカラム校正は、BioRadからのサイズ排除校正標準を使用して行った;マーカーは、サイログロブリン(670kDa)、ウシガンマグロブリン(158kDa)、ニワトリ卵白アルブミン(44kDa)、ウマミオグロビン(17kDa)およびビタミンB12(1.35kDa)を含む。グルカゴン−Y288、グルカゴン−Y144、グルカゴン−Y72、グルカゴン−Y36の代表的なクロマトグラフィープロフィールは、図15にオーバーレイとして示す。データは、各化合物の見かけの分子量が付着したrPEG配列の長さに比例することを示す。しかしデータは、各構築物の見かけの分子量が球状タンパク質で予想される分子量よりも顕著に大きい(同じアッセイの標準タンパク質泳動との比較により示されるように)ことも示す。評価したすべての構築物のSEC分析に基づいて、見かけの分子量、見かけの分子量係数(見かけの分子量の計算した分子量に対する比として表現される)および流体力学半径(nMでのRH)を表26に示す。結果は、576以上のアミノ酸の異なるXTENの組み入れが、融合タンパク質のおおよそ339kDa〜760kDaの見かけの分子量を与えることと、864以上のアミノ酸のXTENがおおよそ800kDA超の見かけの分子量を与えることとを示している。実際の分子量に対する見かけの分子量の比例的増加の結果は、少なくとも4倍の増加および約17倍もの高い比を有する、複数の異なるモチーフファミリ;すなわちAD、AE、AF、AG、およびAMからのXTENを有する生成された融合タンパク質に一致していた。その上、576以上のアミノ酸を有するXTEN融合パートナーのグルコース調節ペプチドを有する融合タンパク質への組み入れは、おおよそ3〜5nmの糸球体孔径を十分に超える7nm以上の流体力学半径によって生じた。したがって、グルコース調節ペプチドおよびXTENを含む融合タンパク質が腎クリアランスを低下させて、対応する未融合生物活性タンパク質と比べて、最終半減期の増加および治療または生物製剤効果の改善に寄与することが結論付けられる。
(実施例20)
カニクイザルにおけるGFPに融合された延長ポリペプチドの薬物動態
カニクイザルにおけるGFP−L288、GFP−L576、GFP−XTEN_AF576、GFP−XTEN_Y576およびXTEN_AD836−GFPの薬物動態を試験して、非構造化ポリペプチドの組成および長さのPKパラメータに対する効果を決定した。注射後の各種の時点で血液試料を分析して、血漿中のGFPの濃度を、捕捉のためのGFPに対するポリクローナル抗体および検出のための同じポリクローナル抗体のビオチン化調製物を用いたELISAによって測定した。結果を図23にまとめる。結果は、XTEN配列の長さの増加と共に、半減期の驚くべき増加を示す。たとえばGFP−XTEN_L288(XTENに288アミノ酸残基を有する)では、10時間の半減期が決定された。576アミノ酸に対する非構造化ポリペプチド融合パートナーの長さが2倍になると、複数の融合タンパク質構築物、すなわちGFP−XTEN_L576、GFP−XTEN_AF576、GFP−XTEN_Y576で半減期が20〜22時間に増加した。836残基に対する非構造化ポリペプチド融合パートナーの長さのさらなる増加は、XTEN_AD836−GFPで72〜75時間の半減期を生じた。それゆえ288残基から576残基への288残基のポリマー長の増加は、インビボ半減期を約10時間増加させた。しかし、576残基から836残基への260残基のポリペプチド長の増加は半減期を50時間超増加させた。これらの結果は、インビボ半減期の比例的増大よりも大きい増大を生じる、非構造化ポリペプチド長の驚くべき閾値があることを示す。それゆえ、延長非構造化ポリペプチドを含む融合タンパク質は、より短い長さのポリペプチドと比較して薬物動態増強特性を有することが予想される。
XTENの血清安定性
GFPのN末端に融合されたXTEN_AE864を含有する融合タンパク質をサル血漿およびラット腎臓溶解物中37℃にて最長7日間インキュベートした。図13に示すように、試料を第0、1および7日に採取して、SDS PAGEによって分析し、ウェスタン分析による検出およびGFPに対する抗体による検出を続けた。XTEN_AE864の配列は、血漿中での7日間にわたって、分解の徴候は無視できるものであった。しかし、XTEN_AE864はラット腎臓溶解物中で3日間にわたって迅速に分解された。融合タンパク質のインビボ安定性を上記のように、GFP_AE864が免疫沈降された血漿試料で試験して、SDS PAGEで分析した。注射後最大7日まで採取した試料は、分解の徴候をほとんど示さなかった。結果によって、BPXTEN融合タンパク質の薬物動態特性の増強における因子である血清プロテアーゼによる分解に対する、BPXTENの抵抗性を証明する。
BPXTEN構成要素XTEN_IL−1ra遺伝子およびベクターの構築
153aaのヒトIL−1raをコードする遺伝子をプライマ5’−ATAAAGGGTCTCCAGGTCGTCCGTCCGGTCGTAAATC(配列番号756)および5’−AACTCGAAGCTTTTATTCGTCCTCCTGGAAGTAAAA(配列番号757)を用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅して、これによりXTENデスティネーションベクターのスタッファにフランキングするBbsIおよびHindIII部位と適合性である、フランキングBsaIおよびHindIII(下線)制限部位を導入した(図7C)。XTENデスティネーションベクターは、カナマイシン抵抗性遺伝子を含有して、セルロース結合ドメイン(CBD)−XTEN−緑色蛍光タンパク質(GFP)の形式の、NovagenからのpET30誘導体であり、GFPはC末端にてペイロードをクローニングするためのスタッファである。XTENデスティネーションベクターのGFPをIL−1raコードフラグメントで置き換えることによって、構築物を生成させた(図7)。XTENデスティネーションベクターは、CBDの上流のT7プロモータ、それに続くスタッファGFP配列の上流にてインフレームで融合されたXTEN配列を特色とする。用いたXTEN配列は、それぞれ875、1318、875および864アミノ酸の長さを有するAM875、AM1318、AF875およびAE864である。BbsIおよびHindIIIエンドヌクレアーゼを使用する制限消化によって、スタッファGFPフラグメントを除去した。T4 DNAリガーゼを使用して、BsaIおよびHindIII制限消化IL−1ra DNAフラグメントをBbsIおよびHindIII消化XTENデスティネーションベクターにライゲーションして、ライゲーション混合物を電気穿孔によって大腸菌株BL21(DE3)Gold(Stratagene)に形質転換した。抗生物質カナマイシンを含有するLBプレートで成長する能力によって、形質転換体を同定した。プラスミドDNAを選択したクローンから単離して、制限分析およびDNA配列決定によって確認した。最終ベクターはT7プロモータの制御下でCBD XTEN_L−1ra遺伝子を産し、CBDは改変(engineered)TEV切断部位によって末端で切断されてXTEN_IL1−raを生じる。C末端にて異なるXTENに融合されたIL−1raを有する各種の構築物は、AC1723(CBD−XTEN_AM875−IL−1ra)、AC175(CBD−XTEN_AM1318−IL−1ra)、AC180(CBD−XTEN_AF875−IL−1ra)、およびAC182(CBD−XTEN_AE864−IL−1ra)を含む。
XTEN_AM875およびXTEN_AE864に融合されたヒトインターロイキン−1受容体アゴニスト(IL−1ra)の発現、精製、およびキャラクタリゼーション
細胞培養物の産生
スターター培養物は、AE864、AM875、またはAM1296に融合されたIL−1raをコードするプラスミドを担持する大腸菌のグリセロールストックを、40ug/mLカナマイシンを含有する100mLの2xYT媒体に接種することによって調製した。培養物を次に37℃にて一晩振とうした。100mLのスターター培養物を使用して、40μg/mLカナマイシンを含有する25リットルの2xYTに接種し、37℃にてOD600が約1.0に達するまで(5時間にわたって)振とうした。温度を次に26℃まで低下させて、1.0mMの最終濃度のIPTGによってタンパク質発現を誘導した。培養物を次に26℃にて一晩振とうした。細胞を遠心分離によって収集して、合計200グラムの細胞ペーストを産した。ペーストは使用するまで−80℃にて凍結貯蔵した。
細胞ペーストを20mMトリスpH6.8、50mM NaClに、細胞ペースト1グラム当たり4mlのバッファーの比で懸濁させた。細胞ペーストを次に、トップスターラーを使用してホモジナイズした。20000psiにてマイクロフルイダイザに試料を1回通過させることによって、細胞溶解を達成した。Sorvall G3Aロータで12000rpmにて20分間遠心分離することにより、溶解物を清澄にした。
2および10mcgの最終精製タンパク質に、InvitrogenからのNuPAGE4−12%ビス−トリスゲルを製造者の仕様書に従って使用して、非還元SDS−PAGEを受けさせた。結果(図14)は、約160kDaの適切なMWを有するIL−1ra−XTEN_AE864組成物が、上で詳述したプロセスによって回収されたことを示す。
Phenomenex BioSEP SEC S4000(7.8×300mm)カラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィー分析を行った。1mg/mlの濃度の、20μgの精製タンパク質を20mMトリス−Cl pH 7.5、300mM NaClにおいて0.5ml/分の流速で分離した。214nmおよび280nmにおける吸光度によって、クロマトグラムプロフィールを監視した。カラム校正は、BioRadによるサイズ排除校正標準を使用して行い、マーカーは、サイログロブリン(670kDa)、ウシガンマグロブリン(158kDa)、ニワトリ卵白アルブミン(44kDa)、ウマミオグロビン(17kDa)およびビタミンB12(1.35kDa)を含む。IL−1ra−XTEN_AM875の代表的なクロマトグラフプロフィールを図15に示し、校正標準を破線で示し、IL−1ra−XTEN_AM875を実線によって示す。データは、上記のように、各構築物の見かけの分子量が、球状タンパク質で予想される分子量よりも著しく大きく(同じアッセイの標準タンパク質泳動との比較により示されるように)、SDS−PAGEによって決定された分子量よりも顕著に大きい見かけの分子量を有することを示す。
Vydac Protein C4(4.6×150mm)カラムを使用して、分析RP−HPLCクロマトグラフィー分析を行った。カラムをHPLCグレードの水中の0.1%トリフルオロ酢酸によって1ml/分の流速にて平衡化した。0.2mg/mlの濃度の10マイクログラムの精製タンパク質を別個に注射した。タンパク質を0.1%TFA中5%〜90%アセトニトリルの直線勾配で溶出させた。OD214nmおよびOD280nmを使用して、クロマトグラムプロフィールを監視した。IL−1ra−XTEN_AM875の代表的なバッチのクロマトグラムを図16に示す。
IL−Ira−含有XTEN融合タンパク質の活性を評価するために、ELISAに基づく受容体結合アッセイを使用した。ここでCostar 3690アッセイプレートのウェルをウェル当り50ngの、ヒトIgGのFcドメインに融合されたマウスIL−1受容体(IL−1R/Fc,R&D Systems)で一晩コーティングした。続いてウェルを3%BSAでブロッキングして、固相との非特異的相互作用を防止した。ウェルを十分に洗浄した後、IL−1ra−XTEN_AM875、XTEN_AM875−IL−1ra、またはIL−1ra(アナキンラ)の任意の希釈系列をウェルに適用した。結合反応を室温にて2時間進行させた。未結合Il−1raを反復洗浄によって除去した。結合IL−1raおよびIL−1ra−XTEn融合物をビオチン化抗ヒトII−1ra抗体およびホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンによって検出した。反応物をTMB基質によって室温にて20分間展開させた(developed)。0.2N硫酸の添加によって色展開を停止させた。450nmおよび570nmにおける各ウェルの吸光度をSpectrMax 384Plus分光光度計で記録した。補正吸光度シグナル(Abscorr=Abs450nm−Abs570nm)をIL−1ra−XTENまたはIL−Ira濃度の関数としてプロットして、図17に示すように結合等温線を産生した。
タンパク質治療薬の血清半減期を延長することに加えて、XTENポリペプチドは、それが融合されるペイロードの熱安定性を改善する特性を有する。たとえばXTENポリペプチドの親水性の性質は、凝集を低下または防止し、それゆえペイロードタンパク質の再折畳みに有利であり得る。XTENのこの特色は、多種多様のタンパク質治療薬のための室温で安定な調合物の開発を補助し得る。
IL−1raおよびXTENを含む融合タンパク質のPK分析
各融合タンパク質のインビボ薬物動態パラメータを決定するために、BPXTEN融合タンパク質IL−1ra_AE864、IL−1ra_AM875、およびIL−1ra_AM1296をカニクイザルにおいて評価した。すべての組成物を水性バッファー中で得て、皮下(SC)経路で個々の動物(n=4/群)に1mg/kgおよび/または10mg/kg単回用量を使用して投与した。血漿試料を投与後の各種の時点で採取して、被験物質(test article)の濃度を分析した。分析はサンドイッチELISA形式を使用して行った。ウサギポリクローナル抗XTEN抗体をELISAプレートのウェルにコーティングした。ウェルをブロッキング、洗浄して、血漿試料を次に様々な希釈度で、ウェル中でインキュベートして、コート抗体による化合物の捕捉を可能にした。ウェルを広範囲に洗浄して、ポリクローナル抗IL−1ra抗体のビオチン化調製物およびストレプトアビジンHRPを使用して、結合タンパク質を検出した。各血清希釈度での比色反応を標準曲線に対して比較することによって、被験物質の濃度を各時点で計算した。薬物動態パラメータは、WinNonLinソフトウェアパッケージを使用して計算した。
(実施例25)
エキセンジン−4およびXTENを含む融合タンパク質のPK分析
単回皮下投薬後の融合タンパク質のインビボ薬物動態パラメータを決定するために、BPXTEN融合タンパク質Ex4_AE864をカニクイザルにおいて評価した。
結論:BPXTEN融合物を生成するためのエキセンジン−4のXTENへの連結によって、霊長類モデルで証明されたように、3つすべての調合物で、半減期の少なくとも30倍の増加と共に薬物動態パラメータの顕著な増強が生じ、このような融合タンパク質組成物の有用性が証明される。
食餌誘発性肥満マウスモデルにおけるBPXTENの使用
XTENに連結されたグルコース調節ペプチド併用療法の効果を食餌誘発性肥満のマウスモデルにおいて評価して、単一BPXTEN組成物としての単量体融合タンパク質の固定併用の有用性を確認した。
カニクイザルにおけるEx4−XTEN BPXTENのPK分析
Ex4−AE864 BPXTENの薬物動態を、0.5mg/kgのBPXTENの1分間にわたる皮下または静脈内注射によってBPXTENを投与されたカニクイザル(1群あたり3頭)において決定した。血漿試料を注射14日後までの各種の時点で採取して、被験物質の血清濃度および免疫原性の両方を決定するためにELISAで分析した。Ex4−AE864の抗被験物質抗体反応は、投与後にいずれの動物でも観察されなかった。サンドイッチELISAを100ng捕捉抗体(ウサギ抗エクセナチド、Peninsula Laboratories、San Carlos, CA)のポリスチレン・マイクロタイター・プレート(Costar 3690,Corning Inc、Corning, N.Y.)の各ウェルへの12時間超の動員、それに続く3%ウシ血清アルブミン(BSA)によるブロッキングによって行った。PBSによる3回の洗浄後、血漿試料を、1%BSAおよび0.5%Tween20を含有するPBS中でプレート全体にわたって連続滴定した。2時間のインキュベーションおよび洗浄後に、試料をビオチン化IgG(インハウスでビオチン化したウサギ抗エクセナチド、Peninsula Laboratories、San Carlos, CA)の各ウェルへの添加によってプローブした。インキュベーションおよび洗浄の後、プレートをホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン(Thermo Fisher Scientific、Rockford,IL)、それに続くテトラメチルベンジン基質(Neogen Corporation、Lexington, KY)で展開させて、次に0.2N H2SO4によって反応停止して、450nmにて読み取った。ノンコンパートメント薬物動態パラメータは、WinNonLinプログラム、Version 2.1(Pharsight Corporation,Mt.View,CA)を使用して計算した。
複数の種でのEx4−XTEN BPXTENのPK分析および予測ヒト半減期
XTENに融合された治療タンパク質のヒトにおける予測薬物動態プロフィールを決定するために、単一の融合ポリペプチドとしてAE864 XTENに融合されたエキセンジン−4を使用して試験を行った。このEx4−XTEN構築物を4つの異なる動物種に0.5〜1.0mg/kgにて皮下および静脈内投与した。投与後に間隔を置いて血清試料を採取し、標準方法を使用して血清濃度を決定した。各種の半減期を決定して、表29で表にした。結果を使用して、最終半減期の相対スケーリング、分布容積、および平均体重に基づくクリアランス速度を用いて、ヒト半減期を予測した。図26Aは、動物種における測定した最終半減期対体重のプロットを示し、75kgヒトでの予測T1/2は、エクセナチドで報告された2.4時間の半減期と比較して140時間である(Bond,A.Proc(Bayl Univ Med Cent)19(3):281−284.(2006))。図26Bは、測定した薬物クリアランス対体重を示し、75kgのヒトでの予測クリアランス速度値は30ml/時間である。図26Cは、測定した分布容積対体重を示し、75kgのヒトでの予測値は5970mlである。
(実施例29)
XTENへの連結によるBPの溶解度および安定性の増加
XTENが溶解度および安定性の物理/化学特性を増強する能力を評価するために、より短い長さのXTENを含むグルカゴンの融合タンパク質を調製して評価した。この被験物質を中性pHのトリス緩衝食塩水で調製して、Gcg−XTEN溶液のキャラクタリゼーションは逆相HPLCおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって、タンパク質は溶液中で均質であり、凝集していないことを確認した。データを表30に表示する。比較の目的で同じバッファーにおける未改変グルカゴンの溶解度限界を60μM(0.2mg/mL)にて測定して、結果により、付加したXTENのすべての長さで溶解度の実質的な増加が獲得されたことが証明される。重要なことに、大半の場合でグルカゴン−XTEN融合タンパク質は、標的濃度を達成するように調製され、所与の構築物の最大溶解度限界を決定するように評価されなかった。しかし、AF−144 XTENに連結されたグルカゴンの場合、溶解度限界が決定され、結果として、XTENに連結されていないグルカゴンと比較して、60倍の溶解度の増加が達成された。さらにグルカゴン−AF144 BPXTENは、安定性について評価され、液体調合物において冷蔵条件下で少なくとも6ヶ月間および37℃でおおよそ1ヶ月間安定であることが見出された(データは示さず)。
(実施例30)
BPXTENの2次構造のキャラクタリゼーション
BPXTEN Ex4−AE864を円偏光二色性分光法によって2次構造の程度について評価した。CD分光法は、Jasco Peltier温度コントローラ(TPC−348WI)を装備したJasco J−715(Jasco Corporation、Tokyo, Japan)分光偏光計で行った。タンパク質濃度を20mMリン酸ナトリウムpH7.0、50mM NaCl中で0.2mg/mLに調整した。実験は、光路長0.1cmのHELLMA石英セルを使用して行った。CDスペクトルを5℃、25℃、45℃、および65℃にて取得して、J−700 version 1.08.01(Build 1)Jasco software for Windows(登録商標)を使用して処理した。CD測定を行う前に、試料を各温度にて5分間平衡化した。すべてのスペクトルは帯域幅1nmおよび時間定数2秒を使用して、走査速度100nm/分にて300nm〜185nmまでを2連で記録した。図24に示すCDスペクトルは、安定な2次構造の証拠を示さず、非構造化ポリペプチドと一致している。
グルカゴンおよびEx4 BPXTEN構築物の生物活性
BPXTEN融合タンパク質としてそれぞれY288に連結された精製グルカゴンおよびエキセンジン−3を生物活性について、インビトロ細胞アッセイを使用してアッセイした。簡潔には、ChemiScreen安定カルシウム最適化グルカゴン受容体細胞系統を、グルカゴンおよびグルカゴン−XTEN構築物のリアルタイムカルシウム動員アッセイに使用して、天然GLP−1受容体を発現する最適化エキセンジン−4受容体細胞系統をエキセンジン−4およびEx4構築物に使用した。本系において、細胞は天然受容体を発現して、本受容体の活性化は、FLIPR装置を使用して検出できる細胞内でのカルシウム流動を生じる。図27に示すように、天然グルカゴンは、用量依存方式でシグナルの増加を生じる。本系における天然グルカゴンのEC50は、4.1nMであることが見出された。グルカゴン−Y288構築物の滴定は、同程度の応答曲線を産し、EC50は72nMであった。図28に示すように、2つの異なる市販元(AnaspecおよびTocris)からの天然エキセンジン−4は、用量依存方式でシグナルの増加を生じ、EC50(破線で示す)はそれぞれ75pMおよび110pMであった。エキセンジン−4−Y576構築物の滴定は、同程度の応答曲線を産し、EC50は98pMであり、補助タンパク質の融合が全生物活性を保持することが示された。
hGH_XTEN−AE遺伝子およびhGH_XTEN−AM遺伝子およびベクターの構築
hGHをコードする遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅して、これによりXTENデスティネーションベクターのスタッファにフランキングするNdeIおよびBsaI部位と適合性である、NdeIおよびBbsI制限部位を導入した。pXTENプラスミドは、スタッファ−XTENの形式のNovagenからのpET30誘導体であり、スタッファは緑色蛍光タンパク質(GFP)またはCBDのどちらかであることができ、XTENは36〜576以上の任意の長さであることができる。pXTENのスタッファ配列をhGHコードフラグメントで置き換えることによって、構築物を生成させた。pXTENは、スタッファ配列の上流のT7プロモータ、およびスタッファ配列の下流にてインフレームで融合されたXTEN配列を特色とする。用いたXTEN配列は、ファミリXTEN_AEまたはXTEN_AMに属し、36、72、144、288、576、864、875および1296アミノ酸を含む長さをコードする。NdeIおよびBsaIエンドヌクレアーゼを使用する制限消化によって、スタッファフラグメントを除去した。T4DNAリガーゼを使用して、制限消化hGH DNAフラグメントを切断pXTENベクターにライゲーションし、BL21(DE3)Gold(Stratagene)中へと電気穿孔した。形質転換体をDNAミニプレップによってスクリーニングして、所望の構築物をDNA配列決定によって確認した。最終ベクターはT7プロモータの制御下でhGH_XTEN遺伝子を産する。
XTEN−AE_hGH遺伝子およびXTEN−AM_hGH遺伝子およびベクターの構築
hGHをコードする遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅して、これによりXTENデスティネーションベクターのスタッファにフランキングするBbsIおよびHindIII部位と適合性である、BbsIおよびHindIII制限部位を導入した。pCBD−XTENプラスミドは、セルロース結合ドメイン(CBD)−XTEN−スタッファの形式のNovagenからのpET30誘導体であり、スタッファは緑色蛍光タンパク質(GFP)であり、XTENは36〜576以上の任意の長さであることができる。pCBD−XTENのスタッファ配列をhGHコードフラグメントで置き換えることによって、構築物を生成させた。pCBD−XTENは、CBDの上流のT7プロモータ、それに続くスタッファ配列の上流にてインフレームで融合されたXTEN配列を特色とする。用いたXTEN配列は、ファミリXTEN_AEおよびXTEN_AMに属し、36、72、144、288、576、864、875および1296アミノ酸を含む長さをコードする。BbsIおよびHindIIIエンドヌクレアーゼを使用する制限消化によって、スタッファフラグメントを除去した。T4 DNAリガーゼを使用して、制限消化hGH DNAフラグメントを切断pCBD−XTENベクターにライゲーションし、BL21(DE3)Gold(Stratagene)中へと電気穿孔した。形質転換体をDNAミニプレップによってスクリーニングして、所望の構築物をDNA配列決定によって確認した。最終ベクターはT7プロモータの制御下でCBD_XTEN_hGH遺伝子を産する。
XTEN−AE_hGH_XTEN−AE_hGH遺伝子およびベクターの構築
hGHをコードする遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅して、これによりXTENデスティネーションベクターのスタッファにフランキングするBbsIおよびBsaI部位に適合性である、BbsIおよびBsaI制限部位を導入した。pNTS−XTENプラスミドは、48アミノ酸のN末端XTEN発現配列の形式のNovagenからのpET30誘導体であり、スタッファは緑色蛍光タンパク質(GFP)であり、XTENは36〜576以上の任意の長さであることができる。pCBD−XTENのスタッファ配列をhGHコードフラグメントで置き換えることによって、構築物を生成させた。pNTS−XTENは、NTSの上流のT7プロモータ、それに続くスタッファ配列の上流にてインフレームで融合されたXTEN配列を特色とする。用いたXTEN配列は、ファミリXTEN_AEに属し、36、72、144、288、576、864、および1296アミノ酸を含む長さをコードする。BbsIおよびBsaIエンドヌクレアーゼを使用する制限消化によって、スタッファフラグメントを除去した。T4 DNAリガーゼを使用して、制限消化hGH DNAフラグメントを切断pNTS−XTENベクターにライゲーションし、BL21(DE3)Gold(Stratagene)中へと電気穿孔した。いくつかの場合において、144または288アミノ酸の第2のXTEN_AE配列をhGH遺伝子のC末端にライゲーションした。形質転換体をDNAミニプレップによってスクリーニングして、所望の構築物をDNA配列決定によって確認した。最終ベクターはT7プロモータの制御下でNTS_XTEN_hGH遺伝子またはNTS_XTEN_hGH_XTEN遺伝子を産する。
GH_XTEN構築物の精製
タンパク質発現
上記のプラスミドをBL21(DE3)−Gold大腸菌株(Novagen)に形質転換して、適切な抗生物質を含むLB寒天プレートに蒔き、37℃にて一晩生育させた。単一のコロニーを5mlのTB125媒体に接種して、37℃にて一晩生育させた。翌日、接種物を、500mlのTB125を有する2L容器中へと変え(transformed)、OD=O.6に達するまで生育させて、続いて0.1mM IPTGを用いて26℃にて16時間にて引き続き生育させた。
次にバッファー交換タンパク質を10K MWCO Ultrafree濃縮器を使用して2mLの最終体積まで濃縮した。0.22umのシリンジフィルタを使用して、濃縮物を滅菌濾過した。最終溶液を等分割して−80℃で貯蔵した。
ELISAに基づく結合アッセイ
GHへのXTEN融合物を標準ELISAに基づくアッセイで試験して、GH受容体へ結合するその能力を評価した。アッセイは、組換えhGH受容体(hGHR−Fc)がELISAプレートのウェルにコーティングされているサンドイッチELISA形式を使用して行った。次にウェルをブロッキングし、洗浄し、BPXTEN試料を次にさまざまな希釈度のウェルにてインキュベートして、BPXTENの捕捉を可能にした。ウェルを広範囲に洗浄して、ポリクローナルまたはモノクローナル抗GH抗体または抗XTEN抗体のビオチン化調製物およびストレプトアビジンHRPを使用して、結合タンパク質を検出した。各血清希釈度での比色反応を未改変GHの標準曲線に対して比較することによって、結合タンパク質の割合を計算した。図30に示した結果により、見かけのEC50値は天然hGHで0.0701nM、AM864_hGHで0.3905、およびhGH_AM864で2.733であることが示される。
ラットにおけるhGH XTEN融合ポリペプチドのPK分析
hGHXTENポリペプチドのインビボ薬物動態パラメータを決定するために、BPXTEN融合タンパク質AE912−hGH、AM864−hGH(本実施例および以下の実施例でAM875−hGHの同義語)、AE912−hGH−AE144およびAE912−hGH−AE288をラットで評価した。すべての組成物を水性バッファーにおいて提供して、皮下(SC)経路で個々の動物に1.5mg/kg単回用量を使用して投与した。血漿試料を投与後の各種の時点で採取して、被験物質の濃度を分析した。分析はサンドイッチELISA形式を使用して行った。組換えhGHR−FcをELISAプレートのウェルにコーティングした。ウェルをブロッキングし、洗浄し、血漿試料を次に様々な希釈度でウェルにてインキュベートして、コート抗体による化合物の捕捉を可能にした。ウェルを広範囲に洗浄して、ポリクローナル抗hGH抗体のビオチン化調製物およびストレプトアビジンHRPを使用して、結合タンパク質を検出した。各血清希釈度での比色反応を標準曲線に対して比較することによって、被験物質の濃度を各時点で計算した。薬物動態パラメータは、WinNonLinソフトウェアパッケージを使用して計算した。
カニクイザルにおけるhGH XTEN融合ポリペプチドのPK分析
hGHXTENポリペプチドのインビボ薬物動態パラメータに対する第2のXTENの包含の効果を決定するために、1個または2個のXTEN分子を含有するBPXTEN融合タンパク質(AE912−hGH、AM864−hGH、およびAE912−hGH−AE144)をカニクイザルにおいて評価した。すべての組成物を水性バッファーにおいて提供して、皮下(SC)経路で個々の動物に1.5mg/kg単回用量を使用して投与した。血漿試料を投与後の各種の時点で収集して、被験物質の濃度を分析した。分析はサンドイッチELISA形式を使用して行った。組換えhGHR−FcをELISAプレートのウェルにコーティングした。ウェルをブロッキングし、洗浄し、血漿試料を次に様々な希釈度でウェルにてインキュベートして、コート抗体による化合物の捕捉を可能にした。ウェルを広範囲に洗浄して、ポリクローナル抗hGH抗体のビオチン化調製物およびストレプトアビジンHRPを使用して、結合タンパク質を検出した。各血清希釈度での比色反応を標準曲線に対して比較することによって、被験物質の濃度を各時点で計算した。薬物動態パラメータは、WinNonLinソフトウェアパッケージを使用して計算した。融合タンパク質の平均最終半減期は、AM864−hGHで33時間、AE912−hGHで44時間、およびAE912−hGH−AE144(hGHのN末端およびC末端に連結された2個のXTENを含有)で110時間であった。
体重増大に対するhGHおよびAM864−hGHの効果の比較
BPXTEN AM864−hGHが薬理学的効力を保持する能力を、投与した化合物に応答した低酸素症ラットにおける体重増大についての測定パラメータを使用して評価した。図34は、示した用量および投与頻度でのhGHまたはAM864−hGHの投与の低酸素症ラットの体重に対する効果を示す。結果は、hGHの同程度の投薬量と効力が同等であるBPXTEN構築物による、またより低い頻度の投薬での生物活性の保持を示す。AM864−hGHの用量レベルの増加は、実験の期間にわたって体重増大の増加をもたらす。
骨軟骨に対するhGHおよびAM864−hGHの効果の比較
hGHに連結されたAM864のBPXTENが薬理学的効力を保持する能力を、低酸素症ラットにおける脛骨端板(tibial epiphyseal plate)幅の増加についての測定パラメータを使用して評価した。図35は、処置9日後のラットからの脛骨の組織断面に示す、プラセボ、hGH、およびAM864−hGHの投与の効果の比較を示し、縁(margin)は点線で記されている。群は図35で示すものと同じである。図35Aは、プラセボ群が9日後に344±38.6μmの脛骨端板の平均断面幅を有したことを示す。図35Bは、hGH群(毎日10μg)が9日後に598±8.5μmの平均断面幅を有したことを示す。図35Cは、AM864−hGH(15mg/kg q3d)が9日後に944±8.5μmの平均断面幅を有したことを示す。結果によって、より頻繁でない間隔で投薬されたにもかかわらず、GHUPR構築物による活性の増強が示される。
FXIaによって放出可能なC末端XTEN
FIXのC末端に融合されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図36Bに描くように、FIX構成要素およびXTEN構成要素の間に配置されたXTEN放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表43に提供する。この場合には、放出部位切断配列は、FXIaプロテアーゼ(EC3.4.21.27,Uniprot P03951)によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有するFIX−XTENに組み入れることができる。特にアミノ酸配列KLTR↓VVGG(配列番号224)[Rawlings N.Dら(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]は、配列のアルギニンの後でFXIaプロテアーゼによって切断される。FXIは、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路においてFIXの直前に位置する凝固促進プロテアーゼである。活性FXIaは、FXIIaによるチモーゲンのタンパク質分解切断によりFXIから産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、FIXの位置R191およびR226にてタンパク質を切ることによりチモーゲンからペプチドを切除してFIXを活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させることである。FXIaの産生は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、XTENドメインのみが、内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにFIXから除去される。これにより、FIX−XTEN融合タンパク質が内因性経路の活性化の間に1つの追加の方式で処理される状況が生じる。FXIaによりFIXドメインのR191およびR226にて起こる天然の切断(natural cleavage)に加えて、XTENタンパク質から今や活性化されたFIXaを分離する(decouple)第3の切断が、XTEN放出部位に出現する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までFIX−XTENがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離FIXaを産生する。
FXIIaによって放出可能なC末端XTEN
FIXのC末端に融合されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図36Bに描くように、FIX構成要素およびXTEN構成要素の間に配置されたXTEN放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表43に提供する。この場合には、XTEN放出部位配列は、FXIIaプロテアーゼ(EC3.4.21.38,Uniprot P00748)によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有できる。具体的に配列TMTR↓IVGG(配列番号225)は、配列の位置4のアルギニンの後で切られる。FXIIは、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路においてFIXの前に位置する凝固促進プロテアーゼである。活性FXIIaは、非自己表面との接触によって、およびカリクレインによる切断によって、FXIIから産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、チモーゲンのタンパク質分解切断によりFXIを活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させることである。FXIIaの産生は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、XTENドメインのみが、内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにFIXから除去される。これにより、FIX−XTEN融合物が内因性経路の活性化の間に1つの追加の方式で処理される状況が生じる。FXIaによりFIXドメインのR191およびR226にておこる天然の切断に加えて、XTENタンパク質から今や活性化されたFIXaを分離する第3の切断が、XTEN放出部位におこる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までFIX−XTENがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離FIXaを産生する。
カリクレインによって放出可能なC末端XTEN
FIXのC末端に融合されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図36Bに描くように、FIX構成要素およびXTEN構成要素の間に配置されたXTEN放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表43に提供する。この場合には、XTEN放出部位配列は、カリクレインプロテアーゼ(EC3.4.21.34,Uniprot P03952)によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有できる。具体的に配列SPFR↓STGG(配列番号226)[Rawlings N.D.ら(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]は、配列の位置4のアルギニンの後で切られる。カリクレインは、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路においてFIXの前に位置する凝固促進プロテアーゼである。活性カリクレインは、非自己表面との接触によって、血漿カリクレイン(Kallirien)から産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、チモーゲンのタンパク質分解切断によりFXII(図39)を活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させることである。カリクレインの産生は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、XTENドメインのみが、内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにFIXから除去される。これにより、FIX−XTEN融合物が内因性経路の活性化の間に1つの追加の方式で処理される状況が生じる。FXIaによりFIXドメインのR191およびR226にておこる天然の切断に加えて、XTENタンパク質から今や活性化されたFIXaを分離する第3の切断が、XTEN放出部位におこる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までFIX−XTENがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離FIXaを産生する。
FVIIaによって放出可能なC末端XTEN
FIXのC末端に融合されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図36Bに描くように、FIX構成要素およびXTEN構成要素の間に配置されたXTEN放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表43に提供する。この場合には、放出部位配列は、FVIIaプロテアーゼ(EC3.4.21.21,Uniprot P08709)によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列LQVR↓IVGG(配列番号227)[Rawlings N.D.ら(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]は、配列の位置4のアルギニンの後で切られる。FVIIaは、外因性凝固経路または細胞傷害活性化凝固経路においてFIXの前に位置する凝固促進プロテアーゼである。活性FVIIaは、組織因子、リン脂質およびカルシウムへの結合によって補助される自己触媒プロセスにおいてFVIIから産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、チモーゲンのタンパク質分解切断によりFIXおよびFX(図39)を活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させることである。FVIIa活性は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、XTENドメインのみが、内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにFIXから除去される。これにより、FIX−XTEN融合物が内因性経路の活性化の間に1つの追加の方式で処理される状況が生じる。FVIIaによりFIXドメインのR191およびR226にておこる天然の切断に加えて、XTENタンパク質から今や活性化されたFIXaを分離する第3の切断が、XTEN放出部位におこる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までFIX−XTENがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離FIXaを産生する。
FIXaによって放出可能なC末端XTEN
FIXのC末端に融合されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図36Bに描くように、FIX構成要素およびXTEN構成要素の間に配置されたXTEN放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表43に提供する。この場合には、放出部位切断配列は、FIXaプロテアーゼ(EC3.4.21.22,Uniprot P00740)によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列PLGR↓IVGG(配列番号228)[Rawlings N.D.ら(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]は、配列の位置4のアルギニンの後で切られる。活性FIXaは、リン脂質およびカルシウムの存在下でのFXIaまたはFVIIaのどちらかによるFIXの切断によって産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、チモーゲンのタンパク質分解切断によりFX(図39)を活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させることである。FIXa活性は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、XTENドメインのみが、外因性凝固経路または内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにFIXから除去される。これにより、FIX−XTEN融合物が内因性経路の活性化の間に1つの追加の方式で処理される状況が生じる。FVIIaまたはFXIaによりFIXドメインのR191およびR226にておこる天然の切断に加えて、XTENタンパク質から今や活性化されたFIXaを分離する第3の切断が、XTEN放出部位におこる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までFIX−XTENがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離FIXaを産生する。
FXaによって放出可能なC末端XTEN
FIXのC末端に融合されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図36Bに描くように、FIX構成要素およびXTEN構成要素の間に配置されたXTEN放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表43に提供する。この場合には、放出部位は、FXaプロテアーゼ(EC3.4.21.6,Uniprot P00742)によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列IEGR↓TVGG(配列番号229)[Rawlings N.D.ら(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]は、配列の位置4のアルギニンの後で切られる。活性FXaは、リン脂質およびカルシウムの存在下でのFIXaによるFXの切断によって産生され、凝固経路の第IX因子からすぐ下流のステップである。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、チモーゲンのタンパク質分解切断によりFII(図39)を活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させることである。FXa活性は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、XTENドメインのみが、外因性凝固経路または内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにFIXから除去される。これにより、FIX−XTEN融合物が凝固の活性化の間に1つの追加の方式で処理される状況が生じる。FVIIaまたはFXIaによりFIXドメインのR191およびR226にておこる天然の切断に加えて、XTENタンパク質から今や活性化されたFIXaを分離する第3の切断が、XTEN放出部位におこる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までFIX−XTENがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離FIXaを産生する。
FIIa(トロンビン)によって放出可能なC末端XTEN
FIXのC末端に融合されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図36Bに描くように、FIX構成要素およびXTEN構成要素の間に配置されたXTEN放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表43に提供する。この場合には、放出部位は、FIIaプロテアーゼ(EC3.4.21.5,Uniprot P00734)によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列LTPR↓SLLV(配列番号230)[Rawlings N.D.ら(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]は、配列の位置4のアルギニンの後で切られる。活性FIIaは、リン脂質およびカルシウムの存在下でのFXaによるFIIの切断によって産生され、凝固経路の第IX因子から下流にある。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割はフィブリノーゲン(fibringin)(図39)を切断することであり、これにより次に、今度はクロット形成が開始する。FIIa活性は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、XTENドメインのみが、外因性凝固経路または内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにFIXから除去される。これにより、FIX−XTEN融合物が凝固の活性化の間に1つの追加の方式で処理される状況が生じる。FVIIaまたはFXIaによりFIXドメインのR191およびR226にておこる天然の切断に加えて、XTENタンパク質から今や活性化されたFIXaを分離する第3の切断が、XTEN放出部位におこる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までFIX−XTENがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離FIXaを産生する。
エラスターゼ−2によって放出可能なC末端XTEN
FIXのC末端に融合されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図36Bに描くように、FIX構成要素およびXTEN構成要素の間に配置されたXTEN放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表43に提供する。この場合には、放出部位は、エラスターゼ−2プロテアーゼ(EC3.4.21.37,Uniprot P08246)によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列LGPV↓SGVP(配列番号231)[Rawlings N.D.ら(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]は、配列の位置4の後で切られる。エラスターゼは好中球によって構成的に発現され、循環中に常時存在する。その活性はセルピンによって厳重に制御され、それゆえ、ほぼ常に最小限に活性である。それゆえ、長寿命FIX−XTENが循環するときに、その一部が切断されて、凝固に使用されるより短寿命のFIXのプールを生成する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより予防量のFIXを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成される。
MMP−12によって放出可能なC末端XTEN
FIXのC末端に融合されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図36Bに描くように、FIX構成要素およびXTEN構成要素の間に配置されたXTEN放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表43に提供する。この場合には、放出部位は、MMP−12プロテアーゼ(EC3.4.24.65,Uniprot P39900)によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列GPAG↓LGGA(配列番号233)[Rawlings N.D.ら(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]は、配列の位置4の後で切られる。MMP−12は全血中で構成的に発現される。それゆえ、長寿命FIX−XTENが循環するときに、その一部が切断されて、凝固に使用されるより短寿命のFIXのプールを生成する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより予防量のFIXを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成される。
MMP−13によって放出可能なC末端XTEN
FIXのC末端に融合されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図36Bに描くように、FIX構成要素およびXTEN構成要素の間に配置されたXTEN放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表43に提供する。この場合には、放出部位は、MMP−13プロテアーゼ(EC3.4.24.−,Uniprot P45452)によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列GPAG↓LRGA(配列番号234)[Rawlings N.D.ら(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]は、位置4の後で切られる(矢印で示す)。MMP−13は全血中で構成的に発現される。それゆえ、長寿命FIX−XTENが循環するときに、その一部が切断されて、凝固に使用されるより短寿命のFIXのプールを生成する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより予防量のFIXを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成される。
MMP−17によって放出可能なC末端XTEN
FIXのC末端に融合されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図36Bに描くように、FIX構成要素およびXTEN構成要素の間に配置されたXTEN放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表43に提供する。この場合には、放出部位は、MMP−20プロテアーゼ(EC.3.4.24.−,Uniprot Q9ULZ9)によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列APLG↓LRLR(配列番号235)[Rawlings N.Dら(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]は、配列の位置4の後で切られる。MMP−17は全血中で構成的に発現される。それゆえ、長寿命FIX−XTENが循環するときに、その一部が切断されて、凝固に使用されるより短寿命のFIXのプールを生成する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより予防量のFIXを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成される。
MMP−20によって放出可能なC末端XTEN
FIXのC末端に融合されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図36Bに描くように、FIX構成要素およびXTEN構成要素の間に配置されたXTEN放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表43に提供する。この場合には、放出部位は、MMP−20プロテアーゼ(EC.3.4.24.−,Uniprot O60882)によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列PALP↓LVAQ(配列番号236)[Rawlings N.D.ら(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]は、位置4の後で切られる(矢印で示す)。MMP−20は全血中で構成的に発現される。それゆえ、長寿命FIX−XTENが循環するときに、その一部が切断されて、凝固に使用されるより短寿命のFIXのプールを生成する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより予防量のFIXを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成される。
KNSADKループへの内部XTEN融合物
FIXのループに挿入されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図37Fに描くように生成することができる。具体的にXTEN配列は、公知の血友病B変異を有さず、FIX結晶構造物で高度に構造化されていないEGF2ドメイン(残基146−152)のKNSADNK(配列番号1749)ループに、融合物として挿入される。この場合には、挿入は、ループ配列のSA結合にて天然配列を分割して、XTEN配列をギャップに融合することによって作られる。これにより、XTENがFIX配列に対して内部であるが、球状タンパク質に対して外部であるループ配列が生まれる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までFIX−XTENがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させるFIXa−XTENを産生する。
LAENループへの内部XTEN融合物
FIXのループに挿入されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図37Fに描くように生成することができる。具体的にXTEN配列は、公知の血友病B変異を有さず、FIX結晶構造物で高度に構造化されていないEGF2ドメイン(残基163−166)のLAEN(配列番号1778)ループに、融合物として挿入される。この場合には、挿入は、配列のAE結合にて天然配列を分割して、XTEN配列をギャップに融合することによって作られる。これによりループ配列LA−XTEN−ENが生まれる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までFIX−XTENがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させるFIXa−XTENを産生する。
活性化ペプチドへの内部XTEN融合物
FIXのループに挿入されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図37Dに描くように生成することができる。具体的にXTEN融合物は、2つの天然FXIa切断部位がどちらも破壊されないように、活性化ペプチド(残基192−226)に配置される。挿入は、配列のT209−I210結合(↓によって示す)にて天然配列を分割して、XTEN配列をギャップに融合することによって作られる。これにより活性化ペプチドの残基188にて開始する、XTENが挿入された配列が生まれる。FXIは、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路においてFIXの直前に位置する凝固促進プロテアーゼである。活性FXIaは、FXIIaによるチモーゲンのタンパク質分解切断によりFXIから産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、位置R191およびR226にてタンパク質を切ることによりFIXチモーゲンから活性化ペプチドを切除してFIX(図39)を活性化することである。これらのカット部位は矢印によって描かれ、配列は、P4−P4’部位を変化させずに残して、凝固カスケードの間の天然の切断活性を可能とするように設計される。それゆえ、XTENドメインのみが、内因性凝固経路内の正常な活性化プロセスの一部としてFIXから除去される。
FIX EGFドメインの間の内部XTEN融合物
FIXのループに挿入されたXTENタンパク質から成るFIX−XTEN融合タンパク質は、図37Cに描くように生成することができる。具体的にXTEN融合物は、FIXの2つのEGF様ドメインの間に配置される(結合部は残基129と130の間である)。挿入は、E129−L130結合にて天然配列を分割して、XTEN配列をギャップに融合することによって作られる。これにより残基121にて開始する、XTENが挿入された配列が生まれる。実際に、これにより凝固の活性化までFIX−XTENが無傷で循環する状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、個体において凝固機能を再構成または増進させるFIXa−XTENを産生する。
C末端XTENの放出速度の最適化
C末端XTENの放出速度が変化する上述の実施例41〜57の変異体を生成することができる。XTEN放出プロテアーゼによるXTEN放出の速度はXTEN放出部位の配列に依存しているため、XTEN放出部位のアミノ酸配列を変更することによって、XTEN放出の速度を制御することができる。多くのプロテアーゼの配列特異性は当分野で周知であり、数種のデータベースに記録されている。この場合には、プロテアーゼのアミノ酸特異性は基質のコンビナトリアルライブラリを使用して[Harris,J.L.ら(2000)Proc Natl Acad Sci USA,97:7754]または[Schellenberger,V.ら(1993)Biochemistry,32:4344]に例証されるように基質混合物の切断に従ってマップされる。代替は、ファージディスプレイによる所望のプロテアーゼ切断配列の同定である[Matthews,D.ら(1993)Science,260:1113]。構築物は変異体配列を用いて作られ、XTENポリペプチド検出のための標準アッセイを使用してXTEN放出についてアッセイされる。
FIX−XTENのトロンビン活性化
FXIに特異的なXTEN放出部位をFIX−XTEN_AE864に挿入して、構築物AC299をもたらした。トロンビンに特異的なXTEN放出部位をFIX−XTEN_AE864に挿入して、構築物AC300をもたらした。XTEN放出部位が欠損した構築物AC296を対照として使用した。FuGene6形質移入試薬(Roche)を使用して、発現プラスミドをBHK−21細胞(Invitrogenによる10mlのOptiMEM媒体の1.2×10e6細胞)に形質移入した。4日後に媒体を収集して、Amicon Ultra遠心分離フィルタ(Ultracel_30K,Millipore)濃縮器を使用して40倍に濃縮した。67μlの濃縮媒体を10×トロンビンバッファーで希釈して、25μlの固定トロンビン(Thrombin CleanCleaveキット、RECOM−T,Sigma)を用いて室温にて8時間インキュベートした。すべての試料におけるFIX濃度を、抗体(cat# FIX−EIA,Affinity Biologicals inc.Canada)を使用してELISAによって決定した。凝固活性をaPPTアッセイ(Thermo Scientific Pacific Hemostasis,Fisher)を使用して決定し、1mUのFIXが4.5ng/mlに等しいと仮定して活性をFIXの濃度に変換した。結果を下の表31でまとめる。データは、トロンビンインキュベーションがAC296およびAC299のELISAシグナルおよび凝固活性に対して顕著な効果を有さなかったことを示し、このことは両方の構築物がトロンビン部位を欠損しているという事実に一致する。これに対して、トロンビン処理により、AC300の凝固活性の27倍の増加が生じた。トロンビン処理は、AC300の凝固活性を遊離FIXの80%まで回復した。これらのデータは、FIXのC末端へのXTENの融合が凝固活性の50分の1〜100分の1までの低下をもたらすことを証明する。XTENのタンパク質分解放出は、これらのC末端FIX−XTEN構築物のプロドラッグ特性の概念を裏付けて、凝固活性の大半を回復した。
(実施例59)
エキソン構造物に基づくFIXへのXTEN挿入
タンパク質のエキソン構造物は、哺乳動物タンパク質へのXTENの挿入を導くことができるドメイン境界に関する貴重な情報を提供する[Kolkman,J.A.ら(2001)Nat Biotechnol,19:423]。図40は、この手法がFIX−XTEN組成物の生成に適用される方法の数種の例を、示されたエキソン境界の間のXTEN挿入のための例示的な位置と共に例証する。
設計製作したFIX配列に基づくFIX−XTEN
活性の改善のためにFIXの多くの変異体(mutant)が設計製作されてきた(have been engineered)。特に有用なのは、プロテアーゼ活性の増加を有する変異体である。しかしGlaおよび/またはEGFドメインに改良を有する変異体は、実験臨床評価の後に天然FIX配列のあるいは該変異体を使用できるように、血友病Bの処置にも有用であることができる。有用なFIX変異体の例を表7に表示する。
FIX−XTENの産生
FIX−XTEN融合タンパク質を多種多様の哺乳動物発現ベクターにおいて発現させることができる。pSecTag2(Invitrogen)に基づく例示的なベクターpCW05090を図42に例証する。発現構築物は、CMVプロモータ、FIXのシグナルペプチド、FIXのプロペプチド、XTEN_AE864をコードする遺伝子に融合した成熟FIX遺伝子、それに続くポリアデニル化部位を含む発現カセットを含有する。ベクターは、哺乳動物細胞における選択のためのゼオシン(zeosin)マーカー、大腸菌のpUC複製起点、および大腸菌における選択のためのアンピシリンマーカーを含有する。発現ベクターは発現のためにCHO細胞、PER.C6細胞、またはBHK細胞に形質移入することができる。発現はELISAまたは凝固アッセイによって監視することができる。FIX−XTEN融合タンパク質はイオン交換、特にアニオン交換によって精製することができる。本実験の目的のために、FIX−XTEN融合タンパク質をCHO細胞に形質移入した。
形質移入細胞の培養物からの細胞培養媒体を20mMトリスpH6.8、50mM NaClで平衡化した800mlのMacrocap Qアニオン交換樹脂(GE Life Sciences)に直接適用した。カラムを50mM、100mM、および150mM NaClを含有するトリスpH6.8バッファーによって続けて洗浄した。生成物を20mMトリスpH6.8、250mM NaClによって溶出させた。
250mLオクチルセファロースFFカラムを平衡化バッファー(20mMトリスpH6.8、1.0M Na2SO4)によって平衡化した。固体Na2SO4をMacrocap Q溶出物プールに添加して、1.0Mの最終濃度を達成した。結果として生じる溶液を濾過して(0.22ミクロン)、HICカラムにロードした。カラムを次に、10CVの平衡化バッファーで洗浄して、未結合のタンパク質および宿主細胞DNAを除去した。生成物を次に、20mMトリスpH6.8、0.5M Na2SO4によって溶出させた。
プールしたHIC溶出物画分を次に、20mMトリスpH7.5によって希釈して、5.0ミリオーム未満の導電率を達成した。希薄生成物を、20mMトリスpH7.5、50mM NaClによって平衡化した300ml QセファロースFFアニオン交換カラムにロードした。
バッファー交換タンパク質を次に、Pellicon XL Biomax 30000 mwcoカートリッジを使用して限外濾過/ダイアフィルトレーション(UF/DF)によって30mg/ml超まで濃縮した。0.22ミクロンのシリンジフィルタを使用して、濃縮物を滅菌濾過した。最終溶液を等分割して−80℃で貯蔵した。
FIX−XTENのコドン最適化
コドン最適化を適用してFIX−XTENの発現を増加させることができる。コドン最適化は、ヒト遺伝子のコドン選択性(codon preference)、RNA構造予測ならびに内部反復の予測を考慮に入れるコンピュータアルゴリズムを使用して行うことができる。
FIX−XTENのデポー調合物
XTENは、注射部位でデポーを形成する調合物のための特定の特性によって選定することができる。これは注射部位からのFIX−XTENの低速放出をもたらし、投薬間隔の間の時間を増加させる。デポー調合物はFIX−XTENを、FIX−XTENと相互作用して複合体または凝集体の形成をもたらす賦形剤と共に調合することによって容易にすることができる。有用な賦形剤の例は亜鉛、プロタミン、PEG、ポリカチオン、ポリマー、ポリアルギニン、ポリリジンである。デポーは、FIX−XTENを粒子、たとえばアルギン酸塩、キチン、ポリ乳酸、PLGA、ヒアルロン酸、ヒドロキシアパタイトまたは当業者に公知の他のポリマーにロードすることによっても形成することができる。
安定性の増加を有するFIX−XTEN
遊離FIXは凝集しやすく、凝集はタンパク質の調合を複雑にする。この特徴は、sc注射に必要な少量注射体積を可能にする高濃度調合物の開発も妨げる。融合パートナーの凝集を低下させるXTENの特性のために、1)FIXの凝集を防止する;および2)皮下または筋肉内投与を可能にする、FIX−XTENの組成物を生成することができる。
FVII−XTEN_AG864
第VII因子(「FVII」)をコードする遺伝子をインフレームでXTEN_AE864に融合して、発現ベクターpCW0590に挿入した.CHO−K1細胞に発現ベクターを形質移入して、ゼオシンを使用して安定なプールを選択し、発現したタンパク質を回収した。発現した第VII因子−XTEN_AE864のアミノ酸配列を表43に挙げる。159ng/mlのFVII等価物の発現レベルをELISAによって検出して、214ng/mlのFVII等価物はPPT凝固アッセイ(Thermo Scientific Pacific Hemostasis,Fisher)を使用して検出した。このことは、BPXTENを生成するXTEN_AE864のFVIIへの融合がFVIIの凝固活性を保持する融合タンパク質を生じることを証明する。
FVIIa−XTENの製造
FIX−XTENについて実施例61で記載されるのと本質的に同様に、FVIIa−XTENを製造することができる。FVII−XTENをFVIIa−XTENに変換するために、活性化ステップが追加される。あるいは、FVIIaの両方のタンパク質鎖が別々に発現され、活性化FVIIa−XTENに直接構築されるように、バイシストロニックベクターを使用することができる。
第VII因子−FVII−XTEN融合ポリペプチドの活性の評価
標準曲線は、正常対照血漿(Pacific Hemostasis 100595)をFVII欠損血漿(100070)によって10倍に希釈して、次に第VII因子欠損血漿によって4、5倍の連続希釈を再度行うことによって調製した。これにより活性の100、20、4、0.8および0.16mUnits/mlに点(points)を有する標準曲線が生成され、1ユニット(unit)の活性は、1mlの正常ヒト血漿におけるFVII活性の量として定義される。ゼロ血漿(null plasma)での活性のバックグラウンドレベルを決定するために、FVII欠損血漿も含めた。試料は、FVII−XTENコード配列を含有するベクターを一過性に形質移入されたHEK293細胞によって、該細胞の成育により馴化媒体(conditioned medium)中に分泌されたFVII−XTENを、FVII欠損血漿に対して1:10の体積比で添加することによって調製した。馴化媒体の可能な干渉を補正するために、空のベクターによる形質移入HEK293細胞からの馴化媒体を標準曲線試料に対して1:10の体積比で添加した。以下のようにプロトロンビン時間アッセイを使用して、試料を試験した。試料をmolecular devicesプレートリーダ分光光度計で37℃にて3分間インキュベートして、この時点で試料1体積当りトロンボプラスチン(Dade Innovin,B4212−50)2体積の添加により、凝固反応を開始させた。濁度を405nmにて5分間監視して、反応プロフィールを生成した。PT時間、すなわち凝固活性の開始までの時間をOD405nmがベースラインを超えて0.06増加した第1の時間として定義した。PT時間に線形に関連する活性の対数によって、対数−線形標準曲線を生成した。これからプレートウェル内の試料の活性を決定して、次にFVII欠損血漿への希釈度に相当する11を掛けることによって、試料の活性を決定した。2回の測定に基づいて、FVII−XTEN融合物の活性は203mUnits/mlであった。反応プロフィールを図9に表示し、ここではFVII欠損血漿が太破線で示され、標準からの3つの試料が破線で示され、FVII−XTEN試料が太線で示されている。
第VII因子−XTEN融合タンパク質精製
FVII−XTEN融合タンパク質を多種多様の哺乳動物発現ベクターにおいて発現させることができる。pSecTag2(Invitrogen)に基づくベクターpCW05090を図46に例証する。発現構築物は、CMVプロモータ、FVIIのシグナルペプチド、FVIIのプロペプチド、XTEN_AE864をコードする遺伝子に融合した成熟FVII遺伝子、それに続くポリアデニル化部位を含む発現カセットを含有する。ベクターは、哺乳動物細胞における選択のためのゼオシン(zeosin)マーカー、大腸菌のpUC複製起点、および大腸菌における選択のためのアンピシリンマーカーを含有する。発現ベクターは発現のためにCHO細胞、HEK293、PER.C6細胞、またはBHK細胞に形質移入することができる。発現はELISAまたは凝固アッセイによって監視することができる。FVII−XTEN融合タンパク質はイオン交換、特にアニオン交換によって精製することができる。
20mMトリスpH6.8、50mM NaClで平衡化した800mlのMacrocap Qアニオン交換樹脂(GE Life Sciences)に、細胞培養媒体を直接適用した。カラムを50mM、100mM、および150mM NaClを含有するトリスpH6.8バッファーによって続けて洗浄した。生成物を20mMトリスpH6.8、250mM NaClによって溶出させ、実施例67の方法を使用して検証した。
FIX活性決定のためのaPTTアッセイ
第IX因子は、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路にある。活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ(aPTT)を使用してFIX−XTENおよびタンパク質分解副生成物の活性を評価するために、この凝固経路の活性を使用する。FIX活性を以下のように具体的に測定し、標準曲線は、正常対照血漿(Pacific Hemostasis cat# 100595)をFIX欠損血漿(cat# 100900)によって2倍に希釈して、次に第IX因子欠損血漿によって6、4倍の連続希釈を再度行うことによって作成した。これにより活性の500、130、31、7.8、2.0、0.5および0.1mUnits/mlに点を有する標準曲線が生成され、1ユニットの活性は、1mlの正常ヒト血漿におけるFIX活性の量として定義される。ゼロ血漿での活性のバックグラウンドレベルを決定するために、FIX欠損血漿も含めた。試料は、FVII−XTENコード配列を含有するベクターを一過性に形質移入されたHEK293細胞によって、該細胞の成育により馴化媒体(conditioned medium)中に分泌されたFVII−XTENを、FVII欠損血漿に対して1:10の体積比で添加することによって調製した。馴化媒体の可能な干渉を補正するために、空のベクターによる形質移入CHO細胞からの馴化媒体を標準曲線試料に1:10の体積比で添加した。以下のようにaPTTアッセイを使用して、試料を試験した。試料をmolecular devicesプレートリーダ分光光度計で37℃にて2分間インキュベートして、この時点で等しい体積のaPTT試薬(Pacific Hemostasis cat# 100402)を添加して、追加の3分間の37℃でのインキュベーションを行った。インキュベーション後、1体積の塩化カルシウム(Pacific Hemostasis cat# 100304)を添加することによって、アッセイを活性化した。濁度を450nmにて5分間監視して、反応プロフィールを生成した。aPPT時間、すなわち凝固活性の開始までの時間をOD450nmがベースラインを超えて0.06増加した第1の時間として定義した。aPPT時間に線形に関連する活性の対数によって、対数−線形標準曲線を生成した。これからプレートウェル内の試料の活性を決定して、次にFIX欠損血漿への希釈度に相当する11を掛けることによって、試料の活性を決定した。
FIX濃度決定のためのELISAアッセイ
各種のFIX−XTEN組成物およびタンパク質分解副生成物の第IX因子濃度を、検出を簡単にするために検出抗体がHRPにコンジュゲートされた抗体の特異的適合対を用いる、ELISAアッセイを使用して決定した(Affinity Biologicals cat# FIX−EIA)。捕捉抗体を高結合96ウェルアッセイプレート(Corning 3690)に、4℃にて一晩コーティングした。プレートをPBS中の3%BSAによって室温にて1時間ブロッキングした。プレートをPBSTでプレート洗浄器によって6回洗浄した。PBSTで希釈した試料または標準を次に、適切なウェルにおいて室温にて2時間結合させた。標準曲線は25ng/ml〜<1pg/mlに及び、既知の濃度の市販FIX(Abcam Cat# ab62544)をPBSTで連続希釈して調製した。プレートをPBSTでプレート洗浄器によって再度、6回洗浄した。FIXを次に、37℃にて1時間結合された検出抗体を使用して検出した。プレートをPBSTでプレート洗浄器によって再度、6回洗浄して、水によってさらに1回洗浄した。シグナル次に、TMB基質によって展開させて、molecular devicesプレートリーダ分光光度計で405nmにて読み取ることにより定量した。次に標準に対して4パラメータフィットを行って、試料の濃度を標準曲線との比較によって決定した。
BPXTENを評価するためのヒト臨床試験設計
臨床試験は、単一の生物製剤に対するBPXTEN組成物の有効性および利点をヒトにおいて検証できるように設計することができる。たとえば上の実施例に記載されるように、グルカゴンおよびエクセナチドの両方を含むBPXTEN融合構築物は、組成物の有効性をキャラクタリゼーションする臨床試験で使用することができる。該臨床試験は、グルカゴンおよびエクセナチドの投与によって改善、緩和、または抑制される1つ以上の代謝性疾患、障害、または状態に行うことができる。成人患者におけるこのような試験は3つの相を含む。成人患者における第1の第I相安全性および薬物動態試験は、ヒト(正常被験体または代謝性疾患もしくは症状を有する患者のどちらか)における最大許容投与量ならびに薬物動態および薬力学を決定するために、ならびに将来の試験で追跡される潜在毒性および有害事象を定義するために行われる。該試験は、単一漸増用量の、グルカゴンおよびエクセナチドに連結されたXTENの融合タンパク質の組成物が投与される該試験が行われ、生化学、PK、および臨床パラメータが測定される。これにより最大許容投与量の決定が可能となり、それぞれの構成要素の治療ウインドウを構成する投与量および循環薬物の閾値および最大濃度が確立される。その後、臨床試験は疾患、障害または状態を有する患者において行われる。
糖尿病、インスリン抵抗性および肥満症状に対して適切な血清グルコースの薬力学的パラメータならびに他の生理学的パラメータ、PKパラメータ、安全性パラメータおよび臨床パラメータ(下に挙げるような)がグルカゴンおよびエクセナチドに連結されたXTENを含む融合タンパク質の投薬の関数として測定される第II相投薬試験は、糖尿病患者に行われ、有害事象に関連する安全性データを収集することに加えて、第III相試験に適切な用量に関する用量範囲情報を産する。PKパラメータは生理学的、臨床および安全性パラメータデータに相関して、BPXTEN組成物の各構成要素の治療ウインドウを確立し、臨床医が、1つのグルコース調節ペプチドをそれぞれ含む2つの構成要素融合タンパク質の適切な比を確立できるようにするか、または2つのグルコース調節ペプチドを含むモノマーBPXTENの単一用量を決定できるようにする。最後に、糖尿病患者がBPXTEN組成物、陽性対照、またはプラセボのいずれかを毎日、隔週、または毎週(またはBPXTEN組成物の薬物動態および薬力学的特性を考慮して、適切と考えられる他の投薬スケジュールで)延長された期間にわたって投与される、第III相有効性試験が行われる。有効性の1次結果指標はHbA1c濃度を含むことができるが、2次結果指標は、試験の間のインスリン必要条件、シミュレートされたCペプチドおよびインスリン濃度、空腹時血漿グルコース(FPG)、血清サイトカインレベル、CRPレベル、ならびにインスリンおよびグルコース測定値を用いたOGTTから誘導されたインスリン分泌およびインスリン感受性指数、ならびに体重、食物消費、およびプラセボまたは陽性対照群に対して追跡される他の許容される糖尿病マーカーを含むことができる。有効性結果は標準統計方法を使用して決定される。毒性および有害事象マーカーも本試験で追跡されて、記載した方式で使用されたときに化合物が安全であることを検証する。
ヒト患者の第II相臨床試験は、IL−1raおよび/もしくは抗IL−2、抗CD3または好適な抗炎症タンパク質に連結されたXTENを含むBPXTENを投与された関節炎患者において行われ、関節腫脹、関節圧痛、炎症、朝のこわばり、および疼痛を低下させることを含む、関節リウマチに関連付けられた少なくとも1つの症状を和らげるのに適切な用量、または赤血球沈降速度、ならびにC反応性タンパク質および/またはIL2受容体の血清レベルの低下を含む、関節リウマチに関連付けられた少なくとも1つの生物学的代用マーカーを決定する。さらに有害事象に関連する安全性データが収集される。関節炎患者がBPXTEN、陽性対照、またはプラセボのいずれかを毎日、隔週、または毎週(または化合物の薬物動態および薬力学的特性を考慮して、適切と考えられる他の投薬スケジュールで)延長された期間にわたって投与される、第III相有効性試験が行われる。患者は、関節腫脹、関節圧痛、炎症、朝のこわばり、患者および医師によって評価された疾患活性、ならびにたとえば標準化健康調査評価(Health Questionnaire Assessment)(HAQ)によって評価される障害、および疼痛を含む、いずれかの処置を受ける前の疾患活性のベースライン症状について評価される。追加のベースライン評価は、赤血球沈降速度(ESR)、C反応性タンパク質(CRP)および可溶性IL−2受容体(IL−2r)の血清レベルを含むことができる。処置に対する臨床応答は、American College of Rheumatology(ACR)によって確立された基準、例えばACR20基準;すなわち圧痛および腫張関節カウントに20パーセントの改善ならびに測定した5つの残存する症状、たとえば患者の全般的疾患変化(global disease change)および医師の全般的疾患変化、疼痛、障害、および急性期反応物質のうち3つの20パーセントの改善があるかどうかを使用して評価できる(Felson,D.T.ら、1993 Arthritis and Rheumatism 36:729−740;Felson,D.T.ら、1995 Arthritis and Rheumatism 38:1−9)。同様に、被験体は、圧痛および腫張関節カウントそれぞれの50または70パーセント改善ならびに測定した5つの残存する症状、たとえば患者の全般的疾患変化および医師の全般的疾患変化、疼痛、障害、および急性反応物質、たとえばCRPまたはESRそれぞれの50または70パーセントの改善があるかどうかという、ACR50またはACR70基準を満足する。さらにリウマチ因子、CRP、ESR、可溶性IL−2R、可溶性ICAM−I、可溶性E−セレクチン、およびMMP−3を含む、疾患活性の潜在的バイオマーカーを測定することができる。有効性結果は標準統計方法を使用して決定される。毒性および有害事象マーカーも本試験で追跡されて、記載した方式で使用されたときに化合物が安全であることを検証する。
急性冠動脈症候群(ACS)および/または急性心筋梗塞(AMI)と診断された患者がたとえばIL−1raおよびBNPを含むBPXTEN融合タンパク質、陽性対照、BPXTEN融合タンパク質と陽性対照物質との組み合わせ、またはプラセボのいずれかを毎日、隔週、または毎週(または化合物の薬物動態および薬力学的特性を考慮して、適切と考えられる他の投薬スケジュールで)延長された期間にわたって投与される、ACSおよび/またはAMIにおける第III相試験が行われる。該試験は、最近の急性冠動脈症候群を有する被験体における心血管による死亡、非致死性心筋梗塞、または虚血性発作を防止する他の処置レジメンよりも優れているか否かを決定するために行われる。患者は、不安定狭心症、左腕および顎左側に放散する胸部絞扼感として経験される胸部痛、人為的発汗(発汗)、悪心および嘔吐、息切れの徴候または症状、ならびに非Q波心筋梗塞およびQ波心筋梗塞の心電図(ECG)による証拠を含む、いずれかの処置を受ける前の疾患活性のベースライン症状について評価される。追加のベースライン評価は、虚血修飾アルブミン(IMA)、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、グリコーゲンホスホリラーゼアイソエンザイムBB−(GPBB)、トロポニン、ナトリウム排泄増加ペプチド(B型ナトリウム排泄増加ペプチド(BNP)およびN末端Pro BNPの両方)、および単球化学誘引活性タンパク質(MCP)−1を含む、バイオマーカーの測定を含むことができる。処置に対する臨床応答は心血管による死亡、心筋梗塞、または虚血性発作の最初の出現までの時間を1次結果指標として使用して評価することができ、最初の不安定狭心症、出血性発作、または致死性出血の出現またはそれまでの時間は2次結果指標として作用することができる。有効性結果は標準統計方法を使用して決定される。毒性および有害事象マーカーも本試験で追跡されて、記載した方式で使用されたときに化合物が安全であることを検証する。
予測アルゴリズムによる2次構造についての配列の分析
アミノ酸配列の2次構造は、特定のコンピュータプログラムまたはアルゴリズム、たとえば周知のChou−Fasmanアルゴリズム(Chou,P.Y.ら(1974)Biochemistry,13:222−45)およびGarnier−Osguthorpe−Robson、すなわち「GOR」法(Garnier J,Gibrat JF,Robson B.(1996).GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence.Methods Enzymol 266:540−553)によって評価することができる。所与の配列では、上記アルゴリズムは、2次構造がいくつか存在するかまたは全く存在しないかを予測することができ、2次構造の存在はたとえばアルファらせんもしくはベータシートを形成する配列の残基の総数および/もしくはパーセンテージ、またはランダムコイル形成物をもたらすことが予測される配列の残基のパーセンテージとして表される。
(実施例73)
反復性についてのポリペプチド配列の分析
より短いサブ配列がポリペプチド全体内に出現する回数を定量することによって、ポリペプチドアミノ酸配列を反復性について評価することができる。たとえば200のアミノ酸残基のポリペプチドは、192の重複9−アミノ酸サブ配列(すなわち9マー「フレーム」)を有するが、独自の9マーサブ配列の数は、配列内の反復の量に依存する。本分析において、200アミノ酸配列以内の独自の3マーサブ配列の絶対数で割ったポリマー部分の最初の200アミノ酸全体にわたる各3−アミノ酸フレームについての独自の3マーサブ配列すべての出現を合計することによって、異なる配列を反復性について評価した。得られたサブ配列スコアは、ポリペプチド内の反復度の反映である。
(実施例74)
TEPITOPEスコアの計算
9マーペプチド配列のTEPITOPEスコアは、Sturniolo[Sturniolo,T.ら(1999)Nat Biotechnol,17:555]によって記載されたポケットポテンシャルを加えることによって計算できる。本実施例において、個々のHLA対立遺伝子について個々のTepitopeスコアを計算した。表34は、例として、白人集団にて高頻度で出現するHLA*0101Bのポケットポテンシャルを示す。配列P1−P2−P3−P4−P5−P6−P7−P8−P9のペプチドのTEPITOPEスコアを計算するために、表34の対応する個々のポケットポテンシャルを加えた。配列FDKLPRTSG(配列番号800)を有する9マーペプチドのHLA*0101Bスコアは、0、−1.3、0、0.9、0、−1.8、0.09、0、0の和である。
Claims (1)
- 明細書に記載の生物活性タンパク質。
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