JPH0789936B2 - 組換え繊維芽細胞成長因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は，組織治癒の際に，循環系を形成するために重
要な成長因子の組換え生産に関する。特に，本発明は，
ウシおよびヒトの，塩基性および酸性の繊維芽細胞成長
因子（FGF）をコードする遺伝子をクローニングし，そ
して発現させる。

技術的背景 組織が創傷または火傷のような外傷を受けた場合の修復
過程は極めて複雑であるが，多数のタンパク因子により
仲介されることが知られている。これらの因子は，破壊
された組織を置換するように働く細胞の増殖および分化
に必須である。数多くの候補となる因子は，脳，脳下垂
体，および視床下部などのいろいろな組織の抽出物が培
養細胞系の有糸分裂を促進する能力を基準として同定さ
れている。多数の短縮名がこれらの抽出物中の活性因子
に与えられている。これらの活性因子には，血小板由来
成長因子（PDGF），マクロファージ由来成長因子（MDG
F），表皮成長因子（EGF），腫瘍脈管形成因子（TA
F），内皮細胞成長因子（ECGF），繊維芽細胞成長因子
（FGF），視床下部由来成長因子（HDGF），網膜由来成
長因子（RDGF），およびヘパリン結合成長因子（HGF）
が含まれる。（例えば,Hunt,T.K.,J Trauma（1984）24:
S39−S49;Lobb,R.R.,et al,Biochemistry（1984）23:62
95−6299を参照）。

Folkman,J.,ら,Science（1983）221:719−725は，創傷
治癒に関与する過程の１つ，すなわち血管の形成は，腫
瘍においてヘパリンにより強く影響されることを報告し
た。このことおよび他の研究から，ヘパリンが，多数の
このような成長因子活性に関連するタンパクに対して特
異的に結合することは明らかである。従って，ヘパリン
が精製手段として用いられてきた。ヘパリンが正および
負に荷電した両方の因子に結合することから，成長因子
のヘパリンに対する親和性は，全体のイオン電荷に無関
係であることが示されている（Maciag,T.,et al,Scienc
e（1984）225:932−935;Shing,Y.,et al,Science（198
4）223:1296−1299;Klagsbrun,M.,et al,Proc Natl Aca
d Sci（USA）（1985）82:805−809）。ヘパリンに対す
る結合能力または非結合能力は，いろいろな抽出物にお
ける活性を区別する１つの尺度である。例えば,EGFおよ
びPDGFはヘパリンに強く結合しない；実際には,EGFはヘ
パリンに全く結合しない。上述の他の因子は強いヘパリ
ン結合正を示す。しかしながら，酸性の脳FGF,ECGF,RDG
FおよびHGF−αは，実際には，同一因子であると考えら
れている。同様に，脳下垂体FGF,陽イオン性の脳FGF,TA
FおよびHGF−βも同一タンパクであると考えられている
（Lobb,R.R.,et al,（前出））。ヘパリン親和性を用い
て精製された13の内皮成長因子の要約および比較が,Lob
b,R.R.,ら,J Biol Chem（1986）261:1924−1928に示さ
れている。

ヘパリン−アフィニティークロマトグラフィーを用い
て，毛細血管内皮に対して強い有糸分裂活性を示す塩基
性の繊維芽細胞成長因子が，ラットの軟骨肉腫（Shing,
Y.,et al,前出）およびウシの軟骨（Sullivan,R.,et a
l,J Biol Chem（1985）260:2399−2403）から単離され
ている。Thomas,K.A.,ら,Proc Natl Acad Sci（USA）
（1984）81:357−361,米国特許第4,444,760号は,16,600
および16,800ダルトンの分子量を有する酸性のウシの脳
繊維芽細胞成長因子の２つの異種型を精製した。Gospod
arowiczおよび協同研究者らは，ウシの脳および脳下垂
体の両方に塩基性の繊維芽細胞成長因子活性が存在する
ことを示し，そしてヘパリン−アフィニティークロマト
グラフィーを他の精製技術と組合せて，これらのタンパ
クを精製した（Bohlen,P.,et al,Proc Natl Acad Sci
（USA）（1984）81:5364−5368;Gospodarowicz,D.,et a
l,（同）6963−6967）。これらの因子の分子量も，ヒト
の胎盤から単離された同様の因子の分子量のように約16
kdである（Gospodarowicz,D.,et al,Biochem Biophys R
es Comm（1985）128:554−562）。

ウシの脳下垂体由来の塩基性FGFに対する完全な配列が
決定されている（Esch,F.,et al,Proc Natl Acad Sci
（USA）（1985）82:6507−6511）。均一な調製物が得ら
れ，そして内皮細胞を用いたインビトロ分析で強い有糸
分裂活性を示した（塩基性FGFは,60pg/mlのED₅₀を有す
る）。

酸性FGFは，約6,000pg/mlのED₅₀を有する。ウシの脳組
織由来の酸性FGFのＮ末端配列は,Bohlen,P.,ら,EMBO J
（1985）４:1951−1956により決定された。Gimenez−Ga
llego,G,らは，ヒトの脳から調製された酸性FGFおよび
塩基性FGF両方のＮ末端配列を決定し，そしてそれらを
ウシのFGFの配列と比較した（Biochem Biophys Res Com
m（1986）135:541−548）。彼らの結果は，ここに開示
された結果と一致している。また，ウシの脳由来の酸性
FGFの全アミノ酸配列が，単離されたタンパクから決定
された（Gimenez−Gallego,G,et al,Science（1985）23
0:1385−1388;Esch,F,et al,Biochem Biophys Res Comm
（1985）133:554−562）。これら２つの決定は,1つのア
ミノ酸を除いて一致している。ここでの多くの研究の後
に，ヒトの酸性FGFの全アミノ酸配列が，その遺伝子か
ら推定された（Jaye,M.,et al,印刷中）。

上述のFGFタンパクおよび他の成長因子は，外傷を受け
た組織の治癒を促進する際，明らかに有効である（例え
ば,Sporn,M.B.,et al,Science（1983）219:1329−1331;
Davidson,J.M.,et al,J.C.B.（1985）100:1219−1227:T
homas,K.A.,et al,Proc Natl Acad Sci（USA）（1985）
82:6409−6413を参照）。Davidsonら（前出）は，特に
創傷治癒におけるFGFの有効性を開示している。塩基性F
GFの天然タンパクは，心筋梗塞の治療に有用であると言
われている（Svet−Moldavsky,G.J.,et al,Lancet（197
7年４月23日）913;米国特許第4,296,100号および第4,37
8,347号）。さらに，ヒトの塩基性FGFが，ラット胎児の
海馬体神経細胞における神経細胞の生存および神経突起
の伸長を増大させることが見出されている（Walicke,
P.,et al,Proc Natl Acad Sci（USA）（1986）83:3012
−3016）。このことは，この因子がアルツハイマー病お
よびパーキンソン病のような退化神経学的疾病の治療に
も有用であり得ることを示唆している。

従って，これらのFGFタンパクを大量に，かついかなる
毒性不純物あるいは感染性不純物を含まない形で利用し
得ることを保証することが望ましい。治療に用いるに
は，このタンパクのヒト型のものが好ましく，そして恐
らく必要とされる。純粋な調製物を得るには約35,000倍
に精製しなければならないので，天然のヒト起源のもの
を用いることは，明らかに実用的ではない。たとえヒト
の死体が実用的な起源であるとしても，エイズ，肝炎あ
るいは他の病気の伝染の可能性があるため完全な精製
は，困難である。最近のクロイツフェルト−ヤコブ症候
群（Powell−Jackson et al,Lancet（1985）ii:244−24
6）の経験からヒトの脳下垂体を起源として用いること
はできない。従って，組換え技術は，特にこれらのタン
パクの生産への応用に適している。本発明は，ここに酸
性FGFおよび塩基性FGFを実用的な量で，かつ純粋であっ
て，汚染されていない形で得る方法を与える。

発明の開示 本発明は，創傷，骨折，火傷組織，創傷心筋組織，退化
神経組織または他の外傷の治癒を効果的に促進させるの
に有用な繊維芽細胞成長因子の合成および操作の手段を
与える。これらの因子をコードする遺伝子のクローニン
グおよび発現は，本発明の方法および材料によって与え
られる。

ある様相において，本発明は，ウシおよびヒトの，酸性
および塩基性のFGF（酸性bFGF,酸性hFGF,塩基性BFGFお
よび塩基性hFGF）をコードする組換えDNA配列に関す
る。特に，これらはヒトまたはウシのゲノム配列を包含
する。他の様相において，本発明は，これらのDNA配列
を有する組換えベクター，このようなベクターを用いて
形質転換され，そしてこれらのDNA配列を保持する宿主
細胞，およびこれらの形質転換された細胞により生産さ
れる組換えタンパクに関する。他の様相において，本発
明は，組換え技術を用いたこれらの繊維芽細胞成長因子
の生産方法に関する。

図面の簡単な説明 第１図から第４図は，酸性bFGF,酸性hFGF,塩基性bFGFお
よび塩基性hFGFをコードするDNA配列，および推定され
たこれらのアミノ酸配列を表す。第１図ａは，酸性のウ
シFGFに対する部分配列を表す；第１図ｂは，このタン
パクの完全なアミノ酸配列を表す。第２図a,第２図ｂお
よび第２図ｃは，それぞれλファージλHAG−9.1,λHG
−３およびλHAG−３に含まれるヒトの酸性FGFの遺伝子
の３つのエキソンに対応するヌクレオチド配列および推
定されるアミノ酸配列を表す。第２図ｄは,Jayeらによ
り開示された，完全なアミノ酸配列およびヒトの酸性FG
FをコードするcDNA配列を表す。

第５図は，酸性bFGFのＮ末端配列から設計されたオリゴ
ヌクレオチドプローブ889/890,891および853−856を表
す。

第６図は，ゲノムの酸性bFGFクローンλBA2およびλBA3
に対する挿入部分の制限地図を表す。

第７図は，ウシの酸性FGFゲノムプローブ250/AluIのDNA
配列を表す。

第８図は，酸性hFGFゲノムクローンλHAG−9.1における
挿入部分の制限地図を表す。

第９図は，酸性hFGFの部分合成遺伝子，すなわち“合成
型−酸性hFGF"を表す。

第10図は，塩基性FGFプローブ1097/1098を表す。

第11図は，塩基性bFGF cDNAクローンλBB2の制限地図を
表す。

第12図は,CV−１細胞における塩基性hFGFの一時的な発
現の結果を表す。

第13図は，塩基性hFGFを構築するためにhGHシグナル配
列への融合物として用いた合成オリゴヌクレオチドを表
す。

第14図は，いくつかの塩基性hFGF組換えタンパクに対す
るhGH/FGF融合連結部におけるアミノ酸配列を表す。

第15図は，いくつかの酸性hFGF組換えタンパクに対する
hGH/FGF融合連結部におけるアミノ酸配列を表す。

第16図は，第15図のタンパクのいくつかの部分をコード
するために用いたDNA配列を表す。

第17図は，ヒトの塩基性FGFをコードする遺伝子の地図
を表す。

本発明の実施方法 A.繊維芽細胞成長因子 ２つの異なったウシ（および類似のヒト）繊維芽細胞成
長因子は，他の人々により均一にまで精製され，そして
部分的にあるいは完全に配列決定されている。両因子
は，ウシの脳および副腎皮質由来の毛細血管内皮細胞，
ヒトの臍静脈内皮細胞，ウシの副腎皮質細胞，顆粒膜細
胞および脈管平滑筋細胞などの培養細胞を用いたインビ
トロ分析において有糸分裂活性を示す。これらの細胞培
養を用いるインビトロ分析は,Gospodarowicz,D.,ら,J C
ell Physiol（1985）122:323−332;およびGospodarowic
z,D.,ら,J Cell Biol（1983）97:1677−1685によって述
べられている。ごく最近，別のインビトロ分析が,Esch
ら,Proc Natl Acad Sci（USA）（1985）82:6507−6511;
およびGospodarowicz,D.,ら,J Cell Physiol（1986）12
7:121−136により報告された。精製された塩基性bFGF
は，ニワトリの漿尿膜分析においてインビボで脈管形成
能があることが示されている（Gospodarowicz,D.ホルモ
ン性タンパクおよびペプチドXII:205−230（アカデミッ
クプレス））。精製された酸性bFGFは，同じ分析におい
てインビボで脈管形成能があることが示されている（Th
omas,K.A.,et al,Proc Natl Acad Sci（前出））。

ウシの脳下垂体の塩基性FGFは，完全に配列決定されて
おり，それを第３図に示す；ゲノムおよびcDNAからここ
で決定されたヒトのFGFの配列を第４図に示す。一次配
列は,146個のアミノ酸を含んでおり，図中の“1"番のプ
ロリン残基で始まっている。この一次配列は,Giminez−
Gallegoら,Biochem Biophys Res Comm（前出）により報
告された，天然のウシのタンパクのＮ末端配列，および
Esch,Proc Natl Acad Sci（前出）により報告された天
然タンパクの全配列と一致している。より大きな分子量
を有するヒトの塩基性FGFは，ヒトの肝細胞系列,SK−He
p−１について,Sullivan,R.J.ら,J Cell Biol（1985）1
01:108a;およびKlagsbrun,M.ら,Proc Natl Acad Sci（U
SA）（1986）83:2448−2452,により報告されている。ヒ
トおよびウシのDNAにおいて，第３図および第４図の上
流側配列を元のATG開始コドンまで翻訳することは，第
３図および第４図において残基１で示されるプロリンの
上流側のアミノ酸を含む，各タンパクの別の型のものも
生産され得ることを示す。これらのDNAには,ATGを含め
９つの上流側コドンが存在する。遺伝子が真核系で発現
する場合,ATGによりコードされるメチオニンが，プロセ
ッシングを受けることはかなり確かである。遺伝子が組
換えによって細菌系で発現する場合，このようなプロセ
ッシングは，起こり得る場合も，起こり得ない場合もあ
る。従って，タンパクの長い型のものは，さらに８つの
アミノ酸プロー配列または合計154個のアミノ酸を含
む。SK−HEP−１細胞から単離された，この伸長したFGF
は，そのＮ末端がブロックされていることも示されてい
る（Klagsbrun,M.,et al,（前出））。

上述のインビトロ分析においてFGF活性を有し，そして
第３図（146個のアミノ酸型）に示されているウシの脳
下垂体の塩基性FGFと類似していると推定されるＮ末端
配列を有するタンパクも，ウシの脳，副腎，黄体，網
膜，腎臓，およびヒトの胎盤から単離されている。これ
らの組織のあるものから得られた天然のタンパクは，不
均一である−−推定される15個のＮ末端アミノ酸を欠く
第２の型は，活性を保持している（Gospodarowicz,D.,M
eth Enz（1986），印刷中）。従って，ウシおよびヒト
の塩基性FGFは,3つの型が存在する−−これらは第３図
および第４図に成熟型として示されている。ここに示さ
れている推定の成熟型配列のうち，長い型はＮ末端にさ
らに８個のアミノ酸を含んでおり，短い型は15個のアミ
ノ酸を欠いている。従って，天然で生産される“長い
（long）”塩基性FGFは,154個のアミノ酸を含み，“基
本型（primary）”塩基性FGFは,146個のアミノ酸を含
み，そして“短い（short）”塩基性FGFは,131個のアミ
ノ酸を含んでいると考えられている。これらのFGFは，
非常に多くの塩基性アミノ酸残基（リジン，アルギニ
ン，ヒスチジン）を含んでおり，従って中性pHの下で陽
イオン性であるので，“塩基性"FGFと呼ばれる。

あるタンパクが前述の分析でFGF活性を有し、ヘパリン
に結合し，中性pHの下で陽イオンであり、そしてウシの
血清アルブミン（もし適当なら），あるいはウシ（また
はヒト）のFGFもしくはそれの合成ペプチドまたは天然
ペプチドに対する他の抗体に結合した，アミノ末端配列
〔tyr¹⁰〕FGF（１−10）の合成類似体を用いて調製され
た抗体と免疫的に反応する場合，このタンパクをここで
は塩基性FGFと定義する。Baird,A.ら,Regulatory Pepti
des（1985）10:309−317を参照されたい。

酸性FGFは，他の人々によりウシの脳から単離され，そ
して始めの34個のアミノ酸残基が決定されている。ウシ
およびヒトの酸性FGFに対する，ここでの遺伝子のクロ
ーニングにより，酸性bFGFに対してアミノ酸配列１−34
に付加的なアミノ酸配列が第１図ａに示したように推定
され，そして第２図ａに示されるように，酸性hFGFの部
分配列が得られた。以下に記述される多くの研究によ
り，酸性bFGFに対する完全なアミノ酸配列が，第１図ｂ
に示すように,Eschら,Biochem Biophys Res Comm（前
出），およびGimenez−Gallego,G.,ら,Science（前
出），により開示された。大部分のこの研究の結果とし
て，酸性hFGFに対する完全なコード配列が，第２図ｂに
示されるように，マキアグ（Maciag）グループにより決
定された。

この酸性タンパクはまた２つの活性型が知られており，
第１の型は図の“1"番のフェニルアラニン残基で始まる
140アミノ酸配列を有しており，そして第２の型はアミ
ノ酸７−140に対応する短い型である。ウシおよびヒト
のタンパクは，いずれもＮ末端伸長型で存在し得る。図
の“1"番のアミノ酸に対するコドンの上流側のDNAの
（括弧で示す−15のATG開始コドンへ戻る）翻訳によっ
て，伸長したタンパクの付加的配列が示される。塩基性
FGFの場合のように,N末端のメチオニンは，遺伝子が細
菌で発現する場合にはあり得ないが，真核発現宿主では
ほとんど確実にプロセッシングされる。従って，上述の
塩基性FGFのように，天然の酸性タンパクは,3つの型で
存在し得る:1つは，切形型（truncated）FGF,すなわち1
34個のアミノ酸を含む“短い“酸性FGF:1つは,N末端伸
長型，すなわち154個のアミノ酸を含む“長い型";そし
て残りの１つは，図の“1"番の残基で始まる140個のア
ミノ酸を含む“基本型“酸性FGF。Burgess,W.H.,ら，
（印刷中）により，ウシの脳の長い型はアセチル残基で
ブロックされていることが示された。これらのタンパク
は，不均衡な数の酸性アミノ酸残基，すなわちグルタミ
ン酸およびアスパラギン酸を含んでおり，従って中性pH
の下で陰イオンである。

あるタンパクがインビトロ分析でFGF活性を示し，ヘパ
リンに結合し，中性pHの下で陰イオンであり，そしてヒ
トまたはウシの酸性FGFあるいはそれの合成ペプチドま
たは天然ペプチドに対して調製された抗体と免疫的に反
応する場合，このタンパクをここでは酸性FGFと定義す
る。

酸性FGFおよび塩基性FGFは，上述のタンパク，または第
１図〜第４図に示されるアミノ酸配列を有するタンパク
を示すために，ここで用いられる。もちろん，これらの
定義は，示された特定の配列に限定されるものでなく，
前述のインビトロおよび免疫的分析によって測定した生
物学的活性，および中性pHの下でのそれぞれの陰イオン
性または陽イオン性が変化しない限り，アミノ酸残基の
欠失，付加または交換のような，偶然の変化あるいは計
画的に誘導した変化を含むタンパクを包含する。もちろ
ん，修飾型は若干変化した定量的活性および特異性を有
し得る。

“精製した”または“純粋の”とは，天然の状態で見ら
れる，通常それに付随する物質を含まないものを意味す
る。従って，例えば“純粋の”酸性hFGFは，ヒトの脳ま
たは脳下垂体における本来の環境下で通常付随している
物質を含んでいない酸性hFGFを意味する。もちろん，
“純粋”の酸性hFGFは，グリコシド残基のような，それ
と共有結合によって結合している物質を含み得る。

“動作可能に連結した”とは，成分がその通常の機能を
果たすように位置している連結部を意味する。従って，
コード配列に動作可能に連結した，制御配列またはプロ
モーターは，このコード配列の発現に効果的である。

“制御配列”とは,DNA配列，あるいは所望のコード配列
に適切に連結した場合，このような配列に適合した宿主
においてその発現を有効にし得る配列を意味する。この
ような制御配列には，少なくとも原核および真核宿主に
おけるプロモーターが含まれるが，任意に転写終止シグ
ナルも含まれる。発現を効果的にするのに必要な他の因
子または補助的な他の因子もまた同定され得る。ここで
用いられるように，“制御配列”とは，単に，用いられ
る特定の宿主において発現を効果的にするのに要求され
るどのようなDNA配列をも意味する。

“細胞”または“細胞培養",もしくは“組換宿主細胞”
または“宿主細胞”とは，内容から明らかであるので，
しばしば互換性をもって用いられる。これらの用語は，
直接の対象細胞を包含するが，もちろん，その子孫をも
包含する。偶然の変異あるいは環境の変化により，必ず
しもすべての子孫が親細胞と正確に同一でないことが理
解されている。しかしながら，このような変化した子孫
は，その子孫が初めの形質転換細胞に与えられた性質に
関連した性質を保持している限り，これらの用語に包含
される。この場合，例えばこのような性質は，組換えFG
Fを生産する能力であり得る。

B.一般的記載 用途および投与 本発明は成長因子タンパクをコードするDNAを提供す
る。成長因子タンパクは，傷の治癒を促進するのに有効
であり，そして，さらに成長因子タンパクに特異的な阻
害剤の設計を行うために充分な量が純粋に提供され得
る。精製された成長因子は一般に，血管新生や治癒を促
進するために，傷ついた組織に局所的に適用される。適
当な対象としては，火傷，骨折，成形外科で扱われるよ
うな外科的擦過傷，または治療を要する他のものがあ
る。これら因子の適用は治癒を促進するので，それらは
また，感染の危険を減少させる。

FGFが血管の新生を促進するということにおいて価値が
ある適応症には，骨折，靭帯および腱の治療，腱炎，お
よび滑液嚢炎のような筋骨格の状態；火傷，切傷，裂
傷，褥瘡，および糖尿病患者に見られるような遅治癒性
潰瘍のような皮膚の状態；および虚血症および心筋梗塞
症時の組織治療時，が包含される。

入手可能な賦形剤および担体を用い組換え技術により生
産される成長因子の処方は，当該分野で既知の標準的な
方法により調製される。このタンパクは，所望であれ
ば，制御された放出システムの一部として，ローショ
ン，ゲル，または抗生物質のような付加的な活性成分を
有する軟膏，として処方され得る。

表面の障害に関して最も適当である局所的な投与におい
ては，例えば,0.1〜1.0％溶液を用いる標準的な局所的
処方が採用される。そのような溶液は患部に,1日あたり
３〜６回適用される。もちろん軟膏または他の処方物の
濃度は，傷の程度および患者の性質に依存する。ほとん
どの処方（プロトコル）においては，用量は時間が経過
して傷跡が残る可能性が減少するにつれて減じられる。
例えば，第３度の火傷のような最も重症の傷は典型的に
は10％組成物で処置される。しかし，治癒が始まると，
用量は傷が治癒するにつれて徐々に約0.1％またはそれ
以下にまで下げられる。BSAを担体としたEGFの局所的処
方は,Franklin,J.D.,ら,Plastic and Reconstruc Surg
（1979）64:766−770,に開示されている。

骨および組織の治療には，投与は局所的になされること
が好ましいが，皮下注入または標的の近傍に直接的に移
入した遅延放出性の処方によることができる。外科手術
は骨の損傷のような状況に対しては必要となることもあ
り得るので，直接的な注入が有利である。遅延放出型
は,Hydron（Langer,R.,et al,Nature（1976）263:797−
799）またはElvax40P（Dupont）（Murry,J.B.,et al,In
Vitro（1983）19:743−747）のようなポリマーに処方
され得る。他の持続的放出系は,Hsieh,D.S.T.ら,J Phar
m Sci（1983）72:17−22により示唆されている。本発明
では望ましくはないが，特に上皮成長因子の処方がBuck
ley,A.,Proc Natl Acad Sci USA（1985）82:7340−7344
に示唆されている。

局所的投与で，持続的な放出の送達については，処方物
中のFGF濃度は，状態の程度および該ポリマーからのFGF
の放出速度を含む多くの因子に依存する。一般的に，そ
の処方は,Buckleyら（Proc Natl Acad Sci USA（前
出））により記載されているように，ホルモンが血清レ
ベルの約100倍，または，組織濃度の10倍の，定常的な
局部的濃度を達成するように構成される。５〜50ng/g湿
潤重量の組織中のFGF濃度（60ng/g湿潤重量でのEGFに比
べて）を基準として,1時間あたり50〜5000μｇ FGFの
放出が許容され得る。もちろん，その初期濃度は傷の程
度に依存する。

FGFは，上皮成長因子（EGF），形質転換成長因子（TGF
−αまたはTGF−β），インシュリン様成長因子（IGF−
１またはIGF−２），および／または血小板由来成長因
子（PDGF）のような他の成長因子と，協奏的に，そして
共働的にも働き得ると期待される。さらに，骨の治療に
関しては特に，それは副甲状腺ホルモンの拮抗薬と共働
して働き得る。なぜなら，副甲状腺ホルモンは骨の再吸
収を促進するからである。従って，所望の組織の治療を
より効果的に達成するために，本発明のFGFが前述の因
子の１もしくはそれ以上と同じ組成でもしくは同じ処方
で投与される実施態様もまた，本発明の組成物および投
与処方内に包含される。

FGFは，軸索の成長，神経再生，および神経単位の生存
を促進させることに効果的であるので，それは，アルツ
ハイマー病およびパーキンソン病のようなある種の神経
性の疾患，筋萎縮性側索硬化症，および神経系の一般的
老化の処置；そして脊髄および末梢神経の外傷に有効で
あり得る。

これらの症状に対して薬剤を投与するときには，傷の治
癒に関連して上に述べた処方と同様の処方で注入するこ
とによるのが好ましい。この薬剤はまた，移植に先立ち
本発明のFGF調製物で培養物を処理することによる移植
治療のときのように，細胞培養物の注入という手段を用
いて送達され得る。さらに，このFGFは髄液に直接注入
され得，または，系統的に適用され得る。系統的処方は
一般に当該技術分野で既知であり，緩衝液または生理学
的食塩水，または他の適当な賦形剤中での処方を包含す
る。用量レベルは，傷を治癒させ得る程度のレベルであ
る。しかし，組織培養または体外移植組織の維持につい
ては，それは，血清または培地の0.1〜1.0ng/mlで供給
され得る。

FGFタンパクも，外科手術中に損傷した組織の再形成お
よび治療を促進させることにおいて，特に有用である。
この用途のために，外科用ステープルとして用いるポリ
マー中にFGFタンパクを埋めこむことが有用であり得
る。このタンパクはこのように，ステープルにより行わ
れる機械的縫合を生物学的に補うことができ，そして，
治療した組織における“自然の”治癒過程を増大させ促
進させることができる。

さらに，ここで述べているFGFタンパクにより供給され
るような脈管形成刺激により，インビトロにおける，組
織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）およびコラゲナ
ーゼの放出が起こる（Gross,J.L.,et al,Proc Natl Aca
d Sci USA（1983）80:2623−2627）。従って，本発明の
FGFタンパクもまた，これらの酵素に応答する状況の処
置に有用である。急性な状況（発作または心臓発作に関
連する血液凝固物が存在するような状況）では，塞栓症
を形成する慢性的傾向に対する処置のために，凝固物を
溶解するために大用量のtPAを直接投与することが必要
であり得るが，血流のtPAの適当なレベルを維持するた
めにFGFを投与することが望ましいかもしれない。従っ
て，この症状に対して，筋肉内または皮下注射のような
従来の方法を用いて，薬剤の系統的投与を行うことが好
ましい。

本発明は，上記の症状に関連した用途に，純粋なFGF成
長因子の実際的な量を提供する。４つの特異的な内皮成
長因子が例示されており，その各々は３つの形（ウシの
酸性および塩基性FGF,およびそれらのヒトに相当するも
の）について明らかに活性がある。酸性および塩基性因
子はいずれも，ここで述べているように，長型，基本
型，そして短型で発現すると考えられる。長型のＮ末端
メチオニンは，真核細胞系において該タンパクが生産さ
れると切り離されること，そして，続くアミノ酸残基が
転写後におそらくアセチル化により誘導されると考えら
れる。

種々の型のFGFは認識されるシグナル配列を持たない
が，それは何らかの方法で分泌されているに違いない。
なぜなら，それを産生している細胞の外の，膜結合受容
体で，作用するからである。従って，たぶん認識される
構造分泌経路によっては分泌されないので，その分泌
は，細胞溶解による，またはエキソサイトシス（開口分
泌）によるような他の方法で達成される。FGFが自然に
誘導されるほとんどの組織においては，そして多くの哺
乳類の発現系においては，そのような放出は，通常に用
いられているA23187（Cal Biochem）のようなカルシウ
ムイオノフォアでのエキソサイトシスを行うことにより
達成され得る。インビトロの状態においては，カルシウ
ムイオノフォアは,1mM CaCl₂の存在下で１〜10μＭとな
るように培地に加えられる。マクロファージまたは単球
に由来する発現系では，リポポリ多糖（LPS）を10μg/m
lで添加するような，または大腸菌エンドトキシン（Dif
co）（300ng/ml）を加えるような他の活性化法が効果的
であることが示されている。これらの刺激は，マクロフ
ァージ由来の類似因子インターロイキン１を放出するこ
とが示されている（March,C.J.,et al,Nature（1985）3
15:641−647）。これらの手法もまた，以下で述べるよ
うに，付加的なシグナル配列なしで細胞内で生産される
と，組換えにより生産されるFGFタンパクを放出させる
のに採用され得る。細胞内で産生したタンパクの放出を
起こさせる刺激には，ホルボールエステルおよびトリグ
リセリドが包含される。

遺伝子回収 例示したFGFをコードしている配列がここで得られるよ
うな一般的な戦略は以下のようである。ウシの酸性FGF
の既知のＮ末端配列を，ファージに連結したウシのゲノ
ムライブラリーとともに使用するための一連のプローブ
を設計するのに用いた。プローブにハイブリダイズした
ファージ組換体をライブラリーより単離し，“天然の”
プローブを得るために,M13クローニングベクターにクロ
ーニングするのに適したより小さな断片にまで分解し
た。これにより，ウシの酸性タンパクの一部分に相当す
る250bpの配列を含むM13プローブが得られた。このプロ
ーブは，これらの種の中の塩基性型の遺伝子を得るため
だけでなく，ウシとヒトの両起源の酸性型に対し完全に
コードしている配列を回収するための中心である。

簡単には，ファージにクローン化した選抜された酸性bF
GF遺伝子断片のAluI分解により得られた断片を，ショッ
トガン法でM13にクローン化した。適当なプローブDNAに
ハイブリダイズされた250bp断片を選抜し，配列決定し
た。上記のものを250/AluIと表すが，それをpBR322に転
写し，そしてウシの脳，視床下部，あるいは脳下垂体の
cDNAライブラリーを探索するため（イントロンで中断さ
れていない完全な酸性bFGF配列を得るため），およびヒ
トのゲノムライブラリーを探索するため（ヒトの酸性FG
Fゲノム配列の最初のエキソンを得るため），に用い
た。酸性FGFをコードしているヒト遺伝子の中央部およ
び第三番目のエキソンを，以下の実施例に記述のよう
に，オリゴマーのプローブを用いて得た。これらのプロ
ーブを，合成したヒトの酸性FGF遺伝子をもとにして設
計した。加えて，この同じ250bpの断片を，酸性型より
もむしろ塩基性型に相応するDNAを変えるために，入手
可能なアミノ酸配列の情報を有効に利用して，塩基性型
のプローブを設計するのに用いた。それゆえ，酸性型bF
GFのＮ末端をコードしている配列と塩基性型のbFGFのア
ミノ酸配列との比較をもとにして設計した修飾プローブ
を，塩基性型bFGF cDNAに対して，同じウシの脳下垂体c
DNAライブラリーを探索するために用いた。回収された
ウシのクローンを，次いでヒトの塩基性型FGFをコード
しているDNAをコードするゲノム配列を回収するため
に，ヒトのゲノムおよびcDNAライブラリーを探索するの
に用いた。選択的には，ウシのcDNAクローンλBB2を，
塩基性型FGFタンパクのヒト型をコードするものにDNA配
列を変換させるために変異させた。酸性型および塩基性
型の両FGFに対して，下記のcDNAクローンおよびゲノム
クローンは，このような哺乳類のライブラリーから類似
のコード配列を得るために，種々の種から調製したDNA
ライブラリーを探索するのに有効である。加えて，この
ゲノムクローンは哺乳類系で発現させることができ，か
つ相当するcDNA以上のよい結果を与えることもある。脳
下垂体，脳，視床下部，あるいは腎臓のような種々の組
織から調製したcDNAライブラリーもこのようにして選抜
され得る。

FGF遺伝子の発現 このクローン化したゲノムあるいはcDNA配列は，適当な
発現系で発現され得る。もちろん，ここで開示したDNA
に対しても，それらを回収するための前述のプロトコル
を繰り返す必要はなく，従来の化学合成法が適当に用い
られ得る。このことは,DNAを調節することにより，あら
ゆる所望の形のタンパクを得ることを可能にする。cDNA
配列は，バクテリア，酵母，あるいは真核細胞を含むど
のような宿主にでも適した適当な制御を供給し得る。ヒ
トの酸性FGFのゲノム配列の再構築を,3つのエキソンを
含む３つの寄託されたλファージから得ることができ
る。イントロンを含むゲノム配列は，真核細胞の制御配
列，および転写物のスプライシングが可能な真核細胞宿
主を用いて発現させ得る。ワクシニアをもとにした発現
も用い得る。典型的な制御配列DNAsおよび宿主を以下の
C.I.節で与えている。

特に，完全長のFGFをコードする完全なDNAは，例えば，
酸性あるいは塩基性FGFの長型，基本型，あるいは短型
のどれでも得るために，組換え方法および合成方法を組
合せて用いながら構築され得る。異種のシグナル配列を
これらに融合することも可能であり，所望形態でタンパ
クを得るために，開裂部位に対するシグナル配列の既知
の関係を考慮に入れることも利用可能である。細胞内で
産生された形態のタンパクは細胞溶解により得られる，
あるいは細胞からのそれらタンパクの遊離は，上で述べ
たように刺激され得る。細胞に関係した形態，もしくは
分泌されシグナル配列に融合されると推定される形態
（この形態は,CHO細胞のような哺乳類細胞と和合可能な
制御系を利用する）の発現系は，特に好ましい。また，
ワクシニアをもとにしたシステムがより好ましい。この
システムは，感染しやすい細胞中にて，安定な，あるい
は一時的な発現に使用可能である。

このように産生された組換えFGFタンパクを，次いで，
天然起源からFGFを精製するために用いられる方法と同
様の方法で精製する。しかし，このタンパクは出発材料
の極めて大部分を占めているので，精製はかなり簡単で
ある。

多形性 ヒトのゲノムDNAは，遺伝子の第二のエキソンの領域に
多形性があることがすでに示されている。この多形性の
存在は,FGFが腫瘍により分泌されるので，充実性腫瘍に
なる傾向を予想させる。そして，多形性は腫瘍への滋養
物の流れを保つ血管の成長を促進するので，それらが生
存するためにおそらく必要である。

この多形性を検出するために，ヒトのゲノムDNAが，例
えば，血液サンプルから従来の方法により得られ，そし
てポリアクリルアミドゲル上でサイズによる分離に供さ
れ，そして標準的なサザンブロット操作を用いて探索さ
れる。効果的なプローブは，以下で述べるλBB2への2.1
kbの挿入から得られた1.4kb EcoRI断片である。このよ
うなプローブあるいはそれと同等物を，単離されたヒト
DNAのHind III分解物を含むゲルにハイブリダイズさせ
るべく用いると,2.7kbの断片が通常検出される。いくつ
かの個体では，付加的な2.9kb断片も見い出される。こ
れらの断片は，第17図に示すように，エキソン２の周辺
の遺伝子領域に地図化される。

検査した３つの個体のうちで,2つは2.7kb断片だけを示
した。１つは2.7断片および2.9kb断片の両方を示した。
ハイブリダイゼーションの強度は，両断片の持つ個体が
両対立形質を含むことを示した。このことは，マウス／
ヒトハイブリッド細胞系由来のDNAのサザンブロット分
析により得られた結果によって，支持される。このよう
なハイブリッド（ここでは１つの染色体のみが転写され
る）では,2つの断片のうちの１つだけが各系に現れる。

C.標準的方法 細胞の形質転換，ベクターの構築，メッセンジャーRNA
の抽出,cDNAライブラリーの調製などに用いる技術の大
部分は，当該分野で広く実施されている。そして，ほと
んどの従業者は，特異的条件および方法を記載している
標準資料に通じている。しかしながら，便宜上，以下の
節にその概要を示す。

C.1.宿主および制御配列 原核生物および真核生物の両方の系を用いて,FGFをコー
ドする配列を発現し得る；原核生物の宿主は，もちろ
ん，クローニングに最も便利である。最も頻繁に使われ
る原核生物は，大腸菌のいろいろな株で代表される；し
かしながら，他の微生物の株も使用し得る。宿主に適合
した種より導かれる複製部位，選択可能なマーカーおよ
び制御配列を含むプラスミドベクターが用いられる；例
えば，大腸菌は，典型的には,pBR322の誘導体，すなわ
ちBolivar,らGene（1977）２:95,によって大腸菌種より
誘導されたプラスミドの誘導体，を用いて形質転換され
る。pBR322は，アンピシリン耐性およびテトラサイクリ
ン耐性の遺伝子を含んでいる。従って，所望のベクター
を構築する際に保持され得るかあるいは分解され得るよ
うな，複数の選択可能なマーカーを与える。一般に用い
た原核生物制御配列（ここでは，リボソーム結合部位配
列に加えて，任意にオペレーターを伴った，転写開始の
ためのプロモーターを含むと定義される）は，β−ラク
タマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（lac）
プロモーター系（Chang,et al,Nature（1977）198:105
6）およびトリプトファン（trp）プロモーター系（Goed
del,et al,Nucleic Acids Res（1980）８:4057）および
ラムダ由来のP_LプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム
結合部位（Shimatake,et al,Nature（1981）292:128）
のような一般に用いられるプロモーターを含む。

細菌に加え，酵母のような真核微生物も宿主として，用
いられ得る。数多くの他の株または種を一般に利用し得
るにもかかわらず，サッカロマイセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）の実験用菌株，ベーカー酵母
（Baker′s yeast）が最もよく用いられる。例えば,Bro
ach,J.R.,Meth Enz（1983）101:307の,2μの複製起点，
または他の酵母の適合した複製起点（例えば,Stinchcom
b,et al,Nature（1979）282:39,Tschumper,G.,et al,Ge
ne（1980）10:157およびClarke,L,et al,Meth Enz（198
3）101:300を参照）を用いるベクターが用いられ得る。
酵母ベクターに対する制御配列は，解糖酵素の合成に対
するプロモーター（Hess,et al,J Adv Enzyme Reg（196
8）７:149;Holland,et al,Biochemistry（1978）17:490
0）を含む。当該分野に既知の他のプロモーターには,3
−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター（Hitzem
an,et al,J Biol Chem（1980）255:2073）が含まれる。
転写が増殖条件および／または遺伝的背景により制御さ
れるという付加的利点を有する他のプロモーターとして
は，アルコール脱水素酵素2,イソチトクロームC,酸性リ
ン酸水解酵素，窒素代謝に関連する分解酵素，アルファ
ー因子系，マルトースおよびガラクトース利用に応答す
る酵素に対するプロモーター領域がある。また，ターミ
ネーター配列は，コード配列の３′末端に存在すること
が望ましいと考えられている。このようなターミネータ
は，酵母由来の遺伝子においてコード配列に続く３′未
翻訳領域に見い出される。

もちろん，多細胞生物由来の真核生物の宿主細胞培養中
で，ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させること
も可能である。例えば,Axelら,4,399,216を参照された
い。これらの系は，イントロンをスプライシングし得る
という付加的な利点を有し，従って，直接用いることに
よってゲノム断片を発現させ得る。有用な宿主細胞系列
には,VEROおよびHeLa細胞，そしてチャイニーズハムス
ターの卵巣（CHO）細胞が含まれる。このような細胞に
対する発現ベクターには，普通，例えば，サルウイルス
40（SV40）由来の初期および後期プロモーター（Fiers,
et al,Nature（1978）273:113），あるいはポルオー
マ，アデノウイルス2,ウシの乳頭腫ウイルスまたはトリ
の肉腫ウイルス由来のプロモーターのようなウイルスプ
ロモーターなどの，哺乳類の細胞に適合するプロモータ
ーおよび制御配列が含まれる。制御可能なプロモータ
ー,hMT II（Karin,M.,et al,Nature（1982）299:797−8
02）もまた使用し得る。哺乳類の細胞宿主系における形
質転換の一般的な様相は,Axel（前出）により記述され
ている。現在では，“エンハンサー（enhancer）”領域
も発現を最適化する際に重要であることは明らかであ
る；これらは，一般に，非コードDNA領域におけるプロ
モーター領域の上流側または下流側に見られる配列であ
る。必要に応じて，ウイルスを起源として，複製起点を
得ることができる。しかしながら，染色体への組込み
が，真核生物におけるDNA複製における共通の機構であ
る。

C.2.形質転換 使用する宿主細胞に依存して，そのような細胞に適した
標準的技術を用いることにより，形質転換が行われる。
Cohen,S.N.,Proc Natl Acad Sci（USA）（1972）69:211
0）によって記述されたような塩化カルシウムを用いた
カルシウム処理，またはManiatisら，分子クローニン
グ：実験の手引き（1982）コールドスプリングハーバー
プレス,P.254,およびHanahan,D.,J Mol Biol（1983）16
6:557−580によって記述されたようなRbCl₂法は，原核
生物または実質的な細胞壁障害を有する他の細胞に対し
て用いられ得る。このような細胞壁を持たない哺乳類細
胞に対しては,Grahamおよびvander Eb,Virology（197
8）52:546）のリン酸カルシウム沈澱法，が用いられ得
るが，任意にはWigler,M.らCell（1979）16:777−785に
より修正された方法が用いられ得る。酵母への形質転換
は,Beggs,J.D.,Nature（1978）275:104−109の方法また
はHinnen,A.ら（Proc Natl Acad Sci（USA）（1978）7
5:1929）の方法に従って実施し得る。

C.3.ベクターの構築 所望のコード配列および制御配列を含む適当なベクター
の構築には，当該分野に既知の標準的な連結技術および
制限酵素技術を採用する。単離されたプラスミド,DNA配
列または合成オルゴヌクレオチドを所望の形に，切断
し，整え，そして再連結する。

ベクターを形成するDNA配列は，数多くの供給源から利
用し得る。もとになるベクターおよび制御系は，一般
に，構築の際に配列の大部分として用いられる，利用可
能な“宿主”ベクター上に見い出される。典型的な配列
は，上記の節C.1.に示されている。適切なコード配列に
対して，最初の構築は，通常,cDNAライブラリーまたは
ゲノムDNAライブラリーから適当な配列を回収すること
である。しかしながら，この配列が開示されれば，それ
ぞれのヌクレオチド誘導体から出発して，インビトロで
全遺伝子配列を合成し得る。例えば,500〜1000bpという
かなりの長さの遺伝子に体する全遺伝子配列は，それぞ
れに重複した相補オリゴヌクレオチドを合成し，そして
一本鎖の重複していない部分をデオキシリボヌクレオチ
ド３リン酸の存在下でDNAポリメラーゼを用いて充填す
ることにより，調製し得る。この方法は，配列が既知で
あるいくつかの遺伝子の構築において成功裏に用いられ
た。例えば,Edge,M.D.,Nature（1981）292:756;Nambai
r,K.P.ら,Science（1984）223:1299;Jay,Ernest,J Biol
Chem（1984）259:6311を参照されたい。

合成オリゴヌクレオチドは,EdgeらNature（前出）およ
びDuckworthらNucleic Acids Res（1981）９:1691によ
って記述されたようなホスホトリエステル法，あるいは
Beaucage,S.L.,およびCruthers,M.H.,Tet Letts（198
1）22:1859およびMatteucci,M.D.,およびCaruthers,M.
H.,J Am Chem Soc（1981）103:3185によって記述された
ようなホスホアミダイト法のいずれかによって調製され
る。また，この合成オリゴヌクレオチドは市販の自動オ
リゴヌクレオチド合成装置を用いて調製し得る。アニー
ニング前のリン酸化（kinasing）あるいはラベルのため
のリン酸化（kinasing）は,50mM Tris（pH7.6）,10mM M
gCl₂,5mMジチオスレイトール,1〜2mM ATP,1.7pmoleγ32
p−ATP（2.9mCi/mmole）,0.1mMスペルミジン,0.1mM EDT
Aの存在下で，過剰量，例えば約10単位のポリヌクレオ
チドキナーゼを用いることによって行われる。

所望のベクターの成分が利用可能な場合には，それらを
標準的な制限方法および連結方法を用いて切断し，そし
て連結し得る。

部位特異的なDNAの切断は，当該分野に既知の条件下
で，適当な１つの制限酵素（または複数の制限酵素）を
用いて処理することにより行われるが，特別なもので
は，これらの市販の制限酵素の生産者によって指定され
た条件下において行われる。例えば，ニューイングラン
ドバイオラボの製品カタログを参照されたい。一般に，
約１μｇのプラスミドまたはDNA配列を，約20μの緩
衝液中で,1単位の酵素によって切断する；実施例におい
ては，典型的には，過剰量の制限酵素を用いてDNA基質
を確実に完全分解する。変更することも可能であるが，
約37℃にて約１〜２時間にわたってインキュベーション
し得る。各インキュベーションの後，フェノール／クロ
ロホルムで抽出することにより，タンパクを除去する。
さらに，引き続いてエーテル抽出を行い得る。エタノー
ルを用いて沈澱させることにより，水層から核酸を回収
する。必要に応じて，標準的な技術を用いてポリアクリ
ルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動を行うこと
により，切断された断片を大きさによって分離し得る。
大きさによる分離に関する一般的な記述は,Methods in
Enzymology（1980）65:499−560に見い出される。

制限酵素で切断した断片は,4つのデオキシヌクレオチド
三リン酸（dNTP）の存在下で，大腸菌DNAポリメラーゼ
Ｉの大きな断片（クレノー（Klenow））で処理すること
によって平端な末端（blunt end）にすることが可能で
ある。インキュベーションは,50mMトリス（pH7.6）,50m
M NaCl,6mM MgCl₂,6mM DTTおよび0.1〜1mM dNTP中,20〜
25℃にて15〜25分間にわたって行う。クレノー断片は,
5′一本鎖の突出部分を充填するが，たとえ４つのdNTP
が存在しても，突出した３′一本鎖を元に戻す（chuw b
ack）。必要に応じて，突出部分の性質によって受ける
制限内で，唯一のdNTP,または選択されたdNTPを与える
ことにより，選択的に修復し得る。クレノー断片で処理
した後，混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し，
エタノール沈澱させる。適当な条件下で,S1ヌクレアー
ゼまたはBAL−31で処理することにより，どのような一
本鎖部分をも加水分解し得る。

連結は,15〜50μの容量で，以下の標準的な条件およ
び温度の下で行う：例えば,20mMトリス−Cl（pH7.5）,1
0mM MgCl₂,10mM DTT,33μg/ml BSA,10mM〜50mM NaCl,そ
して（“粘着末端”の連結に対しては）０℃にて40μM
ATP,0.01〜0.02（ワイス）単位のT4 DNAリガーゼ，ある
いは（“平端な末端”の連結に対しては）14℃にて1mM
ATP,0.3〜0.6（ワイス）単位のT4 DNAリガーゼ。分子間
の“粘着末端”の連結は，通常,33〜100μg/mlの全DNA
濃度（５〜100nMの全末端濃度）で行う。分子間の“平
端な末端”の連結は,1μＭの全末端濃度で行う。

“ベクター断片”を用いたベクターの構築においては,
5′リン酸を除去し，ベクターの自己連結を防ぐため，
一般にベクター断片を細菌アルカリホスファターゼ（BA
P）またはウシ腸アルカリホスファターゼ（CIP）で処理
する。分解は，約10mMトリス−HCl,1mM EDTA中,pH8にて
ベクター１μｇあたり，約１単位のBAPまたはCIPを60℃
にて，約１時間にわたって用いることによって行う。核
酸断片を回収するために，調製物をフェノール／クロロ
ホレムで抽出し，エタノールで沈澱させる。あるいは，
別の制限酵素で分解し，不要な断片を分離することによ
って二重に分解されているベクターにおいても再連結を
防止し得る。

配列の修正を必要とする,cDNAまたはゲノムDNA由来のベ
クター上の部分に対しては，部位特異的なプライマーに
よって導かれる突然変異誘発を用い得る（Zoller,M.J.,
およびSmith,M.Nucleic Acids Res（1982）10:6487−65
00およびAdelman,J.P.,et al,DNA（1983）２:183−19
3）。これは，突然変異させるべき一本鎖ファージDNAに
対して，限られた不一致以外は，相補的であって，所望
の変異を示す合成オリゴヌクレオチドのプライマーを用
いて行う。簡単に言えば，この合成ヌクレオチドをプラ
イマーとして用い，ファージに相補的なDNA鎖の合成を
導き，そして得られた部分的に，あるいは全体が二本鎖
のDNAを，ファージを補助する宿主細菌に形質転換させ
る。形質転換した細菌の培養液を上層寒天に注ぎ，ファ
ージを含む単一細胞からプラークを形成させる。

理論的には，新しいプラークの50％は，一本鎖として変
異型を有するファージを含み;50％はもとの配列を有す
る。得られたプラークをリン酸化した合成プライマーと
ハイブリダイゼーションさせた後，正確に一致するもの
は結合し得るが，もとのDNA鎖と一致しないものは結合
が阻止されるのに十分な，洗浄温度で洗浄する。次い
で，プローブとハイブリダイズするプラークを選択し，
培養し，そしてDNAを回収する。

C.4.構築の確認 以下に示した構築において，プラスミド構築に対する正
しい連結は，まずM.Casadaban博士から提供された大腸
菌株MC1061（Casadaban,M.,et al,J Mol Biol（1980）1
38:179−207）または他の適当な宿主をライゲーション
混合液で形質転換することによって確認する。好結果の
形質転換体は，アンピシリン耐性，テトラサイクリン耐
性または他の抗生物質耐性により選択するか，あるいは
当該分野に既知のプラスミド構築の方法に依存した他の
マーカーを用いて選択する。この形質転換由来のプラス
ミドは,Clewell,D.B.らProc Natl Acad Sci（USA）（19
69）62:1159の方法に従って，また任意にクロルアンフ
ェニコール増幅（Clewell,D.B.,J Bacteriol（1972）11
0:667）を行った後，調製される。いくつかの小規模のD
NA調製法が一般に用いられる（例えば,Holmes,D.S.,et
al,Anal Biochem（1981）114:193−197およびBirnboim,
H.C.,et al,Nucleic Acids Res（1979）７:1513−152
3）。単離されたDNAは，制限処理によって分析され，お
よび／またはSanger,F.らProc Natl Acad Sci（USA）
（1977）74:5463のジデオキシヌクレオチド法であっ
て，さらにMessingらNucleic Acids Res（1981）９:309
によって記述されているようなジデオキシヌクレオチド
法，あるいはMaxamら（Methods in Enzymology（1980）
65:499）の方法によって塩基配列を決定する。

C.5.例示される宿主 ここで，クローニングおよび原核生物の発現に用いた宿
主株は，以下のとおりである： クローニングおよび塩基配列の決定に対して，そしてほ
とんどの細菌のプロモーターの制御下における構築物の
発現に対して,Mc1061,DH1,RR1,C600hfl,K803,HB101,JA2
21およびJM101のような大腸菌株を用いた。

D.例示的な方法 以下の実施例は，本発明を例証することを意図したもの
であって，本発明を限定することを意図したものではな
い。図示したFGF配列をコードするDNAは，まずウシのゲ
ノムライブラリーをスクリーニングし，そして中枢プロ
ーブを得，次いで，付加的なDNAの修復を行うことによ
って得られる。しかしながら，中枢プローブの配列が，
現在，既知であり，従って、インビトロで科学的に構築
し得るので，この方法を繰り返す必要はない。さらに,4
つの図示した配列を保持するバクテリオファージは，ア
メリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されてい
る。

実施例１ 250/AluIプローブの構築；酸性bFGFゲノムDNAの調製 図示した酸性FGFタンパクに対する完全なコード配列を
得るために，ウシの250bp AluIゲノム断片をプローブと
して用いてヒトおよびウシの両方のライブラリーを調べ
た。250/AluIと呼ばれるこのプローブは，以下のように
して得た。

ウシの酸性FGFの残基１〜34に対するＮ末端アミノ酸配
列は既知である。コドンの選択性（Anderson,S.,et al,
Proc Natl Acad Sci（USA）（1983）80:6838−6842;Jay
e,M.ら,Nucleic Acids Res（1983）11:2325−2335）に
基づき，自動合成機およびホスホアミダイドカップリン
グ試薬を用いて,3つの長いプローブを調製した。このヌ
クレオチドプローブの配列を第５図に示す。プローブ89
1は，アミノ酸１−16に対応する48−merである；プロー
ブ889および890は，アミノ酸18−34に対応する51−mer
であり,24位のアルギニンに対するコドンを除いて等し
い２つのオリゴヌクレオチドの50:50混合物として用い
た。これらのプローブは，部分的なMboI分解物として調
製し,BamHIで処理したファージベクター，シャロン28
（Woychik,R.F.,et al,Nucleic Acids Res（1982）10:7
197−7210）にクローニングした。これらのプローブは,
Fritz Rottman博士（ケースウェスターンリザーブ）か
ら提供されたウシのゲノムライブラリーをスクリーニン
グするのに用いた。

ハイブリダイゼーションは,Ullrich,A.らEMBO J（198
4）３:361−364によって述べられた方法の変法を用い，
フィルター上に複製された変性DNAに関して行った；そ
して洗浄条件は,Wood,W.I.らNature（1984）312:330−3
37の洗浄条件に従った。プレハイブリダイゼーション／
ハイブリダイゼーション緩衝液には,20％ホルムアミド,
5×デンハート溶液（100×デンハート溶液は,2％ウシ血
清アルブミン,2％ポリビニルピロリドン,2％フィコルに
等しい）;6×SSC（20×SSCは,3M NaCl,0.3Mクエン酸ナ
トリウムに等しい）;50mMリン酸ナトリウム（pH6.8）;1
00μg/mlニシン精子DNAが含まれていた；ハイブリダイ
ゼーション緩衝液には，さらに10％デキストラン硫酸お
よび約10⁵〜10⁶cpm/mlのリン酸化されたプローブ891ま
たは889/890が含まれていた。プレハイブリダイゼーシ
ョンおよびハイブリダイゼーションは,42℃にてそれぞ
れ１時間および16時間にわたって行った。次いで，フィ
ルターを１×SSC,0.1％SDSで22℃にて15分間,2度洗浄
し，その後１×SSC,0.1％SDS中で55℃にて10分間,1度洗
浄した。洗浄後，これらのフィルターは，増感紙を用い
て１日，感光した。

スクリーニングされたウシのゲノムライブラリーには，
両方のプローブにハイブリダイズした10⁶個の組換え体
の中,50個のファージが含まれていた。これらの50個の
ファージは，さらにプローブ853−856の混合物でスクリ
ーニングされた。このスクリーニングにおいて，プレハ
イブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション緩衝液
には,6×SSC,1×デンハート溶液,0.1％SDS,0.05％ピロ
リン酸ナトリウムおよび100μg/mlサケ精子DNAが含まれ
ていた；ハイブリダイゼーション緩衝液には，さらに10
⁵〜10⁶cpm/mlのプローブが含まれていた。プローブ853
−856は,16の配列からなる４つのプールであって,64個
（全体）の17−merの各々はアミノ酸７−12に対応して
おり，ホスホトリエステル法を用いて合成される。しか
しながら,50個のクローンのうち46個は，より短いプロ
ーブにさらにハイブリダイズさせた。このハイブリダイ
ゼーションは,65℃から35℃の間で16時間にわたって行
った。そして50℃にてテトラメチルアンモニウムクロリ
ドを用いる，塩基組成に依存しない洗浄法を採用した
（Wood,W.I.,Proc Natl Acad Sci（USA）（1985）82:15
85−1588）。

確実にハイブリダイズする２つのファージ（λBA2およ
びλBA3）を選択し，ファージ挿入部分の制限地図を第
６図に示されているように作製し，そして第１図ａに示
されるように部分的に配列決定した。この推定されたア
ミノ酸配列を，天然のウシの酸性FGFタンパクのＮ末端3
4残基に対して公表されているアミノ酸配列と比較した
ところ，これらのクローンは正確であった。コード配列
の性質から，アミノ酸残基１−41（第１図ａに示されて
いる）は，これらのクローンにコードさていることは明
らかである；直後のヌクレオチドは，イントロンを表し
ているようである。このイントロンの長さは，現在のと
ころ，明らかではないが，完全な酸性bFGFコード配列
は，これらのλBA2およびλBA3 DNA上に存在し得る。し
かしながら，このタンパクに対する完全なコード配列を
得るために必要な他のDNAは，“ウォーキング（walkin
g）”技術にλBA2またはλBA3を用いて，同一の遺伝子
ライブラリーから得ることが可能である。Ｎ末端残基よ
り上流側のコドンは，指摘された15アミノ酸のプロ配列
または，先に考察したような単離された“基本”型に比
較して,N末端において15個のアミノ酸（Ｎ末端のメチオ
ニンが開裂する場合は,14個のアミノ酸）だけ伸長した
天然のタンパクの“長”型をコードすると考えられてい
る。

250/AluIプローブを調製するために，λBA2をAluIで部
分的に分解し,M13へのショットガンクローニングを行っ
た（Messing,J.,et al,Gene（1982）19:269−276）。M1
3プラークをプローブ853−856および889/890と２通りに
ハイブリダイズさせた。両方のプローブにハイブリダイ
ズするファージの配列を決定した。得られた250bp AluI
プローブは，対応する推定アミノ酸配列とともに第７図
に示す；第６図のλBA2およびλBA3の挿入部分の位置
は，プローブ889/890および891の部位と一致する。250/
AluIプローブは，酸性bFGFタンパクのＮ末端部分と一致
する。

実施例２ 酸性bFGF cDNAの回収 酸性bFGFをコードするcDNA配列を回収するために250/Al
uIプローブを用いる。Huynh,V.T.,らDNAクローニング技
術：実用の手引き（IRLプレス，オックスフォード,198
4）のλgt10ベクターを用いてウシの脳下垂体，脳また
は視床下部のmRNAからcDNAライブラリーが得られる。得
られハイブリダイジングクローンにより，酸性bFGFをコ
ードする全配列を回収する。他の哺乳類由来の類似mRNA
を用いて構築された同様のcDNAライブラリーを,250/Alu
Iプローブを用いて調べて，例えば，ラット，ヒツジ，
ウシ，ネコ，イヌ，ウマまたはブタの塩基性FGFが得ら
れる。

実施例３ 酸性hFGFゲノムDNAの調製 Charon4A（Lawn,R.M.,et al,Cell（1978）15:1157−117
4）のヒト胎児の肝臓のゲノムライブラリーをヒトの配
列の起源として用いた。ニックトランスレーションした
250/AluIプローブを用いてこのライブラリーを調べた。
プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション
の条件は,40％ホルムアミドを用いること以外は実施例
１のプローブ889/890および891に対する条件と同一であ
った。ハイブリダイゼーションは,42℃にて16時間にわ
たって行った。次いで，フィルターを室温にて１×SSC,
0.1％SDSで洗浄し，そしてさらに同じ緩衝液で50℃にて
15分間,2度洗浄した。確実にハイブリダイズしたクロー
ンを培養したところ，λHAG−9.1と呼ばれるものは，所
望の酸性hFGF配列を含んでいた。このクローンの部分的
な制限地図を第８図に示す；ヌクレオチドおよびアミノ
酸配列に関する情報は，第２図ａに示す。アミノ酸１−
41をコードするヌクレオチド配列を同定し得る；この配
列には，ゲノム酸性bFGFにおけるように，イントロンが
続いていた。酸性hFGFおよび酸性bFGFのアミノ酸配列
は,5位,21位および35位において異なっている。

ヒトの酸性FGFをコードするDNAは，これに対応する単離
されたウシのタンパクのＮ末端の上流に，さらに15個の
コドンを含んでいる。これらのコドンは，ウシのタンパ
クのＮ末端の延長部分と高い相同性を有するアミノ酸配
列をコードする。この翻訳配列は，第２図ａの括弧内に
示されている。ウシのDNAと比較すると，−３位，−６
位，−９位および−12位のコドンにはヌクレオチド置換
が存在するが，翻訳されたタンパクは存在しない。−10
位のコドンにおけるヌクレオチド置換によって，ウシの
タンパクのThr残基はヒトのタンパクではIle残基とな
る。ウシの酸性FGFと同様に，このＮ末端延長部分は，
プロ配列または単離された“基本”型タンパクの“長”
型を表し得るが，このいずれかはメチオニンの開裂に依
存して,14もしくは15のアミノ酸のＮ末端延長部分を含
んでいる。

ヒトの酸性FGFをコードするゲノムDNAのエキソンであっ
て，中間エキソン，およびＣ末端をコードするエキソン
に対応するヌクレオチド配列を含むλファージクローン
も得た。上述のλHAG−9.1とともに，これらのファージ
は完全なタンパクコード配列を与える。

Wyman,A.R.らProc Acad Natl Sci（USA）（1985）82:28
80−2884によって述べられているように調製したヒトの
ゲノムライブラリーから中間エキソンを有するファージ
を得た。これは，ヒトのゲノムをSau3AIで部分分解し，
得られた断片をλシャロン30ファージのポリリンカー領
域のBamHI部位へ挿入することによって調製されるライ
ブラリーである。この挿入部分は，容易に除去され得る
ので，ライブラリー中の２つのEcoRI制限部位の間に位
置している。

このゲノムライブラリーは,2つのオリゴヌクレオチドを
プローブとして調べられた。これらのオリゴヌクレオチ
ドは，次の実施例４に記述され，第９図に示されている
ようにヒトの合成酸性FGF遺伝子を構築するために用い
られていた。この図で“3"および“4"と示されたオリゴ
ヌクレオチドが，プローブとして用いられたものであ
る。λHG−３と呼ばれる，回収されたファージのコード
領域を第２図ｂに示すこのコード配列は,Jaye配列のア
ミノ酸42−48をコードするが，塩基性FGFタンパクをコ
ードする遺伝子のエキソン／イントロン境界に対応して
いる。

同様に，第３のエキソンは，上述のように調製されたシ
ャロン−4AにおけるLawn,ら（前出）のマニアチス（Man
iatis）のヒトゲノムライブラリーから得られた。そし
て，第９図に示されている合成遺伝子の“6"および“7"
をラベルしたオリゴヌクレオチドをプローブとして，こ
の第３のエキソンを調べた。λHAG−３と呼ばれる，回
収されたλファージクローンは，部分的に配列決定され
ており，その結果を第２図ｃに示す。この配列情報か
ら，λHAG−３挿入部分中にＣ末端エキソン配列の存在
することが確かめられる。

前述の３つの挿入部分は，再結合させることにより完全
なヒトの酸性FGFゲノム配列を再構築し得るが，これはE
coRIによって各ファージを切断してこの挿入断片を取り
出し，そして得られた断片を連結して遺伝子を再構築す
ることによってなし得る。このゲノム配列を用いれば，
以下の実施例７においてcDNA配列について述べた方法に
類似した方法により，発現ベクターを構築し得る。特
に，この再構築された遺伝子は，合成型−酸性hFGF Nco
I（平端（blunt））/Hind IIII（平端（blunt））につ
いて述べた方法と同様の方法により,EcoRI（平端（blun
t））断片として挿入し得る。

実施例４ 酸性hFGFコード配列の調製 ヒトの脳下垂体，胸部癌腫，脳，脳幹,SK−HEP−１また
は視床下部のmRNAから，実施例２においてウシのmRNAに
対して述べたようなHuynhの方法によって調製されたcDN
Aライブラリーを，実施例３において述べた条件下で250
/AluIをプローブとして用いて調べ，酸性hFGFをコード
するcDNAを得る。第１のエキソンを含むスプライシング
されていないcDNAは，胸部癌腫のライブラリーから得ら
れた。

別の方法として,Jaye,M.らScience（1986），印刷中，
によって得られたcDNA配列の情報（第２図ｄ参照）を酸
性hFGFをコードする遺伝子の合成のガイドとして用い
た。Jayeらによって報告されたcDNAクローンは，ヒトの
脳幹由来のメッセンジャーRNAを用いて得られ，酸性hFG
Fをコードするが，この酸性hFGFの推定されるアミノ酸
配列は第２図ｂに示されている。

実施例３において述べたゲノムλHAG−9.1クローンを用
いて遺伝子の５′部を得た。この部分を調製するため
に,1.9kb BamHI断片をλHag−9.1から単離し，そしてpU
C13中へサブクローニングしてpCBI−101を得た。次い
で，この中間体プラスミドをNcoI/BamHIで切断し，そし
て成熟“基本”型の酸性hFGFの最初の25個のアミノ酸と
ともに，プロ配列の15個のアミノ酸に対するコドンを含
む118bp断片を５％ポリアクリルアミドゲルを用いて単
離した。主配列の開始点から−15のアミノ酸において開
始コドンを形成していると考えられるATGを含むNcoI部
位の位置は，第９図に示されている。この図は合成遺伝
子を図示したものである。

コード配列の残りの部分は，第９図における１〜20番の
合成オリゴヌクレオチドを用いて合成された。各オリゴ
ヌクレオチドの合成は，簡便な自動化技法を用いて行
う。オリゴヌクレオチドは,Jayeら（上記）によって報
告されたものと２つの例外を除いて同一のヌクレオチド
配列を与えるように設計した：オリゴヌクレオチド４お
よび14は，星印によって示されるように，コドン66のア
ラニンをコードするGCCをGCTに変更することによって，
コドン67まで拡がってNcoI部位をこわすように構築し
た；さらに，オリゴヌクレオチド19および20は,TGA終結
コドンに続くHind IIIおよびEcoRI切断部位を付加する
ように修飾した。前記の変化は，いずれもコードされた
アミノ酸配列に影響を与えない。

標準反応条件を用いて５μｇの各オリゴヌクレオチド
（＃１および＃20を除く）をリン酸化し,10個の異なる
相補的オリゴヌクレオチド対（１＋11,2＋11,など）を
アニーリングし，次いで10個のオリゴヌクレオチド対を
３つの断片に連結することによって，合成オリゴヌクレ
オチドを連結し，第９図に示される配列を得た。これら
の断片は，標準条件下でT4リガーゼを用いて連続的に形
成される。断片Ａを得るために，対1/11を対2/12と連結
し，次いで対3/13と連結し，さらに対4/14と連結させ
る。断片Ｂは，対5/15を対6/16と連結し，次いで対7/17
に連結させることによって形成する。断片Ｃは，対8/18
を対9/19と連結し，次いでこの生成物を対10/20と連結
させることによって得られる。３つの連結した副断片
（Ａ＝144bp,B＝108bpおよびＣ＝106bp）は，ゲル電気
泳動を用いて精製し，次いで標準条件下でT4リガーゼを
用いてＢおよびＣを混合することによって連続的に連結
し，その後Ａを添加する。最終反応液は，フェノールで
抽出し，エタノールで沈澱させる。エタノール沈澱物
は,5％アクリルアミドゲルで電気泳動し,358bp断片Ａ＋
Ｂ＋Ｃを溶出させる。この断片は，第９図に示されるよ
うに,BamHI/EcoRI部位に及んでおり，そしてその配列
は，この断片をM13mp19中へサブクローニングすること
によって，ジデオキシ配列決定法を用いて，確かめられ
る。

コード配列を完成させるために，合成358bp BamHI/EcoR
I断片をファージまたはポリアクリルアミドゲルから単
離し，その末端を必要に応じてリン酸化し，そしてpCBI
−101由来の118bp NcoI/BamHI断片に連結する。酸性hFG
Fをコードする，得られた部分合成ヌクレオチド配列を
第９図に示し，そして合成型−酸性hFGFと名付ける。

もちろん，酸性FGFの“基本”型および“短”型が,ATG
開始コドンから始まり，そして最適な制限部位を含む，
付加的な構築物をも構築し得る。

実施例５ 塩基性bFGFのゲノムおよびcDNAクローンの回収 次いで250/AluIプローブを用いて，対応する塩基性bFGF
配列を得るために適当なプローブを設計した。Esch,F.,
ら（前出）が見出した，酸性bFGFのアミノ酸４−29が塩
基性bFGF配列のアミノ酸13−38と整列しているという利
点が得られた。プローブは，塩基性bFGFの残基18−36お
よび酸性bFGFの残基９−27に基づいて設計したが，どち
らの領域も19アミノ酸残基のうち14個が相同的である。

プローブ1097および1098は，この領域をコードするよう
に設計されている40−merであり，自動合成装置で，ホ
スホアミダイト法を用いて調製した。これらのプローブ
は第10図に示されている；それらは塩基性配列のアミノ
酸23−31の領域で重複している。これらのプローブを設
計する際,250/AluI配列を用いたが，そのアミノ酸配列
は同一であった。またコードされた配列においては，必
要な変化を与えるための最小限のヌクレオチドの相違が
含まれていた。

実施例２において述べたようなHuynh,V.T.の方法により
得られたウシの脳下垂体cDNAライブラリーをプローブ10
98でスクリーニングした。ハイブリダイゼーションに対
する適切な条件は，サザンブロットにゲノムDNA（実施
例１）を用いて次のように決定した。

もちろん，プローブ1097および1098は，それほど厳しく
ない条件の下で酸性FGFをコードするDNAとクロスハイブ
リダイゼーションし得ることが期待された。サザンブロ
ット分析を行ったところ,55℃の洗浄温度でプローブ109
7および1098にハイブリダイゼーションする酸性bFGFを
コードすることが知られているゲノムの配列は,65℃で
はハイブリダイゼーションできなかった（プレハイブリ
ダイゼーション／ハイブリダイゼーション緩衝液および
条件は，実施例１におけるプローブ889/890および891に
対するものと同様であった）。従って,65℃という洗浄
温度を選んだ。この温度では,EcoRI分解物における10kb
断片およびPstI分解物における3.4kb断片がプローブ109
7および1098にハイブリダイゼーションした。

cDNAライブラリーを65℃の洗浄温度を用いて上述のよう
にプローブで調べたところ,NcoIリンカーを有する2.1kb
cDNAを表す，λBB2と名付けられた単一クローンが回収
された。このファージの制限地図を第11図に示す。λBB
2における挿入部分の副断片を，配列決定を行うためにM
13に移した。1.4kbEcoRI分解副断片は，ウシの塩基性FG
Fの（完全な“一次”配列の）アミノ酸１−146をコード
することがわかった。Ｎ末端コドンより上流側の配列
は,9アミノ酸のプロ配列あるいは活性を保持してる天然
のタンパクのＮ末端伸長“長”型のいずれかをコードす
ると考えられている。Ｎ末端の伸長部分は，単に８つの
残基しか含み得ないが，これはもちろんメチオニンが翻
訳後のプロセッシング中に切断されるかどうかに依存し
ている。塩基性bFGFをコードするこの副断片の部分は，
第３図に示されている；位置１を始まりとするアミノ酸
の番号付けは，単離された“一次”タンパクのＮ末端に
対応している。上流側の９コドンは，括弧内に翻訳され
ている。この伸長部分が天然の活性タンパクの必須部分
を表している可能性は，肝細胞から調製されたヒトの塩
基性FGFの，より分子量が大きな型によって示唆されて
いる（Klagsbrun,et al,Proc Natl Acad Sci（前
出））。

次いで1.4kbの副断片をニックトランスレーションし，
そして塩基性bFGFゲノム配列に対する実施例１の方法と
同様に，構築されたウシのゲノムライブラリーのスクリ
ーニングに用いた。

1.4kbの塩基性bFGFをコードするcDNA断片は，ラット，
ブタ，あるいはウシ，ネコ，イヌ，ウマあるいはネズミ
を起源とするような，別の哺乳類のcDNAライブラリーを
プローブで調べ，上記の種の配列であって，塩基性bFGF
をコードする配列を得るためにも用いられる。

実施例６ ヒトの塩基性FGFのゲノムクローンおよびcDNAクローン
の調製 ヒトの腎臓のmRNAから調製されたλgt10cDNAライブラリ
ーを，ウシの1.4kb塩基性副断片を用いて調べた。プレ
ハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション緩衝
液には,40％ホルムアミド,5mMリン酸ナトリウム（pH6.
5）,5×デンハート溶液,5×SSC,および50μg/mlニシン
精子DNAが含まれていた；ハイブリダイゼーション緩衝
液には，さらに,10％硫酸デキストランおよび10⁴〜10⁵c
pm/mlのプローブが含まれていた。３つのクローンを単
離し，そして特徴を調べるために１つを選択した。この
クローンは，λKB7と呼ばれ，約1.4kb EcoRI断片を含
んでいた。この断片を部分的に配列決定したところ，推
定のアミノ酸配列とともに，第４図に示したデータが得
られた。配列決定されたコード領域によって，図中に示
したアミノ酸１−50が推定された；下流側に直ちに続く
配列は，スプライシングされていないmRNAのcDNAコピー
を表しているようであり，このことはイントロンが，塩
基性FGF遺伝子において，ウシおよびヒトの酸性FGF遺伝
子におけるアミノ酸41の後のイントロンに対して相同的
な位置に存在することを示している。λKB7クローン
も，示した長型の９アミノ酸のＮ末端の伸長部分をコー
ドする上流側のDNAを与える。

付加的なゲノムライブラリーおよびcDNAライブラリー
を，上述のヒトの腎臓のλgt10ライブラリーに対して用
いた条件と正確に同じハイブリダイゼーション条件下
で,1.4kb塩基性bFGFをコードする同じ断片を用いてスク
リーニングした。さらに４つのクローンを得たが，それ
らの間では，第４図に示すような単離された塩基性bFGF
に対応する完全な146アミノ酸のタンパクをコードす
る。上述のλKB7に含まれている９つの上流側のコドン
は，ウシの塩基性FGFクローンにおいて翻訳された上流
側のコドンと完全に相同的な配列へ翻訳するが，コドン
−８には発現しないヌクレオチド置換がある。この翻訳
されたＮ末端の伸長部分を第４図の括弧内に示す；そし
てこの伸長部分は，上述のように,N末端の伸長した活性
タンパクのプロ配列または付加的なアミノ酸を表し得
る。

より詳細には,Lawn,R.M.ら（前出）によって記述された
ように調製した，λシャロン4Aにおけるヒトのゲノムラ
イブラリーに由来する２つの確実にハイブリダイゼーシ
ョンするクローンをλMG4およびλMG10と名付けた。λM
G4は，アミノ酸（−９）−51をコードし；λMG10は，ア
ミノ酸86−146をコードする。このことは,3つのエキソ
ンのうち第３のエキソンが遺伝子の成熟型タンパクをコ
ードする領域内に含まれることを示している。（エキソ
ン／イントロン境界の位置は，ウシの配列との相同性に
よって決定した。）E.Fritschから得た，λシャロン28
における少し異なったゲノムライブラリーは，第２の成
熟型タンパクのエキソンを含み，アミノ酸51−85をコー
ドするλHT1を与えた。最終的には，上述のようにλgt1
0で調製したヒト胎児の肝臓のライブラリーから得られ
たcDNAクローン，すなわちλHFL1は，アミノ酸56−146
をコードする。そしてこのことから関連のあるイントロ
ン／エキソン接合点の位置が確認される。

塩基性bFGFおよびhFGFは２つのアミノ酸が相違している
だけである。位置112においてウシのタンパクがセリン
を有するのに対し，ヒトのタンパクはスレオニンを有す
る。また位置128においては，ウシのタンパクがプロリ
ンを有するのに対し，ヒトのタンパクはセリンを有す
る。これらの相違は，各々の場合の単一のヌクレオチド
の相違によるものである；従って，ウシのcDNAを以下に
述べるように突然変異を導く部位により，便宜的に修飾
してヒトのタンパクをコードし得るが，実際には，標準
的な部位特異的変異技法を用いてこれらのコドンを変更
した。実施例５のλBB2クローンをEcoRIで分解し，そし
てbFGFタンパクをコードする部分にまで及ぶ1.4kbの領
域をM13mp8のEcoRI部位に連結した。インビトロ変異を
３つのオリゴヌクレオチドの存在下で実施した：“共
通”プライマー,17−mer;変異16−mer,5′−GAAATACACC
AGTTGG−３′，これはコドン112のコード配列を変更す
る；そして，変異17−mer,5′−ACTTGGATCCAAAACAG−
３′，これはコドン128の配列を変更する。変異させた
ファージは，さらにインビトロでプライマーによって導
かれる変異を２度行い，変異25−mer,5′−TTTTACATGAA
GCTTTATATTTCAG−３′を用いて翻訳終結コドンより34bp
下流側にHind III部位を創造した。得られた変異DNA
は，ジデオキシ配列決定法により配列決定を行い，所望
の変異が生じたことを確認した。そして,FGFコード領域
に及ぶ約630bpの断片をHind IIIで切断し，そしてpUC13
へ連結して中間体プラスミドpJJ15−１を得た。

もちろん，塩基性FGFの３つの既知のＮ末端修飾体のう
ちのいずれをもコードするコード領域の修飾型は，やは
り標準的合成技術を用いることによって調製し得る。

実施例７ 発現ベクターの構築および哺乳動物細胞中でのFGFの安
定な発現 FGFをコードするcDNAクローンは，上のC.1節で述べたよ
うに，種々の宿主中で組換えタンパクを生産するため
に，最も都合よく用いられる。しかし，哺乳動物系での
発現は，その宿主が，本来生産されるタンパクで見られ
るプロセッシングに類似した翻訳後プロセッシングを行
い得る場合，およびcDNA配列あるいはゲノム配列のいず
れの配列を用いたとしても，宿主がイントロンのプロセ
ッシングをも行い得る場合には，有利である。

それゆえ，全長cDNAあるいはゲノムFGFをコードするク
ローンは，以下に述べる宿主ベクターにより例示される
ような（しかしこれに限定されないが）宿主ベクターに
挿入するために，調製される。

このベクターを構築するために，このクローン化された
FGFをコードする挿入断片は,EcoRIで（挿入断片自体がE
coRI部位を含むなら，部分分解による）切断されるか，
または他の適当な酵素で切断され,EcoRIリンカーまたは
必要であれば他の適当なリンカーが付けられる。そして
この挿入断片は，次いで,pHS1や，以下に記述のような
その誘導体といった適当な宿主ベクターに挿入される。

宿主ベクターの構築 pHS1 このプラスミドpHS1は，哺乳動物宿主中での挿入DNAの
発現に適している。このプラスミドは,p84H（Karin,M.,
et al,Nature（1982）299:297−802）からの840bpのhMT
−II配列を含む。この配列は,hMT−II遺伝子の−765の
位置のHind III部位から，＋70のBamHI開裂部位にわた
っている。pHS1を構築するために，プラスミドp84HをBa
mHIで完全なまでに分解し，末端のヌクレオチドを除去
するべくエキソヌクレアーゼBAL−31で処理し，次いでH
ind IIIで分解した。所望の840bp断片をpUC8（Vieira,
J.,et al,Gene（1982）19:259−268）に連結した。この
pUC8はHind IIIおよびHinc IIの分解により，開いてい
る。この連結混合物は，大腸菌HB101をAmp^Rに形質転換
するために用いられた。pHS1と名付けられた１つの候補
プラスミドは単離され，ダイデオキシ配列法により，配
列決定された。pHS1は，好都合な制限部位を含むポリリ
ンカーの上流側に,hMT−II制御配列を含む。

使用可能な宿主プラスミドpHS1は，メタロチオネインプ
ロモーターのほかに，付加的な制御要素を含有させて，
さらに改変され得る。特に,SV40のようなウイルス系の
エンハンサー要素だけでなく,hGHのような他のタンパク
の３′非翻訳領域に結合した終結シグナルも包含され得
る。

ウイルスエンハンサー MT−IIプロモーターに動作可能に連結された状態にある
SV40エンハンサーを含む一対の宿主発現ベクターは,pHS
1のMT−IIプロモーター配列の前方にあるHind III部位
に,1120bpのSV40 DNA断片を挿入することにより，構築
された。このSV40 DNA断片は,SV40の複製起点まで及び,
5171番目のヌクレオチドから5243番目のヌクレオチド
（起点）と,107−250番目のヌクレオチドの72bp反復構
造とを含んでおり，そして後期ウイルスmRNAの５′未満
を含む起点側の1046番目のヌクレオチドにまで至る。こ
の1120bpからなるHind III断片は,SV40 DNA（Buchman,
A.R.,et al,DNA Tumor Viruses,2d ed（J.Tooze,ed.）,
Cold Spring Harbor Laboratory,New York（1981）,pp.
799−841）のHind IIIによる分解から得られ，増幅のた
めにpBR322にクローン可される。このクローニングベク
ターをHind IIIで切断し，そしてこの1120bpのSV40 DNA
断片をゲル電気泳動法により単離し，そしてpHS1（これ
はHind IIIにより分解し,CIP処理した）に連結した。得
られたベクター（これは,pHS1−SV（９）およびpHS1−S
V（10）と名付けられた）は，それぞれ反対方向に,MT−
IIプロモーターを生じる断片を含む。pHS1−SV（９）で
は，エンハンサーは,5′mRNAの転写開始部位から約1600
bpのところにあり，また反対方向には，このエンハンサ
ーは,5′mRNAの転写開始部位からは，およそ980bpのと
ころにある。両方向とも動作可能であるが，エンハンサ
ー配列が転写開始部位に近い方向では，より高いレベル
の発現を示す。転写開始部位の250−400bp上流側にエン
ハンサーを置くことを避けることは，最適であると考え
られている。

さらに,MTプロモーターのTATAボックスの５′−末端か
ら上流側に，それぞれ,190bp,250bpおよび360bpに,SV40
エンハンサーの３′末端を置いたベクターが構築され
た。この構築は，ヒトMTプロモーター上流側の制御領域
の地図化に基づいてなされた。このことは,Karin,M.,
ら,Nature（1984）308:513−519に記述されている。全
ての構築物は，重金属による制御のための反復部位を含
む配列を保持している。しかし,190bpと250bpとに分離
した構築物は，これらの部位からさらに上流側にあるグ
ルココルチコイドによる制御のための配列を保持してい
ない。

これらのベクター（これは,pHS′−SV190,pHS′−SV250
およびpHS′−SV360と名付けられた）は，以下のように
調製される：全ての構築物は，メタロチオネインプロモ
ーターおよび上流領域を含む配列の長さ以外は一致して
いる。このプロモーターおよび上流領域は,pHS1から切
断された断片として供される。

pHS′−SV190に対し,pHS1がSac IIで分解され，平滑化
され，そしてKpnIリンカーに連結される。次いで，この
DNAは,MT−II制御配列の適当な部分を遊離させるため
に,EcoRIおよびKpnIで分解される。同様に,pHS′−SV25
0では,pHS1がHgaIで分解され，平滑化され,KpnIリンカ
ーに連結された後,EcoRIおよびKpnIで分解される。pH
S′−SV360に対して，最初の分解においてDdeIが用いら
れる。

このSV40エンハンサーを含む中間ベクターは,SV40のHin
d III/KpnI断片（これは,5171番目の位置から294番目の
位置にまで及んでおり，また,KpnI部位から50bpのとこ
ろにエンハンサー要素を含んでいる）を,KpnI/Hind III
で分解されたpUC−SVに挿入することにより調製され,pU
C−SVが得られる。（pUC19は，ポリリンカー領域に，順
番にHind III,KpnIおよびEcoRIの３つの好都合な制限部
位を含む）。この完成したベクターは，上で記述のよう
に調製されるKpnI/EcoRI断片を,KpnI/EcoRIで分解され
たpUC−SVに挿入することにより，得られる。

それゆえ，先に改変された全てのベクターは,SV40のエ
ンハンサー要素を利用している。もちろん，他のウイル
スのエンハンサーであれば，同様の方法で用いられるだ
ろう。

転写終結配列 転写終結制御配列を供与するために，このコード配列，
およびヒト成長ホルモンの３′非翻訳配列を表すDNAをp
HS1に連結した。この中間ベクターは,hGHコード配列に
代えてこのベクターに続けて連結されたコード配列に対
し,hGH3′非翻訳配列を供与し得る。

このゲノム配列をコードするhGHを,BamHIおよびEcoRIで
分解し，続いてポリアクリルアミドゲル精製することに
より,p2.6−３（DeNoto,et al,Nucleic Acids Res（198
1）19:3719）から単離した。このBamHIは最初のエキソ
ンの５′末端で切断する。EcoRIは機能遺伝子の３′位
で切断する。この単離された断片を,BamHI/EcoRIで分解
されたpHS1に連結した。この連結混合物を大腸菌MC1061
のAmp^Rに形質転換した。成功した形質転換は，制限分析
により選抜し，所望のプラスミドpMT−hGHgを含む株を
さらに増殖させて，多量のプラスミドDNAを調製した。

pHS1−SV（９）またはpHS1−SV（10）を構築するためで
はあるが,pHS1を代用するために，先に記述の方法と同
様の方法で,MTプロモーターの制御下にあるhGH遺伝子を
含み,SV40エンハンサーと動作可能に連結され，そして
それぞれ,pHGHg−SV（９）およびphGHg−SV（10）と名
付けられた一対のベクター（pMT−hGHg）を得た。その
連結混合物は大腸菌1061をAmp^Rに形質転換するために用
いられた。そして適切な構造が確認された。

発現ベクターの構築 次いで，合成の酸性hFGFに適応する宿主ベクターとし
て,phGHg−SV（10）を用いた。phGHg−SV（10）をBamHI
およびSmaIで分解し，クレノーで平滑化し，そしてhGH
コード配列を切断するためにCIPで処理した。この開か
れたベクターをNcoI（平滑末端）/EcoRI（平滑末端）合
成の酸性hFGF断片に連結し，所望の発現ベクターpahFGF
−SV（10）を得た。ここで，合成の酸性hFGF断片のNcoI
部位は再生されている。

同様に，上で記述の残留FGFをコードする断片をphGHg−
SV（10）に連結して，ウイルスエンハンサー,MT−IIプ
ロモーターおよびhGH3′非翻訳領域の制御下にて，これ
らのコード配列を含む類似ベクターを調製する。例え
ば，実施例６のpJJ15−１からの500bpまでのNcoI（平滑
末端）/Hind III（平滑末端）断片を,BamHI（平滑末
端）/SmaIで分解したphGH−SV（10）にうまく挿入して,
pJJ16−２を得る。

さらに,pHS1,および上で記述のような,SVエンハンサー
の種々の配置を含むべく改変されたpHS1を包含するこれ
らの配列の発現を得るために，他の宿主ベクターが用い
られてもよい。挿入は，この宿主ベクターのBamHI/EcoR
I分解を用いての，類似の方法による。また，酸性また
は塩基性FGFの“長い”形態，“基本の”形態あるいは
“短い”形態のいずれをもコードするべく改変されたDN
Aも用いられ得る。

これらのベクターは，以下で論じる目的のために，一般
的にpMT−FGFと呼ばれる。

哺乳動物の組換え体によるFGFの生産 チャイニーズハムスター卵巣（CHO）−K1細胞を,F12培
地およびDME培地の1:1混合物から構成される培地上で,1
2％ウシ胎児血清とともに生長させた。このコンピテン
ト細胞は,pMT−FGFおよびpSV2:NEO（Southern,P.,et a
l,J Mol Appl Genet（1982）１:327−341）で共形質転
換した。pSV2:NEOは，ネオマイシン類似体G418に耐性を
与える機能遺伝子を含む。この形質転換では,500ngのpS
V2−NEOおよび５μｇのpMT−FGFを,Wigler,M.,ら,Cell
（1979）16:777−785,のプロトコルに従って，リン酸カ
ルシウム−DNA共沈澱物中で,16mmディシュの細胞に適用
した。それとともに，これらをDNAに４時間さらした後,
15％グリセロールで２分間“ショック”を加えた。１日
後,G418耐性コロニーのプールを与えるために，この細
胞を1mg/mlのG418にさらした。これらの耐性コロニーは
FGF生産のために分析され，次いでクローン化され得
る。

成功した形質転換体（これらはまたpMT−FGFの安定な遺
伝形質を有する）を，クローン単離体の精製のため，低
密度でプレート上にまく。これらの単離体の少量を,FGF
生産をうまく分析するために,10^-4Mの塩化亜鉛にさらし
た後，多孔プレート上で生長させる。FGFの定量は通常
の方法を用いて，適当なFGFタンパクに対し調製される
抗血清に対して，標準的なELISAまたはラジオイムノア
ッセイにより行われる。所望のFGFを大量に生産するク
ローン分離体が選抜される。

適当な条件下にてFGFを生産するべく示される細胞を,10
％のウシ胎児血清で補足された基本培地に1/10集密度で
まき，一夜インキュベートし，次いで,1×10^-4M〜３×1
0^-4Mの濃度範囲の塩化亜鉛を加えることにより,FGFの生
産を誘導する。２×10^-4M ZnCl₂の最適の誘導条件下で,
7〜10日間にわたりFGFのレベルが上昇する。

特定の実験では，実施例６のpJJ15−１に由来のヒト塩
基性FGFをコードする約500bpのNcoI（平滑末端）/Hind
III（平滑末端）断片を含む。pMT−FGFを用いて,CHO細
胞が形質転換された。上に記述のように,pMT−FGFのこ
の特別な形（上ではpJJ16−２と名付けた）を得るため
に，この断片をBamHI（平滑末端）/SmaIで分解されたph
GH−SV（10）に挿入した。このベクター（pSV−neoおよ
びpHS1−MT）で，この細胞を共形質転換した。G418選抜
の後，このプールされた耐性コロニーは,10⁶細胞当たり
約500pgのヒト塩基性FGFを生産した。

生産されたFGFの量は，ヘパリン−セファロースを用い
て，溶解した細胞から塩基性FGFをアフィニティー精製
により定量し，続いて組織培養中の内皮細胞の生長促進
のための分析を行った。このヘパリンアフィニティー精
製は，以下に記述の方法のような標準的な方法により，
達成される。この方法は，例えば,Sullivan,R.,ら,J Bi
ol Chem（1985）260:2399−2403,あるいはShing,ら,Sci
ence（1984）223:1296−1299である。また，活性の分析
はGospodarowicz,D.,ら,J Cell Physiol（1985）122:32
3−332,あるいはGospodarowicz,D.,ら,J Cell Biol（19
83）97:1677−1685に記述のように行われる。

500pg/10⁶細胞のレベルで生産する先のプールを，次い
で，誘発物質としての100μM ZnCl₂とともに10μM CdCl
₂の存在下にて生長させることにより，カドミウム耐性
体を選抜した。耐性クローンのプールを，次いで，上で
記述のように分析した。5.6ng/10⁶細胞の生産レベルが
１回の分析で見出された。

望むなら,FGFがこの溶解した細胞から得られ，そして天
然タンパクに対する先に述べた方法によるか，または当
業者に公知の他の標準方法により，精製され得る。

さらに，先に論じたように，前述の構築物により生産さ
れるFGFタンパクの分泌は，カルシウムイオノフォアや
他の適当な刺激剤によって開始されるエキソサイトシス
により，達成され得る。CHO細胞により生産されるタン
パクが，特に,LPSやホルボールエステルの刺激により，
放出されるということは期待できないものの，例えば,C
HO細胞に代えて，組換え宿主としてマクロファージ由来
の細胞系を用いることにより，このような分泌が行われ
得る。また，以下に例示するようはhGH由来のシグナル
配列を与えるために，その構築を変えることにより，通
常の構築経路を用いる分泌も,CHOや他の哺乳動物細胞の
宿主を用いて行われるだろう。もちろん，分泌を生じる
ことは，タンパク精製作業がずっと簡単になるので有利
である。

合成した酸性hFGFの部分合成配列を含むpMT−FGFベクタ
ーでのトランスフェクションにより，成熟した基本型の
140アミノ酸の上流側にある14アミノ酸の前部領域を含
む“長い型"FGFの生産が行われるだろう。それにより，
処理されたMet残基はまた，アセチル基のようなブロッ
キング基と置き換えられてもよい。プロセッシングはま
た，哺乳動物細胞中で行われ，その結果成熟型になる。
しかし，最初のMetを欠き，アセチル化されたＮ末端ア
ラニン残基を有するリーダー配列を含む長い型のもの
が，分裂促進因子としての活性を有することがわかって
いる。

いずれの場合にも,FGFは，ヘパリン／セファロースに適
し，酸性FGFには1.2M NaClでそして塩基性FGFには2M Na
Clで溶出することにより，一部精製される。この溶出物
は,SDS−PAGE,および内皮細胞や3T3細胞に対する分裂促
進活性により，酸性または塩基性FGFの存在について分
析される。

実施例８ ヒトFGFに対するワクシニアベクターの構築，およびCV
−１細胞の一時的な発現 基本のhFGFをコードする配列は,BamHIおよびSmaIでphGH
−SV（10）（前出）を分解し，クレノーを用いて平滑化
し，そしてpJJ15−１からこのFGFにわたる約500bpのNco
I（平滑末端）/Hind III（平滑末端）断片を挿入するこ
とにより,hGHから３′非翻訳領域と共に供給された。得
られたプラスミド,pJJ16−２は，上に記述の発現ベクタ
ーとして直接用いられ得る。

しかしながら，基本のbFGFをコードする領域およびhGHp
olyA付加シグナルを含むNcoI/EcoRI断片（約1.1kb）を,
5％アクリルアミドゲル上で精製し，溶出し，クレノー
で平滑化し，そしてSmaIで分解したホスファターゼ化pG
S20に連結した（Mackett et al,J Virol（1984）49:857
−864）。得られたプラスミド（pJV1−１と命名され
た）は，大腸菌MC1061中で増幅された。そしてこのプラ
スミドDNAは，セシウムクロライド濃度勾配を用い単離
された。

実施例４で合成された合成の酸性hFGF DNA断片も，ワク
シニアの一時的な発現ベクターpGS20の中に連結され
る。第９図に示される合成の酸性hFGF遺伝子は,NcoIお
よびEcoRIで切断され，クレノーで平滑化され，そしてS
maIで切断されたホスファターゼ化pGS20に連結される。
得られたプラスミドの調製物は，セシウムクロライド中
で平衡状態に遠心分離することにより精製され,pJV1−
２と命名された組換えプラスミドが回収される。

このpJV1−１ベクターおよびpJV1−２ベクターは,Cochr
an,M.A.,ら,Proc Natl Acad Sci（USA）（1985）82:19
−23によって記述されるように，ワクシニアに感染する
CV−１細胞に形質転換される。

pJV1−１またはpGS20にトランスフェクトされたCV−１
細胞は,SDS−PAGEオートラジオグラフィーを用いる基本
のFGFを生産するために，分析された。この結果は，第1
2図に示される。レーン１およびレーン２は，それぞれp
JV1−１およびpGS20でトランスフェクトされた細胞の培
地である。レーン３およびレーン４は，対応する細胞溶
解産物のサンプルであり，レーン５およびレーン６は，
以下のこと以外は，レーン３およびレーン４と同じであ
る。溶解産物のサンプルを,0.6M塩化ナトリウムの存在
下にてヘパリンセファロースに結合し,10mMリン酸塩,pH
7.4/1.1M塩化ナトリウムで洗い，そして同じ緩衝液中で
2M塩化ナトリウムを用いてカラムから溶出した（この溶
出物は，ゲル上に載せる前にTCAで沈澱させた）。レー
ン７は,146アミノ酸型にて¹²⁵Iでラベルされた基本のFG
Fである。レーン５中の約18kbの所のバンド（これはFGF
の標準よりも少し高い分子量をもっている）によると，
ウシ配列のその“長い”型が，組織から得られた“基本
の”タンパクよりも多く形成されていることがわかる。

レーン５およびレーン６に示すように調製されたサンプ
ル（TCA沈澱を除く）も，ウシの脳の毛細管内皮細胞の
分裂促進活性について検査された（実施例９参照）。pG
S20サンプルには活性は全くなかったが,pJV1−１サンプ
ルは,20pg FGF/μに相当する活性を含んでいた。

実施例９ FGFに対するインビトロ分析 この分析は,Eschら,Proc Natl Acad Sci（USA）（198
5）82:6507−6511:およびGospodarowiczら,J Cell Phys
iol（1985）122:323−332に記述のように実質的に行わ
れた。

簡単に言うと，ウシの脳の毛細管内皮細胞は,10％ウシ
血清で補われたDMEMの存在下で維持された。複数の単層
が,0.9％塩化ナトリウム,0.01Mリン酸ナトリウム,pH7.
4,0.05％トリプシン，そして0.02％EDTAを含む溶液に，
室温にて２〜３分間さらすことによって，解離された。
この細胞を集めた後，それらを,DMEMおよび10％ウシ血
清中に再懸濁させ，そして細胞懸濁液のアリコートをコ
ルターカウンター（Coultercounter）で計測した。この
細胞を,2mlDMEMに10％ウシ血清を加えた全体を含む各皿
に,35mm皿あたり２×10⁴細胞の初期密度で植えつけた。
６〜12時間後,2通り作成したプレート１セットをトリプ
シン処理し，そして細胞を計測してプレート化効果を測
定した。

FGF活性について検査され得るサンプルのアリコートを,
0.5％BSAを加えたDMEMを用いて1:2,1:4,そして1:8に希
釈し，そして，この希釈液の10μを３通りの検査プレ
ートに０日目および２日目に加えた。４日目に，各サン
プル希釈液に対する３通りのプレートをトリプシン処理
し，そしてこの細胞密度をコルターカウンターにより測
定した。

実施例10 シグナル配列融合の発現 FGFの組換え型は,CHO細胞またはCV−１細胞の培地中で
は見出されなかったので，このFGFをコードするDNA配列
も，組換えFGFタンパクの分泌を起こすために，異種シ
グナル配列に連結される。次いで，この融合した配列
は，ワクシニアで感染させたCV−１細胞中での一時的な
発現および分泌を生じるようなワクシニアにもとづくベ
クターに連結されるか，またはCHO細胞での発現および
分泌のためのベクターにもとづくpHS1に連結される。

ヒトの成長ホルモンからのシグナル配列を，コード配列
全部を含む800bpのHind III断片として,Martial,J.A.,
ら,Science（1979）205:602−607,のcDNAベクターchG H
800/pBR322から得た。NaeI制限部位は，部位特異的な突
然変異によって,26番目のアミノ酸シグナルをコードす
るDNAの３′位にすぐに配置される。その結果,NaIによ
る次の開裂は，このシグナル配列のＣ末端でのアラニン
残基に対するコドンのすぐあとに平滑末端を有する断片
になる。要約すると，このHind III断片をM13mp19に連
結し，そしてプライマー:5′−ATGGTTGGGCCGGCACTGCC−
３′を用いて突然変異させる。そして，この突然変異し
た配列は，回収され,BamHIおよびNaeIで分解されてシグ
ナル配列を含む断片を与える。

（β−ラクタマーゼのシグナル配列の正しく合わせた型
も，類似の構築物中に用いられるだろう（Lingappa,V.
R.,ら,Proc Natl Acad Sci（USA）（1984）81:456−46
0）。） 基本のhFGFの４つの型をコードするDNAは，上に記述の
改変されたλBB2クローンからの一定のＣ末端断片，お
よび可変的な合成のＮ末端部分をそれぞれ含む部分的に
合成された断片として供給される。このＣ末端の位置に
対し，この改変されたλBB2クローンは,3′非翻訳領域
のHind III部位に及ぶ377bpの副断片を得るために,HhaI
およびHind IIIで分解される。このHhaIは，開始メチオ
ニンコドンから122bp下流側を切断する。HhaI部位から
上流側の欠けている部分は，合成のオリゴヌクレオチド
を用いて供給される。

この合成オリゴヌクレオチドは，第13図に示される。そ
れらは，合成の酸性hFGFの産生に関連して上述された方
法と類似の方法で合成され，そして連結される。この個
々のオリゴヌクレオチドは，標準の自動核酸合成器を用
いて合成され，アニーリングされる。そしてこの２重鎖
部分は，その３′末端にHhaI部位を含む適切な全体の上
流側部分を形成するように，連結される。次いで，これ
らの合成の上流側断片は，完全なFGF遺伝子を得るよう
に,T4リガーゼを用いて，下流側のHhaI/Hind III断片に
連結された後,hGHシグナル配列をコードする領域を加え
るために,hGH BamHI−NdeI断片に連結される。

この合成の上流側部分によってコードされるhGH/基本の
FGFタンパクの結合は，第14図に示される。タンパクＡ
は，再構築された上流側部分および連結されたＣ末端コ
ドンを含む。このＣ末端コドンは，それゆえ，−９〜14
6のアミノ酸（第４図に示す）をコードしている。つま
り，このコドンは，ヒトFGFの長い型をコードするアミ
ノ酸全部である。タンパクＢは，−９位のＮ末端メチオ
ニンがアラニン残基によって置き換えられていること以
外は，同じ配列を含む。タンパクＣは，第４図の12−14
6のアミノ酸をコードしている。そして，タンパクＤ
は，このタンパクの16−146のアミノ酸，つまりヒトの
基本のFGFの“短い”型をコードしている。この短い型
は分裂促進活性を示すことが既に知られている。

第14図も,von Heijen,G.,Eur J Biochem（1983）133:17
−21によって示された規則によれば，直接の発現産物に
対する予測されたシグナル配列の開裂部位（太い矢印）
を示す。

構築を完全にするために，第14図で示されるhGHシグナ
ル配列に融合された４つのタンパクをコードする断片
は,BamHI（部分）/Hind III配列として増幅するため，
キャリアープラスミドpUC9中に挿入される。正しい構築
はダイデオキシシーケンス法により確立される。この配
列断片を確認するBamHI（部分）/Hind IIIは，次いで，
キャリアープラスミドから削除され，クレノーにより平
滑化され，そしてpGS20（前述）のSmaI部位に連結され
る。連結された組換えプラスミドは，上に記述のよう
に，ワクシニアに感染したCV−１細胞中で発現される。

同様に，構築物は，同じ発現系での分泌のために，酸性
hFGFから作られる。このFGFをコードする配列は，合成
された酸性のhFGF DNA断片から誘導され，修飾されて，
第15図におけるタンパクE,FおよびＧを生産する。第15
図は，第２図ｂの−15残基から140残基に及ぶ酸性FGFの
長い型，第２図ｂの１〜140残基によって表される基本
型，そして，その図の７〜140残基に及ぶ短い型のhGH/
酸性FGFタンパク結合領域を表す。全ては，この図に示
されているように，このFGFのアミノ末端に少しの変化
をもたらす。

これらのFGFをコードする配列を構築するために，このN
coI/EcoRIの合成の酸性FGFを,NcoI部位にて，クレノー
により平滑化し，そしてSmaI/EcoRIで分解されたM13mp1
9に連結する。得られたファージは，オリゴヌクレオチ
ド:5′−GTAATTCCCGGGAGGCAGAT−３′で突然変異を誘発
され，それゆえ，グリシンに対するコドンのすぐ前に，
第９図の核酸位置62にてSmaI部位を作る。このグリシン
は，主要な酸性hFGFの残基６である。SmaIおよびEcoRI
を有する突然変異された断片の分解により,414bpの断片
が生じ，この断片は，第15図中のタンパクＧのように示
される組換え型をコードするDNAを得るために,BamHI/Na
eI hGHシグナルをコードする断片に直接連結される。ま
たは，この断片は，合成したオリゴヌクレオチド（第16
図に示される）にまず連結され，次いで，第15図のＥお
よびＦと命名されるペプチドをコードする配列を得るた
めに,BamHI/NaeI断片に連結される。

ヒト塩基性FGFに対して先に述べた方法に全く類似の方
法にて，このシグナル配列を進行させる酸性FGFのDNA断
片を,pGS20中に配置し，そしてワクシニアに感染したCV
−１細胞中にトランスフェクトして，酸性FGFの分泌型
の一時的な発現を分析する（この処理されたタンパクの
予期されるシグナル開裂部位を,von Heijneからも推測
されるように，第15図の太い矢印により指示する）。

このFGF配列は，伝統的なシグナル配列を含んでおら
ず，したがって構築条件下にてシグナルの仮定的な機構
により，それらの配列自体の分泌を生じさせる性能を有
することは，注目されるべきである。正常な細胞質タン
パクに外来シグナル配列を融合することにより，それら
の分泌を生じ得るかどうかということは，当該技術分野
からは明らかでない（malEシグナル配列に融合されるβ
−ガラクトシダーゼは，細菌中ではペリプラズムに達し
ないことが示された。しかし,Lingappa,V.R.,ら,Proc N
atl Acad Sci（前述）は，β−ラクタマーゼシグナルに
融合されるβ−グロビンが，インビトロでイヌの脾臓の
ミクロソームにより処理され，そしてこの処理されたタ
ンパクが，トリプシンの分解から保護されることを示し
ている）。

この連結されたシグナル/FGFをコードする配列も，上述
されたMT−IIプロモーターを含む宿主ベクターの中に挿
入され得，そしてCHO細胞中で発現され得る。

実施例11 FGFの細菌での発現 FGFをコードするcDNA配列（これはイントロンによって
分断されていない）も，細菌系にて発現可能である。発
現のために都合のよい宿主ベクターはpKT52であり，そ
れは，“trc"プロモーターおよびそれに続くATG開始コ
ドンを含んでいる。この“trc"プロモーターは,trpプロ
モーターの上流部分および下流部分，オペレーターを含
む部分,lacプロモーターの領域，を含む。このプロモー
ターを含むpKT52は,pKK233−２の簡単な操作により構築
された。それは,Amman,E.,ら,Gene（1985）40:183−190
により，記述されている。pKK233−２は,EcoRIおよびPv
u IIで分解され,dATPおよびdTTPで満たされ，そして所
望のベクターを得るべく再連結された。

pKT52は，所望のtrcプロモーターおよび下流側のATG開
始コドンに加えて，下流側のNcoI部位,PstI部位，およ
びHind III部位を含む。

発現ベクターを構築するために，このFGFをコードするc
DNAは,EcoRIまたは他の適当な酵素で分解すること，単
離すること，およびもし必要ならば，適当な断片を修飾
することにより，得られる。この３′末端は，ある都合
のよい制限酵素部位にて終止コドンの下流側を切断し，
そしてPstIリンカーまたはHind IIIリンカーを与えるこ
とにより,pKT52中に導入するために，調製される。この
５′末端は，このコード配列の内側の部位にて切断し，
そしてこの欠けているコドンおよびNcoI部位を合成DNA
を用いて与えることによるか，または変異操作によって
適当に配置されたNcoI部位を供給することにより，調製
される。得られるNcoI/Hind IIIまたはNcoI/PstI断片
は，次いで,NcoI/Hind IIIで分解されるpKT52か，また
はNcoI/PstIで分解される。pKT52に連結され，読み枠中
にて，このATG開始コドンととも,FGFをコードするcDNA
を供給する。このNcoI/Hind IIIを境界とする合成の酸
性hFGF DNAは，この方法で直接に挿入される。同様のベ
クターは，ヒトの塩基性FGFをコードするDNAを用いて構
築される。

細菌での発現では，得られた発現ベクターは大腸菌MC10
61または他の適当な宿主細胞をAmp^Rに形質転換するため
に用いられ，次いで形質転換された細胞は,O.D.が0.2〜
0.5になる３〜５時間の間,1mMのIPTGを含むM9培地上で
生長される（IPTGは,lacオペレーターによって制御され
る制御配列に対する標準の誘導物質である）。次いで，
細胞を集め，細胞破砕または５％トリクロロ酢酸での処
理により溶菌し，そしてこの細胞抽出物を，所望のFGF
について分析する。FGFは，天然タンパクに対して用い
られる方法，または当該技術分野に既知の他の操作によ
って，抽出物から精製され得る。

実施例12 傷害の修復を促進するFGFの活性 傷害の修復を促進するFGF活性を，対照としてのGospoda
rowiczらの方法（Proc Natl Acad Sci（USA）（1984）8
1:6963−6967）により，ウシの脳下垂体から精製した純
粋な塩基性FGFを用い分析した。分析され得る対照のFGF
は,Davidson,J.M.,ら,J.C.B.（1985）100:1219−1227の
手順によれば，ネズミへのポリビニルアルコールスポン
ジの皮下注入に適用された。代わりの方法として，ゴル
テックスホローファイバーも，用いられ得る（Goodson,
W.H.,et al,J Surg Res（1982）33:394−401）。

標準的な手法では，全部で４匹のネズミを，それぞれ２
つの同一の処理をしたスポンジで処理した。このスポン
ジは，ヘパリンセファロースビーズによる処理，スポン
ジあたり５μｇのFGFを用いてヘパリンセファロースビ
ーズに結合されたFGFによる処理，または溶液中にて５
μg FGFで処理を施す，のいずれかであった。このスポ
ンジを,6日後に回収し，そして，傷害修復を示している
肉芽組織について組織構造的に調べた。

FGFを含むスポンジは，高い量の肉芽組織を示した。そ
して，この肉芽組織は，スポンジの場合には，ヘパリン
セファロースビーズのまわりに集まっていた。このスポ
ンジのところでは,FGFは，これらのビーズに結合して供
給された。

同様の結果により,FGFが天然源によるかまたは組換え体
によるものか，そしてFGFが塩基性か酸性かについて観
察される。

1985年９月９日またはそれ以前に，出願人は,American
Type Culture Collection（ATCC）,Rockville,MD,USA,
にλファージのλBA2,λBA3,λHAG−9.1,λBB2,および
λKB−７を寄託した。これらは,ATCC受託番号40195,401
94,40197,40196,および40198をそれぞれ割り当てられ
た。これらの寄託は，特許目的のための培養菌寄託に関
するATCCの承認のもとで与えられるような状況下にてな
された。1986年９月12日またはそれ以前に，λBB2（ATC
C40196）およびλHAG−9.1（ATCC40197）の寄託条件
は，微生物の寄託に対する国際的な承認（ブダペスト条
約）に関するベダペスト条約で明記された条件に適合す
るように変えられた。1986年９月12日またはそれ以前
に，λHG−３およびλHAG−３と命名されたλファージ
は，ブダペスト条約の条件下でATCCに寄託され,ATCC受
託番号40257および40258を，それぞれ割り当てられた。
寄託された株の有用性は，その特許法に従って，いかな
る政府の権威の下で許された権利にも違反して，その発
明を実施するためのライセンスとして解釈されるべきで
はない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭60−11424（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−500878（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−500036（ＪＰ，Ａ) ＦＥＢＳ．ＬＥＴＴＥＲＳ，1985．６ 〔185〕Ｐ．177−181 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅ ｓ，Ｃｏｍｍｕｎ．，1985．４〔128〕Ｐ. 554−562 ＥＭＢＯ．Ｊ．，1985．７〔４〕Ｐ. 1951−1956 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｏｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，1986．５〔83〕Ｐ．3012− 3016

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト塩基性FGFタンパク質をコードする、
   単離され、クローン化された組換え、または合成DNA配
   列： ここで、該ヒト塩基性FGFタンパク質は、以下のアミノ
   酸配列Ｉ、II、IIIおよびIVを含有するタンパク質群か
   ら選択される： および
2. 【請求項２】前記DNA配列が、プレハイブリダイゼーシ
   ョン／ハイブリダイゼーション緩衝液、pH6.5中で、BB2
   （ATCC40196として寄託している）をEcoRIで分解して得
   られるウシ塩基性FGFをコードする1.4Kbの断片とハイブ
   リダイズし得る、請求の範囲第１項に記載のDNA配列： ここで、該緩衝液は、40％ホルムアミド、5mMリン酸ナ
   トリウム、5xデンハート溶液（0.1％ウシ血清アルブミ
   ン、0.1％ポリビニルピロリドンおよび0.1％フィコ
   ル）、5xSSC（0.75M塩化ナトリウム、0.075Mクエン酸ナ
   トリウム）、50μｇニシン精子DNAおよび10％硫酸デキ
   ストランを含む。
3. 【請求項３】前記ヒト塩基性FGFタンパク質をコードす
   るDNA配列の上流側に、作動可能に連結された異質のシ
   グナル配列をさらに含む、請求の範囲第１項または第２
   項いずれかの項に記載のDNA配列。
4. 【請求項４】前記DNA配列が発現を制御する配列に作動
   可能に連結されている請求の範囲第１項ないし第３項い
   ずれかの項に記載のDNA配列。
5. 【請求項５】前記制御配列がヒトMT−IIプロモーター、
   SV40由来のウイルスのエンハンサー、ワクシニアウイル
   ス由来の制御配列、およびhGH由来の転写シグナルのう
   ち少なくとも一種を含む、請求の範囲第４項に記載のDN
   A配列。
6. 【請求項６】発現を制御する配列に作動可能に連結され
   た、ヒト塩基性FGFタンパク質をコードする、単離さ
   れ、クローン化された組換えまたは合成DNA配列で形質
   転換された哺乳動物細胞または細菌： ここで、該ヒト塩基性FGFタンパク質は、以下のアミノ
   酸配列Ｉ、II、IIIおよびIVを含有するタンパク質群か
   ら選択される： および
7. 【請求項７】哺乳動物細胞宿主または細菌宿主に適合し
   た発現を制御する配列に作動可能に連結された、ヒト塩
   基性FGFタンパク質をコードする、単離され、クローン
   化された組換えまたは合成DNA配列を含有する組換えベ
   クター： ここで、該ヒト塩基性FGFタンパク質は、以下のアミノ
   酸配列Ｉ、II、IIIおよびIVを含有するタンパク質群か
   ら選択される： および