WO2005087257A1 - 架橋ゼラチンゲルを担体とする軟骨組織修復治療剤 - Google Patents

架橋ゼラチンゲルを担体とする軟骨組織修復治療剤 Download PDF

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WO2005087257A1
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gelatin gel
gelatin
bfgf
gel
cartilage tissue
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Yasuhiko Tabata
Toshikazu Kubo
Kenji Takahashi
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Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for repairing cartilage tissue comprising a basic fibroblast growth factor and a homologue thereof or a homolog thereof carried on a crosslinked gelatin gel. More specifically, the present invention relates to a therapeutic agent used for repairing cartilage tissue and repairing cartilage defect after joint destruction due to osteoarthritis or arthritis or the like.
  • OA osteoarthritis
  • HA causes secondary synovitis based on degeneration and rupture of articular cartilage.
  • Significant impairment of joint function limits daily activities and social activities.
  • Oral administration of anti-inflammatory analgesics and intra-articular administration of hyaluronic acid have been used as conservative treatments, but the effects have not been sustained for a long period of time, and the progression of the disease has not been suppressed.
  • Severe joint destruction requires surgical treatment such as artificial joint replacement, but has problems with the size of the invasion and long-term prognosis. Therefore, effective conservative therapies are now eagerly sought. Although the repair of cartilage tissue with various growth factors has been attempted for some time, the therapeutic effect cannot be expected with intra-articular administration of growth factors alone because their biological activity is lost within several hours.
  • Basic fibroblast growth factor (also referred to as basic fibroblast growth factor; hereinafter referred to as bFGF) is pituitary, brain, retina, corpus luteum, adrenal gland, kidney, placenta, prostate, thymus, chondrosarcoma It is a peptidic cell growth factor that has been confirmed to be present in macrophages (Japan, Japan Culture Association, edited by “Cell Growth Factor Part II”, Asakura Shoten, 1987, pp. 15-20). b FGF initially shows a strong proliferative effect on fibroblasts such as BALB / c 3 T3 cells (D. Gospodarowi Named by D. Gospodarowicz, “Nature”, Vol.
  • WO 94/27630 discloses a crosslinked gelatin gel formulation containing bFGF utilizing a crosslinked gelatin gel as a sustained release carrier.
  • JP-A-7- two hundred and thirty-three thousand and eighty-five has a b FGF and / / or its homologues excellent cartilage tissue neogenesis or regeneration promoting effect, cartilage tissue repair, particularly described to be useful in articular cartilage repair ing. '
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for repairing cartilage tissue that can effectively treat a cartilage tissue disease such as osteoarthritis.
  • the present inventors have conducted intensive studies in view of the above problems, and found that by supporting bFGF on a cross-linked gelatin gel, it was possible to effectively repair cartilage tissue while reducing side effects, thereby completing the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a therapeutic agent for repairing cartilage tissue comprising FGF and / or a homolog thereof carried on a cross-linked gelatin gel.
  • a therapeutic agent for repairing articular cartilage tissue comprising FGF and its homologue or a homologue thereof supported on a crosslinked gelatin gel.
  • An agent for treating osteoarthritis comprising FGF and / or a homolog thereof carried on a cross-linked gelatin gel.
  • the therapeutic agent according to any one of [1] to [3], wherein the crosslinked gelatin gel is a crosslinked gelatin gel obtained by crosslinking acidic gelatin.
  • these therapeutic agents are collectively referred to as “the therapeutic agent of the present invention”.
  • the crosslinked gelatin gel in the therapeutic agent of the present invention stays at the administration site for a long time and is gradually decomposed by the hydrolase, so that bFGF carried on the gel is also gradually released with the decomposition of the gel. . Therefore, the therapeutic agent of the present invention is capable of intensively retaining bFGF for a long period of time at a site where cartilage tissue is to be repaired, and is particularly suitable for topical application. Since the release property can be controlled, the necessary dose can be easily set, and excessive administration can be suppressed. Further, the intra-articular administration of the crosslinked gelatin gel according to the present invention can be an epoch-making conservative therapy in the repair of articular cartilage in, for example, osteoarthritis, because of its simplicity in procedures.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of the test example.
  • the vertical axis represents the untreated group, the PBS impregnated particle administration group (PBS), the 10 ⁇ gb FGF solution (PBS dissolved) administration group (10 g solution), and the 10 / zgb FGF impregnated particle administration group (10 ⁇ m).
  • PBS PBS impregnated particle administration group
  • 10 ⁇ gb FGF solution PBS dissolved
  • 10 / zgb FGF impregnated particle administration group 10 ⁇ m
  • g particles and 100 gb FGF impregnated particles administration group (100 / ig particles).
  • bFGF and its homologues can be isolated or purified from those produced in microorganisms or cultured cells by natural or genetic recombination techniques, or by chemically or biologically modifying them. can get.
  • the bFGF used in the present invention is particularly preferably human bFGF or a homolog thereof.
  • bFGF is used as an active ingredient.
  • a group may be used.
  • the homolog of bFGF means the following polypeptide [I] or [II].
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence substantially identical to bFGF produced in a specific mammal refers to one in which 1 to 6 amino acids in the amino acid sequence have been substituted with another kind of amino acid and which has the biological activity of bFGF.
  • An additional amino acid segment has been added to the N-terminus and / or C-terminus of bFGF produced in a specific mammal, or to the N-terminus or C-terminus of the polypeptide of [I].
  • the additional amino acid segment is composed of 1 to 12 amino acids and does not impair the biological activity of bFGF or the biological activity of the polypeptide of the above [I].
  • Human bFGF is a polypeptide having 146 amino acids.
  • as a homolog of human bFGF for example, JP-A-2-504468. May be used.
  • the cysteine at position 69 (Cys) and the cysteine at position 87 (Cys) constituting the amino acid sequence of human bFGF are each substituted by serine (Ser).
  • homologue of [II] for example, a polypeptide having 155 amino acids described in Japanese Patent Publication No. Sho 63-500843 may be used. This polypeptide has a 9 amino acid segment added to the N-terminus of human bFGF.
  • polypeptide of 147 amino acids with Met— added to the N-terminus or a polypeptide of 157 amino acids with a segment of 11 amino acids added to the N-terminus described in JP-T-63-501953. Polypeptides may be used.
  • Particularly preferred bFGFs include traufermin (genetical recombination).
  • one type of bFGF may be used alone, A plurality of types may be used in combination. Further, as described above, there are a plurality of homologs of bFGF, and these homologs may be used alone or in combination.
  • bFGF bFGF
  • a gene for producing FGF or a homolog thereof in this case, generally the polypeptide of the above [I]
  • the gene produced from the microorganism or the cultured cell is generally:
  • the gelatin used as a raw material of the crosslinked gelatin gel in the present invention is not particularly limited and may be a commonly available gelatin.
  • examples of such gelatin include alkali-treated gelatin (acidic gelatin) having an isoelectric point of about 5 and acid-treated gelatin (alkali gelatin) having an isoelectric point of about 9; In this case, an acidic gelatin having an isoelectric point of about 5 is preferred.
  • Gelatin is not limited to one kind, and raw materials and materials having different physical properties such as solubility, molecular weight and isoelectric point may be appropriately mixed and used.
  • the cross-linking agent for cross-linking gelatin that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it has no toxicity to living organisms.
  • daltaraldehyde, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride Salts and 1-cyclohexynole-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide meth p-Toluenesulfonate and other water-soluble carbodiimides, bisepoxy compounds, formalin, etc. are preferred, and glutaraldehyde and 1-ethyl-3 (3-Dimethylaminopropyl) carposimid hydrochloride is particularly preferred.
  • Gelatin is cross-linked by heat treatment or UV or electron beam irradiation. Is also good.
  • the shape of the crosslinked gelatin gel used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a columnar shape, a prismatic shape, a sheet shape, a disk shape, a spherical shape, a particle shape, a granular shape, and a paste shape.
  • a columnar shape When used as an implant, it is preferably in the form of a column, a prism, a sheet, or a disk.
  • an injectable preparation it is preferably in the form of a sphere, particle, granule, or paste.
  • Cylindrical, prismatic, sheet-like, and disk-shaped crosslinked gelatin gels are prepared by adding a crosslinker aqueous solution to an aqueous gelatin solution, or adding gelatin to a crosslinker aqueous solution and pouring it into a desired shape of a mold, and performing a crosslinking reaction.
  • an aqueous solution of a crosslinking agent may be added to the formed gelatin gel as it is or after drying.
  • contact with a low molecular weight substance having an amino group such as ethanolamine or glycine, or add an aqueous solution having a pH of 2.5 or less.
  • the obtained crosslinked gelatin gel is washed with distilled water, ethanol, 2-propanol (hereinafter, referred to as IPA), acetone, etc., and used for preparation of a pharmaceutical preparation.
  • the resulting crosslinked gelatin gel has a water content of 50-99 wZwO / o.
  • the water content of the gel refers to the ratio of the weight of water in the gel to the total weight of the gel when wet.
  • the paste-like crosslinked gelatin gel can be prepared by a method similar to the above-mentioned method for preparing the columnar, prismatic, sheet, or disk-shaped crosslinked gelatin gel.
  • a spherical, particulate, or granular cross-linked gelatin gel can be mixed with a stirring motor (for example, Three One Motor, EYE LA mini DC S tirrer, etc., manufactured by Shinto Kagaku Co., Ltd.) and a Teflon (registered trademark) stirring propeller.
  • a stirring motor for example, Three One Motor, EYE LA mini DC S tirrer, etc., manufactured by Shinto Kagaku Co., Ltd.
  • Teflon registered trademark
  • aqueous gelatin solution was placed in a device with these fixed on a round bottom flask, and oil such as olive oil was added thereto and stirred at a speed of about 200 to 600 rpm to obtain a WZO type emulsion.
  • an aqueous solution of a cross-linking agent to the solution or pre-emulsify an aqueous solution of gelatin in olive oil in advance (eg, vortexmier Advantec TME-21, homogenizer polytron PT 10-35, etc.)
  • the resulting mixture was dropped into olive oil to prepare a micronized W / O emulsion, to which an aqueous solution of a crosslinking agent was added, a crosslinking reaction was performed, and a bridged gelatin gel was recovered by centrifugation. Wash with acetone, ethyl acetate, etc., then wash with IPA, ethanol, etc. and dry.
  • ultrasonic irradiation preferably within 1 minute under cooling
  • a fine crosslinked gelatin gel having a particle size of 20 m or less By pre-emulsifying, a fine crosslinked gelatin gel having a particle size of 20 m or less can be obtained.
  • the average particle size of the obtained crosslinked gelatin gel particles is 1 to 100 O / zm, and particles having a necessary size are appropriately sieved and used according to the purpose. For topical administration, it is preferable to use particles having an average particle size of 10 to 150 ⁇ .
  • the water content of the obtained crosslinked gelatin gel particles is about 50 to 99%, and a preferable water content can be appropriately prepared.
  • Another method for preparing a spherical or particulate crosslinked gelatin gel is as follows.
  • the dried gelatin particles are suspended in an aqueous solution of a cross-linking agent containing 0.1% Tween 80 and subjected to a cross-linking reaction with gentle stirring, and a 100 mM aqueous glycine solution containing 0.1% Tween 80 or 0.Including l% Tween 80 0.004N HC
  • the crosslinked gelatin gel particles can be obtained by stopping the crosslinking reaction by washing with 1 or the like.
  • the average particle size and the water content of the crosslinked gelatin gel particles obtained by this alternative method are the same as those obtained by the above method.
  • Crosslinking reaction conditions should be appropriately selected, but the reaction temperature is preferably 0 to 40 ° C, and the reaction time is preferably 1 to 48 hours.
  • the crosslinked gelatin gel obtained as described above can be dried under reduced pressure or freeze-dried.
  • Freeze-drying is carried out, for example, by placing a cross-linked gelatin gel in distilled water, freezing it in liquid nitrogen for at least 30 minutes or at -80 ° C for at least 1 hour, and then drying it for 1 to 3 days with a freeze dryer.
  • the concentration of the gelatin and the cross-linking agent in preparing the cross-linked gelatin gel should be appropriately selected depending on the desired water content, but the gelatin concentration is 1 to 10 Ow / v ° / 0 , the cross-linking agent concentration is 0.01 to 100 wZv % (Equivalent to 1 to 540 OmM) is preferred.
  • the crosslinked gelatin gel can have a desired water content by changing the concentrations of the raw material gelatin and the crosslinker. To increase the water content, both the gelatin concentration and the cross-linking agent concentration should be lowered, and conversely, to lower the water content, both the gelatin concentration and the cross-linking agent concentration should be increased.
  • an aqueous bFGF solution is dropped and impregnated on the crosslinked gelatin gel, or the crosslinked gelatin gel is suspended and reswelled in the aqueous bFGF solution.
  • the amount of bFGF that can be supported on the crosslinked gelatin gel depends on the water content of the crosslinked gelatin gel and the like, but it can be 0.1 to 500 ⁇ g per mg of the crosslinked gelatin gel.
  • the sustained release period, the amount of bFGF released, etc. depend on the moisture content of the cross-linked gelatin gel, the physical properties such as the isoelectric point of the gelatin used, the amount of bFGF carried on the drug product, the site to be administered, etc. It depends on various conditions.
  • the bFGF-supported crosslinked gelatin gel preparation obtained as described above can also be lyophilized. In the case of freeze-drying, for example, after freeze-drying in liquid nitrogen for 30 minutes or more or at 180 ° C for 1 hour or more, the freeze-drying is performed for 1 to 3 days.
  • the therapeutic agent of the present invention When the therapeutic agent of the present invention is prepared as an injectable preparation, it is appropriately suspended in a medium such as purified water for injection, physiological saline, or a buffer.
  • a medium such as purified water for injection, physiological saline, or a buffer.
  • the buffer include a phosphate buffer, an acetate buffer, a citrate buffer and the like. If necessary, dispersants, surfactants, isotonic agents, pH adjusters, soothing agents, stabilizing agents, preservatives, coloring agents, etc., commonly used in the manufacture of injectable preparations It can be appropriately blended.
  • the method of administering the therapeutic agent of the present invention is preferably local.
  • a therapeutic agent in the form of an injection prepared by suspending a particulate gel carrying bFGF in an appropriate medium is injected into the affected area, or a sheet or disk-like form carrying bFGF is It can be used by placing the gel preparation in the affected area, or injecting it from outside the body into the diseased site using a syringe.
  • the therapeutic agent of the present invention has an excellent cartilage tissue repair effect.
  • cartilage tissue diseases such as joint repair after destruction, (3) repair of cartilage defects caused by traumatic or transosteochondritis, and (4) treatment of spinal diseases such as disc degeneration or herniated disc.
  • the therapeutic agent of the present invention can be applied to various cartilage tissue diseases not only in humans but also in other mammals (eg, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, rabbits, hidge, monkeys, etc.). is there.
  • the amount of FGF is in the range of about 0.001 / zg to 10 mg, preferably 1 to 1,000 / zg per treatment for one treatment site.
  • the number of doses depends on the case and the dose per treatment. However, it is usually 1 to 10 times. It may be administered 2 to 6 times depending on the type and degree of symptoms.
  • Particles having an average particle diameter of 30 to 70 m were prepared using beef bone alkali-treated gelatin having an isoelectric point of 5 (typ1 collagen; manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.). The particles were cross-linked with glutaraldehyde and freeze-dried to prepare a hydrogel, which was then gas-sterilized using ethylene oxide gas.
  • bFGF trafermin (genetical recombination), manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) was prepared with PBS to prepare a 10: 1 mixed solution. This mixture was impregnated with 1 mg of gelatin particles. For 10 mg / gb FGF impregnated particles administration group, lmg gelatin particles impregnated with 10 g bFGF, 100 igb FGF impregnated particles lmg gelatin particles impregnated with 100 g bFGF Each of the prepared particles was produced. Immediately before the joint injection, each of these gelatin particles was dispersed in 300 1 PBS and injected into a 27 G syringe (Myidietater).
  • the bFGF solution (dissolved in PBS) was not impregnated into gelatin particles, but a solution containing 10 / g bFGF in 300 ⁇ l of PBS was prepared, and this solution was injected into a 27G syringe (Mijeta I). Was injected.
  • Rabbits were anesthetized by the same procedure as at the time of surgery, and after 4 weeks and 7 weeks after surgery, joint injection of the injection preparation prepared in the example was performed.
  • the joint injection was performed from the outside of the patella tendon at the 90 ° flexion of the left knee joint.
  • the effect of OA treatment was examined 10 weeks after surgery.
  • the rabbit was euthanized, the knee joint was removed as a lump, the capsule was dissected, and the distal articular surfaces of the femur (medial and lateral condyles) were exposed.
  • Indiaink was applied to the joint surface, and the state of irregularity of the joint surface, fibrosis (fibri11ation), and loss of cartilage could be visually discriminated, and a close-up photograph was taken with a digital camera.
  • the severity of OA was classified as follows based on the captured images. Both the medial condyle and the lateral condyle were evaluated, and the one with the higher G ra d e was defined as the G ra d e of the OA of the knee.
  • the definition of each G ra d e is as follows. Normally, OA of higher G ra d e was observed in the condyles.
  • G ra d e 4a Subchondral bone exposure due to cartilage loss (the major axis of the exposed part of the subchondral bone is 2 mm or less)
  • G ra d e 4 b Subchondral bone exposure due to cartilage loss (the major axis of the exposed part of the subchondral bone is larger than 2 mm and 5 mm or less)
  • Grade 4c Subchondral bone exposure due to cartilage loss (the major axis of the exposed portion of subchondral bone is larger than 5 mm) And each Grade was S cored (0-5) as follows c
  • the crosslinked gelatin gel in the therapeutic agent of the present invention stays at the administration site for a long period of time and is gradually decomposed by the hydrolase, so that bFGF carried on the gel is also gradually released with the decomposition of the gel.
  • the therapeutic agent of the present invention is capable of intensively retaining bFGF for a long period of time at a site where cartilage tissue is to be repaired, and is particularly suitable for topical application. Since the release property can be controlled, the necessary dose can be easily set, and excessive administration can be suppressed.
  • the intra-articular administration of the crosslinked gelatin gel according to the present invention can be an epoch-making conservative therapy in the repair of articular cartilage in, for example, osteoarthritis, since it is simple in technique.

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Abstract

変形性関節症などの軟骨組織疾患を有効に治療し得る軟骨組織修復治療剤。塩基性線維芽細胞成長因子および／またはその同族体を架橋ゼラチンゲルに担持させてなる治療剤を提供する。

Description

明細書
架橋ゼラチンゲルを担体とする軟骨組織修復治療剤
技術分野
本発明は、 塩基性線維芽細胞成長因子およぴノまたはその同族体を架橋ゼラ チンゲルに担持させてなる軟骨組織修復治療剤に関する。 より詳細には、 本発 明は、 変形性関節症または関節炎等による関節破壊後の軟骨組織の修復およぴ 軟骨欠損の修復に用いられる治療剤に関する。
背景技術
現在、 我が国の 65歳以上のいわゆる高齢者は約 2300万人で、 総人口の 18. 5%を占めている。 今後も上昇を続け、 急速に高齢化が進むと予測され る。 こうした高齢者に最も多い整形外科疾患のひとつである変形性関節症 （O A) で苦しんでいる人は約 1200万人にもおよぶとされており、 大きな社会 的 -医療経済的損失を生じている。 OAは、 関節軟骨の変性 ·破壌を基盤とし て、 二次性の滑膜炎を引き起こす。 関節機能を著しく障害するため、 日常生活 動作や社会的活動が制限される。 保存的治療として、 消炎鎮痛剤の経口投与、 ヒアルロン酸の関節内投与などが行われるが、 効果が長期間持続せず、 病期の 進行を抑制するには至っていない。 関節破壊が重度になれば、 人工関節置換術 などの外科的治療が必要となるが、 侵襲の大きさや長期予後に問題がある。 そ こで現在、 有効な保存的治療法が切望されている。 以前から種々の成長因子に よる軟骨組織の修復が試みられているが、 成長因子単体の関節内投与では数時 間で生理活性が失われるため治療効果は期待できない。
塩基性線維芽細胞成長因子 （塩基性線維芽細胞増殖因子ともいう。 以下、 b FGFと称する。） は、 脳下垂体、 脳、 網膜、 黄体、 副腎、 腎、 胎盤、 前立腺、 胸腺、 軟骨肉腫、 マクロファージにおいて存在が確認されているペプチド性細 胞成長因子である （日本,袓織培養学会編， 「細胞成長因子 P a r t I I」， 朝倉書店， 1987年， p. 15— 20)。 b FGFは当初、 BALB/c 3 T 3細胞などの線維芽細胞で強い増殖作用を示すこと （ディー. ゴスポダロウィ ッッ （D. Gospodarowicz) 著， 「ネイチヤー （Nature)」， 第 249卷， 1 9 74 年， p. 123) から命名されたが、 その後、 中胚葉由来のほとんどの細胞、 特に血管内皮細胞の増殖を促進すること （ディー. ゴスポダロウイッツ （D. Gospodarowicz) 著， 「ナショナル 'キャンサー 'インスチチュート ·モノダラ フ （National Cancer Institute Monograph) , 第 48卷， 1 978年， . 1 09)、 また骨格筋のサテライト細胞の増殖も促進させること （アール. ィ一. アレン （R. E. Allen) 著， ェクスペリメンタル ·セル'リサーチ（Experimental Cell Research)」， 第 1 52卷， 1 984年， p. 154) が明らかとなってい る。 また、 近年では創傷治療における b FGFの臨床応用や、 血管新生作用を 用いた血管修復等への b FGFの応用も行なわれている。
国際公開第 94/27630号パンフレツトには、 徐放性担体として架橋ゼ ラチンゲルを利用した b FGFを含有する架橋ゼラチンゲル製剤が開示されて いる。
特開平 7— 233085号公報には、 b FGFおよび/ /またはその同族体が 優れた軟骨組織新生ないし再生促進効果を有し、 軟骨組織修復、 特に関節軟骨 組織修復に有用であることが記載されている。 '
発明の開示
本発明の課題は、 変形性関節症などの軟骨組織疾患を有効に治療し得る軟骨 組織修復治療剤を提供することにある。
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討したところ、 b FGFを架橋ゼラチン ゲルに担持させることによって、 副作用を低減しつつかつ効果的に軟骨組織を 修復できることを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 以下のとおりである。
[1] b FGFおよび/またはその同族体を架橋ゼラチンゲルに担持させて なる、 軟骨組織修復治療剤。
[2] b FGFおよぴノまたはその同族体を架橋ゼラチンゲルに担持させて なる、 関節軟骨組織修復治療剤。 [3] b FGFおよび またはその同族体を架橋ゼラチンゲルに担持させて なる、 変形性関節症治療剤。
[4] 架橋ゼラチンゲルが、 酸性ゼラチンを架橋することにより得られる架 橋ゼラチンゲルである、 上記 [1] 〜 [3] のいずれかに記載の治療剤。 以下、 これらの治療剤を総合して、 「本発明の治療剤」 と称する。
本発明の治療剤における架橋ゼラチンゲルは、 投与部位に長期にわたって滞 留し、 加水分解酵素によって徐々に分解されることから、 該ゲルに担持された b FGFもゲルの分解と共に徐々に放出される。そのため、本発明の治療剤は、 軟骨組織を修復すべき局所に b F G Fを長期にわたって集中的に滞留させるこ とが可能であり、特に、局所への適用に適する。放出性を制御できることから、 必要な投与量の設定が容易となり、 過剰投与を抑制することができる。 また、 本発明に係る架橋ゼラチンゲルの関節内投与は、 手技においても簡易であるこ と力 ら、 例えば、 変形性関節症などにおける関節軟骨の修復において画期的な 保存療法となり得るものである。
図面の簡単な説明
図 1は、 試験例の結果を示すグラフである。 縦軸は、 非処置群、 PB S含浸 粒子投与群 （P B S)、 1 0 μ g b FGF溶液 （P B S溶解） 投与群 （ 1 0 g溶液）、 1 0 /z g b FGF含浸粒子投与群（1 0 μ g粒子）、 1 0 0 g b FGF含浸粒子投与群 （1 0 0 /i g粒子） の各群についての S c o r eの平均 を表す。
発明を実施するための最良の形態
本発明における b FGFおよび またはその同族体は、 天然あるいは遺伝子 組換え技術により微生物または培養細胞に産生させたものから単離精製するこ とにより、 あるいはそれらを化学的修飾または生物的修飾することにより得ら れる。 本発明で用いる b FGFとしては特にヒ ト b FGFまたはその同族体が 好ましい。
また本発明の軟骨組織修復治療剤においては、 有効成分として b FGFの同 族体を用いてもよい。 ここで、 b FGFの同族体とは、 下記 〔I〕 または 〔I I〕 のポリペプチドを意味する。
〔 I〕 特定の哺乳動物で産生される b FGFと実質的に同一のァミノ酸配列か らなるポリペプチド。 実質的に同一のアミノ酸配列とは、 アミノ酸配列中の 1 〜 6個のアミノ酸が別種のアミノ酸により置換されたもので b FGFの生物活 性を有するものを意味する。
〔 I I〕特定の哺乳動物で産生される b FGFの N末端および/または C末端、 あるいは上記 〔I〕 のポリペプチドの N末端おょぴノまたは C末端に、 追加の アミノ酸セグメントが追加されたポリぺプチド。 追加のアミノ酸セグメントと は、 1〜12個のアミノ酸からなり、 b FGFの生物活性または上記 〔I〕 の ポリペプチドの生物活性を損わないものを意味する。
ヒ ト b FGFはアミノ酸 146個のポリペプチドであるが、 本発明の治療剤 においては、 ヒ ト b FGFの同族体 （前記 〔I〕 の同族体） として、 例えば特 表平 2— 504468号公報に記載のアミノ酸 146個のポリべプチドを用い てもよい。 このポリペプチドは、 ヒ ト b FGFのアミノ酸配列を構成する 69 位のシスティン (Cy s) および 87位のシスティン (Cy s) がそれぞれセ リン （S e r) により置換されたものである。
また、 前記 〔I I〕 の同族体として、 例えば特表昭 63- 500843号公 報に記載のアミノ酸 155個のポリペプチドを用いてもよい。 このポリべプチ ドは、 ヒト b FGFの N末端にアミノ酸 9個のセグメントが付加されたもので ある。
また、 N末端に Me t—が付加されたアミノ酸 147個のポリペプチドや、 特表昭 63— 501953号公報に記載の N末端にアミノ酸 1 1個からなるセ グメントが付加されたアミノ酸 157個のポリべプチドを用いてもよい。
特に好ましい b FGFとしては、 トラフエルミン （遺伝子組換え） が挙げら れる。
本発明の治療剤においては、 一種類の b FGFを単独で使用してもよいし、 複数種を併用してもよい。 さらに、 前述したように、 b F G Fの同族体は複数 種あるが、 これらの同族体についても、 それぞれを単独で使用してもよいし、 併用してもよい。
なお、 生体内における b F G Fの存在量は極微量であるため、 本発明の治療 剤を商業的に安定して供給する上からは、 遺伝子組換え技術により大腸菌等の 微生物または培養細胞に産生させた b F G Fまたはその同族体を使用すること が特に好ましい。 b F G Fまたはその同族体 （この場合は一般に前記 〔I〕 の ポリペプチド） を産生させるための遺伝子を微生物または培養細胞に組み込ん だ場合、 この微生物または培養細胞から産生されるものは、 一般に、 b F G F の N末端おょぴノまたは C末端、 または上記 〔I〕 のポリペプチドの N末端お よびノまたは C末端に、 追加のアミノ酸セグメントが付加したもの、 すなわち 前述した 〔I I〕 のポリペプチドである。
本発明における架橋ゼラチンゲルの原料となるゼラチンは、特に制限はなく、 通常入手できるものでよい。 このようなゼラチンとしては、 例えば、 等電点 5 付近のアルカリ処理ゼラチン（酸性ゼラチン）、等電点 9付近の酸処理ゼラチン (アルカリゼラチン） などが挙げられるが、 b F G Fとの親和性の点で、 等電 点 5付近の酸性ゼラチンが好ましい。 ゼラチンは、 一種類のみではなく、 原料 や、 溶解性、 分子量、 等電点等の物性の異なるものを適宜混合して用いてもよ レ、。
本発明で用い得るゼラチンを架橋するための架橋剤としては、 生体に対する 毒性がないものであれば特に限定されないが、 例えば、 ダルタルアルデヒド、 1ーェチルー 3— （ 3—ジメチルァミノプロピル） カルポジィミド塩酸塩や 1 —シクロへキシノレ一 3— （2—モルホリノエチル） カルポジイミド一メ トー p —トルエンスルホナート等の水溶性カルポジイミ ド、 ビスエポキシ化合物、 ホ ルマリンなどが好ましく、 グルタルアルデヒドおよび 1—ェチルー 3— ( 3— ジメチルァミノプロピル） カルポジィミ ド塩酸塩が特に好ましい。
ゼラチンは、 熱処理または紫外線照射もしくは電子線照射によって架橋して もよい。
本発明で用いる架橋ゼラチンゲルの形状は特に制限はなく、例えば、円柱状、 角柱状、 シート状、 ディスク状、 球状、 粒子状、 粒状、 ペースト状などが挙げ られる。 インプラントとして用いる場合には、 円柱状、 角柱状、 シート状、 デ イスク状のものが好ましく、 注入可能な製剤として用いる場合には、 球状、 粒 子状、 粒状、 ペースト状のものが好ましい。
円柱状、 角柱状、 シート状、 ディスク状の架橋ゼラチンゲルは、 ゼラチン水 溶液に架橋剤水溶液を添加する力、あるいは架橋剤水溶液にゼラチンを添加し、 所望の形状の鎵型に流し込み、 架橋反応させて調製することができる。 また、 成形したゼラチンゲルをそのまま、 あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加して もよい。 架橋反応を停止させるには、 エタノールァミン、 グリシン等のアミノ 基を持つ低分子物質に接触させるか、 または pH2. 5以下の水溶液を添加す る。 得られた架橋ゼラチンゲルは、 蒸留水、 エタノール、 2—プロパノール （ 以下、 I PAと称する）、 アセトン等により洗浄し、 製剤調製に供される。 得られる架橋ゼラチンゲルの含水率は、 50〜99 wZwO/oである。ここで、 ゲルの含水率とは、 湿潤時のゲル全重量に対するゲル中の水分重量の割合を示 す。
ペースト状の架橋ゼラチンゲルは、 上述の円柱状、 角柱状、 シート状、 ディ スク状の架橋ゼラチンゲルの調製方法と類似の方法で調製することができる。 球状、 粒子状、 粒状の架橋ゼラチンゲルは、 例えば、 撹拌用モーター （例え ば、新東科学社製、スリーワンモーター、 EYE L A m i n i D. C. S t i r r e r等） とテフロン （登録商標） 製撹拌用プロペラを三つ口丸底フラ スコに取り付け、 これらを固定した装置に、 ゼラチン水溶液を入れ、 ここにォ リーブ油等の油を加えて 200〜600 r pm程度の速度で撹拌し、 WZO型 ェマルジヨンとし、 これに架橋剤水溶液を添加するか、 ゼラチン水溶液を予め ォリーブ油中にて前乳化 （例えば、 v o r t e x m i e r A d v a n t e c TME— 2 1、 ホモジナイザー p o l y t r o n PT 10— 35等 ) しておいたものをオリープ油中に滴下し、 微粒子化した W/O型ェマルジョ ンを調製し、 これに架橋剤水溶液を添加し、 架橋反応させ、 遠心分離により架 橋ゼラチンゲルを回収し、 アセトン、 酢酸ェチル等で洗浄し、 さらに I PA、 エタノール等で洗浄して乾燥させる。 次に、 Twe e n 80を含む水溶液に 1 O OmMグリシンを加え、 その中に粒子を懸濁させることで架橋反応を停止さ せることにより調製することができる。 得られた架橋ゼラチンゲル粒子は、 I PA、 Twe e n 80を含む蒸留水、 蒸留水等で順次洗浄し、 製剤調製に供さ れる。
架橋ゼラチンゲル粒子が凝集する場合には、 例えば、 超音波照射 （冷却下、 1分以内程度が好ましい） 等を行ってもよい。
なお、 前乳化することによって、 粒子サイズ 20 m以下の微粒子状の架橋 ゼラチンゲルが得られる。
得られる架橋ゼラチンゲル粒子の平均粒子径は、 1〜100 O /zmであり、 目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けして使用する。 局所投与す る場合は平均粒子径 10〜1 50 μηιの粒子を用いるのが好ましい。 また、 得 られる架橋ゼラチンゲル粒子の含水率は 50〜 99%程度であり、 適宜好まし い含水率のものを調製できる。
球状、 粒子状の架橋ゼラチンゲルを調製する別法として次のような方法もあ る。
上記の方法と同様の装置にオリープ油を入れ、 200〜600 r pm程度の 速度で撹拌し、 ここにゼラチン水溶液を滴下し、 wZo型ェマルジヨンを調製 し、 これを冷却後アセトン、 酢酸ェチル等を加えて撹拌し、 遠心分離によりゼ ラチン粒子を回収する。 回収したゼラチン粒子をさらにアセトン、 酢酸ェチル 等、 次いで I PA、 エタノール等で洗浄後、 乾燥させる。 乾燥ゼラチン粒子を 0. l%Twe e n 80を含む架橋剤水溶液に懸濁し、 緩やかに撹拌しながら 架橋反応させ、 使用した架橋剤に応じて 0. l%Twe e n 80を含む 100 mMグリシン水溶液または 0. l%Twe e n 80を含む 0. 004N HC 1などにて洗浄して架橋反応を停止することにより架橋ゼラチンゲル粒子を得 ることができる。
本別法で得られる架橋ゼラチンゲル粒子の平均粒子径ぉよぴ含水率は、 上記 の方法で得られるものと同様である。
架橋反応条件は適宜選択すべきものであるが、 反応温度は 0〜40°C、 反応 時間は 1〜48時間が好ましい。
上記のようにして得られた架橋ゼラチンゲルは減圧乾燥または凍結乾燥させ ることもできる。
凍結乾燥は、 例えば架橋ゼラチンゲルを蒸留水に入れ、 液体窒素中で 30分 以上または— 80°Cで 1時間以上凍結させた後に凍結乾燥機で 1〜3日間乾燥 させることにより行う。
架橋ゼラチンゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度は、 所望の含水率 により適宜選択すべきであるが、 ゼラチン濃度 1〜10 Ow/v°/0、 架橋剤濃 度 0. 01〜100wZv% (1〜540 OmMに相当） が好ましい。
架橋ゼラチンゲルは、 原料であるゼラチンと架橋剤の濃度を変化させること により所望の含水率とすることができる。 含水率を高くするには、 ゼラチン濃 度および架橋剤濃度を共に低くし、 逆に含水率を低くするには、 ゼラチン濃度 および架橋剤濃度を共に高くすればよい。
上記のようにして調製した架橋ゼラチンゲルに b F G Fを担持させるには、 b FGF水溶液を架橋ゼラチンゲルに滴下して含浸させるか、 架橋ゼラチンゲ ルを b FGF水溶液中に懸濁して再膨潤させる。
架橋ゼラチンゲルに担持させることができる b FGFの量は、 架橋ゼラチン ゲルの含水率等により異なるが、 架橋ゼラチンゲル lmg当たり 0. 1〜50 0 μ gが可能である。
なお、 徐放期間、 b FGFの放出量等は、 架撟ゼラチンゲルの含水率、 用い たゼラチンの等電点等の物性、 製剤に担持される b FGFの量、 投与される部 位などの種々の条件により異なる。 上記のようにして得られた b F G F担持架橋ゼラチンゲル製剤は、 凍結乾燥 することもできる。 凍結乾燥する場合には、 例えば、 液体窒素中で 30分以上 または一 80°Cで 1時間以上凍結させた後に、 凍結乾燥機で 1〜3日間乾燥さ せることにより行う。
本発明の治療剤を注入可能な製剤とする場合には、 注射用精製水、 生理食塩 水、 緩衝液などの媒体に適宜懸濁する。 緩衝液としては、 リン酸緩衝液、 酢酸 緩衝液、 クェン酸緩衝液などが挙げられる。 さらに必要に応じ、 注射可能な製 剤の製造に通常使用される、 分散剤、 界面活性剤、 等張化剤、 pH調整剤、 無 痛化剤、 安定化剤、 保存剤、 着色剤などを適宜配合することができる。
本発明の治療剤の投与方法は、 局所投与が好ましい。 具体的には、 例えば b FGFを担持させた粒子状のゲルを適切な媒体に懸濁した注射剤形の治療剤を 患部に注入するか、 または b FGFを担持させたシート状やディスク状のゲル 製剤を患部に留置する方法、 あるいは体外より注射器を用いて疾患部位に注入 する方法等により使用することができる。
本発明の治療剤は、 優れた軟骨組織修復作用を有しており、 例えば （1) 変 形性関節症、 （2)感染による関節炎後または慢性関節リゥマチ等膠原病に伴う 関節炎後に生じた関節破壊後の関節修復、 （3)外傷性、離断性骨軟骨炎により 生じた軟骨欠損の修復、 （4)椎間板変性または椎間板ヘルニア等の脊椎疾患の 治療等、 各種軟骨組織疾患の治療に用いることができる。 また本発明の治療剤 は、 ヒトのみならずその他の哺乳動物（例えば、マウス、 ラット、ハムスター、 ゥサギ、 ネコ、 ィヌ、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） における各種軟骨組織疾患に も適用可能である。
本発明の治療剤の投与量は、 対象や適応症の種類、 軟骨組織疾患の程度、 対 象の年齢や病態により異なるので特定することは困難であるが、 例えば、 ヒ ト における関節軟骨組織修復の場合には、 b FGF量で、 1箇所の処置部位に対 して 1回の処置あたり、 およそ 0. 001 /z g〜10mg、 好ましくは 1〜1 000 /z gの範囲である。 投与回数は症例、 1回の処置あたりの投与量にもよ るが、 通常 1〜10回程度とする。 さらに症状の種類や程度によって、 2〜6 回投与してもよい。
実施例
以下、 実施例および試験例を示し本発明を具体的に説明するが、 これらは本 発明を何ら限定するものではない。
(実施例）
ゼラチン粒子の作製
サイズ一平均粒子径 30〜70 //mゼラチン粒子、 含水率一 95 %
等電点 5の牛骨アルカリ処理ゼラチン （t y p e 1コラーゲン；新田ゼラチ ン社製） を用い、 平均粒子径 30〜 70 mの粒子を作製した。 この粒子をグ ルタルアルデヒドで架橋し凍結乾燥させ、 ハイドロゲルを作製し、 エチレンォ キサイドガスを用いガス滅菌した。
注射製剤の作製
適量の b FGF (トラフエルミン （遺伝子組換え）、 科研製薬 （株） 社製） を PB Sで調製し、 10 ; 1の混合液を作製した。 この混合液を lmgのゼラチ ン粒子に含浸させた。 10/ g b FGF含浸粒子投与群用に、 lmgのゼラ チン粒子に 10 gの b FGFを含浸させた粒子、 100 i g b FGF含浸 粒子投与群用に、 lmgのゼラチン粒子に 100 gの b FGFを含浸させた 粒子をそれぞれ作製した。 関節注射の直前にこれらのゼラチン粒子をそれぞれ 300 1の PB Sに分散させて、 27 Gの注射器 （マイジエタター） に注入 した。 なお、 b FGF溶液 （PBS溶解） についてはゼラチン粒子への含浸は 行わず、 300μ 1の PB S中に 10 / gの b FGFを含有する溶液を作製し、 これを 27Gの注射器 （マイジェクタ一） に注入した。
(試験例）
二次性 OAモデル一前十字靭帯切除ゥサギ （ACLT r a b i t) の作製 日本白色家兎 （2k g) にキシラジン 10mg、 ケタミン 5 Omgの筋肉注 射を施行し麻酔を行った。 左膝関節に正中切開を加え、 皮下を展開後、 膝蓋骨 の内側で関節包を切開し関節を展開した。 膝蓋骨を外側に脱臼させ、 膝関節の 外側に存在する副靭帯を切除した。 膝蓋骨下の脂肪を切除し前十字靭帯を露出 させた。 これを尖刃おょぴパンチを用いて完全に切除した。 関節内を生理食塩 水で洗浄後、 皮下おょぴ皮膚を縫合した。
関節注射のプロトコール
家兎に手術時と同様の手技で麻酔を行い、 手術施行 4週後、 および 7週後に 実施例で作製した注射製剤の関節注射を施行した。 関節注射は左膝関節 90° 屈曲位で膝蓋腱の外側から施行した。 OA治療効果を手術施行 10週後に検討 した。
評価方法
家兎を安楽死させ、 膝関節を一塊として取り出し、 関節包を切開し、 大腿骨 遠位関節面 （内顆、 外顆） を露出させた。
I n d i a i n kを関節面に塗布し、 関節面の不整、 線維化 （ f i b r i 1 1 a t i o n)、軟骨の消失の状態を肉眼的に判別可能とし、デジタルカメラ で接写拡大撮影した。 撮影した画像により OAの重症度を以下のように分類し た。 内顆、 外顆ともに評価し、 G r a d eの高い方をその膝の O Aの G r a d eとした。 各 G r a d eの定義は以下の通りである。 通常、 内顆により高い G r a d eの OAの変ィ匕を認めた。
G r a a e 正常関節面
G r a a e 軽度の不整あるいは線維化
G r a d e 著明な関節面の線維化
G r a d e 4 a ： 軟骨の消失による軟骨下骨の露出 （軟骨下骨の露出部分 の長径が 2 mm以下）
G r a d e 4 b : 軟骨の消失による軟骨下骨の露出 （軟骨下骨の露出部分 の長径が 2 mmより大きく 5 mm以下）
G r a d e 4 c : 軟骨の消失による軟骨下骨の露出 （軟骨下骨の露出部分 の長径が 5 mmより大きい） そして各 G r a d eを以下のように S c o r eィ匕 （0〜5) した c
G r a d e 1 一 S c o r e 0
G r a d e 2 一 s c o r e 1
G r a d e 3 ― s c o r e 2
G r a d e 4 a ― s c o r e 3
G r a d e 4 b 一 s c o r e 4
G r a d e 4 c 一 s c o r e 5
各投与群の S c o r eを平均し、 群間の比較を行った。 結果を図 1およぴ以 下に示す。
非処置群 2 8 (n = 6)
PB S含浸粒子投与群 2 3 (n=7)
10 g b FGF溶液 （PB S溶解） 投与群 2 7 (n= 6) 10 g b FG F含浸粒子投与群 0 (n= 7) 100 ^ g b F G F含浸粒子投与群 0 6 (n= 7) b FGF溶液投与群では、治療効果は認められなかった。一方、 10 /z g b FGF含浸粒子投与群おょぴ 100 g b FGF含浸粒子投与群では、 非処 置群と比較して有意に低い S c o r eが得られ、 OA治療効果が認められた。
産業上の利用可能性
本発明の治療剤における架橋ゼラチンゲルは、 投与部位に長期にわたって滞 留し、 加水分解酵素によって徐々に分解されることから、 該ゲル.に担持された b FGFもゲルの分解と共に徐々に放出される。そのため、本発明の治療剤は、 軟骨組織を修復すべき局所に b FGFを長期にわたって集中的に滞留させるこ とが可能であり、特に、局所への適用に適する。放出性を制御できることから、 必要な投与量の設定が容易となり、 過剰投与を抑制することができる。 また、 本発明に係る架橋ゼラチンゲルの関節内投与は、 手技においても簡易であるこ とから、 例えば、 変形性関節症などにおける関節軟骨の修復において画期的な 保存療法となり得るものである。 以上、 本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、 当業者であれ ば示された特定の態様には、 本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲 で様々な修正と変更をなすことは可能である。 従って、 そのような修正及ぴ変 更も、 すべて後記の請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれる ものである。
本出願は、 日本で出願された特願 2 0 0 4— 7 5 2 0 9 (出願日 ： 2 0 0 4 年 3月 1 6日） を基礎としており、 その内容は本明細書に全て包含されるもの である。

Claims

請求の範囲
1 . 塩基性線維芽細胞成長因子および/またはその同族体を架橋ゼラチンゲ ルに担持させてなる、 軟骨組織修復治療剤。
2 . 塩基性線維芽細胞成長因子およぴノまたはその同族体を架橋ゼラチンゲ ルに担持させてなる、 関節軟骨組織修復治療剤。
3 . 塩基性線維芽細胞成長因子およぴ Zまたはその同族体を架橋ゼラチンゲ ルに担持させてなる、 変形性関節症治療剤。
4 . 架橋ゼラチンゲルが、酸性ゼラチンを架橋することにより得られる架橋ゼ ラチンゲノレである、 請求の範囲 1〜 3のいずれか 1項に記載の治療剤。
PCT/JP2005/005300 2004-03-16 2005-03-16 架橋ゼラチンゲルを担体とする軟骨組織修復治療剤 WO2005087257A1 (ja)

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