KR100683603B1 - 창상 치유용 미소구 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 창상치유 및 근육재생을 가속화시키기 위하여 창상 및(또는) 병소에 적용하기 위한 미소구 (microsphere)의 치료 조성물에 관한 것이다. 미소구는 상당한 표면전하를 갖는 비-생분해성 물질로 제조된다. 본 발명의 치료 조성물은 또한 미소구가 불용성인 제약상 허용되는 담체 및 조성물을 보유하기 위한 용기를 포함한다. 치료 조성물은 또한 창상치유과정을 가속화시키는 약리제제 또는 생물학적제제를 함유한다.
창상, 미소구, 다점접촉, 비-생분해성, 표면그룹, 폴리스티렌, 설페이트, 크레아틴, 포스포키나제, 근아세포, 콜라겐

Description

창상 치유용 미소구 조성물{Compositions of Microspheres for Wound Healing}
본 출원은 그의 내용이 온전히 본 명세서에 참고로 포함되어 있는 1997년 6월 4일자 출원된 미국특허출원 제 08/868,950호의 부분연속출원이다.
본 발명은 창상 및(또는) 병소에 적용하기 위한 미소구 (microsphere)의 조성물, 및 창상 또는 병소의 예방 및 치료시에 이 조성물을 단독으로 또는 다른 제제와의 배합물로 사용하는 방법에 관한 것이다.
창상치유 (wound healing)는 세포, 세포외 매트릭스 성분 및 세포의 미소환경과 같은 인자를 포함함을 특징으로 하는 복잡한 과정이다. 필수적으로, 모든 창상치유는 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관 또는 혈관조직을 포함한 (이들로 제한되는 것은 아니다) 손상된 조직의 복원 (repair) 또는 복위 (replacement)를 포함한다. 이러한 모든 과정은 특정한 기본원리를 포함하지만, 이러한 복원 또는 복위의 정확한 성질은 관련된 조직에 따라 달라진다. 창상치유의 중요한 관점은 창상이 인장강도를 획득하는 속도이다.
피부는 긴장 (tension) 및 신장성 (extensibility)을 나타낸다. 피부긴장은 창상에 대한 반응에 있어서의 결정인자 중의 하나이며, 연령 및 부위에 따라 다르다. 피부는 각질, 표피 및 진피를 포함한 다수의 층을 가지며, 세포, 콜라겐과 엘라스틴으로 구성된 섬유상 네트워크, 및 단백질 폴리사카라이드, 당단백질, 구상단백질, 염류 및 물로 구성된 무정형 기본물질을 함유한다. 대부분의 경미한 상해에서와 같이 표피 만이 손상된 경우에는, 각질세포가 창상의 가장자리로부터 이동하여 결국 창상을 덮어서 표피 및 각질을 재형성시킨다 (Knighton, D.R. and Fiegel, V.D., 1991, Invest. Radiol: 26:604-611).
피부의 모든 층이 손상되거나 파괴되는 경우에는, 우선 육아조직이라고 불리우는 새로운 결합조직이 창상 공간을 채워야 한다. 이 조직은 창상 공간내로 이동하는 섬유아세포에 의한 세포외 매트릭스 성분, 예를들어 콜라겐의 침착에 의해 형성된다. 콜라겐의 합성 및 침착은 창상치유에 있어서 중요한 사건이며, 콜라겐 합성속도는 기관에서 마다 다르다 (Haukipuro, K. et al., 1991, Ann. Surg. 213:75-80).
성공적인 창상치유를 위해서는 창상치유의 전체 다단계 과정이 완료되어야만 한다. 이들 성분중의 하나 또는 그 이상이 빠지면 치유는 일어나지 않으며, 피부는 복원되지 않고 창상은 노출된 채로 남게 된다. 이와 같이 노출된 창상은 쉽게 감염될 수 있게 되어 치유의 과정을 더 지연시키고 피부상에서 궤양 및 미란의 형성을 야기시킬 수 있다. 창상치유의 과정은 또한 다수의 환자에게서는 당뇨병 또는 고령을 포함한 (이들로 제한되는 것은 아니다) 병발하는 다른 상태의 존재로 인 해 억제된다. 이러한 상태를 갖는 환자들은 종종 궤양화하고 치유되지 않거나, 장기간이 경과한 후에야만 단지 느리게 치유되는 피부창상을 갖는다.
창상이 치유되는 속도를 가속화시키기 위해서 다양한 치료방법이 사용되어 왔으며 (미국특허 제 4,772,591호; 미국특허 제 4,590,212호), 다양한 제약 담체들, 예를들어 크림, 겔, 분말 및 미소구가 창상에 화학요법제를 송달하기 위하여 사용되어 왔다. 미국특허 제 5,264,207호에는 하나 또는 그 이상의 활성 제약 또는 화장용 물질을 위한 담체로서 작용하는 폴리머의 미소구가 기술되어 있다. 폴리머 미소구는 고체이거나 중공성이며, 담체 액체에 불용성이고, 1000 ㎚ (1 ㎛)를 넘지 않는 다양한 크기를 갖는데, 바람직한 크기는 50 내지 500 ㎚ (0.05 ㎛ 내지 0.5 ㎛) 범위이고, 가장 바람직한 크기는 60 내지 300 ㎚ (0.06 ㎛ 내지 0.3 ㎛) 범위이다. 미소구의 미세도 (fineness)는 피부공극을 막는 통상적인 부형제의 단점이 없이, 단위중량 당 더 큰 비면적 및 활성성분에 대한 미소구의 더 고도의 배합을 제공한다. 즉, 미국특허 제 5,264,207호의 발명에 따르면, 미소구의 현탁액은 활성물질을 미소구 상에 흡착시키고, 또 다른 물질은 화학적 결합에 의해 미소구에 결합시키고, 세번째 물질은 정전기적 또는 이온적 결합에 의해 미소구에 결합할 수 있는 가능성을 가지고 수득될 수 있다 (칼럼 2, 58-63행). 미소구가 중공성인 경우에, 이들은 기능성 그룹의 흡착제 및(또는) 담체 둘다이다 (칼럼 3, 18-21행). 미소구가 공극을 함유하는 경우에, 제약 또는 화장용 물질과의 결합은 공극내로의 흡착으로 구성된다 (칼럼 3, 26-28행). 즉, 미국특허 제 5,264,207호에는 제약 및(또는) 화장용 성분에 대해 담체로서만 작용하는 미소구의 조성물이 기술되어 있으며, 창상치유를 증진시키기 위해서 미소구 그 자체만을 사용하는 것에 대해서는 시사하지도 제안하지도 않았다.
마찬가지로, PCT 특허출원 제 WO96/13164 및 WO94/13333호 둘다에는 특정한 치료 물질의 생성이나 유리에 대한 촉매작용을 하는 물질로 만들어진 미소구가 기술되어 있다. PCT 출원 제 WO96/13164호는 손상된 조직에 직접 적용하였을 때 산화질소를 유리시키는 폴리머성 산화질소 부가물을 기술하고 있다. PCT 출원 제 WO94/13333호에는 창상환경에서 유리래디칼 활성을 갖도록 화학적으로 변형된 입자가 기술되어 있다. 즉, 어떠한 문헌도 미소구 물질의 화학적 변형이 없이 미소구 그 자체를 치료 물질로서 사용하는데 대해서는 시사하지도 제안하지도 않았다.
미소구의 크기는 세포독성 T 림프구의 활성화에 사용된 클래스 I 동종항원 (alloantigen)에 대한 담체로서의 미소구의 효과에 영향을 미치는 것으로 나타났다 (Mescher, M.F., 1992, J. Immunol 149:2402-2405). 반응은 직경 4 또는 5 ㎛ (4000 ㎚ 또는 5000 ㎚)의 미소구의 최적크기에 있어서 클래스 I 항원에 대해 의존적이었다. 다시 말해서, 메셔 (Mescher)는 시험관내에서 T 림프구의 활성화는 미소구 만을 사용하여서는 성취될 수 없고 활성화를 유도하기 위해서는 클래스 I 항원이 필요하였다고 기술하였다. 항원은 4 또는 5 ㎛ 직경의 미소구, 즉 미국특허 제 5,264,207호 (Bommelser J., et al.에게 허여됨)에서 사용된 미소구 보다 크기가 4 내지 5배 더 큰 미소구와 결합하였을 때 최적으로 반응하였다. 여기에서 메셔는 창상치유의 활성화에 있어서 활성성분인 클래스 I 항원이 없이 미소구 만을 단독으로 사용하는 것은 시사하거나 제안하지 않았다. 실제로, 창상치유 및 콜라겐 합성에 있어서의 미소구 및 세포독성 T 림프구의 역할은 메셔에 의해서 전혀 시사되지도 제안되지도 않았다. 더구나, 더 큰 미소구는 피부공극을 차단할 수 있기 때문에 보멜서 (Bommelser)는 크기가 1000 ㎚ 또는 1 ㎛ 이상인 미소구의 사용은 배제하도록 시사하였다. 따라서, 본 발명은 선행기술에 내재되는 것이 아니고 (선행기술의 조성물과 성분에 있어서의 차이가 있기 때문에), 선행기술로부터 자명한 것도 아니다 (사용된 미소구의 크기가 피부공극을 차단하는 것으로 선행기술로부터 예상될 수 있었던 것이기 때문에).
창상치유의 과정은 빠른 세포대사 및 증식, 조직파편의 처리, 섬유아세포의 가동화 (mobilization) 및 순환의 회복을 촉진시키기는 초기증식상을 포함한다. 이 기간중에 창상은 가장 감염되기 쉽다. 창상치유의 후속상 (또한 섬유조직형성상이라고 부른다) 중에는, 인장강도의 증가가 창상의 콜라겐 함량에 있어서의 증가와 유사하다. 따라서, 비-생분해성 미소구 및 그 위치에서 증식상을 촉진시키고 섬유조직형성상을 조절할 수 있는 그밖의 세포외 성분을 함유하는 창상치유용 조성물을 개발하고자하는 필요성이 남아있다.
따라서, 화상조직, 수술후의 감염, 수술창상 파괴, 내부궤양, 출혈, 골괴저, 욕창, 와창, 타협된 절단부위, 비-치유 외상성 창상, 화장, 면도후, 치과작업, (당뇨병, 정맥류성 정맥, 졸중후의) 만성궤양, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 척추상해성 창상, 부인과적 창상, 화학적 창상, 혈관질환 창상, 당뇨성 피부미란, 당뇨성 발, 신체적 외상, 성형수술후 봉합부위, 햇빛화상 (sunburn) 또는 외음절개술을 포함한 (이들로 제한되는 것은 아니다) 다양한 상태에 대하여 동물 및 인간에게서 창상치유 중에 증식상의 촉진과 섬유조직형성상의 발현이 평형을 이루어야만 한다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 목적은 창상의 형성을 예방하거나 창상치유를 촉진시킬 수 있으며, 창상 또는 병소의 윤곽에 또는 창상 또는 병소 내에 적용하였을 때 창상/병소 드레싱 (dressing)으로서의 역할을 할수 있는 예방적 및 치료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 근육, 피부, 연골, 신경조직, 연조직 또는 혈관조직의 재생의 촉진제로서 작용하는 창상드레싱으로서의 역할을 할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 본 발명의 목적은 창상/병소 피복물 (covering)로서의 역할을 할 수 있는, 즉 젖었을 때 부착성이 있으며, 잠재적으로 독성인 접착제를 필요로하지 않고 창상/병소 부위와 접촉한 채로 유지될 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미소구를 위한 매질 및 제약 제제를 위한 약물송달시스템으로서의 역할을 할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 여전히 또 다른 목적은 근아세포 융합을 촉진시키는 작용을 하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시험관내 및 생체내에서 콜라겐 합성을 촉진시키는 작용을 하는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 본 발명의 목적은 반흔형성을 방지하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미소구, 및 여기에 첨가된 창상치유를 촉진시키는 작용을 하는 외인성 성장인자를 포함함을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 여전히 또 다른 목적은 미소구 및 항염제를 포함함을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미소구 및 항히스타민제를 포함함을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미소구 및 항생제를 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 본 발명의 목적은 미소구 및 비타민을 포함함을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미소구 및 무기질을 포함함을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 아직도 또 다른 목적은 미소구 및 항암제, 항바이러스제 및 항진균제를 포함함을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수술, 방사선요법, 호르몬요법 또는 화학요법에 대한 보강요법으로서 적용되는 것으로, 활성성분을 함유하거나 함유하지 않는 미소구를 포함함을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미소구 및 진통제, 마취제 또는 수렴제를 포함함 을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미소구 및 콜라겐을 포함함을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 아직도 또 다른 목적은 미소구, 및 항염제, 항히스타민제, 항생제, 방부제, 항진균제, 진통제, 마취제, 무기질, 비타민, 수렴제 및 콜라겐으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 약제를 포함함을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미소구 및 창상치유를 촉진시키는 작용을 하는 기질세포를 포함함을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미소구, 및 성공적이며/이거나 개선된 창상치유에 유익한 유전자 생성물을 발현하는 유전적으로 조작된 기질세포를 포함함을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다. 예를들어, 당뇨성 미란의 경우에는, 죽상동맥경화증, 폐색의 위험을 감소시키기 위한 인슐린 성장인자 (IGF) 또는 항응혈제 유전자 생성물, 또는 치유가 실패할 위험을 감소시키기 위한 항염성 유전자 생성물을 발현하도록 섬유아세포를 유전적으로 조작할 수 있다 (Alila, H. et al., 1997, Human gene Ther. 8:1785-1795; 및 Pickering, J.G. et al., 1996, Semin. Interv. Cardiol. 1;84-88).
본 발명에 따르면 조성물은 하전된 표면그룹을 갖는 미소구를 함유하는데, 여기에서 전하는 음 또는 양의 전하일 수 있다. 미소구 물질은 폴리스티렌, 유도된 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA), 실리콘, 폴리리신, 폴리-N-에틸- 4-비닐피리디늄브로마이드 및 라텍스로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 특정한 구체예에 따르면, 하전된 표면그룹은 폴리스티렌, 유도된 폴리스티렌, 설페이트, 폴리-N-에틸-4-비닐피리디늄브로마이드, 프로타민, 프로타민 설페이트, 프로타민 염, 폴리리신 및 카복실로 구성된 하전된 그룹으로부터 선택된다. 또한 바람직하게는, 미소구는 약 0.01 미크론 내지 약 200 미크론의 범위, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 약 100 미크론의 범위, 가장 바람직하게는 약 2 내지 약 20 미크론 범위의 직경을 갖는다. 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 조성물을 또한 미소구를 위한 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명에 따르면, 조성물은 메틸셀룰로즈, 아가로즈, 덱스트란, 폴리사카라이드, 젤라틴, 알로에베라 추출물 (아세만난-베타-(1,4)-결합된 아세틸화 만난) 또는 그밖의 다른 제약상 허용되는 비히클을 포함하여 (이들로 제한되는 것은 아니다) 겔제제를 형성시키는데 적합한 제약상 허용되는 담체를 함유한다.
본 발명에 따르면 조성물은 조직배양배지 (예를들어, 둘베코 변형이글배지), 식염수 또는 그밖의 다른 제약상 허용되는 비히클로 이루어지는, 액체제제를 형성시키는데 적합한 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명에 따르면, 창상을 치료하기 위한 조성물은 세포막과의 다점접촉 (multipoint contact)을 형성할 수 있는 미소구, 및 미소구가 실질적으로 불용성인 제약상 허용되는 담체, 및 조성물을 보유하기 위한 용기를 포함한다. 예를들어, 담체는 바람직하게는 수성매질, 에어로졸 담체, 연고 및 붕대로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명에 따르면, 세포막과의 다점접촉을 형성할 수 있는 미소구, 및 약제가 실질적으로 불용성인 제약상 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는 근육재생 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 무균조건에서 미소구의 조성물을 보유하며 세포막과의 다점접촉을 형성할 수 있는 용기를 제공한다.
본 발명에 따르면, 미소구 및 하나 또는 그 이상의 활성물질의 무균조성물을 보유하는 용기를 제공한다.
본 발명에 따르면, 미소구의 무균조성물을 보유하는 용기, 및 각각 활성물질의 제제를 보유하며, 창상에 적용하기 전에 미소구와 혼합시킬 수 있거나, 창상부위에 별개로 적용될 수 있는 하나 또는 그 이상의 추가의 용기를 제공한다.
본 발명 및 그의 잇점에 대한 더 완전한 이해를 위해서는, 다음과 같은 첨부된 도면과 함께 이하의 설명을 참고로 하여야 한다:
도 1은 크레아티닌 포스포키나제 활성을 증가시키는 본 발명의 미소구의 능력을 나타내는 그래프이다;
도 2는 콜라겐 합성에 대한 본 발명의 미소구의 효과를 설명하는 도면이다;
도 3A-3C는 근아세포의 형태에 대한 본 발명의 미소구의 효과를 설명하는 것이다;
도 4A-4D는 랫트에게서 창상치유를 촉진시키는 미소구의 능력을 설명하는 것 이다;
도 5는 도 4의 창상면적이 감소하는 속도에 대한 그래프이다;
도 6A 및 6B는 랫트에게서 조직배양배지 및 식염수에 의한 창상치유에 대한 본 발명의 미소구의 효과를 비교한 것이다;
도 7A-7D는 인간에 대한 첫번째 증례연구에서 창상치유를 촉진시키는 본 발명의 미소구의 능력을 설명하는 것이다;
도 8A 및 8B는 또한 도 7A-7D의 인간에 대한 증례연구에서 본 발명의 효능을 더 설명하는 것이다;
도 9A 및 9B는 인간에 대한 두번째 증례연구에서 본 발명의 효능을 설명하는 것이다;
도 10A-10D는 인간에 대한 세번째 증례연구에서 본 발명의 효과를 나타낸 것이다;
도 11A 및 11B는 인간에 대한 네번째 증례연구에서 본 발명의 효능을 나타낸 것이다;
도 12A-12D는 방사선요법 및 화학요법과 병용한 경우의 개체에게서 본 발명의 효과를 기술한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 예방적 및 치료 조성물, 및 미소구를 사용하여 창상치유를 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 놀랍게도, 본 명세서에 기술된 특정의 크기범위의 미소 구는 어떠한 약제 또는 그밖의 다른 치료 물질을 추가로 첨가하거나 포함시키지 않고도 창상치유를 촉진시킬 수 있다. 실제로, 이하에 기술하는 바와 같이, 이들 미소구는 그들의 치료 효과를 나타내기 위해서 분해하거나 다른 화학적 변화를 겪지 않는다. 본 발명의 미소구는 또한 통상적인 치료법, 예를들어 방사선요법, 화학요법, 호르몬, 레이져, 고압 또는 오존요법에 대한 보강요법 (adjuvant therapy)으로서 투여될 수 있다.
미소구의 특징
이들 미소구의 구조는 코어물질, 및 적어도 미소구의 외부상에 존재하는 적어도 한가지 형태의 하전된 표면그룹을 포함한다. 이 물질의 예로는 폴리스티렌, 라텍스, 폴리-β-알라닌, 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA), 실리콘 및 유도된 폴리스티렌과 같은 장쇄 폴리머가 포함된다. 표면그룹의 예로는 설페이트, 폴리-N-에틸-4-비닐피리디늄브로마이드, 프로타민, 프로타민 설페이트, 프로타민 염, 폴리리신, 카복실 및 폴리스티렌이 포함된다. 이들 표면그룹은 코어물질의 일부분으로서 존재할 수 있거나, 장쇄 폴리머의 유도체화와 같은 화학적 공정에 의해 추후에 첨가될 수도 있다. 이하에서 용어 "유도체화 (derivatization)"는 분자 또는 그의 일부분을 화학적으로 변질, 변형 또는 변화시키는 방법을 의미한다. 폴리머로부터 생산된 미소구는 실질적으로 수성매질내에서 불용성이어야 하며, 대신에 이러한 매질내에서 현탁액 또는 분산액을 형성한다.
본 발명의 파라메터를 더 분명히 하기 위하여, 다수의 용어들이 정의되어야 한다. 이하에서, 용어 "창상" 또는 "병소"는 열성화상, 화학적화상, 방사선화상, 햇빛화상과 같이 자외선 조사에 대한 지나친 노출에 의해 야기된 화상, 외음절개술과 같은 의료처치 중에 지속되는 상해를 포함하여 분만 및 출산으로 인한 회음부와 같은 체조직에 대한 손상, 절단을 포함하여 외상-유도된 상해, 자동차 및 그밖의 다른 기계적 사고에서 지속되는 상해, 및 탄알, 칼 및 다른 무기에 의해 야기되는 상해, 및 수술후 상해와 같은 급성적 상태 뿐 아니라 욕창, 와창, 당뇨병 및 순환불량에 관련된 상태 및 모든 형태의 여드름과 같은 만성적 상태를 포함하여 (이들로 제한되는 것은 아니다) 개체의 신체의 어떠한 부분에 대한 손상이라도 포함된다. 본 발명에 의해 치료될 수 있는 신체의 영역에는 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 혈관조직 및 내부기관이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이하에서, 용어 "개체"는 본 발명이 실시되는 인간 포유류 또는 더 하등의 동물을 의미한다.
이하에서, 용어 "촉진"은 가속화 및 증진을 포함한다. 이하에서, "반흔감소"는 켈로이드 및 비후성반흔과 같은 과도한 반흔형성을 예방하거나 감소시키는 것 뿐 아니라, 개체의 피부상에서와 같이 외부적으로 및 유착과 같이 내부적으로 모두 반흔조직 형성의 범위를 감소시키는 것을 포함한다. 마지막으로, 본 발명의 방법은 또한 얼굴의 피부와 같은 피부에 대한 절단 또는 다른 창상에서의 과도한 반흔형성을 방지하기 위해서 및 여드름을 치료하기 위해서 화장용으로 사용될 수도 있음에 주목하여야 한다. 화장품의 개념에서, 용어 "과도한 반흔형성"은 화장용으로 바람직하지 않거나, 허용될 수 없는 어떠한 반흔형성이라도 모두 포함된다.
이하에서는 특정한 형태의 미소구에 대하여 검토하였지만, 이것은 어떤 식으로든 제한하고자 하는 의도가 아님을 주목하여야 한다. 이들 미소구가 더욱 일반적으로는 고체이거나 중공성인 비드, 입자 또는 소구일 수 있다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 이해될 수 있을 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 이들 미소구는 약제가 실질적으로 불용성인 제약상 허용되는 담체 매질내에, 예를들어 수성매질내에서 현탁액으로서, 또는 연고, 에어로졸 스프레이 또는 폐색성이거나 비폐색성일 수 있는 붕대와 같은 비수성 매질내에 분산된다. 미소구의 형태는 구형 또는 타원형과 같이 규칙적일 수 있거나, 규칙적인 비구형일 수 있으며; 또는 표면이 단일의 연속적인 곡선이 아니거나 또는 표면이 평활하지 않아서 입자의 형태가 불규칙적일 수 있다.
또한, 미소구는 다양한 폴리머들의 혼합물일 수 있으며, 또한 다양한 크기의 다양한 입자, 비드 또는 소구의 혼합물일 수도 있다. 이 약제는 또한 다양한 크기의 공극을 가질 수도 있다.
예를들어, 폴리-β-알라닌과 같이 약제를 형성하는 장쇄 폴리머는 가교결합될 수 있으며, 특히 바람직한 것은 미소구의 구형이지만, 이러한 형태는 가교결합 없이도 수득될 수 있다. 가교결합된 폴리-β-알라닌 미소구를 제조하는 방법의 예는 미국특허 제 5,077,058호에 제시되어 있지만, 이 물질은 미소구의 전반적인 표면전하를 얻기 위해서 추가의 유도체화가 필요할 수 있다는 것에 주목하여야 한다.
또 다른 것으로, 특히 폴리머가 가교결합되지 않는 경우에, 입자는 무질서한 불규칙적 형태를 가질 수 있다. 입자는 코일, 소구, 확장되고 무작위적인 코일과 같은 어떠한 형태라도 될 수 있다. 바람직하게는, 폴리머는 생화학적으로 반응성이 없어야 하며, 비-생분해성이어야 한다. 가장 바람직하게는, 폴리머가 창상의 치유를 위해 필요한 기간중에 분해되지 않은 채로 유지될 수 있도록 폴리머는 치료기간 중에 실질적으로 비-생분해성이다. 이하에서, 용어 "비-생분해성"은 창상의 치료를 위해 필요한 기간인 치료기간 중에 생분해성이 없는 약제를 의미한다.
적어도 이 약제는 다음과 같은 특성을 가져야 한다:
1. 이들은 외부세포막 및 이 막상의 분자와 같은 세포 또는 그 세포의 일부분과 다점접촉을 형성할 수 있어야 한다;
2. 이들은 현저한 화학적 변화 또는 분해가 없이 창상치유를 촉진시킬 수 있어야 한다;
3. 이들은 체액과 같은 수성매질내에서 실질적으로 불용성이어야 하며, 대신에 현탁액을 형성하여야 한다.
이들 특징은 이하에서 더 상세히 논의하는 바와 같이, 본 발명의 약제의 효과가 약제의 물질과 외부세포막과 같은 세포의 일부분 사이에서 다점접촉이 형성되고 이렇게 함으로써 세포에 대해 부착하도록 세포를 위한 접착성 표면이 형성되도록 하는 것과 직접적인 관련이 있는 것으로 보이기 때문에 중요하다. 이러한 다점접촉은 하전된 그룹이 분자와 외부세포막의 일부분과의 상호작용에 이용될 수 있도록 허용하는 다수의 다양한 폴리머에 의해 이루어질 수 있다. 따라서, 이하의 설명은 약제의 한가지 형태인 미소구에 중점을 두었지만, 본 발명은 이러한 다점접촉을 형성할 수 있는 어떠한 물질도 포함함을 특징으로 하는 것으로 이해된다.
상기에서 지적한 바와 같이, 미소구는 바람직하게는 약 0.01 미크론 내지 약 200 미크론 범위, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 약 100 미크론의 범위, 가장 바람직하게는 약 2 내지 약 20 미크론의 직경을 갖는다. 본 발명의 미소구 조성물은 현탁액 중에 0.001 내지 25 중량%를 차지한다. 어떠한 기전에 얽매임이 없이, 이들 바람직한 범위는 창상영역을 침윤시키는 대식세포에 의한 미소구의 흡수를 가능하게 하는 최상의 크기인 것에 주목하여야 한다. 미소구는 대식세포의 적어도 일부분, 아마도 대식세포의 외부세포막의 분자와의 접촉을 통해 실질적으로 대식세포를 유인하여 활성화시키는 것으로 보인다. 따라서,미소구에 대해 관찰된 항염 및 항균효과는 대식세포 또는 다른 세포의 활성화를 통해 얻어지는 간접적인 효과인 것으로 추정된다.
미소구의 또 다른 중요한 특성은 표면그룹의 전하이다. 미소구의 특정한 바람직한 예에 의해 운반되는 전체 전하는 제타매스터 (ZetaMaster; Malvern Instruments, United Kingdom)를 사용하여 전기영동 이동성 (밀리볼트)에 의해 Z 또는 제타전위로서 측정되었다. 본 명세서에 예시된 특정의 구체예에서 측정된 Z 전위의 범위는 -29.58 mV 내지 -79.76 mV였다. 이하에서, 용어 "하전된"은 양이든지 음이든지 적어도 약 1 mV, 바람직하게는 적어도 약 10 mV의 절대값을 갖는 Z 전위를 의미한다.
시험된 현탁액에서 미소구는 회합하거나 응결하거나 응집하거나 비가역적인 점결 (caking)을 일으키지 않았다. 미소구는 기간이 경과함에 따라 다소 침강하였지만, 이들은 온화하게 교반함으로써 쉽게 재현탁되었다.
본 발명의 미소구는 창상의 윤곽에 또는 창상내에 적용될 수 있는 액체붕대 또는 장치와 같은 종류이다. 미소구는 통상적인 방법에 의해 최적 pH에서 다양한 농도 및 용적으로 아르곤, 네온 또는 질소하의 멸균용기 내에 포장된다.
약리 및 생물학적 제제
다음과 같은 종류의 약리 제제중의 하나 또는 그 이상이 비처리된 미소구와 함께 예방적 또는 치료 조성물내에 포함될 수 있다: 방부제, 수렴제, 항진균제, 항바이러스제, 항암제, 항히스타민제, 항생제, 전장에서 사용하기 위한 혈액응고제, 비타민 및 무기질 제제, 비타민, 무기질 또는 항염제.
치료 조성물내에 포함될 수 있는 생물학적 활성물질에는 수렴제, 항생제, 산화제, 단백질분해효소, 콜라겐 가교결합 억제제 (예를들어, 천연 또는 합성 디아민-시스타민, 푸트레신, 스페르미딘, 카다베린 등), 아미노산, 대식세포 자극인자 또는 마취제가 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
성장 및 조절인자를 치료 조성물에 첨가하여 육아조직의 형성 및 재상피화를 도와줌으로써 창상치유 과정을 증진시킬 수 있는데, 이들에는 예를들어 혈소판-유도된 성장인자 (PDGF), 혈소판-유도된 혈관형성인자 (PDAF), 혈소판-유도된 표피성장인자 (PDEGF), 변형성장인자-베타 (transforming growth factor-beta; TGFB), 혈소판 인자 (PF-4), 알파 및 베타 섬유아세포 성장인자 (αFGF 및 βFGF), 성장호르몬 (GH), 표피성장인자 (EGF) 또는 인슐린 성장인자 (IGF)가 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
혈소판-유도된 성장인자는 특히 육아형성 및 재상피화의 상에서 창상치유에 연루된 다단계 시스템을 자극한다. 변형성장인자-베타는 다수의 세포형태의 증식 및 분화를 조절하는 관련된 다이머 단백질의 성장그룹을 의미한다 (Massague, 1990, Ann. Rev. Cell. Biol. 6:597-619). TGFB는 또한 근육세포 및 연골세포에서 연골-특이적 거대분자의 생성을 유도한다. 그러나, TGFB는 닭의 흉골 연골세포 (Horton et al., 1989, J. Cell Physiol. 141:8-15) 및 랫트의 연골세포 (Rosen et al., 1988, J. Cell Physiol. 134:337-346)에 의한 콜라겐 타입 II의 합성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 실제로, TGFB는 시험관내 및 생체내에서 가장 정상적인 세포형태의 증식의 기본형적 억제제로서 출현하였다 (Alexandrow, A.G., et al., 1995, Cancer Res. 55:1452-1457). TGFB1은 인간 및 돼지의 혈소판으로부터 정제되었으며, 재조합 TGFB1은 현재 입수가 가능하다 (Gentry et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427). 인슐린 단독으로는 콜라겐 매트릭스 합성을 자극하는데 있어서 IGF-I 보다 훨씬 덜 강력하다. IGF-II는 DNA 및 RNA 합성을 자극하며, 태아세포에서 클론의 성장을 자극하는데 있어서 IGF-I 보다 더 강력하다 (McQuillan, et al., 1986, Biochem. J. 240:423-430). 표피성장인자 단독으로는 연골세포 증식에 대해 효과가 없다. EGF는 인슐린과 함께 연골세포의 증식을 상승적으로 자극한다 (Osborn, K.D., et al., 1989, J. Orthop. Res. 7:35-42).
높은 레벨의 지질 과산화물은 활성화된 대식세포, 응집된 혈소판, 및 상해를 입은 조직으로부터 분리된 세포하 (subcellular) 입자에서 입증되었다. 강력한 산 화제, 유리래디칼로 대사된 약제 및 이온화 조사는 모두 프로스타글란딘, 류코트리엔 (아이코사노이드) 및(또는) 지질 과산화적 증가를 유도한다. 이들 증가된 아이코사노이드 및 지질 퍼옥사이드는 조직손상 또는 괴사 및 염증반응 증가의 한가지 원인이 될 수 있다. 예방적 및(또는) 치료 조성물에 항염제, 예를들어 비스테로이드성 항염제 (이부프로펜, 인도메타신, 아스피린, 아세트아미노펜, 나프록센, 설린닥) 및 특히 사이클로옥시게나제-2 (COX2) 억제제를 포함시키는 것은 모든 상해를 입은 조직, 예를들어 폐, 간, 지속적이거나 반복된 상해의 현저한 결과인 섬유증이 있는 방사선-유도된 상해에 유용한 것으로 입증될 수 있다. 또한, 항산화제 (예를들어, 비타민 E) 및 유리래디칼 스캐빈저 (scavenger) (예를들어, 환원된 글루타치온)를 포함시키는 것도 또한 유용한 것으로 입증될 수 있다.
아연 - 외상이나 수술 후 또는 다른 경우에 혈액 및 조직내의 아연의 양은 낮은 레벨로 떨어질 수 있는 것으로 입증되었다. 이것은 특히 화상 환자에게서 두드러진다. 혈액 및 조직내의 이 미량원소의 정상적인 레벨을 회복시키기에 충분한 아연을 투여하는 것은 상피화의 속도, 창상강도 획득의 속도, 및 콜라겐과 그밖의 다른 단백질의 합성을 증가시킨다. 다수의 효소, 그중에서도 특히 DNA-폴리머라제 및 역전사효소는 아연-의존성이다. 창상치유에 대한 아연 고갈의 영향은 이들 효소의 기능의 양이 억제되는 경우에 예상될 수 있는 것이다. 상피세포 및 섬유아세포의 증식은 일어나지 않는데, 이는 이들 세포의 유사분열이 DNA-폴리머라제 및 역전사효소 부재하에서는 일어날 수 없기 때문이다. 따라서, 이들 세포는 정상적으로 유주할 수 있지만, 이들은 증식하지 않고, 따라서 적절한 상피화는 일어나지 않 고 창상내로 유주하는 소수의 섬유아세포에 의한 콜라겐 합성은 창상을 함께 유지시키는데 필요한 섬유를 공급할 수 없다. 이러한 경우에, 혈액 및 조직의 아연 농도를 정상으로 증가시키면 창상치유의 정상적인 진행이 회복될 것이다. 본 발명의 목적은 혈액 및 조직의 아연 레벨이 낮은 환자에게서 아연을 치료 조성물로 경구, 비경구 또는 국소투여하여 창상치유를 정상으로 회복시키는 것이다. 아연은 염화아연, 탄산아연 및(또는) 아연글루코네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 염으로서 제공된다.
비타민 A 및 E - 비타민 A는 창상치유에 있어서 육아조직의 지연된 발생 및 콜라겐의 감소된 양을 부분적으로 반전시킬 수 있다. 국소적으로 적용된 비타민 A는 코르티코스테로이드 투여에 의해 지연된 창상에 있어서의 상피화를 증진시키지만, 콜라겐 침착은 전신적인 비타민 A에 의해서만 영향을 받는다.
비타민 E는 반흔형성을 변화시키기 위해 사용될 수 있는데, 이는 그의 부작용이 동등한 양의 스테로이드 호르몬에 비해 덜 하기 때문이다. 고용량에서 비타민 E는 창상치유 및 콜라겐 생성를 지연시키지만, 이 효과는 비타민 A의 존재하에서 극복된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 비타민 A 및 E를 본 발명의 예방적 및(또는) 치료 조성물로서 필요한 개체에게 경구, 비경구 또는 국소로 제공하는 것이다.
유전자 요법
본 발명의 예방적 및(또는) 치료 조성물은 창상치유과정을 가속화시키기 위 해 생체내에 유전자 및 유전자 생성물을 도입시키기 위한 비히클을 제공할 수 있다. 예를들어, 당뇨성 미란의 경우에, 치료 조성물은 본 발명의 미소구, 및 혈전색전증의 위험을 감소시키기 위한 항응고성 유전자 생성물 또는 염증반응에 기인한 부전증의 위험을 감소시키기 위한 항염증성 유전자 생성물을 발현하도록 유전적으로 조작되어 사용되는 유전적으로 조작된 기질세포 (예를들어, 내피세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단핵세포, 혈장세포, 비만세포, 지방세포 등을 포함하여 (이들로 제한되는 것은 아니다), 개체로부터 수집한 느슨한 결합조직에 존재하는 다른 세포 및(또는) 요소가 존재 또는 부재하는 섬유아세포)를 포함한다. 일단, 유전적으로 조작된 세포가 창상부위에 적용되면, 항염증성 유전자 생성물, 예를들어 종양괴사인자 (TNF), 인터류킨-2 (IL-2) 또는 다른 염증성 사이토킨을 위한 중화항체의 유전인자 (idiotype)에 상응하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 존재는 화상조직, 수술후 감염, 당뇨성 신경병성 궤양, 압박궤양, 정맥울혈성 궤양, 화상조직, 수술후 감염, 수술 창상파괴, 내부궤양, 출혈, 골괴저, 욕창, 와창, 타협된 절단부위, 비-치유 외상성 창상, 화상, 면도후, 치과작업, (당뇨병, 정맥류성 정맥, 졸중후의) 만성궤양, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 척추상해성 창상, 부인과적 창상, 화학적 창상, 혈관질환 창상, 당뇨성 피부미란, 당뇨성 발, 신체적 외상, 성형수술후 봉합부위, 햇빛화상 또는 외음절개술을 포함한 (이들로 제한되는 것은 아니다) 질병과 관련된 염증반응의 개선을 제공할 수 있다.
바람직하게는, 세포는 창상치유의 초기상 중에서 일시적으로 및(또는) 유도조건하에서 이러한 유전자 생성물을 발현하도록 조작되거나, 기질세포에 고정된 키 메릭 융합단백질, 예를들어 세포외 영역으로서 유전자 생성물에 융합된 수용체 또는 수용체-양 분자의 세포내 및(또는) 경막 (transmembrane) 영역으로 구성된 키메릭 분자로서 조작된다. 또 다른 구체예에서, 기질세포는 환자에게 결핍되어 있거나 치료 효과를 나타낼 수 있는 유전자, 예를들어 HDL, 아포리포단백질 E 등을 발현하도록 유전적으로 조작된다. 기질세포로 조작하고자 하는 대상유전자는 치료할 질병에 관련될 것이 요구된다.
기질세포는 숙주세포를 형질전환 또는 형질감염시켜서 배양시스템에서 클로닝시킨 다음에 클론확장시키기 위해 사용되는 유전자를 함유하는 재조합 DNA 작제물을 사용하여 조작될 수 있다. 활성유전자 생성물을 발현하는 배양물은 해당 생성물이 결핍되어 있는 개체에게 이식될 수 있다. 예를들어, 다양한 형태의 혈관의 증상을 예방하거나 개선시키는 유전자는 질병상태하에서 저발현되거나 하향조절될 수 있다. 특히, 예를들어 다음과 같은 병리학적 상태를 예방하는데 연루된 유전자의 발현은 하향조절될 수 있다: 혈전 형성, 염증반응, 및 판막의 섬유증 및 석회화. 따라서, 유전자 활성의 레벨은 존재하는 유전자 생성물의 레벨을 증가시키거나, 삼차원적 미소구 배양시스템에 존재하는 활성 유전자 생성물의 레벨을 증가시킴으로써 증가될 수 있다.
또한, 환자들은 창상치유의 섬유조직형성상 중에 유전자대체요법에 의해 치료될 수 있다. 기질세포는 특히 개개 환자의 필요조건에 맞도록 고안될 수 있는데, 예를들어 기질세포는 하나 또는 그 이상의 유전자를 조절하도록 유전적으로 조작될 수 있거나; 유전자 발현의 조절은 일시적이거나 장기간일 수 있으며; 또는 유 전자 활성은 비유도성이거나 유도성일 수 있다. 예를들어, 정상적인 표적유전자의 하나 또는 그 이상의 카피 (copy), 또는 표적유전자 기능을 갖는 정상적인 표적유전자 단백질 생성물의 생성을 지시하는 유전자의 일부분은 리포좀 또는 직접적인 DNA 주사 또는 금입자와 같이 DNA를 세포내로 도입시키는 다른 입자이외에, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 레트로바이러스 벡터를 포함한 (이들로 제한되는 것은 아니다) 비유도성 벡터 또는 메탈로티오네인 또는 열쇼크 (heat shock) 단백질을 포함한 유도성 프로모터를 사용하여 삼차원적 작제물을 거주시키는 인간세포내로 삽입시킬 수 있다.
유전자 요법에서 치료 조성물내에서 기질세포의 사용은 다수의 잇점을 갖는다. 첫째로, 배양물이 진핵세포를 포함하기 때문에 유전자 생성물은 배양물내에서 활성생성물을 형성하도록 적절히 발현 및 처리될 수 있다. 둘째로, 유전자요법 기술은 임상적 가치, 적절성 및 유용성이 있는 형질감염된 세포의 수가 실질적으로 증가할 수 있는 경우에만 유용하며; 본 발명의 삼차원 배양은 형질감염된 세포의 수의 증대 및 형질감염된 세포의 증폭 (세포분열을 통해)을 가능하게 한다.
기질세포로 조작된 유전자 생성물의 구성적 또는 일시적 발현을 얻기 위해서는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를들어, 문헌 (Seldon, R.F., et al., 1987, Science 236:714-718)에 기술된 트랜스카리오틱 (transkaryotic) 이식기술이 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "트랜스카리오틱"은 이식된 세포의 핵이 안정하거나 일시적인 형질감염에 의한 DNA 서열의 첨가에 의해 변질되는 것을 시사한다. 세포는 통합성 바이러스 벡터, 예를들어 레트로바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터, 또는 비-통합성 복제벡터, 예를들어 파필로마 바이러스 벡터, SV40 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 복제-결핍성 바이러스 벡터를 포함한 (이들로 제한되는 것은 아니다) 다양한 벡터중의 어떤 것이라도 사용하여 조작될 수 있다. 일시적인 발현이 요구되는 경우에는 비-통합성 벡터 및 복제-결핍성 벡터가 바람직할 수 있는데, 이는 이들 시스템에서는 해당 유전자의 발현을 조절하기 위해 유도성 또는 구성적 프로모터를 사용할 수 있기 때문이다. 또 달리는, 통합성 벡터를 사용하여 일시적인 발현을 얻을 수 있는데, 단 해당 유전자는 유도성 프로모터에 의해 조절되어야 한다.
삽입된 유전자의 발현을 유도하기 위해서는 어떠한 프로모터라도 사용할 수 있다. 예를들어, 바이러스성 프로모터에는 CMV 프로모터/인핸서 (enhancer), SV40, 파필로마 바이러스, 엡스타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스, 엘라스틴 유전자 프로모터 및 b-글로부린이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일시적인 발현이 요구되는 경우에는, 이러한 구성적 프로모터가 비-통합성 및(또는) 복제-결핍성 벡터 내에서 바람직하게 사용된다. 또한, 필요에 따라 삽입된 유전자의 발현을 유도하기 위해서 유도성 프로모터가 사용될 수도 있다. 예를들어, 유도성 프로모터에는 메탈로티오네인 및 열쇼크 단백질이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
공지되어 있으며 사용될 수 있는 결합조직에 대한 조직특이성을 나타내는 전사조절부위의 예에는 췌장 선포세포에서 활성이 있는 엘라스틴 또는 엘라스타제 I 유전자 조절부위가 포함되나 이것으로 제한되는 것은 아니다 (Swit et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515). 엘라스틴의 침착은 혈관이식편을 포함한 다양한 세포에서 특이적인 생리적 및 발육적 현상과 상관관계가 있다. 예를들어, 동맥의 발육시에 엘라스틴 침착은 동맥압 및 기계적 활성에 있어서의 변화에 의해 조정되는 것으로 보인다. 엘라스틴 발현에 기계적 활성을 연결하는 형질도입 기전은 세포-표면 수용체를 포함한다. 일단 엘라스틴-합성 세포가 세포-표면 수용체를 통해 엘라스틴에 부착하면, 추가의 엘라스틴 및 그밖의 다른 매트릭스 단백질의 합성은 조직내에서 스트레스 또는 기계적 힘 (예를들어, 생물반응기 (bioreactor)에서 작제물의 일정한 이동) 또는 세포형태에 영향을 미치는 다른 인자들에 대한 노출에 의해 영향을 받을 수 있다.
본 발명의 미소구 배양시스템에서 사용된 기질세포는 이식부위에서 응고 또는 거부반응을 촉진시키는 인자 또는 표면항원의 발현을 "녹아웃 (knock out)"시키도록 유전적으로 조작될 수 있다. 표적유전자 발현레벨 또는 표적유전자 생성물 활성레벨의 감소를 위한 부정적 변조기술은 이하에서 논의한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 "부정적 변조 (negative modulation)"는 변조처리의 부재하에서의 표적유전자 생성물의 레벨 및(또는) 활성에 비해 표전유전자 생성물의 레벨 및(또는) 활성이 감소하는 것을 의미한다. 기질세포에 고유적인 유전자의 발현은 다수의 기술을 사용하여 감소되거나 녹아웃될 수 있는데, 예를들어 발현은 동종재조합기술을 사용하여 유전자를 완전히 불활성화시킴 (통상적으로는 "녹아웃"이라 부름)으로써 억제될 수 있다. 통상적으로, 단백질의 중요부분을 코드화한 엑손 (exon) (또는 그 부위에 대한 엑손 51)은 양성 선별마커 (예를들어, 네오 (neo))에 의해 차단되어 표적유전자로부터 정상적인 mRNA의 생성을 방지하고 유전자의 불활성을 야기시킨다. 유전자는 또한 유전자의 일부분에서 결실을 발생시키거나, 전체 유전자를 결실시킴으로써 불활성화될 수도 있다. 게놈내에서 멀리 떨어져 있는 표적유전자에 대해 동종성인 두개의 부분을 갖는 작제물을 사용하여 두개의 부분 사이에 끼어 있는 서열을 결실시킬 수 있다 (Mombaerts, P., et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:3084-3087).
표적유전자의 발현을 억제하는 안티센스 및 리보자임 분자를 또한 본 발명에 따라 사용하여 표적유전자 활성의 레벨을 감소시킬 수 있다. 예를들어, 주된 조직적합성 유전자 복합체 (HLA)의 발현을 억제하는 안티센스 RNA 분자는 면역반응에 대하여 가장 다변성인 것으로 나타났다. 또한, 삼중나선분자를 표적유전자 활성의 레벨을 감소시키는데 이용할 수 있다. 이들 기술은 문헌 (L.G. Davis, et al., Basic Methods in Molecular Biology, 2nd ed., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. 1994)에 상세히 기술되어 있다.
또 다른 대체방법으로, 기질세포는 예를들어, 세포분열 사이클 2 키나제 및 증식성 세포핵 항원의 발현을 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드 차단시킴으로써 평활근 세포가 증식하고, 유주하고 신생혈관내막 과형성의 발생을 야기시키도록 천이시키는데 필요한 유전자 발현을 차단하도록 유전적으로 조작될 수 있다 (Mann, M.J., et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4502-4506).
유전자 요법에서 기질세포 배양물의 사용은 다수의 잇점을 가지고 있다. 첫 째로, 배양물이 진핵세포를 포함하기 때문에 유전자 생성물은 배양물내에서 활성생성물을 형성하도록 적절히 발현 및 처리될 수 있다. 둘째로, 유전자요법 기술은 임상적 가치, 적절성 및 유용성이 있는 형질감염된 세포의 수가 실질적으로 증가할 수 있는 경우에만 유용하며; 본 발명의 기질세포배양물은 형질감염된 세포수의 증대 및 형질감염된 세포의 증폭 (세포분열을 통해)을 가능하게 한다. 예를들어, 창상치유인자를 발현하는 유전적으로 조작된 세포를 건과 인대를 만드는데 사용된 생기질세포배양물에 혼입시켜 상해부위에서 창상치유를 증진시킬 수 있다.
공지되어 있으며 사용될 수 있는, 조직특이성을 나타내는 전사조절부위의 예에는 췌장 선포세포에서 활성이 있는 엘라스타제 I 유전자 조절부위(Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:42S-51S); 췌장 베타세포에서 활성이 있는 인슐린 유전자 조절부위 (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); 림프구양 세포에서 활성이 있는 면역글로부린 유전자 조절부위 (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adams et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); 및 골격근에서 활성이 있는 마이오신 경쇄-2 유전자 조절부위 (Shani, 1985, Nature 314:283-286)가 포함되나 이것으로 제한되는 것은 아니다
창상/병소
(A) 당뇨성 발
미국에서 모든 비외상성 절단의 50-70%는 당뇨병이 있다 (A Report of the National Diabetes Board:NIH Publication 81-2284, 1980, p25). 당뇨병 환자에게서 발의 파괴는 통상적으로, 몇가지 혈관장해의 존재 또는 부재하에서, 신경병증 및 감염의 조합에 기인한 것이다. 내향성 발톱 또는 궤양이 일어나서, 통각의 결여로 인해서 치료되지 않은 채로 남아있는 경우에, 감염은 발 전체에 걸쳐 확산될 수 있으며, 이렇게 하여 손상된 혈관이 제공할 수 있는 것 보다 더 다량의 혈액공급을 요구하는 육안적 감염이 야기된다. 생성된 괴저는 절단을 요구할 수도 있다. 의사들은 때때로 당뇨병에서의 영양성궤양이 감각의 손실 없이 일어난다는 느낌을 받는다. 그후에 이들은 파괴가 일어났을 때 놀라게 된다. 문제는 육안적인 감각상실이 감지되기 훨씬 전에 발이 손상을 입기 쉬울 수도 있다는 점이다. 본 발명의 치료 조성물은 파괴를 예방하고, 당뇨병과 관련된 궤양을 치료하도록 고안된다.
(B) 압박궤양
압박궤양은 특히 제한된 운동성을 갖는 노인환자의 경우에 주된 보건의료상의 문제로 지속되고 있다. 노인과 환자 중에서 사망의 위험은 압박궤양이 발생한 경우에는 4배로, 궤양이 치유지되 않은 경우에는 6배로 증가한다. 압박궤양의 발생은 환자의 간호를 맡고 있는 모든 사람에게 있어서 의료과오 책임의 원인으로서 인식되고 있다. 법원은 이러한 창상이 발생하거나 지속하도록 만든 보건의료 제공자에게 거의 동정심을 나타내지 않는다. 웨스트 (West) 대 반-케어 인코포레이티드 (Van-Care Inc.) 사건 (사건번호 CV-91-617)에서, 알라바마 배심원은 노인환자가 피고의 요양소에 거주하는 동안에 10인치 크기의 괴저성 압박궤양이 발생하였을 때, $65000000의 배상평결을 내렸다. 따라서, 미란의 형성을 예방하기 위해서 더 나은 장비 (예를들어, 매트리스)가 필요할 뿐만 아니라 더 우수한 피부보호를 제공하고 압박궤양에 있어서의 창상치유과정을 가속화시키는데 사용될 수 있는 치료 조성물도 필요하다.
(C) 일반 및 성형수술 및 그밖의 다른 요법
수술 (다음과 같은 기관 및 조직 (이들로 제한되는 것은 아니다)에 대한 수술을 포함: 피부, 유방, 흉벽, 흉막, 폐 및 종격, 심장질환, 대혈관의 질환, 말초동맥 질환, 위장관 질환, 위, 대장, 직장 및 항문, 충수, 간, 담낭 및 간외담도 시스템, 췌장, 비장, 복막염 및 복강내 감염, 복벽, 망 (omentum), 장간막 및 후복막, 복벽 헤르니아, 뇌하수체 및 부신, 소아과 수술, 갑상선 및 부갑상선, 비뇨기과, 부인과, 신경외과, 정형외과, 절단, 손, 성형 및 개조수술, 종양수술, 두부수술, 정형외과, 근골격, 비뇨생식계, 소아과, 위장관), 내부창상, 성형수술, 부인과수술, 반흔제거, 레이저 치료, 렌트겐 조사, 방사선 조사, 오존치료 또는 열치료는 창상에서 숙주 방어의 개시를 유도하는 몇가지 절차이다. 감염에 대한 숙주방어는 국소적이거나 전신적이고, 비특이적이거나 특이적이며, 체액성이거나 세포성일 수 있다. 다양한 정상적 기능은 신체의 세균량을 감소시키고 치유과정을 촉진하도록 지속적으로 작용한다. 본 발명의 예방적 및 치료 조성물을 사용하여 잠재적인 침입성 병원체를 다루는데 관여하는 천연적인 면역학적 현상, 예를들어 해부학적 장벽, 기본량 세포성 식작용, 식작용성 세포에 의한 소화 또는 효과기 기전의 조합된 예방적 효과를 가속화시키거나 증진시킬 수 있다.
(D) 화상
화상은 매우 일반적인 상해로서, 어림잡아 매년 적어도 2000000명의 개체가 의료상의 주의가 필요할 정도로 심각한 화상을 입고 있다. 1도, 2도, 3도 및 4도 화상의 고전적인 설명은 피부해부학에 관련된 상해의 깊이를 기본으로 하는 해부학적인 것이다. 1도 화상은 상피의 기저층을 침투하지 않는다. 본질적으로, 상피는 파괴되지 않는다. 이들 상해는 햇빛화상으로 대표되며, 필수적으로는 아마도 보습을 하는 것을 제외하고는 거의 치료가 필요없다. 2도 화상은 상피의 기저층으로부터 전체 표피까지 확대되나, 표피를 통과하지는 않는다. 상피세포에 접해 있는 진피부속기는 살아 있는 채로 유지되며, 이동하여 창상의 표면을 덮는다. 3도 화상은 완전히 진피 아래에서부터 지방조직내로 확대된다. 4도 화상은 근육 및 뼈 안으로 확대되며, 화상전문센터에서의 치료를 필요로 한다. 본 발명의 치료 조성물은 화상 환자, 흡입손상, 상부기도 화상, 하부기도 화상 또는 폐화상이 있는 환자에게서 및 관련된 합병증의 관리시에 창상치유를 가속화시키는데 적합하다.
여기에서, 본 발명은 일반적으로 창상치유 뿐만 아니라 근육재생을 촉진시키기 위해서 사용될 수 있는 미소구의 사용에 의해 예시된다. 창상치유 및 근육재생 둘다는 손상된 조직의 복원 및 결실된 조직의 복위를 포함한다. 특정 형태의 세포 의 유주 및 증식은 고형종양과 같은 악성조직의 비속박성 성장과는 쉽게 구별될 수 있는 질서정연하고 구조화된 방식으로 일어나야 한다. 특히, 창상치유 및 근육복원에 관련된 세포는 치유과정에서 그의 필요한 역할을 수행하기 위하여 우선적으로 활성화되야만 한다. 정확한 기전은 알려지지 않았지만, 창상치유시에 나타나는 증식에 있어서의 질서정연하고 구조화된 세포성장은 고도로 조직적인 조절과정이 존재함을 명백히 입증하고 있다.
이하에 제시된 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 미소구는 이 복잡하며 조직적이고 구조화된 과정을 방해하는 것으로 보이지 않는데, 이는 이들 미소구가 명백하게 전체적인 치유과정 뿐만 아니라, 그 과정 내의 특정 단계의 속도를 가속화시킬 뿐이기 때문이다. 그러나, 예기치 않게도 본 발명의 미소구는 세포가 지속적이며 비속박성인 대사적 활성화의 상태를 나타내도록 유도하지 않는데, 이는 정상적인 조절과정이 영향을 받지 않음을 시사하는 것이다. 따라서, 본 발명의 미소구는 비속박성인 세포활성화를 야기시키지 않는다.
본 발명을 특정한 기전으로 제한하지 않고, 음으로 하전된 그룹을 갖는 미소구의 첨가는 세포의 부착 및 도말 (plating)을 위한 추가의 표면으로 작용함으로써 창상치유에 대해 치료 효과를 가질 수 있다. 본 발명의 미소구의 효능에 대한 한가지 설명은 음으로 하전된 그룹이 미소구 물질과 세포막 사이의 다점접촉을 나타내는 미소구의 고체표면과 세포막 사이에서의 다중결합을 야기시킬 수 있다는 점이다. 이들 결합의 형성은 막리간드의 분포 및 상태, 세포골격 개조, 세포내 시그날도입의 활성화 및 그밖의 다른 생화학적 변화에 있어서의 변화를 야기시키며, 이렇 게하여 결국은 세포의 활성화를 유도한다. 그후, 세포의 활성화는 세포증식 및 성장인자 및 세포외 매트릭스의 콜라겐 및 그밖의 다른 성분의 생성을 유도한다. 이하에서 입증되는 바와 같이, 이들 미소구는 명백하게 생체내에서 창상치료 및 치유에 대해 유익한 효과를 가지기 때문에, 본 발명은 어떤 특정한 기전에 의존할 필요는 없다는 점을 주목하여야 한다.
이하의 실시예에서는 다수의 상이한 형태의 미소구를 시험하였다. 이들 미소구는 카복실 또는 아미노 표면그룹을 갖거나 추가의 표면그룹을 갖지 않는 폴리스티렌으로부터 제조되었다. 미소구의 직경은 약 0.1 내지 약 20 미크론의 범위이다. 특정의 미소구의 제타전위를 또한 시험하였으며, 구형의 크기 및 표면그룹의 형태는 명백하게, 창상치유를 촉진시키는 미소구의 능력에 대해 중요한 영향을 미칠 수 있는 각각의 미소구에 의해 수반되는 전체적인 전하의 양에 영향을 미친다는 것이 입증되었다.
특정한 구체적인 형태의 미소구가 설명되어 있지만, 그밖의 다른 다수의 관련된 형태의 미소구가 이하의 특징을 충족시킨다면 사용될 수 있다는 점을 이해하여야 한다.
1. 이들은 세포 또는 그 세포의 일부분과 다점접촉을 형성할 수 있어야 한다;
2. 이들의 작용기전은 화학적 변질 또는 분해를 필요로하지 않아야 한다; 및
3. 이들은 체액과 같은 수성매질에 실질적으로 불용성이어야 하며, 대신에 현탁액을 형성하여야 한다.
그밖의 다른 바람직한 속성에는 다음과 같은 것이 포함된다. 첫째, 미소구는 바람직하게는 치료기간중에 비-생분해성인 물질, 가장 바람직하게는 폴리스티렌으로부터 제조되어야 한다. 둘째, 미소구는 바람직하게는 상당한 전하, 더욱 바람직하게는 전체적인 음전하를 수반하여야 한다. 미소구의 크기는 덜 중요하지만, 바람직하게는 미소구는 직경이 약 0.1 내지 약 20 미크론이어야 한다. 바람직하게는, 미소구는 카복실 표면그룹에 의해 유도체화되어야 하지만, 그밖의 다른 음으로 하전된 그룹이 사용될 수도 있다. 따라서, 이들 미소구의 형태는 단지 설명의 목적으로 제시된 것이며, 어떤 식으로든 제한하고자 하는 의미는 아니다. 본 발명에 따르는 미소구의 원리 및 작용은 실시예, 도면 및 첨부된 설명을 참고로 하여 더 잘 이해될 수 있을 것이다.
실시예 1
크레아틴 포스포키나제에 대한 미소구의 효과
본 발명의 미소구는 도 1에서 보는 바와 같이, 배양된 근아세포의 크레아틴 포스포키나제 (CPK) 활성에 있어서 초기증가를 명백하게 유도하였다. 그러나, 8일후에 비처리 및 처리된 세포는 모두 동일한 레벨의 CPK 활성을 나타내었으며, 이것은 본 발명의 미소구에 의한 증가된 CPK 활성의 유도는 일시적인 것임을 시사하는 것이다. 실험방법은 다음과 같았다.
랫트의 배자골격근의 일차배양물은 후레쉬네이 (Freshney)에 의해 기술된 바 와 같이 제조하였다 [R.J. Freshney, Culture of Animal Cells, Willey. 1986, p. 117. 170-172]. 간략하면, 근육을 피부와 뼈가 없도록 절제하여 가온된 트립신처리 (36.5℃에서 0.25% 트립신)에 의해 15회 탈분리시켰다. 섬유아세포는 우선 조직배양 플레이트에 부착하기 때문에, 세포를 5% CO2, 37℃ 하의 배양기에서 한시간 동안 전도말하여 섬유아세포의 오염을 감소시켰다. 그후, 근아세포를 항생제, 10% v/v 말혈청 및 4% v/v 병아리 배자추출물이 보충된 배지 2 ㎖ (1:4 비의 둘베코 변형 이글배지 : 배지 199)가 함유된 35 ㎜ 페트리디쉬상에 ㎖당, 5,000 세포의 농도로 접종하였다. 병아리 배자추출물은 문헌 [R.J. Freshney, Culture of Animal Cells, Willey, 1986]에 따라 10일된 병아리 배자로부터 제조하였다. 항생제로는 표준초기농도 2.5 ㎎/㎖를 1:1000으로 희석한 암포테리신 및 겐타마이신을 포함시켰다. 24시간 후에, 배지를 경사시키고, 20% v/v 태자말혈청 및 1% v/v 병아리 배자추출물을 함유하는 새로운 배지로 대체시켰다.
그후, 배양된 세포는 도말 시점부터 시작하여 4-8일 동안 배지내에서 미소구로 또는 배지 만으로 처리하였다. 미소구는 직경이 1, 2 또는 4.5 미크론인 카복실화 폴리스티렌이거나, 직경이 4.5 미크론인 폴리스티렌 단독이었다. 미소구의 농도는 배지의 ㎖당, 106 또는 107이었으며, 두가지 농도에 대해 유사한 결과가 수득되었다 (데이타는 제시되지 않음). 처리한지 4, 5, 6, 7 또는 8일 후에, 크레아틴 포스포키나제 활성을 표준시험방법 ("Creatine Kinase", Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corporation, Freehold, N.J., USA, 1972, pp. 54-55)에 의해 측정하였다. 결과는 총세포단백질의 ㎎당, CPK 활성의 유니트로서 도 1에 제시하였다.
도 1은 대조세포와 비교하여 본 발명의 미소구가 크레아틴 포스포키나제 활성의 초기증가를 유도하는 능력이 있음을 명백히 입증하고 있다. 처리 4일후에, 미소구 처리된 세포는 대조세포와 비교하여 CPK 활성의 초기증가를 나타내었다. 이 증가는 특히 처리 5 및 6일째에 현저하였다. 그러나, 7일째에는 대조세포에서의 CPK 활성은 미소구-처리된 세포의 활성과 동등한 값에 도달하기 시작하였다. 8일째에, 대조세포 및 미소구-처리된 세포는 둘다 유사한 레벨의 활성을 나타내었다. 명백하게, 미소구는 근아세포에서 CPK 활성의 초기증가를 촉진시켰으며, 이것은 처리 8일후에는 안정한 상태가 되었다. 이와 같이 증가된 CPK 활성은 근원성 세포의 생화학적 성숙과 상관관계가 있다. 따라서, 미소구는 배양된 근아세포의 생화학적 성숙을 촉진시켰다.
실시예 2
세포증식 및 융합에 대한 미소구의 효과
본 발명의 미소구는 이하에서 보는 바와 같이, 대조 (비처리) 세포에 비해 세포증식 및 근아세포 융합 둘다에 있어서 초기증가를 유도하는 것으로 입증되었다.
랫트 근아세포의 일차배양물은 세포를 커버슬립 (cover slip)상에서 배양하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 처리된 세 포는 이하에 더 기술하는 바와 같이 배지내에서 미소구와 함께 배양하였으며, 그 반면에 대조세포는 배지만을 제공하였다. 세포증식의 정도를 측정하기 위하여, 세포를 에탄올/아세트산 (3:1)에서 고정시킨 다음, 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다. 그후, 염색된 세포를 광학현미경 하에서 계수하였다. 유사분열 지수는 세포 1000개당, 계수된 유사분열 세포의 비율로서 계산하였다.
세포증식의 검사를 위해서는, 설페이트 표면그룹을 가지며, 직경이 0.18 미크론인 폴리스티렌 미소구를 배지의 ㎖당 107 미소구의 농도로 사용하였다. 미소구로 24시간 동안 처리한 후에 대조세포와 비교하여 유사분열 지수에 있어서 20-배의 증가가 관찰되었다. 구체적으로, 대조세포의 유사분열 지수는 1.25+0.7%였으며, 그 반면에 미소구-처리된 세포의 지수는 24.6+1.0%였다. 따라서, 미소구는 명백히 근아세포의 유사분열 지수에 있어서의 큰 증가를 촉진시켰다.
근아세포 융합에 대한 미소구의 효과도 역시 검사하였다. 결과는 표 1에 제시하였다. 일반적으로, 미소구에 의해 처리된 세포는 대조군과 비교하여 약 150%의 융합율을 나타내었다. 그러나, 이 효과의 정도는 미소구의 형태 및 처리의 기간에 따라 좌우된다.
시험한 미소구의 형태는 표 1에 제시하였다. 미소구의 직경은 "직경"란에서 미크론으로 나타내었다. 폴리스티렌 비드상의 표면그룹은 "표면그룹"란에 제시하였다. 어떠한 추가의 유도체화도 없는 폴리스티렌 비드는 "폴리스티렌"이다. 카복실이나 아미노 표면그룹으로 유도된 비드는 각각 "카복시" 및 "아미노"로서 기술 하였다. 비드의 농도는 "Conc."란에서 배지의 ㎖당, 비드의 수로서 제시하였다.
상기 기술한 근아세포의 증식율을 측정하는 경우에서와 같이 세포를 제조하여, 고정시키고 염색하였다. 세포는 우선 표 1에서 "초기세포"란에 배지 ㎖당 세포로 기재한 밀도로 도말하였다. 근아세포 융합의 측정은 "처리후 일수"란에서 제시된 처리후의 일수에 이루어졌다.
융합의 정도는 미소구 처리된 세포의 경우에는 "융합비율"로서, 대조용 비처리 세포의 경우에는 "대조융합"으로서 제시한 현미경 영역내의 핵의 총량에 대비한 다핵세포 또는 미오임플라스트 (myoimplast) 내의 핵의 비율로서 계산한다. 각각의 실험조건에서 적어도 400개의 핵이 계수되었다. 미소구 처리된 세포와 대조용 비처리 세포에서 융합의 정도의 비는 "상대적효과"로서 제시하였다. 표 1 에서 특정한 슬롯 (slot)에 값이 제시되지 않은 경우에, 그 값은 윗줄에서 제시된 값과 동일한 것이다.
융합 근아세포에 대한 미소구의 효과
직경 표면그룹 Conc. 초기세포 처리후 일수 융합비율 대조융합 상대적 증가
0.22 폴리스티렌 107 3*104 6 0.75±0.06 0.58±0.10 1.29
7 0.82±0.09 0.64±0.09 1,28
0.49 6 0.86±0.06 0.58±0.10 1.48
7 0.91±0.07 0.64±0.09 1.57
0.91 카복시 106 5*105 5 0.84±0.06 0.64±0.09 1.31
4 0.63±0.09 0.51±0.06 1.23
1.12 아미노 4*104 6 0.69±0.15 0.58±0.10 1.18
0.73±0.08 0.58±0.10 1.25
2.01 카복시 107 5*105 5 0.84±0.096 0.64±0.09 1.31
4 0.63±0.06 0.51±0.06 1.23
4.58 106 5 0.72±0.09 0.64±0.09 1.12
4 0.67±0.09 0.51±0.09 1.31
10.85 5 0.68±0.08 0.64±0.09 1.06
4 0.60±0.10 0.51±0.09 1.17

표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 효과의 정도는 미소구의 직경, 미소구 상의 표면그룹, 처리후의 일수 및 농도에 따라 좌우되지만, 모든 상이한 형태의 미소구는 근아세포의 세포융합을 촉진시켰다. 근아세포 융합은 근육조직이 배형성 중에 형성되는 경우에 일어나며, 또한 근육 재생 및 손상된 근육조직의 복원에 있어서 매우 중요한 단계이다. 따라서, 이러한 융합을 촉진시키는 미소구의 능력은 명백히, 이하의 실시예 5에서 입증되는 바와 같이, 이들 미소구가 근육재생을 촉진시키는 잠재력을 가지고 있음을 시사하는 것이다.
실시예 3
콜라겐 합성 및 침착에 대한 미소구의 효과
배경기술 항목에서 이미 언급한 바와 같이, 콜라겐 합성 및 침착은 창상치유 의 과정에서 중요한 단계이다. 또한, 창상부위에 침착된 콜라겐의 양은 창상강도의 중요한 결정인자이다. 따라서, 상기 및 이하의 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 미소구가 다양한 세포형태에 대해 명백히 다양한 효과를 가지고 있지만, 창상치유를 촉진시키는 조성물의 능력에 대한 한가지 중요한 결정인자는 명백히 콜라겐 합성 및 침착에 대한 그의 효과이다.
도 2A 및 2B에서 보는 바와 같이, 본 발명의 미소구는 명백하게 배양된 섬유아세포에 의한 콜라겐 합성을 촉진시킨다. 최대효과는 타입 I 및 타입 II 미소구에 의해서 나타난다. 타입 I 미소구는 4.5 미크론의 직경을 가지며, 카복실화된 폴리스티렌으로부터 제조되었고, 약 -29.96 mV의 Z 전위를 가지고 있었다. 타입 II 미소구는 0.49 미크론의 직경을 가지며, 폴리스티렌 만으로 제조되었고, 약 -34.5 mV의 Z 전위를 가지고 있었다. 타입 III 미소구는 1.0 미크론의 직경을 가지며, 카복실화된 폴리스티렌으로부터 제조되었고, 약 -53.34 mV의 Z 전위를 가지고 있었다. 실험방법은 다음과 같았다.
포피섬유아세포 배양물은 75 ㎠ 플라스틱 플라스크 (Corning Glass Works, Corning, NY) 내의 10% v/v 태자송아지혈청이 보충된 4.5 ㎎/㎖ 글루코즈, 2 mM L-글루타민, 50 ㎍/㎖ 겐타마이신설페이트 및 2.5 ㎎/㎖ 암포테리신 B를 함유하는 둘베코 변형 이글배지 (DMEM) 중에서 배양하였다. 배양물은 융합이 일어날 때 까지 5% CO2하에 37℃에서 배양하였다. 섬유아세포를 0.25% 트립신/0.05% EDTA 용액을 사용하여 수거하고, 24시간 동안 동일한 배지를 사용하여 24-웰 플레이트에서 200,000 세포/웰의 밀도로 계대배양하였으며, 이때 처리된 세포는 타입 I, II 또는 III 미소구와 함께 배양하였다. 대조세포는 배지 만을 사용하여 배양하였다.
콜라겐 합성은 다음과 같이 측정하였다. 배양된 섬유아세포는 0.5% 투석된 태자송아지혈청이 보충된 DMEM 배지에서 24시간 동안 전배양하였다. 세포를 지시된 바와 같이 10 μM 아스코르브산의 존재 (도 2A) 또는 부재 (도 2B)하에서 100 μM의 최종농도로 B-아미노프로피오니트릴푸마레이트 (BAPN)를 함유하는 3 μCi 2,3-3H-프롤린 또는 3,4-3H-프롤린 용액으로 표지하였다. 아스코르브산은 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 촉진하며, 중요한 촉진인자이다.
배양 24시간 후에, 반응을 종결시키고, 펩신 (최종농도 0.5 ㎎/㎖)을 함유하는 30 ㎕ 냉아세트산 (0.5 M)을 첨가하고, 이어서 실온에서 4시간 동안 온화하게 진탕함으로써 각각의 웰로부터 콜라겐을 추출하였다. 원심분리한 후에, 세포파편을 버리고 각각의 상등액에 0.5 M 아세트산 중의 콜라겐 용액 80 ㎕를 최종 콜라겐농도를 약 200 ㎎/㎖로 하여 첨가하였다. 0.5 M 아세트산 중의 5.2 M NaCl 용액 0.4 ㎖를 첨가하여 각각의 상등액으로부터 콜라겐을 침전시켰다. 2시간 동안 정치시킨 후에, 침전된 콜라겐을 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리시켜 분리하였다. 그 다음에, 펠릿을 1 M NaCl을 함유하는 pH 7.4의 10 mM 트리스 (TRIS) 완충액 750 ㎕에 재현탁시켰다. 콜라겐은 5 M NaCl을 함유하는 pH 7.4의 10 mM 트리스 (TRIS) 완충액 750 ㎕를 첨가하여 침전시켰다. 2시간 후에, 콜라겐을 원심분리에 의해 분리하고, 0.5 M 아세트산에 재용해시킨 다음, 각각의 샘플을 섬광계수기에서 측정하 였다. 결과는 웰당 cpm으로 하여 도 2A 및 2B에 나타내었다. 제시된 데이타는 4번 반복한 샘플의 평균치이다.
타입 I 및 타입 II 미소구 둘다는 아스코르브산의 존재 (도 2A) 및 부재 (도 2B) 하 둘다에서 대조 (비처리) 섬유아세포에서 나타나는 레벨 이상으로 콜라겐 합성을 촉진시킬 수 있었다. 두가지 타입은 아스코르브산의 부재하에서는 유사한 효과를 가지고 있었지만, 아스코르브산의 존재하에서는 타입 I 미소구가 타입 II 미소구에 배해 더 큰 효과를 가지고 있었다. 타입 III 미소구는 아스코르브산의 존재 또는 부재하에서 콜라겐 합성에 대해 검출가능한 효과를 가지지 않았다.
한가지 특히 흥미로운 발견은 타입 I 및 타입 II 미소구가 둘다 효과를 가지는 반면에 타입 III는 그렇지 않다는 점인데, 이것은 미소구의 특정한 크기 및 물질이 중요함을 시사하는 것이다. 또한, 타입 I 및 타입 II 미소구는 아스코르브산의 부재하에서도 효과를 유도하였는데, 이것은 이들 두가지 타입의 미소구가 다른 자극인자의 부재하에서 조차도 콜라겐 합성을 강화시킬 수 있음을 시사하는 것이다. 따라서, 타입 I 및 타입 II 미소구는 둘다 콜라겐 합성에 대하여 상당한 촉진효과를 가짐이 명백하다.
실시예 4
근아세포 형태에 대한 미소구의 효과
랫트 근아세포의 일차 세포배양물은 상기 실시예 1에 기술한 바와 같이 제조하였다. 그후, 세포를 48시간 동안 폴리스티렌 미소구와 함께 (처리된 세포) 또는 미소구 없이 (대조세포) 배양하였다. 그후, 세포를 인산염 완충식염수중의 1% 글루타르알데히드 중에서 1-4일 동안 고정시키고, PBS로 세정하였다. 그 다음에, 세포를 PBS중의 1% 탄닌산 및 1% 구아니딘 HCl (1:1 비)의 용액에 1시간 동안 옮겼다. 시료는 1시간 동안 1% OSO4 중에서 후고정시키고, 실온에서 구배 에탄올 및 프레온 113으로 탈수시켰다. 그후, 시료를 슬라이드 상에 올려 놓고, 금으로 피복시킨 다음 2 kV에서 제올 (JEOL) T-300 주사전자현미경으로 검사하였다.
도 3A-3C는 근아세포 형태에 대한 본 발명의 미소구의 효과를 설명하는 것이다. 도 3A에서 세포는 세포표면의 일부분이 평평하기 보다는 볼록하도록 미소구 상에서 배양하였다. 도 3B 및 3C는 미소구가 놓여져 있는 세포의 부분으로부터 위족이 뻗어나온 세포를 나타낸다. 도 3C에서 세포의 위족은 특히 현저한데, 이것은 미소구가 명백하게 근아세포 형태에 영향을 미치는 것을 보여주는 것이다. 또한, 위족의 형성 및 확대는 명백히 세포골격구조에 있어서의 변화를 필요로 하며, 이것은 미소구가 또한 세포의 세포골격에 영향을 미친다는 사실을 입증하는 것이다. 이러한 위족의 형성은 창상영역 내로 세포가 유주하는데 중요할 수 있다. 따라서, 미소구에 의한 이러한 위족의 자극은 이들이 창상치유과정에서 또 다른 중요한 단계를 촉진시키는 능력이 있음을 시사하는 것이다.
실시예 5
조성물 및 적용방법
이하의 설명은 창상치유제의 적용을 위한 일반적인 장치 및 방법에 관한 것이다. 미소구와 같은 약제는 바람직하게는 치료하고자 하는 창상에 반복적으로 적용된다. 적용의 빈도 및 적용되는 농도는 증상의 중증도 및 치료에 대한 개체의 반응성에 따라 좌우된다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 사람이라면 최적농도, 투여방법 및 반복율을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 본 연구에서, 미소구는 하루에 대략 한번씩 치료하고자 하는 창상에 적용하는데, 물론 다른 적용율도 이용할 수 있다.
방법은 약제가 실질적으로 불용성인 제약상 허용되는 담체내의 미소구와 같은 약제를 치료하고자 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 제약상 허용되는 담체의 예로는 약제의 현탁액을 위한 수성매질, 연고, 크림 및 에어로졸-형성 물질과 같은 비수성 매질, 및 약제와 함께 매질내에 침지되거나 다른 식으로는 매질을 함유하는 붕대가 포함된다. 붕대는 폐색성이거나 비폐색성일 수 있다. 어떤 경우이든지, 제약상 허용되는 담체 내의 약제는 약제의 분산액으로서 설명될 수 있다.
약제는 바람직하게는 예정된 종말점에 도달할 때 까지, 예를들어 개체에서 임상적 증상이 없어질 때 까지, 효과적인 투여방법에 따라 투여된다. 치료하고자 하는 창상의 봉합은 이러한 종말점의 한가지 예이다.
본 발명의 장치는 하나 또는 그 이상의 약제 및 이 약제를 위한 제약상 허용되는 담체를 함유하는 조성물, 및 이 조성물을 함유하기 위한 용기를 포함한다. 적합한 용기의 예에는 에어로졸-분산 펌프 및 분무캔이 포함된다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 사람이라면 조성물에 적합한 용기를 쉽게 선택할 수 있을 것 이다. 사용된 특정한 장치와 무관하게, 미소구와 같은 약제는 바람직하게는 2단계 과정으로 적용된다. 우선, 미소구를 분산액으로하여 적하하거나, 분무하거나, 도포하거나, 세척하거나 또는 그밖의 다른 적합한 국소적용방법에 의해 창상에 적용한다. 바람직하게는, 미소구가 창상과 초기접촉을 할 수 있도록 제 2 단계 전에 30초 내지 2분이 경과하도록 한다. 바람직하게는, 제 2 단계는 미소구를 함유하는 액체현탁액에 침지된 폐색성 또는 비폐색성 붕대 또는 그밖의 다른 적합한 피복물을 창상에 적용하는 것을 포함한다. 이것은 실질적으로 붕대 또는 피복물에 의한 미소구의 흡수를 감소시키거나 배제시킨다. 이 방법은 이하의 실시예에 기술된 바와 같이 창상치유를 위해서 랫트 및 인간 둘다에서 사용하였다.
현탁액 내의 미소구는 회합하거나 응결하거나 응집하거나 비가역적인 점결을 일으키지 않았다. 미소구는 기간이 경과함에 따라 다소 침강하였지만, 이들은 온화하게 교반함으로써 쉽게 재현탁되었다.
실시예 6
랫트에서 미소구에 의한 창상치유의 촉진
상기 실시예 1-4에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 미소구는 시험관내에서 창상치유에 중요한 다양한 세포과정을 촉진시킨다. 그러나, 시험관내 및 생체내 효과는 항상 상관관계가 있는 것은 아니다.
따라서, 미소구가 랫트에서 창상치유를 촉진시키는 능력이 있는지를 평가하기 위하여 생체내 실험을 수행하였다. 도 4A-4D에서 보는 바와 같이, 본 발명의 미소구는 랫트에서 창상치유를 명백하게 촉진시킨다. 도 5는 창상면적이 감소하는 속도를 나타낸 그래프이며, 이것은 본 발명의 미소구가 이러한 감소가 일어나는 속도를 증가시키는 것을 보여주는 것이다. 마지막으로, 표 2는 미소구가 랫트에서 근육재생을 촉진시키는 것을 보여주고 있다. 실험방법은 다음과 같았다.
체중 300 내지 400 g의 수컷 위스타 랫트를 넴부탈 (체중 ㎏당, 5 ㎎)로 마취시켰다. 전경골근의 외측부에 대한 절제손상은 다음과 같이 수행하였다. 우선, 피부에서 종방향 절제를 수행하여 전경골근을 노출시켰다. 그 다음에, 근육 너비의 대략 반을 따라서 근육섬유를 횡방향으로 절단함으로써 이 근육의 부분절제를 수행하였다. 그후, 절제된 조각을 근육으로부터 떼어내어 근육에 약 5 ㎜×5 ㎜의 틈을 남겨두었다. 모든 랫트에서, 동량의 절제된 조직 (80±10 ㎎)을 정확하게 근육의 동일한 위치로부터 제거하였다. 그 다음에, 창상영역을 치료된 랫트의 경우에는 식염수중의 2 미크론 폴리스티렌 미소구로, 대조랫트의 경우에는 식염수 만으로 드레싱하였다. 창사면적은 손상이 있은 후 3 내지 15일 동안 측정하였다.
도 4A-4D는 상술한 바와 같이 만들어진 창상영역의 그림을 보여주는 것이다. 도 4A는 상해를 입은 직후의 대조랫트의 창상을 보여주는 반면에, 도 4B는 치료하고자 하는 랫트의 동등한 창상을 보여주는 것이다. 도 4C 및 4D는 손상을 입은지 5일 후의 동일한 랫트를 나타내고 있다. 대조랫트의 창상은 식염수 만으로 치료하였으며, 완전히 치유되지 않고 그대로 있었다. 이와는 반대로, 미소구로 치료한 치료된 랫트의 창상은 완전하게 치유되었다. 따라서, 본 발명의 미소구가 더 빠른 창상치유를 촉진시킴은 명백하다.
도 5는 또한 본 발명의 미소구에 의한 창상치유의 촉진을 설명하는 것이다. 대조랫트의 창상은 치료된 랫트의 창상에 비해서 훨씬 더 느린 속도로 결국에는 치유되었다. 따라서, 미소구는 명백하게 창상면적을 감소시키고 창상을 치유하는 속도를 증가시킨다.
조직학적 검사를 위한 슬라이드는 창상영역의 조직생검 펀치 (biopsy punch)를 만들어서 제조하였다. 랫트는 상해를 입은지 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13 또는 14일 후에 희생시키고, 조직학적 검사를 위해서 조직생검을 채취하였다. 새로 형성되거나 복원된 근육섬유내로 이입된 특수한 근원성 세포의 수는 활성화된 근원성 세포를 나타내는 "새로운" 핵의 수를 측정함으로써 계수하였다. 이들 세포의 핵은 분산된 크로마틴을 갖는 큰 호염기성 핵이며, 기존의 근아세포의 핵과는 쉽게 구별될 수 있다. 결과는 표 2에 제시하였다.
미소구에 의한 근육재생의 촉진
치료 수술후 일수 슬라이드당 "새로운" 핵 영역당 "새로운" 핵 섬유당 "새로운" 핵
M 4 422±67 53.8±22 9.5±3.5
C 4 117±37 14.6±10 5.9±1.4
M 5 350±84 43.8±13.5 8.6±1.8
C 5 110±31 14.1±4.6 4.8±1.2
M 6 1221±180 94±25 11.9±5
C 6 676±120 52±11 4.9±0.9
M 7 762±110 95±51 9.4±3.5
C 7 169±47 21.1±4.8 4.5±0.8
M 8 715±140 89.4±36 11±2.2
C 8 126±32 18.6±12 5.2±1.5
M 9 299±75 42.7±19 7.4±1.3
C 9 235±84 33±12 6.5±2.8
M 13 747±129 53.3±15 9.7±1.5
C 13 582±140 42±42 5±1.7
M 14 665±143 83±24 9.4±1.9
C 14 491±124 61±36 5.5±2.7

표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 미소구는 근육섬유내의 "새로운" 또는 이입된 핵의 수에 의해 측정된 것으로서 근육재생을 촉진시켰음이 명백하다. 이러한 측정이 생체내에서 치료된 랫트로부터 채취된 조직학적 샘플에 대해 이루어진 것이라는 사실은 또한 미소구가 시험관내에서 뿐만 아니라 생체내에서도 근육재생을 촉진시킴을 시사하는 것이다. 마지막으로, 도 6은 랫트에서 조직배양매질 및 식염수에 의한 창상치유에 대한 본 발명의 미소구의 효과를 비교한 것이다. 상술한 바와 같이 랫트에게서 창상을 유도하였고, 랫트를 식염수 만으로 (도 6A), 조직배양매질 만으로 (도 6B, ×), 식염수와 미소구로 (도 6A), 또는 조직배양매질과 미소구로 (도 6B) 치료하였다. 그후, 랫트를 창상이 발생한지 4일후에 사진을 찍었다. 도 6A 및 6B로부터 알 수 있는 바와 같이, 미소구는 담체가 식염수인지 조직배양매질인지와는 무관하게 창상치유의 훨씬 더 빠른 속도를 유도할 수 있었다. 따라서, 창상치유에 대한 본 발명의 미소구의 효과의 어떤 부분도 조직배양매질에 기인한 것은 아니었다.
실시예 7
미소구의 독성연구
미소구를 함유하는 제제의 독성효과는 관찰되지 않았다. 상해가 있은지 65 및 180일 후에 치료된 랫트의 예비검사는 다음과 같은 기관 중의 어떤 것도 병리학적 변화의 징후를 나타내지 않았음을 보여주고 있다: 심장, 간, 폐, 신장, 혈관, 위, 림프절 및 뇌.
형광물질-표지된 미소구를 사용한 실험에서는 치료된 랫트에서 병변의 징후가 관찰되지 않았음을 보여주고 있다. 또한, 미소구는 상기 언급된 기관중의 어떤 것에도 침투하지 않았다. 상기 언급된 기관에서 새로운 성장은 검출되지 않았다. 마지막으로, 미소구는 창상영역내에 분산되었으며, 재생 근육섬유 내로는 침투하지 않았다.
실시예 8
인간에게서 창상치유에 대한 미소구의 효과
실시예 6에 기술된 생체내 실험은 본 발명의 미소구가 랫트에서 창상치유 및 근육재생을 촉진시킬 수 있음을 명백히 입증하였다. 또한, 실시예 7에 기술된 랫트에서의 독성연구의 결과는 미소구가 실질적으로 무독성임을 보여주고 있다. 따라서, 인간에게서 창상치유에 대한 본 발명의 미소구의 효과를 측정하기 위한 연구를 수행하였다. 이하에서 상세히 기술하는 바와 같이, 증례연구는 미소구가 인간에게서 창상치유를 명백히 촉진시켰음을 입증하였다. 첫번째 증례연구는 왼쪽 다리에 치료가 안되었던 궤양이 있는 66-세의 여성이었다. 환자는 또한 왼쪽 다리에 봉와직염 및 양쪽 다리에 정맥류성 정맥을 가지고 있었다. 환자의 안쪽 대퇴상에 있는 궤양은 물중의 부식성 염소염인 밀톤 (Milton) 2%로 치료하였다. 환자의 바깥쪽 대퇴상의 궤양은 조직배양매질 중의 폴리스티렌으로 만든 본 발명의 4.5 미크론 미소구로 치료하였다. 도 7A는 0일째의 대조창상을 보여주고 있는 반면에, 도 7B는 치료한지 4개월 후의 대조창상을 보여주고 있다. 도 7C는 0일째의 치료된 창상을 보여주며, 그 반면에 도 7D는 치료한지 4개월 후의 치료된 창상을 보여준다. 본 발명의 미소구로 치료된 창상 및 밀톤으로 치료된 창상은 둘다 후속 4개월의 기간중에 감염의 징후 및 치유에 있어서의 다른 어려움을 나타내었다. 그러나, 치료기간이 끝날 때에 미소구로 치료된 창상은 현저한 개선을 보여주었다. 창상크기는 감소하였으며, 창상은 감염의 징후가 없이 깨끗하였다. 따라서, 감염과 같은 합병증으로 인하여 치료하기 어려운 창상의 경우라 하더라도, 본 발명의 미소구는 현재 이용되고 있는 치료보다 창상치유 촉진에 있어서 더 큰 효능을 나타내었다.
추가의 증거로서, 상기 도 7에서 대조군으로서 제공된 창상 (도 7A 및 7B)을 도 7C 및 7D에서 창상을 치료하는데 사용된 것과 동일한 미소구로 치료하였다. 결과는 도 8A 및 8B에 나타내었다. 도 8A는 미소구에 의한 치료 0일째의 창상을 나타낸 것인 반면에, 도 8B는 치료한지 21일 후의 창상을 나타낸 것이다. 명백하게, 이러한 단기간의 기간 후에도 창상의 정도는 감소하였다. 또한, 창상은 표재성이었으며, 깨끗하였고, 더 이상 삼출물을 생성하지 않았다.
두번째 증례연구는 왼쪽 대퇴부의 전면에 1년된 감염된 창상이 있는 52세의 여성이었다. 창상은 일주일 동안 1% 밀톤으로 치료하고, 괴사조직을 제거한 다음, 10일 동안 도 7 및 8의 미소구로 치료하였다. 도 9A는 치료 0일째의 창상을 나타낸 것이며, 그 반면에 도 9B는 치료 10일 후의 창상을 나타낸 것이다.
10일후에 창상은 현저한 개선을 나타내었다. 이것은 도 9B에서 볼 수 있는 바와 같이, 정도에 있어서 작은 크기로 감소하였으며, 깨끗하였고, 더 이상 삼출물 을 생성하지 않았다. 창상이 비교적 짧은 치료기간 중에 완전히 아물지는 않았지만, 그의 효과는 현저히 개선되었다.
세번째 증례연구는 산업작업장 사고시에 화학물질의 유출에 의해 손상을 입은 19세의 남자였다. 문제의 화학물질인 설푸라이드 (sulfurides)는 그의 목의 오른쪽 및 오른손에 심각한 화상 및 수포를 야기시켰다. 첫번째 2일 동안, 모든 창상들은 강력한 흡수특성을 갖는 하이드로겔인 실베롤 (Silverol)로 치료하였다. 그 다음에, 왼쪽 전완의 창상은 증례연구 1 및 2의 미소구로 치료한 반면에, 나머지 창상은 실베롤 (Silverol)로 치료하였다. 결과는 도 10A 및 10B (각각 0일 및 5일째의 대조창상) 및 도 10C 및 10D (각각 0일 및 5일째의 치료된 창상)에 나타내었다.
미소구로 치료한지 5일 후에, 전완상의 치료된 창상의 상태는 미소구로 치료하지 않은 나머지 창상의 상태에 비해 현저하게 개선되었다. 전완에 있는 창상은 미소구로 치료한지 5일 후에 완전히 치유되었다. 이와는 반대로, 실베롤로 치료한 나머지 창상은 완전히 치유되지 않았다. 따라서, 미소구는 명백하게 창상치유를 촉진시켰으며, 이것은 현재 이용되고 있는 치료방법에 비해 더 큰 효능을 입증하는 것이다.
네번째 증례연구는 열수욕에서 엉덩이에 2도 화상을 입은 52세의 여성이었다. 왼쪽 엉덩이의 창상은 실베롤로 치료한 반면에, 오른쪽 엉덩이의 창상은 전술한 증례연구의 미소구로 치료하였다. 결과는 도 11A (치료 0일째) 및 11B (치료 7일째)에서 미소구-치료된 창상의 경우에 대해서만 나타내었다.
치료를 시작한 지 7일 후에, 미소구로 치료한 오른쪽 엉덩이의 창상은 우수한 상피성장과 함께 완전히 치유되었다. 이와는 반대로, 실베롤로 치료한 왼쪽 엉덩이의 창상은 완전히 치유되지 않았으며, 비교적 느리게 아물었다. 따라서, 미소구는 통상적인 치료에 비해 더 빠른 속도로 창상치유를 촉진시킬 수 있었다.
다섯번째 증례연구는 광범하고 심각한 햇빛화상을 입은 28세의 여성이었다 (데이타는 제시하지 않음). 그 여성은 전술한 증례연구의 미소구로 치료하였다. 환자는 불쾌감의 현저한 감소 및 햇빛화상의 빠른 치유 둘다를 보고하였다. 따라서, 본 발명의 방법 및 장치에서 사용된 미소구는 불쾌감을 완화시킬 수 있으며, 또한 창상치유를 촉진시킬 수 있지만, 불쾌감의 완화는 아마도 직접적인 진통효과가 아니라 미소구의 매우 간접적인 효과일 것임에 주목하여야 한다.
실제로, 특히 언급할 만한 것은 상기 환자의 보고가 단지 햇빛화상으로부터의 불쾌한 감각에 있어서의 명백한 감소를 포함함을 특징으로 하는 것으로 추론될 수 있다는 점이다. 이러한 감소된 불쾌감은 아마도 미소구가 신경자극의 전달에 대한 직접적인 효과를 가지거나, 실제로 불쾌한 감각을 유도하는 여러가지 인자중의 어떤 것을 직접적으로 변화시키는 능력을 가진다는 것을 입증하지는 못할 것이다. 대신에, 이 효과는 아마도 매우 간접적일 것이며, 이것은 항염증효과를 가지고 있어서 환자에 의한 불쾌감의 감소를 유도하는 대식세포의 활성화의 결과로서 나타난다.
랫트를 사용한 연구로부터 얻은 광범한 증거와 함께 이들 다섯가지 증례의 기록으로부터, 본 발명에 따르는 미소구와 같은 약제의 사용은 창상치유 및 근육재 생의 촉진에 있어서 현재 이용되고 있는 선행기술의 치료보다 더 큰 효능을 가짐을 명백히 보여주고 있다. 방법 및 장치는 창상치유를 촉진시키고, 가속화시키고 증진시킬 뿐 아니라, 환자가 겪는 불쾌감을 감소시킨다.
감소된 불쾌감과 관련하여, 상기 증례연구에 있어서 환자는 또한 치료된 창상으로부터의 통증 및 불쾌감에 있어서 국소적인 감소를 보고하였으며, 특히 햇빛화상을 입은 환자에게서 아마도 그들의 (또한 간접적인) 항염작용으로 인한 미소구의 간접적인 효과일 것이다.
마지막으로, 데이타가 제시되지는 않았지만, 슈도모나스 (Pseudomonas) 종에 의한 창상의 감염에 대한 간접적인 정균효과도 또한 인간에게서 기록되었다. 간접적인 항염작용 및 간접적인 정균효과 둘다의 기전이 명확하지는 않지만, 아마도 대식세포의 유인 및 활성화를 포함함을 특징으로 하는 세포효과의 결과일 것이다. 정확한 기전과 무관하게, 본 발명에 따르는 미소구의 사용은 명백하게 창상의 치료에 있어서 현저한 개선을 나타낸다.
실시예 9
방사선 조사 후 및 화학요법 전에 창상치유에 대한 미소구의 효과
본 발명의 미소구는 근치적유방절제술에 이어서 방사선 요법을 받는 환자에게서 초기증가를 유도한다.
제 II기의 질병을 갖는 54세의 유방암 환자는 수술을 수행한 다음 방사선 요법을 수행하였다. 환자는 괴사성 병소로 인해 고통을 받고 있었으며 (도 12A), 괴 사성 창상의 봉합이 이루어질 때 까지는 그녀의 진행된 질병의 확산을 방지하기 위하여 화학요법의 과정을 받지 않도록 권유되었다. 환자는 54일 동안 매일 2회씩 미소구로 치료하였다. 미소구로 치료한지 21일 후에 환자의 창상은 개선되었으며, 창상의 봉합이 이루어진 후에 화학요법이 시작되었다 (도 12B-12D). 환자는 화학요법의 과정을 받을 수 있었으며, 현재는 질병이 없는 상태이다. 따라서, 본 발명의 조성물은 방사선 요법 및 화학요법과 병용하여 창상을 치료하는데 유용하다.
실시예 10
약리 제제 및 생물학적 제제 존재하의 미소구 조성물
이하의 실시예에서, 약리 제제 및(또는) 생물학적 제제는 제약 담체에 가용성이지만, 미소구는 불용성이며, 미소구는 치료 조성물내에 현탁액으로 잔존한다.
a) 치료 조성물은 감염을 예방하기 위하여 조성물에 항생제, 예를들어 네오마이신 설페이트 약 1-100 ㎎/㎖, 바시트라신 약 100-1000 유니트/㎖, 옥시테트라사이클린 HCl 약 10-100 ㎎/㎖ 또는 그라마시딘 약 1-10 ㎎/㎖를 첨가하는 것을 제외하고는 상기 미소구의 특징 항목에서 기술된 바와 같은 미소구로 만들었다.
b) 치료 조성물은 필요에 따라 병원성 창상의 효소적 괴사조직제거를 제공하기 위해 조성물에 단백질분해효소, 예를들어 콜라게나제 또는 엘라스타제 약 10-100 유니트/㎖, 스트렙토키나제 약 10-100 유니트/㎖ 또는 스트렙토도나제 약 10-100 유니트/㎖를 첨가하는 것을 제외하고는 상기 미소구의 특징 항목에서 기술된 바와 같은 미소구로 만들었다.
c) 치료 조성물은 응급용 또는 전장용 치료 조성물을 제공하기 위해 조성물에 수렴제, 예를들어 명반 약 75-250 ㎎/㎖, 위치하젤 (witch hazel) 약 100-1000 ㎎/㎖, 포비딘 요오드 약 1-10%, 산소기제로서 오존 약 10-100 ㎎/㎖, 또는 과산화수소 10-100 ㎎/㎖를 첨가하는 것을 제외하고는 상기 미소구의 특징 항목에서 기술된 바와 같은 미소구로 만들었다.
d) 치료 조성물은 콜라겐 가교결합을 감소시키기 위해 조성물에 디아민, 예를들어 푸트레신 약 1-50 ㎎/㎖, 스페르미딘 약 1-100 ㎎/㎖ 또는 카다베린 약 1-150 ㎎/㎖를 첨가하는 것을 제외하고는 상기 미소구의 특징 항목에서 기술된 바와 같은 미소구로 만들었다.
e) 치료 조성물은 자연적인 치유과정을 증진시키고 성장을 촉진시키기 위하여 수성조성물에 성장인자, 예를들어 PDGF, PDAF, PDEGE 또는 PF-4 약 10-100 유니트/㎖, FGF 약 10-100 유니트/㎖, EGF 약 10-100 유니트/㎖, TGF 약 10-100 유니트/㎖ 또는 IGF 약 10-100 유니트/㎖를 첨가하는 것을 제외하고는 상기 미소구의 특징 항목에서 기술된 바와 같은 미소구로 만들었다.
f) 치료 조성물은 창상치유를 자극하기 위해 조성물에 면역증진제, 예를들어 L-아르기닌 약 10-100 ㎎/㎖, 산화질소 약 5-50 ㎎/㎖, 쿠아드롤 약 50-500 ㎎/㎖, 뮤라밀디펩타이드 약 50-500 ㎎/㎖, 대식세포 활성화인자 약 10-100 ㎎/㎖ 또는 히알우론산 약 1-10 ㎎/㎖를 첨가하는 것을 제외하고는 상기 미소구의 특징 항목에서 기술된 바와 같은 미소구로 만들었다.
g) 치료 조성물은 조성물에 금속이온, 예를들어 염화아연 약 1-10 ㎎/㎖, 아연글루코네이트 약 1-10 ㎎/㎖, 마그네슘글루코네이트 1-100 ㎎/㎖, 구리염 또는 펩타이드 약 1-10 ㎎/㎖를 첨가하는 것을 제외하고는 상기 미소구의 특징 항목에서 기술된 바와 같은 미소구로 만들었다.
h) 치료 조성물은 조성물에 비타민, 예를들어 비타민 A 약 100-10 유니트/㎖, 비타민 C 약 50-500 ㎎/㎖ 또는 비타민 E 약 50-500 유니트/㎖를 첨가하는 것을 제외하고는 상기 미소구의 특징 항목에서 기술된 바와 같은 미소구로 만들었다.
i) 치료 조성물은 응급시 또는 전장에서 겪게 되는 외상성 창상을 치료하는 조성물에 진통제, 예를들어 모르핀 설페이트 약 5-50 ㎎/㎖, 휀타밀 시트레이트 약 1-10 ㎎/㎖ 또는 리도카인 하이드로클로라이드 5-50 ㎎/㎖를 첨가하는 것을 제외하고는 상기 미소구의 특징 항목에서 기술된 바와 같은 미소구로 만들었다.
j) 치료 조성물은 방사선 요법, 레이저 치료, 고압치료 또는 오존과의 병용요법으로 투여하기 위하여 상기 미소구의 특징 항목에서 기술된 바와 같은 미소구로 만들었다.
본 발명은 본 발명의 각각의 관점에 대한 간단한 설명을 목적으로 기술된 특정의 구체예에 의해 범위를 제한하는 것은 아니며, 기능적으로 동등한 방법 및 성분들이 본 발명의 범위내에 포함된다. 실제로, 본 명세서에 제시되고 기술된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 특허청구의 범위의 범주내에 포함되는 것이다.
또한, 이하의 특허청구의 범위는 본 명세서에 기술된 발명의 일반적이며 구체적인 특징 및 언어상으로 본 발명의 범주에 포함되는 것이라고 말할 수 있는 본 발명의 범주내의 모든 설명을 모두 포함하고자 하는 것이다.

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  54. 조성물을 창상의 표면에 부어서 적용할 수 있도록 되어 있는 조성물의 저장 및 혼합용 포장내에 함유되어 있으며, 치료기간 중에 실질적으로 비-생분해성이고 1.1㎛ 내지 200㎛ 범위의 직경으로 구성되며 음전하로 하전된 미소구 0.001-25 중량%, 및 상기 미소구가 실질적으로 불용성인 미소구에 대한 제약상 허용되는 담체를 현탁액 내에 포함하며, 상기 미소구가 폴리스티렌, 설페이트 또는 카르복실 잔기로 유도된 폴리스티렌, 폴리리신 및 폴리-N-에틸-4-비닐-피리디늄 브로마이드로 구성된 군으로부터 선택된 물질로 형성된 창상 치유용 치료 조성물.
  55. 제 54 항에 있어서, 미소구가 -10 mV 미만의 제타 전위를 나타내는 창상 치유용 치료 조성물.
  56. 제 54 항에 있어서, 제약 담체가 수성매질, 에어로졸 담체, 약리 제제용 수성용매, 생물학적 제제용 수성용매, 연고 및 붕대로 구성된 군으로부터 선택되는 창상 치유용 치료 조성물.
  57. 제 54 항에 있어서, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 겐타마이신, 네오마이신 설페이트, 바시트라신, 폴리믹신 B 설페이트 및 그라마시클린으로 구성된 군으로부터 선택되는 항생제를 더 포함하는 창상 치유용 치료 조성물.
  58. 제 54 항에 있어서, 항히스타민제; 항염제; 항암제; 항바이러스제; 항진균제; 아연, 마그네슘, 코발트, 철, 구리 및 망간으로 구성된 군으로부터 선택되는 금속이온; 수렴제; 리도카인, 프로카인 및 에피네프린으로 구성된 군으로부터 선택되는 마취제; 통증의 치료를 위한 모르핀, 헤로인 및 휀타닐로 구성된 군으로부터 선택되는 진통제; 비스테로이드성 항염제(NSAID); 비타민; 아미노산; 콜라겐; PDGF, PDAF, PDEGF, TGFB, PF-4, αFGF, BFGF, GH, EGF 및 IGF로 구성된 군으로부터 선택되는 성장인자; 콜라게나제, 엘라스타제, 스트렙토키나제 및 스트렙토도나제로 구성된 군으로부터 선택된 단백질분해효소; 내피세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단핵세포, 혈관세포, 비만세포 및 지방세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기질세포; L-아르기닌, 산화질소, 쿠아드롤 및 뮤라밀 디펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 면역증진제; 또는 수술창상, 병원성 창상, 골절, 울혈성 궤양 및 만성 창상의 치유를 촉진시키기 위한 히알우론산으로 구성된 군으로부터 선택되는 제약 제제를 더 포함하는 창상 치유용 치료 조성물.
  59. 세포막과 다점접촉을 형성할 수 있으며 실질적으로 비-생분해성이고 음으로 하전된 미소구 및 상기 미소구에 대한 제약상 허용되는 담체를 함유하며, 상기 미소구가 폴리스티렌, 설페이트 또는 카르복실 잔기로 유도된 폴리스티렌, 폴리리신 및 폴리-N-에틸-4-비닐-피리디늄 브로마이드로 구성된 군으로부터 선택된 물질로 형성된 조성물을 보유하는 용기를 포함하는 장치.
  60. 제 59 항에 있어서, 미소구가
    a) -10 mV 미만의 제타 전위를 나타내고,
    b) 0.01 ㎛ 내지 200 ㎛의 직경을 갖는 장치.
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