JP4653887B2 - 創傷治療用のミクロスフェアを含む組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【技術分野】
本特許出願は、1997年6月4日付けの特許出願第08/868,950号の、一部継続出願に係わる。
本発明は、創傷および/または病巣に適用するための、ミクロスフェアを含む組成物、および該組成物を単独でまたは他の薬物との組合わせで、創傷または病巣の予防および治療において使用する方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
創傷の治癒は、細胞、細胞外マトリックス成分、および細胞の微小環境等の因子を包含する複雑な過程である。本質的に、全ての創傷の治癒は、損傷を受けた組織の修復および置換を含み、該損傷組織は、皮膚、筋肉、神経系組織、骨、軟質組織、内部器官または血管組織を含むが、これらに制限されない。このような修復および置換の正確な特徴は、関与する該組織に依存するが、全てのこのような過程は、幾つかの基本的な原理を含んでいる。創傷治癒の重要な局面は、創傷が引張り強さを獲得する速度である。
皮膚は、張力および伸長性を示す。皮膚の張力は、創傷に対する応答に関与する決定的な因子の一つであり、また年齢および部位によって変化する。皮膚は、多層を有し、ケラチン、表皮および真皮を含み、また細胞、コラーゲンおよびエラスチンで構成される繊維状網目構造およびアモルファス礎質を含み、該礎質は、タンパク、多糖類、糖タンパク、球状タンパク、塩および水からなる。多くの軽度の傷害におけるように、表皮のみが損傷を受けた場合には、ケラチノサイトが、該創傷の端部から移動し、終にはこれを覆ってしまい、該表皮およびケラチンを再生する(Knighton, D.R.等, Invest. Radiol., 1991, 26: 604-611)。
【０００３】
全ての皮膚層が損傷を受けもしくは破壊された場合には、肉芽組織と呼ばれる新たな連結組織が、まず該創傷空間を満たす必要がある。この組織は、細胞外マトリックス成分、例えばコラーゲンの堆積により、即ち該創傷空間に移動する線維芽細胞によって形成される。このコラーゲンの合成並びに付着は、創傷治癒においても重要であり、またコラーゲンの合成速度は、種々の器官によって異なっている(Haukipuro, K.等, Ann. Surg., 1991, 213:75-80)。
創傷治癒の完全な多段工程が、首尾良い創傷治癒のために完結される必要がある。これら成分の一種以上が失われた場合には、治癒は起こらず、該皮膚は修復されず、該創傷は開放されたままである。このような開放状態にある創傷は、た易く感染される危険性があり、治癒過程が更に遅れ、該皮膚上での潰瘍および糜爛の形成に導く。この創傷の治癒過程は、更に多くの患者において、他の複雑な状態の存在によって、阻害される。該状態は、糖尿病または老齢を含むが、これらに制限されない。このような状態におちいった患者は、しばしば潰瘍化し、かつなかなか治癒しない、あるいは長期間の経過後に、徐々に治癒するに過ぎない、皮膚の創傷をもつ。
【０００４】
種々の治療法を利用して、創傷の治癒する速度を加速し(米国特許第4,772,591号; 同第4,590,212号)、また種々の製薬担体、例えばクリーム、ゲル、粉末およびミクロスフェアを使用して、該創傷に化学療法剤を放出している。米国特許第5,264,207号は、ポリマーのミクロスフェアを開示しており、これは1種以上の活性薬剤または化粧料物質用の担体として作用する。このポリマーミクロスフェアは、中実または中空であり、また該担体液体に不溶性であり、しかも1000nm (1μm)を越えない、変動する寸法を有し、その好ましいサイズは、50〜500nm (0.05〜0.5μm)、および最も好ましくは60〜300nm (0.06〜0.3μm)なる範囲内にある。該ミクロスフェアの細末度は、単位重量当たりの高い比表面積および皮膚の孔を遮断する従来の賦形剤の諸欠点を示すことのない、活性物質とミクロスフェアとの高度の組合わせに導く。かくして、米国特許第5,264,207号発明によれば、該ミクロスフェアの懸濁液を得ることができ、その上に活性物質が吸着され、別の物質が化学結合によって該ミクロスフェアに結合し、第三の物質が、静電的またはイオン結合により該ミクロスフェアと結合する可能性を有する(第2欄、第58-63行)。該ミクロスフェアが中空である場合、これらは、官能性基に対する吸着剤および/または担体両者として機能する(第3欄、第18-21行)。該ミクロスフェアが孔を含む場合、薬理学的または化粧学的物質との結合は、該孔への吸着からなる(第3欄、第26-28行)。このように、米国特許第5,264,207号は、薬理学的および/または化粧学的物質に対してのみ担体として機能する、ミクロスフェアの組成物を開示しており、該ミクロスフェアのみを、それ自体創傷の治癒を増強するのに使用することを、教示も示唆もしていない。
【０００５】
同様に、PCT出願WO96/13164およびWO94/13333両者は、幾つかの治療物質の生成または放出を触媒する材料で作成されたミクロスフェアを開示している。PCT出願WO96/13164は、損傷を受けた組織に、直接適用した場合に、一酸化窒素を放出する、ポリマー-一酸化窒素付加生成物を開示している。PCT出願WO94/13333は、化学的に修飾して、該創傷環境における、遊離基活性を持たせた、粒子を開示している。従って、これら何れの参考文献も、該ミクロスフェア材料を化学的に修飾することなしに、該ミクロスフェア自体を、治療用物質として使用することを、教示も示唆もしていない。
【０００６】
該ミクロスフェアのサイズは、細胞毒性Tリンパ球の活性化において使用する、クラスIアロ抗原用の担体としての、ミクロスフェアの効果に影響を与えることが示された(Mescher, M.F., J. Immunol., 1992, 149:2402-2405)。その応答は、4μmまたは5μm (4000nmまたは5000μm)なる径に相当するミクロスフェアの最適サイズに対して示される、該クラスI抗原に依存した。換言すれば、Mescherは、インビトロでのTリンパ球の活性化が、ミクロスフェアのみでは達成されず、該活性化を誘発するためには、このクラスI抗原が必要であることを開示している。この抗原は、径4または5μmをもつミクロスフェアと結合した際に、即ちBommelser, J.等に付与された米国特許第5,264,207号で使用されたミクロスフェアよりも、4〜5倍大きなサイズをもつミクロスフェアと結合した場合に、最適に反応した。このMescherの特許は、該活性成分、クラスI抗原の使用なしに、ミクロスフェアのみを、創傷治癒の活性化において使用することを、何等教示も示唆もしていない。事実、創傷治癒及びコラーゲン合成における、ミクロスフェア及び細胞毒性Tリンパ球の役割は、Mescherにより教示も示唆も全くなされていない。更に、Bommelserは、1000nmまたは1μmを越えるサイズのミクロスフェアの使用を教示していない。というのは、大きなミクロスフェアは、皮膚の孔を遮断してしまうからである。従って、本発明は、(従来技術の組成物の成分において異なっていることから)該従来技術に固有のものでも、また(使用するミクロスフェアのサイズは、従来技術からは、皮膚の孔を遮断するものと予想されるから)従来技術から自明のものでもない。
【０００７】
創傷の治癒過程は、迅速な細胞の代謝及び増殖を促進する、初期増殖段階、デブリの除去、線維芽細胞の動員および循環の再生を含む。該創傷が最も感染に対して敏感なのは、この期間中である。創傷治癒のこの後の段階(線維組織形成段階とも呼ばれる)において、引張り強さの増加と共に、該創傷におけるコラーゲン含有率の上昇が起こる。従って、該増殖段階を促進し、かつその場で該線維組織形成段階を調節することのできる、非-生分解性のミクロスフェアおよびその他の細胞外成分を含む、創傷治癒用組成物の開発に対する需要が残されている。 従って、種々の状態に対して、動物およびヒトにおける創傷治癒中に、該増殖段階の促進と、該線維組織形成段階の開始との間には、ある釣り合いが存在するはずである。該状態とは、火傷した組織、外科手術後の感染、外科的創傷の破壊、内部の潰瘍、出血、骨壊疽、圧迫性糜爛、床擦れ、折衷的切断部位、治療不能な外傷性創傷、美容整形、髭剃り後、歯科治療、慢性潰瘍(糖尿病性の、結節状構造を持つ静脈の、病後の)、放射線による組織破壊、脊髄損傷による創傷、婦人科学的創傷、化学的創傷、血管疾患性創傷、糖尿病性皮膚糜爛、糖尿病性足、物理的外傷、形成外科手術後の縫合部位、日焼けまたは会陰切開を含むが、これらに制限されない。
【０００８】
【発明の開示】
従って、本発明の目的の一つは、創傷の形成を防止し、あるいは創傷の治癒を促進し、かつ創傷または病巣内におよびその輪郭に適用した場合に、該創傷/病巣を手当てする機能をもち得る、予防的または治療的組成物を製造することにある。
本発明のもう一つの目的は、筋肉、皮膚、軟骨、神経系組織、軟質組織または血管組織の再生を促進するように作用する、創傷の手当て剤として機能できる、組成物を提供することにある。
更に別の本発明の目的は、湿潤時点には接着性である、創傷/病巣被覆として機能でき、かつ潜在的に有害な接着剤を使用することなしに、該創傷/病巣と接触状態に置くことができる、組成物を提供することにある。
本発明の更なる目的は、ミクロスフェア用の媒体および薬剤用の薬物放出系として機能できる、組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、筋原細胞の融合を促進するように機能する組成物を提供することにある。
【０００９】
もう一つの本発明の目的は、インビトロおよびインビボにて、コラーゲンの合成を促進するように機能する、組成物を提供することにある。
更に別の本発明の目的は、瘢痕形成を防止する、組成物を提供することにある。
もう一つの本発明の目的は、ミクロスフェアと、これに添加された、創傷の治癒を促進するように機能する、外因性の増殖因子とを含む、組成物を提供することにある。
更に別の本発明の目的は、ミクロスフェアと抗炎症剤とを含む組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと抗ヒスタミン剤とを含む組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと抗生物質とを含む組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアとビタミンとを含む組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアとミネラルとを含む組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと、抗癌剤、抗ウイルス剤および抗-真菌剤とを含む組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと、活性物質とを含む、または活性物質を含まない、組成物を提供することにあり、ここで該活性物質は、外科手術、放射線療法、ホルモン療法または化学療法に対する補助療法剤として適用されるものである。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと、鎮痛剤、麻酔薬または収斂薬を含む、組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと、コラーゲンとを含む組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと、抗炎症剤、抗-ヒスタミン剤、抗生物質、防腐剤、抗-真菌剤、鎮痛剤、麻酔剤、ミネラル、ビタミン、収斂剤およびコラーゲンからなる群から選択される、１種以上の薬物とを含む組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと、創傷の治癒を促進するのに役立つ、基質細胞とを含む組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと、上首尾のおよび/または改善された創傷治癒にとって有利な、遺伝子生成物を発現する、遺伝子操作された基質細胞とを含む組成物を提供することにある。例えば、糖尿病性糜爛の場合には、線維芽細胞を遺伝子操作にかけて、アテローム性動脈硬化症、閉塞の危険性を減じるための、抗-凝集遺伝子生成物またはインシュリン増殖因子(IGF)を発現し、あるいは治癒失敗の危険性を減じるための、抗炎症性遺伝子生成物を発現することができる。Alila, H.等, Human Gene Ther., 1997, 8:1785-1795; およびPickering, J.G.等, Semin. Interv. Cardiol., 1996, 1:84-88。
【００１２】
本発明によれば、本発明の組成物は、帯電した表面基を有するミクロスフェアを含み、該電荷は負または正であり得る。該ミクロスフェア材料は、ポリスチレン、誘導体化ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、シリコーン、ポリリジン、ポリ-N-メチル-４-ビニルピリジニウムブロミドおよびラテックスからなる群から選択される。本発明の幾つかの態様によれば、該帯電した表面基は、ポリスチレン、誘導体化ポリスチレン、硫酸根、ポリ-N-メチル-４-ビニルピリジニウムブロミド、プロタミン、プロタミン硫酸塩、プロタミン塩、ポリリジンおよびカルボキシルからなる帯電基群から選択される。同様に好ましくは、該ミクロスフェアは、約0.01μ〜約200μ、より好ましくは約1〜100μ、および最も好ましくは約2〜約20μの範囲内にある。本発明のもう一つの態様によれば、該組成物は、また該ミクロスフェア用の製薬上許容される担体をも含む。
【００１３】
本発明によれば、該組成物は、ゲル処方を形成するのに適した製薬上許容される担体を含む。該ゲル処方は、メチルセルロース、アガロース、デキストラン、多糖類、ゼラチン、アロエベラ抽出液(アセマンナン(Acemannan)-β-1,4-結合アセチル化マンナン)またはその他の製薬上許容される賦形剤を含むが、これらに制限されない。
本発明によれば、該組成物は、液状処方物を形成するのに適した、製薬上許容される担体を含み、これらは組織培養培地(例えば、ドルベコの(Dulbeco's)改良イーグル培地)、塩水、またはその他の製薬上許容される賦形剤を含む。
本発明によれば、創傷を治療するための該組成物は、細胞膜と多点接触を形成し得るミクロスフェアと、該ミクロスフェアが実質的に不溶性である、製薬上許容される担体、並びに該組成物を収容する容器を含む。例示すると、該担体は、好ましくは水性媒体、エーロゾル担体、軟膏および包帯からなる群から選択される。
【００１４】
本発明によれば、筋肉の再生を促進するための組成物が提供され、該組成物は、細胞膜と多点接触を形成し得るミクロスフェアと、該ミクロスフェアが実質的に不溶性である、製薬上許容される担体とを含む。
本発明によれば、無菌状態でミクロスフェアを含む組成物を収容し、かつ細胞膜と多点接触を形成し得る容器を提供する。
本発明によれば、ミクロスフェアと１種以上の活性成分とを含む、無菌組成物を収容する容器を提供する。
本発明によれば、ミクロスフェアと１種以上の活性成分とを含む、無菌組成物を収容する容器が提供され、その各々は活性物質の処方物を収容し、これは該創傷に適用する前に、該ミクロスフェアと混合することができ、あるいは該創傷部位に、別々に適用することができる。
【００１５】
【発明を実施するための最良の形態】
本発明並びにその利点をより完全に理解するために、添付図を参照しつつ記載される、以下の説明を参照する。
本発明は、予防並びに治療組成物およびミクロスフェアを使用して、創傷の治癒を促進する方法に関する。予想外のことに、ここに記載する特定のサイズ範囲を持つミクロスフェアは、任意の薬物あるいはその他の治療物質を更に添加し、もしくは含めることなしに、創傷の治癒を促進できる。事実、以下に記載するように、これらミクロスフェアは、その治療効果を発揮するために、分解またはその他の化学的変更を受けない。本発明のミクロスフェアは、また従来の療法、例えば放射線、化学療法、ホルモン療法、レーザー療法、高圧またはオゾン療法に対する、補助的な療法として適用することができる。
【００１６】
5.1 ミクロスフェアの特徴
これらミクロスフェアの構造は、コア材料と、少なくとも一つの型の帯電した表面基とを含む。該表面基は、該ミクロスフェアの少なくとも外部に存在する。その材料の例は、長鎖ポリマー、例えばポリスチレン、ラテックス、ポリ-β-アラニン、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、シリコーンおよび誘導体化ポリスチレンを包含する。表面基の例は、硫酸根、ポリ-N-エチル-４-ビニルピリジニウムブロミド、プロタミン、プロタミン硫酸、プロタミン塩、ポリリジン、カルボキシルおよびポリスチレンを含む。これら表面基は、該コア材料の一部として、あるいは該長鎖ポリマーの誘導体化などの、化学的方法によって後に付加することも可能である。以下において、用語「誘導体化」とは、分子またはその一部を化学的に変更、修飾または変化させる工程を意味するものとする。該ポリマーから製造される該ミクロスフェアは、水性媒体に対して実質的に不溶であるが、代わりにこのような媒体中で懸濁液または分散液を形成する。
【００１７】
本発明のパラメータを更に明確にするために、幾つかの用語を定義すべきである。以下において、用語「創傷」または「病巣」とは、対象身体の任意の部分に対する、任意の損傷を含み、急性状態、例えば熱性熱傷、化学的熱傷、放射線熱傷、過度に紫外線輻射に暴露された場合に生じる熱傷、例えば日焼け、身体組織の損傷、例えば分娩および出産の結果としての会陰部損傷、例えば会陰切開等の医学的手順を持続する際の損傷、外傷-誘発性損傷、例えば切断、自動車およびその他の機械的な事故における持続的な損傷、および弾丸、ナイフおよびその他の武器により起こる損傷、並びに慢性的な状態、例えば圧迫性糜爛、床擦れ、糖尿病お不十分な血液循環に関連する状態、およびあらゆる型のアクネを含むが、これらに制限されない。本発明により処置できる身体の領域は、皮膚、筋肉、神経系組織、骨、軟質組織、血管組織、および内部器官を含むが、これらに制限されない。以下において、「被験者(対象)」とは、本発明を実施する、ヒト、哺乳類または下等動物を意味するものとする。
【００１８】
以下において、用語「促進する」とは、加速および増強を包含する。以下において「瘢痕の軽減」とは、ケロイドおよび肥厚性瘢痕等の、過度の瘢痕形成の予防もしくは軽減、並びに対象の皮膚上などの外的なおよび癒着などの内的な瘢痕組織形成の程度を軽減することを含む。最後に、本発明は、また美容整形的に使用して、皮膚、例えば顔面の皮膚などの切傷またはその他の創傷における、過度の瘢痕形成を防止し、またアクネを治療することができることにも注目すべきである。美容整形的な意味において、「過度の瘢痕の形成」とは、美容整形的に望ましくないまたは許容されない任意の瘢痕を包含する。
【００１９】
以下の議論は、特定の型のミクロスフェアについて言及するが、これにより本発明を何等限定するものではないことに注意すべきである。当業者には、これらミクロスフェアが、より一般的には中実のまたは中空のビーズ、粒子または顆粒であり得ることを理解するであろう。本発明の好ましい態様において、これらミクロスフェアは、該薬物が実質的に不溶性である、製薬上許容される担持媒体中に、例えば水性媒体注の懸濁液として、または吸蔵性または非吸蔵性何れであっても良い、非水性媒体、例えば軟膏、エーロゾルスプレイまたは包帯中に分散される。このミクロスフェアの形状は、規則的な、例えば球状または楕円体形状または規則的な非-球状形態であり得、あるいは該粒子の形状は、その表面が単一の連続な曲線ではなく、あるいは該表面が平滑ではないような、不規則なものであり得る。
更に、該ミクロスフェアは、種々のポリマーの混合物であり得、また異なるサイズを持つ、種々の粒子、ビーズまたは顆粒の混合物であっても良い。これら薬剤は、また異なるサイズの孔を持つことができる。
【００２０】
例を挙げると、該薬物を形成する長鎖ポリマー、例えばポリ-β-アラニンは、架橋して、ミクロスフェアの球状の形状を実現するのに特に好ましいが、このような形状は架橋することなしに得ることができる。架橋されたポリ-β-アラニンからミクロスフェアを製造する方法の一例は、米国特許第5,077,058号に記載されているが、この材料は、更なる誘導体化を行って、該ミクロスフェアに、全体としての表面電荷を付与する必要があることに注意すべきである。
あるいはまた、該粒子は、特に該ポリマーが、架橋されていない場合には、無秩序の不規則形状を持つことができる。該粒子は、任意の形状、例えばコイル、球状、伸長されたコイルおよびランダムコイル等を持つことができる。好ましくは、該ポリマーは、生化学的に反応性であってはならず、また非生分解性であるべきである。最も好ましくは、該ポリマーは、治療期間中実質的に非生分解性であって、該創傷の治癒に必要とされる期間中、分解されずに維持される。以下において、用語「非生分解性」とは、該治療期間中、生分解性を示さない薬物を意味し、該期間とは、該創傷の治療に必要とされる期間である。
【００２１】
少なくとも該薬物は、以下のような特性を持つべきである。
1. これらは、細胞またはその部分、例えば外部細胞膜および該膜上の分子と、多点接触を形成し得るものであるべきである。
2. これらは、著しい化学的な変更または分解を被ることなしに、創傷の治癒を促進できるものであるべきである。
3. これらは、体液などの水性媒体に対して実質的に不溶性であり、代わりに懸濁液を形成すべきである。
これらの特徴は、以下で更に論じる如き理由から重要であり、本発明の薬物の効果は、該薬物の材料と細胞の一部、例えば外部細胞膜との間に多点接触が形成され、結果として該細胞が付着するための接着表面が形成されることと、直接関連するものと思われる。このような多点接触は、帯電した基が、該外部細胞膜の分子および部分との相互作用のために利用できる、多くの異なるポリマーについて可能である。従って、以下の説明は、1種の型の薬物に焦点を置いているが、本発明はこのような多点接触を形成し得る任意の材料をも包含するものであることを理解すべきである。
【００２２】
上記のように、該ミクロスフェアは、好ましくは約0.01μ〜約200μ、より好ましくは約1〜約100μおよび最も好ましくは約2〜約20μなる範囲内の径をもつ。本発明のミクロスフェア組成物は、懸濁液中で、0.001〜25重量%を構成する。如何なるメカニズムにも拘泥するつもりはないが、これらの好ましい範囲は、該創傷領域を浸潤するマクロファージによる、該ミクロスフェアの取り込みが可能な、最良のサイズであることに注意すべきである。少なくとも該マクロファージの一部、恐らく該マクロファージの外部細胞膜の分子との接触を介して、実際に該マクロファージを引き付けかつ活性化するものと考えられる。該ミクロスフェアについて観測される抗炎症性および抗菌性効果は、従って該マクロファージまたはその他の細胞の活性化を介して達成される、間接的な効果であると思われる。
【００２３】
該ミクロスフェアのもう一つの重要な性質は、該表面基の電荷である。ミクロスフェアのある好ましい例の担持する全体としての電荷は、ゼータマスター(ZetaMaster) (英国、マルバーンインスツルメンツ(Malvern Instruments)社)により、電気泳動移動度(mV)に基く、Zまたはζ電位として測定した。ここに例示する幾つかの態様において測定した、Z電位の範囲は、-29.58mV〜-79.76mVであった。以下において、用語「帯電した」とは、少なくとも約1mV、好ましくは少なくとも約10mVなる絶対値によるZ電位を意味するものとする。
テストした懸濁液中の該ミクロスフェアは、凝集、合一または塊状化せず、または不可逆的なケーキ形成を行わなかった。該ミクロスフェアは、時間の経過に伴って、幾分沈降するが、これらは穏やかに攪拌することによって、容易に再懸濁した。
【００２４】
本発明のミクロスフェアは、液状の包帯またはデバイスと類似しており、これは創傷の輪郭にあるいは該創傷内部に適用できる。これらミクロスフェアは、公知の方法により、最適pHにて、かつ種々の濃度にて、アルゴン、ネオンまたは窒素雰囲気下で無菌容器内に充填される。
5.2 薬理的および生物学的薬物
以下に述べる種に属する薬理的試薬の任意の１種またはそれ以上を、未処理のミクロスフェアと共に、本発明の予防または治療用組成物に配合できる：防腐剤、収斂薬、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗癌剤、抗ヒスタミン剤、抗生物質、戦場用途用の血液凝固剤、ビタミンおよびミネラル処方物、ビタミン、ミネラルまたは抗炎症剤。
【００２５】
本発明の治療組成物に配合できる生物学的に活性な物質は、収斂剤、抗生物質、酸化剤、タンパク分解酵素、コラーゲン、架橋阻害剤(例えば、天然または合成ジアミン類-シスタミン、プトレシン、スペルミジン、カダベリン等)、アミノ酸、マクロファージ刺激因子、または麻酔薬を含むが、これらに制限されない。 増殖因子並びに調節因子を該治療組成物に添加して、肉芽組織の形成および再上皮化を補助することにより、該創傷の治癒過程を増強することができる。これら因子は、例えば血小板由来の増殖因子(PDGF)、血小板由来の血管形成因子(PDAF)、血小板由来の表皮増殖因子(PDEGF)、トランスフォーミング増殖因子-β(TGFB)、血小板因子(PF-4)、αおよびβ線維芽細胞増殖因子(αFGFおよびβFGF)、成長ホルモン(GH)、表皮増殖因子(EGF)またはインシュリン増殖因子(IGF)を含むが、これらに制限されない。
【００２６】
血小板由来の増殖因子は、特に肉芽形成および再上皮化段階中の、創傷の治癒に関与する、多段システムを刺激する。トランスフォーミング増殖因子-βは、多くの細胞型の増殖並びに分化を調節する、関連するダイマー型タンパクの、増殖群を意味する(Massague, Ann. Rev. Cell Biol., 1990, 6:597-619)。TGFBも、筋肉細胞および軟骨細胞における、軟骨-特異的巨大分子の生成を誘発する。しかし、TGFBは、鶏胸骨の軟骨細胞による(Horton等, J. Cell Physiol., 1989, 141:8-15)およびラットの軟骨細胞による(Rosen等, J. Cell Physiol., 1988, 134:337-346)コラーゲンタイプIIの合成を阻害することが、分かった。事実、TGFBは、インビボおよびインビトロにおける、最も正常な細胞の基本型阻害剤として出現した(Alexandrow, A.G.等, Cancer Res., 1995, 55:1452-1457)。TGFB1は、ヒトまたはブタの血小板から精製され、また組み換えTGFB1は、一般的に入手できる(Gentry等, Mol. Cell Biol., 1988, 7: 3418-3427)。インシュリン単独では、コラーゲンマトリックス合成を刺激する上で、IGF-Iよりもかなり能力が劣る。IGF-IIは、DNAおよびRNA合成を刺激し、また胎児細胞におけるクローン増殖を刺激する上で、IGF-Iよりも一層強力である(McQuillan等, Boichem. J., 1986, 240:423-430)。表皮増殖因子単独では、軟骨細胞増殖には何の影響も与えない。インシュリンと共に、EGFは、相乗的に軟骨細胞の増殖を刺激する(Osborn, K.D.等, J. Orthop. Res., 1989, 7:35-42)。
【００２７】
高濃度の脂質パーオキシドが、活性化されたマクロファージ、凝集した血小板、および損傷を受けた組織から単離した、細胞下粒子に存在することが明らかにされた。強力な酸化剤、代謝により遊離基となる薬物、およびイオン化輻射は、全てプロスタグランジン、ロイコトリエン(エイコサノイド)および/または脂質パーオキシド(peroxidative)増加を誘発する。これらの増加したエイコサノイドおよび脂質パーオキシドは、組織損傷または壊死のおよびその炎症性反応における増加の1原因であると考えられる。抗炎症性薬物、例えば非-ステロイド系の抗-炎症性薬物(イブプロフェン、インドメタシン、アスピリン、アセトアミノフェン、ナプロキセン、スリンダック)および具体的にはシクロオキシゲナーゼ-2 (COX2)阻害剤の、該予防および/または治療用組成物への配合は、あらゆる損傷を受けた組織、例えば肺、肝臓、線維症が、長期の反復的な傷害の結果である、放射線-誘発性損傷において有用であることが、立証される可能性がある。更に、酸化防止剤(例えば、ビタミンE)および遊離基捕獲剤(例えば、還元されたグルタチオン)の配合も、有用であるものと立証される可能性がある。
【００２８】
亜鉛：外傷、外科手術またはその他の損傷を受けた後に、血液および組織中の亜鉛の量が、低濃度まで減少する可能性があることが、立証されている。これは、特に火傷を負った患者において顕著である。血液および組織におけるこの痕跡量元素が、正常なレベルに回復するのに十分な、亜鉛の投与は、上皮化速度、創傷強度の獲得速度、およびコラーゲンおよびその他のタンパクの合成速度を増大する。多数の酵素が、亜鉛-依存性の、DNA-ポリメラーゼおよび逆転写酵素である。創傷の治癒に及ぼす亜鉛枯渇の効果は、これら酵素の機能の程度が低下した際に予想されるものである。上皮および線維芽細胞の増殖は起こらない。というのは、これら細胞の有糸分裂は、DNA-ポリメラーゼおよび逆転写酵素無しには起こり得ないからである。従って、これら細胞は、正常に移動できるが、これらは増殖しない。従って、十分な上皮化は起こらず、該創傷への僅かな線維芽細胞の移動による、コラーゲンの合成は、該創傷を一緒に維持するのに必要な線維を供給することができない。このような場合には、血液および組織中の亜鉛濃度を、正常値にまで高めることにより、創傷治癒のための正常な増殖が回復されるであろう。血液および組織中の亜鉛濃度が低い患者において、該治療組成物中の亜鉛を、経口的に、腸管外に、あるいは局所的に投与して、正常な創傷の治癒を回復することは、本発明の目的である。亜鉛は、塩化亜鉛、炭酸亜鉛および/または亜鉛グルコネートから選択される塩として与えられる。
【００２９】
ビタミン A および E：ビタミンAは、創傷の治癒における、遅延された肉芽組織の生育および低下された量のコラーゲンを、部分的に逆転できる。局所的に適用されたビタミンAは、コルチコステロイドの投与により遅延された、創傷における上皮化を増強するが、コラーゲンの堆積は、全身的なビタミンAの投与によってのみ影響される。
ビタミンEは、瘢痕形成を改善するために利用できる。というのは、その副作用は、匹敵する量のステロイドホルモンの副作用よりも小さいからである。高い投与量において、ビタミンEは、創傷の治癒およびコラーゲンの生産を遅延するが、この作用は、ビタミンAの存在下では克服される。従って、必要に応じて、被験者に、本発明の予防および/または治療用組成物として、経口的に、腸管外にあるいは局所的に、ビタミンAおよびEを与えることは、本発明のもう一つの目的である。
【００３０】
5.3 遺伝子療法
本発明の予防および/または治療用組成物は、インビボで、遺伝子および遺伝子生成物を導入して、該創傷の治癒を促進するための賦形剤を提供する。例えば、糖尿病性糜爛に対して、該治療組成物は、本発明のミクロスフェアおよび遺伝的に操作された基質細胞(例えば、該対象から採取されたルーズな連結組織中に見出される、他の細胞および/またはエレメントを含む、または含まない線維芽細胞; その例は内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、血漿細胞、マスト細胞、脂肪細胞等を含むが、これらに制限されない)を含み、該基質細胞は、スロモエンボリジム(thromoembolisim)の危険性を減じるために、抗凝結遺伝子生成物を発現し、もしくは炎症性反応による失敗の危険性を減じるために、抗炎症性遺伝子生成物を発現するように、遺伝子操作される。一旦、遺伝子操作された細胞が、該創傷部位に適用されると、該抗炎症性遺伝子生成物、例えば腫瘍壊死因子(TNF)、インターロイキン-2(IL-2)または他の炎症性サイトカインに対する、中和抗体のイディオタイプに相当するペプチドまたはポリペプチドの存在は、種々の疾患と関連する炎症性反応の改善をもたらすことができる。該疾患の例は、火傷を受けた組織、外科手術に伴う感染、糖尿病性ニューロパシー的潰瘍、圧迫性潰瘍、静脈うっ血性潰瘍、火傷を受けた組織、外科手術に伴う感染、外科的創傷破壊、内部潰瘍、出血、骨壊疽、圧迫性糜爛、床擦れ、折衷的切断部位、治療不能な外傷性創傷、美容整形、髭剃り後、歯科治療、慢性潰瘍(糖尿病性の、結節状構造を持つ静脈の、病後の)、放射線による組織破壊、脊髄損傷による創傷、婦人科学的創傷、化学的創傷、血管疾患性創傷、糖尿病性皮膚糜爛、糖尿病性足、物理的外傷、形成外科手術後の縫合部位、日焼けまたは会陰切開を含むが、これらに制限されない。
【００３１】
好ましくは、該細胞は、創傷治癒の初期段階に、このような遺伝子生成物を、一時的におよび/または誘導可能なコントロールの下で発現し、あるいは該基質細胞に係留されたキメラ融合タンパクとして発現するように操作され、該キメラ融合タンパクは、例えばレセプタまたはレセプタ-様分子の、細胞内および/または貫膜ドメインで構成され、かつ細胞外ドメインとして該遺伝子生成物と融合したキメラ分子である。もう一つの態様においては、該基質細胞は、患者にとって欠乏しており、または治療作用を及ぼすであろう、例えばHDL、アポリポタンパクE等に対する遺伝子を発現するように、遺伝子操作することができた。該基質細胞内で操作された関連する遺伝子は、治療すべき疾患と関連するものである必要がある。
【００３２】
該基質細胞は、宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするのに使用した遺伝子を含む、組み換えDNA構築物を使用して、遺伝子操作することができ、該宿主細胞はクローニングされ、次いで培養系において、クローン的に増殖される。該活性遺伝子生成物を発現する培養物は、該生成物の欠乏する個体に移植することができた。例えば、血管の種々の型の症状を予防または改善する遺伝子を、疾患状態の下で、不十分に発現させ、もしくはダウンレグレーションすることができる。具体的には、以下のような病理的状態の予防に関与する遺伝子の発現は、ダウンレグレーションすることができ、該病理的状態は、例えば血栓形成、炎症反応、および弁の線維症および石灰化を含む。かくして、遺伝子活性のレベルは、存在する遺伝子生成物の濃度を増すか、あるいは三次元ミクロスフェア培養系に存在する、該活性遺伝子生成物の濃度を高めることによって増すことができる。
【００３３】
更に、創傷治癒の該線維組織形成段階中に、患者を遺伝子置換療法によって治療することができる。基質細胞を、個々の患者の要件を満たすように、特別に設計することができ、例えば該基質細胞は、１以上の遺伝子を調節するように遺伝子操作することができ、あるいは遺伝子発現の調節を、一時的なもの、または長期に及ぶものとすることができ、もしくは該遺伝子活性を誘導不能なもの、または誘導可能なものとすることができる。例えば、正常なターゲット遺伝子またはターゲット遺伝子機能を持つ、正常なターゲット遺伝子タンパク生成物を生産する、該遺伝子の一部を、ヒト細胞中に挿入でき、該ヒト細胞は、これら三次元構築物を、誘導不能なベクターまたは誘導可能なプロモータの何れかを使用して、存在させる。該ベクターは、アデノウイルス、アデノ-関連ウイルス、およびレトロウイルスベクターを含むが、これらに制限されず、また該プロモータは、DNAを細胞中に導入する他の粒子、例えばリポソームまたは直接DNA注入または金粒子以外にも、メタロチオネイン、または熱ショックタンパクを含む。
【００３４】
遺伝子療法における、該治療組成物での該基質細胞の使用は、幾つかの利点を持つ。まず、該培養物は真核細胞を含むので、該遺伝子生成物は、適正に発現され、また培養物中で処理されて、活性生成物を形成する。第二に、遺伝子療法技術は、トランスフェクションされた細胞数が、実質的に臨床的価値、適性および利用性を達成するまで高められた場合にのみ、有用であり、本発明の三次元培養物は、トランスフェクションされた細胞数を増大させ、かつ該細胞の増殖(細胞分割を介する)を可能とする。
【００３５】
遺伝子操作により該基質細胞に導入された、遺伝子生成物の本質的なまたは一時的な発現を達成するために、種々の方法を利用できる。例えば、Seldon, R.F.等, Science, 1987, 236:714-718によって記載された、トランスカリオティック(transkaryotic)移植技術を利用できる。ここで使用する用語「トランスカリオティック(transkaryotic)」とは、該移植細胞の核が、安定なまたは一時的なトランスフェクションにより、DNA配列の付加によって変更されていることを示唆する。これら細胞は、種々のベクターの何れかを使用して、操作でき、該ベクターは、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、またはアデノ-関連ウイルスベクター、または非-組込み複製(non-integrating replicating)ベクター、例えばパピロマウイルスベクター、SV40ベクター、アデノウイルスベクター、または複製欠失ウイルスベクターを含むが、これらに制限されない。一時的な発現が好ましい場合には、非-組込みベクターおよび複製欠失ベクターが好ましい。というのは、これら系において、誘導可能なまたは本質的なプロモータを使用して、対象とする遺伝子の発現を制御することができるからである。あるいはまた、組込みベクターを使用して、一時的な発現を達成し得るが、この対象とする遺伝子は、誘導可能なプロモータにより制御される。
【００３６】
任意のプロモータを使用して、該挿入遺伝子を発現させることができる。例えば、ウイルスプロモータは、CMVプロモータ/エンハンサー、SV40、パピローマウイルス、エプシュタイン-バールウイルス、エラスチン遺伝子プロモータおよびb-グロブリンを含むが、これらに制限されない。一時的な発現が望ましい場合には、このような構成的プロモータを、非-組込みおよび/または複製-欠失ベクターにおいて使用することが好ましい。あるいはまた、誘導可能なプロモータを使用して、必要な場合に、該挿入遺伝子を発現させることが可能であった。例えば、誘導可能なプロモータは、メタロチオネインおよび/または熱ショックタンパクを含むが、これらに制限されない。
【００３７】
既に記載され、使用できる連結組織に対して特異性を示す、転写調節領域は、膵臓の房状細胞中で活性な、エラスチンまたはエラスターゼI遺伝子調節領域(Swit等, Cell, 1984, 38:639-646; Ornitz等, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology, 7:425-515)を含むが、これらに制限されない。該エラスチンの堆積は、血管の移植片を含む、種々の組織における特定の生理的および発生的事象と相関している。例えば、動脈の発達において、エラスチンの堆積は、動脈圧力および機械的な活性における変化と整合している。機械的な活性とエラスチン発現とを結び付けている、形質導入メカニズムには、細胞表面レセプタが関与している。一旦、細胞表面レセプタを介して、エラスチン合成細胞が、エラスチンに付着すると、付随的なエラスチンおよび他のマトリックスタンパクの合成は、該組織中の応力または機械的な力(例えば、該生体反応器における、該構築体の一定した移動)または細胞の形状に影響を与える他の因子に暴露することによって影響される可能性がある。
【００３８】
本発明の該ミクロスフェア培養システムで使用する該基質細胞は、遺伝子操作により、該移植部位における詰まりまたは拒絶を促進する、因子または表面抗原の発現を「阻止する(knock out)」ことができる。ターゲット遺伝子の発現レベルまたはターゲット遺伝子生成物の活性レベルを低下させるための、負の調節技術は、以下に論ずる。ここで使用する「負の調節」とは、この調節処理のない場合における、ターゲット遺伝子生成物のレベルおよび/または活性に対する、該ターゲット遺伝子生成物のレベルおよび/または活性における減少を意味する。基質細胞に対して負の遺伝子の発現を、多くの技術を利用して低下させ、または阻止することができる。例えば、相同組み換え技術を利用して、該遺伝子を完全に不活性化する(一般的には、「阻止(knockout)する」と言う)ことにより、発現を阻害することができる。通常、該タンパクの重要な領域をコードするエキソン(または該当する領域に対するエキソン51)は、正の選別可能なマーカー(例えば、neo)により遮断され、該ターゲット遺伝子から正常なmRNAの製造を阻止し、かつ該遺伝子の不活性化をもたらす。遺伝子は、また遺伝子の一部に欠失を生成することにより、あるいは該遺伝子全体を除去することによっても、不活性化することができる。該ゲノムから遠く離れた、該ターゲット遺伝子と相同の2つの領域を持つ構築体を使用することによって、これら2つの領域間に入った配列を、除去することができる。Mombaerts, P.等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1991, 88:3084-3087。
【００３９】
該ターゲット遺伝子の発現を阻害する、アンチセンスおよびリボザイム分子も、ターゲット遺伝子の活性レベルを減じるために、本発明に従って使用することができる。例えば、主要な組織適合性遺伝子複合体(HLA)の発現を阻害する、アンチセンスRNA分子は、免疫応答に対して最も多才であることが示された。更に、三重螺旋分子を、ターゲット遺伝子活性のレベルを低下するのに利用できる。これらの技術は、L.G. Davis等編, 分子生物学における基本的方法(Basic Methods in Molecular Biology), 第２版, Appleton & Lange, Norwalk, Conn. 1994。
もう一つの代替法において、該基質細胞を、例えば細胞分割サイクル2キナーゼの発現の、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド遮断により、平滑筋細胞の転移に必要な遺伝子発現を遮断するように、遺伝的に操作し、結果として新生血管内膜増殖し、移動し、かつその増殖の進展に導くことができる。Mann, M.J.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92:4502-4506。
【００４０】
遺伝子療法における、該基質細胞培養物の利用は、多くの利点を有している。まず、該培養物は、真核細胞を含むので、その遺伝子生成物は、適切に発現され、かつ培養物中で処理されて、活性生成物を形成する。第二に、遺伝子療法の技術は、トランスフェクションされた細胞数が、実質的に臨床的価値、適性および利用性を達成するまで高められた場合にのみ、有用であり、本発明の基質細胞培養物は、トランスフェクションされた細胞数を増大させ、かつ該細胞の増殖(細胞分割を介する)を可能とする。例えば、創傷の治癒因子を発現する、遺伝的に操作された細胞は、損傷部位における創傷治癒を増強する、腱および間膜を形成するのに利用される、生きた基質培養物に配合することができる。
【００４１】
既に記載されており、利用することのできる組織特異性を示す、転写調節領域の例は、膵臓の房状細胞中で活性な、エラスターゼI遺伝子調節領域(Swit等, Cell, 1984, 38:639-646; Ornitz等, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology, 7:425-515); 膵臓のβ細胞中で活性なインシュリン遺伝子調節領域(Hanahan, Nature, 1985, 315:115-122); リンパ系細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域(Grosschedl等, Cell, 1984, 38:647-658; Adams等, Nature, 1985, 318:533-538; Alexander等, Mol. Cell Biol., 1987, 7:1436-1444); および骨格筋において活性なミオシン軽鎖-2遺伝子調節領域(Shani, Nature, 1985, 314:283-286)を含むが、これらに制限されない。
【００４２】
5.4 創傷 / 病巣
(A) 糖尿病性足：米国における全ての非外傷性切断の50-70%が、糖尿病にかかっている(ナショナルダイアベーツボードの報告(A Report of the National Diabetes Board): NIH パブリケーション, 81-2284, 1980, p.25)。糖尿病における足の破壊は、幾分かの血管の損傷を含むまたはこれを含まない、通常神経疾患と感染との組合わせによるものである。足の爪の内方成長または潰瘍が見られ、また苦痛の感覚がないことから、未治療のまま放置された場合には、該感染は足全体に広がり、損傷を受けていない血管が供給するよりも多量の血液供給を必要とする、重度の感染を引き起こす。結果として生ずる壊疽は、切断を必要とする可能性がある。医師は、しばしば、糖尿病患者における栄養障害性潰瘍が、感覚なしに起きると言う、印象を得ている。糖尿病患者は、崩壊が生じた場合に初めて驚嘆する。問題は、全体的な感覚の喪失に気付く前に、足が長期に渡り損傷を受け易いことである。本発明の治療組成物は、この破壊を防止し、かつ糖尿病に関連する該潰瘍を治療するように工夫されている。
【００４３】
(B) 圧迫性潰瘍：圧迫性潰瘍は、特に運動性に限界のある老齢の患者にとって、重大な健康管理上の問題となりつつある。老人医学における患者の死の危険性は、圧迫性潰瘍が発生した場合には、4倍にも増加し、また潰瘍が治癒しない場合には、6倍にも増大する。圧迫性潰瘍の発症は、患者の介護に携わる全ての者にとって、誤診に陥り易い原因の一つとして認識されている。法廷は、このような創傷の発生に至らしめたまたはそのような創傷を発生したままとした、健康管理提供者に対して、ほんの僅かな同情をも示さなかった。West v. Van-Care, Inc. (事件No. CV-91-617)において、アラバマ州陪審員は、老年の女性が、被告ナーシングホームに滞在中に、10インチの壊疽性の圧迫性潰瘍を発生した際に、6500万ドルの支払いを命ずる評決を下した。従って、糜爛形成を防止するための、良好なデバイス(例えば、マットレス)の使用ばかりでなく、良好なスキンケアをもたらし、かつ圧迫性潰瘍の治癒を促進するのに使用できる、治療組成物の使用をも必要とする。
【００４４】
(C) 一般並びに形成外科およびその他の治療法：外科(以下に列挙する器官および組織の外科療法を含むが、これらに限定されない: 皮膚、胸部、胸部壁、胸膜、肺および縦隔膜、心疾患、大血管の疾患、末梢動脈疾患、胃腸管の疾患、胃(腹部)、結腸、直腸および肛門、虫垂、肝臓、胆嚢および肝外胆管系、膵臓、脾臓、腹膜炎および腹内感染、腹部壁、大網、隔膜、および後腹膜腔(retroperitenium)、腹部壁ヘルニア、下垂体および副腎、小児外科、甲状腺および傍甲状腺、泌尿器科学、婦人科学、神経外科、整形外科、切断術、手、形成並びに再構成外科、腫瘍外科、頭部外科、整形外科、筋骨格、尿生殖器系、瘢痕除去、小児科、胃腸管)、内部創傷、形成外科、婦人外科、瘢痕除去、レーザー治療、レントゲン輻射、放射線輻射、オゾン治療、または温熱療法が、宿主防御を開始させる創傷をもたらす、幾つかの手順である。感染に対する宿主の防御は、局所的または全身的、非特異的または特異的、および体液性または細胞性何れであっても良い。種々の正常な機能が働いて、身体のバクテリアによる負荷を減じ、かつ該治癒過程を促進する。本発明の予防並びに治療組成物は、潜在的な侵襲的病原体の処理に関与している、自然の免疫学的な現象、例えば解剖学的な障壁、ベースライン細胞性食作用、食細胞による消化またはエフェクターメカニズムの組み合わされた防御作用を促進し、かつ増強するのに使用できる。
【００４５】
(D) 火傷：火傷は極めて一般的な傷害であり、年間少なくとも200万人が、重度の火傷を被り、医学的な手当てを必要とするものと見積もられている。1度、2度、3度および4度の火傷と言う、古典的な説明は、皮膚解剖学に関連する、傷害の深度に基く、解剖学的なものである。1度の火傷は、上皮の基底層には至っていない。本質において、該上皮は、侵されていない。これらの傷害は、典型的には日焼けによって代表され、また本質的には恐らく保湿剤による手当てを除けば、殆ど手当てを必要としない。2度の火傷は、該上皮の基底層下部から、全表皮に及ぶが、該表皮を完全に侵すことはない。該皮膚の付属器を覆う上皮細胞は、生存状態にあり、かつ該創傷の表面を覆うべく移動する。3度の火傷は、完全に皮膚の下部を侵し、脂肪にまで広がっている。4度の火傷は、筋肉および骨にまで及び、専門の火傷センターでの治療を要する。本発明の治療用組成物は、火傷を負った患者、吸入傷害、上部気道火傷、下部気道火傷または肺の火傷を被った患者における創傷の治癒を促進し、また関連する合併症を処置するのに適している。
【００４６】
【実施例】
以下本発明を、ミクロスフェアを使用して例示する。該ミクロスフェアは、一般的に創傷の治癒を促進し、並びに筋肉の再生を促進するのに利用できる。創傷の治癒および筋肉の再生両者は、損傷を受けた組織の修復および失われた組織の置換を含む。特定の型の細胞の移動並びに増殖が、秩序だった、また体系付けられた様式で起こりる必要があり、固形腫瘍などの悪性組織の、抑制のない成長とは容易に識別できる。特に、創傷の治癒および筋肉の修復に関与する細胞は、まず活性化されて、該治癒過程において必要とされる役割を果たす必要がある。その正確なメカニズムは、知られていないが、創傷の治癒において起こる増殖の秩序だった体系的な細胞成長は、明らかに高度に組織化された調節過程の存在を立証している。
以下に与えられる実施例によって明らかにされるように、本発明のミクロスフェアは、この複雑で組織化された、かつ体系的な過程を妨害しないものと思われる。というのは、これらミクロスフェアは、単に該全体としての治癒過程のペースを速め、該過程の特定の段階を明らかに速めるからである。しかし、予想外のことに、本発明のミクロスフェアは、該細胞に、連続的な、制限のない代謝の活性化状態を起こさせず、このことは正常な調節過程が影響を受けないことを示している。従って、本発明のミクロスフェアは、無制限の細胞活性化を起こさない。
【００４７】
本発明を特定のメカニズムに限定することなしに、負に帯電した基を持つミクロスフェアの添加は、細胞が付着し、かつ被覆するための付随的な表面として機能することによって、創傷の治癒に、治療効果を及ぼすものと考えられる。本発明のミクロスフェアの有効性に関する一つの説明は、該負に帯電した基が、該ミクロスフェアの固体表面と、該細胞膜との間の、多重結合の形成を可能とすることにあり、これは該ミクロスフェアの材料と、該細胞膜との間の多点接触を表す。これら結合の形成は、最終的には細胞の活性化に導く、膜リガンドの分布及び状態における変化、細胞骨格の再構成、細胞内シグナル導入およびその他の生化学的な変化を生ずる。従って、細胞の活性化は、細胞の増殖、増殖因子の生産、および該細胞外マトリックスに係わるコラーゲンおよびその他の成分の製造に導く。本発明は、如何なる特定のメカニズムにも頼る必要がないことに注目すべきである。というのは、以下において明らかにされるように、これらミクロスフェアは、明らかにインビボでの創傷の治療および治癒にとって有利な効果を有しているからである。
【００４８】
多数の様々な型のミクロスフェアを、以下の実施例においてテストした。これらミクロスフェアは、カルボキシルまたはアミノ表面基をもつ、または付随的な表面基をもたないポリスチレンで製造された。該ミクロスフェアの径は、約0.1〜約20μの範囲内にあった。幾つかのミクロスフェアのζ電位をもテストし、該球状体のサイズおよび表面基の型が、明らかに各ミクロスフェアにより担持される全電荷量に及ぼす効果を持つことを明らかにした。これは、該ミクロスフェアの、創傷治癒促進能力に及ぼす重要な効果であった。
幾つかの特定の型をもつミクロスフェアを例示してきたが、以下のような特徴が満足される場合には、多くの他の関連する型のミクロスフェアも、使用可能であるものと理解すべきである。
【００４９】
1. これらは、細胞または該細胞の一部と多点接触を形成できるものである必要がある。
2. その作用のメカニズムは、化学的な変更または分解を必要としない。
3. これらは、体液等の水性媒体に実質的に不溶であり、かつ代わりに懸濁液を生成する必要がある。
その他の好ましい寄与は、以下に列挙するものを包含する。まず、該ミクロスフェアは、好ましくは該治療期間中、非-生分解性の材料、特に好ましくはポリスチレンから製造すべきである。第二に、該ミクロスフェアは、好ましくは実質的な電荷、より好ましくは全体として負の電荷をもつべきである。該ミクロスフェアのサイズは、余り重要ではないが、好ましくは該ミクロスフェアは、約0.1〜約20μなる範囲の径をもつべきである。好ましくは、該ミクロスフェアを、カルボキシル表面基で誘導体化すべきであるが、その他の負の帯電した基を使用することも可能である。従って、これら型のミクロスフェアは、例示の目的でのみ与えられたものであり、本発明を何等制限することを意味するものではない。本発明によるミクロスフェアの原理及び操作は、実施例、添付図面および添付された説明を参照することによってより一層十分に理解される。
【００５０】
実施例 1 ：クレアチンホスホキナーゼに及ぼすミクロスフェアの効果
明らかに、本発明のミクロスフェアは、図1に示したように、培養した筋原細胞のクレアチンホスホキナーゼ(CPK)の活性における初期増加を誘発した。しかし、8日後には、該未処理および処理細胞両者共に、同一のレベルのCPK活性を持つことが明らかとなり、このことは本発明のミクロスフェアによる、高いCPK活性の誘導が、一時的なものであることを示している。実験方法は、以下の通りであった。
【００５１】
ラット胚骨格筋の一次培養物を、フレッシュニー(Freshney)によって記載されたように調製した(R.J.フレッシュニー(Freshney), 動物細胞の培養(Culture of Animal Cells), ウイリー社, 1986, p.117, 170-172)。簡単に説明すると、筋肉を、皮膚および骨を含まないように切り分け、加温トリプシン処理(0.25%トリプシン、36.5℃)によって15脱分離処理(desegregated)した。細胞を、5% CO2を含むインキュベータ中で、37℃にて1時間予備平板培養することにより、線維芽細胞による汚染を低下させた。これは、線維芽細胞が、まず組織培養プレートに付着するからである。次いで、筋原細胞を、抗生物質で富化した培地(ドルベコ(Dulbecco)改良培地: 培地199、1:4なる比) 2ml、10%(v/v)ウマ血清および4%(v/v)の鶏胚抽出物と共に、濃度5,000細胞/mlにて、35mmのペトリ皿に播種した。該鶏胚抽出物は、R.J.フレッシュニー(Freshney), 動物細胞の培養(Culture of Animal Cells), 1986に記載の方法に従って、10日齢の鶏胚から調製した。該抗生物質は、アンホテリシンおよびゲンタマイシンを含み、これらは標準的な初期濃度2.5mg/mlから、希釈率1:1000にて調製した。24時間後に、該培地をデカンテーションにより捨て、20%(v/v)の子馬血清および1%(v/v)の鶏胚抽出物を含む新たな培地で置換した。
【００５２】
次いで、この培養した細胞を、培地中で4-8日間、ミクロスフェアで(平板培養時点において開始)処理するか、あるいは培地のみで処理した。該ミクロスフェアは、径1、2または4.5μのカルボキシル化ポリスチレンまたは径4.5μのポリスチレンのみの何れかであった。該ミクロスフェアの濃度は、培地1ml当たり106または107であり、これら両濃度において類似する結果が得られた(データは記載せず)。処理の4、5、6、7または8日後に、クレアチンホスホキナーゼ活性を、標準的なアッセイ(「クレアチンキナーゼ(Creatine Kinase)」, ワーシングトンエンザイムマニュアル(Worthington Enzyme Manual), ワーシングトンバイオケミカル社(Worthington Biochemical Corporation), , N.J., USA, 1972, pp.54-55)によって測定した。結果を図1に示したが、その単位はCPK活性/mg全細胞タンパクで表した。
【００５３】
明らかに、図１は、コントロール細胞と比較して、本発明のミクロスフェアが、クレアチンホスホキナーゼ活性の初期増加を誘発する能力を持つことを、立証している。処置の４日後に、ミクロスフェア処理した細胞は、コントロール細胞と比較して、CPK活性の初期増加を示している。この増加は、処置の5日目または6日目において、特に顕著である。しかし、7日目には、コントロール細胞中のCPK活性は、ミクロスフェア処理した細胞の活性と同等なレベルに達し始めた。8日目までに、コントロールおよびミクロスフェア処理した細胞両者は、同様なレベルの活性を示す。明らかに、ミクロスフェアは、筋原細胞におけるCPK活性の初期増加を促進し、処理の8日後には、該活性は安定化する。このような高いCPK活性は、筋原細胞の生化学的な成熟と相関をもつものである。従って、本発明のミクロスフェアは、該培養筋原細胞の生化学的な成熟を促進した。
【００５４】
実施例 2 ：細胞増殖および融合に及ぼす、ミクロスフェアの効果
本発明のミクロスフェアは、以下に示すように、コントロール(未処理)細胞と比較して、細胞増殖および筋原細胞の融合両者において、初期増加を誘発することが明らかにされた。
ラット筋原細胞の一次培養物を、上記実施例1と同様に調製したが、該細胞は、カバースリップ上で生育させた。処理した細胞を、以下において更に説明するように、培地中でミクロスフェアと共にインキュベートし、一方でコントロール細胞には培地のみを与えた。細胞増殖の程度を決定するために、細胞を、エタノール/酢酸(3:1)中で固定し、次いでヘマトキシリン-エオシンによって染色した。次に、該染色した細胞を、光学顕微鏡による観察下で計数した。有糸分裂指数を、1000細胞当たりの、計数された有糸分裂中の細胞の割合として計算した。
【００５５】
細胞増殖実験のために、スルフェート表面基を有するポリスチレンを使用した。これは、径0.18μおよび107ミクロスフェア/ml培地なる濃度を有していた。コントロール細胞と比較して、ミクロスフェアによる24時間の処理後、有糸分裂指数における20倍の増加が観測された。具体的には、コントロール細胞の有糸分裂指数は、1.25+0.7%であり、一方ミクロスフェアで処理した細胞の該指数は、24.6+1.0%であった。かくして、ミクロスフェアは、明らかに筋原細胞の有糸分裂指数における大きな増加をもたらした。
筋原細胞の融合に及ぼす、ミクロスフェアの効果も検討した。その結果を表1に与える。一般的に、ミクロスフェアで処理した細胞は、コントロールと比較して、約150%の融合速度を示した。しかし、この効果の程度は、ミクロスフェアの型および処理の長さに依存するものであった。
【００５６】
テストしたミクロスフェアの型を、表１に与える。該ミクロスフェアの径は、「径」の欄にμ単位で与えられている。該ポリマービーズ上の表面基は、「表面基」の欄に与えられている。これ以上の如何なる誘導体化もなされていないポリスチレンビーズは、「ポリスチレン」である。カルボキシルまたはアミノ表面基で誘導体化されたビーズは、夫々「カルボキシル」および「アミノ」として記載されている。ビーズの濃度は、「濃度」として、ビーズ数/ml培地単位で与えられている。
筋原細胞の増殖速度を測定するために、上記のようにして、細胞を調製し、固定し、かつ染色した。「初期細胞」の欄に、細胞数/ml培地として表1に与えられている密度にて、細胞をまず平板培養した。「処理後の日数」なる欄に与えられている、所定の処理後の日数が経過した後に、筋原細胞融合の測定を行った。
【００５７】
融合の程度は、顕微鏡的視野内の全核数に関連する、多核細胞またはミオインプラスト(myoimplasts)内の核の割合として計算し、ミクロスフェア処理細胞については、「融合の割合」として、またコントロールの未処理細胞については、「コントロール融合」として与えられている。少なくとも400個の核が、各実験条件に対して計数された。ミクロスフェア処理細胞およびコントロールの未処理細胞における、細胞融合の程度の比は、「相対的効果」として与えられている。表1の特定の位置に、何の数値も与えられていない場合は、その値が上の行の値と同一であることを示す。
【００５８】
【表１】
表1：ミクロスフェアの、筋原細胞融合に及ぼす効果
【００５９】
表１から理解されるように、種々の型のミクロスフェア全てが、筋原細胞の増殖を促進したが、該効果の程度は、該ミクロスフェアの径、該ミクロスフェアの表面基、処理後の日数および該ミクロスフェアの濃度に依存していた。筋肉組織が、胚の形成中に形成された場合には、筋原細胞の融合が起こり、またこの融合は、筋肉の再生および損傷を受けた筋肉組織の修復における、極めて重要な段階でもある。従って、ミクロスフェアの、このような融合を促進する能力は、明らかにこれらミクロスフェアの電位が、以下の実施例5において立証されるように、筋肉の再生を促進することを示している。
【００６０】
実施例 3 ：ミクロスフェアの、コラーゲン合成および堆積に及ぼす効果
背景技術の章で上記したように、コラーゲンの合成および堆積は、創傷治癒の過程における重要な段階である。更に、該創傷に堆積されるコラーゲンの量は、創傷強度の重要な決定因子である。従って、本発明のミクロスフェアは、前のおよび以下に記載する実施例において立証されるように、種々の型の細胞に様々な効果を及ぼすが、明らかに組成物の、創傷を治癒する能力の重要な決定因子は、コラーゲン合成および堆積に及ぼすその効果である。
図2Aおよび2Bに示したように、本発明のミクロスフェアは、明らかに、培養された線維芽細胞による、コラーゲン合成を促進する。最大の効果は、タイプIおよびタイプIIミクロスフェアについてみられる。タイプIミクロスフェアは、径4.5μを有し、カルボキシル化ポリスチレンから製造され、かつ約-29.96 mVというZ電位を有していた。タイプIIミクロスフェアは、径0.49μを有し、ポリスチレンのみから製造され、かつ約-34.5 mVというZ電位を有していた。タイプIIIミクロスフェアは、径1.0μを有し、カルボキシル化ポリスチレンから製造され、かつ約-53.34 mVというZ電位を有していた。その実験法は、以下の通りであった。
【００６１】
包皮線維芽細胞培養物を、4.5 mg/mlのグルコースを含み、10%(v/v)の子牛血清、2mMのL-グルタミン、50μg/mlのゲンタマイシン硫酸および2.5 mg/mlのアンホテリシンBを補充した、ドルベコの改良イーグル培地(DMEM)で満たされた、75cm2のプラスチックフラスコ(NY、コーニングのコーニングガラスワークス(Corning Glass Works)社)中で生育させた。この培養物を、37℃にて、5% CO2中で、密集するまでインキュベートした。線維芽細胞を、0.25%トリプシン/0.05% EDTA溶液を用いて収穫し、24-ウエルプレートにて、同一の培地を使用し、200,000細胞/ウエルなる密度にて、24時間継代培養した。この時点で、該処理細胞を、タイプI、IIまたはIIIミクロスフェアと共にインキュベートした。コントロール細胞は、培地のみと共にインキュベートした。
コラーゲン合成は、以下のようにして測定した。該培養した線維芽細胞を、0.5%の透析した子牛血清を補充したDMEM中で24時間予備的にインキュベートした。B-アミノプロピオニトリルフマレート(BAPN)を、最終的な濃度100μMにて含有する、3 uCi 2,3-3H-プロリンまたは3,4-3H-プロリン溶液で、図示されているように、10μMのアスコルビン酸の存在下(図2A)またはその不在下(図2B)にて、細胞を標識した。アスコルビン酸は、線維芽細胞中でのコラーゲン合成を促進し、かつ重要な刺激因子である。
【００６２】
24時間のインキュベーションの後、この反応を停止させ、コラーゲンを各ウエルから、ペプシン(最終濃度0.5mg/ml)を含有する、30μIの冷酢酸(0.5M)の添加によって抽出し、次いで室温にて4時間穏やかに攪拌した。遠心分離の後、細胞の破片を捨て、0.5M酢酸中にコラーゲンを溶解した溶液80μlを、各上澄に添加し、最終的コラーゲン濃度を約200mg/mlとした。0.5M酢酸中に5.2MのNaClを溶解した溶液0.4mlを添加することによって、各上澄からコラーゲンを沈殿させた。2時間放置した後、沈殿したコラーゲンを、15,000 rpmにて、15分間遠心分離処理することにより分離した。次に、得られたペレットを、1MのNaClを含む、pH 7.4の10mMトリス(TRIS)バッファー750μl中に再懸濁した。コラーゲンを、5MのNaClを含む、pH 7.4のトリスバッファー750μlの添加により沈殿させた。2時間後に、該コラーゲンを遠心分離によって分離し、0.5M酢酸溶液に再溶解し、かつ各サンプルをシンチレーションカウンターで測定した。結果を、ウエル当たりのcpmで、図2Aおよび2Bに示す。提示されたデータは、4つのサンプルに関する平均である。
【００６３】
タイプIおよびIIミクロスフェア両者は、アスコルビン酸の存在下(図2A)および不在下(図2B)何れにおいても、コントロール(未処理)線維芽細胞に見られたレベル以上に、コラーゲン合成を刺激できた。タイプIミクロスフェアは、アスコルビン酸の存在下において、タイプIIミクロスフェアに比して高い効果を有していたが、両タイプ共に、アスコルビン酸の不在下では、同様な効果を示した。タイプIIIミクロスフェアは、アスコルビン酸の存在下および不在下両者において、コラーゲン合成に及ぼす検出可能な効果を示さなかった。
特に興味深い発見の一つは、タイプIおよびIIミクロスフェア両者が、効果を示し、一方タイプIIIミクロスフェアは、その効果を示さなかったことにあり、この事実は、該ミクロスフェアの特定のサイズおよび材料が重要であることを意味している。更に、タイプIおよびIIミクロスフェア両者は、アスコルビン酸の不在下においても効果を示し、このことは、これら2つの型のミクロスフェアが、他の刺激因子の不在下においてさえ、コラーゲン合成を促進することを示す。従って、タイプIおよびIIミクロスフェア両者が、コラーゲン合成に対する実質的な刺激作用を持つことは、明白である。
【００６４】
実施例 4 ：ミクロスフェアの、筋原細胞の形状に及ぼす効果
ラット筋原細胞の一次細胞培養物を、上記実施例1に記載のようにして調製した。次に、細胞を、ポリスチレンミクロスフェアと共に(処理細胞)またはその不在下で(コントロール細胞)、48時間インキュベートした。次いで、細胞を、燐酸緩衝塩水(PBS)中の1%グルタルアルデヒドで、1-4日間固定し、かつPBSですすいだ。次に、細胞をPBS中の、1%タンニン酸および1%グアニジン塩酸(1：1比)の溶液に、1時間移した。検体を、1% OSO4中で1時間後-固定し、室温にて、段階的に変動する比率のエタノールおよびフロン(Freon) 113中で脱水した。次いで、検体をスライドに載せ、金で被覆し、2kVにて、JEOL T-300走査型電子顕微鏡で観察した。
図3A〜3Cは、筋原細胞の形状に及ぼす、本発明のミクロスフェアの効果を示す。図3Aの細胞は、該ミクロスフェア上で成長させたものであり、従ってその細胞表面の一部は、平坦と言うよりも、寧ろ凸状である。図3Bおよび3Cは、該ミクロスフェアが存在する、細胞の一部から、偽足が延びている細胞を示す。図3Cに示す細胞の該偽足は、特に顕著であり、これは該ミクロスフェアが明らかに筋原細胞の形状に影響していることを示す。更に、偽足の形成並びに広がりは、明らかに細胞骨格構造における変化を必要とし、このことは、該ミクロスフェアが、該細胞の細胞骨格にも影響することを立証している。このような偽足の形成は、細胞が該創傷領域に移動するために重要であると思われる。従って、該ミクロスフェアによるこのような偽足の刺激は、該創傷治癒過程におけるもう一つの重要な段階を促進する、その能力を示している。
【００６５】
実施例5：組成物および使用法
以下の説明は、創傷治癒のために、本発明の薬物を使用するための一般的なデバイスおよび方法に関する。該薬物、例えばミクロスフェアを、好ましくは治療すべき創傷に繰り返し適用する。その適用頻度およびその適用濃度は、症状の重度、および治療すべき対象の応答性に依存する。当業者は、容易に最適な濃度、投与方法および反復速度を決定することができる。本研究において、該ミクロスフェアは、ほぼ1日に一回、治療すべき創傷に適用されるが、勿論その他の適用頻度も可能である。
この方法は、該薬物、例えばミクロスフェアが実質的に不溶である、製薬上許容される担体中の該薬物を、治療すべき対象に投与する工程を含む。製薬上許容される担体の例は、薬物懸濁用の水性媒体、非水性媒体、例えば軟膏、クリームおよびエーロゾル-形成材料、並びに該薬物を含む媒体で浸されたあるいは該媒体を含む包帯を包含する。該包帯は、吸蔵性または非吸蔵性何れであっても良い。何れにしろ、製薬上許容される担体中に存在する該薬物は、薬物の分散液として記載できる。
【００６６】
該薬物は、効果的な投与法に従って、好ましくは予め定められた終点に至るまで、例えば該対象における臨床的な症状がなくなるまで、投与する。治療すべき創傷の閉塞が、このような終点の一例である。
本発明のデバイスは、一種以上の薬物と、該薬物用の製薬上許容される担体とを含む組成物と、該組成物を収容するための容器とを含む。適当な容器の例は、エーロゾル分配ポンプ、およびスプレイ缶を含む。当業者は、該組成物用の適当な容器を、容易に選択することができる。使用した特定のデバイスとは無関係に、ミクロスフェアなどの該薬物は、好ましくは２段階の手順で適用される。該ミクロスフェアをまず、浸漬、噴霧、塗布、洗浄または任意の他の適当な局所投与法により、該創傷に分散液として適用する。好ましくは、第二段階を開始する前に、30秒〜2分間の間隔を置いて、該創傷と該ミクロスフェアとの最初の接触を保証する。好ましくは、該第二段階は、吸蔵性または非吸蔵性の包帯、または該ミクロスフェアを含有する液状懸濁液に浸した他の適当なカバー材を、該創傷に適用することを含む。これは、該包帯またはカバー材による、該ミクロスフェアの吸収を実質的に減じまたは排除する。この方法は、以下の実施例に記載するように、創傷の治癒のために、ラットおよびヒト両者に使用した。
該懸濁液中の該ミクロスフェアは、凝集、融合、塊状化または不可逆的なケーキの形成を生じない。該ミクロスフェアは、時間の経過に伴って、幾分沈降するが、これらは穏やかな攪拌によって、容易に再懸濁する。
【００６７】
実施例 6 ：ミクロスフェアによる、ラット中の創傷治癒の促進
実施例1-4において上記したように、本発明のミクロスフェアは、創傷の治癒にとって重要な、種々のインビトロ細胞過程を促進する。しかし、インビトロおよびインビボ作用は、常に相関関係を持つ訳ではない。
従って、インビボ実験を行って、該ミクロスフェアが、ラットにおいて創傷治癒を促進する能力を、評価した。図4A-4Dに示すように、本発明のミクロスフェアは、明らかにラットにおける創傷治癒を促進する。図5は、該創傷面積が減少する速度のグラフであり、該グラフは、本発明のミクロスフェアが、このような減少を引き起こす速度を高めることを示している。最後に、表2は、本発明のミクロスフェアが、ラットにおける筋肉再生を促進することを示している。実験方法は、以下の通りであった。
【００６８】
体重300および400gの雄ウイスター(Wistar)ラットを、ネムブタール(5 mg/kg体重)によって麻酔をかけた。ケイ骨前方筋肉の側面部に、切除による傷を以下のようにして形成した。皮膚に長手方向の切開を行って、該ケイ骨前方筋肉を露出させた。次いで、該筋肉幅の約半分に渡り、筋肉線維の横方向の切断により、この筋肉の一部切除を行った。次に、この切除片を、該筋肉から切り取り、該筋肉に約5mm×5mmの溝を残した。全てのラットにおいて、同一の量の切除組織(80±10mg)を、該筋肉の同一の位置から取り去った。次に、該創傷領域を、処理ラットについては、塩水に分散した2μのポリスチレンミクロスフェアで手当てし、またコントロールラットについては、塩水のみで手当てした。この創傷の面積を、該傷の形成後、3〜15日間に渡って測定した。
図4A〜4Dは、上記のようにして調製した創傷領域の写真を示す。図4Aは、傷の形成直後の、コントロールラットの該創傷を示し、一方図4Bは、治療すべきラットの等価な創傷を示す。図4Cおよび4Dは、該傷形成の5日後の、同一のラットを示す。該コントロールラットの創傷は、塩水のみで処理したが、まだ完全には治癒していなかった。これとは対照的に、ミクロスフェアで治療した、該処理ラットの創傷は、完全に治癒していた。従って、本発明のミクロスフェアは、明らかに創傷の治癒をより迅速に促進する。
【００６９】
更に、図5は、本発明のミクロスフェアによる、創傷治癒の促進を示す。該コントロールラットの創傷は最終的には治癒したが、治療したラットの創傷よりも、著しく遅い治癒速度であった。従って、本発明のミクロスフェアは、明らかに該創傷領域が減少し、かつ該創傷が治癒する速度を増大する。
該創傷領域の生検パンチを作成することによって、組織学的分析用のスライドを調製した。傷の形成後4、5、6、7、8、9、13または14日目に、ラットを殺し、組織学的検査のために、生検を行った。該新たに形成されたまたは修復された筋肉線維に組み込まれた、特殊化された筋原細胞の数を、活性化された筋原細胞を表す、「新たな」核の数を測定することにより、計数した。これら細胞の核は、分散されたクロマチンを含む、大きな好塩基性核であり、既存の筋原細胞の核から容易に分化できる。結果を表2に与える。
【００７０】
【表２】
表2：ミクロスフェアによる、筋肉再生の促進
【００７１】
表2に示したように、本発明のミクロスフェアは、筋肉線維中の「新たな」またはそこに組み込まれた核の数によって測定されたように、明らかに筋肉の再生を促進した。インビボで処置されたラットから採取した組織学的サンプルについて、このような測定がなされたと言う事実は、また該ミクロスフェアが、インビボ並びにインビトロでの筋肉の再生を促進することを示している。最後に、図6は、組織培養培地および塩水を使用した、ラット内での、創傷の治癒に対する本発明のミクロスフェアの効果を比較したものである。上記のように、創傷は、ラット内で誘発され、かつ該ラットは塩水のみ (図6A)、組織培養培地のみ(図6B、x)、塩水＋ミクロスフェア(図6A)、または組織培養培地＋ミクロスフェア(図6B)で処理されていた。次いで、創傷を形成した後4日目に、写真撮影した。図6Aおよび6Bから理解されるように、該ミクロスフェアは、担体が塩水または、組織培養培地の何れであるかとは無関係に、より一層迅速な創傷治癒速度を誘発できた。かくして、組織培養培地は、本発明のミクロスフェアの、創傷の治癒に及ぼす効果の如何なる部分の原因でもなかった。
【００７２】
実施例 7 ：ミクロスフェアの毒性に関する研究
ミクロスフェアを含有する処方物の有害な効果は、何等観測されなかった。傷害を受けた後の、65および180日目の処理ラットの予備的な検査は、以下に列挙する器官の何れも、病理的な変化の徴候を示さないことを、明らかにした：心臓、肝臓、肺臓、腎臓、血管、胃、リンパ節および脳。
蛍光標識したミクロスフェアを用いた実験は、処理ラットには何の病理的な徴候も観測されないことを示した。更に、該ミクロスフェアは、上に列挙した器官の何れにも侵入しなかった。上に列挙した器官の何れにも新たな成長は観測されなかった。最後に、該ミクロスフェアは、該創傷領域に分散されたが、再生中の筋肉線維には侵入しなかった。
【００７３】
実施例 8 ：ヒトにおける創傷治癒に及ぼす、ミクロスフェアの効果
上記実施例6に記載したインビボ実験は、本発明のミクロスフェアが、ラットにおける創傷の治癒および筋肉の再生を促進することを立証している。更に、実施例7に記載した、ラットにおける毒性に関する研究結果は、該ミクロスフェアが、実質的に無毒であることを示す。従って、本発明のミクロスフェアがヒトの創傷治癒に及ぼす効果を決定するために、研究を行った。以下に詳しく説明するように、症例の研究は、該ミクロスフェアが、明らかにヒトにおける創傷の治癒を促進することを明らかにした。第一の症例研究は、左足に治癒できなかった潰瘍をもつ、66歳の婦人についてのものであった。この患者は、また左足のフレグモーネおよび両足に結節状構造の静脈を有していた。この患者の内側大腿上の潰瘍は、腐食性の塩素塩であるミルトン(Milton) 2%の水溶液で治療した。この患者の外側大腿上の潰瘍を、ポリスチレンから製造した、4.5μの本発明のミクロスフェアを、組織培養培地に分散した液で治療した。図7Aは、0日目のコントロール創傷を示し、一方図7Bは、治療開始後4ヶ月目の該コントロール創傷を示す。図7Cは、0日目の該治療した創傷を示し、一方図7Dは、治療開始後4ヶ月目の該治療された創傷を示す。本発明のミクロスフェアで治療した創傷およびミルトンで治療した創傷両者は、感染の徴候、およびその後の4ヶ月間の、その他の治癒の困難さを示した。しかし、この治療期間の終了時点において、ミクロスフェアで治療した創傷は、かなりの改善を示した。即ち、該創傷のサイズが減少し、該創傷は清浄で、感染の徴候は見られなかった。従って、感染などの合併症のために、治癒の困難な創傷についてさえも、本発明のミクロスフェアは、従来利用可能であった治療よりも、創傷の治癒促進において、高い有効性を示した。
【００７４】
更なる証拠として、上記図7のコントロールとしての該創傷(図7Aおよび7B)を、図7Cおよび7Dにおける創傷を治療するのに使用したものと同一のミクロスフェアで治療した。その結果を、図8Aおよび8Bに示す。図8Aは、ミクロスフェアで治療を開始した、0日目の創傷を示し、一方図8Bは、治療開始後21日目の該創傷を示す。明らかに、該創傷の程度は、このような短期間後においてさえ減少した。更に、該創傷は、表面的なものであり、清浄であり、かつ最早滲出物を形成しなかった。
第二の症例研究は、左大腿の前部に、一年にも及ぶ感染した創傷をもつ、52歳の女性に関する研究であった。この創傷を、1週間1%ミルトンで治療し、鮮創し、次いで10日間、図7および8における創傷を治療するのに使用したものと同一のミクロスフェアで治療した。図9Aは、治療0日目のこの創傷を示し、一方図9Bは、治療開始後10日の該創傷を示す。
【００７５】
10日後、該創傷は、大幅な改善を示した。該創傷は、図9Bから理解されるように、その程度において小さなサイズに減少し、清浄であり、かつ最早滲出物を生成しなかった。この創傷は、比較的短い治療期間では、完全には閉じられなかったが、その治癒効果は有意に改善された。
第三の症例研究は、工業的な作業所の事故における、化学薬品の溢れによる傷害を受けた、19歳の男性に関するものであった。問題となった化学薬品、サルフライド(sulfurides)は、重度の火傷を引き起こし、彼の首および右手の右側に、水疱を形成した。初めの2日間は、全ての創傷を、強い吸収性をもつヒドロゲルである、シルベロール(Silverol)で治療した。次に、右前腕上の創傷を、症例研究1および2のミクロスフェアで治療し、一方残りの創傷を、シルベロールで治療した。結果を、図10Aおよび10B(夫々0日目および5日目のコントロール創傷)、および図10Cおよび10D(夫々0日目および5日目の治療した創傷)に示す。
【００７６】
ミクロスフェアで治療を開始した後の５日目に、前腕の該治療した創傷の状態は、ミクロスフェアで治療されなかった、残りの創傷の状態と比較して、大幅に改善された。この前腕の創傷は、ミクロスフェアで治療を開始した5日後に、完全に治癒した。これとは対照的に、シルベロールで治療した該残りの創傷は、完全には治癒しなかった。従って、該ミクロスフェアは、明らかに創傷の治癒を促進した。このことは、従来の利用可能な治療法よりも、本発明の方法が著しく有効であることを立証している。
第四の症例研究は、熱浴による臀部の持続的な第2度の火傷を負った52歳の婦人に関するものであった。左臀部の創傷を、シルベロールで治療し、一方右臀部の創傷を、前の症例研究のミクロスフェアで治療した。結果を、ミクロスフェアで治療した創傷のみについて、図11A(治療の0日目)および図11B(治療の7日目)に示す。
【００７７】
治療開始の７日目に、ミクロスフェアで治療した、右臀部における創傷は、良好な表皮の成長を伴って、完全に治癒した。これに対して、シルベロールで治療した、左臀部の創傷は、完全には治癒せず、比較的緩慢に、閉じられた。従って、本発明のミクロスフェアは、従来の治療法よりも、より一層速い速度で、創傷の治癒を促進した。
第五の症例研究は、広範囲に及ぶ重度の日焼け(データは提示せず)を負った、28歳の女性に関するものであった。彼女を、前の症例研究のミクロスフェアで治療した。この患者は、不快感における大幅な軽減および該日焼けの迅速な治癒両者を報告した。かくして、本発明の方法およびデバイスで使用した、該ミクロスフェアは、不快感を緩和し、かつ創傷の治癒を促進できるが、この不快感の緩和は、直接的な無痛法と言うよりも寧ろ、該ミクロスフェアの高度な間接的効果によるものと思われることに、注目すべきである。
【００７８】
事実、上記患者の報告が、日焼けからの不快感における見掛けの低下を含むものと推定できるに過ぎないことは、述べておく価値がある。このような低い不快感は、恐らく神経刺激の伝達に対して直接的な効果を及ぼす、該ミクロスフェアの能力を立証しておらず、あるいは実際に不快な感覚に導く多くの因子の何れかを直接変更する、該ミクロスフェアの能力を立証していない。その代わりに、この効果は、恐らくかなり間接的なものであり、マクロファージの活性化の結果として起こるものと考えられ、更に抗-炎症性作用を有し、該患者による不快感の減少に導いたものと考えられる。
ラットに関する研究から得られた広範囲に渡る証拠と組み合わせた、これら５例の病歴から、本発明による薬物、例えばミクロスフェアの使用は、明らかに、これまでに利用可能な、従来の治療よりも、創傷治癒の促進および筋肉再生に対して、高い有効性をもつことが示された。本発明の方法並びにデバイスは、被験者により経験されたように、創傷の治癒並びに不快感の軽減を、促進し、加速し、かつ増強する。
【００７９】
この軽減された不快感に関連して、上記症例研究における患者、特に日焼けにかかった患者は、苦痛および治療した創傷からの不快感の局部的な軽減をも報告しており、これは恐らく該ミクロスフェアの抗-炎症作用(間接的な)を介する、該ミクロスフェアの間接的な効果によるものと考えられる、ことに注目すべきである。
最後に、データを提示しないが、シュードモナス(Pseudomonas)種による、該創傷の感染に対する、間接的な静菌作用も、ヒトにおいて認められた。この間接的な抗-炎症作用および該間接的な静菌作用両者に関するメカニズムは、明らかではないが、恐らくマクロファージの引き付けと活性化を含む、細胞的な作用の結果であると考えられる。その正確なメカニズムとは無関係に、本発明によるミクロスフェアの使用は、明らかに、創傷の治療において、有意な改善を示す。
【００８０】
実施例 9 ：放射線照射後かつ化学療法前の、創傷の治癒に及ぼすミクロスフェアの効果
本発明のミクロスフェアは、放射線療法を伴う、乳房根治切除術を受けた、患者における初期増加を誘発する。
段階IIの疾患をもつ、54歳の乳癌患者は、外科手術を受け、次いで放射線療法を受けた。この患者は、壊死性の病巣に侵され(図12A)、かつその進行性の広がりを防止するために、壊死性の創傷の閉塞が達成されるまで、1クールの化学療法を受けないように助言された。この患者を、54日間に渡り、1日当たり2度、ミクロスフェアで治療した。ミクロスフェアによる治療の21日後に、この患者の創傷は、改善され、該創傷が閉塞されるまで、化学療法が開始された(図12B-12D)。この患者は、1クールの化学療法を受けることができた。現在は、疾患から開放されている。かくして、本発明の組成物は、放射線療法および化学療法との組合わせとしての、創傷の治療において有用であった。
【００８１】
実施例 10 ：薬剤および生物学的製剤の存在下での、ミクロスフェア組成物
以下の実施例においては、該薬剤および/または生物学的製剤は、薬理的担体に可溶性であるが、該ミクロスフェアは不溶であり、かつミクロスフェアは、該治療組成物において懸濁状態に維持される。
a) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該組成物に抗生物質を添加して、感染を予防し、該抗生物質は、例えば約1-100mg/mlのネオマイシン硫酸、約100-1000単位/mlのバシトラシン、約10-100mg/mlのオキシテトラサイクリンHCl、または約1-10mg/mlのグラマシジンである。
b) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該組成物にタンパク分解酵素を添加して、病原的な創傷の酵素的な鮮創をもたらす。必要な場合には、例えば約10-100単位/mlのコラーゲナーゼまたはエラスターゼ、約10-100単位/mlのストレプトキナーゼまたは約10-100単位/mlのストレプトドルナーゼを添加する。
c) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該組成物に収斂薬を添加して、緊急用のまたは戦場用の治療組成物を得る。該収斂薬は、例えば約75-250mg/mlの明礬、約100-1000mg/mlのハマメリス葉(witch hazel)、約1-10%のポビドン-ヨウ素(povidine iodine)、酸素ベースとしての10-100mg/mlのオゾン、または10-100mg/mlの過酸化水素である。
d) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該組成物にジアミンを添加して、コラーゲンの架橋を防止する。該ジアミンは、例えば約1-50mg/mlのプトレシン、約1-100mg/mlのスペルミジン、または約1-150mg/mlのカダベリンである。
e) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該水性組成物に増殖因子を添加して、自然の治癒過程を増強し、かつ増殖を刺激する。該増殖因子は、例えば約10-100単位/mlのPGDF、PDAF、PDEGEまたはPF-4、約10-100単位/mlのFGF、約10-100単位/mlのEGF、約10-100単位/mlのTGF、または約10-100単位/mlのIGFである。
f) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該組成物に免疫増強剤を添加して、該創傷の治癒を刺激する。該免疫増強剤の例は、例えば約10-100mg/mlのL-アルギニン、約5-50mg/mlの一酸化窒素、約50-500mg/mlのクアドロール(quadrol)、約50-500mg/mlのムラミルジペプチド、約10-100mg/mlのマクロファージ活性化因子、または約1-10mg/mlのヒアルロン酸である。
【００８２】
g) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該組成物に金属イオンを添加する。該金属イオンの例は、例えば約1-10mg/mlの塩化亜鉛、約1-10mg/mlの亜鉛グルコネート、1-100mg/mlのマグネシウムグルコネート、約1-10mg/mlの銅塩またはペプチドである。
h) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該組成物にビタミンを添加する。該ビタミンの例は、例えば約100-10単位/mlのビタミンA、約50-500mg/mlのビタミンC、または約50-500mg/mlのビタミンEである。
i) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、緊急時または戦場で遭遇する外傷性創傷の治療のために、該組成物に鎮痛薬を添加する。該鎮痛薬の例は、例えば約5-50mg/mlのモルヒネ硫酸塩、約1-10mg/mlのクエン酸フェンタミル、または5-50mg/mlのリドカイン塩酸塩である。
j) 治療用組成物は、上記第5.1章記載したように、ミクロスフェアから製造される。該組成物は、放射線療法、レーザー療法、高圧療法またはオゾン療法との組合わせで投与される。
【００８３】
本発明の範囲は、本発明の個々の局面を単に説明するために記載した、上記の特定の態様により何等制限されず、機能的に等価な方法並びに成分は、本発明の範囲内に入る。実際に、本明細書に示されかつ記載されたものに加えて、本発明の種々の改良が、上記説明および添付図面から、当業者には明らかとなろう。このような改良は、本発明の範囲に入るものとする。
また、上記の特許請求の範囲は、ここに記載した本発明の上位のおよび具体的な特徴全ておよび用語上の問題として包含されると考えられる、本発明の範囲全ての記述を網羅するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のミクロスフェアの、クレアチニンホスホキナーゼ活性を高める能力を示すグラフである。
【図２】 本発明のミクロスフェアの、コラーゲン合成に及ぼす効果を示す、プロットである。
【図３】 図３A〜３Cは、本発明のミクロスフェアの、筋原細胞の形状に及ぼす効果を示す図である。
【図４】 図４A〜４Dは、本発明のミクロスフェアの、ラットにおける創傷の治癒を促進する能力を示すものである。
【図５】 図4の創傷領域が減少する速度を示す、グラフである。
【図６】 図６Aおよび６Bは、本発明のミクロスフェアの、ラットにおいて、組織培養培地および塩水と共に使用した場合の、創傷の治癒に及ぼす効果を比較したものである。
【図７】 図７A-７Dは、本発明のミクロスフェアの、第一のヒト症例研究における、創傷の治癒の促進に及ぼす能力を立証するものである。
【図８】 図８Aおよび８Bは、図７Aおよび７Dのヒト症例研究における、本発明の有効性を更に立証するものである。
【図９】 図９Aおよび９Bは、第二のヒト症例研究における、本発明の有効性を立証するものである。
【図１０】 図10A〜10Dは、第三のヒト症例研究における、本発明の有効性を示すものである。
【図１１】 図11Aおよび11Bは、第四のヒト症例研究における、本発明の有効性を示すものである。
【図１２】 図12A〜12Dは、放射線療法および化学療法との組合わせで実施した場合の、対象における本発明の効果を説明するものである。
【技術分野】
本特許出願は、1997年6月4日付けの特許出願第08/868,950号の、一部継続出願に係わる。
本発明は、創傷および/または病巣に適用するための、ミクロスフェアを含む組成物、および該組成物を単独でまたは他の薬物との組合わせで、創傷または病巣の予防および治療において使用する方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
創傷の治癒は、細胞、細胞外マトリックス成分、および細胞の微小環境等の因子を包含する複雑な過程である。本質的に、全ての創傷の治癒は、損傷を受けた組織の修復および置換を含み、該損傷組織は、皮膚、筋肉、神経系組織、骨、軟質組織、内部器官または血管組織を含むが、これらに制限されない。このような修復および置換の正確な特徴は、関与する該組織に依存するが、全てのこのような過程は、幾つかの基本的な原理を含んでいる。創傷治癒の重要な局面は、創傷が引張り強さを獲得する速度である。
皮膚は、張力および伸長性を示す。皮膚の張力は、創傷に対する応答に関与する決定的な因子の一つであり、また年齢および部位によって変化する。皮膚は、多層を有し、ケラチン、表皮および真皮を含み、また細胞、コラーゲンおよびエラスチンで構成される繊維状網目構造およびアモルファス礎質を含み、該礎質は、タンパク、多糖類、糖タンパク、球状タンパク、塩および水からなる。多くの軽度の傷害におけるように、表皮のみが損傷を受けた場合には、ケラチノサイトが、該創傷の端部から移動し、終にはこれを覆ってしまい、該表皮およびケラチンを再生する(Knighton, D.R.等, Invest. Radiol., 1991, 26: 604-611)。
【０００３】
全ての皮膚層が損傷を受けもしくは破壊された場合には、肉芽組織と呼ばれる新たな連結組織が、まず該創傷空間を満たす必要がある。この組織は、細胞外マトリックス成分、例えばコラーゲンの堆積により、即ち該創傷空間に移動する線維芽細胞によって形成される。このコラーゲンの合成並びに付着は、創傷治癒においても重要であり、またコラーゲンの合成速度は、種々の器官によって異なっている(Haukipuro, K.等, Ann. Surg., 1991, 213:75-80)。
創傷治癒の完全な多段工程が、首尾良い創傷治癒のために完結される必要がある。これら成分の一種以上が失われた場合には、治癒は起こらず、該皮膚は修復されず、該創傷は開放されたままである。このような開放状態にある創傷は、た易く感染される危険性があり、治癒過程が更に遅れ、該皮膚上での潰瘍および糜爛の形成に導く。この創傷の治癒過程は、更に多くの患者において、他の複雑な状態の存在によって、阻害される。該状態は、糖尿病または老齢を含むが、これらに制限されない。このような状態におちいった患者は、しばしば潰瘍化し、かつなかなか治癒しない、あるいは長期間の経過後に、徐々に治癒するに過ぎない、皮膚の創傷をもつ。
【０００４】
種々の治療法を利用して、創傷の治癒する速度を加速し(米国特許第4,772,591号; 同第4,590,212号)、また種々の製薬担体、例えばクリーム、ゲル、粉末およびミクロスフェアを使用して、該創傷に化学療法剤を放出している。米国特許第5,264,207号は、ポリマーのミクロスフェアを開示しており、これは1種以上の活性薬剤または化粧料物質用の担体として作用する。このポリマーミクロスフェアは、中実または中空であり、また該担体液体に不溶性であり、しかも1000nm (1μm)を越えない、変動する寸法を有し、その好ましいサイズは、50〜500nm (0.05〜0.5μm)、および最も好ましくは60〜300nm (0.06〜0.3μm)なる範囲内にある。該ミクロスフェアの細末度は、単位重量当たりの高い比表面積および皮膚の孔を遮断する従来の賦形剤の諸欠点を示すことのない、活性物質とミクロスフェアとの高度の組合わせに導く。かくして、米国特許第5,264,207号発明によれば、該ミクロスフェアの懸濁液を得ることができ、その上に活性物質が吸着され、別の物質が化学結合によって該ミクロスフェアに結合し、第三の物質が、静電的またはイオン結合により該ミクロスフェアと結合する可能性を有する(第2欄、第58-63行)。該ミクロスフェアが中空である場合、これらは、官能性基に対する吸着剤および/または担体両者として機能する(第3欄、第18-21行)。該ミクロスフェアが孔を含む場合、薬理学的または化粧学的物質との結合は、該孔への吸着からなる(第3欄、第26-28行)。このように、米国特許第5,264,207号は、薬理学的および/または化粧学的物質に対してのみ担体として機能する、ミクロスフェアの組成物を開示しており、該ミクロスフェアのみを、それ自体創傷の治癒を増強するのに使用することを、教示も示唆もしていない。
【０００５】
同様に、PCT出願WO96/13164およびWO94/13333両者は、幾つかの治療物質の生成または放出を触媒する材料で作成されたミクロスフェアを開示している。PCT出願WO96/13164は、損傷を受けた組織に、直接適用した場合に、一酸化窒素を放出する、ポリマー-一酸化窒素付加生成物を開示している。PCT出願WO94/13333は、化学的に修飾して、該創傷環境における、遊離基活性を持たせた、粒子を開示している。従って、これら何れの参考文献も、該ミクロスフェア材料を化学的に修飾することなしに、該ミクロスフェア自体を、治療用物質として使用することを、教示も示唆もしていない。
【０００６】
該ミクロスフェアのサイズは、細胞毒性Tリンパ球の活性化において使用する、クラスIアロ抗原用の担体としての、ミクロスフェアの効果に影響を与えることが示された(Mescher, M.F., J. Immunol., 1992, 149:2402-2405)。その応答は、4μmまたは5μm (4000nmまたは5000μm)なる径に相当するミクロスフェアの最適サイズに対して示される、該クラスI抗原に依存した。換言すれば、Mescherは、インビトロでのTリンパ球の活性化が、ミクロスフェアのみでは達成されず、該活性化を誘発するためには、このクラスI抗原が必要であることを開示している。この抗原は、径4または5μmをもつミクロスフェアと結合した際に、即ちBommelser, J.等に付与された米国特許第5,264,207号で使用されたミクロスフェアよりも、4〜5倍大きなサイズをもつミクロスフェアと結合した場合に、最適に反応した。このMescherの特許は、該活性成分、クラスI抗原の使用なしに、ミクロスフェアのみを、創傷治癒の活性化において使用することを、何等教示も示唆もしていない。事実、創傷治癒及びコラーゲン合成における、ミクロスフェア及び細胞毒性Tリンパ球の役割は、Mescherにより教示も示唆も全くなされていない。更に、Bommelserは、1000nmまたは1μmを越えるサイズのミクロスフェアの使用を教示していない。というのは、大きなミクロスフェアは、皮膚の孔を遮断してしまうからである。従って、本発明は、(従来技術の組成物の成分において異なっていることから)該従来技術に固有のものでも、また(使用するミクロスフェアのサイズは、従来技術からは、皮膚の孔を遮断するものと予想されるから)従来技術から自明のものでもない。
【０００７】
創傷の治癒過程は、迅速な細胞の代謝及び増殖を促進する、初期増殖段階、デブリの除去、線維芽細胞の動員および循環の再生を含む。該創傷が最も感染に対して敏感なのは、この期間中である。創傷治癒のこの後の段階(線維組織形成段階とも呼ばれる)において、引張り強さの増加と共に、該創傷におけるコラーゲン含有率の上昇が起こる。従って、該増殖段階を促進し、かつその場で該線維組織形成段階を調節することのできる、非-生分解性のミクロスフェアおよびその他の細胞外成分を含む、創傷治癒用組成物の開発に対する需要が残されている。 従って、種々の状態に対して、動物およびヒトにおける創傷治癒中に、該増殖段階の促進と、該線維組織形成段階の開始との間には、ある釣り合いが存在するはずである。該状態とは、火傷した組織、外科手術後の感染、外科的創傷の破壊、内部の潰瘍、出血、骨壊疽、圧迫性糜爛、床擦れ、折衷的切断部位、治療不能な外傷性創傷、美容整形、髭剃り後、歯科治療、慢性潰瘍(糖尿病性の、結節状構造を持つ静脈の、病後の)、放射線による組織破壊、脊髄損傷による創傷、婦人科学的創傷、化学的創傷、血管疾患性創傷、糖尿病性皮膚糜爛、糖尿病性足、物理的外傷、形成外科手術後の縫合部位、日焼けまたは会陰切開を含むが、これらに制限されない。
【０００８】
【発明の開示】
従って、本発明の目的の一つは、創傷の形成を防止し、あるいは創傷の治癒を促進し、かつ創傷または病巣内におよびその輪郭に適用した場合に、該創傷/病巣を手当てする機能をもち得る、予防的または治療的組成物を製造することにある。
本発明のもう一つの目的は、筋肉、皮膚、軟骨、神経系組織、軟質組織または血管組織の再生を促進するように作用する、創傷の手当て剤として機能できる、組成物を提供することにある。
更に別の本発明の目的は、湿潤時点には接着性である、創傷/病巣被覆として機能でき、かつ潜在的に有害な接着剤を使用することなしに、該創傷/病巣と接触状態に置くことができる、組成物を提供することにある。
本発明の更なる目的は、ミクロスフェア用の媒体および薬剤用の薬物放出系として機能できる、組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、筋原細胞の融合を促進するように機能する組成物を提供することにある。
【０００９】
もう一つの本発明の目的は、インビトロおよびインビボにて、コラーゲンの合成を促進するように機能する、組成物を提供することにある。
更に別の本発明の目的は、瘢痕形成を防止する、組成物を提供することにある。
もう一つの本発明の目的は、ミクロスフェアと、これに添加された、創傷の治癒を促進するように機能する、外因性の増殖因子とを含む、組成物を提供することにある。
更に別の本発明の目的は、ミクロスフェアと抗炎症剤とを含む組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと抗ヒスタミン剤とを含む組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと抗生物質とを含む組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアとビタミンとを含む組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアとミネラルとを含む組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと、抗癌剤、抗ウイルス剤および抗-真菌剤とを含む組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと、活性物質とを含む、または活性物質を含まない、組成物を提供することにあり、ここで該活性物質は、外科手術、放射線療法、ホルモン療法または化学療法に対する補助療法剤として適用されるものである。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと、鎮痛剤、麻酔薬または収斂薬を含む、組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと、コラーゲンとを含む組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと、抗炎症剤、抗-ヒスタミン剤、抗生物質、防腐剤、抗-真菌剤、鎮痛剤、麻酔剤、ミネラル、ビタミン、収斂剤およびコラーゲンからなる群から選択される、１種以上の薬物とを含む組成物を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと、創傷の治癒を促進するのに役立つ、基質細胞とを含む組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の更に別の目的は、ミクロスフェアと、上首尾のおよび/または改善された創傷治癒にとって有利な、遺伝子生成物を発現する、遺伝子操作された基質細胞とを含む組成物を提供することにある。例えば、糖尿病性糜爛の場合には、線維芽細胞を遺伝子操作にかけて、アテローム性動脈硬化症、閉塞の危険性を減じるための、抗-凝集遺伝子生成物またはインシュリン増殖因子(IGF)を発現し、あるいは治癒失敗の危険性を減じるための、抗炎症性遺伝子生成物を発現することができる。Alila, H.等, Human Gene Ther., 1997, 8:1785-1795; およびPickering, J.G.等, Semin. Interv. Cardiol., 1996, 1:84-88。
【００１２】
本発明によれば、本発明の組成物は、帯電した表面基を有するミクロスフェアを含み、該電荷は負または正であり得る。該ミクロスフェア材料は、ポリスチレン、誘導体化ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、シリコーン、ポリリジン、ポリ-N-メチル-４-ビニルピリジニウムブロミドおよびラテックスからなる群から選択される。本発明の幾つかの態様によれば、該帯電した表面基は、ポリスチレン、誘導体化ポリスチレン、硫酸根、ポリ-N-メチル-４-ビニルピリジニウムブロミド、プロタミン、プロタミン硫酸塩、プロタミン塩、ポリリジンおよびカルボキシルからなる帯電基群から選択される。同様に好ましくは、該ミクロスフェアは、約0.01μ〜約200μ、より好ましくは約1〜100μ、および最も好ましくは約2〜約20μの範囲内にある。本発明のもう一つの態様によれば、該組成物は、また該ミクロスフェア用の製薬上許容される担体をも含む。
【００１３】
本発明によれば、該組成物は、ゲル処方を形成するのに適した製薬上許容される担体を含む。該ゲル処方は、メチルセルロース、アガロース、デキストラン、多糖類、ゼラチン、アロエベラ抽出液(アセマンナン(Acemannan)-β-1,4-結合アセチル化マンナン)またはその他の製薬上許容される賦形剤を含むが、これらに制限されない。
本発明によれば、該組成物は、液状処方物を形成するのに適した、製薬上許容される担体を含み、これらは組織培養培地(例えば、ドルベコの(Dulbeco's)改良イーグル培地)、塩水、またはその他の製薬上許容される賦形剤を含む。
本発明によれば、創傷を治療するための該組成物は、細胞膜と多点接触を形成し得るミクロスフェアと、該ミクロスフェアが実質的に不溶性である、製薬上許容される担体、並びに該組成物を収容する容器を含む。例示すると、該担体は、好ましくは水性媒体、エーロゾル担体、軟膏および包帯からなる群から選択される。
【００１４】
本発明によれば、筋肉の再生を促進するための組成物が提供され、該組成物は、細胞膜と多点接触を形成し得るミクロスフェアと、該ミクロスフェアが実質的に不溶性である、製薬上許容される担体とを含む。
本発明によれば、無菌状態でミクロスフェアを含む組成物を収容し、かつ細胞膜と多点接触を形成し得る容器を提供する。
本発明によれば、ミクロスフェアと１種以上の活性成分とを含む、無菌組成物を収容する容器を提供する。
本発明によれば、ミクロスフェアと１種以上の活性成分とを含む、無菌組成物を収容する容器が提供され、その各々は活性物質の処方物を収容し、これは該創傷に適用する前に、該ミクロスフェアと混合することができ、あるいは該創傷部位に、別々に適用することができる。
【００１５】
【発明を実施するための最良の形態】
本発明並びにその利点をより完全に理解するために、添付図を参照しつつ記載される、以下の説明を参照する。
本発明は、予防並びに治療組成物およびミクロスフェアを使用して、創傷の治癒を促進する方法に関する。予想外のことに、ここに記載する特定のサイズ範囲を持つミクロスフェアは、任意の薬物あるいはその他の治療物質を更に添加し、もしくは含めることなしに、創傷の治癒を促進できる。事実、以下に記載するように、これらミクロスフェアは、その治療効果を発揮するために、分解またはその他の化学的変更を受けない。本発明のミクロスフェアは、また従来の療法、例えば放射線、化学療法、ホルモン療法、レーザー療法、高圧またはオゾン療法に対する、補助的な療法として適用することができる。
【００１６】
5.1 ミクロスフェアの特徴
これらミクロスフェアの構造は、コア材料と、少なくとも一つの型の帯電した表面基とを含む。該表面基は、該ミクロスフェアの少なくとも外部に存在する。その材料の例は、長鎖ポリマー、例えばポリスチレン、ラテックス、ポリ-β-アラニン、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、シリコーンおよび誘導体化ポリスチレンを包含する。表面基の例は、硫酸根、ポリ-N-エチル-４-ビニルピリジニウムブロミド、プロタミン、プロタミン硫酸、プロタミン塩、ポリリジン、カルボキシルおよびポリスチレンを含む。これら表面基は、該コア材料の一部として、あるいは該長鎖ポリマーの誘導体化などの、化学的方法によって後に付加することも可能である。以下において、用語「誘導体化」とは、分子またはその一部を化学的に変更、修飾または変化させる工程を意味するものとする。該ポリマーから製造される該ミクロスフェアは、水性媒体に対して実質的に不溶であるが、代わりにこのような媒体中で懸濁液または分散液を形成する。
【００１７】
本発明のパラメータを更に明確にするために、幾つかの用語を定義すべきである。以下において、用語「創傷」または「病巣」とは、対象身体の任意の部分に対する、任意の損傷を含み、急性状態、例えば熱性熱傷、化学的熱傷、放射線熱傷、過度に紫外線輻射に暴露された場合に生じる熱傷、例えば日焼け、身体組織の損傷、例えば分娩および出産の結果としての会陰部損傷、例えば会陰切開等の医学的手順を持続する際の損傷、外傷-誘発性損傷、例えば切断、自動車およびその他の機械的な事故における持続的な損傷、および弾丸、ナイフおよびその他の武器により起こる損傷、並びに慢性的な状態、例えば圧迫性糜爛、床擦れ、糖尿病お不十分な血液循環に関連する状態、およびあらゆる型のアクネを含むが、これらに制限されない。本発明により処置できる身体の領域は、皮膚、筋肉、神経系組織、骨、軟質組織、血管組織、および内部器官を含むが、これらに制限されない。以下において、「被験者(対象)」とは、本発明を実施する、ヒト、哺乳類または下等動物を意味するものとする。
【００１８】
以下において、用語「促進する」とは、加速および増強を包含する。以下において「瘢痕の軽減」とは、ケロイドおよび肥厚性瘢痕等の、過度の瘢痕形成の予防もしくは軽減、並びに対象の皮膚上などの外的なおよび癒着などの内的な瘢痕組織形成の程度を軽減することを含む。最後に、本発明は、また美容整形的に使用して、皮膚、例えば顔面の皮膚などの切傷またはその他の創傷における、過度の瘢痕形成を防止し、またアクネを治療することができることにも注目すべきである。美容整形的な意味において、「過度の瘢痕の形成」とは、美容整形的に望ましくないまたは許容されない任意の瘢痕を包含する。
【００１９】
以下の議論は、特定の型のミクロスフェアについて言及するが、これにより本発明を何等限定するものではないことに注意すべきである。当業者には、これらミクロスフェアが、より一般的には中実のまたは中空のビーズ、粒子または顆粒であり得ることを理解するであろう。本発明の好ましい態様において、これらミクロスフェアは、該薬物が実質的に不溶性である、製薬上許容される担持媒体中に、例えば水性媒体注の懸濁液として、または吸蔵性または非吸蔵性何れであっても良い、非水性媒体、例えば軟膏、エーロゾルスプレイまたは包帯中に分散される。このミクロスフェアの形状は、規則的な、例えば球状または楕円体形状または規則的な非-球状形態であり得、あるいは該粒子の形状は、その表面が単一の連続な曲線ではなく、あるいは該表面が平滑ではないような、不規則なものであり得る。
更に、該ミクロスフェアは、種々のポリマーの混合物であり得、また異なるサイズを持つ、種々の粒子、ビーズまたは顆粒の混合物であっても良い。これら薬剤は、また異なるサイズの孔を持つことができる。
【００２０】
例を挙げると、該薬物を形成する長鎖ポリマー、例えばポリ-β-アラニンは、架橋して、ミクロスフェアの球状の形状を実現するのに特に好ましいが、このような形状は架橋することなしに得ることができる。架橋されたポリ-β-アラニンからミクロスフェアを製造する方法の一例は、米国特許第5,077,058号に記載されているが、この材料は、更なる誘導体化を行って、該ミクロスフェアに、全体としての表面電荷を付与する必要があることに注意すべきである。
あるいはまた、該粒子は、特に該ポリマーが、架橋されていない場合には、無秩序の不規則形状を持つことができる。該粒子は、任意の形状、例えばコイル、球状、伸長されたコイルおよびランダムコイル等を持つことができる。好ましくは、該ポリマーは、生化学的に反応性であってはならず、また非生分解性であるべきである。最も好ましくは、該ポリマーは、治療期間中実質的に非生分解性であって、該創傷の治癒に必要とされる期間中、分解されずに維持される。以下において、用語「非生分解性」とは、該治療期間中、生分解性を示さない薬物を意味し、該期間とは、該創傷の治療に必要とされる期間である。
【００２１】
少なくとも該薬物は、以下のような特性を持つべきである。
1. これらは、細胞またはその部分、例えば外部細胞膜および該膜上の分子と、多点接触を形成し得るものであるべきである。
2. これらは、著しい化学的な変更または分解を被ることなしに、創傷の治癒を促進できるものであるべきである。
3. これらは、体液などの水性媒体に対して実質的に不溶性であり、代わりに懸濁液を形成すべきである。
これらの特徴は、以下で更に論じる如き理由から重要であり、本発明の薬物の効果は、該薬物の材料と細胞の一部、例えば外部細胞膜との間に多点接触が形成され、結果として該細胞が付着するための接着表面が形成されることと、直接関連するものと思われる。このような多点接触は、帯電した基が、該外部細胞膜の分子および部分との相互作用のために利用できる、多くの異なるポリマーについて可能である。従って、以下の説明は、1種の型の薬物に焦点を置いているが、本発明はこのような多点接触を形成し得る任意の材料をも包含するものであることを理解すべきである。
【００２２】
上記のように、該ミクロスフェアは、好ましくは約0.01μ〜約200μ、より好ましくは約1〜約100μおよび最も好ましくは約2〜約20μなる範囲内の径をもつ。本発明のミクロスフェア組成物は、懸濁液中で、0.001〜25重量%を構成する。如何なるメカニズムにも拘泥するつもりはないが、これらの好ましい範囲は、該創傷領域を浸潤するマクロファージによる、該ミクロスフェアの取り込みが可能な、最良のサイズであることに注意すべきである。少なくとも該マクロファージの一部、恐らく該マクロファージの外部細胞膜の分子との接触を介して、実際に該マクロファージを引き付けかつ活性化するものと考えられる。該ミクロスフェアについて観測される抗炎症性および抗菌性効果は、従って該マクロファージまたはその他の細胞の活性化を介して達成される、間接的な効果であると思われる。
【００２３】
該ミクロスフェアのもう一つの重要な性質は、該表面基の電荷である。ミクロスフェアのある好ましい例の担持する全体としての電荷は、ゼータマスター(ZetaMaster) (英国、マルバーンインスツルメンツ(Malvern Instruments)社)により、電気泳動移動度(mV)に基く、Zまたはζ電位として測定した。ここに例示する幾つかの態様において測定した、Z電位の範囲は、-29.58mV〜-79.76mVであった。以下において、用語「帯電した」とは、少なくとも約1mV、好ましくは少なくとも約10mVなる絶対値によるZ電位を意味するものとする。
テストした懸濁液中の該ミクロスフェアは、凝集、合一または塊状化せず、または不可逆的なケーキ形成を行わなかった。該ミクロスフェアは、時間の経過に伴って、幾分沈降するが、これらは穏やかに攪拌することによって、容易に再懸濁した。
【００２４】
本発明のミクロスフェアは、液状の包帯またはデバイスと類似しており、これは創傷の輪郭にあるいは該創傷内部に適用できる。これらミクロスフェアは、公知の方法により、最適pHにて、かつ種々の濃度にて、アルゴン、ネオンまたは窒素雰囲気下で無菌容器内に充填される。
5.2 薬理的および生物学的薬物
以下に述べる種に属する薬理的試薬の任意の１種またはそれ以上を、未処理のミクロスフェアと共に、本発明の予防または治療用組成物に配合できる：防腐剤、収斂薬、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗癌剤、抗ヒスタミン剤、抗生物質、戦場用途用の血液凝固剤、ビタミンおよびミネラル処方物、ビタミン、ミネラルまたは抗炎症剤。
【００２５】
本発明の治療組成物に配合できる生物学的に活性な物質は、収斂剤、抗生物質、酸化剤、タンパク分解酵素、コラーゲン、架橋阻害剤(例えば、天然または合成ジアミン類-シスタミン、プトレシン、スペルミジン、カダベリン等)、アミノ酸、マクロファージ刺激因子、または麻酔薬を含むが、これらに制限されない。 増殖因子並びに調節因子を該治療組成物に添加して、肉芽組織の形成および再上皮化を補助することにより、該創傷の治癒過程を増強することができる。これら因子は、例えば血小板由来の増殖因子(PDGF)、血小板由来の血管形成因子(PDAF)、血小板由来の表皮増殖因子(PDEGF)、トランスフォーミング増殖因子-β(TGFB)、血小板因子(PF-4)、αおよびβ線維芽細胞増殖因子(αFGFおよびβFGF)、成長ホルモン(GH)、表皮増殖因子(EGF)またはインシュリン増殖因子(IGF)を含むが、これらに制限されない。
【００２６】
血小板由来の増殖因子は、特に肉芽形成および再上皮化段階中の、創傷の治癒に関与する、多段システムを刺激する。トランスフォーミング増殖因子-βは、多くの細胞型の増殖並びに分化を調節する、関連するダイマー型タンパクの、増殖群を意味する(Massague, Ann. Rev. Cell Biol., 1990, 6:597-619)。TGFBも、筋肉細胞および軟骨細胞における、軟骨-特異的巨大分子の生成を誘発する。しかし、TGFBは、鶏胸骨の軟骨細胞による(Horton等, J. Cell Physiol., 1989, 141:8-15)およびラットの軟骨細胞による(Rosen等, J. Cell Physiol., 1988, 134:337-346)コラーゲンタイプIIの合成を阻害することが、分かった。事実、TGFBは、インビボおよびインビトロにおける、最も正常な細胞の基本型阻害剤として出現した(Alexandrow, A.G.等, Cancer Res., 1995, 55:1452-1457)。TGFB1は、ヒトまたはブタの血小板から精製され、また組み換えTGFB1は、一般的に入手できる(Gentry等, Mol. Cell Biol., 1988, 7: 3418-3427)。インシュリン単独では、コラーゲンマトリックス合成を刺激する上で、IGF-Iよりもかなり能力が劣る。IGF-IIは、DNAおよびRNA合成を刺激し、また胎児細胞におけるクローン増殖を刺激する上で、IGF-Iよりも一層強力である(McQuillan等, Boichem. J., 1986, 240:423-430)。表皮増殖因子単独では、軟骨細胞増殖には何の影響も与えない。インシュリンと共に、EGFは、相乗的に軟骨細胞の増殖を刺激する(Osborn, K.D.等, J. Orthop. Res., 1989, 7:35-42)。
【００２７】
高濃度の脂質パーオキシドが、活性化されたマクロファージ、凝集した血小板、および損傷を受けた組織から単離した、細胞下粒子に存在することが明らかにされた。強力な酸化剤、代謝により遊離基となる薬物、およびイオン化輻射は、全てプロスタグランジン、ロイコトリエン(エイコサノイド)および/または脂質パーオキシド(peroxidative)増加を誘発する。これらの増加したエイコサノイドおよび脂質パーオキシドは、組織損傷または壊死のおよびその炎症性反応における増加の1原因であると考えられる。抗炎症性薬物、例えば非-ステロイド系の抗-炎症性薬物(イブプロフェン、インドメタシン、アスピリン、アセトアミノフェン、ナプロキセン、スリンダック)および具体的にはシクロオキシゲナーゼ-2 (COX2)阻害剤の、該予防および/または治療用組成物への配合は、あらゆる損傷を受けた組織、例えば肺、肝臓、線維症が、長期の反復的な傷害の結果である、放射線-誘発性損傷において有用であることが、立証される可能性がある。更に、酸化防止剤(例えば、ビタミンE)および遊離基捕獲剤(例えば、還元されたグルタチオン)の配合も、有用であるものと立証される可能性がある。
【００２８】
亜鉛：外傷、外科手術またはその他の損傷を受けた後に、血液および組織中の亜鉛の量が、低濃度まで減少する可能性があることが、立証されている。これは、特に火傷を負った患者において顕著である。血液および組織におけるこの痕跡量元素が、正常なレベルに回復するのに十分な、亜鉛の投与は、上皮化速度、創傷強度の獲得速度、およびコラーゲンおよびその他のタンパクの合成速度を増大する。多数の酵素が、亜鉛-依存性の、DNA-ポリメラーゼおよび逆転写酵素である。創傷の治癒に及ぼす亜鉛枯渇の効果は、これら酵素の機能の程度が低下した際に予想されるものである。上皮および線維芽細胞の増殖は起こらない。というのは、これら細胞の有糸分裂は、DNA-ポリメラーゼおよび逆転写酵素無しには起こり得ないからである。従って、これら細胞は、正常に移動できるが、これらは増殖しない。従って、十分な上皮化は起こらず、該創傷への僅かな線維芽細胞の移動による、コラーゲンの合成は、該創傷を一緒に維持するのに必要な線維を供給することができない。このような場合には、血液および組織中の亜鉛濃度を、正常値にまで高めることにより、創傷治癒のための正常な増殖が回復されるであろう。血液および組織中の亜鉛濃度が低い患者において、該治療組成物中の亜鉛を、経口的に、腸管外に、あるいは局所的に投与して、正常な創傷の治癒を回復することは、本発明の目的である。亜鉛は、塩化亜鉛、炭酸亜鉛および/または亜鉛グルコネートから選択される塩として与えられる。
【００２９】
ビタミン A および E：ビタミンAは、創傷の治癒における、遅延された肉芽組織の生育および低下された量のコラーゲンを、部分的に逆転できる。局所的に適用されたビタミンAは、コルチコステロイドの投与により遅延された、創傷における上皮化を増強するが、コラーゲンの堆積は、全身的なビタミンAの投与によってのみ影響される。
ビタミンEは、瘢痕形成を改善するために利用できる。というのは、その副作用は、匹敵する量のステロイドホルモンの副作用よりも小さいからである。高い投与量において、ビタミンEは、創傷の治癒およびコラーゲンの生産を遅延するが、この作用は、ビタミンAの存在下では克服される。従って、必要に応じて、被験者に、本発明の予防および/または治療用組成物として、経口的に、腸管外にあるいは局所的に、ビタミンAおよびEを与えることは、本発明のもう一つの目的である。
【００３０】
5.3 遺伝子療法
本発明の予防および/または治療用組成物は、インビボで、遺伝子および遺伝子生成物を導入して、該創傷の治癒を促進するための賦形剤を提供する。例えば、糖尿病性糜爛に対して、該治療組成物は、本発明のミクロスフェアおよび遺伝的に操作された基質細胞(例えば、該対象から採取されたルーズな連結組織中に見出される、他の細胞および/またはエレメントを含む、または含まない線維芽細胞; その例は内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、血漿細胞、マスト細胞、脂肪細胞等を含むが、これらに制限されない)を含み、該基質細胞は、スロモエンボリジム(thromoembolisim)の危険性を減じるために、抗凝結遺伝子生成物を発現し、もしくは炎症性反応による失敗の危険性を減じるために、抗炎症性遺伝子生成物を発現するように、遺伝子操作される。一旦、遺伝子操作された細胞が、該創傷部位に適用されると、該抗炎症性遺伝子生成物、例えば腫瘍壊死因子(TNF)、インターロイキン-2(IL-2)または他の炎症性サイトカインに対する、中和抗体のイディオタイプに相当するペプチドまたはポリペプチドの存在は、種々の疾患と関連する炎症性反応の改善をもたらすことができる。該疾患の例は、火傷を受けた組織、外科手術に伴う感染、糖尿病性ニューロパシー的潰瘍、圧迫性潰瘍、静脈うっ血性潰瘍、火傷を受けた組織、外科手術に伴う感染、外科的創傷破壊、内部潰瘍、出血、骨壊疽、圧迫性糜爛、床擦れ、折衷的切断部位、治療不能な外傷性創傷、美容整形、髭剃り後、歯科治療、慢性潰瘍(糖尿病性の、結節状構造を持つ静脈の、病後の)、放射線による組織破壊、脊髄損傷による創傷、婦人科学的創傷、化学的創傷、血管疾患性創傷、糖尿病性皮膚糜爛、糖尿病性足、物理的外傷、形成外科手術後の縫合部位、日焼けまたは会陰切開を含むが、これらに制限されない。
【００３１】
好ましくは、該細胞は、創傷治癒の初期段階に、このような遺伝子生成物を、一時的におよび/または誘導可能なコントロールの下で発現し、あるいは該基質細胞に係留されたキメラ融合タンパクとして発現するように操作され、該キメラ融合タンパクは、例えばレセプタまたはレセプタ-様分子の、細胞内および/または貫膜ドメインで構成され、かつ細胞外ドメインとして該遺伝子生成物と融合したキメラ分子である。もう一つの態様においては、該基質細胞は、患者にとって欠乏しており、または治療作用を及ぼすであろう、例えばHDL、アポリポタンパクE等に対する遺伝子を発現するように、遺伝子操作することができた。該基質細胞内で操作された関連する遺伝子は、治療すべき疾患と関連するものである必要がある。
【００３２】
該基質細胞は、宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするのに使用した遺伝子を含む、組み換えDNA構築物を使用して、遺伝子操作することができ、該宿主細胞はクローニングされ、次いで培養系において、クローン的に増殖される。該活性遺伝子生成物を発現する培養物は、該生成物の欠乏する個体に移植することができた。例えば、血管の種々の型の症状を予防または改善する遺伝子を、疾患状態の下で、不十分に発現させ、もしくはダウンレグレーションすることができる。具体的には、以下のような病理的状態の予防に関与する遺伝子の発現は、ダウンレグレーションすることができ、該病理的状態は、例えば血栓形成、炎症反応、および弁の線維症および石灰化を含む。かくして、遺伝子活性のレベルは、存在する遺伝子生成物の濃度を増すか、あるいは三次元ミクロスフェア培養系に存在する、該活性遺伝子生成物の濃度を高めることによって増すことができる。
【００３３】
更に、創傷治癒の該線維組織形成段階中に、患者を遺伝子置換療法によって治療することができる。基質細胞を、個々の患者の要件を満たすように、特別に設計することができ、例えば該基質細胞は、１以上の遺伝子を調節するように遺伝子操作することができ、あるいは遺伝子発現の調節を、一時的なもの、または長期に及ぶものとすることができ、もしくは該遺伝子活性を誘導不能なもの、または誘導可能なものとすることができる。例えば、正常なターゲット遺伝子またはターゲット遺伝子機能を持つ、正常なターゲット遺伝子タンパク生成物を生産する、該遺伝子の一部を、ヒト細胞中に挿入でき、該ヒト細胞は、これら三次元構築物を、誘導不能なベクターまたは誘導可能なプロモータの何れかを使用して、存在させる。該ベクターは、アデノウイルス、アデノ-関連ウイルス、およびレトロウイルスベクターを含むが、これらに制限されず、また該プロモータは、DNAを細胞中に導入する他の粒子、例えばリポソームまたは直接DNA注入または金粒子以外にも、メタロチオネイン、または熱ショックタンパクを含む。
【００３４】
遺伝子療法における、該治療組成物での該基質細胞の使用は、幾つかの利点を持つ。まず、該培養物は真核細胞を含むので、該遺伝子生成物は、適正に発現され、また培養物中で処理されて、活性生成物を形成する。第二に、遺伝子療法技術は、トランスフェクションされた細胞数が、実質的に臨床的価値、適性および利用性を達成するまで高められた場合にのみ、有用であり、本発明の三次元培養物は、トランスフェクションされた細胞数を増大させ、かつ該細胞の増殖(細胞分割を介する)を可能とする。
【００３５】
遺伝子操作により該基質細胞に導入された、遺伝子生成物の本質的なまたは一時的な発現を達成するために、種々の方法を利用できる。例えば、Seldon, R.F.等, Science, 1987, 236:714-718によって記載された、トランスカリオティック(transkaryotic)移植技術を利用できる。ここで使用する用語「トランスカリオティック(transkaryotic)」とは、該移植細胞の核が、安定なまたは一時的なトランスフェクションにより、DNA配列の付加によって変更されていることを示唆する。これら細胞は、種々のベクターの何れかを使用して、操作でき、該ベクターは、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、またはアデノ-関連ウイルスベクター、または非-組込み複製(non-integrating replicating)ベクター、例えばパピロマウイルスベクター、SV40ベクター、アデノウイルスベクター、または複製欠失ウイルスベクターを含むが、これらに制限されない。一時的な発現が好ましい場合には、非-組込みベクターおよび複製欠失ベクターが好ましい。というのは、これら系において、誘導可能なまたは本質的なプロモータを使用して、対象とする遺伝子の発現を制御することができるからである。あるいはまた、組込みベクターを使用して、一時的な発現を達成し得るが、この対象とする遺伝子は、誘導可能なプロモータにより制御される。
【００３６】
任意のプロモータを使用して、該挿入遺伝子を発現させることができる。例えば、ウイルスプロモータは、CMVプロモータ/エンハンサー、SV40、パピローマウイルス、エプシュタイン-バールウイルス、エラスチン遺伝子プロモータおよびb-グロブリンを含むが、これらに制限されない。一時的な発現が望ましい場合には、このような構成的プロモータを、非-組込みおよび/または複製-欠失ベクターにおいて使用することが好ましい。あるいはまた、誘導可能なプロモータを使用して、必要な場合に、該挿入遺伝子を発現させることが可能であった。例えば、誘導可能なプロモータは、メタロチオネインおよび/または熱ショックタンパクを含むが、これらに制限されない。
【００３７】
既に記載され、使用できる連結組織に対して特異性を示す、転写調節領域は、膵臓の房状細胞中で活性な、エラスチンまたはエラスターゼI遺伝子調節領域(Swit等, Cell, 1984, 38:639-646; Ornitz等, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology, 7:425-515)を含むが、これらに制限されない。該エラスチンの堆積は、血管の移植片を含む、種々の組織における特定の生理的および発生的事象と相関している。例えば、動脈の発達において、エラスチンの堆積は、動脈圧力および機械的な活性における変化と整合している。機械的な活性とエラスチン発現とを結び付けている、形質導入メカニズムには、細胞表面レセプタが関与している。一旦、細胞表面レセプタを介して、エラスチン合成細胞が、エラスチンに付着すると、付随的なエラスチンおよび他のマトリックスタンパクの合成は、該組織中の応力または機械的な力(例えば、該生体反応器における、該構築体の一定した移動)または細胞の形状に影響を与える他の因子に暴露することによって影響される可能性がある。
【００３８】
本発明の該ミクロスフェア培養システムで使用する該基質細胞は、遺伝子操作により、該移植部位における詰まりまたは拒絶を促進する、因子または表面抗原の発現を「阻止する(knock out)」ことができる。ターゲット遺伝子の発現レベルまたはターゲット遺伝子生成物の活性レベルを低下させるための、負の調節技術は、以下に論ずる。ここで使用する「負の調節」とは、この調節処理のない場合における、ターゲット遺伝子生成物のレベルおよび/または活性に対する、該ターゲット遺伝子生成物のレベルおよび/または活性における減少を意味する。基質細胞に対して負の遺伝子の発現を、多くの技術を利用して低下させ、または阻止することができる。例えば、相同組み換え技術を利用して、該遺伝子を完全に不活性化する(一般的には、「阻止(knockout)する」と言う)ことにより、発現を阻害することができる。通常、該タンパクの重要な領域をコードするエキソン(または該当する領域に対するエキソン51)は、正の選別可能なマーカー(例えば、neo)により遮断され、該ターゲット遺伝子から正常なmRNAの製造を阻止し、かつ該遺伝子の不活性化をもたらす。遺伝子は、また遺伝子の一部に欠失を生成することにより、あるいは該遺伝子全体を除去することによっても、不活性化することができる。該ゲノムから遠く離れた、該ターゲット遺伝子と相同の2つの領域を持つ構築体を使用することによって、これら2つの領域間に入った配列を、除去することができる。Mombaerts, P.等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1991, 88:3084-3087。
【００３９】
該ターゲット遺伝子の発現を阻害する、アンチセンスおよびリボザイム分子も、ターゲット遺伝子の活性レベルを減じるために、本発明に従って使用することができる。例えば、主要な組織適合性遺伝子複合体(HLA)の発現を阻害する、アンチセンスRNA分子は、免疫応答に対して最も多才であることが示された。更に、三重螺旋分子を、ターゲット遺伝子活性のレベルを低下するのに利用できる。これらの技術は、L.G. Davis等編, 分子生物学における基本的方法(Basic Methods in Molecular Biology), 第２版, Appleton & Lange, Norwalk, Conn. 1994。
もう一つの代替法において、該基質細胞を、例えば細胞分割サイクル2キナーゼの発現の、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド遮断により、平滑筋細胞の転移に必要な遺伝子発現を遮断するように、遺伝的に操作し、結果として新生血管内膜増殖し、移動し、かつその増殖の進展に導くことができる。Mann, M.J.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92:4502-4506。
【００４０】
遺伝子療法における、該基質細胞培養物の利用は、多くの利点を有している。まず、該培養物は、真核細胞を含むので、その遺伝子生成物は、適切に発現され、かつ培養物中で処理されて、活性生成物を形成する。第二に、遺伝子療法の技術は、トランスフェクションされた細胞数が、実質的に臨床的価値、適性および利用性を達成するまで高められた場合にのみ、有用であり、本発明の基質細胞培養物は、トランスフェクションされた細胞数を増大させ、かつ該細胞の増殖(細胞分割を介する)を可能とする。例えば、創傷の治癒因子を発現する、遺伝的に操作された細胞は、損傷部位における創傷治癒を増強する、腱および間膜を形成するのに利用される、生きた基質培養物に配合することができる。
【００４１】
既に記載されており、利用することのできる組織特異性を示す、転写調節領域の例は、膵臓の房状細胞中で活性な、エラスターゼI遺伝子調節領域(Swit等, Cell, 1984, 38:639-646; Ornitz等, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology, 7:425-515); 膵臓のβ細胞中で活性なインシュリン遺伝子調節領域(Hanahan, Nature, 1985, 315:115-122); リンパ系細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域(Grosschedl等, Cell, 1984, 38:647-658; Adams等, Nature, 1985, 318:533-538; Alexander等, Mol. Cell Biol., 1987, 7:1436-1444); および骨格筋において活性なミオシン軽鎖-2遺伝子調節領域(Shani, Nature, 1985, 314:283-286)を含むが、これらに制限されない。
【００４２】
5.4 創傷 / 病巣
(A) 糖尿病性足：米国における全ての非外傷性切断の50-70%が、糖尿病にかかっている(ナショナルダイアベーツボードの報告(A Report of the National Diabetes Board): NIH パブリケーション, 81-2284, 1980, p.25)。糖尿病における足の破壊は、幾分かの血管の損傷を含むまたはこれを含まない、通常神経疾患と感染との組合わせによるものである。足の爪の内方成長または潰瘍が見られ、また苦痛の感覚がないことから、未治療のまま放置された場合には、該感染は足全体に広がり、損傷を受けていない血管が供給するよりも多量の血液供給を必要とする、重度の感染を引き起こす。結果として生ずる壊疽は、切断を必要とする可能性がある。医師は、しばしば、糖尿病患者における栄養障害性潰瘍が、感覚なしに起きると言う、印象を得ている。糖尿病患者は、崩壊が生じた場合に初めて驚嘆する。問題は、全体的な感覚の喪失に気付く前に、足が長期に渡り損傷を受け易いことである。本発明の治療組成物は、この破壊を防止し、かつ糖尿病に関連する該潰瘍を治療するように工夫されている。
【００４３】
(B) 圧迫性潰瘍：圧迫性潰瘍は、特に運動性に限界のある老齢の患者にとって、重大な健康管理上の問題となりつつある。老人医学における患者の死の危険性は、圧迫性潰瘍が発生した場合には、4倍にも増加し、また潰瘍が治癒しない場合には、6倍にも増大する。圧迫性潰瘍の発症は、患者の介護に携わる全ての者にとって、誤診に陥り易い原因の一つとして認識されている。法廷は、このような創傷の発生に至らしめたまたはそのような創傷を発生したままとした、健康管理提供者に対して、ほんの僅かな同情をも示さなかった。West v. Van-Care, Inc. (事件No. CV-91-617)において、アラバマ州陪審員は、老年の女性が、被告ナーシングホームに滞在中に、10インチの壊疽性の圧迫性潰瘍を発生した際に、6500万ドルの支払いを命ずる評決を下した。従って、糜爛形成を防止するための、良好なデバイス(例えば、マットレス)の使用ばかりでなく、良好なスキンケアをもたらし、かつ圧迫性潰瘍の治癒を促進するのに使用できる、治療組成物の使用をも必要とする。
【００４４】
(C) 一般並びに形成外科およびその他の治療法：外科(以下に列挙する器官および組織の外科療法を含むが、これらに限定されない: 皮膚、胸部、胸部壁、胸膜、肺および縦隔膜、心疾患、大血管の疾患、末梢動脈疾患、胃腸管の疾患、胃(腹部)、結腸、直腸および肛門、虫垂、肝臓、胆嚢および肝外胆管系、膵臓、脾臓、腹膜炎および腹内感染、腹部壁、大網、隔膜、および後腹膜腔(retroperitenium)、腹部壁ヘルニア、下垂体および副腎、小児外科、甲状腺および傍甲状腺、泌尿器科学、婦人科学、神経外科、整形外科、切断術、手、形成並びに再構成外科、腫瘍外科、頭部外科、整形外科、筋骨格、尿生殖器系、瘢痕除去、小児科、胃腸管)、内部創傷、形成外科、婦人外科、瘢痕除去、レーザー治療、レントゲン輻射、放射線輻射、オゾン治療、または温熱療法が、宿主防御を開始させる創傷をもたらす、幾つかの手順である。感染に対する宿主の防御は、局所的または全身的、非特異的または特異的、および体液性または細胞性何れであっても良い。種々の正常な機能が働いて、身体のバクテリアによる負荷を減じ、かつ該治癒過程を促進する。本発明の予防並びに治療組成物は、潜在的な侵襲的病原体の処理に関与している、自然の免疫学的な現象、例えば解剖学的な障壁、ベースライン細胞性食作用、食細胞による消化またはエフェクターメカニズムの組み合わされた防御作用を促進し、かつ増強するのに使用できる。
【００４５】
(D) 火傷：火傷は極めて一般的な傷害であり、年間少なくとも200万人が、重度の火傷を被り、医学的な手当てを必要とするものと見積もられている。1度、2度、3度および4度の火傷と言う、古典的な説明は、皮膚解剖学に関連する、傷害の深度に基く、解剖学的なものである。1度の火傷は、上皮の基底層には至っていない。本質において、該上皮は、侵されていない。これらの傷害は、典型的には日焼けによって代表され、また本質的には恐らく保湿剤による手当てを除けば、殆ど手当てを必要としない。2度の火傷は、該上皮の基底層下部から、全表皮に及ぶが、該表皮を完全に侵すことはない。該皮膚の付属器を覆う上皮細胞は、生存状態にあり、かつ該創傷の表面を覆うべく移動する。3度の火傷は、完全に皮膚の下部を侵し、脂肪にまで広がっている。4度の火傷は、筋肉および骨にまで及び、専門の火傷センターでの治療を要する。本発明の治療用組成物は、火傷を負った患者、吸入傷害、上部気道火傷、下部気道火傷または肺の火傷を被った患者における創傷の治癒を促進し、また関連する合併症を処置するのに適している。
【００４６】
【実施例】
以下本発明を、ミクロスフェアを使用して例示する。該ミクロスフェアは、一般的に創傷の治癒を促進し、並びに筋肉の再生を促進するのに利用できる。創傷の治癒および筋肉の再生両者は、損傷を受けた組織の修復および失われた組織の置換を含む。特定の型の細胞の移動並びに増殖が、秩序だった、また体系付けられた様式で起こりる必要があり、固形腫瘍などの悪性組織の、抑制のない成長とは容易に識別できる。特に、創傷の治癒および筋肉の修復に関与する細胞は、まず活性化されて、該治癒過程において必要とされる役割を果たす必要がある。その正確なメカニズムは、知られていないが、創傷の治癒において起こる増殖の秩序だった体系的な細胞成長は、明らかに高度に組織化された調節過程の存在を立証している。
以下に与えられる実施例によって明らかにされるように、本発明のミクロスフェアは、この複雑で組織化された、かつ体系的な過程を妨害しないものと思われる。というのは、これらミクロスフェアは、単に該全体としての治癒過程のペースを速め、該過程の特定の段階を明らかに速めるからである。しかし、予想外のことに、本発明のミクロスフェアは、該細胞に、連続的な、制限のない代謝の活性化状態を起こさせず、このことは正常な調節過程が影響を受けないことを示している。従って、本発明のミクロスフェアは、無制限の細胞活性化を起こさない。
【００４７】
本発明を特定のメカニズムに限定することなしに、負に帯電した基を持つミクロスフェアの添加は、細胞が付着し、かつ被覆するための付随的な表面として機能することによって、創傷の治癒に、治療効果を及ぼすものと考えられる。本発明のミクロスフェアの有効性に関する一つの説明は、該負に帯電した基が、該ミクロスフェアの固体表面と、該細胞膜との間の、多重結合の形成を可能とすることにあり、これは該ミクロスフェアの材料と、該細胞膜との間の多点接触を表す。これら結合の形成は、最終的には細胞の活性化に導く、膜リガンドの分布及び状態における変化、細胞骨格の再構成、細胞内シグナル導入およびその他の生化学的な変化を生ずる。従って、細胞の活性化は、細胞の増殖、増殖因子の生産、および該細胞外マトリックスに係わるコラーゲンおよびその他の成分の製造に導く。本発明は、如何なる特定のメカニズムにも頼る必要がないことに注目すべきである。というのは、以下において明らかにされるように、これらミクロスフェアは、明らかにインビボでの創傷の治療および治癒にとって有利な効果を有しているからである。
【００４８】
多数の様々な型のミクロスフェアを、以下の実施例においてテストした。これらミクロスフェアは、カルボキシルまたはアミノ表面基をもつ、または付随的な表面基をもたないポリスチレンで製造された。該ミクロスフェアの径は、約0.1〜約20μの範囲内にあった。幾つかのミクロスフェアのζ電位をもテストし、該球状体のサイズおよび表面基の型が、明らかに各ミクロスフェアにより担持される全電荷量に及ぼす効果を持つことを明らかにした。これは、該ミクロスフェアの、創傷治癒促進能力に及ぼす重要な効果であった。
幾つかの特定の型をもつミクロスフェアを例示してきたが、以下のような特徴が満足される場合には、多くの他の関連する型のミクロスフェアも、使用可能であるものと理解すべきである。
【００４９】
1. これらは、細胞または該細胞の一部と多点接触を形成できるものである必要がある。
2. その作用のメカニズムは、化学的な変更または分解を必要としない。
3. これらは、体液等の水性媒体に実質的に不溶であり、かつ代わりに懸濁液を生成する必要がある。
その他の好ましい寄与は、以下に列挙するものを包含する。まず、該ミクロスフェアは、好ましくは該治療期間中、非-生分解性の材料、特に好ましくはポリスチレンから製造すべきである。第二に、該ミクロスフェアは、好ましくは実質的な電荷、より好ましくは全体として負の電荷をもつべきである。該ミクロスフェアのサイズは、余り重要ではないが、好ましくは該ミクロスフェアは、約0.1〜約20μなる範囲の径をもつべきである。好ましくは、該ミクロスフェアを、カルボキシル表面基で誘導体化すべきであるが、その他の負の帯電した基を使用することも可能である。従って、これら型のミクロスフェアは、例示の目的でのみ与えられたものであり、本発明を何等制限することを意味するものではない。本発明によるミクロスフェアの原理及び操作は、実施例、添付図面および添付された説明を参照することによってより一層十分に理解される。
【００５０】
実施例 1 ：クレアチンホスホキナーゼに及ぼすミクロスフェアの効果
明らかに、本発明のミクロスフェアは、図1に示したように、培養した筋原細胞のクレアチンホスホキナーゼ(CPK)の活性における初期増加を誘発した。しかし、8日後には、該未処理および処理細胞両者共に、同一のレベルのCPK活性を持つことが明らかとなり、このことは本発明のミクロスフェアによる、高いCPK活性の誘導が、一時的なものであることを示している。実験方法は、以下の通りであった。
【００５１】
ラット胚骨格筋の一次培養物を、フレッシュニー(Freshney)によって記載されたように調製した(R.J.フレッシュニー(Freshney), 動物細胞の培養(Culture of Animal Cells), ウイリー社, 1986, p.117, 170-172)。簡単に説明すると、筋肉を、皮膚および骨を含まないように切り分け、加温トリプシン処理(0.25%トリプシン、36.5℃)によって15脱分離処理(desegregated)した。細胞を、5% CO2を含むインキュベータ中で、37℃にて1時間予備平板培養することにより、線維芽細胞による汚染を低下させた。これは、線維芽細胞が、まず組織培養プレートに付着するからである。次いで、筋原細胞を、抗生物質で富化した培地(ドルベコ(Dulbecco)改良培地: 培地199、1:4なる比) 2ml、10%(v/v)ウマ血清および4%(v/v)の鶏胚抽出物と共に、濃度5,000細胞/mlにて、35mmのペトリ皿に播種した。該鶏胚抽出物は、R.J.フレッシュニー(Freshney), 動物細胞の培養(Culture of Animal Cells), 1986に記載の方法に従って、10日齢の鶏胚から調製した。該抗生物質は、アンホテリシンおよびゲンタマイシンを含み、これらは標準的な初期濃度2.5mg/mlから、希釈率1:1000にて調製した。24時間後に、該培地をデカンテーションにより捨て、20%(v/v)の子馬血清および1%(v/v)の鶏胚抽出物を含む新たな培地で置換した。
【００５２】
次いで、この培養した細胞を、培地中で4-8日間、ミクロスフェアで(平板培養時点において開始)処理するか、あるいは培地のみで処理した。該ミクロスフェアは、径1、2または4.5μのカルボキシル化ポリスチレンまたは径4.5μのポリスチレンのみの何れかであった。該ミクロスフェアの濃度は、培地1ml当たり106または107であり、これら両濃度において類似する結果が得られた(データは記載せず)。処理の4、5、6、7または8日後に、クレアチンホスホキナーゼ活性を、標準的なアッセイ(「クレアチンキナーゼ(Creatine Kinase)」, ワーシングトンエンザイムマニュアル(Worthington Enzyme Manual), ワーシングトンバイオケミカル社(Worthington Biochemical Corporation), , N.J., USA, 1972, pp.54-55)によって測定した。結果を図1に示したが、その単位はCPK活性/mg全細胞タンパクで表した。
【００５３】
明らかに、図１は、コントロール細胞と比較して、本発明のミクロスフェアが、クレアチンホスホキナーゼ活性の初期増加を誘発する能力を持つことを、立証している。処置の４日後に、ミクロスフェア処理した細胞は、コントロール細胞と比較して、CPK活性の初期増加を示している。この増加は、処置の5日目または6日目において、特に顕著である。しかし、7日目には、コントロール細胞中のCPK活性は、ミクロスフェア処理した細胞の活性と同等なレベルに達し始めた。8日目までに、コントロールおよびミクロスフェア処理した細胞両者は、同様なレベルの活性を示す。明らかに、ミクロスフェアは、筋原細胞におけるCPK活性の初期増加を促進し、処理の8日後には、該活性は安定化する。このような高いCPK活性は、筋原細胞の生化学的な成熟と相関をもつものである。従って、本発明のミクロスフェアは、該培養筋原細胞の生化学的な成熟を促進した。
【００５４】
実施例 2 ：細胞増殖および融合に及ぼす、ミクロスフェアの効果
本発明のミクロスフェアは、以下に示すように、コントロール(未処理)細胞と比較して、細胞増殖および筋原細胞の融合両者において、初期増加を誘発することが明らかにされた。
ラット筋原細胞の一次培養物を、上記実施例1と同様に調製したが、該細胞は、カバースリップ上で生育させた。処理した細胞を、以下において更に説明するように、培地中でミクロスフェアと共にインキュベートし、一方でコントロール細胞には培地のみを与えた。細胞増殖の程度を決定するために、細胞を、エタノール/酢酸(3:1)中で固定し、次いでヘマトキシリン-エオシンによって染色した。次に、該染色した細胞を、光学顕微鏡による観察下で計数した。有糸分裂指数を、1000細胞当たりの、計数された有糸分裂中の細胞の割合として計算した。
【００５５】
細胞増殖実験のために、スルフェート表面基を有するポリスチレンを使用した。これは、径0.18μおよび107ミクロスフェア/ml培地なる濃度を有していた。コントロール細胞と比較して、ミクロスフェアによる24時間の処理後、有糸分裂指数における20倍の増加が観測された。具体的には、コントロール細胞の有糸分裂指数は、1.25+0.7%であり、一方ミクロスフェアで処理した細胞の該指数は、24.6+1.0%であった。かくして、ミクロスフェアは、明らかに筋原細胞の有糸分裂指数における大きな増加をもたらした。
筋原細胞の融合に及ぼす、ミクロスフェアの効果も検討した。その結果を表1に与える。一般的に、ミクロスフェアで処理した細胞は、コントロールと比較して、約150%の融合速度を示した。しかし、この効果の程度は、ミクロスフェアの型および処理の長さに依存するものであった。
【００５６】
テストしたミクロスフェアの型を、表１に与える。該ミクロスフェアの径は、「径」の欄にμ単位で与えられている。該ポリマービーズ上の表面基は、「表面基」の欄に与えられている。これ以上の如何なる誘導体化もなされていないポリスチレンビーズは、「ポリスチレン」である。カルボキシルまたはアミノ表面基で誘導体化されたビーズは、夫々「カルボキシル」および「アミノ」として記載されている。ビーズの濃度は、「濃度」として、ビーズ数/ml培地単位で与えられている。
筋原細胞の増殖速度を測定するために、上記のようにして、細胞を調製し、固定し、かつ染色した。「初期細胞」の欄に、細胞数/ml培地として表1に与えられている密度にて、細胞をまず平板培養した。「処理後の日数」なる欄に与えられている、所定の処理後の日数が経過した後に、筋原細胞融合の測定を行った。
【００５７】
融合の程度は、顕微鏡的視野内の全核数に関連する、多核細胞またはミオインプラスト(myoimplasts)内の核の割合として計算し、ミクロスフェア処理細胞については、「融合の割合」として、またコントロールの未処理細胞については、「コントロール融合」として与えられている。少なくとも400個の核が、各実験条件に対して計数された。ミクロスフェア処理細胞およびコントロールの未処理細胞における、細胞融合の程度の比は、「相対的効果」として与えられている。表1の特定の位置に、何の数値も与えられていない場合は、その値が上の行の値と同一であることを示す。
【００５８】
【表１】
表1：ミクロスフェアの、筋原細胞融合に及ぼす効果
表１から理解されるように、種々の型のミクロスフェア全てが、筋原細胞の増殖を促進したが、該効果の程度は、該ミクロスフェアの径、該ミクロスフェアの表面基、処理後の日数および該ミクロスフェアの濃度に依存していた。筋肉組織が、胚の形成中に形成された場合には、筋原細胞の融合が起こり、またこの融合は、筋肉の再生および損傷を受けた筋肉組織の修復における、極めて重要な段階でもある。従って、ミクロスフェアの、このような融合を促進する能力は、明らかにこれらミクロスフェアの電位が、以下の実施例5において立証されるように、筋肉の再生を促進することを示している。
【００６０】
実施例 3 ：ミクロスフェアの、コラーゲン合成および堆積に及ぼす効果
背景技術の章で上記したように、コラーゲンの合成および堆積は、創傷治癒の過程における重要な段階である。更に、該創傷に堆積されるコラーゲンの量は、創傷強度の重要な決定因子である。従って、本発明のミクロスフェアは、前のおよび以下に記載する実施例において立証されるように、種々の型の細胞に様々な効果を及ぼすが、明らかに組成物の、創傷を治癒する能力の重要な決定因子は、コラーゲン合成および堆積に及ぼすその効果である。
図2Aおよび2Bに示したように、本発明のミクロスフェアは、明らかに、培養された線維芽細胞による、コラーゲン合成を促進する。最大の効果は、タイプIおよびタイプIIミクロスフェアについてみられる。タイプIミクロスフェアは、径4.5μを有し、カルボキシル化ポリスチレンから製造され、かつ約-29.96 mVというZ電位を有していた。タイプIIミクロスフェアは、径0.49μを有し、ポリスチレンのみから製造され、かつ約-34.5 mVというZ電位を有していた。タイプIIIミクロスフェアは、径1.0μを有し、カルボキシル化ポリスチレンから製造され、かつ約-53.34 mVというZ電位を有していた。その実験法は、以下の通りであった。
【００６１】
包皮線維芽細胞培養物を、4.5 mg/mlのグルコースを含み、10%(v/v)の子牛血清、2mMのL-グルタミン、50μg/mlのゲンタマイシン硫酸および2.5 mg/mlのアンホテリシンBを補充した、ドルベコの改良イーグル培地(DMEM)で満たされた、75cm2のプラスチックフラスコ(NY、コーニングのコーニングガラスワークス(Corning Glass Works)社)中で生育させた。この培養物を、37℃にて、5% CO2中で、密集するまでインキュベートした。線維芽細胞を、0.25%トリプシン/0.05% EDTA溶液を用いて収穫し、24-ウエルプレートにて、同一の培地を使用し、200,000細胞/ウエルなる密度にて、24時間継代培養した。この時点で、該処理細胞を、タイプI、IIまたはIIIミクロスフェアと共にインキュベートした。コントロール細胞は、培地のみと共にインキュベートした。
コラーゲン合成は、以下のようにして測定した。該培養した線維芽細胞を、0.5%の透析した子牛血清を補充したDMEM中で24時間予備的にインキュベートした。B-アミノプロピオニトリルフマレート(BAPN)を、最終的な濃度100μMにて含有する、3 uCi 2,3-3H-プロリンまたは3,4-3H-プロリン溶液で、図示されているように、10μMのアスコルビン酸の存在下(図2A)またはその不在下(図2B)にて、細胞を標識した。アスコルビン酸は、線維芽細胞中でのコラーゲン合成を促進し、かつ重要な刺激因子である。
【００６２】
24時間のインキュベーションの後、この反応を停止させ、コラーゲンを各ウエルから、ペプシン(最終濃度0.5mg/ml)を含有する、30μIの冷酢酸(0.5M)の添加によって抽出し、次いで室温にて4時間穏やかに攪拌した。遠心分離の後、細胞の破片を捨て、0.5M酢酸中にコラーゲンを溶解した溶液80μlを、各上澄に添加し、最終的コラーゲン濃度を約200mg/mlとした。0.5M酢酸中に5.2MのNaClを溶解した溶液0.4mlを添加することによって、各上澄からコラーゲンを沈殿させた。2時間放置した後、沈殿したコラーゲンを、15,000 rpmにて、15分間遠心分離処理することにより分離した。次に、得られたペレットを、1MのNaClを含む、pH 7.4の10mMトリス(TRIS)バッファー750μl中に再懸濁した。コラーゲンを、5MのNaClを含む、pH 7.4のトリスバッファー750μlの添加により沈殿させた。2時間後に、該コラーゲンを遠心分離によって分離し、0.5M酢酸溶液に再溶解し、かつ各サンプルをシンチレーションカウンターで測定した。結果を、ウエル当たりのcpmで、図2Aおよび2Bに示す。提示されたデータは、4つのサンプルに関する平均である。
【００６３】
タイプIおよびIIミクロスフェア両者は、アスコルビン酸の存在下(図2A)および不在下(図2B)何れにおいても、コントロール(未処理)線維芽細胞に見られたレベル以上に、コラーゲン合成を刺激できた。タイプIミクロスフェアは、アスコルビン酸の存在下において、タイプIIミクロスフェアに比して高い効果を有していたが、両タイプ共に、アスコルビン酸の不在下では、同様な効果を示した。タイプIIIミクロスフェアは、アスコルビン酸の存在下および不在下両者において、コラーゲン合成に及ぼす検出可能な効果を示さなかった。
特に興味深い発見の一つは、タイプIおよびIIミクロスフェア両者が、効果を示し、一方タイプIIIミクロスフェアは、その効果を示さなかったことにあり、この事実は、該ミクロスフェアの特定のサイズおよび材料が重要であることを意味している。更に、タイプIおよびIIミクロスフェア両者は、アスコルビン酸の不在下においても効果を示し、このことは、これら2つの型のミクロスフェアが、他の刺激因子の不在下においてさえ、コラーゲン合成を促進することを示す。従って、タイプIおよびIIミクロスフェア両者が、コラーゲン合成に対する実質的な刺激作用を持つことは、明白である。
【００６４】
実施例 4 ：ミクロスフェアの、筋原細胞の形状に及ぼす効果
ラット筋原細胞の一次細胞培養物を、上記実施例1に記載のようにして調製した。次に、細胞を、ポリスチレンミクロスフェアと共に(処理細胞)またはその不在下で(コントロール細胞)、48時間インキュベートした。次いで、細胞を、燐酸緩衝塩水(PBS)中の1%グルタルアルデヒドで、1-4日間固定し、かつPBSですすいだ。次に、細胞をPBS中の、1%タンニン酸および1%グアニジン塩酸(1：1比)の溶液に、1時間移した。検体を、1% OSO4中で1時間後-固定し、室温にて、段階的に変動する比率のエタノールおよびフロン(Freon) 113中で脱水した。次いで、検体をスライドに載せ、金で被覆し、2kVにて、JEOL T-300走査型電子顕微鏡で観察した。
図3A〜3Cは、筋原細胞の形状に及ぼす、本発明のミクロスフェアの効果を示す。図3Aの細胞は、該ミクロスフェア上で成長させたものであり、従ってその細胞表面の一部は、平坦と言うよりも、寧ろ凸状である。図3Bおよび3Cは、該ミクロスフェアが存在する、細胞の一部から、偽足が延びている細胞を示す。図3Cに示す細胞の該偽足は、特に顕著であり、これは該ミクロスフェアが明らかに筋原細胞の形状に影響していることを示す。更に、偽足の形成並びに広がりは、明らかに細胞骨格構造における変化を必要とし、このことは、該ミクロスフェアが、該細胞の細胞骨格にも影響することを立証している。このような偽足の形成は、細胞が該創傷領域に移動するために重要であると思われる。従って、該ミクロスフェアによるこのような偽足の刺激は、該創傷治癒過程におけるもう一つの重要な段階を促進する、その能力を示している。
【００６５】
実施例5：組成物および使用法
以下の説明は、創傷治癒のために、本発明の薬物を使用するための一般的なデバイスおよび方法に関する。該薬物、例えばミクロスフェアを、好ましくは治療すべき創傷に繰り返し適用する。その適用頻度およびその適用濃度は、症状の重度、および治療すべき対象の応答性に依存する。当業者は、容易に最適な濃度、投与方法および反復速度を決定することができる。本研究において、該ミクロスフェアは、ほぼ1日に一回、治療すべき創傷に適用されるが、勿論その他の適用頻度も可能である。
この方法は、該薬物、例えばミクロスフェアが実質的に不溶である、製薬上許容される担体中の該薬物を、治療すべき対象に投与する工程を含む。製薬上許容される担体の例は、薬物懸濁用の水性媒体、非水性媒体、例えば軟膏、クリームおよびエーロゾル-形成材料、並びに該薬物を含む媒体で浸されたあるいは該媒体を含む包帯を包含する。該包帯は、吸蔵性または非吸蔵性何れであっても良い。何れにしろ、製薬上許容される担体中に存在する該薬物は、薬物の分散液として記載できる。
【００６６】
該薬物は、効果的な投与法に従って、好ましくは予め定められた終点に至るまで、例えば該対象における臨床的な症状がなくなるまで、投与する。治療すべき創傷の閉塞が、このような終点の一例である。
本発明のデバイスは、一種以上の薬物と、該薬物用の製薬上許容される担体とを含む組成物と、該組成物を収容するための容器とを含む。適当な容器の例は、エーロゾル分配ポンプ、およびスプレイ缶を含む。当業者は、該組成物用の適当な容器を、容易に選択することができる。使用した特定のデバイスとは無関係に、ミクロスフェアなどの該薬物は、好ましくは２段階の手順で適用される。該ミクロスフェアをまず、浸漬、噴霧、塗布、洗浄または任意の他の適当な局所投与法により、該創傷に分散液として適用する。好ましくは、第二段階を開始する前に、30秒〜2分間の間隔を置いて、該創傷と該ミクロスフェアとの最初の接触を保証する。好ましくは、該第二段階は、吸蔵性または非吸蔵性の包帯、または該ミクロスフェアを含有する液状懸濁液に浸した他の適当なカバー材を、該創傷に適用することを含む。これは、該包帯またはカバー材による、該ミクロスフェアの吸収を実質的に減じまたは排除する。この方法は、以下の実施例に記載するように、創傷の治癒のために、ラットおよびヒト両者に使用した。
該懸濁液中の該ミクロスフェアは、凝集、融合、塊状化または不可逆的なケーキの形成を生じない。該ミクロスフェアは、時間の経過に伴って、幾分沈降するが、これらは穏やかな攪拌によって、容易に再懸濁する。
【００６７】
実施例 6 ：ミクロスフェアによる、ラット中の創傷治癒の促進
実施例1-4において上記したように、本発明のミクロスフェアは、創傷の治癒にとって重要な、種々のインビトロ細胞過程を促進する。しかし、インビトロおよびインビボ作用は、常に相関関係を持つ訳ではない。
従って、インビボ実験を行って、該ミクロスフェアが、ラットにおいて創傷治癒を促進する能力を、評価した。図4A-4Dに示すように、本発明のミクロスフェアは、明らかにラットにおける創傷治癒を促進する。図5は、該創傷面積が減少する速度のグラフであり、該グラフは、本発明のミクロスフェアが、このような減少を引き起こす速度を高めることを示している。最後に、表2は、本発明のミクロスフェアが、ラットにおける筋肉再生を促進することを示している。実験方法は、以下の通りであった。
【００６８】
体重300および400gの雄ウイスター(Wistar)ラットを、ネムブタール(5 mg/kg体重)によって麻酔をかけた。ケイ骨前方筋肉の側面部に、切除による傷を以下のようにして形成した。皮膚に長手方向の切開を行って、該ケイ骨前方筋肉を露出させた。次いで、該筋肉幅の約半分に渡り、筋肉線維の横方向の切断により、この筋肉の一部切除を行った。次に、この切除片を、該筋肉から切り取り、該筋肉に約5mm×5mmの溝を残した。全てのラットにおいて、同一の量の切除組織(80±10mg)を、該筋肉の同一の位置から取り去った。次に、該創傷領域を、処理ラットについては、塩水に分散した2μのポリスチレンミクロスフェアで手当てし、またコントロールラットについては、塩水のみで手当てした。この創傷の面積を、該傷の形成後、3〜15日間に渡って測定した。
図4A〜4Dは、上記のようにして調製した創傷領域の写真を示す。図4Aは、傷の形成直後の、コントロールラットの該創傷を示し、一方図4Bは、治療すべきラットの等価な創傷を示す。図4Cおよび4Dは、該傷形成の5日後の、同一のラットを示す。該コントロールラットの創傷は、塩水のみで処理したが、まだ完全には治癒していなかった。これとは対照的に、ミクロスフェアで治療した、該処理ラットの創傷は、完全に治癒していた。従って、本発明のミクロスフェアは、明らかに創傷の治癒をより迅速に促進する。
【００６９】
更に、図5は、本発明のミクロスフェアによる、創傷治癒の促進を示す。該コントロールラットの創傷は最終的には治癒したが、治療したラットの創傷よりも、著しく遅い治癒速度であった。従って、本発明のミクロスフェアは、明らかに該創傷領域が減少し、かつ該創傷が治癒する速度を増大する。
該創傷領域の生検パンチを作成することによって、組織学的分析用のスライドを調製した。傷の形成後4、5、6、7、8、9、13または14日目に、ラットを殺し、組織学的検査のために、生検を行った。該新たに形成されたまたは修復された筋肉線維に組み込まれた、特殊化された筋原細胞の数を、活性化された筋原細胞を表す、「新たな」核の数を測定することにより、計数した。これら細胞の核は、分散されたクロマチンを含む、大きな好塩基性核であり、既存の筋原細胞の核から容易に分化できる。結果を表2に与える。
【００７０】
【表２】
表2：ミクロスフェアによる、筋肉再生の促進
表2に示したように、本発明のミクロスフェアは、筋肉線維中の「新たな」またはそこに組み込まれた核の数によって測定されたように、明らかに筋肉の再生を促進した。インビボで処置されたラットから採取した組織学的サンプルについて、このような測定がなされたと言う事実は、また該ミクロスフェアが、インビボ並びにインビトロでの筋肉の再生を促進することを示している。最後に、図6は、組織培養培地および塩水を使用した、ラット内での、創傷の治癒に対する本発明のミクロスフェアの効果を比較したものである。上記のように、創傷は、ラット内で誘発され、かつ該ラットは塩水のみ (図6A)、組織培養培地のみ(図6B、x)、塩水＋ミクロスフェア(図6A)、または組織培養培地＋ミクロスフェア(図6B)で処理されていた。次いで、創傷を形成した後4日目に、写真撮影した。図6Aおよび6Bから理解されるように、該ミクロスフェアは、担体が塩水または、組織培養培地の何れであるかとは無関係に、より一層迅速な創傷治癒速度を誘発できた。かくして、組織培養培地は、本発明のミクロスフェアの、創傷の治癒に及ぼす効果の如何なる部分の原因でもなかった。
【００７２】
実施例 7 ：ミクロスフェアの毒性に関する研究
ミクロスフェアを含有する処方物の有害な効果は、何等観測されなかった。傷害を受けた後の、65および180日目の処理ラットの予備的な検査は、以下に列挙する器官の何れも、病理的な変化の徴候を示さないことを、明らかにした：心臓、肝臓、肺臓、腎臓、血管、胃、リンパ節および脳。
蛍光標識したミクロスフェアを用いた実験は、処理ラットには何の病理的な徴候も観測されないことを示した。更に、該ミクロスフェアは、上に列挙した器官の何れにも侵入しなかった。上に列挙した器官の何れにも新たな成長は観測されなかった。最後に、該ミクロスフェアは、該創傷領域に分散されたが、再生中の筋肉線維には侵入しなかった。
【００７３】
実施例 8 ：ヒトにおける創傷治癒に及ぼす、ミクロスフェアの効果
上記実施例6に記載したインビボ実験は、本発明のミクロスフェアが、ラットにおける創傷の治癒および筋肉の再生を促進することを立証している。更に、実施例7に記載した、ラットにおける毒性に関する研究結果は、該ミクロスフェアが、実質的に無毒であることを示す。従って、本発明のミクロスフェアがヒトの創傷治癒に及ぼす効果を決定するために、研究を行った。以下に詳しく説明するように、症例の研究は、該ミクロスフェアが、明らかにヒトにおける創傷の治癒を促進することを明らかにした。第一の症例研究は、左足に治癒できなかった潰瘍をもつ、66歳の婦人についてのものであった。この患者は、また左足のフレグモーネおよび両足に結節状構造の静脈を有していた。この患者の内側大腿上の潰瘍は、腐食性の塩素塩であるミルトン(Milton) 2%の水溶液で治療した。この患者の外側大腿上の潰瘍を、ポリスチレンから製造した、4.5μの本発明のミクロスフェアを、組織培養培地に分散した液で治療した。図7Aは、0日目のコントロール創傷を示し、一方図7Bは、治療開始後4ヶ月目の該コントロール創傷を示す。図7Cは、0日目の該治療した創傷を示し、一方図7Dは、治療開始後4ヶ月目の該治療された創傷を示す。本発明のミクロスフェアで治療した創傷およびミルトンで治療した創傷両者は、感染の徴候、およびその後の4ヶ月間の、その他の治癒の困難さを示した。しかし、この治療期間の終了時点において、ミクロスフェアで治療した創傷は、かなりの改善を示した。即ち、該創傷のサイズが減少し、該創傷は清浄で、感染の徴候は見られなかった。従って、感染などの合併症のために、治癒の困難な創傷についてさえも、本発明のミクロスフェアは、従来利用可能であった治療よりも、創傷の治癒促進において、高い有効性を示した。
【００７４】
更なる証拠として、上記図7のコントロールとしての該創傷(図7Aおよび7B)を、図7Cおよび7Dにおける創傷を治療するのに使用したものと同一のミクロスフェアで治療した。その結果を、図8Aおよび8Bに示す。図8Aは、ミクロスフェアで治療を開始した、0日目の創傷を示し、一方図8Bは、治療開始後21日目の該創傷を示す。明らかに、該創傷の程度は、このような短期間後においてさえ減少した。更に、該創傷は、表面的なものであり、清浄であり、かつ最早滲出物を形成しなかった。
第二の症例研究は、左大腿の前部に、一年にも及ぶ感染した創傷をもつ、52歳の女性に関する研究であった。この創傷を、1週間1%ミルトンで治療し、鮮創し、次いで10日間、図7および8における創傷を治療するのに使用したものと同一のミクロスフェアで治療した。図9Aは、治療0日目のこの創傷を示し、一方図9Bは、治療開始後10日の該創傷を示す。
【００７５】
10日後、該創傷は、大幅な改善を示した。該創傷は、図9Bから理解されるように、その程度において小さなサイズに減少し、清浄であり、かつ最早滲出物を生成しなかった。この創傷は、比較的短い治療期間では、完全には閉じられなかったが、その治癒効果は有意に改善された。
第三の症例研究は、工業的な作業所の事故における、化学薬品の溢れによる傷害を受けた、19歳の男性に関するものであった。問題となった化学薬品、サルフライド(sulfurides)は、重度の火傷を引き起こし、彼の首および右手の右側に、水疱を形成した。初めの2日間は、全ての創傷を、強い吸収性をもつヒドロゲルである、シルベロール(Silverol)で治療した。次に、右前腕上の創傷を、症例研究1および2のミクロスフェアで治療し、一方残りの創傷を、シルベロールで治療した。結果を、図10Aおよび10B(夫々0日目および5日目のコントロール創傷)、および図10Cおよび10D(夫々0日目および5日目の治療した創傷)に示す。
【００７６】
ミクロスフェアで治療を開始した後の５日目に、前腕の該治療した創傷の状態は、ミクロスフェアで治療されなかった、残りの創傷の状態と比較して、大幅に改善された。この前腕の創傷は、ミクロスフェアで治療を開始した5日後に、完全に治癒した。これとは対照的に、シルベロールで治療した該残りの創傷は、完全には治癒しなかった。従って、該ミクロスフェアは、明らかに創傷の治癒を促進した。このことは、従来の利用可能な治療法よりも、本発明の方法が著しく有効であることを立証している。
第四の症例研究は、熱浴による臀部の持続的な第2度の火傷を負った52歳の婦人に関するものであった。左臀部の創傷を、シルベロールで治療し、一方右臀部の創傷を、前の症例研究のミクロスフェアで治療した。結果を、ミクロスフェアで治療した創傷のみについて、図11A(治療の0日目)および図11B(治療の7日目)に示す。
【００７７】
治療開始の７日目に、ミクロスフェアで治療した、右臀部における創傷は、良好な表皮の成長を伴って、完全に治癒した。これに対して、シルベロールで治療した、左臀部の創傷は、完全には治癒せず、比較的緩慢に、閉じられた。従って、本発明のミクロスフェアは、従来の治療法よりも、より一層速い速度で、創傷の治癒を促進した。
第五の症例研究は、広範囲に及ぶ重度の日焼け(データは提示せず)を負った、28歳の女性に関するものであった。彼女を、前の症例研究のミクロスフェアで治療した。この患者は、不快感における大幅な軽減および該日焼けの迅速な治癒両者を報告した。かくして、本発明の方法およびデバイスで使用した、該ミクロスフェアは、不快感を緩和し、かつ創傷の治癒を促進できるが、この不快感の緩和は、直接的な無痛法と言うよりも寧ろ、該ミクロスフェアの高度な間接的効果によるものと思われることに、注目すべきである。
【００７８】
事実、上記患者の報告が、日焼けからの不快感における見掛けの低下を含むものと推定できるに過ぎないことは、述べておく価値がある。このような低い不快感は、恐らく神経刺激の伝達に対して直接的な効果を及ぼす、該ミクロスフェアの能力を立証しておらず、あるいは実際に不快な感覚に導く多くの因子の何れかを直接変更する、該ミクロスフェアの能力を立証していない。その代わりに、この効果は、恐らくかなり間接的なものであり、マクロファージの活性化の結果として起こるものと考えられ、更に抗-炎症性作用を有し、該患者による不快感の減少に導いたものと考えられる。
ラットに関する研究から得られた広範囲に渡る証拠と組み合わせた、これら５例の病歴から、本発明による薬物、例えばミクロスフェアの使用は、明らかに、これまでに利用可能な、従来の治療よりも、創傷治癒の促進および筋肉再生に対して、高い有効性をもつことが示された。本発明の方法並びにデバイスは、被験者により経験されたように、創傷の治癒並びに不快感の軽減を、促進し、加速し、かつ増強する。
【００７９】
この軽減された不快感に関連して、上記症例研究における患者、特に日焼けにかかった患者は、苦痛および治療した創傷からの不快感の局部的な軽減をも報告しており、これは恐らく該ミクロスフェアの抗-炎症作用(間接的な)を介する、該ミクロスフェアの間接的な効果によるものと考えられる、ことに注目すべきである。
最後に、データを提示しないが、シュードモナス(Pseudomonas)種による、該創傷の感染に対する、間接的な静菌作用も、ヒトにおいて認められた。この間接的な抗-炎症作用および該間接的な静菌作用両者に関するメカニズムは、明らかではないが、恐らくマクロファージの引き付けと活性化を含む、細胞的な作用の結果であると考えられる。その正確なメカニズムとは無関係に、本発明によるミクロスフェアの使用は、明らかに、創傷の治療において、有意な改善を示す。
【００８０】
実施例 9 ：放射線照射後かつ化学療法前の、創傷の治癒に及ぼすミクロスフェアの効果
本発明のミクロスフェアは、放射線療法を伴う、乳房根治切除術を受けた、患者における初期増加を誘発する。
段階IIの疾患をもつ、54歳の乳癌患者は、外科手術を受け、次いで放射線療法を受けた。この患者は、壊死性の病巣に侵され(図12A)、かつその進行性の広がりを防止するために、壊死性の創傷の閉塞が達成されるまで、1クールの化学療法を受けないように助言された。この患者を、54日間に渡り、1日当たり2度、ミクロスフェアで治療した。ミクロスフェアによる治療の21日後に、この患者の創傷は、改善され、該創傷が閉塞されるまで、化学療法が開始された(図12B-12D)。この患者は、1クールの化学療法を受けることができた。現在は、疾患から開放されている。かくして、本発明の組成物は、放射線療法および化学療法との組合わせとしての、創傷の治療において有用であった。
【００８１】
実施例 10 ：薬剤および生物学的製剤の存在下での、ミクロスフェア組成物
以下の実施例においては、該薬剤および/または生物学的製剤は、薬理的担体に可溶性であるが、該ミクロスフェアは不溶であり、かつミクロスフェアは、該治療組成物において懸濁状態に維持される。
a) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該組成物に抗生物質を添加して、感染を予防し、該抗生物質は、例えば約1-100mg/mlのネオマイシン硫酸、約100-1000単位/mlのバシトラシン、約10-100mg/mlのオキシテトラサイクリンHCl、または約1-10mg/mlのグラマシジンである。
b) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該組成物にタンパク分解酵素を添加して、病原的な創傷の酵素的な鮮創をもたらす。必要な場合には、例えば約10-100単位/mlのコラーゲナーゼまたはエラスターゼ、約10-100単位/mlのストレプトキナーゼまたは約10-100単位/mlのストレプトドルナーゼを添加する。
c) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該組成物に収斂薬を添加して、緊急用のまたは戦場用の治療組成物を得る。該収斂薬は、例えば約75-250mg/mlの明礬、約100-1000mg/mlのハマメリス葉(witch hazel)、約1-10%のポビドン-ヨウ素(povidine iodine)、酸素ベースとしての10-100mg/mlのオゾン、または10-100mg/mlの過酸化水素である。
d) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該組成物にジアミンを添加して、コラーゲンの架橋を防止する。該ジアミンは、例えば約1-50mg/mlのプトレシン、約1-100mg/mlのスペルミジン、または約1-150mg/mlのカダベリンである。
e) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該水性組成物に増殖因子を添加して、自然の治癒過程を増強し、かつ増殖を刺激する。該増殖因子は、例えば約10-100単位/mlのPGDF、PDAF、PDEGEまたはPF-4、約10-100単位/mlのFGF、約10-100単位/mlのEGF、約10-100単位/mlのTGF、または約10-100単位/mlのIGFである。
f) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該組成物に免疫増強剤を添加して、該創傷の治癒を刺激する。該免疫増強剤の例は、例えば約10-100mg/mlのL-アルギニン、約5-50mg/mlの一酸化窒素、約50-500mg/mlのクアドロール(quadrol)、約50-500mg/mlのムラミルジペプチド、約10-100mg/mlのマクロファージ活性化因子、または約1-10mg/mlのヒアルロン酸である。
【００８２】
g) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該組成物に金属イオンを添加する。該金属イオンの例は、例えば約1-10mg/mlの塩化亜鉛、約1-10mg/mlの亜鉛グルコネート、1-100mg/mlのマグネシウムグルコネート、約1-10mg/mlの銅塩またはペプチドである。
h) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、該組成物にビタミンを添加する。該ビタミンの例は、例えば約100-10単位/mlのビタミンA、約50-500mg/mlのビタミンC、または約50-500mg/mlのビタミンEである。
i) 治療用組成物は、上記第5.1章に記載したように、ミクロスフェアから製造されるが、緊急時または戦場で遭遇する外傷性創傷の治療のために、該組成物に鎮痛薬を添加する。該鎮痛薬の例は、例えば約5-50mg/mlのモルヒネ硫酸塩、約1-10mg/mlのクエン酸フェンタミル、または5-50mg/mlのリドカイン塩酸塩である。
j) 治療用組成物は、上記第5.1章記載したように、ミクロスフェアから製造される。該組成物は、放射線療法、レーザー療法、高圧療法またはオゾン療法との組合わせで投与される。
【００８３】
本発明の範囲は、本発明の個々の局面を単に説明するために記載した、上記の特定の態様により何等制限されず、機能的に等価な方法並びに成分は、本発明の範囲内に入る。実際に、本明細書に示されかつ記載されたものに加えて、本発明の種々の改良が、上記説明および添付図面から、当業者には明らかとなろう。このような改良は、本発明の範囲に入るものとする。
また、上記の特許請求の範囲は、ここに記載した本発明の上位のおよび具体的な特徴全ておよび用語上の問題として包含されると考えられる、本発明の範囲全ての記述を網羅するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のミクロスフェアの、クレアチニンホスホキナーゼ活性を高める能力を示すグラフである。
【図２】 本発明のミクロスフェアの、コラーゲン合成に及ぼす効果を示す、プロットである。
【図３】 図３A〜３Cは、本発明のミクロスフェアの、筋原細胞の形状に及ぼす効果を示す図である。
【図４】 図４A〜４Dは、本発明のミクロスフェアの、ラットにおける創傷の治癒を促進する能力を示すものである。
【図５】 図4の創傷領域が減少する速度を示す、グラフである。
【図６】 図６Aおよび６Bは、本発明のミクロスフェアの、ラットにおいて、組織培養培地および塩水と共に使用した場合の、創傷の治癒に及ぼす効果を比較したものである。
【図７】 図７A-７Dは、本発明のミクロスフェアの、第一のヒト症例研究における、創傷の治癒の促進に及ぼす能力を立証するものである。
【図８】 図８Aおよび８Bは、図７Aおよび７Dのヒト症例研究における、本発明の有効性を更に立証するものである。
【図９】 図９Aおよび９Bは、第二のヒト症例研究における、本発明の有効性を立証するものである。
【図１０】 図10A〜10Dは、第三のヒト症例研究における、本発明の有効性を示すものである。
【図１１】 図11Aおよび11Bは、第四のヒト症例研究における、本発明の有効性を示すものである。
【図１２】 図12A〜12Dは、放射線療法および化学療法との組合わせで実施した場合の、対象における本発明の効果を説明するものである。
Claims (5)
- 創傷治療用組成物を、創傷表面上に注ぎ、かつ塗布することができる、該組成物を保存し、混合するための包装内に収容された創傷治療用組成物であって、該組成物が、0.001-25重量%のミクロスフェアを懸濁状態で含み、該ミクロスフェアが、0.18μm〜10.85μmの範囲内の直径をもち、該ミクロスフェアが、細胞膜と多点接触を形成することができ、かつ該ミクロスフェアが、治療期間中、生分解性ではなく、また該組成物は、該ミクロスフェアに対する、製薬上許容される担体をも含み、該ミクロスフェアが、該担体中に不溶であり、該ミクロスフェアが、カルボキシル、スルフェート又はアミノ表面基を有するポリスチレンで製造されていることを特徴とする、上記創傷治療用組成物。
- 該製薬上許容される担体が、水性媒体、エーロゾル担体、薬剤用の水性溶剤、生物学的製剤用の水性溶剤、軟膏および包帯からなる群から選択される、請求項1記載の創傷治療用組成物。
- 更に、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ゲンタマイシン、ネオマイシン硫酸塩、バシトラシン、ポリミキシンB硫酸塩およびグラマサイクリンからなる群から選択される抗生物質を含む、請求項１記載の創傷治療用組成物。
- 更に、
抗ヒスタミン剤、
抗炎症剤、
抗癌剤、
抗ウイルス剤、
抗真菌剤、
亜鉛、マグネシウム、コバルト、鉄、銅およびマンガンからなる群から選択される金属イオン、
収斂薬、
リドカイン、プロカミンおよびエピネフリンからなる群から選択される麻酔薬、
苦痛治療用のモルヒネ、ヘロインおよびフェンタニールからなる鎮痛薬、
シクロオキシゲナーゼ-2阻害剤、
ビタミン、
アミノ酸、
コラーゲン、
PDGF、PDAF、PDEGF、TGFB、PF-4、αFGF、BFGF、GH、EGFおよびIGFからなる群から選択される増殖因子、
タンパク分解酵素、
一種以上の基質細胞、
L-アルギニン、一酸化窒素、クアドロール、ムラミルジペプチドおよびその他のマクロファージ活性化因子からなる群から選択される免疫促進剤、及び
ヒアルロン酸
からなる群から選ばれる薬理剤をも含む、請求項1記載の創傷治療用組成物。 - 容器を含み、該容器がミクロスフェアおよび製薬上許容される該ミクロスフェア用の担体を含む、創傷治療用組成物を保持し、該ミクロスフェアが、0.18μm〜10.85μmの範囲内の直径をもち、該ミクロスフェアが細胞膜との多点接触を形成でき、かつ該ミクロスフェアが、治療期間中に非-生分解性であり、該ミクロスフェアが、該担体中に不溶であり、該ミクロスフェアが、カルボキシル、スルフェート又はアミノ表面基を有するポリスチレンで製造されていることを特徴とする、デバイス。
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