KR20230103530A - 카텝신-절단성 펩타이드로 가교된 염증 상태-특이적 약물 방출 하이드로겔 - Google Patents

카텝신-절단성 펩타이드로 가교된 염증 상태-특이적 약물 방출 하이드로겔 Download PDF

Info

Publication number
KR20230103530A
KR20230103530A KR1020210194471A KR20210194471A KR20230103530A KR 20230103530 A KR20230103530 A KR 20230103530A KR 1020210194471 A KR1020210194471 A KR 1020210194471A KR 20210194471 A KR20210194471 A KR 20210194471A KR 20230103530 A KR20230103530 A KR 20230103530A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hydrogel
ifrep
gel
drug
cathepsin
Prior art date
Application number
KR1020210194471A
Other languages
English (en)
Inventor
오승자
김상헌
이강원
김혜림
Original Assignee
한국과학기술연구원
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원, 서울대학교산학협력단 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to KR1020210194471A priority Critical patent/KR20230103530A/ko
Publication of KR20230103530A publication Critical patent/KR20230103530A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 출원은 카텝신-절단성 펩타이드로 가교된 염증 상태-특이적 약물 방출 하이드로겔 및 이의 용도에 관한 것으로서, 염증 상태-특이적으로 약물의 방출을 조절할 수 있는 하이드로겔, 이를 포함하는 항염증용, 피부 재생 또는 상처 치료용, 또는 약물 전달용 조성물, 및 상기 하이드로겔을 제조하는 방법을 제공한다. 특히, 일 양상에 따른 하이드로겔에 의하면, 대식세포의 후성유전적 조절을 위한 약물의 효과를 극대화할 수 있으며, 이로 인해, 현저히 우수한 항염증, 세포 재생, 및 상처 치료 효과를 나타낼 수 있다.

Description

카텝신-절단성 펩타이드로 가교된 염증 상태-특이적 약물 방출 하이드로겔{Inflammatory state-specific drug release hydrogels cross-linked with cathepsin-cleavable peptides}
카텝신-절단성 펩타이드로 가교된 염증 상태-특이적 약물 방출 하이드로겔에 관한 것이다.
염증의 효과적인 해결은 질병의 진행을 예방하고 치유를 촉진하는 데 기여한다. 과거에는 대부분의 연구가 염증 감소에 중점을 두었지만, 최근에는 친염증과 항염증 사이의 적절한 전환이 조직 재생에 더 효과적이라는 연구 결과가 보고되면서 시기적절한 염증 조절이 더욱 중요해졌다.
상처 치유 과정에서 대식세포의 가소성, 즉 M1-M2 전환은 급성 염증 반응에서 염증 과정의 해결 단계로의 전환을 제어하는 핵심 요소이다. 후성유전적 조절은 대식세포의 가소성을 조절하는 표적 특이성과 가역성을 가진 강력한 효능 때문에 대식세포의 표현형을 변경하는 효과적인 전략이 될 수 있다. 따라서 대식세포의 후성유전적 조절을 통해 염증 반응을 완화하는 것은 임상 적용에서 새로운 치료 전략이 될 수 있다. 그러나 후성유전적 조절을 위한 약물은 반감기가 매우 짧고 후성유전체가 환경에 따라 민감하게 조절되기 때문에, 상기 후성유전적 조절을 위한 약물은 시기적절하게 후성유전체에 전달되어야만 목적하는 효과를 극대화시킬 수 있다. 따라서 대식세포의 효과적인 후성유전적 조절을 통해 염증을 조절하기 위해서는 염증 상태 특이적으로 적시에 약물을 대식세포에 전달할 수 있는 약물 전달 시스템이 필요하다.
하이드로겔은 높은 수분 함량, 다공성 구조, 세포외 기질과의 유사성으로 인하여 높은 생체적합성을 갖는다. 이러한 특성들로 인하여 약물 전달 시스템이나 조직공학 등과 같은 바이오메디컬 분야에서 광범위하게 연구되고 있다 (한국 등록특허 10-2180045).
그러나, 염증 상태 특이적으로 약물을 방출할 수 있는 약물 전달 시스템에 대한 연구는 부족한 실정이다.
일 양상은 생체적합성 고분자를 가교제로 가교시켜 형성된 하이드로겔로서, 상기 하이드로겔 내부에 약물이 봉입되어 있고, 상기 가교제는 카텝신 (cathepsins)에 의해 분해 또는 절단되는 펩타이드를 포함하는 것인, 하이드로겔을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 하이드로겔을 포함하는 약물 전달용 조성물, 항염증용 약제학적 조성물, 항염증용 피부 외용제 조성물, 또는 피부 재생 또는 상처 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 (1) 생체적합성 고분자와 용매를 혼합하는 제1단계; (2) 상기 제1단계를 통하여 얻어진 혼합물에 약물을 혼합하는 제2단계; (3) 상기 제2단계를 통하여 얻어진 혼합물에 자외선 개시제 및 가교제를 혼합하는 제3단계; 및 (4) 상기 제3단계를 통하여 얻어진 혼합물에 자외선을 조사하여 가교시키는 제4단계를 포함하고, 상기 가교제는 카텝신 (cathepsins)에 의해 분해 또는 절단되는 펩타이드를 포함하는 것인, 상기 하이드로겔을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상은 생체적합성 고분자 및 카텝신 (cathepsins)에 의해 분해 또는 절단되는 펩타이드를 포함하는 하이드로겔을 제공한다. 구체적으로, 상기 하이드로겔은, 상기 생체적합성 고분자가 상기 카텝신 (cathepsins)에 의해 분해 또는 절단되는 펩타이드로 가교되어 형성된 것이고, 상기 하이드로겔 내부에는 약물이 봉입되어 있는 것일 수 있다.
즉, 상기 하이드로겔은 생체적합성 고분자를 가교제로 가교시켜 형성된 하이드로겔로서, 상기 하이드로겔 내부에 약물이 봉입되어 있고, 상기 가교제는 카텝신 (cathepsins)에 의해 분해 또는 절단되는 펩타이드를 포함하는 것인, 하이드로겔일 수 있다.
상기 카텝신에 의해 분해 또는 절단되는 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 생체적합성 고분자는 히알루론산 (hyaluronic acid), 폴리감마글루탐산 (poly-γ-glutamic acid), 셀룰로오스 (cellulose), 폴리아크릴산 (polyacrylic acid), 폴리아미노산 (polyamino acid), 및 알지네이트 (alginate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 따르면, 상기 생체적합성 고분자는 노르보르넨 (norbornene)과 연결되어 있는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 생체적합성 고분자의 카르복실기와 노르보르넨이 광개시 클릭 화학 반응 (photo-initiative click chemistry)에 의해 연결되어 있는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 하이드로겔은, 상기 생체적합성 고분자에 연결된 노르보르넨이 상기 가교제 (구체적으로는, 상기 카텝신에 의해 분해 또는 절단되는 펩타이드)와 연결됨으로써, 상기 생체적합성 고분자의 가교결합이 형성된 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 생체적합성 고분자에 연결된 노르보르넨과 상기 가교제 (구체적으로는, 상기 카텝신에 의해 분해 또는 절단되는 펩타이드)는 상기 가교제의 티올기와 상기 노르보르넨 사이에서의 Thiol-ene 반응에 의해 연결된 것일 수 있다.
상기 하이드로겔은 상기 생체적합성 고분자가 상기 카텝신에 의해 분해 또는 절단되는 펩타이드로 가교되어, 네트워크 구조 (망상 구조)를 가지며, 상기 약물은 상기 네트워크 구조 내부에 봉입되어 있는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 가교제가 카텝신에 의해 분해 또는 절단되면, 상기 약물이 상기 하이드로겔 외부로 방출되는 것일 수 있다. 즉, 가교제로서 기능을 하는, 상기 카텝신에 의해 분해 또는 절단되는 펩타이드가 카텝신에 의해 분해 또는 절단되면, 상기 하이드로겔의 가교결합이 손상 또는 파괴되면서, 네트워크 구조 (망상 구조)가 손상 또는 파괴될 수 있고, 이로 인해, 상기 하이드로겔의 내부에 봉입되어 있던 약물이 외부로 방출되는 것일 수 있다.
따라서, 상기 하이드로겔은 카텝신 존재 하에 또는 카텝신과 접촉하는 경우 또는 카텝신에 노출되는 경우, 특이적으로 상기 약물을 방출하는 것일 수 있다. 상기 카텝신은 염증 반응시, 대식세포로부터 발현 또는 분비되는 효소이다. 결국, 상기 하이드로겔은 염증 병변에서 또는 염증 환경에 노출되는 경우 또는 염증 환경과 접촉하는 경우 특이적으로 상기 약물을 방출할 수 있다. 상기 염증은 생체 내에 존재하는 것일 수 있고, 구체적으로는 피부 내 또는 피부 표면에 존재하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 하이드로겔은 염증 진행 정도에 따라 약물 방출 정도가 다르므로 염증 진행 상태에 따라 약물 방출을 조절할 수 있다. 구체적으로, 일 구체예에 따르면, 상기 하이드로겔은 정상 환경 또는 활성화된 카텝신의 농도가 낮은 환경에서는 약물의 방출이 지연되고 약물을 외부 환경으로부터 보호하는 반면, 염증 환경에 노출되었을 때만 특이적으로 약물을 방출시키고, 특히, 활성화된 카텝신의 농도가 높은 단계 즉, 급성 염증 단계에서 그 이후의 증식 단계까지 약물을 지속적으로 방출시킬 수 있다. 결과적으로, 일 구체예에 따르면, 상기 하이드로겔은 염증 반응의 전 과정에서 치료 효율을 높일 수 있는 가장 적절한 시기에 활성이 유지된 약물이 방출되도록 조절할 수 있고, 이로 인해 약물 (특히, 대식세포의 후성유전적 조절을 위한 약물)의 효과를 극대화할 수 있으며, 현저히 우수한 항염증, 세포 재생 (구체적으로는, 각질 세포의 이동 및 증식 촉진), 및 상처 치료 효과를 나타낼 수 있다.
상기 카텝신에 의해 분해 또는 절단되는 펩타이드는, 카텝신에 의해 가수분해되어 펩티드 결합이 파괴되는 것에 의해, 카텝신에 의해 분해 또는 절단되는 것일 수 있다.
상기 약물은 항염증 효과를 나타내거나, 상처 치료에 도움이 되는 약물로써, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 약물은 항생제, 상처치유촉진제, 소독제, 국소마취제, 소염제 등일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 약물은 대식세포의 후성유전적 조절을 통해 항염증 효과를 나타내는 약물일 수 있다. 상기 약물은 BRD4 (bromodomain-containing protein 4)의 억제제인 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로는, 상기 약물은 JQ1 (thienotriazolodiazepine)인 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 JQ1은 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00001
.
상기 하이드로겔에 봉입된 약물의 평균중량분자량은 약 600 내지 10,000 g·mol-1인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 약물의 평균중량분자량은 약 600 내지 8,000 또는 600 내지 5,000 g·mol-1인 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 약물의 평균중량분자량이 약 600 g·mol-1 미만인 경우, 상기 약물이 봉입된 하이드로겔은, 카텝신이 존재하는 염증 환경뿐만 아니라 정상 환경에서도 약물이 방출될 수 있어서, 약물 방출에 있어서 염증 상태에 대한 특이성이 감소할 수 있고, 상기 약물의 평균중량분자량이 약 10,000 g·mol-1 초과인 경우, 상기 약물이 봉입된 하이드로겔은, 약물 봉입 효율이 감소하거나 봉입된 약물의 방출량이 감소하여 항염증 효과가 감소할 수 있다.
상기 하이드로겔에는, 상기 가교제가 몰농도로 약 3 mM 이상 포함되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 하이드로겔에는, 상기 가교제가 몰농도로 약 3 내지 50, 3 내지 40, 3 내지 30, 3 내지 20, 3 내지 10, 또는 3 내지 5 mM 포함되는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 하이드로겔에 포함된 상기 가교제의 몰농도가 약 3 mM 미만인 경우, 상기 하이드로겔의 네트워크 밀도, 단단함 등의 기계적 특성이 감소하여, 상기 하이드로겔은 카텝신이 존재하는 염증 환경뿐만 아니라 정상 환경에서도 약물이 방출될 수 있고, 이로 인해 약물 방출에 있어서 염증 상태에 대한 특이성이 감소할 수 있고, 상기 하이드로겔에 포함된 상기 가교제의 몰농도가 약 50 mM을 초과하는 경우, 상기 하이드로겔은, 약물 봉입 효율이 감소하거나 봉입된 약물의 방출량이 감소하여 항염증 효과가 감소할 수 있다.
상기 하이드로겔의 Young의 계수 값은 약 3 내지 20 kPa일 수 있다. 구체적으로는, 상기 하이드로겔의 Young의 계수 값은 약 5 내지 20, 10 내지 20, 또는 13 내지 17 kPa일 수 있다. 상기 Young의 계수 값 또는 영률 (Young's modulus, Young modulus)은 고체 재료의 강성을 측정하는 역학적 특성을 의미한다.
다른 양상은 상기 하이드로겔을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 하이드로겔을 포함하는 항염증용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 하이드로겔을 포함하는 항염증용 약제학적 조성물 및 피부 재생 또는 상처 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 염증 병변에서 또는 염증 환경에 노출되는 경우 또는 염증 환경과 접촉하는 경우 특이적으로 상기 하이드로겔 내부에 봉입된 약물을 방출할 수 있다.
용어 "피부 외용제"란, 피부에 적용하는 조성물 전반을 포괄하는 개념이고, 예를 들어, 화장료 및 연고제, 크림제, 로션제 등 의약품 및 의약부외품을 포함한 국소 투여용 약학 조성물 등을 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물, 상처 드레싱 조성물, 패치 드레싱 조성물, 패치 드레싱 시트 조성물 등을 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물은 상기 하이드로겔과 희석제, 담체 등과 같은 다른 성분들을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 약제학적 조성물에는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제, 또는 이들의 조합이 필요에 따라 포함될 수 있다.
상기 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 약제학적 조성물은 비경구 (예컨대, 국소 투여, 경피 투여, 주사 투여 등)로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우 바람직하게는 상처 또는 창상 (wound), 또는 염증 부위에 직접 투여할 수 있다.
상기 상처 또는 창상 (wound)은 생체가 손상된 상태를 말하는 것으로서, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관, 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴된 병리학적 상태를 포괄할 수 있다. 구체적으로 상기 상처 또는 창상은 좌상 (contusion or bruise), 열상 (laceration), 결출상 (avulsion), 관통상 (penetrated wound), 비-치유 외상성 창상, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 찰과상 (abrasion), 골괴저, 총상 (gun shot wound), 절상, 화상, 동상, 피부궤양, 피부 건조, 피부각화증, 갈라짐, 터짐, 피부염, 피부사상균증에 의한 통증, 수술상, 혈관질환 창상, 각막창상 등의 창상, 욕창, 와창, 당뇨병, 또는 순환불량에 관련된 상태, 만성궤양, 성형수술 후 봉합부위, 척추상해성 창상, 부인과적 창상, 화학적 창상, 또는 여드름 등의 개체의 일부에 대한 손상을 포괄적으로 의미할 수 있다.
상기 피부 재생은 표피 재생, 진피 재생, 피부부속기관 재생 등을 포함할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 상기 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 mg/kg (체중) 내지 1000 g/kg (체중)일 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제, 겔제, 또는 패치 형태일 수도 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "치료"란 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 질병의 진행을 중단, 지연 또는 완화시키는 것을 의미한다.
상기 조성물에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 하이드로겔에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 하이드로겔에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
또 다른 양상은 (1) 생체적합성 고분자와 용매를 혼합하는 제1단계; (2) 상기 제1단계를 통하여 얻어진 혼합물에 약물을 혼합하는 제2단계; (3) 상기 제2단계를 통하여 얻어진 혼합물에 자외선 개시제 및 가교제를 혼합하는 제3단계; 및 (4) 상기 제3단계를 통하여 얻어진 혼합물에 자외선을 조사하여 가교시키는 제4단계를 포함하고, 상기 가교제는 카텝신 (cathepsins)에 의해 분해되는 펩타이드를 포함하는 것인, 상기 하이드로겔을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 제2단계에서, 혼합된 상기 약물의 평균중량분자량은 약 600 내지 10,000 g·mol-1인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 약물의 평균중량분자량은 약 600 내지 8,000 또는 600 내지 5,000 g·mol-1인 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 약물의 평균중량분자량이 약 600 g·mol-1 미만인 경우, 상기 방법에 의하여 제조된, 상기 약물이 봉입된 하이드로겔은, 카텝신이 존재하는 염증 환경뿐만 아니라 정상 환경에서도 약물이 방출될 수 있어서, 약물 방출에 있어서 염증 상태에 대한 특이성이 감소할 수 있고, 상기 약물의 평균중량분자량이 약 10,000 g·mol-1 초과인 경우, 상기 방법에 의하여 제조된, 상기 약물이 봉입된 하이드로겔은, 약물 봉입 효율이 감소하거나 봉입된 약물의 방출량이 감소하여 항염증 효과가 감소할 수 있다.
상기 제3단계에서, 상기 가교제는 상기 하이드로겔에 몰농도로 약 3 mM 이상, 약 3 내지 50 mM, 약 3 내지 40 mM, 약 3 내지 30 mM, 약 3 내지 20 mM, 약 3 내지 10 mM, 또는 약 3 내지 5 mM의 농도로 포함되도록 혼합되는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 방법에 의하여 제조된 하이드로겔에 포함된 상기 가교제의 몰농도가 약 3 mM 미만인 경우, 상기 하이드로겔의 네트워크 밀도, 단단함 등의 기계적 특성이 감소하여, 상기 하이드로겔은 카텝신이 존재하는 염증 환경뿐만 아니라 정상 환경에서도 약물이 방출될 수 있고, 이로 인해 약물 방출에 있어서 염증 상태에 대한 특이성이 감소할 수 있고, 상기 방법에 의하여 제조된 하이드로겔에 포함된 상기 가교제의 몰농도가 약 50 mM을 초과하는 경우, 상기 하이드로겔은, 약물 봉입 효율이 감소하거나 봉입된 약물의 방출량이 감소하여 항염증 효과가 감소할 수 있다.
상기 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 하이드로겔 및 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 하이드로겔 및 조성물에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 하이드로겔에 의하면, 염증 상태 (구체적으로는, 활성화된 카텝신) 특이적으로 약물의 방출을 조절할 수 있다. 구체적으로, 상기 하이드로겔에 포함된 카텝신-절단성 펩타이드 가교제는 염증 반응의 바이오마커인 활성화된 카텝신에 의해 분해 또는 절단될 수 있고, 이로 인해 상기 하이드로겔을 구성하는 생체적합성 고분자의 가교결합이 손상 또는 파괴됨으로써 하이드로겔 내부에 봉입된 약물이 방출될 수 있다. 이로 인해, 일 양상에 따른 하이드로겔은 정상 환경 또는 활성화된 카텝신의 농도가 낮은 환경에서는 약물의 방출이 지연되고 약물을 외부 환경으로부터 보호하는 반면, 염증 환경에 노출되었을 때만 특이적으로 약물을 방출시키고, 특히, 활성화된 카텝신의 농도가 높은 단계 즉, 급성 염증 단계에서 그 이후의 증식 단계까지 약물을 지속적으로 방출시킬 수 있다. 결과적으로 일 양상에 따른 하이드로겔에 의하면, 염증 반응의 전 과정에서 치료 효율을 높일 수 있는 가장 적절한 시기에 활성이 유지된 약물이 방출되도록 조절할 수 있고, 이로 인해 약물 (특히, 대식세포의 후성유전적 조절을 위한 약물)의 효과를 극대화할 수 있으며, 현저히 우수한 항염증, 세포 재생, 및 상처 치료 효과를 나타낼 수 있다.
도 1a는 M0 및 M1 유사 대식세포에서의 카텝신의 발현 수준을 유전자 수준에서 측정한 결과를 나타낸 도이고, 도 1b는 M0 및 M1 유사 대식세포에서 분비된 카텝신의 활성화 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이고, 도 1c는 마우스에 상처 부상을 유도한 후, TNF-α, iNOS, 및 IL1β의 발현 수준을 유전자 수준에서 측정한 결과를 나타낸 도이고, 도 1d는 마우스에 상처 부상을 유도한 후, 카텝신의 발현 수준을 유전자 수준에서 측정한 결과를 나타낸 도이고, 도 1e는 마우스에 상처 부상을 유도한 후, 염증성 M1 대식세포 (CD11b+iNOS+ 양성 세포) 및 분비된 TNF-α 단백질에 대한 면역형광 염색 결과를 나타낸 도 (상단) 및 상기 면역형광 염색 결과를 정량화한 도 (하단)이고, 도 1f는 마우스에 상처 부상을 유도한 후, 카텝신의 발현 수준을 단백질 수준에서 측정한 면역형광 염색 결과를 나타낸 도 (상단) 및 상기 면역형광 염색 결과를 정량화한 도 (하단)이다.
도 2는 일 양상의 노르보르넨이 접합된 알지네이트 (Norbornene-conjugated alginate: Nor_Alg)에 대하여 1H-NMR을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 일 양상의 카텝신-절단성 펩타이드 가교제와 Nor_Alg의 노르보르넨의 연결에 의해 Nor_Alg 고분자간 가교결합이 형성된 하이드로겔 (IFRep 겔)의 구조를 모식화한 도이다.
도 4a는 일 양상의 IFRep 겔의 저장 탄성률 (G', full dots) 및 손실 탄성률 (G'', empty dots)을 측정한 결과를 나타낸 도이고, 도 4b는 일 양상의 IFRep 겔의 점성 (viscosity)을 측정한 결과를 나타낸 도이고, 도 4c는 일 양상의 IFRep 겔의 Young의 계수 값을 측정한 결과를 나타낸 도이고, 도 4d는 일 양상의 IFRep 겔의 SEM 측정 결과를 나타낸 도이고, 도 4e는 일 양상의 IFRep 겔의 팽윤 속도 (swelling rate)를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5a는 일 양상의 IFRep 겔의 섬유아세포 대한 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 도이고, 도 5b는 일 양상의 IFRep 겔의 대식세포 대한 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6a는 일 양상의 형광 염료인 덱스트란이 봉입된 IFRep 겔을 M1 유사 대식세포가 배양된 조절 배지 (M1 CM) 및 대조군 배지 각각에서 인큐베이션한 후 방출되는 형광을 IVIS를 통해 측정한 결과를 나타낸 도 (상단) 및 상기 형광 측정 결과를 정량화한 도 (하단)이고, 도 6b는 일 양상의 형광 염료인 덱스트란이 봉입된 IFRep 겔을 M0 및 M1 유사 대식세포가 배양된 조절 배지 (M0 CM 및 M1 CM), 대조군 배지, 및 PBS 각각에서 인큐베이션한 후 방출되는 형광을 IVIS를 통해 측정한 결과를 나타낸 도 (상단) 및 상기 형광 측정 결과를 정량화한 도 (하단)이다.
도 7a는 일 양상의 형광 염료인 Cy7-CA이 봉입된 IFRep 겔을 M0 CM, M1 CM, 및 대조군 배지 각각에서 인큐베이션한 후 방출되는 형광을 IVIS를 통해 측정한 결과를 나타낸 도 (상단) 및 상기 형광 측정 결과를 정량화한 도 (하단)이고, 도 7b는 일 양상의 형광 염료인 Cy7-CA이 봉입된 IFRep 겔을 카텝신 포함 배지 및 PBS 각각에서 인큐베이션한 후 방출되는 형광을 IVIS를 통해 측정한 결과를 나타낸 도 (상단) 및 상기 형광 측정 결과를 정량화한 도 (하단)이다.
도 8a는 일 양상의 JQ1이 봉입된 IFRep 겔을 M0 CM, M1 CM, 및 대조군 배지 각각에서 인큐베이션한 후 JQ1의 방출 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이고, 도 8b는 일 양상의 JQ1이 봉입된 IFRep 겔을 카텝신 포함 배지, 카텝신 및 카텝신 억제제 포함 배지, 및 PBS 각각에서 인큐베이션한 후 JQ1의 방출 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 9a는 일 양상의 IFRep 겔을 M1 대식세포에 노출시킨 후, M1 대식세포에서의 Nrf2의 핵 전위를 측정한 결과를 나타낸 도이고, 도 9b는 일 양상의 IFRep 겔을 M1 대식세포에 노출시킨 후, M1 대식세포에서의 항산화 관련 인자 (HO-1, SOD1, 및 NQO1)의 발현 수준을 유전자 수준에서 측정한 결과를 나타낸 도이고, 도 9c는 일 양상의 IFRep 겔을 M1 대식세포에 노출시킨 후, ROS 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이고, 도 9d는 일 양상의 IFRep 겔을 M1 대식세포에 노출시킨 후, M1 대식세포에서의 염증성 마커 (TNF-α, IL6, IL1β, 및 CD197)의 발현 수준을 유전자 수준에서 측정한 결과를 나타낸 도이고, 도 9e는 일 양상의 IFRep 겔을 M1 대식세포에 노출시킨 후, M1 대식세포에서 분비된 염증성 마커 (TNF-α 및 IL1β)의 발현 수준을 단백질 수준에서 측정한 결과를 나타낸 도이다 (IFRep gel: 약물이 봉입되지 않은 IFRep 겔; IFRep gel_JQ1: JQ1이 봉입된 IFRep 겔; NIFRep gel_JQ1: JQ1이 봉입된 비염증반응성 하이드로겔).
도 10a는 일 양상의 IFRep 겔을 마우스의 상처 부위에 적용한 후, 상처 부위의 봉합 수준을 확인한 결과를 나타낸 도이고, 도 10b는 일 양상의 IFRep 겔을 마우스의 상처 부위에 적용한 후, 상처 부위의 재상피화 수준을 확인한 H&E 염색 결과를 나타낸 도 (상단) 및 진피 두께를 측정한 결과를 나타낸 도 (하단)이고, 도 10c는 일 양상의 IFRep 겔을 마우스의 상처 부위에 적용한 후, 상처 부위의 성숙 콜라겐 침착 수준을 확인한 Herovici 염색 결과를 나타낸 도 (상단) 및 상기 Herovici 염색 결과를 정량화한 도 (하단)이고, 도 10d는 일 양상의 IFRep 겔을 마우스의 상처 부위에 적용한 후, 상처 부위의 각질세포 분포를 확인한 cytokeratin 10의 면역형광 염색 결과를 나타낸 도이고, 도 10e는 일 양상의 IFRep 겔을 마우스의 상처 부위에 적용한 후, 상처 부위의 iNOS 양성 대식세포 및 CD206 양성 대식세포를 확인한 면역형광 염색 결과를 나타낸 도이고, 도 10f는 일 양상의 IFRep 겔을 마우스의 상처 부위에 적용한 후, 염증 관련 인자 (TNF-α, IL1β, iNOS) 및 항염증 관련 인자 (Arg1)의 발현 수준을 유전자 수준에서 측정한 결과를 나타낸 도이다 (IFRep gel: 약물이 봉입되지 않은 IFRep 겔; IFRep gel_JQ1: JQ1이 봉입된 IFRep 겔; NIFRep gel_JQ1: JQ1이 봉입된 비염증반응성 하이드로겔).
도 11a는 일 양상의 IFRep 겔을 마우스의 상처 부위에 적용한 후, 상처 부위의 M1 대식세포 (CD11b+iNOS+ 양성 세포)를 확인한 면역형광 염색 결과를 나타낸 도 (상단) 및 상기 면역형광 염색 결과를 정량화한 도 (하단)이고, 도 11b는 일 양상의 IFRep 겔을 마우스의 상처 부위에 적용한 후, 상처 부위의 M2 대식세포 (CD11b+CD206+ 양성 세포)를 확인한 면역형광 염색 결과를 나타낸 도 (상단) 및 상기 면역형광 염색 결과를 정량화한 도 (하단)이고, 도 11c는 일 양상의 IFRep 겔을 마우스의 상처 부위에 적용한 후, 각질세포 활성화 마커 (HB-EGF, CYR61, 및 SDC4)의 발현 수준을 유전자 수준에서 측정한 결과를 나타낸 도이다 (IFRep 4mM only: 약물이 봉입되지 않은 IFRep 겔 (카텝신-절단성 펩타이드 가교제 함유 농도: 약 4 mM); IFRep 4mM_JQ1: JQ1이 봉입된 IFRep 겔 (카텝신-절단성 펩타이드 가교제 함유 농도: 약 4 mM); IFRep 1mM_JQ1: JQ1이 봉입된 IFRep 겔 (카텝신-절단성 펩타이드 가교제 함유 농도: 약 1 mM); NIFRep 4mM_JQ1: JQ1이 봉입된 비염증반응성 하이드로겔 (poly (ethylene glycol), Α,Ω-bis(thiol)-terminated crosslinker 가교제 함유 농도: 약 4 mM)).
이하 본 발명을 실험예 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실험예 및 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 명세서에서 특별한 정의가 없으면, 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 수 있다.
참고예: 실험 방법
IFRep 겔의 기계적 특성 분석
IFRep 겔의 유동학은 레오미터 (Anton Paar)를 사용하여 분석되었다. 측정은 실온에서 약 0.1% 변형률에서 약 0.1 내지 100 rad s-1의 진동 주파수에서 수행되었다. 저장 탄성률 (storage modulus, G') 및 손실 탄성률 (loss modulus, G'')은 기기의 소프트웨어에 의해 계산되었다. 또한, Instron 5900 (Instron Corporation, USA)을 사용하여 IFRep 젤의 강성을 분석하였다. 하이드로겔을 약 20% 높이로 압축하여 응력 변형률 곡선을 측정하고 응력-변형률 곡선에서 선형 영역의 기울기로 Young's 값 (Young's modulus)을 구하였다.
SEM 이미징
샘플의 명확한 단면을 위해 동결건조된 하이드로겔을 액체 질소에 첨가한 후, 절단 샘플을 탄소 테이프에 놓고 표면을 백금으로 코팅하였다. 준비된 샘플은 주사전자현미경 (SEM)으로 가시화되었다.
팽창 속성
하이드로겔 팽윤 특성 분석을 위해, IFRep 겔을 동결건조하고 샘플의 초기 건조 중량 (W0)으로 칭량한 다음, 약 37℃에서 PBS에 담가 두었다. 팽윤된 시료는 시점 (Wt)에서 칭량하였고, 팽윤율은 다음 식을 통해 계산하였다:
팽윤율 (%) = W0 - Wt / W0 x 100.
IFRep 겔에서 약물 로딩 및 방출 프로필
덱스트란 (분자량: 약 4 kDa (약 4000 g·mol-1)) 및 Cy7-CA (소분자에 대한 모델 화합물)는 다양한 조건에서 화물 방출 프로필을 위해 IFRep 겔에 로딩되었다. 덱스트란 및 Cy7-CA 로딩된 IFRep 겔은 24개의 트랜스웰 인서트에 넣고 PBS, 배지, M0, 및 M1 유사 대식세포 조절 배지에서 약 37℃에서 배양되었다. 상기 IFRep 겔을 새로운 24웰 플레이트로 옮기고, 생체내 이미징 시스템 (IVIS)으로 형광 강도를 시각화하였다. 또한, (+)-JQ1 (Selleckchem) 로딩된 IFRep 겔을 PBS, 배지, M0, 및 M1-유사 대식세포 조절 배지에서 약 37℃에서 배양하였다. 배양 후, 상층액을 수집하고 약 254 nm에서 자외선 (UV) 흡광도를 통해 정량화하였다. 또한 (+)-JQ1 방출 프로파일 테스트는 PBS, 37℃ 조건에서 서로 다른 카텝신 하에서 수행되었다. 활성 카텝신 L, S, 및 B를 각각 약 100 ng/ml의 농도로 첨가하였고, 상층액을 수집하여, UV 흡광도를 측정하였다. 또한, 카텝신 L, S, 및 B가 포함된 PBS에서 카텝신 억제를 위해 E-64 억제제가 추가되었다.
세포 배양
인간 단핵구 세포주 THP-1을 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입하고 10% 소 태아 혈청 (FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Roswell Park Memorial Institute 배지 (RPMI 1640)에서 배양하였다. 세포를 약 37℃에서 약 5% CO2와 함께 습한 대기에서 배양하였다.
세포독성 분석
IFRep 겔의 세포독성은 Cell Counting Kit-8 assay (CCK-8, Dojindo)를 이용하여 분석하였다. 섬유아세포 및 THP-1을 24웰 플레이트에 접종하고 24개의 트랜스웰 인서트에 배치된 IFRep 겔과 함께 배양하였다. IFRep 겔과 함께 인큐베이션한 후, 세포를 PBS로 세척하고 약 37℃에서 약 2 시간 동안 약 10% CCK-8 용액이 포함된 유리 배지에 침지시켰다. 상청액을 수집하고 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 약 450 nm 흡광도에서 측정하였다.
THP-1 분극화 측정 (THP-1 polarization)
단핵구를 대식세포로 분화시키기 위해 THP-1 세포를 약 50 ng/ml의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA, Sigma #P1585)와 함께 2일 동안 배양하였다. M0 대식세포는 2일 동안 완전한 배지에서 약 100 ng/mL의 LPS (Sigma, #L2630) 및 약 20 ng/mL의 hIFN-γ (PEPROTECH, #300-02)와 함께 배양되었고, M1 유사 대식세포로 분화되었다.
프로테아제 어레이
M0 및 M1-유사 대식세포의 컨디셔닝된 배지는 1일 배양 후 수집되어 프로테아제 어레이 실험에 사용되었다. 실험 방법은 제조업체의 지침 (abcam, #ARY021B)에 따라 수행되었다.
카텝신 활성 분석
M0 및 M1-유사 대식세포로부터 분비된 카텝신의 확인을 위해, 배지에서 M0 및 M1-유사 대식세포를 1일 동안 인큐베이션한 후 컨디셔닝된 배지를 수확하였다. 카텝신 L 및 B의 활성을 분석하기 위해 형광 기반 분석 키트 (Biovision)를 사용하였다. 실험 방법은 제조업체의 지침에 따라 수행되었다. 샘플의 형광 강도는 약 400/505 nm (Ex/Em)에서 형광 플레이트 판독기로 측정되었다.
정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (real time PCR)
카텝신 (cathepsin L, S, B, K, D) 및 TNF-α, IL6, IL1β, IL10을 포함한 염증 마커의 유전자 발현을 실시간 PCR로 분석하였다. M1 유사 대식세포는 JQ1이 로딩된 IFRep 겔과 함께 약 48시간 동안 배양되었고 대식세포의 mRNA는 RNeasy Mini Kit (QIAGEN)를 사용하여 분리되었으며 SuperScript IV VILO Master Mix (Invitrogen)를 사용하여 cDNA로 합성되었다. 또한 제조사의 지시에 따라 SYBR Premix Ex Taq (Takara)를 이용하여 유전자 수준의 발현 분석을 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기와 같다:
GAPDH (forward 5'-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3' (서열번호 2), reverse 5'-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3' (서열번호 3)), Cathepsin L (forward 5'-GAAAGGCTACGTGACTCCTGTG-3' (서열번호 4), reverse 5'- GTCTACCAGATTCTGCTCACTC-3' (서열번호 5)), Cathepsin S (forward 5'- TGGATCACCACTGGCATCTCTG-3' (서열번호 6), reverse 5'-GCTCCAGGTTGTGAAGCATCAC-3' (서열번호 7)), TNF-α (forward 5'-GTGCCTATGTCTCAGCCTCTTC-3' (서열번호 8), reverse 5'-GCCATAGAACTGATGAGAGGGA-3' (서열번호 9)), Cathepsin B (forward 5'-GCTTCGATGCACGGGAACAATG-3' (서열번호 10), reverse 5'- CATTGGTGTGGATGCAGATCCG-3' (서열번호 11)), Cathepsin K (forward 5'- GAGGCTTCTCTTGGTGTCCATAC-3' (서열번호 12), reverse 5'-TTACTGCGGGAATGAGACAGGG-3' (서열번호 13)), Cathepsin D (forward 5'-GCAAACTGCTGGACATCGCTTG-3' (서열번호 14), reverse 5'-GCCATAGTGGATGTCAAACGAGG-3' (서열번호 15)), IL-6 (forward 5'-CTTCCATCCAGTTGCCTTCTTG-3' (서열번호 16), reverse 5'-AATTAAGCCTCCGACTTGTGAAG-3' (서열번호 17)), IL1β (forward 5'-CCACAGACCTTCCAGGAGAATG-3' (서열번호 18), reverse 5'-GTGCAGTTCAGTGATCGTACAGG-3' (서열번호 19)), and IL-10 (forward 5'-TCTCCGAGATGCCTTCAGCAGA-3' (서열번호 20), reverse 5'- TCAGACAAGGCTTGGCAACCCA-3' (서열번호 21)).
발현된 유전자 수준은 하우스키핑 유전자인 GAPDH에 대해 정규화되었고, 상대 유전자 수준은 2-△△CT 방법으로 계산되었다.
ROS 형광 염색
IFRep 겔, JQ1-로딩된 IFRep 겔, 및 JQ1-로딩된 NIFRep 겔을 M1-유사 대식세포에 약 48시간 동안 처리한 후, 세포를 PBS로 세척하고 약 10 μM의 2',7'-디클로로플루오레세인 (Sigma #D6665) 용액으로 처리하였다. 약 30분 동안 배양한 후, 세포를 세척하고 공초점 현미경 (Carl Zeiss)으로 이미지화하였다.
면역 형광 염색
IFRep 겔, JQ1-로딩된 IFRep 겔, 및 JQ1-로딩된 NIFRep 겔을 M1-유사 대식세포에 약 48시간 동안 처리한 후, Nrf2의 면역 형광 염색을 수행하였다. 세포를 실온에서 약 30분 동안 약 4% 파라포름알데히드로 고정하고 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음 고정된 세포를, PBS에 녹인 약 0.1% Triton X-100 용액으로 15분 동안 투과화하고, 약 3% BSA (bovine serum albumin) 용액으로 실온에서 약 1시간 동안 차단하였다. 순차적으로, 약 3% BSA에 용해된 Nrf2의 1차 항체 (Cell Signaling, #12721)를 처리하고 약 4℃에서 밤새 배양하였다. 샘플을 PBS로 3회 세척한 후 상온에서 약 1시간 동안 2차 항체 Rabbit IgG (Invitrogen, #A21207)로 처리하였다. 인큐베이션 후 PBS 세척 및 DAPI 염색을 약 5분 동안 수행하였다. 면역 염색된 부분을 공초점 현미경 (Carl Zeiss)으로 관찰하였다. 생체 내 절개 조직의 면역 형광 염색을 위해, CD11b (Biolegend, #101201), iNOS (Millipore, #06-573), TNF-α (#ab183218), Cathepsin L (#ab133641), S (#sc-271619), B (#ab214428), 및 사이토케라틴 10 (#ab76318)이 1차 항체에 사용되었고, 2차 항체 토끼 IgG (Invitrogen, #A21207) 및 염소 항-마우스 IgG (Invitrogen, #A11001)를 사용하였다.
ELISA 분석
IFRep 겔, JQ1-로딩된 IFRep 겔, 및 JQ1-로딩된 NIFRep 겔 처리된 M1-유사 대식세포 (약 2 ml / 106 cells)의 상층액을 수집하고 TNF-α ELISA 키트 (R&D systems, #DTA00D) 및 IL1β DuoSet 키트 (R&D 시스템, #DY201)를 사용하여 분석하였다. TNF-α 및 IL1β의 정량화는 450 nm에서 GloMax Discover Multimode Microplate Reader (Promega)로 측정되었다.
생체 내 전층 상처 모델 (in vivo full-thickness wound model)
동물 연구는 한국과학기술연구원 (KIST-2020-046)의 승인을 받았다. 모든 동물 실험은 국제 실험 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었다. Balb/c 마우스 (수컷, 6주)는 Orient Bio (Korea)에서 구입하여 약 1주일의 순응기간을 거친 후 사용하였다. 수술 전, 마우스를 산소 중에서 아이소플루레인 (isoflurane)으로 마취하고 클리퍼를 사용하여 털을 제거하였다. 알코올 거즈로 소독한 후 등쪽 피부에 약 8mm 생검 펀치를 사용하여 전체 두께의 상처를 만들었다 (마우스당 두 개의 상처). 약 0.5 mm 두께의 실리콘 부목 링을 상처 주위에 접착하고 봉합하였다. IFRep 겔, JQ1-로딩된 IFRep 겔, 및 JQ1-로딩된 NIFRep 겔을 상처 부위에 적용하였다. 이후 텍아덤 필름으로 상처 부위를 덮고 코반 붕대를 순차적으로 붙였다. 또한, 14일 동안 생체 내 상처 치유 연구를 위해 약 4 mM 농도의 가교제를 포함하는 하이드로겔을 사용하였다.
조직학
채취한 시료를 10% 포르말린으로 고정하고 파라핀 블록에 담갔다. 조직 블록을 약 6 내지 7 μm 슬라이스로 절단하고 각각 자일렌 및 에탄올 용액을 처리하여 순차적으로 탈파라핀화 및 수화시켰다. 슬라이스를 hematoxylin 및 eosin 염색 (H&E) 및 Herovici 염색으로 염색하고 광학 현미경으로 관찰하였다.
통계 분석
모든 데이터는 평균값 ± 표준편차로 표시되었으며, 각 실험은 3개의 개별 실험에 대해 3회 수행되었다. 데이터는 일원 분산 분석 (ANOVA)에 이어 Tukey의 사후 검정 또는 Prism의 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 분석되었다. 통계적 유의성은 *p<0.05, **p<0.01, 및 ***p<0.001 이었다.
실시예 1. 질병 상태에 따라 약물 방출을 조절하는 하이드로겔 (IFRep 겔)의 제조
염증의 바이오마커로 기능하는 효소, 즉, 카텝신 (cathepsins)에 의해 절단 또는 분해될 수 있는 펩타이드를 개발하였고, 상기 펩타이드를 가교제로 하여 고분자간 가교결합이 형성된 하이드로겔 (IFRep 겔)을 제조하였다. 구체적인 제조 방법은 하기 실시예에 기재하였다.
1-1. 손상 (injury) 후 급성 염증에서 카텝신 (cathepsins)의 향상된 발현 확인
염증에 관여하는 다양한 면역 세포 중에서 대식세포는 치유 과정의 각 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 염증을 반영하는 대표적인 바이오마커를 스크리닝하기 위해 THP-1 유래 M1 대식세포 (THP-1-derived M1 macrophages)를 테스트하여 효소의 향상된 발현 및 활성 수준을 평가하였다.
구체적으로, M0 및 M1 유사 대식세포에서의 카텝신의 발현 수준을 측정하였고, 과발현된 카텝신 효소 중에서 상대적으로 발현 증가 수준이 더 높은 카텝신 L, S, 및 B의 염증 반응시 향상된 효소 활성을 분석하였다. 구체적인 실험 방법은 상기 참고예에 기재하였다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 카텝신 발현은 M0 대식세포에 비해, M1 유사 대식세포에서 더욱 향상되었다. 또한, 도 1b에 나타낸 바와 같이, M0 대식세포에서 분비되는 카텝신 L, S, 및 B에 비해, 염증성 M1 대식세포에서 분비되는 카텝신 L, S, 및 B의 활성이 더 증가함을 확인하였다. 이를 통해, 염증성 M1 대식세포에서 분비되는 카텝신 L, S, 및 B는 손상 후 급성 염증 반응에 기여할 수 있음을 알 수 있었다.
다음으로, 카텝신의 발현 수준과 염증 상태 사이의 상관 관계를 관찰하였다.
구체적으로, Balb/c 마우스의 등쪽에서 전체 두께의 피부에 약 8 mm의 생검 펀치를 사용하여 상처 부상을 만든 후, TNF-α, iNOS, 및 IL1β와 같은 염증 마커 및 카텝신의 발현 수준을 측정하였고, 염증성 M1 대식세포 집단 (CD11b+iNOS+ 양성 세포)의 증감을 분석하였다. 구체적인 실험 방법은 상기 참고예에 기재하였다.
도 1c에 나타낸 바와 같이, TNF-α, iNOS, 및 IL1β와 같은 염증 마커의 mRNA 수준은 상처 부상 후 2일과 5일에 유의하게 증가함을 확인하였다. 동시에, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 카텝신 L, S, 및 B 역시, 상처 부상 후 2일과 5일에 향상된 발현을 나타내어, 상처 부상 후 염증 마커의 발현 증가 양상과 동일한 발현 증가 양상을 나타냄을 확인하였다. 또한, 도 1e에 나타낸 바와 같이, 손상된 조직의 면역형광 염색 결과, 상처 부상 후 염증성 M1 대식세포 집단 (CD11b+iNOS+ 양성 세포)이 증가함에 따라 단백질 수준에서 TNF-α의 발현이 증가함을 확인하였다. 더하여, 도 1f에 나타낸 바와 같이, 손상된 조직의 면역형광 염색 결과, 상처 부상 후 단백질 수준에서 카텝신 L, S, 및 B의 발현 수준이 증가함을 확인하였다.
본 실시예를 통해, 염증성 M1 대식세포에 의해 분비되는 카텝신 L, S, 및 B가 손상 (injury) 후 급성 염증 활성의 대표적인 바이오마커가 될 수 있음을 알 수 있었다.
1-2. 노르보르넨 (norbornene)이 접합된 알지네이트 (Norbornene-conjugated alginate: Nor_Alg) 고분자의 제조
EDC/NHS 합성 방법을 통해, 생체 적합성 및 변형 가능한 알지네이트 (alginate)의 카르복실기와 노르보르넨 (norbornene)의 광개시 클릭 화학 반응 (photo-initiative click chemistry)을 유도하여, 노르보르넨 (norbornene)이 접합된 알지네이트 (Norbornene-conjugated alginate: Nor_Alg) 고분자를 제조하였다.
구체적으로, 알지네이트 (Alginate, PRONOVA UP)를 MES 완충액 (pH 6.5)에 약 1 중량%의 농도로 용해시켰다. 약 40 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) 및 약 60 mM N-hydroxysuccinimide (NHS)를 상기 알지네이트 용액에 약 30분 동안 용해시켰다. 그런 다음 약 20 mM 5-norbornene-2-methylamine을 첨가하고 실온에서 약 24시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 상기 반응액을 25 kDa MWCO 투석관으로 옮기고, 탈이온수 (deionized water: DI water)에 용해된 100 mM, 50 mM, 25 mM, 0 mM의 NaCl 용액으로 상기 반응액을 순차적으로 투석하였다. 투석액은 3일 동안 약 10시간 마다 교체되었다. 투석 후 얻어진 노르보르넨이 접합된 알지네이트 (Norbornene-conjugated alginate: Nor_Alg) 용액을 약 0.22 μm 필터로 멸균하고 2일 동안 동결건조하였다. 얻어진 노르보르넨이 접합된 알지네이트 (Nor_Alg)에 대하여 1H-NMR을 수행하여 구조를 분석하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 1H-NMR 결과 약 6.2 내지 5.8 ppm 사이에서 노르보르넨기의 이중결합이 검출되었으며, 이를 통해, 노르보르넨과 알지네이트가 성공적으로 접합되었음을 확인하였다.
1-3. 카텝신-절단성 펩타이드에 의해 고분자간 가교결합이 형성된 하이드로겔 (IFRep 겔)의 제조
카텝신에 의해 절단 또는 분해될 수 있는 펩타이드를 수득하기 위하여, 하기 서열번호 1의 아미노산 서열을 디자인하였고, 펩타이드 제조 회사를 통해 주문 제작하여, 하기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 수득하였다 (Peptron, Mw: 720):
서열번호 1: CARLRC.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 카텝신에 의해 절단 또는 분해되는 특성을 가지는 카텝신-절단성 펩타이드이며, 하이드로겔을 형성할 수 있는 고분자, 즉, 상기에서 제조된 노르보르넨이 접합된 알지네이트 (Nor_Alg) 고분자간 가교결합을 형성하게 하는 가교제로서 기능할 수 있다.
상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제 및 상기에서 제조된 노르보르넨이 접합된 알지네이트 (Nor_Alg)를 자외선에 노출시켜, 상기 가교제의 티올기와 상기 Nor_Alg의 노르보르넨 사이에서의 Thiol-ene 반응을 유도하여 상기 가교제와 상기 노르보르넨이 연결됨으로써, 상기 Nor_Alg 고분자간 가교결합이 형성된 하이드로겔을 제조하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-2.에서 제조된 Nor_Alg 약 2 중량%를 탈이온수에 용해시키고, 약 0.5 중량% Irgacure를 상기 용액에 첨가하였다. Irgacure와 혼합된, Nor_Alg 용액을 몰드에 첨가한 다음, 그 몰드에 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 가교제를 약 1 mM, 약 2 mM, 및 약 4 mM의 다양한 농도로 첨가하여 혼합하였다. 그 후, 상기 혼합물을 약 10분 동안 UV 광 (약 365 nm, 약 10 mW/cm2)에 노출시켰다. 참고로, 비염증반응성 하이드로겔 (NIFRep gel_JQ1)을 제조하기 위해, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 가교제 대신에 poly (ethylene glycol), Α,Ω-bis(thiol)-terminated crosslinker (Polymer Source. Inc. #P20223A-EG2SH, Mw: 460)를 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 가교제와 동일한 농도로 사용하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 카텝신-절단성 펩타이드 가교제에 의해 고분자간 가교결합이 형성된 하이드로겔 (IFRep 겔)을 수득하였다. 구체적으로는, 상기 알지네이트에 접합된 노르보르넨과 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제가 연결되고, 그로 인해, 상기 알지네이트 고분자간 가교결합이 형성된 하이드로겔을 수득하였다.
상기 IFRep 겔은 내부에 약물이 봉입된 형태로 제조될 수 있고, 약물이 봉입된 IFRep 겔의 경우, 가교제인 상기 카텝신-절단성 펩타이드가 염증의 바이오마커로 기능하는 효소, 즉, 카텝신에 의해 절단 또는 분해되면, IFRep 겔의 고분자간 가교결합이 손상 또는 파괴되면서, IFRep 겔 내부에 봉입되어 있던 약물이 IFRep 겔 외부로 방출될 수 있다. 즉, 상기 약물이 봉입된 IFRep 겔의 약물 방출은 카텝신 효소 특이적으로 유발될 수 있다. 질병 상태에 따라 체내에 존재하는 카텝신 효소의 활성이 달라지기 때문에, 결과적으로, 상기 IFRep 겔은 질병 상태에 따라 약물 방출을 조절할 수 있다. 이는, 하기의 실험예에서 구체적인 실험을 통해 확인되었다.
실험예 1. IFRep 겔의 특성 분석
1-1. IFRep 겔의 기계적 특성 분석
IFRep 겔의 기계적 특성을 분석하였다.
구체적으로, 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 1 mM, 약 2 mM, 및 약 4 mM의 농도로 포함하는 IFRep 겔 각각에 대하여 진동 전단 유변학 (oscillatory shear rheology)을 이용하여 진동 주파수 하에서, 탄성 특성을 나타내는 저장 탄성률 (storage modulus, G')과 점성 특성을 나타내는 손실 탄성률 (loss modulus, G'') 및 점성 (viscosity)을 평가하였다. 또한, IFRep 겔의 단단함 (stiffness)을 나타내는 Young의 계수 값을 측정하였고, 더하여, IFRep 겔에 대하여 SEM (Scanning Electron Microscope) 촬영을 수행하였다. 구체적인 실험 방법은 상기 참고예에 기재하였다.
도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 1 mM, 약 2 mM, 및 약 4 mM의 농도로 포함하는 모든 IFRep 겔은, 저장 탄성률이 손실 탄성률보다 더 높음을 확인하였다. IFRep 겔에 포함된 카텝신-절단성 펩타이드 가교제의 농도가 증가함에 따라 저장 탄성률이 증가하여 더 높은 탄성 특성을 나타내고, 손실 탄성률 역시 증가하여 하이드로겔의 점성 또한 증가함을 확인하였다. 또한, 도 4c에 나타낸 바와 같이, IFRep 겔의 Young의 계수 값은 카텝신-절단성 펩타이드 가교제의 농도가 증가함에 따라 증가하여 단단함의 정도가 더 증가하는 특성을 나타냄을 확인하였다. 이러한 IFRep 겔의 증가된 기계적 특성은 도 4d에 나타낸 바와 같이, SEM 측정 결과, 증가된 네트워크 밀도와 상관관계가 있음을 확인하였다.
따라서, IFRep 겔의 네트워크 밀도와 관련되는 IFRep 겔의 팽창 특성을 분석하였다.
구체적으로, IFRep 겔의 팽윤 거동은 PBS (pH 7.4)에서 배양 후 IFRep 겔의 무게를 측정하여 평가되었다. 구체적인 실험 방법은 상기 참고예에 기재하였다.
도 4e에 나타낸 바와 같이, IFRep 겔의 팽윤 속도 (swelling rate)는 48시간에 걸쳐 점진적으로 증가하였고, IFRep 겔에 포함된 카텝신-절단성 펩타이드 가교제의 농도가 감소함에 따라 평형이 가속화됨을 확인하였다. 이는, IFRep 겔에 포함된 카텝신-절단성 펩타이드 가교제의 농도가 감소함에 따라 IFRep 겔의 팽윤 속도가 증가함을 의미한다.
본 실험예를 통해, 상기 IFRep 겔은, IFRep 겔에 포함된 카텝신-절단성 펩타이드 가교제의 농도가 증가함에 따라 탄성, 점성, 단단함, 네트워크 밀도, 팽창 특성 등의 기계적 특성이 증가할 수 있고, 특히, 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 포함하는 상기 IFRep 겔의 경우, 상기 기계적 특성이 더욱 우수함을 확인하였다.
1-2. IFRep 겔의 세포 독성 분석
IFRep 겔의 섬유아세포 및 대식세포에 대한 세포 독성을 분석하였다. 구체적인 실험 방법은 상기 참고예에 기재하였다.
도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 1 mM, 약 2 mM, 및 약 4 mM의 농도로 포함하는 모든 IFRep 겔은, 섬유아세포 및 대식세포에 대하여 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 이를 통해, 상기 IFRep 겔은 생체 적합성 하이드로겔임을 확인하였다.
실험예 2. IFRep 겔의 염증 상태-특이적 약물 방출 효과 확인
2-1. 카텝신-절단성 펩타이드 함유 농도에 따른 IFRep 겔의 염증 상태-특이적 약물 방출 효과 확인
카텝신 활성에 대한 반응으로, IFRep 겔의 카텝신-절단성 펩타이드 가교제의 분해 및 약물 방출을 분석하여, IFRep 겔의 염증 상태-특이적 약물 방출 효과를 확인하였다. 또한, 염증 상태 특이적으로 우수한 약물 방출 효과를 나타내는 IFRep 겔의 특정 조건을 도출하였다.
구체적으로, M1 유사 대식세포가 배양된 조절 배지 (M1 conditioned media: M1 CM) 및 대조군 배지 각각에 형광 염료인 덱스트란 (분자량: 약 4 kDa (약 4000 g·mol-1))이 봉입된 IFRep 겔 (카텝신-절단성 펩타이드 가교제의 함유 농도: 약 1 mM, 약 2 mM, 및 약 4 mM)을 투입하여 약 37℃에서 인큐베이션하였고, IFRep 겔로부터 방출되는 형광을 IVIS를 통해 모니터링하였다. 구체적인 실험 방법은 상기 참고예에 기재하였다.
도 6a에 나타낸 바와 같이, 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 1 mM, 약 2 mM, 및 약 4 mM의 농도로 포함하는 모든 IFRep 겔은, M1 CM에 노출되는 경우, 대조군 배지에 노출되는 경우에 비해 형광 감소율이 더 높음을 확인하였고, 이를 통해, IFRep 겔은 M1 CM에 노출되는 경우, 대조군 배지에 노출되는 경우에 비해 덱스트란 방출율이 더 높음을 확인하였다. 또한, 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 1 mM 및 약 2 mM의 농도로 포함하는 IFRep 겔은, M1 CM에 노출되는 경우뿐만 아니라 대조군 배지에 노출되는 경우에도, 덱스트란 방출에 의해 형광 수준이 감소하는 것을 확인하였다. 반면, 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 포함하는 IFRep 겔은, 대조군 배지에 노출되는 경우 5일 동안 덱스트란 방출에 의한 형광 감소 현상이 거의 나타나지 않았지만, M1 CM에 노출되는 경우 3일째부터 덱스트란 방출에 의한 형광 수준의 감소가 나타나기 시작하여 5일째에는 형광 수준이 현저히 감소하여 다량의 덱스트란이 방출되었음을 확인하였다.
이를 통해, 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 포함하는 IFRep 겔은 정상 환경 보다 염증 환경에서 더욱 증가된 약물 방출 효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 1 mM 및 약 2 mM의 농도로 포함하는 IFRep 겔은 염증 환경뿐만 아니라 정상 환경에서도 약물을 방출하므로, 약물 방출에 있어서 염증 상태에 대한 특이성이 더 낮은 반면, 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 포함하는 IFRep 겔은 정상 환경에서는 약물 방출 효과가 거의 없지만, 염증 환경에서는 약물 방출 효과가 현저히 증가하여 약물 방출에 있어서 염증 상태에 대한 특이성이 매우 우수함을 확인하였다. 이는 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 포함하는 IFRep 겔은 상술한 바와 같이 기계적 특성이 우수하여 더욱 단단한 하이드로겔 네트워크를 가지는 것에 기인한 결과로 이해될 수 있다.
따라서 추가 연구를 위해 우수한 기계적 특성을 가지는 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 포함하는 IFRep 겔을 선택하여, 형광 염료인 덱스트란을 봉입하고, M0 유사 대식세포가 배양된 조절 배지 (M0 conditioned media: M0 CM), M1 CM, 대조군 배지, 및 PBS 각각에 투입하여 약 37℃에서 인큐베이션하였고, IFRep 겔로부터 방출되는 형광을 IVIS를 통해 모니터링하였다. 구체적인 실험 방법은 상기 참고예에 기재하였다.
도 6b에 나타낸 바와 같이, 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 포함하는 IFRep 겔은, 대조군 배지 및 PBS에 노출되는 경우 5일 동안 덱스트란 방출에 의한 형광 감소 현상이 거의 나타나지 않았지만, MO CM 및 M1 CM에 노출되는 경우 3일째부터 덱스트란 방출에 의한 형광 수준의 감소가 나타나기 시작하여 5일째에는 형광 수준이 현저히 감소하여 다량의 덱스트란이 방출되었음을 확인하였고, 특히, MO CM에 노출되는 경우에 비해, M1 CM에 노출되는 경우, 덱스트란 방출에 의한 형광 감소율이 더 높음을 확인하였다. 이를 통해, 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 포함하는 IFRep 겔은 정상 환경에서는 약물 방출 효과가 거의 없지만, 염증 환경에서는 약물 방출 효과가 증가하며, 특히, 염증 반응이 더욱 증가된 상태를 반영하는, 카텝신을 더 강하게 분비하는 M1 CM에 노출되는 경우, 약물 방출 효과가 더욱 증가함을 확인하였다.
본 실험예를 통해, IFRep 겔은 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 포함함으로써 염증 상태 특이적으로 약물을 방출할 수 있고, 특히, 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 포함하는 IFRep 겔의 경우 염증 상태 특이적 약물 방출 효과가 현저히 우수함을 확인하였다. 더하여, IFRep 겔은 염증 진행 정도에 따라 약물 방출 정도가 다르므로 염증 진행 상태에 따라 약물 방출을 조절할 수 있음을 확인하였다.
2-2. 봉입된 약물 크기에 따른 IFRep 겔의 염증 상태-특이적 약물 방출 효과 확인
봉입된 약물 크기에 따른 IFRep 겔의 염증 상태-특이적 약물 방출 효과를 확인하기 위하여, 소분자 형광 염료인 Cy7-CA (분자량: 약 585.22 g·mol-1)를 IFRep 겔에 봉입한 후, 방출 프로파일을 관찰하였다.
구체적으로, Cy7-CA가 봉입된 IFRep 겔 (상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 함유)을 M0 CM, M1 CM, 대조군 배지, PBS, 카텝신 L 함유 (약 100 ng/ml) 배지, 카텝신 S 함유 (약 100 ng/ml) 배지, 및 카텝신 B 함유 (약 100 ng/ml) 배지 각각에 투입하여 약 37℃에서 인큐베이션하였고, IFRep 겔로부터 방출되는 형광을 IVIS를 통해 모니터링하였다. 구체적인 실험 방법은 상기 참고예에 기재하였다.
도 7a에 나타낸 바와 같이, Cy7-CA가 봉입된 IFRep 겔은, 대조군 배지에 노출되는 경우보다 M0 CM 및 M1 CM에 노출되는 경우 Cy7-CA 방출에 의한 형광 감소율이 더 높았고, 특히, M1 CM에 노출되는 경우 Cy7-CA 방출에 의한 형광 감소율이 가장 높았고, Cy7-CA 방출이 가속화되면서, Cy7-CA의 초기 봉입량의 약 95% 이상이 방출됨을 확인하였다. 다만, Cy7-CA가 봉입된 IFRep 겔은, 대조군 배지에 노출되는 경우에도, Cy7-CA 방출에 의한 형광 감소가 나타났는데, Cy7-CA의 초기 봉입량의 약 20%가 방출됨을 확인하였다. 이를 통해, Cy7-CA와 같은 소분자가 봉입된 IFRep 겔의 경우, 염증 환경뿐만 아니라 정상 환경에서도 약물을 방출하므로, 약물 방출에 있어서 염증 상태에 대한 특이성이 낮음을 확인하였다.
또한, 도 7b에 나타낸 바와 같이, Cy7-CA가 봉입된 IFRep 겔은, PBS에 노출되는 경우보다 카텝신 L, S, 및 B에 노출되는 경우 Cy7-CA 방출에 의한 형광 감소율이 더 높았고, 특히, 카텝신 B에 노출되는 경우 Cy7-CA 방출에 의한 형광 감소율이 가장 높았고, Cy7-CA 방출이 가속화되면서, Cy7-CA의 초기 봉입량의 약 70% 이상이 방출됨을 확인하였다. 이를 통해, IFRep 겔은 카텝신 존재 하에 약물 방출이 더욱 증가함을 확인하였고, 이는, IFRep 겔에 포함된 카텝신-절단성 펩타이드 가교제가 카텝신에 의해 분해 또는 절단됨으로써, IFRep 겔의 고분자간 가교결합이 손상 또는 파괴되고, 이로 인해, IFRep 겔 내부에 봉입된 약물의 방출이 증가되는 것으로 이해될 수 있다.
다만, Cy7-CA가 봉입된 IFRep 겔은, PBS에 노출되는 경우에도, Cy7-CA 방출에 의한 형광 감소가 나타났는데, 이를 통해, Cy7-CA와 같은 소분자가 봉입된 IFRep 겔의 경우, 카텝신이 존재하는 염증 환경뿐만 아니라 정상 환경에서도 약물을 방출하므로, 약물 방출에 있어서 염증 상태에 대한 특이성이 낮음을 확인하였다.
본 실험예를 통해, IFRep 겔은 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 포함함으로써 염증 상태 (구체적으로는, 카텝신) 특이적으로 약물을 방출할 수 있고, 특히, 카텝신 B에 노출되는 경우, 염증 상태 특이적 약물 방출 효과가 현저히 우수함을 확인하였다. 더하여, IFRep 겔에 봉입된 약물의 크기에 따라 염증 상태 특이적 약물 방출 효과가 달라질 수 있고, 구체적으로, 분자량이 약 600 g·mol-1 미만인 약물을 봉입하는 경우, IFRep 겔의 염증 상태 특이적 약물 방출 효과가 감소할 수 있음을 확인하였다.
2-3. 후생유전체 리더 (epigenetic reader) BRD4의 억제제에 대한 IFRep 겔의 염증 상태-특이적 방출 효과 확인
후생유전체 리더 (epigenetic reader) BRD4의 억제제인 JQ1이 봉입된 IFRep 겔의 염증 상태-특이적 JQ1 방출 효과를 확인하였다.
구체적으로, JQ1 (분자량: 약 456.99 g·mol-1)이 봉입된 IFRep 겔 (상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 함유)을 M0 CM, M1 CM, 대조군 배지, PBS, 카텝신 L 함유 배지, 카텝신 L 및 카텝신 억제제 함유 배지, 카텝신 S 함유 배지, 카텝신 S 및 카텝신 억제제 함유 배지, 카텝신 B 함유 배지, 및 카텝신 B 및 카텝신 억제제 함유 배지 각각에 투입하여 약 37℃에서 인큐베이션하였고, UV 흡광도를 측정하여, IFRep 겔의 JQ1 방출 프로파일을 평가하였다. 상기 배지 중 카텝신이 함유된 배지는 모두 약 100 ng/ml의 농도로 카텝신을 함유하였다. 구체적인 실험 방법은 상기 참고예에 기재하였다.
도 8a에 나타낸 바와 같이, JQ1이 봉입된 IFRep 겔은, 대조군 배지 및 M0 CM에 노출되는 경우보다 M1 CM에 노출되는 경우 JQ1 방출량이 현저히 증가함을 확인하였다. 또한, JQ1이 봉입된 IFRep 겔이 대조군 배지 및 M0 CM 각각에 노출되는 경우, JQ1 방출량에 있어서 유의미한 차이가 없음을 확인하였다. 이를 통해, IFRep 겔은 염증 상태를 반영하는 M1 CM에 노출되는 경우에만 특이적으로 현저히 증가된 약물 (예컨대, JQ1) 방출 효과를 나타냄을 확인하였다.
더하여, 도 8b에 나타낸 바와 같이, JQ1이 봉입된 IFRep 겔은, PBS에 노출되는 경우보다 카텝신 함유 배지에 노출되는 경우 JQ1 방출량이 현저히 증가함을 확인하였다. 또한, JQ1이 봉입된 IFRep 겔이 카텝신과 카텝신 억제제를 모두 포함하는 배지에 노출되는 경우, 카텝신 함유 배지에 노출되는 경우와 비교하여 현저히 감소된 JQ1 방출량을 나타내며, 이는 PBS에 노출되는 경우의 JQ1 방출량 정도의 수준임을 확인하였다. 이를 통해, IFRep 겔은 염증 상태를 반영하는, 활성화된 카텝신에 노출되는 경우에만 특이적으로 현저히 증가된 약물 (예컨대, JQ1) 방출 효과를 나타냄을 확인하였다. 이는, IFRep 겔에 포함된 카텝신-절단성 펩타이드 가교제가 활성화된 카텝신에 의해 분해 또는 절단됨으로써, IFRep 겔의 고분자간 가교결합이 손상 또는 파괴되고, 이로 인해, IFRep 겔 내부에 봉입된 약물 (예컨대, JQ1)의 방출이 증가되는 것으로 이해될 수 있다.
본 실험예를 통해, IFRep 겔은, 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 포함함으로써 염증 상태 (구체적으로는, 활성화된 카텝신) 특이적으로 IFRep 겔 내부에 봉입된 약물 (예컨대, JQ1)의 방출을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실험예 3. IFRep 겔의 후성유전적 조절을 통한 대식세포 염증 반응 억제 효과 확인
다양한 질병에서 잠재적인 치료 전략으로 후성유전적 조절이 제안되었고, 환경적 자극에 대한 후성유전체 구성 (epigenetic machinery)의 반응은 매우 민감하기 때문에 질병의 상태에 따른 적절한 후성유전적 조절이 중요하다. 염증 활성에 대한 온디맨드 (On-Demand) 후성유전적 조절을 유도하기 위해, 히스톤 변형을 담당하는 후생유전체 리더 (epigenetic reader) BRD4에 대한 억제제인 JQ1을 IFRep 겔에 봉입하였고, JQ1이 봉입된 IFRep 겔의 대식세포 염증 반응에 대한 억제 효과를 분석하였다.
구체적으로, 약물이 봉입되지 않은 IFRep 겔 (IFRep gel), JQ1이 봉입된 IFRep 겔 (IFRep gel_JQ1), 및 JQ1이 봉입된 비염증반응성 하이드로겔 (NIFRep gel_JQ1)을 준비하였고, M1 대식세포에 상기 겔을 각각 처리한 후, M1 대식세포에서 Nrf2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)의 핵 전위 (nucleus translocation) 여부, 항산화 관련 인자 (HO-1 (heme oxygenase-1), SOD1 (superoxide dismutase-1), 및 NQO1 (NADPH quinine oxidoreductase-1))의 발현 증가 여부, ROS (reactive oxygen species) 억제 여부, 염증성 마커 (TNF-α, IL6, IL1β, 및 CD197)의 발현 감소 여부를 비교 분석 하였다. 약물 봉입 여부와 상관없이 상기 IFRep 겔은 모두 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 함유하도록 제조되었다. 구체적인 실험 방법은 상기 참고예에 기재하였다.
도 9a에 나타낸 바와 같이, M1 대식세포가 JQ1이 봉입된 IFRep 겔에 노출되었을 때, 다른 실험군과 비교하여 대식세포에서 Nrf2의 핵으로의 전위가 현저히 강하게 유도됨을 확인하였다. 또한, 도 9b에 나타낸 바와 같이, M1 대식세포가 JQ1이 봉입된 IFRep 겔에 노출되었을 때, 다른 실험군과 비교하여 대식세포에서 항산화 관련 인자 (HO-1, SOD1, 및 NQO1)의 발현 수준이 현저히 증가함을 확인하였다. 더하여, 도 9c에 나타낸 바와 같이, M1 대식세포가 JQ1이 봉입된 IFRep 겔에 노출되었을 때, 다른 실험군과 비교하여 ROS 수준이 현저히 감소함을 확인하였다. 추가로, 도 9d 및 도 9e에 나타낸 바와 같이, M1 대식세포가 JQ1이 봉입된 IFRep 겔에 노출되었을 때, 다른 실험군과 비교하여 염증성 마커 (TNF-α, IL6, IL1β, 및 CD197)의 발현 수준이 현저히 감소함을 확인하였다.
본 실험예를 통해, JQ1이 봉입된 IFRep 겔을 염증 반응을 반영하는 M1 대식세포 배지에 처리하는 경우, 다른 하이드로겔과 비교하여 현저히 우수한 JQ1 방출 효과를 나타내고, 방출된 JQ1에 의하여 M1 대식세포에서 BRD4가 억제되고, 이로 인해, M1 대식세포에서 Nrf2의 핵 전위가 유도되어 항산화 관련 인자의 발현이 증가되며, ROS가 억제되고, 염증성 인자의 발현이 감소됨으로써, JQ1이 봉입된 IFRep 겔은 후성유전적으로 대식세포의 염증 반응을 억제할 수 있음을 확인하였다. 또한, 이러한 JQ1이 봉입된 IFRep 겔의 대식세포의 염증 반응 억제 효과는 다른 하이드로겔과 비교하여 현저히 우수한 것이며, 이는, IFRep 겔이 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 포함함으로써, 적시에 약물 (구체적으로는, 대식세포의 후성유전적 조절을 위한 약물) 방출이 증가되도록 염증 상태 (구체적으로는, 활성화된 카텝신) 특이적으로 약물 방출을 조절하는 특성에 기인한 결과임을 확인하였다.
실험예 4. IFRep 겔을 통한 상처 치료 가속화 확인 (in vivo)
후생유전체 리더 (epigenetic reader) BRD4에 대한 억제제인 JQ1을 IFRep 겔에 봉입하였고, JQ1이 봉입된 IFRep 겔의 상처 치료 가속화 효과를 분석하였다.
구체적으로, Balb/c 마우스의 등쪽에서 전체 두께의 피부에 약 8 mm의 생검 펀치를 사용하여 상처 부상을 만든 후, 약물이 봉입되지 않은 IFRep 겔 (IFRep 겔), JQ1이 봉입된 IFRep 겔 (IFRep 겔_JQ1), 및 JQ1이 봉입된 비염증반응성 하이드로겔 (NIFRep gel_JQ1)을 그 상처에 적용하여 14일 동안 치료하였다. 14일 후, 상처 부위의 봉합률, 상처 부위의 재상피화 및 총 진피 두께, 상처 부위의 각질세포 분포, 상처 부위의 콜라겐 침착, 상처 부위의 국소적인 염증 및 항염증 마커의 발현 양상, 염증 및 항염증 관련 인자의 유전자 발현 양상을 분석하였다. 약물 봉입 여부와 상관없이 상기 IFRep 겔은 모두 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 함유하도록 제조되었다. 구체적인 실험 방법은 상기 참고예에 기재하였다.
도 10a에 나타낸 바와 같이, 상처 부위에 JQ1이 봉입된 IFRep 겔을 적용하였을 때, 다른 실험군과 비교하여 상처 부위의 봉합률이 현저히 높음을 확인하였다. 또한, 도 10b에 나타낸 바와 같이, 상처 부위에 JQ1이 봉입된 IFRep 겔을 적용하였을 때, 다른 실험군과 비교하여 상처 부위의 재상피화 정도 및 총 진피 두께 증가율이 현저히 높음을 확인하였다. 더하여, 도 10c에 나타낸 바와 같이, 상처 부위에 JQ1이 봉입된 IFRep 겔을 적용하였을 때, 다른 실험군과 비교하여 상처 부위의 성숙한 콜라겐의 침착율이 현저히 높음을 확인하였다. 추가로, 도 10d에 나타낸 바와 같이, 상처 부위에 JQ1이 봉입된 IFRep 겔을 적용하였을 때, 다른 실험군과 비교하여 상처 부위의 각질세포가 현저히 증가하였음을 확인하였다. 또한, 도 10e에 나타낸 바와 같이, 상처 부위에 JQ1이 봉입된 IFRep 겔을 적용하였을 때, 다른 실험군과 비교하여 상처 부위의 대식세포에서, 염증 마커 (iNOS)의 발현이 더욱 감소하고 항염증 마커 (CD206)의 발현이 더욱 증가함을 확인하였다. 또한, 도 10f에 나타낸 바와 같이, 상처 부위에 JQ1이 봉입된 IFRep 겔을 적용하였을 때, 다른 실험군과 비교하여 염증 관련 인자 (TNF-α, IL1β, iNOS)의 유전자 발현 수준이 더욱 감소하였고, 항염증 관련 인자 (Arg1)의 유전자 발현 수준이 더욱 증가함을 확인하였다.
본 실험예를 통해, JQ1이 봉입된 IFRep 겔을 생체 내외의 상처 부위에 적용하는 경우, 다른 하이드로겔과 비교하여 현저히 우수한 JQ1 방출 효과를 나타내고, 방출된 JQ1에 의하여 염증 반응을 현저히 억제시키면서 우수한 상처 치료 효과를 나타냄을 확인하였다. 또한, 이러한 JQ1이 봉입된 IFRep 겔의 생체 내외의 염증 억제 및 상처 치료 효과는 다른 하이드로겔과 비교하여 동일 기간 동안 현저히 우수한 것임을 확인하였고, 이로 인해, JQ1이 봉입된 IFRep 겔은 상처 부위에서 염증 억제 및 상처 치료를 가속화시키는 것임을 확인하였다. 이는, IFRep 겔이 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 포함함으로써, 적시에 약물 (구체적으로는, 대식세포의 후성유전적 조절을 위한 약물) 방출이 증가되도록 염증 상태 (구체적으로는, 활성화된 카텝신) 특이적으로 약물 방출을 조절하는 특성에 기인한 결과임을 확인하였다.
실험예 5. IFRep 겔의 상처 치료를 위한 염증 억제 및 각질세포 활성화 효과 확인 (in vivo)
후생유전체 리더 (epigenetic reader) BRD4에 대한 억제제인 JQ1을 IFRep 겔에 봉입하였고, JQ1이 봉입된 IFRep 겔의 상처 치료를 위한 염증 억제 및 각질세포 활성화 효과를 분석하였다.
구체적으로, Balb/c 마우스의 등쪽에서 전체 두께의 피부에 약 8 mm의 생검 펀치를 사용하여 상처 부상을 만든 후, 하기의 하이드로겔을 각각 그 상처에 4일 동안 적용하였다:
i) 약물이 봉입되지 않은 IFRep 겔인 'IFRep 4mM only' (상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 함유)
ii) JQ1이 봉입된 IFRep 겔인 'IFRep 4mM_JQ1' (상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 함유)
iii) JQ1이 봉입된 IFRep 겔인 'IFRep 1mM_JQ1' (상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 1 mM의 농도로 함유)
iv) JQ1이 봉입된 비염증반응성 하이드로겔인 'NIFRep 4mM_JQ1' (poly (ethylene glycol), Α,Ω-bis(thiol)-terminated crosslinker 가교제를 약 4 mM의 농도로 함유).
상처 부위에서 M1 대식세포 (CD11b+iNOS+ 양성 세포) 및 M2 대식세포의 (CD11b+CD206+ 양성 세포) 수의 증감 양상 및 각질세포 활성화 마커 (HB-EGF, CYR61, 및 SDC4)의 발현 양상을 분석하였다. 구체적인 실험 방법은 상기 참고예에 기재하였다.
도 11a에 나타낸 바와 같이, 상처 부위에 JQ1이 봉입된 IFRep 겔을 적용하였을 때, 다른 실험군과 비교하여 M1 대식세포 (CD11b+iNOS+ 양성 세포)의 수가 현저히 감소함을 확인하였다. 특히, 상처 부위에 JQ1이 봉입된 IFRep 겔 중 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 1 mM의 농도로 함유하는 'IFRep 1mM_JQ1' 겔을 적용하였을 때, 적용 후 2일 만에 M1 대식세포 (CD11b+iNOS+ 양성 세포)의 수가 현저히 감소하였고, JQ1이 봉입된 IFRep 겔 중 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 함유하는 'IFRep 4mM_JQ1' 겔을 적용하였을 때, 적용 후 4일째에 M1 대식세포 (CD11b+iNOS+ 양성 세포)의 수가 현저히 감소하였음을 확인하였다. 또한, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 상처 부위에 JQ1이 봉입된 IFRep 겔을 적용하였을 때, 다른 실험군과 비교하여 M2 대식세포의 (CD11b+CD206+ 양성 세포)의 수가 현저히 증가함을 확인하였다. 특히, 상처 부위에 상기 'IFRep 1mM_JQ1' 겔을 적용하였을 때, 적용 후 2일 만에 M2 대식세포의 (CD11b+CD206+ 양성 세포)의 수가 현저히 증가하였고, 상기 'IFRep 4mM_JQ1' 겔을 적용하였을 때, 적용 후 4일째에 M2 대식세포의 (CD11b+CD206+ 양성 세포)의 수가 현저히 증가하였음을 확인하였다.
더하여, 도 11c에 나타낸 바와 같이, 상처 부위에 상기 'IFRep 4mM_JQ1' 겔을 적용하는 경우에만, 적용 후 4일째에 각질세포 활성화 마커 (HB-EGF, CYR61, 및 SDC4)의 발현이 증가되었고, 나머지 실험군에서는 모두 각질세포 활성화 마커의 발현이 유의미하게 증가되지 않음을 확인하였다.
본 실험예를 통해, JQ1이 봉입된 IFRep 겔을 생체 내외의 상처 부위에 적용하는 경우, 다른 하이드로겔과 비교하여 현저히 우수한 JQ1 방출 효과를 나타내고, 방출된 JQ1에 의하여 M1 대식세포를 감소시키고, M2 대식세포를 증가시켜 염증 반응을 현저히 억제시킴을 확인하였다. 특히, 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM의 농도로 함유하는, JQ1이 봉입된 IFRep 겔을 상처 부위에 적용하는 경우, 즉각적으로 염증 억제 효과를 나타내는 것이 아니고, 점차적으로 염증 억제 효과가 강화되며, 상기 IFRep 겔의 JQ1 방출 효과는 염증 단계 이후의 증식 단계까지 이어져 각질세포 활성화 (예컨대, 각질세포의 이동 또는 증식의 증가) 효과까지 나타냄을 확인하였다. 이는, IFRep 겔이 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM 농도로 포함함으로써, 기계적 특성이 우수한 네트워크 구조를 가지게 되고, 이로 인해, 약물의 방출에 있어서 염증 상태 (구체적으로는, 활성화된 카텝신)에 대한 특이성이 현저히 증가하게 되며, 결과적으로, 적시에 약물 (구체적으로는, 대식세포의 후성유전적 조절을 위한 약물) 방출이 증가되도록 약물 방출을 조절할 수 있는 특성에 기인한 결과임을 확인하였다. 즉 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM 농도로 포함하는 IFRep 겔은, 활성화된 카텝신의 농도가 높은 단계 즉, 급성 염증 단계에서 그 이후의 증식 단계까지 카텝신에 의한 상기 가교제의 절단 또는 분해가 유도될 수 있고, 이로 인해, 상기 IFRep 겔은 급성 염증 단계에서 그 이후의 증식 단계까지 적시에 약물 (구체적으로는, 대식세포의 후성유전적 조절을 위한 약물)을 방출시켜 약물의 효과를 극대화할 수 있다. 이로 인해, 상기 카텝신-절단성 펩타이드 가교제를 약 4 mM 농도로 포함하는 IFRep 겔은, 현저히 우수한 염증 억제 및 세포 재생 효과를 나타내어 상처 치료를 가속화할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB Foundation <120> Inflammatory state-specific drug release hydrogels cross-linked with cathepsin-cleavable peptides <130> PN142029KR <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cathepsin-cleavable peptide <400> 1 Cys Ala Arg Leu Arg Cys 1 5 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Primer F <400> 2 caccattggc aatgagcggt tc 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Primer R <400> 3 aggtctttgc ggatgtccac gt 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L Primer F <400> 4 gaaaggctac gtgactcctg tg 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L Primer R <400> 5 gtctaccaga ttctgctcac tc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin S Primer F <400> 6 tggatcacca ctggcatctc tg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin S Primer R <400> 7 gctccaggtt gtgaagcatc ac 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF alpha Primer F <400> 8 gtgcctatgt ctcagcctct tc 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF alpha Primer R <400> 9 gccatagaac tgatgagagg ga 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin B Primer F <400> 10 gcttcgatgc acgggaacaa tg 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin B Primer R <400> 11 cattggtgtg gatgcagatc cg 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin K Primer F <400> 12 gaggcttctc ttggtgtcca tac 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin K Primer R <400> 13 ttactgcggg aatgagacag gg 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin D Primer F <400> 14 gcaaactgct ggacatcgct tg 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin D Primer R <400> 15 gccatagtgg atgtcaaacg agg 23 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL6 Primer F <400> 16 cttccatcca gttgccttct tg 22 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL6 Primer R <400> 17 aattaagcct ccgacttgtg aag 23 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL1beta Primer F <400> 18 ccacagacct tccaggagaa tg 22 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL1beta Primer R <400> 19 gtgcagttca gtgatcgtac agg 23 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL10 Primer F <400> 20 tctccgagat gccttcagca ga 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL10 Primer R <400> 21 tcagacaagg cttggcaacc ca 22

Claims (12)

  1. 생체적합성 고분자를 가교제로 가교시켜 형성된 하이드로겔로서,
    상기 하이드로겔 내부에 약물이 봉입되어 있고,
    상기 가교제는 카텝신 (cathepsins)에 의해 분해되는 펩타이드를 포함하는 것인, 하이드로겔.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 카텝신에 의해 분해되는 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 하이드로겔.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 히알루론산 (hyaluronic acid), 폴리감마글루탐산 (poly-γ-glutamic acid), 셀룰로오스 (cellulose), 폴리아크릴산 (polyacrylic acid), 폴리아미노산 (polyamino acid), 및 알지네이트 (alginate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것인, 하이드로겔.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 가교제가 카텝신에 의해 분해되면, 상기 약물이 상기 하이드로겔 외부로 방출되는 것인, 하이드로겔.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로겔은 염증 병변에서 특이적으로 상기 약물을 방출하는 것인, 하이드로겔.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 약물은 항염증 효과를 나타내고, 상기 약물의 평균중량분자량은 600 내지 10,000 g·mol-1인 것인, 하이드로겔.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 약물은 BRD4 (bromodomain-containing protein 4)의 억제제인 것인, 하이드로겔.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로겔에는, 상기 가교제가 몰농도로 3 mM 이상 포함되는 것인, 하이드로겔.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 하이드로겔을 포함하는 항염증용 약제학적 조성물.
  10. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 하이드로겔을 포함하는 항염증용 피부 외용제 조성물.
  11. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 하이드로겔을 포함하는 피부 재생 또는 상처 치료용 약제학적 조성물.
  12. (1) 생체적합성 고분자와 용매를 혼합하는 제1단계;
    (2) 상기 제1단계를 통하여 얻어진 혼합물에 약물을 혼합하는 제2단계;
    (3) 상기 제2단계를 통하여 얻어진 혼합물에 자외선 개시제 및 가교제를 혼합하는 제3단계; 및
    (4) 상기 제3단계를 통하여 얻어진 혼합물에 자외선을 조사하여 가교시키는 제4단계를 포함하고,
    상기 가교제는 카텝신 (cathepsins)에 의해 분해되는 펩타이드를 포함하는 것인, 청구항 1의 하이드로겔을 제조하는 방법.
KR1020210194471A 2021-12-31 2021-12-31 카텝신-절단성 펩타이드로 가교된 염증 상태-특이적 약물 방출 하이드로겔 KR20230103530A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210194471A KR20230103530A (ko) 2021-12-31 2021-12-31 카텝신-절단성 펩타이드로 가교된 염증 상태-특이적 약물 방출 하이드로겔

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210194471A KR20230103530A (ko) 2021-12-31 2021-12-31 카텝신-절단성 펩타이드로 가교된 염증 상태-특이적 약물 방출 하이드로겔

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230103530A true KR20230103530A (ko) 2023-07-07

Family

ID=87153655

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210194471A KR20230103530A (ko) 2021-12-31 2021-12-31 카텝신-절단성 펩타이드로 가교된 염증 상태-특이적 약물 방출 하이드로겔

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20230103530A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11529417B2 (en) Wound healing through sirt1 overexpression
Wang et al. Development of biocompatible HA hydrogels embedded with a new synthetic peptide promoting cellular migration for advanced wound care management
ES2435847T3 (es) Composiciones de microesferas para curar heridas
JPH07505378A (ja) 線維障害の創傷治療処置
WO1997041899A1 (en) New medicaments containing gelatin cross-linked with oxidized polysaccharides
KR20080031405A (ko) 상피 재생의 촉진
EP3294312B1 (en) Materials for tissue regeneration
EP3494791B1 (en) Treatment of skin-related symptoms of ehlers-danlos syndrome with poly-n-acetylglucosamine nanofibers
EP3793589B1 (en) Controlled hydrogel delivery of focal adhesion kinase inhibitor for decreased scar formation
KR20230103530A (ko) 카텝신-절단성 펩타이드로 가교된 염증 상태-특이적 약물 방출 하이드로겔
US20170189479A1 (en) Syndecan-4 proteoliposomes for enhanced cutaneous wound healing and minimized inflammatory immune response
Khunmanee et al. Effective wound healing on diabetic mice by adhesive antibacterial GNPs-lysine composited hydrogel
US20240016893A1 (en) Compositions and methods for treating wounds
US20230302191A1 (en) Compositions and methods for sustained oxygen release to ischemic tissues
Sruthi Enhancement of Wound Healing activity of Papain Urea Film Forming Hydrogel using Chitosan
Cevher et al. 15–Bioengineered wound and burn healing substitutes: novel design for biomedical applications and general aspects
RU2153352C1 (ru) Фармацевтическая композиция, обладающая ранозаживляющим и противовоспалительным действием
KR20240019910A (ko) 상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치
Copenhagen 7th Joint Meeting of the European Tissue Repair Society (ETRS) with the Wound Healing Society
Rahmani Neishaboor Topical and local controlled release of stratifin for the improvement of hypertrophic scarring in open and surgically closed wounds
JPH10155892A (ja) 医療用高分子ゲル
WO2008078073A1 (en) Medicaments and methods comprising a compound that promotes oestrogenic activity for wound healing