CN101400787B - 采用脂肪来源成体干细胞大量制造生长因子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于由人类脂肪来源干细胞制造大量人类生长因子的方法。更具体而言，本发明提供了通过在适宜的培养基和条件下培养从人类脂肪细胞中提取的脂肪来源干细胞从而能以显著大的量合成人类生长因子的方法。而且，根据本发明的方法产生的干细胞培养基和从所述培养基中分离的人类生长因子能有利地用作药物和化妆品的原材料。
Description
技术领域
本发明涉及由人类脂肪来源干细胞制造大量生长因子的方法。更具体而言，本发明提供了包括在适宜的培养基和条件下培养提取自人类脂肪细胞的脂肪来源干细胞的方法，使得能以明显多于使用已有干细胞的情况的量合成人类生长因子，例如酸性成纤维细胞生长因子(酸性FGF)、碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、角化细胞生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、人类转化生长因子-α(TGF-α)、人类转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)和神经生长因子。
背景技术
如此处所使用，术语“干细胞”指保持为未分化为特定细胞的细胞，并且如果必要时具有分化为构成身体包括神经、血液、软骨等各种细胞的潜能。能制造这样的干细胞的方法粗略地分为两类：(1)由发育自受精卵的胚胎制造干细胞(胚胎干细胞)的方法；和(2)获取保存在成人体内各个部分的干细胞(成体干细胞)的方法。虽然胚胎干细胞和成体干细胞的功能相互不同，但它们都具有能分化为各种细胞的特性。
所述胚胎干细胞具有非常好的分化潜能和长端粒的优势，但存在伦理问题和难以大量获取的缺点。与之相比，所述成体干细胞可以是大量的，但具有以下缺点，即当这些细胞移植到其他人体内时，它们有感染的风险和相对低的分化潜能。
尽管有上述缺点，所述成体干细胞具有能相当安全地用于医疗应用的特点。具体而言，即使当这些细胞移植入体内进行器官再生时它们也不会导致癌症，并且因为它们源自于自身身体所以不会导致免疫排斥反应。因此，这些成体干细胞能用于自体移植。
同样，所述成体干细胞具有根据周围组织的特征进行分化的位点特异性分化潜能，并且甚至当它们以未分化态进行注射时也不导致癌症。因此，这些成体干细胞具有在移植后立即形成细胞的潜能，并且还表现出如果必要时能形成和保存未分化干细胞的自我更新潜能。
由于上述优势，最近成体干细胞的重要性受到高度关注，并且已开始进行各种研究以获得活体成体干细胞。
脂肪组织在活体正常发育和生理活动中扮演着重要角色，但其重要性到目前为止一直被忽视了。最常见类型的脂肪是白脂肪组织，其位于皮肤以下(皮下脂肪)和腹腔内(内脏脂肪)或位于生殖器官四周(性腺脂肪)。在成体内稍普遍的形式是棕色脂肪组织，其在婴幼儿阶段时产生热量中扮演着重要角色(Gimble，New Biol.2(4)：304-12，(1990))。
然而，实际上，再生能力和成熟阶段与个体中脂肪组织储存密切相关。女性和男性青春期与脂肪组织来源荷尔蒙的生成和分泌密切相关并与身体脂肪组成密切相关。同样，脂肪组织在葡萄糖代谢和能量平衡中扮演重要角色。
在几年里，在生物材料领域已有显著进步。在此基础上，目前已开发出许多材料并得以使用。尽管有此进步，但实际上对于使用人类脂肪组织有很多研究还未进行。然而，由于最近报道成体干细胞存在于脂肪组织中(Zuk PA等，Molecular Biology of Cell，13：4279-4295(2002)；Rodriguez AM等，Biochimie，87：125-128(2005))，已进行使用脂肪来源细胞的各种研究。
同样，在生物化学和分子生物学发展的基础上，最近已在人体内发现少量信号物质(生长因子)，并且在这些发现的基础上，已重新建立了活体衰老的理论(Stanley Cohen，诺贝尔演讲，1986年12月8日)。此外，已发现所述信号物质(生长因子)随着年龄增加而减少，而该生长因子的减少与人体的衰老密切相关(Sporn M和Roberts A，Handbook ofExperimental Pharmacology，Vol.1，Vol.95/1，1990，Springer-Verlag，DE，柏林，pp.667-698)。
因此，已报道，当向身体提供外来生长因子时，身体的衰老可被抑制，并且已对这些物质的特殊效果进行了研究(GE Pierce和TA Mustoe，Annu Rev Med，46.467-481(1995))。具体而言，已进行了对所述信号物质(生长因子)的结构和合成的研究，但大多数生长因子具有蛋白结构(三维复杂的)，因此导致在化学合成中的各种问题并显著增加了合成的成本。
因此，本发明人对低成本获得活性人类生长因子并同时保持其在人体内活性的方法进行了研究，并因此作为结果，注意到脂肪来源成体干细胞分泌生长因子的事实(Rehman，J.等，Circulation，109：1292-1298(2004))。
然而，对脂肪来源成体干细胞的研究主要涉及所述细胞本身的使用或分化，而对由这些细胞合成生长因子的方法几乎没有研究。
韩国专利申请公开2004-94910，发明名称为″Improved fatcell-differentiated，adipose-derived adult stem cells and the use thereof″公开了能提高脂肪来源成体干细胞的活体内存活率的方法，但没有公开生长因子的有意义的合成。韩国专利申请公开2005-6408，发明名称为″PBRligand having function of regulating fat cell differentiation，derivativecompounds thereof，and composition for regulaion of fat cell differentiation，containing the same″，仅仅公开了使脂肪细胞分化为特定细胞的方法。
同样，韩国专利申请公开2005-99274，发明名称为″Animal serum-freemedium composition for culture of human stem cells，and method forinduction of differentiation into liver cells″，公开了使用不含有动物血清的培养基分化人类干细胞的方法，以及韩国专利登记号484550，发明名称为″Method for production of cells for cell transplantation″，公开了干细胞用于细胞移植的用途。
据认为为什么对采用脂肪来源成体干细胞合成生长因子的研究不足的原因是使用成体干细胞的方法集中于其通过分化为其他细胞的用途，而干细胞之间的细胞学差异的研究不足。
同样，如上所述，对合成生长因子的方法的研究仅仅是对采用遗传重组技术产生生长因子的方法的研究，如在韩国专利登记号101436，发明名称为″Method for producing recombined human endothelial cell growthfactors″，韩国专利登记号62551，发明名称为″Method for producing humanepithelial cell growth factors by genetic recombination technology″，韩国专利申请公开2003-45032，发明名称为″Method for producing biologicallyactive human acidic fibroblast growth factors and use thereof for stimulationof angiogenesis″等中所公开的。
因此，本发明人已对采用脂肪来源成体干细胞制造大量生长因子的方法进行了研究，结果发现与没有施加特定刺激的脂肪来源成体干细胞相比，通过建立适宜的培养条件和物理/化学刺激获得的脂肪来源成体干细胞以明显有效量合成和分泌生长因子。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是由脂肪来源成体干细胞制造大量人类生长因子，所制造的人类生长因子相比通过重组或化学方法合成的生长因子而言具有优异的体内活性。
本发明的另一目的是提供安全有效的药物或化妆品，所述药物或化妆品或者含有由脂肪来源干细胞大量制造的人类生长因子，或者含有所述生长因子的培养基。
技术方案
为实现上述目的，在一方面，本发明提供了由脂肪来源干细胞制造大量人类生长因子的方法，所述方法包括步骤：(i)分离从哺乳动物脂肪细胞提取的脂肪来源成体干细胞；(ii)可选地在血清培养基中培养所述干细胞，和随后在无血清培养基中传代培养所述干细胞；(iii)向所述脂肪来源干细胞施加选自低氧培养、UV照射、营养缺乏和机械摩擦的至少一种物理刺激；和(iv)可选地向所述培养基加入选自维生素A、维生素B、维生素C和维生素D的一种或多种维生素，其中所述步骤(iii)和步骤(iv)在其中能实现所述人类生长因子的最高产量的条件下进行。
在另一方面，本发明提供了含有通过所述方法制造的人类生长因子的功能性化妆组合物。
在又一方面，本发明提供了含有通过所述方法获得的脂肪来源成体干细胞培养基的功能性化妆组合物。
有利效果
根据本发明，可由脂肪来源成体干细胞大量制造人类生长因子，并且发现使用本发明制造方法制造的生长因子相比根据已有制造方法制造的生长因子而言具有优异的安全性和活性，并且能以与现有的人体生长因子相同的方式发挥作用。同样，预期脂肪来源干细胞的培养基和由所述培养基分离的生长因子能有利地应用于用于抗皱、创伤愈合和去疤的药物、准药物和化妆品。
附图说明
图1是分离自脂肪组织的干细胞的光学显微镜照片；
图2显示了最初分离的PLA细胞的流式细胞术结果；
图3是显示传代培养后流式细胞术结果的图示；
图4是来自脂肪来源干细胞的通过RT-PCR确认的TGFβ-1、bFGF和VEGF的电泳图；
图5是显示在脂肪来源干细胞培养期间在培养基中分泌的bFGF和VEGF的浓度的图示；
图6是显示在成纤维细胞和脂肪来源干细胞的混合培养物中所测量的成纤维细胞的胶原合成的图示；
图7是显示在不同浓度的脂肪来源干细胞培养基中成纤维细胞数目的图示；
图8是显示脂肪来源干细胞培养基和含有重组生长因子的培养基之间的比较图示；
图9是显示在根据本发明的物理和化学条件下培养的脂肪来源干细胞之间的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的分泌的比较图示；
图10是显示血管内皮生长因子(VEGF)的分泌的比较图示；
图11是显示转化生长因子-β(TGF-β)的分泌的图示；
图12、13、14和15是显示含有分离自自体脂肪来源干细胞的生长因子的组合物的去皱活性的照片；和
图16是显示由脂肪来源干细胞培养基引起的成纤维细胞的胶原合成的Western印迹分析结果的照片。
本发明的SEQ ID NO：1～6和10～11是用于检测特异性蛋白的扩增引物对，SEQ ID NO：7～9是编码人类生长因子的扩增产物。
具体实施方式
本发明的第一方面涉及采用脂肪来源干细胞制造大量生长因子的方法。
包含在脂肪来源干细胞中的生长因子选自由酸性成纤维细胞生长因子(酸性FGF)、碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、角化细胞生长因子(KGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、人类转化生长因子-α(TGF-α)、人类转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、上皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF)及其混合物组成的组。
在本发明中，脂肪来源干细胞用于特殊地刺激以下生长因子的合成。
1)碱性成纤维细胞生长因子(下文中，称为″bFGF″)
bFGF或肝素结合生长因子2(HBGF-2)包括七种在氨基酸水平具有约30％～50％同源性的因子(Burgess，W.H和Maciag，T.，Annu.Rev.Biochem.，58：575-606(1989)；Baird，A.和Klagsbrun，M.，Cancer Cells，3(6)：239-43(1991))。bFGF分离自神经组织、脑垂体、肾上腺皮质、corpora leutea(黄体)和胎盘。
分离自身体的bFGF具有约18kDa的大小。一些研究揭示存在更大类型的bFGF类型。它们具有约24kDa的大小，是由蛋白质氨基端延长而引起的现象，所述蛋白质氨基端延长是由于在不含有AUG起始密码子的区域的翻译起始而导致的(Burgess，W.H和Maciag，T.，Annu.Rev.Biochem.，58：575-606(1989)；Baird，A.和Klagsbrun，M.，Cancer Cells，3(6)：239-43(1991)；Prats，H.等，PNAS，86：1836-1840(1989)；Quarto，N.等，J.Cell.Physiol.，147(2)：311-8(1991)；Bugler，B.等，Mol.Cell.Biol.，11(1)：573-7(1991))。这些现象导致使bFGF位于细胞核中而不是细胞质中(Quarto，N.等，J.Cell.Physiol.，147(2)：311-8(1991)；Bugler，B.等，Mol.Cell.Biol.，11(1)：573-7(1991))，由常规重组或化学方法制造的bFGF蛋白是基于18-kDa区域。这可以以与现有方法不同的途径进行表达，因为bFGF在形态学上缺少疏水信号肽碱基序列(Mignatti，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：11007(1991))。
2)血管内皮生长因子(下文中，称之为″VEGF″)
VEGF(Ferrara，N.和Henzel，W.J.Biochem Biophys Res Commun，161(2)：851-8(1989))已知为血管可渗透性因子(Senger，D.R.等，Science，219(4587)：983-5(1983))，其为同二聚体，具有34kDa～42kDa的分子量并且是肝素结合糖蛋白。这具有血管生成因子，并因此能促进上皮细胞的有丝分裂和改善血管渗透性。
VEGF作为已知为有限碱基序列的一级结构进行表达，并且具有与血小板衍生生长因子(PDGF)的A链和B链的同源性。这些生长因子具有八个保守半胱氨酸残基并包括在二硫键内侧和外侧的链中。cDNA编码的VEGF蛋白具有与血小板衍生生长因子(PDGF)的53％的氨基酸同源性，VEGF分离自人类胎盘的cDNA库(Maglione，D.等，PNAS，88：9267(1991))。该蛋白被称为″胎盘生长因子″(PGF)，目前被认为是VEGF家族的一员。基于与VEGF的同源性，所述胎盘生长因子(PGF)建议为血管生成因子。
人类VEGF的基因组合在八个外显子中。不同的剪接形成121个、165个、189个和206个氨基酸的碱基序列，编码了四个单体VEGF。每个碱基序列具有26个信号肽氨基酸残基，并因此能被检测到。VEGF121和VEGF165是暴露于胞外基质的可扩散的蛋白质，VEGF189和VEGF206对肝素具有高亲合性，并因此与胞外脂质中的肝素形成蛋白多糖键。VEGF具有N-连接的糖基化位点，其最初为糖蛋白。
通过常规重组或化学方法制造的VEGF蛋白是在可扩散的蛋白VEGF121和VEGF165位点的基础上制造的。在现有技术中，据报道重组人类VEGF在大肠杆菌(E.coli)中的表达与原有的体外VEGF没有生物功能上的差异(Connolly，D.T.J.Cell.Biochem，47(3)：219-23(1991)；Schott，R.J.和Morrow，L.A.Cardiovasc，Res.，27(7)：1155-61(1993)；Neufeld，G.等，Prog.Growth Factor Res.，5(1)：89-97(1994)；Senger，D.R.等，Cancer and Metastasis Reviews，12(3-4)：303-24(1993))。
3)转化生长因子-β(下文中，称之为″TGF-β″)
人类转化生长因子(TGF)是刺激成纤维细胞转化以分化为肿瘤样表型的因子，由两种蛋白TGF-α和TGF-β的混合物构成，并发现与肿瘤抑制因子而不是肿瘤刺激因子在一起(Lawrence，D.A.Eur.Cytokine Netw，7(3)：363-74(1996)；Cox，D.A.和Maurer，T.，Clin.Immunol.Immunopathol，83(1)：25-30(1997)；Alevizopoulos，A.和Mermod，N.，Bioassays.19(7)：581-91(1997))。
所述两种分子是超家族的成员包括TGF-β1，其具有五种骨形态发生蛋白作为活性和非活性物质(Kingsley，D.M.，Genes Dev，8：133(1994))。已知人类TGF-β1具有25kDa的分子量，由二硫键和二-糖基同二聚体构成，并在几乎所有哺乳动物物种之间具有100％的保守基因序列。当通过类似于枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶由前体转移了二硫键时，TGF-β1引发细胞内信号传导(Dubois，C.M.等，J.Biol.Chem.，270：10618(1995))，并且它通常作为非活性物质或两者的组合而被分泌(Gleizes，P-E.等，Stem Cells，15：190-197(1997))。TGF-β1信号转导过程包括两个受体(Ten Dijke，P.Curr.Opin.Cell Biol，8(2)：139-45(1996)；Derynck，R.和Feng X.H.，Biochim.Biophys.Acta 1333(2)：F105-50(1997)；Padgett，R.W.等，Bioessays，20(5)：382-90(1998))，TGF-βRII二聚体为75-kDa配体结合蛋白，具有细胞内丝氨酸-苏氨酸激酶，其被持续激活，通过与TGF-β1相结合，TGF-βRII使53-kDa信号转导二聚体TGF-βRI磷酸化。所述磷酸化的TGF-βRI激活蛋白激酶并通过细胞内蛋白SMADS诱导引发下游信号。
在信号转导过程中涉及的TGF受体在所有细胞中均有发现并影响几乎所有的生理学行为。其系统性的和细胞特异性的激活是非常复杂的机制，但表现出三种基本活性。TGF-β1通常调控细胞的增殖诸如抑制因子，通过重复蛋白降解的抑制和蛋白的合成从而促进细胞膜的沉积之外，还促进蛋白水解产物的沉积，并且通过各种机制刺激免疫抑制反应。
通过现有重组或化学合成制造的TGF-β1蛋白是具有25kDa大小的活性蛋白，因此在体外表现出与原有TGF-β1蛋白类似的生物活性，但其仅包括所述TGF-β1蛋白的一些固有性质。
根据本发明的第一方面的方法包括步骤：(i)分离从哺乳动物脂肪细胞提取的脂肪来源成体干细胞；(ii)在血清培养基中选择性地培养所述干细胞，随后在无血清培养基中传代培养所述干细胞；(iii)向所述脂肪来源干细胞施加选自低氧培养、UV照射、营养缺乏和机械摩擦的至少一种物理刺激；和(iv)选择性地向所述培养基加入选自维生素A、维生素B、维生素C和维生素D的一种或多种维生素，其中所述步骤(iii)和步骤(iv)在其中能实现所述人类生长因子的最高产量的条件下进行。
干细胞的收集
根据本发明，可以通过纯化过程从存在于脂肪组织的细胞中收集脂肪来源成体干细胞。优选为，收集人类脂肪来源成体干细胞，并为此目的，从人类脂肪组织中分离脂肪来源干细胞。
脂肪组织是得自皮下、网络膜、肠、乳房生殖器或其他脂肪组织位点的棕色或者白色脂肪组织，采用吸脂术可以方便地获得皮下白色脂肪组织。
作为脂肪组织，可使用通常进行的吸脂过程中废弃的脂肪组织。即，所述脂肪组织的效用得以提高，因为不再需要进行创伤性外科手术。洗涤所分离的吸脂材料，从所述洗涤材料中仅仅分离出脂肪组织。所述脂肪组织的细胞外基质用胶原酶处理，然后经离心收集含有高密度干细胞的基质血管组分。由此获得沉淀经洗涤，然后穿过细胞过滤器至其他组织。然后，使用单核细胞分离溶液将含有红细胞的单核细胞和细胞碎片与剩余的组织分离开。在非诱导培养基中培养所述分离的单核细胞，并移除非粘附性细胞。
干细胞的培养
在本发明中，建立特殊的培养基以体外培养在上述过程中获得的脂肪来源干细胞。
在细胞培养开始之前，由供应来源提取的生物样品可以用含有广谱抗生素的洗涤介质反复洗涤以将在随后的培养中出现污染的可能性降至最低。
在本发明中，培养基经优化使得所述脂肪来源干细胞中的生长因子得以最大程度地合成和分泌。
具体而言，所述脂肪来源干细胞的体外培养如下进行，即在血清培养基中培养所述细胞，然后在无血清培养基中传代培养所述细胞，使得生长因子的合成最大化。
用于初始细胞培养的含有血清的培养基优选为适用于保持和保存细胞类型诸如脂肪来源干细胞的培养基。
在本发明中，所述培养基基于Dulbecco的改良的Eagle的培养基(DMEM)，在本领域其通常使用在细胞培养中，并含有通常在细胞培养中使用的血清。
此处，所述初始培养基也可以是通过向其中加入7％～10％二甲基亚砜(DMSO)获得的冷冻培养基，并因此所述干细胞能被冷冻，然后在需要时可在使用前解冻。
作为所述血清，优选加入0.1％～20％胎牛血清(FBS)，更优选向所述培养基加入抗生素试剂、抗真菌试剂和防止能引起污染的支原体(micoplasma)生长的试剂。
作为所述抗生素试剂，可使用在通常细胞培养中采用的所有抗生素试剂，包括青霉素-链霉素。作为所述抗真菌试剂，优选为使用两性霉素B，而作为所述支原体抑制试剂，优选为使用泰乐菌素。此外，可以用庆大霉素、环丙沙星和阿奇霉素等防止所述支原体污染。如果需要，氧化营养物诸如谷氨酰胺和能量代谢物诸如丙酮酸钠也可进一步加入到所述培养基中。
更优选的培养基含有1mM～2mM谷氨酰胺、0.5mM～1mM丙酮酸钠、0.1％～10％FBS、1％抗生素(100IU/ml)-补充有葡萄糖和DMEM，并称之为″完全血清培养基″。此处，葡萄糖的浓度为约1g/L～4.5g/L。所述完全血清培养基提供了脂肪来源干细胞的保存和保持和稳定的体外基本培养条件并显示出有效的细胞稳定性。
关于所述初始培养的通常培养条件，应用了最适宜的细胞培养条件，因此在5％～10％CO2的条件下，所述细胞培养在湿度为90％～95％，温度为35℃～39℃的温育器中进行。当所述细胞培养在5％～10％CO2的条件下进行时，加入碳源诸如碳酸氢钠至最终浓度0.17％～0.22％。
在所述初始培养阶段，所述组织碎片优选保持贴附在所述培养瓶底部，通过根据标准细胞培养技术的胰蛋白酶-EDTA处理引起的短时刺激能促进所述细胞的生长。
保持累计种群倍增时间(cumulative population doubling time)直至培养瓶中所培养的细胞达到75％～85％的汇合。优选为，在80％的汇合时收集所述细胞，并在无血清培养基中传代培养以进行后阶段的培养。
本发明提供了用于所述生长因子分化的不含血清的培养基，其刺激脂肪来源干细胞中的所述生长因子的分化。
所述用于生长因子分化的使用了无血清培养基的传代培养过程优选通过如下过程进行，即通过用磷酸盐缓冲液洗涤所述培养瓶，从中移除培养基，用胰蛋白酶-EDTA使所述细胞悬浮，离心所述细胞悬浮液，然后用缓冲溶液洗涤所得沉淀，其中所述洗涤过程重复2～3次。所述经洗涤的沉淀悬浮于在本发明中开发的无血清培养基中，并在细胞培养瓶中传代培养约三次。
在本发明中开发的无血清培养基是基于不含有pH指示剂诸如酚红的DMEM，并且以大约1∶0.5至1∶2的比例向其中加入Ham′s F-12营养混合物(SIGMA，Cancer Research Vol 47，第1期，275-280)。此处，可加入氧化营养物诸如L-谷氨酰胺、能量代谢物诸如丙酮酸钠，和碳源诸如碳酸氢钠。此外，可不仅加入除在本发明中所选定的生长因子，而且还可以加入生长激素。
在本发明中开发出的无血清培养基的固有特征可在所述Ham′s F-12营养混合物中看到。在该混合物中，以给定的比例将各种无机物质和氨基酸和维生素营养物和其他因子相互混合，所述无机物质和氨基酸能协助保持所述细胞的生长和稳态，并涉及提高所述细胞在所述脂肪来源干细胞的初始阶段培养之后的后阶段培养中的安全和保持，所述维生素营养物能刺激选白所述脂肪来源干细胞的生长因子的更大量的制造。相比于含有动物血清的通常血清培养基的情况，所述在本发明中建立的含有Ham′s F-12混合物的无血清培养基对所述脂肪来源干细胞的培养和生长因子的制造没有显示出任何减少或者负面影响。同样，一些生长因子在所述无血清培养基中表现出更高的制造能力，所述培养基的所有组分和含量均可以测定，而不像由于血清导致的含有未知组分的血清培养基。
这表明由包含在血清培养基中的动物血清所导致的各种变数可以降至最小，与现有技术相比本发明的效果可以以约50％的低成本而实现。
以下表1指示了在本发明中建立的所述无血清培养基中含有的Ham′s F-12营养混合物的组分和含量。
表1
显而易见的是所述无血清培养基中的氨基酸、维生素和无机盐的组分和含量可被本领域技术人员所修改，只要该修改没有影响本发明的目的。
为实现本发明的目的，可通过由特定刺激活化根据以上方法培养的脂肪来源成体干细胞而促进目标生长因子的合成。此处，所述刺激可以在分为物理条件和化学条件的条件下进行。
物理刺激的例子包括UV线、营养和氧气，化学刺激的例子可包括用于细胞培养的培养基组合物中的维生素和其他活性化合物。
物理刺激
为了比用于培养脂肪来源成体干细胞的已有方法获得显著更大量的生长因子，施加了物理刺激，包括低氧反应(Circulation.2004年3月16日；109(10)：1292-8.)，UV照射(FASEB J.2003年3月；17(3)：446-8)，营养缺乏(Blood.2004年11月1日；104(9)：2886-92.Epub 2004年6月24日)，和机械摩擦。这些物理刺激可选择性地或者共同地增加本发明中所选定的生长因子。
为了验证所述物理刺激是否促进生长因子的合成和分泌，在本发明中，如上所述采用血清培养基以及随后采用无血清培养基体外培养所述脂肪来源干细胞，然后收集所述细胞并将所述培养基完全与所述细胞分离。在此状态下，所述细胞经受低氧培养、UV照射、营养缺乏和机械摩擦中的每一种，然后正常培养，并测量在所述脂肪来源干细胞的培养基中分泌的生长因子的浓度。
具体而言，所述低氧培养优选在约5％二氧化碳和1％～5％氧气的条件下进行36～48小时以获得生长因子的最大合成。所述UV照射优选通过照射紫外线B(波长为280nm～320nm、能量剂量为80mJ/cm2～120cm2)而进行。所述营养缺乏优选为通过以下方法而进行：紧接在所述细胞沉淀之前在含有Mg2+和Ca2+的Dulbecco的磷酸缓冲盐溶液中培养所述细胞达最长4小时，然后在通过向不含有pH指示剂诸如酚红的DMEM中以约1∶1的比例加入Ham′s F-12营养混合物获得的培养基中正常培养所述细胞。所述机械摩擦优选通过在格子(lattice)中向所述细胞培养基施加刮擦刺激而进行。
结果，bFGF在低氧刺激的情况下增加了1.74倍，在UV刺激的情况下增加了2.71倍。同样，当联合进行物理刺激中的低氧刺激和UV刺激时，显现出其协同效应(参见图9)。
VEGF在低氧刺激的情况下增加了2.53倍，在UV刺激的情况下增加了1.36倍，在使用机械摩擦的刮擦刺激的情况下增加了1.30倍。同样，当联合进行物理刺激中的低氧刺激、UV刺激和刮擦刺激时，显现出其协同效应(参见图10)。
TGFβ-1在低氧刺激的情况下增加了1.64倍，在UV刺激的情况下增加了1.75倍，在使用机械摩擦的刮擦刺激的情况下增加了2.13倍，以及在营养缺乏刺激的情况下增加了2.01倍。同样，当联合进行物理刺激中的低氧刺激和UV刺激时，显现出其协同效应(参见图11)。
化学刺激
对于化学条件，优选为将各种普遍广泛已知的活化化合物直接地或间接地暴露于个体。
可以加入到本发明的脂肪来源干细胞中的活化化合物包括与细胞衰老相关的视黄酸，作为其前体的长春西汀，用作此循环中的助剂的匹卡米隆(picamillon)，以及用作蛋白激酶的奎宁酸和奎宁酸盐。此外，在代谢中涉及的碳水化合物合成因子诸如腺嘌呤二核苷酸和乙酰-L-肉碱在细胞营养中扮演着重要角色，并且这些活化化合物包括其他添加剂，诸如可起停止凋亡作用的二甲基氨基乙醇，在细胞增殖中涉及到的硫辛酸和L-羟酸，在氨基酸制造中涉及的辅酶Q-10。如上所述，这些活化化合物可以在所述脂肪来源干细胞的培养中同时或单独加入。
本发明关注在各种活化化合物中维生素系列的刺激效果。
通常，已知在原发性免疫反应、与之相关的细胞发育过程以及一系列凋亡反应中涉及维生素A，其典型例子是视黄酸，其与视黄酸受体(RAR)相结合以调控和激活与之相关联的代谢过程。其中，与RAR-α、RXR-α和RXR-β相结合的复合物据报道能促进或抑制约128个基因的表达，这些基因涉及作为主要免疫细胞的T-淋巴细胞的发育。特别地，据报道，已知为典型抗凋亡蛋白的bcl2家族基因在凋亡机制中明确地增加(Rasooly，R.等，J.Immunol.，175：7916-7929(2005)；Spilianakis，C.G.等，Eur.J.Immunol.，35(12)：3400-4(2005)；Evans T，Exp.Hematol.，33(9)：1055-61(2005))。这表明维生素A能表现出抑制凋亡反应的效果。
维生素B通常已知为核黄素并在保持人体健康方面扮演着重要角色。在瑞典的一个研究小组报道了用该物质进行治疗显示出对嗜中性粒细胞迁移的作用，因此导致增加的原发性免疫应答(Verdrengh，M.和Tarkowski，A.，Inflamm.Res.，54(9)：390-3(2005))。预计该物质能增加由原发性免疫细胞的迁移导致的初始免疫应答。
维生素C具有促进胶原和成纤维细胞的合成的重要细胞内功能，其典型例子包括抗坏血酸。当其与其他细胞因子TGF-β和IFN-γ联合使用时，其作用进一步增强(Chung，J.H.等，J.Dermatol.Sci.，15(3)：188-200(1997))。维生素D3已被频繁使用，这是因为已知与其他维生素不同，它能影响细胞发育和分化。维生素D3介导细胞生长和发育过程中，尤其是表皮角化细胞和骨原细胞诸如成骨细胞和破骨细胞的形成过程中的重要信号传导系统。同样，它对多种细胞因子诸如在炎性反应中涉及的IL-1α、IL-6和IL-8d具有抑制作用(Alper，G.等，Endocr.Rev.，23：763(2002))。
在本发明中，维生素A、维生素C和维生素D中的任一种或混合物作为化学刺激条件以不导致细胞毒性的有效量加入到培养基中。
为了验证使用维生素的化学刺激是否促进生长因子的合成和分泌，在本发明中，如上所述采用血清培养基以及随后使用无血清培养基体外培养所述脂肪来源干细胞。然后收集所述细胞并用磷酸盐缓冲液洗涤以完全除去所述培养基，而所述细胞在如下获得的培养基中培养，即以约1∶1的比例将Ham′s F-12营养混合物加入到不含有pH指示剂诸如酚红的DMEM中，并向其中加入选自氧化营养物诸如L-谷氨酰胺、能量代谢物诸如丙酮酸钠和碳源诸如碳酸氢钠中的至少一种。将适宜量的选自维生素A、维生素B、维生素C和维生素D中的至少一种加入到所述培养基中，然后测量在所述脂肪来源干细胞的培养基中分泌的生长因子的浓度。
具体而言，维生素A的最佳浓度为2μM～5μM，维生素B2的最佳浓度是50μM～100μM，维生素C的最佳浓度是10μM～100μM，以及维生素D的最佳浓度是5μM～10μM。优选为，在将维生素加入到所述培养基中后，将所述培养进行超过48小时。当使用维生素混合物时，维生素的最佳浓度与上述相同。
结果，可以看到bFGF在维生素A的情况下增加了1.62倍，在维生素B的情况下增加了1.33倍，在维生素C的情况下增加了2.33倍，以及在维生素D的情况下增加了2.80倍。
同样，观察到VEGF在维生素A的情况下增加了1.59倍，在维生素B的情况下增加了1.68倍，在维生素C的情况下增加了1.68倍，以及在维生素D的情况下增加了1.30倍。
此外，观察到TGFβ-1在维生素A的情况下增加了1.20倍，在维生素B的情况下增加了1.56倍，在维生素C的情况下增加了1.20倍，以及在维生素D的情况下增加了1.16倍。
此外，观察到当维生素A、维生素B、维生素C和维生素D以上述最佳浓度加入到所述培养基中时，bFGF增加了3.62倍，VEGF增加了2.03倍，而TGFβ-1增加了1.68倍。
刺激组合
对于其中组合使用物理刺激和化学刺激的情况，将UV光照射到培养基中，然后将所述培养基立即用含有Ham′s F-12营养混合物和优化浓度的维生素A、B、C和D的DMEM培养基替换，并将所述培养基在低氧刺激的条件下培养最佳培养时间。在此情况下，bFGF增加了4.11倍。
同样，当将UV光照射到培养基中，随后施加刮擦刺激，然后将所述培养基立即用含有Ham′s F-12营养混合物和优化浓度的维生素A、B、C和D的DMEM培养基替换，并将所述培养基在低氧刺激的条件下培养最佳培养时间时，VEGF增加了3.92倍。
此外，当将UV光照射培养基中，随后施加刮擦刺激和营养缺乏，然后将所述培养基立即用含有Ham′s F-12营养混合物和优化浓度的维生素A、B、C和D的DMEM培养基替换，并将所述培养基在低氧刺激的条件下培养最佳培养时间时，TGFβ-1增加了2.35倍。
而且，对于bFGF、VEGF和TGFβ-1，最优选的是采用以下组合：低氧刺激、UV光刺激和维生素A、B、C和D。具体而言，在将UV光照射到培养基中之后，将所述培养基用含有Ham′s F-12营养混合物和优化浓度的维生素A、B、C和D的培养基替换，并将所述培养基在低氧刺激的条件下培养最佳培养时间。在此情况下，bFGF增加了4.11倍，VEGF增加了3.8倍，而TGFβ-1增加了1.9倍。
本发明的第二方面提供了根据第一方面的方法获得的培养基或纯化自所述培养基的人类生长因子的新型用途。
具体而言，根据本发明获得的脂肪来源干细胞培养基或者人类生长因子可用在用于抗皱、创口愈合和去疤的药物、准药物、药物补充物和化妆品中。
根据本发明获得的脂肪来源干细胞培养基包括通过以下情况获得的所有培养基：i)其中脂肪来源干细胞在无血清培养基中培养的情况；ii)其中脂肪来源干细胞在血清培养基中稳定，然后在无血清培养基中培养的情况；和iii)脂肪来源干细胞在培养过程中通过物理或化学刺激被活化。同样，本发明的人类生长因子包括通过纯化由上述培养方法获得的细胞或培养基而获得的所有人类生长因子。
优选为或者使用通过根据本发明的第一方面的优化方法在血清培养基以及随后在无血清培养基中培养细胞而获得的培养基，或者使用纯化自所述培养基的人类生长因子。
更优选为或者通过根据本发明的第一方面的优化方法在血清培养基以及随后在无血清培养基中培养细胞和在所述培养过程中通过物理或化学刺激而活化所述细胞从而获得的培养基，或者使用纯化自所述培养基的生长因子。
制造自脂肪来源成体干细胞的生长因子不同于通过已有方法合成的生长因子，即通过化学合成法由氨基酸合成的生长因子，和通过基因重组方法合成的生长因子。与这些通过基因重组方法或化学合成方法合成的生长因子相比，根据本发明制造的生长因子具有的优点在于它们在结构上类似于人体原有的生长因子，并因此具有优异的皮肤相容性和确保的安全性。
在功能方面，本发明的生长因子没有表现出异构体或三维立体特异性，并具有与人体生长因子相同的形式。因此，相比于通过重组或化学合成方法制造的生长因子，本发明的生长因子具有优异的活性。
具体而言，在本发明的生长因子和通过重组或化学合成方法制造的生长因子之间比较了成纤维细胞增殖的潜力。结果，可以看到根据本发明由脂肪来源干细胞制造的生长因子相比通过已有合成方法获得的生长因子而言具有优异的活性(参见表5)。
同样，或者是本发明的脂肪来源干细胞培养基或者是由所述培养基纯化所得的人类生长因子具有提高细胞内胶原合成、促进成纤维细胞增殖、抑制UV光导致的角化细胞增殖、缓解皮肤过度角化和去除皱纹的作用(参见表4、6、7和8，以及图6、12、13、14、15和16)。
因此，本发明的脂肪来源干细胞培养基或纯化自所述培养基的人类生长因子可有利地用作用于抗皱、创口愈合和去疤的药物、准药物、药物补充物和化妆品的原材料。特别是，根据本发明，可大量制造人类生长因子并解决现有技术中几乎不可能在没有其他操作的情况下由脂肪来源成体干细胞制造工业有效量的生长因子的问题。
以下，参考实施例进一步详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是可作出各种修改、补充和替换而不背离在所附权利要求中所披露的本发明的范围和精神。
实施例
实施例1
(1-1)脂肪来源干细胞的分离
收集自Leaders Clinic(首尔，韩国)的人类吸脂材料用相同体积的磷酸盐缓冲液洗涤，从所述吸脂材料中仅分离出脂肪组织。
在37℃，在5％CO2温育器中用0.075％胶原酶对所述脂肪组织的细胞外基质进行酶处理45分钟，然后所述经酶处理的脂肪组织在1200g离心5分钟以收集含有高密度干细胞的基质血管组分。沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤并使其通过70μm尼龙细胞过滤器以除去其他组织，用Histopaque-1077(SIGMA)从所剩余的材料中仅分离出包括红细胞的单核细胞和细胞碎片。
在37℃，在5％CO2温育器中，将所分离的单核细胞在含有Dulbecco的改良Eagle的培养基(DMEM)、10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素链霉素和0.17％碳酸氢钠的非诱导培养基中培养24小时，从中移除非粘附性细胞，从而分离出干细胞(参见图1)。
(1-2)脂肪来源干细胞的培养
分离自所述脂肪组织的干细胞的初始阶段培养是采用含有10％FBS的DMEM进行的。同样，1％青霉素-链霉素(100IU/ml，GIBCO)作为抗生素试剂加入，两性霉素E(0.5μg/ml，Amresco)作为抗真菌试剂加入，泰乐菌素(10μg/ml，Serva，Heidelberg)作为支原体抑制剂加入，以及再加入2mM谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠。所述培养在95％湿度和37℃的温度下，在5％CO2温育器中进行。在所述5％CO2培养时，以0.17％的最终浓度加入碳酸氢钠。
将在上节(1-1)中分离的干细胞以104细胞/ml的密度悬浮，将10ml所述细胞悬浮液转移至T25烧瓶(面积：25cm2；体积：50ml)中并在上述条件下培养。
保持累计倍增时间直至所培养的细胞在烧瓶中达到80％的汇合，并在80％的汇合时将所述细胞进行传代培养。
用PBS洗涤烧瓶中的培养基，用0.25％胰蛋白酶-EDTA(GIBCO)使所述细胞悬浮，然后离心所述细胞悬浮液。然后，测量所述细胞的数量和存活力，并将所述细胞传代培养三次。在所述传代培养过程中使用的无血清培养基是基于不含有pH指示剂诸如酚红的DMEM，并向其中以1∶1的比例加入Ham′s F-12营养混合物(SIGMA)。同样，向所述培养基中加入2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠，然后以0.1重量％的浓度加入碳酸氢钠。所述传代培养过程进行三次。
所述细胞数量测量和存活力测量如下进行，即混合0.1ml的所述细胞悬浮液和相同量的0.2％台盼蓝(SIGMA)，在显微镜下用血球计对已染色的细胞和未染色的细胞计数，并计算所述染色和未染色细胞相对于所述细胞总数的百分比。
(1-3)干细胞的鉴定
脂肪来源干细胞表达大量粘附蛋白和表面蛋白。作为这些蛋白SH-2、SH-3和SH-4单克隆抗体识别人类间质干细胞的表面表位。作为肽碱基序列和吸光率的分析结果，SH-3和SH-4被鉴定为CD73(ecto-5′-核苷酸酶)，而SH-2被鉴定为CD105(endoglin)。这些细胞表面标记由脂肪来源干细胞所共有(Barry，F.等，Biochem Biophys Res Commun.，289(2)：519-24(2001))。
通过进行所述脂肪组织来源干细胞的流式细胞术，并使用荧光活化细胞分选器(Beckman Coulter)进行干细胞的确认，所述脂肪组织来源干细胞为在初始培养、第一传代培养和第二传代培养中培养的脂肪组织来源干细胞。具体而言，用0.25％胰蛋白酶-EDTA收集所述细胞，用PBS洗涤并调整至105细胞/ml的细胞密度。然后，使所述细胞与间质干细胞特异性标记CD73-PE和CD105-FITC(BD Science)抗体反应，用氩激光在488nm进行分析。
在分离自脂肪组织的PLA细胞的流式细胞术结果中，所述初始分离的基质血管组分表现出与干细胞5.27％的同源性(参见图2)，在所述第二传代培养后，所述细胞表现出与CD73-PE的干细胞的92.32％的同源性，且与CD105-FITC的干细胞的90.67％的同源性(参见图3)。
实施例2
脂肪来源干细胞的活化生长因子的鉴定
为了验证脂肪来源干细胞是否合成生长因子，在与实施例(1-2)相同的培养基和培养条件下培养脂肪来源干细胞，然后通过逆转录聚合酶链式反应分析所述干细胞中的RNA。
具体而言，用RNeasy Plus迷你试剂盒(RNeasy Plus Mini kit(QIAGEN Corp.，Valencia，California))提取所述脂肪来源干细胞的总RNA，在37℃，采用MMLV-逆转录酶(Promega Corp.，U.S.A)通过PCR扩增所述RNA达45分钟。然后，将所述MMLV-逆转录酶在65℃失活45分钟。所述PCR反应溶液具有50μl的总体积并含有1.5mM MgCl2、0.25mM dNTP和2.5单位的Taq聚合酶(QIAGEN)。所述PCR反应在以下条件下在TGRADIENT(BIOMETRA)中进行：在94℃，3分钟的cDNA变性，然后每个循环由94℃时30秒(DNA变性)，60℃时30秒(退火)和72℃时30秒(延伸)构成的30次循环，之后在72℃进行5分钟的最终延伸。如上所述进行逆转录以合成cDNA，其随后用VEGF-β、bFGF和TGFβ-1的引物进行逆转录-PCR(参见表2)。
表2
在RT-PCR中使用的引物的碱基序列
| 正向引物 | 反向引物 | |
| VEGF | 5′-TACCTCCACCATGCCAAGTG-3′；SEQ ID NO：1 | 5′-TGATGATTCDTGCCCTCCTCC-3′；SEQ ID NO：2 |
| bFGF | 5′-GACGGCAGAGTTGACGG-3′；SEQ ID NO：3 | 5′-CTCTCTCTTCTGCTTGAAGTTGTAGC-3′；SEQ ID NO：4 |
| TGFβ-1 | 5′-GCTGAGCGCTTTTCTGATCCT-3′；SEQ ID NO：5 | 5′-CGAGTGTGCTGCAGGTAGACA-3′；SEQ ID NO：6 |
结果，对应于SEQ ID NO：7的482-bp bFGF产物(1522bp～2003bp)，对应于SEQ ID NO：8的343-bp VEGF产物(1080bp～1422bp)，和对应于SEQ ID NO：9的212-bp TGFβ-1产物(2119bp～2330bp)，经鉴定为所述脂肪来源干细胞中的生长因子(参见图4)。
同样，为了验证生长因子是否存在于培养基中，进行了酶联免疫吸附测定。
具体而言，将1ml通过在实施例1-2的条件下培养脂肪来源干细胞至第3代(passage 3)而获得的培养基在1200g离心5分钟。然后通过0.22mm过滤器过滤出去细胞残留物。将滤过物系列稀释以确定不发生非特异性反应的最佳条件。然后，用夹心ELISA试剂盒(Quantikine HumanFGF basic Immunoassay，R&D systems)测量所述培养基中分泌的每种生长因子VEGF、bFGF和TGFβ-1的浓度。
为检验最佳稀释的生长因子的浓度，用所述试剂盒中的校准稀释液以相同的浓度比将培养基系列稀释，测定包括在所述标准曲线范围内的吸光率时的浓度，然后绘制出包括在所述标准曲线范围内的数值作为数据。将100ml的每种含有生长因子的培养基和生长因子标准溶液放置在用每种生长因子的抗体(Quantikine Human FGF basic Immunoassay，R&Dsystems)包被的每个孔中，并在室温下培养2小时。在抗原-抗体结合反应完成后，每个孔用清洗缓冲液清洗四次，将结合有每种生长因子的二抗的200ml溶液(Quantikine Human FGF basic Immunoassay，R&D systems)放置在每个孔中，随后在室温培养2小时。在二抗结合反应完成后，每个孔用清洗缓冲液清洗四次，将200ml显色试剂(四甲基联苯胺，R&Dsystems)加入到每个孔中，然后用ELISA读数器测量所述培养基在450nm处的吸光率。
结果，bFGF在12小时后显示54.96pg/ml的增加，24小时后显示76.393pg/ml的增加，而VEGF在12小时后显示87.021pg/ml的增加，24小时后显示163.52pg/ml的增加(参见图5)。
实施例3
脂肪来源干细胞对成纤维细胞的胶原生成的作用
皮肤皱纹形成的一个原因是胶原缺乏。胶原是主要的真皮蛋白并用以保持皮肤结构和结实。已知胶原的生成随着年龄增加而减少，而其分解也增加从而诱发真皮层的塌陷，从而形成皮肤皱纹。因此，抗皱物质的效果可以通过测试胶原的生成和分解来证实。
(3-1)脂肪来源干细胞和成纤维细胞的共培养
通过脂肪来源干细胞和成纤维细胞的共培养来评估脂肪来源干细胞对成纤维细胞的胶原生成的作用。在所述测试中，当脂肪来源干细胞与成纤维细胞在transwell insert(Costar，Corning)中共培养时，成纤维细胞中胶原的生成的增加与在成纤维细胞的单培养中胶原的生成进行比较。
a)共培养
通过以下获得成纤维细胞(原代细胞系)：精确切割悬浮在PBS中的人体皮肤组织的一部分(Department of Laboratory Medicine，HangangSungsim Hospital；九岁；circumcison fragment)，用50～100ml的胰蛋白酶搅拌所述切割组织20分钟，离心所述经搅拌的组织，然后用7mm尼龙过滤器过滤所述组织。
将所述过滤细胞悬浮液接种在培养皿的底部并加入含有青霉素(100IU/mL)、链霉素(100g/mL)和10％FBS的DMEM培养基。然后，所述细胞在37℃，含有5％二氧化碳的温育器中培养。达到80％汇合的成纤维细胞以5×104/孔的密度被分配到6-孔板中并按照与所述传代过程相同的培养条件培养24小时。
在实施例(1-1)中分离的脂肪来源干细胞按照与成纤维细胞情况相同的条件在transwell insert中培养24小时，然后将所述transwell insert插入到其中培养了成纤维细胞的6-孔板中。所述干细胞和成纤维细胞在所述6-孔板中共培养。此时，所述transwell insert以下的培养基被弃去，所述6-孔板用PBS洗涤，向其中加入新鲜培养基，然后共培养所述成纤维细胞和所述脂肪来源干细胞。
在所述培养后24小时和72小时取出1ml的共培养培养基，测量在所述培养基中的胶原的量。
在对照组测试中，达到汇合的成纤维细胞以5×104细胞/孔的密度被分配到6-孔板中，然后培养24小时。将其中没有接种脂肪来源干细胞的transwell insert插入所述6-孔板。
b)胶原生成活性的分析
1)采用酶联免疫吸附测定(ELISA)的胶原量的测量
使用Procollagen I型肽EIA试剂盒(TAKARA BIOMEDICAL Co.)进行胶原量的测量。将100ml的抗体-PoD偶联物溶液放置在每个孔中。然后，将经过用校准稀释液最佳地稀释以包括在胶原标准曲线中的20μl成纤维细胞，以及经与脂肪来源干细胞共培养的20μl成纤维细胞放置在每个孔中并在37℃静置3小时。然后，每个孔用清洗缓冲液清洗四次，将100μl的显色试剂加入到每个孔中，随后在室温下培养15分钟。然后，用ELISA读数器在450nm测量所述培养基的吸光率。
2)采用半定量PCR的细胞中胶原量的测量
用RNeasy plus迷你试剂盒(QIAGEN)提取与干细胞共培养的成纤维细胞的总RNA，通过PCR在含有200单位MMLV-逆转录酶(Promega)、50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、10mMdNTP、25单位的RNase抑制剂和20pM Oligo-dT的反应溶液中对3μg的所提取的RNA进行扩增。所述PCR反应在37℃在T-GRADIENT(BIOMETRA)中进行45分钟，然后在65℃使所述MMLV-逆转录酶失活15分钟。根据在NCBI Genbank中记录的碱基序列构建用于胶原I型(GenBank No.NM-000089)检测的特异性碱基序列，并列在以下表3中。
表3
用于胶原I型检测的特异性碱基序列
| 正向引物 | 反向引物 | |
| 胶原I型 | 5′-CCCTCAAGGTTTCCAAGGAC-3′；SEQ ID NO：10 | 5′-ACCAGGTTCACCCTTCACAC-3′；SEQ ID NO：11 |
结果，如图6所示，相比于所述对照组，细胞内胶原合成的量在1天培养中增加了2.17倍，在3天培养中增加了1.27倍，而总胶原合成的量在1天培养中增加了1.44倍，在3天培养中增加了1.14倍。
(3-2)采用脂肪来源干细胞培养基的成纤维细胞的胶原合成
为了检验脂肪来源干细胞的培养基(条件培养基)对成纤维细胞的胶原合成的作用，进行western印迹分析(特异性蛋白检测)。
为收集脂肪来源干细胞的培养基，将5×105脂肪来源干细胞在传代培养后接种在T75烧瓶中。此处，无血清DMEM用作培养基。所述细胞在37℃，5％CO2温育器中培养3天，然后收获所述培养基并通过0.22μm注射过滤器进行过滤。所述滤过物用作以下测试中的无血清条件培养基。
成纤维细胞经过传代培养，然后以5×104细胞/孔的密度接种在6-孔板中的含有0.1％FBS的DMEM中。在所述细胞经培养24小时以后，所述培养基用上述无血清条件培养基进行替换。作为对照组，使用无血清DMEM。在12小时后，将血清调整为2％，并在培养30小时后，收获所述培养基并进行western印迹分析。
采用电泳试剂盒(Bio-rad)根据SDS-PAGE方法进行所述培养基的电泳。在所述电泳中，使用8％聚丙烯酰胺凝胶并转移至PVDF膜(Bio-rad)。然后，用含有5％脱脂干奶粉的TBST(50mM Tris，pH8.0，138mM NaCl，2.7mM KCl和0.1％(w/v)Tween 20)封闭所述印迹。将所述培养基与作为一抗的胶原I型(Santacruz)进行反应过夜，然后与作为二抗的过氧化物酶-兔抗山羊IgG(Zymed)进行反应30分钟。最后，将所述培养基与抗体检测试剂(ECL，Milipore)反应1分钟，观察所述测试结果。
结果，如图16所示，与未用成纤维细胞处理的培养基相比，用成纤维细胞处理过的脂肪来源干细胞培养基显示出超过2倍的胶原量的增加(用基因工具软件进行量化，增加2.16倍)。这证明了脂肪来源干细胞的培养基提高了成纤维细胞的胶原合成，并因此提示所述脂肪来源干细胞的培养基可用作用于防止皮肤衰老的抗皱物质。
实施例4
脂肪来源干细胞对成纤维细胞增殖的刺激
如实施例(1-2)所述将分离自脂肪组织的干细胞培养至第3代，然后将所述干细胞的106细胞接种在T175烧瓶(面积：175cm2；和体积：500ml)中并培养3天。收集所述干细胞培养基，并以10％、25％、50％和100％的浓度加入到6-孔板中，其中来自9岁男孩(Department of LaboratoryMedicine，Hangang Sungsim Hospital；9岁；circumcison fragment)的皮肤组织的第4代成纤维细胞以25,000细胞/孔的密度分配在其中。
三天后，用细胞存活力测量试剂盒(细胞计数试剂盒-8，DojindoMolecular Technologies，Inc.)测量所述成纤维细胞的增殖，然后用ELISA读数器在450nm测量所述细胞的吸光率。
结果，如表4所示，证明了由所述脂肪来源干细胞分泌的生长因子刺激了成纤维细胞的增殖。同样，观察到随着由脂肪来源干细胞分泌的生长因子的浓度增加，刺激了成纤维细胞的增殖(参见图7)。
表4
在不同浓度的含有分泌自脂肪来源干细胞的生长因子的培养基中的成纤维细胞的数目
| 分类 | 细胞 |
| 普通培养基(对照组) | 35000 |
| 用10％ADSC传代3次(3-passage)3天培养的培养基处理 | 45000 |
| 用25％ADSC传代3次3天培养的培养基处理 | 93000 |
| 用50％ADSC传代3次3天培养的培养基处理 | 180000 |
| 用100％ADSC传代3次3天培养的培养基处理 | 240000 |
实施例5
分泌自脂肪来源干细胞的生长因子和在大肠杆菌(E.coli)中表达的重组生长因子的比较
如实施例(1-2)所述，将分离自脂肪组织的干细胞培养至第3代，然后将所述干细胞的106细胞接种在T175烧瓶(面积：175cm2；和体积：500ml)中并培养3天。收集所述培养基，并以100％的浓度加入到6-孔板中，其中来自9岁男孩的皮肤组织的第4代成纤维细胞以5000细胞/孔的密度分配在其中。作为对照组，使用含有相同浓度的在大肠杆菌(E.coli)中表达的重组生长因子VEGF和bFGF(Santa Cruz.)的培养基。使用细胞存活力测量试剂盒比较所述脂肪来源干细胞培养基和所述含有重组生长因子的培养基之间的细胞增殖潜能。
结果，当通过使用遗传重组方法在E.coli中过表达和分离的生长因子基因得到的生长因子与合成自成体干细胞的生长因子相比较时，证明了由所述脂肪来源成体干细胞合成的生长因子相比于通过已有合成方法得到的生长因子具有优异的效果。分析结果如以下表5所示。
表5
脂肪来源干细胞培养基和含有重组生长因子的培养基之间的细胞增殖潜能的比较
| 分类 | 细胞 |
| 普通培养基+rFGF(50ng) | 8215.3 |
| 普通培养基+rVEGF(500ng) | 4408.9 |
| 普通培养基+rFGF+rVEGF | 6727.1 |
| 用100％ADSC传代3次3天培养的培养基处理 | 17215 |
实施例6
具有提高的生长因子分泌的脂肪来源干细胞的培养方法
(6-1)物理刺激
如实施例(1-2)所述，将来源自脂肪组织的干细胞培养至第3代，当所述培养的细胞达到80％的汇合时，用胰蛋白酶/EDTA收集细胞。然后，将所述细胞以25,000细胞/孔的密度精确分配在6-孔板中。
在所述分配后24小时，当所述细胞全部贴附后，完全移除所述培养基，并将所述细胞在物理条件为含有5％二氧化碳和1％氧气的多气体温育器中培养，然后用波长280～320nm能量90mJ/cuf(型号BEX-800；Ultra-Lum，Inc.)(对应于UV B)进行照射。在营养缺乏反应中，立即将所述细胞在含有Mg2+和Ca2+的Dulbecco的磷酸缓冲盐溶液中培养最多4小时直至细胞沉淀，然后所述培养基用实施例(1-2)的无血清培养基替换。在使用机械摩擦的刮擦刺激中，粘附在所述板上培养的细胞培养基用大小为1mm×1mm的为格子形式的刀刃进行刮擦。
(6-2)化学条件
以约1∶1的比例将Ham′s F-12营养混合物加入到不含有pH指示剂诸如酚红的DMEM中，并向其中加入2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和0.17％碳酸氢钠而制备实施例(1-2)的无血清培养基，向所述无血清培养基加入不引起细胞毒性的有效水平的维生素A、B、C和D。将细胞在该培养基中培养。
将所述细胞在37℃，在5％二氧化碳温育器中培养在上述培养基超过48小时，然后将200μl的所述培养基上清液在3,000rpm离心并经过0.22μm过滤纸进行过滤。然后，通过实施例2的酶联免疫吸附测定(ELISA)测量过滤物中bFGF、VEGF和TGFβ-1的浓度。
在所述分析结果中，维生素A的最佳浓度为2μM～10μM，维生素B2的最佳浓度为50μM～100μM，维生素C的最佳浓度为10μM～100μM，而维生素D的最佳浓度为5μM～10μM。可以看到，在所述浓度，作为MTT分析的结果没有出现细胞毒性，本发明中的各目标生长因子的合成都增加了。
(6-3)对照组的培养条件
作为对照组，使用不经过物理刺激和化学刺激的普通培养基。在对照组和经过物理刺激和化学刺激的培养基之间比较生长因子的增加。
在培养过程中，细胞加入到通过以约1∶1的比例将Ham′s F-12营养混合物加入到不含有pH指示剂诸如酚红的DMEM中，并向其中加入2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和0.17％碳酸氢钠而制备的无血清培养基中。然后将所述细胞在37℃，在5％二氧化碳温育器中培养超过48小时，然后将200μl的所述培养基上清液在3,000rpm离心并经过0.22μm过滤纸进行过滤。然后，通过实施例2的酶联免疫吸附测定(ELISA)测量bFGF、VEGF和TGFβ-1的浓度。
(6-4)刺激组合
现在描述其中组合使用物理刺激和化学刺激的情况。对于bFGF，将UV光照射到培养基中，然后所述培养基立即用含有Ham′s F-12营养混合物和优化浓度的2μM维生素A、50μM维生素B、10μM维生素C和10μM维生素D的DMEM培养基替换。所述培养基在1％氧气和5％二氧化碳的低氧刺激条件下培养48小时。
对于VEGF，用UV光照射培养基并随后经过刮擦刺激。然后所述培养基立即用含有Ham′s F-12营养混合物和优化浓度的2μM维生素A、50μM维生素B、10μM维生素C和10μM维生素D的DMEM培养基替换。所述培养基在1％氧气和5％二氧化碳的低氧刺激条件下培养48小时。
对于TGFβ-1，用UV光照射培养基随后施加刮擦刺激和营养缺乏刺激。然后所述培养基用含有Ham′s F-12营养混合物和优化浓度的2μM维生素A、50μM维生素B、10μM维生素C和10μM维生素D的DMEM培养基替换。所述培养基在1％氧气和5％二氧化碳的低氧刺激条件下培养48小时。
为获得bFGF、VEGF和TGFβ-1的最高总量，用UV光照射培养基，然后用含有Ham′s F-12营养混合物和优化浓度的2μM维生素A、50μM维生素B、10μM维生素C和10μM维生素D的DMEM培养基替换。所述培养基在1％氧气和5％二氧化碳的低氧刺激条件下培养48小时。
(6-5)结果
如图9所示，与对照组相比较，bFGF在低氧刺激的情况下增加了1.74倍，在UV光刺激的情况下增加了2.71倍。在化学刺激的情况下，bFGF对于维生素A增加了1.62倍，对于维生素B增加了1.33倍，对于维生素C增加了2.33倍，而对于维生素D增加了2.80倍。
当在上述刺激中具有优异效果的低氧刺激和UV光刺激组合进行时，显示出其协同效应。在化学刺激的情况下，在含有优化浓度的维生素A、B、C和D的培养基中bFGF增加了3.62倍。在组合施加物理刺激和化学刺激的情况下，当低氧刺激被优化，UV光照射并且维生素A、B、C和D的浓度得以优化时，bFGF增加了4.11倍。
如图10所示，与对照组比较，血管内皮生长因子(VEGF)在低氧刺激的情况下增加了2.53倍，在UV光刺激的情况下增加了1.36倍，而在通过机械摩擦引起的刮擦刺激的情况下增加了1.33倍。在化学刺激的情况下，VEGF对于维生素A增加了1.59倍，对于维生素B增加了1.56倍，对于维生素C增加了1.68倍，对于维生素D增加了1.30倍。
当在上述刺激中具有优异效果的低氧刺激和UV光刺激组合进行时，显示出其协同效应。在化学刺激的情况下，在含有优化浓度的维生素A、B、C和D的培养基中VEGF增加了2.03倍。
在组合施加物理刺激和化学刺激的情况下，当低氧刺激被优化，使用UV光照射和刮擦刺激，并且维生素A、B、C和D的浓度得以优化时，VEGE能增加了3.92倍。
如图11所示，与对照组比较，转化生长因子β-1(TGFβ-1)在低氧刺激的情况下增加了1.64倍，在UV光刺激的情况下增加了1.75倍，在通过机械摩擦引起的刮擦刺激的情况下增加了2.13倍，和在营养缺乏刺激的情况下为2.01倍。在化学刺激的情况下，TGFβ-1对于维生素A增加了1.20倍，对于维生素B增加了1.56倍，对于维生素C增加了1.20倍，对于维生素D增加了1.16倍。
在上述刺激中具有优异效果的低氧刺激和UV光刺激组合进行时，显示出其协同效应。在化学刺激的情况下，在含有优化浓度的维生素A、B、C和D的培养基中TGFβ-1增加了1.68倍。
在组合施加物理刺激和化学刺激的情况下，当低氧刺激被优化，使用UV光照射、刮擦刺激和低氧刺激，并且维生素A、B、C和D的浓度得以优化时，TGFβ-1能增加了2.35倍。
同样，为获得bFGF、VEGF和TGFβ-1的最高总量，最优选为培养基经过低氧刺激和UV光照射，并向所述培养基加入维生素A、B、C和D。具体而言，用UV光照射培养基，然后用含有Ham′s F-12营养混合物和优化浓度的维生素A、B、C和D的培养基替换，然后所述培养基在低氧刺激下培养经优化的培养时间。在此情况下，与对照组相比较，bFGF增加了4.11倍，VEGF增加了3.8倍，而TGFβ-1增加了1.9倍。
实施例7
脂肪来源干细胞防UV光的角化细胞防御效果
按照以下方式测试由脂肪来源干细胞分泌的生长因子防UV光的角化细胞防御效果。
以适宜的细胞浓度将角化细胞分配到6-孔板中，并在37℃，在5％二氧化碳温育器中，加入到KGM(角化细胞生长培养基；Clonetics.)中。向所述培养基，加入2.5cc的100％ADSC传代3次3天培养的培养基以调整所述KGM至5cc。同样，将2μM视黄醇加入到5cc的KGM中。以及，作为阴性对照组，向角化细胞独自施用5cc的KGM。每个测试样品稳定4小时，使得所述原材料充分分散。此后，在无菌实验室里用40W双灯对每个测试样品进行8分钟的UV光照射。24小时以后，通过比较所述阴性对照组测定所述细胞的存活力对所述测试样品的UV防御功能进行测量，其中所述阴性对照组未用所述培养基或视黄醇处理，用UV光照射8分钟。
结果，如以下表6所示，如实施例(1-2)所描述培养并含有VEGF、bFGF和TGFβ-1的细胞组显示出67％的防御效果，施用了视黄醇的细胞组显示出54％的防御效果，以及所述阴性对照组显示出55％的防御效果。这表明视黄醇具有较低的防UV光的防御效果，然而由脂肪来源干细胞分泌的生长因子具有提高的防UV光防御效果。
表6
抗衰老效果的测量结果
| 测试材料 | 防御效果 |
| 100％ADSC传代3次3天培养的培养基 | 67％ |
| 视黄醇 | 54％ |
| 阴性对照组 | 55％ |
实施例8
脂肪来源干细胞生长因子对裸鼠由UV光照射导致的皮肤光老化的作用
为了评价如实施例(1-2)所描述培养并含有VEGF、bFGF和TGFβ-1的培养基的活性，用三十只15～20周龄的裸鼠进行以下试验。
使用UV模拟器用2mJ/cm2剂量的UV光照射裸鼠的背部，每周进行两次，持续四周，因此诱发皮肤的异常过度角化。然后，将通过化学合成方法合成的生长因子、通过基因重组方法合成的生长因子和由脂肪来源成体干细胞合成的生长因子以1cc的量施用在所述裸鼠的背部的一侧，每天两次，持续2周，而另一侧未经处理用于比较。在2周后，目视观察和评价所述生长因子的抗衰老效果(Jin Ho Chung等Archives ofDermatology，137-8(2001))。所述测量结果显示在以下表7中。
表7
抗衰老效果的测量结果
| 明显效果(小鼠数量) | 中等效果(小鼠数量) | 没有效果(小鼠数量) | |
| 100％培养基 | 23 | 7 | 0 |
| 阴性对照组 | 4 | 8 | 18 |
当将各生长因子施用于人工诱导衰老的裸鼠时，由脂肪来源成体干细胞合成的生长因子在所有30只动物中均显现出减少异常皮肤过度角化的效果，与通过所述化学合成方法或所述基因重组方法合成的生长因子相比，该效果是优异的。
实施例9
人类中由自体脂肪来源干细胞分泌的生长因子的抗皱效果
为了验证由脂肪来源成体干细胞合成的生长因子对30岁～50岁妇女的抗皱效果，选择了每测试组20人并进行了以下试验。
将1cc经纯化具有30ng的VEGF含量、30ng的bFGF含量和70ng的TGFβ-1含量的脂肪来源干细胞培养基施用在每个妇女受试者的肘部或一只眼睛的周围，一天2次，持续8周，阴性对照组(1cc的生理盐水作为基本溶液)施用在另一只眼睛周围进行比较。在4周和8周之后，目视观察所述测试样品的减皱效果，所述测量结果总结在以下表8之中。
表8
测量结果
| 明显效果(人数) | 中等效果(人数) | 没有效果(人数) | |
| 含有生长因子的培养基 | 8 | 12 | 0 |
| 阴性对照组 | 2 | 4 | 14 |
从表8和图12～15的结果可以看出，施用由成体干细胞合成的生长因子显示出优异的减皱效果。
工业应用性
根据本发明的方法制造的人类生长因子是具有确保的稳定性和生理活性的物质，因此可用于开发用于抗皱、创口愈合和去疤的药物、准药物和化妆品等。
同样，本发明的脂肪来源干细胞培养基含有大量的各种生长因子，因此可将其本身用在用于抗皱、创口愈合和去疤的药物、准药物和化妆品等中。
序列表
Claims (17)
1.由脂肪来源干细胞制造大量人类生长因子的方法，所述方法包括步骤：
(i)分离从哺乳动物脂肪细胞提取的脂肪来源成体干细胞；
(ii)在血清培养基中培养所述干细胞，和随后在无血清培养基中传代培养所述干细胞；和
(iii)向所述脂肪来源干细胞施加选自低氧培养、UV照射、营养缺乏和机械摩擦中的至少一种物理刺激，
其中所述人类生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和/或转化生长因子-β(TGF-β)。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括步骤(iv)：向所述培养基加入选自维生素A、维生素B、维生素C和维生素D中的一种或多种维生素。
3.由脂肪来源干细胞最大程度培养碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的方法，所述方法包括步骤：
(i)分离从哺乳动物脂肪细胞提取的脂肪来源成体干细胞；
(ii)在血清培养基中培养所述干细胞，和随后在无血清培养基中传代培养所述干细胞；和
(iii)用UV光照射所述干细胞，用含有选自维生素A、B、C和D中的一种或多种维生素的培养基替换所述培养基，和然后在低氧刺激的条件下在所述替换的培养基中培养所述干细胞。
4.由脂肪来源干细胞最大程度培养血管内皮生长因子(VEGF)的方法，所述方法包括步骤：
(i)分离从哺乳动物脂肪细胞提取的脂肪来源成体干细胞；
(ii)在血清培养基中培养所述干细胞，和随后在无血清培养基中传代培养所述干细胞；和
(iii)用UV光照射所述干细胞，向所述培养基施加刮擦刺激，用含有选自维生素A、B、C和D中的一种或多种维生素的培养基替换所述培养基，和然后在低氧刺激的条件下在所述替换的培养基中培养所述干细胞。
5.由脂肪来源干细胞最大程度培养转化生长因子-β(TGF-β)的方法，所述方法包括步骤：
(i)分离从哺乳动物脂肪细胞提取的脂肪来源成体干细胞；
(ii)在血清培养基中培养所述干细胞，和随后在无血清培养基中传代培养所述干细胞；和
(iii)用UV光照射所述干细胞，施加刮擦刺激，施加营养缺乏刺激，用含有选自维生素A、B、C和D中的一种或多种维生素的培养基替换所述培养基，和在低氧刺激的条件下在所述替换的培养基中培养所述干细胞。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中所述不含血清的培养基含有Ham′s F-12营养混合物。
7.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中所述低氧培养在5%碳和1%～5%氧的条件下进行。
8.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中所述UV照射是通过用具有波长为280nm～320nm的UV光以80mJ～120mJ的能量剂量照射而进行的。
9.如权利要求1或5所述的方法，其中所述营养缺乏是在含有Mg2+和Ca2+的缓冲溶液中进行的。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述机械摩擦是通过向所述细胞培养基施加刮擦刺激而进行的。
11.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中所述维生素A以2μM～5μM的量加入。
12.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中所述维生素B以50μM～100μM的量加入。
13.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中所述维生素C以10μM～100μM的量加入。
14.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中所述维生素D以5μM～10μM的量加入。
15.含有根据权利要求1所述方法获得的脂肪来源成体干细胞培养基的功能性化妆组合物。
16.如权利要求15所述的化妆组合物，其中所述功能性是抗皱或抗衰老活性。
17.用于抗皱和/或抗衰老的功能性化妆组合物，其含有干细胞的培养基，其中所述干细胞的培养基通过包括以下步骤的方法获得：
(i)分离从哺乳动物脂肪细胞提取的脂肪来源成体干细胞；和
(ii)在血清培养基中培养所述干细胞，和随后在无血清培养基中传代培养所述干细胞。
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