CN101589138A - 用于控制细胞外基质矿化的方法、基于上述方法的治疗方法以及其中使用的药物 - Google Patents

用于控制细胞外基质矿化的方法、基于上述方法的治疗方法以及其中使用的药物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及选择用于控制对象的组织中的细胞外基质矿化的候选治疗剂的方法。本发明进一步涉及一种细胞培养矿化模型，其包括在支持细胞外基质形成和基质成熟的条件下产生细胞外基质的细胞培养物、检测化合物、以及用于确定编码基质蛋白的基因的表达水平的手段和方法。

Description

用于控制细胞外基质矿化的方法、基于上述方法的治疗方法以及其中使用的药物
技术领域
本发明涉及用于选择控制骨矿化的生物活性化合物的方法。具体地，本发明涉及选择用于控制对象的组织中细胞外基质矿化的候选治疗剂的方法，以及涉及用于控制细胞外基质矿化的方法，尤其是伴随骨形成细胞和/或血管平滑肌细胞和/或其它异位、病理性钙化。本发明进一步涉及细胞培养矿化模型，其包括在支持细胞外基质形成和基质成熟的条件下产生细胞外基质的细胞的培养、检测化合物、以及用于确定编码基质蛋白的基因的表达水平的手段和方法。本发明还涉及治疗方法以及涉及在上述治疗方法中使用的药物。
背景技术
骨质疏松是一种疾病，其中骨的密度和质量降低，导致骨骼薄弱和骨折风险增加，尤其是脊柱、腕、髋、骨盆以及上臂。骨质疏松和伴随的骨折是死亡率和发病率的重要因素。骨质量在骨质疏松中是一个关键特征并且成骨细胞作为骨形成细胞以及破骨细胞引起骨吸收发挥关键作用。成骨细胞具有间充质来源(meschenchymalorigin)并且间充质干细胞分化成成骨细胞系是由许多内分泌因子、旁分泌因子以及自分泌因子加以调节的。在骨形成期间，成骨细胞产生有机细胞外基质(ECM)或类骨质(矿化前的不成熟基质)，其主要由I型胶原和非胶原蛋白组成。然后通过在其上沉积磷酸钙，这种ECM矿化以形成骨针(bone spicule)。骨矿化或骨化的起始需要磷酸钙晶体，尤其是羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)，沉淀和附着于ECM。
这种矿化过程并不是骨细胞特有的。它还发生在肥大软骨细胞中，作为在生长期间软骨内骨形成的一部分。此外，在血管钙化的病理条件中，认为血管平滑肌细胞(VSMC)ECM的矿化涉及血管钙化并且在关节软骨的钙化中，关节软骨的钙化伴随年龄的增大、变性的关节疾病(例如骨性关节炎)、以及各种代谢和遗传性疾病而发生。因此，ECM矿化是骨中的生理过程和软组织中的病理过程。
骨矿化以及具体地其调节是一种由许多因素调控的复杂过程，其中上述因素包括血清钙和磷酸盐浓度、激素、酶、以及ECM的结构。I型胶原的大分子组织是一种促进骨矿化的因素。起初，磷酸钙沉积在胶原原纤维的洞中，后来则填充在胶原原纤维内的小孔中和间隙内。
血管钙化以及特定的动脉钙化很久以来被认为是一种被动过程，其涉及斑块(噬斑)的坏死核心作为磷酸钙矿物沉积的成核中心。最近的科学见解已攻击这种假说，因为各种细胞外基质(ECM)分子(包括基质Gla蛋白和护骨素)的遗传畸变导致自发性动脉钙化，这表明和骨矿化一样，动脉钙化是一种被精细调节的过程。
很明显，希望可以控制ECM矿化过程，如在骨质疏松和骨折愈合的情况下促进矿化的方向，以及如在血管钙化，尤其是动脉粥样硬化性钙化、以及软骨钙化的情况下降低或防止矿化的方向。
本发明的一个目的是提供用于选择候选治疗剂的方法，其中候选治疗剂用于控制对象(优选哺乳动物，最优选人)组织中细胞外基质的矿化。本发明的另一个目的是提供一些方法，这些方法用于控制在哺乳动物，优选人的软组织中的ECM矿化，尤其是相对于软骨和血管的病理性钙化，如产生ECM的VSMC的矿化和动脉粥样硬化。本发明的又一个目的是提供控制方法，一方面通过提供刺激矿化的可能性，而另一方面通过提供减少或防止矿化的可能性。本发明的进一步的目的是提供在上述方法中应用的药物组合物和药剂。
发明内容
在第一方面，本发明提供了用于选择候选治疗剂的方法，其中候选治疗剂用于控制在对象的组织中的细胞外基质的矿化，所述方法包括以下步骤：
a)在支持细胞外基质形成和基质成熟的条件下，将来自所述组织并产生细胞外基质的细胞暴露于检测化合物；
b)确定在所述细胞中至少一种基因响应于所述暴露的表达，其中所述基因选自：
-A组，由编码以下物质的基因组成：血小板反应蛋白1；
V型胶原α1；XVI型胶原α1；VIII型胶原α2；胶原三股螺旋重复蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1)；透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1；硫酸软骨素蛋白多糖2(多功能蛋白聚糖)；潜在的转化生长因子β结合蛋白2；双糖链蛋白多糖(biglycan)；基质金属肽酶2(matrix metallopeptidase 2)；成骨细胞特异性因子2(periostin)、成骨细胞特异性因子；抗“衰老关键蛋白”抗体(fibulin 5)；SPOCK1、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(Sparc)/骨连蛋白、cwcv和kazal样结构域蛋白聚糖(睾丸蛋白聚糖)；以及具有1型血小板反应蛋白基序的ADAM金属肽酶(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1motif)；和/或
-B组，由编码以下物质的基因组成：CD248抗原、内皮唾酸蛋白(endosialin)；弹性微原纤维界面蛋白2(elastinmicrofibril interfacer 2)；matrilin 2；异连蛋白α(dystrobrevin，alpha)；IV型胶原α6；巢蛋白2(骨巢蛋白)；乳突淋蛋白、蛋白聚糖样硫酸糖蛋白(papilin，proteoglycon-like sulfatedglycoprotein)；C型凝集素结构域家族3、成员B(C-type lectindomain family 3，member B)；V型胶原α3；以及TIMP金属肽酶抑制剂4；以及
c)在所述至少一种基因在所述细胞中的表达作为所述暴露的直接结果被调节的情况下，选择所述检测化合物作为候选治疗剂来控制在对象的组织中细胞外基质的矿化。
将来自组织的产生细胞外基质的细胞暴露于检测化合物的步骤持续一段时间(即，从几小时至数天或更长时间)以有效地对细胞基因表达产生反应。因为细胞的基因的所有组成成分还受到其它外部条件的影响，所以应在有检测化合物存在的情况下将细胞放置在支持细胞外基质形成和基质成熟的条件下。
确定至少一种基因在细胞中表达的步骤可以适当地包括确定选自如上所述的A组和B组的两种基因，更优选3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24种基因的表达水平。更优选地，确定了A组的至少一种基因的表达水平的增加或降低，其连同B组的至少一种基因的表达水平的相伴随的降低或增加(即相反的)。在一种最优选实施方式中，确定了基本上所有A组基因的表达水平的增加或降低，其连同基本上所有B组基因的表达水平的相伴随的降低或增加。因此，最优选地，相对于B组基因的表达来确定A组基因的相对表达，其中在A组基因的相对下调与B组基因的相对上调同时发生的情况下(反之亦然，这取决于药剂是否有效抑制或刺激基质成熟以及随后的矿化)，检测化合物被确定为用于控制矿化的候选治疗剂。
上述用于选择候选治疗剂的方法适当地用筛查化合物对矿化的治疗效果的细胞培养模型(矿化模型)加以说明。此细胞培养模型基本上是产生细胞外基质的细胞的培养，其中基质可以借助于磷酸钙沉积被矿化。发明人已发现，在可以确定化合物对基质的矿化潜力的影响以前，不需要完全矿化例如人成骨细胞或间充质干细胞的基质的矿化。矿化模型是基于以下理解：活化素信号导致阻断基质向成熟(可矿化或前矿化)状态的发展，该状态由基质蛋白的一定组成加以确定。基质发展的阻断是基质蛋白的基因表达调节的结果。因此，通过测量对特定基质蛋白的基因表达水平的影响，优选某些基因的上调和其它基因的下调，尤其是在如上述所限定的A组和B组之间，可以估计检测化合物对矿化施加(治疗)效应(或对其预防)的潜力，然后该检测化合物可以被确定为候选治疗剂并且最终通过使它可用于治疗目的加以选择。
在本发明的一种实施方式的各个方面，产生细胞外基质的细胞的培养可能包括敲除的细胞系(knockout cell lines)的细胞，其中涉及活化素信号级联放大或涉及基质成熟的一种或多种基因(例如，其编码涉及基质成熟的基质蛋白或转录因子)被敲除，例如通过使用本领域众所周知的siRNA方式。这样的细胞系可以形成各种矿化障碍的适当模型系统的基础，并且可以用来发现和最终选择中和或改善上述障碍的化合物，或确定用于治疗上述障碍的适当的治疗靶。
模型的有效性是通过抑制矿化的活化素A和可以中和活化素A的效应的卵泡抑素证实的。因此，本发明提供了筛选候选治疗剂的更加先进的方法，其是基于细胞培养矿化模型，其中确定了基质蛋白的表达。在以下实施例中说明了优选的模型。
细胞培养矿化模型基本上包括i)在支持细胞外基质形成和基质成熟的条件下，培养产生细胞外基质的细胞，ii)检测化合物，以及iii)用于确定由于将所述培养中的细胞暴露于所述检测化合物时，如上所述的A组和/或B组基因在细胞中的表达水平的手段和方法。模型的操作(该模型可以采用部件试剂盒的形式)涉及将检测化合物加入细胞培养基，从而将所述细胞暴露于所述检测化合物，使暴露可以持续前矿化期(pre-mineralization)的一段时间，以及确定如上所述的A组和/或B组的至少一种基因在细胞中的表达水平，其作为暴露结果的对表达的调节，优选如下所述的特定基因表达的具体上调和下调，则表明检测化合物作为候选治疗剂来控制在对象组织中细胞外基质的矿化的潜力。
在本发明的一种方法中，可以通过测量转录自所述至少一种基因的mRNA水平的任何方式、或通过所述细胞或所述细胞外基质的蛋白质分析，来确定所述至少一种基因的表达。用于确定如上所述的A组和/或B组基因在细胞中的表达水平的手段和方法适宜地涉及核酸阵列(基因芯片阵列)和杂交实验，其用于确定在组织细胞中的基因表达水平。这样的杂交实验在本领域是众所周知的并且通常涉及将mRNA逆转录成cDNA，在标记有可检测标记的核苷酸存在的情况下扩增获得的cDNA以产生标记cDNA扩增产物，在严格的杂交条件下将标记cDNA杂交于在核酸阵列上的核酸，除去非杂交产物，并且通过检测标记来检测在阵列上的杂交。
在本发明的用于选择候选治疗剂的方法的一种特别优选的实施方式中，其中候选治疗剂用于控制矿化，该候选治疗剂是用于刺激矿化、骨愈合、骨形成和/或用于治疗骨质疏松。在这样的方法中，细胞优选为成骨细胞。在这样的方法的另一种实施方式中，当如本文中所限定的A组的至少一种基因被下调和/或如本文中所限定的B组的至少一种基因被上调时，检测化合物被确定为用于刺激矿化、骨愈合、骨形成和/或用于治疗骨质疏松的候选治疗剂。可以通过使用任何化合物，优选卵泡抑素的功能类似物、活化素A抑制剂、活化素A抑制剂的诱导剂以及II型活化素受体的拮抗剂作为检测化合物，来适当地实施上述方法。
在根据本发明确定候选治疗剂以后，可以可选地证实治疗剂控制基质矿化的适宜性。这样的验证分析可以包括以下步骤：将培养细胞持续暴露于候选治疗剂一段时间，其持续基质的成熟阶段并进入该阶段，在该阶段中基质的发展涉及磷酸钙沉积(矿化)的阶段。为达到该阶段，暴露的持续时间优选大于12天(开始矿化)，优选大于15天，更优选约19天，或至少刚好进入矿化阶段。于是实验包括测量在所述基质中的磷酸钙沉积以估计治疗剂对矿化的真正的效果。可以使用适宜的控制化合物如活化素A(作为矿化抑制剂)或卵泡抑素(作为活化素A的抑制剂)。用于测量基质中磷酸钙沉积的实验在本领域是众所周知的并且可以基于基质钙含量的测定。这可以通过使用基于邻甲酚酞类氨羧络合剂(ortho-cresolphthaleincomplexone)测量钙的显色剂来进行比色(参见例如美国专利4,448,889和4,871,678)。可替换地，可以使用茜素红S染色(例如，如商业上可获得的来自Millipore Corporation的骨生成定量试剂盒(Osteogenesis Quantitation Kit)的形式)。
在本发明的用于选择控制矿化的候选治疗剂的方法的另一种特别优选的实施方式中，候选治疗剂是用于预防矿化或用于治疗钙化症。钙化症可以例如是病理性钙化，其选自由以下组成的组：动脉粥样硬化性钙化，转移性肺钙化，心脏瓣膜钙化，以及伴随腱炎的关节内钙化；关节炎；滑囊炎；骨刺；皮肤骨化；肾结石；骨化性肌炎；肺骨化；白内障；双侧纹状体苍白球齿状体钙质沉着症(bilateral striopallidodentate calcinosis)；神经源性异位骨化以及骨肉瘤。在这样的方法中，细胞优选为血管平滑肌细胞。在这样的方法的另一实施方式中，当如本文中所限定的A组的至少一种基因被上调和/或如本文中所限定的B组的至少一种基因被下调时，则检测化合物被确定为用于预防矿化或用于治疗钙化症的候选治疗剂。可以通过一些化合物来适当地实施上述方法，其中所述化合物包括活化素A(activin A)的功能类似物、活化素A的内源性诱导剂以及II型活化素受体的激动剂。
另一方面，本发明提供了用于预防矿化或用于治疗钙化症的治疗剂，其中所述候选治疗剂是活化素A。
又一方面，本发明提供了用于预防矿化或用于治疗钙化症的药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的活化素A和药学上可接受的赋形剂(vehicle)。
另一方面，本发明提供了一种治疗剂，该治疗剂用于刺激矿化、骨愈合、骨形成和/或用于治疗骨质疏松，其中所述候选治疗剂是卵泡抑素(follistatin)。
又一方面，本发明提供了用于预防矿化或用于治疗钙化症的药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的活化素A和药学上可接受的赋形剂。
在用于治疗或预防病理性钙化的方法中，产生所述细胞外基质的细胞优选为血管细胞，更优选为血管平滑肌细胞。可替换地，细胞可以是软骨细胞或在以下任何一种条件下驱动病理性钙化的细胞：转移性肺钙化、心脏瓣膜钙化、腱炎；关节炎；滑囊炎；骨刺；皮肤骨化；肾结石；骨化性肌炎；肺骨化；白内障；双侧纹状体苍白球齿状体钙质沉着症；神经源性异位骨化以及骨肉瘤。
又一方面，本发明涉及用于产生非矿化细胞外基质的方法。这样的基质基本上作为组织的一部分(例如类似细胞的聚集以及围绕它们的细胞间质)而产生，并且基质可以可选地分离自组织，尤其通过除去细胞。上述方法基本上包括在其中所述组织的细胞产生细胞外基质的条件下培养适宜的产生基质的组织。根据本发明的用于产生非矿化基质的方法，该方法是联合本发明的任何方法一起实施，其中防止或抑制基质的成熟和/或矿化。
又一方面，本发明涉及产生快速矿化细胞外基质的方法。这样的方法基本上类似于刚刚描述的针对产生非矿化基质的方法，但在这里该方法是联合本发明的刺激基质的成熟和/或矿化的任何方法一起实施的。
又一方面，本发明提供了用于诊断对象中骨质疏松的标志，其中所述标志是在所述对象的液体或组织样品中活化素A的量与卵泡抑素的量的比率，并且当和对照对象相比时其中所述比率是升高的。适宜的流体样品包括血液、血清、尿、唾液、滑液以及液体，而适宜的组织样品包括骨和软骨或其它结缔组织、肌肉组织、脂质组织、骨髓、血液(细胞)、以及肠上皮或皮肤。
附图说明
图1示出活化素信号对矿化的抑制。在有各种浓度的活化素A存在下培养成骨细胞(SV-HFO)19天。在第19天量化钙含量。和媒介物/赋形剂(vehicle)培养相比**p＜0.01。
图2示出活化素A在人类骨组织中的生产和定位。(A)抑制素/活化素亚单位和活化素I型和II型受体在成骨细胞(SV-HFO)培养中的表达(mRNA)。(B)人成骨细胞(SVHFO)生产的活化素A蛋白。在对照成骨细胞培养和被诱导矿化的成骨细胞培养的培养上清液中测量活化素A水平。对生产作培养DNA含量方面的校正。和对照培养相比，*p＜0.05；**p＜0.01；和矿化培养的第5天相比，#p＜0.01。(C)在人类骨组织中抑制素βA(INHBA)的免疫组织学染色(左图片；深棕(黑)色)和抑制素α(INHA)的免疫组织学染色(中心图片；没有着色)。小鼠IgG2b用作阴性对照(右图片；轻度着色)，此抗体并不与任何人细胞表面标志起反应。
图3示出成骨细胞培养(SV-HFO)中卵泡抑素对内源性活化素信号的抑制。图片(A)示出在没有(赋形剂)和有500ng/ml卵泡抑素存在的情况下响应各种活化素A浓度(0、5以及20ng/ml的细胞培养)，活化素效应报道构建体(CAGA-荧光素酶)的诱导效应(在开始处理后24h)。卵泡抑素明显降低荧光素酶检测的水平。(B)类似于(A)，仅使用BMP-效应报道构建体(BRE-荧光素酶)并且用BMP-2a而不是活化素A可选地联合卵泡抑素来处理培养物。很明显，没有观测到卵泡抑素的效应。(C)用卵泡抑素或活化素A处理成骨细胞培养物19天并在第19天测量钙含量。和赋形剂(vehicle)相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
图4示出活化素A和卵泡抑素之间的定量关系。(A)在对照和矿化条件下，在第5、12以及19天，人成骨细胞(SV-HFO)的卵泡抑素生产。(B)在第5、12以及19天，测量对照成骨细胞和矿化成骨细胞的培养上清液中的活化素A和卵泡抑素的浓度，随后计算活化素A和卵泡抑素之间的摩尔比。和对照成骨细胞相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
图5说明活化素信号的时间特定效应。(A)在开始矿化前(第0天至第10天)、在开始矿化以后(第10天至第19天)、在整个培养期间(第0天至第19天)，用活化素A处理成骨细胞(SV-HFO)，或未处理。在培养结束时(第19天)，测量钙含量。(B)在开始矿化前的特定的时间期限用活化素A处理成骨细胞(SV-HFO)。在第12天测量钙含量。(C)在有或没有活化素A存在的情况下，培养成骨细胞培养物(SV-HFO)12天。在第12天，固定培养物并通过冷冻杀死，随后在标准培养基中培养。当固定时以及在固定后的3天和7天后，测量钙含量。和未处理培养物相比，**p＜0.01。
图6示出在成骨细胞和血管平滑肌细胞中活化素A对矿化的抑制。在没有(顶行)和持续存在(底行)活化素A(20ng/ml)的情况下，两种不同的成骨细胞分化模型(SV-HFO和NHOst)以及血管平滑肌细胞(VSMC)被诱导矿化。利用1x和40x放大倍数的显微镜观察SVHFO培养物和NHOst培养物在第14天以及VSMC培养物在第30天用茜素红S染色使矿化可视化的结果。在没有活化素A的情况下矿化的诱导导致广泛的茜素红S染色，这表明在基质中存在钙(顶行)，而在有活化素A存在的情况下矿化的诱导导致几乎没有染色(底行)。
图7示出由活化素信号调节的基因的鉴定。该图是最初颜色配置的灰阶。(A)用赋形剂、活化素A(50ng/ml)以及卵泡抑素(500ng/ml)处理的成骨细胞培养物(SV-HFO)基于Affymetrix表达微阵列数据的选择查询的表型。选择这样的基因，在第5天和第12天，和赋形剂培养物相比，其在经活化素A处理的培养物中被上调(低矿化)，同时在经卵泡抑素处理的培养物中被下调(高矿化)，反之亦然。此外，在上述两天之一，在经活化素A和卵泡抑素处理的培养物之间基因表达的差异应至少是2倍，(B)520个Affymetrix探针集合的层次聚类(Hierarchical clustering)，其中探针集合匹配这种选择查询，其表示397种独特的基因和62个尚未注解的探针集合。和赋形剂培养物(V)相比，红色(上半部第5天F，下半部第5天″A″，上半部第12天″F″以及下半部第12天″A″)表示上调，而绿色(下半部第5天F，上半部第5天″A″，下半部第12天″F″以及上半部第12天″A″)表示下调。颜色强度表示调节的大小(幅度)。
图8示出定位在由活化素信号调节的细胞外基质中的基因的表达。该图是最初颜色配置的灰阶。提供的是基因的层次聚类，其匹配选择查询(图7)并且具有细胞外基质(ECM)GO注解。官方基因符号、基因名称以及affymetrix探针集合和在第5天以及第12天的基因调节列在一起。和对照培养物(V)相比，红色(提供有″+″)表示上调而绿色(″F″柱的顶部和″A″柱的底部)表示下调。
图9示出在成骨细胞(SV-HFO)和血管平滑肌细胞(VSMC)中，定位在由活化素信号调节的细胞外基质中的基因的表达。示于图8中的若干所选ECM基因的QPCR分析，联合ALPL作为阳性对照。在经活化素A处理和经卵泡抑素处理的成骨细胞(SV-HFO，第7天)和VSMC(第12天)培养物中对表达进行测量。在赋形剂培养物中的mRNA表达被设置为1并作为参考。和赋形剂相比，*p＜0.05；**p＜0.01。和卵泡抑素相比，#p＜0.05；##p＜0.01。
具体实施方式
为了提供对本说明书和权利要求的明确的和一致的理解，包括给定术语的范围，提供了以下定义。
术语″细胞外基质″，缩写为″ECM″，是指复杂的结构材料，其由哺乳动物组织中的细胞，尤其是结缔组织的细胞，例如这样的细胞如成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、以及间充质细胞所产生，并且该材料在体内围绕并支持这些细胞。通常，ECM由包埋在通常称作‘基质(ground substance)’中的纤维组成。纤维由结构蛋白组成，通常为胶原和/或弹性蛋白。在本发明的一些方面，基质的纤维优选为胶原。特别适宜的胶原是纤维形成胶原。I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原或X型胶原是特别优选的。最优选的是I型胶原。‘基质’由蛋白聚糖(或黏多糖)组成并且可以包括提供功能的蛋白如原纤蛋白、纤连蛋白、和/或层粘连蛋白。在本发明的一些方面，ECM适当地包含至少一种蛋白聚糖作为基质的成分。蛋白聚糖由具有悬挂着糖胺聚糖(GAG)分子的核心蛋白组成。适宜的GAG例如是透明质酸、软骨素-4-硫酸、软骨素-6-硫酸、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、硫酸肝素、以及硫酸角质素。借助于三糖接头(例如GalGalXyl接头)，GAG优选连接于核心蛋白。示例性的蛋白聚糖是装饰蛋白、双糖链蛋白多糖、多功能蛋白聚糖以及聚集蛋白聚糖。蛋白聚糖可以可选地通过透明质酸分子互联。可替换地，多种蛋白聚糖可以附着于单透明质酸骨架。在两种情况下基质均形成能够保存水的聚合物网络或凝胶。上述网络可以进一步包含这样的蛋白如：糖蛋白如层粘连蛋白、巢蛋白、腱生蛋白(tenascin)、原纤蛋白或纤连蛋白，用于改善网络的结构完整性以及用于将细胞附着于ECM；骨钙蛋白(Gla蛋白)，作为在矿化期间结合钙的蛋白；骨连蛋白，其在胶原和矿物成分之间发挥桥连作用；以及涎蛋白(sialoprotein)，如骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)、牙质基质蛋白-1(DMP1)、牙质涎磷蛋白(DSPP)以及细胞外基质磷酸糖蛋白(MEPE)。基质可以进一步包含细胞因子和生长因子。适宜的细胞因子和生长因子包括护骨素(OPG)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF、FGF-1、以及FGF-2)、干扰素-α(IFN-α)、白细胞介素(IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、以及IL-11)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-α和TGF-β)、肿瘤坏死因子(TNF)、胰岛素样生长因子(IGF-I和IGF-II)、破骨细胞分化因子(ODF，还称作OPGL[护骨素配体]、RANKL[NFB配体的受体激活子]、TRANCE[TNF相关激活诱导细胞因子])、以及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。其中大部分(IL-1、IL-4、IL-6、IL-11、TNF、EGF、bFGF、FGF-2、PDGF、以及M-CSF)刺激骨吸收。一些(IGF-I和IGF-II、FGF-2、以及TGF-3)增强骨形成，而其它的(OPG)则抑制骨吸收。还有一些(PDGF和TGF-β)还刺激胶原合成细胞的增殖和分化。优选的细胞因子是OPG。优选的生长因子包括BMP、IGF、PTH以及PDGF。当在本发明的一些方面中使用时，术语“细胞外基质”是指体内材料以及分离自产生它的细胞的分离形式的材料。在本发明的一些方面中的ECM可以是天然或人工材料(例如蛋白质水凝胶或肽水凝胶)。
如在本文中所使用的，术语″活化素″是指这样的分子，其由通过二硫键连接的抑制素β亚单位的同二聚体构成。存在β亚单位的若干同种型，包括最常见的抑制素-βA和抑制素-βB，其产生活化素的三种同种型：活化素A(βAβA)、活化素-B(βBβB)以及活化素AB(βAβB)。活化素需要I型和II型活化素受体，用于它们的信号转导。活化素结合于II型活化素受体(ACVR2A/2B)，导致I型活化素受体(ACVR1B，还称作ALK4)的征集和磷酸化。磷酸化I型受体转而磷酸化称作Smad的细胞内信号蛋白。Smad1/5/8由BMP样配体加以磷酸化，而Smad2/3由活化素和TGFβ加以磷酸化。如在本文中所使用的，术语″活化素A″是指活化素同种型βAβA。如在本发明的一些方面中用于治疗目的的活化素A优选为人活化素A，如重组人活化素A。
如在本文中所使用的，术语″活化素受体″是指任何受体，其在结合它的配体以后导致如本文中所定义的活化素信号转导。该受体可以是，并且优选是II型活化素受体，以及配体可以是活化素，优选活化素A。然而，任何给定细胞可以包括其它受体，其在配体结合以后触发活化素信号。受体是否是如本文所定义的活化素受体，可以试验如下。如果在受体激活以后，细胞外基质蛋白的表达发生变化，其类似于(基本上相同于)当活化素A结合于II型活化素受体时所观测到的那些变化(如表1和表2所示)，那么该受体在本文中被定义为活化素受体。
术语″活化素抑制剂″用来包括任何化合物，并且尤其是任何蛋白质(或肽)，其能够选择性地抑制活化素的活性以致改变任何活化素的功能，包括抑制活化素结合于活化素受体、尤其是抑制在ECM产生细胞的细胞表面上的活化素信号受体的能力。当给予需要治疗的对象时，本发明的活化素抑制化合物基本上没有自然污染物，其在体内(在原核或真核)宿主、或体外(作为化学合成的结果)伴随这样的化合物。这样的化合物包括但不限于细胞外活化素结合化合物，以及细胞内化合物，其调节细胞内活化素信号。本发明的方法的范围内的活化素抑制化合物还包括但不限于a)活化素抑制化合物，其主要螯合活化素单体，即，结合于在耐二聚化的复合物中的单体；b)活化素抑制化合物，其螯合活化素二聚体并防止活化素与其信号受体(例如，卵泡抑素或其生物活性衍生物)相互作用；或c)通过干扰ECM产生细胞中的活化素信号级联放大来防止活化素信号。卵泡抑素是可溶性蛋白，其用作活化素结合蛋白以防止活化素与其信号受体相互作用。
在本发明的实施方式中抗活化素A抗体可以用作配体抑制剂。如果需要，可以将上述化合物以药学上可接受的盐的形式给予对象。
如在本文中所使用的，术语″活化素信号″是指由配体结合于活化素受体所引起的细胞过程的受体介导的激活，该激活可以直接或间接偶联于细胞对配体的反应。间接偶联是指在产生配体对细胞行为的最终生理效应以前需要激活受体来与细胞内的其它蛋白相互作用。经常，随着受体激活，若干相互作用细胞蛋白质链的行为会改变。由受体激活诱导的细胞变化的整个集合经常被称作信号转导途径并通常以基因的转录和表达的水平的具体变化而终结。因此，如在本文中所使用的，活化素信号是指信号转导途径，其可以通过以下表1和表2所示的细胞外基质蛋白的表达的具体变化最好地加以定义。因此，为了确定一种物质是否是活化素A的激动剂或功能类似物，可以估计该物质与活化素受体相互作用的能力和细胞外基质蛋白的表达产生的变化(示在以下表1和表2中)。如果该物质与活化素受体相互作用并从而引起细胞外基质蛋白的表达的变化(示在表1和表2中)类似于(基本上相同于)由活化素A引起的那些变化，优选当出现其结合于活化素II受体时，那么该物质是激动剂或功能类似物。
如在本文中所使用的，术语″矿化″是指磷酸钙沉积在细胞外基质上的一般过程。该术语相当于术语″钙化″。后一术语在本文中还连同细胞外基质上的病理性磷酸钙沉积(如处于疾病状况)一起使用。
术语″骨化″用来指骨形成的正常的生理过程，尤其与成骨细胞有关。
如在本文中所使用的，术语″磷酸钙″尤其是指在低温下通过沉淀获自水溶液的磷酸钙。高度优选的磷酸钙是正磷酸钙，该正磷酸钙表示化合物的家族，其包括钙阳离子，Ca2+，以及磷酸根阴离子，PO4 3-。存在多种正磷酸钙，其包括正磷酸一钙(一碱价的)、正磷酸二钙(二碱价的)、正磷酸三钙(三碱价的)、以及羟基磷灰石(三磷酸五钙)，所有这些在其矿化期间可以沉积在ECM上。
配体、配体抑制剂、诱导剂、激动剂、拮抗剂或功能类似物的″有效量″是这样的量，其足以在体内或体外的所期望的位置和所期望的量来实现控制ECM矿化的效果。
如在本文中所使用的，术语″治疗有效量″是指治疗剂的量，其可以治疗、改善、或预防所期望的疾病或病症，或呈现可检测的治疗或预防作用。对象需要的精确的有效量将取决于对象大小和健康状态、病症的特性和程度、以及选择给药的疗法或结合的疗法。因此，预先规定治疗有效量是没有用的。然而，对于给定情况的治疗有效量可以通过常规试验来确定。
受体的″激动剂″是指一种化合物，该化合物结合于受体并且对其来说这样的结合具有和受体的天然的内源性配体的结合类似的功能结果。即，该化合物，在与受体相互作用以后，必须产生和内源性配体相同或基本上类似的跨膜和/或细胞内效应。因此，活化素受体的激动剂结合于受体并且这样的结合具有和配体结合相同或类似的功能结果(例如，矿化的抑制)。激动剂的活性或效力可以低于天然配体，在这种情况下激动剂被叙述成是″部分激动剂″，或它可以相等于或高于天然配体，在这种情况下它被叙述成是″完全激动剂″。因此，例如，在结合和激活配体的受体方面可以模拟配体活性的短肽或其它分子可以用作配体的等效物。优选地，激动剂是完全激动剂，但也可以有利地采用部分受体激动剂。鉴定这种激动剂的方法是本领域技术人员容易预见的并且包括检测诱导活化素信号介导反应(例如，基质成熟的抑制等)化合物。这样的药剂还可以称作配体″模拟″、″模拟物″或″类似物″。
术语″类似物″是指化学型密切相关成员-分子家族，其显示独特的核心结构或支架-其中成员彼此相对地呈现较小的化学变化。如本文中所使用的，″类似物″是指一种化合物，相对于指定的化合物，其呈现较小的化学变化，如某些化学基团的化学置换，即化学衍生物。类似物基本上呈现和指定化合物可比拟的生物活性，即，活化素A信号的抑制或刺激，但可以提供相对于指定化合物的优点如更长的半衰期、抗降解、改善的靶结合亲和力、更高的效力、更小的毒性或更高的耐受性。
活化素A的″功能类似物″是一种化学衍生物，其生物活性基本上类似活化素A的生物活性。″基本上类似″是指活性在数量上有差异但性质上相同。术语″功能类似物″用来包括分子的″片段″、″类似物″、″衍生物″、或″化学衍生物″。本文中活化素A的片段是指活化素A的生物活性片段，其保留引起活化素信号的能力。活化素A的″类似物″是指一种化合物，其基本上在功能上类似于天然活化素A或类似于其片段。例如，活化素A的类似物是一种蛋白质，其并不具有和活化素A相同的氨基酸序列但其足够同源于活化素A以致保留活化素A的生物活性。例如，活化素A的功能衍生物将包含和活化素A相同的氨基酸主链，但还包含其它修饰如翻译后修饰例如，结合磷脂、或共价键相连碳水化合物，这取决于上述修饰用于进行治疗性处理的需要。如在本文中所使用的，该术语还用来包括活化素A的化学衍生物。这样的衍生物可以改善化合物的可溶性、吸收、生物半衰期等。衍生物还可以降低分子的毒性，或消除或减轻分子的任何不希望的副作用等。衍生物并且具体地说，能够介导上述作用的化学部分披露在Remington′s PharmaceuticalSciences(1980)中。用于将上述部分耦合到分子的步骤在本领域是众所周知的。
术语″功能类似物″进一步包含这样的化合物，其并不是化学相关的但其例如阻断主要化合物的抑制剂。例如，作为活化素A的抑制剂的卵泡抑素可以受到卵泡抑素结合蛋白的抑制，从而作为卵泡抑素的引诱物以中和卵泡抑素并最终使得可以通过活化素A来激活活化素信号。
术语″给药″用来包括通过医疗领域已知的任何适当方式将治疗性化合物引入对其需要的对象，上述方式包括但不限于肠和胃肠道外(例如，静脉内)给药。
术语″药学上可接受的盐″用来包括在本发明各方面所用的治疗性化合物的盐。这样的盐可以形成自药学上可接受的酸或碱，如，例如，酸如硫酸、盐酸、硝酸、磷酸等，或碱如碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物、氢氧化铵、烷基氢氧化铵等。
术语″药学上可接受的赋形剂(vehicle)″用来包括溶剂、载体、稀释剂等，其用作在本发明的各方面中所用治疗性化合物的药剂的添加剂以便为上述化合物的给药提供载体或佐剂。
在本发明的各方面，″细胞″包括但不限于成骨细胞、间充质干细胞、软骨细胞、平滑肌细胞(尤其是血管平滑肌细胞)、成纤维细胞、间充质细胞以及脂肪细胞。
术语″对象″用来包括所有动物，优选哺乳动物，最优选人，其中希望增强ECM的矿化并且其中所述矿化有利于动物的生理过程，或其中希望防止ECM的矿化并且其中所述矿化将有害于动物的生理过程。在上述这样的动物中最主要的是人类；然而，本发明不希望受如此限制，本发明设想可以治疗可实现本发明的有利影响的任意及所有动物。
用于控制细胞外基质的矿化的机制的基本描述
转化生长因子-β(TGFβ)和骨形态发生蛋白(BMP)是骨形成的众所周知的调节剂。通过刺激成骨细胞祖细胞的分化，TGFβ和BMP均促进骨发育。还认为TGFβ可抑制成骨细胞分化和矿化的后期。活化素属于TGFβ超家族，然而，和TGFβ相比，它们在骨形成中的作用是相对未知的并且得到不太充分的研究。活化素的结构与TGFβ密切相关并且它们经由类似的细胞内信号分子起作用。活化素和它们的相对的抑制素最初纯化自性腺液体(gonadal fluids)并且基于它们调节从垂体促性腺素细胞分泌FSH的能力来表征(参见Chen等人Exp Biol Med，2006.231：534-44；Bilezikjian等人MolCell Endocrinol，2004.225：29-36的综评)。
除活化素作为FSH分泌的调节剂的典型作用之外，活化素还在其它细胞类型和组织(例如肾上腺、肝脏、神经元以及胰腺)中行使调节功能。
各种出版物报道了活化素A可增强骨形成。例如，Centrella等人(Mol Cell Biol，1991.11：250-8)说明了活化素A的作用类似于TGF-β，因为它在成骨细胞中可以增强胶原和DNA合成。Ogawa等人(J Biol Chem，1992.267：14233-7)说明了活化素和骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-3)一起可增强体内胶原/陶瓷载体植入物上异位骨的形成。Gaddy-Kurten等人(Endocrinology，2002.143：74-83)说明了活化素可刺激成骨细胞发生(osteoblastogenesis)，该刺激受到抑制素的拮抗。Sakai等人(Bone，1999.25(2)：191-6)说明了活化素可促进骨痂形成，增加骨的机械强度以及在骨折愈合期间促进软骨内骨形成。Sakai等人(Bone，2000.27：91-6)和Sakai & Eto(Mol CellEndocrinol，2001.180：183-8)证明了在衰老的卵巢切除的大鼠中全身给予活化素可增加骨量和椎骨的机械强度，并且说明活化素可用于治疗骨折和骨质疏松。Hirotani等人(Calcif Tissue Int，2002.70：330-8)说明了在小鼠的同系移植骨中局部给予活化素A可刺激骨膜骨形成和增加骨量。
总之，许多报道表明，活化素可在鼠骨髓培养物中促进骨发生并在啮齿动物中促进体内骨形成和骨折愈合。
本发明的发明人已发现，在成骨细胞和VSMC中的活化素信号可影响由这些细胞排出的ECM的成熟，从而将ECM保持在未成熟状态并有效地防止它被矿化。因此，在ECM发育早期的活化素信号在防止其矿化方面是最有效的。
作为这些发现的结果，本发明的发明人已发现，活化素A可以防止或抑制细胞外基质(尤其是成骨细胞或VSMC的成熟的细胞外基质)的矿化、或磷酸钙沉积在细胞外基质(尤其是成骨细胞或VSMC的成熟的细胞外基质)上。相反，活化素A抑制剂(如卵泡抑素)可以促进或刺激细胞外基质、尤其是成骨细胞或VSMC的成熟ECM的矿化。
这些发现均使得可以提供用于在两个方向控制ECM矿化的方法。因此在两个方向控制矿化的能力是基于这样的发现：ECM成熟对于其后的矿化是必不可少的，以及这种成熟受到活化素A的控制。
因此本发明的发明人已发现，活化素A在ECM生产和成熟(其导致矿化)中具有重要作用，以及借助于未成熟的ECM、以及因此类骨质的构建，活化素A对矿化具有抑制效应。总之，本发明的发明人发现：
1)人成骨细胞表达活化素A以及其天然抑制剂卵泡抑素从而以分化依赖性方式调控活化素信号，
2)在人骨形成模型以及在血管矿化模型中活化素抑制矿化，以及
3)活化素如此起作用的方式是，在开始矿化以前通过改变大范围的基质蛋白的表达，其导致基质成分没有或具有降低的矿化能力。
这导致以下结论：活化素信号是骨基质的形成和矿化的强有力的调节剂，从而是控制和保持骨质量的一种有趣的机制。利用活化素A、卵泡抑素、或这些化合物的类似物，可以在两个方向控制矿化。因此，活化素信号和活化素靶基因是用来控制骨中基质矿化以及病理条件下矿化的重要的治疗靶标。
控制机制的概要描述可以提供如下：
*或其类似物
 活化素A＊  活化素A抑制剂 卵泡抑素＊   卵泡抑素抑制剂
  矿化  受到抑制  受到刺激 受到刺激   受到抑制
上述基本机制已提出了以下观点：这种控制机制的生物学基础在于干扰正常的受体-配体相互作用；以及由此的矿化过程无论矿化过程是病理性的或正常的，其至少部分地受控于与活化素受体有关的受体-配体相互作用的水平，因此受控于活化素信号的水平。在认识到上述以后，这种假说的科学证据存在于，通过干预活化素受体和配体之间的相互作用来操纵编码特定细胞外基质蛋白的基因的表达的能力。尤其发现，某些编码蛋白质或糖蛋白(其是ECM的一部分)的基因的表达，作为活化素攻击的结果被增强，而作为卵泡抑素攻击的结果其它基因的表达被增强(参见图8)。
因为发现活化素参与基质成熟和/或矿化的抑制，所以应该得出这样的结论：在活化素攻击以后显示增强的表达的基因、以及因此是由活化素引发的细胞反应的基因(即，活化素靶基因)，也与基质成熟和/或矿化的抑制有关。
编码蛋白质或糖蛋白(其是ECM的一部分)并且作为活化素暴露的结果被上调(表达被增加)的基因是下述的基因：成骨细胞特异性因子2(periostin)、成骨细胞特异性因子(POSTN)；基质金属肽酶2(MMP2)；双糖链蛋白多糖(BGN)；富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白/骨连蛋白、cwcv和kazal样域蛋白聚糖(睾丸蛋白聚糖)(SPOCK1)；抗“衰老关键蛋白”抗体(FBLN5)；潜在的转化生长因子β结合蛋白2(LTBP2)；硫酸软骨素蛋白多糖2(多功能蛋白聚糖)(VCAN)；透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1(HAPLN1)；VIII型胶原α-2(COL8A2)；XVI型胶原α-1(COL16A1)；胶原三股螺旋重复蛋白1(CTHRC1)；具有1型血小板反应蛋白基序的ADAM金属肽酶(ADAMTS3)；V型胶原α-1(COL5A1)；以及血小板反应蛋白1(THBS1)。因此，这些基因的表达的上调或增强将导致基质成熟和/或矿化的抑制或阻止。相反地，上述基因的下调会刺激或增强成熟和/或矿化。
编码蛋白质或糖蛋白(其是ECM的一部分)并且作为活化素A暴露的结果被下调(表达被降低)的基因是下述的基因：C型凝集素结构域家族3、成员B(CLEC3B)；V型胶原α-3(COL5A3)；巢蛋白2(骨巢蛋白)(NID2)；TIMP金属肽酶抑制剂4(TIMP4)；乳突淋蛋白(Papilin)、蛋白聚糖样硫酸糖蛋白(PAPLN)；IV型胶原α-6(COL4A6)；异连蛋白α(DTNA)；CD248抗原、内皮唾酸蛋白(CD248)；Matrilin 2(MATN2)；以及弹性微原纤维界面蛋白2(EMILIN2)。因此，这些基因的表达的上调或增强将导致基质成熟和/或矿化的刺激或增强。相反地，上述基因的上调会抑制或阻止基质成熟和/或矿化。
因为发现卵泡抑素参与基质成熟和/或矿化的刺激，所以应该得出这样的结论：编码蛋白质或糖蛋白(其是ECM的一部分)在卵泡抑素攻击以后显示增强的表达的基因也与基质成熟和/或矿化的刺激有关。作为卵泡抑素暴露的结果被上调(表达被增加)的基因是以下的基因：CD248抗原、内皮唾酸蛋白；弹性微原纤维界面蛋白2；Matrilin 2；异连蛋白α；IV型胶原α-6；巢蛋白2(骨巢蛋白)；乳突淋蛋白、蛋白聚糖样硫酸糖蛋白；C型凝集素结构域家族3、成员B；V型胶原α-3；TIMP金属肽酶抑制剂4。因此，这些基因的表达的上调或增强将导致基质成熟和/或矿化的刺激。相反地，上述基因的下调会抑制或阻止成熟和/或矿化。表1
由活化素A上调的细胞外基质蛋白(由卵泡抑素下调)。
Figure A20078005010200291
基于图7A所示的选择标准鉴定了细胞外基质蛋白。基于第5天的活化素A的影响对基因进行分选。示出的log2倍变化是相对于在同一天用赋形剂处理的。赋形剂数值未示出。FST＝卵泡抑素；Act.A＝活化素A。
表2
由活化素A下调的细胞外基质蛋白(由卵泡抑素上调)。
Figure A20078005010200301
基于图7A所示的选择标准鉴定了细胞外基质蛋白。基于第5天的活化素A的影响对基因进行分选。示出的log2倍变化是相对于在同一天用赋形剂处理的。赋形剂数值未示出。FST＝卵泡抑素；Act.A＝活化素A。
控制矿化的方法
基于上述，本发明提供了用于改善或预防矿化的若干方法，所有这些方法均基于这样的认识：由于活化素受体的激活所导致的选择性基因表达。因此，可以在两个方向上控制矿化。
A.通过受体相互作用来抑制ECM矿化和钙化
在控制矿化的第一方向，抑制或阻止ECM的矿化和/或钙化。根据本发明的方法，矿化和/或钙化的这种抑制或预防通过激活活化素受体来完成。
因此，在一个方面，本发明提供了一种用于抑制或预防细胞外基质的矿化的方法，该方法包括激活活化素受体的步骤。因此应当明了，可以用这样的方法和组合物，其包含例如活化素受体的配体或激动剂，优选II型活化素受体的配体或激动剂来实施本发明。
如在本文中所使用的，除非另有明确说明，术语″配体”是指活化素受体配体。应当明了，配体可以是内源性配体、或能够与活化素受体相互作用的外源性受体配体，即参与这样的相互作用从而导致如本文中所定义的活化素信号转导。
在活化素信号受体配体是II型活化素受体的情况下，适宜配体的一个实例是活化素A。
可替换地，可以使用配体刺激剂或配体诱导剂来代替配体。″配体诱导剂″是一种化合物，其在哺乳动物身体内刺激体内生产(例如表达)治疗有效浓度的足以实现受体激活的内源性受体配体，其在活化素A的情况下是指足以保持或刺激ECM矿化或足以抑制ECM矿化(当需要时)的浓度。上述化合物应理解为包括这样的物质，当给予哺乳动物时，其作用于组织或器官的细胞(其通常有能力产生和/或分泌在哺乳动物的基因组内编码的配体)，并且其引起哺乳动物身体内的配体的内源性水平发生改变。内源性或给予的配体可以作为内分泌因子、旁分泌因子或自分泌因子。即，可以通过产生ECM的细胞、通过邻近细胞、或通过遥远组织的细胞，来合成内源性配体，在这样的情况下分泌的内源性配体被运送到预防(防止)或刺激矿化的部位，例如，通过个体的血流。在优选的实施方式中，该药剂刺激内源性配体的表达和/或分泌以致增加其在组织(其中ECM矿化要加以控制)中的量。
在另外一些实施方式中，可以给予作为活化素受体的激动剂的药剂来代替配体本身。
在进一步的实施方式中，可以使用配体的功能类似物。适宜的功能类似物是例如卵泡抑素结合蛋白或相对于卵泡抑素的抗体。这样的化合物是配体抑制剂的有效抑制剂，从而防止配体失活并允许激活受体。
本发明的配体、诱导剂、激动剂以及功能类似物可以通过与所选药剂相容的任何给药途径来给予，并且可以用适合于给药途径的任何药学上可接受的载体来配制。优选的给药途径是胃肠道外途径，尤其是静脉内途径、腹腔内途径、以及囊内途径。在其他应用中，如在外科植入物是钙化对象的情况下，可以用配体、诱导剂或激动剂来浸渍植入物本身。非常适宜的植入材料可以形成或包含能够在预定位置经一段时间释放化合物的缓释基质。还优选在延长的时期内进行治疗(缓释)，优选在门诊病人(的时间)的基础上，其中活性化合物的每日剂量为约0.01-1000μg/kg体重的范围，并且更优选为约0.1-100μg/kg体重的范围。
本发明的用于抑制或预防细胞外基质矿化的方法可以用于各种治疗性和非治疗性应用。例如，用于抑制或预防细胞外基质矿化的方法的治疗应用可用于治疗或预防病理性钙化。这样的病理性钙化过程的实例列在以下的表3中。
表3.病理性矿化的病症
Figure A20078005010200331
因此，在用于抑制或预防细胞外基质矿化的方法的一种优选实施方式中，矿化是病理性钙化。这样的钙化可以发生在各种组织中，并且直接伴随那些作为病理性状态的结果组织，或伴随在上述组织中的合成的、半合成的或组织工程植入物；所有上述钙化被共同地称为病理性的。优选地所述病理性钙化选自由以下组成的组，该组包括：动脉粥样硬化性钙化，转移性肺钙化，心脏瓣膜钙化，以及伴随腱炎的钙化；关节炎；滑囊炎；骨刺；皮肤骨化；肾结石；骨化性肌炎；肺骨化；白内障；双侧纹状体苍白球齿状体钙质沉着症；神经源性异位骨化以及骨肉瘤。
此外，提供了本发明的方法的各种非治疗性应用。例如，在体外或在活体外组织工程应用中的软骨钙化，尤其是在软骨细胞的组织培养中。
B.通过受体相互作用来刺激ECM矿化和钙化
在控制矿化的第二方向，刺激ECM的矿化和/或钙化。通过防止活化素受体和其内源性配体之间的相互作用来完成矿化的刺激。
因此，在另一个方面，本发明提供了用于刺激细胞外基质矿化的方法，该方法包括防止活化素受体和其内源性配体之间相互作用的步骤。因此应当明了，可以用这样的方法和组合物，其包括活化素受体的配体清除剂或抑制剂、所述配体抑制剂的诱导剂或所述受体的拮抗剂来实施本发明。技术人员将明了，本发明的这方面的实施方式(涉及矿化的刺激)类似于但相反于以上针对矿化的抑制所描述那些实施方式。因此应当明了，可以用包含活化素受体的配体的抑制剂的方法和组合物来实施本发明。
如在本文中所使用的，除非另有明确说明，术语″配体的抑制剂”或其等效术语“配体抑制剂”是指活化素受体配体抑制剂。应当明了，该配体抑制剂可以是内源性抑制剂、或外源性抑制剂。
在活化素受体配体是II型活化素受体以及配体是活化素A的情况下，适宜的配体抑制剂是卵泡抑素。
可替换地，并且和上述类似，可以使用配体抑制剂刺激剂或配体诱导剂来代替配体。
在另外一些实施方式中，可以给予作为受体(其将被激活)的拮抗剂的药剂以阻断该受体。受体的″拮抗剂″是指一种化合物，当结合于受体时，其阻断该受体但并不刺激它并且防止信号反应发生或降低反应的强度。
本发明的配体抑制剂、配体抑制剂的诱导剂以及拮抗剂可以通过与所选药剂相容的任何给药途径来给予，并且可以用适合于给药途径的任何药学上可接受的载体来配制。优选的给药途径是胃肠道外途径，并且尤其是静脉内途径、腹腔内途径、以及囊内途径。在其他应用中，如在需要外科植入物的快速骨化的情况下，可以用配体抑制剂、配体抑制剂诱导剂或拮抗剂来浸渍植入物本身。非常适宜地，植入材料可以形成或包含能够在预定位置经一段时间释放化合物的缓释基质。还优选在延长的时期内进行治疗，优选在门诊病人(的时间)的基础上，其中活性化合物的每日剂量为约0.01-1000μg/kg体重的范围，并且更优选为约0.1-100μg/kg体重的范围。
本发明的用于刺激细胞外基质矿化的方法可以用于各种治疗性和非治疗性应用。例如，用于刺激细胞外基质矿化的方法的治疗性应用可以用来治疗或预防骨质疏松以及用于骨愈合。非治疗性应用包括在细胞培养物中的人造骨生产以及组织工程中的骨化。
C.通过改变基因表达来抑制ECM矿化和钙化
如上所述，已鉴定了若干种基因，其是活化素信号的靶并且作为上述信号的结果被上调，作为其详细阐述，本发明提供了用于抑制或预防基质成熟和/或矿化的方法，其中通过增强选自由以下组成的组的至少一种基因的表达，该组包括血小板反应蛋白1；V型胶原α-1；XVI型胶原α-1；VIII型胶原α-2；胶原三股螺旋重复蛋白1；透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1；硫酸软骨素蛋白多糖2(多功能蛋白聚糖)；潜在的转化生长因子β结合蛋白2；双糖链蛋白多糖；基质金属肽酶2；成骨细胞特异性因子2(periostin)、成骨细胞特异性因子；抗“衰老关键蛋白”抗体；SPOCK1、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白/骨连蛋白、cwcv和kazal样域蛋白聚糖(睾丸蛋白聚糖)；以及具有1型血小板反应蛋白基序的ADAM金属肽酶。
基因表达的上调或增强可以例如通过基因治疗来完成。可替换地，如上所述，已鉴定了细胞外基质蛋白的若干种基因，其表达同样受到活化素信号的影响(但以相反方式)，即，作为卵泡抑素暴露的结果，其表达被上调，作为其详细阐述，本发明提供了用于抑制或预防基质成熟和/或矿化的方法，其中通过阻断选自由以下组成的组的至少一种基因的表达，该组包括下述的基因：CD248抗原、内皮唾酸蛋白；弹性微原纤维界面蛋白2；matrilin 2；异连蛋白α；IV型胶原α-6；巢蛋白2(骨巢蛋白)；乳突淋蛋白、蛋白聚糖样硫酸糖蛋白；C型凝集素结构域家族3、成员B；V型胶原α-3；以及TIMP金属肽酶抑制剂4。
可以通过例如这样的方法如RNAi来进行基因表达的阻断，其是本领域技术人员熟知的。
D.通过改变基因表达来刺激ECM矿化和钙化
与上述用于抑制ECM矿化的方法相反，本发明提供了用于刺激基质成熟和/或矿化的方法，其中通过
i)阻断选自由以下组成的组的至少一种基因的表达，该组包括：血小板反应蛋白1；V型胶原α-1；XVI型胶原α-1；VIII型胶原α-2；胶原三股螺旋重复蛋白1；透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1；硫酸软骨素蛋白多糖2(多功能蛋白聚糖)；潜在的转化生长因子β结合蛋白2；双糖链蛋白多糖；基质金属肽酶2；成骨细胞特异性因子2(periostin)、成骨细胞特异性因子；抗“衰老关键蛋白”抗体；SPOCK1、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白/骨连蛋白、cwcv和kazal样域蛋白聚糖(睾丸蛋白聚糖)；以及具有1型血小板反应蛋白基序的ADAM金属肽酶；或
ii)增强选自由以下组成的组的至少一种基因的表达，该组包括下述的基因：CD248抗原、内皮唾酸蛋白；弹性微原纤维界面蛋白2；matrilin 2；异连蛋白α；IV型胶原α-6；巢蛋白2(骨巢蛋白)；乳突淋蛋白、蛋白聚糖样硫酸糖蛋白；C型凝集素结构域家族3、成员B；V型胶原α-3；以及TIMP金属肽酶抑制剂4。
特别优选的实施方式的描述
一种用于选择候选治疗剂的方法，其中所述候选治疗剂用于控制在对象的组织中细胞外基质的矿化，上述方法包括以下步骤：在支持细胞外基质形成和基质成熟的条件下，将来自所述组织并产生细胞外基质的细胞暴露于检测化合物。
术语“支持细胞外基质形成和基质成熟的条件”是指用于培养细胞的培养条件，其向细胞提供营养物、生长因子以及其它补充物，其使ECM形成在细胞周围并潜在地达到可被矿化(例如通过活成骨细胞)的组成所必要的，上述组成被称作“成熟的”。尤其是，术语“支持细胞外基质形成和基质成熟的条件”是指从开始形成细胞外基质到开始矿化细胞外基质期间的条件，优选不包括矿化，因而优选不包括矿化条件。通常，在开始形成细胞外基质和开始矿化之间的SV-HFO和NHOst细胞的培养期是在第5天和第12天之间，但可以在不同细胞型之间有变化。因此，术语“支持细胞外基质形成和基质成熟的条件”尤其是指前矿化期(pre-mineralization)期间的条件。
术语“矿化条件”是指培养细胞的培养条件，其中向细胞提供营养物、生长因子以及其它矿化ECM所必要的补充物。尤其是这样的条件需要钙和经常为β-甘油磷酸的可矿化源的存在。
在产生矿化基质的条件(即，“矿化条件”)下，产生细胞外基质的细胞的培养在本领域是众所周知的并且可以因细胞型不同而有差异。
产生细胞外基质的细胞，优选人成骨细胞、人间充质干细胞或人血管平滑肌细胞，可以在一般细胞培养基中培养，如最基本的必需培养基α(αMEM)或Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，优选补充有血清(优选小牛血清)。大体上这样的培养基能够支持细胞外基质形成和成熟。为了提供矿化条件，必须提供适宜的磷酸钙源。非常适宜地，为了提供矿化条件，在有类固醇激素(尤其是糖皮质激素，优选地塞米松或皮质醇)存在的情况下，可选地在有抗坏血酸存在的情况下，以及在具有适宜的钙源如氯化钙和适宜的磷源如β-甘油磷酸(两者均需要用于磷酸钙形式的沉积)的情况下，对细胞培养进行培养而没有传代培养，时间长达30天。可以在常规细胞培养条件(在湿润环境下，37℃和5％CO2)下进行培养。
可以由和用于矿化条件具有相同的培养条件的细胞来提供支持细胞外基质形成和基质成熟的条件，不同之处在于省去糖皮质激素和/或钙和/或磷源(phosphate source)，为了获得正常的细胞功能需要少量的钙和磷，但可选地可以省去矿化所需要的量。非常适宜的条件是例如通过在适当的细胞培养基进行培养来提供，如αMEM或DMEM，其补充有血清(如上所述)，优选没有传代培养，在常规细胞培养条件下持续长达30天的时间。
为了在支持细胞外基质形成和基质成熟的条件下将细胞暴露于检测化合物，适当地将检测化合物加入培养基。检测化合物的浓度(在对象暴露期间以该浓度提供给细胞)并没有特别限制。非常适宜地，检测化合物的浓度为约1至约1000ng/ml。
作为检测化合物，可以选择小化学分子、核酸、蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、以及它们的混合物。
用于选择候选治疗剂的方法，其中候选治疗剂用于控制对象组织(其可以包括自然组织或如用于组织工程中的人工组织)中的细胞外基质的矿化，进一步包括以下步骤：确定响应所述暴露的至少一种基因在所述细胞中的表达。这种确定优选在前矿化期期间进行，即通常在细胞已被提供有支持细胞外基质形成和基质成熟的条件以后的第5天和第12天之间。对于技术人员来说，确定基因在细胞中的表达水平是常规操作。可以通过如在以下实施例中所描述的微阵列分析来确定表达水平。通常，微阵列表达谱(profiling)是常规操作，并且涉及在DNA芯片阵列上测量制备自mRNA(分离自感兴趣的细胞)的cDNA。可替换地，该水平可以通过测量个别mRNA的水平(借助于定量RT-PCR(qPCR)或等效方法)来确定。在一种进一步可替换的实施方式中，可以以蛋白质的水平来确定表达水平。可以例如通过使用用于分析蛋白质组的质谱法或基于抗体的方法来实施上述方法。
在本发明的一种方法中，仅非常有限数目的基因的表达水平需要确定以估计特定检测化合物影响矿化过程的潜力。一般而言，检测如本文所描述的A组和/或B组的一种基因是足够的。然而，优选地，确定多于一种的基因的表达水平。要确定表达水平的基因的优选数目是3、4、5、6、7、8、9、或10或甚至更多种基因。最优选地，确定20、21、22或23种基因的表达水平。
要确定表达水平的基因选自这样的基因，其编码血小板反应蛋白1；V型胶原α-1；XVI型胶原α-1；VIII型胶原α-2；胶原三股螺旋重复蛋白1；透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1；硫酸软骨素蛋白多糖2(多功能蛋白聚糖)；潜在的转化生长因子β结合蛋白2；双糖链蛋白多糖；基质金属肽酶2；成骨细胞特异性因子2(periostin)、成骨细胞特异性因子；抗“衰老关键蛋白”抗体；SPOCK1、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白/骨连蛋白、cwcv和kazal样域蛋白聚糖(睾丸蛋白聚糖)；以及具有1型血小板反应蛋白基序的ADAM金属肽酶(在下文一起称作A组)，以及CD248抗原、内皮唾酸蛋白；弹性微原纤维界面蛋白2；matrilin 2；异连蛋白α；IV型胶原α-6；巢蛋白2(骨巢蛋白)；乳突淋蛋白、蛋白聚糖样硫酸糖蛋白；C型凝集素结构域家族3、成员B；V型胶原α-3；以及TIMP金属肽酶抑制剂4(在下文一起称作A组)。
一种用于选择候选治疗剂(其用于控制细胞外基质的矿化)的方法进一步包括以下步骤：作为所述暴露的直接结果，确定所述至少一种基因在所述细胞中的表达是否被调节。
如在本文中所使用的，术语“调节的”是指以下事实：作为细胞暴露于检测化合物的直接或间接的后果，基因的表达发生变化。技术人员将明了，需要参考测量(对照测量)以确定检测化合物是否以直接或间接方式诱导基因表达水平的变化。技术人员将能够设计适当的测定条件，借此可以获得参考测量。作为指导，可以采用利用检测化合物的赋形剂进行的分析作为参考测量。如在本文中所使用的，术语“赋形剂”是指适宜的对照物质，如检测化合物的载体、溶剂或稀释剂(即空白(blanc))。
当作为暴露的结果表达被调节时，检测化合物被确定为阳性，用于在所研究的对象组织中控制细胞外基质矿化的候选治疗剂。
活化素A分子，其是本发明的优选方面的主题，可以是经纯化的天然和重组活化素A、以及它们的功能类似物，其特征在于存在独特的受体结合结构域并且其具有在包含活化素受体的细胞中引发活化素信号的生物活性。
特定的活化素A抑制剂分子，其是本发明的若干方面的主题，可以是经纯化的天然和重组活化素A抑制剂蛋白、其它蛋白质或非蛋白质活化素A抑制剂分子、以及它们的生物活性片段，其特征在于存在独特的活化素结合结构域，该活化素结合结构域具有以下生物活性：能够以单体或二聚体形式螯合活化素A或引起同二聚体解开或覆盖在游离活化素A上的受体结合位点或通过结合于活化素信号受体来阻断活化素A的结合。还可以通过合成方法、酶法、水解法、化学方法或重组DNA方法来产生具有这种生物活性的个别的活化素结合结构域。
在本发明的若干方面的优选实施方式中，按照本发明的治疗方法，卵泡抑素、或其活化素结合片段用来例如提供给需要治疗的对象。
在一种实施方式中，给予有效水平的活化素抑制化合物，以提供改善ECM的矿化能力的治疗效果。
在本发明的方法中，输注活化素抑制化合物，如，例如，卵泡抑素、或其活化素抑制片段，最初导致a)结合于活化素单体以致防止它们二聚成活化素A，和/或b)解开活化素A二聚体以致导致形成失活的活化素A单体，和/或c)从循环或细胞外组织环境增强清除上述复合于活化素抑制化合物的活化素A二聚体，和/或d)结合于活化素A二聚体以致活化素A的生物学功能被阻断。作为活化素A的这种抑制的结果，在靶组织的细胞中的活化素信号将被阻止，其导致在靶细胞周围ECM的矿化增强。
在本发明的方法中，活化素A或其功能类似物的输注导致靶组织细胞中的活化素信号转导，从而防止这些细胞周围的ECM发育到成熟期并有效地将ECM保持在成熟前期，这可以防止其矿化。
因此，取决于所需要的治疗，在本发明的一些方面的治疗性化合物可以是活化素A抑制剂或活化素A。这些治疗性化合物可以结合于(通过化学方式或通过基因工程)其它药剂的片段，其将上述化合物导向所期望的作用位点。
用于给予治疗性化合物的量和方案可以由治疗矿化相关性疾病、骨形成缺陷和/或动脉粥样硬化的临床领域的技术人员容易地确定。通常，治疗剂量将随所考虑的因素而变化，如：所用化合物的类型；年龄；健康状态；要治疗的病症；同时治疗(如果有的话)的种类、治疗频率以及所期望效果的特性；组织损伤的程度；性别；症状的持续时间；以及禁忌证(如果有的话)、和其它由具体的医生调节的变量。可以以一次或多次给药来给药以获得所期望的结果。
优选地应选择给药剂量以使活化素A的局部浓度为2至100ng/ml以及卵泡抑素的局部浓度为约50至500ng/ml。给药当然取决于化合物的种类和化合物的效力。通常也需要以更低剂量形式给予被靶向的化合物。
作为活化素A抑制剂的卵泡抑素的剂量可以适当地为约1至约1000ng/ml。
可以在用于给药的任何适当的药物赋形剂来给予在本发明的各方面中所使用的治疗性化合物。可以以在人类和动物中有效地预防、减轻、防止或治愈矿化缺陷的病症的任何形式来给予上述治疗性化合物。
用于胃肠道外给药的治疗性化合物的药剂包括无菌含水或非水溶剂、混悬剂以及乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油、以及可注射有机酯。含水赋形剂包括水、水-乙醇溶液、乳浊液或悬浮液，其包括盐水和缓冲医用胃肠道外赋形剂，上述赋形剂包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖溶液、葡萄糖加氯化钠溶液、包含乳糖的林格氏液、或固定油。静脉用赋形剂包括流体和营养补充物、电解质补充物，如那些基于林格氏葡萄糖等的静脉用赋形剂(intravenous vehicles)。
尤其是当矿化缺陷被延长或延迟而不是急性的时候，还可以借助于泵、或用控释剂型给予治疗性化合物。其中矿化缺陷经常被延长或延迟而不是急性的一个实例是起因于骨质疏松的缺陷、或起因于动脉粥样硬化的缺陷，其中没有硬化斑块的钙化或硬化斑块的钙化是不完整的。还可以以高浓度并借助于适当插入的导管、或通过将上述分子提供为嵌合分子(或复合物)的一部分(其用来靶向特定器官)，来将治疗性化合物递送到特定器官。
当指定长时间内重复注射时，用控释剂型给药对于对象来说是更方便的。例如，当本发明的方法用来治疗基于矿化相关性的遗传性疾病或慢性疾病时，则希望以控释剂型来给予治疗性化合物，以最大限度地提高对象的舒适度。
治疗性化合物可以用于以下剂型中如片剂、胶囊剂、粉包、用于胃肠道外注射到体内的液体溶液、或用于肠(口服)给药的液体溶液(如果治疗性化合物的生物活性不被消化过程破坏并且如果化合物的特性使它可以穿过肠组织被吸收)。
可以通过混合药剂和药学上可接受的赋形剂来获得供本发明的各方面用的药物组合物。
供本发明的各方面用的药物组合物是以本身已知的方式制备的，例如，借助于常规混合、造粒、在外包糖衣(dragee-making)、溶解、冷冻干燥或类似方法。这些组合物可用于控制矿化相关性疾病(慢性或急性)。这些组合物引导与细胞外基质材料的矿化有关的身体本身的机制。在高效力形式中，在本发明的各方面中使用的组合物可以足够快速地开始作用以用于ECM矿化的急性处理。
另外，低效力形式可用于治疗轻度或慢性矿化相关性疾病。
基本上没有自然污染物的活化素A和活化素A抑制蛋白或其它活化素A抑制化合物，可以按照先前用来分离上述蛋白质和/或化合物的技术领域中的常规条件和技术，从它们的自然或重组来源分离和纯化，如提取、沉淀、层析、亲和层析、电泳等。
利用本领域已知的技术并且不需要过度的实验，本领域技术人员可以确定活化素抑制化合物的活化素结合结构域，并且这样的结合结构域在本发明的方法中是优选的。例如，可以通过用常见蛋白酶，如，例如，胰蛋白酶、糜蛋白酶、以及枯草杆菌蛋白酶，蛋白酶剪切全长活化素抑制蛋白来制备天然活化素抑制蛋白的衍生物、或重组产生的活化素抑制蛋白的衍生物。用活化素衍生树脂进行的亲和层析可以用来测定上述片段的活化素结合能力。
另外，化合物如活化素A和卵泡抑素在物种间是高度保守的并且可以容易地大量分离自非人类来源，而且通过本技术领域熟知的技术可以化学地或酶法制备这些蛋白质的片段。因此可以将这样的化合物给予需要本发明的治疗方法的对象而不会激起严重的免疫反应。
在一种实施方式中，可以通过将产生ECM的细胞暴露于有效量的活化素A或其功能类似物来实施本发明的方法。
在另一种实施方式中，可以通过阻断所述II型活化素受体来实施本发明的方法。适宜的II型活化素受体阻断剂是Cripto(如在Harrison等人.的Trends in endocrinology and metabolism，2005，16：73-78中所描述的)。可替换地，可以向细胞提供截短或主要的阴性形式(dominant negative form)的活化素II型或I型受体，已知其可以阻断活化素信号。
在又一种实施方式中，可以通过抑制活化素A来实施本发明的方法。一种非常适宜的活化素抑制剂是卵泡抑素。然而，还可以使用其它抑制剂。适宜的实例是活化素A抗体，其有效地阻断蛋白质的受体结合部分。
现在本发明提供了一种方法，其中在形成细胞外基质期间，将细胞暴露于活化素A或活化素A抑制剂。
应当明了，在根据本发明的方法进行处理后由产生ECM的细胞产生的细胞外基质本身是本发明的一部分。这样的细胞外基质材料可以应用于这样的用途，其中需要当暴露于矿化环境时并不矿化的材料。可替换地，这样的细胞外基质材料可以应用于这样的用途，其中需要当暴露于矿化环境时快速矿化的材料。确定为由活化素信号调节的特定ECM蛋白的调节因此还可以用来控制ECM的矿化。如在本文中所使用的，矿化环境通常理解为细胞环境，例如包含磷酸钙沉积成骨细胞的环境，虽然细胞的存在并不是基本的，只要磷酸钙形成和沉积所必要的生化因子，如骨钙蛋白、骨连蛋白、护骨素、和/或骨涎蛋白(其可以作为磷酸钙形成的成核剂)以及磷酸钙源提供给所述基质到可以发生矿化的程度即可。
本发明的方法的一种非常适宜的用途是提供快速矿化的组织再生支架，并且其中所述矿化可以体内或体外发生。适当地体外制备这样的支架，然后植入在需要快速矿化的部位。可替换地，在体外适当地制备这样的支架并矿化成骨，然后将经矿化的支架植入需要所述骨的部位。因此，可以连同组织工程(TE)来实施本发明的方法，以增强在有机或无机支架上的骨形成。TE的原理涉及细胞的分离和培养，以及在接种支架移植到身体的特定位置以前，将培养细胞体外接种到生物或人工支架上。从而支架作为附着基质并在组织形成或再生期间引导细胞。接种细胞再生成组织可以发生在植入以前、植入期间或植入以后。作为适宜的支架材料，可以使用有机和无机材料、以及它们的组合。
因此本发明的用于控制ECM矿化的方法可以和用于制备快速可矿化支架的方法一起使用。这样的方法可以包括提供适宜的支架，用产生ECM的细胞如成骨细胞或其祖细胞，如干细胞，接种所述支架。干细胞可以例如分离自自体来源(对象的骨髓)并在体外培养中扩展。优选的祖细胞是间充质干细胞(MSC)，其可以衍生自各种来源，包括脂肪组织、骨髓、心脏肌肉等。可以用特定的生物活性分子来诱导这些祖细胞以成熟为所需要的细胞型。可以例如通过地塞米松来诱导MSC以形成成骨细胞。为了骨生成(再生)，可以体外将间充质干细胞诱导成成骨细胞，例如通过利用地塞米松。例如，可以通过骨形态发生蛋白(BMP)来引导MSC以增殖和变成特化细胞，其产生软骨(软骨细胞)或骨(成骨细胞)。成骨细胞可以经受另外的培养期，例如约1-30天，优选约1-2周，以进一步扩充上述细胞。适宜的培养基是技术人员已知的并且可以例如包含甘油磷酸和抗坏血酸。为了体外诱导人MSC的成骨分化，适宜的培养基可以包括1至1000nM地塞米松(Dex)、0.01至4mM L-抗坏血酸-2-磷酸盐(AsAP)或0.25mM抗坏血酸、以及1至10mM β-甘油磷酸(βGP)。
本发明的用于控制ECM矿化的方法还可以和用于制备不可矿化支架或其中矿化被很大程度上降低的支架的方法一起使用。这样的支架作为例如在软骨组织工程和软骨再生用途中的软骨细胞的支架，引起了很大的兴趣。
然后可以使细胞可以在组织培养物中形成ECM或以后被装载到支架上，例如通过使用在下述实施例中描述的如用于SV-HFO成骨细胞或NHOst成骨细胞的培养基。可以例如利用在以下实施例中描述的如用于SV-HFO成骨细胞或NHOst成骨细胞的培养基来实现最佳的成骨分化，如通过成骨细胞形态、碱性磷酸酶(APase)的表达、I型胶原的表达、骨钙蛋白表达和/或ECM的矿化或其它成骨细胞分化标志所确定的。在本发明的用于产生可矿化ECM的一种方法中，将成骨细胞暴露于活化素A抑制剂。在所述暴露于活化素A抑制剂以前或以后，可以将成骨细胞接种到支架上，以产生细胞外基质。可替换地，可以将祖细胞接种到支架上，然后被诱导以形成成骨细胞，其随后被暴露于活化素A抑制剂。
在另一可替换方式中，可以将成骨细胞暴露于活化素A抑制剂，并使其可以产生(优选成熟的)ECM，然后将ECM(单独或连同成骨细胞一起)提供在支架上。因此，ECM还可以分离自成骨细胞并用作用于快速矿化的基质。在一种优选的体外实施方式中，将细胞接种到支架上并暴露于活化素A抑制剂。此外，可以通过其它特定的生物活性分子如生长因子、通过经回体(ex-vivo)基因转移或通过其它物理因子来诱导细胞，以体外形成所需要的新组织。可替换地，支架可以包括生长因子。然后可以将体外制备和装载的支架植入骨缺损中，其中接种的细胞被诱导以矿化ECM。当然，还可以完全体外产生组织或器官，然后作为准备好的更换材料用来移植。
根据本发明的用于控制ECM矿化的方法可以用于各种组织再生应用。例如，本发明的方法可以应用于与骨质疏松有关的缺陷、创伤、矫形术、瘤腔、耳鼻喉、颌面外科手术、牙周手术、带有骨缺损的骨折、具有或没有骨缺损的假关节、脊柱关节融合术(脊柱融合术)、胫骨截骨术和/或心脏瓣膜移植。其它TE应用可以包括例如骨的修复。在骨折-愈合途径中，软骨细胞产生软骨框架，其最终被由成骨细胞形成的骨取代。这里也可以应用本发明的方法。
本发明的方法涉及能够产生ECM的任何细胞的ECM，其中需要ECM的矿化，尤其是需要增强ECM矿化的患者细胞的ECM。示例性的ECM是在骨质疏松、骨折愈合或骨再造期间的成骨细胞或软骨细胞的那些ECM。此外本发明的方法涉及能够产生ECM的任何细胞的ECM，其中发生ECM的矿化但不是所期望的，尤其是需要减少或预防ECM矿化的患者的细胞的ECM。示例性的ECM是在动脉粥样硬化性钙化期间或以前的血管平滑肌细胞的那些ECM。因此，在一种优选实施方式中，矿化涉及骨矿化，而在另一种优选实施方式中，矿化涉及动脉粥样硬化性钙化。
可以体内或体外实施本发明的方法。当体外实施时，该方法可以例如涉及控制与组织培养物(包含排出的ECM)有关的矿化过程、或与非细胞环境中分离的ECM有关的矿化过程。非常适宜地，本发明的体外方法用来控制与组织工程或组织再生过程有关的矿化，如在骨修复植入物中的矿化。
当体内实施时，该方法可以例如涉及与骨折愈合有关的矿化过程的控制、或骨质疏松的治疗。可替换地，当体内实施时，该方法可以例如涉及与动脉粥样硬化性钙化有关的矿化过程的控制。
现在本发明提供了体内或体外方法，用于控制参与病理性钙化过程的细胞的细胞外基质的矿化，其中病理性钙化包括但不限于动脉粥样硬化性钙化，转移性肺钙化，心脏瓣膜钙化，以及关节中的钙化并伴随腱炎；关节炎；滑囊炎；骨刺；皮肤骨化；肾结石；骨化性肌炎；肺骨化；白内障；双侧纹状体苍白球齿状体钙质沉着症；神经源性异位骨化以及骨肉瘤；或用于控制参与生理性钙化过程(例如骨化和骨矿化)的细胞的细胞外基质的矿化，其中生理性钙化过程包括但不限于骨愈合或骨形成以及其中的疾病如骨质疏松。这样的方法可以涉及医疗方法或涉及医学工程(如组织工程)的方法。
控制参与病理性钙化的细胞(包括但不限于血管细胞，优选血管平滑肌细胞、或软骨细胞)的细胞外基质的矿化将涉及以以下方式之一抑制或预防所述细胞外基质的矿化：
i)在产生细胞外基质的细胞表面上激活活化素受体，优选II型活化素受体。这可以例如通过使用所述受体的配体或功能类似物、诱导剂和/或激动剂来实现。上述配体优选是活化素A，最优选是外源性活化素A；或
ii)在所述细胞中增强至少一种基因的表达，所述基因选自由以下组成的组，该组包括：血小板反应蛋白1；V型胶原α-1；XVI型胶原α-1；VIII型胶原α-2；胶原三股螺旋重复蛋白1；透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1；硫酸软骨素蛋白多糖2(多功能蛋白聚糖)；潜在的转化生长因子β结合蛋白2；双糖链蛋白多糖；基质金属肽酶2；成骨细胞特异性因子2(periostin)、成骨细胞特异性因子；抗“衰老关键蛋白”抗体；SPOCK1、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白/骨连蛋白、cwcv和kazal样域蛋白聚糖(睾丸蛋白聚糖)；以及具有1型血小板反应蛋白基序的ADAM金属肽酶，或控制所述基因的表达产物的活性；或
iii)在所述细胞中阻断或抑制至少一种基因的表达，所述基因选自选自由以下组成的组，该组包括：CD248抗原、内皮唾酸蛋白；弹性微原纤维界面蛋白2；matrilin 2；异连蛋白α；IV型胶原α6；巢蛋白2(骨巢蛋白)；乳突淋蛋白、蛋白聚糖样硫酸糖蛋白；C型凝集素结构域家族3、成员B；V型胶原α3；以及TIMP金属肽酶抑制剂4，或控制所述基因的表达产物的活性。
控制参与生理性钙化的细胞(包括但不限于成骨细胞)的细胞外基质的矿化将涉及以下述方式之一刺激所述细胞外基质的矿化：
iv)防止活化素受体(优选II型活化素受体，在产生所述细胞外基质的细胞的表面上)和所述受体的内源性配体之间的相互作用。这可以例如通过使用配体抑制剂、所述配体抑制剂的诱导剂和/或所述受体的拮抗剂来实现。配体抑制剂优选是卵泡抑素；或
v)在所述细胞中阻断或抑制至少一种基因的表达，所述基因选自由以下组成的组，该组包括：血小板反应蛋白1；V型胶原α1；XVI型胶原α1；VIII型胶原α2；胶原三股螺旋重复蛋白1；透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1；硫酸软骨素蛋白多糖2(多功能蛋白聚糖)；潜在的转化生长因子β结合蛋白2；双糖链蛋白多糖；基质金属肽酶2；成骨细胞特异性因子2(periostin)、成骨细胞特异性因子；抗“衰老关键蛋白”抗体；SPOCK1、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白/骨连蛋白、cwcv和kazal样域蛋白聚糖(睾丸蛋白聚糖)；以及具有1型血小板反应蛋白基序的ADAM金属肽酶，或控制所述基因的表达产物的活性；或
vi)在所述细胞中增强或刺激至少一种基因的表达，所述基因选自由以下组成的组，该组包括：CD248抗原、内皮唾酸蛋白；弹性微原纤维界面蛋白2；matrilin 2；异连蛋白α；IV型胶原α6；巢蛋白2(骨巢蛋白)；乳突淋蛋白、蛋白聚糖样硫酸糖蛋白；C型凝集素结构域家族3、成员B；V型胶原α3；以及TIMP金属肽酶抑制剂4，或控制所述基因的表达产物的活性。
本发明提供了医疗方法，其中治疗包括控制细胞外基质的矿化过程(如上所述)。该方法可以是体内或体外方法。
因此本发明提供了用于治疗或预防病理性钙化的方法，其中病理性钙化优选选自由以下组成的组：动脉粥样硬化性钙化，转移性肺钙化，心脏瓣膜钙化，以及关节中的钙化并伴随腱炎；关节炎；滑囊炎；骨刺；皮肤骨化；肾结石；骨化性肌炎；肺骨化；白内障；双侧纹状体苍白球齿状体钙质沉着症；神经源性异位骨化以及骨肉瘤，包括通过本发明的方法按照如上所述实施方式i)、ii)或iii)来控制细胞外基质的矿化。
本发明还提供了用于刺激矿化、骨愈合、骨形成和/或用于治疗骨质疏松的方法，包括通过本发明的方法按照如上所述的实施方式iv)、v)或vi)来控制细胞外基质的矿化。
作为供上述医疗之用的产品，本发明提供了用于治疗病理性钙化的药剂，所述药剂包含活化素受体配体、或激动剂或其功能类似物，优选活化素A，以及药学上可接受的赋形剂。本发明还提供了用于治疗骨质疏松或骨折的药剂(药物)，所述药剂包含活化素A抑制剂，优选卵泡抑素，以及药学上可接受的赋形剂。
本发明提供了非治疗方法，如医学工程(优选体外回输(ex vivo))的方法，例如组织工程。在该方面的一种实施方式中，本发明提供了用于产生非矿化细胞外基质的方法，包括实施用于抑制或预防细胞外基质的矿化的方法(如上所述)以及可选地分离如此获得的细胞外基质。这样的基质可以例如用于软骨组织的生产。在该方面的一种可替换实施方式中，本发明提供了用于生产快速矿化细胞外基质的方法，包括实施用于刺激所述细胞外基质的矿化的方法(如上所述)以及可选地分离如此获得的细胞外基质。这样的基质可以例如用于骨组织的生产。
本发明还提供了用于在对象中诊断骨质疏松的标志。如本文中提供的标志是所述对象的骨组织中的成骨细胞所分泌活化素A的量与卵泡抑素的量的比率。技术人员非常熟悉用于确定组织中上述蛋白质化合物的水平的方法。例如，ELISA试验或质谱测定可以用来确定骨组织中卵泡抑素和活化素A的量(水平)。当和对照对象相比所述比率升高时，则对象被诊断患有骨质疏松。这意味着，组织并不是正在矿化或具有被矿化的低效力，因为所述比率预示着细胞外基质的组成是仍然未成熟的。
通过举例而不是限制，现将给出本发明的实施例。
实施例
以下描述的实验的目的是估计在人成骨细胞中活化素的功能。使用了人成骨细胞，其体外形成矿化ECM，其中分析了活化素对矿化的调节。测量了成骨细胞分化期间的活化素生产，以及活化素拮抗剂的表达。检测了全基因组表达谱以揭示在成骨细胞中活化素信号的下游介体(mediator)。此外，利用人血管平滑肌细胞(VSMC)，研究了活化素对血管钙化的影响。
材料与方法
细胞培养
建立自胎儿颅盖的用于永生化人成骨细胞细胞系SV-HFO的细胞的培养指南详细描述在Eijken，M.，等人的Mol Endocrinol，2005.19(3)：p.621-31中。简单地说，第9传代和第13传代之间的SV-HFO细胞是在37℃和5％ CO2的湿润气氛中并在α-极限必需培养基(Gibco BRL，Paisley，U.K.)中加以培养，其中α-极限必需培养基补充有20mM HEPES pH 7.5(Sigma St.Louis，MI，U.S.A.)、链霉素/青霉素(Gibco BRL)、1.8mM CaCl2(Sigma)以及2％活性炭处理的热灭活胎牛血清(FCS)(Gibco BRL)。将细胞以10×103个活细胞/cm2的密度接种在6孔或12孔平板中(Corning，NY，USA)。接种以后，在将它们放入分化-矿化培养基(α-极限必需培养基，补充有20mM HEPESpH 7.5、链霉素/青霉素、1.8mM CaCl2、以及2％活性炭处理的热灭活FCS、10mM β-甘油磷酸和100nM地塞米松)以前(表示为第0天)，细胞被温育两天。培养基补充有新鲜加入的10mM β-甘油磷酸(Sigma)、100nM地塞米松(DEX)(Sigma)或其它添加剂(活化素和卵泡抑素)并且每2-3天加以更换。卵泡抑素购买自PeproTech(RockyHill，NJ，USA)而活化素A购买自R&D systems(Minneapolis，MN，USA)。
类似于如上所述的SV-HFO细胞，培养正常人成骨细胞(NHOst)(Cambrex Bio Science，Verviers，Belgium；CC-2538)、血管平滑肌细胞(VSMC)(冠状动脉平滑肌细胞；Cambrex bioscience；CC-2583)以及人间充质干细胞(hMSC)；(Cambrex bioscience)，其中仅进行以下调节。使用第3传代和第6传代之间的NHOst和hMSC并以5×103个活细胞/cm2的密度进行接种。在与SV-HFO类似的培养中，NHOst和hMSC培养物被诱导矿化，不同之处在于使用了10％活性炭处理的热灭活FCS(Gibco BRL)。使用了第3传代和第7传代之间的VSMC并以5×103个活细胞/cm2的密度进行接种。在补充有CloneticsTM Sm-GM-2 Bulletkit(Cambrex Bio Science)的平滑肌细胞培养基(Cambrex Bio Science)中进行VSMC的扩增。在补充有l00nM DEX、0.1mM抗坏血酸(Sigma)、10μg/ml胰岛素(Sigma)、1mM CaCl2(终浓度为2.8mM)、10mM β-甘油磷酸以及10％FCS的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Gibco BRL；含有4500mg/l葡萄糖、L-谷氨酰胺以及丙酮酸)中VSMC被诱导矿化。
成骨细胞培养物的灭活
在矿化培养基中培养的第12天，除去培养基并在磷酸缓冲盐溶液(PBS)(Gibco BRL)中洗涤培养物一次。风干培养物并在-20℃下温育过夜。接着，如在细胞培养方法中所描述的，正常孵育经灭活的培养物(对于经灭活的培养物，表示为第0天)。
DNA、碱性磷酸酶活性以及矿化测定
细胞培养物刮自在包含0.1％ Triton X-100的PBS中的培养皿并存放在-80℃下。分析以前，用超声波细胞粉碎仪在冰上超声处理细胞裂解液2×15秒，然后用于DNA、碱性磷酸酶活性以及矿化测定，其详细描述在Eijken等人，2005[上文]中，该参考文献的全部内容以引用方式结合于本文。简言之，利用溴乙啶溶液荧光测量DNA含量。通过确定对硝基苯酚从对硝基磷酸苯酯的释放来测量碱性磷酸酶活性。在加入1M乙醇胺缓冲液(pH 10.6)、0.35mM邻甲酚酞氨羧络合剂、19.8mM 8-羟基喹啉以及0.6mM盐酸以后在595nm处比色法测定钙含量。为了茜素红染色，在冰上用70％乙醇固定细胞培养物60分钟。固定以后，用PBS洗涤细胞两次并用茜素红溶液(在脱矿物质水水中的饱和茜素红，利用0.5％氢氧化铵调节至pH 4.2)染色10分钟。除去茜素红S并用脱矿物质水水洗涤培养物。
荧光素酶报道测定
在培养的第5天，按照制造商的说明，利用Fugene6(Roche，Basel，Switzerland)并用200ng报道质粒/孔(12孔板)转染细胞。24小时以后，用包含低血清(0.2％FCS)的新鲜培养基更换培养基并温育3小时。3小时以后，用包含低血清的培养基第二次更新培养基，然而现在补充有在结果部分描述的添加剂。24小时以后，通过在100-200μl裂解缓冲液(Promega，Madison，WI)中温育20分钟来裂解细胞。利用25μl细胞裂解液和Steady-Glo Luciferase AssaySystem(Promega)来测量荧光素酶活性。利用pGL3(CAGA)12-lux(CAGA-Luc)(Dennler et al，Embo J，1998 17：3091-100)来测量活化素信号并且利用pGL3-BRE-luc(BRE-Luc)(Korchynskyi等人JBiol Chem，2002.277：4883-91)来测量BMP信号。
卵泡抑素和活化素A的量化
在培养期间的不同天数，收集培养基用于活化素A和卵泡抑素测量。在48小时温育以后，从培养物收集培养基。离心培养基(5分钟，500g)并且随后存放在-20℃下供进一步分析。还制备细胞裂解液以分析相应培养物的DNA含量。分别利用活化素A DuoSetELISA试剂盒或卵泡抑素quantikine ELISA试剂盒(R & D systems)分析100μl的培养基中活化素A和卵泡抑素的量。
免疫组织学
在二甲苯和氯仿的1∶1混合物中对塑化骨(plastified bone)切片进行去丙烯酸化(deacrylated)30分钟，然后浸泡在二甲苯中，再水化然后用蒸馏水冲洗两次。在100℃下用Tris-EDTA缓冲液pH9.0预处理载玻片15分钟然后冷却15分钟，接着用流动的自来水冲洗。用PBS和H2O2的10∶1混合物抑制内源性过氧化物酶活性10分钟，接着两次水洗涤和一次Tris-HCl pH 8.0洗涤。以下步骤在室温的加湿室中进行。一抗被1∶50稀释在正常的抗体稀释剂(SkytekLaboratories，UT，USA；ref.ABB999)中，然后温育60分钟。抑制素-βA、抑制素-α以及IgG2b阴性对照抗体购买自Serotec(Serotec，Oxford，UK；MCA950 ST，MSA951S，MCA691)。用Tris-HCl冲洗载玻片两次。用Dako REALtm Envisiontm Detection System、过氧化物酶/DAB+、兔/小鼠(Dako，Glostrup，Denmark；Code K5007)检测载玻片。在DAB检测以后，用流动的自来水冲洗载玻片，并用苏木紫对比染色1分钟，用流动的自来水冲洗2分钟，在增加的乙醇步骤中脱水。用二甲苯冲洗并利用Pertex封固剂(Histolab，Gothenburg，Sweden)覆盖盖玻片。
实时PCR分析(qPCR)
在Eijken等人，2005[上文]中详细描述了RNA分离、cDNA合成以及qPCR。简单地说，利用ABI 7700序列检测系统(AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)进行定量实时逆转录PCR(qPCR)。利用SYBR绿色或荧光内部探针(5′-FAM；3′-TAMRA)来量化基因表达。对于SYBR绿色和荧光探针测定，PCR反应包含20ng的cDNA并且分别利用用于SYBR绿色I的qPCR试剂盒或qPCR核心试剂盒(Eurogentec)来进行。人甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA(GAPDH)的量用作内部对照以对RNA提取和降解以及cDNA合成效力方面的可能的差异进行标准化。数据表示为相对mRNA水平，其是通过方程2-ΔCt(ΔCt＝靶基因的Ct减去GAPDH的Ct)加以计算。对于qPCR分析，使用的RNA分离自培养物，其并不用于微阵列分析。
基于Affymetrix阵列的基因表达
用2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)并通过RNA 6000纳米分析评估了分离的RNA的纯度和质量。所使用的样品均没有显示出明显降解或DNA污染。对于每种分析条件，汇集了3个不同样品的总RNA。按照单循环靶标记程序(Affymetrix；701024 Rev.3)从总RNA合成第一和第二链cDNA。总计，按照制造商的说明(Invitrogen)利用Superscript双链-cDNA合成试剂盒(Superscriptds-cDNA Synthesis Kit)逆转录4.0μg的总RNA。随后，利用基因芯片样品纯化模型(GeneChip Sample Cleanup Module)(Affymetrix)纯化双链cDNA并在体外转录反应中用作模板，其中使用BioArray(tm)HighYield(tm)RNA转录标记试剂盒(RNA TranscriptLabeling Kit)(Affymetrix)。利用基因芯片样品纯化模型(GeneChipSample Cleanup Module)和量化分光光度法(1 OD260nm＝40μg/mL)来纯化扩增的生物素化互补RNA(cRNA)。总计，在94℃下通过终浓度为0.5μg/μL的金属诱导水解35分钟，20μg的生物素标记的cRNA被片段化。用Agilent 2100 Bioanalyzer检查片段化，证实平均大小大约为100nt。总计，按照制造商的方法(Affymetrix，701025Rev 5)，15μg片段化生物素化cRNA杂交于基因芯片人类基因组(GeneChip Human Genome)U133 Plus 2.0寡核苷酸微阵列(Affymetrix)。如在基因芯片表达分析(GeneChip ExpressionAnalysis)技术手册(Affymetrix)中所描述的，进行染色、洗涤以及扫描程序。利用基因芯片(r)扫描仪3000，对每个阵列进行数据采集约12分钟。
微阵列数据分析
为了检查不同阵列的质量，利用基因芯片操作软件(GeneChipOperating Software)(GCOS，Affymetrix)对测得的强度值进行分析。本(发明)要求的百分比(约40％)、噪声、本底、以及GAPDH 3′与5′的比率(＜1.4)均表明高质量的样品以及总体上的可比性。
对在任何微阵列中从未存在的探针组合(按照AffymetrixMAS5.0软件)未进行进一步的分析。利用分位数标准化对每个芯片的剩余探针组合(30336)的原强度进行log2转换和标准化。在标准化以后，数据被反向转换到正常强度值。利用OmniViz软件、版本3.6.0(OmniViz，Maynard，MA)进行数据分析。
基因命名
使用了如由HUGO基因命名委员会[Wain，H.M.，等人，Guidelines for human gene nomenclature.Genomics，2002.79(4)：p.464-70]提供的基因名称和基因符号。
统计资料
如果多个独立的实验显示类似的结果，数据才提供。至少一式三份地进行实验。数值是平均值±SEM。利用t检验计算显著性。为了计算GO分析的显著性，使用了Benjamini和Hochberg错误发现率[Young，A.，等人，OntologyTraverser：an R package for GO analysis.Bioinformatics，2005.21(2)：p.275-6]。
结果
活化素A抑制在人成骨细胞培养物中的矿化
利用成骨细胞分化模型SV-HFO，我们详细研究了活化素信号在成骨细胞中的作用。这种人成骨细胞模型在培养期间产生细胞外基质(ECM)，其最终在2至3周的时间期间被矿化。利用这些人成骨细胞，我们证明了活化素A治疗可强烈抑制矿化过程(图1和图6)。这种效应是剂量依赖性的，表明在用高于5ng/ml的活化素A浓度治疗以后矿化显著降低。活化素A同样剂量依赖性地减少成骨细胞分化标志碱性磷酸酶(ALPL)(数据未示出)，然而，和矿化的程度相比，抑制的程度(10-30％)较小。活化素A治疗对细胞生长没有影响，如由未改变的DNA含量(数据未示出)所显示的。
成骨细胞以分化依赖性方式产生活化素A
为了揭示活化素是否以自分泌方式起作用，我们测量了在人成骨细胞中两种抑制素-β亚单位以及活化素A蛋白的mRNA水平。QPCR说明了，和抑制素-βB(INHBB)亚单位相比，抑制素-βA(INHBA)被充分表达。另一方面，抑制素-a(INHA)mRNA几乎检测不到(图2A)。这说明成骨细胞主要产生活化素A。
活化素A蛋白定量测量结果表明，成骨细胞培养物分泌生物相关量的活化素A(高达5ng/ml)，而抑制素-A蛋白则不可能检测到(数据未示出)。纠正细胞数(DNA含量)的活化素A生产是在分化的不同阶段加以测量(第5、12和19天)。这表明，在分化期间活化素A的生产减少并且在基质矿化阶段(第12和19天)最低(图2B，矿化成骨细胞)。
为了考察这种分化依赖性调节，在并没有经历分化的成骨细胞培养物中测量了活化素A生产。通过从培养基排除糖皮质激素(DEX)产生了非分化成骨细胞(对照成骨细胞)，导致这样的成骨细胞培养物，其具有低ALP活性并且没有呈现体外矿化。有趣的是，和它们的矿化对应物相比，对照成骨细胞具有高得多的活化素A生产(图2B)，这说明成熟的功能性成骨细胞已抑制活化素A生产。
此外，关于人骨活检的免疫组织化学表明人类骨组织上有活化素A。在矿化骨基质中INHBA亚单位被明显检测到，而INHA亚单位则不能被检测到(图2C)。
活化素A以自分泌方式抑制矿化
通过用活化素拮抗剂卵泡抑素中和活化素信号来测量内源产生的活化素对成骨细胞功能的影响。首先我们测量了卵泡抑素是否能够中和成骨细胞培养物中的活化素信号。活化素/TGFβ信号荧光素酶报道构建体(CAGA-荧光素酶)用来测量活化素信号。活化素A治疗剂量依赖性地增加活化素/TGFβ信号，其可以通过与卵泡抑素的共同孵育加以抑制(图3A)。此外，卵泡抑素还降低基本的活化素/TGFβ信号50％，其进一步支持在成骨细胞中内源性活化素信号的观测结果。在文献中提示，卵泡抑素还中和BMP的作用。为了在成骨细胞中对此进行研究，使用了BMP-反应元件荧光素酶报道构建体(BRE-荧光素酶)。加入10和100ng/ml BMP-2a会强烈诱导BRE荧光素酶活性。与活化素信号相反，卵泡抑素的存在均不能降低基本的和BMP-2a诱导的BMP信号(图3B)。这表明，在这些条件下，卵泡抑素特异性地中和成骨细胞中的活化素信号。卵泡抑素的这种抑制效应用来研究内源性活化素信号对成骨细胞分化和矿化的影响。用卵泡抑素(100和500ng/ml)进行的治疗明显增加了基质矿化(图3C)同时有ALP活性的较小增加(数据未示出)。这说明，成骨细胞分泌活化素A，其以旁分泌和/或自分泌方式抑制矿化和ALP活性。
在矿化培养物中活化素A与卵泡抑素的比率降低
除了成骨细胞的活化素A生产外，我们还说明了，成骨细胞分泌生物相关量的卵泡抑素。在培养的第12天，在培养基温育的第2天以后，在培养物上清液中可以测量到1-3ng/ml的最高水平的卵泡抑素(数据未示出)。这表明，在成骨细胞中内源性活化素信号由活化素A的表达以及F卵泡抑素的表达加以调节。在整个培养过程中计算在矿化和对照成骨细胞中的卵泡抑素的生产(纠正培养物DNA含量的卵泡抑素水平)(图4A)。这表明，和对照成骨细胞相比，在矿化成骨细胞中，在培养开始时(第5天)，卵泡抑素生产更高，以及在两种条件下的培养期间卵泡抑素生产均降低。接着，计算了活化素A和卵泡抑素之间的摩尔比。这表明，和对照培养相比，矿化培养物具有降低的活化素A与卵泡抑素的比率，这表明在矿化条件下受到抑制的活化素信号(图4B)。
在开始矿化以前活化素信号是最有效的
我们研究了在成骨细胞分化的具体的时间窗口活化素信号是否抑制矿化。使用了若干温育实验，其中在具体的时间期限用活化素A处理成骨细胞培养物。首先，在前矿化期期间(长达培养的第10天)或在矿化期期间(从培养的第10起)，用中等剂量活化素A(20ng/ml)处理培养物，并且随后在第19天测量矿化(图5A)。这说明，在矿化期以前的处理可以最有效地抑制矿化。为了放大这种前矿化期，进行了更特别的温育，如在图5B中所描述的。这说明，当存在于开始矿化以前的最后7天时活化素A是最有效的。甚至当活化素A仅存在于矿化以前的最后两天(第10-12天)时，也可以测量到矿化的显著降低。
我们假设，在该前矿化阶段的活化素信号导致基质组成的改变，将它保持在不能够矿化的未成熟状态。为了证明上述假设，我们利用了以下事实：成骨细胞在培养的最初12天内产生ECM，其随后可以矿化而与活成骨细胞的进一步存在无关(图5C，赋形剂)(Fratzl-Zelman，N.，等人，Matrix mineralization in MC3T3-E1 cellcultures initiated by beta-glycerophosphate pulse.Bone，1998.23(6)：p.511-20)。这是通过在开始矿化时(第12天)冷冻成骨细胞培养物至-20℃(以灭活培养物)来实现的。接着，随后用培养基再温育这些包含非活细胞但未破坏ECM的培养物7天。在固定时(第12天活培养物＝第0天灭活的培养物)以及在3和7天以后(参见孵育计划，图5C)对矿化进行量化。在开始时(第0天)测量不到矿化，然而，在3和7天以后可以测量到ECM的矿化(图5C，赋形剂)。重要的是，在灭活以前用活化素A预处理的培养物中，不能检测到ECM的矿化。这支持我们的假设，活化素A的主要影响是在开始矿化以前并且揭示了对基质组成和成熟的影响。
活化素抑制成骨细胞矿化以及异位矿化
用活化素A处理不同的矿化模型以说明由活化素A诱导的矿化的抑制并不是SV-HFO人成骨细胞模型所特有的。
在另一种成骨细胞模型(NHOst)和在血管平滑肌细胞(VSMC)培养物中检测了活化素A。这些VSMC用作动脉粥样硬化的模型[Shioi，A.，等人Arterioscler Thromb Vasc Biol，1995.15(11)：p.2003-9]并且可以利用成骨培养基被诱导矿化。如针对SV-HFO培养物所证明的，活化素I型(ACVRIB)和II型受体(ACVR2A/2B)在NHOst以及VSMC培养物中表达(mRNA)(数据未示出)。重要的是，活化素A在NHOst和VSMC培养物中均强烈抑制矿化过程(图6)。
经卵泡抑素和活化素A处理的培养物的基因谱分析
利用Affymetrix HG U133 Plus 2.0微阵列进行基因谱试验，以了解活化素A在成骨细胞中的机制和分子作用。比较了经卵泡抑素、赋形剂以及活化素A处理的成骨细胞的基因表达谱。这些处理产生具有低、中等(内源性)、或高活化素信号的培养物，导致3种不同水平的基质矿化如图3C所示。此外，在不同的阶段测量3个表型的基因表达：1)基质形成，没有矿化(第5天)，2)基质成熟，开始矿化(第12天)，以及3)充分矿化(第19天)。
设计了基于表型的查询，其关注在前矿化期(第5和12天)由活化素信号调节的基因，其显示出对于活化素A的矿化抑制是重要的。在选择查询中一个重要方面是，我们寻找用卵泡抑素和活化素A处理细胞后被调节的基因，因为两种条件均影响矿化。在第5和12天，选择这样的基因，即和赋形剂培养相比，其在经活化素A处理的培养物中被上调(低矿化)并在同时在经卵泡抑素处理的培养物中被下调(高矿化)，反之亦然。此外，在上述两天之一，在经活化素A和卵泡抑素处理的培养物之间的基因表达的差异应至少是2倍是因素-2(factor-2)(图7)。总计，选择520 Affymetrix ID，其表示397种独特的基因和62个未注解的Affymetrix ID。在图7中，所选择的Affymetrix ID表现为层次聚类(hierarchical clustering)；和赋形剂培养物相比，红色和绿色分别表示上调和下调。
基因本体(GO)分析
接着，GO富集分析用来基于GO生物过程、GO分子功能、以及GO细胞组分对397种所选的基因进行分类(数据未示出)(Young，A.，等人，OntologyTraverser：an R package for GOanalysis.Bioinformatics，2005.21(2)：p.275-6)。总计，我们鉴定了47个生物过程、13种分子功能、以及4种细胞成分，与如果分析397种随机基因所期望的相比(纠正多个试验)表现为显著过度表现。若干生物过程GO项目具有高度相似性，因此通过基因的类似组加以鉴定。
细胞成分的分析表明，位于细胞外区、间隙或基质中的基因显著过度表达。这是更有趣的，因为这种非偏爱的基因表达谱和分析支持我们的以下假设：活化素A的影响在细胞外基质形成和成熟期是最重要的(参见图5)。qPCR分析表明，活化素信号并没有改变众所周知的和丰富的ECM蛋白在骨中的mRNA表达、胶原I型、骨桥蛋白以及骨钙蛋白(数据未示出)。然而，这些微阵列分析鉴定了位于ECM中并被活化素信号调节的若干基因(图8)。
活化素信号改变成骨细胞以及VSMC中的ECM组成
利用在经卵泡抑素、赋形剂以及活化素处理的成骨细胞中的qPCR以及它们在VSMC中的表达更详细地分析了ECM基因的选择(图9)。还量化了ALPL的表达，作为阳性对照。这表明，在成骨细胞中受到活化素A抑制的CLEC3B、COL5A3、TIMP4、NID2以及ALPL(上部5个图)在VSMC培养物中也受到活化素A的抑制。在成骨细胞中活化素信号强烈增加POSTN，其在VSMC中也得到证明。相反，在成骨细胞中活化素A增加了MMP2、FBLN5以及VCAN的表达，但在VSMC中这些基因的表达没有变化。
卵泡抑素处理并没有改变在VSMC中的基因表达。这与INHBA和INHBB亚单位在VSMC中的表达数据是一致，和在成骨细胞的表达相比，其均是低表达的(mRNA)(数据未示出)。此外，VSMC培养物的活化素A生产不能被检测到(数据未示出)。在VSMC中仅POSTN mRNA表达被卵泡抑素调节(0.5倍)。这种基因被活化素信号强烈诱导并可能已经被低浓度的活化素激活(图8)。
这些表达数据表明，内源性或外源性活化素信号可以改变成骨细胞培养物以及VSMC培养物中的ECM组成，防止ECM的矿化。尽管，内源性活化素信号在矿化VSMC方面是相对不太显著的。

Claims (19)

1.一种选择用于控制对象的组织中的细胞外基质矿化的候选治疗剂的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在支持细胞外基质形成和基质成熟的条件下将产生细胞外基质的来自所述组织的细胞暴露于检测化合物；
b)确定至少一种基因响应所述暴露在所述细胞中表达，其中所述基因选自：
A组，由编码以下物质的基因组成：血小板反应蛋白1；V型胶原α1；XVI型胶原α1；VIII型胶原α2；胶原三股螺旋重复蛋白1；透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1；硫酸软骨素蛋白多糖2(多功能蛋白聚糖)；潜在的转化生长因子β结合蛋白2；双糖链蛋白多糖；基质金属肽酶2；成骨细胞特异性因子2、成骨细胞特异性因子；抗“衰老关键蛋白”抗体；SPOCK1、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白/骨连蛋白、cwcv和kazal样结构域蛋白聚糖(睾丸蛋白聚糖)；以及具有1型血小板反应蛋白基序的ADAM金属肽酶；和/或
B组，由编码以下物质的基因组成：CD248抗原、内皮唾酸蛋白；弹性微原纤维界面蛋白2；matrilin 2；异连蛋白α；IV型胶原α6；巢蛋白2(骨巢蛋白)；乳突淋蛋白、蛋白聚糖样硫酸糖蛋白；C型凝集素结构域家族3成员B；V型胶原α3；以及TIMP金属肽酶抑制剂4；以及
c)在所述至少一种基因在所述细胞中的表达作为所述暴露的直接结果被调节的情况下，选择所述检测化合物作为候选治疗剂来控制在对象的组织中细胞外基质的矿化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种基因的表达通过全基因组表达谱确定。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种基因的表达通过测量转录自所述至少一种基因的mRNA水平确定。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种基因的表达通过所述细胞或所述细胞外基质的蛋白质分析确定。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述用于控制矿化的药剂是用于刺激矿化、骨愈合、骨形成和/或用于治疗骨质疏松的药剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述细胞是成骨细胞。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，当在权利要求1中所述的A组中的至少一种基因被下调和/或当在权利要求1中所述的B组中的至少一种基因被上调时，所述检测化合物被确定为候选治疗剂。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中，所述检测化合物选自由卵泡抑素的功能类似物、活化素A抑制剂、活化素A抑制剂的诱导剂以及II型活化素受体的拮抗剂组成的组。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述用于控制矿化的药剂是用于预防矿化或用于治疗钙化病症的药剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述钙化病症是病理性钙化，所述病理性钙化选自由动脉粥样硬化性钙化，转移性肺钙化，心脏瓣膜钙化，以及伴随腱炎的关节内钙化、关节炎、滑囊炎、骨刺、皮肤骨化、肾结石、骨化性肌炎、肺骨化、白内障、双侧纹状体苍白球齿状体钙质沉着症、神经源性异位骨化以及骨肉瘤组成的组。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述细胞是血管平滑肌细胞。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中，当在权利要求1中所述的A组中的至少一种基因被上调和/或当在权利要求1中所述的B组中的至少一种基因被下调时，所述检测化合物被确定为候选治疗剂。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，其中，所述检测化合物选自由活化素A的功能类似物、活化素A的内源性诱导剂以及II型活化素受体的激动剂组成的组。
14.一种细胞培养矿化模型，包括：
在支持细胞外基质形成和基质成熟的条件下产生细胞外基质的细胞的培养物；
检测化合物，以及
用于确定作为在所述培养物中的所述细胞暴露于所述检测化合物的结果的如在权利要求1中所述的A组和/或B组基因在所述细胞中的表达水平的手段和方法。
15.一种用于预防矿化或用于治疗钙化病症的治疗剂，其中，所述候选治疗剂是活化素A。
16.一种用于预防矿化或用于治疗钙化病症的药物组合物，包含治疗有效量的活化素A和药学上可接受的赋形剂。
17.一种用于刺激矿化、骨愈合、骨形成和/或用于治疗骨质疏松的治疗剂，其中，所述候选治疗剂是卵泡抑素。
18.一种用于预防矿化或用于治疗钙化病症的药物组合物，包含治疗有效量的活化素A和药学上可接受的赋形剂。
19.一种用于诊断对象中骨质疏松的标志，其中，所述标志是所述对象的骨组织中的成骨细胞分泌的活化素A的量与卵泡抑素的量的比率，并且当与对照对象比较时其中所述比率是升高的。
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