KR100684778B1

KR100684778B1 - 초음파로 전처리된 중간엽 줄기세포로부터 연골세포의분화방법

Info

Publication number: KR100684778B1
Application number: KR1020050054518A
Authority: KR
Inventors: 민병현; 박소라; 이현정; 최기호
Original assignee: (주)필미아젠; 박소라
Priority date: 2005-06-23
Filing date: 2005-06-23
Publication date: 2007-02-20
Also published as: KR20060134649A

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 중간엽 줄기세포가 접종된 삼차원 지지체를 초음파 자극에 일정기간 노출시킨 후 생체 내에 이식하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법 및 상기 초음파 처리에 의해 전분화된 중간엽 줄기세포를 함유하는 연골질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 연골세포로 전분화된 중간엽 줄기세포를 생체 내에 이식하면, 이식된 중간엽 줄기세포가 뼈 등의 다른 세포로 분화할 우려가 적어 보다 안전하게 치료에 이용할 수 있다.

중간엽 줄기세포, 연골세포, 초음파, 전분화, TGF-β

Description

초음파로 전처리된 중간엽 줄기세포로부터 연골세포의 분화방법{Method for Inducing Chondrogenesis From Ultrasound Pretreated Mesenchymal Stem Cells}

도 1은 각 그룹별 PGA/세포의 전체적 성상을 나타낸 사진이다.

도 2는 각 그룹별 PGA/세포 그룹의 시간에 따른 총 DNA 함량의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 3은 각 그룹별 PGA/세포의 시간에 따른 수분함량의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 4는 각 그룹별 PGA/세포의 시간에 따른 총 GAG(glycosaminoglycan) 함량의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 각 그룹별 PGA/세포의 시간에 따른 총 콜라겐 함량의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 6은 각 그룹별 PGA/세포를 사프라닌-O/패스트 그린으로 염색한 결과를 나타낸 사진이다.

도 7은 각 그룹별 PGA/세포를 Von Kossa 염색한 결과를 나타낸 사진이다.

도 8은 각 그룹별 PGA/세포의 타입II 콜라겐만을 면역조직화학적 방법으로 염색한 결과를 나타낸 사진이다.

본 발명은 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 초음파 자극에 일정기간 노출시킨 후 생체 내에 이식하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법 및 상기 초음파 처리에 의해 전분화된 중간엽 줄기세포를 함유하는 연골질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell:MSC)는 여러종류의 결합조직의 수선세포(repair cell)로 알려져 있으며, 이들 세포는 중간엽계의 여러 종류의 세포로 분화할 수 있다. 중간엽 줄기세포를 관절연골의 손상을 치유하는 데 사용하기 위해서는 생체 내 및 실험실 내에서 줄기세포를 직접적으로 연골세포주로 분화시키는 효율적이면서도 잘 정리된 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 이러한 미분화된 중간엽 줄기세포는 복구된 조직의 장기간 동안의 안정성에 대한 정보가 부족하고, 다른 형태의 세포로 분화하는 경향에 의해서 생체 내에서 이형조직이 형성될 위험이 있기 때문에 그 이용이 제한적이다 (De Bari, C et al., Arthritis Rheum, 50:142, 2004). 유전적 재조합을 하지 않거나 미분화된 중간엽 줄기세포를 무릎 관절에 직접 주사하였을 때, 분화되어 연골조직을 복원시키지 못하고, 오히려 증식하여 종양 을 형성하였다는 보고가 있다 (Gilbert, JE et al., Am. J. Knee Surg., 11:42, 1998, Noel, D et al., Stem Cells, 22:74, 2004, Butnariu-Ephrat, M et al., Clin. Orthop. Relat., 330:234, 1996).

수여자에 이식되지 전에 분화된 일부의 줄기세포를 선택적 정제 및 증식시킴으로써, 이로 인하여 이식 부위에서 줄기세포가 연골세포계가 아닌 다른 다양한 세포들로 분화하는 것을 감소시킬 수 있을 것으로 생각되나, 어떤 단계까지 전 분화된 중간엽 줄기세포가 생체에 이식하기에 적당한지는 아직 밝혀지지 않고 있다.

연골세포 분화를 유도하기 위하여, 중간엽 줄기세포는 3차원 배양 및 생물학적 성장 인자에 의한 자극 또는 물리적인 자극 등과 같은 특정 조건에서 배양되며, TGF-β(transforming growth factor β), BMP(bone morphogenic protein), FGF(fibroblast growth factor), IGF-I(insulin-like growth factor)를 포함하는 여러 성장인자들이 연골세포분화를 촉진할 가능성이 있다는 것으로 생각되어지고 있다. 순환 압축의 순환 수압 또는 물리적 하중이 중간엽 줄기세포의 연골세포분화에 효과적이라는 보고가 있어, 배아 분화 및 조직 재생 동안에 물리적 환경이 연골세포 분화에서 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.

골절의 치유 및 연골세포 대사에 있어서 관찰된 초음파의 영향에 대한 생물학적 기작을 연구하는데 많은 실험실 내 및 생체 내에서의 연구가 이루어지고 있으며, 최근 본 발명자들은 초음파를 이용하여 중간엽 줄기세포를 연골세포로의 분화시키는 방법 및 연골조직을 재생시키는 방법에 대한 특허를 출원한 바 있다 (대한민국 특허출원 10-2004-0090207, 대한민국 특허출원 10-2005-0030837).

그러나 상기 연골조직 재생 방법은 중간엽 줄기세포를 동물에 주입한 후 초음파 처리에 의하여 연골세포 분화를 촉진하였으나, 주입된 중간엽 줄기세포가 연골세포로만 분화하는 것이 아니라 의도하지 않은 골아세포 등의 다른 세포로 분화하는 경우가 발생하는 단점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 외부로부터 주입된 중간엽 줄기세포가 연골세포로만 분화할 수 있는 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, 중간엽 줄기세포를 초음파로 미리 처리하여 특정 단계의 연골세포로 분화시킨 다음 생체 내에 주입한 결과, 대부분의 모든 세포들이 연골세포로 분화하고, 이러한 연골세포의 표현형을 더 오랫동안 유지하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명 주된 목적은 초음파 처리에 의해 전분화된 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 생체 내에 주입하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 초음파 처리에 의해 전분화된 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 함유하는 연골질환 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 중간엽 줄기세포를 단층 배양한 다음, 상기 단층배양된 중간엽 줄기세포를 원심분리하여 세포를 수득하는 단계; (b) 상기 중간엽 줄기세포를 생분해성 고분자 지지체에 고정하여 삼차원 지지체를 제조하는 단계; (c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 초음파로 처리하여 중간엽 줄기세포를 전분화시키는 단계; 및 (d) 상기 전분화된 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 인간을 제외한 동물에 주입하여 연골화시키는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 중간엽 줄기세포를 단층 배양한 다음, 상기 단층배양된 중간엽 줄기세포를 원심분리하여 세포를 수득하는 단계; (b) 상기 중간엽 줄기세포를 생분해성 고분자 지지체에 고정하여 삼차원 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 초음파로 처리하여 중간엽 줄기세포를 전분화시키는 단계를 거쳐 제조된, 전분화된 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 함유하는 연골질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 초음파는 주파수(frequency) 10kHz~100MHz, 출력강도 10~5000mW/cm²인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 초음파 처리는 6~24시간 간격으로 1~30분간, 3~12일 동안 연속하여 실시하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 전분화시키는 단계는 TGF-β를 더 처리하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 중간엽 줄기세포는 배아, 성체조직, 또는 골수(bone-marrow) 유래인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 바람직하게 사용되는 PGA는 생체내에서 분해되어 생체에 저절로 흡수되는 성질을 가지고 있다. 중간엽 줄기세포가 고정된 생분해성 고분자입자를 생체내에 이식함으로서, 생분해성 고분자가 생체내에서 지지체 역할을 수행하여 연골세포로의 분화를 촉진하게 된다.

본 발명의 초음파 처리는 시중에서 판매되고 있는 초음파 치료기에 의해 수행될 수 있으며, 연골세포로의 분화하고자 하는 배양환경을 제공하여 연골화 분화를 촉진하는 작용을 한다.

본 발명에 의해 중간엽 줄기세포를 관절형태의 삼차원 지지체 상에서 연골세포로 분화시키면 인공연골을 제조할 수 있다.

본 발명의 방법으로 생산된 전분화된 중간엽 줄기세포가 고정된 생분해성 고분자를 이용하여 치료할 수 있는 연골 질환으로는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합, 외상에 의한 관절손상 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 사용하였으나, 배아 유래 줄기세포, 근육, 지방, 신경조직 등 성체조직에서 유래되는 줄기세포 등의 다른 중간엽 줄기세포를 사용할 수 있는 것은 당해분야 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 및 연골세포의 분리 및 배양

중간엽 줄기세포는 2주령의 암컷으로 뉴질랜드산 흰토끼(중앙실험동물센터, 한국)에서 분리하였다. 경골과 대퇴골로부터 분리한 골수천자액을 1,500rpm에서 5분동안 원심분리하여 골수 내 세포를 수득하였다.

상기 골수내 세포를 항생제 및 10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 α-MEM(Minimum essential medium eagle alpha modification; Sigma, USA)에 현탁시키고, 1.5×10⁷ 농도로 조직배양 평판에 분주한 후, 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 1주 동안 배양하여 조직배양 평판에 부착된 세포만 수득하여 중간엽 줄기세포로 사용하였다.

상기 일차 배양된 세포는 0.05% 트립신-EDTA(Gibco-BRL Life Technologies, USA)로 처리한 후, 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 수득한 세포는 상기 배지로 현탁하여, 플레이트당 1.5×10⁶ 세포농도로 평판배양하고 일주일에 세 번씩 배지를 교환하였다.

상기와 동일한 토끼의 무릎관절의 연골을 적출하여 무균적으로 얇게 절단하여 PBS(phosphate-buffered saline)에 현탁시켰다. 절단된 단편들은 0.2% 콜라게네이즈(Worthington Biochemical Co., USA)가 포함된 DMEM(Dulgecco's modified eagle medium,, Gibco BRL Life Technologies, USA)를 사용하여 37℃, 3시간동안 반응시켜 교원질을 분해시켰다. 현탁액을 1700rpm에서 10분간 원심분리하여 분리해 연골세포를 분리하였으며, PBS로 두 번 세척하고, 10% NCS(New-born calf serum, Gibco BRL Life Technologies, USA)을 포함하는 DMEM에서 1.5×10⁵/cm²의 세포농도로 배양하였다.

PGA 스캐폴드 배양에는 두 번째 계대배양한 상기 중간엽 줄기세포와 첫 번째 계대배양한 상기 연골세포를 사용하였다.

실시예 2. PGA/세포 구조물의 제조방법

중간엽 줄기세포는 그 분화를 용이하게 하기 위하여, 하기의 방법으로 PGA(non-woven mesh)를 스캐폴드로 이용한 3차원 배양을 수행하였다.

PGA(mesh)를 생체검사용 펀치를 사용하여 지름 6mm, 두께 2mm의 크기로 동일하게 절단하고, 70% 알콜에 10시간 담궈 멸균한 후, 4℃에 보관하였다. 상기의 과정을 거친 PGA를 항생제를 함유한 PBS로 3번 세척한 다음, DMEM(Dulbecco's modifided eagle medium, Gibco, New York)에 넣고 37℃ 항온기에서 12시간 두었다.

실시예 1에서 계대배양한 중간엽 줄기세포 및 연골세포를 PGA 골격당 각각 5×10⁶ 세포농도로 분주하였다. PGA/세포 구조물은 중간엽 줄기세포 그룹과 연골세포 그룹으로 나누었으며, 상기 중간엽 줄기세포 그룹은 기본배지에서 배양한 대조그 룹, 기본 배지에서 매일 초음파 처리한 초음파 처리그룹, 10ng/ml의 TGF-β1을 포함한 배지에서 배양한 TGF 그룹 및 TGF-β1을 포함한 배지에서 매일 초음파 처리를 함께한 초음파+TGF 그룹의 네 개의 그룹으로 나누었다. 상기 기본배지는 연골화배지(chondrogenic-defined medium)로서, DMEM 배지에 ITS, 50ug/ml ascorbate 2-phosphate, 100nM dexamethasone, 40mg/ml proline, 1.25mg/ml BSA 및 10% NCS을 포함한다. 모든 PGA/세포 구조물은 누드 마우스에 이식되기 전 일주일 동안 배양되었으며, 이틀에 한번씩 새 배지로 갈아주었다.

실시예 3. PGA/세포 구조물에 대한 초음파 자극 및 PGA/세포 구조물의 생체 내 이식

중간엽 줄기세포에 대한 초음파 처리는 Noblelife^TM(듀플로젠, 한국)을 사용하여 0.8MHz의 주파수로 200mW/cm²의 출력강도로 매일 20분간 1주간 처리하였으며, 상기 처리는 12시간 간격으로 7일간 연속하여 실시하였다.

PGA/MSCs 구조물을 주입하기 위하여, 5주령된 수컷 누드마우스를 케타민과 하이드로클로라이드로 마취시킨 후, 등피부의 피하조직을 절개하였다. 개체별 차이를 줄이기 위하여 하나의 마우스에 각 실험그룹의 PGA/세포 구조물(모두 5그룹)을 모두 주입하였고, 48마리의 누드마우스를 사용하였으며, 이식 후 1, 2, 4 및 6주 경과하였을 때 조직학적, 면역조직학적, 생화학적, 물리학적 분석을 하였다.

실시예 4. PGA/세포 구조물의 성상변화 및 총 DNA 함량 측정

실시예 3에서 이식된 검체의 부피와 색깔은 5개 그룹에서 시간에 따라 계속하여 변화하였다 (도 1). 이식 4주째의 검체에서는 초음파 처리 및 초음파+TGF 처리그룹의 색깔과 형태가 연골세포그룹과 유사하였으며, 이식 6주째의 검체 중 대조그룹과 TGF에서 중대한 비정형적 모양 변화가 관찰되었다. 4주째와 6주째에 각각 투명한 연골상 조직 및 골상 조직의 외양이 관찰되었다.

본 실시예 및 이후의 실시예에서 물리적 생물학적 분석에 있어서, 통계학적 차이는 ANOVA(one-way analysis of variance) 및 Student-Newman-Keuls test 및 student t test(two-tail)을 이용하여 두 그룹간의 차이를 확인하였으며, P<0.05일 경우 통계학적 의의를 인정하였다.

검체의 부피는 NIH imageJ 프로그램으로 측정하였으며, 1째주와 2째주에서는 별다른 변화가 관찰되지 않았으며, 4주째와 6주째의 같은 그룹의 중간엽 줄기세포 내에서 중대한 차이를 나타내었다. 초음파 처리그룹 및 초음파+TGF 처리그룹에서 대조그룹과 TGF 처리그룹 보다 적게 줄어드는 것을 관찰할 수 있었으며, 특히 4주째와 6주째에 명확하였다. 반면, 연골세포 그룹에서는 시간이 경과함에 따라 전체 부피가 점차 증가하는 것으로 나타났다 (표 1).

각 시간대별 검체의 부피(mm³)

	1주째	2주째	4주째	6주째
대조그룹	38.41±0.65	36.01±2.02	26.6±2.32	22.71±1.54
초음파	37.37±13.48	36.26±0.95	34.17±2.02	27.03±0.44
TGF-β	37.38±2.27	32.98±1.58	24.16±2.6	21.49±2.24
초음파+TGF-β	39.76±2.45	37.24±1.53	36.26±1.84	28.66±1.34
연골세포	43.08±1.02	43.46±3.64	50.61±1.29	51.83±2.4

실시예 3에 따라 누드마우스에 주입된 검체를 각 시기마다 회수하여 함수중량을 측정하였으며, 생화학적 성질을 측정하기 전에 액체질소를 이용하여 즉시 동결시켰다. 동결된 PGA/세포 구조물은 125g/ml의 파파인을 포함하는 소디움 포스페이트 버퍼용액(5mM EDTA, 5mM L-cysteine-HCl)에서 60℃, 24시간 동안 반응시켜 완전히 분해시켰다.

총 DNA 함량은 Hoechst 33258 염색시약을 이용한 방법으로 측정하였으며, 마우스 흉선 DNA(Takara, Japan)의 표준곡선을 이용하여 0~2㎍/ml의 범위에서 사용하였다. 총 DNA 함량은 1, 2, 4주째의 중간엽 줄기세포 그룹간 및 동일 그룹에서 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 6주째에는 중간엽 줄기세포 그룹에서 총 DNA가 크게 감소하였으나, 4개의 중간엽 줄기세포 그룹 간에는 차이가 보이지 않았다. 반면, 연골세포 그룹에서 측정된 시간대별 총 DNA 양은 차이가 없었으며, 이 양은 1, 2, 4주째의 중간엽 줄기세포 그룹들의 총 DNA량과도 유사하였다 (도 2).

실시예 5. 수분, 콜라겐 및 GAG(Glycosaminoglycan) 함량 측정

실시예 4에 따라 효소분해된 PGA/세포 구조물의 총 콜라겐 함량은 Heide tullberg-reinert 방법으로 측정하였다(Heide, T.R. and Gernot, J., Histochem. Cell Biol., 112:271, 1999). 상기 효소분해된 PGA/MSCs 구조물을 시리우수 래드 다이 용액(Sirius red dye solution)과 같이 96웰 플레이트에서 건조한 후, 염색용액으로 1시간동안 반응시켰다. 염색된 PGA/MSCs 구조물의 흡광도는 550 nm에서 측정하였다. 총 콜라겐 함량은 0~100 ㎍/mL 범위에서 소혈청 알부민의 표준직선으로 나타냈다.

또한, 효소분해된 PGA/세포 구조물의 총 GAG 함량은 DMB(1,9-dimethylmethylene blue) 컬러메트릭 방법으로 측정하였다(Farndale, R.W. et al., Biochim. Biophys. Acta., 883:173, 1986). 상기 효소분해된 PGA/MSCs 구조물을 DMB 용액과 혼합한 다음, 525 nm에서 흡광도값을 측정하였다. 총 GAG 함량은 상어 콘드로이친 설페이트(Shark chondroitin sulfate)의 표준도표를 사용하였다.

각 시간대에서의 1주 및 2주째의 중간엽 줄기세포와 연골세포 그룹 수분 함량은 평균 81~88%(P>0.05)로 큰 차이가 없었으나, 4주째부터는 중간엽 줄기세포의 수분함량이 현저히 줄어들기 시작하였으며, 6주째에는 대조그룹과 TGF 처리그룹에서 각각 48.02±5.15 및 46.50±3.46이었으며, 초음파 처리그룹과 초음파+TGF 처리그룹에서 각각 60.17±2.9 및 64.51±4.3이었다 (도 3). 대조그룹과 TGF 처리그룹의 수분함량은 초음파 처리그룹과 초음파+TGF 처리그룹의 수분함량보다 현저히 감소하였다.

각 검체의 건조중량에 의하면, 총 GAG 함량(mg/mg)은 초음파 처리그룹과 초음파+TGF 처리그룹에서 4주째까지 급격히 증가(p>0.05)하였으며, 대조그룹과 TGF 처리그룹에서 총 GAG는 4주째까지 증가하였으나, 2주와 주째 사이에 큰 차이가 없었다(P<0.05). 그리고 모든 중간엽 줄기세포 그룹에서 총 GAG는 이식 6주째에서 심각하게 감소되었으며, 또한 1주째를 제외하고는 대조군과 TGF 처리군보다 이들 그룹 이외의 그룹의 총 GAG가 월등히 높았다 (도 4).

총 콜라겐 함량(mg/mg)은 1주째 및 2주째에는 모든 중간엽 줄기세포 그룹에서 특별한 차이가 없었으나, 4주째에는 대조그룹과 TGF 처리 그룹이 초음파 처리그룹과 초음파+TGF 처리그룹보다 월등히 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 증가는 6주째 때에 더욱 선명하게 나타났다 (도 5).

연골세포 그룹에서의 총 콜라겐은 시간에 따라서 증가하는 것으로 나타났다. 총 DNA, 수분함량, 총 GAG 및 총 콜라겐 함량은 대조그룹 및 TGF 그룹 간에는 큰 차이가 없었으며, 초음파 처리그룹과 초음파+TGF 처리그룹 간에도 큰 차이를 보이지 않았다.

실시예 6. 조직학적 및 면역조직세포학적 측정

실시예 3에 따라 누드마우스에 주입된 PGA/세포 구조물을 4% 포름알데하이드에서 48시간동안 고정시켰다. 고정된 시료를 탈수시킨 후, 파라핀 왁스에 담갔다. 시료가 포함된 파라핀을 5㎛ 두께로 절단하여 절편을 만들었으며, 그 중 일부 절편은 기질에서 절조직과 같은 세포외 기질(ECM)의 합성을 확인하기 위하여 GAG를 확인할 수 있는 사프라닌-O/패스트 그린(Safranin-O/Fast green)으로 염색하였으며, 일부는 골 형성을 확인하기 위하여 Von Kossa 염색을 수행하였다.

다른 절편들은 연골세포 분화표식 인자인 타입 Ⅱ 콜라겐의 발현을 확인하기 위한 면역조직화학적 분석에 사용하였다. 절편은 PBS로 세척한 다음, 3% 과산화수소로 처리하였다. 그 후, 조직의 투과성을 높이기 위해 0.15% 트리톤 X-100과 반응시켰다.

면역과산화효소 염색은 1% BSA(bovine serum albumin)으로 30분간 반응시켜 비특이적 결합을 블로킹시킨 후, 절편 슬라이드는 마우스 항-인간 타입 Ⅱ 콜라겐 모노 클로날 항체(Chemicon, CA)와 1:500으로 희석시켜서 1시간 배양하였다. 상기 일차 항체로 처리된 절편을 200배 희석된 biotinylated 2차 항체(DAKO LSAB System, CA)와 실온에서 1시간 배양하였다.

상기 이차항체로 처리된 절편은 PBS로 세척한 다음, 스트렙타비딘(Streptavidin) 용액과 접합한 펄옥시다아제(peroxidase)와 실온에서 30분간 반응하였다. 반응한 절단면은 Mayer's hematoxylin(Sigma, USA)으로 대조염색하여, 현미경(Nikon E600, Japan)으로 관찰하였다.

PGA/세포 구조물로부터 연골 ECM(Extra cellular matrix)의 합성이 진행되는 것을 확인하기 위해 사프라닌-O/패스트 그린으로 염색하였다. 시간이 지남에 따라 GAG 분자의 강도와 분포에 있어서 다섯 개 그룹 사이에 차이를 나타내었다 (도 6). 1주째에는 특징적인 붉은색 염색이 모든 중간엽 줄기세포 그룹에서 변연부(peripheral region)에만 나타났으며, 2주째에는 초음파 처리그룹 및 초음파+TGF처리그룹에서는 중앙 부분까지 염색된 것을 관찰할 수 있었으며, 4주째에는 거의 모든 부위가 염색된 것을 확인할 수 있었다. 반대로, 대조그룹과 TGF그룹에서는 2 주까지 변연부(peripheral region)에서만 염색부위를 관찰할 수 있었으며 4주 때는 중앙부위까지 염색된 것을 관찰할 수 있었으나 초음파 처리그룹 및 초음파+TGF 처리그룹이 대조그룹 및 TGF 그룹 보다는 더 넓은 면적에서 더 강하고 넓게 퍼져 있었다. 또한 6 주 째에는 대조그룹 및 TGF 그룹에서는 거의 염색이 되지 않은 반면 초음파 처리그룹 및 초음파+TGF 처리그룹에서는 염색이 된 부분이 많이 남아있는 것을 확인하였다. 연골세포 그룹에서는 2 주 때부터 거의 대부분 면적에서 GAG형성을 볼 수 있었으며 4주와 6주에서 현저한 차이를 보이지 않았다.

상기 사프라닌-O/패스트 그린에서 염색되지 않은 부분이 섬유성 조직인지 아니면 골 조직인지를 확인하기 위하여 Von Kossa 염색을 실행하였다. 그 결과, 대조군 그룹 및 TGF 그룹에서 2 주 때부터 표면의 작은 면적에서 골 형성이 시작되는 것을 관찰할 수 있었고 이러한 표면 골 형성은 초음파 처리그룹 및 초음파+TGF 처리그룹에서는 4주째에 관찰할 수 있었다. 대조그룹 및 TFG 그룹에서는 4주, 초음파 처리그룹 및 초음파+TGF 처리그룹에서는 6 주 때 골 형성이 많은 면적에서 관찰되었다. 반면에 연골세포 그룹에서는 모든 기간동안 골 형성을 관찰 할 수 없었다 (도 7).

도 8에 나타낸 바와 같이, 타입 II 콜라겐의 면역화학적 분석방법에 의해서 4 그룹의 중간엽 줄기세포 그룹에서는 4주째까지 콜라겐이 발현이 점차적으로 증가 하는 것을 확인할 수 있었다. 1주 및 2주째의 4개의 중간엽 줄기세포 그룹에서 타입 II 콜라겐은 표면 부분에서만 염색되었으나, 4주째에는 중앙부분으로 염색부위가 확장되었다. 대조군 그룹과 TGF 그룹보다 초음파 처리그룹과 초음파+TGF 처리그룹이 더 넓은 면적에서 더욱 높은 강도로 염색되었다. 또한, 타입 II 콜라겐의 분포는 GAG가 많이 형성된 부분에서 많이 발현되었다. 6 주 째의 세포들은 큰 lacunae를 보여주는 거대한 연골세포 형태를 나타냈으며 타입 II 콜라겐이 거의 발현이 되지 않았으나 연골세포 그룹에서는 6주째 까지 타입 II 콜라겐이 강하게 발현되었다.

상기 결과들에 의해서 체내에서 지속적으로 초음파를 주지 않고서, 체외에서 1주일간 초음파 처리하여 전분화시킨 세포를 생체 내에 이식하여도 충분하게 연골분화를 일으키는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 초음파 처리에 의해 전분화된 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 생체 내에 주입하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법을 제공하는 효과가 있으며, 초음파 처리에 의해 전분화된 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 함유하는 연골질환 치료용 조성물을 제공하는 효과가 있다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법:

(a) 중간엽 줄기세포를 단층 배양한 다음, 상기 단층배양된 중간엽 줄기세포를 원심분리하여 세포를 수득하는 단계;

(b) 상기 중간엽 줄기세포를 포어를 가지는 생분해성 합성 고분자 지지체에 고정하여 삼차원 지지체를 제조하는 단계;

(c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 초음파로 처리하여 중간엽 줄기세포를 전분화시키는 단계; 및

(d) 상기 전분화된 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 인간을 제외한 동물에 주입하여 연골화시키는 단계.
제1항에 있어서, 상기 초음파는 주파수(frequency) 10kHz~100MHz, 출력강도 10~5000mW/cm²인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 초음파 처리는 6~24시간 간격으로 1~30분간, 3~12일 동안 연속하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 전분화 시키는 단계는 TGF-β로 더 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 배아, 성체조직, 또는 골수(bone-marrow) 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 중간엽 줄기세포를 단층 배양한 다음, 상기 단층배양된 중간엽 줄기세포를 원심분리하여 세포를 수득하는 단계; (b) 상기 중간엽 줄기세포를 포어를 가지는 생분해성 합성 고분자 입자를 함유하는 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 초음파로 처리하여 중간엽 줄기세포를 전분화시키는 단계를 거쳐 제조된, 전분화된 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 함유하는 연골질환 치료용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 초음파는 주파수(frequency) 10kHz~100MHz, 출력강도 10~5000mW/cm²인 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서, 상기 초음파 처리는 6~24시간 간격으로 1~30분간, 3~12일 동안 연속하여 실시하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서, 상기 전분화 시키는 단계는 TGF-β로 더 처리하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서, 상기 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상인 것을 특징으로 하는 조성물.