ES2351875T3

ES2351875T3 - Utilización de inhibidores de las lisil oxidasas para el cultivo celular y la ingeniería tisular.

Info

Publication number: ES2351875T3
Application number: ES02772482T
Authority: ES
Inventors: Michel-Henri Fessy; Odile Damour Nee Baudoux; Pascal Sommer; Jean Farjanel; Fabienne Braye
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Priority date: 2001-08-03
Filing date: 2002-08-02
Publication date: 2011-02-11
Anticipated expiration: 2022-08-02
Also published as: FR2828206B1; JP4733346B2; EP1412484B1; EP1412484A1; ATE485366T1; FR2828206A1; CA2456271A1; US20040248871A1; CA2456271C; DE60238058D1; WO2003014333A1; JP2004537998A

Abstract

Utilización de inhibidores directos de lisil-oxidasas (LO) seleccionados entre: las aminas primarias que reaccionan con el grupo carbonilo del sitio activo de las LO, y más particularmente las que proporcionan, después de una unión al carbonilo, un producto estabilizado por resonancia, tales como las aminas primarias siguientes: - la etilendiamina, - los aminonitrilos, tales como el β-aminopropionitrilo (βAPN) o la 2-nitroetilamina, - las haloaminas insaturadas o saturadas, tales como la 2-bromoetilamina, la 2-cloroetilamina, la 2-trifluoroetilamina, la 3-bromopropilamina, las p-halobencilaminas, y los compuestos halogenados insaturados, - la selenohomocisteína lactona. como inhibidores de la desdiferenciación de las células en cultivo in vitro, con vistas al mantenimiento constante del fenotipo de dichas células en el marco de la realización de un procedimiento de cultivo in vitro de estas últimas, y durante la totalidad del tiempo de cultivo, para la preparación de células diferenciadas cuyo fenotipo es idéntico, o para la preparación de una matriz celular constituida por células diferenciadas que conservan el mismo fenotipo y cultivadas en presencia de dichos inhibidores, y del medio extracelular segregado por dichas células y que une estas últimas en la matriz.

Description

Utilización de inhibidores de las lisil oxidasas para el celular y la ingeniería tisular.

La presente invención tiene por objeto la utilización de inhibidores de las lisil-oxidasas en el marco de la realización de procedimientos de cultivo in vitro de células susceptibles de ser utilizadas en terapia tisular, o celular, o en farmacología experimental.

Las lisil-oxidasas son unas amina-oxidasas que inducen la reticulación de los colágenos y de la elastina catalizando la desaminación oxidativa de residuos lisilos e hidroxilisilos en \alpha-aminoadipic-S-semialdehídos correspondientes (para revisión, Smith-Mango & Kagan, Matrix Biology 1998, 16: 387): RCH_{2}NH_{2} + O_{2} + H_{2}O \rightarrow RCHO + NH_{3} + H_{2}O_{2}. Los residuos aldehídos formados sufrirán una serie de condensaciones espontáneas con otras funciones aldehídos o aminas no modificadas próximas, conduciendo a unas uniones intra e inter-moleculares. Estas condensaciones son el origen de los puentes intra e intermoleculares de los colágenos y de la elastina. Entre los inhibidores directos de la actividad LO, que actúan en el sitio activo de la enzima, el \betaAPN es el utilizado más corrientemente (para revisión, H.M. Kagan Acta Tropica 77 (2000) 147-152).

La reticulación dependiente de las LO de los colágenos y de elastina es un parámetro esencial de la formación de los tejidos y de los implantes neosintetizados in vitro: la ausencia de reticulación no permite la constitución de tejidos resistentes, demasiada reticulación (o una reticulación química inapropiada) provoca una rigidez demasiado grande y una retracción de los tejidos.

La presente invención resulta de la demostración por los inventores del hecho de que la adición de un inhibidor específico de las LO a unos condrocitos, células específicas del cartílago, permite anular la desdiferenciación de estas células. En efecto, el problema principal de la formación de implantes de cartílago por los condrocitos es que éstos se desdiferencian, y pierden su potencial para fabricar colágeno de cartílago (colágenos de tipo cartílago: II, IX, XI y X). Sin este inhibidor, los condrocitos desdiferenciados sintetizan unos tipos de colágenos anormales en el cartílago sano (I, III). La adición temporal del inhibidor de LO tiene por lo tanto un efecto importante y reversible en la formación del cartílago, cuyas propiedades físicas específicas están relacionadas con la presencia de los colágenos que lo
constituyen.

Se sabe que el cultivo en gel de alginato permite evitar la desdiferenciación de los condrocitos y que la adición de \beta-aminopropionitrilo (\betaAPN) aumenta la síntesis global del colágeno y reduce su reticulación. (B. Beekman et al., Experimental Cell Research 1997, 237(1): 135-141). No se ha demostrado ningún efecto directo del \betaAPN sobre la diferenciación de las células y la ausencia de estudio detallado de los sub-tipos de colágeno no permite excluir la presencia minoritaria de colágeno I. Otros estudios han mostrado que la aplicación de \betaAPN sobre un explante de cartílago ya formado reducía su reticulación y concluyen en el interés de no utilizar ningún \betaAPN sobre un explante de cartílago para la reparación tisular. (Ahsan T et al., Journal of Orthopedic Research 1999, 17(6): 850-857).

Además, los inventores han demostrado asimismo que la adición del mismo inhibidor de las LO durante la constitución de un modelo de piel reconstruida se traduce asimismo por un efecto sobre el fenotipo de las células. Los componentes celulares del modelo ensayado de piel reconstruida son unos fibroblastos y unos queratinocitos. Los fibroblastos sintetizan en particular los colágenos fibrilares (tipo I y III) y la elastina de la dermis, mientras que los queratinocitos se diferencian porque forman todas las capas de la epidermis hasta la capa córnea que asegura la función de barrera. En presencia del inhibidor de LO, se modifican las propiedades de la piel reconstruida. Se observa que la ausencia de reticulación de los colágenos permite una mejor colonización del soporte esponja por los fibroblastos y un aumento de la formación de la matriz extracelular, así como una disminución in vitro de la retracción de la piel reconstruida. Por otra parte, se observa una mejor organización de la epidermis, con una capa granulosa muy bien formada. La adición temporal de inhibidor de las LO tiene por lo tanto un efecto positivo en la gestión de la formación y de la organización de la piel reconstruida facilitando la preparación en gran cantidad de este material.

A partir de biopsias de cartílago, y en presencia de inhibidores de LO, los inventores han demostrado que resulta posible multiplicar unos condrocitos sobre un soporte plástico en 2 dimensiones en presencia de suero del donante según las condiciones clásicas, obteniendo al mismo tiempo la producción de una matriz extracelular libre de cualquier colágeno anormal, incluso después de 2 semanas de cultivo, y a pesar de una solubilización aumentada de los colágenos sintetizados en el medio de cultivo (figura 1, 2). Dicha matriz ve disminuir su fluidez a lo largo del tiempo de cultivo: se selecciona el tiempo de cultivo óptimo en función de la cantidad de matriz producida y de fluidez buscada. Resulta inútil entonces recurrir al uso de soportes exógenos de los que, ulteriormente, el rechazo o la resorción defectuosa eventuales anularían las propiedades favorables ya obtenidas.

En ausencia del inhibidor tipo de la actividad LO, el \betaAPN, la matriz extracelular está muy empobrecida en colágenos de tipo cartílago, y mayoritariamente constituida por colágenos de tipo I así como, para una pequeña parte, por colágeno de tipo III, es decir, por colágenos que no participan en la elaboración del cartílago. Además, la matriz presenta una ausencia de fluidez incompatible con el recurso eventual a unas inyecciones mediante jeringuilla.

La expresión de varias isoformas de lisil oxidasa (LOX y LOL1 por lo menos) por los condrocitos es manifiesta, pero no se modifica por el tratamiento mediante \betaAPN (figura 3) que inhibe sólo la actividad de la enzima (tabla I).

La adición de \betaAPN, utilizado a diferentes concentraciones (entre 50 y 200 \mug/ml), permite la formación de pieles reconstruidas humanas cuya retracción puede ser disminuida in vitro. Además, el \betaAPN a 50 \mug/ml mejora la colonización de la esponja por los fibroblastos y la extensión de la síntesis de la matriz extracelular. Mejora asimismo la organización de la epidermis, con una capa granulosa muy bien formada que genera una capa córnea muy estructurada. Este efecto sobre la diferenciación de la epidermis y la disminución de la retracción reducen la formación de hojas que se sueltan y pueden facilitar la preparación de piel reconstruida (figura 4).

La utilización de inhibidores de la actividad LO se puede aplicar a cualquier cultivo de células con el fin de obtener cualquier implante tisular, puesto que los colágenos y las LO son unos constituyentes y unos participantes ubiquitarios de todos los tejidos animales. Sin embargo, las condiciones de los cultivos pueden variar en función de los tipos celulares usados y de los sustratos diana.

La invención tiene por objeto la utilización de inhibidores directos o indirectos de las lisil-oxidasas (LO), como inhibidores de la desdiferenciación de las células en cultivo in vitro, con vistas al mantenimiento casi constante del fenotipo de dichas células en el marco de la realización de procedimientos de cultivo in vitro de estas últimas, y durante casi la totalidad del tiempo de cultivo.

Con este fin, la invención tiene muy particularmente por objeto la utilización de inhibidores mencionados anteriormente para la preparación de células diferenciadas cuyo fenotipo está preservado.

La invención se refiere más particularmente todavía a la utilización de inhibidores mencionados anteriormente para la preparación de una matriz celular, constituida por células diferenciadas cultivadas en presencia de dichos inhibidores, y del medio extracelular condicionado por dichas células y en contacto con dicha matriz, siendo dicha matriz celular susceptible de poder ser utilizada como tejidos o implantes tisulares.

La invención tiene asimismo por objeto la utilización mencionada anteriormente, de inhibidores de las LO seleccionadas de entre:

: las aminas primarias que reaccionan con el grupo carbonilo del sitio activo de las LO, y más particularmente las que proporcionan, después de una unión al carbonilo, un producto estabilizado mediante resonancia, tales como las aminas primarias siguientes:

-: la etilendiamina,

-: los aminonitrilos, tales como el \beta-aminopropionitrilo (\beta-APN), o la 2-nitroetilamina,

-: las haloaminas insaturadas o saturadas, tales como la 2-bromoetilamina, la 2-cloroetilamina, la 2-trifluoroetilamina, la 3-bromopropilamina, las p-halobencilaminas,

-: la selenohomocisteína lactona.

La invención tiene más particularmente por objeto la utilización del \beta-APN con los fines mencionados anteriormente.

La invención se refiere asimismo a la utilización de inhibidores de LO tales como se han definido anteriormente, para la realización de procedimientos de cultivo in vitro de cualquier célula de origen humano o animal, siendo dichas células mantenidas a un fenotipo de diferenciación constante, y seleccionadas en particular de entre los condrocitos de los cartílagos, las células de la córnea, las células de la piel (tales como los fibroblastos de la dermis, y los queratinocitos de la epidermis), las células endoteliales de los vasos, los osteoblastos de los huesos, los hepatocitos, las células renales, las células musculares, y las células cepas o pluripotentes.

La invención tiene asimismo por objeto la utilización de inhibidores de LO tales como se han definido anteriormente, para la realización de procedimientos de cultivo in vitro de células, con vistas a obtener unas células susceptibles de ser utilizadas en terapia celular, o en farmacología experimental, en particular en el marco del cribado de medicamentos.

La invención se refiere asimismo a la utilización de inhibidores de LO tales como se han definido anteriormente, para la realización de procedimientos de cultivo in vitro de células con vistas a obtener unos tejidos, tales como piel o cartílago, siendo dichos tejidos susceptibles de ser utilizados como injertos o implantes en terapia tisular, o en farmacología experimental, en particular en el marco del cribado de medicamentos.

La invención tiene asimismo por objeto cualquier medio de cultivo celular caracterizado porque contiene uno o varios inhibidores de LO tales como se han definido anteriormente.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento de cultivo in vitro de células tales como se han definido anteriormente, durante el cual el fenotipo de dichas células se mantiene en un estado idéntico a aquél en el que se encontraban inicialmente dichas células durante su cultivo, comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de dichas células en un medio apropiado que contiene uno o varios inhibidores de LO tales como se han definido anteriormente.

La invención tiene más particularmente por objeto un procedimiento de mantenimiento constante del fenotipo de células diferenciadas en cultivo en un estado próximo o idéntico al que se encontraban dichas células durante su cultivo, caracterizado porque comprende el cultivo de dichas células en un medio apropiado que contiene uno o varios inhibidores de LO tales como se han definido anteriormente.

La invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de preparación de células diferenciadas al fenotipo idéntico, o de implantes celulares constituidos por dichas células, caracterizado porque comprende:

-: realizar un procedimiento de cultivo in vitro de células tal como se ha definido anteriormente,

-: llegado el caso, una o varias etapas de lavado de las células en cultivo con la ayuda de una disolución tampón apropiada, con el fin de eliminar la totalidad o parte del o de los inhibidores de LO utilizados,

-: llegado el caso, una etapa de digestión enzimática de la materia extracelular susceptible de formarse, con la ayuda de enzimas apropiadas,

-: llegado el caso, una etapa de recuperación de las células cultivadas.

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La invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación in vitro de una matriz celular tal como se ha definido anteriormente, susceptible de poder ser utilizada como tejidos o implantes tisulares, constituidos por células diferenciadas, caracterizado porque comprende:

-: realizar un procedimiento de cultivo in vitro de células tal como se ha definido anteriormente, hasta la formación de una matriz celular tal como se ha definido anteriormente, suficiente para constituir una trama tisular,

-: llegado el caso, una o varias etapas de lavado de la matriz celular en cultivo con la ayuda de una disolución tampón apropiada, con el fin de eliminar la totalidad o parte del o de los inhibidores de LO utilizados,

-: llegado el caso, una etapa de recuperación de la matriz celular tal como se ha definido anteriormente.

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La invención tiene más particularmente por objeto un procedimiento de preparación in vitro de tejidos o de implantes tisulares tal como se ha definido anteriormente, aplicado a la neosíntesis de implantes de cartílago cuando dicho procedimiento se efectúa a partir de condrocitos, o a la preparación de sustitutos cutáneos cuando dicho procedimiento se efectúa a partir de fibroblastos y/o de queratinocitos.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento de cribado de moléculas de interés farmacológico, en particular de medicamentos, caracterizado porque comprende:

-: realizar un procedimiento de cultivo in vitro de células tal como se ha definido anteriormente, llegado el caso hasta la formación de una matriz celular suficiente para constituir una trama tisular,

-: una etapa de puesta en presencia de la molécula ensayada con las células o tejidos obtenidos durante las etapas anteriores,

-: detectar el eventual efecto de dicha molécula sobre las células o los tejidos mencionados anteriormente.

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La invención tiene asimismo por objeto las células diferenciadas al fenotipo mantenido, o implantes celulares constituidos por dichas células, tales como se han definido anteriormente, caracterizadas porque contienen unos inhibidores de LO tales como se han definido anteriormente, llegado el caso en el estado de trazas.

La invención se refiere asimismo a las matrices celulares o a los tejidos o a los implantes tisulares a base de células tales como se han definido anteriormente, caracterizados porque contienen unos inhibidores de LO tales como se han definido anteriormente, llegado el caso en el estado de trazas.

La invención tiene más particularmente por objeto las células o los implantes celulares, o las matrices celulares o los tejidos o implantes tisulares mencionados anteriormente, tales como los obtenidos mediante la realización de un procedimiento tal como se ha definido anteriormente.

La invención se refiere asimismo a los implantes de cartílago que comprenden una matriz extracelular esencialmente libre de colágenos normalmente ausentes del cartílago sano (a saber, los colágenos I y III), y que comprende la totalidad de los colágenos específicos del cartílago (a saber, los colágenos II, IX, XI, y llegado el caso X).

La invención tiene más particularmente por objeto los implantes de cartílago mencionados anteriormente, caracterizados porque contienen unos inhibidores de LO tales como se han definido anteriormente, llegado el caso en el estado de trazas.

La invención tiene aún más particularmente por objeto los implantes de cartílago mencionados anteriormente, tales como los obtenidos mediante la realización de un procedimiento tal como se ha definido anteriormente.

La invención se refiere asimismo a los implantes de condrocitos, cuyo fenotipo inicial, de tipo cartílago, ha sido mantenido durante la fase preliminar de multiplicación celular in vitro.

La invención tiene asimismo por objeto los implantes tisulares mencionados anteriormente que corresponden a unos implantes de piel reconstituida, o sustitutos cutáneos, tales como los obtenidos mediante la realización de un procedimiento según la reivindicación 11 efectuado a partir de fibroblastos y/o de queratinocitos.

La invención se pondrá más claramente de manifiesto a partir de la descripción siguiente de las utilizaciones posibles de los inhibidores de LO.

La fabricación de implantes tisulares en ingeniería tisular debe superar en general un obstáculo principal: evitar producir un tejido anormal que presente unas propiedades físico-químicas incompatibles con el uso previsto. El cultivo de las células in vitro con vistas a su multiplicación y a su producción de una matriz extracelular se acompaña desafortunadamente de una alteración de su fenotipo bioquímico que es más o menos profundo según el tipo de cultivo de células.

El cultivo de condrocitos ha estado hasta ahora, desde este punto de vista, acompañado siempre de esta alteración fenotípica. Las soluciones propuestas hasta ahora para los cultivos de condrocitos han consistido en añadir (o suprimir a veces) unos factores solubles al cultivo (hormonas, vitaminas, factores celulares esencialmente), ya sea ésta efectuada sobre soporte plástico plano o en un soporte en tres dimensiones de diversas naturalezas (esponjas de colágenos más o menos reticuladas asociadas a diversos constituyentes, cerámicas, etc.).

La producción de piel reconstruida está basada en la interacción de fibroblastos y de queratinocitos dispuestos en unas condiciones particulares. Las intervenciones que permiten mejorar esta producción son limitadas y están mal definidas, frecuentemente sobre una base empírica. Varios nutrientes resultan así indispensables y han sido añadidos a las condiciones de cultivo. El tratamiento con \betaAPN presenta la singularidad de dirigirse a los dos tipos celulares.

El método de la presente invención se aplica a cualquier tipo de cultivo en ingeniería tisular. Consiste en actuar sobre el estado físico de la matriz extracelular sintetizada por las células en cultivo con el fin de modular las señales que ésta envía a las células, a través de diversos receptores celulares, y regular así el estado de diferenciación de las células aisladas a partir de biopsias.

La inhibición de la LO (en particular por el \betaAPN) ha sido hasta ahora utilizada en el marco de procedimientos de producción de colágenos, para inhibir la reticulación de los colágenos por las células y mejorar así las condiciones de su solubilización. Dicho inhibidor es, por esta razón, reconocido clásicamente por alterar la matriz extracelular y ha sido hasta ahora utilizado sólo en tres circunstancias:

-: la producción de colágenos no reticulados fácilmente extraíbles,

-: el estudio fundamental del mecanismo de acción de la LO,

-: contribuir a inhibir los puentes excesivos de los colágenos en ciertas patologías fibrosantes.

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Aparte de estos tres campos, la inhibición de la actividad LO ha aparecido hasta ahora como una molestia, no como una ventaja.

Las principales ventajas de la presente invención son las siguientes.

El \betaAPN, el inhibidor tipo de la actividad LO, es un amino-nitrilo. Este compuesto, muy económico, no ha sido hasta ahora utilizado para mantener el fenotipo de las células en cultivo. No tóxico a las dosis usadas para las células en cultivo, su acción puede sin embargo alcanzar otras células en el seno de un organismo: por ello, no se puede utilizar sin riesgo con fines terapéuticos, obligatoriamente determinados. Su eliminación de los cultivos antes de su utilización como implante es fácil mediante lavados sucesivos para agotar el cultivo en \betaAPN. Los demás inhibidores específicos de la actividad LO podrían ser comparados útilmente en cuanto a su nivel de tolerancia in vivo en dicho modelo.

La eficacia del \betaAPN a la concentración habitual de 50 \mug/ml ha sido total después de 2 semanas de cultivo en el que, en su ausencia, la desdiferenciación de los condrocitos se había vuelto máxima. Esta concentración se puede utilizar para el tratamiento de las pieles reconstruidas.

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La parada del tratamiento mediante el \betaAPN permite entonces restaurar la actividad de las LO que son segregadas en continuo (incluso más expresadas en presencia de \betaAPN) por las células y presentan una duración de actividad limitada en el tiempo. Aunque la inhibición de las LO por el \betaAPN sea irreversible, la eliminación del \betaAPN, mediante lavados y parada del tratamiento, permite restaurar in vitro en el momento elegido la actividad de esta enzima. La reticulación deseada de las fibrillas de colágenos y de elastina, sustratos de las LO, puede así ser programada.

El método de la presente invención se aplica a cualquier tipo de cultivo en ingeniería tisular, es decir:

-: cualquier tipo de soporte: desde el más simple tal como el soporte plástico de las cajas de cultivo, hasta el más sofisticado tal como ciertos modelos de cultivo en tres dimensiones,

-: cualquier tipo de células con vistas a implantes tisulares diversos (cartílago, hueso, córnea, vasos sanguíneos, etc.). El tratamiento descrito se puede utilizar para dos tipos de implantaciones:

a): suspensión de condrocitos multiplicados in vitro. Además, el tratamiento previo del cultivo por el \betaAPN mejora el rendimiento de aislamiento de las células viables por tripsinación.

b): Matriz cartilaginosa rica en condrocitos y de viscosidad definida.

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En el caso de cartílagos articulares lesionados o necrosados localmente (cadera en particular), puede ser deseable recurrir a unas inyecciones de una matriz rica en condrocitos no desdiferenciados. La fluidez del tapiz celular depende de la duración del cultivo y puede por lo tanto ser fácilmente elegida por el cirujano en función de las necesidades. Esta ventaja se puede generalizar evidentemente a cualquier otra situación encontrada en ingeniería tisular.

Los tapices celulares así obtenidos después de un tiempo dado de contacto con un inhibidor de LO pueden servir asimismo de soporte de estudio en farmaco-toxicología.

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1. Descripción detallada 1.1.) Material y métodos Modelo de cultivo de condrocitos

a): El modelo experimental de cultivo de condrocitos es el del cultivo sobre plástico en dos dimensiones de condrocitos embrionarios de pollo. El estado embrionario de las células permite un alto nivel de síntesis de los colágenos, al contrario de los condrocitos adultos. El esternón de pollo del que proceden los condrocitos permite obtener dos sub-poblaciones puras de condrocitos capaces o no de hipertrofiarse ulteriormente (respectivamente, los condrocitos de la parte craneal o caudal del esternón). Las biopsias de cartílago bovino o humano no permiten esta distinción. Los resultados descritos distinguen siempre la sub-población de los condrocitos estudiados.

Los cultivos con antibióticos L-glutamina 4 mM y 25 \mug/ml de ascorbato (factor necesario para la estabilidad de las unidades en triple hélice de colágenos segregados) continúan durante 2 semanas en presencia o en ausencia de 10% de suero, sustituido eventualmente por la insulina 100 ng/ml, y de 50 \mug/ml de \betaAPN. La ausencia de suero necesita la adición de agentes protectores (1 mM de cisteína y 1 mM de piruvato). Un día antes de las extracciones, se añaden 10 \muCi de 14C Prolina a los cultivos cuyos tapices o medios serán pepsinados a continuación (0,2 mg de pepsina/ml/pH 4/24 horas) y sometidos al análisis electroforético (SDS PAGE en gradiente de 4,5 a 15% de acrilamida) y después fluorográfico. Los fluorogramas revelarán entonces las únicas bandas proteínicas pepsino-resistentes, esencialmente los colágenos y unas lipocalinas (proteínas de transporte lipídico). La posición conocida de estas bandas permite señalar la desdiferenciación de las células por la aparición de la cadena \alpha2I del colágeno I asociada al descenso de síntesis de los colágenos de tipo cartílago.

La actividad lisil-oxidasa ha sido dosificada a 300.000 dpm de elastina marcada sobre la lisina, sustrato de la enzima (Shackelton y Hulmes, Anal. Biochem. (1990) 185: 359-362). La determinación de la presencia de lisil-oxidasas en los cultivos de condrocitos se lleva a cabo según los métodos habituales de inmunodecoración de los soportes en lo que han sido transferidas las bandas separadas de las proteínas extraídas a partir de los medios de cultivo o de los tapices celulares correspondientes.

b): Los cultivos de condrocitos humanos normales proceden de cartílagos extraídos durante intervenciones de prótesis de cadera o de ligamentoplastia, y después son sometidos a una digestión enzimática. Estas biopsias de cartílago son consideradas como res nullus.

Los condrocitos extraídos del burlete cotiloidiano han sido utilizados para el cultivo en dos dimensiones sobre plástico en presencia de \betaAPN: se han comparado los cultivos obtenidos después de la digestión enzimática de los cartílagos en presencia o en ausencia de hialuronidasa (figuras 4 y 5).

Los condrocitos obtenidos después de la ligamentoplastia han sido utilizados para el cultivo en tres dimensiones en esponja de colágeno-GAG-quitosano (Collombel et al. 1987)* en presencia o en ausencia de \betaAPN (figuras 7 y 8).

*Collombel C., Damour O., Gagneu C., Poinsignon F., Echinard C., Marichy J.: Peau artificielle et son procédé de fabrication. Patente de invención francesa nº 87-08752 (15 de junio de 1987), patente de invención europea nº 88-420194.8 (14 de junio de 1988).

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Modelo de cultivo de piel reconstruida

El procedimiento que permite la formación de la piel reconstruida es el descrito en la patente francesa 87 08252 del 15 de junio de 1987.

El soporte del modelo de piel reconstruida está constituido por un sustrato dérmico (SD) a base de colágeno-glicosaminoglicano reticulado por quitosano según la técnica publicada por Duplan-Perrat et al. (J Invest Dermatol 2000 114:365). Unos fibroblastos son inoculados en el interior del SD para obtener una dermis equivalente. La piel reconstruida (PR) se obtiene mediante la inoculación de los queratinocitos después de 15 días (D15) de cultivo en dermis equivalente. Los fibroblastos dérmicos se obtienen a partir de explantes de prepucios humanos después de la separación dermo-epidérmica y se cultivan en monocapa en medio DMEM (Sigma) suplementado con 10% de suero de ternera fetal, de L-glutamina 4 mM, de EGF (Austral Biologic) a 10 ng/ml, de penicilina a 100 Ul/ml, de gentamicina a 100 \mug/ml y de amfotericina B a 1 \mug/ml. Los queratinocitos proceden de una extracción de biopsia de piel humana después de la separación dermo-epidérmica por tripsinación. Las células se inoculan sobre unas capas nutricias (fibroblastos irradiados) y cultivadas en DMEM y HAM F12 al 30% suplementado con suero de ternera fetal al 10%, de EGF a 10 ng/ml, de hidrocortisona a 1,6 ng/ml, de umulina a 0,12 Ul/ml, de coleratoxina a 0,1 nM, de triiodotironina a 0,2 \muM, de adenina a 24 \mug/ml, de L-glutamina a 4 mM, de penicilina a 100 Ul/ml, de gentamicina a 100 \mug/ml y de amfotericina B a 1 \mug/ml.

Una mezcla a base de colágeno bovino de tipo I y III (72%), de glicosaminoglicano (8%) reticulado por quitosano (20%) se vierte en unas placas de 6 pocillos. Los sustratos dérmicos así obtenidos se congelan después a -80ºC y se liofilizan. Los fibroblastos se inoculan en el sustrato dérmico rehidratado y esterilizado a razón de 250.000 células por cm^{2}. Unos queratinocitos se inoculan después de 15 días (D15) con una densidad de 200.000 a 250.000 células/cm^{2}. Las pieles reconstruidas se cultivan durante 8 días de manera sumergida, en el medio descrito anteriormente suplementado con 50 \mug/ml de vitamina C. Las pieles reconstruidas son elevadas a continuación a la interfaz aire-líquido utilizando un medio de cultivo simplificado a base de DMEM, suplementado con suero de ternera fetal, de EGF, de hidrocortisona, de umulina, de L-glutamina, de penicilina, de gentamicina, y de amfotericina B, y de ácido ascórbico, a las concentraciones descritas anteriormente. Las pieles reconstruidas se cultivan hasta el día 60. Se realizan unas extracciones el D30 y el D60 para los diferentes análisis.

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Utilización del inhibidor de lisil-oxidasas

El \betaAPN (50 \mug/ml) se añade a partir de la inoculación al medio de cultivo renovado cada 2 días y suministrado a los cultivos de condrocitos así como a los de fibroblastos y después de queratinocitos durante la formación de la piel reconstruida. La concentración de 50 \mug/ml no es tóxica para las células y no afecta sustancialmente a la multiplicación celular. Unas concentraciones más elevadas de 200 \mug/ml parecen tener poco efecto sobre la viabilidad y la multiplicación de los fibroblastos y de los queratinocitos en cultivos aislados.

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1.2.) Resultados

Unos anticuerpos específicos de diversas enzimas de la familia lisil-oxidasa han permitido identificar por primera vez estas diferentes isoformas en los condrocitos, tanto mediante inmuno-decoración después de la separación electroforética como mediante inmuno-marcaje de tapices celulares observado con el microscopio de fluorescencia. Una actividad lisil-oxidasa específica ha sido, asimismo por primera vez, demostrada en los medios de cultivo de los condrocitos (tabla I).

Los anticuerpos anti-LO han permitido asimismo detectar estas isoformas en la piel reconstruida. Unos resultados han demostrado una fuerte expresión de las LOX (figura 4), LOXL1 y LOXL2 a nivel de la dermis, de la epidermis y de la unión dermo-epidérmica. La observación de una expresión de estas isoformas de LO en unos queratinocitos es muy original a este nivel, en el que no existe síntesis ni de colágeno ni de elastina.

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Regulación del fenotipo "cartílago" de los condrocitos

En presencia de suero, con el que los índices de multiplicación y de síntesis proteicas son óptimos, los condrocitos estudiados se desdiferencian claramente después de la primera semana de cultivo, de acuerdo con los datos de la bibliografía. La adición de \betaAPN durante todo el cultivo suprime cualquier desdiferenciación, tal como lo atestigua la ausencia de la cadena colagénica \alpha2I en los fluorogramas. Asimismo, el \betaAPN suprime asimismo las alteraciones morfológicas observadas por otra parte a partir de los primeros días en los cultivos no tratados en los que son bien visibles unas células de forma fibroblástica.

En ausencia de suero, los condrocitos se adhieren bien sobre el soporte plástico pero se extienden muy difícilmente, incluso nada para los condrocitos caudales. La presencia de un anabolizante de los condrocitos, como la insulina, aumenta un poco los índices de síntesis, no inducen ninguna desdiferenciación bioquímica con o sin \betaAPN, pero dejan aparecer una alteración morfológica en ausencia de \betaAPN (figura 1).

La presencia de suero en el medio de cultivo es sin embargo deseable para obtener un índice elevado de multiplicación y de síntesis, permitiendo el \betaAPN suprimir la alteración del fenotipo bioquímico y morfológico.

Los cultivos de condrocitos así tratados pero estudiados entre el 2º y el 3º día han mostrado la presencia de colágenos normales tanto en el tapiz celular como en el medio de cultivo. Sin embargo, el \betaAPN ha permitido la aparición normal de colágeno X por los condrocitos hipertróficos: el descenso de esta síntesis, en ausencia de \betaAPN, se conoce porque precede a la síntesis de colágeno I, marcador de desdiferenciación (figura 2). Estos colágenos, de cualquier tipo de cartílago, parecerían por lo tanto adquirir bien, bajo el efecto de puentes dependientes de LO, una estructura que contribuiría progresivamente al envío de señales a los condrocitos, origen de la alteración del fenotipo bioquímico en cultivo in vitro.

Quedaba por demostrar el origen de esta inhibición de desdiferenciación por el \betaAPN. Los cultivos en presencia de \betaAPN no modifican para nada la síntesis y la secreción de estas LO (figura 3). El \betaAPN actúa por lo tanto bien sólo en la actividad amina-oxidasa de la enzima, y no sobre su secreción.

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Aplicación del modelo a las células de cartílago humano

El modo de extracción de las células mediante digestión enzimática del cartílago permite demostrar unas sub-poblaciones diferentes de condrocitos en el seno de una misma biopsia de cartílago. Es el caso de los condrocitos superficiales y profundos del cotilo del cartílago femoral después de la adición de hialuronidasa en el medio de extracción. En la inoculación, estas dos poblaciones de células producen bien colágeno II, pero no colágeno I. Solos, los condrocitos profundos serán después capaces en presencia de \betaAPN de conservar su morfología y su fenotipo durante las dos semanas siguientes en las que se multiplican produciendo una matriz extracelular de tipo cartilaginoso, desprovista de colágeno I.

Por lo tanto, resulta necesario utilizar con fines de ingeniería tisular unas zonas de cartílago cuyas poblaciones de condrocitos sensibles al \betaAPN han sido correctamente aisladas.

Sin embargo, unos condrocitos humanos desdiferenciados al final del tiempo de cultivo necesario para su multiplicación en cultivo sobre plástico, pueden ser, ventajosamente, cultivados en tres dimensiones 3D en presencia de \betaAPN. El cultivo en 3D puede no bastar, por sí solo, para asegurar un retorno al fenotipo cartílago perdido durante el cultivo en 2 dimensiones en presencia de suero, tal como se ha descrito para unos cultivos 3D en agarosa. Efectivamente, la inmunofluorescencia en triple marcaje del colágeno I, colágeno II y agrecano, sobre unos cortes obtenidos a partir de cultivos tridimensionales de condrocitos en esponja ha permitido demostrar el efecto favorable del \betaAPN sobre la preservación del fenotipo cartílago de los condrocitos después de tres meses de cultivo:

: una extensión de la zona de depósito de colágeno II en la esponja y un claro aumento de la intensidad de marcaje del colágeno II y del agrecano (marcadores del cartílago) asociada a una fuerte disminución de la del colágeno I debidas al \betaAPN.

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Es necesario asegurarse de la eficacia del tratamiento destinado a eliminar el \betaAPN del cultivo de células antes de su utilización como implante tisular autólogo. Esta operación responde a dos exigencias:

1ª: - restablecer una actividad lisil-oxidasa normal en el seno del cartílago implantado durante una reparación.

2ª: - eliminar el riesgo, hipotético pero no demostrado, de un eventual rechazo perjudicial del \betaAPN sobre las células del paciente.

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Las modificaciones, observadas por primera vez, bajo el efecto de la inhibición por el \betaAPN de la actividad lisil-oxidasa, en los puentes entre cadenas de colágeno IX resultan muy precoces (preceden a la aparición de colágeno I marcador de desdiferenciación) e irreversibles, (como muy tarde, en los 6 días siguientes a la eliminación del \betaAPN) (figura 9). Se ha demostrado así que unos lavados repetidos del tapiz celular por PBS previamente a la utilización del medio de cultivo sin \betaAPN son suficientes para eliminar cualquier traza de \betaAPN activo.

Por otra parte, se ha verificado que una inoculación a alta densidad retarda bien la aparición de la desdiferenciación en cultivo 2D.

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Regulación de la formación de la piel reconstruida Estudio preliminar del \betaAPN sobre los fibroblastos y los queratinocitos cultivados en monocapa

La numeración celular muestra que el \betaAPN presenta un efecto inhibidor sobre la proliferación de los fibroblastos y de los queratinocitos sólo para unas dosis relativamente fuertes. En efecto, el número de estas células ha disminuido aproximadamente 50% con respecto al control cuando se cultivan en presencia de 600 \mug/ml de \betaAPN. Sin embargo, a la concentración de 200 \mug/ml, la proliferación de los fibroblastos ha aumentado ligeramente, mientras que la de los queratinocitos ha disminuido aproximadamente 10%. Por el contrario, no se observa ningún efecto tóxico del \betaAPN sobre los fibroblastos y los queratinocitos en confluencia hasta 800 \mug/ml. Los resultados del ensayo de viabilidad con MTT confirman los de la numeración celular. En conclusión, estos resultados indican que el \betaAPN, a unas concentraciones elevadas (superiores a 500 \mug/ml), presenta un efecto inhibidor sobre la proliferación de los fibroblastos y de los queratinocitos. Se debe subrayar que el \betaAPN a 200 \mug/ml puede generar eventualmente un aumento de la actividad celular (proliferación y viabilidad) sobre los fibroblastos inoculados a baja densidad, y sobre los fibroblastos y los queratinocitos inoculados a fuerte densidad.

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Pieles reconstruidas (PR)

Un efecto importante del \betaAPN para los injertos sería la reducción posible de la retracción inducida por la reticulación de los colágenos (figura 10).

La superficie de las pieles reconstruidas sumergidas tratadas con \betaAPN es superior a la de las PR sumergidas no tratadas, lo que sugiere una atenuación del fenómeno de retracción. En efecto, si se consideran los resultados obtenidos antes de la elevación a la interfaz aire-líquido, las pieles de control no tratadas presentan una disminución de superficie de 40% con respecto a su estado original, contra 17% sólo para las pieles tratadas mediante 500 \mug/ml de \betaAPN.

En el día 35 de cultivo, la superficie de las pieles reconstruidas de control o tratadas mediante 50 g/ml de \betaAPN es de 50% con respecto a la superficie de partida, mientras que las pieles reconstruidas tratadas con 200 y 500 \mug/ml de \betaAPN presentan sólo una disminución de superficie de 40%. El efecto del \betaAPN observado sobre la superficie de las pieles reconstruidas después de dos semanas de cultivo en la interfaz aire-líquido no es esta vez dosis-dependiente. Se observa una superficie significativamente superior de las PR tratadas por 200 ó 500 \mug/ml de \betaAPN, con respecto a la del control. Las PR tratadas por 50 \mug/ml de \betaAPN no muestran ninguna diferencia significativa de su superficie con respecto al control no tratado.

La histología de las PR (figura 11) no aparece cambiada fundamentalmente mediante el tratamiento con \betaAPN a 50 \mug/ml o 200 \mug/ml. Las PR tratadas aparecen constituidas por una dermis que presenta una matriz extracelular (MEC) rica, y por una epidermis que presenta las capas basales, espinosas, granulosas y córneas. Incluso si las PR formadas son más frágiles y la epidermis más fina, la estructura general clásica de la epidermis está conservada. La colonización inicial de la esponja por los fibroblastos está favorecida por la presencia de \betaAPN, lo que se traduce por una síntesis aumentada de MEC.

En la piel normal y en el presente modelo de piel reconstruida, los queratinocitos de la capa basal representan las células cepas. La evolución de su fenotipo concomitante y su migración hacia las capas externas de la epidermis permitirán la formación de la capa córnea. Esta capa córnea es indispensable, debido a que asegura la función de barrera de la piel. Su formación debe ser controlada sin embargo con el fin de permitir la síntesis de muestras de piel suficientemente importante. Incluso si la aportación temporal de \betaAPN parece ralentizar la evolución del fenotipo inicial de los queratinocitos, la organización general en capas basales, granulosa, espinosa y córnea se mantiene.

Los análisis inmunohistológicos y ultraestructurales revelan unas modificaciones significativas de las PR tratadas. Los constituyentes estructurantes de la MEC que son los colágenos fibrilares ven modificada su organización en fibras. Las moléculas de colágeno segregadas se depositan en forma de fibras de diámetros irregulares, que presentan unas fusiones entre fibras adyacentes. Se ha mostrado por último mediante la hibridación in situ que el tratamiento por 50 \mug/ml de \betaAPN se traducía por un ligero aumento de la detección de los genes LOX y LOXL, al mismo tiempo en la dermis y en la epidermis.

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Leyendas de las figuras

Figura 1: Efecto de la actividad lisil-oxidasa sobre la desdiferenciación de condrocitos después de 2 semanas de cultivo en dos dimensiones sobre plástico.

Se han inoculado 4 millones de condrocitos de la parte craneal del esternón de pollo por caja de Petri de 35 mm de diámetro (P35) en medio DMEM con o sin suero al 10% (sustituido por insulina 100 ng/ml) con o sin \betaAPN (50 \mug/ml). Los medios de cultivo con 25 \mug/ml de ascorbato son cambiados cada dos días. Los colágenos neosintetizados marcados con prolina 14C durante las últimas 24 horas son aislados después de la pepsinación clásica de los medios de cultivo acondicionados y después sometidos a SDS PAGE, sin ninguna condición reductora, y a fluorografía.

Observaciones:

-: en presencia de suero, altamente anabolizante, la desdiferenciación bioquímica de los condrocitos (colágeno I segregado, parada de síntesis de colágeno X) está totalmente inhibida bajo la acción del \betaAPN que aumenta la proporción de colágeno X específico de estos condrocitos hipertróficos. Asimismo, el \betaAPN preserva la hipertrofia y la morfología no esparcida características de estos condriomas.

-: en ausencia de suero, los condrocitos se adhieren al plástico de las cajas pero no se esparcen. Después de 15 días de cultivo, la ausencia de \betaAPN genera sólo la alteración morfológica, pero el crecimiento celular sigue en su conjunto ralentizado a pesar de la presencia de insulina.

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Figura 2: Efecto de la actividad lisil-oxidasa sobre la desdiferenciación de condrocitos después de 3 días de cultivo, en presencia de suero, en dos dimensiones sobre plástico.

El estudio fluorográfico descrito para la figura 1 se ha referido en este caso a los tapices y a los medios de cultivo pepsinados.

Observaciones:

: Solo la presencia de \betaAPN permite la expresión normal de colágeno X (bandas inferiores de los fluorogramas) por los condrocitos hipertróficos (craneales) identificado en los medios y los tapices celulares. La inhibición de la síntesis de colágeno X se conoce porque precede a la aparición de colágeno I mediante los condrocitos durante la desdiferenciación, que se inicia por lo tanto en los primeros días de cultivo mientras que los colágenos anormales no han sido todavía sintetizados.

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Figura 3: Inmunodecoración mediante anticuerpos anti LOX, LOXL1, de extractos de tapices celulares y de medio de cultivo de condrocitos sometidos a SDS PAGE y después transferencia sobre membrana de nitrocelulosa.

El día anterior a las extracciones, el tapiz celular se lava tres veces mediante un medio sin suero. El medio se cambia entonces para 24 horas por medio completo sin suero.

En el día 6 ó 14 de cultivo los medios se extraen y se precipitan clásicamente por TCA al 10% final/4ºC/30 minutos. Los residuos de centrifugación se aclaran con acetona y después se solubilizan en 50 \mul de tampón de electroforesis. Los tapices celulares aclarados son lisados durante 2h/a 4ºC (300 \mul/P35) en la mezcla de urea 8M, Nonidet al 0,5%, fosfato de sodio disódico 16 mM, pH 8 e inhibidor de proteasas. La concentración de urea se lleva hasta 4M antes de la centrifugación de la suspensión. Los sobrenadantes se precipitan mediante TCA y después se tratan como para los medios correspondientes.

Después de la separación por SDS PAGE y transferencia western, las bandas proteínicas se analizan mediante inmunodecoración con la ayuda de anticuerpos anti-LOX y anti-LOXL1 policlonales de conejo, después de un 2º anticuerpo anti-conejo marcado con fosfatasa alcalina antes de la revelación con el reactivo NBT/BCIP (Roche Diagnostic GmbH, Manheim, Alemania).

Observaciones:

1): la LOX y la LOXL1 son expresadas por los condrocitos cultivados en las condiciones descritas para la dosificación de actividad enzimática. Las lisil-oxidasas acumuladas en los tapices después de 1 a 2 semanas pueden ser demostradas, a la inversa de los medios de cultivo de sólo 24 horas.

2: La presencia de \betaAPN no modifica la expresión de las moléculas de lisil-oxidasas, sólo la actividad enzimática está inhibida, tal como lo muestra la tabla I.

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Figura 4: Identificación mediante fluorografía de los colágenos radiomarcados sintetizados por los condrocitos de cartílagos cotiloidianos en cultivo 2D sobre plástico. Efectos de la hialuronidasa añadida al medio de digestión enzimática de los cartílagos.

Los radiomarcajes de 24 horas con prolina 14C han sido efectuados en los días 2, 7 y 14 del cultivo en presencia de suero y \betaAPN (D2, D7 y D14 respectivamente). Los extractos pepsinados de medio de cultivo y de tapiz celular han sido sometidos a una electroforesis y después a una fluorografía.

Las zonas superficiales (n^{os} pares) y profundas (n^{os} impares) del cartílago cotiloidiano han sido separadas antes de ser sometidas a la digestión enzimática en presencia o no de hialuronidasa.

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Observaciones:

b): las dos sub-poblaciones de condrocitos, profunda y superficial, presentan un fenotipo cartílago en el 2º día de cultivo, en el que no sintetizan ningún colágeno I, tanto en el tapiz celular como en el medio.

c): En presencia de hialuronidasa durante la digestión previa del cartílago: la zona profunda continúa sin sintetizar ningún colágeno I, tanto en el 7º día como en el 14º día de cultivo.

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Por el contrario, las células de la zona superficial se desdiferencian produciendo colágeno I de manera creciente desde el 7º día hasta el 14º día de cultivo. Un colágeno I neosintetizado está asimismo presente en el tapiz celular. Un colágeno III se produce tardíamente y en baja proporción en el 14º día en el medio de cultivo, pero está muy poco retenido en el tapiz celular, a la inversa del colágeno II.

d): En ausencia de hialuronidasa durante la digestión previa del cartílago: las dos sub-poblaciones de condrocitos que se acaban de definir evolucionan de manera similar durante las dos semanas de cultivo desdiferenciándose.

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Figura 5: Morfología de las células de cartílago cotiloidiano en cultivo 2D sobre plástico.

Las observaciones han sido efectuadas en los días 7 y 14 de cultivo (D7 y D14) en presencia de suero y \betaAPN sobre los mismos cultivos utilizados para los radiomarcajes.

Digestiones enzimáticas previas de los cartílagos en presencia (+) o en ausencia (-) de hialuronidasa.

Observaciones:

e): digestión en presencia de hialuronidasa (+): en el 7º día de cultivo (a, e): las células de la zona profunda presentan una morfología característica de los condrocitos, tal como se puede observar in situ. Por el contrario, las células de la zona superficial, de tipo fibroblastoide, presentan numerosas y delgadas prolongaciones. Estas diferencias se mantienen durante las multiplicaciones sucesivas por lo menos hasta el 14º día de cultivo (c, g),

f): Digestión en ausencia de hialuronidasa (-): las células están incluidas en una matriz extracelular más abundante en la que las diferencias morfológicas entre los dos sub-tipos de células son menos claras (b, f, d y h).

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Figura 6: Estructura del cartílago humano normal.

Figura 7: Condrocitos humanos normales cultivados durante 1 mes en 3D bajo agitación en presencia de \betaAPN.

Cultivos en 3D en unas esponjas de colágeno-GAG-quitosano, en presencia de suero y \betaAPN de condrocitos humanos normales. Los condrocitos han sido previamente multiplicados, y desdiferenciados, en cultivo 2D sobre plástico.

El análisis histológico muestra en superficie la presencia de una zona densa espesa de estructura histológica muy cercana de la del cartílago humano normal (figura 6). Los condrocitos están rodeados de una matriz extracelular importante que se han neosintetizado y están alojados en pequeñas lagunas. Más profundamente, se observa una colonización de la esponja con una síntesis de matriz muy pobre.

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Figura 8: Condrocitos humanos normales cultivados durante 1 mes en 3D bajo agitación sin \betaAPN.

Las mismas esponjas de colágeno-GAG-quitosano tratadas en este caso sin \betaAPN presentan en superficie una zona densa poco gruesa localizada sobre una superficie limitada de la esponja. Más profundamente, la colonización y la síntesis de matriz no difieren de las esponjas tratadas con \betaAPN.

En conclusión, el tratamiento con \betaAPN parece favorecer el desarrollo de una estructura cercana de la del cartílago humano normal en superficie.

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Figura 9: Reversibilidad de los efectos del \betaAPN sobre los puentes de las cadenas de colágeno IX producido en el tapiz celular de condrocitos hipertróficos de pollo embrionario. Estudio fluorográfico.

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Unos condrocitos de la parte craneal de esternón han sido inoculados a fuerte concentración (5 millones de células por caja de Petri P35) y después han sido sometidos a 24 horas de radiomarcaje con prolina 14C los días 7, 14 y 24 de cultivo (respectivamente D7, D14 y D21).

El \betaAPN estaba presente (+) o ausente (-) durante la duración total del cultivo, o presente sólo durante la primera semana ((+)).

Observaciones:

: La presencia de dos bandas principales de colágeno IX varía en función de la presencia o no de \betaAPN durante todo el cultivo: la banda A está relacionada con la ausencia de \betaAPN, mientras que la banda B se observa esencialmente en presencia de \betaAPN. La presencia de \betaAPN limitada a la única primera semana proporciona un perfil electroforético después de 2 y 3 semanas de cultivo que es característico de un cultivo sin \betaAPN.

En todos los casos, la síntesis de colágeno X aumenta con la edad del cultivo, pero la síntesis de colágeno 1 está ralentizada por la fuerte densidad de inoculación inicial (5 millones de células/P35 en lugar de 1,5).

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Conclusiones:

: Se muestra el efecto del \betaAPN sobre los puentes del colágeno IX, precede al de la desdiferenciación caracterizada por la síntesis de colágeno I. Estos resultados muestran:

b): la reversibilidad de los efectos del \betaAPN.

c): La eficacia de la eliminación del \betaAPN del cultivo celular después de los lavados repetidos de los tapices celulares y después la utilización de un medio de cultivo sin \betaAPN.

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Figura 10: Análisis inmunohistoquímico de la piel reconstruida con y sin \betaAPN

1 y 2: coloración de control con hematoxilina sin el 1^{er} anticuerpo.

3 a 6: inmunodetección de la LOX por un 2º anticuerpo marcado con peroxidasa en ausencia (1, 3, 5) o en presencia (2, 4, 6) de \betaAPN.

Las coloraciones de color marrón oscuro marcan la presencia del antígeno LOX y están ausentes de los cortes de control.

Después de 35 días de formación, la piel reconstruida está constituida por una dermis depositada sobre la esponja de colágeno-glicosaminoglicano-quitosano, y por una epidermis formada por los queratinocitos.

A nivel de la dermis, el tratamiento con \betaAPN permite una colonización más importante de la esponja por los fibroblastos, lo que se traduce por una síntesis aumentada de matriz extracelular (1 y 2). La expresión de LOX aparece más intensa.

A nivel de la epidermis, se vuelve a encontrar la estratificación general, pero el tratamiento con \betaAPN hace aparecer una línea granulosa más intensa. La expresión de LOX ha aumentado asimismo.

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Figura 11: Efecto del \betaAPN sobre la retracción de pieles reconstruidas:

El \beta-APN provoca una disminución dosis-dependiente y significativa de la retracción con respecto al control, cuando las pieles están todavía en cultivo sumergido (en gris). Después de dos semanas en la interfaz aire-líquido (en blanco), la retracción sigue disminuida con respecto al control, pero solamente para las concentraciones de 200 y
500 \mug/ml.

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TABLA I Actividades lisil-oxidasa recogidas en los tapices celulares de condrocitos en cultivo sobre plástico

Dos poblaciones de condrocitos de esternón de embrión de pollo (hipertróficos en la parte craneal, que sintetizan el colágeno X, y no hipertróficos en la parte caudal). Inoculación: 4 millones de células/Petri 35 mm (P35).

Cultivo + 25 \mug/ml de ascorbato, + 1 mM de piruvato, \pm 10% de FCS, \pm 1 mM de cys. El tapiz celular se lava mediante el medio sin suero + cys 24 horas antes de la recogida del medio sin suero (1,5 ml). Unas alícuotas de medio de cultivo, después de 24 horas, son concentradas 10 veces y después sometidas a la dosificación de la actividad lisil-oxidasa con diferentes lotes de sustrato elastina tritiada.

100

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Conclusiones

Unas actividades lisil-oxidasa (inhibidas por el \betaAPN y dosificadas por la producción de agua tritiada) son segregadas en los medios de cultivo. La actividad específica recogida en los medios es más fuerte el día 7 de cultivo que el día 13. Siendo la matriz extracelular más rica en sustratos colagénicos naturales de la actividad lisil-oxidasa el día 13 de cultivo, retendría por lo tanto la enzima en el tapiz celular.

Claims

1. Utilización de inhibidores directos de lisil-oxidasas (LO) seleccionados entre:

: las aminas primarias que reaccionan con el grupo carbonilo del sitio activo de las LO, y más particularmente las que proporcionan, después de una unión al carbonilo, un producto estabilizado por resonancia, tales como las aminas primarias siguientes:

-: la etilendiamina,

-: los aminonitrilos, tales como el \beta-aminopropionitrilo (\betaAPN) o la 2-nitroetilamina,

-: las haloaminas insaturadas o saturadas, tales como la 2-bromoetilamina, la 2-cloroetilamina, la 2-trifluoroetilamina, la 3-bromopropilamina, las p-halobencilaminas, y los compuestos halogenados insaturados,

-: la selenohomocisteína lactona.

como inhibidores de la desdiferenciación de las células en cultivo in vitro, con vistas al mantenimiento constante del fenotipo de dichas células en el marco de la realización de un procedimiento de cultivo in vitro de estas últimas, y durante la totalidad del tiempo de cultivo, para la preparación de células diferenciadas cuyo fenotipo es idéntico, o para la preparación de una matriz celular constituida por células diferenciadas que conservan el mismo fenotipo y cultivadas en presencia de dichos inhibidores, y del medio extracelular segregado por dichas células y que une estas últimas en la matriz.

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2. Utilización del \betaAPN como inhibidor de las LO según la reivindicación 1.

3. Utilización de inhibidores de LO según una de las reivindicaciones 1 a 2, para la realización de procedimientos de cultivo in vitro de cualquier célula de origen humano o animal, en la que dichas células son mantenidas a un fenotipo de diferenciación constante, y se seleccionan en particular de entre los condrocitos de los cartílagos, y las células de la córnea, las células de la piel (tales como los fibroblastos de la dermis, y los queratinocitos de la epidermis), las células endoteliales de los vasos, los osteoblastos de los huesos, los hepatocitos, las células renales, las células musculares, las células cepas o pluripotentes.

4. Utilización de inhibidores de LO según una de las reivindicaciones 1 a 3, para la realización de procedimientos de cultivo in vitro de células.

5. Utilización de inhibidores de LO según una de las reivindicaciones 1 a 3, para la realización de procedimientos de cultivo in vitro de células con vistas a obtener unos tejidos, tales como de la piel o de cartílago.

6. Procedimiento de cultivo in vitro de células tales como las definidas en la reivindicación 3, durante el cual el fenotipo de dichas células se mantiene en un estado idéntico al que se encontraban inicialmente dichas células durante su cultivo, comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de dichas células en un medio apropiado que contiene uno o varios inhibidores de LO definidos en una de las reivindicaciones 1 a 2.

7. Procedimiento de preparación de células, o de implantes celulares, caracterizado porque comprende:

-: realizar un procedimiento de cultivo in vitro de células según la reivindicación 6,

-: llegado el caso, una o varias etapas de lavado de las células en cultivo con la ayuda de un disolución tampón apropiada, con el fin de eliminar la totalidad o parte del o de los inhibidores de LO utilizados,

-: llegado el caso, una etapa de recuperación de las células cultivadas.

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8. Procedimiento de preparación in vitro de una matriz celular tal como la definida en la reivindicación 1, susceptible de poder ser utilizada como tejidos o implantes tisulares, constituidos por células diferenciadas al fenotipo idéntico, caracterizado porque comprende:

-: realizar un procedimiento de cultivo in vitro de células según la reivindicación 6, hasta la formación de una matriz celular tal como se ha definido anteriormente, suficiente para constituir una trama tisular,

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9. Procedimiento de preparación in vitro de tejidos según la reivindicación 8, aplicado a la neosíntesis de implantes de cartílago cuando dicho procedimiento se efectúa a partir de condrocitos, o a la preparación de sustitutos cutáneos cuando dicho procedimiento se efectúa a partir de fibroblastos y/o de queratinocitos.

10. Procedimiento de cribado de moléculas de interés farmacológico, en particular de medicamentos, caracterizado porque comprende:

-: realizar un procedimiento de cultivo in vitro de células según la reivindicación 6, llegado el caso hasta la formación de una matriz celular suficiente para constituir una trama tisular,

-: llegado el caso, una o varias etapas de lavado de los tejidos en cultivo con la ayuda de una disolución tampón apropiada, con el fin de eliminar la totalidad o parte del o de los inhibidores de LO utilizados,

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11. Implantes para la terapia celular que corresponden a unos implantes de suspensiones de condrocitos diferenciados, cuyo fenotipo inicial de tipo cartílago ha sido mantenido durante la fase preliminar de multiplicación celular in vitro, tales como los obtenidos mediante la realización de un procedimiento según la reivindicación 7.

12. Implantes para la terapia tisular de tipo cartílago, tales como los obtenidos mediante la realización de un procedimiento según la reivindicación 8 efectuado a partir de condrocitos, que comprenden una matriz extracelular exenta de colágenos normalmente ausentes del cartílago sano (a saber, los colágenos I y III), y que comprenden la totalidad de los colágenos específicos del cartílago (a saber, los colágenos II, IX, XI, y llegado el caso X).

13. Implantes de cartílago según la reivindicación 12, caracterizados porque contienen unos inhibidores de LO en el estado de trazas.

14. Implantes de piel reconstituida, o sustitutos cutáneos, tales como los obtenidos mediante la realización de un procedimiento según la reivindicación 10 efectuado a partir de fibroblastos y/o de queratinocitos, habiendo disminuido la superficie de dichos implantes 40% después de 35 días de cultivo con respecto a la superficie de partida.