KR20230031285A - 레티노이드와 암 치료제의 병용 요법이 효과적인 암 환자를 선별하는 방법 및 레티노이드와 암 치료제의 병용 의약 - Google Patents

레티노이드와 암 치료제의 병용 요법이 효과적인 암 환자를 선별하는 방법 및 레티노이드와 암 치료제의 병용 의약 Download PDF

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야스유키 미즈타니
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히로키 가와시마
요시히사 마쓰카와
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Abstract

본 발명은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자를 선별하는 단계를 포함하는, 레티노이드와 암 치료제의 병용 요법이 효과적인 암 환자를 선별하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자가 대상이고 레티노이드와 암 치료제를 병용 투여하는 의약을 제공한다.

Description

레티노이드와 암 치료제의 병용 요법이 효과적인 암 환자를 선별하는 방법 및 레티노이드와 암 치료제의 병용 의약
본 발명은 레티노이드와 암 치료제의 병용 요법이 효과적인 암 환자를 선별하는 방법, 및 선택된 암 환자에 대해 레티노이드와 암 치료제가 효과적인 병용 의약에 관한 것이다.
간질은 암의 미세환경을 구성하는 암연관 섬유아세포, 세포외기질, 면역세포, 혈관 등의 총칭이다. 췌장암("췌장종양"이라고도 함), 담관암, 유방암, 및 폐암 등의 일부 악성 종양은 항암제 내성의 원인으로 생각되는 간질을 다량 함유하고 있다. 간질의 주요 성분인 암연관 섬유아세포는 다양한 기전으로 암세포의 성장을 촉진하고, 암연관 섬유아세포에서 유래하는 풍부한 세포외기질은 항암제의 침투를 막는다. 따라서 암연관 섬유아세포는 암을 촉진하는 인자로 간주되어왔다. 상기에 근거하여, 암연관 섬유아세포를 표적으로 하는 암 치료가 시도되었으나, 예상과 달리 악성도가 높은 암세포가 생성되어 왔다(비특허문헌 1).
한편, 최근의 연구에서는 상기 암을 촉진하는 암연관 섬유아세포 외에 암을 저지하는 암연관 섬유아세포도 존재하는 것으로 밝혀졌고, GPI 고정막 분자인 메플린(meflin)이 특정 분자 표지자로 파악되었다(비특허문헌 2 내지 4). 또한, 암이 진행됨에 따라 암을 저지하는 암연관 섬유아세포는 암을 촉진하는 암연관 섬유아세포로 변화(변환)하는 반면, 암연관 섬유아세포는 특정 약물에 의해 종양 저지적 암연관 섬유아세포로 되돌릴 수(재프로그래밍) 있다. 현재, ATRA(all-trans retinoic acid) 또는 비타민 D는 암을 촉진하는 암연관 섬유아세포를 암을 저지하는 암연관 섬유아세포로 재프로그래밍하는 약물로서 알려져 있다(비특허문헌 5 내지 9).
항암제내성 간질이 많은 악성 종양을 가진 일부 암 환자에 대해 고도로 특이적인 치료 방법이 개발되고, 나아가 치료가 효과적인 일부 암 환자를 정확하게 선별할 수 있는 방법이 개발된다면, 암 환자에게 효과가 없는 치료법을 투여할 가능성이 줄어들 수 있고 의료비 절감에 기여할 수 있을 뿐만 아니라 최적의 치료를 통해 환자의 예후를 개선할 수 있는 것으로 생각된다.
https://www.sec.gov/Archives/edgar/data/1113148/000119312512026049/d290658dex991.htm(미국 증권거래위원회 웹사이트) Cancer Cell. 2014; 25: 719-734 Cancer cell. 2014; 25: 735-747. 메플린 양성 암연관 섬유아세포는 췌장암 발생을 억제한다. Cancer Res 79:5367-81, 2019 Biochem Pharmacol. 2003 Aug 15; 66(4):633-41. doi: 10.1016/s0006-2952(03)00390-3. Gut. 2006 Jan; 55(1): 79-89. doi: 10.1136/gut.2005.064543 Gastroenterology 2011 Oct; 141(4):1486-97, 1497.e1-14. doi: 10.1053/j.gastro.2011.06.047. Epub 2011 Jun 24. Cell. 2014 Sep 25; 159(1):80-93. doi: 10.1016/j.cell.2014.08.007. Nat Commun. 2016 Sep 7; 7:12630. doi: 10.1038/ncomms12630.
본 발명의 목적은 항암제 내성 간질이 많은 악성 종양을 갖는 암 환자의 암 치료에 매우 효과적인 의약을 제공하고, 그 의약을 이용하는 치료가 효과적인 암 환자를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 다음과 같은 발명을 포함한다.
[1] 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자를 선별하는 단계를 포함하는, 레티노이드와 암 치료제의 병용 요법이 효과적인 암 환자를 선별하는 방법.
[2] 상기 [1]에 있어서, 암 환자를 선별하는 단계가 검사 대상 암 환자로부터 수득한 악성 종양 조직에서 적어도 하나의 암연관 섬유아세포를 검출하는 것을 포함하는 방법.
[3] 상기 [1] 또는 [2]에 있어서, 암 환자를 선별하는 단계가 검사 대상인 암 환자로부터 수득한 악성 종양 조직의 조직병리학적 표본을 준비하고 현미경 관찰 하에 적어도 하나의 암연관 섬유아세포를 검출하는 것을 포함하는 방법.
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 암 환자를 선별하는 단계는 검사 대상 암 환자로부터 수득한 악성 종양 조직의 조직병리학적 표본을 현미경으로 관찰하고, 암 세포 영역 및 간질 영역을 포함하는 임의의 고배율 필드에서 적어도 하나의 암연관 섬유아세포를 검출하는 것을 포함하는 방법.
[5] 상기 [3] 또는 [4]에 있어서, 암연관 섬유아세포를 검출하는 것은 헤마톡실린-에오신 염색된 조직병리학적 표본을 현미경으로 관찰함으로써 수행되는 방법.
[6] 상기 [3] 또는 [4]에 있어서, 암연관 섬유아세포를 검출하는 것은 면역조직화학적 염색 또는 암연관 섬유아세포의 표지자 분자에 대한 제자리 혼성화에 의해 수행되는 방법.
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 선별된 암 환자가 대상이고 레티노이드와 암 치료제를 병용 투여하는 의약.
[8] 상기 [7]에 있어서, 암 치료제가 화학 치료제, 분자 표적제, 면역 치료제, 또는 호르몬 치료제인 의약.
[9] 상기 [7] 또는 [8]에 있어서, 레티노이드가 타미바로텐인 의약.
[10] 상기 [7] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 레티노이드가 미리 투여되도록 사용되는 의약.
[11] 암 치료제의 작용을 증진 및/또는 목적 종양 조직에 대한 암 치료제의 전달을 촉진하기 위한 의약에 있어서, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 선별되는 암 환자가 대상이고, 레티노이드가 유효 성분인 의약.
[12] 상기 [11]에 있어서, 암 치료제가 화학 치료제, 분자 표적제, 면역 치료제, 또는 호르몬 치료제인, 의약.
[13] 상기 [11] 또는 [12]에 있어서, 레티노이드가 타미바로텐인 의약.
[14] 암 치료제의 작용을 증진하기 위한 의약에 있어서, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 선별되는 암 환자가 대상이고, 종양 조직 세포에서 메플린을 과발현하는 조성물이 유효 성분인 의약.
[15] 상기 [14]에 있어서, 메플린을 과발현하는 조성물이 메플린 유전자를 포함하는 바이러스 벡터인 의약.
[16] 상기 [14] 또는 [15]에 있어서, 암 치료제가 화학 치료제, 분자 표적제, 면역 치료제, 또는 호르몬 치료제인 의약.
[17] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 선별되는 암 환자가 대상이고 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제와 암 치료제를 병용 투여하는 의약.
[18] 상기 [17]에 있어서, 암 치료제가 화학 치료제, 분자 표적제, 면역 요법제, 또는 호르몬 치료제인 의약.
[19] 상기 [17] 또는 [18]에 있어서, 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제가 미리 투여되도록 사용되는 의약.
[20] 암 치료제의 작용을 증진 및/또는 목적 종양 조직에 대한 암 치료제의 전달을 촉진하기 위한 의약에 있어서, 상기 [1] 내지 [6]에 따른 방법에 의해 선별되는 암 환자가 대상이고 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제가 유효 성분인 의약.
[21] 상기 [20]에 있어서, 암 치료제가 화학 치료제, 분자 표적제, 면역 치료제, 또는 호르몬 치료제인 의약.
본 발명은 항암제 내성 간질을 다량 함유한 악성 종양을 갖는 암 환자의 암 치료에 매우 효과적인 의약을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 의약을 사용한 치료가 효과적인 암 환자를 선별하는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명에 따르면, 치료 효과가 높은 암 환자를 식별할 수 있고 선택된 암 환자만 치료할 수 있으므로 치료 효과가 낮은 암 환자에게 높은 의료비를 지불함으로써 낭비적인 치료를 피할 수 있다.
도 1은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 췌장 종양(역형성 암)에 대한 수술로 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 2는 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 췌장 종양(췌장내 유두 점액선종)에 대한 수술로 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 3은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 췌장 종양(세관 선암)에 대한 수술에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 4는 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 췌장 종양(세관 선암)에 대한 수술에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 5는 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양(선상 세포 암종)에 대한 수술에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 6은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양(선상 세포 암종)에 대한 수술에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양(췌장내 유두점막선암(비침습성 암))에 대한 수술에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 8은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양(췌장내 유두점액선종(IPMA))에 대한 수술에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 9는 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양(점액낭종 종양)에 대한 수술에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 10은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양(신경내분비 종양(G1, 인슐린종))에 대한 수술에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 11은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양(신경내분비 종양(G1, 가스트린종))에 대한 수술에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 12는 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양(췌장 상피내 종양 병변(PanIN))에 대한 수술에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 13은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양(장액성 낭선종)에 대한 수술에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 14는 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양(고형 가유두 신생물(SPN))에 대한 수술에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 15는 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 췌장 종양(세관 선암종)에 대한 생검에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 16은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 췌장 종양(역형성 암종)에 대한 생검에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 17은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 췌장 종양(췌장내 유두점막 선암종(침습성 암))에 대한 생검에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 18은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양(선상 세포 암종)에 대한 생검에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 19는 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양(고형 가유두 신생물(SPN))에 대한 생검에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 20은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양(신경내분비 종양)에 대한 생검에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 21은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양(췌장내 유두 점액선종(IPMA))에 대한 생검에 의해 수득한 HE 염색 표본을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 22는 항메플린 항체를 이용한 면역조직화학적 염색(좌)과 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 췌장 종양의 조직 표본에 대해 메플린 유전자의 mRNA에 혼성화하는 프로브를 이용한 제자리 혼성화(in situ hybridization(ISH))의 결과를 나타낸다.
도 23은 항메플린 항체를 이용한 면역조직화학적 염색(좌)과 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 췌장 종양의 조직 표본에 대해 메플린 유전자의 mRNA에 혼성화하는 프로브를 이용한 제자리 혼성화(ISH)의 결과를 나타낸다.
도 24는 항메플린 항체를 이용한 면역조직화학적 염색(좌)과 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤되지 않은 췌장 종양의 조직 표본에 대해 메플린 유전자의 mRNA에 혼성화하는 프로브를 이용한 제자리 혼성화(ISH)의 결과를 나타낸다.
도 25는 실시예 3의 프로토콜을 나타낸다.
도 26은 이식 15일 후 종양 체적을 측정한 결과를 나타내고, 여기서 (A)는 인간 췌장암 세포만을 이식한 누드 마우스에서 젬시타빈 및 타미바로텐 투여군(Gem + AM80 군)과 젬시타빈 및 DMSO 투여군(Gem + DMSO)의 결과를 나타내고, (B)는 인간 췌장암 세포와 인간 췌장 성상세포를 동시 이식한 Gem + AM80군과 Gem + DMSO군의 결과를 나타낸다.
도 27은 100% 합류까지 1차 마우스 중간엽 줄기세포를 배양하고 ATRA, AM80, 또는 AM580을 배지에 첨가한 48시간 후 유전자 발현을 측정한 결과를 나타내고, 여기서 (A)는 메플린 유전자(Islr), (B)는 액틴 유전자(Acta2), (C)는 I형 콜라겐 유전자(Col1a1), 및 (D)는 III형 콜라겐 유전자(Col3a1)이다.
도 28은 실시예 6의 프로토콜을 나타낸다.
도 29는 마우스 췌장암 세포를 피하 이식한 마우스를 사용한 실시예 6의 각 군에서 이식 후 시간 경과에 따른 종양 체적을 측정한 결과를 나타낸다.
도 30은 이식 22일 후에 종양을 제거하고 조직 절편을 준비한 실시예 6에서 종양에서 메플린 유전자(Islr) 발현의 제자리 혼성화(ISH) 검출의 결과를 나타내고, 여기서
(A)는 대조군의 대표적인 현미경 이미지이고, (B)는 AM80 3 mg/kg/day군의 대표적인 현미경 이미지이고, (C)는 양 군 사이의 고배율 필드당 Islr 양성 신호의 도트 수를 비교한 그림이다.
도 31은 이식 22일 후 종양을 제거하고 조직 절편을 준비한 실시예 6에서 종양에서 액틴 유전자(Acta2) 발현의 제자리 혼성화(ISH) 검출의 결과를 나타내고, 여기서
(A)는 대조군의 대표적인 현미경 이미지이고, (B)는 AM80 3 mg/kg/day 군의 대표적인 현미경 이미지이고, (C)는 양 군 사이의 고배율 필드당 Acta2 양성 신호의 도트 수를 비교한 그림이다.
도 32는 이식 22일 후 종양을 제거하고 조직 절편을 준비하여 항CD31 항체로 면역염색한 실시예 6에서 혈관 내강 면적을 측정한 결과를 나타내고,
(A)는 대조군의 대표적인 현미경 이미지이고, (B)는 AM80 3 mg/kg/day 군의 대표적인 현미경 이미지이고, (C)는 양 군 사이의 혈관 내강 면적을 비교한 그림이다.
도 33은 실시예 7의 프로토콜을 나타낸다.
도 34는 마우스 췌장암 세포를 피하 이식한 마우스를 사용한 실시예 7의 각 군에서 이식 후의 시간 경과에 따른 종양 체적을 측정한 결과를 나타낸다.
도 35는 실시예 8의 프로토콜을 나타낸다.
도 36은 마우스 췌장암 세포를 피하 이식한 누드 마우스를 사용한 실시예 8의 각 군에서 이식 후의 시간 경과에 따른 종양 체적을 측정한 결과를 나타낸다.
도 37은 실시예 9의 프로토콜을 나타낸다.
도 38은 마우스 자연발생 췌장암 발병 모델(KPC 마우스)을 이용한 실시예 9에서 각 군으로 분류한 후 시간 경과에 따른 종양 체적을 측정한 결과를 나타낸다.
도 39는 실시예 11의 프로토콜을 나타낸다.
도 40은 메플린 결핍 마우스를 사용한 실시예 11의 각 군에서 이식 후 시간 경과에 따른 종양 체적을 측정한 결과를 나타낸다.
도 41은 이식 24일 후에 종양을 제거하고 조직 절편을 준비한 실시예 11에서 종양에서 액틴 유전자(Acta2) 발현의 제자리 혼성화(ISH) 검출의 결과를 나타내고, 여기서
(A)는 젬시타빈 투여군(Gem 군)의 대표적인 현미경 이미지이고, (B)는 젬시타빈과 타미바로텐 투여군(Gem + AM80 군)의 대표적인 현미경 이미지이고, (C)는 양 군 사이의 고배율 필드 당 Acta2 양성 신호의 도트 수를 비교한 그림이다.
도 42는 실시예 12의 프로토콜을 나타낸다.
도 43은 마우스 췌장암 세포를 피하 이식한 마우스를 사용한 실시예 12의 종양에서 메플린 유전자(Islr) 발현의 제자리 혼성화(ISH) 검출의 결과를 나타낸다. 여기서 감염된 세포에서 메플린을 과발현하는 센다이 바이러스(SeV-Meflin) 및 감염된 세포에서 GFP를 과발현하는 센다이 바이러스(SeV-GFP)를 각각 종양내 투여하고, 이식 17일 후에 종양을 제거하고 조직 절편을 준비하며, 여기서
(A)는 SeV-GFP 투여군의 대표적인 현미경 이미지이고, (B)는 SeV-메플린 투여군의 대표적인 현미경 이미지이다.
도 44는 실시예 12에서 이식 17일 후에 양 군 사이의 종양 체적을 비교한 그림을 나타낸다.
도 45는 실시예 13의 프로토콜을 나타낸다.
도 46은 마우스 췌장암 세포를 피하 이식한 마우스를 사용한 실시예 13에서 SeV-메플린을 종양내 투여한 후 젬시타빈을 투여한 군과 Sev-GFP를 종양내 투여한 후 젬시타빈을 투여한 군 사이에서 이식 17일 후의 종양 체적을 비교한 그림을 나타낸다.
도 47은 마우스 메플린을 안정적으로 발현하는 세포의 배양 상청액과 대조군 세포의 배양 상청액을 재조합 인간 라이실 옥시다제 L2(LoxL2)와 각각 혼합하여 인간 라이실 옥시다제 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 48은 야생형 마우스 자연발생 췌장암 발병 모델(KPC 마우스) 및 메플린 결핍 KPC 마우스에서 췌장 종양의 간질에서의 콜라겐 배열을 이차고조파 현미경으로 측정한 결과를 나타낸다.
(A)는 야생형 KPC군의 대표적인 이차고조파 현미경 이미지이고, (B)는 메플린 결핍 KPC군의 대표적인 이차 고조파 현미경 이미지이며, (C)는 양 군 사이의 콜라겐의 곡률(직선성)을 비교한 그림이다.
도 49는 마우스 췌장암 세포를 피하 이식한 마우스에 타미바로텐 또는 용매(DMSO)를 투여하고, 종양의 간질에서의 콜라겐 배열을 이차고조파 현미경으로측정한 결과를 나타내고, 여기서
(A)는 대조군의 대표적인 이차고조파 현미경 이미지이고, (B)는 타미바로텐 투여군의 대표적인 이차고조파 현미경 이미지이고, (C)는 두 군 사이의 콜라겐의 곡률(직선성)을 비교한 그림이다.
도 50은 실시예 17의 프로토콜을 나타낸다.
도 51은 마우스 췌장암 세포를 피하 이식한 마우스를 사용한 실시예 17에서, 타미바로텐의 사전 투여 후 젬시타빈을 투여한 군, 타미바로텐의 사전 투여 후 타미바로텐과 젬시타빈을 동시 투여한 군, 및 타미바로텐 대신 DMSO와 젬시타빈을 투여한 군에서 이식 후 시간 경과에 따른 종양 체적을 측정한 결과를 나타낸다.
도 52는 실시예 18의 프로토콜을 나타낸다.
도 53은 마우스 췌장암 세포를 피하 이식한 마우스를 사용한 실시예 18에서 항PD-L1 항체를 투여한 군과 항PD-L1 항체와 타미바로텐을 투여한 군에서 이식 후 시간 경과에 따른 종양 체적을 측정한 결과를 나타낸다.
도 54는 실시예 18에서 양 군의 모든 마우스가 죽을 때까지의 생존율의 경향을 나타낸다.
도 55는 실시예 19의 프로토콜을 나타낸다.
도 56은 마우스 췌장암 세포를 피하 이식한 마우스를 사용한 실시예 19에서 항PD-L1 항체를 투여한 군, 항PD-L1 항체 및 타미바로텐을 투여한 군, 및 IgG를 투여한 대조군에서 이식 후 시간 경과에 따른 종양 체적을 측정한 결과를 나타낸다.
도 57은 실시예 19에서 전체 군의 모든 마우스가 죽을 때까지의 생존율의 경향을 나타낸다.
도 58은 실시예 20의 프로토콜을 나타낸다.
도 59는 마우스 방광암 세포를 피하 이식한 마우스를 사용한 실시예 20에서 항PD-L1 항체를 투여한 군과 항PD-L1 항체와 타미바로텐을 투여한 군에서 이식 후 시간 경과에 따른 종양 체적을 측정한 결과를 나타낸다.
도 60은 마우스 폐암 세포가 피하 이식된 마우스를 사용한 실시예 19에서 항PD-L1 항체를 투여한 군과 항PD-L1 항체와 타미바로텐을 투여한 군에서 이식 후 시간 경과에 따른 종양 체적을 측정한 결과를 나타낸다.
도 61은 실시예 23의 프로토콜을 나타낸다.
도 62는 마우스 췌장암 세포를 피하 투여한 메플린 결핍 마우스를 사용한 실시예 23에서 항PD-L1 항체를 투여한 군, 항PD-L1 항체 및 타미바로텐을 투여한 군, 및 IgG를 투여한 대조군에서 이식 후 시간 경과에 따른 종양 체적을 측정한 결과를 나타낸다.
도 63은 실시예 23에서 전체 군의 모든 마우스가 죽을 때까지의 생존율의 경향을 나타낸다.
도 64는 마우스 위암 세포를 피하 투여한 마우스를 사용한 실시예 24에서 항PD-L1 항체를 투여한 군과 항PD-L1 항체와 타미바로텐을 투여한 군에서 이식 후 시간 경과에 따른 종양 체적을 측정한 결과를 나타낸다.
[레티노이드와 암 치료제의 병용 의약]
본 발명은 레티노이드와 암 치료제를 병용 투여하는, 암 치료용 의약(이하, "본 발명의 제 1 의약"이라 함)을 제공한다. 본 발명의 제 1 의약의 투여 대상은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자이다. 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자는 하기 방법에 의해 선별될 수 있다. 본 발명은 또한 레티노이드와 암 치료제의 병용 요법이 효과적인 암 환자를 선별하는 방법을 포함한다.
레티노이드와 암 치료제의 병용 요법이 효과적인 암 환자를 선별하는 방법(이하, "본 발명의 암 환자를 선별하는 방법"이라 함)은 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자를 선별하는 단계를 포함한다. 환자를 선별하는 단계를 포함한다. 암 환자를 선별하는 단계는 검사 대상 암 환자로부터 수득한 악성 종양 조직에서 적어도 하나의 암연관 섬유아세포(이하, "CAF"로 축약될 수 있다)를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 악성 종양 조직은 검사 대상 암 환자로부터 수득한 악성 종양 조직이라면 생검이나 수술에 의해 수득할 수 있다. 조직병리학적 표본을 준비하거나, 세포 현탁액을 준비하거나, 또는 세포 파쇄액을 검사 대상 암 환자로부터 수득한 악성 종양 조직으로부터 준비할 수 있다. CAF를 검출하는 수단은 특별히 한정되지 않고, CAF 특이적 핵산을 검출하는 것, CAF 특이적 단백질을 검출하는 것, 또는 CAF 특이적 형태를 검출하는 것이어도 된다.
본 발명의 암 환자를 선별하는 방법에 있어서, 간질에 CAF가 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자를 선별하는 단계는 검사 대상 암 환자로부터 수득한 악성 종양 조직의 조직병리학적 표본을 준비하고 현미경 관찰하에 적어도 하나의 CAF를 검출하는 것을 포함한다. 조직병리학적 표본을 준비하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 사용하는 염색 방법이나 검출 방법에 따라 공지의 방법을 적절히 선택할 수 있다. 현미경 관찰은 조직병리학적 표본의 전체 영역에 걸쳐 수행될 수 있고, 현미경 관찰에서 적어도 하나의 CAF가 검출되면 검사 대상 환자는 본 발명의 첫 번째 의약의 투여가 효과적인 암 환자로 간주된다. 복수의 조직병리학적 표본을 준비한 경우, 어느 조직병리학적 표본에서 적어도 하나의 CAF가 검출될 때 검사 대상 환자는 본 발명의 제 1 의약의 투여가 효과적인 암 환자로 간주될 수 있다.
본 발명의 암 환자를 선별하는 방법에 있어서, 간질에 CAF가 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자를 선별하는 단계는 검사 대상 암 환자로부터 수득한 악성 종양 조직의 조직병리학적 표본을 현미경으로 관찰하고 암세포 영역 및 간질 영역을 포함한 임의의 고배율 필드에서 하나 또는 그 이상의 CAF를 검출하는 것을 포함한다. 하나의 고배율 필드에서 CAF의 수는 적어도 하나일 수 있고, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상일 수 있다. 현미경 관찰에서 "고배율 필드"는 40x 대물렌즈와 10x 접안렌즈를 사용하여 400x에서 관찰하는 것을 의미하고, 고출력 필드(HPF)라고도 한다.
CAF는 조직병리학적 표본에 대해 헤마톡실린-에오신 염색(이하 "HE 염색"으로 축약될 수 있다)을 수행하여 검출할 수 있다. 이 경우, 병리학자는 일반적으로 현미경으로 HE 염색 표본을 관찰하여 CAF의 유무를 형태학적으로 결정한다.
본 발명의 암 환자를 선별하는 방법에 있어서, 면역조직화학법에 의해 CAF의 표지자 분자를 검출하는 방법(이하, "IHC"로 축약될 수 있다)을 사용할 수 있고, 제자리 혼성화(이하, "ISH"로 축약될 수 있다)에 의해 CAF의 표지자 분자를 검출하는 방법을 사용할 수 있다. IHC에 의해 검출되면, CAF의 표지자 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 통상적인 방법에 따라 IHC 표본을 준비할 수 있다. ISH에 의해 검출되면, CAF의 표지자 분자의 mRNA에 특이적으로 혼성화하는 프로브를 사용하여 통상적인 방법에 따라 ISH 표본을 준비할 수 있다.
CAF의 표지자 분자는 α-평활근 액틴(αSMA), 메플린, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 α(PDGFRα), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β(PDGFRβ), 섬유아세포 특이적 단백질1(FSP1), 포도플라닌, 페리오스틴, 그렘린, 데스민, CXCL12, 비멘틴, 테나신-C, NG2, ASPN, 스타니오칼루신-1(STC-1), Gli1, I형 콜라겐(Col1a1) 등을 포함한다. 이들 표지자 분자에 특이적으로 결합하는 항체로서, 시판되는 항체를 사용할 수 있다. mRNA 특이적 방식으로 이들 표지자 분자에 혼성화하는 프로브는 이들 표지자 분자를 코딩하는 유전자의 염기 서열에 근거하여 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 이들 표지자 분자를 코딩하는 유전자의 염기서열은 공지된 데이터베이스(NCBI 등)로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 제 1 의약에 사용되는 레티노이드의 예는 아시트레티노인, 아다팔렌, AGN194204(IRX4204, NRX194204, 및 VTP194204라고도 함), AGN195183, 알리트레티노인(9-cis-레티노산이라고도 함), 암실라로텐, AM580, 벡사로텐, 비스페놀 A 디글리시딜 에테르(BADGE라고도 함), 펜레티나이드, 4-히드록시레티노산, 이소트레티노인(13-시스-레티노산이라고도 함), LG268, LGD1550, 페레티노인, 레티닐 아세테이트, 타미바로텐(AM80이라고도 함), 타자로텐, 트레티노인(모든 트랜스 레티노산(ATRA)이라고도 함), TTNPB 등을 포함한다. 바람직한 것은 타미바로텐이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "레티노이드"는 "비타민 A 유도체", "비타민 A 유사체", "레티노산 수용체(RAR) 작용제" 및 "레티노익 X 수용체(RXR) 작용제"를 포함하지만, "레티노산 수용체(RAR) 길항제" 또는 "레티노익 X 수용체(RXR) 길항제"는 포함하지 않는다.
레티노이드는 염을 형성할 수 있고, 염은 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염이다. 이러한 예는 염산, 황산, 젖산, 타르타르산, 말레산, 푸마르산, 옥살산, 말산, 시트르산, 올레산, 팔미트산, 질산염, 인산, 트리플루오로아세트산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔 술폰산과 같은 산을 갖는 염; 나트륨, 칼륨, 칼슘과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속을 갖는 염; 수산화알루미늄 또는 탄산염을 갖는 염; 및 트리에틸아민, 벤질아민, 디에탄올아민, t-부틸아민, 디시클로헥실아민, 아르기닌을 갖는 염 등을 포함한다.
후단의 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 레티노이드가 간질에 CAF가 침윤된 악성 종양에 대한 동시 암 치료제의 전달을 개선함으로써 암 치료제의 작용을 증진하는 것을 발견하였다. 따라서, 레티노이드는 병용하는 암 치료제의 작용 증진제의 유효 성분이라고 할 수 있다. 또한, 레티노이드는 표적 종양 조직에 대한 동시 암 치료제의 전달을 촉진하기 위한 의약의 유효 성분이라고 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 암 치료제의 작용을 증진하기 위한 의약을 포함하고, 여기서 간질에 CAF가 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자가 환자이고 레티노이드가 유효 성분이다. 또한, 본 발명은 표적 종양 조직에 대한 암 치료제의 전달을 촉진하기 위한 의약을 포함하고, 여기서 간질에 CAF가 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자가 환자이고 레티노이드가 유효 성분이다.
본 발명의 제 1 의약에 사용되는 레티노이드는 공지된 의약 제제의 생산 방법(예: 일본 약전 등에 기재된 방법 등)에 따라 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 적절히 배합함으로써 생산할 수 있다. 특히, 약학 조성물은 예를 들어, 정제(당의정, 필름코팅정, 설하정, 구강내 붕괴정, 및 구강정을 포함), 환제, 산제, 과립, 캡슐(연질 캡슐 및 마이크로캡슐 포함), 트로키, 시럽, 액체, 에멀젼, 현탁액, 제어 방출 제제(예: 속방성 제제, 지속 방출 제제, 지속 방출 마이크로캡슐 등), 에어로졸, 필름(예: 구강 붕해 필름, 구강 점막 접착 필름 등), 주사제(예: 피하 주사, 정맥 주사, 근육 주사, 복강 주사 등), 정맥 주사, 경피 제제, 연고, 로션, 패치, 좌약(예: 직장 좌약, 질 좌약 등), 펠렛, 비강 제제, 경폐 제제(흡입제) 및 점안제를 포함하는 경구 제제 또는 비경구 제제일 수 있다. 첨가되는 담체 또는 첨가제의 양은 약학 분야에서 통상적으로 사용되는 범위에 근거하여 적절하게 결정될 수 있다. 첨가될 수 있는 담체 또는 첨가제는 특별히 한정되지 않고 그 예는 물, 생리식염수, 기타 수성 용매, 및 수성 또는 유성 비히클과 같은 다양한 유형의 담체; 및 부형제, 결합제, pH 조절제, 붕해제, 흡수 촉진제, 윤활제, 착색제, 향료, 및 방향제와 같은 다양한 유형의 첨가제를 포함한다.
정제, 캡슐 등에 배합될 수 있는 첨가제의 예는 젤라틴, 옥수수 전분, 트라가칸트, 아라비아 검과 같은 결합제; 결정질 셀룰로오스와 같은 부형제; 옥수수 전분, 젤라틴, 알긴산 등의 팽윤제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 자당, 유당, 사카린 등의 감미료; 및 페퍼민트 향, 윈터그린 오일, 및 체리 향과 같은 향료를 포함한다. 단위 제형이 캡슐제인 경우, 상기 유형의 물질 외에 유지와 같은 액상 담체를 더 첨가할 수 있다. 주사용 무균 조성물은 통상적인 제제 절차(예를 들어, 주사용수 또는 천연 식물성 오일과 같은 용매에 유효 성분을 용해 또는 현탁시킴으로써)에 따라 준비될 수 있다. 사용될 수 있는 주사용 수용액은 예를 들어 생리 식염수 및 포도당 및/또는 기타 보조 물질(예를 들어, D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등)을 함유하는 등장액이다. 주사용 수용액은 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 및 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80, HCO-50 등)와 같은 적절한 가용화제와 병용할 수 있다. 사용될 수 있는 유성 액체는 예를 들어 참기름 및 대두유이다. 유성 액체는 벤질 벤조에이트 및 벤질 알코올과 같은 가용화제와 병용할 수 있다. 추가될 수 있는 다른 첨가제는 예를 들어 완충제(예: 인산염 완충제, 아세트산나트륨 완충제 등), 진정제(예: 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제(예: 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌 글리콜 등), 방부제(예: 벤질 알코올, 페놀 등) 및 항산화제이다.
레티노이드는 인간 및 기타 포유류(예: 쥐, 생쥐, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등)에 대한 독성이 낮고 안전하게 투여할 수 있다. 제제 중 레티노이드의 양은 제형, 투여방법, 담체 등에 따라 다르지만 일반적으로 제제dml 총량에 대하여 0.01 내지 100%(w/w)이며, 0.1 내지 95%(w/w)일 수 있다.
레티노이드의 투여량은 피검체, 증상, 투여경로 등에 따라 다르지만, 예를 들어 경구 투여의 경우, 체중 약 60 kg인 사람에 대한 투여량은 1일당 약 0.01 내지 1000 mg, 바람직하게는 1일당 약 0.1 내지 100 mg, 더욱 바람직하게는 1일당 약 0.5 내지 500 mg이다. 비경구 투여의 경우, 단일 비경구 투여의 용량은 환자의 상태, 증상, 투여 방법 등에 따라 달라진다. 예를 들어, 정맥 주사의 경우, 투여량은 예를 들어 일반적으로 체중 kg당 약 0.01 내지 100 mg, 바람직하게는 체중 kg당 약 0.01 내지 500 mg, 보다 바람직하게는 약 0.01 내지 20 mg이다. 1일 총 투여량은 단일 투여량 또는 분할 투여량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 제 1 의약에 사용되는 암 치료제는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 화학 치료제, 면역 치료제, 또는 호르몬 치료제가 바람직하다. 이들 암 치료제는 리포솜 제제일 수 있다. 또한, 이들 암 치료제는 핵산 약물 또는 항체 약물일 수 있다.
화학요법제의 예는 질소 머스타드, 질소 머스타드 염산염 N-옥사이드, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 티오테파, 카르보콘, 임프로설판 토실레이트, 부설판, 니무스틴 염산염, 미토브로니톨, 멜팔란, 다카바진, 라니무스틴, 에스트라무스틴 인산나트륨, 트리에틸렌멜라민, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 피포브로만, 에토글루시드, 카르보플라틴, 시스플라틴, 미보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 알트레타민, 암바무스틴, 푸미테파, 리보무스틴, 테모졸로미드, 트레오설판, 트로포스파미드, 지노스타틴 스티말라머, 아데젤레신, 시스테무스틴, 비젤레신 등과 같은 알킬화제;
메르캅토푸린, 6-메르캅토푸린 리보사이드, 티오이노신, 메토트렉세이트, 페메트렉스트, 에노시타빈, 시타라빈, 시타라빈 옥포스페이트, 안시타빈 염산연, 5-Fu 약물 (예: 플루오로우라실, 테가푸르, UFT, 독시플루리딘, 카르모푸르, 갈로시타빈, 에미테푸르, 카페시타빈 등), 아미노프테린, 넬자라빈, 류코보린 칼슘, 타블로이드, 부토신, 엽산 칼슘, 레보폴리네이트 칼슘, 클라드리빈, 에미테푸르, 플루다라빈, 젬시타빈, 히드록시카르바미드, 펜토스타틴, 피리트렉심, 이독수리딘, 미토구아존, 티아조푸린, 암바무스틴, 벤다무스틴 등과 같은 항대사물질;
액티노마이신 D, 액티노마이신 C, 미토마이신 C, 크로모마이신 A3, 블레오마이신 염산염, 블레오마이신 설페이트, 페플로마이신 설페이트, 다우노루비신 염산염, 독소루비신 염산염, 아클라루비신 염산염, 피라루비신 염산염, 에피루비신 염산염, 네오카르지노피신, 미트라마이신, 사르코마이신, 카르지노필린, 미토탄, 조루비신 염산염, 미톡산트론 염산염, 이다루비신 염산염 등과 같은 항암 항생제;
에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신 설페이트, 테니포사이드, 파클리탁셀, 도세탁셀, 비노렐빈, 이리노테칸, 이리노테칸 염산염 등과 같은 식물 유래 항암제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
분자 표적 제제의 예는 아파티닙, 에를로티닙, 제피티닙, 세툭시맙, 파니투무맙, 네시투무맙, 크리조티닙, 알렉티닙, 라파티닙, 트라스투주맙, 트라스투주맙 엠탄신, 페르투주맙, 베바시주맙, 악시티닙, 수니티닙, 소라페닙, 파조파닙, 레고라페닙, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 시롤리무스, 이마티닙, 다사티닙, 닐로티닙, 보수티닙, 포나티닙, 입리투모맙 티욱세탄, 오파투무맙, 리툭시맙, 브렌툭시맙 베도틴, 젬투주맙 오조가미신, 모가물리주맙, 알렘투주맙, 다라투무맙, 이노투주맙 오조가미신, 데노수맙, 보르테조밉, 렌바티닙, 반데타닙, 세리티닙, 입루티닙, 오시메르티닙, 카르필조밉, 엘로투주맙, 익사조밉, 팔보시클립, 올라파립, 아베마시클립, 질테리티닙, 로르라티닙, 엔트렉티닙, 퀴자르티닙, 다코미티닙, 베네토클락스, 카보잔티닙, 오비누투주맙, 블리나투모맙, 로미뎁신, 보리노스타트, 파노비노스타트, 엔코라페닙, 베무라페닙, 다브라페닙, 비니메티닙, 트라메티닙, 토실리주맙, 실툭시맙, 인플릭시맙, 라무시루맙 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
면역치료제의 예는 피시바닐, 크레스틴, 쉬조필란, 렌티난, 우베니멕스, 인터페론, 인터루킨, 대식세포 집락 자극 인자, 과립구 집락 자극 인자, 에리트로포이에틴, 림포톡신, BCG 백신, 코리네박테리움 파르붐, 레바미솔, 다당류 K, 프로코다졸, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 스파르탈리주맙, 세미플리맙, 아벨루맙, 아테졸리주맙, 더발루맙 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
면역치료제는 면역 관문 억제제일 수 있다. 면역 관문 억제제에 대한 표적 분자의 예는 CTLA-4, PD-1, LAG-3, BTLA, KIR, TIM-3, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HVEM, GAL9, CD160, VISTA, BTNL2, TIGIT, PVR, BTN1A1, BTN2A2, BTN3A2, CSF-1R 등을 포함한다. 면역 관문 억제제의 표적 분자는 CTLA-4, PD-1, 또는 PD-L1일 수 있다. 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙, 트레멜리무맙 등을 포함한다. 항PD-1 항체의 예는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 스파르탈리주맙, 세미플리맙 등을 포함하고, 항PD-L1 항체의 예는 아벨루맙, 아테졸리주맙, 더발루맙 등을 포함한다.
호르몬 치료제의 예는 포스페스트롤, 디에틸스틸베스트롤, 클로로트리아니센, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 클로르마디논 아세테이트, 사이프로테론 아세테이트, 다나졸, 알릴에스트레놀, 게스트리논, 메파트리신, 랄록시펜, 오르멜록시펜, 레보르멜록시펜, 안티에스트로겐(예: 타목시펜 구연산염, 토레미펜 구연산염 등), 알략 제형, 메피티오스탄, 테스토로락톤, 아미노글루테티미드, LH-RH 작용제(예: 고세렐린 아세테이트, 부세렐린, 류프로렐린 등), 드롤록시펜, 에피티오스타놀, 에티닐 에스트라디올 염산염, 아로마타아제 억제제(예: 파드로졸 염산염, 아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄, 보로졸, 포르메스탄 등), 항안드로겐(예: 플루타미드, 비칼루타미드, 닐루타미드 등), 5α-환원효소 억제제(예: 피나스테리드, 에프리스테리드 등), 코르티코스테로이드(예: 덱사메타손, 프레드니솔론, 베타메타손, 트리암시놀론 등), 안드로겐 합성 억제제(예: 아비라테론 등) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 제 1 의약에 사용되는 레티노이드와 암 치료제는 각각의 투여 사이에 일정한 시간 간격을 두고 대상에게 동시 투여되거나 개별적으로 투여될 수 있다. 본 명세서 중 "병용 투여한다"라는 용어는 레티노이드를 적용하는 기간이 암 치료제를 적용하는 기간과 중복되는 것을 의미하며, 동시 투여를 요구하지 않는다. 본 발명의 제 1 의약에 있어서는, 미리 레티노이드의 투여를 개시한 후, 시차를 두고 암 치료제의 투여를 개시하는 것이 바람직하다. 레티노이드 투여 개시부터 암 치료 개시까지의 시차는 특별히 한정되지 않으나, 시차는 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상일 수 있다. 암 치료제의 투여량은 임상적으로 승인된 투여량에 따라 결정될 수 있고, 대상, 대상의 연령 및 체중, 증상, 투여기간, 제형, 투여 방법, 약물의 병용 등에 따라 적절하게 선택된다.
[메플린을 과발현하는 조성물을 유효 성분으로 포함하는 의약]
본 발명은 종양 조직 세포에서 메플린을 과발현하는 조성물을 유효 성분으로 포함하는 암 치료제의 작용 증진용 의약(이하, "본 발명의 제 2 의약"이라 함)을 제공한다. 본 발명의 제 2 의약의 투여 대상은 본 발명의 제 1 의약의 투여 대상과 동일한 암 환자로서, 간질에 CAF가 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자이다. 따라서, 본 발명의 제 2 의약의 투여 대상은 상술한 본 발명의 암 환자를 선별하는 방법에 의해 선별될 수 있다.
종양 조직 세포에서 메플린을 과발현하는 조성물로서는 메플린을 코딩하는 DNA가 발현적으로 삽입된 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하는 조성물을 바람직하게 사용할 수 있다. 메플린을 코딩하는 유전자의 염기서열은 공지된 데이터베이스(NCBI 등)에서 쉽게 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 메플린 유전자(ISLR)의 염기서열의 기탁번호는 NM_201526.2 또는 NM_005545.4이다. 메플린을 발현하는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터는 수득된 인간 메플린 유전자(ISLR)의 뉴클레오티드 서열에 근거하여 공지된 유전공학 기술을 사용하여 준비할 수 있다.
종양 조직 세포에서 메플린을 과발현시키는 조성물을 비바이러스성 벡터 형태로 투여하는 경우, 리포솜을 이용하여 메플린 발현 플라스미드를 도입하는 방법(리포솜법, HVJ-리포솜법, 양이온성 리포솜법, 리포펙션법, 리포펙타민법 등), 미세주입법, 메플린 발현 플라스미드를 유전자 총을 이용하여 담체(금속 입자)와 함께 세포 내로 옮기는 방법 등이 사용될 수 있다. 바이러스 벡터의 형태로 투여되는 경우, 메플린 유전자는 메플린 발현 카세트를 무독화 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 수두 바이러스, 소아마비 바이러스, 신드비스 바이러스, 센다이 바이러스, SV40 바이러스와 같은 DNA 또는 RNA 바이러스로 도입하고 표적 종양을 바이러스 벡터로 감염시킴으로써 도입시킬 수 있다. 메플린 유전자를 포함하는 바이러스 벡터가 본 발명의 제 2 의약의 유효 성분으로서 바람직하다.
종양 조직 세포에서 메플린을 과발현하는 조성물의 투여량은 벡터의 종류, 발현 효율, 종양 크기 등을 고려하여 적절하게 설정하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제 2 의약은 암 치료제의 작용을 증진하기 위한 의약이고, 암 치료제와 병용 투여하는 것이 바람직하다. 병용하는 암 치료제는, 상술한 본 발명의 제 1 의약에 사용하는 암 치료제와 동일하다.
[암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성 억제를 유도하는 제 및 암 치료제의 병용 의약]
본 발명은 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제와 암 치료제(이하, "본 발명의 제 3 의약"이라 함)를 병용 투여하는 암 치료용 의약을 제공한다. 본 발명의 제 3 의약을 투여한 대상은 본 발명의 제 1 의약을 투여한 대상과 동일한 암 환자로서, 간질에 CAF가 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자이다. 따라서, 본 발명의 제 3 의약의 투여 대상은 상술한 본 발명의 암 환자를 선별하는 방법에 의해 선별될 수 있다.
라이실 옥시다제(이하 "LOX"라 함)는 1차 아민 기질을 반응성 알데히드로 산화시키는 구리 함유 아민 옥시다제이다. 라이실 옥시다제는 콜라겐의 펩티딜라이신 및 하이드록실리신 잔기와 엘라스틴의 펩티딜라이신 잔기의 산화적 탈아미노화를 촉매하고 세포외 기질의 형성에 필수적이다. 생성된 펩티딜 알데히드는 세포외 기질의 정상적인 구조적 완전성에 요구되는 라이신 유래 공유 가교를 형성하기 위해 자발적으로 응축되고 산화 반응을 겪는다.
암의 간질에서 LOX 활성의 저지를 유도하는 제제는 LOX를 직접적으로 억제하는 제제 또는 LOX를 간접적으로 억제하는 제제일 수 있다. LOX를 직접적으로 억제하는 제제의 예는 LOX 억제제 및 항-LOX 중화 항체를 포함한다. LOX 억제제의 예는 심투주맙과 같은 WO2011097513에 개시된 항체; GB2064와 같은 WO2016144703에 개시된 화합물; PXS5505, PXS-5446, PXS-6302 등과 같은 WO2020024017에 개시된 화합물; PXS-5120A, PXS-5153A, PXS-5129A와 같은 WO2017136870에 개시된 화합물; WO2017136871에 개시된 아자인돌 할로알릴아민 유도체; WO2018157190에 개시된 할로알릴아민 피라졸 유도체; WO2021012014에 개시된 디플루오로할로알릴아민 유도체; WO2011097513, WO2009017833, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0053224에 개시된 항체 AB-0023; US Pat. No. 4,965,288, US Pat. No. 4,997,854, US Pat. No. 4,943,593, US Pat. No. 5,021,456, US Pat. No. 5059714, US Patent No. 5,120,764, US Patent No. 5,182,297, US Patent No. 5,252,608, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0248871에 개시된 화합물; PXS-5382A, PXS-5033A; PAT-1251(CAS 번호: 2007885-39-2) 등을 포함한다. LOX 억제제는 또한 카르보닐과 결합한 후 공명에 의해 안정화된 생성물을 생성하는 것들을 포함하여 라이실 옥시다제의 활성 부위의 카르보닐기와 반응하는 1차 아민, 예를 들어 다음의 1차 아민을 포함한다: 에틸렌디아민, 히드라진, 페닐히드라진, 및 이들의 유도체, 세미카바지드, 및 우레아 유도체, β-아미노프로피오니트릴(BAPN)과 같은 아미노니트릴, 또는 2-니트로에틸아민, 포화 또는 불포화 할로아민, 예를 들어, 2-브로모-에틸아민, 2-클로로에틸아민, 2-트리플루오로에틸아민, 3- 브로모프로필아민, p-할로벤질아민, 및 셀레노호모시스테인 락톤. 추가의 LOX 억제제는 라이실 옥시다제에 의한 라이실 및 하이드록실리실 잔기의 산화적 탈아민화로부터 유래하는 알데하이드 유도체를 차단하는 화합물과 같은 간접 억제제가 포함되고, 예를 들어 D-페니실라민과 같은 티올아민, 또는 2-아미노-5-메르캅토-5-메틸헥산산, D-2-아미노-3-메틸-3-((2-아세트아미도에틸)디티오)부탄산, p-2-아미노-3-메틸-3-((2-아미노에틸)디티오)부탄산, 나트륨-4-((p-1-디메틸-2-아미노-2-카르복시에틸)디티오)부탄 술피네이트, 2-아세트아미도에틸-2-아세트아미도에탄티올 술파네이트, 나트륨-4-머캅토부탄술피네이트 삼수화물과 같은 이의 유사체를 포함한다.
LOX를 간접적으로 억제하는 제제의 예는 악성 종양의 간질에서 암연관 섬유아세포에서 메플린의 발현을 유도하는 제제를 포함한다. 본 발명자들은 메플린이 LOX 활성을 억제함을 확인하였다(실시예 14 참조). 또한, 본 발명자들은 CAF 유래 세포로 간주되는 췌장 성상세포 및 간엽줄기세포에 대한 레티노이드를 사용한 처치가 메플린 유전자의 발현량을 증가시킨다는 것을 확인하였고(실시예 4 및 5 참조); 췌장암 세포를 피하 이식하여 종양을 형성한 마우스에 레티노이드를 투여하면 종양 내 메플린 유전자의 발현이 유의하게 증가한다는 사실을 확인하였다(실시예 6). 따라서, 본 발명의 제 1 의약에 사용되는 레티노이드는 LOX를 간접적으로 저해하는 제제로서 적합하게 사용할 수 있다. 본 발명의 제 3 의약에 레티노이드를 사용하는 경우, 레티노이드는 본 발명의 제 1 의약과 동일한 방식으로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 제 2 의약의 유효 성분인 종양 조직 세포에서 메플린을 과발현하는 조성물도 LOX를 간접적으로 억제하는 제제로서 적합하게 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하는 조성물에 메플린을 코딩하는 DNA가 발현적으로 삽입된 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명의 제 3 의약으로서 종양 조직 세포에서 메플린을 과발현하는 조성물을 사용하는 경우, 조성물은 본 발명의 제 2 의약과 동일한 방식으로 수행할 수 있다.
LOX는 콜라겐 분자 사이에 가교 활성이 있는 것으로 알려져 있다. 콜라겐 분자의 가교는 콜라겐 섬유의 강도를 증가시키고 조직을 단단하게 하는 것으로 간주된다. 따라서, 암의 간질에서 LOX 기능을 억제하거나 저지하는 것은 암 조직의 경화를 저지하고, 종양 혈관을 확장시키고, 종양에 대한 동시 암 치료제의 전달을 개선하며, 암 치료제의 효과를 증진할 수 있다. 본 발명자들은 이러한 개념을 "간질 컨디셔닝"이라고 지칭하고, 미리 표적 종양에 "간질 컨디셔닝"을 가한 후 암 치료제를 투여함으로써 치료 효과를 증진할 수 있다고 생각한다. 따라서, 본 발명의 제 3 의약에 사용되는 암의 간질에서 LOX 활성의 저지를 유도하는 제제는 "간질 컨디셔닝" 효과를 갖는 의약이라고 할 수 있다.
암의 간질에서 LOX 활성의 저지를 유도하는 본 발명의 제 3 의약에 사용되는 제제는 동시 암 치료제의 작용을 증진하는 의약의 유효 성분이고, 또한 표적 종양 조직에 대한 동시 암 치료제의 전달을 촉진하기 위한 의약의 활성 성분이다. 따라서, 본 발명은 암 치료제의 작용을 증진하기 위한 의약을 포함하고, 여기서 간질에 CAF가 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자가 환자이고 암의 간질에 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제는 유효 성분이다. 또한, 본 발명은 표적 종양 조직에 대한 암 치료제의 전달을 촉진하기 위한 의약을 포함하고, 여기서 간질에 CAF가 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자가 환자이고 암의 간질에서 라이실 옥시다제의 저지를 유도하는 제제는 유효 성분이다.
본 발명의 제 3 의약에 사용되는 암 치료제는, 상술한 본 발명의 제 1 의약에 사용되는 암 치료제와 동일하다.
암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제와 본 발명의 제 3 의약에 사용되는 암 치료제는 각 투여 간 일정한 시간 간격을 두고 대상에게 병용 투여하거나 별도로 투여할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "병용 투여한다"라는 용어는 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제의 기간이 암 치료제의 기간과 중복되는 것을 의미하며, 동시 투여를 요구하지 않는다. 본 발명의 제 3 의약에 있어서, 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제의 투여를 미리 개시한 후, 시간차를 두고 암 치료제의 투여를 개시하는 것이 바람직하다. 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제의 개시와 암 치료제의 개시 사이의 시차는 특별히 한정되지 않으나, 그 시차는 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상일 수 있다.
LOX 억제에 관여하지 않지만 "간질 컨디셔닝" 효과를 갖는 제제의 예는 WO2012012300에 개시된 PEG화 히알루로난 분해 효소 PEGPH20과 같은 히알루로니다제 제제; US20180201640에 개시된 4-메틸움벨리페론 유도체와 같은 히알루론산 합성 억제제; WO2006026430에 개시된 IPI-926(파티데깁, 사리데깁), WO2007131201에 개시된 소니데깁(Odomzo), WO2006028958, US2009005416 PF-04449913(Daurismo)에 개시된 비스모데깁(vismodegib(erivedge), WO2010147917에 개시된 LY-2940680 (탈라데깁), WO2009107850에 개시된 NLM-001, WO2014001464에 개시된 4SC-208과 같은 헤지호그 신호전달 억제제; WO2008009437, WO2009019007, WO2012031773에 개시된 핵산 약물 NOX-A12와 같은 간질 세포 유래 인자 1 억제제; WO2012049277, WO2016157149에 개시된 화합물 USL-311, WO2018011376에 개시된 화합물 LIT-927; WO2013048164에 개시된 화합물 IDF-11774, WO2005007828에 개시된 화합물 PX-478과 같은 저산소증 유도성 인자 1-알파 억제제; 및 WO2015035223에 개시된 화합물 PT-2977(벨주티판)과 같은 저산소증 유도성 인자 2-알파 억제제를 포함한다. 본 발명은 또한 LOX 억제가 없는 "간질 컨디셔닝" 효과를 갖는 제제와 암 치료제의 이러한 병용 의약을 포함한다.
본 발명은 이하의 각 발명을 포함한다.
(1) 상기 언급된 본 발명에 따른 방법에 의해 선별된 암 환자에게 레티노이드와 암 치료제를 병용 투여하는 의약.
(2) 상기 본 발명에 따른 암 환자를 선별하는 방법에 의해 선별된 암 환자에게 간질 내 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제와 암 치료제를 병용 투여하는, 암을 치료하는 방법.
(3) 상기 언급된 본 발명에 따른 암 환자를 선별하는 방법에 의해 선별되고 암 치료제를 받는 환자에게 레티노이드, 종양 조직 세포에서 메플린을 과발현하는 조성물, 또는 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제를 투여하는, 암 치료제의 작용을 증진하는 방법.
(4) 상기 언급된 본 발명에 따른 암 환자를 선별하는 방법에 의해 선별되고 암 치료제를 받는 환자에게 레티노이드 또는 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제를 병용 투여하는, 표적 종양 조직에 대한 암 치료제의 전달을 촉진하는 방법.
(5) 암 치료제의 제조를 위한 레티노이드 또는 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제의 사용으로서, 대상이 상기 언급된 본 발명에 따른 암 환자를 선별하는 방법에 의해 선별되고 암 치료제를 받는 환자인 사용.
(6) 암 치료제의 작용을 증진하는 제제의 제조를 위한 레티노이드, 종양 조직 세포에서 메플린을 과발현하는 조성물, 또는 암 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제의 사용으로서, 대상이 상기 언급된 본 발명에 따른 암 환자를 선별하는 방법에 의해 선별되고 암 치료제를 받는 환자인 사용.
(7) 표적 종양 조직에 대한 암 치료제의 전달을 촉진하기 위한 제제의 제조를 위한 레티노이드 또는 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제의 사용으로서, 대상이 상기 언급된 본 발명에 따른 암 환자를 선별하는 방법에 의해 선별되고 암 치료제를 받는 환자인 사용.
(8) 레티노이드 및 암 치료제를 포함하는 암 치료용 키트로서, 레티노이드와 암 치료제가 별도의 용기에 담겨 있고, 암 환자는 상기 언급된 본 발명에 따른 암 환자를 선별하는 방법에 의해 선별되는 키트.
(9) 암 요법에 사용되는 레티노이드로서, 환자가 상기 언급된 본 발명에 따른 암 환자를 선별하는 방법에 의해 선별되고 암 치료제를 받는, 레티노이드.
(10) 암 요법에 사용되는 암의 간질에 라이실 옥시다제의 저지를 유도하는 제제로서, 환자는 상기 언급된 본 발명에 따른 암 환자를 선별하는 방법에 의해 선별되고 암 치료제를 받는, 제제.
(11) 암 치료제의 작용을 증진하기 위한, 레티노이드, 종양 조직 세포에서 메플린을 과발현하는 조성물, 또는 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제의 사용으로서, 환자는 상기 언급된 본 발명에 따른 암 환자를 선별하는 방법에 의해 선별되고 암 치료제를 받는, 사용.
(12) 표적 종양 조직에 대한 암 치료제의 전달을 촉진하기 위한, 레티노이드 또는 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제의 사용으로서, 환자는 상기 언급된 본 발명에 따른 암 환자를 선별하는 방법에 의해 선별되고 암 치료제를 받는, 사용.
[실시예]
이하, 본 발명은 실시예에 따라 구체적으로 설명되나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
[실시예 1: 간질에 CAF가 침윤된 악성 종양의 HE 염색에 의한 판별]
수술 또는 생검에 의해 수득한 종양 조직으로부터 통상적인 방법에 따라 조직 표본을 준비하고 HE 염색을 수행한다. 병리학자는 현미경으로 HE 염색 표본을 검사하고 형태학적으로 CAF의 유무를 결정한다.
도 1 내지 4는 수술 표본에서 간질에 CAF가 침윤된 췌장 종양의 예를 나타낸다. 도 1은 역형성 암, 도 2는 유두내 점액성 선암종, 도 3 및 4는 관상선암이다. 도 1 내지 4에서 화살표는 CAF의 위치를 나타낸다. 또한, 수술 표본에서 간질에 CAF가 침윤된 췌장 종양의 예는 도 5 내지 14에 나타나 있다. 도 5 및 6은 샘암종, 도 7은 췌내 유두 점액선종(비침습성 암), 도 8은 췌내 유두 점액선종(IPMA), 및 도 9는 점액낭종 종양이다. 도 10은 신경내분비 종양(G1, 인슐린종), 도 11은 신경내분비 종양(G1, 가스트린종), 도 12는 췌장상피내 신생물 병변(PanIN), 도 13은 장액낭종선종, 및 도 14는 가유두종양(SPN)이다. 어떤 도면에서든 현미경의 배율은 위쪽 행이 100x, 아래쪽 행이 200x이다.
도 15 내지 17은 생검 표본의 간질에 CAF가 침윤된 췌장 종양의 예를 나타낸다. 도 15는 관형 선암종, 도 16은 역형성 암, 및 도 17은 관내 유두 점막 선암종(침습성 암)이다. 또한, 생검 표본에서 간질에 CAF가 침윤되지 않은 췌장 종양의 예는 도 18 내지 21에 나타나 있다. 도 18은 포상 세포 암종, 도 19는 고형 가유두 종양(SPN), 도 20은 신경내분비 종양, 및 도 21은 관내 유두 점액선종(IPMA)이다. 어떤 도면에서든 현미경의 배율은 위쪽 행이 100x, 아래쪽 행이 200x이다.
[실시예 2: 간질에 CAF가 침윤된 악성 종양의 IHC 또는 ISH에 의한 판별]
수술 또는 생검을 통해 수득한 종양 조직으로부터 준비된 조직 표본에 CAF의 표지자 분자의 mRNA에 혼성화하는 프로브를 사용하여 CAF 또는 ISH의 표지자 분자에 대한 항체를 사용하여 IHC가 수행된다. 양성 신호의 유무는 현미경 관찰에 의해 결정된다. 본 실시예에서 메플린은 CAF의 표지자 분자로 채택되고, 항메플린 항체를 이용한 IHC와 메플린 유전자의 mRNA에 혼성화하는 프로브를 이용한 ISH가 수행된다.
도 22 및 23은 메플린 양성 췌장 종양의 예를 나타내고, 도 24는 메플린 음성 췌장 종양의 예를 나타낸다. 모든 도면은 동일한 샘플에 대해 IHC와 ISH를 수행하여 수득한 이미지이고, 고배율은 고배율 필드(400x)이다. 도 22 및 23에서 화살표는 양성 세포의 위치를 나타낸다. 도 24의 IHC 고배율 이미지에서 깊게 염색된 둥근 세포는 괴사 세포에 대한 비특이적 반응이다.
[실시예 3: 간질에 CAF가 침윤된 악성 종양의 종양 수축의 효과]
(1) 실험 방법
인간 췌장암 세포 BxPC-3(1.0 x 106 세포)을 BALB/c-nu 암컷 누드 마우스에 피하 이식하여 암세포 단일 이식군을 형성한다. 또한, 인간 췌장암 세포 BxPC-3(1.0 x 106 세포) 및 인간 췌장 성상세포(5.0 x 106 세포)를 BALB/c-nu 암컷 누드 마우스에 피하 이식하여 공동 이식군을 형성한다. 췌장 성상세포는 췌장 섬유아세포이고 CAF의 기원 세포로 간주된다. 암세포 단일 이식군과 공동 이식군은 각각 젬시타빈(Gem) 및 타미바로텐(AM80) 투여군(Gem + AM80군)과 Gem 및 DMSO 투여군(Gem + DMSO군)의 두 군으로 나뉜다. AM80(3.0 mg/kg) 또는 DMSO를 이식 후 3일차부터 14일차까지 매일 경구 투여한다. Gem(50 mg/kg)은 이식 후 6일차부터 3일에 1회 복강내 투여한다. 종양 체적은 이식 15일 후에 측정된다. 프로토콜은 도 25에 나타나 있다.
(2) 결과
결과는 도 26에 나타나 있다. (A)는 암세포 단일 이식군의 결과이고, (B)는 공동 이식군의 결과이다. 암세포 단일 이식군에서는 Gem + AM80군과 Gem + DMSO 군 간에 유의한 차이가 관찰되지 않는다. 공동 이식군에서는 Gem + AM80군에서 유의한 감소 효과를 수득한다. 이 결과는 AM80이 간질에 CAF가 침윤된 악성 종양에서 항암제의 종양 수축 효과를 증진한다는 것을 보여준다.
[실시예 4: 레티노이드에 의한 재프로그래밍이 인간 췌장 성상세포 및 마우스 중간엽 줄기세포에 미치는 영향]
(1) 실험 방법
사용된 1차 인간 췌장 성상세포는 토호쿠대학, Dr. 마사무네가 제공한 것이다. 사용된 1차 마우스 중간엽 줄기세포는 Cyagen Co., Ltd.에서 구입한 것이다. 췌장 성상세포와 중간엽 줄기세포는 모두 CAF의 기원으로 간주된다. 레티노이드로서는, SCREEN-WELL Nuclear Receptor 리간드 라이브러리(ENZO)에 함유된 레티노이드를 사용한다. DMEM + 10% FBS를 배양 배지로 사용한다. 세포를 콜라겐이 코팅된 접시에 파종하고 100% 합류까지 배양한 다음, 다양한 레티노이드를 1 μM의 농도로 첨가한다. 48시간 후, 세포를 수확하고, RNeasyPLUS KIT(QIAGEN)을 사용하여 RNA를 추출하고, ReverseTra Ace qPCR RT Master Mix(TOYOBO)를 사용하여 cDNA를 합성한다. 메플린 유전자(ISLR 및 Islr)의 발현량은 유전자 발현 분석(Thermo Fisher Scientific)을 사용하는 qPCR에 의해 측정된다.
(2) 결과
1차 인간 췌장 성상세포의 결과는 표 1에 나타나 있다. ISLR 발현량은 대조군(DMSO 처리 세포)의 ISLR 발현량이 1일 때 상대적인 발현량으로 나타낸다. 사용된 모든 레티노이드는 ISLR 발현량을 증가시킨다. 여기서, 종양 촉진 CAF의 표지자는 αSMA(유전자명: ACTA2), 종양 저지 CAF에 대한 표지자는 메플린(유전자 이름: ISLR)이고, CAF에서 두 표지자의 발현량은 반비례한다. 따라서, 이 결과는 레티노이드가 인간 종양 촉진 CAF를 종양 억제 CAF로 재프로그래밍한다는 것을 보여준다.
[표 1]
Figure pct00001
1차 마우스 중간엽 줄기세포의 결과는 표 2에 나타나 있다. Islr 발현량은 대조군(DMSO 처리 세포)의 Islr 발현량이 1일 때 상대적인 발현량으로 나타낸다. 사용된 모든 레티노이드는 Islr 발현을 증가시킨다. 여기서, 종양 촉진 CAF의 표지자는 αSMA(유전자명: Acta2), 종양 억제 CAF에 대한 표지자는 메플린(유전자 이름: Islr)이고, CAF에서 두 표지자의 발현량은 반비례한다. 따라서, 이 결과는 레티노이드가 마우스 종양 촉진 CAF를 종양 억제 CAF로 재프로그래밍한다는 것을 보여준다.
[표 2]
Figure pct00002
[실시예 5: 레티노이드에 의한 재프로그래밍이 마우스 중간엽 줄기세포에 미치는 영향]
(1) 실험 방법
실시예 4의 1차 마우스 중간엽 줄기세포를 이용한 실험과 동일한 방법으로 수행한다. ATRA, AM80, 및 AM580을 레티노이드로 사용한다. 메플린 유전자(Islr), 액틴 유전자(Acta2), I형 콜라겐 유전자(Col1a1), 및 III형 콜라겐 유전자(Col3a1)의 발현량은 qPCR에 의해 측정된다.
(2) 결과
결과는 도 27에 나타나 있다. (A)는 메플린 유전자(Islr)의 결과, (B)는 액틴 유전자(Acta2)의 결과, (C)는 I형 콜라겐 유전자(Col1a1)의 결과, 그리고 (D)는 III형 콜라겐 유전자(Col3a1)의 결과이다. 대조군(DMSO)에서 Acta2, Col1a1, 및 Col3a1의 발현량은 높고, Islr의 발현량은 낮다. 한편, 레티노이드(ATRA, AM80, 및 AM580) 처리군에서는 Islr의 발현량이 높고 Acta2, Col1a1, Col3a1의 발현량이 낮다. 이 결과는 종양 촉진 CAF가 레티노이드에 의해 종양 억제 CAF로 재프로그래밍된다는 것을 보여준다.
[실시예 6: 타미바로텐(AM80)이 마우스 췌장암 세포에 대해 미치는 효과]
(1) 실험 방법
Cold Spring Harbor Laboratory, Dr. 데이비드 튜브슨이 배포한 췌장암 세포 mT5가 사용된다. mT5는 췌장암 자연발생 발병 모델(인간 및 마우스 췌관암의 오르가노이드 모델. Cell. 2015 Jan 15; 160 (1-2)): 324-38. Doi: 10.1016/j. cell. 2014.12.021. Epub 2014 Dec 31.)인 KPC 마우스에서 개발된 췌장 종양으로부터 확립된 췌장암 세포이다.
C57BL/6J 암컷 마우스에 마우스 췌장암 세포 mT5(1.0 x 106 세포)를 피하 이식한다. 8일 후(8일차), AM80을 종양 형성이 확인된 마우스에 15일 동안 경구 투여한다. AM80의 용량(0.1 mg/kg/일, 0.5 mg/kg/일, 1 mg/kg/일, 3mg/kg/일)에 따라, 총 5개의 군, 즉 4개의 AM80 투여군과 1개의 대조군(DMSO 투여)이 설정된다(각 군에서 n = 5). 체중 및 종양 체적을 AM80 투여 개시 전(8일차), 11일차, 15일차, 18일차, 및 22일차에 측정한다. 22일에 마우스를 안락사시키고 종양을 제거하여 조직 표본을 준비하고, 제자리 혼성화(ISH)를 수행하여 메플린 유전자(Islr) 및 액틴 유전자(Acta2)의 발현을 검출한 후 양성 신호의 수를 각각 계산한다. 또한, 종양의 조직 표본을 준비하고 항CD31 항체로 면역염색을 수행하여 혈관 내피 세포의 표지자인 CD31을 염색하고, 혈관 내강 면적을 측정한다. 프로토콜은 도 28에 나타나 있다.
(2) 결과
(2-1) 종양 체적
종양 체적의 경향은 도 29에 나타나 있다. 군간에 유의미한 차이는 없고, AM80의 어떤 농도의 투여도 췌장암 세포의 성장을 저지하지 않는다. 또한, AM80의 투여는 마우스의 체중에 영향을 미치지 않는다.
(2-2) 종양에서 메플린 유전자(Islr)의 발현
종양 표본에서 Islr 발현의 ISH 검출의 결과는 도 30에 나타나 있다. (A)는 대조군의 대표적인 현미경 이미지, (B)는 AM80 3 mg/kg/day군의 대표적인 현미경 이미지, (C)는 대조군의 고배율 필드(400x) 및 AM80군의 3 mg/kg/일 당 Islr 양성 신호의 도트 수를 비교한 그림이다. 억제성 CAF의 표지자인 Islr의 발현은 AM80의 투여에 의해 증가하고, AM80 3 mg/kg/일 군에서 Islr 양성 신호의 도트 수는 대조군보다 유의하게 더 높다.
(2-3) 종양에서 액틴 유전자(Acta2)의 발현
종양 표본에서 Acta2-발현 세포의 ISH 검출 결과는 도 31에 나타나 있다. (A)는 대조군의 대표적인 현미경 이미지이고, (B)는 AM80 3 mg/kg/일 군의 대표적인 현미경 이미지이며, (C)는 대조군과 AM80 3 mg/kg/일 군 사이의 고배율 필드(400x) 당 Islr 양성 신호의 도트 수를 비교한 그림이다. CAF 촉진 표지자인 Acta2의 발현은 AM80의 투여에 의해 감소하고, AM80 3 mg/kg/일 군에서 Acta2 양성 신호의 도트 수는 대조군보다 유의하게 낮다.
(2-4) 항CD31 항체에 의한 종양 표본의 면역염색
항CD31 항체를 사용한 종양 표본의 면역염색의 결과는 도 32에 나타나 있다. (A)는 대조군의 대표적인 현미경 이미지이고, (B)는 AM80 3 mg/kg/일 군의 대표적인 현미경 이미지이며, (C)는 대조군과 3 mg/kg/일 AM80군 사이의 혈관 내강 면적을 비교한 그림이다. AM80 3 mg/kg/일 군의 혈관 내강 면적은 대조군보다 유의하게 높다.
(2-5) 요약
C57BL/6J 암컷 마우스에서 마우스 췌장암 mT5 세포의 피하 이식에 의해 형성된 종양은 CAF의 표지자인 Islr 또는 Acta2를 발현하기 때문에, 간질에 CAF가 침윤된 악성 종양으로 판단된다. 실시예 6의 결과는 암을 촉진하는 CAF(대조군, Acta2 양성)의 존재하에서 간질압이 높고 혈관이 압력에 의해 짓눌린 것으로 간주됨을 보여준다. AM80 처치가 종양 저지 CAF(Islr 양성)를 재프로그래밍하면 콜라겐 생성 등이 변화하고 간질 리모델링이 일어나 간질압의 감소로 인해 짓눌린 혈관이 열리게 된다.
[실시예 7: 타미바로텐과 젬시타빈의 병용이 마우스 췌장암 세포에 미치는 효과]
(1) 실험 방법
C57BL/6J 암컷 마우스에 마우스 췌장암 세포 mT5(1.0 x 106 세포)를 피하 이식한다. 8일 후(8일차), 마우스를 대조군, 젬시타빈 투여군(Gem 군), 젬시타빈 및 타미바로텐 투여군(Gem + AM80 군)의 3개의 군으로 나누어 동등한 종양 체적을 보장한다(각 군에서 n = 8). Gem + AM80 군에서 타미바로텐(3.0 mg/kg)을 8일째부터 17일 동안 1일 1회 경구 투여한다. 또한, Gem 군과 Gem + AM80 군에서 젬시타빈(50mg/kg)을 15일차, 18일차, 및 21일차에 각각 1회 복강 내 투여한다. 대조군에서는 타미바로텐 대신 DMSO를 경구투여하고, 젬시타빈 대신 식염수를 복강내 투여한다. 종양 체적을 AM80 투여 개시 전(8일차), 12일차, 15일차, 18일차, 21일차, 및 24일차에 측정한다. 프로토콜은 도 33에 나타나 있다.
(2) 결과
결과는 도 34에 나타나 있다. 도 34는 Gem 군이 대조군보다 종양 성장을 더 유의하게 저지하고, Gem + AM80 군이 Gem 군보다 종양 성장을 더 유의하게 저지함을 나타낸다. 이 결과는 타미바로텐이 젬시타빈의 종양 성장 억제 효과를 유의하게 증진한다는 것을 보여준다.
[실시예 8: 타미바로텐, 젬시타빈, 및 냅-파클리탁셀의 병용이 인간 췌장암 세포에 대해 미치는 효과]
(1) 실험 방법
BALB/c-nu 암컷 누드 마우스에 인간 췌장암 세포 BxPC-3(1.0 x 106 세포)을 피하 이식한다. 종양 체적이 50 내지 150 mm3에 도달하면 마우스를 대조군, 젬시타빈 및 냅-파클리탁셀 투여군(Gem + nabPTX 군), 및 젬시타빈 + 냅-파클리탁셀 및 타미바로텐 투여군(Gem + nabPTX + AM80 군)의 3개의 군으로 나누어 동등한 종양 체적을 보장한다(각 군에서 n = 7). Gem + nabPTX + AM80 군에서 타미바로텐(3.0 mg/kg)을 군집화일(1일차)로부터 17일 동안 1일 1회 경구 투여한다. Gem + nabPTX 군 및 Gem + nabPTX + AM80 군에서 젬시타빈(50 mg/kg)을 7일차, 10일차, 및 13일차에 각각 1회 복강 내 투여하고, 냅-파클리탁셀(5 mg/kg)을 7일차, 10일차, 및 13일차에 각각 1회 정맥 내 투여한다. 대조군에서는 타미바로텐 대신 DMSO를 경구 투여하고, 젬시타빈 대신 식염수를 복강 내 투여하며, 냅-파클리탁셀 대신 식염수를 정맥 내 투여한다. 종양 체적을 AM80 투여 개시 전(1일차), 4일차, 7일차, 10일차, 13일차 및 16일차에 측정한다. 프로토콜은 도 35에 나타나 있다.
(2) 결과
결과는 도 36에 나타나 있다. 도 36은 Gem + nabPTX 군이 대조군보다 종양 성장을 더 유의하게 저지하고, Gem + nabPTX + AM80 군이 Gem + nabPTX 군보다 종양 성장을 더 유의하게 저지한다는 것을 나타낸다. 이 결과는 타미바로텐이 젬시타빈과 냅-파클리탁셀의 병용의 종양 성장 억제 효과를 더욱 유의하게 증진한다는 것을 보여준다.
[실시예 9: 마우스 자연발생 췌장암 발병 모델(KPC 마우스)에서 타미바로텐과 젬시타빈의 병용 효과]
(1) 실험 방법
타미바로텐(3.0 mg/kg)을 자연발생 췌장암 마우스 모델(KPC마우스)에서 복부 초음파촬영으로 췌장종양의 길이가 1mm 이상으로 확인된 시점(1일차)부터 17일 동안 1일 1회 경구 투여한다) (S. R. Hingorani et al., Trp53R172H 및 KrasG12D는 협력하여 마우스에서 염색체 불안정성과 광범위하게 전이된 췌관 선암종을 촉진한다. Cancer Cell 7, 469-483(2005)). 젬시타빈 및 타미바로텐 투여군(Gem + AM80 군, n = 5)에서 젬시타빈(50 mg/kg)을 7일차, 10일차, 및 13일차에 각각 1회 복강 내 투여한다. 대조군(Gem군, n=5)에서, 젬시타빈(50 mg/kg)을 7일차, 10일차, 13일차에 각각 1회 복강 내 투여하지만 타미바로텐은 투여하지 않는다. 종양 장축을 AM80 투여 개시 전(1일차), 8일차, 15일차, 및 22일차에 측정한다. 프로토콜은 도 37에 나타나 있다.
(2) 결과
결과는 도 38에 나타나 있다. 도 38은 Gem + AM80 군이 대조군(Gem 군)보다 종양 성장을 더 유의하게 저지하는 것을 나타낸다. KPC 마우스는 CAF의 침윤으로 더 풍부한 간질을 가지고 인간 췌장 종양에 가장 가까운 마우스 모델이다. 타미바로텐은 또한 이 자연발생 발병 모델에서 젬시타빈의 종양 성장 억제 효과를 유의하게 증진하는 것으로 나타난다.
[실시예 10: 마우스 자연발생 췌장암 발병 모델(KPC 마우스)에서 타미바로텐과 면역 관문 억제제의 병용의 효과]
(1) 실험 방법
젬시타빈 대신 항PD1 항체 또는 항PDL1 항체를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 9와 동일한 방식으로 실험을 수행한다. 그 결과, 타미바로텐과 항PD1 항체 또는 항PDL1 항체의 병용군이 대조군(항PD1 항체 단일 투여군 또는 항PDL1 항체 단일 투여군)보다 종양 성장을 더 유의하게 저지한다.
[실시예 11: 메플린 결핍 마우스에서 타미바로텐과 젬시타빈의 병용의 효과]
(1) 실험 방법
메플린 결핍 마우스(Maeda K. et al., Sci Rep. 2016 Feb 29;6:22288. doi: 10.1038/srep22288.)에 마우스 췌장암 세포 mT5(1.0 x 106 세포)를 피하 이식한다. 8일 후(8일차), 마우스를 젬시타빈 단일 투여군(Gem 군, n = 6)과 젬시타빈 및 타미바로텐 투여군(Gem + AM80 군, n = 6)의 두 군으로 나누어 동일한 종양을 보장한다. Gem + AM80 군에서 타미바로텐(3.0 mg/kg)을 8일째부터 17일 동안 1일 1회 경구 투여한다. Gem + AM80 군에서 타미바로텐(3.0 mg/kg)을 8일째부터 17일 동안 1일 1회 경구 투여한다. Gem 군 및 Gem + AM80 군에서 젬시타빈(50mg/kg)을 15일차, 18일차, 및 21일차에 각각 1회 복강 내 투여한다. 체중 및 종양 체적을 AM80 투여 개시 전(8일차), 12일차, 15일차, 18일차, 21일차, 및 24일차에 측정한다. 24일차에 마우스를 안락사시키고, 종양을 제거하여 조직 표본을 준비하고, 제자리 혼성화(ISH)를 수행하여 액틴 유전자(Acta2)의 발현을 검출한 후 양성 신호의 수를 각각 계산한다. 프로토콜은 도 39에 나타나 있다.
(2) 결과
(2-1) 종양 체적
종양 체적의 경향은 도 40에 나타나 있다. 두 군 사이에 유의미한 차이는 없고, 젬시타빈과 타미바로텐의 병용은 메플린 결핍 마우스에 이식된 췌장암 세포의 성장을 저지하지 않는다. 또한 두 군 사이의 체중에도 유의미한 차이가 없다.
(2-2) 종양에서 액틴 유전자(Acta2)의 발현
종양 표본에서 Acta2-발현 세포의 ISH 검출의 결과는 도 41에 나타나 있다. (A)는 Gem 군의 대표적인 현미경 이미지이고, (B)는 Gem + AM80 군의 대표적인 현미경 이미지이며, (C)는 두 군 사이의 고배율(400x) 당 Acta2 양성 신호의 도트 수를 비교한 그림이다. 두 군 사이에 양성 신호의 도트 수에는 차이가 관찰되지 않는다. 이 결과는 타미바로텐이 메플린을 통해 동시 암 치료제의 효과를 증진한다는 것을 보여준다.
[실시예 12: 메플린 과발현 종양의 준비]
(1) 실험 방법
C57BL/6J 암컷 마우스에 마우스 췌장암 세포 mT5(1.0 x 106 세포)를 피하 이식한다. 종양 체적이 50 내지 100 mm3에 도달하면, 마우스를 두 군으로 나누어 동등한 종양 체적을 보장한다(각 군에서 n = 7). 감염된 세포에서 메플린을 과발현하는 센다이 바이러스(SeV-Meflin) 및 감염된 세포에서 GFP를 과발현하는 센다이 바이러스(SeV-GFP)를 군집화일(1일차), 5일차, 및 9일차에 각각 종양내 투여한다. 17일차에 종양 체적을 측정한 후, 마우스를 안락사시키고 종양을 제거하여 조직 표본을 준비하고, 제자리 혼성화(ISH)를 수행하여 메플린 유전자(Islr)의 발현을 검출한다. 프로토콜은 도 42에 나타나 있다.
(2) 결과
ISH의 결과는 도 43에 나타나 있다. (A)는 SeV-GFP 군의 대표적인 현미경 이미지이고, (B)는 SeV-Meflin 군의 대표적인 현미경 이미지이다. 메플린은 SeV-Meflin 군에서 과발현된다. 종양 체적의 경향은 도 44에 나타나 있다. 두 군 사이에는 유의한 차이가 없다.
[실시예 13: 메플린 과발현 종양에서 젬시타빈의 효과]
(1) 실험 방법
C57BL/6J 암컷 마우스에 마우스 췌장암 세포 mT5(1.0 x 106 세포)를 피하 이식한다. 종양 체적이 50 내지 100 mm3에 도달하면 마우스를 두 군으로 나누어 동등한 종양 체적을 보장한다(각 군에서 n = 8). 감염된 세포에서 메플린을 과발현하는 센다이 바이러스(SeV-Meflin) 및 감염된 세포에서 GFP를 과발현하는 센다이 바이러스(SeV-GFP)를 군집화일(1일차), 5일차, 및 9일차에 각각 종양내 투여한다. 또한, 젬시타빈(50mg/kg)을 5일차, 8일차, 11일차, 및 14일차에 각각 1회 복강 내 투여한다. 종양 체적은 17일차에 측정된다. 프로토콜은 도 45에 나타나 있다.
(2) 결과
결과는 도 46에 나타나 있다. SeV-Meflin 군에 대한 젬시타빈의 투여는 SeV-GFP 군에 대한 젬시타빈의 투여보다 종양 성장을 더 유의하게 저지한다. 이 결과는 종양에 메플린 유전자를 도입하고 메플린을 과발현함으로써 항암제의 효과가 증진된다는 것을 보여준다.
본 발명의 기술적 개념에 따라 암 환자를 선별할 때, 타미바로텐 이외의 레티노이드는 젬시타빈과 병용시 유사한 효과를 나타낸다. 또한, 타미바로텐은 젬시타빈 이외의 암 치료제와 병용할 때 유사한 효과를 나타낸다. 또한, 타미바로텐 이외의 레티노이드는 젬시타빈 이외의 암 치료제와 병용하여 유사한 효과를 나타낸다. 이러한 효과는 위의 실시예에 따라 쉽게 확인할 수 있다.
[실시예 14: 메플린의 기능 분석, 파트 1]
(1) 실험 방법
대조군 Flp-In-293 세포 또는 마우스 메플린을 안정적으로 발현하는 세포(각각 대조군 조건 배지 또는 메플린 조건 배지라 함)의 배양 상청액을 수집한다. 그런 다음 각 조건 배지를 표시된 농도의 재조합 인간 LoxL2와 혼합하고, LOX 활성 분석 키트(Abcam, ab112139)를 사용하여 LOX 활성을 정량화한다. 재조합 LOX는 활성이 없기 때문에 LOXL2를 사용한다.
(2) 결과
결과는 도 47에 나타나 있다. 이 결과는 메플린이 LOX 활성을 유의하게 억제함을 보여준다.
[실시예 15: 메플린의 기능 분석, 파트 2]
(1) 실험 방법
마우스 자연발생 췌장암 발병 모델인 KPC 마우스(야생형) 및 메플린 결핍 KPC 마우스(Maeda K. et al. 중간엽 간질세포의 잠재적인 표지자로서의 메플린의 식별. Sci Rep 2016;6:22288.)를 사용한다(각 군에서 n = 6). 종양 사멸 직전의 마우스(15 내지 24주령)를 안락사시키고 췌장을 제거하여 종양의 조직 표본을 준비한다. 종양 조직 표본에서 무작위로 8 내지 16개의 이미지를 선택하고, 이차고조파 현미경으로 콜라겐 정렬을 측정하고, 곡률 계수를 계산하여 콜라겐의 직선성을 분석한다.
(2) 결과
결과는 도 48에 나타나 있다. (A)는 야생형 KPC군의 대표적인 이차고조파 현미경 이미지이고, (B)는 메플린 결핍 KPC군의 대표적인 이차고조파 현미경 이미지이며, (C)는 N이 관찰 필드의 수인 양 군 사이의 곡률(직선성)을 비교한 그림이다.
[실시예 16: 종양의 간질에서 콜라겐이 타미바로텐에 미치는 효과]
(1) 실험 방법
C57BL/6J 암컷 마우스에 마우스 췌장암 세포 mT5(1.0 x 106 세포)를 피하 이식한다. 8일 후(8일차), 마우스를 대조군과 타미바로텐 투여군(AM80군)의 두 군으로 나누어 동등한 종양 체적을 보장한다(각 군에서 n = 5). AM80군에서는 8일차부터 7일간 1일 1회 타미바로텐(3.0 mg/kg)을 경구 투여한다. 대조군에서는 타미바로텐 대신 DMSO를 경구 투여한다. 15일차에 마우스를 안락사시키고 종양을 제거하여 조직 표본을 준비한다. 종양 조직 표본에서 무작위로 8 내지 16개의 이미지를 선택하고 이차고조파 현미경으로 콜라겐 배열을 측정하고 곡률(직선성)을 분석한다.
(2) 결과
결과는 도 49에 나타나 있다. (A)는 대조군의 대표적인 이차고조파 현미경 관찰 이미지이고, (B)는 AM80군의 대표적인 이차고조파 현미경 관찰 이미지이며, (C)는 두 군 사이의 콜라겐의 곡률(직선성)을 비교한 그림이다. 이 결과는 대조군에서 콜라겐의 직선성이 유의하게 증가한다는 것을 보여준다. 결과는 AM80군에서 타미바로텐의 투여가 CAF에서 메플린의 발현을 유도하고 간질에서 LOX 활성을 억제하여 콜라겐의 직선성을 감소시킴을 시사한다.
[실시예 17: 타미바로텐 및 젬시타빈 투여 시기에 따른 효과 조사]
(1) 실험 방법
C57BL/6J 암컷 마우스에 마우스 췌장암 세포 mT5(1.0 x 106 세포)를 피하 이식한다. 8일 후(8일차), 마우스를 젬시타빈 단일 투여군(Gem 군), 타미바로텐 사전 투여 및 젬시타빈 투여군(AM80 사전 투여 + Gem 군), 및 타미바로텐 사전/공동 투여 및 젬시타빈 투여군(AM80 사전/공동 투여 + Gem 군)의 3개의 군으로 나누어 동등한 종양 체적을 보장한다(각 군에서 n = 5). 타미바로텐의 사전투여에서는 타미바로텐(3.0 mg/kg)을 8일차부터 7일간 1일 1회 경구 투여한다. 타미바로텐 공동 투여에서는 타미바로텐(3.0 mg/kg)을 15일차부터 10일 동안 1일 1회 경구 투여한다. 젬시타빈(50 mg/kg)을 15일차, 18일차, 및 21일차에 각각 1회 복강 내 투여한다. 타미바로텐이 없는 마우스(Gem 군)에서 DMSO를 타미바로텐의 사전/공동 투여와 같은 날에 경구 투여한다. 종양 체적은 AM80 투여 개시 전(8일차), 12일차, 15일차, 18일차, 21일차, 및 24일차에 측정된다. 프로토콜은 도 50에 나타나 있다.
(2) 결과
종양 체적의 경향은 도 51에 나타나 있다. 이 결과는 AM80 사전 투여 + Gem 군이 AM80 사전/공동 투여 + Gem 군과 동일한 정도로 종양 성장을 저지함을 보여준다.
[실시예 18: 타미바로텐, 젬시타빈, 및 면역 관문 억제제 병용의 효과]
(1) 실험 방법
C57BL/6J 암컷 마우스에 마우스 췌장암 세포 mT5(1.0 x 106 세포)를 피하 이식한다. 8일 후(8일차), 마우스를 항PD-L1 항체 투여군(PDL1 군)과 항PD-L1 항체 및 타미바로텐 투여군(PDL1 + AM80 군)의 두 군으로 나누어 동등한 종양 체적을 보장한다(각 군에서 n = 7). 군집화일을 1일차로 지정하고, 타미바로텐(3 mg/kg)을 1일차로부터 7일동안 1일 1회 경구 투여한다. 젬시타빈(100 mg/kg)을 7일차에 복강 내 투여하고 항 PD-L1 항체(10F.9G2)를 8일차, 10일차, 12일차, 14일차, 16일차, 18일차에 250 μg/마우스로 복강 내 투여한다. 종양 체적은 1일차, 4일차, 및 7일차부터 27일차까지 격일로 측정된다. 프로토콜은 도 52에 나타나 있다. 또한, 모든 마우스가 죽을 때까지의 생존율이 결정된다.
(2) 결과
종양 체적의 경향은 도 53에 나타나 있다. 이 결과는 PDL1 + AM80 군이 PDL1 군에 비해 종양 성장을 유의하게 저지한다는 것을 보여준다. 생존율의 경향은 도 54에 나타나 있다. 이 결과는 PDL1 + AM80 군이 PDL1 군에 비해 생존 기간이 유의하게 연장되었음을 보여준다.
[실시예 19: 타미바로텐과 면역 관문 억제제의 병용의 효과]
(1) 실험 방법
C57BL/6J 암컷 마우스에 마우스 췌장암 세포 mT5(1.0 x 106 세포)를 피하 이식한다. 8일 후(8일차), 마우스를 대조군, 항PD-L1 항체 투여군(PDL1 군), 및 항PD-L1 항체 및 타미바로텐 투여군(PDL1 + AM80 군)의 3개의 군으로 나누어 동등한 종양 체적을 보장한다(각 군에서 n = 7). 군집화일을 1일차로 지정하고, 타미바로텐(3 mg/kg)을 1일차로부터 7일동안 1일 1회 경구 투여한다. 항PD-L1 항체(10F.9G2)를 8일차, 10일차, 12일차, 14일차, 16일차, 및 18일차에 250㎍/마우스로 복강 내 투여한다. 대조군에는 항PD-L1 항체 대신 IgG를 투여한다. 종양 체적은 8일차부터 26일차까지 격일로 측정된다. 프로토콜은 도 55에 나타나 있다. 또한, 모든 마우스가 죽을 때까지의 생존율이 결정된다.
(2) 결과
종양 체적의 경향은 도 56에 나타나 있다. 이 결과는 PDL1 + AM80 군이 PDL1 군에 비해 종양 성장을 유의하게 저지한다는 것을 보여준다. 생존율의 경향은 도 57에 나타나 있다. 이 결과는 PDL1 + AM80 군이 PDL1 군에 비해 생존 기간이 유의하게 연장되었음을 보여준다.
[실시예 20: 타미바로텐과 면역 관문 억제제 병용이 방광암에 미치는 영향]
(1) 실험 방법
C57BL/6J 암컷 마우스에 마우스 방광암 세포 MB49(1.0 x 106 세포)를 피하 이식한다(1일차). 5일 후(5일차), 마우스를 항PD-L1 항체 투여군(PDL1 군)과 항PD-L1 항체 및 타미바로텐 투여군(PDL1 + AM80 군)의 두 군으로 나누어 동등한 종양 체적을 보장한다(각 군에서 n = 5). 타미바로텐(3 mg/kg)은 5일차부터 7일 동안 1일 1회 경구 투여한다. 항PD-L1 항체(10F.9G2)를 12일차, 15일차, 18일차, 및 21일차에 250㎍/마우스로 복강 내 투여한다. 종양 체적을 2일차부터 40일차까지 3일에 한 번 측정한다. 프로토콜은 도 58에 나타나 있다.
(2) 결과
종양 체적의 경향은 도 59에 나타나 있다. 이 결과는 PDL1 + AM80 군이 PDL1 군에 비해 종양 성장을 유의하게 저지한다는 것을 보여준다.
[실시예 21: 타미바로텐과 면역 관문 억제제의 병용이 폐암에 미치는 영향]
(1) 실험 방법
C57BL/6J 암컷 마우스는 마우스 폐암 세포주인 루이스 폐 암종 세포주(LCC)에서 루시퍼라제가 강제로 발현되는 LCC-luc(1.0 x 106 세포)로 피하 이식된다(1일차). 5일 후(5일차), 마우스를 항PD-L1 항체 투여군(PDL1 군)과 항PD-L1 항체 및 타미바로텐 투여군(PDL1 + AM80 군)의 두 군으로 나누어 동등한 종양 체적을 보장한다(각 군에서 n = 5). 타미바로텐(3 mg/kg)을 9일차부터 7일 동안 1일 1회 경구 투여한다. 항PD-L1 항체(10F.9G2)를 16일차, 19일차, 및 22일차에 250㎍/마우스로 복강 내 투여한다. 종양 체적을 9일차부터 40일차까지 3일에 한 번 측정한다.
(2) 결과
종양 체적의 경향은 도 60에 나타나 있다. 이 결과는 PDL1 + AM80 군이 PDL1 군에 비해 종양 성장을 유의하게 저지한다는 것을 보여준다.
[실시예 22: 타미바로텐과 면역 관문 억제제의 병용이 위암에 미치는 효과]
(1) 실험 방법
C57BL/6J 암컷 마우스에 마우스 위암 세포주 YTN5 또는 YTN16(1.0 내지 5.0 x 106 세포)을 피하 이식한다(1일차). 5일 후(5일차), 마우스를 항PD-L1 항체 투여군(PDL1 군)과 항PD-L1 항체 및 타미바로텐 투여군(PDL1 + AM80 군)의 두 군으로 나누어 동등한 종양 체적을 보장한다(각 군에서 n = 5). 타미바로텐의 투여는 5일에서 9일 사이에 시작된다. 타미바로텐은 3 mg/kg으로 7일동안 1일 1회 경구 투여한다. PD-L1 항체(10F.9G2)를 타미바로텐의 투여 종료 다음 날부터 3일마다 1회 250㎍/마우스로, 총 3 내지 6회 복강 내 투여한다. 종양 체적을 타미바로텐의 투여 개시부터 3일에 한 번 측정한다. PDL1 + AM80 군은 PDL1 군에 비해 종양 성장을 유의하게 저지한다.
[실시예 23: 메플린 결핍 마우스에서 타미바로텐과 면역 관문 억제제의 병용의 효과]
(1) 실험 방법
메플린 결핍 마우스(Maeda K. et al., Sci Rep. 2016 Feb 29;6:22288. doi: 10.1038/srep22288.)에 마우스 췌장암 세포 mT5(1.0 x 106 세포)를 피하 이식한다. 8일 후(8일차) 마우스를 대조군, 항PD-L1 항체 투여군(PDL1 군), 및 항PD-L1 항체 및 타미바로텐 투여군(PDL1 + AM80 군)의 3개 군으로 나누어 동등한 종양 체적을 보장한다(각 군에서 n = 7). 군집화일을 1일차로 지정하고, 타미바로텐(3 mg/kg)을 1일차로부터 7일동안 1일 1회 경구 투여한다. 항PD-L1 항체(10F.9G2)를 8일차, 10일차, 12일차, 14일차, 16일차, 및 18일차에 250㎍/마우스로 복강 내 투여한다. 대조군에는 항PD-L1 항체 대신 IgG를 투여한다. 종양 체적은 8일차부터 26일차까지 격일로 측정된다. 프로토콜은 도 61에 나타나 있다. 또한, 모든 마우스가 죽을 때까지의 생존율이 결정된다.
(2) 결과
종양 체적의 경향은 도 62에 나타나 있다. 이 결과는 PDL1 군과 PDL1 + AM80 군 사이에 종양 성장 억제 효과에 유의한 차이가 없음을 보여준다. 생존율의 경향은 도 63에 나타나 있다. 이 결과는 PDL1 군과 PDL1 + AM80 군 사이의 생존율에 유의한 차이가 없음을 보여준다.
[실시예 24: 타미바로텐과 면역 관문 억제제의 병용이 위암에 미치는 효과]
(1) 실험 방법
C57BL/6J 암컷 마우스에 마우스 위암 세포주 YTN5(5.0 x 106 세포)를 피하 이식한다(1일차). 7일 후(7일차), 마우스를 항PD-L1 항체 투여군(PDL1 군)과 항PD-L1 항체 및 타미바로텐 투여군(PDL1 + AM80 군)의 두 군으로 나누어 동등한 종양 체적을 보장한다(각 군에서 n = 6). 타미바로텐의 투여는 7일치에 시작된다. 타미바로텐을 6일 동안 1일 1회 3 mg/kg을 경구 투여한다. PD-L1 항체(10F.9G2)는 타미바로텐 투여 종료 다음날부터 3일마다 200㎍/마우스로 총 3회 복강 내 투여한다. 종양 체적을 타미바로텐의 투여 개시부터 3일에 한 번 측정한다.
(2) 결과
종양 체적의 경향은 도 64에 나타나 있다. 이 결과는 PD1 + AM80 군이 PD1 군에 비해 종양 성장을 유의하게 저지한다는 것을 보여준다.
본 발명은 상술한 각 실시형태 및 실시예에 한정되지 않고, 특허청구범위의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다. 본 발명의 다른 실시예에 개시된 기술적 수단을 적절히 조합하여 얻을 수 있는 실시예도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 여기에 인용된 과학 문헌 및 특허 문헌의 내용은 그 전체가 참고로 여기에 포함된다.

Claims (21)

  1. 암연관 섬유아세포가 간질에 침윤된 악성 종양을 갖는 암 환자를 선별하는 단계를 포함하는, 레티노이드와 암 치료제의 병용 요법이 효과적인 암 환자를 선별하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 암 환자를 선별하는 단계가 검사 대상 암 환자로부터 수득한 악성 종양 조직에서 적어도 하나의 암연관 섬유아세포를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 암 환자를 선별하는 단계가 검사 대상인 암 환자로부터 수득한 악성 종양 조직의 조직병리학적 표본을 준비하고 현미경 관찰 하에 적어도 하나의 암연관 섬유아세포를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 암 환자를 선별하는 단계는 검사 대상 암 환자로부터 수득한 악성 종양 조직의 조직병리학적 표본을 현미경으로 관찰하고, 암 세포 영역 및 간질 영역을 포함하는 임의의 고배율 필드에서 적어도 하나의 암연관 섬유아세포를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 암연관 섬유아세포를 검출하는 것은 헤마톡실린-에오신 염색된 조직병리학적 표본을 현미경으로 관찰함으로써 수행되는 방법.
  6. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 암연관 섬유아세포를 검출하는 것은 면역조직화학적 염색 또는 암연관 섬유아세포의 표지자 분자에 대한 제자리 혼성화에 의해 수행되는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선별된 암 환자가 대상이고 레티노이드와 암 치료제를 병용 투여하는 의약.
  8. 제 7항에 있어서, 암 치료제가 화학 치료제, 분자 표적제, 면역 치료제, 또는 호르몬 치료제인 의약.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 레티노이드가 타미바로텐인 의약.
  10. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 레티노이드가 미리 투여되도록 사용되는 의약.
  11. 암 치료제의 작용을 증진 및/또는 목적 종양 조직에 대한 암 치료제의 전달을 촉진하기 위한 의약에 있어서, 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선별되는 암 환자가 대상이고, 레티노이드가 유효 성분인 의약.
  12. 제 11항에 있어서, 암 치료제가 화학 치료제, 분자 표적제, 면역 치료제, 또는 호르몬 치료제인, 의약.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 레티노이드가 타미바로텐인 의약.
  14. 암 치료제의 작용을 증진하기 위한 의약에 있어서, 제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 선별되는 암 환자가 대상이고, 종양 조직 세포에서 메플린을 과발현하는 조성물이 유효 성분인 의약.
  15. 제 14항에 있어서, 메플린을 과발현하는 조성물이 메플린 유전자를 포함하는 바이러스 벡터인 의약.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 암 치료제가 화학 치료제, 분자 표적제, 면역 치료제, 또는 호르몬 치료제인 의약.
  17. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선별되는 암 환자가 대상이고 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제와 암 치료제를 병용 투여하는 의약.
  18. 제 17항에 있어서, 암 치료제가 화학 치료제, 분자 표적제, 면역 치료제, 또는 호르몬 치료제인 의약.
  19. 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제가 미리 투여되도록 사용되는 의약.
  20. 암 치료제의 작용을 증진 및/또는 목적 종양 조직에 대한 암 치료제의 전달을 촉진하기 위한 의약에 있어서, 상기 제 1항 내지 제 6항에 따른 방법에 의해 선별되는 암 환자가 대상이고 암의 간질에서 라이실 옥시다제 활성의 저지를 유도하는 제제가 유효 성분인 의약.
  21. 제 20항에 있어서, 암 치료제가 화학 치료제, 분자 표적제, 면역 치료제, 또는 호르몬 치료제인 의약.
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