PT2041282T

PT2041282T - Ácidos nucleicos que se ligam a fde-1

Info

Publication number: PT2041282T
Application number: PT77861607T
Authority: PT
Inventors: Buchner Klaus; Purschke Werner; Jarosch Florian; Eulberg Dirk; Maasch Christian; Dinse Nicole
Original assignee: Noxxon Pharma Ag
Priority date: 2006-07-18
Filing date: 2007-07-18
Publication date: 2018-03-13
Also published as: WO2008009437A2; WO2008009437A3; JP5380287B2; CN101506364B; KR20130090428A; KR101466931B1; BRPI0714844B1; CN101506364A; US20210139909A1; KR20090039717A; US8314223B2; HK1131184A1; AU2007276435B2; CA2658267C; DK2041282T3; US20110112172A1; EP2041282A2; BRPI0714844B8; US20130041019A1; AU2007276435C1

Description

alterações na forma da célula, aumento temporário da concentração de iões de cálcio intracelulares livres, desgranulação, hiper-regulação de integrinas, formação de lípidos bioativos (leucotrienos, prostaglandinas, tromboxanos) ou explosão respiratória (libertação de espécies reativas de oxigénio para destruição de organismos patogénicos ou células de tumor). Assim, ao provocar a libertação de outros mediadores pró-inflamatórios, a quimiotaxia e a extravasão de leucócitos em direção a sítios de infeção ou de inflamação, as quimiocinas desencadeiam uma escalada de respostas inflamatórias. As quimiocinas homeostáticas, por sua vez, expressam-se predominantemente na medula óssea e em tecidos linfóides e estão envolvidas na hematopoiese, na vigilância imunitária e nas respostas imunitárias adaptativas (Godessart, 2005).

Com base no arranjo dos primeiros dois dos quatro resíduos de cisteína conservados, as quimiocinas dividem-se em quatro classes: CC ou quimiocinas β (por exemplo), em que as cisteínas estão em tandem, CXC ou quimiocinas a, em que elas estão separadas por um resíduo adicional de aminoácido, XC ou quimiocinas γ (linfotactina/XCLl como o único representante até à data), que possui apenas uma ponte de bissulfureto e quimiocinas CX3C, que têm por características três resíduos de aminoácidos entre as cisteínas (fractalcina ligada à membrana como o único elemento da classe; (Bazan, Bacon et al., 1997)).

As quimiocinas CXC atuam principalmente nos neutrófilos, em particular, as quimiocinas CXC que são portadoras de uma sequência de aminoácidos ELR no seu terminal amino. Exemplos de quimiocinas CXC, que são ativas nos neutrófilos, são IL-8/CXCL8, GROa/CXCLl, GROp/CXCL2 e GROy/CXCL3, NAP-2/CXCL7, ENA-7 8/CXCL5, FDE-1/CXCL12 e GCP-2/CXCL6. As quimiocinas CC atuam numa grande variedade de leucócitos, tais como monócitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, assim como, linfócitos T e B (Oppenheim, Zachariae et al., 1991; Miller and Krangel 1992; Baggiolini, Dewald et al., 1994; Jose, Griffiths-Johnson et al., 1994; Ponath, Qin et al., 1996). Exemplo destes são I-309/CCLl; MCP-1/CCL2, MCP-2/CCL8, MCP-3/CCL7, MCP-4/CCL13, MIP-la/CCL3 e MIP-ip/CCL4, RANTES/CCL5, e eotaxina/CCLl1.

As quimiocinas atuam através de recetores que pertencem a uma superfamília de sete recetores acoplados à proteína G que se espalham na transmembrana (RAPG; (Murphy, Baggiolini et al., 2000)) . Falando de uma forma geral, as quimiocinas e as interações dos recetores de quimiocina tendem a ser promíscuas pelo facto de uma quimiocina se poder ligar a muitos recetores de quimiocina e, inversamente, um único recetor de quimiocina poder interagir com várias quimiocinas. Alguns recetores conhecidos para as quimiocinas CXC incluem CXCRl, que se liga a GROa, GCP-2 e IL-8; CXCR2, que se liga a quimiocinas incluindo GROa, ΰΕΟβ, GROy, ENA-78 e IL-8; CXCR3, que se liga a quimiocinas incluindo PF4, MIG, IP-10 e I-TAC; CXCR4, que até agora tem sido encontrado apenas a sinalizar respostas a FDE-1 e CXCR5, que tem demonstrado dar sinal em resposta a BCA-1 (Godessart 2005). O FDE-1 (fator 1 derivado de células do estroma, em inglês SDF-1; sinónimos, CXCL12; PBSF [fator de estimulação do crescimento de células pré-B]; TPAR-1 [gene 1 reprimido por TPA]; SCYB12; FELT [fator de estimulação de células do linfoma tímico]; ihRH [intercrina humana reduzida em hepatomas]) é uma quimiocina angiogénica CXC que não contém um elemento típico ELR, das quimiocinas semelhantes a IL-8 (Salcedo, Wasserman et al., 1999; Salcedo and Oppenheim 2003) , que se liga e ativa o recetor acoplado à proteína G, CXCR4. A quimiocina foi descoberta por três grupos, independentemente, quer por clonagem de ADNc que eram portadores de sequências de sinal do terminal N (Tashiro, Tada et al., 1993), em virtude da sua capacidade para estimular progenitores precoces de células B quando expressas por linhas de células do estroma PA6 (Nagasawa, Kikutani et al., 1994) ou por isolamento, a partir de uma biblioteca de ADNc, preparada a partir de fibroblastos de embriões de murganhos, tratados com o ativador C da proteína-cinase, acetato de tetra-dodecanoil-forbol (TPA) (Jiang, Zhou et al., 1994) . Como resultado da divisão alternativa, há duas formas de FDE-1, FDE-la (68 AA) e FDE-Ιβ, que comportam quatro resíduos adicionais no terminal C (Shirozu, Nakano et al., 1995) . 0 significado biológico destas duas variantes separadas não está completamente compreendido. A conservação das sequências entre FDE-1 de diferentes espécies é notável: FDE-la humano (SEQ ID N°. 1) e FDE-la de murino (SEQ ID N°. 2) são praticamente idênticos. Há apenas uma única alteração conservadora de V para I na posição 18 (Shirozu, Nakano et al., 1995). Outra caracteristica rara que distingue FDE-1 da maior parte das outras quimiocinas é a sua seletividade. De facto, FDE-1 e o recetor CXCR4 parecem conter um par de ligantes de recetores monogâmicos.

Existe um modelo de estrutura de RMN (acesso PDB, FDE-1) para FDE-1 [8-68]. Verificou-se que FDE-1 era um monómero com uma região do terminal N perturbada. As diferenças em relação a outras quimiocinas verificam-se principalmente no invólucro do núcleo hidrofóbico e na distribuição das cargas na superfície (Crump, Gong et al., 1997).

Atividades fisiológicas de FDE-1: Dado que o recetor de FDE-1, CXCR4 é largamente expresso em leucócitos, células dendríticas maduras, células endoteliais, células do cérebro e megacariócitos, as atividades de FDE-1 são pleiotrópicas. Esta quimiocina, mais do que qualquer outra identificada até agora, exibe a mais vasta gama de funções biológicas, especialmente fora do sistema imunitário. Os efeitos funcionais mais significativos de FDE-1 são:

Alojamento e ligação de células epiteliais a sitios neo-vasculares na porção coróide da retina. FDE-1 tem mostrado que está envolvida no alojamento de células epiteliais na coróide durante a neovascularização do tecido do olho. 0 papel exato destas células está ainda sob investigação, mas a hipótese publicada é que as células epiteliais estão envolvidas na formação de vasos aberrantes de sangue (Sengupta, Caballero et al., 2005).

Hematopoiese. É necessário FDE-1 para manter células progenitoras hematopoiéticas (CD34+) na medula óssea do adulto. AMD3100, um antagonista seletivo de CXCR4, pode ser utilizado para mobilizar células CD34+ para o transplante de células estaminais hematopoiéticas. As células CD34+ migram in vitro e in vivo em direção a um gradiente de FDE-1 produzido por células do estroma (Aiuti, Webb et al., 1997).

Desenvolvimento e quimiotaxia de células B. FDE-1 suporta a proliferação de pré-células B e aumenta o crescimento dos progenitores de células B da medula óssea (Nagasawa, Kikutani et al., 1994); induz a migração especifica de células de pré- e pró-B, ao mesmo tempo que não atua como um quimioatrator significativo para as células B maduras (D'Apuzzo, Rolink et al., 1997; Bleul, Schultze et al., 1998). Presumivelmente, FDE-1 é importante para o posicionamento das células B dentro de tecido linfóide secundário.

Quimiotaxia de células T. FDE-1 é um dos quimioatratores de células T mais eficazes; CXCR4 está presente em muitos subconjuntos de células T (Bleul, Farzan et al., 1996).

Desenvolvimento embrionário. FDE-1 e o seu recetor, CXCR4, são essenciais para o desenvolvimento embrionário. FDE-1 e CXCR4 de murganhos transgénicos morrem peri-natalmente; exibem defeitos do septo ventricular cardíaco ou um desenvolvimento cerebelar anormal, para além do número reduzido de células B e de progenitores de mielóides (Nagasawa, Hirota et al., 1996; Ma, Jones et al., 1998; Zou,

Kottmann et al., 1998). FDE-1 é também necessário para a ontogenia normal do desenvolvimento sanguíneo durante a embriogénese (Juarez e Bendall 2004).

Infeção por VIH. FDE-1 é capaz de inibir a entrada de VIH-1 trópico de T em linhas de células que comportam CXCR4 e a expressão de FDE-1 pode ter um papel importante na patogénese da SIDA, dado que um polimorfismo nos genes humanos de FDE-1 afetam o início da SIDA (Bleul, Farzan et al., 1996). Níveis alterados de expressão de FDE-1 ou do seu recetor CXCR4 ou respostas alteradas em relação às moléculas que estão associadas com muitas doenças humanas, tais como a retinopatia (Brooks, Caballero et al., 2004; Butler, Guthrie et al., 2 0 05; Meleth, Agron et al., 2005); o cancro da mama (Muller, Homey et al., 2001; Cabioglu, Sahin et al., 2005), dos ovários (Scotton, Wilson et al., 2002), do pâncreas (Koshiba, Hosotani et al., 2000), da tiróide (Hwang, Chung et al., 2003), da nasofaringe (Wang, Wu et al., 2005); glioma (Zhou, Larsen et al., 2002); neuroblastoma (Geminder, Sagi-

Assif et al., 2001); leucemia linfocítica crónica das células B (Burger, Tsukada et al., 2000); síndrome de VHIM (verrugas, hipogamaglobulinémia, infeções, mielocatexia) (Gulino, Moratto et al., 2004; Balabanian, Lagane et al., 2005; Kawai, Choi et al., 2005); síndromes de deficiência imunitária (Arya, Ginsberg et al., 1999; Marechal, Arenzana-Seisdedos et al., 1999; Soriano, Martinez et al., 2002); neovascularização patológica (Salvucci, Yao et al., 2002; Yamaguchi, Kusano et al., 2003; Grunewald, Avraham et al., 2006); inflamação (Murdoch 2000; Fedyk, Jones et al., 2001; Wang, Guan et al., 2001); esclerose múltipla (Krumbholz, Theil et al., 2006); artrite reumatoide/osteoartrite (Buckley, Amft et al., 2000;

Kanbe, Takagishi et al., 2002; Grassi, Cristino et al., 2004) .

Em configurações experimentais de animais, os antagonistas de FDE-1 ou os seus recetores têm provado serem eficientes para o bloqueio do crescimento e/ou para a proliferação metastática de células de cancro humano, de diferentes origens, tais como o pâncreas (Guleng, Tateishi et al., 2005; Saur, Seidler et al., 2005), o cólon (Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al., 2003; Guleng, Tateishi et al., 2005) , a mama (Muller, Homey et al., 2001; Lapteva, Yang et al., 2005), o pulmão (Phillips, Burdick et al., 2003), glioblastoma/meduloblastoma (Rubin, Rung et al., 2003), a próstata (Sun, Schneider et al., 2005), o osteossarcoma (Perissinotto, Cavalloni et al., 2005), o melanoma (Takenaga, Tamamura et al., 2004), o estômago (Yasumoto, Koizumi et al., 2006) , o mieloma múltiplo (Menu, Asosingh et al., 2006).

Além disso, a terapêutica anti-FDE-1 foi benéfica em modelos de animais na prevenção da neovascularização da retina (Butler, Guthrie et al., 2005), de nefrite (Balabanian, Couderc et al., 2003) e de artrite (Matthys, Hatse et al., 2001; Tamamura, Fujisawa et al., 2004; De

Klerck, Geboes et al., 2005). FDE-1 é um elemento fundamental na patologia de doenças da parte anterior dos olhos, tais como retinopatia diabética (RD) (Fong, Aiello et al., 2004) e degeneração macular relacionada com a idade (DMI) (Ambati, Anand et al., 2003). Ambas estas doenças danificam os olhos e levam a uma perda gradual da visão que termina com a cegueira. As lesões ocorrem devido a um crescimento inadequado de vasos sanguíneos na parte posterior do olho, um processo conhecido como neovascularização coroidal (NVC).

Durante a NVC, novos vasos sanguíneos que têm origem no coróide, migram através de uma fenda na membrana de Bruch para o epitélio do pigmento sub-retinal (EP sub-R) ou espaço subretinal. Os vasos anormais podem produzir hemorragia (hemorragia intrarretinal) ou perda de fluido sob a retina. Isto pode levar a escaras e levar a mácula, o que distorce a visão.

Pensa-se que FDE-1 desempenha um papel na NVC por via do recrutamento de células precursoras endoteliais (CPE) do olho. Estas células precursoras tornam-se então componentes-chave estruturais nos vasos sanguíneos aberrantes. A retinopatia diabética é a principal sequela da diabetes, ocorrendo frequentemente em doentes tanto com diabetes do tipo 1 como do tipo 2. Há aproximadamente 16 milhões de diabéticos nos Estados Unidos, em que cerca de 8 milhões têm, de alguma forma, retinopatia diabética. Quando a retinopatia diabética proliferativa (RDP) não é tratada, cerca de 60 % dos doentes ficam cegos de um ou de ambos os olhos, no prazo de 5 anos. Com o aumento alarmante da prevalência de diabetes na América do Norte, na Europa e em muitos países emergentes, a população doente está a crescer rapidamente. Por exemplo, a incidência da cegueira é 25 vezes superior em doentes diabéticos do que na população em geral. Além disso, a retinopatia diabética (RD) é a causa mais comum de cegueira em indivíduos de meia-idade, sendo responsável por pelo menos 12 % de todos os novos casos nos Estados

Unidos, por ano. Estão a decorrer programas de rastreio de modo que a visão dos doentes com diabetes possa ser monitorizada e que os tratamentos que estão disponíveis possam ser disponibilizados a tempo.

As causas diretas da retinopatia diabética ainda são muito mal compreendidas, mas pensa-se que a doença tenha as suas origens numa combinação de fontes: autorregulação comprometida do fluxo sanguíneo da retina; acumulação de sorbitol dentro das células da retina; e acumulação de glicosilação avançada de produtos finais no fluido extra-celular. Todos estes fatores estão relacionados, direta ou indiretamente com hiperglicémia, a abundância de açúcar na corrente sanguínea.

Os sintomas da RD são semelhantes aos da DMI. Os doentes perdem células na retina e ocorrem micro-aneurismas (fluxo sanguíneo) na base da membrana da retina. Além disso, FCEV, FCI-1 e outros fatores que têm origem no sangue, possivelmente incluindo FDE-1, atraem novas células vasculares e encorajam a formação de vasos sanguíneos danificados. A degeneração macular relacionada com a idade (DMI) destrói a visão central da pessoa. Nos primeiros estádios da doença pode-se não dar conta porque os sintomas variam consoante os doentes. Algumas vezes um doente está afetado apenas num dos olhos. Ou a visão pode estar prejudicada em ambos os olhos, mas não significativamente. A doença causa distorção ou falta de perceção da cor. Há muitas vezes um ponto negro no centro do campo visual. A etiologia (decurso) da doença é muito mal compreendida. Pensa-se muitas vezes na DMI como o envelhecimento da camada mais externa da retina. As alterações físicas ocorrem no centro da retina, também conhecida como a mácula, que é a parte da retina em que a visão é mais apurada. A DMI húmida começa como uma sequela da forma seca da doença. 90 % dos doentes sofrem da forma seca de DMI, que resulta no adelgaçamento dos tecidos maculares e em perturbações na sua pigmentação. Os restantes têm a forma húmida que envolve a hemorragia descrita antes. A forma húmida de DMI representa um mercado ideal para uma nova terapêutica: sendo já a causa mais comum de cegueira nas pessoas com idades acima de 55 anos, estima-se que a DMI aflija 4 % a 5 % da população dos Estados Unidos, com idade de 65-74 anos e aproximadamente 10 % daqueles que têm 75 anos de idade ou são mais velhos. Há já 5 milhões de pessoas nos Estados Unidos, só com mais de 80 anos de idade, que têm esta doença e outros 5 milhões que se espera que venham a ser afetados por ela até 2020.

Os tumores não são apenas massas de células de cancro: a infiltração de tumores com células imunitárias é uma característica do cancro. Muitos cancros humanos têm uma rede complexa de quimiocinas que influencia a extensão e o fenótipo destes infiltrados, assim como o crescimento do tumor, a sobrevivência e a migração e a angiogénese. A maior parte dos tumores sólidos contêm muitas células do estroma não malignas. Na verdade, as células do estroma, algumas vezes, ultrapassam as células de cancro. As células de estroma predominantes que se encontram nos cancros são macrófagos, linfócitos, células endoteliais e fibroblastos.

As células malignas de diferentes tipos de cancro têm diferentes perfis de expressão dos recetores da quimiocina, mas o recetor de FDE-1, CXCR4, é o que se encontra na forma mais comum em murganhos e no homem: as células de tumor de pelo menos 23 tipos diferentes de cancros humanos do epitélio, mesênquima e hematopoiéticas expressam CXCR4 (Balkwill 2004). FDE-1 é o único ligando conhecido para CXCR4. Independentemente do tecido de medula-óssea e do tecido linfóide secundário, onde é expresso constitutivamente, encontra-se FDE-1 em sítios primários de tumor no linfoma (Corcione, Ottonello et al., 2000) e em tumores do cérebro, tanto da linha neuronal como astrocítica. Além disso, está presente, em níveis elevados, no ovário (Scotton, Wilson et al., 2002) e no cancro pancreático (Koshiba, Hosotani et al., 2000), assim como, em sítios de metástases da mama (Muller, Homey et al., 2001) e cancro da tiróide (Hwang, Chung et al., 2003), neuroblastoma e situações hematológicas malignas (Geminder, Sagi-Assif et al., 2001) . Ao contrário, a expressão de CXCR4 é baixa ou está ausente na mama normal (Muller, Homey et al., 2001), no ovário (Scotton, Wilson et al., 2002) e no epitélio da próstata (Sun, Schneider et al., 2005). A expressão de CXCR4 parece assim ser uma característica genérica das células epiteliais malignas e não a sua contraparte normal. A inibição da sinalização do recetor de quimiocina em células de tumor tem potencial para induzir o crescimento ou a apoptose e prevenir a invasão e as metástases in vivo: A inativação de CXCR4 pelo crescimento do tumor da mama suprimiu ARNsi (Lapteva, Yang et al., 2005); as células de hibridoma T que foram transfectadas com uma estrutura que previne a expressão na superfície de CXCR4, não podiam mais metastizar órgãos distantes quando injetadas intravenosamente em murganhos (Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al., 2001); em experiências semelhantes com células de cancro colorretal, as metástases do pulmão e do fígado foram muito reduzidas (Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al., 2003); os anticorpos anti-CXCR4 ou anti-FDE-1 inibiram a dispersão dos xenoenxertos de cancro da mama para os nódulos linfáticos (Muller, Homey et al., 2001); o tratamento de células linfoblastóides com anticorpos anti-CXCR4 ou anti-FDE-1 atrasaram o crescimento do tumor em murganhos (NOD)/SCID (Bertolini, Dell'Agnola et al., 2002); os anticorpos anti-FDE-1 inibiram o desenvolvimento de metástases de órgãos de cancro do pulmão de células não pequenas (CPCNP) (Phillips, Burdick et al., 2003); a administração sistémica do antagonista de CXCR4, AMD3100 (AnorMED) inibiu o crescimento de glioblastoma intracraniano e xenoenxertos de meduloblastoma e aumentou a apoptose de células do tumor no prazo de 24 horas (Rubin, Rung et al., 2003); os anticorpos anti-FDE-1 inibiram o crescimento de células do cancro da mama MCF-7 misturadas com fibroblastos associados ao carcinoma (Orimo, Gupta et al., 2005); a neutralização de CXCR4 com anticorpos bloqueou metástases de cancro da próstata e o crescimento em sítios ósseos (Sun, Schneider et al., 2005); o desenvolvimento de metástases no pulmão, após a injeção de células de osteossarcoma, foi evitado pela administração do antagonista peptidico de CXCR4, T134 (Perissinotto, Cavalloni et al., 2005).

Diferentes autores chegaram à conclusão de que atingir o eixo de FDE-1/CXCR4 pode providenciar novas operações terapêuticas para doentes com cancro:

Os tumores do ovário humano expressam fortemente FDE-1 mais, a um nivel mais baixo, FCEV. Ambas as proteínas são desencadeadas por hipóxia no tumor. As concentrações patológicas de qualquer uma das proteínas isoladamente, não foi suficiente para induzir angiogénese in vivo, mas, em conjunto, FDE-1 e FCEV, em concentrações patológicas, induziram, de forma eficiente e sinérgica, a neovascularização. Assim, a interrupção deste eixo sinérgico, em vez de apenas FCEV, pode ser uma nova e eficiente estratégia antiangiogénese para tratar o cancro (Kryczek, Lange et al., 2005);

As linhas de células de cancro da mama, quando equipadas com a via de sinalização autocrínica de FDE-1/CXCR4, exibem um comportamento agressivo. Isto inclui um aumento da invasão e da migração em conjunto com um crescimento mais rápido. O eixo de FDE-1/CXCR4 pode assim providenciar uma informação importante para prever a natureza agressiva e constitui um importante alvo terapêutico em cancros humanos da mama (Kang, Watkins et al., 2005); A migração e as metástases de células de cancro do pulmão de células pequenas (CPCN) - que expressam elevados níveis de CXCR4 - são reguladas por FDE-1. A ativação de CXCR4 promove a adesão a células acessórias (tais como células do estroma) e moléculas da matriz extracelular, dentro do microambiente do tumor. Estas interações adesivas resultam num aumento da resistência das células de CPCN à quimioterapia. Assim, os inibidores do eixo de FDE-1/CXCR4 podem aumentar a quimiossensibilidade das células de CPCN e levam a novas vias terapêuticas para doentes com CPCN (Hartmann, Burger et al., 2004); O eixo de FDE-1/CXCR4 emerge como um regulador pivô do tráfego de vários tipos de células estaminais no corpo. Dado que a maior parte não tem origem maligna, no compartimento das células estaminais/progenitoras, as células estaminais de cancro também expressam CXCR4 na sua superfície e, como resultado, o eixo de FDE-1/CXCR4 está envolvido no direcionamento e no tráfego/metástases para órgãos que expressam FDE-1 (por exemplo, nódulos linfáticos, pulmões, fígado, ossos). Em consequência, as estratégias traçadas na regulação do eixo de FDE-1/CXCR4 têm importantes aplicações clínicas, tanto na medicina regenerativa para administrar células estaminais normais aos tecidos, como na oncologia clínica para inibir metástases de células estaminais de cancro (Kucia, Reca et al., 2005). O pedido de patente internacional WO 02/101350 tem por objeto um ensaio modificado de migração de células, que permite a identificação de antagonistas de recetores de quimiocina a partir de bloqueadores não específicos. O problema subjacente à presente invenção consiste em providenciar um antagonista específico para FDE-1. Um outro aspeto do problema subjacente à presente invenção consiste em providenciar um composto para o tratamento de doenças e de distúrbios que envolvem FDE-1 e o recetor, CXCR4, respetivamente.

Outro problema subjacente à presente invenção consiste em providenciar processos para a deteção especifica de FDE-1. 0 problema subjacente à presente invenção é resolvido pela matéria de facto das reivindicações independentes. Podem retirar-se modalidades preferidas a partir das reivindicações dependentes. 0 problema subjacente à presente invenção é resolvido, num primeiro aspeto, por uma molécula de ácido nucleico que se liga a FDE-1, compreendendo, na direção 5'->3' um primeira fileira de nucleótidos, uma sequência nuclear de nucleótidos e um segundo fileira de nucleótidos ou uma segunda fileira de nucleótidos, uma sequência nuclear de nucleótidos e uma primeira fileira de nucleótidos, em que o comprimento da molécula de ácido nucleico é de 20 a 50 nucleótidos, em que a molécula de ácido nucleico se seleciona no grupo de moléculas que consiste em moléculas de ácidos nucleicos do tipo A, moléculas de ácidos nucleicos do tipo B, moléculas de ácidos nucleicos do tipo C e moléculas de ácidos nucleicos com uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma SEQ ID N° . 142, SEQ ID N°. 143 e SEQ ID N°. 144; em que as moléculas de ácidos nucleicos do tipo A contêm a sequência nuclear de nucleótidos que se segue: 5' AAAGYRACAHGUMAAXaUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID N°. 19) em que Xa ou está ausente ou representa A e em que a primeira fileira de nucleótidos, das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A, compreende uma sequência de nucleótidos de 5' X1X2NNBV 3' (SEQ ID N°. 44) e a segunda fileira de nucleótidos, das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A, compreende uma sequência de nucleótidos de 5' BNBNX3X4 3' (SEQ ID N°. 45), em que Xi ou está ausente ou representa R, X2 representa S, X3 representa S e X4 ou está ausente ou representa Y ou

Xi está ausente, X2 ou está ausente ou representa S, X3 ou está ausente ou representa S e X4 está ausente; em que as moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreendem a sequência nuclear de nucleótidos que se segue: 5' GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3' (SEQ ID N°. 57) e em que a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreende uma sequência de nucleótidos de 5' X1X2SVNS 3' (SEQ ID N°. 77) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreende uma sequência de nucleótidos de 5' BVBSX3X4 3' (SEQ ID N°. 78), em que

Xi ou está ausente ou representa A, X2 representa G, X3 representa C e X4 ou está ausente ou representa U ou

Xi está ausente, X2 ou está ausente ou representa G, X3 ou está ausente ou representa C e X4 está ausente; em que moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreendem a sequência nuclear de nucleótidos que se segue: GGUYAGGGCUHRXAaGUCGG (SEQ ID N°. 90), em que Xa ou está ausente ou representa A e em que a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' RKSBUSNVGR 3' (SEQ ID N°. 120) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' YYNRCASSMY 3' (SEQ ID N°. 121) ou em que a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' XsSSSV 3' (SEQ ID N°. 124) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' BSSSXs 3' (SEQ ID N°. 125), em que Xs ou está ausente ou representa S ou em que a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' UGAGAUAGG 3' e a segunda fileira de

nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CUGAUUCUCA 3' ou em que a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' GAGAUAGG 3' e a segunda fileira de

nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CUGAUUCUC 3'.

Numa modalidade do primeiro aspeto, as moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreendem uma sequência nuclear de nucleótidos selecionada no grupo que compreende 5' AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID N°. 20), 5' AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID N°. 21) e 5' AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID N°. 22), preferencialmente, a sequência nuclear de nucleótidos que compreende 5' AAAGYAACAHGU CAAU GAAAGGUARC 3' (SEQ ID N°. 22) .

Numa modalidade do primeiro aspeto, as referidas primeira e segunda fileiras de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A, eventualmente hibridam umas com as outras de tal modo que, após hibridação, forma-se uma estrutura de hélice dupla.

Numa modalidade do primeiro aspeto, a estrutura de hélice dupla consiste em quatro a seis pares de bases, preferencialmente, cinco pares de bases.

Numa modalidade do primeiro aspeto, a referida primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreendem uma sequência de nucleótidos de 5' X2BBBS 3' (SEQ ID N°. 42) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' SBBVX3 3' (SEQ ID N°. 43), em que X2 ou está ausente ou representa S e X3 ou está ausente ou representa S; preferencialmente, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CUGUG 3' e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CGCAG 3'; ou a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' GCGUG 3' e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CGCGC 3'.

Numa modalidade do primeiro aspeto, a molécula de ácidos nucleicos do tipo A tem uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das SEQ ID N°s. 5 a 18, 25 a 41, 133, 137 e 139 a 141.

Numa modalidade do primeiro aspeto, as moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreendem uma sequência nuclear de nucleótidos de GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG (SEQ ID N° . 58) .

Numa modalidade do primeiro aspeto, as referidas primeira e segunda fileiras de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B eventualmente hibridam umas com as outras de tal modo que, após hibridação, forma-se uma estrutura de hélice dupla.

Numa modalidade do primeiro aspeto, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreendem uma sequência de nucleótidos de 5' X2SSBS 3' (SEQ ID N°. 73) e a segunda fileira de nucleótidos, das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B, compreende uma sequência de nucleótidos de 5' BVSSXs 3' (SEQ ID N°. 74), em que X2 ou está ausente ou representa G e X3 ou está ausente ou representa C, preferencialmente, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreende uma sequência de nucleótidos de 5' GCGUG 3' e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreende uma sequência de nucleótidos de 5' UACGC 3'.

Numa modalidade do primeiro aspeto, a molécula de ácido nucleico do tipo B tem uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das SEQ ID N°s. 46 a 56, 61 a 72 e 132 .

Numa modalidade do primeiro aspeto, as moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreendem uma sequência nuclear de nucleótidos selecionada no grupo que compreende 5' GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3' (SEQ ID N°. 91), 5' GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3' (SEQ ID N°. 92), e 5' GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ ID N° . 93), preferencialmente, uma sequência nuclear de nucleótidos que compreende 5' GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ ID N°. 93) .

Numa modalidade do primeiro aspeto, pelo menos uma parte das referidas primeira e segunda fileiras de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C eventualmente hibridam umas com as outras de tal modo que, após hibridação, forma-se uma estrutura de hélice dupla.

Numa modalidade do primeiro aspeto, a estrutura de hélice dupla consiste em 4 a 10 pares de bases, preferencialmente, 4 a 6 pares de bases, mais preferencialmente, 5 pares de bases.

Numa modalidade do primeiro aspeto, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' RKSBUGSVGR 3' (SEQ ID N°. 122) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' YCNRCASSMY 3' (SEQ ID N°. 123) .

Numa modalidade do primeiro aspeto, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' SSSSR 3' (SEQ ID N°. 130) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' YSBSS 3' (SEQ ID N°. 131).

Numa modalidade do primeiro aspeto, a molécula de ácido nucleico do tipo C tem uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das SEQ ID N°s. 79 a 89, 94 a 119 e 134 a 136.

Numa modalidade do primeiro aspeto, a molécula de ácidos nucleicos do tipo C tem uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das SEQ ID N°s. 142 a 144.

Numa modalidade do primeiro aspeto, a molécula de ácidos nucleicos é um antagonista de FDE-1.

Numa modalidade do primeiro aspeto, a molécula de ácido nucleico é um antagonista do sistema recetor de FDE-1 em que, preferencialmente, o recetor de FDE-1 do sistema recetor de FDE-1 é o recetor de CXCR4.

Numa modalidade do primeiro aspeto, FDE-1 é um FDE-1 humano em que, preferencialmente, FDE-1 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID N°. 1.

Numa modalidade do primeiro aspeto, a molécula de ácido nucleico compreende uma modificação, preferencialmente, a modificação selecionada no grupo que compreende um radical HES e um radical PEG.

Numa modalidade do primeiro aspeto, os nucleótidos de uma molécula de ácidos nucleicos são nucleótidos L, preferencialmente, os nucleótidos das sequências de acordo com uma qualquer das SEQ ID N°. 19, 20, 21, 22, 57, 58, 90, 91, 92 e 93. 0 problema subjacente à presente invenção é resolvido, num segundo aspeto, por meio da molécula de ácidos nucleicos, de acordo com o primeiro aspeto, incluindo qualquer uma das suas modalidades, para se utilizar num processo de tratamento de uma doença. 0 problema subjacente à presente invenção é resolvido, num terceiro aspeto, por meio de uma composição farmacêutica, contendo uma molécula de ácido nucleico, de acordo com o primeiro aspeto, incluindo qualquer uma das suas modalidades e, eventualmente, um outro constituinte, em que esse outro constituinte se seleciona no grupo que compreende excipientes, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico e agentes, ativos sob o ponto de vista farmacêutico. 0 problema subjacente à presente invenção é resolvido num quarto aspeto, por meio da utilização de uma molécula de ácido nucleico, de acordo com o primeiro aspeto, incluindo qualquer uma das suas modalidades, para o fabrico de um medicamento.

Numa modalidade do segundo aspeto, a doença é mediada por FDE-1, preferencialmente essa doença ou distúrbio seleciona-se no grupo que compreende doenças da parte posterior dos olhos, tal como retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade; cancro da mama, ovários, próstata, pâncreas, tiróide, nasofaringe, cólon, pulmão e estômago; osteossarcoma; melanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; síndrome de VHIM; sindromes de deficiências imunitárias; neovascularização patológica; inflamação; esclerose múltipla; artrite reumatoide/osteo-artrite e nefrite. 0 problema subjacente à presente invenção é resolvido num quinto aspeto, por meio de uma molécula de ácido nucleico, de acordo com o primeiro aspeto, incluindo qualquer uma das suas modalidades, em que a molécula de ácido nucleico se destina a ser utilizada na inibição de angiogénese, neovascularização, inflamação e metástases. 0 problema subjacente à presente invenção é resolvido, num sexto aspeto, por meio da utilização de uma molécula de ácido nucleico, de acordo com o primeiro aspeto, incluindo qualquer uma das suas modalidades, para o fabrico de meios de diagnóstico.

Numa modalidade do sexto aspeto, os meios de diagnóstico são para o diagnóstico de uma doença, em que a doença é mediada por FDE-1, preferencialmente essa doença é selecionada no grupo que compreende doenças da parte anterior dos olhos como retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade; cancro da mama, ovários, próstata, pâncreas, tiróide, nasofaringe, cólon, pulmão e estômago; osteossarcoma; melanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; sindrome de WHIM; sindromes de deficiências imunitárias; neovascularização patológica; inflamação; esclerose múltipla; artrite reumatóide/osteo-artrite e nefrite.

Numa modalidade do sexto aspeto, os meios de diagnóstico são para o diagnóstico de angiogénese, neovascularização, inflamação e/ou metástases. 0 problema subjacente à presente invenção é resolvido num sétimo aspeto, por meio de um complexo que compreende FDE-1 e uma molécula de ácido nucleico, de acordo com o primeiro aspeto, incluindo qualquer uma das suas modalidades, em que preferencialmente, o complexo é um complexo cristalino. 0 problema subjacente à presente invenção é resolvido num oitavo aspeto, por meio da utilização de uma molécula de ácido nucleico, de acordo com o primeiro aspeto, incluindo qualquer uma das suas modalidades, para a deteção de FDE-1. 0 problema subjacente à presente invenção é resolvido num oitavo aspeto, por meio de um estojo para a deteção de FDE-1, compreendendo uma molécula de ácido nucleico, de acordo com o primeiro aspeto, incluindo qualquer uma das suas modalidades.

Numa modalidade, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' X1X2NNBV 3' (SEQ ID N°. 44) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' BNBNX3X4 3' (SEQ ID N°. 45) em que Xi ou está ausente ou representa R, X2 representa S, X3 representa S e X4 ou está ausente ou representa Y; ou

Xi está ausente, X2 ou está ausente ou representa S, X3 ou está ausente ou representa S e X4 está ausente.

Numa modalidade, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' RSHRYR 3' (SEQ ID N°. 23) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' YRYDSY 3' (SEQ ID N°. 24), preferencialmente, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' GCUGUG 3' e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CGCAGC 3'.

Numa modalidade, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreende uma sequência de nucleótidos de 5' X1X2SVNS 3' (SEQ ID N°. 77) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreende uma sequência de nucleótidos de 5' BVBSX3X4 3' (SEQ ID N°. 78), em que

Xi ou está ausente ou representa A, X2 representa G, X3 representa C e X4 ou está ausente ou representa U; ou

Xi está ausente, X2 ou está ausente ou representa G, X3 ou está ausente ou representa C e X4 está ausente.

Numa modalidade, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreende uma sequência de nucleótidos de 5' XiGCRWG 3' (SEQ ID N°. 59) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreende uma sequência de nucleótidos de 5' KRYSCX4 3' (SEQ ID N°. 60), em que Xi ou está ausente ou representa A e X4 ou está ausente ou representa U.

Numa modalidade, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreende uma sequência de nucleótidos de 5' XiGCGUG 3' (SEQ ID N°. 75) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreende uma sequência de nucleótidos de 5' UACGCX4 3' (SEQ ID N°. 76), em que Xi ou está ausente ou representa A e X4 ou está ausente ou representa U, preferencialmente, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreende uma sequência de nucleótidos de 5' AGCGUG 3' e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreende uma sequência de nucleótidos de 5' UACGCU 3'.

Numa modalidade, o comprimento da primeira fileira das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C e o comprimento da segunda fileira das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C é, individualmente e independentemente, de 0 a 17 nucleótidos, preferencialmente, de 4 a 10 nucleótidos e, mais preferencialmente, de 4 a 6 nucleótidos.

Numa modalidade, a estrutura de hélice dupla das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreendem 4 a 10 pares de bases, preferencialmente, 4 a 6 pares de bases, mais preferencialmente, 5 pares de bases.

Numa modalidade preferida, a estrutura de hélice dupla das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreendem 4 a 10 pares de bases consecutivos, preferencialmente, 4 a 6 pares de bases consecutivos, mais preferencialmente, 5 pares de bases consecutivos.

Numa modalidade, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' RKSBUSNVGR 3' (SEQ ID N°. 120) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' YYNRCASSMY 3' (SEQ ID N°. 121).

Numa modalidade, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' XsSSSV 3' (SEQ ID N°. 124) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' BSSSXs 3' (SEQ ID N°. 125), em que Xs ou está ausente ou representa S.

Preferencialmente, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' SGGSR 3' (SEQ ID N°. 126) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' YSCCS 3' (SEQ ID N°. 127).

Numa modalidade, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' GCSGG 3' (SEQ ID N°. 128) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CCKGC 3' (SEQ ID N°. 129), preferencialmente, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' GCCGG 3' e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CCGGC 3'.

Numa modalidade, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CGUGCGCUUGAGAUAGG 3' e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CUGAUUCUCACG 3'.

Numa modalidade, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' UGAGAUAGG 3' e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CUGAUUCUCA 3'.

Numa modalidade, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' GAGAUAGG 3' e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CUGAUUCUC 3'.

Numa modalidade do primeiro aspeto, o FDE-1 é um FDE-1 humano e/ou o recetor de FDE-1 é um recetor de FDE-1 humano.

Numa modalidade do primeiro aspeto, o FDE-1 compreende uma sequência de aminoácidos, de acordo com a SEQ ID N°. 1.

Numa modalidade preferida do primeiro aspeto, a modificação é um radical de PEG, que consiste num PEG de cadeia linear ou ramificada, em que o peso molecular do radical PEG é, preferencialmente, de cerca de 2 a 180 kD, mais preferencialmente, de cerca de 60 a 140 kD e, o que é mais preferencial, cerca de 40 kD.

Numa modalidade do primeiro aspeto, a modificação é um radical de HES, em que, preferencialmente, o peso molecular do radical HES é de cerca de 10 a 130 kD, mais preferencialmente, de cerca de 30 a 130 kD e, mais preferencialmente, cerca de 100 kD.

Numa modalidade do quarto aspeto, o medicamento serve para a inibição de angiogénese, neovascularização, inflamação e metástases. A presente invenção também tem por objeto um processo para o rastreio de um antagonista de FDE-1 ou de um agonista de FDE-1 que compreende as etapas seguintes: - providenciar um candidato a antagonista de FDE-1 e/ou um candidato a agonista de FDE-1, - providenciar um ácido nucleico, de acordo com o primeiro aspeto, - providenciar um sistema de ensaio que providencia um sinal na presença de um antagonista de FDE-1 e/ou de um agonista de FDE-1 e - determinar se o candidato a antagonista de FDE-1 é um antagonista de FDE-1 e/ou se o candidato a agonista de FDE-1 é um agonista de FDE-1. A presente invenção também tem por objeto um processo para o rastreio de um agonista de FDE-1 e/ou um antagonista de FDE-1 que compreende as etapas seguintes: - providenciar um FDE-1 imobilizado numa fase, preferencialmente, uma fase sólida, - providenciar um ácido nucleico, de acordo com o primeiro aspeto, preferencialmente, um ácido nucleico, de acordo com o primeiro aspeto, que está marcado, - adicionar um candidato a agonista de FDE-1 e/ou um candidato a antagonista de FDE-1 e - determinar se o candidato a agonista de FDE-1 é um agonista de FDE-1 e/ou se o candidato a antagonista de FDE-1 é um antagonista de FDE-1. 0 processo pode ser realizado de tal modo que seja avaliado se o ácido nucleico está substituído pelo candidato a agonista de FDE-1 ou por um candidato a antagonista de FDE-1.

Também tem por objeto um antagonista de FDE-1, que se pode obter pelo processo de acordo com o sétimo aspeto ou com o oitavo aspeto. A presente invenção tem por base a verificação, surpreendente, que é possível gerar ácidos nucleicos, que se ligam especificamente e com elevada afinidade a FDE-1. FDE-1 é um péptido básico com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID N°. 1. A pi calculada de FDE-1 é de 9,70. Tal como se utiliza aqui, o termo FDE-1 refere-se a qualquer FDE-1 incluindo, mas não se limitando a FDE-1 de mamífero. Preferencialmente, o FDE-1 de mamífero seleciona-se no grupo que compreende FDE-1 de murganho, de rato, de coelho, de hamster, de macaco e de ser humano. Mais preferencialmente, o FDE-1 é um FDE-1 humano (SEQ ID N°. 1). A verificação de que ácidos nucleicos que se ligam com elevada afinidade a FDE-1 pode ser identificada é ainda assim surpreendente, conforme Eaton et al., (Eaton, Gold et al., 1997) observou que a geração de aptâmeros, isto é, ácidos nucleicos D se ligam a uma molécula-alvo, dirigida a uma proteína básica é, em geral, muito difícil porque este tipo de alvo produz uma proporção elevada mas não específica de sinal-ruído. Esta proporção elevada entre sinal e ruído resulta de uma afinidade elevada, não especifica, ilustrada pelos ácidos nucleicos para alvos básicos, tais como FDE-1.

As caracteristicas do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, tal como aqui descritas, podem ser realizadas em qualquer aspeto da presente invenção em que se utiliza o ácido nucleico, quer isolado ou em qualquer combinação.

Sem pretender estar liqado a qualquer teoria, os requerentes assumem que a especificidade observada dos ácidos nucleicos que se ligam a FDE-1, de acordo com a presente invenção, partilha algumas caracteristicas estruturais e, em particular, uma das sequências de nucleótidos que também é referida aqui como sequência nuclear, que deve ser discutida com mais detalhe a seguir, em que essa referência está ilustrada nas fig. 1 a 8 e no exemplo 1. Contudo, deve entender-se que as referidas fig. e o exemplo 1 incorporam várias das referidas caracteristicas estruturais, que não têm que ser necessariamente realizadas em cada um dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção.

Tal como se evidencia com mais detalhe nas reivindicações e no exemplo 1, as várias moléculas de ácidos nucleicos que se ligam a FDE-1 humano podem ser categorizadas com base nas referidas caixas e algumas caracteristicas e elementos estruturais, respetivamente. As várias categorias assim definidas são também referidas aqui como tipos e, mais especificamente, como tipo A, tipo B e tipo C.

Numa modalidade preferida, o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, é uma molécula simples de ácido nucleico. Noutra modalidade, a molécula simples de ácido nucleico está presente como uma variedade de moléculas simples de ácidos nucleicos. Preferencialmente, as expressões ácido nucleico e molécula de ácido nucleico são utilizadas de forma intermutável aqui, salvo indicação em contrário. É do conhecimento dos especialistas nesta técnica que a molécula de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, consiste preferencialmente em nucleótidos, que estão ligados covalentemente uns aos outros, preferencialmente através de ligações de fosfodiéster.

Os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, também devem compreender ácidos nucleicos que são praticamente homólogos às sequências particulares aqui descritas. A expressão praticamente homólogo deve ser entendida de tal modo que a homologia seja de pelo menos 75 %, preferencialmente, 85 %, mais preferencialmente, 90 % e, ainda mais preferencialmente, mais do que 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99%. A percentagem real de nucleótidos homólogos presentes no ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, irá depender do número total de nucleótidos presentes no ácido nucleico. A modificação percentual pode ter por base o número total de nucleótidos presentes no ácido nucleico. A homologia pode ser determinada pelo conhecimento de um especialista nesta técnica. Mais especificamente, um algoritmo de comparação de sequências vai então calcular a percentagem de identidade de sequências para o ensaio de sequências relativamente à sequência de referência, com base nos parâmetros desenhados para o programa. A sequência de ensaio é, preferencialmente, a sequência ou a molécula de ácidos nucleicos sobre a qual se vai verificar se é ou não homóloga e no caso de o ser em que medida, com outra molécula de ácido nucleico, em que essa outra molécula de ácido nucleico é também referida como sequência de referência. Numa modalidade, a sequência de referência é uma molécula de ácidos nucleicos, tal como aqui descrita, mais preferencialmente, uma molécula de ácidos nucleicos que tem uma sequência de acordo com qualquer uma das SEQ. ID. N°s. 5 a 144. 0 alinhamento ótimo das sequências para comparação pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman (Smith & Waterman, 1981), por meio do algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch (Needleman & Wunsch, 1970), pela pesquisa pelo processo da semelhança de Pearson & Lipman (Pearson & Lipman, 1988), por implementações em computador destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA, na Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) ou por inspeção visual.

Um exemplo de um algoritmo que é apropriado para a determinação da percentagem de identidade de sequências é o algoritmo utilizado na ferramenta de pesquisa de alinhamento básico local (daqui em diante referido como "BLAST"), ver, por exemplo, Altschul et al., (Altschul et al., 1990 e Altschul et al, 1997). O programa informático para a realização das análises por BLAST está disponível publicamente através do National Center for Biotechnology Information (daqui em diante referido como "NCBI"). Os parâmetros por defeito utilizados na determinação da entidade de sequência utilizam o programa informático disponível no NCBI, por exemplo, BLASTN (para as sequências de nucleótidos) e BLASTP (para as sequências de aminoácidos), estão descritos em McGinnis et al., (McGinnis et al., 2004). A expressão "ácido nucleico" ou "ácido nucleico de acordo com a presente invenção", também deve compreender os ácidos nucleicos que compreendem as sequências de ácidos nucleicos aqui descritas ou parte delas, preferencialmente, na medida em que os ácidos nucleicos ou as referidas partes estão envolvidos na ligação a FDE-1. Esses ácidos nucleicos podem derivar dos aqui descritos, por exemplo, por truncagem. A truncagem pode dizer respeito a uma das extremidades ou a ambas dos ácidos nucleicos, tal como aqui descritas. A truncagem também pode dizer respeito à sequência interior dos nucleótidos, isto é, pode dizer respeito aos nucleótidos entre os nucleótidos dos terminais 5' e 3', respetivamente. Além disso, a truncagem deve compreender a eliminação de tão pouco quanto um único nucleótido da sequência de ácidos nucleicos aqui descrita. A truncagem também pode estar relacionada com mais do que uma fileira de ácidos nucleicos da presente invenção, em que a fileira pode ser tão pequena como um nucleótido de comprimento. A ligação de um ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, pode ser determinada por um especialista na técnica, utilizando experiências de rotina ou utilizando ou adotando um processo, tal como aqui descrito, preferencialmente, como descrito aqui na parte dos exemplos.

Os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, podem ser quer ácidos nucleicos D, quer ácidos nucleicos L. Preferencialmente, os ácidos nucleicos da presente invenção são ácidos nucleicos L. Além disso, é possível que uma ou várias partes dos ácidos nucleicos estejam presentes como ácidos nucleicos D ou pelo menos uma ou várias partes dos ácidos nucleicos sejam ácidos nucleicos L. 0 termo "parte" dos ácidos nucleicos deve significar tão pouco quanto um nucleótido. Esses ácidos nucleicos são geralmente referidos aqui como ácidos nucleicos D e L, respetivamente. Por isso, numa modalidade particularmente preferida, os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, consistem em nucleótidos L e compreendem pelo menos um nucleótido D. Esse nucleótido D liga-se, preferencialmente, a uma parte diferente das fileiras que definem os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, preferencialmente, as suas partes, em que está envolvida uma interação com outras partes do ácido nucleico. Preferencialmente, esse nucleótido D está ligado a um terminal de qualquer uma das fileiras e de qualquer ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, respetivamente. Noutra modalidade preferida, esses nucleótidos D podem atuar como espaçadores ou como ligantes, preferencialmente, ligando modificações, tais como PEG e HES aos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção.

Está também dentro da presente invenção que cada uma das moléculas de ácidos nucleicos aqui descritas, na sua totalidade, em termos das suas sequências de ácidos nucleicos, estão limitadas a sequências particulares de nucleótidos. Por outras palavras, os termos "compreendendo" ou "compreende" devem ser interpretados nessas modalidades como significando que contêm ou consistem em.

Está também dentro do âmbito da presente invenção que os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, fazem parte de ácidos nucleicos mais compridos, em que estes ácidos nucleicos mais compridos compreendem várias partes em que pelo menos uma dessas partes é um ácido nucleico ou parte dele, de acordo com a presente invenção. As outras partes destes ácidos nucleicos mais longos podem ser um ou vários ácidos nucleicos D ou ácidos nucleicos L. Pode-se utilizar qualquer combinação em ligação com a presente invenção. Estas outras partes de ácidos nucleicos mais longos podem exibir uma função que é diferente da ligação, preferencialmente, a ligação a FDE-1. Uma possível função consiste em permitir a interação com outras moléculas, em que essas outras moléculas preferencialmente são diferentes de FDE-1, tais como, por exemplo, por imobilização, reticulação, deteção ou amplificação. Noutra modalidade da presente invenção, os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, compreendem, como radicais individuais ou combinados, vários dos ácidos nucleicos da presente invenção. Esses ácidos nucleicos compreendem vários dos ácidos nucleicos da presente invenção, estão também englobados pela expressão, ácidos nucleicos mais longos.

Os ácidos nucleicos L, tal como se utilizam aqui, são ácidos nucleicos que consistem em nucleótidos L, que consistem, preferencialmente, completamente em nucleótidos L.

Os ácidos nucleicos D, tal como se utilizam aqui, são ácidos nucleicos que consistem em nucleótidos D, que consistem, preferencialmente, completamente em nucleótidos D.

As expressões "ácido nucleico" e "molécula de ácido nucleico" utilizam-se aqui de forma intermutável, salvo indicação explicitamente em contrário.

Também, salvo indicação em contrário, qualquer sequência de nucleótidos é estabelecida aqui na direção 5'->3' .

No que respeita a saber se os ácidos nucleicos da presente invenção consistem em nucleótidos D, nucleótidos L ou uma combinação de ambos, sendo essa combinação, por exemplo, uma combinação aleatória ou uma sequência definida de fileiras que consistem em pelo menos um nucleótido L e pelo menos um ácido nucleico D, o ácido nucleico pode consistir em desoxiribonucleótidos, ribonucleótidos ou as suas combinações.

Conceber os ácidos nucleicos da presente invenção como ácidos nucleicos L, é vantajoso por várias razões. Os ácidos nucleicos L são enantiómeros de ácidos nucleicos de ocorrência natural. Os ácidos nucleicos D, contudo, não são muito estáveis em soluções aquosas e, particularmente, em sistemas biológicos ou amostras biológicas, devido à enorme presença de nucleases. As nucleases de ocorrência natural, particularmente as nucleases de células de animais, não são capazes de degradar os ácidos nucleicos L. Por causa desta semi-vida biológica do ácido nucleico L estar significativamente aumentada nesse sistema, incluindo o corpo do animal e do ser humano. Devido à falta de degradibilidade do ácido nucleico L, não se geram nenhuns produtos de degradação da nuclease e assim não se observam efeitos secundários. Este aspeto delimita o ácido nucleico L factualmente de todos os outros compostos que são utilizados na terapêutica de doenças e/ou distúrbios que envolvem a presença de FDE-1. Os ácidos nucleicos L que especificamente se ligam a uma molécula-alvo, através de um mecanismo diferente do emparelhamento de bases de Watson Crick ou os aptâmeros que consistem parcialmente ou completamente em nucleótidos L, particularmente, estando essas partes de aptâmeros envolvidas na ligação do aptâmero à molécula-alvo, são designados por Spiegelmers.

Está no âmbito da presente invenção que a primeira e a segunda fileiras de nucleótidos que flanqueiam a sequência nuclear de nucleótidos podem, em principio, hibridar uma com a outra. Após essa hibridação, forma-se uma estrutura de hélice dupla. É sabido dos especialistas na matéria que esta hibridação pode ou não ocorrer, particularmente em condições in vitro e/ou in vivo. Também, no caso dessa hibridação, não é necessariamente o caso dessa hibridação ocorrer ao longo de todas as duas fileiras, em que quando, pelo menos, com base nas regras do emparelhamento de bases, essa hibridação e assim a formação de estruturas de hélice dupla possa ocorrer. Tal como se utiliza preferencialmente aqui, uma estrutura de hélice dupla é uma parte de uma molécula ou de uma estrutura formada por duas ou mais hélices separadas, em que pelo menos um, preferencialmente, dois ou mais pares de bases existem que são bases emparelhadas preferencialmente de acordo com as regras de emparelhamento de bases de Watson-Crick. Também é do conhecimento de um especialista na matéria, que existem outros emparelhamentos de bases, tal como o emparelhamento de bases de Hoogsten, numa forma tal que a estrutura tenha hélice dupla.

Está também no âmbito da presente invenção, que os ácidos nucleicos da presente invenção, independentemente de estarem presentes como ácidos nucleicos D, ácidos nucleicos L ou ácidos nucleicos D,L ou se forem ADN ou ARN, podem estar presentes como ácidos nucleicos de hélice simples ou de hélice dupla. Normalmente, os ácidos nucleicos da presente invenção são ácidos nucleicos de hélice simples, que exibem estruturas secundárias definidas devido à sequência primária e podem assim também formar estruturas terciárias. Os ácidos nucleicos da presente invenção, contudo, também podem ser de hélice dupla, que tem o significado de duas hélices, que são complementares ou parcialmente complementares uma à outra, estão hibridadas uma com a outra. Isto confere estabilidade ao ácido nucleico que, em particular, será vantajoso se o ácido nucleico estiver presente na forma D de ocorrência natural em vez da forma L.

Os ácidos nucleicos da presente invenção podem estar modificados. Essas modificações podem estar relacionadas com os nucleótidos simples do ácido nucleico e são bem conhecidas na técnica. Exemplos dessas modificações estão descritos, entre outros, por Venkatesan et al., (Venkatesan, Kim et al., 2003) e Kusser (Kusser 2000) . Essas modificações podem ser de um átomo de H, um átomo de F ou um grupo O-CH3 ou um grupo NH2 na posição 2' dos nucleótidos individuais que vão constituir o ácido nucleico. Também o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, pode conter pelo menos um nucleótido LNA. Numa modalidade, o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, consiste em nucleótidos LNA.

Numa modalidade, os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, podem ser ácidos nucleicos multipartidos. Um ácido nucleico multipartido, tal como se utiliza aqui, é um ácido nucleico que consiste pelo menos em duas hélices de ácidos nucleicos. Pelo menos dois destes ácidos nucleicos formam uma unidade funcional em que a unidade funcional é um ligando de uma molécula-alvo. Pelo menos duas hélices de ácidos nucleicos podem derivar de qualquer um dos ácidos nucleicos da presente invenção, quer por clivagem do ácido nucleico para gerar duas hélices ou por síntese de um ácido nucleico, correspondendo a uma primeira parte da presente invenção, isto é, todos os ácidos nucleicos e outros ácidos nucleicos correspondentes à segunda parte de todos os ácidos nucleicos. É sabido que tanto a clivagem como a sintese se podem aplicar para gerar um ácido nucleico multipartido, em que há mais do que duas hélices, conforme foi exemplificado antes. Por outras palavras, pelo menos duas hélices de ácidos nucleicos são normalmente diferentes das duas hélices que lhes são complementares e hibridam uma com a outra, embora possa existir uma certa complementaridade entre as várias partes de ácidos nucleicos.

Finalmente, está também dentro do âmbito da presente invenção que se prepara uma estrutura completamente fechada, isto é, uma estrutura circular para os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, isto é, que os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, são fechados, preferencialmente através de uma ligação covalente, em que mais preferencialmente essa ligação covalente é feita entre a extremidade 5' e a extremidade 3' das sequências de ácidos nucleicos, conforme aqui descritas.

Os requerentes descobriram que os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, exibem um intervalo de valores de Kd muito favorável.

Uma possibilidade para determinar a constante de ligação é uma medição por ressonância plasmónica de superfície, utilizando o chamado dispositivo Biacore (Biacore AB, Uppsala, Suécia), que é também conhecido dos especialistas nesta técnica. A afinidade, tal como, preferencialmente, é utilizada aqui, foi também medida pela utilização do "ensaio de ligação do aumento de peso", tal como descrito nos exemplos. Uma mediação apropriada para expressar a intensidade de ligação entre o ácido nucleico e o alvo que, no caso presente, é FDE-1, é o chamado valor de Kd que, assim como o processo para a sua determinação são conhecidos dos especialistas na matéria.

Os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, são caracterizados por um certo valor de Kd. Preferencialmente, o valor de Kd ilustrado pelos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, está abaixo de 1 μΜ. Um valor de Kd de cerca de 1 μΜ diz-se que é caracterí stico de uma ligação não específica de um ácido nucleico a um alvo. Tal como é bem sabido pelos especialistas na matéria, o valor de Kd de um grupo de compostos, tais como os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, estão dentro de um certo intervalo. 0 Kd mencionado antes, de cerca de 1 μΜ, é um limite superior preferido para o valor de Kd. 0 limite inferior preferido para o Kd dos ácidos nucleicos que se ligam ao alvo pode ser de cerca de 10 picomolar ou superior. Está dentro da presente invenção que os valores de Kd dos ácidos nucleicos individuais, que se ligam a grelin, estão preferencialmente dentro deste intervalo. Os intervalos preferidos podem ser definidos escolhendo qualquer um dos primeiros números dentro deste intervalo e qualquer segundo número dentro deste intervalo.

Os valores superiores preferidos são 250 nM e 100 nM, os valores inferiores preferidos são 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM e 10 pM. A molécula de ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, pode ter qualquer comprimento desde que ainda sejam capazes de se ligar à molécula-alvo. É bem conhecido na técnica que há comprimentos preferidos para os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção. Normalmente, o comprimento está entre 15 e 120 nucleótidos. É bem sabido pelos especialistas nesta técnica que qualquer número inteiro entre 15 e 120 é um comprimento possível para os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção. Mais preferencialmente, os intervalos para os comprimentos dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, são os comprimentos de cerca de 20 a 100 nucleótidos, cerca de 20 a 80 nucleótidos, cerca de 20 a 60 nucleótidos, cerca de 20 a 50 nucleótidos e cerca de 20 a 40 nucleótidos.

Está dentro do âmbito da presente invenção, que os ácidos nucleicos aqui descritos compreendam um radical que, preferencialmente, é um radical de elevado peso molecular e/ou que, preferencialmente, permite modificar as características do ácido nucleico, em termos de, entre outros, tempo de permanência no corpo do animal, preferencialmente, o corpo de um ser humano. Uma modalidade particularmente preferida dessa modificação é a PEGuilação e a HESilação dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção. Tal como se utiliza aqui, PEG indica poli(etileno-glicol) e HES indica amido de hidroxietilo. A PEGuilação, tal como preferencialmente se utiliza aqui, é a modificação do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, em que essa modificação consiste num radical de PEG que se liga a um átomo de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção. A HESilação, tal como preferencialmente se utilizada aqui, é a modificação de um ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, em que essa modificação consiste num radical de HES, que se liga a um ácido nucleico, de acordo com a presente invenção. Estas modificações, assim como o processo de modificação de um ácido nucleico utilizando essas modificações, estão descritos no pedido de patente europeia 1 306 382.

Preferencialmente, o peso molecular de uma modificação, que consiste ou que compreende um radical de elevado peso molecular é de cerca de 2 000 a 200 000 Da, preferencialmente, 40 000 a 120 000 Da, particularmente no caso de se utilizar PEG como radical de elevado peso molecular é, preferencialmente, de 3 000 a 180 000 Da, mais preferencialmente, de 60 000 a 140 000 Da, particularmente no caso de HES, sendo esse radical de elevado peso molecular. O processo de modificação de HES está, por exemplo, no pedido de patente alemã 1 2004 006 249.8.

Está dentro do âmbito da presente invenção, que quer PEG, quer HES, podem ser utilizados quer como lineares ou ramificados, tal como está descrito nos pedidos de patentes W02005074993 e PCT/EP02/11950. Essa modificação, em princípio, pode ser realizada com as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção em qualquer uma das suas posições. Preferencialmente, essa modificação é realizada quer no nucleótido do terminal 5', no nucleótido do terminal 3' e/ou em qualquer nucleótido entre o nucleótido 5' e o nucleótido 3' da molécula de ácidos nucleicos. A modificação e, preferencialmente, o radical de PEG e/ou de HES pode ligar-se à molécula de ácido nucleico da presente invenção, quer diretamente, quer através de um ligante. Está também no âmbito da presente invenção que a molécula de ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, compreende uma ou mais modificações, preferencialmente, um ou mais radicais de PEG e/ou de HES. Numa modalidade, a molécula individual do ligante liga mais do que um radical de PEG ou mais do que um radical de HES a uma molécula de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção. 0 ligante utilizado em relação com a presente invenção pode ele próprio ser linear ou ramificado. Estes tipos de ligantes são conhecidos dos especialistas nesta técnica e estão ainda descritos nos pedidos de patentes W02005074993 e PCT/EP02/11950.

Sem pretender estar ligado a qualquer teoria, parece que por modificação dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, com radicais de elevado peso molecular, tais como polímeros e, mais particularmente, os polímeros aqui descritos, que são preferencialmente aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico, a cinética de excreção está alterada. Mais particularmente, parece que devido ao maior peso molecular desses ácidos nucleicos modificados da presente invenção e devido ao facto de os ácidos nucleicos não terem sido submetidos a um metabolismo particularmente quando estão na forma L, a excreção de um corpo de um animal, preferencialmente, do corpo de um mamífero e, mais preferencialmente, do corpo de um ser humano, diminuiu. Como a excreção normalmente ocorre por via dos rins, os requerentes assumem que a taxa de filtração glomerular do ácido nucleico assim modificado é significativamente reduzida em comparação com a dos ácidos nucleicos que não têm este tipo de modificação de elevado peso molecular, o que resulta num aumento do tempo de permanência no corpo. Em relação com isto, é particularmente importante notar que, apesar dessa modificação de elevado peso molecular, a especificidade do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, não está afetada de uma forma prejudicial. Assim, os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, têm características surpreendentes - que normalmente não são esperadas de compostos ativos sob o ponto de vista farmacêutico - tal como uma formulação farmacêutica que providencia uma libertação sustentada não é necessariamente necessária para providenciar uma libertação sustentada. Como os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, na sua forma modificada, contendo um radical de elevado peso molecular, já podem, como tal ser utilizados como uma formulação de libertação sustentada. Assim, as modificações das moléculas de ácidos nucleicos, conforme aqui descritas e as moléculas de ácidos nucleicos assim modificadas e qualquer composição que as contenha, podem providenciar uma farmacocinética perfeitamente controlada e a sua biodistribuição. Isto também inclui um tempo de permanência em circulação e a distribuição para os tecidos. Essas modificações estão ainda descritas no pedido de patente PCT/EP02/11950.

Contudo, está também dentro do âmbito da presente invenção que os ácidos nucleicos aqui descritos não contêm quaisquer modificações e, particularmente, não contêm modificações de elevado peso molecular, tais como PEGuilação ou HESilação. Essa modalidade é particularmente preferida quando a purificação dos ácidos nucleicos, a partir do corpo, após administração, é desejada. Essa purificação rápida pode ser desejada no caso de imagiologia in vivo ou requisitos de dosagem terapêuticos específicos, utilizando os ácidos nucleicos ou os medicamentos que os contêm, de acordo com a presente invenção.

Os ácidos nucleicos da presente invenção, que também são referidos aqui como ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção e/ou os antagonistas, de acordo com a presente invenção, podem ser utilizados para a geração ou para o fabrico de um medicamento. Esse medicamento contém, pelo menos, um dos ácidos nucleicos da presente invenção, eventualmente em conjunto com outros compostos ativos sob o ponto de vista farmacêutico, em que o ácido nucleico da presente invenção, preferencialmente, atua como um composto ativo sob o ponto de vista farmacêutico por si só. Esses medicamentos contêm, em modalidades preferidas, pelo menos um veículo, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Esse veículo pode ser, por exemplo, água, tampão, STF, solução de glicose, solução de sacarose, solução de manose, preferencialmente, uma solução equilibrada com sacarose a 5 %, amido, açúcar, gelatina ou qualquer outra substância veicular aceitável. Esses veículos são geralmente conhecidos dos especialistas na matéria. Será entendido por um especialista na matéria que quaisquer modalidades, utilizações e aspetos relacionados com o medicamento da presente invenção, são também aplicáveis à composição farmacêutica da presente invenção e vice-versa. A indicação, doenças e distúrbios para o tratamento e/ou a prevenção desses ácidos nucleicos, as composições farmacêuticas e os medicamentos, de acordo com ou preparados de acordo com a presente invenção, resultam do envolvimento quer direto, quer indireto de FDE-1, no respetivo mecanismo patogénico.

Obviamente, como os ácidos nucleicos que se ligam a FDE-1, de acordo com a presente invenção, interagem ou ligam-se a FDE-1 de seres humanos ou de murinos, um especialista na matéria entenderá que os ácidos nucleicos que se ligam a FDE-1, de acordo com a presente invenção, podem ser facilmente utilizados para o tratamento, a prevenção e/ou o diagnóstico de quaisquer doenças, conforme aqui descritas, de seres humanos e de animais.

As doenças e/ou os distúrbios e/ou os estados clínicos patológicos para serem tratados e/ou prevenidos utilizando esses medicamentos incluem, mas não se limitam a doenças da parte anterior do olho, tais como retinopatia, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade, tanto na sua forma anidra como húmida; cancro; cancro da mama, ovários, próstata, pâncreas, tiróide, nasofaringe, cólon, pulmão e estômago; osteossarcoma; melanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; leucemia linfocitica crónica das células B; mieloma múltiplo; linfoma; síndrome de WHIM; síndromes de deficiências imunitárias; neo-vascularização patológica; inflamação; esclerose múltipla; artrite, artrite reumatóide, osteoartrite e nefrite.

Noutra modalidade, o medicamento inclui mais um agente ativo sob o ponto de vista farmacêutico. Esses outros compostos ativos sob o ponto de vista farmacêutico podem ser os que são conhecidos pelos especialistas nesta técnica e selecionam-se, preferencialmente, no grupo que compreende quimiocinas ou antagonistas de citocinas, corticosteróides e similares. Um especialista nesta técnica entenderá que dadas as várias indicações que podem ser realizadas, de acordo com a presente invenção, por meio de ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, os referidos outros agentes ativos sob o ponto de vista farmacêutico pode ser qualquer um que, em principio, seja apropriado para o tratamento e/ou a prevenção dessas doenças. As moléculas de ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, particularmente se estiverem presentes ou forem utilizadas como um medicamento, combinam-se preferencialmente com inibidores de FCEV, tais como Macugen (Pegatanib) da Pfizer Ophthalmics, Lucentis (Ranitizumab) da Novartis Ophthalmics, Avastina (Bevacizumab) da Roche (utilização fora da marca); ou com terapêutica fotodinâmica, tal como Visudyne (Verteporfing) da Novartis Ophthalmics e derivados de cortisona injetados intravitreamente, tais como Retaane (acetato de anecortave) da Alcon Inc.

Alternativamente ou adicionalmente, esses outros agentes ativos sob o ponto de vista farmacêutico são outros ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. Alternativamente, o medicamento compreende pelo menos mais um ácido nucleico que se liga a uma molécula-alvo diferente de FDE-1 ou que exibe uma função que é diferente da dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção.

Como é bem conhecido pelos especialistas nesta técnica, os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser utilizados factualmente em qualquer doença, em que se possa administrar um antagonista de FDE-1 a um doente que necessite desse antagonista e que esse antagonista seja apropriado para eliminar a causa da doença ou do distúrbio ou pelo menos para reduzir os efeitos da doença ou do distúrbio. Esses efeitos incluem, mas não se limitam a neovascularização patológica, inflamação e metástases. A aplicabilidade dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, que está ligada a esta e a outras doenças ou distúrbios resulta, entre outras coisas, do envolvimento de FDE-1, tal como foi sublinhado na parte introdutória da presente memória descritiva, que está aqui incorporada como referência, para evitar repetições desnecessárias.

Está dentro do âmbito da presente invenção o facto de um medicamento ser utilizado alternativamente ou adicionalmente, em principio, para a prevenção de qualquer das doenças descritas em relação com a utilização do medicamento para o tratamento das referidas doenças. Os seus respetivos marcadores, isto é, para as doenças respetivas são conhecidos dos especialistas nesta técnica. Preferencialmente, o respetivo marcador é FDE-1. Alternativamente e/ou adicionalmente, o respetivo marcador seleciona-se no grupo de marcadores de tensão oxidativa, compreendendo redutase da transmembrana de ferricianeto (RTM), atividade acrescida da via de sorbitol que inclui, após acumulação de sorbitol, uma proporção citosólica aumentada de NADH/NAD, diminuição de NADPH e acumulação de frutose com a resultante produção não enzimática de produtos terminais de glicação avançada (AGES) e consequente ativação da proteína-cinase C, eventos a jusante mediados pela tensão oxidativa e nitrose ativa, tais como ativação da cinase MAP; marcadores inflamatórios, compreendendo ICAM-1, VCAM-1, RANTES, haptoglobina ou proteína reativa C; e marcadores pró-angiogénicos como eritropoietina ou FCEV. Tendo isto em vista, os referidos marcadores podem ser utilizados para determinar se um indivíduo ou doente pode ou não ser tratado com qualquer uma das moléculas de ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção. Por isso, num outro aspeto, a presente invenção tem por objeto esse processo, em que a presença ou a ausência e, mais especificamente, a concentração dos respetivos marcadores está determinada. Os processos para a deteção dos referidos marcadores, eventualmente, para a sua quantificação, assim como, o intervalo dentro do qual os respetivos marcadores devem estar presentes ou ausentes, para decidir se o indivíduo ou doente sofre ou não de qualquer uma das referidas doenças ou está em risco de desenvolver essas doenças e, de acordo com isto, poderá assim ser tratado, de acordo com a presente invenção, são conhecidos dos especialistas nesta técnica.

Numa modalidade do medicamento da presente invenção, esse medicamento é para ser utilizado em combinação com outros tratamentos, para qualquer uma das doenças aqui descritas, particularmente aquelas para as quais o medicamento da presente invenção deve ser utilizado. "Terapêutica de combinação" (ou "co-terapêutica") inclui a administração de um medicamento da presente invenção e, pelo menos, um segundo agente, como parte de um regime de tratamento específico, realizado para providenciar efeitos benéficos da co-ação destes agentes terapêuticos, isto é, o medicamento da presente invenção e o referido segundo agente. 0 efeito benéfico da combinação inclui, mas não se limita a co-ação farmacocinética ou farmacodinâmica resultante da combinação de agentes terapêuticos. A administração destes agentes terapêuticos, em combinação, faz-se normalmente ao longo de um período definido de tempo (normalmente minutos, horas, dias ou semanas, consoante a combinação selecionada). "Terapêutica de combinação" pode englobar, mas geralmente não engloba a administração de dois ou mais destes agentes terapêuticos como parte de regimes separados mono-terapêuticos, que incidentalmente e arbitrariamente resultam das combinações da presente invenção. "Terapêutica de combinação" entende-se que engloba a administração destes agentes terapêuticos de uma forma sequencial, isto é, em que cada agente terapêutico é administrado num momento diferente, assim como, a administração destes agentes terapêuticos ou de pelo menos dois dos agentes terapêuticos é realizada de uma maneira praticamente simultânea. A administração praticamente simultânea pode conseguir-se, por exemplo, por administração a um indivíduo de uma única cápsula com uma proporção fixa de cada agente terapêutico ou em múltiplas cápsulas simples para cada um dos agentes terapêuticos. A administração sequencial ou praticamente simultânea de cada agente terapêutico pode ser efetuada por qualquer via apropriada incluindo, mas não se limitando a vias tópicas, vias orais, vias intravenosas, vias intramusculares e absorção direta através dos tecidos da membrana da mucosa. Os agentes terapêuticos podem ser administrados pela mesma via ou por vias diferentes. Por exemplo, um primeiro agente terapêutico da combinação selecionada pode ser administrado por injeção, enquanto os outros agentes terapêuticos da combinação podem ser administrados topicamente.

Alternativamente, por exemplo, todos os agentes terapêuticos podem ser administrados topicamente ou todos os agentes terapêuticos podem ser administrados por injeção. A sequência pela qual os agentes terapêuticos são administrados não é suficientemente crítica, salvo indicação em contrário. "Terapêutica de combinação" também pode englobar a administração de agentes terapêuticos, tal como foram descritos antes, numa outra combinação com outros princípios ativos sob o ponto de vista biológico. Quando a terapêutica de combinação compreende ainda um tratamento que não inclui fármacos, o tratamento que não inclui fármacos pode ser realizado em qualquer momento, desde que se consiga o efeito benéfico da co-ação da combinação de agentes terapêuticos e tratamentos que não incluem fármacos. Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico é ainda alcançado quando o tratamento que não inclui fármacos é temporariamente eliminado da administração dos agentes terapêuticos, talvez durante dias ou mesmo semanas.

Tal como foi sublinhado antes, em termos gerais, o medicamento, de acordo com a presente invenção, pode ser administrado, em principio, em qualquer forma conhecida dos especialistas nesta técnica. Uma via de administração preferida é a administração sistémica, mais preferencialmente, por administração parentérica, preferencialmente, por injunçâo. Alternativamente, o medicamento pode ser administrado localmente. Outras vias de administração compreendem a administração intramuscular, intraperitonial e subcutânea, per orum, intranasal, intratraqueal ou pulmonar, dando-se preferência à via de administração que for menos invasiva, embora assegurando eficácia. A administração parentérica é geralmente utilizada para injeções subcutâneas, intramusculares ou intravenosas e infusões. Adicionalmente, uma abordagem para a administração parentérica utiliza a implantação de sistemas de libertação lenta ou de libertação sustentada, que asseguram que se mantém um nivel constante de dose, que são bem conhecidos dos especialistas nesta técnica.

Além disso, os medicamentos preferidos da presente invenção podem ser administrados numa forma intranasal, por via da utilização tópica de veículos intranasais apropriados, inalantes ou por vias transdérmicas, utilizando essas formas de adesivos transdérmicos para a pele, bem conhecidos dos especialistas nesta técnica. Para ser administrado sob a forma de um sistema de libertação transdérmica, a administração da dose obviamente será continua, em vez de ser intermitente através de um regime de dosagem. Outras preparações tópicas preferidas incluem cremes, pomadas, loções, aerossóis e géis, em que a concentração do principio ativo normalmente varia entre 0,01 % a 15 %, p/p ou p/v. O medicamento da presente invenção conterá normalmente uma quantidade eficaz dos componentes ativos da terapêutica, incluindo, mas não se limitando a uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, dissolvida ou dispersa num meio, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Os meios, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico ou os veículos incluem qualquer um ou todos os dissolventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes anti-bacterianos e anti-fúngicos e agentes isotónicos de absorção retardada e similares. A utilização desses meios e agentes para substâncias ativas sob o ponto de vista farmacêutico é bem conhecida da técnica. Também se podem incorporar princípios ativos suplementares no medicamento da presente invenção.

Um outro aspeto da presente invenção está ainda relacionado com uma composição farmacêutica. Essa composição farmacêutica compreende pelo menos um dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção e, preferencialmente, um ligante, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Esse ligante pode ser qualquer ligante utilizado e/ou conhecido na técnica. Mais particularmente, esse ligante é qualquer ligante, tal como foi discutido em ligação com o fabrico do medicamento aqui descrito. Noutra modalidade, a composição farmacêutica compreende mais um agente ativo sob o ponto de vista farmacêutico. A preparação de um medicamento e de uma composição farmacêutica será conhecida dos especialistas nesta técnica à luz da presente memória descritiva. Normalmente, essas composições podem ser preparadas como soluções ou suspensões liquidas injetáveis; formas sólidas apropriadas para solução ou suspensão em liquidos antes da injeção; como comprimidos ou outras formas de administração sólidas; como cápsulas que se libertam ao longo do tempo; ou qualquer outra forma normalmente utilizada, incluindo gotas para os olhos, cremes, loções, pomadas, inalantes e similares. A utilização de formulações esterilizadas, tal como águas de lavagem à base de soluções salinas, por cirurgiões, médicos ou trabalhadores da saúde, para tratar uma área particular no campo da operação, podem também ser particularmente úteis. As composições podem ser administradas por via de micro-aparelhos, micro-particulas ou esponjas.

Após a formulação, o medicamento será administrado de uma forma compatível com a formulação farmacêutica e numa quantidade tal, que seja eficaz sob o ponto de vista farmacológico. As formulações são facilmente administradas numa variedade de formas farmacêuticas, tais como o tipo de soluções injetáveis descritas antes, mas também se podem utilizar cápsulas de libertação do fármaco e similares.

Neste contexto, a quantidade de princípio ativo e o volume da composição que vai ser administrada depende do indivíduo ou do sujeito a ser tratado. As quantidades específicas de composto ativo, necessárias para a administração, dependem da decisão do médico e são peculiares para cada indivíduo.

Normalmente utiliza-se um volume mínimo de um medicamento necessário para dispersar os compostos ativos. Os regimes apropriados para administração também são variáveis, mas poderão ser tipificados pela administração inicial do composto e monitorização dos resultados e depois tomas posteriores de doses controladas a diversos intervalos.

Por exemplo, para a administração oral, sob a forma de um comprimido ou de uma cápsula (por exemplo, uma cápsula de gelatina) o componente ativo do fármaco, isto é, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção e/ou qualquer outro agente ativo sob o ponto de vista farmacêutico, também aqui referidos como agentes terapêuticos ou compostos ativos, podem combinar-se com um veiculo oral, não tóxico, inerte, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, tal como etanol, glicerol, água e similares. Além disso, quando desejado ou necessário, também se pode incorporar na mistura ligantes, lubrificantes, agentes de desintegração e agentes corantes apropriados. Os ligantes apropriados incluem amido, silicato de alumínio e magnésio, pasta de amido, gelatina, metil-celulose, carboximetilcelulose sódica e/ou polivinil-pirrolidona, açúcares naturais, tais como glicose ou beta-lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas, tais como goma de acácia, tragacanto ou alginato de sódio, polietileno-glicol, ceras e similares. Os lubrificantes utilizados nestas formas farmacêuticas incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, silica, talco, ácido esteárico, os seus sais de cálcio ou de magnésio e/ou polietilenoglicol e similares. Os desintegrantes incluem, sem limitação, amido, metil-celulose, agar, bentonite, amidos de goma de xantano, agar, ácido algínico ou o seu sal de sódio ou misturas efervescentes e similares. Os diluentes incluem, por exemplo, lactose, dextrose, sacarose, manitol, sorbitol, celulose e/ou glicina. 0 medicamento da presente invenção também pode ser administrado em formas farmacêuticas orais, sob a forma de comprimidos ou cápsulas de libertação ao longo do tempo e de libertação sustentada, pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões. Os supositórios preparam-se, com vantagem, a partir de emulsões ou suspensões gordas. A composição farmacêutica ou o medicamento podem ser esterilizados e/ou podem conter adjuvantes, tais como agentes conservantes, estabilizantes, de molhagem ou emulsionantes, promotores da solução, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões. Além disso, podem também conter outras substâncias válidas sob o ponto de vista terapêutico. As composições são preparadas de acordo com processos convencionais de mistura, granulação ou revestimento e normalmente compreendem cerca de 0,1 % a 75 %, preferencialmente, cerca de 1 % a 50 % do princípio ativo.

As composições líquidas, particularmente as injetáveis, podem ser preparadas, por exemplo, por dissolução, dispersão, etc. Dissolve-se o composto ou mistura-se com um dissolvente puro, tal como, por exemplo, água, soro fisiológico, dextrose aquosa, glicerol, etanol e similares, para assim formar a solução ou a suspensão injetável. Além disso, as formas sólidas apropriadas para a dissolução em líquidos antes da injeção também podem ser formuladas.

Para as composições sólidas, os excipientes incluem os graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio e similares. O composto ativo definido antes pode também ser formulado sob a forma de supositórios, utilizando, por exemplo, polialquileno-glicóis, por exemplo, propileno-glicol, como veiculo. Nalgumas modalidades, os supositórios são preparados, com vantagem, a partir de emulsões ou suspensões gordas.

Os medicamentos e as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção também podem ser administrados respetivamente, sob a forma de sistemas de libertação de lipossomas, tais como vesículas unilamelares pequenas, vesículas unilamelares grandes e vesículas multilamelares. Os lipossomas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolípidos, contendo colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas. Nalgumas modalidades, hidrata-se uma película de componentes de lípidos com uma solução aquosa do fármaco para formar uma camada lipídica que encapsula o fármaco, o que é bem conhecido da prática desta técnica. Por exemplo, as moléculas de ácidos nucleicos aqui descritas podem ser fornecidas sob a forma de complexos com um composto lipofílico ou não imunogénico, um composto de elevado peso molecular preparado utilizando processos conhecidos na técnica. Adicionalmente, os lipossomas podem comportar essas moléculas de ácidos nucleicos na sua superfície para atingir e transportar agentes citotóxicos internamente para mediar a morte das células. Um exemplo de complexos associados aos ácidos nucleicos é dado na patente norte-americana N°. 6 011 020.

Os medicamentos e as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção, também podem ser acoplados respetivamente, a polímeros solúveis, como veículos de fármacos direcionados. Esses polímeros podem incluir polivinilpirrolidona, co-polímero de pirano, poli-hidroxipropil-metacrilamido-fenol, poli-hidroxietilaspanamidofenol ou polietileno-óxido-poli-lisina substituídos com resíduos de palmitoílo. Além disso, os medicamentos e as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção, respetivamente, podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis, úteis para conseguir uma libertação controlada de um fármaco, por exemplo, ácido poliláctico, poliépsilon-capro-lactona, ácido poli-hidroxi-butírico, poliortoésteres, poliacetais, polidi-hidropiranos, policianoacrilatos e copolímeros de hidrogéis reticulados ou formando blocos anfipáticos.

Se desejado, a composição e o medicamento que vão ser administrados, respetivamente, também podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes de molhagem ou emulsionantes, agentes de tamponamento do pH e outras substâncias, tais como, por exemplo, acetato de sódio e oleato de trietanolamina. 0 regime de dosagem que utiliza as moléculas de ácidos nucleicos e os medicamentos da presente invenção, selecionam-se, respetivamente, de acordo com uma variedade de fatores incluindo tipo, espécie, idade, peso, género e estado clinico do doente; a gravidade do estado clinico a ser tratado; a via de administração; a função renal e hepática do doente; e o aptâmero particular do sal utilizado. Um médico ou um veterinário com as competências apropriadas pode facilmente determinar e prescrever a quantidade eficaz do fármaco, necessária para prevenir, conter ou parar o progresso do estado clinico.

Os níveis eficazes de ácido nucleico no plasma, de acordo com a presente invenção, variam, preferencialmente, entre 500 fM e 500 μΜ no tratamento de qualquer uma das doenças aqui descritas.

As moléculas de ácidos nucleicos e os medicamentos da presente invenção podem ser administrados, respetivamente, numa dose diária única, de dois em dois ou de três em três dias, semanalmente, de duas em duas semanas, numa única dose mensal ou de três em três meses.

Está dentro do âmbito da presente invenção o facto de o medicamento, tal como aqui descrito, constituir a composição farmacêutica aqui descrita.

Um outro aspeto da presente invenção, tem por objeto um processo para o tratamento de um indivíduo que necessite desse tratamento, em que o processo compreende a administração de uma quantidade ativa, sob o ponto de vista farmacêutico, de pelo menos um dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção. Numa modalidade, o indivíduo sofre de uma doença ou está em risco de desenvolver essa doença, em que a doença é qualquer uma das descritas aqui, particularmente qualquer uma dessas doenças descritas em ligação com a utilização de qualquer um dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, para o fabrico de um medicamento.

Tal como se utiliza aqui, preferencialmente, um diagnóstico ou um agente de diagnóstico ou meios de diagnóstico que são apropriados para detetar, quer diretamente, quer indiretamente FDE-1, tal como descrito em relação a vários distúrbios e doenças aqui descritas. 0 diagnóstico é apropriado para a deteção e/ou o seguimento de qualquer dos distúrbios e das doenças aqui descritas, respetivamente. Essa deteção é possível através da ligação dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, a FDE-1. Essa ligação pode ser detetada quer diretamente, quer indiretamente. Os respetivos processos e meios são conhecidos dos especialistas na técnica. Entre outros, os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, podem compreender um marcador que permite a deteção dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, preferencialmente, o ácido nucleico ligado a FDE-1. Esse marcador seleciona-se, preferencialmente, no grupo que consiste em marcadores radioativos, enzimáticos e fluorescentes. Em principio, todos os ensaios conhecidos desenvolvidos para anticorpos podem ser adaptados para os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, em que o anticorpo ligado ao alvo é substituído por um ácido nucleico ligado ao alvo. Noutros ensaios de anticorpos, que utilizam anticorpos não marcados, ligados aos alvos, a deteção faz-se preferencialmente, por meio de um anticorpo secundário, que é modificado por marcadores radioativos, enzimáticos e fluorescentes e liga o anticorpo de ligação ao alvo no seu fragmento Fc. No caso de um ácido nucleico, preferencialmente um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, modifica-se o ácido nucleico com esse marcador e esse marcador seleciona-se, preferencialmente, no grupo que compreende biotina, Cy-3 e Cy-5 e deteta-se esse marcador por meio de um anticorpo dirigido contra esse marcador, por exemplo, um anticorpo anti-biotina e um anticorpo anti-Cy3 ou um anticorpo anti-Cy5 ou - no caso de o marcador ser biotina o marcador é detetado por meio de estreptavidina ou avidina, que se ligam naturalmente a biotina. Esse anticorpo, estreptavidina ou avidina, por sua vez, é modificado preferencialmente com um marcador respetivo, por exemplo, um marcador radioativo, enzimático ou fluorescente (como um anticorpo secundário).

Noutra modalidade, as moléculas de ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, são detetadas ou analisadas por um segundo meio de deteção, em que o referido meio de deteção é um sinal molecular. A metodologia do sinal molecular é conhecida dos especialistas nesta técnica. Em resumo, as sondas de ácidos nucleicos que também são referidas como sinais moleculares, são um complemento inverso das amostras de ácidos nucleicos que se querem detetar e hibridar, porque causa desta parte da amostra de ácido nucleico a ser detetada. Após a liqação à amostra de ácido nucleico, os grupos fluorofóricos do sinal molecular são separados, o que resulta numa alteração do sinal de fluorescência, preferencialmente uma alteração da sua intensidade. Esta alteração está relacionada com a quantidade de amostra de ácidos nucleicos presente.

Um especialista nesta técnica compreenderá que, devido à relação aqui sublinhada entre FDE-1 e o seu correspondente recetor, as doenças e estados clinicos que podem ser diagnosticados utilizando as moléculas de ácido nucleico da presente invenção são, em principio, exatamente as mesmas que foram aqui descritas em relação com a utilização das referidas moléculas de ácidos nucleicos para o tratamento e/ou a prevenção da referida doença.

Independentemente disso, outras utilizações das moléculas de ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, residem num decréscimo da hematopoiese, um decréscimo da invasão ou das metástases, um decréscimo do desenvolvimento de células B e quimiotaxia, um decréscimo da quimioatração de células T e uma indução da paragem do crescimento e apoptose.

Em relação com a deteção de FDE-1, um processo preferido compreende as etapas seguintes: (a) providenciar uma amostra que é para ser analisada quanto à presença de FDE-1, (b) providenciar um ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, (c) fazer reagir a amostra com o ácido nucleico, preferencialmente num reator, em que a etapa (a) pode ser realizada antes da etapa (b) ou a etapa (b) pode ser realizada antes da (a).

Numa modalidade preferida, providencia-se uma outra etapa d) , que consiste na deteção da reação da amostra com o ácido nucleico. Preferencialmente, o ácido nucleico da etapa b) é imobilizado numa superfície. A superfície pode ser a superfície de um reator, tal como um tubo de reação, um poço de uma placa ou a superfície de um dispositivo contido nesse reator, tal como, por exemplo, uma pérola. A imobilização do ácido nucleico na superfície pode ser realizada por qualquer meio conhecido dos especialistas nesta técnica incluindo, mas não se limitando a ligações covalentes ou não covalentes. Preferencialmente, a ligação estabelece-se por via de uma ligação química covalente entre a superfície e o ácido nucleico. Contudo, está também dentro do âmbito da presente invenção que o ácido nucleico seja imobilizado indiretamente na superfície, em que essa imobilização direta envolve a utilização de mais um componente ou um par de parceiros de iteração. Esse componente adicional é, preferencialmente, um composto que interage especificamente com o ácido nucleico a ser imobilizado, que é também referido como um parceiro de interação e assim medeia a ligação do ácido nucleico à superfície. 0 parceiro da interação seleciona-se, preferencialmente, no grupo que compreende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas e anticorpos. Preferencialmente, o parceiro de interação é um anticorpo, mais preferencialmente, um anticorpo monoclonal. Alternativamente o parceiro de interação é um ácido nucleico, preferencialmente, um ácido nucleico funcional. Mais preferencialmente, esse ácido nucleico funcional seleciona-se no grupo que compreende aptâmeros, Spiegelmers e ácidos nucleicos que são pelo menos parcialmente complementares do ácido nucleico. Noutra modalidade alternativa, a ligação do ácido nucleico à superfície é mediada por um parceiro de interação de várias partes. Esse parceiro de interação de várias partes é, preferencialmente, um par de parceiros de interação ou um parceiro de interação que consiste num primeiro elemento e num segundo elemento, em que o primeiro elemento está compreendido ou está ligado ao ácido nucleico e o segundo elemento está ligado ou está compreendido na superfície. 0 parceiro de interação de várias partes seleciona-se, preferencialmente, no grupo de pares de parceiros de interação, que compreendem biotina e avidina, biotina e estreptavidina e biotina e neutravidina. Preferencialmente, o primeiro elemento do par de parceiros de interação é a biotina.

Um resultado preferido desse processo é a formação de um complexo imobilizado de FDE-1 e do ácido nucleico, em que, mais preferencialmente, o referido complexo é detetado. Está dentro desta modalidade que se deteta o complexo de FDE-1. 0 processo para a deteção de FDE-1 também compreende que a amostra seja removida do reator que tenha sido utilizado preferencialmente para a realizar a etapa c). 0 processo compreende, numa outra modalidade, em que também a etapa de imobilização de um parceiro de interação de FDE-1 na superfície, preferencialmente, uma superfície, tal como foi definida antes, em que o parceiro de interação tem a definição dada aqui e, preferencialmente dada antes, em ligação com o respetivo processo e, mais preferencialmente, compreende ácidos nucleicos, polipéptidos proteínas e anticorpos, nas suas várias modalidades. Nesta modalidade, o meio de deteção particularmente preferido é um ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, em que esse ácido nucleico pode ser, preferencialmente, marcado ou não marcado. No caso de esse ácido nucleico ser marcado, ele pode ser detetado diretamente ou indiretamente. Essa deteção também pode envolver a utilização de um segundo meio de deteção, que é, preferencialmente, também selecionado no grupo que compreende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas e modalidades das várias modalidades aqui descritas. Esses meios de deteção são, preferencialmente, específicos para o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção. Numa modalidade mais preferida, o segundo meio de deteção é um sinal molecular. Quer o ácido nucleico ou o segundo meio de deteção ou ambos podem compreender, numa modalidade preferida, um marcador de deteção. 0 marcador de deteção seleciona-se, preferencialmente, no grupo que compreende biotina, um marcador de bromo-desoxiuridina, um marcador de digoxigenina, um marcador de fluorescência, um marcador de UV, um radiomarcador e uma molécula quelante. Alternativamente, o segundo meio de deteção interage com o marcador de deteção, que está contido preferencialmente, ou está ligado ao ácido nucleico. As combinações particularmente preferidas são as que se seguem: o marcador de deteção é biotina e o segundo meio de deteção é um anticorpo dirigido contra a biotina ou em que o marcador de deteção é biotina e o segundo meio de deteção é uma avidina ou uma molécula portadora de avidina ou em que o marcador de deteção é biotina e o segundo meio de deteção é uma estreptavidina ou uma molécula portadora de estreptavidina ou em que o marcador de deteção é biotina e o segundo meio de deteção é uma neutravidina ou uma molécula portadora de neutravidina ou em que o marcador de deteção é bromo-desoxiuridina e o segundo meio de deteção é um anticorpo dirigido contra bromo-desoxiuridina ou em que o marcador de deteção é digoxigenina e o segundo meio de deteção é um anticorpo dirigido contra digoxigenina ou em que o marcador de deteção é um agente quelante e o segundo meio de deteção é um radio-nuclidio, em que se prefere que o referido marcador de deteção esteja ligado ao ácido nucleico. Sabe-se que este tipo de combinação é também aplicável à modalidade em que o ácido nucleico está ligado à superfície. Nessa modalidade, prefere-se que o marcador de deteção esteja ligado a um parceiro de interação.

Finalmente, está também dentro do âmbito da presente invenção, que o segundo meio de deteção seja detetado utilizando um terceiro meio de deteção, preferencialmente, o terceiro meio de deteção é uma enzima, mais preferencialmente, que exiba uma reação enzimática após deteção do segundo meio de deteção ou o terceiro meio de deteção é um meio para detetar radiação, mais preferencialmente, radiação emitida por um radio-nuclidio. Preferencialmente, o terceiro meio de deteção deteta especificamente e/ou interage com o segundo meio de deteção.

Também na modalidade com um parceiro de interação de FDE-1 a ser imobilizado numa superfície e o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, é preferencialmente adicionado ao complexo formado entre o parceiro de interação e FDE-1, a amostra pode ser retirada da reação, mais preferencialmente, do reator, quando se realizam as etapas c) e/ou d).

Numa modalidade, o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, compreende um radical fluorescente e a fluorescência desse radical fluorescente é diferente da formação de complexo entre o ácido nucleio e FDE-1 e FDE-1 livre.

Noutra modalidade, o ácido nucleico é um derivado do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, em que o derivado do ácido nucleico compreende pelo menos um derivado fluorescente de adenosina substituindo adenosina. Numa modalidade preferida, o derivado fluorescente de adenosina é etenoadenosina.

Numa outra modalidade, o complexo consiste num derivado do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção e o FDE-1, que deteta-se utilizando a fluorescência.

Numa modalidade do processo, cria-se um sinal na etapa (c) ou na etapa (d) e, preferencialmente, o sinal está correlacionado com a concentração de FDE-1 na amostra.

Num aspeto preferido, os ensaios podem realizar-se em placas de 96 poços, em que os componentes estão imobilizados nos reatores, tal como descrito antes e os poços atuam como reatores. 0 ácido nucleico da presente invenção pode ainda ser utilizado como material inicial para a conceção do fármaco. Basicamente, há duas abordagens possíveis. Uma abordagem consiste em rastrear bibliotecas de compostos, em que essas bibliotecas de compostos são, preferencialmente, bibliotecas de compostos de baixo peso molecular. Numa modalidade, o rastreio é um rastreio de elevado rendimento. Preferencialmente, o rastreio de elevado rendimento é rápido, eficaz e permite a avaliação por tentativa e erro dos compostos num ensaio à base do alvo. No melhor caso, a análise realiza-se por meio de medições colorimétricas. As bibliotecas, tal como se utilizam em relação a este tema, são conhecidas dos especialistas nesta técnica.

Alternativamente, o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizado para uma conceção racional de fármacos. Preferencialmente, a conceção racional de fármacos é a conceção de uma estrutura que leve a um produto farmacêutico. Partindo de uma estrutura tridimensional do alvo que é normalmente identificado por processos, tais como cristalografia de raios-X ou espetroscopia de ressonância magnética nuclear, utilizam-se programas de computador para pesquisar, através de bases de dados que contêm estruturas de muitos compostos químicos diferentes. A seleção é feita por um computador, os compostos identificados podem, em seguida, ser analisados num laboratório. A conceção racional dos fármacos pode partir de qualquer um dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção e envolve uma estrutura, preferencialmente, uma estrutura tridimensional, que é semelhante à estrutura dos ácidos nucleicos da presente invenção ou idêntica às partes que medeiam a ligação da estrutura dos ácidos nucleicos da presente invenção. Em qualquer caso, essa estrutura ainda exibe as mesmas características de ligação ou características similares que às dos ácidos nucleicos da presente invenção. Ainda numa outra etapa ou etapa alternativa da conceção racional de fármacos, preferencialmente, a estrutura tridimensional dessas partes da ligação dos ácidos nucleicos ao neurotransmissor é simulada por grupos quimicos, que são diferentes dos nucleótidos e dos ácidos nucleicos. Nesta simulação, pode-se conceber um composto diferente dos ácidos nucleicos. Esse composto é, preferencialmente, uma molécula pequena ou um péptido.

No caso do rastreio de bibliotecas de compostos, tais como utilizando um ensaio comparativo que é conhecido dos especialistas nestas técnicas, podem encontrar-se, apropriadamente, análogos de FDE-1, agonistas de FDE-1 ou antagonistas de FDE-1. Esses ensaios comparativos podem ser estabelecidos como se segue. 0 ácido nucleico da presente invenção, preferencialmente, um Spiegelmer, que é um ácido nucleico L de ligação ao alvo, é acoplado a uma fase sólida. Para identificar os análogos de FDE-1, pode-se adicionar ao ensaio com FDE-1 marcado. Um análogo potencial irá competir com as moléculas de FDE-1 na ligação ao Spiegelmer que, em conjunto, irão diminuir o sinal obtido pelo respetivo marcador. 0 rastreio de agonistas ou de antagonistas pode envolver a utilização de um ensaio de cultura de células como é conhecido dos especialistas na matéria. 0 estojo, de acordo com a presente invenção, pode conter pelo menos um ou vários dos ácidos nucleicos da presente invenção. Adicionalmente, o estojo pode conter pelo menos um ou vários controlos positivos ou negativos. Um controlo positivo pode ser, por exemplo, FDE-1, particularmente, aquele contra o qual se seleciona o ácido nucleico da presente invenção ou se liga, preferencialmente, numa forma liquida. Um controlo negativo pode ser, por exemplo, um péptido que se define em termos de propriedades biofísicas semelhantes a FDE-1, mas que não é reconhecido pelos ácidos nucleicos da presente invenção. Além disso, o referido estojo pode conter um ou vários tampões. Os vários ingredientes podem estar contidos no estojo numa forma anidra ou liofilizada ou dissolvido num liquido. 0 estojo pode conter uma ou várias embalagens que, por sua vez, podem conter um ou vários ingredientes do estojo. Noutra modalidade, o estojo contém uma instrução ou um folheto de instruções, que providencia informação ao utilizador, sob a forma como o estojo deve ser utilizado, assim como, os seus vários ingredientes.

Tal como é preferencialmente utilizado aqui, o termo tratamento, compreende, numa modalidade preferida, adicionalmente ou alternativamente, prevenção e/ou seguimento. A determinação farmacêutica e bioanalitica do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, é elementar para a avaliação do seu perfil farmacocinético e biodinâmico em vários humores, tecidos e órgãos do corpo humano e não humano. Com essa finalidade, pode-se utilizar qualquer um dos processos de deteção aqui descritos ou conhecidos dos especialistas na matéria. Noutro aspeto da presente invenção, providencia-se um ensaio de hibridação em "sanduíche" para a deteção do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção. Dentro dos ensaios de deteção, utiliza-se uma sonda de captura e uma sonda de deteção. A sonda de captura é complementar à primeira parte e a sonda de deteção à segunda parte do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção. Tanto a sonda de captura como a sonda de deteção podem ser formados por nucleótidos de ADN, nucleótidos modificados de ADN, nucleótidos de ARN modificados, nucleótidos de ARN, nucleótidos de ANL e/ou nucleótidos de ANP.

Assim, a sonda de captura compreende uma fileira de sequências complementares ao terminal 5' do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção e a sonda de deteção compreende uma fileira de sequências complementares ao terminal 3' dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção. Neste caso, a sonda de captura pode ser eliminada numa superfície ou numa matriz, por via da sua extremidade 5' , em que a sonda de captura pode ser imobilizada diretamente na sua extremidade 5' ou por via de um ligante, entre a sua extremidade 5' e a superfície da matriz. Contudo, em princípio, o ligante pode ligar-se a cada um dos nucleótidos da sonda de captura. 0 ligante pode ser formado por ligantes hidrofílicos dos conhecidos na técnica ou por nucleótidos de ADN-D, nucleótidos de ADN-D modificados, nucleótidos de ARN-D, nucleótidos de ANL-D, nucleótidos de ANP, nucleótidos de ARN-L, nucleótidos de ADN-L, nucleótidos de ARN-L modificados, nucleótidos de ADN-L modificados e/ou nucleótidos de ANL-L.

Alternativamente, a sonda de captura compreende uma fileira de sequências complementares à extremidade 3' do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção e a sonda de deteção compreende uma fileira de sequências

complementares à extremidade 5' do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção. Neste caso, a sonda de captura é imobilizada numa superfície ou matriz, por via da sua extremidade 3' , em que a sonda de captura pode ser imobilizada diretamente na sua extremidade 3' ou por via de um ligante entre a sua extremidade 3' e a superfície da matriz. Contudo, em princípio, o ligante pode ligar-se a cada um dos nucleótidos da sonda de captura. 0 ligante pode ser formado por ligantes hidrofílicos dos conhecidos na técnica ou por nucleótidos de ADN-D, nucleótidos de ADN-D modificados, nucleótidos de ARN-D, nucleótidos de ANL-D, nucleótidos de ANP, nucleótidos de ARN-L, nucleótidos de ADN-L, nucleótidos de ARN-L modificados, nucleótidos de ADN-L modificados e/ou nucleótidos de ANL-L. 0 número de nucleótidos da sonda de captura e de deteção, que podem hibridar com o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, é variável e pode estar dependente do número de nucleótidos da sonda de captura e/ou de deteção e/ou do próprio ácido nucleico, de acordo com a própria presente invenção. 0 número total de nucleótidos de captura e a sonda de deteção que pode hibridar com o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, deve ser o máximo do número de nucleótidos que estão contidos no ácido nucleico, de acordo com a presente invenção. 0 número mínimo de nucleótidos (2 a 10 nucleótidos) da sonda de deteção e de captura deve permitir a hibridação com a extremidade 5' ou a extremidade 3', respetivamente, do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção. Para ter uma especificidade e seletividade elevadas entre o ácido nucleico, de acordo com a presente invenção e os outros ácidos nucleicos que ocorrem nas amostras que são analisadas, o número total de nucleótidos da sonda de captura e da de deteção deve ser o número máximo de nucleótidos que estão contidos no ácido nucleico, de acordo com a presente invenção.

Além disso, a sonda de deteção comporta, preferencialmente, uma molécula-marcador ou um marcador, que pode ser detetado, conforme foi previamente descrito aqui. O marcador ou a molécula-marcadora pode, em princípio, estar ligado a cada um dos nucleótidos da sonda de deteção. Preferencialmente, o marcador ou a molécula-marcadora está localizado na extremidade 5' ou na extremidade 3' da sonda de deteção, em que, entre os nucleótidos dentro da sonda de deteção que são complementares ao ácido nucleico, de acordo com a presente invenção e o marcador, pode-se inserir um ligante. 0 ligante pode ser formado por ligantes hidrofilicos dos que são conhecidos na técnica ou por nucleótidos de ADN-D, nucleótidos de ADN-D modificados, nucleótidos de ARN-D, nucleótidos de ARN-D modificados, nucleótidos de ANL-D, nucleótidos de ANP, nucleótidos de ARN-L, nucleótidos de ADN-L, nucleótidos de ARN-L modificados, nucleótidos de ADN-L modificados e/ou nucleótidos de ANL-L. A deteção do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, pode ser realizada como se segue: 0 ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, híbrida com uma das suas extremidades com a sonda de captura e com a outra extremidade com a sonda de deteção. Depois da sonda de deteção se desligar, é removida, por exemplo, por uma ou várias etapas de lavagem. A quantidade de sonda de deteção ligada, que comporta preferencialmente um marcador ou uma molécula marcadora, pode em seguida ser medida.

Tal como se utiliza aqui, preferencialmente, os termos doença e distúrbio devem ser utilizados de uma maneira intermutável, salvo indicação em contrário.

Tal como se utiliza aqui, o termo compreende, não pretende, preferencialmente, limitar a matéria de facto que se segue ou que está descrita por esse termo. Contudo, numa modalidade alternativa, o termo compreende deve ser entendido como significando contendo e assim como limitando a matéria de facto que se segue ou que se descreve por esse termo. A seguir, resume-se nas tabelas que se seguem, as várias SEQ ID N° s., a natureza química das moléculas de ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção e as moléculas-alvo FDE-1, tal como se utilizam aqui, a sua sequência atual e o número de referência interno.

Como se irá notar, os ácidos nucleicos foram caracterizados no seu aptâmero, isto é, nivel de ácido nucleico D (ARN-D) com o FDE-l-D humano biotinilado (SEQ ID N°. 4) ou no nivel de Spiegelmer, isto é, o ácido nucleico L (ARN-L) com a configuração natural de FDE-1, o FDE-l-L (FDE-la humano, SEQ-ID. 1). Os ácidos nucleicos diferentes partilham o nome de referência interna, mas uma sequência para a molécula de ARN-D (aptâmero) e uma sequência para a molécula de ARN-L (Spiegelmer), respetivamente. TABELA 1(A)

73 TABELA 1(A)

TABELA 1(B)

TABELA 1(C)

TABELA 1(D)

TABELA 1(E)

TABELA 1(F)

TABELA 1(G)

TABELA 1(Η)

TABELA 1(1)

TABELA 1(J)

TABELA 1(K)

TABELA 1(L)

TABELA 1(Μ)

TABELA 1(N)

TABELA 1(Ο)

TABELA 1(P)

A presente invenção vai ainda ser ilustrada pelas figuras, pelos exemplos e as listas de sequências, a partir das quais se pode retirar outras características, modalidades e vantagens, em que

Fig. 1 mostra um alinhamento das sequências da ligação dos ligandos de ARN relacionados com FDE-1 humano, indicando o elemento da sequência ("Tipo A") que está numa modalidade preferida na sua integridade essencial para ligação a FDE-1 humano;

Fig. 2A mostra derivados do ligando de ARN 192-A10-001 (ligando de ARN de FDE-1 humano do elemento da sequência do "Tipo A");

Fig. 2B mostra derivados do ligando de ARN 192-A10-001 (ligando de ARN de FDE-1 humano do elemento da sequência do "Tipo A");

Fig. 3 mostra um alinhamento de sequências da ligação dos ligandos de ARN relacionados com FDE-1 humano, indicando o elemento da sequência ("tipo B") que está numa modalidade preferida, na sua integridade, essencial para ligação a FDE-1 humano;

Fig. 4A mostra derivados de ligandos de ARN, 193-C2-001 e 193-G2-001 (ligando de ARN de FDE-1 humano do elemento da sequência do "tipo B");

Fig. 4B mostra derivados dr ligandos de ARN, 193-C2-001 e 193-G2-001 (ligando de ARN de FDE-1 humano do elemento da sequência do "tipo B");

Fig. 5 mostra um alinhamento de sequências da ligação de ligandos de ARN relacionados com FDE-1 humano, indicando o elemento da sequência ("tipo C") que está numa modalidade preferida, na sua integridade, essencial para ligação a FDE-1 humano;

Fig. 6 mostra derivados do ligando de ARN, 190-A3-001 (ligando de ARN de FDE-1 humano do elemento da sequência do "tipo C");

Fig. 7A mostra derivados do ligando de ARN, 190-D5-001 (ligando de ARN de FDE-1 humano do elemento da sequência do "tipo C");

Fig. 7B mostra derivados do ligando de ARN, 190-D5-001 (ligando de ARN de FDE-1 humano do elemento da sequência do "tipo C");

Fig. 8 mostra derivados do ligando de ARN, 197-B2 (ligando de ARN de FDE-1 humano do elemento da sequência do "tipo C") ;

Fig. 9 mostra ainda ligandos de ARN que se ligam a FDE-1 humano;

Fig. 10 mostra a quimiotaxia, induzida por FDE-1 humano, de células de leucemia das células T humanas de

Jurkat, em que, passadas 3 horas de migração das células de leucemia das células T humanas de Jurkat em direção a várias concentrações de FDE-1 humano, obteve-se uma curva de resposta à dose, para FDE-1 humano, representada como um sinal de fluorescência em relação à concentração de FDE-1 humano;

Fig. 11 mostra o resultado de uma análise da ligação do aptâmero ligado a FDE-1 humano, 192-A10-001, com FDE-l-D humano biotinilado, a 37 °C, representada como a ligação do aptâmero em relação à concentração de FDE-l-D humano biotinilado;

Fig. 12 mostra a eficácia do Spiegelmer de ligação a FDE-1 humano, 192-A10-001, num ensaio de quimiotaxia; deixaram-se as células migrar para FDE-1 humano 0,3 nM, pré-incubado, a 37 °C, com várias quantidades do Spiegelmer, 192-A10-001, representado como a percentagem de controlo em relação à concentração do Spiegelmer 192-A10-001;

Fig. 13 mostra o resultado da análise comparativa da ligação dos aptâmeros de ligação de FDE-1 humano, 192-Al0-0 01, 192-F10-001, 192-C9-001, 192-E10-001,

192-C10-001, 192-D11-001, 192-G11-001, 192-H11-001, 192-D10-001, 192-E9-001 e 192-H9-001 a FDE-l-D humano biotinilado, a 37 °C, representado como a ligação do aptâmero marcado, 192-A10-001 (utilizado como referência que é deslocada pelos aptâmeros não marcados) , aos aptâmeros 1 nM e 5 nM não marcados 192-A10-001, 192-F10-001, 192-C9-001, 192-E10-001, 192-C10-001, 192-Dl1-001, 192-G11-001, 192-H11-001, 192-D10-001, 192-E9-001 e 192-H9-001;

Fig. 14 mostra o resultado de uma análise de ligação do aptâmero de ligação a FDE-1 humano, 192-A10-008, a FDE-l-D humano biotinilado, a 37 °C, representada como a ligação do aptâmero em relação à concentração de FDE-l-D humano biotinilado;

Fig. 15 mostra um sensorgrama de Biacore 2000, indicando o valor de Kd do Spiegelmer de ligação a FDE-1 humano, 192-A10-008, que se liga a FDE-1 humano, que foi imobilizado num chip sensor PioneerFl, por meio de um procedimento de acoplamento de amina, representado como uma resposta (RU), ao longo do tempo, adicionalmente as taxas de associação e de dissociação e os valores de KD dos Spiegelmers 192-A10-008 e 192-A10-001 estão também listados;

Fig. 16 mostra a eficácia do Spiegelmer de ligação do FDE-1 humano, 192-A10-008, num ensaio de quimiotaxia; deixaram-se as células migrar para FDE-1 humano 0,3 nM, pré-incubado, a 37 °C, com várias quantidades do Spiegelmer 192-A10-008, representada como a percentagem de controlo em relação à concentração do Spiegelmer 192-A10-008;

Fig. 17 mostra um sensorgrama de Biacore 2000, indicando o valor de Kd do Spiegelmer de ligação a FDE-1 humano, 193-G2-01, que foi imobilizado num chip sensor PioneerFl, por meio de um procedimento de acoplamento de amina, representado como uma resposta (RU), ao longo do tempo, adicionalmente as taxas de associação e de dissociação e os valores de Kd dos Spiegelmers 193-G2-001 e 193-C2-001 estão também listados;

Fig. 18 mostra o resultado de uma análise de ligação do aptâmero anti-FDE-1 humano, 193-G2-012, a FDE-l-D humano biotinilado, a 37 °C, representada como a ligação do aptâmero em relação à concentração de FDE-l-D humano biotinilado;

Fig. 19 mostra o resultado de um ensaio comparativo da ligação dos aptâmeros de ligação de FDE-1 humano, 190- A3-0 01, 190-A3-003, 190-A3-004, 190-A3-007, 191- D5-001, 191-D5-002, 191-D5-003, 191-D5-004,

191-D5-005, 191-D5-006 e 191-D5-007 a FDE-l-D humano biotinilado, a 37 °C, representada como a ligação do aptâmero marcado, 190-A3-001 ou 191-D5-001 (utilizado como uma referência que é deslocada pelos aptâmeros não marcados) aos aptâmeros não marcados a 500 nM, 50 nM e 10 nM, 190-A3-001, 190-A3-003, 190-A3-004, 190-A3-007, 191-D5-001, 191-D5-002, 191-D5-003, 191-D5-004, 191-D5-005, 191-D5-006 e 191-D5-007;

Fig. 20 mostra o resultado de uma análise de ligação dos aptâmeros de ligação a FDE-1 humano, 190-A3-004 e 191-D5-007, a FDE-l-D humano biotinilado, a 37 °C, representada como a ligação do aptâmero em relação à concentração de FDE-l-D humano biotinilado;

Fig. 21 mostra um sensorgrama de Biacore 2000, indicando o valor de Kd do Spiegelmer 191-D5-007, que se liga a SDF-1 que foi imobilizado num chip sensor PioneerFl, por meio de um procedimento de acoplamento de amina, representada como uma resposta (RU), ao longo do tempo, adicionalmente as taxas de associação e de dissociação e os valores de Kd dos Spiegelmers 191-D5-001, 191-D5-007, 190- A3-003 e 197-B2 estão também listados;

Fig. 22 mostra a eficácia do Spiegelmer de ligação de FDE-1 humano, 190-A3-004, num ensaio de quimiotaxia; deixaram-se as células migrar para FDE-1 humano 0,3 nM, pré-incubado, a 37 °C, com várias quantidades do Spiegelmer 190-A3-004, representada como a percentagem de controlo em relação à concentração do Spiegelmer 190-A3-004;

Fig. 23A mostra a eficácia dos Spiegelmers de ligação do FDE-1 humano, 193-G2-012-5'-PEG, 197-B2-006-5'-PEG, 191-D5-007-5'-PEG e 191-Al0-008-5'-PEG, num ensaio de quimiotaxia; deixaram-se as células migrar para FDE-1 humano 0,3 nM, pré-incubado, a 37 °C, com várias quantidades dos Spiegelmers 193-G2-012-5'-PEG, 197-B2-006-5'-PEG, 191-D5-007-5'-PEG e 191-A10-008-5'-PEG, representada como a percentagem de controlo em relação à concentração dos Spiegelmers 193-G2-012-5'-PEG, 197-B2-006-5'-PEG, 191-D5-007-5'-PEG e 191-Al0-008-5'-PEG;

Fig. 23B mostra a eficácia dos Spiegelmers de ligação do FDE-1 humano, 197-B2-006-5'PEG e 197-B2-006-31b-5'-PEG, num ensaio de quimiotaxia; deixaram-se as células migrar para FDE-1 humano 0,3 nM, pré-incubado, a 37 °C, com várias quantidades dos

Spiegelmers 197-B2-006-5'PEG e 197-B2-006-31b-5'-PEG, representada como a percentagem de controlo em relação à concentração dos Spiegelmers 197-B2-006-5' PEG e 197-B2-006-31b-5'-PEG;

Fig. 24A mostra um sensorgrama de Biacore 2000, indicando o valor de KD dos Spiegelmers, 193-G2-012-5'-PEG, 191-Al0-008-5'-PEG e 191-A10-001-5'-PEG, que se ligam a FDE-1 humano foram imobilizados num chip sensor PioneerFl, por meio de um procedimento de acoplamento de amina, representada como uma resposta (RU), ao longo do tempo;

Fig. 24B mostra um sensorgrama de Biacore 2000, indicando o valor de Kd dos Spiegelmers 197-B2-006-5'PEG, 197-B2-006-31b-5'-PEG e 191-D5-007-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano, que foram imobilizados num chip sensor PioneerFl, por meio de um procedimento de acoplamento de amina, representads como uma resposta (RU), ao longo do tempo;

Fig. 25A mostra a eficácia dos Spiegelmers de ligação de FDE-1 humano, 192-A10-001, 192-A10-001-5'-HES130 e 192-A10-001-5'-HES100, num ensaio de quimiotaxia; deixaram-se as células migrar para FDE-1 humano 0,3 nM, pré-incubado, a 37 °C, com várias quantidades dos Spiegelmers 192-A10-001, 192-A10- 001-5'-HES130 e 192-A10-001-5'-HES100, representada como a percentagem de controlo em relação à concentração dos Spiegelmers 192-A10-001, 192-A10- 001-5'-HES130 e 192-A10-001-5'-HES100;

Fig. 25B mostra a eficácia dos Spiegelmers de ligação do FDE-1 humano, 192-A10-001, 192-A10-001-5'-PEG30 e 192-A10-001-5'-PEG40, num ensaio de quimiotaxia; deixaram-se as células migrar para FDE-1 humano 0,3 nM, pré-incubado, a 37 °C, com várias quantidades dos Spiegelmers 192-A10-001, 192-A10- 001-5'-PEG30 e 192-A10-001-5'-PEG40, representada como a percentagem de controlo em relação à concentração dos Spiegelmers 192-A10-001, 192-A10- 001-5'-PEG30 e 192-Al0-001-5'-PEG40;

Fig. 26 mostra a ineficácia de um Spiegelmer de controlo, num ensaio de quimiotaxia; deixaram-se as células migrar para FDE-1 humano 0,3 nM ou FDE-1 de murino, pré-incubado, a 37 °C, com várias quantidades do

Spiegelmer de controlo, representado como a percentagem de controlo em relação à concentração do Spiegelmer de controlo;

Fig. 27 mostra a quimiotaxia, induzida por FDE-1 de murino, de células de leucemia das células T humanas de Jurkat, em que, passadas 3 horas de migração das células de leucemia das células T humanas de Jurkat em relação a várias concentrações de FDE-1, obteve-se uma curva de resposta à dose para FDE-1, representada como um sinal de fluorescência;

Fig. 28 mostra a eficácia dos Spiegelmers de ligação do FDE-1, 192-A10-001 e 191-D5-007-5'PEG, num ensaio de quimiotaxia; deixaram-se as células migrar para FDE-1 humano 0,3 nM, pré-incubado, a 37 °C, com várias quantidades dos Spiegelmers 192-A10-001 e 191- D5-007-5TEG, representado como a percentagem de controlo em relação à concentração dos Spiegelmers 192- A10-001 e 191-D5-007-5'PEG;

Fig. 29 mostra a eficácia do Spiegelmer de ligação do FDE-1, 192-A10-001, num ensaio de ligação ao recetor CXCR4, utilizando [125J] -FDE-Ια humano, que foi pré-incubado, a 37 °C, com várias quantidades do Spiegelmer 192-A10-001, especificamente a ligação de [125J] -FDE-Ια foi desenhada num gráfico em relação representado como a percentagem de controlo em relação à concentração do Spiegelmer 192-A10-001; e

Fig. 30 mostra a inibição da estimulação da cinase MAP de células que expressam CXCR4 com FDE la humano 1 nM, por meio do Spiegelmer de ligação a FDE-1 humano, 192-A10-001;

Fig. 31 mostra a inibição da proliferação induzida por FDE-1, por meio do Spiegelmer de ligação a FDE-1 humano, 193-G2-012-5'-PEG e pelo Spiegelmer de controlo PEGuilado, num ensaio de proliferação do anel aórtico, em que os anéis da aorta do rato foram embebidos numa matriz de colagénio, durante 6 dias com FDE-1, com ou sem Spiegelmers (a: controlo; b: FDE-1 10 nM; c: FDE-1 10 nM +

Spiegelmer de ligação a FDE-1 humano 1 μΜ, 193-G2-012-5'-PEG; d: FDE-1 10 nM + Spiegelmer de controlo 1 μΜ PEGuilado);

Fig. 32 mostra a inibição da proliferação induzida por FDE-1, por meio do Spiegelmer de ligação a FDE-1 humano, 193-G2-012-5'-PEG e pelo Spiegelmer de controlo PEGuilado, no ensaio de proliferação do anel aórtico, em que os indices de proliferação estão ilustrados como média +/- DP para 5 anéis por cada estado (*: o valor FDE-1 é significativamente diferente do de controlo (ensaio de Mann-Whitney; p = 0, 009); **: o valor de FDE-1 + Spiegelmer de ligação a FDE-1 humano, 193-G2-012-5'-PEG, é significativamente diferente do de FDE-1 (ensaio de Mann-Whitney; p = 0,028);

Fig. 33 mostra o nivel de Spiegelmer de ligação a FDE-1 humano, 193-G2-012-5'-PEG no plasma, em ratos, após uma injeção em bólus intravenosa do Spiegelmer de ligação a FDE-1 humano, 193-G2-012-5'-PEG, em comparação com o nível de FDE-1 no plasma de ratos que não foram tratados com o Spiegelmer de ligação a FDE-1 humano, 193-G2-012-5'-PEG, em que o nível no plasma dos Spiegelmer de ligação a FDE-1 humano, 193-G2-012-5'-PEG, foi determinado ao longo de urn período de 96 horas.

Exemplo 1: Ácidos nucleicos que se ligam a FDE-1 humano

Utilizando como alvo FDE-l-D humano biotinilado, vários ácidos nucleicos que se ligam a FDE-1 humano podem gerar as sequências de nucleótidos, que estão descritas nas figuras 1 a 9. Os ácidos nucleicos foram caracterizados no aptâmero, isto é, o nível de ácido nucleico D com FDE-l-D humano biotinilado ou no nível de Spiegelmer, isto é, o ácido nucleico L com a configuração natural de FDE-1 (FDE-l-L) .

Analisaram-se os aptâmeros com FDE-l-D humano biotinilado utilizando ensaios comparativos ou de ligação para aumento de peso com FDE-l-D humano biotinilado (exemplo 4) . Ensaiaram-se os Spiegelmers com a configuração natural de FDE-1 (FDE-l-L) por medição por ressonância plasmónica de superfície, utilizando um instrumento Biacore 2000 (exemplo 6) e um ensaio de quimiotaxia em cultura de células in vitro (exemplo 5).

As moléculas de ácidos nucleicos assim geradas exibiram diferentes elementos de sequência, definindo-se três tipos principais nas figs. 1, 2A e 2B (tipo A), nas figs. 3, 4A e 4B (tipo B) , nas figs. 5, 6, 7A, 7B e 8 (tipo C) . Para a definição dos elementos das sequências de nucleótidos utilizam-se as abreviaturas IUPAC para nucleótidos ambíguos: S forte GorC; W fraco AorU; R purina GorA; Y pirimidina C ou U; K ceto G ou U; M imino A ou C; B não A C ou U ou G; D não C A ou G ou U; H não G A ou C ou U; V não U A ou C ou G;

N todos A ou G ou C ou U

Salvo indicação em contrário, qualquer sequência de ácido nucleico ou sequência das fileiras e caixas, respetivamente, estão indicadas na direção 5' -*· 3' .

1.2 Ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A

Tal como se descreve na fig. 1, todas as sequências dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A contêm uma sequência nuclear de nucleótidos que está flanqueada pelas fileiras dos terminais 5' e 3', que podem hibridar umas com as outras. Contudo, essa hibridação não se dá necessariamente em todas as moléculas.

Os ácidos nucleicos foram caracterizados ao nivel do aptâmero utilizando ensaios de ligação comparativos com FDE-1-D humano biotinilado, de forma a classificá-los no que respeita ao seu comportamento de ligação (exemplo 4) . As sequências selecionadas foram sintetizadas como Spiegelmers (exemplo 3) e foram analisadas utilizando a configuração natural de FDE-1 (FDE-l-L), num ensaio de quimiotaxia, numa cultura de células in vitro (exemplo 5) e por medição por ressonância plasmónica de superfície, utilizando um instrumento Biacore 2000 (exemplo 6).

As sequências das caixas ou das fileiras definidas podem ser diferentes entre os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A, o que influencia a afinidade de ligação a FDE-1. Com base na análise de ligação dos diferentes ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 resumidos como ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A, a sequência nuclear de nucleótidos e as suas sequências de nucleótidos, tal como se descrevem aqui a seguir, estão individualizadas e, mais preferencialmente, na sua integridade essencial para a ligação a FDE-1:

As sequências nucleares de nucleótidos de todas as sequências identificadas dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A partilham a sequência AAAGYRACAHGUMAAXaUGAAAGGUARC (fórmula 1 do tipo A), em que XA ou está ausente ou representa "A". Se "A" estiver ausente, a sequência de uma sequência nuclear de nucleótidos pode ser resumida como fórmula 2 do tipo A (AAAGYRACAHGMAA-UGAAAGGUARC). 0 ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo A, 191-A6 (sequência nuclear de nucleótidos: AAAGUAACACGUAAAAUGAAAGGUAAC) comporta o nucleótido adicional "A" dentro da sequência nuclear de nucleótidos e ainda se liga a FDE-1, deixando concluir uma sequência nuclear de nucleótidos alternativa (AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC, fórmula 3 do tipo A). Exemplos de todos os outros ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A, o ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-A10-001, é caracterizado pela sua afinidade de ligação a FDE-1 humano. A constante de equilíbrio da ligação Kd foi determinada utilizando um ensaio de ligação "pull-down" (KD = 1,5 nM, fig. 11) e por medição por ressonância plasmónica de superfície (Kd = 1,0 nM, fig. 15) . A Ciso (concentração inibidora a 50 %) de 0,12 nM para 192-A10-001, foi medida utilizando um ensaio de quimiotaxia de cultura de células in vitro (fig. 12). Consequentemente, todos os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A, tal como se descreve na fig. 1, foram analisados num ensaio comparativo de

ligação "pull-down" vs. 192-A10-001 (Fig. 13; nem todos os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A ensaiados estão ilustrados na fFig. 13). Os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-B11 e 192-C10, mostraram iguais afinidades de ligação que o 192-A10-001 nestas experiências comparativas. Determinou-se uma afinidade de ligação mais fraca para os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-G10, 192- F10, 192-C9, 192-E10, 192-Dll, 192-G11, 192-H11 e 191- A6. Os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-D10, 192-E9 e 192-H9, têm uma afinidade de ligação muito mais fraca do que 192-A10-001 (fig. 13).

Tal como se mencionou antes, os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-B11 e 192-C10, exibem igual afinidade de ligação a FDE-1 que 192-A10-001. Contudo, mostram ligeiras diferenças na sequência de nucleótidos de uma sequência nuclear de nucleótidos. Por isso, a sequência de consenso das três moléculas que se ligam a FDE-1 com quase a mesma elevada afinidade, podem ser resumidas pela sequência de nucleótidos AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC (Fórmula 4 do tipo A) em que a sequência de nucleótidos de uma sequência nuclear de nucleótidos de 192-A10-001 (sequência de nucleótidos: AAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCj representa a sequência de nucleótidos com a melhor afinidade de ligação dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A.

Cinco ou seis dos seis nucleótidos da fileira do terminal 5' dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A podem hibridar com os respetivos cinco ou seis nucleótidos dos seis nucleótidos da fileira do terminal 3' dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A, para formar uma hélice do terminal. Embora estes nucleótidos sejam variáveis em várias posições, os diferentes nucleótidos permitem a hibridação de cinco ou seis dos seis nucleótidos de cada uma das fileiras dos terminais 5' e 3' . As fileiras do terminal 5' e do terminal 3' dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A, estão ilustrados na fig. 1 e podem ser resumidos numa fórmula genérica para a fileira do terminal 5' ("RSHRYR", fórmula 5-5' do tipo A) e para fileira do terminal 3' ("YRYDSY", fórmula 5-3' do tipo A). Os derivados truncados do ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-A10-001, foram analisados num ensaio comparativo de ligação "pulldown" vs. a molécula original 192-A10-001 e 192-A10-008 (Fig. 2A e 2B) . Estas experiências mostraram que a redução de seis nucleótidos do terminal (extremidade 5': GCUGUG; extremidade 3': CGCAGC) de 192-A10-001 para cinco nucleótidos (extremidade 5' : CUGUG; extremidade 3' : CGCAG) do derivado 192-A10-002, podia ser realizada sem redução da afinidade de ligação. Contudo, a truncagem de quatro nucleótidos do terminal (extremidade 5' : UGUG; extremidade 3' : CGCA; 192-A10-003) ou menos (192-A10-004/ -005/ -006/ -007) levou a uma redução da afinidade de a FDE-1 (Fig. 2A) . As fileiras do terminal 5' e do terminal 3' determinadas com u comprimento de cinco e quatro nucleótidos dos derivados do ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-A10-001, tal como se mostra nas Figs. 2A e B, pode ser descrita numa fórmula genérica para a fileira do terminal 5' ("X2BBBS", fórmula 6-5' do tipo A) e para a fileira do terminal 3' ("SBBVX3"; fórmula 6-3' do tipo A), em que X2 ou está ausente ou representa "S" e X3 ou está ausente ou representa "S". A sequência de nucleótidos das fileiras dos terminais 5' e 3' têm uma influência na afinidade de ligação dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A. Isto não está só ilustrado pelos ácidos nucleicos 192-F10 e 192-E10, mas também pelos derivados de 192-A10-001 (fig. 2B) . As sequências nucleares de nucleótidos de 192-F10 e de 192-E10 são idênticas a 192-Bll e 192-C10, mas contêm ligeiras diferenças na fileira da extremidade 3' do terminal 5' e nas fileiras da extremidade 5' do terminal 3' , resultando numa redução da afinidade de ligação. A substituição dos nucleótidos dos terminais 5' e 3' "CUGUG" e "CGCAG" do ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-A10-002, por "GCGCG" e "CGCGC" (192-Al0-015), resultou numa redução da afinidade de ligação, em que as substituições por "GCGUG" e "CGCGC" (192-A10-008), resultaram na mesma afinidade de ligação que a ilustrada para 192-AlO-002 (fig. 2B, fig. 15, fig. 12, fig. 16). Adicionalmente, analisaram-se nove derivados do ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-A10-001 (192-A10-014/ -015/ -016/ -017/ -018/ -019/ -020/ -021/ -022/ -023), comportando quatro nucleótidos dos terminais 5' e 3' , respetivamente, como aptâmeros, quanto à sua afinidade de ligação vs. 192-A10-001 ou os derivados 192-A10-008 (ambos tiveram afinidade de ligação idêntica a FDE-1). Todos os clones mostraram uma afinidade mais fraca, muito mais fraca ou muitíssimo mais fraca de ligação a FDE-1 do que 192-A10-001 (seis nucleótidos formando uma hélice terminal) ou que 192-A10-008 com cinco nucleótidos terminais, respetivamente (fig. 2B). Consequentemente, a sequência e o número de nucleótidos das fileiras dos terminais 5' e 3' são essenciais para uma ligação eficaz a FDE-1. Tal como se mostra para os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-A10-002 e 192-A10-08, a combinação preferida das fileiras dos terminais 5' e 3' é "CUGUG" e "CGCAG" (fileiras dos terminais 5' e 3' do ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-A10-002) e "GCGUG" e "CGCGC" (fileiras dos terminais 5' e 3' do ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-A10-008).

Contudo, a combinação das fileiras dos terminais 5' e 3' de todos os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A que foram ensaiados, a fórmula genérica para a fileira do terminal 5' dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A é "X1X2NNBV" (fórmula 7-5' do tipo A) e a fórmula genérica para a fileira do terminal 3' dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo A é "BNBNX3X4" (fórmula 7-3' do tipo A) , em que

Xi representa "R" ou está ausente, X2 representa "S", X3 representa "S" e X4 representa "Y" ou está ausente; ou

Xi está ausente, X2 representa "S" ou está ausente, X3 representa "S" ou está ausente e X4 está ausente.

2.2 Ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B

Tal como se descreve na fig. 3, todas as sequências dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B contêm uma sequência nuclear de nucleótidos que é flanqueada pelas fileiras dos terminais 5' e 3', que podem hibridar uma com a outra. Contudo, esta hibridação não é necessariamente realizada na molécula.

Os ácidos nucleicos foram caracterizados ao nivel do aptâmero, utilizando ensaios diretos e comparativos de ligação "pull-down" a FDE-l-D humano biotinilado, de modo a classificá-los no que respeita ao seu comportamento de ligação (exemplo 4). Sintetizaram-se as sequências selecionadas como Spiegelmers (exemplo 3) e ensaiaram-se utilizando a configuração natural de FDE-1 (FDE-L) num ensaio de quimiotaxia de cultura de células in vitro (exemplo 5) e por medição por ressonância plasmónica de superfície, utilizando um instrumento Biacore 2000 (exemplo 6).

As sequências das caixas ou das fileiras definidas podem ser diferentes entre os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, o que influencia a afinidade de ligação a FDE-1. Com base na análise de ligação dos diferentes ácidos nucleicos de ligação a FDE-1, resumidos como ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, a sequência nuclear de nucleótidos e as suas sequências de nucleótidos, tal como se descrevem aqui a seguir, estão individualizadas e, mais preferencialmente, na sua integridade essencial para a ligação a FDE-1: A sequência nuclear de nucleótidos, de todas as sequências identificadas de ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, partilha a sequência

(Fórmula 1 do tipo B).

Os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, 193-G2-001, 193-C2-001 e 193-F2-001, que diferem numa posição da sequência nuclear de nucleótidos, foram analisados num ensaio comparativo de ligação "pull-down" vs. o ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-A10-001 (Kd de 1,5 nM determinada num ensaio de ligação "pull-down" [fig. 11], Kd de 1,0 nM determinado por medição por ressonância plasmónica de superfície [fig. 15], CI50 de 0,12 nM; [fig. 12]). Cada um dos três ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B que foram ensaiados mostrou uma ligação superior a FDE-1 humano em comparação com o ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-A10-001, em que a afinidade de ligação de 193-G2-001 é tão boa quanto 193-C2-001 e 193-F2-001 (fig. 3). Os dados sugerem que a diferença na sequência de nucleótidos de uma sequência nuclear de nucleótidos dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, 193-G2-001, 193-C2-001 e 193-F2-001 não tem influência na afinidade de ligação a FDE-1. Exemplos de ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, 193-G2-001, são caracterizados pela sua afinidade de ligação a FDE-1 humano. A constante de equilíbrio da ligação Kd foi determinada utilizando um ensaio de ligação "pull-down" (Kd = 0,3 nM) e por medição por ressonância plasmónica de superfície (KD = 0,5 nM, Fig. 17). A CI50 (concentração inibidora a 50 %) de 0,08 nM para 193-G2-001, foi medida utilizando um ensaio de quimiotaxia de cultura de células in vitro. Ao contrário, os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, 193-B3-002, 193-H3-002, 193-E3-002 e 193-D1-002, que diferem na sequência de uma sequência nuclear de nucleótidos tem piores propriedades de ligação (Fig. 3). Como resultado, os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, com uma melhor afinidade de ligação a FDE-1, partilham uma sequência nuclear de nucleótidos com a sequência

(Fórmula 2 do tipo B)

Quatro, cinco ou seis nucleótidos dos seis nucleótidos da fileira do terminal 5' dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, podem hibridar com os respetivos quatro, cinco ou seis nucleótidos dos seis nucleótidos da fileira do terminal 3' dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, para formar uma hélice terminal. Embora os nucleótidos sejam variáveis em várias posições, os diferentes nucleótidos permitem a hibridação para quatro, cinco ou seis nucleótidos dos seis nucleótidos de cada uma das fileiras dos terminais 5' e 3' . As fileiras do terminal 5' e do terminal 3' dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, tal como se mostra na fig. 3, podem ser resumidas numa fórmula genérica para a fileira do terminal 5' (fórmula 3-5' do tipo B; "XiGCRWG", em que Xi representa "A" ou está ausente) e da fileira do terminal 3' (fórmula 3-3' do tipo B; "KRYSCX4", em que X4 representa "U" ou está ausente) . Os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002 e 193-D3-002, têm afinidades de ligação mais fracas a FDE-1, embora partilhem a sequência nuclear de nucleótidos idênticas (fórmula 2 do tipo B) com 193-C2-001, 193-G2-001 e 193-F2-001 (Fig. 3). As propriedades desfavoráveis de ligação dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002 e 193-D3-002, podem ser devidas a um certo número de nucleótidos e sequências das fileiras dos terminais 5' e 3'.

Os derivados truncados dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, 193-G2-001 e 193-C2-001, foram analisados num ensaio comparativo de ligação "pull-down" vs. 193-G2-001 e 193-G2-012, respetivamente (fig. 4A e 4B) . Estas experiências mostraram que uma redução dos seis nucleótidos do terminal (extremidade 5' : AGCGUG; extremidade 3' : UACGCU) dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, 193-G2-001 e 193-C2-001 aos cinco nucleótidos (extremidade 5' : GCGUG; extremidade 3' : UACGC), levam a moléculas com afinidade de ligação semelhante (193-C2-002 e 193-G2-012). Determinou-se a constante de dissociação de equilíbrio KD utilizando um ensaio de ligação "pull-down" (Kd = 0,3 nM, fig. 18) . Uma truncagem para quatro (extremidade 5' : CGUG; extremidade 3' : UACG; 193-C2-003) ou menos nucleótidos (193-C2-004, 193-C2- 005, 193-C2-006, 193-C2-007) resultou numa redução da

afinidade de ligação a FDE-1, que foi medida utilizando um ensaio comparativo de ligação "pull-down" (fig. 4A). A sequência de nucleótidos dos cinco nucleótidos do terminal na extremidade 5' e 3', respetivamente, têm influência na afinidade de ligação dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B. A substituição dos nucleótidos do terminal 5' e 3' "GCGUG" e "UACGC" (193-C2-002, 193-G2-12) por "GCGCG" e "CGCGC" (193-G2-013), resultou numa redução da afinidade de ligação. Adicionalmente, analisaram-se os quatro derivados diferentes do ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo B, 193-G2-001, com uma hélice terminal com um comprimento de quatro nucleótidos de emparelhamento de bases (193-G2-014/ -015/ -016/ -017). Todos exibiram uma afinidade de ligação reduzida a FDE-1 (fig. 4B) . Por isso, as sequências e o comprimento dos nucleótidos dos terminais 5' e 3' são essenciais para uma ligação eficaz para FDE-1 (fig. 4B) . As fileiras do terminal 5' e do terminal 3' com um comprimento de cinco e quatro nucleótidos dos derivados de ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, 193-C2-003 e 193-G2-012, tal como se mostra nas figs. 4A e 4B podem ser descritas numa fórmula genérica para a fileira do terminal 5' ("X2SSBS", fórmula 4-5' do tipo B), em que X2 ou está ausente ou representa "G" e para a fileira do terminal 3' ("BVSSX3", fórmula 4-3' do tipo B) e em que X3 ou está ausente ou representa "C". Tal como se mostra para os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B, 193-G2-001 e 193-C2-01 e os seus derivados 193-G2-012 e 193-C2-002, a combinação preferida das fileiras dos terminais 5' e 3' são "XiGCGUG" (fileira do terminal 5'; fórmula 5-5' do tipo B) e "UACGCX4" (fileira do terminal 3' ; fórmula 5-3' do tipo B) , em que Xi representa "A" ou está ausente e X4 representa "U" ou está ausente.

Contudo, a combinação das fileiras dos terminais 5' e 3' de todos os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B enaiados, a fórmula genérica para a fileira do terminal 5' dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B é "X1X2SVNS" (fórmula 6-5' do tipo B) e a fórmula genérica para a fileira do terminal 3' dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo B é "BVBSX3X4" (fórmula 6-3' do tipo B), em que Xi representa "A" ou está ausente, X2 representa "G", X3 representa "C" e X4 representa "U" ou está ausente; ou Xi está ausente, X2 representa "G" ou está ausente, X3 representa "C" ou está ausente e X4 está ausente.

1.3 Ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C

Tal como se descreve na fig. 5, todas as sequências dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C contêm uma sequência nuclear de nucleótidos, que é flanqueada pelas fileiras dos terminais 5' e 3', que podem hibridar uma com a outra. Contudo, essa hibridação não se dá necessariamente na molécula.

Os ácidos nucleicos foram caracterizados ao nível do aptâmero utilizando ensaios comparativos de ligação "pulldown" com FDE-l-D humano biotinilado, de modo a classificá-los no que respeita ao seu comportamento de ligação (exemplo 4). As sequências selecionadas foram sintetizadas como Spiegelmers (exemplo 3) e foram analisadas utilizando a configuração natural de FDE-1 (FDE-L), num ensaio de quimiotaxia de cultura de células in vitro (exemplo 5) e por medição por ressonância plasmónica de superfície, utilizando um instrumento Biacore 2000 (exemplo 6).

As sequências das caixas ou fileiras definidas podem ser diferentes entre os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C, o que influencia a afinidade de ligação a FDE-1. Com base na análise de ligação dos diferentes ácidos nucleicos de ligação a FDE-1, resumidos como ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C, a sequência nuclear de nucleótidos e as suas sequências de nucleótidos, tal como se descrevem aqui a seguir, estão individualizadas e, mais preferencialmente, na sua integridade essencial para a ligação a FDE-1: A sequência nuclear de nucleótidos de todas as sequências identificadas de ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C partilha a sequência

(Fórmula 1 do tipo C) em que Xa ou está ausente ou representa "A". Com a exceção do ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo C, 197-D1, a sequência nuclear de nucleótidos de todas as sequências identificadas dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C partilham a sequência de nucleótidos

(Fórmula 2 do tipo C). 0 ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo C, 197-Dl, (sequência nuclear de nucleótidos:

falta um nucleótido "A" dentro da sequência nuclear de nucleótidos e ainda a ligação a FDE-1 deixa concluir que há uma sequência nuclear de nucleótidos alternativa (Fórmula 3 do tipo C).

Inicialmente, todos os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C, tal como se descreve na fig. 5, foram analisados num ensaio comparativo de ligação "pull-down" vs. o ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo A, 192-A10-001 (KD = 1,5 nM, determinado por um ensaio comparativo de ligação "pull-down" e por medição por ressonância plasmónica de superfície; CI50 = 0,12 nM) . Os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C, 191-D5-001, 197-B2, 190-A3-001, 197-Hl, 197-H3 e 197-E3 mostram afinidades de ligação mais fracas do que 192-A10-001, em experiências comparativas.

Determinou-se uma afinidade de ligação muito mais fraca para 191-A5, 197-B1, 197-Dl, 197-H2 e 197-D2 (fig. 5). As moléculas ou os seus derivados foram ainda caracterizados por outros ensaios comparativos de ligação "pull-down", medições por ressonância plasmónica e um ensaio de quimiotaxia in vitro. O ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo C, 191-D5-001, foi caracterizado pela sua afinidade de ligação a FDE-1 humano, em que a constante de equilíbrio da ligação Kd foi determinada por medição por ressonância plasmónica de superfície (Kd = 0,8 nM, fig. 21) . A CI50 (concentração inibidora a 50 %) de 0,2 nM para 191-D5-001, foi medida utilizando um ensaio de quimiotaxia de cultura de células in vitro. A afinidade de ligação do ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo C, 197-B2, para FDE-1 humano foi determinada por medição por ressonância plasmónica de superfície (Kd = 0,9 nM) , a sua CI50 (concentração inibidora a 50 %) de 0,2 nM foi analisada num ensaio de quimiotaxia de cultura de células in vitro. Estes dados indicam que os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C, 191-D5-001 e 197-B2, têm uma afinidade de ligação semelhante a FDE-1 (fig. 5 e 8). 0 ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo C, 190-A3-001 (48 nt), contém uma fileira do terminal 5' de 17 nucleótidos e uma fileira do terminal 3' de 12 nucleótidos, em que, por um lado, os quatro nucleótidos na extremidade 5' da fileira do terminal 5' e os quatro nucleótidos na extremidade 3' da fileira do terminal 3' podem hibridar uns com os outros para formar uma hélice terminal.

Alternativamente, os nucleótidos "UGAGA" na fileira do terminal 5' podem hibridar com os nucleótidos "UCUCA" na fileira do terminal 3' para formar uma hélice terminal. Uma redução para oito nucleótidos da fileira do terminal 5' ("GAGAUAGG") e para nove nucleótidos da fileira do terminal 3' ("CUGAUUCUC") da molécula 190-A3-001 (em que seis dos oito/nove nucleótidos das fileiras dos terminais 5' e 3' podem hibridar uns com os outros), não tem influência na afinidade de ligação a FDE-1 (190-A3-004; fig. 6 e fig. 19). A constante de equilíbrio da ligação, Kd, de 190-A3-004, foi determinada utilizando um ensaio de ligação "pull-down" (Kd = 4,6 nM, fig. 20) e por medição por ressonância plasmónica de superfície (KD = 4,7 nM) . A CI50 (concentração inibidora a 50 %) de 0,1 nM para 190-A3-004, foi medida utilizando um ensaio de quimiotaxia de cultura de células in vitro (fig. 22). Contudo, a truncagem para dois nucleótidos na fileira do terminal 5' leva a uma redução muito forte da afinidade de ligação (190-A3-007; fig. 6 e fig. 19) .

Os ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C, 191-D5-001, 197-B2 e 197-Hl (sequência nuclear de nucleótidos:

197-H3/191-A5 (sequência nuclear de nucleótidos:

e 197-E3/197-B1 (sequência nuclear de nucleótidos:

partilham uma sequência nuclear de nucleótidos quase idêntica (fórmula 4 do tipo C; sequência de nucleótidos:

191-D5-001, 197-B2 e 197-Hl não partilham uma fileira semelhante à dos terminais 5' e 3' (197-H3 e 197-E3 têm fileiras dos terminais 5' e 3' idênticas, tal como 197-B2) . Contudo, os respetivos dez (197-B2, 197-E3, 197-H3) ou nove em dez (191-D5-001, 197-Hl) nucleótidos da fileira do terminal 5' podem hibridar com os respetivos dez (197-B2, 197-E3, 197-H3) ou nove de dez (191-D5-001, 197-Hl) nucleótidos da fileira do terminal 3' (fig. 5) . Assim, a fileira do terminal 5' dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C, 197-B2, 191-D5-001, 197-Hl, 197-E3 e 197-H3, tal como mencionados antes, mars 191-A5, 197-B1, 197-H2, 197-Dl e 197-D2 contêm uma sequência genérica comum de nucleótidos "RKSBUSNVGR" (fórmula 5-5' do tipo C). A fileira do terminal 3' dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C, 197-B2, 191-D5-001, 197-Hl, 197-E3 e 197-H3, tal como mencionados antes, mais 191-A5, 197-Bl, 197-H2, 197-Dl e 197-D2 contêm uma sequência genérica comum de nucleótidos de "YYNRCASSMY" (fórmula 5-3' do tipo C), em que as fileiras dos terminais 5' e 3' dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C, 197-B2, 191-D5-001, 197-Hl, 197-E3 e 197-H3 são as preferidas.

Estas fileiras preferidas dos terminais 5' e 3' dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C, 197-B2, 191-D5-001, 197-Hl, 197-E3 e 197-H3 podem resumir-se na fórmula genérica "RKSBUGSVGR" (fórmula 6-5' do tipo C; fileira do terminal 5') e "YCNRCASSMY" (fórmula 6-3' do tipo C; fileira do terminal 3' ) .

Os derivados truncados do ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo C, 191-D5-001, foram preparados e ensaiados num ensaio comparativo de ligação "pull-down" vs. a molécula original, 191-D5-001 (fig. 7A, fig. 7B e fig. 19). Primeiro do que tudo, o comprimento das fileiras dos terminais 5' e 3' foram encurtados de dez nucleótidos (191-D5-001) cada um deles para sete nucleótidos cada (191-D5-004) , tal como se descreve na fig. 7A, em que nove dos dez (191-D5-001) ou seis dos sete nucleótidos (191-D5-004) da fileira do terminal 5' e da fileira do terminal 3', respetivamente, podem hibridar uns com os outros. A redução para sete nucleótidos das fileiras dos terminais 5' e 3', respetivamente (em que seis dos sete nucleótidos podem hibridar uns com os outros) leva a uma afinidade de ligação reduzida a FDE-1 (191-D5-004). As fileiras dos terminais do ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo C, 191-D5-004, foram modificadas, pelo que o nucleótido "A", não emparelhado, dentro da fileira do terminal 3' de 191-D5-004, foi substituído por um "C" (191-D5-005) . Esta modificação levou a um aumento da ligação. Este derivado, o ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo C, 191-D5-005, mostrou uma ligação a FDE-1 semelhante a 191-D5-001. Outra truncagem da fileira dos terminais 5' e 3' para cinco nucleótidos, respetivamente, levou a uma molécula com um comprimento total de 29 nucleótidos (191-D5-007). Por causa das semelhanças de 191-D5-001 e dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C, 197-B2, 191-D5-001, 197-Hl, 191-A5, 197-H3, 197-B1, 197-E3, 197-Dl, 197-H2 e 197-D2 e por causa dos dados ilustrados para 191-D5-007, pode assumir-se que a fileira dos terminais 5' e 3' pode, em principio, ser truncada diminuindo para cinco nucleótidos, pelo que a sequência de nucleótidos "CGGGA" para a fileira do terminal 5' e "UCCCG" para a fileira do terminal 3' foi ensaiada com sucesso (ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo C, 191-D5-007). Surpreendentemente, o ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo C, 191-D5-007, liga-se de uma forma melhor a FDE-1 do que a 191-D5-001 (determinado ao nível do aptâmero, utilizando um ensaio comparativo da ligação). Determinou-se a constante de equilíbrio da ligação Kd de 191-D5-007, utilizando um ensaio de ligação "pull-down" (KD = 2,2 nM, Fig. 20) e por medição por ressonância plasmónica de superfície (KD = 0,8 nM, Fig. 21). A CI50 (concentração inibidora a 50 %) de 0,1 nM para 191-D5-007, foi medida utilizando um ensaio de quimiotaxia de cultura de células in vitro. Outra truncagem de ambas as fileiras do terminal para quatro nucleótidos (191-D5-010, fig.7A).

Outros derivados do ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo C, 191-D5-001 (191-D5-017/ -024/ - 029), portador das fileiras dos terminais 5' e 3' de, respetivamente, quatro nucleótidos, também mostrou uma afinidade de ligação a FDE-1 reduzida, no ensaio comparativo de ligação "pull-down" vs. 191-D5-007 (fig. 7B). Fizeram-se outras análises de fileiras alternativas dos terminais 5' e 3' com um comprimento respetivo de cinco nucleótidos (191-D5-017-29a, 191-D5-017-29b, 191-D5-019-29a, 191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b). As fórmulas genéricas destes derivados para a fileira do terminal 5' é "XsSSSV" (fórmula 7-5' do tipo C) e para a fileira do terminal 3' é "BSSSXs" (fórmula 1-3' do tipo C) , em que Xs está ausente ou representa "S". Duas das cinco variantes ensaiadas mostraram uma afinidade de ligação a FDE-1 idêntica a 191-D5-007 (191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b; Fig. 7B). As sequências das fileiras do terminal 5' e do terminal 3' dos derivados de 191-D5-001, que mostraram a melhor afinidade de ligação a FDE-1 e compreendem uma fileira do terminal 5' e do terminal 3' de cinco nucleótidos, respetivamente (191-D5-007, 191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b), podem ser resumidas numa fórmula genérica (fileira do terminal 5' : "SGGSR", fórmula 8-5' do tipo C; fileira do terminal 3': "YSCCS", fórmula 8-3' do tipo C).

Os derivados truncados do ácido nucleico de ligação a FDE-1 do tipo C, 197-B2, foram analisados num ensaio comparativo de ligação "pull-down" vs. a molécula original, 197-B2 e 191-D5-007 (fig. 8). Utilizando o ensaio comparativo de ligação "pull-down" vs. 191-D5-007, verificou-se que 197-B2 tem a mesma afinidade de ligação a FDE-1 que 191-D5-007. As fileiras dos terminais 5' e 3' foram encurtadas sem perda de afinidade de ligação a partir dos dez nucleótidos (197— B2), cada uma delas para cinco nucleótidos cada (197-B2-005), pelo que os nucleótidos da fileira do terminal 5' e da fileira do terminal 3' podem hibridar completamente uns com os outros. Se a fileira do terminal 5' ("GCGGG") e a fileira do terminal 3' ("CCUGC") de 197-B2-005 for substituída por "GCCGG" (fileira do terminal 5') e por "CCGGC" (fileira do terminal 3') de 197-B2-006, a afinidade de ligação a FDE-1 persiste completamente. Como 197-B2 e 191-D5-001 (e os seus derivados) partilham de uma sequência nuclear de nucleótidos idêntica

e vários derivados de 191-D5 com fileiras dos terminais 5' e 3' com um comprimento de, respetivamente, quatro nucleótidos, foram ensaiados, omitiu-se uma nova truncagem da fileira dos terminais 5' e 3' . Conceberam-se mais dois derivados, que contêm seus nucleótidos nas extremidades 5' e 3' (fileiras dos terminais 5' e 3')/ respetivamente. A afinidade de ligação a FDE-1 de ambas as moléculas (197-B2-006-31a e 197-B2-006-31b) é a mesma que a ilustrada para 191-D5-007 e 197-B2-006 (Fig. 8). As sequências das fileiras do terminal 5' e do terminal 3' dos derivados de 197-B2, que mostram a melhor afinidade de ligação a FDE-1 e compreendem as fileiras do terminal 5' e do terminal 3' de cinco nucleótidos, respetivamente, podem resumir-se numa fórmula genérica (fileira do terminal 5' : "GCSGG", fórmula 9-5' do tipo C; fileira do terminal 3': "CCKGC", fórmula 9-3' do tipo C).

Combinando as fileiras preferidas dos terminais 5' e 3' dos derivados truncados dos ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 do tipo C, 191-D5-001 (fileira do terminal 5': "SGGSR", fórmula 8-5' do tipo C; fileira do terminal 3' : "YSCCS", fórmula 8-3' do tipo C) e 197-B2 (fileira do terminal 5' : "GCSGG", fórmula 9-5' do tipo C; fileira do terminal 3' : "CCKGC", fórmula 9-3' do tipo C) , a fórmula genérica comum para as fileiras do terminal 5' e do terminal 3' é "SSSSR" (fileira do terminal 5' , fórmula 10-5' do tipo C) e "YSBSS" (fileira do terminal 3': fórmula 10-3' do tipo C). 1.4 Outros ácidos nucleicos de ligação a FDE-1

Adicionalmente, identificaram-se mais três ácidos nucleicos de ligação a FDE-1, que não partilham os elementos de ligação a FDE-1 do "tipo A", do "tipo B" e do "tipo C". Analisaram-se como aptâmeros, utilizando um ensaio de ligação "pull-down" (fig. 9).

Deve entender-se que qualquer uma das sequências ilustradas na figs. 1 a 9, são ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, incluindo as suas formas truncadas, mas também incluindo as suas formas prolongadas, conforme previsto, contudo, nessas formas truncadas e prolongadas, respetivamente, as moléculas de ácidos nucleicos ainda são capazes de se ligarem ao alvo.

Exemplo 2: PEG de 40 kDa e outras modificações dos Splegelmers de ligação a FDE

Para prolongar o tempo de permanência dos Spiegelmers no plasma, in vivo, os Spiegelmers 193-G2-012, 192-A10-008, 191-D5-007, 197-B2-006 e 197-B2-006-31b foram acoplados co-valentemente a um radical de polietileno-glicol (PEG) de 40 kDa, na extremidade 5' , tal como descrito no capitulo 3 (clones PEGuilados: 193-G2-012-5'-PEG, 192-Al0-008-5'PEG, 191-DS-007-5'PEG, 197-B2-006-5'PEG e 197-B2-006-31b-5'PEG).

As moléculas de Spiegelmer PEGuiladas foram analisadas num ensaio de TAX de cultura de células in vitro (capitulo 5) e por medições por ressonância plasmónica, utilizando um Biacore (capitulo 6) . Todos os Spiegelmers modificados com PEG de 40 kDa foram ainda capazes de inibir FDE-1 induzida por quimiotaxia e de se ligar a FDE-1 num intervalo pequeno nanomolar (fig. 23A, 23B, 24A e fig. 24B).

Adicionalmente, o Spiegelmer que se liga a FDE-1, 192-A10-001, foi modificado com PEG de 40 kDa, PEG de 30 kDa, HES de 100 kDa ou HES de 130 kDa (clones PEGuilados: 192-A10-001-5'PEG40, 192-Al0-001-5'PEG30, 192-A10-001-5'HES100, 192-A10-001-5'HES130; procedimento de acoplamento no capitulo 3). Tal como se descreve na fig. 25A e na fig. 25B nem o radical PEG nem o radical HES têm influência na potência dos Spiegelmers para inibir a quimiotaxia induzida por FDE-1.

Exemplo 3: Síntese e derivação de aptâmeros e Spiegelmers

3.1 SÍNTESE EM PEQUENA ESCALA

Produziram-se os aptâmeros e os Spiegelmers por síntese em fase sólida com um sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), utilizando a química de fosforamidite de ARN, 2'TBDMS (Damha and Ogilvie, 1993). Compraram-se as fosforamidites rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)-e rU- nas configurações D e L, na ChemGenes, Wilmington, MA. Purificaram-se os Spiegelmers por eletroforese em gel.

3.2 SÍNTESE EM LARGA ESCALA MAIS MODIFICAÇÃO

Produziram-se os Spiegelmers por síntese em fase sólida com um sintetizador ÀktaPilotlOO (Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Freiburg) utilizando a química de fosforamidite de ARN, 2'TBDMS (Damha and Ogilvie, 1993). Compraram-se as fosforamidites L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)- e L-rU- à ChemGenes (Wilmington, MA, EUA). 0 modificador de 5'-amino foi comprado à American International Chemicals Inc. (Framingham, MA, EUA). As sínteses dos Spiegelmers começaram em L-riboG; L-riboC, L-riboA, L-riboU, respetivamente modificados por CPG, com uma dimensão de poros de 1000 Ã (Link Technology, Glasgow, RU) . Para o acoplamento (15 min por ciclo), utilizou-se benziltiotetrazol 0,3 M (American International Chemicals Inc., Framingham, MA, EUA), em acetonitrilo e 3,5 equivalentes da respetiva solução 0,2 M de fosforamidite, em acetonitrilo. Utilizou-se um ciclo de proteção da oxidação. Compraram-se outros dissolventes-padrão e reagentes para a síntese de oligonucleótidos na Biosolve (Valkenswaard, NL) . Sintetizaram-se os Spiegelmers DMT-ON; após desproteção, purificaram-se por via de CLAR-TI preparativa (Wincott F. et al., 1995), utilizando o meio

Sourcel5RPC (Amersham). Eliminou-se o grupo 5'DMT com ácido acético a 80 % (90 min, à ΤΑ) . Em seguida, adicionou-se uma solução aquosa 2 M de NaOAc e dessalinizou-se o Spiegelmer por filtração com fluxo tangencial, utilizando uma membrana de celulose regenerada 5 K (Millipore, Bedford, MA).

3.3 PEGUILAÇÃO

Para prolongar o tempo de permanência dos Spiegelmers no plasma, in vivo,· acoplaram-se covalentemente os Spiegelmers a um radical de polietileno-glicol (PEG) de 40 kDa, na extremidade 5'.

Para a PEGuilação (para detalhes técnicos do processo de PEGuilação, ver o pedido de patente europeia 1 306 382) , dissolveu-se o Spiegelmer purificado e modificado em 5'-amino numa mistura de H2O (2,5 mL) , DMF (5 mL) e tampão A (5 mL; preparado misturando ácido cítrico · H2O [7 g] , ácido bórico [3,54 g] , ácido fosfórico [2,26 mL] e NaOH 1 M [343 mL] e adicionando água até a um volume final de 1 L; ajustou-se o pH = 8,4 com HC1 1 M).

Levou-se o pH da solução de Spiegelmer até 8,4 com NaOH 1 M. Depois, adicionou-se éster de PEG-NHS de 40 kDa (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) , a 37 °C, de 30 em 30 min, em seis porções de 0,25 equivalentes, até se atingir um rendimento máximo de 75 a 85 %. Manteve-se o pH da mistura reacional em 8-8,5 com NaOH 1 M, durante a adição do éster de PEG-NHS.

Misturou-se a mistura reacional com 4 mL de uma solução de ureia (8 M) e 4 mL de tampão B (acetato de trietilamónio 0,1 M, em H2O) e aqueceu-se para 95 °C, durante 15 min. Depois purificou-se o Spiegelmer PEGuilado por CLAR-TI com o meio Sourcel5RPC (Amersham), utilizando um gradiente de acetonitrilo (tampão B; tampão C: acetato de trietilamónio 0,1 M, em acetonitrilo). Eluiu-se o excesso de PEG em tampão C a 5 %, Spiegelmer PEGuilado em tampão C a 10-15 %. Combinaram-se as frações do produto com uma pureza > 95 % (conforme avaliado por CLAR) e misturaram-se com 40 mL de NaOAC 3 M. Dessalinizou-se o Spiegelmer PEGuilado por filtração de fluxo tangencial (membrana de celulose regenerada de 5 K, Millipore, Bedford MA). 3.4 HESilaçâo

Para prolongar o tempo de permanência dos Spiegelmers no plasma, in vivo, acoplaram-se covalentemente os Spiegelmers a um hidroxil-etil-amido (HES), de vários pesos moleculares > 130 kDa e grau de substituição > 0,5. A extremidade 5' do Spiegelmer é o sitio preferido para a conjugação.

Para a HESilaçâo (para detalhes técnicos do processo de HESilaçâo dos ácidos nucleicos, ver German Offenlegungsschrift da DE 101 12 825 AI e para os ácidos nucleicos D/L PCT WO 02/080979 A2), dissolveu-se o Spiegelmer purificado e modificado em 5'-amino em bicarbonato de sódio (0,3 Μ, 1 mL) e ajustou-se o pH para 8,5.

No que respeita ao Spiegelmer, adicionou-se um excesso de 5 vezes de ácido livre de HES (3,3 mmole, Supramol, Rosbach, Alemanha) e carbonato de di(N-succinimidilo) (3,3 mmole), a N,N-dimetilformamida (1 mL), para se obter uma solução do éster de N-hidroxisuccimida de HES ativado. Para dissolver todos os reagentes, agitou-se rapidamente a mistura, a 60 °C, arrefeceu-se para 25 °C e depois agitou-se, durante 1,5 h, a 25 °C. Adicionou-se a solução de Spiegelmer a uma solução de HES ativado e agitou-se a mistura resultante, a 25 °C e a pH 8,5. Monitorizou-se a reação por CLAR-IEX analítica. Normalmente, a conjugação dá-se até > 75 %, no prazo de 1 h.

Para a purificação por CLAR-IEX, por via do meio Source 15Q (GE, Freiburg, Alemanha), misturou-se a mistura reacional com uma quantidade 10 vezes maior do tampão A (EDTA 1 mM, Tris 25 mM, NaCICh 10 mM, em água/acetonitrilo a 9:1, a pH 4) . Eluiu-se o excesso de HES, num tampão A a 5 % (EDTA 1 mM, Tris 25 mM, NaCICb 500 mM, em água/acetonitrilo a 9:1, a pH 4), pelo que o conjugado HES-Spiegelmer eluiu-se em tampão B a 20-30 %. Combinaram-se as frações de produto com uma pureza > 95 % (conforme avaliado por CLAR) e dessalinizaram-se por filtração de fluxo tangencial (membrana de celulose regenerada 5 K, Millipore, Bedford MA).

Exemplo 4: Determinação das constantes de ligação (ensaio de ligação "pull-down") 4.1 Ensaio direto de ligação "pull-down"

Mediu-se a afinidade dos aptâmeros para FDE-l-D humano biotinilado num formato do ensaio de ligação "pull-down", a 37 °C. Os aptâmeros foram marcados com 5'-fosfato por meio de polinucleótido-cinase T4 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), utilizando ATP marcado com [γ-32Ρ] (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemanha). A reatividade específica dos parâmetros marcados foi de 200 000-800 000 cpm/pmole. Fez-se a incubação dos aptâmeros após a desnaturação e a re-naturação, a uma concentração de 10, 20, 30 ou 40 pM, a 37 °C, num tampão de seleção (Tris-HCl 20 mM, a pH 7,4; NaCl 137 mM; KC1 5 mM; MgCl2 1 mM; CaCl2 1 mM; Tween-20 a 0,1 % [p/v]), em conjunto com várias quantidades de FDE-l-D humano biotinilado, durante 4-12 horas, até atingir o equilíbrio a concentrações baixas. Complementou-se o tampão de seleção com 10 yg/mL de albumina de soro humano (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) e 10 yg/mL de ARN de levedura (Ambion, Austin, EUA) de modo a evitar a adsorção dos parceiros de ligação com as superficies de plástico utilizadas ou a matriz de imobilização. O intervalo de concentração de FDE-l-D humano biotinilado foi estabelecido entre 8 pM e 100 nM; o volume total da reação foi de 1 mL. Imobilizaram-se os complexos de péptido e péptido-aptâmero em partículas de 1,5 yL de estreptavidina Ultralink Plus (Pierce Biotechnology, Rockford, EUA), que tinham sido pré-equilibradas com tampão de seleção e novamente suspensas num volume total de 6 yL. Mantiveram-se as partículas em suspensão, durante 30 min, à temperatura respetiva, num termomisturador. Quantificou-se a radioatividade imobilizada num contador de cintilação, após destacar o sobrenadante e fez-se a lavagem apropriada. Fez-se um gráfico com a percentagem da ligação em função da concentração de FDE-l-D humano biotinilado e obtiveram-se as constantes de dissociação, utilizando algoritmos de programa informático (GRAFIT; Erithacus Software; Surrey R.U.), assumindo uma estequiometria a 1:1. 4.2 Ensaio comparativo de ligação "pull-down"

Para comparar os diferentes aptâmeros que se ligam a FDE-l-D, realizou-se um ensaio comparativo para os classificar. Com esta finalidade, marcou-se radioativamente o aptâmero disponível mais afinado (ver antes) e este serviu como referência. Após desnaturação e renaturação, incubou-se, a 37 °C, com FDE-l-D humano biotinilado, em 1 mL de tampão de seleção, em condições que resultaram próximas de uma ligação ao péptido de 5-10 %, após imobilização e lavagem em agarose NeutrAvidin ou estreptavidina Ultralink Plus (ambas da

Pierce) sem comparação. Adicionou-se um excesso das variantes de aptâmero de ARN-D desnaturado e renaturado e não marcado, a diferentes concentrações (por exemplo, 2, 10 e 50 nM) , com o aptâmero de referência marcado em reações de ligação paralelas. Os aptâmeros que vão ser analisados foram comparados com o aptâmero de referência quanto à ligação ao alvo, diminuindo assim o sinal de ligação na dependência das suas caracteristicas de ligação. O aptâmero que se mostrou mais ativo neste ensaio pôde então servir como uma nova referência para análise comparativa de outras variantes de aptâmero.

Exemplo 5: Análise da inibição de quimiotaxia induzida por FDE-1 por meio de Spiegelmers que se ligam a FDE-1

Fez-se uma cultura de células de leucemia de células T humanas de Jurkat (obtidas da DSMZ, Braunschweig), a 37 °C e em CO2 a 5 %, em meio RPMI 1640 com Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) , que continha soro bovino fetal a 10 %, 100 unidades/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). Um dia antes da experiência, semearam-se as células num novo frasco, a uma densidade de 0,3 x 106/mL (9 x 106/30 mL) , num meio-padrão (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha).

Para esta experiência, centrifugaram-se as células (5 min, 300 g) , suspenderam-se novamente, contaram-se e lavaram-se uma vez com 15 mL de HBH (solução salina de Hanks equilibrada contendo 1 mg/mL de albumina de soro bovino e HEPES 20 mM; Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). Depois fez-se novamente uma suspensão das células a 3 x 106/mL ou 1,33 x 106/mL, consoante o tipo de placa de filtro utilizada. Depois, deixaram-se as células migrar através das membranas porosas das placas de filtro, durante várias horas, para uma solução contendo FDE-1 e várias quantidades de Spiegelmer. Utilizaram-se quer placas Transwell, quer inserções com membranas porosas de policarbonato, com dimensão de poro de 5 ym (Corning; 3421) ou placas Multiscreen MCI (Millipore, MAMCI5S10). 5.1 Protocolo para as placas Transwell

Prepararam-se as soluções de estimulação (FDE-1 + várias concentrações de Spiegelmer) , em 600 yL de HBH, nos compartimentos menores das placas Transwell e incubaram-se, durante 20-30 min. Todas as condições foram realizadas pelo menos duas vezes. Transferiram-se as inserções para os poços contendo as soluções de estimulação e adicionou-se, a todas as inserções, 100 yL de uma suspensão de células com 3 x 106/mL (3 x 105 células/poço). Depois, deixaram-se as células migrar, durante 3 h, a 37 °C.

Depois, eliminaram-se os elementos inseridos e adicionou-se 60 yL de uma solução de trabalho de resazurina (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) (440 yM em STF; Biochrom, Berlin, Alemanha) aos poços (também aos poços de calibração). Depois, incubaram-se as placas, a 37 °C, durante 2,5 a 3 h. Após a incubação, transferiu-se 200 yL de cada poço para uma placa negra de 96 poços. Fez-se a medição dos sinais de fluorescência a 544 nm (excitação) e a 590 nm (emissão) , num leitor de placas multideteção Fluostar Optima (BMG, Offenburg, Alemanha). 5.2 Protocolo para as placas Millipore Multiscreen

Prepararam-se as soluções de estimulação (FDE-1 + várias concentrações de Spiegelmer), como soluções lOx numa placa de 96 poços de perfil baixo de 0,2 mL. Pipetou-se 135 yL de HBH, nos compartimentos menores da placa Multiscreen e adicionou-se 15 yL das soluções de estimulação. Todas as condições foram realizadas em triplicado. Passados 20 a 30 min, inseriu-se a placa de filtro na placa contendo as soluções de estimulação e adicionou-se 75 yL de uma suspensão de células com 1,33 x 106/mL aos poços da placa de filtração (1 x 105 células/poço). Depois, deixaram-se as células migrar, durante 3 h, a 37 °C.

Depois, a placa inserida é removida e adiciona-se 20 yL de uma solução de trabalho de resazurina (440 yM em STF) aos poços mais pequenos. Depois, incubaram-se as placas, a 37 °C, durante 2,5 a 3 h. Após a incubação, transferiu-se 100 yL de cada poço para uma placa negra de 96 poços. Fez-se a medição dos sinais de fluorescência, tal como descrito antes. 5.3 Avaliação

Para a avaliação, corrigiram-se os valores da fluorescência para a fluorescência inicial (sem células nos poços). Depois, calculou-se a diferença entra as condições experimentais com e sem FDE-1. O valor para a amostra sem Spiegelmer (apenas FDE-1) foi fixado em 100 % e os valores para as amostras com Spiegelmer foram calculados como uma percentagem deste valor. Para uma curva de resposta à dose, realizou-se um gráfico dos valores percentuais em função da concentração de Spiegelmer e determinou-se graficamente o valor de CI50 (concentração de Spiegelmer à qual 50 % da atividade sem Spiegelmer está presente), a partir da curva resultante. 5.4 Resultados 5.4.1 Estimulação de células de Jurkat por meio de FDE-1 humano, de uma forma dependente da dose

Verificou-se que FDE-1 humano estimula a migração de células de Jurkat, numa forma dependente da dose, com uma estimulação semi-máxima de cerca de 0,3 nM (fig. 11). 5.4.2 Inibição da quimiotaxia induzida por FDE-1 humano, por meio de Spiegelmers de ligação a FDE-1, de uma forma dependente da dose

Quando se deixou que as células migrassem para uma solução contendo FDE-1 humano, mais concentrações crescentes de Spiegelmers de ligação a FDE-1, observou-se uma inibição dependente da dose. As respetivas CI50 dos Spiegelmers ensaiados estão especificadas no exemplo 1. Quando se utilizou um Spiegelmer de controlo não especifico, em vez dos Spiegelmers de ligação a FDE-1, não se observou nenhum efeito inibidor até 1 μΜ (fig. 26). 5.4.3 Inibição da quimiotaxia induzida por FDE-1 de murganho, por meio de Spiegelmers de ligação a FDE-1, de uma forma dependente da dose FDE-1 está bem conservado entre as espécies: o FDE-1 de murganho difere do FDE-Ια de seres humanos por um aminoácido (isoleucina na posição 18 em vez de valina). FDE-1 de murino pode estimular a quimiotaxia de células de Jurkat (fig. 27) e verificou-se que esta ação era inibida pelos Spiegelmers, 192-A10-001 e 191-D5-007-5'-PEG, com a mesma potência que no caso de FDE-1 humano (fig. 28).

Exemplo 6: Análise de ligação por melo da medição por ressonância plasmónlca de superfície

Utilizou-se um instrumento Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) para analisar a ligação dos Spiegelmers a FDE-Ια humano. Quando se queria fazer o acoplamento de FDE-la, por meio de grupos amina, dialisou-se FDE-Ια em função da água, durante 1-2 h (ésteres mistos de celulose Millipore VSWP; dimensão de poro, 0,025 ym), para eliminar as aminas de interferência. Ativaram-se chips sensores CM4 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) antes do acoplamento da proteína, por meio de uma injeção de 35 yL de NHS 0,4 Me EDC 0,1 M, numa diluição a 1:1, a um fluxo de 5 yL/min. Depois injetou-se a quimiocina em concentrações de 0,1-1,5 yg/mL, a um fluxo de 2 yL/min, até a resposta dos instrumentos estar no intervalo de 1000-2 000 UR (unidades relativas). Os ésteres de NHS que não reagiram foram desativados por injeção de 35 yL de uma solução de cloridrato de etanolamina (pH 8,5), a um fluxo de 5 yL/min. Iniciou-se o chip-sensor, duas vezes, com tampão de ligação e equilibrou-se a 10 yL/min, durante 1-2 horas, até parecer estável a linha de base. Avaliaram-se os parâmetros cinéticos e as constantes de dissociação para todas as proteínas, por meio de injeções de Spiegelmer, a concentrações de 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 e 0 nM, num tampão de seleção (Tris-HCl, 20 mM; NaCl, 137 mM; KC1, 5 mM; CaCl2, 1 mM; MgCl2, 1 mM; Tween 20, a 0,1 % [p/v] ; a pH 7,4) . Em todas as experiências, a análise foi realizada a 37 °C, utilizando o comando Kinject, definido um tempo de associação de 180 e um tempo de dissociação de 360 segundos, a um fluxo de 10 yL/min. A análise dos dados e os cálculos das constantes de dissociação (Kd) foram realizados com o programa informático BIAevaluation 3.0 (BIACORE AB, Uppsala, Suécia), utilizando o algoritmo de ajustamento estequiométrico de Langmuir a 1:1.

Exemplo 7: Inibição da ligação de [125J]-DF-1 a CXCR4 expressando células por meio dos Spiegelmers de ligação a FDE-1 7.1 Processo

Comprou-se um clone de ADNc que codifica para o recetor humano CXCR4 (NM_003467.2) à OriGene Technologies (Rockville, MD) e clonou-se num vetor pCR3.1 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). Transfectou-se o vetor resultante em células OHC-Kl (DSMZ, Braunschweig, Alemanha), utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) e selecionaram-se as linhas de células que se expressam estavelmente por meio do tratamento geneticina. Verificou-se a expressão dos recetores por RCP-TI.

Para os ensaios de ligação, semearam-se células que expressam CXCR4 em placas de 24 poços revestidas com poli-lisina, a uma densidade de 1 x 105 células/poço e fez-se a sua cultura, durante a noite, a 37 °C e em CO2 a 5 %, em meio de OHC-Ultra (Cambrex, Verviers, Bélgica), contendo 50 unidades/mL de penicilina, 50 yg/mL de estreptomicina e 0,5 mg/mL de geneticina.

Para a experiência de ligação, retirou-se o meio e lavaram-se as células, uma vez, com solução salina de Hanks equilibrada, contendo adicionalmente HEPES 20 mM, 1 mg/mL albumina de soro bovino, 0,1 mg/mL de bacitracina (HBB). Depois, incubaram-se as células em 0,2 mL de HBB, durante 1 h, à temperatura ambiente, em conjunto com [125J] -FDE-1 50 pM (PerkinElmer, Rodgau, Alemanha) e para várias concentrações de Spiegelmer.

Determinou-se a ligação não especifica adicionando FDE-1 humano não marcado (R & D Systems, Wiesbaden, Alemanha), até a uma concentração final de 0,5 uM nos vários poços.

Após o período de incubação, retirou-se o sobrenadante e lavaram-se os poços, 3 vezes, com HBB arrefecida com gelo. Depois fez-se a lise das células com 0,1 mL de NaOH 0,1 M. Transferiram-se os produtos da lise para frascos de cintilação e, após a adição de 4 mL de um cocktail líquido de cintilação Unisafe 1 (Zinsser, Frankfurt, Alemanha), contaram-se num contador de cintilação Beckman LS6500.

Dado que os valores da ligação não específica (ligação na presença de uma elevada quantidade de FDE-1 não marcado) eram, de alguma forma, superiores aos valores da ligação total na presença de concentrações elevadas (500 pM) de Spiegelmer, utilizou-se a diferença entre a ligação máxima ("max") e a ligação na presença de Spiegelmer 500 pM, para o cálculo dos valores de CI50. 7.2 Resultados O gráfico de ligação de [125J] -FDE-1, em função da concentração de Spiegelmer, revelou que a ligação de FDE-1 podia ser bloqueada pelo Spiegelmer 192-A10-001 com uma CI50 de cerca de 60 pM (fig. 29).

Exemplo 8: Inibição da ativação da cinase MAP induzida por FDE-1, por meio de Spiegelmers de ligação a FDE-1 8.1 Processo

Semearam-se células de OHC que expressam CXCR4 em placas de 6 poços, a uma densidade de 0,5 x 106 células/poço e fez- se a sua cultura, durante cerca de três horas, a 37 °C e CO2 a 5 %, num meio OHC-Ultra (Cambrex, Verviers, Bélgica), contendo 50 unidades/mL de penicilina, 50 yg/mL de estreptomicina e 0,5 mg/mL de geneticina. Após a ligação das células, retirou-se o meio e substituiu-se por meio de meio de Ham F12, contendo 50 unidades/mL de penicilina, 50 yg/mL de estreptomicina. Depois, incubaram-se as células durante a noite, a 37 °C e CO2 a 5 %. Três horas antes da estimulação, substituiu-se o meio, mais uma vez, por meio de Ham F12 fresco. As células foram estimuladas com FDE-1 1 nM humano e várias quantidades de Spiegelmer, durante 5 ou 10 minutos. Depois, retirou-se o meio e lavaram-se rapidamente as células, uma vez, com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (STF) arrefecia com gelo, seguida da lise com tampão de amostra SDS (Tris/HCl, pH 6,8, 62,5 mM; glicerol, a 10 %; SDS, a 2 %; azul de bromofenol, 0,01 %; beta-mercaptoetanol, 5 %). Adicionou-se a cada poço 1 yL de 0,5 u/yL de benzonase (Merck, Darmstadt, Alemanha) e depois da incubação, durante 5 a 10 min, à temperatura ambiente, transferiram-se os produtos da lise para tubos de Eppendorf, incubados a 95 °C, durante 5 min e armazenaram-se a -20 °C até uma análise posterior.

Separou-se 25 yL dos produtos da lise em géis de desnaturação de SDS-poliacrilamida a 10 %. Transferiram-se então as proteínas por "electroblotting" para membranas de nitrocelulose HybondECL (Amersham/GE Healthcare, Munique, Alemanha). Após enxaguamento, coraram-se as membranas com vermelho de Ponceau (0,2 % em ácido tricloroacético a 3 %) para o controlo da carga de proteína e transferiram-se e depois bloquearam-se por incubação em TBS-T (solução salina tamponada com Tris (Tris/HCl 20 mM, a pH 7,6, NaCl 137 mM) com Tween 20 a 0,1 %), contendo leite em pó desnatado a 10 %, a 2-8 °C, durante a noite. Depois, incubou-se a membrana com um anticorpo de coelho anti-fosfo-MAP-cinase (1:1000, em leite a 10 %, em TBS-T), durante 2 h, à temperatura ambiente. Após lavagem, três vezes, durante 5 min, com TBS-T, incubou-se a membrana com um conjugado anti-IgG de coelho-PRS (1:2 000, em leite a 10 %, em TBS-T), durante 1 h, à temperatura ambiente. Depois, lavou-se novamente a membrana, três vezes, durante 5 min, com TBS-T, seguida da incubação, durante 1 min, num reagente quimioluminescente LumiGloR. Detetou-se a luminescência por exposição a películas de quimioluminescência Hyperfilm™ECL (Amersham/GE Healthcare), durante 30 segundos a 2 minutos. Os anticorpos e o reagente de deteção da luminescência eram componentes do estojo de anticorpo PhosphoPlus p44/42 MAP Kinase (Tre 202/Tir 204) a partir da tecnologia de sinalização de células (New England Biolabs, Frankfurt a.M., Alemanha). 8.2 Resultados A estimulação de células que expressam CXCR4 com FDE-1 humano 1 nM, durante 5 min, levou a uma estimulação profunda de MAP-cinase, indicada por um aumento da intensidade da banda que reflete MAP-cinase ativada. Esta ativação de MAP-cinase podia ser inibida pelo Spiegelmer, 191-A10-001, de uma forma dependente da dose (fig. 30).

Exemplo 9: Análise funcional do Spiegelmer de ligação a FDE-1 humano, 193-G2-012-5'-PEG, num ensaio de desenvolvimento de anéis aórticos

Para analisar se o Spiegelmer, 193-G2-012-5'-PEG, que se ligam a FDE-1 humano são funcionais, também num ensaio-padrão de angiogénese de cultura de órgãos, realizaram-se ensaios de desenvolvimento de anéis aórticos. Este ensaio, em que se avalia o comprimento e a abundância de extensões semelhantes a vasos dos explantes, tornou-se o modelo mais utilizado de cultura de órgãos para a angiogénese (Auerbach et al., 2003). Também já foi demonstrado que FDE-1 induz o desenvolvimento deste tipo de ensaio (Salcedo et al., 1999) .

Cortaram-se aortas de ratos em anéis, embeberam-se numa matriz de colagénio e incubaram-se com FDE-1 e FDE-1 mais Spiegelmer, 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano ou FDE-1 mais Spiegelmer de controlo PEGuilado que não se ligam a FDE-1. Passados 6 a 7 dias, analisou-se o desenvolvimento (isto é, o crescimento de células endoteliais), tirando fotografias e determinando o indice de desenvolvimento.

Processo

Obtiveram-se aortas de ratos machos na Bagheri Life sciences (Berlim, Alemanha). Prepararam-se as aortas frescas e transportaram-se em meio MCDB 131 gelado (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), contendo 50 unidades/mL de penicilina, 50 yg/mL de estreptomicina (ambas da Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) e 2,5 yg/mL de fungizona (Cambrex, EUA).

Para uma experiência, transferiu-se uma única aorta para um prato de cultura de células, em conjunto com o meio e eliminou-se o tecido conjuntivo residual. Depois, cortou-se a aorta com um escalpe, em anéis de cerca de 1 a 2 mm de comprimento. Lavaram-se profundamente os anéis (pelo menos cinco vezes) em meio 199 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) e depois colocaram-se em poços de uma placa de 24 poços, contendo 450 yL de uma solução de colagénio em cada poço. Preparou-se esta solução de colagénio misturando 9 mL de colagénio da cauda de rato (3 mg/mL em ácido acético a 0,1 %; Sigma, Deisenhofen, Alemanha) com 1,12 mL de lOx meio 199 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), 1,12 mL de lOx tampão de colagénio (NaOH 0,05 N, HEPES 200 mM, NaHC03 260 mM) e 0,6 mL de glutamina 200 mM. Orientaram-se os anéis de tal modo que os rebordos cortados ficaram perpendiculares ao fundo do poço. Deixou-se o colagénio solidificar por incubação das placas durante pelo menos uma hora, a 37 °C. Depois, fizeram-se adições a cada poço de 1 mL de meio MCDB131 com adições (FDE-1 e Spiegelmers). Depois, incubaram-se os anéis, a 37 °C, durante seis a sete dias. Como controlo do desenvolvimento, fizeram-se adicionalmente as experiências com FCEV (fator de crescimento endotelial vascular). 0 desenvolvimento foi documentado pelas fotografias tiradas com uma câmara digital. Nalguns casos, fixaram os anéis por adição de 1 ml de para-formaldeído a 10 % e armazenaram-se a 2-8 °C, para posterior documentação. Analisaram-se as fotografias com o programa informático de processamento de imagens Scion Image. Após calibração com a ajuda de uma fotografia tirada num estádio micrométrico, desenhou-se uma linha com uma distância de 0,33 mm, a partir de um dos rebordos de um anel. Gerou-se um gráfico de histograma, ao longo desta linha, por meio do programa informático, imprimiram-se os histogramas e contaram-se os picos (representando os desenvolvimentos que atravessam a linha) . Tomou-se este número como o índice de desenvolvimento. Avaliaram-se 4 a 5 anéis para cada condição. A análise estatística foi realizada com o WinSTAT para Excel.

Resultados Pôde-se demonstrar que FDE-1 induz o desenvolvimento e que este efeito pode ser bloqueado com o Spiegelmer, 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano. Não se observou nenhum bloqueio do desenvolvimento induzido por FDE-1, por meio do Spiegelmer de controlo PEGuilado não funcional (figs. 31 e 32) .

Exemplo 10: Nivel de FDE-1 e do Spiegelmer, 193-G2-012-5' -PEG, de ligação a FDE-1 humano no plasma, administrados a ratos, com injeções em bólus intravenosas de Spiegelmer 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano

Para avaliar se o Spiegelmer, 193-G2-012-5'-PEG de ligação a FDE-1 humano é funcional, in vivo, administrou-se Spiegelmer 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano a ratos, sob a forma de um bólus intravenoso e determinou-se o nivel do Spiegelmer, 193-G2-012-5'-PEG de ligação a FDE-1 humano e de FDE-1 no plasma. Como controlo, determinaram-se os níveis de FDE-1 no plasma em ratos não tratados.

Animais, administração e recolha de amostras

Dissolveu-se Spiegelmer 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano, em STF, até a uma concentração final de 0,5 mg/mL e filtrou-se de forma esterilizada. Administrou-se 1,0 mg/kg de Spiegelmer 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano, como uma única injeção em bólus intravenosa, a ratos machos Sprague Dawley (peso aproximado de 300 g). Recolheram-se as amostras de sangue em vários momentos (tal como se mostra na fig. 33) para seguir o desaparecimento do Spiegelmer, 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano, no plasma.

Ensaio de hibridação em sanduíche para a quantificação do Spiegelmer

Quantificou-se a quantidade de Spiegelmer 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano em amostras, por meio de um ensaio de hibridação em sanduíche. O princípio do ensaio de hibridação em sanduíche é bastante semelhante ao do ensaio de ELISA (ensaio imuno-absorvente ligado a enzimas), normalmente utilizado: imobilização e deteção do Spiegelmer. A deteção tem por base a hibridação de uma sonda biotinilada detetada numa extremidade do Spiegelmer. A extremidade da hélice simples remanescente do Spiegelmer medeia a imobilização do complexo após hibridação numa sonda de captura imobilizada. Depois de se retirarem os complexos que não se ligaram, deteta-se finalmente a sonda de deteção hibridada com Spiegelmer por meio de um conjugado de estreptavidina/ fosfatase alcalina, que converte um substrato de quimio-luminescência. Esse ensaio de hibridação em sanduíche também se aplicou para detetar e quantificar um aptâmero de ARN, tal como descrito por Drolet et al., (Drolet et. al, 2000).

Preparação da placa de hibridação

Imobilizou-se a sonda de captura 193-G2-012 (SEQ ID N°. 240) em placas brancas de 96 poços de ligação a ADN (Corning Costar, Wiesbaden, Alemanha) , a 100 nM, em fosfato de sódio 0,5 M, EDTA 1 mM, a pH 8,5, durante a noite, a 4 °C. Lavaram-se duas vezes os poços e bloquearam-se com ASB a 0,5 % p/v, em fosfato de sódio 0,25 M, EDTA 0,5 mM, a pH 8,5, durante 2 h, a 25 °C, lavaram-se novamente e armazenaram-se à temperatura ambiente até se utilizarem. Antes da hibridação, lavaram-se, duas vezes, com tampão de lavagem (3x SSC, sarcosinato de dodecilo e sódio a 0,5 % [p/v], a pH 7,0; em avanço uma concentração de 20x [NaCl 3 M, citrato de Na3 0,3 M], que é preparado sem lauroilsarcosina sódica e é diluído de acordo).

Preparação da amostra

Todas as amostras foram ensaiadas em duplicado. Descongelaram-se as amostras de plasma em gelo, fez-se uma centrifugação rápida em vórtice e depois diminuiu-se a centrifugação numa centrífuga de balcão de laboratório arrefecida. Descongelaram-se os homogeneizados de tecido à TA e centrifugaram-se, 5 min, à velocidade máxima e à TA. Diluíram-se as amostras com tampão de hibridação (sonda de deteção 193-G2-012, 40 nM [SEQ ID N°. 241], em tampão de lavagem), à TA, de acordo com o seguinte esquema: 10 pL de amostra + 90 pL de tampão de hibridação 1:10 20 pL a 1:10 + 180 μΐ de tampão de hibridação 1:100

Ensaiaram-se todas as diluições das amostras. Diluiu-se em série o padrão do Spiegelmer 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano, até a um ponto 12 da curva de calibração e expandindo o intervalo de 0,001-40 nM. O padrão de calibração foi idêntico ao das amostras em estudo.

Hibridação e deteção

Aqueceram-se as amostras, durante 5 min, a 95 °C e arrefeceram-se para a temperatura ambiente. Hibridaram-se complexos de Spiegelmer/sonda de deteção, com sondas de captura imobilizadas, durante 45 min, a 25 °C, a 500 rpm, num agitador. Retiraram-se os Spiegelmers não ligados por lavagem, duas vezes, com tampão de lavagem e 1 x TBST (Tris-Cl 20 mM, NaCl 137 mM, Tween 20 a 0,1 %, a pH 7,5), respetivamente. Detetaram-se os complexos hibridados por meio de fosfatase alcalina e estreptavidina, diluída a 1:5 000, em lx TBST, durante 1 h, a 25 °C, a 500 rpm, num agitador. Para eliminar o conjugado não ligado, lavaram-se novamente os poços com 1 x TBST. Finalmente, encheram-se os poços com 100 mL de substrato de CSDP (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha) e incubaram-se, durante 45 min, a 25 °C. Mediu-se a quimioluminescência num leitor de microplacas FLUOstar Optima (BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemanha).

Análise dos dados

Utilizaram-se as diluições das amostras ensaiadas a seguir para a análise quantitativa dos dados:

Plasma de rato em EDTA 1:100

Os dados obtidos do grupo de veículo (sem administrar Spiegelmer) foram subtraídos do sinal inicial. ELISA para a quantificação do Spiegelmer

Quantificou-se a quantidade de FDE-1 presente nas amostras de plasma com um ensaio de imuno-absorção ligado a enzimas, in vitro, que utiliza um anticorpo específico para FDE-Ια humano, numa placa de 96 poços revestida (FDE-la humano, estojo de ELISA; RayBiotech, Norcross GA, EUA). O ensaio realizou-se de acordo com as instruções do vendedor.

Resultados

Tal como se mostra na fig. 33, o nível regular de FDE-1 no plasma em ratos não tratados está num intervalo de um valor baixo picomolar (aproximadamente 50 pM). Ao contrário, o nível no plasma em ratos que foram tratados com o Spiegelmer 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano, parece diferente: nas primeiras oito horas, após a administração do Spiegelmer 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano, o nível no plasma aumentou até, aproximadamente, 700 pM. Entre as 12 e as 72 horas, o nível de FDE-1 no plasma decresceu novamente até, aproximadamente, 50 pM. O tempo decorrido da análise do nível de FDE-1 no plasma pode estar diretamente correlacionado com o nível do Spiegelmer 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano, no plasma. Por causa da eliminação renal do Spiegelmer 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano, o nível do Spiegelmer, 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano no plasma, decresceu aproximadamente de 1 100 nM para menos de 50 nM, no prazo de 72 horas. Contudo, o Spiegelmer 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano (PM de aproximadamente 54 000 Da), não foi eliminado do corpo, no prazo de uma hora, como se pode ver pelos Spiegelmers não PEGuilados (aproximadamente 15 000 Da) ou outras moléculas com uma massa molecular abaixo do limite de filtração do rim, como FDE-1. O FDE-1 endógeno estava ligado pelo Spiegelmer 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano, formando complexos de FDE-l-Spiegelmer, em que a eliminação e/ou a degradação de FDE-1 foi retardada, de alguma forma, o que teve como consequência aumentar os níveis de FDE-1 no plasma nas primeiras oito horas. Devido ao procedimento de eliminação do Spiegelmer 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano, ao longo do tempo, em que a taxa de eliminação é muito mais lenta do que para moléculas muito mais pequenas como FDE-1 - o nível dos complexos formados pelo Spiegelmer 193-G2-012-5'-PEG, de ligação a FDE-1 humano e FDE-1 no plasma decresceu (fig. 33).

Referências

Os dados bibliográficos completos dos documentos aqui citados são, salvo indicação em contrário, os seguintes.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> NOXXON Pharma AG <120> Ácidos nucleicos de ligação a FDE-1 <130> Nl00 52 PCT <160> 241 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1

Lis Pro Vai Ser Leu Ser Tir Arg Cis Pro Cis Arg Fen Fen Glu Ser 15 10 15

His Vai Ala Arg Ala Asn Vai Lis His Leu Lis lie Leu Asn Tre Pro 20 25 30

Asn Cis Ala Leu Gin Ile Vai Ala Arg Leu Lis Asn Asn Asn Arg Gin 35 40 45

Vai Cis lie Asp Pro Lis Leu Lis Trp Ile Gin Glu Tir Leu Glu Lis 50 55 60

Ala Leu Asn Lis 65

<210> 2 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Lis Pro Val Ser Leu Ser Tir Arg Cis Pro Cis Arg Fen Fen Glu Ser 15 10 15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lis His Leu Lis lie Leu Asn Tre Pro 20 25 30

Asn Cis Ala Leu Gin lie Val Ala Arg Leu Lis Asn Asn Asn Arg Gin 35 40 45

Val Cis lie Asp Pro Lis Leu Lis Trp lie Gin Glu Tir Leu Glu Lis 50 55 60

Ala Leu Asn Lis Arg Fen Lis Met 65 70

<210> 3 <211> 68 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3

Lis Pro Val Ser Leu Ser Tir Arg Cis Pro Cis Arg Fen Fen Glu Ser 15 10 15

His lie Ala Arg Ala Asn Val Lis His Leu Lis lie Leu Asn Tre Pro 20 25 30

Asn Cis Ala Leu Gin lie Val Ala Arg Leu Lis Asn Asn Asn Arg Gin 35 40 45

Val Cis lie Asp Pro Lis Leu Lis Trp lie Gin Glu Tir Leu Glu Lis 50 55 60

Ala Leu Asn Lis 65

<210> 4 <211> 71 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (71)

<223> Péptido-D <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (71)..(71) <223> biotinilado <400> 4

Lis Pro Val Ser Leu Ser Tir Arg Cis Pro Cis Arg Fen Fen Glu Ser 15 10 15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lis His Leu Lis lie Leu Asn Tre Pro 20 25 30

Asn Cis Ala Leu Gin lie Val Ala Arg Leu Lis Asn Asn Asn Arg Gin 35 40 45

Val Cis lie Asp Pro Lis Leu Lis Trp lie Gin Glu Tir Leu Glu Lis 50 55 60

Ala Leu Asn Lis Arg Fen Lis 65 70

<210> 5 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <400> 5 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc 38

<210> 6 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <4 0 0> 6 gcugugaaag uaacauguca augaaaggua accacagc 38

<210> 7 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <400> 7 gcugugaaag uaacacguca augaaaggua accgcagc 38

<210> 8 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> ARN-L <222> (1) . . (38) <223> <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <400> 8 gcugugaaag uaacacguca augaaaggua accacagc 38

<210> 9 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> ARN-L <222> (1) . . (38) <223> <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <4 Ο Ο > 9 gcuguaaaag uaacauguca augaaaggua acuacagc 38 <210> 10 <211> 38 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <221> ARN-L <222> (1) . . (38) <223> <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <4 0 0> 10 gcuguaaaag uaacaaguca augaaaggua acuacagc 38

<210> 11 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> ARN-L <222> (1) . . (38) <223> <4 Ο 0> 11 gcugugaaag uaacaaguca augaaaggua accacagc 38

<210> 12 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <4 0 0> 12 gcagugaaag uaacauguca augaaaggua accacagc 38

<210> 13 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> ARN-L <222> (1) . . (38) <223> <4 Ο 0> 13 gcugugaaag uaacauguca augaaaggua accacugc 38

<210> 14 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <4 0 0> 14 gcuaugaaag uaacauguca augaaaggua accauagc 38

<210> 15 <211> 38 <212> ARN <213> Artificial Sequência <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <4 0 0> 15 gcugcgaaag cgacauguca augaaaggua gccgcagc 38

<210> 16 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> ARN-L <222> (1) . . (38) <223> <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <4 0 0> 16 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccacagc 38

<210> 17 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <4 0 0> 17 gcugugaaag uaacauguca augaaaggua gccgcagc 38

<210> 18 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <4 0 0> 18 agcgugaaag uaacacguaa aaugaaaggu aaccacgcu 39

<210> 19 <211> 27 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (27)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (16)..(16) <223> A ou está ausente <4 0 0> 19 aaagyracah gumaaaugaa agguarc 27

<210> 20 <211> 26 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (26)

<223> ARN-L <400> 20 aaagyracah gumaaugaaa gguarc 26

<210> 21 <211> 27 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (27)

<223> ARN-L <400> 21 aaagyracah gumaaaugaa agguarc 27

<210> 22 <211> 26 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (26)

<223> ARN-L <400> 22 aaagyaacah gucaaugaaa gguarc 26

<210> 23 <211> 6 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (6)

<223> ARN-L <400> 23 rshryr 6

<210> 24 <211> 6 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (6)

<223> ARN-L <400> 24 yrydsy 6

<210> 25 <211> 36 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (36)

<223> ARN-L <400> 25 cugugaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcag 36

<210> 26 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (34)

<223> ARN-L <400> 26 ugugaaagca acaugucaau gaaagguagc cgca 34

<210> 27 <211> 32 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (32)

<223> ARN-L <400> 27 gugaaagcaa caugucaaug aaagguagcc gc 32

<210> 28 <211> 30 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (30)

<223> ARN-L <400> 28 ugaaagcaac augucaauga aagguagccg 30

<210> 29 <211> 28 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> ARN-L <222> (1) . . (28) <223> <400> 29 gaaagcaaca ugucaaugaa agguagcc 28

<210> 30 <211> 26 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (26)

<223> ARN-L <400> 30 aaagcaacau gucaaugaaa gguagc 26

<210> 31 <211> 36 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (36)

<223> ARN-L <400> 31 gcgugaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcgc 36

<210> 32 <211> 36 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (36)

<223> ARN-L <400> 32 gcgcgaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcgc 36

<210> 33 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (34)

<223> ARN-L <400> 33 gcggaaagca acaugucaau gaaagguagc ccgc 34

<210> 34 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (34)

<223> ARN-L <400> 34 cgugaaagca acaugucaau gaaagguagc cgcg 34

<210> 35 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (34)

<223> ARN-L <400> 35 gcgcaaagca acaugucaau gaaagguagc gugc 34

<210> 36 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (34)

<223> ARN-L <400> 36 gugcaaagca acaugucaau gaaagguagc gcgc 34

<210> 37 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (34)

<223> ARN-L <400> 37 cgcgaaagca acaugucaau gaaagguagc cgug 34

<210> 38 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (34)

<223> ARN-L <400> 38 gggcaaagca acaugucaau gaaagguagc gccc 34

<210> 39 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (34)

<223> ARN-L <400> 39 ggccaaagca acaugucaau gaaagguagc ggcc 34

<210> 40 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (34)

<223> ARN-L <400> 40 gcccaaagca acaugucaau gaaagguagc gggc 34

<210> 41 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (34)

<223> ARN-L <400> 41 ccccaaagca acaugucaau gaaagguagc gggg 34

<210> 42 <211> 5 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1)..(5)

<223> ARN-L <220> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> S ou está ausente <4Ο0> 42 sbbbs 5

<210> 43 <211> 5 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (5)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (5) . . (5) <223> S ou está ausente <400> 43 sbbvs 5

<210> 44 <211> 6 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias características <222> (3) . . (3) <223> nucleótido = a, g, c ou u <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (4)..(4) <223> nucleótido = a, g, c ou u <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (6)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> R ou está ausente <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (2)..(2) <223> S ou está ausente <400> 44 rsnnbv 6

<210> 45 <211> 6 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (6)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (2)..(2) <223> nucleótido = a, g, c ou u <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (4)..(4) <223> nucleótido = a, g, c ou u <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (5) . . (5) <223> R ou está ausente <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (6)..(6) <223> Y ou está ausente <400> 45 bnbnry 6 <210> 46 <211> 47

<212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (47)

<223> ARN-L <4 0 0> 4 6 agcguggugu gaucuagaug uaguggcuga uccuagucag guacgcu 47

<210> 47 <211> 47 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (47)

<223> ARN-L <400> 47 agcguggugu gaucuagaug uauuggcuga uccuagucag guacgcu 47 <210> 48 <211> 47

<212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (47)

<223> ARN-L <400> 48 agcguggugu gaucuagaug uaauggcuga uccuagucag gugcgcu 47

<210> 49 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (45)

<223> ARN-L <400> 49 gcgaggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugcgc 45 <210> 50 <211> 45

<212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (45)

<223> ARN-L <400> 50 gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugcgc 45

<210> 51 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (45)

<223> ARN-L <400> 51 gcauggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugccc 45 <210> 52 <211> 45

<223> ARN-L <400> 52 gcguggugug aucuagaugu aauggcugau ccuagucagg gacgc 45

<210> 53 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (45)

<223> ARN-L <400> 53 gcguggugug aucuagaugu agaggcugau ccuagucagg uacgc 45 <210> 54 <211> 45

<223> ARN-L <400> 54 gcguggugug aucuagaugu aaaggcugau ccuagucagg uacgc 45

<210> 55 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> ARN-L <222> (11.. (45) <223> <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (45)

<223> ARN-L <400> 55 gcguggugug aucuagaugu aguggcuguu ccuagucagg uaugc 45

<210> 56 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (45)

<223> ARN-L <400> 56 gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuaguuagg uacgc 45

<210> 57 <211> 35 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (35)

<223> ARN-L <400> 57 gugugaucua gauguadwgg cugwuccuag uyagg 35

<210> 58 <211> 35 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (35)

<223> ARN-L <400> 58 gugugaucua gauguadugg cugauccuag ucagg 35

<210> 59 <211> 6 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (6)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> A ou está ausente <400> 59 agcrwg 6

<210> 60 <211> 6 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (6)

<223> ARN-L <220> <221> várias caracteristicas <222> (6)..(6) <223> U ou está ausente <4 0 0> 60 kryscu 6

<210> 61 <211> 45 <212> ARN <213> Artificial Sequência <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (45)

<223> ARN-L <400> 61 gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg uacgc 45

<210> 62 <211> 43 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (43)

<223> ARN-L <400> 62 cgugguguga ucuagaugua guggcugauc cuagucaggu acg 43

<210> 63 <211> 41 <212> ARN <213> Artificial Sequência <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (41)

<223> ARN-L <400> 63 guggugugau cuagauguag uggcugaucc uagucaggua c 41

<210> 64 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> ARN-L <222> (1) . . (39) <223> <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (39)

<223> ARN-L <400> 64 uggugugauc uagauguagu ggcugauccu agucaggua 39

<210> 65 <211> 37 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (37)

<223> ARN-L <400> 65 ggugugaucu agauguagug gcugauccua gucaggu 37

<210> 66 <211> 35 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (35)

<223> ARN-L <4 0 0> 6 6 gugugaucua gauguagugg cugauccuag ucagg 35

<210> 67 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (45)

<223> ARN-L <400> 67 gcguggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg uacgc 45

<210> 68 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (45)

<223> ARN-L <400> 68 gcgcggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg cgcgc 45

<210> 69 <211> 43 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (43)

<223> ARN-L <4 0 0> 6 9 gcgcguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg cgc 43

<210> 70 <211> 43 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (43)

<223> ARN-L <400> 70 gggcguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg ccc 43 <210> 71

<211> 43 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (43)

<223> ARN-L <400> 71 ggccguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg gcc 43

<210> 72 <211> 43 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (43)

<223> ARN-L <400> 72 gcccguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg ggc 43 <210> 73

<211> 5 <212> ARN <213> Artificial Sequência <220> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) .. (5)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> G ou está ausente <400> 73 gssbs 5

<210> 74 <211> 5 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) .. (5) <223> ARN-L <220> <221> várias caracteristicas <222> (5) .. (5) <223> C ou está ausente <400> 74 bvssc 5

<210> 75 <211> 6 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (6)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> A ou está ausente <400> 75 agcgug 6

<210> 76 <211> 6 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (6)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (6)..(6) <223> U ou está ausente <400> 76 uacgcu 6

<210> 77 <211> 6 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1)..(6)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> A ou está ausente <22 0> <221> várias características <222> (2)..(2) <223> G ou está ausente <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (5) . . (5) <223> nucleótido = a, g, c ou u <400> 77 agsvns 6

<210> 78 <211> 6 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (6)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (5) . . (5) <223> C ou está ausente <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (6)..(6) <223> U ou está ausente <400> 78 bvbscu 6

<210> 79 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (39)

<223> ARN-L <400> 79 gugcugcggg gguuagggcu agaagucggc cugcagcac 39

<210> 80 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (39) <223> ARN-L <400> 80 agcguggcga gguuagggcu agaagucggu cgacacgcu 39

<210> 81 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (39)

<223> ARN-L <400> 81 guguugcgga gguuagggcu agaagucggu cagcagcac 39

<210> 82 <211> 48 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> ARN-L <222> (1) . . (48) <223> <4Ο0> 82 cgugcgcuug agauaggggu uagggcuuaa agucggcuga uucucacg 48

<210> 83 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (39)

<223> ARN-L <400> 83 agcgugaagg gguuagggcu cgaagucggc ugacacgcu 39

<210> 84 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> ARN-L <222> (1) . . (39) <223> <4Ο0> 84 gugcugcggg gguuagggcu cgaagucggc ccgcagcac 39

<210> 85 <211> 39 <212> ARN <213> Seguência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (39)

<223> ARN-L <400> 85 guguucccgg gguuagggcu ugaagucggc cggcagcac 39

<210> 86 <211> 39 <212> ARN <213> Seguência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (39) <223> ARN-L <400> 86 guguugcagg gguuagggcu ugaagucggc cugcagcac 39

<210> 87 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (39)

<223> ARN-L <400> 87 gugcugcggg gguuagggcu caaagucggc cugcagcac 39

<210> 88 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38) <223> ARN-L <400> 88 gugcugccgg gguuagggcu aaagucggcc gacagcac 38

<210> 89 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (39)

<223> ARN-L <400> 89 gugcuguggg ggucagggcu agaagucggc cugcagcac 39

<210> 90 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial Sequência <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (19) <223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (13)..(13) <223> A ou está ausente <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (13)..(13) <223> A ou está ausente <400> 90 gguyagggcu hraagucgg 19

<210> 91 <211> 19 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (19)

<223> ARN-L <400> 91 gguyagggcu hraagucgg 19 <210> 92

<211> 18 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (18)

<223> ARN-L <400> 92 gguyagggcu hragucgg 18

<210> 93 <211> 19 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (19)

<223> ARN-L <400> 93 gguuagggcu hgaagucgg 19 <210> 94

<211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <400> 94 ugagauaggg guuagggcuu aaagucggcu gauucuca 38

<210> 95 <211> 36 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (36)

<223> ARN-L <400> 95 gagauagggg uuagggcuua aagucggcug auucuc 36 <210> 96

<211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (29)

<223> ARN-L <4 0 0> 9 6 gggguuaggg cuuaaagucg gcugauucu 29

<210> 97 <211> 37 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (37)

<223> ARN-L <400> 97 gcguggcgag guuagggcua gaagucgguc gacacgc 37 <210> 98

<211> 35 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (35)

<223> ARN-L <400> 98 cguggcgagg uuagggcuag aagucggucg acacg 35

<210> 99 <211> 33 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (33)

<223> ARN-L <400> 99 cgggcgaggu uagggcuaga agucggucga ccg 33 <210> 100

<211> 32 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (32)

<223> ARN-L <4 0 0> 100 gggcgagguu agggcuagaa gucggucgcc eg 32

<210> 101 <211> 31 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (31)

<223> ARN-L <4 0 0> 101 cggcgagguu agggcuagaa gucggucgcc g 31 <210> 102

<223> ARN-L <4 0 0> 102 cgggagguua gggcuagaag ucggucccg 29

<210> 103 <211> 27 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (27)

<223> ARN-L <4 0 0> 103 gggagguuag ggcuagaagu cgguccc 27 <210> 104

<211> 27 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (27)

<223> ARN-L <4 0 0> 104 ccgcgguuag ggcuagaagu cgggcgg 27

<210> 105 <211> 27 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (27)

<223> ARN-L <4 0 0> 105 cccggguuag ggcuagaagu cggcggg 27 <210> 106

<223> ARN-L <4 0 0> 106 ggcggguuag ggcuagaagu cggcgcc 27

<210> 107 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (29)

<223> ARN-L <4 0 0> 107 cccgcgguua gggcuagaag ucgggcggg 29 <210> 108

<223> ARN-L <4 0 0> 108 gccgcgguua gggcuagaag ucgggcggc 29

<210> 109 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (29)

<223> ARN-L <4 0 0> 109 ccccggguua gggcuagaag ucggcgggg 29 <210> 110

<223> ARN-L <4 0 0> 110 cggcggguua gggcuagaag ucggcgccg 29

<210> 111 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (29)

<223> ARN-L <400> 111 gggcggguua gggcuagaag ucggcgccc 29 <210> 112

<211> 37 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (37)

<223> ARN-L <4 0 0> 112 ugcugcgggg guuagggcua gaagucggcc ugcagca 37

<210> 113 <211> 35 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (35)

<223> ARN-L <4 0 0> 113 gcugcggggg uuagggcuag aagucggccu gcagc 35 <210> 114

<211> 33 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (33)

<223> ARN-L <4 0 0> 114 cugcgggggu uagggcuaga agucggccug cag 33

<210> 115 <211> 31 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (31)

<223> ARN-L <4 0 0> 115 ugcggggguu agggcuagaa gucggccugc a 31 <210> 116

<211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> ARN-L <222> (1) . . (29) <223> <4 0 0> 116 gcggggguua gggcuagaag ucggccugc 29

<210> 117 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (29)

<223> ARN-L <4 0 0> 117 gccgggguua gggcuagaag ucggccggc 29 <210> 118

<211> 31 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (31)

<223> ARN-L <4 0 0> 118 ggccgggguu agggcuagaa gucggccggc c 31

<210> 119 <211> 31 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (31)

<223> ARN-L <4 0 0> 119 cgccgggguu agggcuagaa gucggccggc g 31 <210> 120

<211> 10 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (10)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (7)..(7) <223> nucleótido = a, g, c ou u <4 0 0> 120 rksbusnvgr 10

<210> 121 <211> 10 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (10)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias características <222> (3) . . (3) <223> n é qualquer nucleótido <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (3) . . (3) <223> nucleótido = a, g, c ou u <4 0 0> 121 yynrcassmy 10

<210> 122 <211> 10 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (10)

<223> ARN-L <4 0 0> 122 rksbugsvgr 10

<210> 123 <211> 10 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1)..(10)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (3) . . (3) <223> n é qualquer nucleótido <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (3) . . (3) <223> nucleótido = a, g, c ou u <4 0 0> 123 ycnrcassmy 10

<210> 124 <211> 5 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1)..(5) <223> ARN-L <22 0> <221> S ou está ausente <222> (1) . . (1) <223> <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> S ou está ausente <4 0 0> 124 ssssv 5

<210> 125 <211> 5 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1)..(5)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (5) . . (5) <223> S ou está ausente <4 Ο 0> 125 bssss 5

<210> 126 <211> 5 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1)..(5)

<223> ARN-L <4 0 0> 126 sggsv 5

<210> 127 <211> 5 <212> ARN <213> Artificial Sequência <220> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (5)

<223> ARN-L <4 Ο 0> 127 ysccs 5

<210> 128 <211> 5 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1)..(5)

<223> ARN-L <4 0 0> 128 gcsgg 5 <210> 129 <211> 5 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1)..(5)

<223> ARN-L <4 0 0> 129 cckgc 5

<210> 130 <211> 5 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <220> <221> várias caracteristicas <222> (1)..(5)

<223> ARN-L <4 0 0> 130 ssssr 5

<210> 131 <211> 5 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1)..(5)

<223> ARN-L <4 0 0> 131 ysbss 5

<210> 132 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (45)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1)

<223> 40 kDa-PEG <4 0 0> 132 gcguggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg uacgc 45

<210> 133 <211> 36 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (36)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias características <222> (1) . . (1) <223> PEG de 40 kDa <4 0 0> 133 gcgugaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcgc 36

<210> 134 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (29)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> PEG de 40 kDa <4 0 0> 134 cgggagguua gggcuagaag ucggucccg 29

<210> 135 <211> 29 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (29)

<223> ARN-L <22 0> <221> PEG de 40 kDa <222> (1)..(1) <223> <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> PEG de 40 kDa <4 0 0> 135 gccgggguua gggcuagaag ucggccggc 29

<210> 136 <211> 31 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> ARN-L <222> (1) . . (31) <223> <22 0> <221> PEG de 40 kDa <222> (1) . . (1) <223> <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> PEG de 40 kDa <4 0 0> 136 cgccgggguu agggcuagaa gucggccggc g 31

<210> 137 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <22 0> <221> PEG de 40 kDa <222> (1) . . (1) <223> <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> PEG de 40 kDa <4 0 0> 137 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc 38

<210> 138 <211> 40 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (40)

<223> ARN-L <4 0 0> 138 uaaggaaacu cggucugaug cgguagcgcu gugcagagcu 40 <210> 139 <211> 38 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias características <222> (1) . . (1) <223> PEG de 30 kDa <4 0 0> 139 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc 38 <210> 140 <211> 38 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> HES de 100 kDa <4 0 0> 140 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc 38

<210> 141 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (38)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> HES de 130 kDa <4 0 0> 141 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc 38

<210> 142 <211> 48 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (48)

<223> ARN-L <4 0 0> 142 cgugguccgu ugugucaggu cuauucgccc cggugcaggg cauccgcg 48 <210> 143

<211> 49 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (49)

<223> ARN-L <4 0 0> 143 gcagugugac gcggacguga uaggacagag cugaucccgc ucaggugag 49

<210> 144 <211> 49 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (99)

<223> ARN-L <4 0 0> 144 caacagcagu gugacgcgga cgugauagga cagagcugau cccgcucag 49 <210> 145

<211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 145 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc 38

<210> 146 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 146 gcugugaaag uaacauguca augaaaggua accacagc 38

<210> 147 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 147 gcugugaaag uaacacguca augaaaggua accgcagc 38

<210> 148 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 148 gcugugaaag uaacacguca augaaaggua accacagc 38

<210> 149 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 149 gcuguaaaag uaacauguca augaaaggua acuacagc 38

<210> 150 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 150 gcuguaaaag uaacaaguca augaaaggua acuacagc 38

<210> 151 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 151 gcugugaaag uaacaaguca augaaaggua accacagc 38

<210> 152 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> sintético <400> 152 gcagugaaag uaacauguca augaaaggua accacagc 38

<210> 153 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 Ο 0> 153 gcugugaaag uaacauguca augaaaggua accacugc 38

<210> 154 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 154 gcuaugaaag uaacauguca augaaaggua accauagc 38 <210> 155

<211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 155 gcugcgaaag cgacauguca augaaaggua gccgcagc 38

<210> 156 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> sintético <4 0 0> 156 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccacagc 38

<210> 157 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> sintético <222> (1) .. (38) <223> <4 0 0> 157 gcugugaaag uaacauguca augaaaggua gccgcagc 38

<210> 158 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 158 agcgugaaag uaacacguaa aaugaaaggu aaccacgcu 39

<210> 159 <211> 36 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 159 cugugaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcag 36

<210> 160 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 160 ugugaaagca acaugucaau gaaagguagc cgca 34

<210> 161 <211> 32 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 161 gugaaagcaa caugucaaug aaagguagcc gc 32

<210> 162 <211> 30 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 162 ugaaagcaac augucaauga aagguagccg 30

<210> 163 <211> 28 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 163 gaaagcaaca ugucaaugaa agguagcc 28

<210> 164 <211> 26 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 164 aaagcaacau gucaaugaaa gguagc 26

<210> 165 <211> 36 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 165 gcgugaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcgc 36

<210> 166 <211> 36 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 166 gcgcgaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcgc 36

<210> 167 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 Ο 0> 167 gcggaaagca acaugucaau gaaagguagc ccgc 34

<210> 168 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 168 cgugaaagca acaugucaau gaaagguagc cgcg 34

<210> 169 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 169

gcgcaaagca acaugucaau gaaagguagc gugc 34 <210> 170 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 Ο 0> 170 gugcaaagca acaugucaau gaaagguagc gcgc 34

<210> 171 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 171 cgcgaaagca acaugucaau gaaagguagc cgug 34

<210> 172 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 172 gggcaaagca acaugucaau gaaagguagc gccc 34

<210> 173 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 173 ggccaaagca acaugucaau gaaagguagc ggcc 34

<210> 174 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 174 gcccaaagca acaugucaau gaaagguagc gggc 34

<210> 175 <211> 34 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 175 ccccaaagca acaugucaau gaaagguagc gggg 34

<210> 176 <211> 47 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 176 agcguggugu gaucuagaug uaguggcuga uccuagucag guacgcu 47

<210> 177 <211> 47 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> sintético <400> 177 agcguggugu gaucuagaug uauuggcuga uccuagucag guacgcu 47

<210> 178 <211> 47 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 178 agcguggugu gaucuagaug uaauggcuga uccuagucag gugcgcu 47

<210> 179 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 179 gcgaggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugcgc 45

<210> 180 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 180 gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugcgc 45

<210> 181 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 181 gcauggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugccc 45 <210> 182 <211> 45

<212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 182 gcguggugug aucuagaugu aauggcugau ccuagucagg gacgc 45

<210> 183 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 183 gcguggugug aucuagaugu agaggcugau ccuagucagg uacgc 45

<210> 184 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 184 gcguggugug aucuagaugu aaaggcugau ccuagucagg uacgc 45

<210> 185 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 185 gcguggugug aucuagaugu aguggcuguu ccuagucagg uaugc 45

<210> 186 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 186 gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuaguuagg uacgc 45

<210> 187 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 187 gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg uacgc 45

<210> 188 <211> 43 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> sintético <400> 188 cgugguguga ucuagaugua guggcugauc cuagucaggu acg 43

<210> 189 <211> 41 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> sintético <400> 189

guggugugau cuagauguag uggcugaucc uagucaggua c 41 <210> 190 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> sintético <4 0 0> 190 uggugugauc uagauguagu ggcugauccu agucaggua 39

<210> 191 <211> 37 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 191 ggugugaucu agauguagug gcugauccua gucaggu 37

<210> 192 <211> 35 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 192 gugugaucua gauguagugg cugauccuag ucagg 35

<210> 193 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 Ο 0> 193 gcguggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg uacgc 45

<210> 194 <211> 45 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 194 gcgcggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg cgcgc 45

<210> 195 <211> 43 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> sintético <400> 195 gcgcguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg cgc 43

<210> 196 <211> 43 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> sintético <4 0 0> 196 gggcguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg ccc 43

<210> 197 <211> 43 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 197 ggccguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg gcc 43

<210> 198 <211> 43 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 198 gcccguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg ggc 43

<210> 199 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 199 gugcugcggg gguuagggcu agaagucggc cugcagcac 39

<210> 200 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 200 agcguggcga gguuagggcu agaagucggu cgacacgcu 39

<210> 201 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 201 guguugcgga gguuagggcu agaagucggu cagcagcac 39

<210> 202 <211> 48 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 202 cgugcgcuug agauaggggu uagggcuuaa agucggcuga uucucacg 48 <210> 203

<211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 203 agcgugaagg gguuagggcu cgaagucggc ugacacgcu 39

<210> 204 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 204 gugcugcggg gguuagggcu cgaagucggc ccgcagcac 39

<210> 205 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 205 guguucccgg gguuagggcu ugaagucggc cggcagcac 39

<210> 206 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 206 guguugcagg gguuagggcu ugaagucggc cugcagcac 39

<210> 207 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 207 gugcugcggg gguuagggcu caaagucggc cugcagcac 39 <210> 208

<211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> sintético <400> 208 gugcugccgg gguuagggcu aaagucggcc gacagcac 38

<210> 209 <211> 39 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> sintético <400> 209

gugcuguggg ggucagggcu agaagucggc cugcagcac 39 <210> 210 <211> 38 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 210 ugagauaggg guuagggcuu aaagucggcu gauucuca 38

<210> 211 <211> 36 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 211 gagauagggg uuagggcuua aagucggcug auucuc 36

<210> 212 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 212 gggguuaggg cuuaaagucg gcugauucu 29

<210> 213 <211> 37 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 213 gcguggcgag guuagggcua gaagucgguc gacacgc 37

<210> 214 <211> 35 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 214 cguggcgagg uuagggcuag aagucggucg acacg 35

<210> 215 <211> 33 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 215 cgggcgaggu uagggcuaga agucggucga ccg 33

<210> 216 <211> 33 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4Ο0> 216 cgggcgaggu uagggcuaga agucggucgc ccg 33

<210> 217 <211> 31 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 217 cggcgagguu agggcuagaa gucggucgcc g 31

<210> 218 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 218 cgggagguua gggcuagaag ucggucccg 29

<210> 219 <211> 27 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 219 gggagguuag ggcuagaagu cgguccc 27

<210> 220 <211> 27 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 220 ccgcgguuag ggcuagaagu cgggcgg 27

<210> 221 <211> 27 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 221 cccggguuag ggcuagaagu cggcggg 27

<210> 222 <211> 27 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 222 ggcggguuag ggcuagaagu cggcgcc 27

<210> 223 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 223 cccgcgguua gggcuagaag ucgggcggg 29

<210> 224 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 224 gccgcgguua gggcuagaag ucgggcggc 29 <210> 225

<211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 225 ccccggguua gggcuagaag ucggcgggg 29

<210> 226 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 226

cggcggguua gggcuagaag ucggcgccg 29 <210> 227 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 227 gggcggguua gggcuagaag ucggcgccc 29

<210> 228 <211> 37 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 228 ugcugcgggg guuagggcua gaagucggcc ugcagca 37

<210> 229 <211> 35 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 229 gcugcggggg uuagggcuag aagucggccu gcagc 35

<210> 230 <211> 33 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 230 cugcgggggu uagggcuaga agucggccug cag 33

<210> 231 <211> 31 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 231 ugcggggguu agggcuagaa gucggccugc a 31

<210> 232 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 232 gcggggguua gggcuagaag ucggccugc 29

<210> 233 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <4Ο0> 233 gccgggguua gggcuagaag ucggccggc 29

<210> 234 <211> 31 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 234 ggccgggguu agggcuagaa gucggccggc c 31

<210> 235 <211> 31 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 235 cgccgggguu agggcuagaa gucggccggc g 31

<210> 236 <211> 48 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 236 cgugguccgu ugugucaggu cuauucgccc cggugcaggg cauccgcg 48

<210> 237 <211> 49 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <400> 237 gcagugugac gcggacguga uaggacagag cugaucccgc ucaggugag 49

<210> 238 <211> 49 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> sintético <400> 238 caacagcagu gugacgcgga cgugauagga cagagcugau cccgcucag 49

<210> 239 <211> 40 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (40)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> peguilado <400> 239 uaaggaaacu cggucugaug cgguagcgcu gugcagagcu 40

<210> 240 <211> 13 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (13)

<223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (3) .. (3) <223> u representa um t <22 0> <221> várias características <222> (13)..(13) <223> ligado a - (C18-PEG-espaçador)-(C18-PEG-espaçador)-I-NH2 <400> 240 gaucacacca cgc 13

<210> 241 <211> 11 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (11) <223> ARN-L <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1) . . (1) <223> ligado a 5'-NH2-(C18-PEG-espaçador)-(C18-PEG-espaçador)- <400> 241 gcguaccuga c 11

Lisboa, 7 de Março de 2018.

REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico, que se liga a FDE-1, caracterizada pelo facto de compreender, na direção 5'->3', uma primeira fileira de nucleótidos, uma sequência nuclear de nucleótidos e uma segunda fileira de nucleótidos ou uma segunda fileira de nucleótidos, uma sequência nuclear de nucleótidos e uma primeira fileira de nucleótidos, em que o comprimento da molécula de ácidos nucleicos é de 20 a 50 nucleótidos, em que a molécula de ácidos nucleicos se seleciona no grupo de moléculas que consiste em moléculas de ácidos nucleicos do tipo A, moléculas de ácidos nucleicos do tipo B, moléculas de ácidos nucleicos do tipo C e moléculas de ácidos nucleicos com uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma SEQ ID N°. 142, SEQ ID N°. 143 e SEQ ID N°. 144; em que as moléculas de ácidos nucleicos do tipo A contêm a sequência nuclear de nucleótidos que se segue: 5' AAAGYRACAHGUMAAXaUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID N° . 19) em que Xa ou está ausente ou representa A e em que a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' X1X2NNBV 3' (SEQ ID N°. 44) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' BNBNX3X4 3' (SEQ ID N°. 45), em que Xi está ausente ou representa R, X2 representa S,

X3 representa S e X4 ou está ausente ou representa Y ou

Claims

Xi está ausente, X2 ou está ausente ou representa S, X3 ou está ausente ou S e X4 está ausente; em que as moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreendem a sequência nuclear de nucleótidos que se segue: 5' GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3' (SEQ ID N°. 57) e em que a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreende uma sequência de nucleótidos de 5' X1X2SVNS 3' (SEQ ID N°. 77) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreende uma sequência de nucleótidos de 5' BVBSX3X4 3' (SEQ ID N°. 78), em que Xi ou está ausente ou representa A, X2 representa G, X3 representa C e X4 ou está ausente ou representa U ou Xi está ausente, X2 ou está ausente ou representa G, X3 ou está ausente ou representa C e X4 está ausente; em que moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreendem a sequência nuclear de nucleótidos que se segue: GGUYAGGGCUHRXAaGUCGG (SEQ ID N°. 90), em que Xa ou está ausente ou representa A e em que a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' RKSBUSNVGR 3' (SEQ ID N°. 120) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' YYNRCASSMY 3' (SEQ ID N°. 121) ou em que a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' XsSSSV 3' (SEQ ID N°. 124) e a sequnda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' BSSSXs 3' (SEQ ID N°. 125), em que Xs ou está ausente ou representa S ou em que a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' UGAGAUAGG 3' e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CUGAUUCUCA 3' ou em que a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' GAGAUAGG 3' e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CUGAUUCUC 3' .
2. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de as moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreenderem uma sequência nuclear de nucleótidos, selecionada no grupo que compreende 5' AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID N°. 20), 5' AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID N°. 21) e 5' AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID N°. 22), preferencialmente a sequência nuclear de nucleótidos que compreende 5' AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID N°. 22).
3. Molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo facto de as referidas primeira e sequnda fileiras de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A eventualmente hibridarem umas com as outras de tal modo que, após hibridação, forma-se uma estrutura de hélice dupla.
4. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo facto de a estrutura de hélice dupla consistir em quatro a seis pares de bases, preferencialmente, cinco pares de bases.
5. Molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo facto de a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreender uma sequência de nucleótidos de 5' X2BBBS 3' (SEQ ID N°. 42) e a sequnda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreender uma sequência de nucleótidos de 5' SBBVX3 3' (SEQ ID N°. 43), em que X2 ou está ausente ou representa S e X3 ou está ausente ou representa S; preferencialmente, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CUGUG 3' e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CGCAG 3'; ou a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' GCGUG 3' e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo A compreende uma sequência de nucleótidos de 5' CGCGC 3'.
6. Molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo facto de a molécula de ácido nucleico do tipo A ter uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das SEQ ID N°s. 5 a 18, 25 a 41, 133, 137 e 139 a 141.
7. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de as moléculas de ácidos nucleicos, do tipo B, compreenderem uma sequência nuclear de nucleótidos de GUGUGAUCUAGAUGUADUG-GCUGAUCCUAGUCAGG (SEQ ID N°. 58).
8. Molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 7, caracterizada pelo facto de as referidas primeira e segunda fileiras de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B eventualmente hibridarem umas com as outras de tal modo que, após hibridação, forma-se uma estrutura de hélice dupla.
9. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo facto de a estrutura de hélice dupla consistir em quatro a seis pares de bases, preferencialmente, cinco pares de bases.
10. Molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 7 a 9, caracterizada pelo facto de a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreender uma sequência de nucleótidos de 5' X2SSBS 3' (SEQ ID N°. 73) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreender uma sequência de nucleótidos de 5' BVSSX3 3' (SEQ ID N°. 74), em que X2 ou está ausente ou representa G e X3 ou está ausente ou representa C, preferencialmente, a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreender uma sequência de nucleótidos de 5' GCGUG 3' e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo B compreender uma sequência de nucleótidos de 5' UACGC 3'.
11. Molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 7 a 10, caracterizada pelo facto de a molécula de ácido nucleico do tipo B ter uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das SEQ ID N°s. 46 a 56, 61 a 72 e 132.
12. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de as moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreenderem uma sequência nuclear de nucleótidos selecionada no grupo que compreende 5' GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3' (SEQ ID N°. 91), 5' GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3' (SEQ ID N°. 92) e 5' GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ ID N°. 93), preferencialmente, uma sequência nuclear de nucleótidos que compreende 5' GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ ID N°. 93).
13. Molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 12, caracterizada pelo facto de pelo menos uma parte das referidas primeira e segunda fileiras de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C eventualmente hibridarem umas com as outras de tal modo que, após hibridação, forma-se uma estrutura de hélice dupla.
14. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo facto de a estrutura de hélice dupla consistir em 4 a 6 pares de bases, mais preferencialmente, 5 pares de bases.
15. Molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 12 a 14, caracterizada pelo facto de a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreender uma sequência de nucleótidos de 5' RKSBUGSVGR 3' (SEQ ID N°. 122) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreender uma sequência de nucleótidos de 5' YCNRCASSMY 3' (SEQ ID N°. 123).
16. Molécula de ácidos nucleicos, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 12 a 14, caracterizada pelo facto de a primeira fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreender uma sequência de nucleótidos de 5' SSSSR 3' (SEQ ID N°. 130) e a segunda fileira de nucleótidos das moléculas de ácidos nucleicos do tipo C compreender uma sequência de nucleótidos de 5' YSBSS 3' (SEQ ID N°. 131).
17. Molécula de ácidos nucleicos, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 12 a 16, caracterizada pelo facto de a molécula de ácido nucleico do tipo C ter uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das SEQ ID N°s. 79 a 89, 94 a 119 e 134 a 136.
18. Molécula de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a molécula de ácidos nucleicos do tipo C ter uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das SEQ ID N°s. 142 a 144.
19. Molécula de ácidos nucleicos, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo facto de a molécula de ácido nucleico ser um antagonista de FDE-1.
20. Molécula de ácidos nucleicos, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo facto de a molécula de ácido nucleico ser um antagonista do sistema recetor de FDE-1 em que, preferencialmente, o recetor de FDE-1 do sistema recetor de FDE-1 é o recetor de CXCR4.
21. Molécula de ácidos nucleicos, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo facto de FDE-1 ser um FDE-1 humano em que, preferencialmente, FDE-1 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID N°. 1.
22. Molécula de ácidos nucleicos, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo facto de a molécula de ácido nucleico compreender uma modificação, preferencialmente, a modificação selecionada no grupo que compreende um radical HES e um radical PEG.
23. Molécula de ácidos nucleicos, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo facto de os nucleótidos da molécula de ácido nucleico serem nucleótidos L, preferencialmente, os nucleótidos das sequências de acordo com uma qualquer das SEQ ID N°. 19, 20, 21, 22, 57, 58, 90, 91, 92 e 93.
24. Molécula de ácidos nucleicos, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo facto de se utilizar num processo de tratamento de uma doença.
25. Composição farmacêutica, contendo uma molécula de ácidos nucleicos, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 24 e, eventualmente, um outro constituinte, em que esse outro constituinte se seleciona no qrupo que compreende excipientes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico e aqentes ativos sob o ponto de vista farmacêutico.
26. Utilização de uma molécula de ácidos nucleicos, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo facto de se destinar ao fabrico de um medicamento.
27. Molécula de ácidos nucleicos, para utilização de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo facto de a doença ser mediada por FDE-1, preferencialmente essa doença ou distúrbio selecionar-se no qrupo que compreende doenças da parte posterior dos olhos, tal como retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade; cancro da mama, ovários, próstata, pâncreas, tiróide, nasofaringe, cólon, pulmão e estômago; osteossarcoma; melanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; sindrome de WHIM; sindromes de deficiências imunitárias; neovascularização patológica; inflamação; esclerose múltipla; artrite reumatói- de/osteoartrite e nefrite.
28. Molécula de ácidos nucleicos, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo facto de a molécula de ácido nucleico se destinar a ser utilizada na inibição de angiogénese, neovascularização, inflamação e metástases.
29. Utilização de uma molécula de ácidos nucleicos, de acordo com uma qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo facto de se destinar ao fabrico de meios de diagnóstico.
30. Utilização, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo facto de os meios de diagnóstico serem para o diagnóstico de uma doença, em que a doença é mediada por FDE-1, preferencialmente essa doença é selecionada no grupo que compreende doenças da parte anterior dos olhos como retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade; cancro da mama, ovários, próstata, pâncreas, tiróide, nasofaringe, cólon, pulmão e estômago; osteossarcoma; melanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; sindrome de WHIM; sindromes de deficiências imunitárias; neo- vascularização patológica; inflamação; esclerose múltipla; artrite reumatóide/osteoartrite e nefrite.
31. Utilização, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo facto de os meios de diagnóstico serem para o diagnóstico de angiogénese, neo- vascularização, inflamação e/ou metástases.
32. Complexo que compreende FDE-1 e uma molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo facto de, preferencialmente, o complexo ser um complexo cristalino.
33. Utilização da molécula de ácidos nucleicos, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo facto de se destinar à deteção de FDE-1.
34. Estojo para a deteção de FDE-1, caracterizado pelo facto de compreender uma molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 24. Lisboa, 7 de Março de 2018.