JP5380287B2 - Ｓｄｆ−１結合核酸 - Google Patents

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Description

本発明はＣＸＣケモカイン間質細胞誘導因子−１（ＳＤＦ−１）に結合する核酸、および薬物の製造におけるその使用、および診断薬の製造におけるその使用に関する。
ケモカインは８〜１４ｋＤａの構造的に関連するヘパリン結合塩基性小型タンパク質のファミリーである。機能的にはそれらは炎症誘発性の機能、ホメオスタシスの機能、または二重の機能として分類できる（Ｍｏｓｅｒ，Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，２００４）。炎症性のケモカインは病原体、サイトカイン、または成長因子により誘導され、感染、炎症、組織傷害および腫瘍の部位にエフェクター白血球を補充する。そのようなケモカインは白血球の補充、活性化、および増殖を調節する（Ｓｃｈａｌｌ ａｎｄ Ｂａｃｏｎ，１９９４；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９５；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，１９９８）。ケモカインは好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、肥満細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞の化学遊走を選択的に誘導する。その化学遊走作用に加えて、それらは応答性の細胞において他の作用、例えば細胞形状の変化、細胞内遊離カルシウムイオンの濃度の一過性の上昇、脱顆粒化、インテグリンのアップレギュレーション、生物活性脂質（ロイコトリエン、プロスタグランジン、トロンボキサン）の形成、または呼吸バースト（病原性の生物または腫瘍細胞の破壊のための反応性酸素種の放出）を選択的に発揮することができる。即ち、別の炎症誘発性のメディエーターの放出、化学遊走、および感染症部位または炎症部位に向かう白血球の血管外溢出を惹起することにより、ケモカインは炎症応答の上昇を誘発する。一方ホメオスタシスケモカインは骨髄組織およびリンパ様組織において優先的に発現され、造血、免疫監視機構、および適応免疫応答に関与している（Ｇｏｄｅｓｓａｒｔ，２００５）。
４つの保存されたシステイン残基の最初の２つの配置に基づいて、ケモカインは４つのクラス、即ち、システインが直列になっているＣＣまたは（例えば）β−ケモカイン、それらが１つの追加的なアミノ酸残基により分離されているＣＸＣまたはα−ケモカイン、ジスルフィド架橋１つのみを有するＸＣまたはγケモカイン（現在まで唯一示されているリンホタクチン／ＸＣＬ１）、およびシステイン間の３つのアミノ酸残基を特徴とするＣＸ３Ｃ−ケモカイン（唯一のクラスメンバーとしての膜結合フラクタルカイン（Ｂａｚａｎ，Ｂａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７））に分類される。
ＣＸＣケモカイン、特にそのアミノ末端上にアミノ酸配列ＥＬＲを担持しているＣＸＣケモカインは主に好中球に作用する。好中球に対して活性であるＣＸＣケモカインの例はＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、ＧＲＯα／ＣＸＣＬ１、ＧＲＯβ／ＣＸＣＬ２、およびＧＲＯγ／ＣＸＣＬ３、ＮＡＰ−２／ＣＸＣＬ７、ＥＮＡ−７８／ＣＸＣＬ５、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２およびＧＣＰ−２／ＣＸＣＬ６である。ＣＣケモカインはより大型種の白血球、例えば単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、並びにＴおよびＢリンパ球に作用する（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｚａｃｈａｒｉａｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｋｒａｎｇｅｌ，１９９２；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｄｅｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｊｏｓｅ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｐｏｎａｔｈ，Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。これらの例はＩ−３０９／ＣＣＬ１、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２、ＭＣＰ−２／ＣＣＬ８、ＭＣＰ−３／ＣＣＬ７、ＭＣＰ−４／ＣＣＬ１３、ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４、ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５、およびエオタキシン／ＣＣＬ１１である。
ケモカインは７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体のスーパーファミリーに属する受容体を介して作用する（ＧＰＣＲ；（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０００））。一般的に、ケモカインおよびケモカイン受容体の相互作用は、１つのケモカインが多くのケモカイン受容体と結合でき、逆に単一のケモカイン受容体は数種のケモカインと相互作用できるという点において無差別的な傾向を有する。ＣＸＣケモカインに対する一部の公知の受容体は、ＧＲＯα、ＧＣＰ−２およびＩＬ−８に結合するＣＸＣＲ１と、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＥＮＡ−７８およびＩＬ−８を含むケモカインに結合するＣＸＣＲ２と、ＰＦ４、ＭＩＧ、ＩＰ−１０、およびＩ−ＴＡＣを含むケモカインに結合するＣＸＣＲ３と、ＳＤＦ−１に応答してシグナルを送ることのみ現時点で公知のＣＸＣＲ４と、ＢＣＡ−１に応答してシグナルを送ることが分かっているＣＸＣＲ５とを含む（Ｇｏｄｅｓｓａｒｔ，２００５）。
ＳＤＦ−１（間質細胞由来因子−１であり、同義語はＣＸＣＬ１２、ＰＢＳＦ［プレＢ細胞成長刺激因子］、ＴＰＡＲ−１［ＴＰＡ抑制遺伝子１］、ＳＣＹＢ１２、ＴＬＳＦ［胸腺リンパ腫細胞刺激因子］、ｈＩＲＨ［ヘパトーマにおいて低減するヒトインタークリン］である）はＧタンパク質共役受容体ＣＸＣＲ４に結合して活性化するＩＬ−８様ケモカイン（Ｓａｌｃｅｄｏ，Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓａｌｃｅｄｏ ａｎｄ Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，２００３）に典型的なＥＬＲモチーフを含有しない血管新生性のＣＸＣケモカインである。ケモカインはＮ末端シグナル配列を担持するｃＤＮＡをクローニングすることによる（Ｔａｓｈｉｒｏ，Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９３）か、間質細胞株ＰＡ６により発現される場合に早期Ｂ細胞前駆体を刺激するその能力による（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｋｉｋｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）か、またはタンパク質キナーゼＣ活性化物質テトラドデカノイルホルボールアセテート（ＴＰＡ）で処理したマウス胚線維芽細胞から構築したｃＤＮＡからの単離による（Ｊｉａｎｇ，Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４）かのいずれかにより、独立して３つのグループにより発見されている。
選択的スプライシングの結果として、ＳＤＦ−１の２つの形態、即ちＳＤＦ−１α（６８ＡＡ）およびＣ末端に４つの追加的残基を担持しているＳＤＦ−１βが存在する（Ｓｈｉｒｏｚｕ，Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。これらの２つのスプライス変形の生物学的意味は完全には理解されていない。
異なる種に由来するＳＤＦ−１の間の配列の保存は顕著であり、ヒトＳＤＦ−１α（配列番号１）およびネズミＳＤＦ−１α（配列番号２）は実質的に同一である。１８位にＶからＩへの単一の保存的変化があるのみである（Ｓｈｉｒｏｚｕ，Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ＳＤＦ−１を大部分の他のケモカインと区別させる他の通常ではない特徴は選択性である。実際、ＳＤＦ−１および受容体ＣＸＣＲ４は一対一の受容体−リガンド対を含むと考えられる。
ＳＤＦ−１［８−６８］にはあるＮＭＲ構造モデルが存在する（ＰＤＢアクセス、１ＳＤＦ）。ＳＤＦ−１は無秩序なＮ末端領域を有する単量体であることが分かっている。他のケモカインとの相違は、疎水性のコアの充填および表面電荷分布において主に観察されている（Ｃｒｕｍｐ，Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
ＳＤＦ−１の生理学的活性。ＳＤＦ−１受容体ＣＸＣＲ４は白血球、成熟樹状細胞、内皮細胞、脳細胞、および巨核球上で広範に発現するため、ＳＤＦ−１の活性は多面的である。このケモカインは現在までに発見されているいずれの他のものよりも、最大範囲の生物学的機能を、特に免疫系外において示す。ＳＤＦ−１の最も顕著な機能的作用を以下に示す。
網膜の脈絡膜部分の血管形成部位への上皮細胞の帰巣および結合。ＳＤＦ−１は眼組織内の血管形成の間の脈絡膜への上皮細胞の帰巣に関与していることが分かっている。これらの細胞の厳密な役割はなお研究中であるが、公開されている仮説は、上皮細胞が異常な血管の形成に関与しているということである（Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ｃａｂａｌｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
造血。ＳＤＦ−１は成人の骨髄における造血前駆（ＣＤ３４＋）細胞を維持するために必要である。ＡＭＤ３１００、即ち選択的ＣＸＣＲ４アンタゴニストは造血幹細胞移植のためにＣＤ３４＋を動員させるために使用できる。ＣＤ３４＋細胞は間質細胞により生産されるＳＤＦ−１の勾配の方へインビトロおよびインビボで遊走する（Ａｉｕｔｉ，Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
Ｂ細胞の発達および化学遊走。ＳＤＦ−１はプレＢ細胞の増殖を支援し、骨髄Ｂ細胞前駆体の成長を増強する（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｋｉｋｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。それはプレＢ細胞およびプロＢ細胞の特定の遊走を誘導するが、成熟Ｂ細胞に対しては顕著な化学誘引物質としては作用しない（Ｄ’Ａｐｕｚｚｏ，Ｒｏｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｂｌｅｕｌ，Ｓｃｈｕｌｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＳＤＦ−１は二次リンパ様組織内のＢ細胞の位置決めのために重要であると推測される。
Ｔ細胞化学遊走。ＳＤＦ−１は最も効率的なＴ細胞走化性因子の１つであり；多くのＴ細胞サブセット上に存在する（Ｂｌｅｕｌ，Ｆａｒｚａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
胚の発生。ＳＤＦ−１およびその受容体ＣＸＣＲ４は胚の発生に必須である。ＳＤＦ−１およびＣＸＣＲ４のノックアウトマウスは周産期に死亡し、それらはＢ細胞と骨髄様前駆体の減数以外に心室隔壁欠損または異常な小脳の発達も呈する（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｈｉｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｍａ，Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｚｏｕ，Ｋｏｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＳＤＦ−１はまた胚形成の間の血液の発生の正常な個体発生のためにも必要である（Ｊｕａｒｅｚ ａｎｄ Ｂｅｎｄａｌｌ，２００４）。
ＨＩＶ感染。ＳＤＦ−１はまたＣＸＣＲ４を有する細胞株内へのＴ細胞向性ＨＩＶ−１進入を抑制することができ、ヒトＳＤＦ−１遺伝子の多形がエイズの発症に影響を与えることから、ＳＤＦ−１の発現はエイズの病因に対して重要な関連性を有すると考えられる（Ｂｌｅｕｌ，Ｆａｒｚａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
ＳＤＦ−１またはその受容体ＣＸＣＲ４の改変された発現レベルまたはこれらの分子に対する改変された応答は多くのヒトの疾患、例えば網膜症（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｃａｂａｌｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｇｕｔｈｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｍｅｌｅｔｈ，Ａｇｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）、乳癌（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｈｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｃａｂｉｏｇｌｕ，Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）、卵巣癌（Ｓｃｏｔｔｏｎ，Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）、膵臓癌（Ｋｏｓｈｉｂａ，Ｈｏｓｏｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）、甲状腺癌（Ｈｗａｎｇ，Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）、鼻咽頭癌（Ｗａｎｇ，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）、神経膠腫（Ｚｈｏｕ，Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）、神経芽種（Ｇｅｍｉｎｄｅｒ，Ｓａｇｉ−Ａｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ．，２００１）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂｕｒｇｅｒ，Ｔｓｕｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ＷＨＩＭ症候群（疣贅、低γグロブリン血症、感染症、骨髄カテクシス（ｍｙｅｌｏｋａｔｈｅｘｉｓ））（Ｇｕｌｉｎｏ，Ｍｏｒａｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｂａｌａｂａｎｉａｎ，Ｌａｇａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｋａｗａｉ，Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）、免疫不全症候群（Ａｒｙａ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｍａｒｅｃｈａｌ，Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２）、病的血管形成（Ｓａｌｖｕｃｃｉ，Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｋｕｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ，Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００６）、炎症（Ｍｕｒｄｏｃｈ，２００２；Ｆｅｄｙｋ，Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗａｎｇ，Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）、多発性硬化症（Ｋｒｕｍｂｈｏｌｚ，Ｔｈｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）；慢性関節リウマチ／変形性関節症（Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ａｍｆｔ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｋａｎｂｅ，Ｔａｋａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｇｒａｓｓｉ，Ｃｒｉｓｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）に関連している。
実験動物のセッティングにおいては、ＳＤＦ−１またはその受容体のアンタゴニストは異なる起源、例えば、膵臓（Ｇｕｌｅｎｇ，Ｔａｔｅｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓａｕｒ，Ｓｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）、結腸（Ｚｅｅｌｅｎｂｅｒｇ，Ｒｕｕｌｓ−Ｖａｎ Ｓｔａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｇｕｌｅｎｇ，Ｔａｔｅｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）、乳房（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｈｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌａｐｔｅｖａ，Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）、肺（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｂｕｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００３）、神経膠芽腫／髄芽腫（Ｒｕｂｉｎ，Ｋｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）、前立腺（Ｓｕｎ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）、骨肉腫（Ｐｅｒｉｓｓｉｎｏｔｔｏ，Ｃａｖａｌｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）、黒色腫（Ｔａｋｅｎａｇａ，Ｔａｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００４）、胃（Ｙａｓｕｍｏｔｏ，Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）、多発性骨髄腫（Ｍｅｎｕ，Ａｓｏｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００６）に由来するヒト癌細胞の成長および／または転移拡張をブロックするために効率的であることが分かっている。
更にまた、抗ＳＤＦ−１療法は網膜の血管形成（Ｂｕｔｌｅｒ，Ｇｕｔｈｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）、腎炎（Ｂａｌａｂａｎｉａｎ，Ｃｏｕｄｅｒｃ ｅｔ ａｌ．，２００３）および関節炎（Ｍａｔｔｈｙｓ，Ｈａｔｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｔａｍａｍｕｒａ，Ｆｕｊｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｄｅ Ｋｌｅｒｃｋ，Ｇｅｂｏｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）を予防する場合に動物モデルにおいて有益であった。
ＳＤＦ−１は眼底の疾患、例えば糖尿病性網膜症（ＤＲ）（Ｆｏｎｇ，Ａｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）および加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（Ａｍｂａｔｉ，Ａｎａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）の病状においても役割を果たしている。これらの疾患は両者とも眼を損傷し、徐々に視力を喪失させ、最悪の場合は盲目に至る。損傷は脈絡膜血管形成（ＣＮＶ）として知られているプロセスである眼底の血管の不適切な成長に起因する。ＣＮＶの間、脈絡膜から発生した新しい血管がブルーフ膜を経由して網膜下色素上皮（サブＲＰＥ）または網膜下腔に遊走する。
異常な血管は網膜下で出血（網膜内出血）または液体漏出を起こす場合がある。これが瘢痕を残し、黄斑を上昇させ、視界を歪曲する。
ＳＤＦ−１は、眼への内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の補充を介してＣＮＶにおいて役割を果たしていると考えられる。これらの前駆細胞が次に異常な血管における重要な構成成分となる。
糖尿病性網膜症は糖尿病の主要な続発症であり、１型および２型の両方の糖尿病患者において頻発する。米国には約１６００万人の糖尿病患者が存在し、うち約８百万人は糖尿病性網膜症の何らかの形態を有する。増殖性の糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）が未治療のまま放置されると、患者の約６０％は５年以内に片方または両方の眼が失明する。北米、欧州および多くの新興国において糖尿病の発生が激増しているため、患者人口は急速に増加している。例えば失明の発生率は一般集団よりも糖尿病患者において２５倍高い値である。更にまた、糖尿病性網膜症（ＤＲ）は中年において失明の最も一般的な原因であり、毎年米国における全ての新症例の少なくとも１２パーセントに相当している。糖尿病患者の視力をモニタリングし、使用可能な治療が随時提供できるようにスクリーニングプログラムが設けられている。
糖尿病性網膜症の直接の原因はほとんど理解されていないが、疾患は原因の組み合わせ、即ち網膜血流の自己調節の減損、網膜細胞内部のソルビトールの蓄積、および細胞外液中の進行型グリコシル化最終生成物の蓄積に起源を有すると考えられている。これらの要因の全ては血流中の糖の存在量である高血糖に直接または間接的に関係している。
ＤＲの症状はＡＭＤの症状と同様である。患者は網膜内の細胞を喪失し、網膜の基底膜内に微小動脈瘤（血流）が生じる。更にまた、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１および他の血液媒介の因子が、恐らくはＳＤＦ−１も含めて、新しい血管細胞を誘引し、損傷性血管の形成を支援する。
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は人間の中心視野を破壊する。疾患の早期の段階は、症状が患者間で変動するため認識できない場合さえある。ある場合は、患者は片目のみ罹患する。あるいは、両眼の視力が減損するが、顕著ではない場合もある。疾患は歪曲または誤った色彩知覚をもたらす。視野の中心に暗部が生じる場合が多い。
疾患の病因（経過）はほとんど理解されていない。ＡＭＤはしばしば網膜の最外層の加齢と考えられている。物理的改変が、最も鋭い視覚を担っている網膜の部分である黄斑としても知られている網膜の中心部に生じる。
湿性のＡＭＤは疾患の乾性形態の続発症として始まる。患者のほぼ９０％がＡＭＤの乾性形態に罹患し、これは黄斑組織の薄片化およびその色素沈着の撹乱をもたらす。残りは湿性形態を有し、これは上記の出血を伴っている。
ＡＭＤの湿性形態は新規な治療方法の理想的な市場であり、既に５５歳超の人々における失明の最大原因であるＡＭＤは６５〜７４歳の米国人口の推定４％〜５％および７５歳以上の約１０％が罹患している。この疾患を有する８０歳超の人々は米国単独で既に５百万人が存在し、更に５百万人が２０２０年までに罹患すると推定される。
腫瘍は癌細胞の単なる塊ではなく、免疫細胞による腫瘍の浸潤が癌の１つの特徴である。多くのヒトの癌はこの浸潤の程度および表現型、並びに腫瘍の成長、生存および遊走、および血管新生に影響する複雑なケモカインネットワークを有する。大部分の固形腫瘍は多くの非悪性の間質細胞を含む。実際、間質細胞は場合により癌細胞より多数となる場合がある。癌において見出される主要な間質細胞はマクロファージ、リンパ球、内皮細胞および線維芽細胞である。
異なる種々の癌の型に由来する悪性の細胞は、ケモカイン受容体発現の異なるプロファイルを有するが、ＳＤＦ−１受容体ＣＸＣＲ４はマウスおよびヒトにおいて最も一般的に見出され、上皮、間葉および造血を原発とするヒト癌の少なくとも２３の異なる種類の型に由来する腫瘍細胞はＣＸＣＲ４を発現する（Ｂａｌｋｗｉｌｌ，２００４）。ＳＤＦ−１はＣＸＣＲ４に関する唯一の既知のリガンドである。これが構成的に発現する骨髄および二次リンパ様組織の他に、ＳＤＦ−１はリンパ腫における原発腫瘍部位（Ｃｏｒｃｉｏｎｅ，Ｏｔｔｏｎｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）および神経細胞株および星状細胞株の両方の脳腫瘍において見出される。更にまた、これは卵巣癌（Ｓｃｏｔｔｏｎ，Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）および膵臓癌（Ｋｏｓｈｉｂａ，Ｈｏｓｏｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０００）並びに乳癌の転移部位（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｈｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００１）および甲状腺癌（Ｈｗａｎｇ，Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）、神経芽腫および悪性血液疾患（Ｇｅｍｉｎｄｅｒ，Ｓａｇｉ−Ａｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ．，２００１）において高レベルで存在する。これとは対照的に、ＣＸＣＲ４の発現は正常な乳房（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｈｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００１）、卵巣（Ｓｃｏｔｔｏｎ，Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）および前立腺の上皮（Ｓｕｎ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）においては低値であるか存在しない。即ちＣＸＣＲ４の発現は悪性上皮細胞の一般的特徴であり、その正常な対応物においては一般的特徴ではないと考えられる。
腫瘍細胞上のケモカイン受容体シグナリングを抑制することは、成長停止またはアポトーシスを誘導し、侵襲および転移をインビボで予防するという潜在性を有する。
ｓｉＲＮＡによるＣＸＣＲ４のノックダウンは、乳癌の成長を停止させた（Ｌａｐｔｅｖａ，Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＣＸＣＲ４の表面発現を防止する構築物でトランスフェクトしたＴハイブリドーマ細胞は、マウスに静脈内注射した場合に遠位の臓器にはもはや転移できなかった（Ｚｅｅｌｅｎｂｅｒｇ，Ｒｕｕｌｓ−Ｖａｎ Ｓｔａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。結腸直腸癌細胞を用いた同様の実験において肺および肝臓への転移が大きく低減された（Ｚｅｅｌｅｎｂｅｒｇ，Ｒｕｕｌｓ−Ｖａｎ Ｓｔａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）。抗ＣＸＣＲ４抗体はリンパ節への乳癌異種移植片の拡張を抑制した（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｈｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００１）。抗ＣＸＣＲ４抗体または抗ＳＤＦ−１抗体を用いたリンパ芽球様細胞の治療は（ＮＯＤ）／ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍成長を遅延させた（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ，Ｄｅｌｌ’Ａｇｎｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。抗ＳＤＦ−１抗体は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞の臓器転移の発生を抑制した（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｂｕｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＣＸＣＲ４アンタゴニストＡＭＤ３１００（ＡｎｏｒＭＥＤ）の全身投与は頭蓋内神経膠芽腫および髄芽腫の異種移植片の成長を抑制し、２４時間以内の腫瘍細胞アポトーシスを増大させた（Ｒｕｂｉｎ，Ｋｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。抗ＳＤＦ−１抗体は癌腫関連線維芽細胞と混合したＭＣＦ−７乳癌細胞の成長を抑止した（Ｏｒｉｍｏ，Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。抗体によるＣＸＣＲ４の中和は骨部位における前立腺癌の転移および成長をブロックした（Ｓｕｎ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）。骨肉腫細胞の注射後の肺転移の発生はペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストＴ１３４の投与により予防された（Ｐｅｒｉｓｓｉｎｏｔｔｏ，Ｃａｖａｌｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
別の著者らはＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４系にターゲティングすることは癌患者に対して新しい治療の選択肢を提供し得ると結論付けている。
ヒト卵巣腫瘍はＳＤＦ−１を強力に発現することに加えて、ＶＥＧＦもより低レベルで発現する。両方のタンパク質は腫瘍における低酸素により誘発される。タンパク質単独のいずれの病理学的濃度もインビボで血管新生を誘導するために十分ではなかったが、併用されれば病理学的濃度のＳＤＦ−１とＶＥＧＦは血管形成を効率的かつ相乗作用的に誘導している。即ち、ＶＥＧＦ単独よりはむしろこの相乗作用的な系を遮断することが、癌治療のための新規で効率的な抗血管新生の方策となり得る（Ｋｒｙｃｚｅｋ，Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
乳癌細胞株は、オートクリンＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４シグナリング経路を備えているとき攻撃的な挙動を呈する。これにはより高速の成長を伴った侵襲性と遊走の増大が包含される。即ちＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４系は攻撃的な性質を予測するための重要な情報を与え得るものであり、ヒト乳癌における重要な治療標的を構成する（Ｋａｎｇ，Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
高レベルのＣＸＣＲ４を発現する小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞の遊走および転移はＳＤＦ−１により調節される。ＣＸＣＲ４の活性化は、腫瘍の微小環境内における補助細胞（例えば間質細胞）および細胞外マトリックス分子への接着を増進する。これらの接着相互作用は化学療法へのＳＣＬＣ細胞の抵抗性の増大をもたらす。即ち、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４系の抑制剤は、ＳＣＬＣ細胞の化学療法感受性を増大させ、ＳＣＬＣを有する患者に対する新しい治療法をもたらす場合がある（Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４系は身体における幹細胞の種々の型のトラフィッキングの中枢的調節物質として生じる。全てではないが大部分の悪性疾患は幹細胞／前駆細胞のコンパートメントから発生しているため、癌の幹細胞もまたその表面上でＣＸＣＲ４を発現し、その結果、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４系はそのトラフィッキング／転移をＳＤＦ−１を発現する臓器（例えばリンパ節、肺、肝臓、骨）に指向させることに関与している。結果として、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４系を調節することを目標とした方策は、組織に正常な幹細胞を送達するための再生医療における場合、癌幹細胞の転移を抑制するための臨床的腫瘍学における場合の双方において、重要な臨床用途を有する（Ｋｕｃｉａ，Ｒｅｃａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
本発明に潜在的に存在する課題はＳＤＦ−１に対する特異的アンタゴニストを提供することである。本発明に潜在的に存在する課題の別の態様はＳＤＦ−１およびＣＸＣＲ４受容体がそれぞれ関与する疾患および障害の治療のための化合物を提供することである。
本発明に潜在的に存在する別の課題はＳＤＦ−１の特異的検出のための方法を提供することである。
本発明に潜在的に存在する課題は独立請求項の構成要件により解決される。好ましい実施形態は独立請求項から誘導される。
第１の態様において、本発明に潜在的に存在する課題は、Ａ型核酸分子、Ｂ型核酸分子、Ｃ型核酸分子、ならびに配列番号１４２、配列番号１４３、および配列番号１４４のいずれかの核酸配列を有する核酸分子を含む群から選択され、好ましくはＳＤＦ−１に結合する核酸分子により解決される。
ある実施形態において、Ａ型核酸分子は下記のコアヌクレオチド配列、
５’ＡＡＡＧＹＲＡＣＡＨＧＵＭＡＡＸＡＵＧＡＡＡＧＧＵＡＲＣ３’（配列番号１９）
（式中、ＸＡは不在またはＡである）を含む。
好ましい実施形態においては、Ａ型核酸分子は、
５’ＡＡＡＧＹＲＡＣＡＨＧＵＭＡＡＵＧＡＡＡＧＧＵＡＲＣ３’（配列番号２０）、
５’ＡＡＡＧＹＲＡＣＡＨＧＵＭＡＡＡＵＧＡＡＡＧＧＵＡＲＣ３’（配列番号２１）、および、
５’ＡＡＡＧＹＡＡＣＡＨＧＵＣＡＡＵＧＡＡＡＧＧＵＡＲＣ３’（配列番号２２）
を含む群から選択されるコアヌクレオチド配列を含み、好ましくはコアヌクレオチド配列が５’ＡＡＡＧＹＡＡＣＡＨＧＵＣＡＡＵＧＡＡＡＧＧＵＡＲＣ３’（配列番号２２）を含む。
ある実施形態においては、核酸分子は、５’→３’の方向に、ヌクレオチドの第１のストレッチ、コアヌクレオチド配列、およびヌクレオチドの第２のストレッチを含む。
ある実施形態においては、核酸分子は、５’→３’の方向に、ヌクレオチドの第２のストレッチ、コアヌクレオチド配列、およびヌクレオチドの第１のストレッチを含む。
好ましい実施形態においては、核酸分子はヌクレオチドの第１のストレッチおよびヌクレオチドの第２のストレッチを含み、該ヌクレオチドの第１のストレッチおよび該ヌクレオチドの第２のストレッチは任意選択的に相互にハイブリダイズし、これによりハイブリダイゼーションのときに２本鎖構造が形成される。
別の好ましい実施形態においては、２本鎖構造は４〜６塩基対、好ましくは５塩基対からなる。
ある実施形態においては、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’Ｘ１Ｘ２ＮＮＢＶ３’（配列番号４４）のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＢＮＢＮＸ３Ｘ４３’（配列番号４５）のヌクレオチド配列を含む
（式中、Ｘ１は不在もしくはＲであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４は不在もしくはＹであるか、
または、
Ｘ１は不在であり、Ｘ２は不在もしくはＳであり、Ｘ３は不在もしくはＳであり、Ｘ４は不在である）。
ある実施形態においては、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＲＳＨＲＹＲ３’（配列番号２３）のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＹＲＹＤＳＹ３’（配列番号２４）のヌクレオチド配列を含み、
好ましくはヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＧＣＵＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＣＧＣＡＧＣ３’のヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態においては、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’Ｘ２ＢＢＢＳ３’（配列番号４２）のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＳＢＢＶＸ３３’（配列番号４３）のヌクレオチド配列を含み、
（式中、Ｘ２は不在またはＳであり、Ｘ３は不在またはＳである）
好ましくは、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＣＵＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＣＧＣＡＧ３’のヌクレオチド配列を含むか、またはヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＧＣＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＣＧＣＧＣ３’のヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態においては、核酸分子は配列番号５〜１８、２５〜４１、１３３、１３７、１３９〜１４１のいずれかに記載の核酸配列を有する。
ある実施形態においては、Ｂ型核酸分子は下記のコアヌクレオチド配列、
５’ＧＵＧＵＧＡＵＣＵＡＧＡＵＧＵＡＤＷＧＧＣＵＧＷＵＣＣＵＡＧＵＹＡＧＧ３’
（配列番号５７）
を含む。
好ましい実施形態においては、Ｂ型核酸分子は、
ＧＵＧＵＧＡＵＣＵＡＧＡＵＧＵＡＤＵＧＧＣＵＧＡＵＣＣＵＡＧＵＣＡＧＧ
（配列番号５８）
のコアヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態においては、核酸分子は、５’→３’の方向に、ヌクレオチドの第１のストレッチ、コアヌクレオチド配列、およびヌクレオチドの第２のストレッチを含む。
ある実施形態においては、核酸分子は、５’→３’の方向に、ヌクレオチドの第２のストレッチ、コアヌクレオチド配列、およびヌクレオチドの第１のストレッチを含む。
好ましい実施形態においては、核酸分子はヌクレオチドの第１のストレッチおよびヌクレオチドの第２のストレッチを含み、該ヌクレオチドの第１のストレッチおよび該ヌクレオチドの第２のストレッチは任意選択的に相互にハイブリダイズし、これによりハイブリダイゼーションのときに２本鎖構造が形成される。
ある実施形態においては、２本鎖構造は４〜６塩基対、好ましくは５塩基対からなる。
ある実施形態においては、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’Ｘ１Ｘ２ＳＶＮＳ３’（配列番号７７）のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＢＶＢＳＸ３Ｘ４３’（配列番号７８）のヌクレオチド配列を含む
（式中、Ｘ１は不在もしくはＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＣであり、Ｘ４は不在もしくはＵであるか、
または、
Ｘ１は不在であり、Ｘ２は不在もしくはＧであり、Ｘ３は不在もしくはＣであり、Ｘ４は不在である）。
ある実施形態においては、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’Ｘ１ＧＣＲＷＧ３’（配列番号５９）のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＫＲＹＳＣＸ４３’（配列番号６０）のヌクレオチド配列を含む（式中、Ｘ１は不在またはＡであり、Ｘ４は不在またはＵである）。
ある実施形態においては、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’Ｘ１ＧＣＧＵＧ３’（配列番号７５）のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＵＡＣＧＣＸ４３’（配列番号７６）のヌクレオチド配列を含み（式中、Ｘ１は不在またはＡであり、Ｘ４は不在またはＵである）、
好ましくは、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＡＧＣＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＵＡＣＧＣＵ３’のヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態においては、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’Ｘ２ＳＳＢＳ３’（配列番号７３）のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＢＶＳＳＸ３３’（配列番号７４）のヌクレオチド配列を含み（式中、Ｘ２は不在またはＧであり、Ｘ３は不在またはＣである）、
好ましくは、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＧＣＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＵＡＣＧＣ３’のヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態においては、核酸分子は配列番号４６〜５６、６１〜７２、および１３２のいずれかの核酸配列を有する。
ある実施形態においては、Ｃ型核酸分子は下記、
ＧＧＵＹＡＧＧＧＣＵＨＲＸＡＡＧＵＣＧＧ（配列番号９０）
（式中ＸＡは不在またはＡである）のコアヌクレオチド配列を含む。
好ましい実施形態においては、Ｃ型核酸分子は下記、
５’ＧＧＵＹＡＧＧＧＣＵＨＲＡＡＧＵＣＧＧ３’（配列番号９１）、
５’ＧＧＵＹＡＧＧＧＣＵＨＲＡＧＵＣＧＧ３’（配列番号９２）、および、
５’ＧＧＵＵＡＧＧＧＣＵＨＧＡＡＧＵＣＧＧ３’（配列番号９３）
を含む群から選択されるコアヌクレオチド配列を含み、好ましくはコアヌクレオチド配列は５’ＧＧＵＵＡＧＧＧＣＵＨＧＡＡＧＵＣＧＧ３’（配列番号９３）を含む。
ある実施形態においては、核酸分子は、５’→３’の方向に、ヌクレオチドの第１のストレッチ、コアヌクレオチド配列、およびヌクレオチドの第２のストレッチを含む。
ある実施形態においては、核酸分子は、５’→３’の方向に、ヌクレオチドの第２のストレッチ、コアヌクレオチド配列、およびヌクレオチドの第１のストレッチを含む。
好ましい実施形態においては、核酸分子はヌクレオチドの第１のストレッチおよびヌクレオチドの第２のストレッチを含み、該ヌクレオチドの第１のストレッチの少なくとも一部分および該ヌクレオチドの第２のストレッチの少なくとも一部分は任意選択的に相互にハイブリダイズし、これによりハイブリダイゼーションのときに２本鎖構造が形成される。
ある実施形態においては、第１のストレッチの長さおよび第２のストレッチの長さは個別に独立して０〜１７ヌクレオチド、好ましくは４〜１０ヌクレオチド、より好ましくは４〜６ヌクレオチドである。
ある実施形態においては、２本鎖構造は、４〜１０塩基対、好ましくは４〜６塩基対、より好ましくは５塩基対を含む。
好ましい実施形態においては、２本鎖構造は、連続する４〜１０塩基対、好ましくは連続する４〜６塩基対、より好ましくは連続する５塩基対を含む。
ある実施形態においては、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＲＫＳＢＵＳＮＶＧＲ３’（配列番号１２０）のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＹＹＮＲＣＡＳＳＭＹ３’（配列番号１２１）のヌクレオチド配列を含み、
好ましくはヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＲＫＳＢＵＧＳＶＧＲ３’（配列番号１２２）のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＹＣＮＲＣＡＳＳＭＹ３’（配列番号１２３）のヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態においては、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＸＳＳＳＳＶ３’（配列番号１２４）のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＢＳＳＳＸＳ３’（配列番号１２５）のヌクレオチド配列を含む（式中、ＸＳは不在またはＳである）。
ある実施形態においては、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＳＳＳＳＲ３’（配列番号１３０）のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＹＳＢＳＳ３’（配列番号１３１）のヌクレオチド配列を含み、
好ましくはヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＳＧＧＳＲ３’（配列番号１２６）のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＹＳＣＣＳ３’（配列番号１２７）のヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態においては、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＧＣＳＧＧ３’（配列番号１２８）のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＣＣＫＧＣ３’（配列番号１２９）のヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＧＣＣＧＧ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＣＣＧＧＣ３’のヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態においては、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＣＧＵＧＣＧＣＵＵＧＡＧＡＵＡＧＧ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＣＵＧＡＵＵＣＵＣＡＣＧ３’のヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態においては、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＵＧＡＧＡＵＡＧＧ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＣＵＧＡＵＵＣＵＣＡ３’のヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態においては、ヌクレオチドの第１のストレッチは５’ＧＡＧＡＵＡＧＧ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第２のストレッチは５’ＣＵＧＡＵＵＣＵＣ３’のヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態においては、核酸分子は配列番号７９〜８９、９４〜１１９、および１３４〜１３６のいずれかの核酸配列を有する。
ある実施形態においては、核酸分子は配列番号１４２〜１４４のいずれかの核酸配列を有する。
ある実施形態においては、核酸分子はＳＤＦ−１に対するアンタゴニストである。
ある実施形態においては、核酸分子はＳＤＦ−１受容体系のアンタゴニストであり、好ましくはＳＤＦ−１受容体系のＳＤＦ−１受容体はＣＸＣＲ４受容体である。
ある実施形態においては、ＳＤＦ−１はヒトＳＤＦ−１であり、および／またはＳＤＦ−１受容体系のＳＤＦ−１受容体はヒトＳＤＦ−１受容体である。
ある実施形態においては、ＳＤＦ−１は配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態においては、核酸分子は修飾を含む。
好ましい実施形態においては、修飾はＨＥＳ部分およびＰＥＧ部分を含む群から選択される。
別の好ましい実施形態においては、修飾は直鎖または分枝鎖のＰＥＧからなるＰＥＧ部分であり、ＰＥＧ部分の分子量は好ましくは約２〜１８０ｋＤであり、より好ましくは約６０〜１４０ｋＤであり、最も好ましくは約４０ｋＤである。
ある実施形態においては、修飾はＨＥＳ部分であり、好ましくはＨＥＳ部分の分子量は約１０〜１３０ｋＤであり、より好ましくは約３０〜１３０ｋＤであり、最も好ましくは約１００ｋＤである。
ある実施形態においては、核酸のヌクレオチドはＬ−ヌクレオチド、好ましくは配列番号１９、２０、２１、２２、５７、５８、９０、９１、９２および９３のいずれかの配列のヌクレオチドである。
第２の態様において、本発明に潜在的に存在する課題は第１の態様に記載の核酸と任意選択的にさらなる構成成分とを含む医薬組成物であって、構成成分が薬学的に許容可能な賦形剤と薬学的活性剤とを含む群から選択される上記医薬組成物により解決される。
第３の態様において、本発明に潜在的に存在する課題は薬物の製造のための第１の態様に記載の核酸の使用により解決される。
第３の態様のある実施形態において、薬物は疾患または障害の治療および／または予防のためのものであり、該疾患または障害はＳＤＦ−１により媒介され、好ましくは該疾患または障害は眼底の疾患、例えば糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性；乳房、卵巣、前立腺、膵臓、甲状腺、鼻咽頭、結腸、肺および胃の癌；骨肉腫；黒色腫；神経膠腫；髄芽腫および神経芽腫；白血病；ＷＨＩＭ症候群；免疫不全症候群；病的血管形成；炎症；多発性硬化症；慢性関節リウマチ／変形性関節症および腎炎を含む群から選択される。
第３の態様のある実施形態において、薬物は血管新生、血管形成、炎症および転移を抑制するためのものである。
第４の態様において、本発明に潜在的に存在する課題は診断手段の製造のための第１の態様に記載の核酸の使用により解決される。
第４の態様のある実施形態において、診断手段は疾患の診断のためのものであり、該疾患は眼底の疾患、例えば糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性；乳房、卵巣、前立腺、膵臓、甲状腺、鼻咽頭、結腸、肺および胃の癌；骨肉腫；黒色腫；神経膠腫；髄芽腫および神経芽腫；白血病；ＷＨＩＭ症候群；免疫不全症候群；病的血管形成；炎症；多発性硬化症；慢性関節リウマチ／変形性関節症および腎炎を含む群から選択される。
第４の態様のある実施形態において、診断手段は血管新生、血管形成、炎症および／または転移の診断のためのものである。
第５の態様において、本発明に潜在的に存在する課題は、ＳＤＦ−１と、第１の態様に記載の核酸とを含む複合体であって、好ましくは複合体が結晶性の複合体である上記複合体により解決される。
第６の態様において、本発明に潜在的に存在する課題はＳＤＦ−１の検出のための第１の態様に記載の核酸の使用により解決される。
第７の態様において、本発明に潜在的に存在する課題は、
候補ＳＤＦ−１アンタゴニストおよび／または候補ＳＤＦ−１アゴニストを提供するステップと、
第１の態様に記載の核酸を提供するステップと、
ＳＤＦ−１アンタゴニストおよび／またはＳＤＦ−１アゴニストの存在下にシグナルを与える試験系を提供するステップと、
候補ＳＤＦ−１アンタゴニストがＳＤＦ−１アンタゴニストであるかどうか、および／または候補ＳＤＦ−１アゴニストがＳＤＦ−１アゴニストであるかどうかを決定するステップと
を含むＳＤＦ−１アンタゴニストまたはＳＤＦ−１アゴニストをスクリーニングするための方法により解決される。
第８の態様において、本発明に潜在的に存在する課題は、
相、好ましくは固相に固定化されたＳＤＦ−１を提供するステップ、
第１の態様に記載の核酸、好ましくは標識された第１の態様に記載の核酸を提供するステップと、
候補ＳＤＦ−１アゴニストおよび／または候補ＳＤＦ−１アンタゴニストを添加するステップと、
候補ＳＤＦ−１アゴニストがＳＤＦ−１アゴニストであるかどうか、および／または候補ＳＤＦ−１アンタゴニストがＳＤＦ−１アンタゴニストあるかどうかを決定するステップと、
を含むＳＤＦ−１アゴニストおよび／またはＳＤＦ−１アンタゴニストをスクリーニングするための方法により解決される。
第８の態様のある実施形態において、核酸が候補ＳＤＦ−１アゴニストにより、または候補ＳＤＦ−１アンタゴニストにより置き換えられているかどうかが評価されるように決定が実施される。
第９の態様において、本発明に潜在的に存在する課題は第１の態様に記載の核酸を含むＳＤＦ−１の検出のためのキットにより解決される。
第１０の態様において、本発明に潜在的に存在する課題は第７の態様または第８の態様に記載の方法により得られるＳＤＦ−１アンタゴニストにより解決される。
本発明はＳＤＦ−１に特異的に、高親和性で結合する核酸を形成することができるという意外な発見に基づいている。
ＳＤＦ−１は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドである。ＳＤＦ−１の計算されたｐＩは９．７０である。本明細書においては、ＳＤＦ−１という用語ははいずれかのＳＤＦ−１、例えば限定しないが哺乳類ＳＤＦ−１を指す。好ましくは、哺乳類ＳＤＦ−１はマウスＳＤＦ−１、ラットＳＤＦ−１、ウサギＳＤＦ−１、ハムスターＳＤＦ−１、サルＳＤＦ−１およびヒトＳＤＦ−１を含む群から選択される。最も好ましくは、ＳＤＦ−１はヒトＳＤＦ−１（配列番号１）である。
ＳＤＦ−１に対する高親和性結合核酸が識別可能であったという発見は、Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅａｔｏｎ，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７）の観察によれば塩基性タンパク質に指向されたアプタマーの生成、即ち標的分子へのＤ−核酸の結合が、この種の標的が高い値ではあるが非特異的な信号対雑音比を生じるために一般的には非常に困難であったことからすれば、現時点において意外なことである。この高い信号対雑音比はＳＤＦ−１のような塩基性の標的に対する核酸により示される高値の非特異的親和性に起因している。
本発明による核酸の本明細書に記載する性質は、核酸を単独またはいずれかの組み合わせにおいて使用する本発明のいずれかの態様において理解することができる。
特定の理論に制約されないが、本発明者等は本発明によるＳＤＦ−１結合核酸の観察された特異性が、何らかの構造的性質、および、特に、図１〜８および実施例１を参照しながら後に詳細に考察するコア配列とも称するヌクレオチド配列の１つを共有すると推定する。しかしながら該図および実施例は本発明による核酸の各々およびいずれかにおいて必ずしも理解する必要はない該構造的性質のいくつかを組み込んでいる。
特許請求の範囲および実施例１においてより詳細に概説する通り、種々のヒトＳＤＦ−１結合核酸分子はそれぞれボックスおよびいくつかの構造的性質および要素に基づいて類別できる。即ち定義される種々の分類は、本明細書においては型、より具体的にはＡ型、Ｂ型およびＣ型とも称する。
好ましい実施形態においては、本発明による核酸は単一の核酸分子である。別の実施形態においては、単一の核酸分子は多数の単一の核酸分子として存在する。好ましくは核酸および核酸分子という用語は相反する指示が無い限り本明細書においては互換的に使用する。
当業者に知られているように、好ましくは、本発明による核酸分子は、ホスホジエステル結合またはホスホジエステル結合部を好ましくは介して相互に共有結合されたヌクレオチドからなる。
本発明による核酸はまた本明細書に開示した特定の配列と本質的に相同である核酸を含む。本質的に相同という用語は、相同性が少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える場合と理解してよい。
本発明による核酸中に存在する相同なヌクレオチドの実際のパーセンテージは、該核酸中に存在するヌクレオチドの総数に依存する。パーセントの修正は核酸中に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。
相同性は当分野で既知の通りに測定できる。より具体的には、配列比較アルゴリズムにより、指定のプログラムパラメータに基づいて参照配列と比較した場合の試験配列のパーセント配列同一性を計算する。試験配列は、好ましくはそれが別の核酸分子と相同であるというべき、または相同であるかどうか、相同であればどの程度であるかを試験すべき配列または核酸分子であり、そのような別の核酸分子も参照配列と称される。ある実施形態においては、参照配列は本明細書に記載した核酸分子、より好ましくは、配列番号５〜１４４のいずれかの配列を有する核酸分子である。比較のための配列の最適なアライメントは例えばＳｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ、１９８１）によるか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０）によるか、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎの類似法に関する検索（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ、１９８８）によるか、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によるか、または目視による検査により実施できる。
パーセント配列同一性を測定するために適しているアルゴリズムの一例はベーシックローカルアライメント検索ツール（以降「ＢＬＡＳＴ」）において使用されているアルゴリズムであり、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７）を参照できる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以降「ＮＣＢＩ」）を介して公的に入手できる。ＮＣＢＩから入手できるソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列用）を用いて配列同一性を測定する場合に使用されるデフォルトパラメータはＭｃＧｉｎｎｓ ｅｔ ａｌ．（ＭｃＧｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）に記載されている。
本発明の核酸という用語、または本発明による核酸という用語は、本明細書に開示している核酸配列またはその部分を、好ましくは核酸または該部分がＳＤＦ−１への結合に関与する程度まで含む核酸を含む。そのような核酸は例えばトランケーションにより本明細書に開示するものから誘導してよい。トランケーションは本明細書に開示する通り核酸の末端の一方または両方に関わるものであってよい。また、トランケーションはヌクレオチドの内部の配列に関わるものであってよく、即ちそれはそれぞれ５’末端および３’末端のヌクレオチドの間のヌクレオチドに関わるものであってよい。更にまた、トランケーションは本明細書に開示した核酸の配列から単一ほどの少数のヌクレオチドの欠失を含む。トランケーションはまた本発明の核酸の１つより多いストレッチに関わるものであってよく、その場合、ストレッチは１ヌクレオチド長ほど短くてもよい。本発明による核酸の結合は通常の実験を用いて当業者により、または本明細書に記載した方法、好ましくは実施例の部分において本明細書に記載した方法を用いるか適合させることにより測定できる。
本発明による核酸はＤ−核酸またはＬ−核酸のいずれかであってよい。好ましくは、本発明の核酸はＬ−核酸である。更にまた、核酸の１つまたはいくつかがＤ−核酸として存在するか、または核酸の少なくとも１つまたは複数の部分がＬ−核酸であることも可能である。核酸の「部分」という用語は１つ程度の少数のヌクレオチドを意味する場合もある。そのような核酸は本明細書においては一般的にそれぞれＤ−核酸およびＬ−核酸と称する。従って、特に好ましい実施形態においては、本発明による核酸はＬ−ヌクレオチドよりなり、少なくとも１つのＤ−ヌクレオチドを含む。そのようなＤ−ヌクレオチドは好ましくは本発明による核酸を定義するストレッチとは異なる部分、好ましくは核酸の他の部分との相互作用が関与している核酸の部分に結合する。好ましくは、そのようなＤ−ヌクレオチドは、それぞれストレッチおよび本発明による任意の核酸の任意の末端に結合する。別の好ましい実施形態においては、そのようなＤ−ヌクレオチドは本発明による核酸にＰＥＧおよびＨＥＳのような修飾部を好ましくは結合させるスペーサーまたはリンカーとして機能する。
本明細書に記載した核酸分子の各々およびいずれかは、その核酸配列の観点で、その全体において、特定のヌクレオチド配列に限定されることも本発明に含まれる。換言すれば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」という用語は含有する、または、からなるという意味においてそのような実施形態では解釈される。
本発明による核酸はより長い核酸の部分であり、このより長い核酸は複数の部分を含み、少なくとも１つのそのような部分は本発明による核酸またはその部分である。これらのより長い核酸の他の部分は、１つまたはいくつかのＤ−核酸またはＬ−核酸のいずれかであることができる。いかなる組み合わせも本発明と関連して使用してよい。より長い核酸のこれらの他の部分は結合とは異なる機能、好ましくはＳＤＦ−１への結合とは異なる機能を呈することができる。１つの可能な機能は他の分子との相互作用を可能にすることであり、この場合、そのような他の分子は好ましくは、例えば固定化、架橋結合、検出または増幅に関して、ＳＤＦ−１とは異なる。本発明の別の実施形態においては、本発明による核酸は、本発明の核酸のいくつかを個々の、または複合された部分として含む。本発明の核酸のいくつかを含むそのような核酸もまたより長い核酸という用語に包含される。
Ｌ−核酸とは、本明細書においてはＬ−ヌクレオチドからなり、好ましくは完全にＬ−ヌクレオチドからなる核酸である。
Ｄ−核酸とは、本明細書においてはＤ−ヌクレオチドからなり、好ましくは完全にＤ−ヌクレオチドからなる核酸である。
核酸および核酸分子という用語は、相反する指示が無い限り本明細書においては互換的に使用される。
更にまた相反する指示が無い限り、いかなるヌクレオチド配列も本明細書においては５’→３’の方向に記載する。
本発明の核酸がＤ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、または、両方の組み合わせであって、該組み合わせがランダムな組み合わせであるか、少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドおよび少なくとも１つのＤ−核酸からなるストレッチの所定の配列である組み合わせであるかどうかにかかわらず、核酸はデスオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこれらの組み合わせからなるものであってよい。
Ｌ−核酸として本発明の核酸を設計することはいくつかの理由により好都合である。Ｌ−核酸は天然に存在する核酸のエナンチオマーである。しかしながらＤ−核酸は水溶液中、および特に生物系または生物試料中においては、ヌクレアーゼの広範な存在により、それほど安定ではない。天然に存在するヌクレアーゼ、特に動物細胞由来のヌクレアーゼはＬ−核酸を分解することができない。このため、Ｌ−核酸の生物学的半減期は、動物およびヒトの身体を含む生物系の中においては顕著に増大する。Ｌ−核酸の生物分解性が存在しないことにより、ヌクレアーゼ分解生成物が生成されず、このため、それより生じる副作用は観察されない。この点で、Ｌ−核酸は、ＳＤＦ−１の存在が関与している疾患および／または障害の治療において使用されている事実上全ての他の化合物から区別される。ワトソンクリック塩基対形成とは異なる機序を介して標的分子に特異的に結合するＬ−核酸、または部分的または完全にＬ−ヌクレオチドからなるアプタマー、特に標的分子へのアプタマーの結合に関与するアプタマーの部分を有するアプタマーは、シュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓ）とも称される。
コアヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチドの第１のストレッチおよび第２のストレッチは原則として相互にハイブリダイズできるということも本発明の範囲内に包含される。そのようなハイブリダイゼーションでは２本鎖構造が形成される。当業者に知られているように、そのようなハイブリダイゼーションは特にインビトロおよび／またはインビボの条件下において起こる場合と起こらない場合がある。更にまた、そのようなハイブリダイゼーションの場合、必ずしも２つのストレッチの全長にわたってハイブリダイゼーションが起こるわけではなく、その場合、少なくとも塩基対形成の規則に基づいて、そのようなハイブリダイゼーション、それによる２本鎖構造の形成が起こってよい。好ましくは本明細書においては、２本鎖構造は２つ以上の別個の鎖により形成される分子または構造の一部分であり、ここで少なくとも１つ、好ましくは２つ以上の塩基対が存在し、それらは好ましくはワトソンクリック塩基対形成規則に従って塩基対形成している。当業者に知られているように、他の塩基対形成、例えばフーグスティーン塩基対形成がそのような２本鎖構造中に存在するか、フーグスティーン塩基対が形成してもよい。
本発明の核酸は、それらがＤ−核酸、Ｌ−核酸、またはＤ，Ｌ−核酸として存在するかどうかに関わらず、あるいはそれらがＤＮＡであるかＲＮＡであるかに関わらず、１本鎖または２本鎖の核酸として存在してよい。典型的には本発明の核酸は一次配列に起因する所定の二次構造を呈し、これにより三次構造も形成してよい１本鎖核酸である。しかしながら本発明の核酸はまた、相互に相補的であるか、部分的に相補的である２つの鎖が相互にハイブリダイズするという意味において２本鎖であってもよい。これにより核酸に安定性が付与され、２本鎖は特に核酸がＬ型ではなく天然に存在するＤ型で存在する場合に好都合である。
本発明の核酸は修飾されていてもよい。そのような修飾は核酸の単一のヌクレオチドに関するものであってよく、当分野で周知である。そのような修飾の例は、例えばＶｅｎｋａｔｅｓａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ，Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００３）およびＫｕｓｓｅｒ（Ｋｕｓｓｅｒ，２０００）に記載されている。そのような修飾は、核酸を構成している個々のヌクレオチドの２’位におけるＨ原子、Ｆ原子、またはＯ−ＣＨ３基またはＮＨ２基であることができる。更にまた、本発明による核酸は少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドを含むことができる。ある実施形態においては、本発明による核酸はＬＮＡヌクレオチドからなる。
ある実施形態において、本発明による核酸は多分岐核酸であってよい。多分岐核酸とは本明細書においては少なくとも２つの核酸鎖からなる核酸である。これらの少なくとも２つの核酸鎖は機能的単位を形成し、ここで機能的単位は標的分子に対するリガンドである。少なくとも２つの核酸鎖は、本発明の核酸のいずれかから核酸を切断して２つの鎖を生成することによるか、または本発明の、即ち全核酸の第１の部分に相当するある核酸、および全核酸の第２の部分に相当する別の核酸を合成することにより、誘導してよい。当然ながら、切断および合成は両者ともに、上記例示したように、２つより多い鎖が存在する多分岐核酸を生成するために適用してよい。換言すれば、少なくとも２つの核酸鎖は、種々の核酸部分の間に特定の範囲の相補性が存在してよいが、典型的には相互に相補でありハイブリダイズする２つの鎖とは異なる。
最後に、本発明による核酸の完全に閉鎖した、即ち環状の構造も実現されること、即ち本発明による核酸は好ましくは共有結合部を介して閉鎖されることも本発明の範囲に包含され、この場合、より好ましくはそのような共有結合部は本明細書に開示する通り核酸配列の５’末端および３’末端の間に生じる。
本発明者等は本発明による核酸が極めて好都合なＫｄ値範囲を呈することを発見した。
結合定数を求める可能性は、いわゆるＢｉａｃｏｒｅ装置（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の使用による表面プラズモン共鳴測定であり、これも当業者に知られている。本明細書で好ましく使用される親和性はまた、実施例に記載する「プルダウン結合試験」の使用により計測した。核酸と、この場合はＳＤＦ−１である標的との間の結合の強度を表示するための適切な尺度は、いわゆるＫｄ値であり、Ｋｄ値、及びその測定のための方法は当業者の知る通りである。
本発明による核酸は、特定のＫｄ値により特徴づけられる。好ましくは本明細書による核酸により示されるＫｄ値は１μＭ未満である。約１μＭのＫｄ値は、標的への核酸の非特異的結合に特徴的であると言える。当業者に知られるように、本発明による核酸のような化合物群のＫｄ値は特定の範囲内にある。約１μＭの上記Ｋｄは、Ｋｄ値の好ましい上限である。標的結合核酸のＫｄの好ましい下限は約１０ｐＭ以上であることができる。グレリンに結合する個々の核酸のＫｄ値が好ましくはこの範囲内であることは、本発明の範囲内である。好ましい範囲はこの範囲内のいずれかの第１の数、およびこの範囲内のいずれかの第２の数を選択することにより定義できる。好ましい高い方の値は２５０ｎＭおよび１００ｎＭであり、好ましい低い方の値は５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭおよび１０ｐＭである。
本発明による核酸分子は、それらがなお標的分子に結合できる限りにおいて、いかなる長さを有してもよい。当業者に知られるように、本発明による核酸には好ましい長さがある。典型的には長さは１５〜１２０ヌクレオチドである。当業者に知られるように、１５と１２０との間の整数は本発明による核酸の可能な長さである。本発明による核酸の長さのより好ましい範囲は、約２０〜１００ヌクレオチド、約２０〜８０ヌクレオチド、約２０〜６０ヌクレオチド、約２０〜５０ヌクレオチド、および約２０〜４０ヌクレオチドの長さである。
本明細書に開示した核酸が、好ましくは高分子量の部分であり、および／または好ましくは特に動物の体、好ましくはヒトの体における滞留時間の点において核酸の特性を修飾できる部分を含むことは、本発明の範囲内である。そのような修飾の特に好ましい実施形態は、本発明による核酸のＰＥＧ化およびＨＥＳ化である。本明細書においては、ＰＥＧとはポリ（エチレングリコール）を意味し、ＨＥＳはヒドロキシエチル澱粉を意味する。本明細書において好ましく使用されるＰＥＧ化は、本発明による核酸の修飾であって、修飾が本発明による核酸に結合したＰＥＧ部分からなる修飾である。本明細書において好ましく使用されるＨＥＳ化は、本発明による核酸の修飾であって、修飾が本発明による核酸に結合したＨＥＳ部分からなる修飾である。これらの修飾及びそのような修飾を用いて核酸を修飾するプロセスは、引用することにより本明細書の一部をなすものとする欧州特許出願第ＥＰ１３０６３８２号に記載されている。
好ましくは高分子量の部分からなる、または高分子量の部分を含む修飾の分子量は、特にＰＥＧがそのような高分子量の部分である場合は、約２，０００〜２００，０００Ｄａ、好ましくは４０，０００〜１２０，０００Ｄａであり、特にＨＥＳがそのような高分子量の部分である場合は、好ましくは約３，０００〜１８０，０００Ｄａ、より好ましくは６０，０００〜１４０，０００Ｄａである。ＨＥＳ修飾のプロセスは、例えば引用することにより本明細書の一部をなすものとする独国特許出願第ＤＥ１２００４００６２４９．８号に記載されている。
ＰＥＧおよびＨＥＳのいずれかを、特許出願第ＷＯ２００５０７４９９３号およびＰＣＴ／ＥＰ０２／１１９５０において更に記載されている通り直鎖または分枝鎖の形態において使用してよいことも本発明の範囲内である。そのような修飾は原則として本発明の核酸分子に対し、そのいずれかの位置において行うことができる。好ましくはそのような修飾は核酸分子の５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、および／または５’ヌクレオチドと３’ヌクレオチドの間のいずれかのヌクレオチドに対して行う。
修飾、および好ましくはＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分は、直接にまたはリンカーを介して本発明の核酸分子に結合できる。本発明による核酸分子が１つ以上の修飾、好ましくは１つ以上のＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分を含むことも本発明の範囲内である。ある実施形態においては、個々のリンカー分子は１つより多いＰＥＧ部分またはＨＥＳ部分を本発明による核酸分子に結合させる。本発明に関連して使用されるリンカーはそれ自体は直鎖または分枝鎖であることができる。この種のリンカーは当業者の知る通りであり、特許出願第ＷＯ２００５０７４９９３号およびＰＣＴ／ＥＰ０２／１１９５０において更に記載されている通りである。
特定の理論に制約されないが、重合体、更に好ましくは本明細書に開示する重合体であって、好ましくは生理学的に許容されるもののような高分子量の部分を用いて本発明による核酸を修飾することにより、排出動態が変化すると考えられる。より詳細には、そのような修飾された本発明の核酸分子量の増大に起因して、特にＬ型の場合には核酸が代謝に付されないことに起因して、動物の体から、好ましくは哺乳類の体から、より好ましくはヒトの体からの排出が低下するように思われる。排出は典型的には腎臓を介して起こるため、本発明者等は、このように修飾された核酸の糸球体濾過速度は、体内の滞留時間を増大せるこの種の高分子量修飾を有さない核酸と比較して、有意に低減されると推定する。このことに関連して、そのような高分子量の修飾にも関わらず、本発明による核酸の特異性は損なわれる方向には影響を受けていないことは重要である。現時点で本発明による核酸は、除放性をもたらすために除放性を与える医薬品製剤を必ずしも必要としないような、通常であれば薬学的活性化合物からは期待されない意外な特性を有する。高分子量の部分を含む修飾された形態の本発明による核酸はむしろ、それ自体が既に除放性製剤として使用できる。現時点で、本明細書に開示した核酸分子の修飾、およびそのように修飾された核酸分子およびこれを含むいずれかの組成物は、明確に異なる薬物動態およびその生体分布、好ましくは制御された薬物動態およびその生体分布を与え得ると考えられる。これはまた組織への循環および分布における滞留時間を含む。そのような修飾はＰＣＴ／ＥＰ０２／１１９５０において更に記載されている。
しかしながら、本明細書に開示した核酸がいかなる修飾も含まず、特にＰＥＧ化またはＨＥＳ化のような高分子量の修飾を有さないことも本発明の範囲に含まれる。そのような実施形態は、投与後の体からの核酸の急速なクリアランスが望ましい場合に特に好ましい。そのような急速なクリアランスは本発明による核酸またはこれを含む薬物を用いたインビボの画像化、または特定の治療投薬の条件の場合に望ましいものとなる。
即ち本明細書においては本発明による核酸および／または本発明によるアンタゴニストとも称する本発明の核酸は、薬物の生成または製造のために使用してよい。そのような薬物は本発明の核酸の少なくとも１つを、任意選択的に別の薬学的活性化合物と共に含有しており、この場合、本発明の核酸自体が好ましくは薬学的活性化合物として作用する。そのような薬物は好ましい実施形態においては少なくとも薬学的に許容可能な担体を含む。そのような担体は、例えば水、緩衝液、ＰＢＳ、グルコース溶液、スクロース溶液、マンノース溶液、好ましくは５％スクロース平衡化溶液、澱粉、糖、ゼラチンまたはいずれかの他の許容される担体物質であってよい。そのような担体は一般的に当業者には公知である。当分野で公知の通り、本発明の薬物のいずれかの実施形態、使用および態様、または本発明の薬物に関連するいずれかの実施形態、使用および態様は、本発明の医薬組成物にも適用されてもよく、適用されなくてもよい。
本発明に従った核酸、医薬組成物および薬物、または本発明に従って調製された核酸、医薬組成物および薬物を用いて治療および／または予防される適応症、疾患および障害は、それぞれの病因機序におけるＳＤＦ−１の直接または間接的な関与に起因する。
当然ながら、本発明によるＳＤＦ−１結合核酸はヒトまたはネズミのＳＤＦ−１と相互作用するか、これに結合するため、本発明によるＳＤＦ−１結合核酸は、本明細書に記載したヒトおよび動物のいずれかの疾患の治療、予防および／または診断のために容易に使用できることは、当業者は通常理解するだろう。
そのような薬物を使用して治療および／または予防される疾患および／または障害および／または疾患状態は、眼底の疾患、例えば網膜症、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性の乾性および湿性の形態；癌；乳房、卵巣、前立腺、膵臓、甲状腺、鼻咽頭、結腸、肺および胃の癌；骨肉腫；黒色腫；神経膠腫；髄芽腫および神経芽腫；白血病；Ｂ細胞慢性リンパ性白血病；多発性骨髄腫；リンパ腫；ＷＨＩＭ症候群；免疫不全症候群；病的血管新生；炎症；多発性硬化症；慢性関節リウマチ、変形性関節症および腎炎を含むが、これらに限定されない。
別の実施形態において、薬物は別の薬学的活性剤を含む。そのような別の薬学的活性剤は当業者には公知のものであることができ、好ましくはケモカインアンタゴニストまたはサイトカインアンタゴニスト、コルチコステロイド等を含む群から選択される。本発明による核酸により本発明に従って対象とすることができる種々の適応症が存在する場合、上記の別の薬学的活性剤は、原則としてそのような疾患の治療および／または予防に適するいずれかのものであってよいことは、当業者には理解される。特に薬物として存在または使用する場合の本発明による核酸分子は、好ましくはＶＥＧＦ抑制剤、例えばＰｆｉｚｅｒ ＯｐｔｈａｌｍｉｃｓのＭａｃｕｇｅｎ（ペガタニブ）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＯｐｈｔｈａｌｍｉｃｓのＬｕｃｅｎｔｉｓ（ラニチツマブ）、ＲｏｃｈｅのＡｖａｓｔｉｎ（ベバシツマブ）（オフラベル使用）、または光力学的療法、例えばＮｏｖａｒｔｉｓ ＯｐｈｔｈａｌｍｉｃｓのＶｉｓｕｄｙｎｅ（バルテポルフィング）および硝子体内注射可能なコルチゾン誘導体、例えばＡｌｃｏｎ Ｉｎｃ．のＲｅｔａａｎｅ（アネコルタブアセテート）と組み合わせる。
あるいは、または追加的に、そのような別の薬学的活性剤は本発明による別の核酸である。あるいは、薬物はＳＤＦ−１とは異なる標的分子に結合する核酸か、本発明による核酸の１つとは異なる機能を呈する核酸を少なくとも１つ含む。
当業者に知られるように、ＳＤＦ−１に対するアンタゴニストをこのようなアンタゴニストの必要な患者に投与することができる場合であって、このようなアンタゴニストが疾患または障害の原因を除去するため、または疾患または障害に起因する作用を少なくとも低減するために適する場合のいずれかの疾患において、本発明の核酸を実際に使用してよい。そのような作用は、病的な血管形成、炎症および転移を含むが、これらに限定されない。これらおよび他の疾患または障害に関連した本発明による核酸の適用性は、特に、不必要な繰り返しを回避するため引用することにより本明細書の一部をなすものとする本明細書の序論部分において概説した通り、ＳＤＦ−１の関与に起因している。
薬物は原則として、開示した疾患のいずれかの治療のための薬物の使用と関連して該疾患の予防のために、代替的または追加的に使用されことも本発明の範囲内である。従って、それぞれのマーカー、即ちそれぞれの疾患に対するそれぞれのマーカーは当業者に知られている。好ましくはそれぞれのマーカーはＳＤＦ−１である。あるいは、および／または追加的に、それぞれのマーカーはフェリシアニドの膜貫通還元酵素（ＴＭＲ）、ソルビトールの後蓄積を含むソルビトール経路の活性増大、細胞質ゾルのＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の増大、ＮＡＤＰＨの枯渇およびフラクトースの蓄積とその結果として生じる進行グリケーション最終生成物（ＡＧＥＳ）の非酵素的生産およびその結果として生じるタンパク質キナーゼＣの活性化、ＭＡＰキナーゼ活性化のようなニトロソおよび酸化ストレス媒介性の下流の事象を含む酸化ストレスマーカー；例えばＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ハプトグロビン、またはＣ反応性タンパク質を含む炎症マーカー；および、例えばエリスロポエチンまたはＶＥＧＦを含むプロ血管新生マーカーの群から選択される。これを鑑みれば、該マーカーは本発明による核酸分子のいずれかを用いてある対象または患者を治療できるかどうかを調べるために使用することができる。従って、別の態様において、本発明はそのような方法に関し、そのような方法においてそれぞれのマーカーの存在または不在、より具体的には濃度を測定する。該マーカーの検出および任意選択的にその定量をするための方法、並びに、対象または患者が該疾患のいずれかに罹患しているか、またはそのような疾患を発症する危険性を有するかどうか、適宜に本発明に従って治療してよいかどうかを決定するためにそれぞれのマーカーが存在または不在であるべき範囲は当業者には知られている。
本発明の薬物の１つの実施形態において、そのような薬物は本明細書に開示した疾患のいずれかの他の治療、特に本発明の薬物を使用すべき治療と組み合わせて使用される。
「併用療法（または「同時療法」）」は、本発明の薬物および少なくとも１つの第２の薬剤の投与を、これらの治療薬、即ち本発明の薬物および該第２の薬剤の同時作用から得られる有利な作用をもたらすことを意図した特定の治療計画の部分として行うことを含む。組み合わせの有利な作用は、治療薬の組み合わせに起因する薬物動態または薬力学的な同時作用を包含するがこれらに限定されない。組み合わせにおけるこれらの治療薬の投与は、典型的には所定の時間（選択された組み合わせに応じて通常は数分、数時間、数日、または数週間）にわたって実施される。
一般的とはいえないが「併用療法」は、偶然にまたは任意の本発明の組み合わせが生じるような、別個の単剤治療計画の部分としてこれらの治療薬の２種以上の投与を包含することを意図してよい。「併用療法」は、逐次的にこれらの治療薬の投与、即ち各治療薬を異なる時間に投与する場合、並びに実質的に同時にこれらの治療薬または治療薬の少なくとも２種の投与を包含することを意図している。実質的同時投与は例えば各治療薬の固定した比率を有する単一のカプセル、または治療薬各々に対する多数の単カプセルにおいて患者に投与することにより達成することができる。
各治療薬の逐次的投与または実質的同時投与は、局所経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を経由する直接の吸収を含むいずれかの適切な経路により行うことができるが、これらに限定されない。治療薬は同じ経路により、または異なる経路により投与できる。例えば選択された組み合わせの第１の治療薬を注射により投与し、組み合わせの別の治療薬を局所投与してよい。
あるいは、例えば全ての治療薬を局所投与してよく、または全ての治療薬を注射により投与してよい。治療薬を投与する順序は、特別の記載が無い限り狭小に厳密とならない。「併用療法」はまた上記した治療薬を更に他の生物学的活性成分と組み合わせて投与することも包含できる。併用療法が非薬物の治療をさらに含む場合は、非薬物の治療は治療薬と非薬物治療の組み合わせの同時作用から有利な作用が達成される限り、いずれかの適当な時期に実施してよい。例えば適切な場合においては、有利な作用は、非薬物治療を一時的に、おそらくは数日または数週間、治療薬投与とは切り離した場合にもなお達成される。
上記の一般的用語において概説したとおり、本発明による薬物は原則として当分野で知られたいかなる形態においても投与することもできる。好ましい投与経路は全身投与、より好ましくは非経口投与、好ましくは注射によるものである。あるいは、薬物は局所投与してよい。他の投与経路は、筋肉内、腹腔内、および皮下、経口、鼻腔内、気管内、または肺への投与を含み、侵襲性が最少であり効力を確保できる投与経路が優先的に扱われる。
非経口投与は一般的に皮下、筋肉内、または静脈内の注射または注入のために使用される。更にまた、非経口投与の１つの方策は緩徐放出または除放性の系の移植を採用し、これは一定レベルの投薬が維持されることを確保するものであり、当分野で周知である。
更に、本発明の好ましい薬物は、適当な鼻腔内ビヒクル、吸入剤の局所的使用を介した経鼻投与形態で、または当分野で良く知られている経皮用皮膚パッチの形態を用いた経皮経路により、投与することができる。経皮送達系の形態で投与するためには投薬は当然ながら投薬計画全体にわたって断続的というよりもむしろ、連続的なものとなる。他の好ましい局所用調製品は、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレーおよびゲルを含み、活性成分の濃度は典型的には０．０１％〜１５％ｗ／ｗまたはｗ／ｖの範囲である。
本発明の薬物は、一般的に薬学的に許容可能な媒体に溶解または分散させた治療活性成分、例えば限定しないが本発明の核酸分子の有効量を含むことになる。薬学的に許容可能な媒体または担体は、任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗カビ剤、等張剤および吸収遅延剤等も含む。薬学的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は当分野で周知である。補助的な活性成分もまた本発明の薬物中に配合できる。
別の態様において、本発明は医薬組成物に関する。そのような医薬組成物は本発明による核酸を少なくとも１つと、好ましくは薬学的に許容可能な結合剤とを含む。そのような結合剤は当分野で使用される、および／または知られる任意の結合剤であってもよい。より詳細には、そのような結合剤は本明細書に開示する薬物の製造に関連して考察するいずれかの結合剤である。別の実施形態においては、医薬組成物は別の薬学的活性剤を含む。
薬物および医薬組成物の調製は、本開示を鑑みれば当業者に理解され得るものである。そのような組成物は、典型的には、注射可能な液体の溶液または懸濁液のいずれか、注射前に液体中の溶液または懸濁液とするのに適した固体形態として、錠剤または他の経口投与用の固体として、持続放出カプセルとして、または、現在使用されているいずれかの他の形態（点眼薬、クリーム、ローション、軟膏類、吸入剤等を含む）として、製造してよい。手術現場において特定の部位を処理するための外科医、医師または医療従事者による滅菌された製剤の使用、例えば食塩水をベースとする洗浄剤の使用も特に有用である。組成物はまたマイクロデバイス、微粒子またはスポンジを介して送達してもよい。
製剤に際しては、薬物は投薬製剤に適合した方法で、薬理学的に有効な量で投与することになる。製剤は種々の剤型、例えば上記した注射用溶液の型において容易に投与されるが、薬物放出カプセル等も使用できる。
この点に関して、投与すべき活性成分の量および組成物の体積は治療すべき個体または対象に応じたものとなる。投与のために必要な活性化合物の特定の量は専門家の判断によるものであり、各個体に特有のものとなる。
活性化合物を分散させるために必要な薬物の最小体積を典型的には使用する。投与のための適当な計画もまた変動するが、先ず化合物を投与し、結果をモニタリングし、次に別の時間間隔で別の調整された用量を投与することにより典型化される。
例えば、錠剤またはカプセル（例えばゼラチンカプセル）の形態での経口投与のためには、活性薬品成分、即ち本発明の核酸分子および／または本明細書において治療薬または活性化合物と称するいずれかの別の薬学的活性剤を、経口用の非毒性の薬学的に許容可能な不活性の担体、例えばエタノール、グリセロール、水等と組み合わせることができる。更にまた、所望または必要に応じて、適当な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、および着色剤も混合物に配合できる。適当な結合剤は、澱粉、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン、天然の糖類、例えばグルコースまたはβラクトース、コーン甘味料、天然および合成のガム類、例えばアカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ワックス等を含む。これらの剤型中で使用される潤滑剤は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウムまたはカルシウム塩、および／またはポリエチレングリコール等を含む。崩壊剤は、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム澱粉、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩、または発泡性混合物などを包含するが、これらに限定されない。希釈剤は、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシンを含む。
本発明の薬物はまた、持続放出性および除放性の錠剤またはカプセル、丸薬、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ剤、懸濁剤、シロップおよびエマルジョンのような経口用剤型で投与できる。坐薬は、好都合には脂肪のエマルジョンまたは懸濁液から製造する。
医薬組成物または薬物は滅菌し、および／または補助剤、例えば保存料、安定化剤、水和剤または乳化剤、溶液促進剤、浸透圧調節用の塩、および／または緩衝剤を含有してよい。更に、これらは他の治療上価値がある物質を含有してよい。組成物は、従来の混合方法、顆粒化方法、またはコーティング方法に従って調製され、典型的には活性成分を約０．１％〜７５％、好ましくは約１％〜５０％を含有する。
液体、特に注射用組成物は溶解、分散等により調製できる。活性化合物を薬学的に純粋な溶媒、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等に溶解するかこれらと混合し、これにより注射用の溶液または懸濁液を作る。更に、注射の前に液体に溶解するために適する固体形態を製剤できる。
固体組成物に関しては、賦形剤は医薬品等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む。上記定義した活性化合物はまた、例えばポリアルキレングリコール、ポリエチレングリコールを担体として使用し、坐薬として製剤してもよい。一部の実施形態においては、坐薬は脂肪エマルジョンルまたは懸濁液から製造される。
本発明の薬物および核酸分子はそれぞれ、リポソーム送達系、例えば小型単層小胞、大型単層小胞および多層小胞の形態でも投与できる。リポソームはコレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンを含有する種々のリン脂質から形成できる。一部の実施形態においては、脂質成分のフィルムを薬剤の水溶液中で水和させることにより薬剤をカプセル化した脂質層の形態とし、これは当分野で良く知られている。例えば本明細書に記載した核酸分子は、当分野で知られた方法を用いて構築された親油性の化合物または非免疫原性の高分子量化合物との複合体として、提供することができる。更に、リポソームは、ターゲティングおよび細胞殺傷を媒介するための細胞毒性剤を内在させて運搬するために、それ自体の表面上にそのような核酸分子を担持してよい。核酸に関連する複合体の例は米国特許第６，０１１，０２０号に記載されている。
本発明の薬物および核酸分子はそれぞれ、ターゲティング可能な薬物担体としての可溶性重合体にカップリングしてもよい。そのような重合体はポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンを包含できる。更に、本発明の薬物および核酸分子はそれぞれ、薬剤の制御された放出を達成するために有用な生体分解性重合体のクラス、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋共重合体またはヒドロゲルの両親媒性ブロック共重合体にカップリングさせてよい。
所望により、投与すべき医薬組成物および薬品は、それぞれ少量の非毒性の補助物質、例えば水和剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および他の物質、例えば酢酸ナトリウム、およびオレイン酸トリエタノールアミンも含有してよい。
本発明の核酸分子および薬物をそれぞれ利用する投薬計画は、患者の型、種、齢、体重、性別および医学的状態を含む種々の要因、治療すべき状態の重症度、投与経路、患者の腎機能および肝機能、および使用する特定のアプタマーまたはその塩に従って選択される。当業者であれば状態の進行を予防、阻止または停止するために必要な薬品の有効量を容易に決定および処方できる。
本発明による核酸の有効血漿中レベルは、好ましくは本明細書に開示した疾患の任意の治療において５００ｆＭ〜５００μＭの範囲である。
本発明の核酸分子および薬物は、それぞれ好ましくは１日単回の投与で、２日毎または３日毎に、週１回、隔週に、１月１回の投与で、または３カ月毎に投与してよい。
本明細書に記載した薬物が本明細書に開示した医薬組成物を構成することは本発明の範囲に包含される。
更に別の態様において、本発明は治療を必要とする対象のそのような治療のための方法に関し、この方法は少なくとも１つの本発明による核酸の薬学的に活性な量の投与を含む。ある実施形態において、対象は疾患に罹患しているか、そのような疾患を発症する危険性を有しており、疾患は本明細書に開示したもののいずれか、特に薬物の製造のための本発明による核酸のいずれかの使用に関して開示した疾患のいずれかである。
本明細書において好ましく使用されるものとして、診断または診断薬または診断手段は本明細書に記載した種々の障害および疾患に関連して本明細書に記載したＳＤＦ−１を直接または間接的に検出するのに適している。診断は本明細書に記載したいずれかの障害および疾患のそれぞれの検出および／またはフォローアップのために適している。そのような検出はＳＤＦ−１に対する本発明による核酸の結合を介して可能となる。そのような結合は直接または間接的に検出できる。それぞれの方法および手段は当業者には公知である。特に、本発明による核酸は、本発明による核酸、好ましくはＳＤＦ−１に結合する核酸の検出を可能にする標識を含んでよい。そのような標識は好ましくは放射性、酵素的および蛍光性の標識を含む群から選択される。原則として、抗体に関して開発された全ての公知の試験法を本発明による核酸に適合させることができるが、標的結合抗体は標的結合核酸に置き換える。未標識の標的結合抗体を使用する抗体試験では、検出は、好ましくは放射性、酵素的および蛍光性の標識により修飾されている二次抗体であって、そのＦｃフラグメントにおいて標的結合抗体に結合する二次抗体により行う。核酸、好ましくは本発明による核酸の場合は、核酸はそのような標識により修飾され、好ましくはそのような標識はビオチン、Ｃｙ−３およびＣｙ−５を含む群から選択され、そのような標識はそのような標識に対する抗体、例えば抗ビオチン抗体、抗Ｃｙ３抗体、または抗Ｃｙ５抗体により検出されるか、または標識がビオチンである場合は、標識はビオチンに天然に結合するストレプトアビジンまたはアビジンにより検出される。今度はそのような抗体、ストレプトアビジンまたはアビジンが、好ましくはそれぞれ標識、例えば放射性、酵素的および蛍光性の標識により修飾される（二次抗体の場合と同様）。
別の実施形態においては本発明による核酸分子は第２の検出手段により検出または分析され、ここで該検出手段は分子ビーコンである。分子ビーコンの方法論は当業者の知る通りである。慨すれば分子ビーコンとも称する核酸プローブは検出すべき核酸試料に対して逆相補であり、このため検出すべき核酸試料の一部分にハイブリダイズする。核酸試料への結合により分子ビーコンの蛍光団が分離し、これが蛍光シグナルの変化、好ましくは強度の変化をもたらす。この変化は存在する核酸試料の量に相関している。
ＳＤＦ−１とこれに対応する受容体との間には、本明細書において概説した関係があるため、本発明の核酸分子を使用して診断できる疾患および状態は、原則として該疾患の治療および／または予防のための該核酸分子の使用に関連して本明細書に記載したものと全く同じである。
上記以外に、本発明による核酸分子の別の使用は、造血の低下、侵襲または転移の低下、Ｂ細胞の発生および化学遊走の低下、Ｔ細胞の化学誘引の低下および成長停止およびアポトーシスの誘導にある。
ＳＤＦ−１の検出に関連し、好ましい方法は以下のステップ、
（ａ）ＳＤＦ−１の存在を試験すべき試料を準備するステップと、
（ｂ）本発明による核酸を準備するステップと、
（ｃ）核酸と試料とを、好ましくは反応容器中で反応させるステップと
を含み、ここでステップ（ａ）はステップ（ｂ）の前に実施でき、あるいはステップ（ｂ）はステップ（ａ）の前に実施できる。
好ましい実施形態においては、別のステップｄ）が設けられ、ステップｄ）は核酸との試料の反応の検出を含む。好ましくは、ステップｂ）の核酸は表面に固定化される。表面は反応容器、例えば試験管、プレートのウェルの表面、または、例えばビーズのような反応容器中に含有されるデバイスの表面であってよい。表面への核酸の固定化は当分野で知られたいずれかの手段、非共有結合または共有結合により行うことができるが、これらに限定されない。好ましくは結合は表面と核酸との間の共有結合性の化学結合を介して樹立される。しかしながら、核酸を表面に間接的に固定化することも本発明の範囲内であり、そのような間接的な固定化においては別の成分または一対の相互作用パートナーを使用する。そのような別の成分は、好ましくは相互作用パートナーとも称する固定化されるべき核酸と特異的に相互作用し、これにより表面への核酸の結合を媒介する化合物である。相互作用パートナーは、好ましくは核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含む群から選択される。好ましくは、相互作用パートナーは抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。あるいは、相互作用パートナーは核酸、好ましくは機能的核酸である。より好ましくはそのような核酸はアプタマー、シュピーゲルマー、および核酸に少なくとも部分的に相補的である核酸を含む群から選択される。別の代替的な実施形態においては、表面への核酸の結合は多数の部分からなる相互作用パートナーにより媒介される。そのような多数の部分からなる相互作用パートナーは、好ましくは一対の相互作用パートナー、または第１のメンバーおよび第２のメンバーからなる相互作用パートナーであり、ここで第１のメンバーは核酸に含まれるか結合し、第２のメンバーは表面に結合しているか含まれる。多数の部分からなる相互作用パートナーは、好ましくはビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびストレプトアビジン、ならびにビオチンおよびニュートラアビジンを含む相互作用パートナーの対の群から選択される。好ましくは相互作用パートナーの対の第１のメンバーはビオチンである。
そのような方法の好ましい結果はＳＤＦ−１と核酸との固定化された複合体の形成であり、より好ましくは該複合体を検出する。複合体からＳＤＦ−１を検出することはある実施形態に含まれる。
ＳＤＦ−１の検出のための方法は、ステップｃ）を実施するために好ましくは使用されている反応容器から試料を取り出すことをも含む。
本方法は、別の実施形態においては表面、好ましくは上記定義した表面上にＳＤＦ−１の相互作用パートナーを固定化するステップも含み、相互作用パートナーは本明細書において定義され、好ましくはそれぞれの方法に関連する上記の通り定義され、より好ましくは種々の実施形態における核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含む。本実施形態においては、特に好ましい検出手段は本発明による核酸であり、そのような核酸は好ましくは標識されているか、未標識であってよい。そのような核酸が標識されている場合は、核酸は直接または間接的に検出できる。そのような検出はまた、好ましくは本明細書に記載した種々の実施形態において核酸、ポリペプチド、タンパク質および実施形態を含む群から選択される第２の検出手段を使用する。そのような検出手段は好ましくは本発明による核酸に特異的である。より好ましい実施形態では、第２の検出手段は分子ビーコンである。核酸または第２の検出手段のいずれかまたは両方が好ましい実施形態においては検出標識を含んでよい。検出標識は、好ましくはビオチン、ブロモデスオキシウリジン標識、ジゴキシゲニン標識、蛍光標識、ＵＶ標識、放射標識、およびキレート形成分子を含む群から選択される。あるいは、第２の検出手段は、好ましくは核酸に含有されるか、含まれるか、または結合された検出標識と相互作用する。特に好ましい組み合わせは以下の通りである。
検出標識はビオチンであり、第２の検出手段はビオチンに対する抗体であるか、
検出標識はビオチンであり、第２の検出手段はアビジンまたはアビジン担持分子であるか、
検出標識はビオチンであり、第２の検出手段はストレプトアビジンまたはストレプトアビジン担持分子であるか、
検出標識はビオチンであり、第２の検出手段はニュートラアビジンまたはニュートラアビジン担持分子であるか、または、
検出標識はブロモデオキシウリジンであり、第２の検出手段はブロモデオキシウリジンに対する抗体であるか、または、
検出標識はジゴキシゲニンであり、第２の検出手段はジゴキシゲニンに対する抗体であるか、または、
検出標識はキレート剤であり、第２の検出手段は放射性核種であり、ここで該検出標識が核酸に結合していることが好ましい。当然ながら、この種の組み合わせはまた核酸が表面に結合している実施形態にも適用される。そのような実施形態において、検出標識は相互作用パートナーに結合していることが好ましい。
最後に、第２の検出手段が第３の検出手段を使用して検出されることも本発明の範囲内であり、好ましくは第３の検出手段は酵素、より好ましくは第２の検出手段の検出時に酵素反応を示すものであるか、または第３の検出手段は放射線、より好ましくは放射性核種から発射された放射線を検出する手段である。好ましくは、第３の検出手段は第２の検出手段の特異的検出および／または第２の検出手段との相互作用を行う。
また、ＳＤＦ−１の相互作用パートナーが表面上に固定化され、本発明による核酸が好ましくは相互作用パートナーとＳＤＦ−１との間に形成された複合体に添加される実施形態においては、試料は反応から、より好ましくはステップｃ）および／またはステップｂ）を実施する反応容器から取り出すことができる。
ある実施形態においては、本発明の核酸は蛍光部分を含み、蛍光部分の蛍光は核酸とＳＤＦ−１の間の複合体形成時と遊離ＳＤＦ−１とで異なっている。
別の実施形態においては、核酸は本発明による核酸の誘導体であり、その場合、核酸の誘導体はアデノシン置換アデノシンの蛍光誘導体少なくとも１つを含む。好ましい実施形態においてはアデノシンの蛍光誘導体はエテノアデノシンである。
別の実施形態においては、本発明による核酸の誘導体およびＳＤＦ−１からなる複合体を蛍光を用いて検出する。
本方法のある実施形態においては、シグナルはステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において発生し、好ましくはシグナルは試料中のＳＤＦ−１の濃度に相関している。
好ましい態様において、試験は９６ウェルプレートにおいて実施してよく、成分は上記した通り反応容器に固定化し、ウェルが反応容器として機能する。
本発明の核酸は更に薬剤設計のための材料として使用してよい。基本的には２つの可能な手法が存在する。１つの手法は化合物ライブラリのスクリーニングであり、そのような化合物ライブラリは好ましくは低分子量化合物ライブラリである。ある実施形態においてはスクリーニングは高スループットスクリーニングである。好ましくは高スループットスクリーニングは、標的に基づくアッセイにおける化合物の高速で効率的な試行錯誤による評価である。
最良の場合においては、分析は比色測定により行う。これに関連して使用されるライブラリは当業者には公知である。
あるいは、本発明による核酸は合理的薬剤設計のために使用してよい。好ましくは合理的薬剤設計は薬学的リード構造の設計である。Ｘ線結晶分析または核磁気共鳴スペクトル分析のような方法により典型的には同定される標的の３次元構造から出発して、多くの異なる化合物構造を含むデータベースによって検索するためにコンピュータプログラムを用いる。選択はコンピュータにより行われ、同定された化合物をその後、実験室で試験することができる。
合理的薬剤設計は本発明による核酸のいずれかから出発してよく、構造、好ましくは３次元構造を用いるものであり、その構造は、本発明の核酸の構造と類似であるか、本発明の核酸の構造の結合媒介部分と同一である。いずれの場合においても、そのような構造はなお本発明の核酸と同じか類似の結合特性を示す。合理的薬剤設計の別のステップにおいて、または代替のステップとして、神経伝達物質に結合する核酸の部分の好ましくは３次元構造は、ヌクレオチドおよび核酸とは異なる化学基により模倣される。この模倣により、核酸とは異なる化合物を設計できる。そのような化合物は、好ましくは小分子またはペプチドである。
当分野で知られた競合試験等を用いて行われる化合物ライブラリのスクリーニングの場合には、適切なＳＤＦ−１類縁体、ＳＤＦ−１アゴニストまたはＳＤＦ−１アンタゴニストを見出してよい。そのような競合試験は以下の通り設定してよい。本発明の核酸、好ましくは標的結合Ｌ−核酸であるシュピーゲルマーを固相にカップリングさせる。ＳＤＦ−１類縁体を同定するためには、標識されたＳＤＦ−１を試験に添加してよい。潜在的類縁体はシュピーゲルマーに結合するＳＤＦ−１分子と競合することになり、この競合はそれぞれの標識により得られるシグナルの低下とともに進行する。アゴニストまたはアンタゴニストを得るためのスクリーニングでは、当分野で公知の細胞培養試験を使用する。
本発明によるキットは本発明の核酸の少なくとも１つまたは数種を含んでよい。更にまた、キットは陽性対照または陰性対照の少なくとも１つまたは数種を含んでよい。陽性対照は、例えばＳＤＦ−１であり、特に、本発明の核酸が選択される対象となるか、本発明の核酸が好ましくは液体形態において結合するものであってよい。陰性対照は、例えばペプチドであってよく、これはＳＤＦ−１と類似する生物物理学的特性の観点から定義されるが、本発明の核酸により認識されない。更に、該キットは１つまたは数種の緩衝液を含んでよい。種々の成分が乾燥または凍結乾燥された形態において、または液体中に溶解された状態で、キットに含有されてよい。キットは、１つまたは数種の容器を含んでよく、この容器はキットの１つまたは数種の成分を順に含有してよい。別の実施形態においては、キットは説明書または小冊子を含み、これはキットおよびその種々の成分の使用方法に関するユーザー情報を与えるものである。
本明細書において好ましくは、治療という用語は、好ましい実施形態において追加的または代替的に予防および／またはフォローアップを含む。
本発明による核酸の薬学的および生物分析学的な測定は、基本的にはヒトおよび非ヒトの身体の数種の体液、組織および臓器の中のその薬物動態および生物力学的なプロファイルの測定のためのものである。そのような目的のためには本明細書に開示するか当分野で公知の検出方法のいずれかを使用してよい。本発明の別の態様において、本発明による核酸の検出のためのサンドイッチハイブリダイゼーション試験が提供される。検出試験内においては、キャプチャープローブおよび検出プローブを使用する。キャプチャープローブは本発明による核酸の第１の部分に対して相補的であり、検出プローブは第２の部分に対して相補的である。キャプチャープローブおよび検出プローブは両方とも、ＤＮＡヌクレオチド、修飾ＤＮＡヌクレオチド、修飾ＲＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチドおよび／またはＰＮＡヌクレオチドにより形成できる。
従って、キャプチャープローブは本発明による核酸の５’末端に相補的である配列ストレッチを含み、検出プローブは本発明による核酸の３’末端に相補的である配列ストレッチを含む。この場合、キャプチャープローブは５’末端を介して表面またはマトリックスに固定化されることにより、キャプチャープローブはその５’末端において直接固定化することができるか、またはその５’末端および表面またはマトリックスの間のリンカーを介して固定化することができる。しかしながら、原則としてリンカーはキャプチャープローブの各ヌクレオチドに連結できる。リンカーは当分野の親水性リンカーにより、またはＤ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾されたＤ−ＤＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾されたＤ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＬＮＡヌクレオチド、ＰＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾されたＬ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾されたＬ−ＤＮＡヌクレオチドおよび／またはＬ−ＬＮＡヌクレオチドにより形成できる。
あるいは、キャプチャープローブは本発明による核酸の３’末端に相補的である配列ストレッチを含み、検出プローブは本発明による核酸の５’末端に相補的である配列ストレッチを含む。この場合、キャプチャープローブは３’末端を介して表面またはマトリックスに固定化されることにより、キャプチャープローブはその３’末端において直接固定化することができ、またはその３’末端および表面またはマトリックスの間のリンカーを介して固定化することができる。しかしながら、原則としてリンカーは本発明による核酸に相補的である配列ストレッチの各ヌクレオチドに連結できる。リンカーは当分野の親水性リンカーにより、またはＤ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾されたＤ−ＤＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾されたＤ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＬＮＡヌクレオチド、ＰＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾されたＬ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾されたＬ−ＤＮＡヌクレオチドおよび／またはＬ−ＬＮＡヌクレオチドにより形成できる。
本発明による核酸にハイブリダイズしてよいキャプチャープローブおよび検出プローブのヌクレオチドの数は可変であり、キャプチャープローブおよび／または検出プローブおよび／または本発明による核酸自体のヌクレオチドの数に依存する場合がある。本発明による核酸にハイブリダイズしてよいキャプチャープローブおよび検出プローブのヌクレオチドの総数は、本発明による核酸に含まれるヌクレオチドの数を最大限とすべきである。検出プローブおよびキャプチャープローブのヌクレオチドの最小数（２〜１０ヌクレオチド）は、本発明による核酸のそれぞれ５’末端および３’末端へのハイブリダイゼーションを可能にしなければならない。本発明による核酸と分析される試料中に存在する他の核酸との間の高い特異性および選択性を実現するためには、キャプチャープローブおよび検出プローブのヌクレオチドの総数は本発明による核酸に含まれるヌクレオチドの数を最大限とすべきである。
更に、検出プローブは、好ましくは本明細書において上記の通り検出できるマーカー分子または標識を担持する。標識またはマーカー分子は原則として検出プローブの各ヌクレオチドに連結できる。好ましくは標識またはマーカーは検出プローブの５’末端または３’末端に位置し、これにより、本発明による核酸に相補的である検出プローブ内のヌクレオチドと標識との間にリンカーを挿入することができる。リンカーは当分野の親水性リンカーにより、またはＤ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾されたＤ−ＤＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾されたＤ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＬＮＡヌクレオチド、ＰＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾されたＬ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾されたＬ−ＤＮＡヌクレオチドおよび／またはＬ−ＬＮＡヌクレオチドにより形成され得る。
本発明による核酸の検出は以下の通り実施できる。本発明による核酸をその一端においてキャプチャープローブに、もう一端において検出プローブにハイブリダイズさせる。その後、未結合の検出プローブを、例えば１回または数回の洗浄工程により除去する。好ましくは標識またはマーカー分子を担持している結合した検出プローブの量をその後計測することができる。
本明細書においては好ましくは、疾患および障害という用語は、相反する指示が無い限り本明細書においては互換的に使用する。
本明細書においては、含むという用語は好ましくはその用語に続く要件またはその用語により説明される要件を限定する意図はない。しかしながら、別の実施形態においては、含むという用語はその用語に続く要件またはその用語により説明される要件を含有し、これによりそれを限定する意味において理解する。
種々の配列番号、本明細書において使用する本発明による核酸分子および標的分子ＳＤＦ−１の化学的性質、その実際の配列、および内部参照番号を以下の表にまとめる。
核酸はアプタマー、即ちビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１（配列番号４）を有するＤ−核酸（Ｄ−ＲＮＡ）レベルにおいて、またはシュピーゲルマーレベル、即ちＳＤＦ−１の天然の配置、Ｌ−ＳＤＦ−１（ヒトＳＤＦ−１α、配列番号１）を有するＬ−核酸（Ｌ−ＲＮＡ）において特徴付けられていることに留意する。異なる種々の核酸が１つの内部参照名を共有するが、それぞれのＤ−ＲＮＡ（アプタマー）分子に対しては１つの配列番号、Ｌ−ＲＮＡ（シュピーゲルマー）分子に対して１つの配列番号である。
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本発明を、図面、実施例および配列表により更に説明し、これらより、特徴、実施形態および利点をさらに得ることができる。
配列モチーフ（「Ａ型」）を示すヒトＳＤＦ−１に結合する関連ＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す。この配列モチーフは、好ましい実施形態においては、その全体がヒトＳＤＦ−１への結合のために必須である。 ＲＮＡリガンド１９２−Ａ１０−００１の誘導体を示す（配列モチーフ「Ａ型」のヒトＳＤＦ−１ＲＮＡリガンド）。 ＲＮＡリガンド１９２−Ａ１０−００１の誘導体を示す（配列モチーフ「Ａ型」のヒトＳＤＦ−１ＲＮＡリガンド）。 配列モチーフ（「Ｂ型」）を示すヒトＳＤＦ−１に結合する関連ＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す。この配列モチーフは、好ましい実施形態においては、その全体がヒトＳＤＦ−１への結合のために必須である。 ＲＮＡリガンド１９３−Ｃ２−００１および１９３−Ｇ２−００１の誘導体を示す（配列モチーフ「Ｂ型」のヒトＳＤＦ−１ＲＮＡリガンド）。 ＲＮＡリガンド１９３−Ｃ２−００１および１９３−Ｇ２−００１の誘導体を示す（配列モチーフ「Ｂ型」のヒトＳＤＦ−１ＲＮＡリガンド）。 配列モチーフ（「Ｃ型」）を示すヒトＳＤＦ−１に結合する関連ＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す。この配列モチーフは、好ましい実施形態においては、その全体がヒトＳＤＦ−１への結合のために必須である。 ＲＮＡリガンド１９０−Ａ３−００１の誘導体を示す（配列モチーフ「Ｃ型」のヒトＳＤＦ−１ＲＮＡリガンド）。 ＲＮＡリガンド１９０−Ｄ５−００１の誘導体を示す（配列モチーフ「Ｃ型」のヒトＳＤＦ−１ＲＮＡリガンド）。 ＲＮＡリガンド１９０−Ｄ５−００１の誘導体を示す（配列モチーフ「Ｃ型」のヒトＳＤＦ−１ＲＮＡリガンド）。 ＲＮＡリガンド１９７−Ｂ２の誘導体を示す（配列モチーフ「Ｃ型」のヒトＳＤＦ−１ＲＮＡリガンド）。 ヒトＳＤＦ−１に結合する別のＲＮＡリガンドを示す。 ＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞白血病細胞のヒトＳＤＦ−１に誘導される化学遊走を示す。ここでは、種々のヒトＳＤＦ−１の濃度に対するＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞白血病細胞の３時間遊走の後に、ヒトＳＤＦ−１の濃度にわたる蛍光シグナルとして表した場合のヒトＳＤＦ−１に関する用量応答曲線が得られた。 ビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１の濃度にわたるアプタマーの結合として表した場合の３７℃におけるビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１へのヒトＳＤＦ−１結合アプタマー１９２−Ａ１０−００１の結合分析の結果を示す。 化学遊走試験におけるヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１の効力を示す。細胞は、種々の量のシュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１と共に３７℃において予備インキュベートしたヒト０．３ｎＭ ＳＤＦ−１に対して遊走させ、シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１の濃度にわたる対照のパーセンテージとして表した。 ３７℃におけるビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１へのヒトＳＤＦ−１結合アプタマー１９２−Ａ１０−００１、１９２−Ｆ１０−００１、１９２−Ｃ９−００１、１９２−Ｅ１０−００１、１９２−Ｃ１０−００１、１９２−Ｄ１１−００１、１９２−Ｇ１１−００１、１９２−Ｈ１１−００１、１９２−Ｄ１０−００１、１９２−Ｅ９−００１および１９２−Ｈ９−００１の競合結合分析の結果を示す。１ｎＭおよび５ｎＭの未標識アプタマー１９２−Ａ１０−００１、１９２−Ｆ１０−００１、１９２−Ｃ９−００１、１９２−Ｅ１０−００１、１９２−Ｃ１０−００１、１９２−Ｄ１１−００１、１９２−Ｇ１１−００１、１９２−Ｈ１１−００１、１９２−Ｄ１０−００１、１９２−Ｅ９−００１および１９２−Ｈ９−００１における、標識アプタマー１９２−Ａ１０−００１（未標識アプタマーにより置き換えられる参照として使用）の結合として表した。 ３７℃におけるビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１へのヒトＳＤＦ−１結合アプタマー１９２−Ａ１０−００８の結合分析の結果を示す。ビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１の濃度にわたるアプタマーの結合として表した。 経時的な応答（ＲＵ）として表した場合のアミンカップリング手順によりＰｉｏｎｅｅｒＦ１センサチップ上に固定化したヒトＳＤＦ−１に結合したヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００８のＫＤ値を示すＢｉａｃｏｒｅ２０００センサグラムを示し、更に、シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００８および１９２−Ａ１０−００１のオンおよびオフの速度およびＫＤ値も示す。 化学遊走試験におけるＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００８の効力を示し、細胞は種々の量のシュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００８と共に３７℃で予備インキュベートした０．３ｎＭヒトＳＤＦ−１に対して遊走させ、シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００８の濃度にわたり対照のパーセンテージとして表した。 経時的な応答（ＲＵ）として表した場合のアミンカップリング手順によりＰｉｏｎｅｅｒＦ１センサチップ上に固定化したヒトＳＤＦ−１に結合したシュピーゲルマー１９３−Ｇ２−００１のＫＤ値を示すＢｉａｃｏｒｅ２０００センサグラムを示し、更に、シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−００１および１９３−Ｃ２−００１のオンおよびオフ速度およびＫＤ値も示す。 ３７℃におけるビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１へのヒト抗ＳＤＦ−１アプタマー１９３−Ｇ２−０１２の結合分析の結果を示す。ビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１の濃度にわたるアプタマーの結合として表した。 ３７℃におけるビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１へのヒトＳＤＦ−１結合アプタマー１９０−Ａ３−００１、１９０−Ａ３−００３、１９０−Ａ３−００４、１９０−Ａ３−００７、１９１−Ｄ５−００１、１９１−Ｄ５−００２、１９１−Ｄ５−００３、１９１−Ｄ５−００４、１９１−Ｄ５−００５、１９１−Ｄ５−００６および１９１−Ｄ５−００７の競合結合分析の結果を示す。５００ｎＭ、５０ｎＭおよび１０ｎＭの未標識アプタマー１９０−Ａ３−００１、１９０−Ａ３−００３、１９０−Ａ３−００４、１９０−Ａ３−００７、１９１−Ｄ５−００１、１９１−Ｄ５−００２、１９１−Ｄ５−００３、１９１−Ｄ５−００４、１９１−Ｄ５−００５、１９１−Ｄ５−００６および１９１−Ｄ５−００７における標識アプタマー１９０−Ａ３−００１または１９１−Ｄ５−００１（未標識アプタマーにより置き換えられる参照として使用される）の結合として表した。 ３７℃におけるビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１へのヒトＳＤＦ−１結合アプタマー１９０−Ａ３−００４および１９１−Ｄ５−００７の結合分析の結果を示す。ビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１の濃度にわたるアプタマーの結合として表した。 経時的な応答（ＲＵ）として表した場合のアミンカップリング手順によりＰｉｏｎｅｅｒＦ１センサチップ上に固定化したヒトＳＤＦ−１に結合したシュピーゲルマー１９１−Ｄ５−００７のＫＤ値を示すＢｉａｃｏｒｅ２０００センサグラムを示し、更に、シュピーゲルマー１９１−Ｄ５−００１、１９１−Ｄ５−００７、１９０−Ａ３−００３、および１９７−Ｂ２のオンおよびオフ速度およびＫＤ値が列挙される。 化学遊走試験におけるＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９０−Ａ３−００４の効力を示し、細胞は種々の量のシュピーゲルマー１９０−Ａ３−００４と共に３７℃で予備インキュベートした０．３ｎＭヒトＳＤＦ−１に対して遊走させ、シュピーゲルマー１９０−Ａ３−００４の濃度にわたり対照のパーセンテージとして表した。 化学遊走試験におけるＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧ、１９７−Ｂ２−００６−５’−ＰＥＧ、１９１−Ｄ５−００７−５’−ＰＥＧおよび１９１−Ａ１０−００８−５’−ＰＥＧの効力を示し、細胞は種々の量のシュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧ、１９７−Ｂ２−００６−５’−ＰＥＧ、１９１−Ｄ５−００７−５’−ＰＥＧおよび１９１−Ａ１０−００８−５’−ＰＥＧと共に３７℃で予備インキュベートした０．３ｎＭヒトＳＤＦ−１に対して遊走させ、シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧ、１９７−Ｂ２−００６−５’−ＰＥＧ、１９１−Ｄ５−００７−５’−ＰＥＧおよび１９１−Ａ１０−００８−５’−ＰＥＧの濃度にわたり対照のパーセンテージとして表した。 化学遊走試験におけるＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９７−Ｂ２−００６−５’−ＰＥＧおよび１９７−Ｂ２−００６−３１ｂ−５’−ＰＥＧの効力を示し、細胞はシュピーゲルマー１９７−Ｂ２−００６−５’−ＰＥＧおよび１９７−Ｂ２−００６−３１ｂ−５’−ＰＥＧの種々の量と共に３７℃で予備インキュベートした０．３ｎＭヒトＳＤＦ−１に対して遊走させ、シュピーゲルマー１９７−Ｂ２−００６−５’−ＰＥＧおよび１９７−Ｂ２−００６−３１ｂ−５’−ＰＥＧの濃度にわたり対照のパーセンテージとして表した。 経時的な応答（ＲＵ）として表した場合のアミンカップリング手順によりＰｉｏｎｅｅｒＦ１センサチップ上に固定化したヒトＳＤＦ−１に結合したシュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧ、１９１−Ａ１０−００８−５’−ＰＥＧおよび１９１−Ａ１０−００１−５’−ＰＥＧのＫＤ値を示すＢｉａｃｏｒｅ２０００センサグラムを示す。 経時的な応答（ＲＵ）として表した場合のアミンカップリング手順によりＰｉｏｎｅｅｒＦ１センサチップ上に固定化したヒトＳＤＦ−１に結合したシュピーゲルマー１９７−Ｂ２−００６−５’ＰＥＧ、１９７−Ｂ２−００６−３１ｂ−５’−ＰＥＧおよび１９１−Ｄ５−００７−５’−ＰＥＧのＫＤ値を示すＢｉａｃｏｒｅ２０００センサグラムを示す。 化学遊走試験におけるＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１、１９２−Ａ１０−００１−５’−ＨＥＳ１３０および１９２−Ａ１０−００１−５’−ＨＥＳ１００の効力を示し、細胞は種々の量のシュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１、１９２−Ａ１０−００１−５’−ＨＥＳ１３０および１９２−Ａ１０−００１−５’−ＨＥＳ１００と共に３７℃で予備インキュベートした０．３ｎＭヒトＳＤＦ−１に対して遊走させ、シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１、１９２−Ａ１０−００１−５’−ＨＥＳ１３０および１９２−Ａ１０−００１−５’−ＨＥＳ１００の濃度にわたり対照のパーセンテージとして表した。 化学遊走試験におけるＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１、１９２−Ａ１０−００１−５’−ＰＥＧ３０および１９２−Ａ１０−００１−５’−ＰＥＧ４０の効力を示し、細胞は種々の量のシュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１、１９２−Ａ１０−００１−５’−ＰＥＧ３０および１９２−Ａ１０−００１−５’−ＰＥＧ４０と共に３７℃で予備インキュベートした０．３ｎＭヒトＳＤＦ−１に対して遊走させ、シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１、１９２−Ａ１０−００１−５’−ＰＥＧ３０および１９２−Ａ１０−００１−５’−ＰＥＧ４０の濃度にわたり対照のパーセンテージとして表した。 化学遊走試験における対照シュピーゲルマーの無効力を示し、種々の量の細胞は対照シュピーゲルマーと共に３７℃で予備インキュベートした０．３ｎＭヒトまたはネズミＳＤＦ−１に対して遊走させ、対照シュピーゲルマーの濃度にわたり対照のパーセンテージとして表した。 ＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞白血病細胞のネズミＳＤＦ−１誘導化学遊走を示し、ここでは、種々のＳＤＦ−１の濃度に対するＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞白血病細胞の３時間遊走の後に、蛍光シグナルとして表した場合のＳＤＦ−１に関する用量応答曲線が得られた。 化学遊走試験におけるＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１および１９１−Ｄ５−００７−５’ＰＥＧの効力を示し、細胞はシュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１および１９１−Ｄ５−００７−５’ＰＥＧの種々の量と共に３７℃で予備インキュベートした０．３ｎＭネズミＳＤＦ−１に対して遊走させ、シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１および１９１−Ｄ５−００７−５’ＰＥＧの濃度にわたり対照のパーセンテージとして表した。 種々の量のシュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１と共に３７℃で予備インキュベートしたヒト［１２５Ｊ］−ＳＤＦ−１αを用いたＣＸＣＲ４−受容体結合試験におけるＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１の効力を示し、特異的に結合した［１２５Ｊ］−ＳＤＦ−１αをシュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１の濃度にわたってプロットした。 １ｎＭヒトＳＤＦ−１αによるＣＸＣＲ４発現細胞のＭＡＰキナーゼ刺激の、ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１による抑制を示す。 大動脈輪新芽形成試験におけるヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧによる、ＰＥＧ化対照シュピーゲルマーによるＳＤＦ−１誘導新芽形成の抑制を示し、ここではラット大動脈由来の輪をコラーゲンマトリックスに包埋し、シュピーゲルマーの存在下または不在下にＳＤＦ−１と共に６日間インキュベートした（ａ：対照；ｂ：１０ｎＭ ＳＤＦ−１；ｃ：１０ｎＭ ＳＤＦ−１＋１μＭヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧ；ｄ：１０ｎＭ ＳＤＦ−１＋１μＭ ＰＥＧ化対照シュピーゲルマー）。 ＰＥＧ化対照シュピーゲルマーによるＳＤＦ−１誘導新芽形成の、大動脈輪新芽形成試験におけるヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧによる抑制を示し、新芽形成指数を、条件当たりの５輪に関する平均±ＳＤとして示す（＊：ＳＤＦ−１に関する値は対照と有意差有り（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、ｐ＝０．００９）、＊＊：ＳＤＦ−１＋ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧに関する値はＳＤＦ−１に関するものと有意差有り（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、ｐ＝０．０２８）。 ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧによる治療を受けていないラットのＳＤＦ−１血漿中レベルと比較した場合のヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧを静脈内大量投与した後のラットにおけるヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧおよびＳＤＦ−１の血漿中レベルを示し、ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧおよびＳＤＦ−１の血漿中レベルは９６時間にわたって測定した。
［実施例１：ヒトＳＤＦ−１に結合する核酸］
標的としてビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１を用いることにより、ヒトＳＤＦ−１に結合する数種の核酸を形成し、そのヌクレオチド配列を図１〜９に示した。核酸はアプタマー、即ちビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１を有するＤ−核酸レベルにおいて、またはシュピーゲルマーレベル、即ちＳＤＦ−１の天然の配置（Ｌ−ＳＤＦ−１）を有するＬ−核酸において特徴付けた。
アプタマーは、ビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１を用いる競合的試験または直接プルダウン結合試験を用いて、ビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１により分析した（実施例４）。シュピーゲルマーはＢｉａｃｏｒｅ２０００機器（実施例６）を用いた表面プラズモン共鳴計測および細胞培養インビトロ化学遊走試験（実施例５）によりＳＤＦ−１の天然構成（Ｌ−ＳＤＦ−１）により試験した。
このようにして形成した核酸分子は異なる配列モチーフを示し、３つの主要な型を図１、図２Ａおよび図２Ｂ（Ａ型）、図３、図４Ａおよび図４Ｂ（Ｂ型）、図５、図６、図７Ａ、図７Ｂおよび図８（Ｃ型）において定義する。ヌクレオチド配列モチーフの定義に関しては、多義のヌクレオチドに関するＩＵＰＡＣの略記法を使用する。
Ｓ 強 ＧまたはＣ、
Ｗ 弱 ＡまたはＵ、
Ｒ プリン ＧまたはＡ、
Ｙ ピリミジン ＣまたはＵ、
Ｋ ケト ＧまたはＵ、
Ｍ イミノ ＡまたはＣ、
Ｂ Ａではない ＣまたはＵまたはＧ、
Ｄ Ｃではない ＡまたはＧまたはＵ、
Ｈ Ｇではない ＡまたはＣまたはＵ、
Ｖ Ｕではない ＡまたはＣまたはＧ、
Ｎ 全て ＡまたはＧまたはＣまたはＵ。
相反する指示が無い限り、いずれかの核酸配列またはストレッチおよびボックスの配列はそれぞれ５’→３’の方向に示す。
［１．１ Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸］
図１に示す通り、Ａ型のＳＤＦ−１結合核酸の全ての配列は、相互にハイブリダイズできる５’末端および３’末端のストレッチに隣接する１つのコアヌクレオチド配列を含む。しかしながら、そのようなハイブリダイゼーションは分子内に必ずしも生じる必要はない。
核酸をそれらの結合挙動に関して順位付けするために、ビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１を用いた直接プルダウン結合試験および競合的プルダウン結合試験を用いてアプタマーレベルについて核酸を特徴付けした（実施例４）。選択された配列をシュピーゲルマーとして合成し（実施例３）、細胞培養インビトロ化学遊走試験において（実施例５）、そしてＢｉａｃｏｒｅ２０００機器を用いた表面プラズモン共鳴計測により（実施例６）、ＳＤＦ−１の天然の配置（Ｌ−ＳＤＦ）を用いて試験した。
所定のボックスまたはストレッチの配列はＡ型のＳＤＦ−１結合核酸の間で異なる場合があり、これはＳＤＦ−１に対する結合親和性に影響する。Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸として集約される種々のＳＤＦ−１結合核酸の結合分析に基づけば、以下に説明するコアヌクレオチド配列およびそのヌクレオチド配列は個々に、より好ましくはそれら全体が、ＳＤＦ−１への結合のために必須である。
Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸の全ての発見されている配列のコアヌクレオチド配列は、配列ＡＡＡＧＹＲＡＣＡＨＧＵＭＡＡＸＡＵＧＡＡＡＧＧＵＡＲＣ（Ａ型式１）を共有し、ここでＸＡは不在であるか、または「Ａ」である。「Ａ」が不在である場合は、コアヌクレオチド配列の配列はＡ型式２（ＡＡＡＧＹＲＡＣＡＨＧＵＭＡＡＵＧＡＡＡＧＧＵＡＲＣ）として集約できる。コアヌクレオチド配列内に追加的なヌクレオチド「Ａ」を有し、尚ＳＤＦ−１に結合するＡ型ＳＤＦ−１結合核酸１９１−Ａ６（コアヌクレオチド配列：ＡＡＡＧＵＡＡＣＡＣＧＵＡＡＡＡＵＧＡＡＡＧＧＵＡＡＣ）は、別のコアヌクレオチド配列（ＡＡＡＧＹＲＡＣＡＨＧＵＭＡＡＡＵＧＡＡＡＧＧＵＡＲＣ、Ａ型式３）を結果として生じさせる。Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸の他の全ての核酸についての例として、Ａ型のＳＤＦ−１結合核酸１９２−Ａ１０−００１をヒトＳＤＦ−１に対する結合親和性に関して特徴付けた。平衡結合定数ＫＤはプルダウン結合試験を用いることにより（ＫＤ＝１．５ｎＭ、図１１）、および表面プラズモン共鳴計測により（ＫＤ＝１．０ｎＭ、図１５）測定した。１９２−Ａ１０−００１に関して、０．１２ｎＭのＩＣ５０（抑制濃度５０％）が細胞培養インビトロ化学遊走試験を用いて計測された（図１２）。結果として図１に示す全てのＡ型のＳＤＦ−１結合核酸を１９２−Ａ１０−００１との競合的プルダウン結合試験で分析した（図１３、試験したＡ型ＳＤＦ−１結合核酸の一部を図１３には示してある）。Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸１９２−Ｂ１１および１９２−Ｃ１０はこれらの競合的実験において１９２−Ａ１０−００１と等しい結合親和性を示した。より弱い結合親和性がＡ型ＳＤＦ−１結合核酸１９２−Ｇ１０、１９２−Ｆ１０、１９２−Ｃ９、１９２−Ｅ１０、１９２−Ｄ１１、１９２−Ｇ１１、１９２−Ｈ１１および１９２−Ａ６に関して測定された。Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸１９２−Ｄ１０、１９２−Ｅ９および１９２−Ｈ９は、１９２−Ａ１０−００１よりも遙かに弱い結合親和性を有する（図１３）。
上記した通り、Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸１９２−Ｂ１１および１９２−Ｃ１０は１９２−Ａ１０−００１と等しいＳＤＦ−１に対する結合親和性を示している。しかしながら、それらはコアヌクレオチド配列のヌクレオチド配列における僅かな相違を示している。従って、ほぼ同じく高い親和性においてＳＤＦ−１に結合する３分子のコンセンサス配列はヌクレオチド配列（ＡＡＡＧＹＡＡＣＡＨＧＵＣＡＡＵＧＡＡＡＧＧＵＡＲＣ（Ａ型式４）により集約することができ、ここで１９２−Ａ１０−００１のコアヌクレオチド配列のヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列：ＡＡＡＧＣＡＡＣＡＵＧＵＣＡＡＵＧＡＡＡＧＧＵＡＧＣ）はＡ型ＳＤＦ−１結合核酸の最も高い結合親和性を有するヌクレオチド配列を表している。
Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸の５’末端ストレッチの６ヌクレオチドのうち５つまたは６つは、Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸の３’末端ストレッチの６ヌクレオチドのうちのそれぞれの５つまたは６つのヌクレオチドとハイブリダイズすることにより末端へリックスを形成してよい。これらのヌクレオチドは数か所の位置において可変であるが、異なるヌクレオチドは各々５’末端および３’末端のストレッチの６ヌクレオチドのうち５つまたは６つのハイブリダイゼーションを可能とする。図１に示すＡ型ＳＤＦ−１結合核酸の５’末端および３’末端のストレッチは、一般式で、５’末端ストレッチに関して（「ＲＳＨＲＹＲ」、Ａ型式５−５’）、３’末端ストレッチに関して（「ＹＲＹＤＳＹ」、Ａ型式５−３’）集約することができる。Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸１９２−Ａ１０−００１のトランケーションされた誘導体は元の分子の１９２−Ａ１０−００１および１９２−Ａ１０−００８との競合的プルダウン結合試験で分析した（図２Ａおよび図２Ｂ）。これらの実験は、１９２−Ａ１０−００１の６末端ヌクレオチド（５’末端：ＧＣＵＧＵＧ、３’末端：ＣＧＣＡＧＣ）の誘導体１９２−Ａ１０−００２の５ヌクレオチド（５’末端：ＣＵＧＵＧ、３’末端：ＣＧＣＡＧ）への低減が結合親和性の低減を伴うことなく実施できることを示している。しかしながら、４末端ヌクレオチド（５’末端：ＵＧＵＧ、３’末端ＣＧＣＡ、１９２−Ａ１０−００３）またはそれより小さいもの（１９２−Ａ１０−００４／−００５／−００６／−００７）へのトランケーションは低減されたＳＤＦ−１への結合親和性をもたらしている（図２Ａ）。図２Ａおよび図２Ｂに示す通り、Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸１９２−Ａ１０−００１の誘導体の５ヌクレオチドおよび４ヌクレオチドの長さを有する測定された５’末端および３’末端ストレッチは、一般式で、５’末端ストレッチに関して（「Ｘ２ＢＢＢＳ」、Ａ型式６−５’）、３’末端ストレッチに関して（「ＳＢＢＶＸ３」、Ａ型式６−３’）記載することができ、ここでＸ２は不在であるか、または「Ｓ」であり、Ｘ３は不在であるか、または「Ｓ」である。
５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチのヌクレオチド配列は、Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸の結合親和性に対して影響する。これは核酸１９２−Ｆ１０および１９２−Ｅ１０のみならず１９２−Ａ１０−００１の誘導体によっても示されている（図２Ｂ）。１９２−Ｆ１０および１９２−Ｅ１０のコアヌクレオチド配列は１９２−Ｂ１１および１９２−Ｃ１０と同一であるが、５’末端のストレッチの３’末端において、および３’末端ストレッチの５’末端において僅かな相違を含んでおり、これにより結合親和性が低減している。
Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸である１９２−Ａ１０−００２の５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチド「ＣＵＧＵＧ」および「ＣＧＣＡＧ」の、「ＧＣＧＣＧ」および「ＣＧＣＧＣ」（１９２−Ａ１０−０１５）による置換は低減された結合親和性をもたらすのに対し、「ＧＣＧＵＧ」および「ＣＧＣＧＣ」（１９２−Ａ１０−００８）による置換は１９２−Ａ１０−００２に関して観察されるものと同様の結合親和性をもたらしている（図２Ｂ、図１５、図１２、図１６）。更に、それぞれ４つの５’ 末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドを有しているＡ型ＳＤＦ−１結合核酸１９２−Ａ１０−００１の９つの誘導体（１９２−Ａ１０−０１４／１９２−Ａ１０−０１５／１９２−Ａ１０−０１６／１９２−Ａ１０−０１７／１９２−Ａ１０−０１８／１９２−Ａ１０−０１９／１９２−Ａ１０−０２０／１９２−Ａ１０−０２１／１９２−Ａ１０−０２２／１９２−Ａ１０−０２３）を、アプタマーとして、１９２−Ａ１０−００１またはその誘導体１９２−Ａ１０−００８（両方ともＳＤＦ−１に対して同一の結合親和性を有する）に対する結合親和性に関して試験した。全クローンとも、それぞれ１９２−Ａ１０−００１（６ヌクレオチドが末端へリックスを形成する）のように、または５末端ヌクレオチドを有する１９２−Ａ１０−００８のように、ＳＤＦ−１に対してより弱い、遙かに弱い、または極めて遙かに弱い結合親和性を示していた（図２Ｂ）。従って、５’ 末端ストレッチおよび３’末端ストレッチのヌクレオチドの配列および数はＳＤＦ−１への効果的な結合のために必須である。Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸１９２−Ａ１０−００２および１９２−Ａ１０−０８に関して観察された通り、５’ 末端ストレッチおよび３’末端ストレッチの好ましい組み合わせは、「ＣＵＧＵＧ」および「ＣＧＣＡＧ」（Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸１９２−Ａ１０−００２の５’ 末端ストレッチおよび３’末端ストレッチ）、ならびに「ＧＣＧＵＧ」および「ＣＧＣＧＣ」（Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸１９２−Ａ１０−００８の５’および３’末端ストレッチ）である。
しかしながら、全ての試験したＡ型ＳＤＦ−１結合核酸の５’ 末端ストレッチおよび３’末端ストレッチを組み合わせれば、Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸の５’末端ストレッチの一般式は「Ｘ１Ｘ２ＮＮＢＶ」（Ａ型式７−５’）となり、Ａ型ＳＤＦ−１結合核酸の３’末端ストレッチの一般式は「ＢＮＢＮＸ３Ｘ４」（Ａ型式７−３’）となる。
（式中、Ｘ１は「Ｒ」または不在であり、Ｘ２は「Ｓ」であり、Ｘ３は「Ｓ」であり、Ｘ４は「Ｙ」または不在であるか、
または、
Ｘ１は不在であり、Ｘ２は「Ｓ」または不在であり、Ｘ３は「Ｓ」または不在であり、Ｘ４は不在である。）
［１．２ Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸］
図３に示す通り、Ｂ型のＳＤＦ−１結合核酸の全ての配列は相互にハイブリダイズできる５’ 末端のストレッチおよび３’末端のストレッチに隣接する１つのコアヌクレオチド配列を含む。しかしながら、そのようなハイブリダイゼーションは分子内に必ずしも生じる必要はない。
核酸を、それらの結合挙動に関して順位付けするために、ビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１を用いた直接プルダウン結合試験および競合的プルダウン結合試験を用いてアプタマーレベルにおいて核酸を特徴付けた（実施例４）。選択された配列をシュピーゲルマーとして合成し（実施例３）、細胞培養インビトロ化学遊走試験において（実施例５）、そしてＢｉａｃｏｒｅ２０００機器を用いた表面プラズモン共鳴計測により（実施例６）、ＳＤＦ−１の天然構成（Ｌ−ＳＤＦ）を用いて試験した。
所定のボックスまたはストレッチの配列はＢ型のＳＤＦ−１結合核酸の間で異なる場合があり、これはＳＤＦ−１に対する結合親和性に影響する。Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸として集約される種々のＳＤＦ−１結合核酸の結合分析に基づけば、以下に説明するコアヌクレオチド配列およびそのヌクレオチド配列は個々に、より好ましくはそれら全体が、ＳＤＦ−１への結合のために必須である。
Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸の全ての発見されている配列のコアヌクレオチド配列は配列ＧＵＧＵＧＡＵＣＵＡＧＡＵＧＵＡＤＷＧＧＣＵＧＷＵＣＣＵＡＧＵＹＡＧＧを共有する（Ｂ型式１）。コアヌクレオチド配列の１つの位置において異なるＢ型ＳＤＦ−１結合核酸１９３−Ｇ２−００１、１９３−Ｃ２−００１および１９３−Ｆ２−００１をＡ型ＳＤＦ−１結合核酸１９２−Ａ１０−００１との競合的プルダウン結合試験において分析した（プルダウン結合試験において求められた１．５ｎＭのＫＤ［図１１］、表面プラズモン共鳴計測において求められた１．０ｎＭのＫＤ［図１５］、０．１２ｎＭのＩＣ５０、［図１２］）。３種の試験したＢ型ＳＤＦ−１結合核酸の各々はＡ型ＳＤＦ−１結合核酸１９２−Ａ１０−００１と比較してヒトＳＤＦ−１への優れた結合を示し、１９３−Ｇ２−００１の結合親和性は１９３−Ｃ２−００１および１９３−Ｆ２−００１と同様に良好であった（図３）。データは、Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸１９３−Ｇ２−００１、１９３−Ｃ２−００１および１９３−Ｆ２−００１のコアヌクレオチド配列のヌクレオチド配列における相違がＳＤＦ−１への結合親和性に対して影響しないことを示唆している。例示により、Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸１９３−Ｇ２−００１を、ヒトＳＤＦ−１への結合親和性に関して特徴付けた。平衡結合定数ＫＤをプルダウン結合試験を用いて（ＫＤ＝０．３ｎＭ）、および表面プラズモン共鳴計測により（ＫＤ＝０．５ｎＭ、図１７）測定した。１９３−Ｇ２−００１についての０．０８ｎＭのＩＣ５０（抑制濃度５０％）が、細胞培養インビトロ化学遊走試験を用いて計測された。これとは対照的に、コアヌクレオチド配列の配列において異なっているＢ型ＳＤＦ−１結合核酸１９３−Ｂ３−００２、１９３−Ｈ３−００２、１９３−Ｅ３−００２および１９３−Ｄ１−００２は不良な結合特性を有する（図３）。結果として、ＳＤＦ−１に対する向上した結合親和性を有するＢ型ＳＤＦ−１結合核酸は配列ＧＵＧＵＧＡＵＣＵＡＧＡＵＧＵＡＤＵＧＧＣＵＧＡＵＣＣＵＡＧＵＣＡＧＧを有するコアヌクレオチド配列を共有する（Ｂ型式２）。
Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸の５’末端ストレッチの６ヌクレオチドのうち４つ、５つまたは６つのヌクレオチドは、Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸の３’末端ストレッチの６ヌクレオチドのうちの該当する４つ、５つまたは６つのヌクレオチドとハイブリダイズすることにより末端へリックスを形成してよい。これらのヌクレオチドは数か所の位置において可変であるが、異なるヌクレオチドは各々５’ 末端のストレッチおよび３’末端のストレッチの６ヌクレオチドのうち４つ、５つまたは６つのヌクレオチドとハイブリダイゼーションを可能とする。図３に示すＢ型ＳＤＦ−１結合核酸の５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチは、一般式で、５’末端ストレッチに関して（Ｂ型式３−５’；「Ｘ１ＧＣＲＷＧ」。式中、Ｘ１は「Ａ」または不在である）、３’末端ストレッチに関して（Ｂ型式３−３’；「ＫＲＹＳＣＸ４」、式中、Ｘ４は「Ｕ」または不在である）に集約することができる。Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸１９３−Ｇ１−００２、１９３−Ｄ２−００２、１９３−Ａ１−００２および１９３−Ｄ３−００２は、１９３−Ｃ２−００１、１９３−Ｇ２−００１および１９３−Ｆ２−００１と同一のコアヌクレオチド配列（Ｂ型式２）を共有するものの、ＳＤＦ−１に対してはより弱い結合親和性を有する（図３）。Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸１９３−Ｇ１−００２、１９３−Ｄ２−００２、１９３−Ａ１−００２および１９３−Ｄ３−００２の望ましくない結合特性は５’ 末端ストレッおよび３’末端ストレッチのヌクレオチド数および配列に起因すると考えられる。
Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸１９３−Ｇ２−００１および１９３−Ｃ２−００１のトランケーションされた誘導体を、それぞれ１９３−Ｇ２−００１および１９３−Ｃ２−００１との競合的プルダウン結合試験において分析した（図４Ａおよび図４Ｂ）。これらの実験は、Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸１９３−Ｇ２−００１および１９３−Ｃ２−００１の６末端ヌクレオチド（５’末端：ＡＧＣＧＵＧ、３’末端：ＵＡＣＧＣＵ）から５ヌクレオチド（５’末端：ＧＣＧＵＧ；３’末端：ＵＡＣＧＣ）への低減が、同様の結合親和性を有する分子（１９３−Ｃ２−００２および１９３−Ｇ２−０１２）をもたらすことを示している。平衡解離定数ＫＤはプルダウン結合試験を用いて測定した（ＫＤ＝０．３ｎＭ、図１８）。４つ（５’末端：ＣＧＵＧ、３’末端：ＵＡＣＧ、１９３−Ｃ２−００３）またはそれより少ないヌクレオチド（１９３−Ｃ２−００４、１９３−Ｃ２−００５、１９３−Ｃ２−００６、１９３−Ｃ２−００７）へのトランケーションは、競合的プルダウン結合試験を用いて計測した場合にＳＤＦ−１への低減された結合親和性をもたらした（図４Ａ）。５’ 末端および３’末端それぞれにおける５末端ヌクレオチドのヌクレオチド配列はＢ型ＳＤＦ−１結合核酸の結合親和性に影響している。５’末端および３’末端ヌクレオチド「ＧＣＧＵＧ」および「ＵＡＣＧＣ」（１９３−Ｃ２−００２、１９３−Ｇ２−１２）の、「ＧＣＧＣＧ」および「ＣＧＣＧＣ」による置換は低減された結合親和性をもたらした。更に、４塩基対を形成するヌクレオチド長の末端へリックスを有するＢ型ＳＤＦ−１結合核酸１９３−Ｇ２−００１の４種の異なる誘導体（１９３−Ｇ２−０１４／−０１５／−０１６／−０１７）を試験した。それらの全てはＳＤＦ−１に対する低減された結合親和性を示した（図４Ｂ）。従って、５’ 末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドの配列および長さはＳＤＦ−１への効果的な結合のために必須である。図４Ａおよび図４Ｂに示す通り、Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸１９３−Ｃ２−００３および１９３−Ｇ２−０１２の誘導体の５ヌクレオチド長および４ヌクレオチド長の５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチは一般式で、５’末端ストレッチに関して（「Ｘ２ＳＳＢＳ」、Ｂ型式４−５’、式中、Ｘ２は不在であるか、または「Ｇ」である）、３’末端ストレッチに関して（「ＢＶＳＳＸ３」、Ｂ型式４−３’、式中、Ｘ３は不在であるか、または「Ｃ」である）、と記載することがでる。Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸１９３−Ｇ２−００１および１９３−Ｃ２−０１ならびにそれらの誘導体１９３−Ｇ２−０１２および１９３−Ｃ２−００２に関して示す通り、５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチの好ましい組み合わせは「Ｘ１ＧＣＧＵＧ」（５’末端ストレッチ、Ｂ型式５−５’）および「ＵＡＣＧＣＸ４」（３’末端ストレッチ、Ｂ型式５−３’）である（式中、Ｘ１は「Ａ」または不在であり、Ｘ４は「Ｕ」または不在である）。
しかしながら、全ての試験したＢ型ＳＤＦ−１結合核酸の５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチを組み合わせれば、Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸の５’末端ストレッチの一般式は「Ｘ１Ｘ２ＳＶＮＳ」（Ｂ型式６−５’）となり、Ｂ型ＳＤＦ−１結合核酸の３’末端ストレッチの一般式は「ＢＶＢＳＸ３Ｘ４」（Ｂ型式６−３’）となる。
（式中、Ｘ１は「Ａ」または不在であり、Ｘ２は「Ｇ」であり、Ｘ３は「Ｃ」であり、Ｘ４は「Ｕ」または不在であるか、
またはＸ１は不在であり、Ｘ２は「Ｇ」または不在であり、Ｘ３は「Ｃ」または不在であり、Ｘ４は不在である。）
［１．３ Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸］
図５に示す通り、Ｃ型のＳＤＦ−１結合核酸の全ての配列は相互にハイブリダイズできる５’末端ストレッチおよび３’末端のストレッチに隣接する１つのコアヌクレオチド配列を含む。しかしながら、そのようなハイブリダイゼーションは分子内に必ずしも生じる必要はない。
核酸を、それらの結合挙動に関して順位付けするために、ビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１を用いた直接プルダウン結合試験および競合的プルダウン結合試験を用いてアプタマーレベルにおいて核酸を特徴付けた（実施例４）。選択された配列をシュピーゲルマーとして合成し（実施例３）、細胞培養インビトロ化学遊走試験において（実施例５）、そしてＢｉａｃｏｒｅ２０００機器を用いた表面プラズモン共鳴計測により（実施例６）、ＳＤＦ−１の天然構成（Ｌ−ＳＤＦ）を用いて試験した。
所定のボックスまたはストレッチの配列はＣ型のＳＤＦ−１結合核酸の間で異なる場合があり、これはＳＤＦ−１に対する結合親和性に影響する。Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸として集約される種々のＳＤＦ−１結合核酸の結合分析に基づけば、以下に説明するコアヌクレオチド配列およびそのヌクレオチド配列は個々に、より好ましくはそれら全体が、ＳＤＦ−１への結合のために必須である。
Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸の全ての発見されている配列のコアヌクレオチド配列は、配列ＧＧＵＹＡＧＧＧＣＵＨＲＸＡＡＧＵＣＧＧ（Ｃ型式１）を共有する（式中、ＸＡは不在であるか、または「Ａ」である）。Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９７−Ｄ１を例外として、Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸の全ての発見されている配列のコアヌクレオチド配列はヌクレオチド配列ＧＧＵＹＡＧＧＧＣＵＨＲＡＡＧＵＣＧＧ（Ｃ型式式２）を共有する。Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９７−Ｄ１（コアヌクレオチド配列ＧＧＵＵＡＧＧＧＣＵＡＡ−ＡＧＵＣＧＧ）は、コアヌクレオチド配列内に１つのヌクレオチド「Ａ」を失っているが、なおＳＤＦ−１に結合し、別のコアヌクレオチド配列（ＧＧＵＹＡＧＧＧＣＵＨＲ−ＡＧＵＣＧＧ（Ｃ型式３）を推論させた。初めは、図５に示す全てのＣ型ＳＤＦ−１結合核酸がＡ型ＳＤＦ−１結合核酸１９２−Ａ１０−００１に対する競合的プルダウン結合試験において分析された（プルダウン結合試験および表面プラズモン共鳴計測において求められたＫＤ＝１．５ｎＭ、ＩＣ５０＝０．１２ｎＭ）。Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９１−Ｄ５−００１、１９７−Ｂ２、１９０−Ａ３−００１、１９７−Ｈ１、１９７−Ｈ３および１９７−Ｅ３は、競合的実験において１９２−Ａ１０−００１よりも弱い結合親和性を示した。１９１−Ａ５、１９７−Ｂ１，１９７−Ｄ１、１９７−Ｈ２および１９７−Ｄ２に関しては遥かに弱い結合親和性が測定された（図５）。その分子または誘導体を、競合的プルダウン結合試験、プラズモン共鳴計測、およびインビトロの化学遊走試験を更に実施することにより更に特徴付けた。Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９１−Ｄ５−００１はヒトＳＤＦ−１への結合親和性に関して特徴付けを行い、平衡解離定数ＫＤを表面プラズモン共鳴計測により求めた（ＫＤ＝０．８ｎＭ、図２１）。１９１−Ｄ５−００１に関して０．２ｎＭのＩＣ５０（抑制濃度５０％）が細胞培養インビトロ化学遊走試験を用いて計測された。ヒトＳＤＦ−１に対するＣ型ＳＤＦ−１結合核酸１９７−Ｂ２の結合親和性は表面プラズモン共鳴計測により求め（ＫＤ＝０．９ｎＭ）、０．２ｎＭのＩＣ５０（抑制濃度５０％）は細胞培養インビトロ化学遊走試験を用いて分析した。これらのデータは、Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９１−Ｄ５−００１および１９７−Ｂ２がＳＤＦ−１に対して同様の結合親和性を有することを示している（図５および図８）。
Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９０−Ａ３−００１（４８ｎｔ）は１７ヌクレオチドの５’末端ストレッチおよび１２ヌクレオチドの３’末端ストレッチを含み、これにより一方では５’末端ストレッチの５’末端に４ヌクレオチド、３’末端ストレッチの３’末端に４ヌクレオチドが相互にハイブリダイズして末端へリックスを形成してよい。あるいは、５’末端ストレッチにおけるヌクレオチド「ＵＧＡＧＡ」が３’末端ストレッチにおけるヌクレオチド「ＵＣＵＣＡ」にハイブリダイズすることにより末端へリックスを形成してよい。分子１９０−Ａ３−００１の５’末端ストレッチの８ヌクレオチド（「ＧＡＧＡＵＡＧＧ」）および３末端ストレッチの９ヌクレオチド（「ＣＵＧＡＵＵＣＵＣ」）への低減（これにより５’ 末端ストレッチおよび３’末端ストレッチの８／９ヌクレオチド中６つが相互にハイブリダイズできる）は、ＳＤＦ−１に対する結合親和性に対して影響しない（１９０−Ａ３−００４、図６および図１９）。１９０−Ａ３−００４の平衡結合定数ＫＤをプルダウン結合試験を用いて（ＫＤ＝４．６ｎＭ、図２０）、および表面プラズモン共鳴計測により（ＫＤ＝４．７ｎＭ）測定した。１９０−Ａ３−００４に関して０．１ｎＭのＩＣ５０（抑制濃度５０％）が細胞培養インビトロ化学遊走試験を用いて計測された（図２２）。しかしながら５’末端ストレッチにおける２ヌクレオチドのトランケーションは結合親和性の極めて大きい低減をもたらしている（１９０−Ａ３−００７、図６および図１９）。
Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９１−Ｄ５−００１、１９７−Ｂ２および１９７−Ｈ１（コアヌクレオチド配列：ＧＧＵＵＡＧＧＧＣＵＡＧＡＡＧＵＣＧＧ、１９７−Ｈ３／１９１−Ａ５（コアヌクレオチド配列：ＧＧＵＵＡＧＧＧＣＵＣＧＡＡＧＵＣＧＧ）および１９７−Ｅ３／１９７−Ｂ１（コアヌクレオチド配列：ＧＧＵＵＡＧＧＧＣＵＵＧＡＡＧＵＣＧＧ）はほぼ同一のコアヌクレオチド配列を共有する（Ｃ型式４、ヌクレオチド配列：ＧＧＵＵＡＧＧＧＣＵＨＧＡＡＧＵＣＧＧ）。１９１−Ｄ５−００１、１９７−Ｂ２および１９７−Ｈ１は５’ 末端ストレッチおよび３’末端ストレッチを共有していない（１９７−Ｈ３および１９７−Ｅ３は１９７−Ｂ２と同一の５’ 末端ストレッチおよび３’末端ストレッチを有する）。しかしながら、５’末端ストレッチのそれぞれの１０ヌクレオチド（１９７−Ｂ２、１９７−Ｅ３、１９７−Ｈ３）または１０ヌクレオチドのうちの９ヌクレオチド（１９１−Ｄ５−００１、１９７−Ｈ１）は３’末端ストレッチの該当する１０ヌクレオチド（１９７−Ｂ２、１９７−Ｅ３、１９７−Ｈ３）または１０ヌクレオチドのうちの９ヌクレオチド（１９１−Ｄ５−００１、１９７−Ｈ１）にハイブリダイズする場合がある（図５）。即ち、上記したＣ型ＳＤＦ−１結合核酸１９７−Ｂ２、１９１−Ｄ５−００１、１９７−Ｈ１、１９７−Ｅ３および１９７−Ｈ３に加え、１９１−Ａ５、１９７−Ｂ１、１９７−Ｈ２、１９７−Ｄ１および１９７−Ｄ２の５’末端ストレッチは「ＲＫＳＢＵＳＮＶＧＲ」の共通の一般的ヌクレオチド配列を含む（Ｃ型式５−５’）。上記したＣ型ＳＤＦ−１結合核酸１９７−Ｂ２、１９１−Ｄ５−００１、１９７−Ｈ１、１９７−Ｅ３および１９７−Ｈ３に加え、１９１−Ａ５、１９７−Ｂ１、１９７−Ｈ２、１９７−Ｄ１および１９７−Ｄ２の３’末端ストレッチは「ＹＹＮＲＣＡＳＳＭＹ」の共通の一般的ヌクレオチド配列を含んでおり（Ｃ型式５−３’）、これにより、Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９７−Ｂ２、１９１−Ｄ５−００１、１９７−Ｈ１、１９７−Ｅ３および１９７−Ｈ３の５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチが好ましい。Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９７−Ｂ２、１９１−Ｄ５−００１、１９７−Ｈ１、１９７−Ｅ３および１９７−Ｈ３のこれらの好ましい５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチは一般式において「ＲＫＳＢＵＧＳＶＧＲ」（Ｃ型式６−５’、５’末端ストレッチ）および「ＹＣＮＲＣＡＳＳＭＹ」（Ｃ型式６−３’、３’末端ストレッチ）に集約できる。
Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９１−Ｄ５−００１のトランケーション誘導体を構築し、元の分子１９１−Ｄ５−００１との競合的プルダウン結合試験において試験した（図７Ａ、図７Ｂおよび図１９）。第１に、図７Ａに示す通り、５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチの長さを各々１０ヌクレオチド（１９１−Ｄ５−００１）から各々７ヌクレオチド（１９１−Ｄ５−００４）に短鎖化し、これによりそれぞれ５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチの１０ヌクレオチド（１９１−Ｄ５−００１）のうち９つのヌクレオチド、または７ヌクレオチド（１９１−Ｄ５−００４）のうち６つのヌクレオチドを相互にハイブリダイズすることができる。それぞれ５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチの７ヌクレオチドまでの低減（ここで７ヌクレオチド中６つが相互にハイブリダイズできる）によりＳＤＦ−１への低減された結合親和性がもたらされた（１９１−Ｄ５−００４）。Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９１−Ｄ５−００４の末端ストレッチを修飾することにより、１９１−Ｄ５−００４の３’末端ストレッチ内の塩基対を形成しないヌクレオチド「Ａ」を、「Ｃ」により置換した（１９１−Ｄ５−００５）。この修飾により結合が向上した。この誘導体、Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９１−Ｄ５−００５は、１９１−Ｄ５−００１と同様のＳＤＦ−１に対する結合を示した。５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチを更にトランケーションしてそれぞれ５ヌクレオチドとしたところ、合計２９ヌクレオチドの長さの分子がもたらされた（１９１−Ｄ５−００７）。１９１−Ｄ５−００１の類似性およびＣ型ＳＤＦ−１結合核酸１９７−Ｂ２、１９１−Ｄ５−００１、１９７−Ｈ１、１９１−Ａ５、１９７−Ｈ３、１９７−Ｂ１、１９７−Ｅ３、１９７−Ｄ１、１９７−Ｈ２および１９７−Ｄ２の類似性から、１９１−Ｄ５−００７に関して示されたデータから、５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチは原則として５ヌクレオチドまでトランケーションすることができ、５’末端ストレッチに関するヌクレオチド配列「ＣＧＧＧＡ」および３’末端ストレッチに関する「ＵＣＣＣＧ」を良好に試験することができた（Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９１−Ｄ５−００７０１０）。Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９１−Ｄ５−００７は意外にも１９１−Ｄ５−００１よりも幾分良好にＳＤＦ−１に結合している（競合結合試験を用いてアプタマーレベルで測定した）。１９１−Ｄ５−００７の平衡結合定数ＫＤをプルダウン結合試験を用いて（ＫＤ＝２．２ｎＭ、図２０）、および表面プラズモン共鳴計測により（ＫＤ＝０．８ｎＭ、図２１）測定した。１９１−Ｄ５−００７に関して０．１ｎＭのＩＣ５０（抑制濃度５０％）が細胞培養インビトロ化学遊走試験を用いて計測された。４ヌクレオチドまでの両方の末端ストレッチのさらなるトランケーション（１９１−Ｄ５−０１０、図７Ａ）。
それぞれ４ヌクレオチドの５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチを有しているＣ型ＳＤＦ−１結合核酸１９１−Ｄ５−００１の別の誘導体（１９１−Ｄ５−０１７／−０２４／−０２９）もまた１９１−Ｄ５−００７との競合的プルダウン結合試験においてＳＤＦ−１への低減された結合親和性を示している（図７Ｂ）。それぞれ５ヌクレオチド長の別の５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチも追加的に試験した（１９１−Ｄ５−０１７−２９ａ、１９１−Ｄ５−０１７−２９ｂ、１９１−Ｄ５−０２４−２９ａ、１９１−Ｄ５−０２４−２９ｂ）。これらの誘導体の一般式は５’末端ストレッチに関しては「ＸＳＳＳＳＶ」（Ｃ型式７−５’）であり、３’ストレッチに関しては「ＢＳＳＳＸＳ」（Ｃ型式７−３’）である（式中、ＸＳは不在下「Ｓ」である）。５つの試験した変異体のうち２つは１９１−Ｄ５−００７と同一のＳＤＦ−１に対する結合親和性を示した（１９１−Ｄ５−０２４−２９ａ、１９１−Ｄ５−０２４−２９ｂ、図７Ｂ）。ＳＤＦ−１に対して最良の結合親和性を示し、それぞれ５ヌクレオチドの５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチを含む１９１−Ｄ５−００１誘導体（１９１−Ｄ５−００７、１９１−Ｄ５−０２４−２９ａ、１９１−Ｄ５−０２４−２９ｂ）の５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチの配列は一般式で集約できる（５’末端ストレッチ：「ＳＧＧＳＲ」、Ｃ型式８−５’、３’末端ストレッチ：「ＹＳＣＣＳ」、Ｃ型式８−３’）。
Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９７−Ｂ２のトランケーション誘導体を、元の分子１９７−Ｂ２および１９１−Ｄ５−００７との競合的プルダウン結合試験において分析した（図８）。１９１−Ｄ５−００７との競合的プルダウン試験を用いた場合、１９７−Ｂ２は１９１−Ｄ５−００７と同じＳＤＦ−１への結合親和性を有することが分かった。５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチを各々１０ヌクレオチド（１９７−Ｂ２）から各５ヌクレオチド（１９７−Ｂ２−００５）まで結合親和性を失うことなく短鎖化することにより、５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチのヌクレオチドを相互に完全にハイブリダイズさせることができる。１９７−Ｂ２−００５の５’末端ストレッチ（「ＧＣＧＧＧ」）および３’末端ストレッチ（「ＣＣＵＧＣ」）を、１９７−Ｂ２−００６の「ＧＣＣＧＧ」（５’末端ストレッチ）により、および「ＣＣＧＧＣ」（３’末端ストレッチ）により置換した場合、ＳＤＦ−１への結合親和性は完全に存続していた。１９７−Ｂ２および１９１−Ｄ５−００１（およびその誘導体）は同じコアヌクレオチド配列（ＧＧＵＵＡＧＧＧＣＵＡＧＡＡＧＵＣＧＧ）を共有し、それぞれ４ヌクレオチド長の５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチを有する１９１−５Ｄの数種の誘導体を試験したため、５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチの追加的トランケーションは省略した。それぞれ５’末端および３’末端に６ヌクレオチド（５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチ）を含む２つの別の誘導体を設計した。両方の分子（１９７−Ｂ２−００６−３１ａおよび１９７−Ｂ２−００６−３１ｂ）のＳＤＦ−１への結合親和性は、１９１−Ｄ５−００７および１９７−Ｂ２−００６で示されたものと同じである（図８）。ＳＤＦ−１に対して最良の結合親和性を示し、それぞれ５ヌクレオチドの５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチを含む１９７−Ｂ２誘導体の５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチの配列は一般式で集約できる（５’末端ストレッチ：「ＧＣＳＧＧ」、Ｃ型式９−５’、３’末端ストレッチ：「ＣＣＫＧＣ」、Ｃ型式９−３’）。
Ｃ型ＳＤＦ−１結合核酸１９１−Ｄ５−００１（５’末端ストレッチ：「ＳＧＧＳＲ」、Ｃ型式８−５’、３’末端ストレッチ：「ＹＳＣＣＳ」、Ｃ型式８−３’）および１９７−Ｂ２（５’末端ストレッチ：「ＧＣＳＧＧ」、Ｃ型式９−５’、３’末端ストレッチ：「ＣＣＫＧＣ」、Ｃ型式９−３’）のトランケーションされた誘導体の好ましい５’ストレッチおよび３’ストレッチを組み合わせれば、５’末端ストレッチおよび３’末端ストレッチに関する共通の好ましい一般式は「ＳＳＳＳＲ」（５’末端ストレッチ、Ｃ型式１０−５’）および「ＹＳＢＳＳ」（３’末端ストレッチ、Ｃ型式１０−３’）である。
［１．４ 別のＳＤＦ−１結合核酸］
更に、「Ａ型」、「Ｂ型」および「Ｃ型」のＳＤＦ−１結合モチーフを共有しない別の３種のＳＤＦ−１結合核酸を発見した。それらはプルダウン結合試験を用いてアプタマーとして分析した（図９）。
図１〜図９に示す配列のいずれも、それらのトランケーションされた形態のみならず、それらの伸長された形態も含めて本発明による核酸であるが、そのようにそれぞれトランケーションおよび伸長された核酸分子がなお、標的に結合できることが条件である。
［実施例２：ＳＤＦ−結合シュピーゲルマーの４０ｋｄａ−ＰＥＧ修飾および他の修飾］
インビボにおけるシュピーゲルマーの血漿中滞留時間を延長するために、シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２、１９２−Ａ１０−００８、１９１−Ｄ５−００７、１９７−Ｂ２−００６および１９７−Ｂ２−００６−３１ｂを、第３章に記載の通り、５’末端において４０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に共有結合的にカップリングした（ＰＥＧ化クローン：１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧ、１９２−Ａ１０−００８−５’ＰＥＧ、１９１−Ｄ５−００７−５’ＰＥＧ、１９７−Ｂ２−００６−５’ＰＥＧおよび１９７−Ｂ２−００６−３１ｂ−５’ＰＥＧ）。
ＰＥＧ化シュピーゲルマー分子は細胞培養インビトロＴＡＸ試験（第５章）において、Ｂｉａｃｏｒｅを用いたプラズモン共鳴計測（第６章）により分析した。全ての４０ｋＤａ−ＰＥＧ修飾シュピーゲルマーはなおＳＤＦ−１誘導化学遊走を抑制し、低ナノモル範囲においてＳＤＦ−１に結合することができた（図２３Ａ、図２３Ｂ、図２４Ａおよび図２４Ｂ）。
更に、ＳＤＦ結合シュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１を４０ｋＤａ−ＰＥＧ、３０ｋＤａ−ＰＥＧ、１００ｋＤａ−ＨＥＳ、または１３０ｋＤａ−ＨＥＳで修飾した（ＰＥＧ化クローン：１９２−Ａ１０−００１−５’ＰＥＧ４０、１９２−Ａ１０−００１−５’ＰＥＧ３０、１９２−Ａ１０−００１−５’ＨＥＳ１００、１９２−Ａ１０−００１−５’ＨＥＳ１３０；カップリング手順は第３章）。図２５Ａおよび図２５Ｂに示す通り、ＰＥＧ部分およびＨＥＳ部分のいずれもＳＤＦ−１誘導化学遊走を抑制するシュピーゲルマーの効力に影響しなかった。
［実施例３：アプタマーおよびシュピーゲルマーの合成および誘導体化］
［３．１ 小規模合成］
アプタマーおよびシュピーゲルマーを、２’ＴＢＤＭＳ ＲＮＡホスホロアミダイト化学法（Ｄａｍｈａ ａｎｄ Ｏｇｉｌｖｉｅ，１９９３）を用いながらＡＢＩ３９４合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）による固相合成により製造した。Ｄ配置およびＬ配置のｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−ホスホロアミダイト、ｒＣ（Ａｃ）−ホスホロアミダイト、ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−ホスホロアミダイト、およびｒＵ−ホスホロアミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから購入した。アプタマーおよびシュピーゲルマーはゲル電気泳動で精製した。
［３．２ 大規模合成および修飾］
シュピーゲルマーは２’ＴＢＤＭＳ ＲＮＡホスホロアミダイト化学法（Ｄａｍｈａ ａｎｄ Ｏｇｉｌｖｉｅ，１９９３）を用いながらＡｅｋｔａＰｉｌｏｔ１００合成装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ、Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）による固相合成により製造した。Ｌ−ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−ホスホロアミダイト、Ｌ−ｒＣ（Ａｃ）−ホスホロアミダイト、Ｌ−ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−ホスホロアミダイト、およびＬ−ｒＵ−ホスホロアミダイトはＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡから購入した。５’−アミノ−モディファイアーはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。シュピーゲルマーの合成はＬ−ｒｉｂｏＧに対して開始し、Ｌ−ｒｉｂｏＣ、Ｌ−ｒｉｂｏＡ、Ｌ−ｒｉｂｏＵはそれぞれＣＰＧ孔径１０００Åを修飾した（Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）。カップリングのために（サイクルあたり１５分）、アセトニトリル中０．３Ｍベンジルチオテトラゾール（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、およびアセトニトリル中それぞれ０．２Ｍのホスホロアミダイト溶液３．５等量を使用した。酸化キャッピングサイクルを用いた。オリゴヌクレオチド合成のための追加的な標準溶媒および試薬はＢｉｏｓｏｌｖｅ（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ、ＮＬ）から購入した。シュピーゲルマーはＤＭＴ−ＯＮ合成し、脱保護の後、Ｓｏｕｒｃｅｌ５ＲＰＣ溶媒（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用て分取用ＲＰ−ＨＰＬＣを介して精製した（Ｗｉｎｃｏｔｔ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９５）。５’ＤＭＴ−基を８０％酢酸を用いて除去した（ＲＴで９０分）。その後、２Ｍ ＮａＯＡｃ水溶液を添加し、５Ｋ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いながら接線流濾過によりシュピーゲルマーを脱塩した。
［３．３ ＰＥＧ化］
シュピーゲルマーのインビボの血漿中滞留時間を延長するために、シュピーゲルマーを５’末端において４０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に共有結合的にカップリングした。
ＰＥＧ化のために（ＰＥＧ化のための方法の技術的詳細は欧州特許出願第ＥＰ１３０６３８２号参照）、精製された５’アミノ修飾シュピーゲルマーをＨ２Ｏ（２．５ｍｌ）、ＤＭＦ（５ｍｌ）および緩衝液Ａ（５ｍｌ。クエン酸・Ｈ２Ｏ［７ｇ］、ホウ酸［３．５４ｇ］、リン酸［２．２６ｍｌ］および１Ｍ ＮａＯＨ［３４３ｍｌ］を混合し、１リットルの最終容量まで水を添加することにより調製した。ｐＨ＝８．４は１ＭのＨＣｌで調節した。）の混合物中に溶解した。
シュピーゲルマー溶液のｐＨは１ＭのＮａＯＨで８．４とした。次に７５〜８５％の最大収率が達成されるまで０．２５等量の６分画で、３０分毎に３７℃で４０ｋＤａＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を添加した。反応混合物のｐＨはＰＥＧ−ＮＨＳエステルの添加の間、１ＭのＮａＯＨで８〜８．５に維持した。
反応混合物を４ｍｌの尿素溶液（８Ｍ）および４ｍｌの緩衝液Ｂ（Ｈ２Ｏ中０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）と混合し、１５分間９５℃で加熱した。次にＰＥＧ化シュピーゲルマーをアセトニトリル勾配（緩衝液Ｂ、緩衝液Ｃ、アセトニトリル中０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）を用いたＳｏｕｒｃｅ １５ＲＰＣ溶媒（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。過剰のＰＥＧは５％緩衝液Ｃにおいて溶離し、ＰＥＧ化シュピーゲルマーは１０〜１５％緩衝液Ｃにおいて溶離した。＞９５％純度（ＨＰＬＣで試験）の生成物画分を合わせ、４０ｍｌの３ＭのＮａＯＡｃと混合した。ＰＥＧ化シュピーゲルマーは接線流濾過により脱塩した（５Ｋ再生セルロース膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）。
［３．４ ＨＥＳ化］
シュピーゲルマーのインビボの血漿中滞留時間を延長するために、シュピーゲルマーを＞１３０ｋＤａの種々の分子量および＞０．５の置換度を有するヒドロキシルエチル澱粉（ＨＥＳ）に共有結合的にカップリングした。シュピーゲルマーの５’末端がコンジュゲーションのための好ましい部位である。
ＨＥＳ化のために（核酸のＨＥＳ化のための方法の技術的詳細は独国公開第ＤＥ１０１１２８２５Ａ１号を、Ｄ／Ｌ−核酸に関してはＰＣＴ ＷＯ０２／０８０９７９Ａ２を参照）、精製された５’アミノ修飾シュピーゲルマーを重炭酸ナトリウム（０．３Ｍ、１ｍｌ）に溶解し、ｐＨを８．５に調節した。
シュピーゲルマーに関しては、５倍過剰量の遊離のＨＥＳ酸（３．３ｍｍｏｌ、Ｓｕｐｒａｍｏｌ、Ｒｏｓｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびジ（Ｎ−スクシンイミジル）カーボネート（３．３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムミド（１ｍｌ）に添加し、ＨＥＳの活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの溶液を形成した。全ての反応物を溶解するために、混合物を６０℃で短時間攪拌し、２５℃に冷却し、次に２５℃で１．５時間攪拌した。シュピーゲルマーの溶液を活性化ＨＥＳの溶液に添加し、得られた混合物を２５℃およびｐＨ８．５で攪拌した。反応は分析用ＩＥＸ−ＨＰＬＣでモニタリングした。典型的には、コンジュゲーションは１時間以内に＞７５％まで進行した。
Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ溶媒（ＧＥ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によるＩＥＸ−ＨＰＬＣ精製のために、反応混合物を１０倍量の緩衝液Ａ（水／アセトニトリル９：１中に１ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＮａＣｌＯ４、ｐＨ４）と混合した。過剰のＨＥＳは５％緩衝液Ａ（水／アセトニトリル９：１中に１ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌＯ４、ｐＨ４）で溶離したのに対し、ＨＥＳ−シュピーゲルマーコンジュゲートは２０〜３０％緩衝液Ｂで溶離した。＞９５％純度（ＨＰＬＣで試験）の生成物画分を合わせ、接線流濾過により脱塩した（５Ｋ再生セルロース膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）。
［実施例４：結合定数の測定（プルダウン結合試験）］
［４．１ 直接プルダウン結合試験］
ビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１へのアプタマーの親和性を、３７℃においてプルダウン結合試験形式で計測した。アプタマーは、［γ−３２Ｐ］標識ＡＴＰ（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａｎａｌｙｔｉｃ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により５’ホスフェートの標識をした。標識されたアプタマーの比放射能は２００，０００〜８００，０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌであった。アプタマーは、変性および再生後に、４〜１２時間、種々の量のビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１とともに選択緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２の０．１％［ｗ／ｖｏｌ］Ｔｗｅｅｎ−２０）中で、３７℃において、１０ｐＭ、２０ｐＭ、３０ｐＭまたは４０ｐＭの濃度でインキュベートすることにより、低濃度で平衡化させた。選択緩衝液には１０μｇ／ｍｌヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および１０μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＵＳＡ）を補充することにより、使用するプラスチック製品または固定化マトリックスの表面との結合パートナーの吸着を防止した。ビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１の濃度範囲は８ｐＭ〜１００ｎＭに設定し、総反応容量は１ｍｌとした。ペプチドおよびペプチド−アプタマー複合体は、選択緩衝液中で予備平衡化されている１．５μｌのストレプトアビジンウルトラリンクプラス粒子（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）上に固定化し、６μｌの総容量中に再懸濁した。粒子はサーモミキサー中で、各温度で、３０分間懸濁液中に保持した。固定化された放射能は、上澄みを分離し適切な洗浄をした後に、シンチレーションカウンターで定量した。結合のパーセントをビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１の濃度に対してプロットし、解離定数は、１：１の化学量論を仮定し、ソフトウエアアルゴリズム（ＧＲＡＦＩＴ、Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｓｕｒｒｅｙ ＵＫ）を用いることにより求めた。
［４．２ 競合的プルダウン結合試験］
異なるＤ−ＳＤＦ−１結合アプタマーを比較するために、競合的順位づけ試験を実施した。この目的のために使用可能な最も関連性の高いアプタマーを放射標識（上記参照）し、参照として使用した。変性および再生後、ニュートラビジンアガロースまたはストレプトアビジンウルトラリンクプラス（共にＰｉｅｒｃｅより入手）上で固定化および洗浄後に競合を行うことなくペプチドへの約５〜１０％結合をもたらす条件において、１ｍｌの選択緩衝液中、ビオチニル化ヒトＤ−ＳＤＦ−１とともに３７℃でインキュベートした。過剰の変性および再生した未標識Ｄ−ＲＮＡアプタマー変異体を標識参照アプタマーと共に異なる濃度となるように（例えば２ｎＭ、１０ｎＭ 及び５０ｎＭ）添加することにより、結合反応に並行させた。試験すべきアプタマーは標的結合に関して参照アプタマーと競合したため、その結合特性に依存しながら結合シグナルを低下させた。この試験において最も活性であることがわかったアプタマーは次に、別のアプタマー変異体の競合的分析のための新しい参照として使用した。
実施例５：ＳＤＦ−１結合シュピーゲルマーによるＳＤＦ−１誘導化学遊走の抑制の分析
ＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞白血病細胞（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇより入手）を、１０％ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するグルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地中で、３７℃および５％ＣＯ２において培養した。実験の１日前に、標準培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中０．３×１０６／ｍｌ（９×１０６／３０ｍｌ）の密度で新しいフラスコに細胞を播種した。
実験のために、細胞を遠心分離（３００ｇで５分間）し、再懸濁し、計数し、１回１５ｍｌのＨＢＨ（１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するハンクスバランス塩溶液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で洗浄した。次に細胞を使用するフィルタープレートの型に応じて３×１０６／ｍｌまたは１．３３×１０６／ｍｌで再懸濁した。次にＳＤＦ−１および種々の量のシュピーゲルマーを含有する溶液に向けて、フィルタープレートの多孔性膜をとおして細胞を数時間遊走させた。トランスウェルプレートおよび孔径５μｍの多孔性ポリカーボネート膜のインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３４２１）またはマルチスクリーンＭＩＣプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡＭＩＣ５Ｓ１０）のいずれかを使用した。
［５．１ トランスウェルプレートに関するプロトコル］
刺激溶液（ＳＤＦ−１＋種々の濃度のシュピーゲルマー）をトランスウェルプレートの下コンパートメント中６００μｌＨＢＨ中に作成し、２０〜３０分間インキュベートした。全ての条件は少なくとも２回行った。インサートを刺激溶液の入ったウェルに移し、３×１０６／ｍｌで細胞懸濁液１００μｌをインサートに添加した（３×１０５細胞／ウェル）。次に細胞を３７℃で３時間遊走させた。
その後、インサートを取り出し、６０μｌのリサズリン（ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）（Ｓｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ワーキング溶液（ＰＢＳ中４４０μＭ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をウェル（およびキャリブレーションウェル）に添加した。次にプレートを２．５〜３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、各ウェル２００μｌを黒色の９６ウェルプレートに移した。蛍光シグナルの計測はフルオスターオプティマ多重検出プレートリーダー（ＢＭＧ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、５４４ｎｍ（励起）および５９０ｎｍ（発光）において行った。
［５．２ ミリポアマルチスクリーンプレートに関するプロトコル］
刺激溶液（ＳＤＦ−１＋種々の濃度のシュピーゲルマー）を０．２ｍｌのロープロファイル９６ウェルプレート中１０Ｘ溶液として作成した。１３５μｌのＨＢＨをマルチスクリーンプレートの下コンパートメント内にピペットで添加し、刺激溶液１５μｌを添加した。全条件は３回繰り返して行った。２０〜３０分の後、フィルタープレートを刺激溶液の入ったプレート内に挿入し、細胞懸濁液７５μｌを１．３３×１０６／ｍｌでフィルタープレートのウェルに添加した（１×１０５細胞／ウェル）。次に細胞を３７℃で３時間遊走させた。
その後、インサートプレートを取り出し、２０μｌのリサズリンワーキング（ｒｅｓａｚｕｒｉｎ ｗｏｒｋｉｎｇ）溶液（ＰＢＳ中４４０μＭ）を下ウェルに添加した。次にプレートを２．５〜３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、各ウェル１００μｌを黒色の９６ウェルプレートに移した。蛍光シグナルの計測は上記した通り行った。
［５．３ 評価］
評価のために、蛍光の数値をバックグラウンドの蛍光（ウェル中細胞不在）で補正した。次にＳＤＦ−１が存在する実験条件と存在しない実験条件の間の相違を計算した。シュピーゲルマーを有さない試料（ＳＤＦ−１のみ）の数値を１００％とし、これのパーセントとしてシュピーゲルマーを有する試料の数値を計算した。用量応答曲線に関してはパーセント数値をシュピーゲルマー濃度に対してプロットし、得られた曲線からグラフ上でＩＣ５０値（シュピーゲルマー不在の場合の活性の５０％が存在するシュピーゲルマーの濃度）を求めた。
［５．４ 結果］
［５．４．１ ヒトＳＤＦ−１によるＪｕｒｋａｔ細胞の用量依存的刺激］
ヒトＳＤＦ−１は用量依存的にＪｕｒｋａｔ細胞の遊走を刺激することがわかり、最大半量の刺激は約０．３ｎＭにおいて観察された（図１１）。
［５．４．２ ＳＤＦ−１結合シュピーゲルマーによるヒトＳＤＦ−１誘導化学遊走の用量依存的抑制］
細胞をヒトＳＤＦ−１に加え、漸増濃度のＳＤＦ−１結合シュピーゲルマーを含有する溶液に向けて遊走させたところ、用量依存的な抑制が観察された。試験したシュピーゲルマーのそれぞれのＩＣ５０は実施例１に特定する通りである。非特異的な対照シュピーゲルマーをＳＤＦ−１結合シュピーゲルマーの代わりに使用した場合、１μＭまで抑制作用は観察されなかった（図２６）。
［５．４．３ ＳＤＦ−１結合シュピーゲルマーによるマウスＳＤＦ−１誘導化学遊走の用量依存的抑制］
ＳＤＦ−１は種を超えて高度に保存されており、マウス由来のＳＤＦ−１はヒトＳＤＦ−１ａと１つのアミノ酸において異なる（１８位においてバリンの代わりにイソロイシン）。マウスＳＤＦ−１はＪｕｒｋａｔ細胞の化学遊走を刺激することができ（図２７）、この作用はヒトＳＤＦ−１の場合と同じ効力をもってシュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１および１９１−Ｄ５−００７−５’−ＰＥＧにより抑制されることがわかった（図２８）。
［実施例６：表面プラズモン共鳴計測による結合分析］
Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてヒトＳＤＦ−１αへのシュピーゲルマーの結合を分析した。アミン基を介してＳＤＦ−１αのカップリングを達成する場合は、ＳＤＦ−１αは１〜２時間水に対して透析（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＶＳＷＰ混合セルロースエステル、孔径０．０２５μＭ）することにより干渉するアミンを除去した。ＣＭ４センサチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を活性化した後、５μｌ／分の流量で０．４ＭのＮＨＳおよび０．１ＭのＥＤＣの１：１希釈物３５μｌを注入することによりタンパク質をカップリングした。次に、機器の応答が１０００〜２０００ＲＵ（相対単位）の範囲となるまで２μｌ／分の流量で１〜１．５μｇ／ｍｌの濃度でケモカインを注入した。未反応のＮＨＳエステルは５μｌ／分の流量で３５μｌの塩酸エタノールアミン溶液（ｐＨ８．５）を注入することにより脱活性化した。センサチップを結合緩衝液を用いて２回プライミングし、ベースラインが安定化するまで１０μｌ／分で１〜２時間平衡化させた。全タンパク質に関し、速度論的パラメータおよび解離定数は、選択緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌが２０ｍＭ、ＮａＣｌが１３７ｍＭ、ＫＣｌが５ｍＭ、ＣａＣｌ２が１ｍＭ、ＭｇＣｌ２が１ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ−２０が０．１％［ｗ／ｖ］。ｐＨ７．４）中１０００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、３１．２５ｎＭおよび０ｎＭの濃度における一連のシュピーゲルマー注入により評価した。全実験において、分析は、１０μｌ／分の流量において会合時間１８０秒および解離時間３６０秒を定義するＫｉｎｊｅｃｔコマンドを用いることにより３７℃で実施した。データ分析および解離定数（ＫＤ）の計算はロングミュアーの１：１化学量論的フィッティングアルゴリズムを用いてＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０ソフトウエア（ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により実施した。
［実施例７：ＣＸＣＲ４発現細胞への［１２５Ｊ］−ＳＤＦ−１結合のＳＤＦ−１結合シュピーゲルマーによる抑制］
［７．１ 方法］
ヒトＣＸＣＲ４受容体をコードしているｃＤＮＡクローン（ＮＭ＿００３４６７．２）をＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入し、ｐＣＲ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローニングした。得られたベクターをリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にトランスフェクトし、安定に発現している細胞株をゲネチシンによる処理により選択した。受容体の発現はＲＴ−ＰＣＲにより確認した。
結合試験のために、ＣＸＣＲ４発現細胞を１×１０５個／ウェルの細胞密度でポリリジンでコーティングされた２４ウェルプレート内に播種し、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．５ｍｇ／ｍｌゲネチシンを含有するＣＨＯ−Ｕｌｔｒａ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中で、３７℃および５％ＣＯ２で一晩培養した。
結合実験のために、培地を除去し、細胞を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンおよび０．１ｍｇ／ｍｌバシトラシン（ＨＢＢ）を更に含有するハンクスバランス（Ｈａｎｋｓ ｂａｌａｎｃｅｄ）塩溶液で一回洗浄した。次に細胞を５０ｐＭの［１２５Ｊ］−ＳＤＦ−１（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｒｏｄｇａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および種々の濃度のシュピーゲルマーとともに室温で、０．２ｍｌのＨＢＢ中で１時間インキュベートした。
非特異的結合は、数個のウェルに対し、０．５μＭの終濃度となるように未標識のヒトＳＤＦ−１（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加することにより求めた。
インキュベーション時間の後、上澄みを除去し、ウェルを氷冷ＨＢＢで３回洗浄した。その後、細胞を０．１ｍｌの０．１ＭのＮａＯＨを用いて溶解した。溶解物をシンチレーションバイアルに移し、４ｍｌのＵｎｉｓａｆｅ１液体シンチレーションカクテル（Ｚｉｎｓｓｅｒ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したのち、ＢｅｃｋｍａｎＬＳ６５００シンチレーションカウンターにおいて計数した。
非特異的結合（未標識ＳＤＦ−１の大量存在下の結合）に関する数値が、高濃度（５００ｐＭ）のシュピーゲルマーの存在下では全結合に関する数値より幾分高い値であったため、最大結合（「ｍａｘ」）と５００ｐＭシュピーゲルマー存在下の結合との間の差をＩＣ５０値の計算のために使用した。
［７．２ 結果］
結合した［１２５Ｊ］−ＳＤＦ−１をシュピーゲルマーの濃度に対してプロットしたところ、ＳＤＦ−１の結合は約６０ｐＭのＩＣ５０値でシュピーゲルマー１９２−Ａ１０−００１によりブロックされることがわかった。
［実施例８：ＳＤＦ−１結合シュピーゲルマーによるＳＤＦ−１誘導ＭＡＰキナーゼ活性化の抑制］
［８．１ 方法］
ＣＸＣＲ４発現ＣＨＯ細胞を、０．５×１０６個／ウェルの細胞密度で６ウェルプレート内に播種し、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．５ｍｇ／ｍｌゲネチシンを含有するＣＨＯ−Ｕｌｔｒａ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中で、３７℃および５％ＣＯ２で約３時間培養した。細胞結合の後、培地を除去し、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地と交換した。次に細胞を３７℃および５％ＣＯ２において一晩インキュベートした。刺激の３時間前に、培地を新しいＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地と再度交換した。細胞を、ヒト１ｎＭのＳＤＦ−１および種々の量のシュピーゲルマーで５分間または１０分間刺激した。その後培地を除去し、１ｍｌの氷冷ホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回迅速に洗浄し、その後ＳＤＳ試料緩衝液（Ｔｒｉｓ／塩酸がｐＨ６．８および６２．５ｍＭ、グリセロールが１０％、ＳＤＳが２％、ブロモフェノールブルーが０．０１％、β−メルカプトエタノールが５％）で溶解した。１μｌの０．５ｕ／μｌベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を各ウェルに添加し、室温で５〜１０分間インキュベートした後、溶解物をエッペンドルフ試験管に移し、５分間９５℃でインキュベートし、その後の分析時まで−２０℃で保存した。
溶解物２５μｌを１０％変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離した。次にタンパク質をＨｙｂｏｎｄＥＣＬニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に電気ブロッティングにより移行させた。ブロッティングの後、タンパク質のローディングおよび移行の制御のためにポンソーレッド（３％トリクロロ酢酸中に０．２％）で膜を染色し、次に一晩２〜８℃で１０％の脱脂粉乳を含有するＴＢＳ−Ｔ（トリス緩衝食塩水（２０ｍＭのＴｒｉｓ／塩酸、ｐＨ７．６、１３７ｍＭのＮａＣｌ）に０．１％のＴｗｅｅｎ２０を添加）中でインキュベーションすることによりブロックした。次に膜を室温でウサギ抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＡＰキナーゼ抗体（ＴＢＳ−Ｔ中の１０％乳中に１：１０００）とともに２時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで５分間３回洗浄した後、膜を抗ウサギＩｇＧＨＲＰコンジュゲート（ＴＢＳ−Ｔ中の１０％乳中に１：２０００）とともに室温で１時間インキュベートした。膜を再度ＴＢＳ−Ｔで５分間３回洗浄した後、ＬｕｍｉＧｌｏＲケミルミネセント試薬中で１分間インキュベートした。ルミネセンスは３０秒〜２分間Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（商標）ＥＣＬケミルミネセンスフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に曝露することにより検出した。抗体およびルミネセンス検出試薬はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａ．Ｍ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手したＰｈｏｓｐｈｏＰｌｕｓｐ４４／４２ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体キットの構成要素を用いた。
［８．２ 結果］
活性化されたＭＡＰキナーゼを反映しているバンドの強度の上昇によって示される通り、１ｎＭのヒトＳＤＦ−１でＣＸＣＲ４発現細胞を５分間刺激することにより、ＭＡＰキナーゼの著しい刺激がもたらされる。ＭＡＰキナーゼのこの活性化はシュピーゲルマー１９１−Ａ１０−００１により用量依存的に抑制することができる（図３０）。
［実施例９：大動脈輪新芽形成試験におけるヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧの機能的分析］
ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧが標準的な血管新生臓器培養試験においても機能するかどうかを調べるために、大動脈輪新芽形成試験を実施した。体外移植組織からの血管様の伸長物の長さおよび充満性を評価するこの試験は血管新生に関する最も広範に使用されている臓器培養モデルとなっている（Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＳＤＦ−１はこの型の試験において新芽形成を誘導することがすでにわかっている（Ｓａｌｃｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
ラット大動脈を輪型に切り出し、コラーゲンマトリックスに包埋し、ＳＤＦ−１およびＳＤＦ−１＋ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧまたはＳＤＦ＋ＳＤＦ−１に結合しない非機能性ＰＥＧ化対照シュピーゲルマーとともにインキュベートした。６〜７日の後、新芽形成（即ち内皮細胞の増殖）を写真撮影および新芽形成指数の測定により分析した。
［方法］
雄ラット由来の大動脈をＢａｇｈｅｒｉ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より入手した。大動脈は新しく調製し、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および２．５μｇ／ｍｌフンジゾン（Ｃａｍｂｒｅｘ，ＵＳＡ）を含有するＭＣＤＢ １３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、氷上で輸送した。
実験のために単一の大動脈を培地と共に細胞培養皿に移し、残存する結合組織を除去した。次に大動脈を約１〜２ｍｍの長さの輪にメスで切りだした。輪を培地１９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で十分洗浄し（少なくとも５回）、次にウェル当たりコラーゲン溶液４５０μｌの入った２４ウェルプレートのウェルに入れた。このコラーゲン溶液は９ｍｌのラット尾部コラーゲン（０．１％酢酸中３ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１．１２ｍｌの１０Ｘ培地１９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１．１２ｍｌの１０Ｘコラーゲン緩衝液（０．０５ＮのＮａＯＨ、２００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２６０ｍＭのＮａＨＣＯ３）および０．６ｍｌの２００ｍＭグルタミンと混合することにより製造した。輪はトリミングされた端部がウェルの底面に対して垂直となるように方向づけた。３７℃で少なくとも１時間プレートをインキュベートすることによりコラーゲンを固化させた。その後、（ＳＤＦ−１およびシュピーゲルマーが）添加されたＭＣＤＢ１３１培地をウェル当たり１ｍｌ添加した。次に輪を６〜７日間３７℃でインキュベートした。新芽形成の対照としてＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）を用いて追加的に実験を行った。
新芽形成はデジタルカメラを用いて写真を撮影することにより記録した。一部の場合においては、１０％パラホルムアルデヒド１ｍｌを添加することにより輪を固定し、その後の記録用に２〜８℃で保存した。写真はＳｃｉｏｎＩｍａｇｅ画像処理ソフトウエアを用いて分析した。ステージマイクロメーターから撮られた写真を参考にしながらキャリブレーションした後、輪の一端から０．３３ｍｍの距離に線を描いた。この線に沿ったプロットヒストグラムをソフトウエアにより作成し、ヒストグラムを印刷し、ピーク（線を通過する新芽を示す）を計数した。この数を新芽形成指数とみなした。条件当たり４〜５輪を評価した。統計学的分析はＥｘｃｅｌのためのＷｉｎＳＴＡＴを用いて実施した。
［結果］
ＳＤＦ−１は新芽形成を誘導し、この作用はヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧでブロックできることが明らかになった。非機能的ＰＥＧ化対照シュピーゲルマーによるＳＤＦ−１誘導新芽形成のブロッキングは観察されなかった（図３１および図３２）。
［実施例１０：ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧの単回静脈内大量注射としてラットに投与されたＳＤＦ−１およびヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧの血漿中レベル］
ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧがインビボにおいて機能するかどうか試験するために、ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧを静脈内大量注射としてラットに投与し、ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧおよびＳＤＦ−１の血漿中レベルを測定した。対照として未投与ラットのＳＤＦ−１の血漿中レベルも測定した。
［動物、投与および試料採取］
ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧを０．５ｍｇ／ｍｌの終濃度となるようにＰＢＳ中に溶解し、滅菌濾過した。雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重約３００ｇ）に単回静脈内大量注射として１．０ｍｇ／ｋｇのヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧを投与した。数回の時点（図３３に示す）において血液試料を採取することによりヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧの血漿中クリアランスを追跡した。
［シュピーゲルマーの定量のためのサンドイッチハイブリダイゼーション試験］
試料中のヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧの量をサンドイッチハイブリダイゼーション試験により定量した。サンドイッチハイブリダイゼーション試験の原理は一般的に使用されているＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着試験）と極めて同様であり、シュピーゲルマーの固定化と検出である。検出はシュピーゲルマーの一端へのビオチニル化検出プローブのハイブリダイゼーションに基づく。シュピーゲルマーの残余の１本鎖の末端は固定化されたキャプチャープローブへのハイブリダイゼーション時の複合体の固定化を媒介する。未結合の複合体が除去された後、シュピーゲルマーにハイブリダイズした検出プローブは最終的にはケミルミネセンス物質を変換するストレプトアビジン／アルカリホスファターゼコンジュゲートにより検出される。そのようなサンドイッチハイブリダイゼーション試験はまたＤｒｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ｄｒｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０００）により記載される通りＲＮＡアプタマーの検出および定量にも適用した。
［ハイブリダイゼーションプレート調製］
１９３−Ｇ２−０１２キャプチャープローブ（配列番号２４０）を４℃で一晩０．５Ｍリン酸ナトリウム、１ｍのＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．５中において１００ｎＭで白色ＤＮＡ−ＢＩＮＤ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に固定化した。ウェルを２回洗浄し、２５℃で２時間０．２５Ｍリン酸ナトリウム、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５中で０．５％ｗ／ｖＢＳＡでブロックし、再度洗浄し、使用時まで室温で保存した。ハイブリダイゼーションの前に、洗浄緩衝液（３ｘＳＳＣ、０．５％［ｗ／ｖ］ナトリウムドデシルサルコシネート、ｐＨ７．０、予め、２０×保存用液［３ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸三ナトリウム］をナトリウムラウロイルサルコシンを使用せずに調製し、適宜希釈しておく）で２回洗浄した。
［試料調製］
全試料とも２回繰り返して試験した。血漿試料を氷上で解凍し、回転混合し、冷却卓上遠心分離機中で短時間遠心分離した。組織ホモジネートを室温で解凍し、最大速度および室温において５分間遠心分離した。試料を以下のスキームに従って室温でハイブリダイゼーション緩衝液（洗浄緩衝液中４０ｎＭの１９３−Ｇ２−０１２検出プローブ［配列番号２４１］）で希釈した。
１：１０ １０μｌ試料＋９０μｌハイブリダイゼーション緩衝液
１：１００ ２０μｌの１：１０＋１８０μｌハイブリダイゼーション緩衝液
全ての試料希釈物を試験した。ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧ標準物質を連続希釈することにより０．００１〜４０ｎＭ範囲にわたる１２点検量線を得た。検量線用の標準物質は試験における試料のものと同一とした。
［ハイブリダイゼーションおよび検出］
試料を５分間９５℃に加熱し、室温に冷却した。シュピーゲルマー／検出プローブ複合体を振とう器上で５００ｒｐｍにおいて２５℃で４５分間固定化されたキャプチャープローブにアニーリングさせた。未結合のシュピーゲルマーは洗浄緩衝液および１×ＴＢＳＴ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）でそれぞれ２回洗浄することにより除去した。ハイブリダイズした複合体は振とう器上で５００ｒｐｍにおいて２５℃で１時間１×ＴＢＳＴ中に１：５０００希釈したストレプトアビジンアルカリホスファターゼにより検出した。未結合のコンジュゲートを除去するために、ウェルを再度１×ＴＢＳＴで洗浄した。最後にウェルに１００ｍｌのＣＳＤＰ基質（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を充填し、２５℃で４５分間インキュベートした。ケミルミネセンスはＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で計測した。
［データ分析］
以下の試験した試料希釈物を用いて定量的データ分析を行った。
ラットＥＤＴＡ血漿 １：１００
ビヒクル群（シュピーゲルマー投与せず）から得られたデータをバックグラウンドシグナルとして差し引いた。
［シュピーゲルマーの定量のためのＥＬＩＳＡ］
血漿試料中に存在するＳＤＦ−１の量は９６ウェルプレート上にコーティングされたヒトＳＤＦ−１αに対して特異的な抗体を用いるインビトロの酵素結合免疫吸着試験により定量した（ヒトＳＤＦ−１αＥＬＩＳＡキット、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ ＧＡ，ＵＳＡ）。試験は供給元の説明書に従って実施した。
［結果］
図３３に示す通り、未投与のラットにおけるＳＤＦ−１の通常の血漿中レベルは低ピコモル範囲にある（約５０ｐＭ）。これとは対照的に、ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧを投与したラットの血漿中レベルは異なっているように観察された。ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧ投与後最初の８時間以内にＳＤＦ−１の血漿中レベルは約７００ｐＭまで上昇した。１２〜７２時間においては、ＳＤＦ−１の血漿中レベルは再度約５０ｐＭまで低下した。このようなＳＤＦ−１血漿中レベルの時間経過はヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧの血漿中レベルに直接相関する可能性がある。ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧの腎排出のため、ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧの血漿中レベルは７２時間以内に約１１００ｎＭから５０ｎＭ未満まで低下した。しかしながら、ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧ（ＭＷ約５４０００Ｄａ）は非ＰＥＧ化シュピーゲルマー（約１５０００Ｄａ）またはＳＤＦ−１のような腎濾過限界未満の分子質量を有する他の分子で観察されるように１時間以内に身体から排出されることはなかった。内因性のＳＤＦ−１はヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧにより結合されてＳＤＦ−１−シュピーゲルマー複合体を形成し、これによりＳＤＦ−１の排出および／または分解が遅延し、これは結果的に最初の８時間以内に上昇したＳＤＦ−１血漿中レベルをもたらした。経時的にヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧの排出が進行するため、ＳＤＦ−１のような遙かに小型の分子の場合よりも排出速度が遥かに緩徐となるため、ヒトＳＤＦ−１結合シュピーゲルマー１９３−Ｇ２−０１２−５’−ＰＥＧおよびＳＤＦ−１による形成された複合体の血漿中レベルは低下した（図３３）。
［先行技術文献］
本明細書で引用されている文書の全参考文献データは、それとは反対のことが示されていない場合は以下の通りであり、上記参考文献の開示は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
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明細書、特許請求の範囲および／または図面において開示した本発明の特徴は別個およびそのいずれかの組み合わせにおける双方において、本発明をその種々の形態で実現するための材料としてよい。

Claims (29)

  1. ＳＤＦ−１に結合する核酸分子であって、
    ５’→３’の方向に、ヌクレオチドの第１のストレッチ、コアヌクレオチド配列、およびヌクレオチドの第２のストレッチからなるか、またはヌクレオチドの第２のストレッチ、コアヌクレオチド配列、およびヌクレオチドの第１のストレッチからなり、
    前記核酸分子の前記ヌクレオチドがＬ−ヌクレオチドであり、
    前記核酸分子の長さが２０〜５０ヌクレオチドであり、
    前記核酸分子が、Ａ型核酸分子、Ｂ型核酸分子、Ｃ型核酸分子、ならびに配列番号１４２、配列番号１４３、および配列番号１４４のいずれかの核酸配列からなる核酸分子からなる群から選択され、
    前記Ａ型核酸分子のコアヌクレオチド配列が、下記のヌクレオチド配列：
    ５’ＡＡＡＧＹＲＡＣＡＨＧＵＭＡＡＸ Ａ ＵＧＡＡＡＧＧＵＡＲＣ３’（配列番号１９）
    （式中、Ｘ Ａ は不在またはＡである）からなり、
    前記Ａ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第１のストレッチが５’Ｘ １ Ｘ ２ ＮＮＢＶ３’（配列番号４４）のヌクレオチド配列からなり、前記Ａ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第２のストレッチが５’ＢＮＢＮＸ ３ Ｘ ４ ３’（配列番号４５）のヌクレオチド配列からなり（式中、Ｘ １ は不在もしくはＲであり、Ｘ ２ はＳであり、Ｘ ３ はＳであり、Ｘ ４ は不在もしくはＹであるか、または、Ｘ １ は不在であり、Ｘ ２ は不在もしくはＳであり、Ｘ ３ は不在もしくはＳであり、Ｘ ４ は不在である）、
    前記Ｂ型核酸分子のコアヌクレオチド配列が、下記のヌクレオチド配列：
    ５’ＧＵＧＵＧＡＵＣＵＡＧＡＵＧＵＡＤＷＧＧＣＵＧＷＵＣＣＵＡＧＵＹＡＧＧ３’（配列番号５７）からなり、
    前記Ｂ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第１のストレッチが５’Ｘ １ Ｘ ２ ＳＶＮＳ３’（配列番号７７）のヌクレオチド配列からなり、前記Ｂ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第２のストレッチが５’ＢＶＢＳＸ ３ Ｘ ４ ３’（配列番号７８）のヌクレオチド配列からなり（式中、Ｘ １ は不在もしくはＡであり、Ｘ ２ はＧであり、Ｘ ３ はＣであり、Ｘ ４ は不在もしくはＵであるか、または、Ｘ １ は不在であり、Ｘ ２ は不在もしくはＧであり、Ｘ ３ は不在もしくはＣであり、Ｘ ４ は不在である）、
    前記Ｃ型核酸分子のコアヌクレオチド配列が、ＧＧＵＹＡＧＧＧＣＵＨＲＸ Ａ ＡＧＵＣＧＧ（配列番号９０）（式中、Ｘ Ａ は不在またはＡである）のコアヌクレオチド配列からなり、
    前記Ｃ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第１のストレッチが５’ＲＫＳＢＵＳＮＶＧＲ３’（配列番号１２０）のヌクレオチド配列からなり、前記Ｃ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第２のストレッチが５’ＹＹＮＲＣＡＳＳＭＹ３’（配列番号１２１）のヌクレオチド配列からなるか、または
    前記Ｃ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第１のストレッチが５’Ｘ Ｓ ＳＳＳＶ３’（配列番号１２４）のヌクレオチド配列からなり、前記Ｃ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第２のストレッチが５’ＢＳＳＳＸ Ｓ ３’（配列番号１２５）のヌクレオチド配列からなるか（式中、Ｘ Ｓ は不在またはＳである）、または
    前記Ｃ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第１のストレッチが５’ＵＧＡＧＡＵＡＧＧ３’のヌクレオチド配列からなり、前記Ｃ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第２のストレッチが５’ＣＵＧＡＵＵＣＵＣＡ３’のヌクレオチド配列からなるか、
    前記Ｃ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第１のストレッチが５’ＧＡＧＡＵＡＧＧ３’のヌクレオチド配列からなり、前記Ｃ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第２のストレッチが５’ＣＵＧＡＵＵＣＵＣ３’のヌクレオチド配列からなる核酸分子。
  2. 前記Ａ型核酸分子の前記コアヌクレオチド配列が、
    ５’ＡＡＡＧＹＲＡＣＡＨＧＵＭＡＡＵＧＡＡＡＧＧＵＡＲＣ３’（配列番号２０）
    ５’ＡＡＡＧＹＲＡＣＡＨＧＵＭＡＡＡＵＧＡＡＡＧＧＵＡＲＣ３’（配列番号２１）、および、
    ５’ＡＡＡＧＹＡＡＣＡＨＧＵＣＡＡＵＧＡＡＡＧＧＵＡＲＣ３’（配列番号２２）
    からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 前記Ａ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第１のストレッチおよび前記ヌクレオチドの第２のストレッチが任意選択的に相互にハイブリダイズし、これによりハイブリダイゼーションのときに２本鎖構造が形成される、請求項１または２に記載の核酸分子。
  4. 前記２本鎖構造が４〜６塩基対からなる、請求項３に記載の核酸分子。
  5. 前記Ａ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第１のストレッチが５’Ｘ２ＢＢＢＳ３’（配列番号４２）のヌクレオチド配列からなり、前記Ａ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第２のストレッチが５’ＳＢＢＶＸ３３’（配列番号４３）のヌクレオチド配列からなる（式中、Ｘ２は不在またはＳであり、Ｘ３は不在またはＳである）、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子。
  6. 前記Ａ型核酸分子が配列番号５〜１８、２５〜４１、１３３、１３７、１３９〜１４１のいずれかの核酸配列からなる、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子。
  7. 前記Ｂ型核酸分子の前記コアヌクレオチド配列が、
    ５’ＧＵＧＵＧＡＵＣＵＡＧＡＵＧＵＡＤＵＧＧＣＵＧＡＵＣＣＵＡＧＵＣＡＧＧ３’（配列番号５８）からなる、請求項１に記載の核酸分子。
  8. 前記Ｂ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第１のストレッチおよび前記ヌクレオチドの第２のストレッチが任意選択的に相互にハイブリダイズし、これによりハイブリダイゼーションのときに２本鎖構造が形成される、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸分子。
  9. 前記２本鎖構造が４〜６塩基対からなる、請求項８に記載の核酸分子。
  10. 前記Ｂ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第１のストレッチが５’Ｘ２ＳＳＢＳ３’（配列番号７３）のヌクレオチド配列からなり、前記Ｂ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第２のストレッチが５’ＢＶＳＳＸ３３’（配列番号７４）のヌクレオチド配列からなる（式中、Ｘ２は不在またはＧであり、Ｘ３は不在またはＣである）、請求項１および７〜９のいずれかに記載の核酸分子。
  11. 前記Ｂ型核酸分子が配列番号４６〜５６、６１〜７２、および１３２のいずれかの核酸配列からなる、請求項１および７〜１０のいずれかに記載の核酸分子。
  12. 前記Ｃ型核酸分子の前記コアヌクレオチド配列が、
    ５’ＧＧＵＹＡＧＧＧＣＵＨＲＡＡＧＵＣＧＧ３’（配列番号９１）、
    ５’ＧＧＵＹＡＧＧＧＣＵＨＲＡＧＵＣＧＧ３’（配列番号９２）、および、
    ５’ＧＧＵＵＡＧＧＧＣＵＨＧＡＡＧＵＣＧＧ３’（配列番号９３）
    からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
  13. 前記Ｃ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第１のストレッチの少なくとも一部分および前記ヌクレオチドの第２のストレッチの少なくとも一部分が任意選択的に相互にハイブリダイズし、これによりハイブリダイゼーションのときに２本鎖構造が形成される、請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸分子。
  14. 前記２本鎖構造が、４〜１０塩基対、または４〜６塩基対、または５塩基対を含む、請求項１３に記載の核酸分子。
  15. 前記Ｃ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第１のストレッチが５’ＳＳＳＳＲ３’（配列番号１３０）のヌクレオチド配列からなり、前記Ｃ型核酸分子の前記ヌクレオチドの第２のストレッチが５’ＹＳＢＳＳ３’（配列番号１３１）のヌクレオチド配列からなる、請求項１および１２〜１４のいずれかに記載の核酸分子。
  16. 前記Ｃ型核酸分子が配列番号７９〜８９、９４〜１１９、および１３４〜１３６のいずれかの核酸配列からなる、請求項１および１２〜１５のいずれかに記載の核酸分子。
  17. 前記核酸分子の前記核酸配列が配列番号１４２〜１４４からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
  18. 前記核酸分子がＳＤＦ−１に対するアンタゴニストであるか、または前記核酸分子がＳＤＦ−１受容体系のアンタゴニストである、請求項１〜１７のいずれかに記載の核酸分子。
  19. 前記ＳＤＦ−１がヒトＳＤＦ−１である、請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸分子。
  20. 前記核酸分子が修飾を含み、該修飾がＨＥＳ部分およびＰＥＧ部分を含む群から選択される、請求項１〜１９のいずれかに記載の核酸分子。
  21. 疾患の治療方法における使用のための請求項１〜２０のいずれかに記載の核酸。
  22. 請求項１〜２１のいずれかに記載の核酸と任意選択的にさらなる構成成分とからなる医薬組成物であって、前記構成成分が、薬学的に許容可能な賦形剤と薬学的活性剤とからなる群から選択される医薬組成物。
  23. 薬物の製造のための請求項１〜２１のいずれかに記載の核酸の使用。
  24. 前記薬物が疾患または障害の治療および／または予防のためのものであり、該疾患または障害がＳＤＦ−１により媒介される、請求項２３に記載の使用。
  25. 診断手段の製造のための請求項１〜２１のいずれかに記載の核酸の使用。
  26. 前記診断手段が疾患の診断のためのものであり、該疾患がＳＤＦ−１により媒介される、請求項２５に記載の使用。
  27. ＳＤＦ−１と、請求項１〜２１のいずれかに記載の核酸とからなる複合体。
  28. 試料中のＳＤＦ−１の検出のための請求項１〜２１のいずれかに記載の核酸のインビトロでの使用。
  29. 請求項１〜２１のいずれかに記載の核酸を含むＳＤＦ−１の検出のためのキット。
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