BRPI0714844B1 - Molécula de ácido nucleico e seus usos, composição farmaceutica e complexo - Google Patents

Abstract

molécula de ácido nucleico e seus usos, composição farmaceutica e complexo a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico, preferencialmente ligando a sdf-1, selecionada entre o grupo compreendendo moléculas de ácido nucleico tipo a, moléculas de ácido nucleico tipo b, moléculas de ácido nucleico tipo c e moléculas de ácido nucleico tendo uma sequência de ácido nucleico de acordo com qualquer de seq. id. nº 142, seq. id. nº 143 e seq. id. nº 144.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO E SEUS USOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E COMPLEXO.

[001] A presente invenção refere-se a ácidos nucleicos ligando ao fator 1 derivado de células estromais de quimiocina CXC (SDF-1), e seu uso na fabricação de um medicamento, e seu uso na fabricação de um agente de diagnóstico.

[002] As quimiocinas são uma família de pequenas proteínas básicas de ligação de heparina, estruturalmente relacionadas, de 8 a 14 kDa. Funcionalmente, podem ser classificadas como próinflamatórias, homeostáticas, ou de dupla função (Moser, Wolf et al. 2004). Quimiocinas inflamatórias são induzidas por patógenos, citocinas, ou fatores de crescimento e recrutam leucócitos efetores para sítios de infecção, inflamação, lesão tecidual, e tumor. As quimiocinas referidas regulam o recrutamento, ativação, e proliferação de células brancas (leucócitos) (Schall and Bacon 1994; Springer 1995; Baggiolini 1998). Quimiocinas induzem seletivamente quimiotaxia de neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos, macrófagos, mastócitos, células T e células B. Além de seu efeito quimotático, podem exercer seletivamente ourtos efeitos em células responsivas como alterações no formato celular, aumento transitório na concentração de íons de cálcio intracelular livre, desgranulação, regulação para cima de integrinas, formação de lipídeos bioativos (leucotrienos, prostaglandinas, tromboxanos), ou explosão respiratória (liberação de espécies de oxigênio reativo para destruição de organismos patogênicos ou células tumorais). Portanto, provocando a liberação de mediadores pró-inflamatórios adicionais, quimiotaxia e extravasamento de leucócitos em direção a sítios de infecção ou inflamação, quimiocinas disparam aumento progressivo da reação inflamatória. Quimiocinas homeostáticas, por outro lado, são

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2/151 expressadas predominantemente na medula óssea e nos tecidos linfoides e estão envolvidas na hematopoiese, vigilância imune, e reações imunes adaptivas (Godessart 2005).

[003] Com base na disposição dos primeiros dois de quatro resíduos cisteína conservados, as quimiocinas são divididas em quatro classes: CC ou β-quimiocinas (por exemplo,) nas quais as cisteínas estão em tandem, CXC ou α-quimiocinas, onde são separadas por um resíduo aminoácido adicional, XC ou γ quimiocinas (linfotactina/XCL1 como único representante até o momento) que possuem somente uma ponte dissulfeto, e CX3C-quimiocinas as quais caracterizam três resíduos aminoácido entre as cisteínas (fractalcina ligada a membrana como único membro da classe; (Bazan, Bacon et al. 1997)).

[004] As quimiocinas CXC agem essencialmente sobre neutrófilos, em particular as quimiocinas CXC que carregam a sequência de aminoácido ELR sobre seu término amino. Exemplos de quimiocinas CXC que são ativas sobre neutrófilos são IL-8/CXCL8, GROa/CXCL1, GROe/CXCL2, e GROy/CXCL3, NAP-2/CXCL7, ENA78/CXCL5, SDF-1/CXCL12 e GCP-2/CXCL6. As quimiocinas CC agem sobre uma maior variedade de leucócitos, tais como monócitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, bem como linfócitos T e B (Oppenheim, Zachariae et al. 1991; Miller and Krangel 1992; Baggiolini, Dewald et al. 1994; Jose, Griffiths-Johnson et al. 1994; Ponath, Qin et al. 1996). Exemplos destas são I-309/CCL1; MCP1/CCL2, MCP-2/CCL8, MCP-3/CCL7, MCP-4/CCL13, MIP-1a/CCL3 e MIP-1e/CCL4, RANTES/CCL5, e eotaxina/CCL11.

[005] Quimiocinas agem através de receptores que pertemcem a uma superfamília de sete receptores acoplados a proteína G de transposição transmembrana (GPCRs; (Murphy, Baggiolini et al. 2000)). Falando de modo geral, interações de receptores de quimiocina e quimiocina tendem a ser promíscuas em que uma

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3/151 quimiocina pode ligar muitos receptores de quimiocina e de modo oposto um único receptor de quimiocina pode interagir com várias quimiocinas. Alguns receptores conhecidos para as quimiocinas CXC incluem CXCR1, o qual liga GROa, GCP-2, e IL-8; CXCR2, o qual liga quimiocinas incluindo GROa, GROp, GROy, ENA-78, e IL-8; CXCR3, o qual liga quimiocinas incluindo PF4, MIG, IP-10, e I-TAC; CXCR4 o qual até o momento foi visto que somente sinaliza em reação a SDF-1, e CXCR5, o qual foi demonstrado que sinaliza em reação a BCA-1 (Godessart 2005).

[006] SDF-1 (fator derivado de células estromais-1; sinônimos,

CXCL12; PBSF [fator estimulador do crescimento células pré-B]; TPAR-1 [gene TPA reprimido 1]; SCYB12; TLSF [fator estimulador de células de linfoma tímico]; hIRH [intércrino humano reduzido em hepatomas]) é uma quimiocina CXC angiogênica que não contém o motivo ELR típico das quimiocinas semelhantes a IL-8 (Salcedo, Wasserman et al. 1999; Salcedo and Oppenheim 2003) que liga e ativa o receptor CXCR4 acoplado à proteína G. A quimiocina foi descoberta por três grupos independentemente, ou por clonagem de cDNAs que carregam sequências de sinal de N-terminal (Tashiro, Tada et al. 1993), em virtude de sua capacidade para estimular progenitores de células B iniciais quando expressados pela linhagem de células estromais PA6 (Nagasawa, Kikutani et al. 1994), ou por isolamento de uma biblioteca de cDNA construída a partir de fibroblastos de embrião de camundongo tratados com o ativador de proteína quinase C- tetra dodecanoil forbol acetato (TPA) (Jiang, Zhou et al. 1994).

[007] Em consequência de junção alternativa, há duas formas de SDF-1, SDF-1 α (68 AA) e SDF-1 β, as quais carregam quatro resíduos adicionais no C-término (Shirozu, Nakano et al. 1995). A importância biológica destas duas variantes de junção não é completamente

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4/151 entendida.

[008] A conservação de sequência entre SDF-1 de diferentes espécies é notável: SDF-1 α humano (SEQ.ID. 1) e SDF-1 α murino (SEQ.ID. 2) são virtualmente idênticos. Há uma única uma alteração conservativa única de V para I na posição 18 (Shirozu, Nakano et al. 1995). Outra característica incomum que distingue SDF-1 da maioria das outras quimiocinas é sua seletividade. De fato, SDF-1 e o receptor CXCR4 parecem compreender um par de receptor-ligante monógamo. [009] Existe um modelo de estrutura de RMN (acesso de PDB, 1SDF) para SDF-1 [8-68]. Foi visto que SDF-1 é um monômero com uma região de N-terminal desordenada. Foram encontradas diferenças com outras quimiocinas principalmente no tamponamento do núcleo hidrofóbico e na distribuição de carga superficial (Crump, Gong et al. 1997).

[0010] Atividades fisiológicas de SDF-1: Como o receptor de SDF1 CXCR4 é amplamente expressado sobre leucócitos, células dendríticas maduras, células endoteliais, células cerebrais, e megacariócitos, as atividades de SDF-1 são pleiotrópicas. Esta quimiocina, mais do que qualquer outra identificada até o momento, apresenta a faixa mais ampla de funções biológicas, especialmente fora do sistema imune. Os efeitos funcionais mais significativos de SDF-1 são:

[0011] Homing e fixação de células epiteliais a sítios neovasculares na porção coroide da retina. Foi demonstrado que SDF1 está envolvido em homing de células epiteliais para a coroide durante neovascularização em tecido dos olhos. O papel exato destas células ainda está sob investigação, mas a hipótese publicada é que células epiteliais estão envolvidas na formação de vasos sanguíneos aberrantes (Sengupta, Caballero et al. 2005).

[0012] Hematopoiese. SDF-1 é necessário para manter células

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5/151 progenitoras hematopoiéticas (CD34+) na medula óssea do adulto. AMD3100, um antagonista de CXCR4 seletivo, pode ser usado para mobilizar células CD34+ para transplantação de células-tronco hematopoiéticas. Células CD34+ migram in vitro e in vivo em direção a um gradiente de SDF-1 produzido por células estromais (Aiuti, Webb et al. 1997).

[0013] Desenvolvimento e quimiotaxia de células B. SDF-1 suporta proliferação de células pré-B e aumenta o crescimento de progenitores de células B da medula óssea (Nagasawa, Kikutani et al. 1994); induz migração específica de células pré- e pré-B, enquanto não agindo como um quimioatrator significativo para células B maduras (D'Apuzzo, Rolink et al. 1997; Bleul, Schultze et al. 1998). Presumivelmente, SDF1 é importante para o posicionamento de células B dentro de tecido linfoide secundário.

[0014] Quimiotaxia de células T. SDF-1 é um dos quimioatratores de células T mais eficazes; CXCR4 está presente em muitos subgrupos de células T (Bleul, Farzan et al. 1996).

[0015] Desenvolvimento embrionário. SDF-1 e seu receptor CXCR4 são essenciais para o desenvolvimento embrionário. Camundongos de nocaute SDF-1 e CXCR4 morrem perinatalmente; eles apresentam defeitos do septo ventricular cardíaco ou desenvolvimento cerebelar anormal além de números reduzidos de progenitores mieloides e de células B (Nagasawa, Hirota et al. 1996; Ma, Jones et al. 1998; Zou, Kottmann et al. 1998). SDF-1 também é necessário para ontogenia normal do desenvolvimento sanguíneo durante a embriogênese (Juarez and Bendall 2004).

[0016] Infecção por HIV. SDF-1 tem capacidade de inibir a entrada de HIV-1 T-trópico em linhagens celulares portando CXCR4, e a expressão de SDF-1 pode ter um importante comportamento sobre a patogênese da AIDS, uma vez que um polimorfismo no gene de SDF-1

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6/151 humano afeta o surto de AIDS (Bleul, Farzan et al. 1996).

[0017] Níveis de expressão alterados de SDF-1 ou seu receptor CXCR4 ou reações alteradas em direção a estas moléculas estão associadas com muitas doenças humanas, tais como retinopatia (Brooks, Caballero et al. 2004; Butler, Guthrie et al. 2005; Meleth, Agron et al. 2005); câncer de mama (Muller, Homey et al. 2001; Cabioglu, Sahin et al. 2005), ovários (Scotton, Wilson et al. 2002), pâncreas (Koshiba, Hosotani et al. 2000), tiroide (Hwang, Chung et al. 2003), nasofaringe (Wang, Wu et al. 2005); glioma (Zhou, Larsen et al.

2002) ; neuroblastoma (Geminder, Sagi-Assif et al. 2001); leucemia linfocítica crônica de células B (Burger, Tsukada et al. 2000); síndrome de WHIM (verrugas, hipogamaglobulinemia, infecções, mielocatexia) (Gulino, Moratto et al. 2004; Balabanian, Lagane et al. 2005; Kawai, Choi et al. 2005); síndromes de deficiência imunológica (Arya, Ginsberg et al. 1999; Marechal, Arenzana-Seisdedos et al. 1999; Soriano, Martinez et al. 2002); neovascularização patológica (Salvucci, Yao et al. 2002; Yamaguchi, Kusano et al. 2003; Grunewald, Avraham et al. 2006); inflamação (Murdoch 2000; Fedyk, Jones et al. 2001; Wang, Guan et al. 2001); esclerose múltipla (Krumbholz, Theil et al. 2006); artrite reumatoide / osteoartrite (Buckley, Amft et al. 2000; Kanbe, Takagishi et al. 2002; Grassi, Cristino et al. 2004).

[0018] Em situações de animais experimentais, antagonistas de SDF-1 ou seu receptor se comprovaram eficientes para bloqueio do crescimento e/ou disseminação metastática de células de câncer humano de diferentes origens tais como pâncreas (Guleng, Tateishi et al. 2005; Saur, Seidler et al. 2005), cólon (Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al. 2003; Guleng, Tateishi et al. 2005), mama (Muller, Homey et al. 2001; Lapteva, Yang et al. 2005), pulmão (Phillips, Burdick et al.

2003) , glioblastoma / meduloblastoma (Rubin, Kung et al. 2003), próstata (Sun, Schneider et al. 2005), osteossarcoma (Perissinotto,

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Cavalloni et al. 2005), melanoma (Takenaga, Tamamura et al. 2004), estômago (Yasumoto, Koizumi et al. 2006), mieloma múltiplo (Menu, Asosingh et al. 2006).

[0019] Além disso, terapia anti-SDF-1 foi benéfica em modelos animais para prevenir neovascularização retinal (Butler, Guthrie et al. 2005), nefrite (Balabanian, Couderc et al. 2003) e artrite (Matthys, Hatse et al. 2001; Tamamura, Fujisawa et al. 2004; De Klerck, Geboes et al. 2005).

[0020] SDF-1 é um agente na patologia de doenças do fundo de olho tais como retinopatia diabética (DR) (Fong, Aiello et al. 2004) e degeneração macular relacionada com a idade (AMD) (Ambati, Anand et al. 2003). Ambas estas doenças danificam o olho e levam a perda gradual da visão culminando em cegueira. A lesão ocorre devido ao crescimento inadequado de vasos sanguíneos no fundo do olho, um processo conhecido como neovascularização coroidal (CNV). Durante a neovascularização coroidal, novos vasos sanguíneos que se originam da coroide migram através de um rompimento na membrana de Bruch para dentro do epitélio do pigmento sub-retinal (sub-RPE) ou espaço subretinal. Os vasos anormais podem sangrar (hemorragia intrarretinal) ou vazar fluido sobre a retina. Isto pode deixar cicatrizes e pode elevar a mácula, o que distorce a visão.

[0021] Imagina-se que o SDF-1 tenha um papel na neovascularização coroidal através do recrutamento de células precursoras endoteliais (EPCs) para o olho. Estas células precursoras então se tornam componentes estruturais-chaves nos vasos sanguíneos aberrantes.

[0022] Retinopatia diabética é uma sequela importante do diabetes, ocorrendo frequentemente em pacientes tanto com diabetes tipo 1 quanto com tipo 2. Há aproximadamente 16 milhões de diabéticos nos Estados Unidos, com quase 8 milhões tendo alguma

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8/151 forma de retinopatia diabética. Quando a retinopatia diabética proliferativa (PDR) é deixada sem tratamento, cerca de 60% dos pacientes se tornam cegos em um ou ambos os olhos dentro de 5 anos. Com o aumento alarmante na prevalência de diabetes na América do Norte, Europa e muitos países emergentes, a população de pacientes está crescendo rapidamente. Por exemplo, a incidência de cegueira é 25 vezes maior em pacientes com diabetes do que na população geral. Além disso, a retinopatia diabética (DR) é a causa mais comum de cegueira em indivíduos da meia idade, sendo responsável por no mínimo 12 porcento de todos os novos casos nos Estados Unidos a cada ano. Programas de triagem estão sendo realizados de modo que a visão de pacientes com diabetes possa ser monitorada e que o tratamento possa ser liberado em tempo, tal como está disponível.

[0023] As causas diretas de retinopatia diabética são parcamente entendidas, mas imagina-se que a doença tenha suas origens em uma combinação de fontes: autorregulação prejudicada do fluxo sanguíneo da retina; acumulação de sorbitol dentro das células da retina; e acumulação de produtos finais de glicosilação avançada no fluido extracelular. Todos estes fatores estão relacionados diretamente ou indiretamente com hiperglicemia, a abundância de açúcar na corrente sanguínea.

[0024] Os sintomas de retinopatia diabética são similares aos da degeneração macular relacionada com a idade. Os pacientes perdem células na retina e ocorrem microaneurismas (escoamentos de sangue) na membrana de base da retina. Além disso, VEGF, IGF-1 e outros fatores transportados pelo sangue, possivelmente incluindo SDF-1, atraem novas células vasculares e estimulam a formação de vasos sanguíneos prejudiciais.

[0025] Degeneração macular relacionada com a idade (AMD)

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9/151 destrói a visão central de uma pessoa. Os estágios iniciais da doença podem mesmo não ser dignos de nota, porque os sintomas variam entre os pacientes. Algumas vezes um paciente é afetado somente em um olho. Ou a visão pode ser prejudicada em ambos os olhos mas não significativamente. A doença causa distorção ou percepção defeituosa das cores. Frequentemente há um ponto escuro no centro do campo visual.

[0026] A etiologia (curso) da doença é parcamente compreendida. Frequentemente a degeneração macular relacionada com a idade é considerada como o envelhecimento da camada mais externa da retina. As alterações físicas ocorrem no centro da retina, também conhecida como a mácula, a qual é a parte da retina responsável pela visão mais aguda.

[0027] Degeneração macular relacionada com a idade úmida se inicia como uma sequela para a forma seca da doença. Uns 90% dos pacientes sofrem da forma seca de degeneração macular relacionada com a idade, o que resulta no adelgaçamento de tecidos maculares e distúrbios em sua pigmentação. O resto tem a forma úmida, a qual envolve a hemorragia descrita acima.

[0028] A forma úmida de degeneração macular relacionada com a idade representa um mercado ideal para um novo terapêutico: já a causa mais comum de cegueira em pessoas acima da idade de 55, a degeneração macular relacionada com a idade afeta uma estimativa de 4% a 5% da população dos Estados Unidos com idades de 65 a 74 e quase 10% daqueles com 75 anos de idade ou mais. Já há 5 milhões de pessoas nos Estados Unidos somente acima da idade de 80 que têm esta doença e espera-se que outros 5 milhões de pessoas sejam afetadas por volta de 2020.

[0029] Tumores não são somente massas de células cancerígenas: infiltração de tumores com células imunes é uma

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10/151 característica do câncer. Muitos cânceres humanos têm uma rede complexa de quimiocina que influencia a extensão e o fenótipo deste infiltrado, bem como crescimento, sobrevida e migração tumorais, e angiogênese. A maior parte dos tumores sólidos contém muitas células estromais não-malignas. Na verdade, as células estromais algumas vezes superam em número as células cancerígenas. As células estromais predominantes que são encontradas em cânceres são macrófagos, linfócitos, células endoteliais e fibroblastos.

[0030] Células malignas de diferentes tipos de câncer têm diferentes perfis de expressão de receptor de quimiocina, mas o receptor de SDF-1 CXCR4 é o mais comumente encontrado em camundongo e no homem: células tumorais de no mínimo 23 tipos diferentes de cânceres humanos de origem epitelial, mesenquimal, e hematopoiética expressam CXCR4 (Balkwill 2004). SDF-1 é o único ligante conhecido para CXCR4. À parte da medula óssea e de tecido linfoide secundário, onde é expressado constitutivamente, SDF-1 é encontrado em sítios tumorais primários em linfoma (Corcione, Ottonello et al. 2000) e tumores cerebrais tanto de linhagem neuronal quanto astrocítica. Além disso, está presente em algos níveis em câncer de ovário (Scotton, Wilson et al. 2002) e câncer pancreático (Koshiba, Hosotani et al. 2000) bem como em sítios de metástase em câncer de mama (Muller, Homey et al. 2001) e da tiroide (Hwang, Chung et al. 2003), neuroblastoma e malignidades hematológicas (Geminder, Sagi-Assif et al. 2001). Em contraste, a expressão de CXCR4 é baixa ou está ausente sobre epitélios normais de mama (Muller, Homey et al. 2001), de ovário (Scotton, Wilson et al. 2002) e de próstata (Sun, Schneider et al. 2005). A expressão de CXCR4, portanto, parece ser uma característica geral da célula epitelial maligna e não seu complemento normal.

[0031] Inibição da sinalização de receptor de quimiocina sobre

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11/151 células tumorais tem o potencial de induzir parada do crescimento ou apoptose, e evitar invasão e metástase in vivo:

[0032] Knockdown de CXCR4 por siRNA anulou o crescimento de tumor de mama (Lapteva, Yang et al. 2005); células de hibridoma T as quais foram transfectadas com um constructo que previne a expressão superficial de CXCR4 não podem mais metastizar para órgãos distantes quando injetadas por via intravenosa em camundongos (Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al. 2001); em experimentos similares com células de câncer colorretal, metástases de pulmão e de fígado foram muito reduzidas (Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al. 2003); anticorpos anti-CXCR4 inibiram a disseminação de xenoenxertos de câncer de mama para os linfonodos (Muller, Homey et al. 2001); tratamento de células linfoblastoides com anticorpos anti-CXCR4 ou anti-SDF-1 retardou o crescimento tumoral em camundongos (NOD)/SCID (Bertolini, Dell'Agnola et al. 2002); anticorpos anti-SDF-1 inibiram o desenvolvimento de metástases de órgãos de células de câncer pulmonar de células não pequenas (NSCLC) (Phillips, Burdick et al. 2003); administração sistêmica do CXCR4 antagonista AMD3100 (AnorMED) inibiu o crescimento de glioblastoma intracranial e xenoenxertos de meduloblastoma, e aumento de apoptose de células tumorais dentro de 24 horas (Rubin, Kung et al. 2003); anticorpos antiSDF-1 inibiram o crescimento de células de câncer de mama MCF-7 misturadas com fibroblastos associados a carcinoma (Orimo, Gupta et al. 2005); neutralização de CXCR4 com anticorpos bloqueou metástase de câncer de próstata e crescimento em sítios ósseos (Sun, Schneider et al. 2005); desenvolvimento de metástase pulmonar depois de injeção de células de osteossarcoma foi evitado por administração do CXCR4 antagonista peptídico T134 (Perissinotto, Cavalloni et al. 2005).

[0033] Diferentes autores chegam à conclusão de que tendo por

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12/151 alvo o eixo SDF-1 / CXCR4 pode proporcionar novas opções terapêuticas para pacientes com câncer:

[0034] Tumores de ovário humano expressam fortemente SDF-1 mais, em um menor nível, VEGF. Ambas as proteínas são disparadsa por hipoxia no tumor. Concentrações patológicas de quaisquer das proteínas somente não foram suficientes para induzir angiogênese in vivo, mas juntos, SDF-1 e VEGF em concentrações patológicas induziram de modo eficaz e sinergicamente neovascularização. Portanto, interromper este eixo sinérgico, ao invés de VEGF somente, pode ser uma nova estratégia antiangiogênese eficaz para tratar câncer (Kryczek, Lange et al. 2005);

[0035] Linhagens de células de câncer de mama, quando equipadas com o caminho de sinalização SDF-1 / CXCR4 autócrino, apresentam comportamento agressivo. Isto inclui um aumento na invasividade e migração junto com crescimento mais rápido. O eixo SDF-1/CXCR4 pode, portanto, proporcionar importante informação para prognosticar a natureza agressiva e constituir importantes alvos terapêuticos em câncer de mama humano (Kang, Watkins et al. 2005); [0036] A migração e a metástase de células de câncer pulmonar de células pequenas (SCLC) - as quais expressam altos níveis de CXCR4 - são reguladas pelo SDF-1. A ativação de CXCR4 promove adesão a células acessórias (tais como células estromais) e moléculas da matriz extracelular dentro do microambiente tumoral. Estas interações adesivas resultam em uma aumentada resistência de células de câncer pulmonar de células pequenas a quimioterapia. Deste modo, inibidores do eixo SDF-1 / CXCR4 podem aumentar a quimossensibilidade de células de câncer pulmonar de células pequenas e levar a novos caminhos terapêuticos para pacientes com câncer pulmonar de células pequenas (Hartmann, Burger et al. 2004);

[0037] O eixo SDF-1 / CXCR4 surge como um regulador pivotal do

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13/151 tráfico de vários tipos de células-tronco no corpo. Como a maioria caso não todas as malignidades se originam no compartimento de célulastronco / células progenitoras, as células-tronco cancerígenas também expressam CXCR4 sobre sua superfície e, em consequência, o eixo SDF-1 / CXCR4 está envolvido em direcionar seu tráfico / sua metástase para órgãos que expressam SDF-1 (por exemplo, linfonodos, pulmões, fígado, ossos). Em consequência, estratégias tendo por alvo a modulação do eixo SDF-1 / CXCR4 pode ter importantes aplicações clínicas tanto em medicina regenerativa para liberar células-tronco normais para os tecidos quanto em oncologia clínica para inibir metástase de células-tronco cancerígenas (Kucia, Reca et al. 2005).

[0038] O problema básico da presente invenção é proporcionar um antagonista específico para SDF-1. Um aspecto adicional do problema básico da presente invenção é proporcionar um composto para o tratamento de doenças e distúrbios envolvendo SDF-1 e o CXCR4 receptor, respectivamente.

[0039] Um outro problema básico da presente invenção é proporcionar métodos para a detecção específica de SDF-1.

[0040] O problema básico da presente invenção é resolvido pelo tema das reivindicações independentes. Modalidades preferenciais podem ser tiradas das reivindicações dependentes.

[0041] Em um primeiro aspecto o problema básico da presente invenção é resolvido por uma molécula de ácido nucleico, preferencialmente ligando a SDF-1, selecionada entre o grupo compreendendo moléculas de ácido nucleico tipo A, moléculas de ácido nucleico tipo B, moléculas de ácido nucleico tipo C e moléculas de ácido nucleico tendo uma sequência de ácido nucleico de acordo com qualquer de SEQ. ID. N° 142, SEQ. ID. N° 143 e SEQ. ID. N° 144. [0042] Em uma modalidade as moléculas de ácido nucleico tipo A

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14/151 compreendem a seguinte sequência de nucleotídeos de núcleo:

5' AAAGYRACAHGUMAAXaUGAAAGGUARC 3' (SEQ.ID.

19) por meio da qual XA ou está ausente ou é A.

Em uma modalidade preferencial as moléculas de ácido nucleico tipo A compreendem uma sequência de nucleotídeos de núcleo selecionada entre o grupo compreendendo

5' AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ. ID. N°

20) ,

5' AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ. ID. N° 21), e

5' AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ. ID. N° 22), preferencialmente a sequência de nucleotídeos de núcleo compreende 5' AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ. ID. N° 22).

[0043] Em uma modalidade a molécula de ácido nucleico compreende na direção 5'->3' um primeiro trecho de nucleotídeos, a sequência de nucleotídeos de núcleo, e um segundo trecho de nucleotídeos.

[0044] Em uma modalidade a molécula de ácido nucleico compreende na direção 5'->3' um segundo trecho de nucleotídeos, a sequência de nucleotídeos de núcleo, e um primeiro trecho de nucleotídeos.

[0045] Em uma modalidade preferencial a molécula de ácido nucleico compreende o primeiro e o segundo trecho de nucleotídeos e o referido primeiro e o referido segundo trecho de nucleotídeos opcionalmente hibridizam um com o outro, por meio da qual na hibridização se forma uma estrutura de filamento duplo.

[0046] Em uma modalidade preferencial adicional a estrutura de filamento duplo consiste em quatro a seis pares de bases,

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15/151 preferencialmente cinco pares de bases.

[0047] Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' X1X2NNBV 3' (SEQ. ID. N° 44) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' BNBNX3X4 3' (SEQ. ID. N° 45) por meio da qual X1 ou está ausente ou R, X2 é S, X3 é S e X4 ou está ausente ou Y;

ou

X1 está ausente, X2 ou está ausente ou é S, X3 ou está ausente ou é S e X4 está ausente.

[0048] Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' RSHRYR 3' (SEQ. ID. N° 23) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' YRYDSY 3'(SEQ. ID. N° 24), preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' GCUGUG 3' e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' CGCAGC 3'.

[0049] Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' X2BBBS 3' (SEQ. ID. N° 42) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' SBBVX3 3' (SEQ. ID. N° 43), por meio da qual X2 ou está ausente ou é S e X3 ou está ausente ou é S;

preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' CUGUG 3' e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' CGCAG 3';

ou o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' GCGUG 3' e o segundo trecho de

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16/151 nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' CGCGC 3'.

[0050] Em uma modalidade a molécula de ácido nucleico tem uma sequência de ácido nucleico de acordo com quaisquer das SEQ. ID. Nos. 5 a 18, 25 a 41, 133, 137, 139 a 141.

[0051] Em uma modalidade as moléculas de ácido nucleico tipo B compreendem a seguinte sequência de nucleotídeos de núcleo:

5'

GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3' (SEQ. ID. N° 57).

[0052] Em uma modalidade preferencial as moléculas de ácido nucleico tipo B compreendem uma sequência de nucleotídeos de núcleo de GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG (SEQ. ID. N° 58):

[0053] Em uma modalidade a molécula de ácido nucleico compreende na direção 5'->3' um primeiro trecho de nucleotídeos, a sequência de nucleotídeos de núcleo, e um segundo trecho de nucleotídeos.

[0054] Em uma modalidade a molécula de ácido nucleico compreende na direção 5'->3' um segundo trecho de nucleotídeos, a sequência de nucleotídeos de núcleo, e um primeiro trecho de nucleotídeos [0055] Em uma modalidade preferencial a molécula de ácido nucleico compreende o primeiro e o segundo trecho de nucleotídeos e o referido primeiro e o referido segundo trecho de nucleotídeos opcionalmente hibridizam um com o outro, por meio da qual na hibridização se forma uma estrutura de filamento duplo.

[0056] Em uma modalidade a estrutura de filamento duplo consiste em quatro a seis pares de bases, preferencialmente cinco pares de bases.

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17/151 [0057] Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' X1X2SVNS 3' (SEQ. ID. N° 77) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' BVBSX3X4 3' (SEQ. ID. N° 78), por meio da qual

X1 ou está ausente ou é A, X2 é G, X3 é C e X4 ou está ausente ou é U;

ou

X1 está ausente, X2 ou está ausente ou é G, X3 ou está ausente ou é C e X4 está ausente.

[0058] Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' X1GCRWG 3' (SEQ. ID. N° 59) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' KRYSCX4 3'(SEQ. ID. N° 60), por meio da qual X1 ou está ausente ou é A, e X4 ou está ausente ou é U.

[0059] Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' X1GCGUG 3' (SEQ. ID. N° 75) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' UACGCX4 3' (SEQ. ID. N° 76), por meio da qual X1 ou está ausente ou é A, e X4 ou está ausente ou é U, preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' AGCGUG 3' e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' UACGCU 3'.

[0060] Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' X2SSBS 3' (SEQ. ID. N° 73) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' BVSSX3 3' (SEQ. ID. N° 74),

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18/151 por meio da qual X2 ou está ausente ou G, e X3 ou está ausente ou C, preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' GCGUG 3' e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' UACGC 3'.

[0061] Em uma modalidade a molécula de ácido nucleico tem uma sequência de ácido nucleico de acordo com quaisquer das SEQ. ID. Nos. 46 a 56, 61 a 72, 132.

[0062] Em uma modalidade as moléculas de ácido nucleico tipo C compreendem uma sequência de nucleotídeos de núcleo de GGUYAGGGCUHRXaAGUCGG (SEQ. ID. N° 90), por meio da qual Xa ou está ausente ou é A.

[0063] Em uma modalidade preferencial as moléculas de ácido nucleico tipo C compreendem uma sequência de nucleotídeos de núcleo selecionada entre o grupo compreendendo

5' GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3' (SEQ. ID. N° 91),

5' GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3' (SEQ. ID. N° 92), e

5' GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ. ID. N° 93), preferencialmente a sequência de nucleotídeos de núcleo compreende 5' GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ. ID. N° 93).

[0064] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende na direção 5'->3' um primeiro trecho de nucleotídeos, a sequência de nucleotídeos de núcleo, e um segundo trecho de nucleotídeos.

[0065] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende na direção 5'->3' um segundo trecho de nucleotídeos, a sequência de nucleotídeos de núcleo, e um primeiro trecho de nucleotídeos.

[0066] Em uma modalidade preferencial, a molécula de ácido

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19/151 nucleico compreende o primeiro e o segundo trecho de nucleotídeos e por meio da qual no mínimo uma parte do referido primeiro trecho e no mínimo uma parte do referido segundo trecho de nucleotídeos opcionalmente hibridizam um com o outro, por meio da qual na hibridização se forma uma estrutura de filamento duplo.

[0067] Em uma modalidade, a extensão do primeiro trecho e a extensão do segundo trecho é individualmente e independentemente 0 a 17 nucleotídeos, preferencialmente 4 a 10 nucleotídeos e mais preferencialmente 4 a 6 nucleotídeos.

[0068] Em uma modalidade, a estrutura de filamento duplo compreende 4 a 10 pares de bases, preferencialmente 4 a 6 pares de bases, mais preferencialmente 5 pares de bases.

[0069] Em uma modalidade preferencial a estrutura de filamento duplo compreende 4 a 10 pares de bases consecutivos, preferencialmente 4 a 6 pares de bases consecutivos, mais preferencialmente 5 pares de bases consecutivos.

[0070] Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' RKSBUSNVGR 3' (SEQ. ID. N° 120) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' YYNRCASSMY 3' (SEQ. ID. N° 121), preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' RKSBUGSVGR 3' (SEQ. ID. N° 122) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' YCNRCASSMY 3' (SEQ. ID. N° 123).

[0071] Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' XsSSSV 3' (SEQ. ID. N° 124) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' BSSSXs 3' (SEQ. ID. N° 125), por

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20/151 meio da qual Xs ou está ausente ou é S.

[0072] Em uma modalidade, o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' SSSSR 3' (SEQ. ID. N° 130) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' YSBSS 3' (SEQ. ID. N° 131), preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' SGGSR 3' (SEQ. ID. N° 126) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' YSCCS 3' (SEQ. ID. N° 127).

[0073] Em uma modalidade, o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' GCSGG 3' (SEQ. ID. N° 128) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' CCKGC 3' (SEQ. ID. N° 129), preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' GCCGG 3' e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' CCGGC 3'.

[0074] Em uma modalidade, o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' CGUGCGCUUGAGAUAGG 3' e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' CUGAUUCUCACG 3'.

[0075] Em uma modalidade, o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' UGAGAUAGG 3' e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' CUGAUUCUCA 3'.

[0076] Em uma modalidade, o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' GAGAUAGG 3' e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5' CUGAUUCUC 3'.

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21/151 [0077] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico tem uma sequência de ácido nucleico de acordo com quaisquer das SEQ. ID. Nos. 79 a 89, 94 a 119, 134 a 136.

[0078] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico tem uma sequência de ácido nucleico de acordo com quaisquer das SEQ. ID. Nos. 142 a 144.

[0079] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico é um antagonista para SDF-1.

[0080] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico é um antagonista do sistema receptor de SDF-1, preferencialmente o receptor de SDF-1 do sistema receptor de SDF-1 é o CXCR4 receptor.

[0081] Em uma modalidade, o SDF-1 é um SDF-1 humano e/ou o receptor de SDF-1 é um receptor de SDF-1 humano.

[0082] Em uma modalidade SDF-1 compreende uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID N° 1.

[0083] Em uma modalidade, o ácido nucleico compreende uma modificação.

[0084] Em uma modalidade preferencial, a modificação é selecionada entre o grupo compreendendo uma porção HES e uma porção PEG.

[0085] Em uma modalidade preferencial adicional a modificação é uma porção PEG consistindo em um PEG reto ou ramificado, por meio da qual o peso molecular da porção PEG é preferencialmente a partir de cerca de 2 até 180 kD, mais preferencialmente a partir de cerca de 60 até 140 kD e o mais preferencialmente cerca de 40 kD.

[0086] Em uma modalidade, a modificação é uma porção HES, por meio da qual preferencialmente o peso molecular da porção HES é a partir de cerca de 10 até 130 kD, mais preferencialmente a partir de cerca de 30 até 130 kD e o mais preferencialmente cerca de 100 kD.

[0087] Em uma modalidade, os nucleotídeos do ácido nucleico são

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22/151

L-nucleotídeos, preferencialmente os nucleotídeos das sequências de acordo com quaisquer das SEQ. ID. Nos.: 19, 20, 21, 22, 57, 58, 90, 91,92, e 93.

[0088] Em um segundo aspecto, o problema básico da presente invenção é resolvido por uma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto e opcionalmente um constituinte adicional, por meio da qual o constituinte adicional é selecionado entre o grupo compreendendo excipientes farmaceuticamente aceitáveis e agentes farmaceuticamente ativos.

[0089] Em um terceiro aspecto, o problema básico da presente invenção é resolvido pelo uso de um ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto para a fabricação de um medicamento.

[0090] Em uma modalidade do terceiro aspecto o medicamento é para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio, por meio do qual semelhante doença ou distúrbio é mediado por SDF-1, preferencialmente semelhante doença ou distúrbio é selecionado entre o grupo compreendendo doenças do fundo de olho como retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade; câncer de mama, ovários, próstata, pâncreas, tiroide, nasofaringe, cólon, pulmão, e estômago; osteossarcoma; melanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; síndrome de WHIM; síndromes de deficiência imunológica; neovascularização patológica; inflamação; esclerose múltipla; artrite reumatoide / osteoartrite e nefrite.

[0091] Em uma modalidade do terceiro aspecto, o medicamento é para inibir angiogênese, neovascularização, inflamação e metástase.

[0092] Em um quarto aspecto, o problema básico da presente invenção é resolvido pelo uso do ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto para a fabricação de um meio diagnóstico.

[0093] Em uma modalidade do quarto aspecto, o meio diagnóstico

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23/151 é para o diagnóstico de uma doença, por meio do qual a doença é selecionada entre o grupo compreendendo doenças do fundo de olho como retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade; câncer de mama, ovários, próstata, pâncreas, tiroide, nasofaringe, cólon, pulmão, e estômago; osteossarcoma; melanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; síndrome de WHIM; síndromes de deficiência imunológica; neovascularização patológica; inflamação; esclerose múltipla; artrite reumatoide / osteoartrite e nefrite.

[0094] Em uma modalidade do quarto aspecto, o meio diagnóstico é para diagnosticar angiogênese, neovascularização, inflamação e/ou metástase.

[0095] Em um quinto aspecto, o problema básico da presente invenção é resolvido por um complexo compreendendo SDF-1 e um ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto, por meio da qual preferencialmente o complexo é um complexo cristalino.

[0096] Em um sexto aspecto, o problema básico da presente invenção é resolvido pelo uso do ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto para a detecção de SDF-1.

[0097] Em um sétimo aspecto, o problema básico da presente invenção é resolvido por um método para a triagem de um antagonista de SDF-1 ou um SDF-1 agonista compreendendo as seguintes etapas: proporcionar um antagonista de SDF-1 candidato e/ou um SDF-1 agonista candidato,

- proporcionar um ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto,

- proporcionar um sistema de teste o qual proporciona um sinal na presença de um antagonista de SDF-1 e/ou um SDF-1 agonista, e

- determinar se o antagonista de SDF-1 candidato é um

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24/151 antagonista de SDF-1 e/ou whether o SDF-1 agonista candidato é um SDF-1 agonista.

[0098] Em um oitavo aspecto, o problema básico da presente invenção é resolvido por um método para a triagem de um SDF-1 agonista e/ou um antagonista de SDF-1 compreende as seguintes etapas:

- proporcionar SDF-1 imobilizado para uma fase, preferencialmente uma fase sólida,

- proporcionar um ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto, preferencialmente um ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto o qual é marcado,

- adicionar um SDF-1 agonista candidato e/ou um antagonista de SDF-1 candidato, e

- determinar se o SDF-1 agonista candidato é um SDF-1 agonista e/ou se o antagonista de SDF-1 candidato é um antagonista de SDF-1.

[0099] Em uma modalidade do oitavo aspecto, a determinação é realizada de tal modo que é avaliado se o ácido nucleico é substituído pelo SDF-1 agonista candidato ou por um antagonista de SDF-1 candidato.

[00100] Em um nono aspecto o problema básico da presente invenção é resolvido por um kit para a detecção de SDF-1, compreendendo um ácido nucleico de acordo com o primeiro aspecto.

[00101] Em um décimo aspecto o problema básico da presente invenção é resolvido por um antagonista de SDF-1 obtenível pelo método de acordo com o sétimo aspecto ou o oitavo aspecto.

[00102] A presente invenção se baseia no achado surpreendente que é possível gerar ácidos nucleicos ligando especificamente e com alta afinidade a SDF-1.

[00103] SDF-1 é um peptídeo básico tendo a sequência de

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25/151 aminoácido de acordo com a SEQ. ID. N° 1. O pI calculado de SDF-1 é 9,70. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo SDF-1 se refere a qualquer SDF-1 incluindo, mas não limitado a, SDF1 mamífero. Preferencialmente, o SDF-1 mamífero é selecionado entre o grupo compreendendo SDF-1 de camundongos, de rato, de coelho, de hamster, de macaco e humano. O mais preferencialmente o SDF-1 é SDF-1 humano (SEQ.ID. 1).

[00104] A descoberta de que ácidos nucleicos ligando com alta afinidade a SDF-1 podem ser identificados, é insofar surpreendente conforme Eaton et al. (Eaton, Gold et al. 1997) observaram que a produção de aptâmeros, isto é, D-ácidos nucleicos ligando a uma molécula-alvo, dirigida para uma proteína básica é em geral muito difícil porque este tipo de alvo produz uma proporção de sinal para ruído elevada mas não específica. Esta elevada proporção de sinal para ruído resulta da elevada afinidade não específica mostrada por ácidos nucleicos para alvos básicos tais como SDF-1.

[00105] As características do ácido nucleico de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, podem ser realizadas em qualquer aspecto da presente invenção onde o ácido nucleico é usado, quer sozinho quer em qualquer combinação.

[00106] Sem desejar serem limitados por qualquer teoria, os presentes inventores pressumem que a especificidade observada dos ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 de acordo com a presente invenção partilha algumas características estruturais e em particular uma das sequências de nucleotídeos as quais também são referidas no mesmo como sequências de núcleo as quais serão discutidas em mais detalhes a seguir, por meio dos quais é feita referência às Figuras 1 a 8 e ao Exemplo 1. No entanto, deve ser entendido que as Figuras e o Exemplo 1 referidos incorporam várias das características

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26/151 estruturais referidas as quais não têm de ser necessariamente realizadas em cada um e quaisquer dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção.

[00107] Conforme resumido em mais detalhes nas reivindicações e no exemplo 1, as várias moléculas de ácido nucleico de ligação de SDF-1 humano podem ser categorizadas com base nas referidas Caixas e algumas características estruturais e elementos, respectivamente. As várias categorias definidas deste modo também são referidas aqui, neste requerimento de patente, como tipos e mais especificamente como Tipo A, Tipo B e Tipo C.

[00108] Em uma modalidade preferencial o ácido nucleico de acordo com a presente invenção é uma única molécula de ácido nucleico. Em uma modalidade adicional, a única molécula de ácido nucleico está presente como uma multitude da única molécula de ácido nucleico. Preferencialmente, os termos ácido nucleico e molécula de ácido nucleico são usados em uma maneira intercambiável aqui, neste requerimento de patente, caso não indicado ao contrário.

[00109] Será reconhecido por aqueles versados na técnica que a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção preferencialmente consiste em nucleotídeos os quais são encadeados de modo covalente una aos outros, preferencialmente através de ligações ou cadeias fosfodiéster.

[00110] Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção também compreenderão ácidos nucleicos os quais são essencialmente homólogos às sequências em particular reveladas aqui, neste requerimento de patente. O termo substancialmente homólogos será entendido tal como a homologia é de no mínimo 75%, preferencialmente 85%, mais preferencialmente 90% e o mais preferencialmente mais de 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99%.

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27/151 [00111] A percentagem real de nucleotídeos homólogos presentes no ácido nucleico de acordo com a presente invenção dependerá do número total de nucleotídeos presentes no ácido nucleico. A percentagem de modificação pode ser baseada no número total de nucleotídeos presentes no ácido nucleico.

[00112] A homologia pode ser determinada conforme de conhecimento de uma pessoa versada na técnica. Mais especificamente, um algoritmo de comparação de sequências em seguida calcula a percentagem de identidade de sequência para a uma ou mais sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados. A sequência de teste jé preferencialmente a sequência ou molécula de ácido nucleico a qual se diz que é ou deve ser testada se é homóloga, e em caso positivo, em qual extensão, a outra molécula de ácido nucleico, por meio do que a outra molécula de ácido nucleico também é referida como a sequência de referência. Em uma modalidade, a sequência de referência é uma molécula de ácido nucleico conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, mais preferencialmente uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de acordo com quaisquer das SEQ. ID. NOs. 5 a 144. Alinhamento de sequências ótimo para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman (Smith & Waterman, 1981) pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch (Needleman & Wunsch, 1970) pela pesquisa para método de similaridade de Pearson & Lipman (Pearson & Lipman, 1988), por implementações computerizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ou por inspeção visual.

[00113] Um exemplo de um algoritmo que é adequado para

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28/151 determinar a percentagem de identidade de sequência é o algoritmo usado na ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico (nas partes que se seguem BLAST ), vide, por exemplo, Altschul et al (Altschul et al. 1990 and Altschul et al., 1997). Software para realizar análises BLAST está disponível publicamente através do National Center for Biotechnology Information (nas partes que se seguem NCBI). Os parâmetros padrão usados na determinação da identidade de sequência usando o software disponível na NCBI, por exemplo, BLASTN (para sequências de nucleotídeos) e BLASTP (para sequências de aminoácidos) são descritos em McGinnis et al (McGinnis et al., 2004).

[00114] O termo ácido nucleico da invenção ou ácido nucleico de acordo com a presente invenção também compreenderá os ácidos nucleicos compreendendo as sequências de ácidos nucleicos reveladas aqui, neste requerimento de patente, ou parte das mesmas, preferencialmente na extensão que os ácidos nucleicos ou as partes referidas estão envolvidos na ligação a SDF-1. Um ácido nucleico semelhante pode ser derivado daqueles revelados aqui, neste requerimento de patente, por exemplo, por truncação. Truncação pode ser relacionada com qualquer uma ou ambas as extremidades dos ácidos nucleicos conforme revelado aqui, neste requerimento de patente. Além disso, truncação pode ser relacionada com a sequência interna de nucleotídeos, isto é, pode ser relacionada com o um ou mais nucleotídeos entre o nucleotídeo 5' e o 3' terminal, respectivamente. Além disso, truncação compreenderá a eliminação de tão pouco quanto um único nucleotídeo da sequência dos ácidos nucleicos revelados aqui, neste requerimento de patente. Truncação também pode ser relacionada a mais de um trecho do um ou mais ácidos nucleicos da invenção, por meio da qual o trecho pode ser tão pouco quanto um nucleotídeo de extensão. A ligação de um ácido

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29/151 nucleico de acordo com a presente invenção pode ser determinada por aqueles versados na técnica usando experimentos de rotina ou usando ou adotando um método conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, preferencialmente conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, na parte de exemplos.

[00115] Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem ser ou D-ácidos nucleicos ou L-ácidos nucleicos. Preferencialmente, os ácidos nucleicos da invenção são L-ácidos nucleicos. Além disso, é possível que uma ou várias partes do ácido nucleico estejam presentes como D-ácidos nucleicos ou no mínimo uma ou várias partes dos ácidos nucleicos sejam L-ácidos nucleicos. O termo parte dos ácidos nucleicos significará tão pouco quanto um nucleotídeo. Semelhantes ácidos nucleicos são geralmente referidos aqui, neste requerimento de patente, como D- e L-ácidos nucleicos, respectivamente. Portanto, em uma modalidade particularmente preferencial, os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção consistem em L-nucleotídeos e compreendem no mínimo um Dnucleotídeo. Semelhante D-nucleotídeo é preferencialmente fixado a uma parte diferente dos trechos definindo os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, preferencialmente as partes dos mesmos, onde uma interação com outras partes do ácido nucleico está envolvida. Preferencialmente, semelhante D-nucleotídeo é fixado a um término de quaisquer dos trechos e de qualquer ácido nucleico de acordo com a presente invenção, respectivamente. Em uma modalidade preferencial adicional, semelhantes D-nucleotídeos podem agir como um espaçador ou um ligante, preferencialmente anexando modificações tais como PEG e HES aos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção.

[00116] Também está dentro da presente invenção que cada e quaisquer das moléculas de ácido nucleico descritas aqui, neste

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30/151 requerimento de patente, em sua totalidade em termos de sua uma ou mais sequências de ácido nucleico são limitadas à ou às sequências de nucleotídeos em particular. Em outras palavras, os termos compreendendo ou compreende(m) serão interpretados em semelhante modalidade no significado de contendo ou consistindo em. [00117] Também está dentro da presente invenção que os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são parte de um ácido nucleico mais longo por meio da qual este ácido nucleico mais longo compreende várias partes por meio das quais no mínimo uma parte semelhante é um ácido nucleico, ou uma parte do mesmo, de acordo com a presente invenção. A uma ou mais outras partes destes ácidos nucleicos mais longos podem ser ou um ou vários ácidos nucleicos-D ou ácidos nucleicos-L. Qualquer combinação pode ser usada em conexão com a presente invenção. Estas outras uma ou mais partes do ácido nucleico mais longo podem apresentar uma função a qual é diferente de ligação, preferencialmente de ligação a SDF-1. Uma função possível é permitir interação com outras moléculas, por meio da qual as outras moléculas referidas preferencialmente são diferentes de SDF-1, tal como, por exemplo, para imobilização, reticulação, detecção ou amplificação. Em uma modalidade adicional da presente invenção os ácidos nucleicos de acordo com a invenção compreendem, como porções individuais ou combinadas, vários dos ácidos nucleicos da presente invenção. Semelhante ácido nucleico compreendendo vários dos ácidos nucleicos da presente invenção também é englobado pelo termo ácido nucleico mais longo.

[00118] L-Ácidos nucleicos conforme usado aqui, neste requerimento de patente, são ácidos nucleicos consistindo em Lnucleotídeos, preferencialmente consistindo completamente em Lnucleotídeos.

[00119] D-Ácidos nucleicos conforme usado aqui, neste

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31/151 requerimento de patente, são ácidos nucléicos consistindo em Dnucleotídeos, preferencialmente consistindo completamente de Dnucleotídeos.

[00120] Os termos ácido nucleico e molécula de ácido nucleico são usados aqui, neste requerimento de patente, em uma maneira intercambiável caso não explicitamente indicados ao contrário.

[00121] Além disso, caso não indicado ao contrário, qualquer sequência de nucleotídeos é determinada aqui, neste requerimento de patente, na direção 5' 3'.

[00122] Independente de se o ácido nucleico da invenção consiste em D-nucleotídeos, L-nucleotídeos ou uma combinação de ambos com a combinação sendo, por exemplo, uma combinação aleatória ou uma sequência definida de trechos consistindo em no mínimo um Lnucleotídeo e no mínimo um D-ácido nucleico, o ácido nucleico pode consistir de um ou mais desoxirribonucleotídeos, um ou mais ribonucleotídeos ou combinações dos mesmos.

[00123] Desenhar os ácidos nucleicos da invenção como L-ácido nucleico é vantajoso por várias razões. L-ácidos nucleicos são enantiômeros de ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente. D-ácidos nucleicos, no entanto, não são muito estáveis em soluções aquosas e particularmente em sistemas biológicos ou amostras biológicas devido à presença disseminada de nucleases. Nucleases que ocorrem naturalmente, particularmente nucleases de células animais não têm capacidade de degrar L-ácidos nucleicos. Por causa disto a meia-vida biológica do L-ácido nucleico é significativamente aumentada em um sistema semelhante, incluindo o corpo animal e humano. Devido à falta de degradabilidade de L-ácido nucleico não são produzidos produtos da degradação de nuclease e portanto não são observados efeitos colaterais surgindo a partir dos mesmos. Este aspecto delimita o L-ácido nucleico de factualmente todos os outros compostos os

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32/151 quais são usados na terapia de doenças e/ou distúrbios envolvendo a presença de SDF-1. L-Ácidos nucleicos os quais especificamente ligam a uma molécula-alvo através de um mecanismo diferente de pareamento de bases de Watson Crick, ou aptâmeros os quais consistem parcialmente ou completamente de L-nucleotídeos, particularmente com as partes do aptâmero estando envolvidas na ligação do aptâmero à molécula-alvo, também são denominados spiegelmeros.

[00124] Está dentro da presente invenção que o primeiro e o segundo trecho de nucleotídeos flanqueando a sequência de nucleotídeos de núcleo podem, em princípio, hibridizar um com o outro. Na hibridização referida se forma uma estrutura de filamento duplo. Será reconhecido por uma pessoa versada na técnica que semelhante hibridização pode ocorrer ou não, particularmente sob condições in vitro e/ou in vivo. Além disso, no caso de semelhante hibridização, não é necessariamente o caso de que a hibridização ocorra sobre toda a extensão dos dois trechos onde, no mínimo com base nas regras para pareamento de bases, pode ocorrer semelhante hibridização e, portanto, formação de uma estrutura de filamento duplo. Conforme preferencialmente usado aqui, neste requerimento de patente, uma estrutura de filamento duplo é uma parte de uma molécula ou uma estrutura formada por dois ou mais filamentos separados, por meio da qual existem no mínimo um, preferencialmente dois ou mais pares de bases os quais são pareamento de bases preferencialmente de acordo com as regras de pareamento de bases de Watson-Crick. Também será reconhecido por uma pessoa versada na técnica que outro pareamento de bases tal como pareamento de bases de Hoogsten pode existir em ou formar a estrutura de filamento duplo referida.

[00125] Também está dentro da presente invenção que os ácidos

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33/151 nucléicos da invenção, independente se estão presentes como Dácidos nucleicos, L-ácidos nucleicos ou D,L-ácidos nucleicos ou se são DNA ou RNA, podem estar presentes como ácidos nucleicos de filamento único ou de filamento duplo. Tipicamente, os ácidos nucleicos da invenção são ácidos nucleicos de filamento único os quais apresentam estruturas secundárias definidas devido às sequência primárias e, portanto, também podem formar estruturas terciárias. Os ácidos nucleicos da invenção, no entanto, também podem ser de filamento duplo no significado de que dois filamentos os quais são complementares ou parcialmente complementares um ao outro são hibridizados um ao outro. Isto confere estabilidade ao ácido nucleico a qual, em particular, será vantajosa se o ácido nucleico estiver presente na forma-D que ocorre naturalmente ao invés de na forma-L.

[00126] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser modificados. Semelhantes modificações podem ser relacionadas com o único nucleotídeo do ácido nucleico e são de conhecimento geral na técnica. Exemplos de semelhante modificação são descritos por, entre outros, Venkatesan et al. (Venkatesan, Kim et al. 2003) e Kusser (Kusser 2000). Semelhante modificação pode ser um átomo de H, um átomo de F ou grupo O-CH3 ou grupo NH2 na posição 2' do nucleotídeo individual do qual consiste o ácido nucleico. Além disso, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode compreender no mínimo um nucleotídeo de LNA. Em uma modalidade o ácido nucleico de acordo com a presente invenção consiste em nucleotídeos de LNA. [00127] Em uma modalidade, os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem ser um ácido nucleico multipartido. Um ácido nucleico multipartido conforme usado aqui, neste requerimento de patente, é um ácido nucleico o qual consiste em no mínimo dois filamentos de ácido nucleico. Estes no mínimo dois filamentos de ácido

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34/151 nucleico formam uma unidade funcional por meio da qual a unidade funcional é um ligante para uma molécula-alvo. Os no mínimo dois filamentos de ácido nucleico podem ser derivados de quaisquer dos ácidos nucleicos da invenção ou por clivagem do ácido nucleico para gerar dois filamentos ou sintetizando um ácido nucleico correspondente a uma primeira parte do ácido nucleico da invenção, isto é, total e outro ácido nucleico correspondente à segunda parte do ácido nucleico total. Deve ser reconhecido que tanto a clivagem quanto a síntese podem ser aplicadas para gerar um ácido nucleico multipartido onde há mais de dois filamentos conforme exemplificado acima. Em outras palavras, os no mínimo dois filamentos de ácido nucleico são tipicamente diferentes de dois filamentos sendo complementares e hibridizano um ao outro embora possa existir uma certa extensão de complementaridade entre as várias partes de ácido nucleico.

[00128] Finalmente, também está dentro da presente invenção que uma estrutura totamente fechada, isto é, circular, para os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção é realizada, isto é, que os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são fechados, preferencialmente através de uma ligação covalente, por meio da qual mais preferencialmente a referida ligação covalente é feita entre a extremidade 5' e a extremidade 3' das sequências de ácido nucleico conforme revelado aqui, neste requerimento de patente.

[00129] Os presentes inventores descobriram que os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção apresentam uma faixa de valor de Kd muito favorável.

[00130] Uma possibilidade para determinar a constante de ligação é medição da ressonância de plasmon superficial pelo uso do denominado dispositivo Biacore (Biacore AB, Uppsala, Suécia), o qual também é conhecido por uma pessoa versada na técnica. A afinidade

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35/151 conforme preferencialmente usado aqui, neste requerimento de patente, também foi medida pelo uso de prova de ligação de pull dowrí' conforme descrito nos exemplos. Uma medida apropriada de modo a expressar a intensidade da ligação entre o ácido nucleico e o alvo o qual é no presente caso SDF-1, é o denominado valor da Kd o qual deste modo bem como o método para sua determinação são de conhecimento de uma pessoa versada na técnica.

[00131] Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são caracterizados por um valor da Kd determinado. Preferencialmente, o valor da Kd mostrado pelos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção é abaixo de 1 μΜ. Diz-se que um valor da Kd de cerca de 1 μΜ é característico para uma ligação não específica de um ácido nucleico a um alvo. Conforme será reconhecido por aqueles na técnica, o valor da Kd de um grupo de compostos tais como os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção está dentro de uma certa faixa. A Kd mencionada acima de cerca de 1 μΜ é um limite superior preferencial para o valor da Kd. O limite inferior preferencial para a Kd de ácidos nucleicos de ligaçãoalvo pode ser cerca de 10 picomolar ou superior. Está dentro da presente invenção que os valores da Kd de ácidos nucleicos individuais ligando a SDF-1 preferencialmente estão dentro desta faixa. Faixas preferenciais podem ser definidas escolhendo qualquer primeiro número dentro desta faixa e qualquer segundo número dentro desta faixa. Valores superiores preferenciais são 250 nM e 100 nM, valores inferiores preferenciais são 50 nM, 10 nM, 1 nM , 100 pM e 10 pM.

[00132] As moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção podem ter qualquer extensão contanto que ainda sejam capazes de ligar à molécula-alvo. Será reconhecido na técnica que são preferenciais extensões dos ácidos nucleicos de acordo com a

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36/151 presente invençãos. Tipicamente, a extensão é entre 15 e 120 nucleotídeos. Será reconhecido por aqueles versados na técnica que qualquer inteiro entre 15 e 120 é uma extensão possível para os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. Faixas mais preferenciais para a extensão dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são extensões de cerca de 20 a 100 nucleotídeos, cerca de 20 a 80 nucleotídeos, cerca de 20 a 60 nucleotídeos, cerca de 20 a 50 nucleotídeos e cerca de 20 a 40 nucleotídeos.

[00133] Está dentro da presente invenção que os ácidos nucleicos revelados aqui, neste requerimento de patente, compreendem uma porção a qual preferencialmente é uma porção de alto peso molecular e/ou a qual preferencialmente permite modificar as características do ácido nucleico em termos de, entre outros, duração da permanência no corpo do animal, preferencialmente o corpo humano. Uma modalidade particularmente preferencial de semelhante modificação é PEGuilação e HESilação dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, PEG significa poli(etileno glicol) e HES significa hidroxietil amido. PEGuilação conforme preferencialmente usado aqui, neste requerimento de patente, é a modificação de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção por meio da qual semelhante modificação consiste em um porção PEG a qual é anexada a um ácido nucleico de acordo com a presente invenção. HESilação conforme preferencialmente usado aqui, neste requerimento de patente, é a modificação de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção por meio da qual semelhante modificação consiste em uma porção HES a qual é anexada a um ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Estas modificações bem como o processo para modificar um ácido nucleico usando semelhantes modificações, são descritas no requerimento de patente Europeia N° EP 1 306 382, cuja descoberta é

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37/151 deste modo incorporada em sua totalidade por meio de referência. [00134] Preferencialmente, o peso molecular de uma modificação consistindo em ou compreendendo uma porção de alto peso molecular é cerca de a partir de 2.000 a 200.000 Da, preferencialmente 40.000 a 120.000 Da, particularmente em caso de PEG sendo semelhante porção de alto peso molecular, e é preferencialmente cerca de a partir de 3.000 a 180.000 Da, mais preferencialmente a partir de 60.000 a 140.000 Da, particularmente em caso de HES sendo semelhante porção de alto peso molecular. O processo de modificação por HES é descrito, por exemplo, no requerimento de patente Alemã N° DE 1 2004 006 249.8 cuja descoberta é deste modo incorporada em sua totalidade por meio de referência.

[00135] Está dentro da presente invenção que qualquer um de PEG e HES pode ser usado como ou um linear ou ramificado de conforme adicionalmente descrito nos requerimentos de patentes N° WO2005074993 e N° PCT/EP02/11950. Semelhante modificação pode ser feita, em princípio, às moléculas de ácido nucleico da presente invenção em qualquer posição das mesmas. Preferencialmente semelhante modificação é feita ou ao nucleotídeo de 5' -terminal, ao nucleotídeo de 3'-terminal e/ou qualquer nucleotídeo entre o nucleotídeo 5' e o nucleotídeo 3' da molécula de ácido nucleico.

[00136] A modificação e preferencialmente a porção PEG e/ou HES pode ser anexada à molécula de ácido nucleico da presente invenção quer diretamente ou através de um ligante. Também está dentro da presente invenção que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção compreende uma ou mais modificações, preferencialmente uma ou mais porções PEG e/ou HES. Em uma modalidade a molécula ligante individual anexa mais de uma porção PEG ou porção HES a uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. O ligante usado em conexão com a presente

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38/151 invenção pode ser o próprio linear ou ramificado. Este tipo de ligantees é de conhecimento daqueles versados na técnica e estes são adicionalmente descritos nos requerimentos de patente N° WO2005074993 e N° PCT/EP02/11950.

[00137] Sem desejar ser limitado por qualquer teoria, parece que modificando os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção com porção de alto peso molecular tal como um polímero e mais particulamente os polímeros revelados aqui, neste requerimento de patente, os quais são preferencialmente e fisiologicamente aceitáveis, a cinética de excreção é alterada. Mais particularmente, parece que devido ao aumentado peso molecular de semelhantes ácidos nucleicos modificados da invenção e devido aos ácidos nucleicos não estarem indivíduos a metabolismo particularmente quando na forma L, a excreção a partir de um corpo animal, preferencialmente de um corpo de mamífero e mais preferencialmente de um corpo humano é reduzida. Como a excreção tipicamente ocorre através dos rins, os presentes inventores presumiram que a taxa de filtração glomerular do ácido nucleico modificado deste modo é significativamente reduzida comparados com os ácidos nucleicos não tendo este tipo de modificação de alto peso molecular o qual resulta em um aumento na duração da permanência no corpo. Em conexão com isto é particularmente digno de nota que, apesar de semelhante modificação de alto peso molecular a especificidade do ácido nucleico de acordo com a presente invenção não é afetada em uma maneira prejudicial. Insofar, os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção têm características surprendeentes - as quais normalmente não podem ser esperadas de compostos farmaceuticamente ativos - de tal modo que uma formulação farmacêutica proporcionando uma liberação gradual não é necessariamente requerida para proporcionar uma liberação gradual. Ao contrário os ácidos nucleicos de acordo com a presente

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39/151 invenção em sua forma modificada compreendendo uma porção de alto peso molecular, já podem ser usados no estado em que se encontram como uma formulação de liberação gradual. Insofar, a uma ou mais modificações das moléculas de ácido nucleico conforme revelado aqui, neste requerimento de patente, e as moléculas de ácido nucleico modificadas deste modo e qualquer composição compreendendo as mesmas podem proporcionar uma farmacocinética e biodistribuição das mesmas distintas e preferencialmente controladas. Isto também inclui duração da permanência na circulação e distribuição para tecidos. As modificações referidas são adicionalmente descritas no requerimento de patente N° PCT/EP02/11950.

[00138] No entanto, está dentro da presente invenção que os ácidos nucleicos revelados aqui, neste requerimento de patente, não compreendem qualquer modificação e particularmente nenhuma modificação de alto peso molecular tal como PEGuilação ou HESilação. A modalidade referida é particularmente preferenciais quando se deseja um clearance rápido dos ácidos nucleicos do corpo depois da administração. A desobstrução rápida referida pode ser desejada em caso de estudo por imagens in vivo ou requisitos específicos de dosagem terapêutica usando os ácidos nucleicos ou medicamentos compreendendo os mesmos, de acordo com a presente invenção.

[00139] Os ácidos nucleicos da invenção, os quais também são referidos aqui, neste requerimento de patente, como os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, e/ou os antagonistas de acordo com a presente invenção podem ser usados para a produção ou fabricação de um medicamento. O medicamento referido contém no mínimo um dos ácidos nucleicos da invenção, opcionalmente junto com compostos farmaceuticamente ativos adicionais, por meio da qual

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40/151 o ácido nucleico da invenção preferencialmente age como o próprio composto farmaceuticamente ativo. Os medicamentos referidos compreendem em modalidades preferenciais no mínimo um veículo farmaceuticamente aceitável. O veículo referido pode ser, por exemplo, água, tampão, PBS, solução de glicose, solução de sacarose, solução de manose, preferencialmente uma solução balanceada a 5% de sacarose, amido, açúcar, gelatina ou qualquer outra substância de veículo aceitável. Os veículos referidos são geralmente conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Será reconhecido por uma pessoa versada na técnica que quaisquer modalidades, uso e aspectos de ou relacionados com o medicamento da presente invenção também são aplicáveis à composição farmacêutica da presente invenção e vice-versa.

[00140] A indicação, doenças e distúrbios para o tratamento e/ou prevenção das quais os ácidos nucleicos, as composições farmacêuticas e medicamentos de acordo com ou preparados de acordo com a presente invenção resultam do envolvimento, quer direto ou indireto, de SDF-1 no mecanismo patogênico respectivo.

[00141] Logicamente, como os ácidos nucleicos de ligação de SDF1 de acordo cm a presente invenção interagem com ou ligam a SDF-1 humano ou murino, uma pessoa versada geralmente entenderá que os ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 de acordo com a presente invenção podem ser facilmente usados para o tratamento, a prevenção e/ou diagnóstico de qualquer doença conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, de seres-humanos e animais.

[00142] Doença e/ou distúrbios e/ou condições de doença para o tratamento e/ou a prevenção das quais o medicamento referido pode ser usado incluem, mas não estão limitadas a doenças do fundo de olho como retinopatia, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade, tanto a forma seca quanto úmida; câncer;

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41/151 câncer de mama, ovários, próstata, pâncreas, tiroide, nasofaringe, cólon, pulmão, e estômago; osteossarcoma; melanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; leucemia linfocítica crônica de células B; mieloma múltiplo; linfoma; síndrome de WHIM; síndromes de deficiência imunológica; neovascularização patológica; inflamação; esclerose múltipla; artrite, artrite reumatoide, osteoartrite e nefrite.

[00143] Em uma modalidade adicional, o medicamento compreende um agente farmaceuticamente ativo adicional. Semelhantes compostos farmaceuticamente ativos adicionais podem ser os conhecidos por aqueles versados na técnica e são preferencialmente selecionados entre o grupo compreendendo antagonistas de citocina ou quimiocina, corticosteroides, e semelhantes. Será entendido por uma pessoa versada na técnica que dadas as várias indicações as quais podem ser tratadas de acordo com a presente invenção pelos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, o um ou mais agentes farmaceuticamente ativos adicionais referidos podem ser qualquer um o qual em princípio é adequado para o tratamento e/ou prevenção de semelhantes doenças. As moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, particularmente caso presentes ou usadas como um medicamento, são preferencialmente combinadas com inibidores de VEGF tais como Macugen (Pegatanib) da Pfizer Ophthalmics, Lucentis (Ranitizumab) da Novartis Ophthalmics, Avastin (Bevacizumab) da Roche (off-label use); ou com terapia fotodinâmica tal como Visudyne (Verteporfing) da Novartis Ophthalmics e derivado de cortisona injetável intravitrealmente tal como Retaane (Anecortave acetate) da Alcon Inc.

[00144] Alternativamente, ou adicionalmente, o agente farmaceuticamente ativo adicional referido é um ácido nucleico adicional de acordo com a presente invenção. Alternativamente, o medicamento compreende no mínimo mais um ácido nucleico o qual

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42/151 liga a uma molécula-alvo diferente de SDF-1 ou apresenta uma função a qual é diferente da função dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção.

[00145] Conforme será reconhecido por aqueles da técnica os ácidos nucleicos da invenção podem ser usados efetivamente em qualquer doença onde um antagonista para SDF-1 pode ser administrado a um paciente que necessite de semelhante antagonista e semelhante antagonista seja adequado para eliminar a causa da doença ou do distúrbio ou no mínimo para reduzir os efeitos da doença ou do distúrbio. O efeito referido inclui, mas não está limitado à neovascularização patológica, inflamação e metástase. A aplicabilidade dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção em conexão com estas e outras doenças ou distúrbios resulta, entre outros, do envolvimento de SDF-1 conforme resumido na parte introdutória da presente especificação a qual é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência de modo a evitar qualquer repetição desnecessária.

[00146] Está dentro da presente invenção que o medicamento é alternativamente ou adicionalmente usado, em princípio, para a prevenção de quaisquer das doenças reveladas em conexão com o uso do medicamento para o tratamento das doenças referidas. Marcadores respectivos portanto, isto é, para as doenças respectivas são conhecidos por aqueles versados na técnica. Preferencialmente, o marcador respectivo é SDF-1. Alternativamente e/ou adicionalmente, o marcador respectivo é selecionado entre o grupo de marcadores de estresse oxidativo, compreendendo transmembrana redutase de ferricianeto (TMR), aumentada atividade do caminho do sorbitol que inclui depois de acumulação de sorbitol, aumentada proporção de NADH/NAD citosólico, depleção de NADPH e acumulação de frutose com a produção não enzimática resultante de produtos finais de

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43/151 glicação avançada (AGES) e consequente ativação da proteína quinase C, eventos a jusante mediados por estresse oxidativo e nitrosativo tais como ativação da MAP quinase; marcadores inflamatórios, compreendendo ICAM-1, VCAM-1, RANTES, haptoglobina, ou proteína C reativa; e marcadores pró-angiogênicos como eritropoetina ou VEGF. Em vista disto, os marcadores referidos podem ser usados para determinar se ou não um indivíduo ou um paciente pode ser tratado com quaisquer das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Portanto, em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a semelhante método, por meio do qual a presença ou ausência e mais especificamente a concentração do um ou mais marcadores respectivos é/são determinada(s). Métodos para a detecção dos marcadores referidos e opcionalmente sua quantificação, bem como a faixa dentro da qual o marcador respectivo estará presente ou ausente de modo a decidir se ou não o indivíduo ou paciente está sofrendo de quaisquer das doenças referidas ou está em risco de desenvolver as doenças referidas, e, por conseguinte, pode portanto ser tradado de acordo com a presente invenção, são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00147] Em uma modalidade do medicamento da presente invenção, o medicamento é para uso em combinação com outros tratamentos para quaisquer das doenças reveladas aqui, neste requerimento de patente, particularmente aquelas para as quais o medicamento da presente invenção deve ser usado.

[00148] Terapia de combinação (ou coterapia) inclui a administração de um medicamento da invenção e no mínimo um segundo agente como parte de um regime de tratamento específico pretendido para proporcionar o efeito benéfico da coação destes agentes terapêuticos, isto é, o medicamento da presente invenção e o

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44/151 segundo agente referido. O efeito benéfico da combinação inclui, mas não está limitado a, coação farmacocinética ou farmacodinâmica resultante da combinação de agentes terapêuticos. A administração destes agentes terapêuticos em combinação tipicamente é realizada durante um período de tempo definido (geralmente minutos, horas, dias ou semanas dependendo da combinação selecionada).

[00149] Terapia de combinação pode, mas geralmente não, pretender englobar a administração de dois ou mais destes agentes terapêuticos como parte de regimes de monoterapia separada que incidentalmente e arbitrariamente resultam nas combinações da presente invenção. Terapia de combinação pretende englobar a administração destes agentes terapêuticos em uma maneira sequencial, isto é, em que cada agente terapêutico é administrado em uma hora diferente, bem como a administração destes agentes terapêuticos, ou no mínimo dois dos agentes terapêuticos, em uma maneira substancialmente simultânea. Administração substancialmente simultânea pode ser realizada, por exemplo, administrando a um indivíduo uma única cápsula tendo uma proporção fixa de cada agente terapêutico ou em múltiplas, cápsulas únicas para cada um dos agentes terapêuticos.

[00150] Administração sequencial ou substancialmente simultânea de cada agente terapêutico pode ser realizada por qualquer via apropriada incluindo, mas não limitada a, vias tópicas, vias orais, vias intravenosas, vias intramusculares, e absorção direta através dos tecidos das membranas mucosas. Os agentes terapêuticos podem ser administrados pela mesma via ou por vias diferentes. Por exemplo, um primeiro agente terapêutico da combinação selecionada pode ser administrado por injeção ao passo que os outros agentes terapêuticos da combinação podem ser administrados topicamente.

[00151] Alternativamente, por exemplo, todos os agentes

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45/151 terapêuticos podem ser administrados topicamente ou todos os agentes terapêuticos podem ser administrados por injeção. A sequência na qual os agentes terapêuticos são administrados não é estreitamente crítica a menos que mencionado de modo diverso. Terapia de combinação também pode englobar a administração dos agentes terapêuticos conforme descrito acima em combinação adicional com outros ingredientes biologicamente ativos. Onde a terapia de combinação compreende adicionalmente um tratamento não fármaco. O tratamento não fármaco pode ser conduzido em qualquer momento adequado à medida que seja obtido um efeito benéfico da coação da combinação dos agentes terapêuticos e o tratamento não fármaco. Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico ainda é obtido quanto o tratamento não fármaco é temporariamente removido da administração dos agentes terapêuticos, talvez por dias ou mesmo semanas.

[00152] Conforme resumido em termos gerais acima, o medicamento de acordo com a presente invenção pode ser administrado, em princípio, em qualquer forma de conhecimento daqueles versados na técnica. Uma via de administração preferencial é administração sistêmica, mais preferencialmente por administração parenteral, preferencialmente por injunção. Alternativamente, o medicamento pode ser administrado localmente. Outras vias de administração compreendem intramuscular, intraperitoneal, e subcutânea, per orum, intranasal, intratraqueal ou pulmonar com preferência dada à via de administração que é a menos invasiva, ao mesmo tempo que assegurando a eficiência.

[00153] Administração parenteral é geralmente usada para injeções e infusões subcutâneas, intramusculares ou intravenosas. Adicionalmente, uma abordagem para administração parenteral emprega a implantação de alguns sistemas de liberação lenta ou de

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46/151 liberação gradual, os quais asseguram que seja mantido um nível de dosagem constante, que são de conhecimento geral daqueles ordinariamente versados na técnica.

[00154] Além disso, medicamentos preferenciais da presente invenção podem ser administrados em forma intranasal através de uso tópico de veículos intranasais adequados, inalantes, ou através de vias transdérmicas, usando as formas de emplastros de pele transdérmicos de conhecimento geral daqueles ordinariamente versados na técnica. Para ser administrada sob a forma de um sistema de liberação transdérmica, a administração da dosagem, logicamente, será contínua ao invés de intermitente do início ao fim do regime da dosagem. Outras preparações tópicas preferenciais incluem cremes, pomadas, loções, sprays de aerosol e géis, em que a concentração de ingrediente ativo tipicamente variaria de 0,01% a 15%, em peso / peso ou em peso / volume.

[00155] O medicamento da presente invenção geralmente compreenderá uma quantidade eficaz do um ou mais componentes ativos da terapia, incluindo, mas não limitado a, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, dissolvida ou dispersada em um meio farmaceuticamente aceitável. Meios ou veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e semelhantes. O uso de semelhantes meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é de conhecimento geral na técnica. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados no medicamento da presente invenção.

[00156] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica referida compreende no mínimo um dos ácidos nucleicos de acordo com a

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47/151 presente invenção e preferencialmente um aglutinante farmaceuticamente aceitável. O aglutinante referido pode ser qualquer aglutinante usado e/ou conhecido na técnica. Mais particularmente o aglutinante referido é qualquer aglutinante conforme discutido em conexão com a fabricação do medicamento revelado aqui, neste requerimento de patente. Em uma modalidade adicional, a composição farmacêutica compreende um agente farmaceuticamente ativo adicional.

[00157] A preparação de um medicamento e uma composição farmacêutica será de conhecimento daqueles versados na técnica à luz da presente descoberta. Tipicamente, as composições referidas podem ser preparadas como injetáveis, quer como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, líquido antes da injeção; como comprimidos ou outros sólidos para administração oral; como cápsulas de liberação com o tempo; ou em qualquer outra forma atualmente usada, incluindo gotas oculares, cremes, loções, pomadas, inalantes e semelhantes. O uso de formulações estéreis, tais como lavagens à base de salina, por cirurgiões, médicos ou funcionários de tratamento de saúde para tratar uma área particular no campo de operação também pode ser particularmente útil. Composições também podem ser liberadas através de microdispositivo, micropartícula ou esponja.

[00158] Na formulação, um medicamento será administrado em uma maneira compatível com a formulação da dosagem, e em uma quantidade tal qual é farmacologicamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como o tipo de soluções injetáveis descritas acima, mas também podem ser empregadas cápsulas de liberação de fármaco e semelhantes.

[00159] Neste contexto, a quantidade de ingrediente ativo e o

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48/151 volume da composição a ser administrado depende do indivíduo ou do indivíduo a ser tratado. Quantidades específicas de composto ativo requeridas para administração dependem do critério do clínico e são peculiares a cada indivíduo.

[00160] Tipicamente, é utilizado um volume mínimo de um medicament requerido para dispersar os compostos ativos. Regimes adequados para administração também são variáveis, mas seriam tipificados inicialmente administrando o composto e monitorando os resultados e em seguida administrando doses controladas adicionais em intervalos adicionais.

[00161] Por exemplo, para administração oral sob a forma de um comprimido ou cápsula (por exemplo, uma cápsula de gelatina), o componente de fármaco ativo, isto é, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção e/ou qualquer agente farmaceuticamente ativo adicional, também referidos aqui, neste requerimento de patente, como agente(s) terapêutico(s) ou composto(s) ativo(s) podem ser combinados com um veículo inerte oral, não-tóxico, farmaceuticamente aceitável tal como etanol, glicerol, água e semelhantes. Além disso, quando desejado ou necessário, aglutinantes, lubrificantes, agentes desintegrantes, e agentes colorantes adequados também podem ser incorporados na mistura. Aglutinantes adequados incluem amido, silicato de alumínio de magnésio, pasta de amido, gelatina, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona, açúcares naturais tais como glucose ou beta-lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas tais como acacia, tragacanto ou alginato de sódio, polietileno glicol, ceras, e semelhantes. Lubrificantes usados nestas formas de dosagem incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, sílica, talco, ácido esteáric, seu sal de magnésio ou

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49/151 de cálcio e/ou polietileno glicol, e semelhantes. Desintegrantes incluem, sem limitação, amido, metil celulose, agar, bentonita, amidos de goma xantano, agar, ácido algínico ou seu sal de sódio, ou misturas efervescentes, e semelhantes. Diluentes, incluem, por exemplo, lactose, dextrose, sucrose, manitol, sorbitol, celulose e/ou glicina. [00162] O medicamento da invenção também pode ser administrado em formas de dosagens orais tais como comprimidos ou cápsulas de liberação cronometrada e de liberação gradual, pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões. Supositórios são preparados vantajosamente a partir de suspensões ou emulsões oleosas.

[00163] A composição farmacêutica ou medicamento pode ser esterilizada e/ou conter adjuvantes, tais como agentes preservantes, estabilizantes, umectantes ou emulsificantes, estimuladores de solução, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões. Além disso, também podem conter outras substâncias terapeuticamente valiosas. As composições são preparadas de acordo com métodos convencionais de mistura, granulação, ou revestimento, e tipicamente contêm cerca de 0,1% a 75%, preferencialmente cerca de 1% a 50%, do ingrediente ativo.

[00164] Composições líquidas, particularmente injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, dissolvendo, dispersando, e etc. O composto ativo é dissolvido em ou misturado com um solvente farmaceuticamente puro tal como, por exemplo, água, salina, dextrose aquosa, glicerol, etanol, e semelhantes, para deste modo formar a solução ou suspensão injetável. Adicionalmente, podem ser formuladas formas sólidas adequadas para dissolver em líquido antes da injeção.

[00165] Para composições sólidas, excipientes incluem graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio,

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50/151 sacarina de sódio, talco, celulose, glucose, sacarose, carbonato de magnésio, e semelhantes. O composto ativo definido acima, também pode ser formulado como supositórios, usando, por exemplo, polialquileno glicóis, por exemplo, propileno glicol, como o veículo. Em algumas modalidades, supositórios são preparados vantajosamente a partir de suspensões ou emulsões oleosas.

[00166] Os medicamentos e moléculas de ácido nucleico, respectivamente, da presente invenção também podem ser administrados sob a forma de sistemas de liberação de lipossomas, tais como pequenas vesículas unilamelares, grandes vesículas unilamelares e vesículas multilamelares. Lipossomas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolipídeos, contendo colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas. Em algumas modalidades, um filme de componentes lipídicos é hidratado com uma solução aquosa de fármaco para uma forma de camada lipídica encapsulando o fármaco, o que é de conhecimento geral das pessoas ordinariamente versadas na técnica. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico descritas aqui, neste requerimento de patente, podem ser proporcionadas como um complexo com um composto lipofílico ou composto não-imunogênico, de alto peso molecular construído usando métodos conhecidos na técnica. Adicionalmente, lipossomas podem portar as moléculas de ácido nucleico referidas sobre sua superfície para direcionar e transportar agentes citotóxicos internamente para mediar destruição celular. Um exemplo de complexos associados a ácidos nucleicos é proporcionado na Patente dos Estados Unidos N° 6.011.020.

[00167] Os medicamentos e moléculas de ácido nucleico, respectivamente, da presente invenção também podem ser acoplados com polímeros solúveis como veículos de fármacos direcionáveis. Os polímeros referidos podem incluir polivinilpirrolidona, copolímero de

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51/151 pirano, polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, polihidroxietilaspanamidafenol, ou polietilenoóxidopolilisina substituída com resíduos palmitoíla. Além disso, os medicamentos e moléculas de ácido nucleico, respectivamente, da presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis úteis para obter liberação controlada de uma drag, por exemplo, ácido poliláctico, poliépsilon capro lactona, ácido polihidróxi butírico, poliortoésteres, poliacetais, polidiidropiranos, policianoacrilatos e copolímeros em bloco reticulados ou anfipáticos de hidrogéis.

[00168] Caso desejado, a composição farmacêutica e medicamento, respectivamente, a serem administrados também podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares nãotóxicas tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, e outras substâncias tais como, por exemplo, acetato de sódio, e oleato de trietanolamina.

[00169] O regime de dosagem utilizando as moléculas de ácido nucleico e medicamentos, respectivamente, da presente invenção é selecionado de acordo com uma variedade de fatores incluindo tipo, espécie, idade, pedo, sexo e condição médica do paciente; a gravidade da condição a ser tratada; a via de administração; a função renal e hepática do paciente; e o aptâmero em particular ou sal do mesmo empregado. Um médico ou veterinário ordinariamente versado pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz do fármaco requerida para prevenir, neutralizar ou interromper o progresso da condição.

[00170] Níveis plasmáticos eficazes do ácido nucleico de acordo com a presente invenção preferencialmente variam de 500 fM a 500 μΜ no tratamento de quaisquer das doenças reveladas aqui, neste requerimento de patente.

[00171] As moléculas de ácido nucleico e medicamentos,

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52/151 respectivamente, da presente invenção podem preferencialmente ser administrados em uma única dose diária, a cada dois ou três dias, semanalmente, a cada duas semanas, em uma única dose mensal ou a cada três meses.

[00172] Está dentro da presente invenção que o medicamento conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, constitua a composição farmacêutica revelada aqui, neste requerimento de patente.

[00173] Em um aspecto adicional a presente invenção se refere a um método para o tratamento de um indivíduo que esteja necessitando de semelhante tratamento, por meio do qual o método compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamente ativa de no mínimo um dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o indivíduo sofre de uma doença ou está em risco de desenvolver a referida doença, por meio da qual a doença é qualquer uma das reveladas aqui, neste requerimento de patente, particularmente qualquer uma das doenças reveladas em conexão com o uso de quaisquer dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medicamento.

[00174] Conforme preferencialmente usado aqui, neste requerimento de patente, um diagnóstico ou agente de diagnóstico ou meio diagnóstico é adequado para detectar, quer diretamente ou indiretamente SDF-1 conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, em conexão com os vários distúrbios e doenças descritos aqui, neste requerimento de patente. O diagnóstico é adequada para a detecção e/ou o seguimento de quaisquer dos distúrbios e doenças, respectivamente, descritos aqui, neste requerimento de patente. Semelhante detecção é possível através da ligação dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção a SDF-1. Semelhante ligação pode ser detectada quer diretamente quer indiretamente. Os

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53/151 métodos e meios respectivos são de conhecimento daqueles versados na técnica. Entre outros, os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem compreender uma marcação a qual permite a detecção dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, preferencialmente o ácido nucleico liga a SDF-1. Uma marcação semelhante é preferencialmente selecionada entre o grupo compreendendo marcaçãos radioativas, enzimáticas e fluorescentes. Em princípio, todos os testes conhecidos desenvolvidos para anticorpos podem ser adotados para os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção visto que o anticorpo de ligação-alvo é substituído por um ácido nucleico de ligação-alvo. Em provas de anticorpo usando anticorpos de ligação-alvo não marcados a detecção é feita preferencialmente por um anticorpo secundário o qual é modificado com marcaçãos radioativas, enzimáticas e fluorescentes e ligam ao anticorpo de ligação-alvo em seu fragmento Fc. No caso de um ácido nucleico, preferencialmente um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico é modificado com uma marcação semelhante, por meio da qual preferencialmente uma marcação semelhante é selecionada entre o grupo compreendendo biotina, Cy-3 e Cy-5, e a marcação referida é detectada por um anticorpo dirigido contra a marcação referida, por exemplo, um anticorpo anti-biotina, um anticorpo anti-Cy3 ou um anticorpo anti-Cy5, ou - no caso que a marcação é biotina - a marcação é detectada por estreptavidina ou avidina as quais ligam naturalmente a biotina. O referido anticorpo, estreptavidina ou avidina por sua vez é preferencialmente modificado com uma marcação respectiva, por exemplo, uma marcação radioativa, enzimática ou fluorescente (como um anticorpo secundário).

[00175] Em uma modalidade adicional as moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção são detectadas ou analisadas por

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54/151 um segundo meio de detecção, em que o referido meio de detecção é um sinal molecular. A metodologia de sinal molecular é de conhecimento das pessoas versadas na técnica. Em resumo, sondas de ácidos nucleicos as quais também são referidas como sinais moleculares, são um complemento reverso para a amostra de ácidos nucleicos a ser detectada e hibridizam devido a isto a uma parte da amostra de ácido nucleico a ser detectada. Ao ligar à amostra de ácido nucleico os grupos fluorofóricos do sinal molecular são separados o que resulta em uma mudança do sinal de fluorescência, preferencialmente uma mudança na intensidade. Esta mudança se correlaciona com a quantidade da amostra de ácidos nucleicos presente.

[00176] Será entendido por uma pessoa versada na técnica que devido à relação resumida aqui, neste requerimento de patente, entre SDF-1 e seu receptor correspondente, as doenças e condições as quais podem ser diagnosticadas usando as moléculas de ácido nucleico da presente invenção, são, em princípio, as mesmas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, em conexão com o uso das referidas moléculas de ácido nucleico para o tratamento e/ou prevenção da referida doença.

[00177] À parte disto, usos adicionais das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção residem em uma redução na hematopoiese, uma redução na invasão ou metástase, uma redução no desenvolvimento e quimiotaxia de células B, uma redução na quimoatração de células T e uma indução de parada de crescimento de apoptose.

[00178] Em conexão com a detecção de SDF-1 um método preferencial compreende as seguintes etapas:

(a) proporcionar uma amostra a qual deve ser testada para a presença de SDF-1,

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55/151 (b) proporcionar um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, (c) reagir a amostra com o ácido nucleico, preferencialmente em um vaso de reação por meio do qual a etapa (a) pode ser realizada antes da etapa (b), ou a etapa (b) realizada antes da etapa (a).

[00179] Em uma modalidade preferencial é proporcionada uma etapa adicional d), a qual consiste na detecção da reação da amostra com o ácido nucleico. Preferencialmente, o ácido nucleico da etapa b) é imobilizado a uma superfície. A superfície pode ser a superfície de um vaso de reação tal como um tubo de reação, uma cavidade de uma lâmina, ou a superfície de um dispositivo contido em semelhante vaso de reação tal como, por exemplo, uma conta. A imobilização do ácido nucleico à superfície pode ser feita por quaisquer meios de conhecimento daqueles versados na técnica incluindo, mas não limitados a, ligações não-covalentes ou covalentes. Preferencialmente, a ligação é estabelecida através de uma ligação química covalente entre a superfície e o ácido nucleico. No entanto, também está dentro da presente invenção que o ácido nucleico é indiretamente imobilizado a uma superfície, por meio da qual semelhante imobilização indireta envolve o uso de um componente adicional ou um par de parceiros de interação. Semelhante componente adicional é preferencialmente um composto o qual especificamente interage com o ácido nucleico a ser imobilizado o qual também é referido como parceiro de interação, e portanto media a fixação do ácido nucleico à superfície. O parceiro de interação é preferencialmente selecionado entre o grupo compreendendo ácidos nucleicos, polipeptídeos, proteínas e anticorpos. Preferencialmente, o parceiro de interação é um anticorpo, mais preferencialmente um anticorpo monoclonal. Alternativamente, o parceiro de interação é um ácido nucleico, preferencialmente um ácido

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56/151 nucleico funcional. Mais preferencialmente semelhante ácido nucleico funcional é selecionado entre o grupo compreendendo aptâmeros, spiegelmeros, e ácidos nucleicos os quais são no mínimo parcialmente complementares ao ácido nucleico. Em uma modalidade alternativa adicional, a ligação do ácido nucleico à superfície é mediada por um parceiro de interação multipartite. Semelhante parceiro de interação multipartite é preferencialmente um par de parceiros de interação ou um parceiro de interação consistindo em um primeiro membro e um segundo membro, por meio do qual o primeiro membro é compreendido por ou anexado ao ácido nucleico e o segundo membro é anexado a ou compreendido pela superfície. O parceiro de interação multipartite é preferencialmente selecionado entre o grupo de pares de parceiros de interação compreendendo biotina e avidina, biotina e estreptavidina, e biotina e neutravidina. Preferencialmente, o primeiro membro do par de parceiros de interação é biotina.

[00180] Um resultado preferencial de semelhante método é a formação de um complexo imobilizado de SDF-1 e o ácido nucleico, por meio do qual mais preferencialmente o referido complexo é detectado. Está dentro de uma modalidade que a partir do complexo o SDF-1 é detectado.

[00181] O método para a detecção de SDF-1 também compreende que a amostra é removida do vaso de reação o qual preferencialmente foi usado para realizar a etapa c).

[00182] O método compreende em uma modalidade adicional também a etapa de imobilizar um parceiro de interação de SDF-1 sobre uma superfície, preferencialmente uma superfície conforme definido acima, por meio da qual o parceiro de interação é definido conforme aqui, neste requerimento de patente, e preferencialmente como acima em conexão com o método respectivo e mais preferencialmente compreende ácidos nucleicos, polipeptídeos,

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57/151 proteínas e anticorpos em suas várias modalidades. Nesta modalidade, um meio de detecção particularmente preferencial é um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, por meio do qual o ácido nucleico referido preferencialmente pode ser marcado ou não marcado. No caso do ácido nucleico referido ser marcado, pode ser detectado diretamente ou indiretamente. Semelhante detecção também pode envolver o uso de um segundo meio de detecção o qual é, preferencialmente, também selecionado entre o grupo compreendendo ácidos nucleicos, polipeptídeos, proteínas e modalidades nas várias modalidades descritas aqui, neste requerimento de patente. Semelhantes meios de detecção são preferencialmente específicos para o ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade mais preferencial, o segundo meio de detecção é um sinal molecular. Ou o ácido nucleico ou o segundo meio de detecção ou ambos podem compreender em uma modalidade preferencial uma marcação de detecção. A marcação de detecção é preferencialmente selecionada entre o grupo compreendendo biotina, uma marcação de bromo-desoxiuridina, uma marcação de digoxigenina, uma marcação de fluorescência, uma marcação UV, uma radio-marcação, e uma molécula queladora. Alternativamente, o segundo meio de detecção interage com a marcação de detecção a qual é preferencialmente contida por, compreendida por ou anexada ao ácido nucleico. Combinações particularmente preferenciais são como se segue:

a marcação de detecção é biotina e o segundo meio de detecção é um anticorpo dirigido contra biotina, ou em que a marcação de detecção é biotina e o segundo meio de detecção é uma avidina ou uma molécula carrregando avidina, ou em que a marcação de detecção é biotina e o segundo meio de

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58/151 detecção é uma estreptavidina ou uma molécula carrregando estretavidina, ou em que a marcação de detecção é biotina e o segundo meio de detecção é uma neutravidina ou uma molécula carrregando neutravidina, ou em que a marcação de detecção é uma bromodesoxiuridina e o segundo meio de detecção é um anticorpo dirigido contra bromo-desoxiuridina, or em que a marcação de detecção é uma digoxigenina e o segundo meio de detecção é um anticorpo dirigido contra digoxigenina, ou em que a marcação de detecção é um quelador e o segundo meio de detecção é um radionuclídeo, por meio da qual é preferencial que a referida marcação de detecção seja anexada ao ácido nucleico. Deve ser reconhecido que este tipo de combinação também é aplicável à modalidade em que o ácido nucleico é anexado à superfície. Em semelhante modalidade é preferencial que a marcação de detecção seja anexada ao parceiro de interação.

[00183] Finalmente, também está dentro da presente invenção que o segundo meio de detecção é detectado usando um terceiro meio de detecção, preferencialmente o terceiro meio de detecção é uma enzima, mais preferencialmente apresentando uma reação enzimática na detecção do segundo meio de detecção, ou o terceiro meio de detecção é um meio para detectar radiação, mais preferencialmente radiação emitida por um radionuclídeo. Preferencialmente, o terceiro meio de detecção é especificamente detectar e/ou interagir com o segundo meio de detecção.

[00184] Além disso, na modalidade com um parceiro de interação de SDF-1 sendo imobilizado sobre uma superfície e o ácido nucleico de acordo com a presente invenção sendo preferencialmente adicionado ao complexo formado entre o parceiro de interação e o

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SDF-1, a amostra pode ser removida da reação, mais preferencialmente do vaso de reação onde são realizadas a etapa c) e/ou a etapa d).

[00185] Em uma modalidade, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção compreende uma porção de fluorescência e por meio da qual a fluorescência da porção de fluorescência é diferente na formação de complexo entre o ácido nucleico e SDF-1 e SDF-1 livre.

[00186] Em uma modalidade adicional, o ácido nucleico é um derivado do ácido nucleico de acordo com a presente invenção, por meio da qual o derivado do ácido nucleico compreende no mínimo um derivado fluorescente de adenosina substituindo adenosina. Em uma modalidade preferencial o derivado fluorescente de adenosina é etenoadenosina.

[00187] Em uma modalidade adicional, o complexo consistindo no derivado do ácido nucleico de acordo com a presente invenção e o SDF-1 é detectado usando fluorescência.

[00188] Em uma modalidade do método um sinal é criado na etapa (c) ou na etapa (d) e preferencialmente o sinal está correlacionado com a concentração de SDF-1 na amostra.

[00189] Em um aspecto preferencial, as provas podem ser realizadas em lâminas de 96 cavidades, onde os componentes são imobilizados nos vasos de reação conforme descrito acima e as cavidades agem como vasos de reação.

[00190] O ácido nucleico da invenção pode ser usado adicionalmente como matéria-prima para design de fármaco. Basicamente há duas abordagens possíveis. Uma abordagem é a triagem de bibliotecas de compostos visto que semelhantes bibliotecas de compostos são preferencialmente bibliotecas de compostos de baixo peso molecular. Em uma modalidade, a triagem é uma triagem de alta produtividade. Preferencialmente, triagem de alta produtividade

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60/151 é a avaliação de tentativa e erro rápida e eficiente de compostos em uma prova à base de alvo. No melhor caso as análises são realizadas por algumas medições colormáticas. Bibliotecas conforme usado em conexão com isso são de conhecimento de uma pessoa versada na técnica.

[00191] Alternativamente, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser usado para design do fundamento racional de fármacos. Preferencialmente, design de fármaco racional é o design de uma estrutura de orientação farmacêutica. Iniciando a partir da estrutura tridimensional do alvo a qual é tipicamente identificada por métodos tais como cristalografia de raios X ou espectroscopia por ressonância magnética nuclear, programas de computador são usados para pesquisar através de bancos de dados contendo estruturas de muitos compostos químicos diferentes. A seleção é feita por um computador, os compostos identificados podem ser em seguida testados no laboratório.

[00192] O design racional de fármacos pode se iniciar a partir de quaisquer dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção e envolve uma estrutura, preferencialmente uma estrutura tridimensional, a qual é similar à estrutura dos ácidos nucleicos da invenção ou idêntica às partes mediando ligação da estrutura dos ácidos nucleicos da invenção. Em qualquer caso semelhante estrutura ainda mostra a mesma característica de ligação ou uma característica de ligação similar aos ácidos nucleicos da invenção. Em quer uma etapa adicional ou como uma etapa alternativa no design racional de fármacos preferencialmente a estrutura tridimensional destas partes dos ácidos nucleicos ligando ao neurotransmissor são simuladas por grupos químicos os quais são diferentes de nucleotídeos e ácidos nucleicos. Por esta simulação pode ser desenhado um composto diferente dos ácidos nucleicos. O composto referido é

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61/151 preferencialmente uma molécula pequena ou um peptídeo.

[00193] Em caso de triagem de bibliotecas de compostos, tal como usando uma prova competitiva as quais são de conhecimento de uma pessoa versada nas técnicas, SDF-1 análogos, SDF-1 agonistas ou antagonistas de SDF-1 apropriados podem ser encontrados. As provas competitivas referidas podem ser estabelecidas como se segue. O ácido nucleico da invenção, preferencialmente um spiegelmero o qual é um L-ácido nucleico de ligação-alvo, é ligado a uma fase sólida. De modo a identificar SDF-1 análogos marcados SDF-1 pode ser adicionado à prova. Um análogo potencial competiria com as moléculas de SDF-1 ligando ao spiegelmero o qual iria junto com uma redução no sinal obtido pela marcação respectiva. Triagem para agonistas ou antagonistas pode envolver o uso de uma prova de cultura celular conforme de conhecimento daqueles versados na técnica.

[00194] O kit de acordo com a presente invenção pode compreender no mínimo um ou vários dos ácidos nucleicos da invenção. Adicionalmente, o kit pode compreender no mínimo um ou vários controles positivos ou negativos. Um controle positivo pode ser, por exemplo, SDF-1, particularmente o SDF-1 contra o qual o ácido nucleico da invenção é selecionado ou ao qual liga, preferencialmente, em forma líquida. Um controle negativo pode ser, por exemplo, um peptídeo o qual é definido em termos de propriedades biofísicas similares a SDF-1, mas o qual não é reconhecido pelos ácidos nucleicos da invenção. Além disso, o kit referido pode compreender um ou vários tampões. Os vários ingredientes podem ser contidos no kit em forma seca ou liofilizada ou solvidos em um líquido. O kit pode compreender um ou vários recipientes os quais por sua vez podem conter um ou vários ingredientes do kit. Em uma modalidade adicional, o kit compreende uma instrução ou folheto de instruções o qual

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62/151 proporcionao ao usuário informação sobre como usar o kit e seus vários ingredientes.

[00195] Conforme preferencialmente usado aqui, neste requerimento de patente, o termo tratamento compreende em uma modalidade preferencial adicionalmente ou alternativamente prevenção e/ou seguimento.

[00196] A determinação farmacêutica e bioanalítica do ácido nucleico de acordo com a presente invenção é elementarmente para a avaliação de seu perfil farmacocinético e biodinâmico em vários humores, tecidos e órgãos do corpo humano e não-humano. Para semelhante finalidade, podem ser usados quaisquer dos métodos de detecção revelados aqui, neste requerimento de patente, ou de conhecimento de uma pessoa versada na técnica. Em um aspecto adicional da presente invenção é proporcionada uma prova de hibridização de sanduíche para a detecção do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Dentro do teste de detecção são usadas uma sonda de captura e uma sonda de detecção. A sonda de captura é complementar à primeira parte e a sonda de detecção à segunda parte do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Ambas, sonda de captura e de detecção, podem ser formadas por nucleotídeos de DNA, nucleotídeos de DNA modificados, nucleotídeos de RNA modificados, nucleotídeos de RNA, nucleotídeos de LNA e/ou nucleotídeos de PNA.

[00197] Portanto, a sonda de captura compreende um trecho de sequência complementar à extremidade 5' do ácido nucleico de acordo com a presente invenção e a sonda de detecção compreende um trecho de sequência complementar à extremidade 3' do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Neste caso, a sonda de captura é imobilzada para uma superfície ou matriz através de sua extremidade 5' por meio da qual a sonda de captura pode ser imobilzada

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63/151 diretamente em sua extremidade 5' ou através de um ligante entre sua extremidade 5' e a superfície ou matriz. No entanto, em princípio o ligante pode ser encadeado a cada nucleotídeo da sonda de captura. O ligante pode ser formado por ligantees hidrofílicos de versados na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA, nucleotídeos de D-DNA modificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeos de D-RNA modificados, nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA, nucleotídeos de L-RNA, nucleotídeos de L-DNA, nucleotídeos de LRNA modificados, nucleotídeos de L-DNA modificados e/ou nucleotídeos de L-LNA.

[00198] Alternativamente, a sonda de captura compreende um trecho de sequência complementar à extremidade 3' do ácido nucleico de acordo com a presente invenção e a sonda de detecção compreende um trecho de sequência complementar à extremidade 5' do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Neste caso a sonda de captura é imobilzada para uma superfície ou matriz através de sua extremidade 3' por meio da qual a sonda de captura pode ser imobilzada diretamente em sua extremidade 3' ou através de um ligante entre sua extremidade 3' e a superfície ou matriz. No entanto, em princípio, o ligante pode ser encadeado a cada nucleotídeo do trecho da sequência que é complementar ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção. O ligante pode ser formado por ligantees hidrofílicos de versados na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA, nucleotídeos de D-DNA modificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeos de D-RNA modificados, nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA, nucleotídeos de L-RNA, nucleotídeos de L-DNA, nucleotídeos de L-RNA modificados, nucleotídeos de L-DNA modificados e/ou nucleotídeos de L-LNA.

[00199] O número de nucleotídeos da sonda de captura e detecção que podem hibridizar ao ácido nucleico de acordo com a presente

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64/151 invenção é variável e pode ser dependente do número de nucleotídeos da sonda de captura e/ou detecção e/ou o próprio ácido nucleico de acordo com a presente invenção. O número total de nucleotídeos da sonda de captura e de detecção que podem hibridizar ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção deve ser máximo o número de nucleotídeos que são compreendidos pelo ácido nucleico de acordo com a presente invenção. O número mínimo de nucleotídeos (2 a 10 nucleotídeos) da sonda de detecção e captura deve permitir hibridização à extremidade 5' ou à extremidade 3', respectivamente, do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. De modo a realizar alta especificidade e seletividade entre o ácido nucleico de acordo com a presente invenção e outros ácidos nucleicos ocorrendo em amostras que são analisadas o número total de nucleotídeos da sonda de captura e detecção deve ser ou máximo o número de nucleotídeos que são compreendidos pelo ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[00200] Além disso, a sonda de detecção preferencialmente carrega uma molécula de marcador ou marcação que pode ser detectada conforme previamente descrito aqui, neste requerimento de patente. A molécula de marcador ou marcação pode em princípio ser encadeada a cada nucleotídeo da sonda de detecção. Preferencialmente, a marcação ou marcador está localizada na extremidade 5' ou na extremidade 3' da sonda de detecção, por meio da qual entre os nucleotídeos dentro da sonda de detecção que são complementares ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção, e a marcação pode ser inserido um ligante. O ligante pode ser formado por ligantees hidrofílicos dos versados na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA, nucleotídeos de D-DNA modificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeos de D-RNA modificados, nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA, nucleotídeos de L-RNA, nucleotídeos de L-DNA,

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65/151 nucleotídeos de L-RNA modificados, nucleotídeos de L-DNA modificados e/ou nucleotídeos de L-LNA.

[00201] A detecção do ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser realizada como se segue:

[00202] o ácido nucleico de acordo com a presente invenção hibridisa com uma de suas extremidades à sonda de captura e com a outra extremidade à sonda de detecção. Depois disso a sonda de detecção não ligada é removida, por exemplo, por uma ou várias etapas de lavagem. A quantidade de sonda de detecção ligada a qual preferencialmente carrega uma molécula de marcador ou marcação, pode ser medida em seguida.

[00203] Conforme preferencialmente usado aqui, neste requerimento de patente, os termos doença e distúrbio serão usados em uma maneira intercambiável, caso não indicado ao contrário.

[00204] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo compreendem preferencialmente não pretende limitar o temo seguido ou descrito por semelhante termo. No entanto, em uma modalidade alternativa o termo compreende será entendido no significado de contendo e portanto como limitando o tema seguido ou descrito por semelhante termo.

[00205] As várias SEQ. ID. Nos., a natureza química das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção e as moléculas SDF-1 alvo conforme usado aqui, neste requerimento de patente, a real sequência das mesmas e o número de referência interno são resumidos na tabela seguinte.

[00206] Também foi observado que os ácidos nucleicos foram caracterizados no nível de aptâmero, isto é, D-ácido nucleico (D-RNA) com o D-SDF-1 humano biotinilado (SEQ.ID. 4) ou no nível de Spiegelmero, isto é, L-ácido nucleico (L-RNA) com a configuração natural de SDF-1, o L- SDF-1 (SDF-1 α humano, SEQ-ID. 1). Os

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66/151 diferentes ácidos nucleicos compartilham um nome de referência interno mas uma SEQ. ID para a molécula de D-RNA (Aptâmero) e uma SEQ. ID. para a molécula de L-RNA (Spiegelmero), respectivamente.

TABELA 1 (A)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
1	L-peptídeo	KPVSLSYRCPCRFFES HVARANVKHLKILNTP NCALQIVARLKNNNRQ VCIDPKLKWIQEYLEKA LNK	SDF-1a humano / de macaco / de gato SDF-1 humano / de macaco / de gato
2	L-peptídeo	KPVSLSYRCPCRFFES HVARANVKHLKILNTP NCALQIVARLKNNNRQ VCIDPKLKWIQEYLEKA LNKRFKM	SDF-1 β humano / de macaco / de gato
3	L-peptídeo	KPVSLSYRCPCRFFES HIARANVKHLKILNTPN CALQIVARLKNNNRQV CIDPKLKWIQEYLEKAL NK	SDF-1a murino SDF-1 murino
4	D-peptídeo	KPVSLSYRCPCRFFES HVARANVKHLKILNTP NCALQIVARLKNNNRQ VCIDPKLKWIQEYLEKA LNKRFK-Biotin	D-SDF-1 hu biotinilado

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67/151

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
5	L-RNA (SPIEGELMER )	GCUGUGAAAGCAACA UGUCAAUGAAAGGUA GCCGCAGC	192-A10-001
6	L-RNA (SPIEGELMER )	GCUGUGAAAGUAACA UGUCAAUGAAAGGUA ACCACAGC	192-G10
7	L-RNA (SPIEGELMER )	GCUGUGAAAGUAACA CGUCAAUGAAAGGUA ACCGCAGC	192-F10
8	L-RNA (SPIEGELMER )	GCUGUGAAAGUAACA CGUCAAUGAAAGGUA ACCACAGC	192-B11
9	L-RNA (SPIEGELMER )	GCUGUAAAAGUAACA UGUCAAUGAAAGGUA ACUACAGC	192-C9
10	L-RNA (SPIEGELMER )	GCUGUAAAAGUAACA AGUCAAUGAAAGGUA ACUACAGC	192-E10
11	L-RNA (SPIEGELMER )	GCUGUGAAAGUAACA AGUCAAUGAAAGGUA ACCACAGC	192-C10
12	L-RNA (SPIEGELMER )	GCAGUGAAAGUAACA UGUCAAUGAAAGGUA ACCACAGC	192-D11
13	L-RNA (SPIEGELMER )	GCUGUGAAAGUAACA UGUCAAUGAAAGGUA ACCACUGC	192-G11

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
14	L-RNA (SPIEGELMER )	GCUAUGAAAGUAACA UGUCAAUGAAAGGUA ACCAUAGC	192-H11
15	L-RNA (SPIEGELMER )	GCUGCGAAAGCGACA UGUCAAUGAAAGGUA GCCGCAGC	192-D10
16	L-RNA (SPIEGELMER )	GCUGUGAAAGCAACA UGUCAAUGAAAGGUA GCCACAGC	192-E9
17	L-RNA (SPIEGELMER )	GCUGUGAAAGUAACA UGUCAAUGAAAGGUA GCCGCAGC	192-H9

TABELA 1 (B)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
18	L-RNA (SPIEGELMER )	AGCGUGAAAGUAACA CGUAAAAUGAAAGGU AACCACGCU	191-A6
19	L-RNA (SPIEGELMER )	AAAGYRACAHGUMAA XaUGAAAGGUARC; Xa = A ou ausente	Fórmula-1 Tipo A
20	L-RNA (SPIEGELMER )	AAAGYRACAHGUMAA UGAAAGGUARC	Fórmula-2 Tipo A
21	L-RNA (SPIEGELMER )	AAAGYRACAHGUMAA AUGAAAGGUARC	Fórmula-3 Tipo A

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
22	L-RNA (SPIEGELMER )	AAAGYAACAHGUCAA UGAAAGGUARC	Fórmula-4 Tipo A
23	L-RNA (SPIEGELMER	RSHRYR	Fórmula-5-5' Tipo A
24	L-RNA (SPIEGELMER	YRYDSY	Fórmula-5-3' Tipo A
25	L-RNA (SPIEGELMER )	CUGUGAAAGCAACAU GUCAAUGAAAGGUAG CCGCAG	192-A10-002
26	L-RNA (SPIEGELMER )	UGUGAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC CGCA	192-A10-003
27	L-RNA (SPIEGELMER )	GUGAAAGCAACAUGU CAAUGAAAGGUAGCC GC	192-A10-004
28	L-RNA (SPIEGELMER )	UGAAAGCAACAUGUC AAUGAAAGGUAGCCG	192-A10-005
29	L-RNA (SPIEGELMER )	GAAAGCAACAUGUCA AUGAAAGGUAGCC	192-A10-006
30	L-RNA (SPIEGELMER )	AAAGCAACAUGUCAA UGAAAGGUAGC	192-A10-007
31	L-RNA (SPIEGELMER )	GCGUGAAAGCAACAU GUCAAUGAAAGGUAG CCGCGC	192-A10-008

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
32	L-RNA (SPIEGELMER )	GCGCGAAAGCAACAU GUCAAUGAAAGGUAG CCGCGC	192-A10-015
33	L-RNA (SPIEGELMER )	GCGGAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC CCGC	192-A10-014
34	L-RNA (SPIEGELMER )	CGUGAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC CGCG	192-A10-016
35	L-RNA (SPIEGELMER )	GCGCAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC GUGC	192-A10-017
36	L-RNA (SPIEGELMER )	GUGCAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC GCGC	192-A10-018

TABELA 1 (C)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
37	L-RNA (SPIEGELME R)	CGCGAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC CGUG	192-A10-019
38	L-RNA (SPIEGELME R)	GGGCAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC GCCC	192-A10-020
39	L-RNA (SPIEGELME R)	GGCCAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC GGCC	192-A10-021

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
40	L-RNA (SPIEGELME R)	GCCCAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC GGGC	192-A10-022
41	L-RNA (SPIEGELME R)	CCCCAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC GGGG	192-A10-023
42	L-RNA (SPIEGELME R)	X2BBBS; X2 = S ou ausente	Fórmula-6-5' Tipo A
43	L-RNA (SPIEGELME R)	SBBVX3; X3 = S ou ausente	Fórmula-6-3' Tipo A
44	L-RNA (SPIEGELME R)	X1X2NNBV; X1 = R ou ausente, X2 = S ou ausente	Fórmula-7-5' Tipo A
45	L-RNA (SPIEGELME R)	BNBNX3X4; X3 = R ou ausente, X4 = Y ou ausente	Fórmula-7-3' Tipo A
46	L-RNA (SPIEGELME R)	AGCGUGGUGUGAUC UAGAUGUAGUGGCU GAUCCUAGUCAGGUA CGCU	193-C2-001
47	L-RNA (SPIEGELME R)	AGCGUGGUGUGAUC UAGAUGUAUUGGCUG AUCCUAGUCAGGUAC GCU	193-G2-001

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
48	L-RNA (SPIEGELME R)	AGCGUGGUGUGAUC UAGAUGUAAUGGCUG AUCCUAGUCAGGUGC GCU	193-F2-001
49	L-RNA (SPIEGELME R)	GCGAGGUGUGAUCU AGAUGUAGUGGCUGA UCCUAGUCAGGUGC GC	193-G1-002
50	L-RNA (SPIEGELME R)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAGUGGCUGA UCCUAGUCAGGUGC GC	193-D2-002
51	L-RNA (SPIEGELME R)	GCAUGGUGUGAUCUA GAUGUAGUGGCUGA UCCUAGUCAGGUGCC C	193-A1-002
52	L-RNA (SPIEGELME R)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAAUGGCUGA UCCUAGUCAGGGACG C	193-D3-002

TABELA 1 (D)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
53	L-RNA (SPIEGELME R)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAGAGGCUGA UCCUAGUCAGGUACG C	193-B3-002

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
54	L-RNA (SPIEGELME R)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAAAGGCUGA UCCUAGUCAGGUACG C	193-H3-002
55	L-RNA (SPIEGELME R)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAGUGGCUG UUCCUAGUCAGGUAU GC	193-E3-002
56	L-RNA (SPIEGELME R)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAGUGGCUGA UCCUAGUUAGGUACG C	193-D1-002
57	L-RNA (SPIEGELME R)	GUGUGAUCUAGAUGU ADWGGCUGWUCCUA GUYAGG	Fórmula-1 Tipo B
58	L-RNA (SPIEGELME R)	GUGUGAUCUAGAUGU ADUGGCUGAUCCUAG UCAGG	Fórmula-2 Tipo B
59	L-RNA (SPIEGELME R)	XiGCRWG; Xi = A ou ausente	Fórmula-3-5' Tipo B
60	L-RNA (SPIEGELME R)	KRYSCX4; X4 = U ou ausente	Fórmula-3-3' Tipo B
61	L-RNA (SPIEGELME R)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAGUGGCUGA UCCUAGUCAGGUACG C	193-C2-002

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
62	L-RNA (SPIEGELME R)	CGUGGUGUGAUCUA GAUGUAGUGGCUGA UCCUAGUCAGGUACG	193-C2-003
63	L-RNA (SPIEGELME R)	GUGGUGUGAUCUAG AUGUAGUGGCUGAUC CUAGUCAGGUAC	193-C2-004
64	L-RNA (SPIEGELME R)	UGGUGUGAUCUAGAU GUAGUGGCUGAUCC UAGUCAGGUA	193-C2-005
65	L-RNA (SPIEGELME R)	GGUGUGAUCUAGAU GUAGUGGCUGAUCC UAGUCAGGU	193-C2-006
66	L-RNA (SPIEGELME R)	GUGUGAUCUAGAUGU AGUGGCUGAUCCUAG UCAGG	193-C2-007
67	L-RNA (SPIEGELME R)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAUUGGCUGA UCCUAGUCAGGUACG C	193-G2-012

TABELA 1 (E)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
68	L-RNA (SPIEGELME R)	GCGCGGUGUGAUCU AGAUGUAUUGGCUGA UCCUAGUCAGGCGC GC	193-G2-013

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
69	L-RNA (SPIEGELME R)	GCGCGUGUGAUCUA GAUGUAUUGGCUGAU CCUAGUCAGGGCGC	193-G2-014
70	L-RNA (SPIEGELME R)	GGGCGUGUGAUCUA GAUGUAUUGGCUGAU CCUAGUCAGGGCCC	193-G2-015
71	L-RNA (SPIEGELME R)	GGCCGUGUGAUCUA GAUGUAUUGGCUGAU CCUAGUCAGGGGCC	193-G2-016
72	L-RNA (SPIEGELME R)	GCCCGUGUGAUCUA GAUGUAUUGGCUGAU CCUAGUCAGGGGGC	193-G2-017
73	L-RNA (SPIEGELME R)	X2SSBS; X2 = G ou ausente	Fórmula-4-5' Tipo B
74	L-RNA (SPIEGELME R)	BVSSX3; X3 = C ou ausente	Fórmula-4-3' Tipo B
75	L-RNA (SPIEGELME R)	X1GCGUG; X1 = A ou ausente	Fórmula-5-5' Tipo B
76	L-RNA (SPIEGELME R)	UACGCX4; X4 = U ou ausente	Fórmula-5-3' Tipo B
77	L-RNA (SPIEGELME R)	X1X2SVNS; X1 = A ou ausente, X2 = G ou ausente	Fórmula-6-5' Tipo B

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
78	L-RNA (SPIEGELME R)	BVBSX3X4; X3 = C ou ausente, X4 = U ou ausente	Fórmula-6-3' Tipo B
79	L-RNA (SPIEGELME R)	GUGCUGCGGGGGUU AGGGCUAGAAGUCG GCCUGCAGCAC	197-B2
80	L-RNA (SPIEGELME R)	AGCGUGGCGAGGUU AGGGCUAGAAGUCG GUCGACACGCU	191-D5-001
81	L-RNA (SPIEGELME R)	GUGUUGCGGAGGUU AGGGCUAGAAGUCG GUCAGCAGCAC	197-H1
82	L-RNA (SPIEGELME R)	CGUGCGCUUGAGAUA GGGGUUAGGGCUUA AAGUCGGCUGAUUCU CACG	190-A3-001
83	L-RNA (SPIEGELME R)	AGCGUGAAGGGGUU AGGGCUCGAAGUCG GCUGACACGCU	191-A5

TABELA 1 (F)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
84	L-RNA (SPIEGELME R)	GUGCUGCGGGGGUU AGGGCUCGAAGUCG GCCCGCAGCAC	197-H3
85	L-RNA (SPIEGELME R)	GUGUUCCCGGGGUU AGGGCUUGAAGUCG GCCGGCAGCAC	197-B1

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
86	L-RNA (SPIEGELME R)	GUGUUGCAGGGGUU AGGGCUUGAAGUCG GCCUGCAGCAC	197-E3
87	L-RNA (SPIEGELME R)	GUGCUGCGGGGGUU AGGGCUCAAAGUCGG CCUGCAGCAC	197-H2
88	L-RNA (SPIEGELME R)	GUGCUGCCGGGGUU AGGGCUAAAGUCGGCCGACAGCA C	197-D1
89	L-RNA (SPIEGELME R)	GUGCUGUGGGGGUC AGGGCUAGAAGUCG GCCUGCAGCAC	197-D2
90	L-RNA (SPIEGELME R)	GGUYAGGGCUHRXaA GUCGG; Xa = A ou ausente	Fórmula-1 Tipo C
91	L-RNA (SPIEGELME R)	GGUYAGGGCUHRAAG UCGG	Fórmula-2 Tipo C
92	L-RNA (SPIEGELME R)	GGUYAGGGCUHRAG UCGG	Fórmula-3 Tipo C
93	L-RNA (SPIEGELME R)	GGUUAGGGCUHGAA GUCGG	Fórmula-4 Tipo C
94	L-RNA (SPIEGELME R)	UGAGAUAGGGGUUA GGGCUUAAAGUCGG CUGAUUCUCA	190-A3-003

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
95	L-RNA (SPIEGELME R)	GAGAUAGGGGUUAG GGCUUAAAGUCGGCU GAUUCUC	190-A3-004
96	L-RNA (SPIEGELME R)	GGGGUUAGGGCUUA AAGUCGGCUGAUUCU	190-A3-007
97	L-RNA (SPIEGELME R)	GCGUGGCGAGGUUA GGGCUAGAAGUCGG UCGACACGC	191-D5-002
98	L-RNA (SPIEGELME R)	CGUGGCGAGGUUAG GGCUAGAAGUCGGU CGACACG	191-D5-003
99	L-RNA (SPIEGELME R)	CGGGCGAGGUUAGG GCUAGAAGUCGGUC GACCG	191-D5-004
100	L-RNA (SPIEGELME R)	CGGGCGAGGUUAGG GCUAGAAGUCGGUC GCCCG	191-D5-005

TABELA 1 (G)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
101	L-RNA (SPIEGELME R)	CGGCGAGGUUAGGG CUAGAAGUCGGUCGC CG	191-D5-006
102	L-RNA (SPIEGELME R)	CGGGAGGUUAGGGC UAGAAGUCGGUCCCG	191-D5-007

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 89/208

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
103	L-RNA (SPIEGELME R)	GGGAGGUUAGGGCU AGAAGUCGGUCCC	191-D5-010
104	L-RNA (SPIEGELME R)	CCGCGGUUAGGGCU AGAAGUCGGGCGG	191-D5-017
105	L-RNA (SPIEGELME R)	CCCGGGUUAGGGCU AGAAGUCGGCGGG	191-D5-029
106	L-RNA (SPIEGELME R)	GGCGGGUUAGGGCU AGAAGUCGGCGCC	191-D5-024
107	L-RNA (SPIEGELME R)	CCCGCGGUUAGGGC UAGAAGUCGGGCGG G	191-D5-017-29a
108	L-RNA (SPIEGELME R)	GCCGCGGUUAGGGC UAGAAGUCGGGCGG C	191-D5-017-29b
109	L-RNA (SPIEGELME R)	CCCCGGGUUAGGGC UAGAAGUCGGCGGG G	191-D5-019-29a
110	L-RNA (SPIEGELME R)	CGGCGGGUUAGGGC UAGAAGUCGGCGCC G	191-D5-024-29a
111	L-RNA (SPIEGELME R)	GGGCGGGUUAGGGC UAGAAGUCGGCGCCC	191-D5-024-29b

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
112	L-RNA (SPIEGELME R)	UGCUGCGGGGGUUA GGGCUAGAAGUCGG CCUGCAGCA	197-B2-001
113	L-RNA (SPIEGELME R)	GCUGCGGGGGUUAG GGCUAGAAGUCGGC CUGCAGC	197-B2-002
114	L-RNA (SPIEGELME R)	CUGCGGGGGUUAGG GCUAGAAGUCGGCCU GCAG	197-B2-003
115	L-RNA (SPIEGELME R)	UGCGGGGGUUAGGG CUAGAAGUCGGCCUG CA	197-B2-004
116	L-RNA (SPIEGELME R)	GCGGGGGUUAGGGC UAGAAGUCGGCCUGC	197-B2-005

TABELA 1 (H)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
117	L-RNA (SPIEGELME R)	GCCGGGGUUAGGGC UAGAAGUCGGCCGG C	197-B2-006
118	L-RNA (SPIEGELME R)	GGCCGGGGUUAGGG CUAGAAGUCGGCCG GCC	197-B2-006-31a
119	L-RNA (SPIEGELME R)	CGCCGGGGUUAGGG CUAGAAGUCGGCCG GCG	197-B2-006-31b

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 91/208

81/151

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
120	L-RNA (SPIEGELME R)	RKSBUSNVGR	Fórmula-5-5' Tipo C
121	L-RNA (SPIEGELME R)	YYNRCASSMY	Fórmula-5-3' Tipo C
122	L-RNA (SPIEGELME R)	RKSBUGSVGR	Fórmula-6-5' Tipo C
123	L-RNA (SPIEGELME R)	YCNRCASSMY	Fórmula-6-3' Tipo C
124	L-RNA (SPIEGELME R)	XsSSSV; Xs = S ou ausente	Fórmula-7-5' Tipo C
125	L-RNA (SPIEGELME R)	BSSSXs; Xs = S ou ausente	Fórmula-7-3' Tipo C
126	L-RNA (SPIEGELME R)	SGGSV	Fórmula-8-5' Tipo C
127	L-RNA (SPIEGELME R)	YSCCS	Fórmula-8-3' Tipo C
128	L-RNA (SPIEGELME R)	GCSGG	Fórmula-9-5' Tipo C

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 92/208

82/151

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
129	L-RNA (SPIEGELME R)	CCKGC	Fórmula-9-3' Tipo C
130	L-RNA (SPIEGELME R)	SSSSR	Fórmula-10-5' Tipo C
131	L-RNA (SPIEGELME R)	YSBSS	Fórmula-10-3' Tipo C

TABELA 1 (I)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
132	L-RNA (SPIEGELME R)	5'-40 kDa-PEG- GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAUUGGCUGA UCCUAGUCAGGUACG C	193-G2-012-5'- PEG
133	L-RNA (SPIEGELME R)	5'-40 kDa-PEG- GCGUGAAAGCAACAU GUCAAUGAAAGGUAG CCGCGC	192-A10-008-5'- PEG
134	L-RNA (SPIEGELME R)	5'-40 kDa-PEG- CGGGAGGUUAGGGC UAGAAGUCGGUCCCG	191-D5-007-5'- PEG
135	L-RNA (SPIEGELME R)	5'-40 kDa-PEG- GCCGGGGUUAGGGC UAGAAGUCGGCCGG C	197-B2-006-5'- PEG

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 93/208

83/151

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
136	L-RNA (SPIEGELME R)	5'-40 kDa-PEG- CGCCGGGGUUAGGG CUAGAAGUCGGCCG GCG	197-B2-006-31b- 5'PEG
137	L-RNA (SPIEGELME R)	5'-40 kDa-PEG- GCUGUGAAAGCAACA UGUCAAUGAAAGGUA GCCGCAGC	192-A10-001-5'- PEG 192-A10-001-5'- PEG40
138	L-RNA (SPIEGELME R)	UAAGGAAACUCGGUC UGAUGCGGUAGCGC UGUGCAGAGCU	Spiegelmero Controle
139	L-RNA (SPIEGELME R)	5'-30 kDa-PEG- GCUGUGAAAGCAACA UGUCAAUGAAAGGUA GCCGCAGC	192-A10-001-5'- PEG30
140	L-RNA (SPIEGELME R)	5'-100 kDa-HES- GCUGUGAAAGCAACA UGUCAAUGAAAGGUA GCCGCAGC	192-A10-001-5'- HES100
141	L-RNA (SPIEGELME R)	5'-130 kDa-HES- GCUGUGAAAGCAACA UGUCAAUGAAAGGUA GCCGCAGC	192-A10-001-5'- HES130
142	L-RNA (SPIEGELME R)	CGUGGUCCGUUGUG UCAGGUCUAUUCGCC CCGGUGCAGGGCAU CCGCG	194-A2-001

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 94/208

84/151

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
143	L-RNA (SPIEGELME R)	GCAGUGUGACGCGG ACGUGAUAGGACAGA GCUGAUCCCGCUCAG GUGAG	196-B12-003
144	L-RNA (SPIEGELME R)	CAACAGCAGUGUGAC GCGGACGUGAUAGG ACAGAGCUGAUCCCG CUCAG	196-B12-004

TABELA 1 (J)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
145	D-RNA (APTÂMERO)	GCUGUGAAAGCAACA UGUCAAUGAAAGGUA GCCGCAGC	192-A10-001
146	D-RNA (APTÂMERO)	GCUGUGAAAGUAACA UGUCAAUGAAAGGUA ACCACAGC	192-G10
147	D-RNA (APTÂMERO)	GCUGUGAAAGUAACA CGUCAAUGAAAGGUA ACCGCAGC	192-F10
148	D-RNA (APTÂMERO)	GCUGUGAAAGUAACA CGUCAAUGAAAGGUA ACCACAGC	192-B11
149	D-RNA (APTÂMERO)	GCUGUAAAAGUAACA UGUCAAUGAAAGGUA ACUACAGC	192-C9

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 95/208

85/151

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
150	D-RNA (APTÂMERO)	GCUGUAAAAGUAACA AGUCAAUGAAAGGUA ACUACAGC	192-E10
151	D-RNA (APTÂMERO)	GCUGUGAAAGUAACA AGUCAAUGAAAGGUA ACCACAGC	192-C10
152	D-RNA (APTÂMERO)	GCAGUGAAAGUAACA UGUCAAUGAAAGGUA ACCACAGC	192-D11
153	D-RNA (APTÂMERO)	GCUGUGAAAGUAACA UGUCAAUGAAAGGUA ACCACUGC	192-G11
154	D-RNA (APTÂMERO)	GCUAUGAAAGUAACA UGUCAAUGAAAGGUA ACCAUAGC	192-H11
155	D-RNA (APTÂMERO)	GCUGCGAAAGCGACA UGUCAAUGAAAGGUA GCCGCAGC	192-D10
156	D-RNA (APTÂMERO)	GCUGUGAAAGCAACA UGUCAAUGAAAGGUA GCCACAGC	192-E9
157	D-RNA (APTÂMERO)	GCUGUGAAAGUAACA UGUCAAUGAAAGGUA GCCGCAGC	192-H9
158	D-RNA (APTÂMERO)	AGCGUGAAAGUAACA CGUAAAAUGAAAGGU AACCACGCU	191-A6

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 96/208

86/151

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
159	D-RNA (APTÂMERO)	CUGUGAAAGCAACAU GUCAAUGAAAGGUAG CCGCAG	192-A10-002
160	D-RNA (APTÂMERO)	UGUGAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC CGCA	192-A10-003

TABELA 1 (K)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
161	D-RNA (APTÂMERO)	GUGAAAGCAACAUGU CAAUGAAAGGUAGCC GC	192-A10-004
162	D-RNA (APTÂMERO)	UGAAAGCAACAUGUC AAUGAAAGGUAGCCG	192-A10-005
163	D-RNA (APTÂMERO)	GAAAGCAACAUGUCA AUGAAAGGUAGCC	192-A10-006
164	D-RNA (APTÂMERO)	AAAGCAACAUGUCAA UGAAAGGUAGC	192-A10-007
165	D-RNA (APTÂMERO)	GCGUGAAAGCAACAU GUCAAUGAAAGGUAG CCGCGC	192-A10-008
166	D-RNA (APTÂMERO)	GCGCGAAAGCAACAU GUCAAUGAAAGGUAG CCGCGC	192-A10-015
167	D-RNA (APTÂMERO)	GCGGAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC CCGC	192-A10-014

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 97/208

87/151

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
168	D-RNA (APTÂMERO)	CGUGAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC CGCG	192-A10-016
169	D-RNA (APTÂMERO)	GCGCAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC GUGC	192-A10-017
170	D-RNA (APTÂMERO)	GUGCAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC GCGC	192-A10-018
171	D-RNA (APTÂMERO)	CGCGAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC CGUG	192-A10-019
172	D-RNA (APTÂMERO)	GGGCAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC GCCC	192-A10-020
173	D-RNA (APTÂMERO)	GGCCAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC GGCC	192-A10-021
174	D-RNA (APTÂMERO)	GCCCAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC GGGC	192-A10-022
175	D-RNA (APTÂMERO)	CCCCAAAGCAACAUG UCAAUGAAAGGUAGC GGGG	192-A10-023
176	D-RNA (APTÂMERO)	AGCGUGGUGUGAUC UAGAUGUAGUGGCU GAUCCUAGUCAGGUA CGCU	193-C2-001

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 98/208

88/151

TABELA 1 (L)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
177	D-RNA (APTÂMERO)	AGCGUGGUGUGAUC UAGAUGUAUUGGCUG AUCCUAGUCAGGUAC GCU	193-G2-001
178	D-RNA (APTÂMERO)	AGCGUGGUGUGAUC UAGAUGUAAUGGCUG AUCCUAGUCAGGUGC GCU	193-F2-001
179	D-RNA (APTÂMERO)	GCGAGGUGUGAUCU AGAUGUAGUGGCUGA UCCUAGUCAGGUGC GC	193-G1-002
180	D-RNA (APTÂMERO)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAGUGGCUGA UCCUAGUCAGGUGC GC	193-D2-002
181	D-RNA (APTÂMERO)	GCAUGGUGUGAUCUA GAUGUAGUGGCUGA UCCUAGUCAGGUGCC C	193-A1-002
182	D-RNA (APTÂMERO)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAAUGGCUGA UCCUAGUCAGGGACG C	193-D3-002

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 99/208

89/151

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
183	D-RNA (APTÂMERO)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAGAGGCUGA UCCUAGUCAGGUACG C	193-B3-002
184	D-RNA (APTÂMERO)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAAAGGCUGA UCCUAGUCAGGUACG C	193-H3-002
185	D-RNA (APTÂMERO)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAGUGGCUG UUCCUAGUCAGGUAU GC	193-E3-002
186	D-RNA (APTÂMERO)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAGUGGCUGA UCCUAGUUAGGUACG C	193-D1-002
187	D-RNA (APTÂMERO)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAGUGGCUGA UCCUAGUCAGGUACG C	193-C2-002
188	D-RNA (APTÂMERO)	CGUGGUGUGAUCUA GAUGUAGUGGCUGA UCCUAGUCAGGUACG	193-C2-003
189	D-RNA (APTÂMERO)	GUGGUGUGAUCUAG AUGUAGUGGCUGAUC CUAGUCAGGUAC	193-C2-004

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 100/208

90/151

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
190	D-RNA (APTÂMERO)	UGGUGUGAUCUAGAU GUAGUGGCUGAUCC UAGUCAGGUA	193-C2-005
191	D-RNA (APTÂMERO)	GGUGUGAUCUAGAU GUAGUGGCUGAUCC UAGUCAGGU	193-C2-006

TABELA 1 (M)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
192	D-RNA (APTÂMERO)	GUGUGAUCUAGAUGU AGUGGCUGAUCCUAG UCAGG	193-C2-007
193	D-RNA (APTÂMERO)	GCGUGGUGUGAUCU AGAUGUAUUGGCUGA UCCUAGUCAGGUACG C	193-G2-012
194	D-RNA (APTÂMERO)	GCGCGGUGUGAUCU AGAUGUAUUGGCUGA UCCUAGUCAGGCGC GC	193-G2-013
195	D-RNA (APTÂMERO)	GCGCGUGUGAUCUA GAUGUAUUGGCUGAU CCUAGUCAGGGCGC	193-G2-014
196	D-RNA (APTÂMERO)	GGGCGUGUGAUCUA GAUGUAUUGGCUGAU CCUAGUCAGGGCCC	193-G2-015

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 101/208

91/151

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
197	D-RNA (APTÂMERO)	GGCCGUGUGAUCUA GAUGUAUUGGCUGAU CCUAGUCAGGGGCC	193-G2-016
198	D-RNA (APTÂMERO)	GCCCGUGUGAUCUA GAUGUAUUGGCUGAU CCUAGUCAGGGGGC	193-G2-017
199	D-RNA (APTÂMERO)	GUGCUGCGGGGGUU AGGGCUAGAAGUCG GCCUGCAGCAC	197-B2
200	D-RNA (APTÂMERO)	AGCGUGGCGAGGUU AGGGCUAGAAGUCG GUCGACACGCU	191-D5-001
201	D-RNA (APTÂMERO)	GUGUUGCGGAGGUU AGGGCUAGAAGUCG GUCAGCAGCAC	197-H1
202	D-RNA (APTÂMERO)	CGUGCGCUUGAGAUA GGGGUUAGGGCUUA AAGUCGGCUGAUUCU CACG	190-A3-001
203	D-RNA (APTÂMERO)	AGCGUGAAGGGGUU AGGGCUCGAAGUCG GCUGACACGCU	191-A5
204	D-RNA (APTÂMERO)	GUGCUGCGGGGGUU AGGGCUCGAAGUCG GCCCGCAGCAC	197-H3
205	D-RNA (APTÂMERO)	GUGUUCCCGGGGUU AGGGCUUGAAGUCG GCCGGCAGCAC	197-B1

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 102/208

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TABELA 1 (N)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
206	D-RNA (APTÂMERO)	GUGUUGCAGGGGUU AGGGCUUGAAGUCG GCCUGCAGCAC	197-E3
207	D-RNA (APTÂMERO)	GUGCUGCGGGGGUU AGGGCUCAAAGUCGG CCUGCAGCAC	197-H2
208	D-RNA (APTÂMERO)	GUGCUGCCGGGGUU AGGGCUAAAGUCGGCCGACAGCA C	197-D1
209	D-RNA (APTÂMERO)	GUGCUGUGGGGGUC AGGGCUAGAAGUCG GCCUGCAGCAC	197-D2
210	D-RNA (APTÂMERO)	UGAGAUAGGGGUUA GGGCUUAAAGUCGG CUGAUUCUCA	190-A3-003
211	D-RNA (APTÂMERO)	GAGAUAGGGGUUAG GGCUUAAAGUCGGCU GAUUCUC	190-A3-004
212	D-RNA (APTÂMERO)	GGGGUUAGGGCUUA AAGUCGGCUGAUUCU	190-A3-007
213	D-RNA (APTÂMERO)	GCGUGGCGAGGUUA GGGCUAGAAGUCGG UCGACACGC	191-D5-002
214	D-RNA (APTÂMERO)	CGUGGCGAGGUUAG GGCUAGAAGUCGGU CGACACG	191-D5-003

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 103/208

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
215	D-RNA (APTÂMERO)	CGGGCGAGGUUAGG GCUAGAAGUCGGUC GACCG	191-D5-004
216	D-RNA (APTÂMERO)	CGGGCGAGGUUAGG GCUAGAAGUCGGUC GCCCG	191-D5-005
217	D-RNA (APTÂMERO)	CGGCGAGGUUAGGG CUAGAAGUCGGUCGC CG	191-D5-006
218	D-RNA (APTÂMERO)	CGGGAGGUUAGGGC UAGAAGUCGGUCCCG	191-D5-007
219	D-RNA (APTÂMERO)	GGGAGGUUAGGGCU AGAAGUCGGUCCC	191-D5-010
220	D-RNA (APTÂMERO)	CCGCGGUUAGGGCU AGAAGUCGGGCGG	191-D5-017
221	D-RNA (APTÂMERO)	CCCGGGUUAGGGCU AGAAGUCGGCGGG	191-D5-029
222	D-RNA (APTÂMERO)	GGCGGGUUAGGGCU AGAAGUCGGCGCC	191-D5-024
223	D-RNA (APTÂMERO)	CCCGCGGUUAGGGC UAGAAGUCGGGCGG G	191-D5-017-29a

TABELA 1 (O)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
224	D-RNA (APTÂMERO)	GCCGCGGUUAGGGC UAGAAGUCGGGCGG C	191-D5-017-29b

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 104/208

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
225	D-RNA (APTÂMERO)	CCCCGGGUUAGGGC UAGAAGUCGGCGGG G	191-D5-019-29a
226	D-RNA (APTÂMERO)	CGGCGGGUUAGGGC UAGAAGUCGGCGCC G	191-D5-024-29a
227	D-RNA (APTÂMERO)	GGGCGGGUUAGGGC UAGAAGUCGGCGCCC	191-D5-024-29b
228	D-RNA (APTÂMERO)	UGCUGCGGGGGUUA GGGCUAGAAGUCGG CCUGCAGCA	197-B2-001
229	D-RNA (APTÂMERO)	GCUGCGGGGGUUAG GGCUAGAAGUCGGC CUGCAGC	197-B2-002
230	D-RNA (APTÂMERO)	CUGCGGGGGUUAGG GCUAGAAGUCGGCCU GCAG	197-B2-003
231	D-RNA (APTÂMERO)	UGCGGGGGUUAGGG CUAGAAGUCGGCCUG CA	197-B2-004
232	D-RNA (APTÂMERO)	GCGGGGGUUAGGGC UAGAAGUCGGCCUGC	197-B2-005
233	D-RNA (APTÂMERO)	GCCGGGGUUAGGGC UAGAAGUCGGCCGG C	197-B2-006
234	D-RNA (APTÂMERO)	GGCCGGGGUUAGGG CUAGAAGUCGGCCG GCC	197-B2-006-31a

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 105/208

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
235	D-RNA (APTÂMERO)	CGCCGGGGUUAGGG CUAGAAGUCGGCCG GCG	197-B2-006-31b
236	D-RNA (APTÂMERO)	CGUGGUCCGUUGUG UCAGGUCUAUUCGCC CCGGUGCAGGGCAU CCGCG	194-A2-001
237	D-RNA (APTÂMERO)	GCAGUGUGACGCGG ACGUGAUAGGACAGA GCUGAUCCCGCUCAG GUGAG	196-B12-003
238	D-RNA (APTÂMERO)	CAACAGCAGUGUGAC GCGGACGUGAUAGG ACAGAGCUGAUCCCG CUCAG	196-B12-004

TABELA 1 (P)

Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
239	L-RNA (Spiegelmero)	5'-PEG- UAAGGAAACUCGGUC UGAUGCGGUAGCGC UGUGCAGAGCU	Spiegelmero Controle PEGuilado
240	L-RNA (Spiegelmero)	GATCACACCACGC(C18-PEG-espaçador)(C18-PEG-espaçador)1-NH2-3'	sonda de captura 193-G2-012-5'- PEG

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 106/208

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Seq.-ID	RNA/Peptídeo	Sequência	Referência Interna
241	L-RNA (Spiegelmero)	5'-NH2-(C18-PEGespaçador)-(C18-PEGespaçador)GCGUACCUGAC	sonda de detecção de 193G2-012-5'-PEG

[00207] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelas figuras, exemplos e a listagem de sequência dos quais características adicionais, modalidades e vantagens podem ser tiradas, em que a figura 1 mostra um alinhamento de sequências de ligantes de RNA relacionados ligando a SDF-1 humano indicando o motivo de sequência (Tipo A) que é em uma modalidade preferencial em sua totalidade essencial para ligar a SDF-1 humano;

a figura 2A mostra derivados de ligante de RNA 192-A10001 (ligante de RNA de SDF-1 humano de motivo de sequência Tipo A);

a figura 2B mostra derivados de ligante de RNA 192-A10001 (ligante de RNA de SDF-1 humano de motivo de sequência Tipo A);

a figura 3 mostra um alinhamento de sequências de ligantes de RNA relacionados ligando a SDF-1 humano indicando o motivo de sequência (Tipo B) que é em uma modalidade preferencial em sua totalidade essencial para ligar a SDF-1 humano;

a figura 4A mostra derivados de ligantes de RNA 193-C2001 e 193-G2-001 (ligantes de RNA de SDF-1 humano de motivo de sequência Tipo B);

a figura 4B mostra derivados de ligantes de RNA 193-C2001 e 193-G2-001 (ligantes de RNA de SDF-1 humano de motivo de sequência Tipo B);

a figura 5 mostra um alinhamento de sequências de

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 107/208

97/151 ligantes de RNA relacionados ligando a SDF-1 humano indicando o motivo de sequência (Tipo C) que é em uma modalidade preferencial em sua totalidade essencial para ligar a SDF-1 humano;

a figura 6 mostra derivados de ligante de RNA 190-A3-001 (ligante de RNA de SDF-1 humano de motivo de sequência Tipo C);

a figura 7A mostra derivados de ligante de RNA 190-D5001 (ligante de RNA de SDF-1 humano de motivo de sequência Tipo C);

a figura 7B mostra derivados de ligante de RNA 190-D5001 (ligante de RNA de SDF-1 humano de motivo de sequência Tipo C);

a figura 8 mostra derivados de ligante de RNA 197-B2 (ligante de RNA de SDF-1 humano de motivo de sequência Tipo C);

a figura 9 mostra ligantes de RNA adicionais ligando a SDF1 humano;

a figura 10 mostra a quimiotaxia induzida por SDF-1 humano de células de leucemia de células T humanas Jurkat visto que depois de 3 horas de migração de células de leucemia de células T humanas Jurkat em direção a várias concentrações de SDF-1 humano foi obtida uma curva de dose-resposta para SDF-1 humano, representada como sinal de fluorescência sobre concentração de SDF1 humano;

a figura 11 mostra o resultado de uma análise de ligação do aptâmero 192-A10-001 de ligação de SDF-1 humano a D-SDF-1 humano biotinilado 37°C, representado como ligação do aptâmero sobre concentração de D-SDF-1 humano biotinilado;

a figura 12 mostra a eficácia de Spiegelmero 192-A10-001 de ligação de SDF-1 humano em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spieg elmero 192

Petição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 108/208

98/151

A10-001, representadas como percentagem de controle sobre concentração de Spiegelmero 192-A10-001;

a figura 13 mostra o resultado de uma análise de ligação competitiva dos aptâmeros de ligação de SDF-1 humano 192-A10-001, 192-F10-001, 192-C9-001, 192-E10-001, 192-C10-001, 192-D11-001, 192-G11-001, 192-H11-001, 192-D10-001, 192-E9-001 e 192-H9-001 a d-SDF-1 humano biotinilado a 37°C, representada como ligação do aptâmero marcado 192-A10-001 (usado como referência que é deslocado pelos aptâmeros não marcados) a 1 nM e 5 nM de aptâmeros não marcados 192-A10-001, 192-F10-001, 192-C9-001, 192-E10-001, 192-C10-001, 192-D11-001, 192-G11-001, 192-H11001, 192-D10-001, 192-E9-001 e 192-H9-001;

a figura 14 mostra o resultado de uma análise de ligação do aptâmero 192-A10-008 de ligação de SDF-1 humano a D-SDF-1 humano biotinilado a 37°C, representada como ligaçã o do aptâmero sobre concentração de D-SDF-1 humano biotinilado;

a figura 15 mostra um sensorgrama Biacore 2000 indicando o valor KD do Spiegelmero 192-A10-008 de ligação de SDF1 humano ligando a SDF-1 humano o qual foi imobilizado sobre um chip sensor PioneerF1 por procedimento de ligação de amina, representado como resposta (RU) sobre tempo, adicionalmente são listados as taxas ligado (on) e desligado (off) e os valores KD dos Spiegelmeros 192-A10-008 e 192-A10-001;

a figura 16 mostra a eficácia de Spiegelmero 192-A10-008 de ligação de SDF-1 em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano préincubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelme ro 192-A10008, representadas como percentagem de controle sobre concentração do Spiegelmero 192-A10-008;

a figura 17 mostra um sensorgrama Biacore 2000

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99/151 indicando o valor Kd de Spiegelmero 193-G2-01 ligando a SDF-1 humano o qual foi imobilizado sobre um chip sensor PioneerF1 por procedimento de ligação de amina, representado como resposta (RU) sobre tempo, adicionalmente as taxas ligado (on) e desligado (off) e valor Kd do Spiegelmero 193-G2-001 são listados;

a figura 18 mostra o resultado de uma análise de ligação do aptâmero 193-G2-012 anti-SDF-1 humano a D-SDF-1 humano biotinilado a 37°C, representada como ligação do aptâmero sobre concentração de D-SDF-1 humano biotinilado;

a figura 19 mostra o resultado de uma análise de ligação competitiva dos aptâmeros de ligação de SDF-1 humano 190-A3-001, 190-A3-003, 190-A3-004, 190-A3-007, 191-D5-001, 191-D5-002, 191D5-003, 191-D5-004, 191-D5-005, 191-D5-006 e 191-D5-007 a D-SDF1 humano biotinilado a 37°C, representada como ligação do aptâmero marcado 190-A3-001 ou 191-D5-001 (usado como referência que é deslocado pelos aptâmeros não marcados) a 500 nM, 50 nM e 10 nM de aptâmeros não marcados 190-A3-001, 190-A3-003, 190-A3-004, 190-A3-007, 191-D5-001, 191-D5-002, 191-D5-003, 191-D5-004, 191D5-005, 191-D5-006 e 191-D5-007;

a figura 20 mostra o resultado de uma análise de ligação dos aptâmeros de ligação de SDF-1 humano 190-A3-004 e 191-D5007 a D-SDF-1 humano biotinilado a 37°C, representada como ligação do aptâmero sobre concentração de D-SDF-1 humano biotinilado;

a figura 21 mostra um sensorgrama Biacore 2000 indicando o valor Kd de Spiegelmero 191-D5-007 ligando a SDF-1 humano o qual foi imobilizado sobre um chip sensor PioneerF1 por procedimento de ligação de amina, representada como resposta (RU) sobre tempo, adicionalmente as taxas ligado (on) e desligado (off) e valor Kd de Spiegelmero 191-D5-007, são listados;

a figura 22 mostra a eficácia de Spiegelmero 190-A3-004

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100/151 de ligação de SDF-1 em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano préincubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmero 190-A3-004, representadas como percentagem de controle sobre concentração de Spiegelmero 190-A3-004;

a figura 23A mostra a eficácia de Spiegelmeros de ligação de SDF-1 193-G2-012-5'-PEG, 197-B2-006-5'-PEG, 191-D5-007-5'PEG e 191-A10-008-5'-PEG em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spieg elmeros 193G2-012-5'-PEG, 197-B2-006-5'-PEG, 191-D5-007-5'-PEG e 191-A10008-5'-PEG, representadas como percentagem de controle sobre concentração de Spiegelmeros 193-G2-012-5'-PEG, 197-B2-006-5'PEG, 191-D5-007-5'-PEG e 191-A10-008-5'-PEG;

a figura 23B mostra a eficácia de Spiegelmeros de ligação de SDF-1 197-B2-006-5'PEG e 197-B2-006-31b-5'-PEG em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmeros 197-B2-006-5'PEG e 197-B2-006-31b5'-PEG, representadas como percentagem de controle sobre concentração de Spiegelmeros 197-B2-006-5'PEG e 197-B2-006-31b5'-PEG;

a figura 24A mostra um sensorgrama Biacore 2000 indicando os valores de KD de Spiegelmeros 193-G2-012-5'-PEG, 191A10-008-5'-PEG e 191-A10-001-5'-PEG ligando a SDF-1 humano o qual foi imobilizado sobre um chip sensor PioneerF1 por procedimento de ligação de amina, representado como resposta (RU) sobre tempo;

a figura 24B mostra um sensorgrama Biacore 2000 indicando os valores de KD de Spiegelmeros 197-B2-006-5'PEG, 197B2-006-31b-5'-PEG e 191-D5-007-5'-PEG ligando a SDF-1 humano o

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101/151 qual foi imobilizado sobre um chip sensor PioneerF1 por procedimento de ligação de amina, representado como resposta (RU) sobre tempo;

a figura 25A mostra a eficácia de Spiegelmeros de ligação de SDF-1 192-A10-001, 192-A10-001-5'-HES130 e 192-A10-001-5'HES100 em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmeros 192-A10-001, 192-A10-0015'-HES130 e 192-A10-001-5'-HES100, representadas como percentagen de controle sobre concentração de Spiegelmeros 192A10-001, 192-A10-001-5'-HES130 e 192-A10-001-5'-HES100;

a figura 25B mostra a eficácia de Spiegelmeros de ligação de SDF-1 192-A10-001, 192-A10-001-5'-PEG30 e 192-A10-001-5'PEG40 em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmeros 192-A10-001, 192-A10-0015'-PEG30 e 192-A10-001-5'-PEG40, representadas como percentagem de controle sobre concentração de Spiegelmeros 192A10-001, 192-A10-001-5'-PEG30 e 192-A10-001-5'-PEG40;

a figura 26 mostra a ineficácia de um Spiegelmero controle em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano ou murineo pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmero controle , representadas como percentagem de controle sobre concentração de Spiegelmero controle;

a figura 27 mostra a quimiotaxia induzida por SDF-1 murino de células de leucemia de células T humanas Jurkat visto que depois de 3 horas de migração de células de leucemia de células T humanas Jurkat em direção a várias concentrações de SDF-1 foi obtida uma curva de dose-resposta para SDF-1, representada como sinal de fluorescência;

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102/151 a figura 28 mostra a eficácia de Spiegelmeros de ligação de SDF-1 192-A10-001 e 191-D5-007-5'PEG em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 murino pré-incubado a 37°C com várias q uantidades de Spiegelmeros 192-A10-001 e 191-D5-007-5'PEG representadas como percentagem de controle sobre concentração de Spiegelmeros 192A10-001 e 191-D5-007-5'PEG;

a figura 29 mostra a eficácia de Spiegelmero 192-A10-001 de ligação de SDF-1 em uma prova de ligação de CXCR4-receptor usando [¹²⁵J]-SDF-1a humano que foi pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmeros 192-A10-001, [¹²⁵J]-SDF-1a especificamente ligado foi plotado sobre concentração de Spiegelmero 192-A10-001; e a figura 30 mostra a inibição da estimulação de MAPquinase de células expressando CXCR4 com 1 nM de SDF-1 α humano por Spiegelmero 192-A10-001 de ligação de SDF-1 humano;

a figura 31 mostra a inibição de germinação induzida por SDF-1 por Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano e por Spiegelmero Controle PEGuilado em prova de germinação do anel aórtico, por meio da qual anéis de aorta de rato foram embutidos em matriz de colágeno e incubados por 6 dias com SDF-1 com ou sem Spiegelmeros (a: controle; b: 10 nM de SDF-1; c: 10 nM de SDF-1 +1 μΜ de Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano; d: 10 nM de SDF-1 + 1 μM de Spiegelmero Controle PEGuilado);

a figura 32 mostra a inibição de germinação induzida por SDF-1 por Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano e por Spiegelmero Controle PEGuilado em prova de germinação do anel aórtico por meio da qual os índices de germinação são mostrados como média +/- desvio padrão para 5 anéis por

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103/151 condição (*: o valor para SDF-1 é significativamente diferente do controle (teste de Mann-Whitney; p = 0,009); **: o valor para SDF-1 + Spiegelmero de ligação de SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG é significativamente diferente do valor para SDF-1 (teste de MannWhitney; p = 0,028);

a figura 33 mostra o nível plasmático de Spiegelmero 193G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano e de SDF-1 em ratos depois um bolo intravenoso de Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano em comparação com o nível plasmático de SDF-1 de rato que não foi tratado com Spiegelmero 193-G2-012-5'PEG de ligação de SDF-1 humano, por meio do qual o nível plasmático de Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano e de SDF-1 foram determinados durante um período de 96 horas;

Exemplo 1: Ácidos nucleicos que ligam SDF-1 humano [00208] Usando D-SDF-1 humano biotinilado como um alvo, vários ácidos nucleicos que ligam a SDF-1 humano podem ser gerados cujas sequências de nucleotídeos são representadas nas figuras 1 a 9. Os ácidos nucleicos foram caracterizados no nível de aptâmero, isto é, nível de ácido nucleico-D com D-SDF-1 humano biotinilado ou no nível de Spiegelmero, isto é, ácido nucleico-L com a configuração natural de SDF-1 (L- SDF-1).

[00209] Aptâmeros foram analisados com D- SDF-1 humano biotinilado usando provas de ligação de pull down competitiva ou direta com d-SDF-1 humano biotinilado (Exemplo 4). Spiegelmeros foram testados com a configuração natural de SDF-1 (L-SDF-1) por medição da ressonância de plasmon superficial usando um instrumento Biacore 2000 (Exemplo 6) e uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular (Exemplo 5).

[00210] As moléculas de ácido nucleico produzidas deste modo

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104/151 apresentam diferentes motivos de sequência, três tipos principais são definidos nas Figuras 1, 2A e 2B (Tipo A), Figuras 3, 4A e 4B (Tipo B), Figuras 5, 6, 7A, 7B e 8 (Tipo C). Para definição de motivos de sequência de nucleotídeos, são usadas as abreviações IUPAC para nucleotídeos ambíguos:

S forte fraca purina pirimidina ceto imino não A não C não G não U todas

G ou C;

A ou U;

G ou A;

C ou U;

G ou U;

A ou C;

C ou U ou G;

A ou G ou U;

A ou C ou U;

A ou C ou G;

A ou G ou C ou U

Caso não indicado ao contrário, qualquer sequência de [00211] ácido nucleico ou sequência de trechos e caixas, respectivamente, é indicada na direção 5' 3'.

1.1 Ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A [00212] Conforme representado na figura 1 todas as sequências de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A compreendem uma sequência de nucleotídeos de núcleo a qual é flanqueada por trechos de 5'- e 3'-terminal que podem hibridizar uns com os outros. No entanto, semelhante hibridização não é necessariamente dada na molécula.

[00213] Os ácidos nucleicos foram caracterizados no nível de aptâmero usando provas de ligação de pull down direta e competitiva com D-SDF-1 humano biotinilado de modo a classificar os mesmos com respeito a seu comportamento de ligação (Exemplo 4).

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105/151

Sequências selecionadas foram sintetizadas como Spiegelmeros (Exemplo 3) e foram testadas usando a configuração natural de SDF-1 (l-SDF) em uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular (Exemplo 5) e por medição da ressonância de plasmon superficial usando um instrumento Biacore 2000 (Exemplo 6).

[00214] As sequências das caixas definidas ou trechos pode ser diferente entre os ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A o que influencia a afinidade de ligação a SDF-1. Com base na análise de ligação dos diferentes ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 resumidos como ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A, a sequência de nucleotídeos de núcleo e suas sequências de nucleotídeos conforme descrito a seguir são individualmente e mais preferencialmente em sua totalidade essenciais para ligar a SDF-1:

a sequência de nucleotídeos de núcleo de todas as sequências identificadas de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A compartilham a sequência

AAAGYRACAHGUMAAXaUGAAAGGUARC| (Fórmula-1 de Tipo A), por meio da qual Xa ou está ausente ou é Ά'. Se Ά' está ausente, a sequência da sequência de nucleotídeos de núcleo pode ser resumida como Fórmula-2 de Tipo A (^AAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARCl). Ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo A 191A6 (sequência de nucleotídeos de núcleo: AAAGUAACACGUAAAAUGAAAGGUÀÃCI) transportando o nucleotídeo adicional Ά' dentro da sequência de nucleotídeos de núcleo e ainda ligando a SDF-1 deixa inferir uma sequência de nucleotídeos de núcleo alternativa (|AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC|, Fórmula-3 de Tipo A). Exemplarmente para todos os outros ácidos nucleicos de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A, o ácido nucleico 192-A10001 de ligação de SDF-1 do Tipo A foi caracterizado por sua afinidade

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106/151 de ligação a SDF-1 humano. A constante de ligação de equilíbrio Kd foi determinada usando a prova de ligação de pull down (Kd = 1,5 nM, figura 11) e por medição da ressonância de plasmon superficial (Kd = 1,0 nM, figura 15). A IC50 (concentração inibitória de 50%) de 0,12 nM para 192-A10-001 foi medida usando uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular (figura 12). Consequentemente, todos os ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A conforme representado na figura 1 foram analisados em uma prova de ligação de pull down competitiva vs. 192-A10-001 (figura 13; nem todos os ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A testados são mostrados na figura 13). Os ácidos nucleicos 192-B11 e 192-C10 de ligação de SDF-1 do Tipo A apresentaram afinidades de ligação iguais a 192-A10-001 nestes experimentos de competição. Afinidade de ligação mais fraca foi determinada para ácidos nucleicos 192-G10, 192-F10, 192-C9, 192E10, 192-D11, 192-G11, 192-H11 e 191-A6 de ligação de SDF-1 do Tipo A. Os ácidos nucleicos 192-D10, 192-E9 e 192-H9 de ligação de SDF-1 do Tipo A têm afinidade de ligação muito mais fraca do que 192-A10-001 (figura 13).

[00215] Conforme mencionado acima, o ácido nucleico 192-B11 e 192-C10 de ligação de SDF-1 do Tipo A apresenta igual afinidade de ligação a SDF-1 que 192-A10-001. No entanto, apresentam ligeiras diferenças na sequência de nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de núcleo. Portanto, a sequência de consenso das três moléculas ligando a SDF-1 com quase a mesma alta afinidade pode resumida pela sequência de nucleotídeos AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARCl (Fórmula-4 de Tipo A) por meio da qual a sequência de nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de núcleo de 192-A10-001 (sequência de nucleotídeos: AAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGC) representa a sequência de nucleotídeos com a melhor afinidade de ligação de ácidos nucleicos de

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107/151 ligação de SDF-1 do Tipo A.

[00216] Cinco ou seis dos seis nucleotídeos do trecho de 5'-terminal de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A podem hibridizar aos cinco ou seis nucleotídeos respectivos dos seis nucleotídeos dos ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A do trecho de 3'terminal para formar uma hélice de terminal. Embora estes nucleotídeos sejam variáveis em várias posições, os diferentes nucleotídeos permitem hibridização de cinco ou seis dos seis nucleotídeos dos trechos de 5'- e 3'-terminal cada. Os trechos de 5'terminal e 3'-terminal de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A conforme mostrado na figura 1 podem ser resumidos em uma fórmula geral para o trecho de 5'-terminal ('RSHRYR', Fórmula-5-5' de Tipo A) e para o trecho de 3'-terminal ('YRYDSY', Fórmula-5-3' de Tipo A). Derivados truncados de ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-001 foram analisados em uma prova de ligação de pull down competitiva vs. A molécula original 192-A10-001 e 192-A10-008 (figura 2A e 2B). Estes experimentos mostraram que uma redução dos seis nucleotídeos de terminal (extremidade 5': GCUGUG; extremidade 3': CGCAGC) de 192-A10-001 a cinco nucleotídeos (extremidade 5': CUGUG; extremidade 3': CGCAG) do derivado 192-A10-002 pode ser feita sem redução da afinidade de ligação. No entanto, a truncação para quatro nucleotídeos terminais (extremidade 5': UGUG; extremidade 3': CGCA; 192-A10-003) ou menos (192-A10-004/ -005/ 006/ -007) levou a afinidade de ligação reduzida para SDF-1 (figura 2A). Os trechos de 5'-terminal e 3'-terminal determinados com uma extensão de cinco e quatro nucleotídeos dos derivados de ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-001 conforme mostrado na figuras 2A e B podem ser descritos em uma fórmula geral para o trecho de 5'-terminal ('X2BBBS', Fórmula-6-5' de Tipo A) e do trecho de 3'-terminal ('SBBVX3'; Fórmula-6-3' de Tipo A), por meio da

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108/151 qual X2 ou está ausente ou é 'S' e X3 ou está ausente ou é 'S'.

[00217] A sequência de nucleotídeos dos trechos de 5'- e 3'terminal tem uma influência sobre a afinidade de ligação de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A. Isto é não somente mostrado pelos ácidos nucleicos 192-F10 e 192-E10, mas também por derivados de 192-A10-001 (figura 2B;). As sequências de nucleotídeos de núcleo 192-F10 e 192-E10 são idênticas a 192-B11 e 192-C10, mas compreendem ligeiras diferenças na extremidade 3' do trecho de 5'-terminal e na extremidade 5' do trecho de 3'-terminal resultando em afinidade de ligação reduzida.

[00218] A substituição de nucleotídeos de 5'- e 3'-terminal 'CUGUG' e 'CGCAG' de ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10002 por 'GCGCG' e 'CGCGC' (192-A10-015) resultou em uma reduzida afinidade de ligação ao passo que substituições por 'GCGUG' e 'CGCGC' (192-A10-008) resultou na mesma afinidade de ligação conforme mostrado para 192-A10-002 (figura 2B, figura 15, figura 12, figura 16). Adicionalmente, nove derivados de ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-001 (192-A10-014/ -015/ -016/ 017/ -018/ -019/ -020/ -021/ -022/ -023) portando quatro nucleotídeos de 5'- e 3'-terminal respectivamente foram testados como aptâmeros para sua afinidade de ligação vs. 192-A10-001 ou seu derivado 192A10-008 (ambos têm a afinidade de ligação idêntica para SDF-1). Todos os clones apresentaram afinidade de ligação mais fraca, muito mais fraca ou muitíssimo mais fraca para SDF-1 que 192-A10-001 (seis nucleotídeos formando uma hélice terminal) ou como 192-A10008 com cinco nucleotídeos terminais, respectivamente (figura 2B). Consequentemente, a sequência e o número de nucleotídeos dos trechos de 5'- e 3'-terminal são essenciais para uma ligação eficaz a SDF-1. Conforme mostrado para ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-002 e 192-A10-08 a combinação preferencial de

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109/151 trechos de 5'- e 3' -terminal são 'CUGUG' e 'CGCAG' (trechos de 5'- e 3'-terminal de ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10002) e 'GCGUG' e 'CGCGC' (trechos de 5'- e 3'-terminal de ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-008).

[00219] No entanto, combinando os trechos de 5'- e 3'-terminal de todos os ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A testados a fórmula geral para o trecho de 5'-terminal de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A é 'X1X2NNBV' (Fórmula-7-5' do Tipo A) e a fórmula geral para o trecho de 3'-terminal de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo A é 'BNBNX3X4' (Fórmula-7-3' do Tipo A), ao passo que

X1 é 'R' ou está ausente , X2 é 'S', X3 é 'S' e X4 é 'Y' ou está ausente;

ou

X1 está ausente, X2 é 'S' ou está ausente, X3 é 'S' ou está ausente e X4 está ausente.

1.2 Ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B [00220] Conforme representado na figura 3 todas as sequências de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B compreendem uma sequência de nucleotídeos de núcleo a qual é flanqueada por trechos de 5'- e 3'-terminal que podem hibridizar uns aos outros. No entanto, semelhante hibridização não é necessariamente dada na molécula.

[00221] Os ácidos nucleicos foram caracterizados no nível de aptâmeros usando provas de ligação de pull down direta e competitiva com d-SDF-1 humano biotinilado de modo a classificar os mesmos com respeito a seu comportamento de ligação (Exemplo 4). Sequências selecionadas foram sintetizadas como Spiegelmeros (Exemplo 3) e foram testadas usando a configuração natural de SDF-1 (l-SDF) em uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular (Exemplo 5) e por medição da ressonância de plasmon superficial

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110/151 usando um instrumento Biacore 2000 (Exemplo 6).

[00222] As sequências das caixas ou trechos definidos podem ser diferentes entre os ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B o que influencia a afinidade de ligação para SDF-1. Com base na análise de ligação dos diferentes ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 resumidos como ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B, a sequência de nucleotídeos de núcleo e suas sequências de nucleotídeos conforme descrito a seguir são individualmente e mais preferencialmente em sua totalidade essenciais para ligar a SDF-1: [00223] A sequência de nucleotídeos de núcleo de todas as sequências de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B identificadas compartilham a sequência

GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG| (Fórmula-1 do Tipo B). Os ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193G2-001, 193-C2-001 e 193-F2-001 que diferem em uma posição da sequência de nucleotídeos de núcleo foram analisados em uma prova de ligação de pull down competitiva vs. O ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-001 (Kd de 1,5 nM determinada em uma prova de ligação de pull down [figura 11], Kd de 1,0 nM determinada por medição da ressonância de plasmon superficial [figura 15], IC50 de 0,12 nM; [figura 12]). Cada um dos três ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B testados apresentou ligação superior a SDF-1 humano em comparação a ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-001 por meio da qual a afinidade de ligação de 193-G2-001 é tão boa quanto 193-C2-001 e 193-F2-001 (figura 3). Os dados sugerem que a diferença na sequência de nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de núcleo de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-G2-001, 193-C2-001 e 193-F2-001 não tem influência sobre a afinidade de ligação a SDF-1. Exemplarmente o ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-G2-001 foi caracterizado por sua

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111/151 afinidade de ligação a SDF-1 humano. A constante de ligação de equilíbrio Kd foi determinada usando a prova de ligação de pull down (Kd = 0,3 nM) e por medição da ressonância de plasmon superficial (Kd = 0,5 nM, figura 17). A IC50 (concentração inibitória de 50%) de 0,08 nM para 193-G2-001 foi medida usando uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular. Em contraste, os ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-B3-002, 193-H3-002, 193-E3-002 e 193-D1-002 que diferem na sequência da sequência de nucleotídeos de núcleo têm piores propriedades de ligação (figura 3). Em consequência ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B com aprimorada afinidade de ligação a SDF-1 compartilham uma sequência de nucleotídeos de núcleo com a sequência GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG| (Fórmula-2 do Tipo B).

[00224] Quatro, cinco ou seis nucleotídeos dos seis nucleotídeos do trecho de 5'-terminal de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B podem hibridizar aos respectivos quatro, cinco ou seis dos seis nucleotídeos do trecho de 3'-terminal de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B para formar uma hélice terminal. Embora os nucleotídeos sejam variáveis em várias posições, os diferentes nucleotídeos permitem a hibridização para quatro, cinco ou seis nucleotídeos dos seis nucleotídeos dos trechos de 5'- e 3'-terminal cada. Os trechos de 5'-terminal e de 3'-terminal de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B conforme mostrado na figura 3 podem ser resumidos em uma fórmula geral para o trecho de 5'-terminal (Fórmula-3-5' do Tipo B; 'X1GCRWG' ao passo que X1 é 'A' ou está ausente) e do trecho de 3'-terminal (Fórmula-3-3' do Tipo B; 'KRYSCX4' ao passo que X4 é 'U' ou está ausente). Ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002 e 193-D3-002 têm afinidades de ligação mais fraca para SDF-1

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112/151 embora partilhem a sequência de nucleotídeos de núcleo idêntica (Fórmula-2 do Tipo B) com 193-C2-001, 193-G2-001 e 193-F2-001 (figura 3). As propriedades de ligação desfavoráveis dos ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002 e 193-D3-002 podem ser devidas ao número de nucleotídeos e sequência dos trechos de 5'- e 3'-terminal.

[00225] Derivados truncados dos ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-G2-001 e 193-C2-001 foram analisados em uma prova de ligação de pull down competitiva vs. 193-G2-001 e 193-G2012, respectivamente (figura 4A e 4B). Estes experimentos mostraram que uma redução dos seis terminal nucleotídeos (extremidade 5': AGCGUG; extremidade 3': UACGCU) de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-G2-001 e 193-C2-001 a cinco nucleotídeos (extremidade 5': GCGUG; extremidade 3': UACGC) leva a moléculas com afinidade de ligação similar (193-C2-002 e 193-G2-012). A constante de dissociação de equilíbrio KD foi determinada usando a prova de ligação de pull down (Kd = 0,3 nM, figura 18). Uma truncação para quatro (extremidade 5': CGUG; extremidade 3': UACG; 193-C2003) ou menos nucleotídeos (193-C2-004, 193-C2-005, 193-C2-006, 193-C2-007) resultou em uma reduzida afinidade de ligação para SDF1 a qual foi medida usando a prova de ligação de pull down de competição (figura 4A). A sequência de nucleotídeos dos cinco nucleotídeos terminais na extremidade 5'- e 3', respectivamente, tem uma influência sobre a afinidade de ligação de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B. A substituição dos nucleotídeos de 5'- e 3'-terminal 'GCGUG' e 'UACGC' (193-C2-002, 193-G2-12) por 'GCGCG' e 'CGCGC' (193-G2-013) resultou em uma reduzida afinidade de ligação. Adicionalmente, foram testados os quatro diferentes derivados de ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-G2-001 com uma hélice terminal com uma extensão de quatro

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113/151 nucleotídeos de pareamento de bases (193-G2-014/ -015/ -016/ -017). Todos eles apresentatam reduzida afinidade de ligação a SDF-1 (figura 4B). Portanto a sequência e a extensão dos nucleotídeos de 5'e 3'-terminal são essenciais para uma ligação eficaz a SDF-1. Os trechos de 5'-terminal e de 3'-terminal com uma extensão de cinco e quatro nucleotídeos dos derivados de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-C2-003 e 193-G2-012 conforme mostrado na Figuras 4A e 4B podem ser descritos em uma fórmula geral para o trecho de 5'-terminal ('X2SSBS', Fórmula-4-5' do Tipo B), por meio da qual X2 ou está ausente ou é 'G', e do trecho de 3'-terminal ('BVSSX3', Fórmula-4-3' do Tipo B), e por meio da qual X3 ou está ausente ou é 'C'. Conforme mostrado para ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-G2-001 e 193-C2-01 e seus derivados 193-G2-012 e 193C2-002 a combinação preferencial de trechos de 5'- e 3'-terminal são 'X1GCGUG' (trecho de 5'-terminal; Fórmula 5-5' do Tipo B) e 'UACGCX4' (trecho de 3'-terminal; Fórmula 5-3' do Tipo B), visto que X1 é ou 'A' ou está ausente e X4 é 'U' ou está ausente.

[00226] No entanto, combinando os trechos de 5'- e 3'-terminal de todos os ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B testados a fórmula geral para o trecho de 5'-terminal de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B é 'X1X2SVNS' (Fórmula-6-5' do Tipo B) e a fórmula geral para o trecho de 3'-terminal ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo B é 'BVBSX3X4' (Fórmula-6-3' do Tipo B), ao passo que

X1 é 'A' ou está ausente, X2 é 'G', X3 é 'C' e X4 é 'U' ou está ausente;

ou X1 está ausente, X2 é 'G' ou está ausente, X3 é 'C' ou ausente e X4 está ausente;

1.3 Ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo C [00227] Conforme representado na figura 5 todas as sequências de

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114/151 ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C compreendem uma sequência de nucleotídeos de núcleo a qual é flanqueada por trechos de 5'- e 3'-terminal que podem hibridizar uns aos outros. No entanto, semelhante hibridização não é necessariamente dada na molécula. [00228] Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmeros usando provas de ligação de pull down direta e competitiva com d-SDF-1 humano biotinilado de modo a classificar os mesmos com respeito a seu comportamento de ligação (Exemplo 4). Sequências selecionadas foram sintetizadas como Spiegelmeros (Exemplo 3) e foram testadas usando a configuração natural de SDF-1 (l-SDF) em uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular (Exemplo 5) e por medição da ressonância de plasmon superficial usando um instrumento Biacore 2000 (Exemplo 6).

[00229] As sequências das caixas ou trechos definidas podem ser diferentes entre os ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C o que influencia a afinidade de ligação a SDF-1. Com base na análise de ligação dos diferentes ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 resumida como ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C, a sequência de nucleotídeos de núcleo e sua sequência de nucleotídeos conforme descrito a seguir são individualmente e mais preferencialmente em sua totalidade essenciais para ligar a SDF-1:

as sequência de nucleotídeos de núcleo de todas as sequências identificadas de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C compartilham a sequência GGUYAGGGCUHRXaAGUCGG (Fórmula-1 do Tipo C), por meio da qual Xa ou está ausente ou é Ά'. Com a exceção de ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo C 197D1 a sequência de nucleotídeos de núcleo de todas as sequências identificadas de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C compartilham a sequência de nucleotídeos GGUYAGGGCUHRAAGUCGGl (Fórmula-2 do Tipo C). Ácido nucleico

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115/151 de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-D1 (sequência de nucleotídeos de núcleo: GGUUAGGGCUAA-AGUCGG) faltando um nucleotídeo Ά' dentro da sequência de nucleotídeos de núcleo e ainda ligando a SDF1 deixa inferir uma sequência alternativa de nucleotídeos de núcleo (GGUYAGGGCUHR-AGUCGG, Fórmula-3 do Tipo C). Inicialmente, todos os ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo C conforme representado na figura 5 foram analisados em uma prova de ligação de pull down competitiva vs. ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-001 (Kd = 1,5 nM determinada por prova de pull down e por medições da ressonância de plasmon superficial; IC50 = 0,12 nM). Os ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-001, 197-B2, 190-A3-001, 197-H1, 197-H3 e 197-E3 apresentaram afinidades de ligação mais fracas do que 192-A10-001 em experimentos de competição. Afinidade de ligação muito mais fraca foi determinada para 191-A5, 197-B1, 197-D1, 197-H2 e 197-D2 (figura 5). As moléculas ou derivados das mesmas foram adicionalmente caracterizadas por provas de ligação de pull down competitiva adicionais, medições da ressonância de plasmon e uma prova de quimiotaxia in vitro. O ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-001 foi caracterizado por sua afinidade de ligação a SDF-1 humano ao passo que a constante de ligação de equilíbrio Kd foi determinada por medição da ressonância de plasmon superficial (Kd = 0,8 nM, figura 21). A IC50 (concentração inibitória de 50%) de 0,2 nM para 191-D5-001 foi medida usando uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular. A afinidade de ligação de ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-B2 para SDF-1 humano foi determinada por medição da ressonância de plasmon superficial (Kd = 0,9 nM), sua IC50 (concentração inibitória de 50%) de 0,2 nM foi analisada em uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular. Estes dados indicam que ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-001 e

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197-Β2 têm a afinidade de ligação similar a SDF-1 (figuras 5 e 8). [00230] Ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo C 190-A3-001 (48 nt) compreende um trecho de 5'-terminal de 17 nucleotídeos e um trecho de 3'-terminal de 12 nucleotídeos por meio do qual por um lado os quatro nucleotídeos na extremidade 5' do trecho de 5'-terminal e os quatro nucleotídeos na extremidade 3' do trecho de 3'-terminal podem hibridizar uns aos outros para formar uma hélice de terminal. Alternativamente, os nucleotídeos 'UGAGA' no trecho de 5'-terminal pode hibridizar aos nucleotídeos 'UCUCA' no trecho de 3'-terminal para formar uma hélice de terminal. Uma redução para oito nucleotídeos do trecho de 5'-terminal ('GAGAUAGG') e para nove nucleotídeos do trecho de 3'-terminal ('CUGAUbCUC') de molécula 190-A3-001 (por meio da qual seis dos oito / nove nucleotídeos do trecho de 5'- e 3'-terminal podem hibridizar uns aos outros) não tem uma influência sobre a afinidade de ligação a SDF-1 (190-A3-004; figura 6 e figura 19). A constante de ligação de equilíbrio Kd de 190A3-004 foi determinada usando a prova de ligação de pull down (Kd = 4,6 nM, figura 20) e por medição da ressonância de plasmon superficial (Kd = 4,7 nM). A ICso (concentração inibitória de 50%) de 0,1 nM para 190-A3-004 foi medida usando uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular (figura 22). No entanto, a truncação a dois nucleotídeos no trecho de 5'-terminal leva a uma redução muito forte da afinidade de ligação (190-A3-007; figura 6 e figura 19).

[00231] Os ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 191D5-001, 197-B2 e 197-H1 (sequência de nucleotídeos de

E3/197-B1 (sequência de nucleotídeos de núcleo: |GGUUAGGGCUUGAAGUCGG|) compartilham uma sequência de nucleotídeos de núcleo quase idêntica (Fórmula-4 do Tipo C;

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117/151 sequência de nucleotídeos: |GGUUAGGGCUHGAAGUCGG|)· 191-D5001, 197-B2 e 197-H1 não compartilham um trecho similar de 5'- e 3'terminal (197-H3 e 197-E3 têm o trecho de 5'- e 3'-terminal idêntico a 197-B2). No entanto, o respectivos dez (197-B2, 197-E3, 197-H3) ou nove dos dez (191-D5-001, 197-H1) nucleotídeos do trecho de 5'terminal podem hibridizar aos respectivos dez (197-B2, 197-E3, 197H3) ou nove dos dez (191-D5-001, 197-H1) nucleotídeos do trecho de 3'-terminal (figura 5). Portanto, o trecho de 5'-terminal dos ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197H1, 197-E3 e 197-H3 conforme mencionado acima mais 191-A5, 197B1, 197-H2, 197-D1 e 197-D2 compreendem uma sequência de nucleotídeos geral comum de 'RKSBUSNVGR' (Fórmula-5-5' do Tipo C). O trecho de 3'-terminal dos ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3, e 197-H3 conforme mencioado acima mais 191-A5, 197-B1, 197-H2, 197-D1 e 197-D2 compreende uma sequência de nucleotídeos geral comum de 'YYNRCASSMY' (Fórmula-5-3' do Tipo C), por meio da qual os trechos de 5' e o 3'-terminal de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 e 197-H3 são preferenciais. Estes trechos de 5'- e 3'-terminal preferenciais de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 e 197-H3 podem ser resumidos na fórmula geral 'RKSBUGSVGR' (Fórmula-6-5' do Tipo C; trecho de 5'-terminal) e 'YCNRCASSMY' (Fórmula-6-3' do Tipo C; trecho de 3'-terminal).

[00232] Derivados truncados de ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-001 foram construídos e testados em uma prova de ligação de pull down competitiva vs. a molécula original 191-D5-001 (figura 7A, figura 7B e figura 19). Primeiro a extensão dos trechos de 5'- e 3'-terminal foram encurtadas de dez nucleotídeos (191-D5-001) cada para sete nucleotídeos cada (191-D5-004) conforme

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118/151 representado na figura 7A por meio da qual nove dos (191-D5-001) ou seis dos sete nucleotídeos (191-D5-004) do trecho de 5'-terminal e do trecho de 3'-terminal, respectivamente podem hibridizar uns aos outros. A redução para sete nucleotídeos do trecho de 5'- e 3'- terminal respectivamente (ao passo que seis dos sete nucleotídeos podem hibridizar uns aos outros) levou a reduzida afinidade de ligação para SDF-1 (191-D5-004). Os trechos terminais de ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-004 foram modificados por meio da qual o nucleotídeo não pareandte 'A' dentro do trecho de 3'-terminal de 191-D5-004 foi substituído por um 'C' (191-D5-005). Esta modificação levou a um aprimoramento da ligação. Este derivado, ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-005, apresentou ligação a SDF-1 similar a 191-D5-001. Truncação adicional do trecho de 5'- e 3'-terminal a cinco nucleotídeos respectivamente levou a uma molécula com uma extensão total de 29 nucleotídeos (191-D5-007). Devido às similaridades de 191-D5-001 e dos ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 191-A5, 197-H3, 197-B1, 197-E3, 197-D1, 197-H2 e 197-D2 e devido aos dados mostrados para 191-D5-007 pode-se presumir que o trecho de 5'- e de 3'-terminal pode em princípio ser truncado para baixo para cinco nucleotídeos por meio da qual a sequência de nucleotídeos 'CGGGA' para o trecho de 5'-terminal e 'UCCCG' para o trecho de 3'terminal foi testado com sucesso (ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-007). Ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-007 liga surpreendentemente um tanto melhor a SDF-1 do que 191-D5-001 (determinado no nível de aptâmeros usando a prova de ligação de competição). A constante de ligação de equilíbrio KD de 191-D5-007 foi determinada usando a prova de ligação de pull down (KD = 2,2 nM, figura 20) e por medição da ressonância de plasmon superficial (Kd = 0,8 nM, figura 21). A IC50 (concentração inibitória de

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50%) de 0,1 nM para 191-D5-007 foi medida usando uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular. Truncação adicional de ambos os trechos terminais para quatro nucleotídeos (191-D5-010, figura7A). [00233] Derivados adicionais de ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-001 (191-D5-017/ -024/ -029) portando trechos de 5'- e 3'-terminal de respectivamente quatro nucleotídeos também apresentaram reduzida afinidade de ligação para SDF-1 na prova de ligação de pull down de competição vs. 191-D5-007 (figura 7B). Trechos alternativos de 5'- e 3'-terminal com uma extensão de respectivamente cinco nucleotídeos foram adicionalmente testados, também (191-D5-017-29a, 191-D5-017-29b, 191-D5-019-29a, 191-D5024-29a, 191-D5-024-29b). A fórmula geral destes derivados para o trecho de 5'-terminal é 'XSSSSV' (Fórmula-7-5' do Tipo C) e para o trecho 3' é 'BSSSXS' Fórmula-7-3' do Tipo C), por meio da qual XS está ausente ou ,S'. Duas das cinco variantes testadas apresentaram idêntica afinidade de ligação a SDF-1 que 191-D5-007 (191-D5-02429a, 191-D5-024-29b; figura 7B). As sequências dos trechos de 5'terminal e 3'-terminal dos derivados 191-D5-001 que mostram a melhor afinidade de ligação a SDF-1 e compreendem um trecho de 5'terminal e 3'-terminal de cinco nucleotídeos respectivamente (191-D5007, 191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b) podem ser resumidas em uma fórmula geral (trecho de 5'-terminal: 'SGGSR', Fórmula-8-5' do Tipo C; trecho de 3'-terminal: , YSCCS', Fórmula-8-3' do Tipo C).

[00234] Derivados truncados de ácido nucleico de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-B2 foram analisados em uma prova de ligação de pull down competitivo versus a molécula original 197-B2 e 191-D5-007 (figura 8). Usando a prova de ligação de pull down competitivo versus 191-D5-007 foi mostrado que 197-B2 tem a mesma afinidade de ligação para SDF-1 que 191-D5-007. Os trechos de 5'- e 3'-terminal foram encurtados sem perda de afinidade de ligação a partir de dez

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120/151 nucleotídeos (197-B2) cada a cinco nucleotídeos cada (197-B2-005) por meio da qual os nucleotídeos do trecho de 5'-terminal e do trecho de 3'-terminal podem hibridisar completamente um ao outro. Se o trecho de 5'-terminal ('GCGGG') e 3'-terminal ('CCUGC') de 197-B2005 foi substituído por 'GCCGG' (trecho de 5'-terminal) e por 'CCGGC' (trecho de 3'-terminal) de 197-B2-006, a afinidade de ligação a SDF-1 persistiu totalmente. Como 197-B2 e 191-D5-001 (e seus derivados) compartilham a sequência de nucleotídeos de núcleo idêntica (GGUUAGGGCUAGAAGUCGG) e vários derivados de 191-D5 com trechos de 5'- e 3'-terminal com uma extensão de respectivamente quatro nucleotídeos foram testados, uma truncação adicional do trecho de 5'- e 3'-terminal foi omitida. Dois derivados adicionais foram designados que compreendem seis nucleotídeos na extremidade 5' e 3' (trechos de 5'- e 3'-terminal) respectivamente. A afinidade de ligação a SDF-1 de ambas as moléculas (197-B2-006-31a e 197-B2-006-31b) é a mesma que mostrado para 191-D5-007 e 197-B2-006 (figura 8). As sequências dos trechos de 5'-terminal e 3'-terminal de 197-B2 derivados que mostram a melhor afinidade de ligação para SDF-1 e compreendem um trecho de 5'-terminal e 3'-terminal de cinco nucleotídeos respectivamente podem ser resumidas em uma fórmula geral (trecho de 5'-terminal: 'GCSGG', Fórmula-9-5' Tipo C; trecho de 3'-terminal: ,CCKGC', Fórmula-9-3' Tipo C).

[00235] Combinando os trechos 5' e 3' de derivados truncados de ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-001 (trecho de 5'-terminal: 'SGGSR', Fórmula-8-5' Tipo C; trecho de 3'-terminal: ,YSCCS', Fórmula-8-3' Tipo C) e 197-B2 (trecho de 5'-terminal: 'GCSGG', Fórmula-9-5' Tipo C; trecho de 3'-terminal: ,CCKGC', Fórmula-9-3' Tipo C) a fórmula geral preferencial comum para o trecho de 5'-terminal e o 3'-terminal é 'SSSSR' (trecho de 5'-terminal, Fórmula-10-5' Tipo C) e 'YSBSS' (trecho de 3'-terminal: Fórmula-10-3'

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Tipo C).

1.4 ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 adicionais [00236] Adicionalmente, foram identificados três ácidos nucleicos de ligação de SDF-1 adicionais que não compartilham os motivos de ligação de SDF-1 de 'Tipo A', 'Tipo B' e 'Tipo C'. Eles foram analisados como aptâmeros usando a prova de ligação de pull down (figura 9).

[00237] Deve ser entendido que quaisquer das sequências mostradas nas Figuras 1 a 9 são ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, incluindo as formas truncadas das mesmas m as também incluindo as formas estendidas das mesmas com a condição, no entanto, de que as moléculas de ácido nucleico deste modo truncadas e estendidas, respectivamente, ainda são capazes de ligar ao alvo.

Exemplo 2: 40kda-PEG e outra Modificação de Spiegelmeros ligado SDF [00238] De modo a prolongar a duração da permanência plasmática de Spiegelmeros in vivo, os Spiegelmeros 193-G2-012, 192-A10-008, 191-D5-007, 197-B2-006 e 197-B2-006-31b foram ligados de modo covalente a uma porção de 40 kDa de polietileno glicol (PEG) na extremidade 5' conforme descrito no capítulo 3 (clones PEGuilados: 193-G2-012-5'-PEG, 192-A10-008-5'PEG, 191-D5-007-5'PEG, 197-B2006-5'PEG e 197-B2-006-31b-5'PEG).

[00239] As moléculas de Spiegelmeros PEGuilados foram analisadas em uma prova TAX de cultura celular in vitro (Exemplo 5) e por medições da ressonância de plasmon usando um Biacore (Exemplo 6). Todos os Spiegelmeros modificados com 40 kDa-PEG ainda são capazes de inibir quimiotaxia induzida por SDF-1 e ligar a SDF-1 em baixa faixa nanomolar (figuras 23A, 23B, 24A e figura 24B).

[00240] Adicionalmente, Spiegelmero 192-A10-001 ligando SDF foi modificado com 40kDa-PEG, 30 kDa-PEG, 100kDa-HES ou 130 kDaPetição 870180154936, de 26/11/2018, pág. 132/208

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HES (clones PEGuilados: 192-A10-001-5^,PEG40, 192-A10-0015'PEG30, 192-A10-001-5'HES100, 192-A10-001-5'HES130;

procedimento de ligação no exemplo 3). Conforme representado na figura 25A e na figura 25B nem uma porção PEG ou uma porção HES tem uma influência sobre a potência de Spiegelmeros para inibir quimiotaxia induzida por SDF-1.

Exemplo 3: Síntese e derivação de Aptâmeros e Spiegelmeros

3.1 SÍNTESE EM PEQUENA ESCALA [00241] Aptâmeros e Spiegelmeros foram produzidos por síntese de fase sólida com um sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) usando química de fosforamidita de 2'TBDMS RNA (Damha and Ogilvie, 1993). rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)-, e rUfosforamiditas na configuração D- e L- foram adquiridas da ChemGenes, Wilmington, MA. Aptâmeros e Spiegelmeros foram purificados por eletroforese de gel.

3.2 SÍNTESE EM LARGA ESCALA MAIS MODIFICAÇÃO [00242] Os Spiegelmeros foram produzidos por síntese de fase sólida com um sintetizador ÃktaPilot100 (Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Freiburg) usando química de fosforamidita de 2'TBDMS RNA (Damha and Ogilvie, 1993). L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, e L-rU- fosforamiditas foram adquiridas da ChemGenes (Wilmington, MA, EUA). O 5'-amino-modificador foi adquirido da American International Chemicals Inc. (Framingham, MA, EUA). A síntese dos Spiegelmeros foi iniciada sobre L-riboG; L-riboC, L-riboA, LriboU respectivamente modificou CPG tamanho de poro de 1000 A (Link Technology, Glasgow, Reino Unido). Para acoplamento (15 min por ciclo), 0,3 M de benziltiotetrazol (American International Chemicals Inc., Framingham, MA, EUA) em acetonitrilo, e 3,5 equivalentes da solução respectiva a 0,2 M de fosforamidita em acetonitrilo foi usado. Foi usado um ciclo de capeamento de oxidação. Solventes e

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123/151 reagentes de rotina para síntese de oligonucleotídeo foram adquiridos da Biosolve (Valkenswaard, Países Baixos). Os Spiegelmeros foram sintetizados DMT-ON; depois de desproteção, foi purificado através de RP-HPLC do preparativo (Wincott F. et al., 1995) usando meio Source15RPC (Amersham). O grupo 5'DMT foi removido com 80% de ácido acético (90 min em temperatura ambiente). Subsequentemente, solução aquosa a 2 M de NaOAc foi adicionada e o Spiegelmero foi dessalgado por filtração de fluxo tangencial usando uma membrana de celulose regenerada 5 K (Millipore, Bedford, MA).

3.3 PEGUILAÇÃO [00243] De modo a prolongar a duração da permanência plasmática dos Spiegelmeros in vivo, os Spiegelmeros foram acoplados de modo covalente a uma porção de 40 kDa de polietileno glicol (PEG) na extremidade 5'.

[00244] Para PEGuilação (para detalhes técnicos do método para PEGuilação vide o requerimento de patente Europeia N° EP 1 306 382), os Spiegelmeros 5'-amino modificados purificados foram dissolvidos em uma mistura de H2O (2,5 ml), DMF (5 ml), e tampão A (5 ml; preparado misturando ácido cítrico · H2O [7 g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico [2,26 ml], e 1 M de NaOH [343 ml] e adicionando água para um volume final de 1 l; pH = 8,4 foi ajustado com 1 M de HCl).

[00245] O pH da solução de Spiegelmero foi trazido para 8,4 com 1 M de NaOH. Em seguida, 40 kDa de PEG-NHS éster (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) foi adicionado a 37°C a cada 30 min em seis porções de 0,25 equivalente até uma produção máxima de 75 a 85% ser atingida. O pH da mistura da reação foi mantido a 8 a 8,5 com 1 M de NaOH durante adição do PEG-NHS éster.

[00246] A mistura da reação foi combinada com 4 ml de solução de ureia (8 M), e 4 ml de tampão B (0,1 M de acetato de trietilamônio em

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H2O) e aquecida até 95°C por 15 min. O Spiegelmero PEGuilado foi em seguida purificado por RP-HPLC com meio Source 15RPC (Amersham), usando um gradiente de acetonitrilo (tampão B; tampão C: 0,1 M de acetato de trietilamônio em acetonitrila). Excesso de PEG elutriou a 5% de tampão C, Spiegelmero PEGuilado a 10 a 15% de tampão C. Frações de produto com uma pureza de >95% (conforme avaliado por HPLC) foram combinadas e misturadas com 40 ml de NaOAC a 3 M. O Spiegelmero PEGuilado foi dessalgado por filtração de fluxo tangencial (membrana de celulose regenerada 5 K, Millipore, Bedford MA).

3.4 HESilação [00247] De modo a prolongar a duração da permanência plasmática de Spiegelmeros in vivo, os Spiegelmeros foram acoplados de modo covalente a Hidroxil Etil Amido (HES) de vários pesos moleculares de >130 kDa e grau de substituição >0,5. A extremidade 5' do Spiegelmero é o sítio preferencial para conjugação.

[00248] Para HESilação (para detalhes técnicos do método para Hesilação de ácidos nucleicos vide o requerimento de patente alemã N° German Offenlegungsschrift DE 101 12 825 A1, e para D/L-ácidos nucleicos vide o requerimento de patente internacional N° PCT WO 02/080979 A2), o Spiegelmero 5'-amino modificado purificado foi dissolvido em bicarbonato de sódio (0,3 M, 1 ml) e o pH é ajustado para 8.5.

[00249] Em respeito ao Spiegelmero, um excesso de 5 vezes do ácido HES livre (3,3 mmol, Supramol, Rosbach, Alemanha) e di(Nsuccinimidil) carbonato (3,3 mmol) foram adicionados a N,Ndimetilformamida (1 ml) para produzir uma solução do éster de Nhidroxissuccimida ativado de HES. Para dissolver todos os reagentes a mistura foi agitada brevemente a 60°C, resfriada até 25 °C e em seguida agitada por 1,5 h a 25 °C. A solução de Spiegelmero foi

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125/151 adicionada à solução de HES ativado, e a mistura resultante foi agitada a 25°C e pH 8.5. A reação foi monitorada por IEX-HPLC analítica. Tipicamente a conjugação prosseguiu até >75 % dentro de 1 hora.

[00250] Para purificação por IEX-HPLC através de meio Source 15Q (GE, Freiburg, Alemanha) A mistura da reação foi combinada com uma quantidade de 10 vezes de tampão A (1 mM de EDTA, 25 mM de Tris, 10 mM de NaClO4 em água / acetonitrila a 9:1, pH 4). Excesso de HES elutria a 5% de tampão A (1 mM de EDTA, 25 mM de Tris, 500 mM de NaClO4 em água / acetonitrilo a 9:1, pH 4), ao passo que o conjugado HES-Spiegelmero elutria a 20 a 30% de tampão B. Frações de produto com uma pureza de >95% (conforme avaliado por HPLC) foram combinadas e dessalgadas por filtração de fluxo tangencial (membrana de celulose regenerada 5 K, Millipore, Bedford MA).

Exemplo 4: Determinação de constantes de ligação (Prova de ligação de pull down)

4.1 Prova de ligação de pull down direta [00251] A afinidade de aptâmeros para D-SDF-1 humano biotinilado foi medida em um formato de prova de ligação de pull down a 37°C. Aptâmeros foram marcados com 5'-fosfato por T4 polinucleotídeo quinase (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) usando ATP marcada com [γ-³²Ρ] (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemanha). A radioatividade específica de aptâmeros marcados foi 200.000 a 800.000 cpm/pmol. Aptâmeros foram incubados depois de desnaturação e renaturação em concentração de 10, 20, 30 ou 40 pM a 37°C em tampã o de seleção (20 mM de Tris-HCl pH 7.4; 137 mM de NaCl; 5 mM de KCl; 1 mM de MgCb; 1 mM de CaCb; 0,1% [peso/ vol] de Tween-20) junto com quantidades variáveis de D-SDF-1 humano biotinilado por 4 a 12 horas de modo a atingir equilíbrio em baixas concentrações. Tampão de seleção foi suplementado com 10 pg/ml de albumina sérica humana

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126/151 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha), e 10 pg/ml de RNA de levedura (Ambion, Austin, EUA) de modo a prevenir adsorção de parceiros de ligação com superfícies de plasticware usadas ou a matriz de imobilização. A faixa de concentração de d-SDF-1 humano biotinilado foi ajustada de 8 pM a 100 nM; o volume total da reação foi de 1 ml. Peptídeo e complexos de peptídeo-aptâmero foram imobilizados sobre

1,5 pl de partículas Streptavidin Ultralink Plus (Pierce Biotechnology, Rockford, EUA) as quais tinham sido pré-equilibradas com tampão de seleção e ressuspensas em um volume total de 6 pl. As partículas foram mantidas em suspensão por 30 min na temperatura respectiva em um termomisturador. A radioatividade imobilizada foi quantificada em um contador de cintilação depois de destacar o sobrenadante e apropriada lavagem. A percentagem de ligação foi plotada contra a concentração de d-SDF-1 humano biotinilado e foram obtidas constantes de dissociação usando algoritmos do programa (GRAFIT; Erithacus Software; Surrey, Reino Unido) presumindo uma estequiometria de 1:1.

4.2 Prova de ligação de pull down competitiva [00252] De modo a comparar diferentes aptâmeros de ligação de dSDF-1, foi realizada uma prova de classificação competitiva. Para esta finalidade o aptâmero mais affine disponível foi marcado radioativamente (vide acima) e serviu como referência. Depois de desnaturação e renaturação foi incubado a 37°C com d-SDF-1 humano biotinilado em 1 ml de tampão de seleção em condições que resultaram em torno de 5 a 10 % de ligação ao peptídeo depois de imobilização e lavagem sobre agarose NeutrAvidin ou Streptavidin Ultralink Plus (ambos da Pierce) sem competição. Um excesso de variantes de aptâmero de d-RNA não marcado desnaturado e renaturado foi adicionado a diferentes concentrações (por exemplo, 2, 10, e 50 nM) com o aptâmero de referência marcado para reações de

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127/151 ligação paralela. O aptâmeros a ser testado competiu com o aptâmero de referência para ligação-alvo, deste modo diminuindo o sinal de ligação em dependência de suas características de ligação. O aptâmero que foi considerado mais ativo neste teste pode então servir como uma nova referência para análise comparativa de variantes de aptâmeros adicionais.

Exemplo 5: Análise da inibição de quimiotaxia induzida por SDF-1 por Spiegelmeros de ligação de SDF-1 [00253] Células de leucemia de células T humanas Jurkat (obtidas da DSMZ, Braunschweig) foram cultivadas a 37°C e 5% de CO2 em meio RPMI 1640 com Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) o qual contém 10% de soro bovino fetal, 100 unidades/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). Um dia antes do experimento, as células foram semeadas em um novo frasco com uma densidade de 0,3 x 10⁶/ml (9 x 106/30 ml) em meio de rotina (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha).

[00254] Para o experimento, as células foram centrifugadas (5 min a 300g ), ressuspensas, contadas e lavadas uma vez com 15 ml de HBH (solução salina balanceada de Hanks contendo 1 mg/ml de albumina sérica bovina e 20 mM de HEPES; Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). Em seguida as células foram ressuspensas a 3 x 106/ml ou 1,33 x 10⁶/ml, dependendo do tipo de placa de filtro usada. Em seguida, as células foram deixadas para migrar através das membranas porosas das placas de filtro por várias horas para uma solução contendo SDF-1 e várias quantidades de Spiegelmero. Foram usados ou placas Transwell e insertos com membrana de Policarbonato porosa, tamanho de poro de 5 pm (Corning; 3421) ou placas MultiScreen MIC (Millipore, MAMIC5S10).

5.1 Protocolo para placas Transwell [00255] As soluções de estimulação (SDF-1 + várias concentrações

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128/151 de Spiegelmero) foram preparadas em 600 μΙ de HBH nos compartimentos inferiores das placas Transwell e incubadas por 20 a 30 min. Todas as condições foram dispostas no mínimo duas vezes. Os insertos foram transferidos para as cavidades contendo as soluções de estimulação e 100 μl de uma suspensão celular com 3 x 10⁶/ml foram adiiconadas aos insertos (3 x 10⁵ células/ cavidade). Em seguida, as células foram deixadas para migrar por 3 h a 37°C.

[00256] Depois disso, os insertos foram removidos e 60 μl de solução de trabalho de resazurin (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) (440 μΜ em PBS; Biochrom, Berlin, Alemanha) foram adicionados às cavidades (também a cavidades de calibração). As placas em seguida foram incubadas a 37°C por 2,5 a 3 h. Depois de incubação, 200 μl de cada cavidade foram transferidos para uma placa de 96 cavidades preta. Foi feita medição dos sinais de fluorescência a 544 nm (excitação) e 590 nm (emissão) em uma leitora de lâminas de multidetecção Fluostar Optima (BMG, Offenburg, Alemanha).

5.2 Protocolo para lâminas Millipore MultiScreen [00257] As soluções de estimulação (SDF-1 + várias concentrações de Spiegelmero) foram preparadas como 10X soluções em uma lâmina de 96 tubos de 0,2 ml de perfil baixo. 135 μl de HBH foram pipetados para dentro dos compartimentos inferiores da lâmina MultiScreen e foram adicionados 15 μl das soluções de estimulação. Todas as condições foram feitas como triplicatos. Depois de 20 a 30 min a placa de filtro foi inserida na placa contendo as soluções de estimulação e 75 μl de uma suspensão celular com 1,33 x 10⁶/ml foram adicionados às cavidades da placa de filtro (1 x 10⁵ células/ cavidade). As células foram em seguida deixadas para migrar por 3 h a 37°C.

[00258] Depois disso, a lâmina do inserto é removida e 20 μl de solução de trabalho de resazurin (440 μΜ em PBS) são adicionados às

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129/151 cavidades inferiores. As lâminas foram em seguida incubadas a 37°C por 2,5 a 3 horas.

[00259] Depois de incubação, 100 μΙ de cada cavidade foram transferidas para uma lâmina de 96 cavidades preta. Foi realizada medição dos sinais de fluorescência conforme descrito acima.

5.3 Avaliação [00260] Para avaliação, valores de fluorescência foram corrigidos para fluorescência de fundo (sem células na cavidade). Em seguida, foi calculada a diferença entre condições experimentais com e sem SDF-1. O valor para a amostra sem Spiegelmero (SDF-1 somente) foi determinado 100% e os valores para as amostras com Spiegelmero foram calculados como percentagem disto. Para uma curva de doseresposta os valores de percentagem foram plotados contra concentração de Spiegelmero e o valor da IC50 (concentração de Spiegelmero na qual está presente 50% da atividade sem Spiegelmero) foi determinado graficamente a partir da curva resultante.

5.4 Resultados

5.4.1 Estimulação dose dependente de células por SDF-1 humano [00261] Foi visto que SDF-1 humano estimula a migração de células Jurkat em uma maneira dose dependente, com estimulação meia-máxima a cerca de 0,3 nM (figura 11).

5.4.2 Inibição dose dependente de quimiotaxia induzida por SDF-1 humano por Spiegelmeros de ligação de SDF-1 [00262] Quando as células foram deixadas para migrar para uma solução contendo SDF-1 humano mais concentrações crescentes de Spiegelmeros de ligação de SDF-1, foi observada inibição dosedependente. As IC50s respectivas dos Spiegelmeros testados são especificadas no Exemplo 1. Quando foi usado um Spiegelmero Controle inespecífico ao invés de Spiegelmeros de ligação de SDF-1,

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130/151 não foi observado efeito inibitório até 1 μΜ (figura 26).

5.4.3 Inibição dose dependente de quimiotaxia induzida por SDF-1 de camundongo, por Spiegelmeros ligando SDF-1 [00263] SDF-1 é bem conservado entre as espécies: SDF-1 de camundongo difere de SDF-1 α humano em um aminoácido (isoleucina na posição 18 ao invés de valina). SDF-1 murino pode estimular quimiotaxia de células Jurkat (figura 27) e foi visto que esta ação é inibida por Spiegelmeros 192-A10-001 e 191-D5-007-5'-PEG com a mesma potência como no caso de SDF-1 humano (figura 28).

Exemplo 6: Análise de Ligação por Medição da Ressonância de Plasmon Superficial [00264] O instrumento Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) foi usado para analisar a ligação de Spiegelmeros a SDF-1 α humano. Quando a ligação de SDF-1 aDdevia ser obtida através de grupos amina, SDF-1 anfoi dialisado contra água por 1 a 2 horas (Millipore VSWP ésteres celulósicos mistos; tamanho de poro, 0,025 μΜ) para remover aminas interferentes. Chips sensores CM4 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) foram ativados antes de ligação de proteína por uma injeção de 35 μl de uma diluição a 1:1 de NHS a 0,4 M e EDC a 0,1 M em um fluxo de 5 μ^η. Quimiocina foi em seguida injetada em concentrações de 0,1 a 1,5 μg/ml em um fluxo de 2 μ^η até a resposta do instrumento estar na faixa de 1000 a 2000 RU (unidades relativas). Ésteres de NHS não reagidos foram desativados por injeção de 35 μl de solução de cloridreto de etanolamina (pH 8.5) em um fluxo de 5 μ^π. O chip sensor foi primed duas vezes com tampão de ligação e equilibrado a 10 μ^η por 1 a 2 horas até a linha basal parecer estável. Para todas as protepubas, parâmetros cinéticos e constantes de dissociação foram avaliados por uma série de injeções de Spiegelmero em concentrações de 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, e 0 nM em tampão de seleção (Tris-HCl, 20 mM; NaCl, 137

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131/151 mM; KCl, 5 mM; CaCl2, 1 mM; MgCl2, 1 mM; Tween20, 0,1% [peso/ vol]; pH 7.4). Em todos os experimentos, a análise foi realizada a 37°C usando o comando Kinject definindo um tempo de associação de 180 e um tempo de dissociação de 360 segundos em um fluxo de 10 pl/min. Foi feita análise dos dados e cálculo das constantes de dissociação (Kd) com o software BIAevaluation 3.0 (BIACORE AB, Uppsala, Suécia) usando o algoritmo de ajustamento estequiométrico de Langmuir a 1:1.

Exemplo 7: Inibição, de ligação de [¹²⁵J]-SDF-1 a células expressando CXCR4, por Spiegelmeros de ligação de SDF-1

7.1 Método [00265] Um clone de cDNA codificando para CXCR4-receptor humano (NM_003467.2) foi adquirido da OriGene Technologies (Rockville, MD) e clonado no pCR3.1-vector (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). O vetor resultante foi transfectado em células CHO-K1 (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) usando Lipofectamin 2000 (Invitrogen) e linhagens celulares de expressão estável foram selecionadas por tratamento com geneticina. A expressão de receptores foi verificada por RT-PCR.

[00266] Para provas de ligação células expressando CXCR4 foram semeadas em lâminas de 24 cavidades revestidas com polilisina em uma densidade celular de 1 x 10⁵ células/ cavidade e cultivadas de um dia para o outro a 37°C e 5% de CO 2 em meio CHO-Ultra (Cambrex, Verviers, Bélgica) contendo 50 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina e 0,5 mg/ml de geneticina.

[00267] Para o experimento de ligação, o meio foi removido e as células foram lavadas uma vez com solução salina balanceada de Hanks, contendo adicionalmente 20 mM de HEPES, 1 mg/ml de albumina sérica bovina, 0,1 mg/ml de bacitracin (HBB). Em seguida as células foram incubadas em 0,2 ml de HBB por 1 h em temperatura

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132/151 ambiente junto com 50 pM de [¹²⁵J]-SDF-1 (PerkinElmer, Rodgau, Alemanha) e concentrações variáveis de Spiegelmero.

[00268] Ligação não-específica foi determinada adicionando SDF-1 humano não marcado (R & D Systems, Wiesbaden, Alemanha) para uma concentração final de 0,5 μΜ a várias cavidades.

[00269] Depois do período de incubação o sobrenadante foi removido e as cavidades foram lavadas 3 vezes com HBB gelado. Depois disso as células foram lisadas com 0,1 ml de NaOH a 0,1 M. Os lisados foram transferidos para frascos de cintilação e depois da adição de 4 ml de coquetel de cintilação Unisafe 1 Liquid Szintillation (Zinsser, Frankfurt, Alemanha) foram contados em um contador de cintilação Beckman LS6500.

[00270] Como os valores para ligação não-específica (ligação na presença de quantidade elevada de SDF-1 não marcado) foram um tanto maiores do que os valores para ligação total na presença de altas concentrações (500 pM) de Spiegelmero, a diferença entre ligação máxima (max) e ligação na presença de 500 pM de Spiegelmero foi usada para cálculo dos valores da IC50.

7.2 Resultados [00271] Plotagem de [¹²⁵I]-SDF-1 ligado contra concentração de Spiegelmeros revelou que a ligação de SDF-1 pode ser bloqueada por Spiegelmero 192-A10-001 com uma IC50 de cerca de 60 pM (figura 29).

Exemplo 8: Inibição, de ativação de MAP-quinase induzida por SDF-1, por Spiegelmeros de ligação de SDF-1

8.1 Método [00272] Células CHO expressando CXCR4 foram semeadas em lâminas de 6 cavidades em uma densidade de 0,5 x 10⁶ células/ cavidade e cultivadas por cerca de três horas a 37°C e 5% de CO2 em meio CHO-Ultra (Cambrex, Verviers, Bélgica) contendo 50

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133/151 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina e 0,5 mg/ml de geneticina. Depois de fixação celular o meio foi removido e substituído por meio F12 de Ham contendo 50 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina. Em seguida as células foram incubadas de um dia para o outro a 37°C e 5% de CO 2. Três horas antes da estimulação o meio foi substituído mais uma vez por meio fresco F12 de Ham. As células foram estimuladas com 1 nM de SDF-1 humano e várias quantidades de Spiegelmero por 5 ou 10 minutos. Depois disso o meio foi removido e as células foram rapidamente lavadas uma vez com 1 ml de salina tamponada com fosfato gelada (PBS), seguida por lise com tampão de amostra SDS (Tris/HCl, pH 6.8, 62,5 mM; glicerol, 10%; SDS, 2%; azul bromofenol, 0,01 %; beta-mercaptoetanol, 5%). 1 pl de 0,5 unidades/pl de Benzonase (Merck, Darmstadt, Alemanha) foi adicionado a cada cavidade e depois de incubação por 5 a 10 min em temperatura ambiente, os lisados foram transferidos para tubos Eppendorf, incubados a 95°C por 5 min e armazenados a-20°C até análise posterior.

[00273] 25 pl dos lisados foram separados sobre 10% de géis de

SDS-poliacrilamida desnaturante. Em seguida, as proteínas foram transferidas por eletroblotting sobre membranas de nitrocelulose HybondECL (Amersham/GE Healthcare, Munich, Alemanha). Depois de blotting, as membranas foram coradas com vermelho de Ponceau (0,2% em 3% de ácido tricloroacético) para controle da carga protéica e transferência e em seguida bloqueadas por incubação em TBS-T (salina Tris-tamponada (20 mM de Tris/HCl, pH 7.6, 137 mM de NaCl) com 0,1% de Tween 20) contendo 10% de leite em pó sem gordura a 2 a 8°C de um dia para o outro.

[00274] Em seguida, a membrana foi incubada com um anticorpo anti-Fosfo-MAP-quinase de coelho (1:1000 em 10% de leite em TBST) por 2 h em temperatura ambiente. Depois de lavar três vezes por 5

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134/151 min com TBS-T, a membrana foi incubada com anticoelho-IgG-HRPconjugado (1:2000 em 10% de leite em TBS-T) por 1 h em temperatura ambiente. Em seguida a membrana foi novamente lavada três vezes por 5 min com TBS-T, seguida por incubação por 1 min em reagente quimiluminescente LumiGlo^R. A luminescência foi detectada por exposição a filmes de quimiluminescência Hyperfilm^®ECL (Amersham/GE Healthcare) por 30 segundos a 2 minutos. Os anticorpos e o reagente de detecção de luminescência foram componentes do kit PhosphoPlus p44/42 MAP Kinase (Thr202/Tyr204) Antibody da Cell Signaling Technology (New England Biolabs, Frankfurt a.M., Alemanha).

8.2 Resultados [00275] Estimulação de células expressando CXCR4 com 1 nM de SDF-1 humano por 5 min levou a uma profunda estimulação de MAPquinase, indicada por um aumento na intensidade da banda refletindo MAP-quinase ativada. Esta ativação de MAP-quinase pode ser inibida de modo dose-dependente pelo Spiegelmero 191-A10-001 (figura 30).

Exemplo 9: Análise funcional de Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano em uma prova de germinação de anel aórtico [00276] Para testar se Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano é funcional também em uma prova de cultura de orgãos de angiogênese de rotina, foram realizadas provas de germinação de anel aórtico. Esta prova, na qual são avaliadas a extensão e a abundância de extensões semelhantes a vaso dos explantes, se tornou o modelo de cultura de órgãos mais amplamente usado para angiogênese (Auerbach et al. 2003). Já foi mostrado que SDF-1 induz germinação neste tipo de prova (Salcedo et al. 1999). [00277] Aortas de ratos foram cortadas em anéis, embutidas em uma matriz de colágeni e incubadas com SDF-1 e SDF-1 mais

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Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano ou SDF mais um Spiegelmero Controle PEGuilado não-funcional que não liga SDF-1. Depois de 6 a 7 dias, a germinação (isto é, desenvolvimento de células endoteliais) foi analisada tirando fotografias e determinando um índice de germinação.

Método [00278] Aortas de ratos machos foram obtidas da Bagheri Life sciences (Berlin, Alemanha). As aortas foram preparadas recentemente e transportadas sobre gelo em meio MCDB 131-Medium (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) contendo 50 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina (ambas da Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) e 2,5 pg/ml de fungizona (Cambrex, EUA).

[00279] Para um experimento uma única aorta fiu transferida para uma placa de cultura celular junto com o meio e foi removido tecido conjuntivo residual. Em seguida a aorta foi cortada com um bisturi em anéis de cerca de 1 a 2 mm de extensão. Os anéis foram lavados intensivamente (no mínimo cinco vezes) em meio Medium 199 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) e em seguida colocados dentro de cavidades de uma lâmina de 24 cavidades, contendo 450 pl de solução de colágeno por cavidade. Esta solução de colágeno foi preparada misturando 9 ml de colágeno da cauda de rato (3 mg/ml em 0,1% de ácido acético; Sigma, Deisenhofen, Alemanha) com 1,12 ml de 10X Medium 199 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), 1,12 ml de 10X tampão de Colágeno (0,05 N de NaOH, 200 mM de HEPES, 260 mM de NaHCO3 ) e 0,6 ml de Glutamina a 200 mM. Os anéis foram orientados de tal modo que as bordas equilibradas ficassem perpendiculares ao fundo da cavidade. O colágeno foi deixado para solidificar incubando as lâminas por no mínimo uma hora a 37°C. Depois disso 1 ml de meio MCDB131 com adições (SDF-1 e Spiegelmeros) foi acrescentado por cavidade. Em seguida, os anéis

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136/151 foram incubados a 37°C por seis a sete dias. Como controle para germinação os experimentos foram feitos adicionalmente com VEGF (Fator de crescimento endotelial vascular).

[00280] A germinação foi documentada tirando fotografias com uma câmera digital. Em alguns casos, anéis foram fixados por adição de 1 ml de paraformaldeído a 10% e armazenados em 2 a 8°C para documentação posterior. As fotos foram analisadas com o software de processamento de imagens Scion Image. Depois de calibração com o auxílio de uma foto tirada de um micrômetro de estágio, uma linha foi desenhada em uma distância de 0,33 mm de uma borda de um anel. Um gráfico de histograma ao longo desta linha foi gerada pelo software, histogramas foram impressos e picos (representando germinações cruzando a linha) foram contados. Este número foi tomado como índice de germinação. Foram avaliados 4 a 5 anéis por condição. Foi realizada análise estatistica com WinSTAT for Excel. Resultados [00281] Pode ser demonstrado que SDF-1 induz germinação e que este efeito pode ser bloqueado com Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano. Não foi observado bloqueio de germinação induzida por SDF-1 pelo Spiegelmero Controle PEGuilado não-funcional (Figuras 31 e 32).

Exemplo 10: Nível plasmático de SDF-1 e Spiegelmero 193G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano administrado a ratos como bolo intravenoso único de Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano [00282] Para testar se o Spiegelmero de ligação de SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG é funcional in vivo, Spiegelmero de ligação de SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG foi administrado em ratos como um bolo intravenoso e o nível plasmático de Spiegelmero de ligação de SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG e de SDF-1 foram

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137/151 determinados. Como controle foram determinados os níveis plasmáticos de SDF-1 de ratos não tratados.

[00283] Animais, administração e coleta de amostra [00284] Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano foi dissolvido em PBS para uma concentração final de 0,5 mg/ml e filtrado estéril. Ratos machos Sprague Dawley (peso de aproximadamente 300 g) foram administrados com 1,0 mg/kg de Spiegelmero de ligação de SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG como bolo intravenoso único. Amostras de sangue foram coletadas em vários pontos de tempo (conforme mostrado na figura 33) para seguir o clearance plasmático de Spiegelmero de ligação de SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG.

Prova de hibridização de sanduíche para quantificação de Spiegelmero [00285] A quantidade de Spiegelmero de ligação de SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG nas amostras foi quantificada por uma prova de hibridização de sanduíche. O princípio da prova de hibridização de sanduíche é bastante similiar a um ELISA comumente usado (Ensaio Imunossorvente ligado a Enzima): imobilização e detecção do Spiegelmero. A detecção se baseia na hibridização de uma sonda de detecção biotinilada a uma extremidade do Spiegelmero. A extremidade de filamento único remanescente da imobilização do meio de Spiegelmero do complexo na hibridização a uma sonda de captura imobilizada. Depois de complexos não ligados terem sido removidos, a sonda de detecção hibridisada ao Spiegelmero é finalmente detectada por um conjugado de estreptavidina / fosfatase alcalina convertendo um substrato de quimiluminescência. Uma prova de hibridização de sanduíche semelhante também foi aplicada para detecção e quantificação de um aptâmero de RNA conforme descrito por Drolet et al. (Drolet et. al, 2000).

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Preparação de lâmina de hibridização [00286] A sonda de captura 193-G2-012 (Seq. ID.: 240) foi imobilizada para lâminas de 96 cavidades DNA-BIND brancas (Corning Costar, Wiesbaden, Alemanha) a 100 nM em 0,5 M de fosfato de sódio, 1 mM de EDTA, pH 8.5 de um dia para o outro a 4°C. As cavidades foram lavadas duas vezes e bloqueadas com 0,5% em peso/ vol de BSA em 0,25 M de fosfato de sódio, 0,5 mM de EDTA, pH

8.5 por 2 h a 25°C, lavadas de novo e armazendas em temperatura ambiente até o uso. Antes de hibridização, lavadas duas vezes com tampão de lavagem (3xSSC, 0,5% [em peso/ vol] dodecil sarcosinato de sódio, pH 7.0; previamente um estoque de 20x [3 M de NaCl, 0,3 M de Na3Citrato] é preparado sem lauroil sarcosina de sódio e diluído desta maneira).

Preparação da amostra [00287] Todas as amostras foram testadas em duplicatas. Amostras de plasma foram degeladas sobre gelo, turbilhonadas e centrifugadas brevemente em uma centrifuga de tabletop resfriada. Homogenados de tecido foram degelados em temperatura ambiente e centrifugados 5 min em velocidade máxima e temperatura ambiente. As amostras foram diluídas com tampão de hibridização (40 nM de sonda de detecção 193-G2-012 [Seq. ID. 241] em tampão de lavagem) em temperatura ambiente de acordo com o seguinte esquema: 1:10 10 μ l de amostra + 90 μ l de tampão de hibridização

1:100 20 μ l 1:10 + 180 μ l de tampão de hibridização [00288] Todas as diluições das amostras foram testadas. Spiegelmero de ligação de SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG padrão foi diluído serialmente para uma curva de calibração de 12 pontos transpondo a faixa de 0,001 a 40 nM. O padrão de calibração foi idêntico ao das amostras em estudo.

Hibridização e detecção

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139/151 [00289] As amostras foram aquecidas por 5 min a 95°C e resfriadas até a temperatura ambiente. Complexos de Spiegelmero / sonda de detecção foram recozidos para sondas de captura imobilizadas por 45 min a 25°C a 500 rpm sobre um agitador. Spiegelm eros não ligados foram removidos lavando duas vezes com tampão de lavagem e 1x TBST (20 mM de Tris-Cl, 137 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20, pH 7.5), respectivamente. Complexos hibridizados foram detectados por estreptavidina fosfatase alcalina diluída a 1:5000 em 1x TBST por 1 h a 25°C a 500 rpm sobre um shaker. Para remover conj ugado não ligado, as cavidades foram lavadas de novo com 1x TBST. As cavidades foram finalmente preenchidas com 100 ml de substrato CSDP (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha) e incubadas por 45 min a 25°C. A quimiluminescência foi meida em uma l eitora de microlâmina FLUOstar Optima (BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemanha).

Análise dos dados [00290] Foram usadas as seguintes diluições das amostras testadas para análise quantitativa dos dados:

[00291] EDTA plasma de rato 1:100 [00292] Os dados obtidos do grupo de veículo (nenhum Spiegelmero foi administrado) foram subtraídos como sinal de fundo. ELISA para quantificação de Spiegelmero [00293] A quantidade de SDF-1 presente nas amostras de plasma foi quantificada com um ensaio imunossorvente ligado a enzima in vitro o qual emprega um anticorpo específico para SDF-1 α humano revestido sobre uma lâmina de 96 cavidades (kit Human SDF-1 α ELISA; RayBiotech, Norcross GA, EUA). O teste foi realizado de acordo com as instruções do vendedor.

Resultados [00294] Conforme mostrado na figura 33 o nível plasmático regular

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140/151 de SDF-1 em ratos não tratados está na faixa picomolar baixa (aproximadamente 50 pM). Em contraste o nível plasmático de ratos que foram tratados com Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano parece diferente: dentro das primeiras oitos horas depois da administração de Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano o nível plasmático de SDF-1 aumentou para aproximadamente 700 pM. Entre 12 e 72 horas o nível plasmático de SDF-1 diminuiu para aproximadamente 50 pM novamente. Este curso de tempo do nível plasmático de SDF-1 pode ser diretamente correlacionado com o nível plasmático do Spiegelmero 193-G2-012-5'PEG de ligação de SDF-1 humano. Devido à eliminação renal do Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano, o nível plasmático do Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano diminuiu de aproximadamente 1100 nM para abaixo de 50 nM dentro de 72 horas. No entanto, o Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano (MW appproximately 54000 Da) não foi eliminado do corpo dentro de uma hora conforme pode ser visto para Spiegelmeros não-PEGuilados (aproximadamente 15000 Da) ou outras moléculas com uma massa molecular abaixo do limite de filtração do rim como SDF-1. O SDF-1 endógeno foi ligado por Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano formando complexos de SDF-1- Spiegelmero por meio dos quais a eliminação e/ou degradação de SDF-1 foi retardado o que levou como consequência a níveis plasmáticos de SDF-1 elevados dentro das primeiras oito horas. Devido ao prosseguimento da eliminação de Spiegelmero 193-G2-012-5'-PEG de ligação de SDF-1 humano durante o tempo - por meio da qual a taxa de eliminação é muito mais lenta do que para moléculas muito menores como SDF-1 - o nível plasmático dos complexos formados por Spiegelmero 193-G2-012-5'PEG de ligação de SDF-1 humano e SDF-1 diminuiu (figura 33).

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Referências [00295] Os dados bibliográficos completos dos documentos mencionados aqui, neste requerimento de patente, caso não indicados ao contrário, são como se segue, por meio dos quais a revelação das referidas referências é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

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[00392] As características da presente invenção reveladas na especificação, suas reivindicações e/ou os desenhos podem tanto separadamente quanto em qualquer combinação dos mesmos ser material para realizar a invenção em várias formas da mesma.

Claims (21)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Molécula de L-ácido nucleico, ligada a SDF- 1 e tendo atividade antagonista a SDF-1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico apresenta uma sequência de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das SEQ ID N°s 46 a 56, 61 a 72 e 132.
2. 2. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico é um antagonista do sistema receptor de SDF-1.
3. 3. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o receptor SDF-1 do sistema receptor de SDF-1 é o receptor CXCR4.
4. 4. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o SDF-1 é um SDF-

   1 humano e/ou o receptor SDF-1 do sistema receptor de SDF-1 é um receptor SDF-1 humano.
5. 5. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o SDF-1 consiste em uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID N° 1.
6. 6. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico compreende uma modificação, em que a modificação é selecionada do grupo que consiste em uma porção HES e uma porção PEG.
7. 7. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a modificação é uma porção PEG que consiste em um PEG linear ou ramificado.
8. 8. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o peso molecular da porção PEG é entre

   2 e 180 kD, de 60 a 140 kD, ou é de 40 kD.

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9. 9. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico apresenta uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID N° 132.
10. 10. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a modificação é uma porção HES.
11. 11. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação

    10, caracterizada pelo fato de que o peso molecular da porção HES é de 10 a 130 kD.
12. 12. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação

    11, caracterizada pelo fato de que o peso molecular da porção HES é de 30 a 130 kD ou é de 100 kD.
13. 13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e, opcionalmente, um constituinte adicional, em que o constituinte adicional é selecionado do grupo que consiste em um excipiente farmaceuticamente aceitável e um agente farmaceuticamente ativo.
14. 14. Uso de uma molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica e/ou medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio, em que a dita doença ou distúrbio é selecionada do grupo que consiste em doenças do fundo do olho, como retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade; câncer de mama, ovários, próstata, pâncreas, tiroide, nasofaringe, cólon, pulmão, e estômago; osteossarcoma; melanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; síndrome WHIM; síndromes de deficiência imunológica; neovascularização patológica; esclerose múltipla; artrite reumatoide/osteoartrite e nefrite.

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15. 15. Uso de uma molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um meio de diagnóstico.
16. 16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o meio de diagnóstico é para o diagnóstico de uma doença, pelo que a doença é mediada por SDF-1.
17. 17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada do grupo que consiste em doenças do fundo de olho como retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade; câncer de mama, ovários, próstata, pâncreas, tiroide, nasofaringe, cólon, pulmão, e estômago; osteossarcoma; melanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; síndrome WHIM; síndromes de deficiência imunológica; neovascularização patológica; inflamação; esclerose múltipla; artrite reumatoide/osteoartrite e nefrite.
18. 18. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o meio de diagnóstico é para diagnosticar angiogênese, neovascularização, inflamação e/ou metástase.
19. 19. Complexo, caracterizado pelo fato de que compreende SDF1 e uma molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
20. 20. Complexo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o complexo é um complexo cristalino.
21. 21. Uso de uma molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para a detecção de SDF-1.