ES2678497T3 - Ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 y su uso en el tratamiento del cáncer - Google Patents

Ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 y su uso en el tratamiento del cáncer Download PDF

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 y de bloquear la interacción entre SDF-1 y el receptor de SDF-1, CXCR7, en donde la molécula de ácido nucleico es para uso en un método para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno, o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno, como una terapia complementaria, o para uso como un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, en donde la enfermedad o el trastorno es un cáncer que expresa el receptor de SDF-1, CXCR7.

Description

DESCRIPCIÓN
Ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 y su uso en el tratamiento del cáncer
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 y bloquear la interacción entre SDF-1 y el receptor de SDF-1, CXCR7, en donde la molécula de ácido nucleico es para uso en un método 5 para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno, o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno, como una terapia complementaria, o para uso como un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno; a una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 y bloquear la interacción entre SDF-1 y el receptor de SDF-1, CXCR7, para uso en un 10 método para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, o para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno, o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno, como una terapia complementaria, o para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno; a un medicamento que comprende una o varias unidades de dosificación de al menos una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 y de bloquear la interacción entre SDF-1 y el receptor de SDF-1, CXCR7, 15 para uso en un método para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, o para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno, o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno, como una terapia complementaria, o para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno; al uso de una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 y de bloquear la interacción entre SDF-1 y el receptor de SDF-1, CXCR7, para la preparación de un medicamento para el tratamiento 20 y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, o para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que
padece una enfermedad o un trastorno, o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno, como una terapia complementaria; y a una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 y de bloquear la interacción entre SDF-1 y el receptor de SDF-1, CXCR7, para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece o tiene riesgo de desarrollar cáncer.
25 El factor derivado de células del estroma 1 (abrev.: SDF-1; sinónimos, CXCL12; PBSF [factor estimulante del crecimiento de pre-linfocitos B]; TPAR-1 [gen reprimido 1 TPA]; SCYB12; TLSF [factor estimulante de células de linfoma tímico]; hIRH [intercrina humana reducida en hepatomas]) es una quimiocina CXC angiogénica que no contiene el motivo ELR típico de las quimiocinas de tipo IL-8 (Salcedo, Wasserman et al. 1999; Salcedo y Oppenheim 2003) pero que se une y activa el receptor CXCR4 acoplado a proteína G. Como resultado de un corte y empalme alterna- 30 tivo, hay dos formas de SDF-1, SDF-1a (68 aminoácidos, SEQ ID NO: 1) y SDF-1p (SEQ ID NO: 2), que, en compa
ración con SDF-1a, es portadora de cinco aminoácidos adicionales en el extremo C-terminal (Shirozu, Nakano et al. 1995).
La conservación de la secuencia de aminoácidos entre SDF-1 procedentes de diferentes especies es notable: SDF- 1a humano (SEQ ID NO: 1) y SDF-1a murino (SEQ ID NO: 3) son prácticamente idénticos. Solo hay un solo cambio 35 conservador de V a I en la posición 18 (Shirozu, Nakano et al. 1995).
Dado que el receptor de SDF-1, CXCR7, se expresa ampliamente en leucocitos, células dendríticas maduras, células endoteliales, células del cerebro y megacariocitos, las actividades de SDF-1 son pleyotrópicas. Esta quimiocina, más que cualquier otra identificada hasta la fecha, muestra la más amplia gama de funciones biológicas. Los efectos funcionales más significativos de SDF-1 son:
40 • Migración dirigida y fijación de células epiteliales a sitios neovasculares en la porción coroides de la retina;
• SDF-1 es necesario para mantener las células madre y las células progenitoras, por ejemplo, células pro- genitoras hematopoyéticas (normalmente CD34+) en la médula ósea del adulto;
• SDF-1 favorece la proliferación de los pre-linfocitos B y aumenta el crecimiento de progenitores de linfocitos B de la médula ósea e induce una migración específica de los pre-linfocitos B y pro-linfocitos B, mientras
45 que no actúa como un quimioatrayente significativo para los linfocitos B maduros;
• SDF-1 es uno de los factores quimiotácticos de linfocitos T más eficaces; y
• SDF-1 y su receptor CXCR4 son esenciales para el desarrollo embrionario.
Una alteración de los niveles de expresión de SDF-1 o de su receptor CXCR4 o respuestas alteradas hacia esas moléculas se dice que están asociadas con muchas enfermedades humanas, tales como la retinopatía (Brooks, 50 Caballero et al. 2004; Butler, Guthrie et al. 2005; Meleth, Agron et al. 2005); cáncer de mama (Muller, Homey et al. 2001; Cabioglu, Sahin et al. 2005), ovarios (Scotton, Wilson et al. 2002), páncreas (Koshiba, Hosotani et al. 2000), tiroides (Hwang, Chung et al. 2003) y nasofaringe (Wang, Wu et al. 2005); glioma (Zhou, Larsen et al. 2002); neuro- blastoma (Geminder, Sagi-Assif et al. 2001); leucemia linfocítica crónica de linfocitos B (Burger, Tsukada et al. 2000); síndrome de WHIM (WHIM es una abreviatura para verrugas, hipogammaglobulinemia, infecciones, síndrome 55 de Mielokatexis) (Gulino, Moratto et al. 2004; Balabanian, Lagane et al. 2005b; Kawai, Choi et al. 2005); síndromes de deficiencia inmunológica (Arya, Ginsberg et al. 1999; Marechal, Arenzana-Seisdedos et al. 1999; Soriano, Marti- nez et al. 2002); neovascularización patológica (Salvucci, Yao et al. 2002; Yamaguchi, Kusano et al. 2003; Grune-
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wald, Avraham et al. 2006); inflamación (Murdoch 2000; Fedyk, Jones et al. 2001; Wang, Guan et al. 2001); esclerosis múltiple (Krumbholz, Theil et al. 2006); artritis reumatoide / osteoartritis (Buckley, Amft et al. 2000; Kanbe, Taka- gishi et al. 2002; Grassi, Cristino et al. 2004).
Los tumores (incluyendo neoplasias y tumores malignos sólidos y hematológicos) no son solo masas de células cancerosas: una infiltración de los tumores con células inmunes es una característica del cáncer. Muchos cánceres humanos tienen una red compleja de quimiocinas que influye en el grado y el fenotipo de este infiltrado, así como en el crecimiento del tumor, la supervivencia, la migración y la angiogénesis. La mayoría de los tumores sólidos contienen muchas células del estroma no malignas. De hecho, las células del estroma a veces superan en número a las células cancerosas. Las células del estroma predominantes que se encuentran en los cánceres son macrófagos, linfocitos, células endoteliales y fibroblastos.
Las células de diferentes tipos de cáncer tienen diferentes perfiles de expresión del receptor de quimiocinas, pero el receptor de SDF-1, CXCR4 se encuentra más comúnmente en las células tumorales de ratón y humanas: células tumorales procedentes de al menos 23 diferentes tipos de cánceres humanos de origen epitelial, mesenquimatoso y hematopoyético expresan CXCR4 (Balkwill 2004), siendo SDF-1 el único ligando conocido para CXCR4. Además de la médula ósea y el tejido linfoide secundario, en donde se expresa constitutivamente, SDF-1 se encuentra en sitios de tumores primarios en el linfoma (Corcione, Ottonello et al. 2000) y tumores cerebrales tanto de linaje neuronal como astrocítico. Además, está presente en altos niveles en el cáncer de ovario (Scotton, Wilson et al. 2002) y de páncreas (Koshiba, Hosotani et al. 2000), así como en los sitios de metástasis del cáncer de mama (Muller, Homey et al. 2001) y de tiroides (Hwang, Chung et al. 2003), neuroblastoma y neoplasias hematológicas (Geminder, Sagi- Assif et al. 2001).
Además de CXCR4 se ha identificado otro receptor de SDF-1: RDC1/CXCR7 (Balabanian, Lagane et al. 2005a, Bums, Summers et al. 2006). Estudios in vitro e in vivo con líneas celulares de cáncer de próstata sugieren que alteraciones en la expresión de CXCR7/RDC1 están asociadas con actividades adhesivas e invasivas incrementadas, además de una ventaja en la supervivencia. Estudios in vitro e in vivo han mostrado que ambos receptores de SDF-1, a saber, CXCR4 y CXCR7 favorecen el crecimiento tumoral, el potencial metastásico y la resistencia a la apoptosis (inducida por quimioterapia) en una serie de tumores, por ejemplo, cáncer de mama, glioblastomas, cáncer de ovario, neuroblastoma, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal y de próstata (Burns et al., 2006; Li et al., 2008; Scotton et al., 2002; Yang et al., 2008; Zagzag et al., 2008).
La expresión de CXCR4 y CXCR7, por lo tanto, parece ser una característica general de varios tumores.
El documento de solicitud de patente internacional WO 2008/009437 se refiere a moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1.
El documento de solicitud de patente internacional WO 2009/019007 se refiere a moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 que influyen en la migración de las células.
Azab AK et al. (Azab AK et al., Blood, vol. 113, n° 18, 30 Abril 2009, pp. 4341-4351) informan sobre el inhibidor de CXCR4, AMD3100, que interrumpe la interacción de células de mieloma múltiple con el microambiente de la médula ósea y mejora su sensibilidad a una terapia.
Burger M et al. (Burger M et al., Blood, vol. 106, n° 5, 1 Septiembre 2005, pp. 1824-1830) informan sobre inhibidores peptídicos pequeños del receptor de quimiocinas CXCR4 (CD184) que antagonizan la activación, la migración y las respuestas antiapoptóticas de CXCL12 en linfocitos B de leucemia linfocítica crónica.
Rajagopalan L et al. (Rajagopalan L et al., Bioscience Reports, vol. 26, n° 5, 6 Octubre 2006, pp. 325-339) informan sobre la base estructural de la función del receptor de quimiocinas y un modelo para la afinidad de la unión y la selectividad del ligando.
Crump MP et al. (Crump MP et al., EMBO Journal, vol. 16, n° 23, 1 Enero 1997, pp. 6996-7007) informan sobre la estructura de la solución de SDF-1 y la base para su actividad funcional.
Balabanian K et al. (Balabanian K et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 280, n° 42, 21 Octubre 2005, pp. 3576035766) informan que SDF-1 se une a y señaliza a través del receptor huérfano RDC1 en linfocitos T.
El problema subyacente a la presente invención es proporcionar un medio que interaccione específicamente con SDF-1, en donde los medios son adecuados para la prevención y/o el tratamiento del cáncer.
Otro problema subyacente a la presente invención es proporcionar un medio que apoye la terapia del cáncer, en donde tal terapia del cáncer normalmente hace uso de una quimioterapia y/o radiación.
Un problema adicional subyacente de la presente invención es proporcionar un medio que es adecuado para uso en una terapia complementaria en el tratamiento del cáncer.
Todavía otro problema subyacente a la presente invención es proporcionar un medio que es capaz de quimiosensibi- lizar a un paciente que padece cáncer y/o quimiosensibilizar células que forman parte o son parte de un cáncer.
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Estos y otros problemas subyacentes de la presente invención se resuelven mediante la materia objeto de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las realizaciones preferidas se pueden extraer a partir de las reivindicaciones dependientes.
Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un primer aspecto mediante una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 y de bloquear la interacción entre SDF-1 y el receptor de SDF-1, CXCR7, en donde la molécula de ácido nucleico es para uso en un método para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno, o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno, como una terapia complementaria, o para uso como un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, en donde la enfermedad o el trastorno es un cáncer que expresa el receptor de SDF-1, CXCR7.
En una realización del primer aspecto, el cáncer es un cáncer seleccionado a partir del grupo de cánceres hemato- lógicos y tumores sólidos, en donde preferiblemente el cáncer hematológico se selecciona a partir del grupo que comprende la leucemia y mieloma y los tumores sólidos se seleccionan a partir del grupo que comprende glioblas- toma, cáncer colorrectal, cáncer de mama, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.
En una realización del primer aspecto, la terapia complementaria sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto sensibilizado es más sensible a una terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno.
En una realización del primer aspecto, la terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o radiar al sujeto y/o una cirugía y/o una terapia celular.
En una realización del primer aspecto, el agente farmacéuticamente activo adicional se selecciona a partir del grupo que comprende un anticuerpo, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, un terpenoide vegetal, un inhibidor de la topoisomerasa, leucovorina, metotrexato, tamoxifeno, sorafenib, lenalidomida, bortezomib, dexa- metasona, fluorouracilo y prednisona.
En una realización del primer aspecto, el tratamiento o la prevención de la enfermedad o el trastorno está causado por la molécula de ácido nucleico que inhibe la interacción entre SDF-1 y un receptor de SDF-1.
En una realización del primer aspecto, en donde la molécula de ácido nucleico comprende en dirección 5'->3' un primer tramo terminal de nucleótidos, un tramo central de nucleótidos y un segundo tramo terminal de nucleótidos, o un segundo tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y un primer tramo terminal de nucleótidos,
en donde la molécula de ácido nucleico se selecciona a partir del grupo que comprende una molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B, una molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C, una molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A y una molécula de ácido nucleico que se une a sDF-1 de tipo D;
en donde el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B comprende la siguiente secuencia de nucleótidos:
5' GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3' (SEQ ID NO: 52), y
en donde el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' X1X2SVNS 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BVBSX3X4 3', en donde
X1 está o bien ausente o es A, X2 es G, X3 es C y X4 está o bien ausente o es U; o
X1 está ausente, X2 está o bien ausente o es G, X3 está o bien ausente o es C y X4 está ausente;
en donde el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende la siguiente secuencia de nucleótidos: GGUYAGGGCUHRXaAGUCGG (SeQ ID NO: 108),
en donde Xa está o bien ausente o es A, y
en donde el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' RKSBUSNVGR 3' (SEQ ID NO: 138) y el segundo tramo de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' YYNRCASSMY 3' (SEQ ID NO: 139)
o
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en donde el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' XsSSSV 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BSSSXs 3', en donde Xs está o bien ausente o es S,
o
en donde el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CGUGCGCUUGAGAUAGG 3' (SEQ iD NO: 220) y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CUGAUUCUCACG 3' (SEQ ID NO: 221);
o
el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' UGAGAUAGG 3' Y el segundo tramo terminal
de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CUGAUUCUCA 3' (SEQ ID NO: 222);
o
el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GAGAUAGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CUGAUUCUC 3';
en donde el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A, comprende una secuencia de nucleótidos de 5' AAAGYRACAHGUMAAXaUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID NO: 74),
en donde Xa está o bien ausente o es A, y
en donde el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' X1X2NNBV 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BNBNX3X4 3'
en donde X1 está o bien ausente o es R, X2 es S, X3 es S y X4 está ausente o es Y,
o
X1 está ausente, X2 está o bien ausente o es S, X3 está o bien ausente o es S y X4 está ausente; y en donde la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo D comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 142 a SEQ ID NO: 144.
En una realización del primer aspecto, el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B comprende la siguiente secuencia de nucleótidos:
5' GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG 3' (SEQ ID NO: 53).
En una realización del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' X1X2SSBS 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BVSSX3X4 3',
en donde X1 está ausente, X2 está o bien ausente o es G, X3 está o bien ausente o es C, y X4 está ausente, preferiblemente el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GCGUG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' UACGC 3'.
En una realización del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 20 y SEQ iD NO: 22 a SEQ ID NO: 28.
preferiblemente una cualquiera de SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 28.
más preferiblemente una cualquiera de SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 28.
En una realización del primer aspecto, el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5'
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GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 109), 5' GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 110) o 5' GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 111), preferiblemente 5' GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 111).
En una realización del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' RKSBUGSVGR 3' (SEQ ID NO: 140) y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' YCNRCASSMY 3' (SEQ ID NO: 141).
En una realización del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' SGGSR 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleóti- dos de 5' YSCCS 3'.
En una realización del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID No: 95 a SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 112 a SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 224,
preferiblemente una cualquiera de SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 224.
En una realización del primer aspecto, el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de
5'AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID NO: 75), o
5' AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID NO: 76), o
5' AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID NO: 77), preferiblemente el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID NO: 77).
En una realización del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' X2BBBS 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' SBBVX3 3',
en donde X2 está o bien ausente o es S y X3 está o bien ausente o es S;
preferiblemente, el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CUGUG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CGCAG 3';
o el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GCGUG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CGCGC 3'.
En una realización del primer aspecto, en donde la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 60 a SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78 a SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 a SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89 a SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 145,
preferiblemente una cualquiera de SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 146,
más preferiblemente una cualquiera de SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 146.
En una realización del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende una modificación, en donde la modificación es preferiblemente un resto de peso molecular elevado y/o en donde la modificación permite preferiblemente modificar las características de la molécula de ácido nucleico en términos de tiempo de residencia en el cuerpo animal o humano, preferiblemente el cuerpo humano.
En una realización del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico L.
Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un segundo aspecto mediante una composición farmacéutica que comprende como primer agente farmacéuticamente activo, la molécula de ácido nucleico según cualquier realización del primer aspecto y, opcionalmente, un componente adicional, en donde el componente adicional se selecciona a partir del grupo que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable, un vehículo farmacéuticamente aceptable y un agente farmacéuticamente activo adicional y en donde la composición farmacéutica es para uso en un método para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno,
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o para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno, o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno, como terapia complementaria, o para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, en donde la enfermedad o el trastorno es un cáncer que expresa el receptor de SDF-1, CXCR7.
En una realización del segundo aspecto, la terapia complementaria sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto sensibilizado es más sensible a una terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno.
En una realización del segundo aspecto, la terapia para el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades o el trastorno comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o radiar al sujeto y/o una cirugía y/o terapia celular.
En una realización del segundo aspecto, el agente farmacéuticamente activo adicional es un agente farmacéuticamente activo seleccionado a partir del grupo que comprende un anticuerpo, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, preferiblemente vincristina, un terpenoide vegetal, un inhibidor de la topoisomerasa, leucovori- na, metotrexato, tamoxifeno, sorafenib, lenalidomida, bortezomib, dexametasona, fluorouracilo y prednisona.
En una realización del segundo aspecto, el cáncer es un cáncer seleccionado a partir del grupo de cáncer hematoló- gico y tumores sólidos, en donde preferiblemente el cáncer hematológico se selecciona a partir del grupo de leucemia y mieloma y los tumores sólidos se seleccionan a partir del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorrec- tal, cáncer de mama, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.
Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un tercer aspecto mediante un medicamento que comprende una o varias unidades de dosificación de al menos un primer agente farmacéuticamente activo, en donde el primer agente farmacéuticamente activo es una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 como se define en cualquier realización del primer aspecto, en donde el medicamento es para uso en un método para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, o para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno, o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno, como una terapia complementaria, o para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, en donde la enfermedad o el trastorno es un cáncer que expresa el receptor de SDF-1, CXCR7.
En una realización del tercer aspecto, la terapia complementaria sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto sensibilizado es más sensible a una terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno.
En una realización del tercer aspecto, la terapia para el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades o el trastorno comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o radiar al sujeto y/o una cirugía y/o terapia celular.
En una realización del tercer aspecto, el medicamento comprende un agente farmacéuticamente activo adicional, preferentemente una o varias unidades de dosificación de un agente farmacéuticamente activo adicional, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional se selecciona a partir del grupo que comprende un anticuerpo, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, preferiblemente vincristina, un terpenoide vegetal, un inhibidor de la topoisomerasa, leucovorina, metotrexato, tamoxifeno, sorafenib, lenalidomida, bortezomib, dexametasona, fluorouracilo y prednisona.
En una realización del tercer aspecto, el cáncer es un cáncer seleccionado a partir del grupo de cáncer hematológico y tumores sólidos, en donde preferiblemente el cáncer hematológico se selecciona a partir del grupo que comprende leucemia y mieloma, y los tumores sólidos se seleccionan a partir del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de mama, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.
Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un cuarto aspecto mediante el uso de una molécula de ácido nucleico como se define en cualquier realización del primer aspecto, para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno o para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno, o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno, como terapia complementaria, en donde la enfermedad o el trastorno es un cáncer que expresa el receptor de SDF-1, CXCR7.
En una realización del cuarto aspecto, la terapia complementaria sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto sensibilizado es más sensible a una terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno.
En una realización del cuarto aspecto, la terapia para el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades o el trastorno comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o radiar al sujeto y/o una cirugía y/o terapia celular.
En una realización del cuarto aspecto, el medicamento se usa en combinación con un agente farmacéuticamente activo adicional, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional es un agente farmacéuticamente activo
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seleccionado a partir del grupo que comprende un anticuerpo, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, preferiblemente vincristina, un terpenoide vegetal, un inhibidor de la topoisomerasa, leucovorina, metotrexa- to, tamoxifeno, sorafenib, lenalidomida, bortezomib, dexametasona, fluorouracilo y prednisona.
En una realización del cuarto aspecto, el cáncer es un cáncer seleccionado a partir del grupo de cáncer hematológi- co y tumores sólidos, en donde preferiblemente el cáncer hematológico se selecciona a partir del grupo que comprende leucemia y mieloma, y los tumores sólidos se seleccionan a partir del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de mama, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.
Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un quinto aspecto mediante una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a sDF-1 como se define en cualquier realización del primer aspecto, para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece o tiene riesgo de desarrollar un cáncer que expresa el receptor de sDF-1, CXCR7, en donde el método comprende
• una etapa a) de administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de la molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 como se define en cualquier realización del primer aspecto; y
• una etapa b) de radiar al sujeto y/o una cirugía y/o terapia celular y/o administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un agente farmacéuticamente activo adicional al sujeto, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional es un agente farmacéuticamente activo seleccionado a partir del grupo que comprende un anticuerpo, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, preferiblemente vincristina, un terpenoide vegetal, un inhibidor de la topoisomerasa, leucovorina, metotrexato, tamoxifeno, sorafenib, lenalidomida, bortezomib, dexametasona, fluorouracilo y prednisona.
En una realización del quinto aspecto, la cantidad farmacéuticamente eficaz de una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 como se define en cualquier realización del primer aspecto, se administra como una terapia complementaria o parte de una terapia complementaria.
En una realización del quinto aspecto, la terapia complementaria sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto sensibilizado es más sensible a una terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno.
En una realización del quinto aspecto, la terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o radiar al sujeto y/o una cirugía y/o terapia celular como se realiza en la etapa b).
En una realización del quinto aspecto, el cáncer es un cáncer seleccionado a partir del grupo de cáncer hematológico y tumores sólidos, en donde preferiblemente el cáncer hematológico se selecciona a partir del grupo que comprende leucemia y mieloma, y los tumores sólidos se seleccionan a partir del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de mama, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.
En una realización del primer aspecto, la leucemia se selecciona a partir del grupo que comprende leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.
En una realización del primer aspecto, el mieloma es mieloma múltiple.
En una realización del primer aspecto, el anticuerpo se selecciona a partir del grupo que comprende Rituximab, Ofatumumab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab y Alemtuzumab.
En una realización del primer aspecto, el agente alquilante se selecciona a partir del grupo que comprende cispla- tino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, doxorrubicina, doxorrubicina liposómica, bendamustina, temozolomida y melfalán.
En una realización del primer aspecto, el antimetabolito se selecciona a partir del grupo que comprende purinazati- oprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina y cladribina.
En una realización del primer aspecto, el terpenoide vegetal se selecciona a partir del grupo que comprende un taxano, más preferiblemente seleccionado a partir del grupo que comprende docetaxel, paclitaxel, podofilotoxina y epotilona.
En una realización del primer aspecto, el inhibidor de la topoisomerasa se selecciona a partir del grupo que comprende camptotecina, irinotecán y mitoxantrona.
En una realización del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico es capaz de bloquear la interacción entre SDF- 1 y un receptor de SDF-1, en donde el receptor de SDF-1 se selecciona a partir del grupo que comprende CXCR4 y CXCR7.
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En una realización del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' X1X2CRWG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' KRYSX3X4 3',
en donde X1 o bien está ausente o es A, X2 es G, X3 es C y X4 o bien está ausente o es U.
En una realización del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' X1X2CGUG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' UACGX3X4 3',
en donde X1 o bien está ausente o es A, X2 es G, X3 es C y X4 o bien está ausente o es U.
preferiblemente, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' AGCGUG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' UACGCU 3'.
En una realización del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GCCGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CCGGC 3'.
En una realización del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' RSHRYR 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' YRYDSY 3',
preferiblemente, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GCUGUG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CGCAGC 3'.
En una realización del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' X2BBBS 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' SBBVX3 3',
en donde X2 está o bien ausente o es S y X3 o bien está ausente o es S;
En una realización del primer aspecto, la modificación se selecciona a partir del grupo que comprende un resto HES, un resto PEG, modificaciones biodegradables y combinaciones de los mismos.
En una realización del primer aspecto, la modificación es un resto PEG que consiste en un PEG lineal o ramificado, en donde preferiblemente el peso molecular del PEG lineal o ramificado es desde aproximadamente 20.000 a
120.000 Da, más preferiblemente desde aproximadamente 30.000 a 80.000 Da y lo más preferiblemente de aproximadamente 40.000 Da.
En una realización del primer aspecto, la modificación es un resto HES, en donde preferiblemente el peso molecular del resto HES es desde aproximadamente 10.000 a 200.000 Da, más preferiblemente desde aproximadamente
30.000 a 170.000 Da y lo más preferiblemente de aproximadamente 150.000 Da.
En una realización del primer aspecto, la modificación se fija a la molécula de ácido nucleico mediante un enlazador, en donde el enlazador es preferiblemente un enlazador bioestable o biodegradable.
En una realización del primer aspecto, la modificación se fija a la molécula de ácido nucleico en el nucleótido 5'- terminal de la molécula de ácido nucleico y/o el nucleótido 3'-terminal de la molécula de ácido nucleico y/o a un nucleótido de la molécula de ácido nucleico entre el nucleótido 5'-terminal de la molécula de ácido nucleico y el nucleó- tido 3'-terminal de la molécula de ácido nucleico.
En una realización del primer aspecto, los nucleótidos de la molécula de ácido nucleico o los nucleótidos que forman la molécula de ácido nucleico son nucleótidos L.
En una realización del segundo aspecto, el anticuerpo se selecciona a partir del grupo que comprende Rituximab, Ofatumumab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab y Alemtuzumab.
En una realización del segundo aspecto, el agente alquilante se selecciona a partir del grupo que comprende cispla- tino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, doxorrubicina, doxorrubicina liposómica, bendamustina, temozolomida y melfalán.
En una realización del segundo aspecto, el antimetabolito se selecciona a partir del grupo que comprende purinaza- tioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina y cladribina.
En una octava realización del segundo aspecto, el terpenoide vegetal se selecciona a partir del grupo que comprende un taxano, más preferiblemente se selecciona a partir del grupo que comprende docetaxel, paclitaxel, podofiloto- xina y epotilona.
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En una realización del segundo aspecto, el inhibidor de la topoisomerasa se selecciona a partir del grupo que comprende camptotecina, irinotecán y mitoxantrona.
En una realización del segundo aspecto, la leucemia se selecciona a partir del grupo que comprende leucemia linfoi- de crónica y leucemia mieloide aguda.
En una realización del segundo aspecto, el mieloma es mieloma múltiple.
En una realización del tercer aspecto, el agente farmacéuticamente activo adicional se selecciona a partir del grupo que comprende un anticuerpo, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, preferiblemente vincris- tina, un terpenoide vegetal, un inhibidor de la topoisomerasa, leucovorina, metotrexato, tamoxifeno, sorafenib, lenali- domida, bortezomib, dexametasona, fluorouracilo y prednisona.
En una realización del tercer aspecto, el anticuerpo se selecciona a partir del grupo que comprende Rituximab, Ofa- tumumab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab y Alemtuzumab.
En una realización del tercer aspecto, el agente alquilante se selecciona a partir del grupo que comprende cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, doxorrubicina, doxorrubicina liposómica, bendamustina, temozolomida y melfalán.
En una realización del tercer aspecto, el antimetabolito se selecciona a partir del grupo que comprende purinazati- oprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina y cladribina.
En una realización del tercer aspecto, el terpenoide vegetal se selecciona a partir del grupo de un taxano, más preferiblemente se selecciona a partir del grupo que comprende docetaxel, paclitaxel, podofilotoxina y epotilona.
En una realización del tercer aspecto, el inhibidor de la topoisomerasa se selecciona a partir del grupo que comprende camptotecina, irinotecán y mitoxantrona.
En una realización del tercer aspecto, la leucemia se selecciona a partir del grupo que comprende leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.
En una realización del tercer aspecto, el mieloma es mieloma múltiple.
En una realización del cuarto aspecto, el anticuerpo se selecciona a partir del grupo que comprende Rituximab, Ofatumumab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab y Alemtuzumab.
En una realización del cuarto aspecto, el agente alquilante se selecciona a partir del grupo que comprende cispla- tino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, doxorrubicina, doxorrubicina liposómica, bendamustina, temozolomida y melfalán.
En una realización del cuarto aspecto, el antimetabolito se selecciona a partir del grupo que comprende purinazati- oprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina y cladribina.
En una realización del cuarto aspecto, el terpenoide vegetal se selecciona a partir del grupo que comprende un taxano, más preferiblemente se selecciona a partir del grupo de docetaxel, paclitaxel, podofilotoxina y epotilona.
En una realización del cuarto aspecto, el inhibidor de la topoisomerasa se selecciona a partir del grupo que comprende camptotecina, irinotecán y mitoxantrona.
En una realización del cuarto aspecto, la leucemia se selecciona a partir del grupo que comprende leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.
En una realización del cuarto aspecto, el mieloma es mieloma múltiple.
En una realización del quinto aspecto, el anticuerpo se selecciona a partir del grupo que comprende Rituximab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab y Alemtuzumab.
En una realización del quinto aspecto, el agente alquilante se selecciona a partir del grupo que comprende cispla- tino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, doxorrubicina, doxorrubicina liposómica, bendamustina, temozolomida y melfalán.
En una realización del quinto aspecto, el antimetabolito se selecciona a partir del grupo que comprende purinazati- oprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina y cladribina.
En una realización del quinto aspecto, el terpenoide vegetal se selecciona a partir del grupo que comprende un taxano, más preferiblemente se selecciona a partir del grupo de docetaxel, paclitaxel, podofilotoxina y epotilona.
En una realización del quinto aspecto, el inhibidor de la topoisomerasa se selecciona a partir del grupo que comprende camptotecina, irinotecán y mitoxantrona.
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En una realización del quinto aspecto, la leucemia se selecciona a partir del grupo que comprende leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.
En una realización del quinto aspecto, el mieloma es mieloma múltiple.
Si bien no se desea estar ligado a ninguna teoría, los presentes inventores han encontrado que las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención inhiben la unión de SDF-1 a sus receptores de SDF-1 receptores y, por tanto, ya sea directa o indirectamente, se utilizan para el tratamiento del cáncer. Además, los presentes inventores han encontrado que las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención son adecuadas para bloquear la interacción de SDF-1 con los receptores de SDF-1, CXCR4 y CXCR7, respectivamente. Por lo tanto, la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de acuerdo con la presente invención también se puede entender como un antagonista de CXCR4 y CXCR7, respectivamente.
En cuanto a las diversas enfermedades, afecciones y trastornos que se pueden tratar o prevenir mediante el uso de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención o composiciones, preferentemente composiciones farmacéuticas que comprenden las mismas, se debe tener en cuenta que este tipo de enfermedades, afecciones y trastornos son los que se describen en este documento, incluyendo y en particular los descritos y establecidos en la parte introductoria de la presente solicitud. Por ello, los pasajes respectivos forman una parte integrante de la presente descripción que describe la idoneidad de las moléculas de ácido nucleico para la prevención y el tratamiento, respectivamente, de dichas enfermedades, afecciones y trastornos.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término SDF-1 se refiere a cualquier SDF-1, incluyendo, pero no limitado a, SDF-1 de mamífero. Preferiblemente, el SDF-1 de mamífero se selecciona a partir del grupo que comprende SDF-1 de ratón, rata, conejo, hámster, mono y ser humano. Más preferiblemente, el SDF-1 es sDF-1 humano también conocido como SDF-1a (SEQ ID NO: 1) y/o SDF-1p humano (SEQ ID NO: 2), lo más preferiblemente, el SDF-1 humano también se denomina también SDF-1a (SEQ ID NO: 1).
SDF-1 actúa a través de dos receptores diferentes, los receptores CXCR4 y RDC1/CXCR7 (Balabanian, Lagane et al. 2005a, Burns, Summers et al. 2006) (véase la parte introductoria de la presente solicitud). Una expresión elevada de CXCR4 y CXCR7 se mostró para varios tipos de cáncer, como se describe en el presente documento.
Debido a que SDF-1 actúa a través de dos receptores diferentes, un tratamiento de una enfermedad o un trastorno relacionado con SDF-1 mediante un compuesto específico para uno de los dos receptores de SDF-1, CXCR4 y CXCR7:
a) debe ser menos eficaz debido a los dos receptores de SDF-1 diferentes, expresados en células, preferiblemente células cancerosas;
b) se limita a una población distinta de células, preferiblemente a una población distinta de células cancerosas, debido a los receptores de SDF-1 individuales expresados sobre las células.
Cáncer es un término para neoplasias malignas, un grupo grande y heterogéneo de enfermedades en las que las células presentan un crecimiento incontrolado, invasión y frecuentemente metástasis, en donde las células cancerosas se dispersan a otros lugares en el cuerpo, a los ganglios linfáticos regionales o a sitios del cuerpo distantes, tales como cerebro, hueso, hígado u otros órganos. Estas tres propiedades malignas del cáncer diferencian los tumores malignos de tumores benignos, por lo que, tal como se utiliza en esta memoria, el término cáncer debe incluir también los tumores malignos que a su vez también se denominan en este documento tumores. Los tumores malignos se dividen en dos categorías en función de su origen: tumores hematológicos y sólidos. Los tumores hematoló- gicos son tipos de cáncer que afectan a la sangre, la médula ósea y los ganglios linfáticos. Los tumores sólidos están formados por un crecimiento anormal de las células del tejido corporal distintas de la sangre, la médula ósea y las células linfáticas.
Las formas preferidas de cáncer son las siguientes:
Carcinoma adrenocortical
Cánceres relacionados con el SIDA, como sarcoma de Kaposi y linfoma
Cáncer anal
Cáncer de apéndice
T umor teratoideo/rabdoideo atípico
Carcinoma de células basales
Cáncer de conducto biliar, extrahepático
Cáncer de vejiga
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Cáncer de huesos Osteosarcoma Histiocitoma fibroso maligno Glioma del tronco cerebral
Tumor cerebral tal como astrocitomas, tumores cerebrales y de la médula espinal, glioma del tronco cerebral, tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central, infantil, tumores embrionarios del sistema nervioso central, craneofaringioma, ependimoblastoma, ependimoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineoblastoma
Cáncer de mama
Tumores bronquiales
Tumor carcinoide
Carcinoma de origen primario desconocido
Cáncer del sistema nervioso central tal como tumor teratoideo/rabdoideo atípico y linfoma Cáncer cervical Cánceres infantiles Cordoma
Trastornos mieloproliferativos crónicos
Cáncer de colon
Cáncer colorrectal
Craneofaringioma
Linfoma cutáneo de linfocitos T
Tumores embrionales
Cáncer de endometrio
Ependimoblastoma
Ependimoma,
Cáncer esofágico
Estesioneuroblastoma
Familia de tumores de sarcoma de Ewing
Tumor de células germinales extracraneal
Tumor de células germinales extragonadal
Cáncer de conducto biliar extrahepático
Cáncer de ojos tal como melanoma intraocular y retinoblastoma
Histiocitoma fibroso de hueso
Osteosarcoma
Cáncer de vesícula biliar
Cáncer gástrico (estómago)
Tumor carcinoide gastrointestinal Tumores del estroma gastrointestinal (GIST)
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Tumor de las células germinales (extracraneal, extragonadal o de ovario)
Tumor trofoblástico gestacional Glioma
Leucemia de células pilosas Cáncer de cabeza y cuello Cáncer de corazón Cáncer hepatocelular (hígado)
Histiocitosis Cáncer hipofaríngeo Melanoma intraocular
Tumores de las células de los islotes (páncreas endocrino)
Sarcoma de Kaposi Cáncer de riñón
Histiocitosis de las células de Langerhans Cáncer de laringe
Leucemia tal como leucemia linfoblástica aguda (abrev. ALL), leucemia mieloide aguda (abrev. AML), leucemia linfo- cítica crónica (abrev. CLL), leucemia mielógena crónica (abrev.
CML) y leucemia de células pilosas
Cáncer de labio y cavidad oral
Cáncer de hígado (primario)
Carcinoma lobular in situ (LCIS)
Cáncer de pulmón
Linfoma tal como linfoma relacionado con el SIDA, de Burkitt, micosis fungoide y síndrome de Sézary, de Hodgkin, de no Hodgkin y leucemia del sistema nervioso central (abrev. SNC) primaria
Macroglobulinemia
Histiocitoma fibroso maligno de hueso y osteosarcoma
Meduloblastoma
Meduloepitelioma
Melanoma
Carcinoma de células de Merkel Mesotelioma
Cáncer escamoso metastásico de cuello con tumor primario oculto Carcinoma de tracto de línea media que implica el gen NUT Cáncer de boca
Síndromes de neoplasia endocrina múltiple Mieloma múltiple Micosis fungoide
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Síndromes mielodisplásicos
Neoplasmas mielodisplásicos/mieloproliferativos
Trastornos mieloproliferativos
Cáncer de la cavidad nasal y seno paranasal
Cáncer nasofaríngeo
Neuroblastoma
Cáncer de pulmón de células no pequeñas Cáncer oral
Cáncer de la cavidad oral Cáncer orofaríngeo
Osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno del hueso
Cáncer de ovario
Cáncer pancreático
Papilomatosis
Paraganglioma
Cáncer de la cavidad nasal y seno paranasal
Cáncer paratiroideo
Cáncer de pene
Cáncer faríngeo
Feocromocitoma
Tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia Pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales Tumor de la pituitaria
Neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple Blastoma pleuropulmonar, infantil
Linfoma del sistema nervioso central (en forma abreviada SNC) primario Cáncer de próstata Cáncer rectal
Cáncer de células renales (riñón)
Cáncer de células de transición de pelvis renal y uréter
Retinoblastoma
Rabdomiosarcoma
Cáncer de las glándulas salivares
Sarcoma tal como la familia de tumores de sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino
Cáncer de piel tal como melanoma, carcinoma de células de Merkel y no melanoma Cáncer de pulmón de células pequeñas
Cáncer de intestino delgado Sarcoma de tejidos blandos Carcinoma de células escamosas
Cáncer de cuello escamoso, cáncer de estómago (gástrico)
5 Tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales Linfoma de linfocitos T Cáncer testicular Cáncer de garganta Timoma y carcinoma tímico 10 Cáncer de tiroides
Cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter Tumor trofoblástico, gestacional
Cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter Cáncer de uretra
15 Cáncer uterino, endometrial Sarcoma uterino Cáncer vaginal Cáncer de vulva
Macroglobulinemia de Waldenstrom 20 Tumor de Wilms
Se ha mostrado que el eje SDF-1 - CXCR4 desempeña un papel en la movilización de las células madre, incluyendo células madre de cáncer, vasculogénesis, crecimiento tumoral y metástasis. El receptor de SDF-1, CXCR4, se expresa en una variedad de cánceres y tumores malignos hematológicos in vivo tal como CXCR7 (Maksym, Tarnowski et al., 2009; Wang, Shiosawa et al., 2008; Miao, Lucker et al., 2007). La señal de crecimiento e invasión para las 25 células tumorales es SDF-1, en particular si las células expresan los receptores de SDF-1 (Batchelor et al., 2007; Zhu et al., 2009; Xu et al., 2009; Kozin et al., 2010).
CXCR4, así como SDF-1 están inducidos por hipoxia (Ceradini et al. 2004). Junto con VEGF, representan un eje sinérgico potente que inicia y mantiene las vías angiogénicas/vasculogénicas (Kryczek et al. 2005). La función en la vasculogénesis se apoya en la evidencia de que SDF-1 atrae las células progenitoras endoteliales que expresan 30 CXCR4 desde la circulación (Sengupta et al. 2005). El reclutamiento mediado por SDF-1 - CXCR4, de células procedentes de la médula ósea que apoyan la vascularización, también puede ser la razón de la recurrencia de los glioblastomas después de una terapia de radiación (Kioi et al., 2010). Como han demostrado Kioi et al., en un modelo de xenoinjerto de ratón de glioblastoma intracraneal multiforme (abrev. GBM), el tratamiento de pacientes con GBM con una dosis elevada de radiación es menos eficaz debido a que la radiación inducía el reclutamiento de 35 células procedentes de la médula ósea (abrev. BMDCs). El bloqueo de la interacción de SDF-1 y su receptor CXCR4 a través del antagonista de CXCR4, AMD3100, impedía la afluencia de BMDCs al tumor irradiado (Kioi et al., 2010). En los datos presentados en 2010 por Tseng et al. con un modelo de glioblastoma de rata inducido con ENU, un modelo que imita estrechamente el GBM humano, en donde además de CXCR4, también CXCR7 estaba implicado en el reclutamiento de BMDCs inducido por radiación. En este estudio el antagonista de CXCR7, CCX2206, impedía 40 la afluencia de BMDCs en el tumor irradiado (Tseng et al., 2010). De acuerdo con ello y debido a que las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención son capaces de bloquear la interacción de SDF-1 y CXCR4 y también de SDF-1 y CXCR7, el efecto de una supervivencia después de la radiación se espera que sea mejor que el mostrado para el uso de solo uno de los antagonistas de CXCR4 y CXCR7.
Además, SDF-1 induce la secreción de VEGF, mientras que VEGF aumenta la expresión de CXCR4 (Salcedo et al. 45 1999) y las señales de la angiogénesis. Por lo tanto la inhibición del eje SDF-1 - CXCR4 puede reducir o prevenir el
crecimiento tumoral mediante la inhibición de la angiogénesis/vasculogénesis, bien con una monoterapia o en particular en combinación con otros agentes antivasculares tales como inhibidores de VEGF.
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Además se sugiere que la 'migración dirigida' de células cancerosas que expresan CXCR4 hacia órganos que expresan SDF-1, dirige las células metastásicas preferentemente hacia el hígado, médula ósea, pulmón y ganglios linfáticos (Alsayed et al. 2007; Burger & Peled 2009) y por lo tanto el eje SDF-1 - CXCR4 tiene un papel en la metástasis.
Por lo tanto, la inhibición del eje SDF-1 - CXCR4 y el eje SDF-1 - CXCR7 con solo un compuesto tal como la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de acuerdo con la presente invención, debe ser eficaz en el tratamiento del cáncer y/o tumores, en particular, una amplia gama de tumores hematológicos y sólidos, ya sea como monotera- pia o en combinación con otros tratamientos tales como, pero no limitados a, terapia con fármacos, terapia celular, radiación y cirugía. Por otra parte, en comparación con un compuesto que se une e inhibe uno de los dos receptores de SDF-1, CXCR4 y CXCR7, la inhibición del eje SDF-1 - CXCR4 y el eje SDF-1 - CXCR7 con solo un compuesto tal como la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de acuerdo con la presente invención, debería ser más eficaz en el tratamiento del cáncer y/o tumores, en particular una amplia gama de tumores hematológicos y sólidos, tanto como monoterapia o en combinación con otros tratamientos, tales como pero no limitados a terapia con fármacos, terapia celular, radiación y cirugía.
Dentro de la presente invención se encuentra que la terapia con fármacos comprende el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno a través de un fármaco, preferiblemente un agente farmacéuticamente activo, más preferiblemente un agente farmacéuticamente activo tal como se define en el presente documento.
Tal como se utiliza preferiblemente en la presente memoria, en la terapia de células también denominada terapia celular, un tejido procesado procedente de los órganos, los embriones o los fetos de animales tales como ovejas o vacas, se inyecta en un sujeto que padece o tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno, en donde la enfermedad o el trastorno es preferiblemente cáncer y la terapia celular es una forma de tratamiento del cáncer.
En teoría, los cánceres no hematológicos se pueden curar si se eliminan totalmente mediante cirugía. Cuando el cáncer se ha diseminado por otras partes del cuerpo antes de la cirugía, una extirpación quirúrgica completa es generalmente imposible. Ejemplos de procedimientos quirúrgicos o de cirugía contra el cáncer incluyen la mastec- tomía para el cáncer de mama, la prostatectomía para el cáncer de próstata y la cirugía de cáncer pulmonar para el cáncer de pulmón de células no pequeñas. El objetivo de la cirugía puede ser o bien la eliminación solo del tumor, o de todo el órgano. La cirugía se combina a menudo con otros tratamientos contra el cáncer o terapias contra el cáncer, como la quimioterapia y la radiación. La cirugía del cáncer se puede utilizar para lograr uno o varios objetivos. Tales objetivos pueden incluir, pero no se limitan a, prevención, diagnóstico, estadificación, tratamiento primario, reducción de volumen y alivio de los síntomas o efectos secundarios del cáncer.
La radioterapia (también denominada terapia de rayos X o radiación) es el uso de una radiación ionizante para destruir las células cancerosas. La radioterapia se utiliza en la técnica médica para el tratamiento de casi cualquier tipo de tumor sólido. La radiación también se utiliza para tratar la leucemia y el linfoma. La radioterapia daña o destruye las células en la zona que se está tratando, al dañar su material genético, haciendo que sea imposible que estas células continúen creciendo y dividiéndose. Los efectos de la radioterapia están localizados y confinados a la región que está siendo tratada. La dosis de radiación en cada sitio depende de una serie de factores, que incluyen la radiosensibilidad de cada tipo de cáncer y de si hay tejidos y órganos cercanos que puedan ser dañados por la radiación. El objetivo de la radioterapia es dañar tantas células cancerosas como sea posible, mientras que se limita el daño a los tejidos sanos cercanos.
Adicionalmente, se prefiere una molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de acuerdo con la presente invención, si el efecto fisiológico del eje SDF-1 - CXCR4 y/o el eje SDF-1 - CXCR7 está relacionado con altos niveles en plasma de SDF-1. Por ejemplo, determinados agentes terapéuticos tales como paclitaxel y bevacizumab producen una elevación de los niveles en plasma de SDF-1 que puede tener un efecto negativo sobre la terapia tumoral mediante una liberación de células progenitoras endoteliales obtenidas a partir de la médula ósea o mediante una estimulación del crecimiento, invasividad o metástasis (Shaked, Henke et al., 2008; Xu, Duda et al., 2009). En este caso, la aplicación conjunta de un ácido nucleico que se une a SDF-1 mejorará los efectos de los niveles plasmáticos elevados de SDF-1.
Además, la inhibición del eje SDF-1 - CXCR4 y/o el eje SDF-1 - CXCR7 con una molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de acuerdo con la presente invención, mejorará los efectos antitumorales de otros agentes terapéuticos mediante una interrupción de las interacciones estromales adhesivas con las células de la leucemia y otras células cancerosas que confieren supervivencia y resistencia a los fármacos para estas terapias (Jin et al. 2008; Nervi et al. 2009). Un uso de este tipo de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 se conoce como un procedimiento conocido como quimiosensibilización.
La sensibilización de las células tumorales frente a una quimioterapia o radioterapia se conoce como 'quimiosensibi- lización' o 'radiosensibilización', respectivamente. Tal 'quimiosensibilización' o 'radiosensibilización', preferentemente mediante moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, sensibiliza al sujeto que padece una enfermedad o un trastorno, por lo que el sujeto sensibilizado es más sensible a una terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno, en donde la enfermedad o el trastorno es preferentemente cáncer. Un tratamiento de este tipo utilizado junto con un tratamiento primario, de preferencia un tratamiento del cáncer, es una
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terapia complementaria de acuerdo con la presente invención y también se denomina terapia coadyuvante. Los fines de una terapia complementaria de este tipo son ayudar a un tratamiento primario, preferiblemente un tratamiento de cáncer primario. Por lo tanto, la inhibición del eje SDF-1 - CXCR4 y/o el eje SDF-1 - CXCR7 será particularmente eficaz en el tratamiento de una amplia gama de tumores hematológicos y sólidos, ya sea como monoterapia o en combinación con otros tratamientos tales como, pero no limitados a, terapia con fármacos, terapia celular, radiación y cirugía.
Con estos medios y en vista de la implicación señalada de SDF-1 y los receptores de SDF-1, tales como CXCR4 y CXCR7, la unión de SDF-1 y la interacción entre SDF-1 y las moléculas de ácido nucleico que inhiben el receptor de SDF-1 de acuerdo con la presente invención, pueden ayudar a atenuar tales enfermedades, por lo que la inhibición de SDF-1 con las moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de acuerdo con la presente invención conduce a una quimiosensibilización de las células malignas que se van a tratar con quimioterapia, a una reducción o inhibición del crecimiento y la invasividad, una inhibición de la angiogénesis/vasculogénesis, una inhibición de la metástasis y/o una inhibición de los niveles plasmáticos elevados de SDF-1, producidos por la respuesta del hospedador frente a la quimioterapia.
Además, la presente invención se basa en el hallazgo sorprendente de que es posible generar moléculas de ácido nucleico que se unen específicamente y con alta afinidad a SDF-1, inhibiendo de este modo y antagonizando los efectos de SDF-1, en particular los efectos de SDF-1 sobre sus receptores, tales como CXCR4 y CXCR7.
Un antagonista de SDF-1 es una molécula que se une a SDF-1 - tal como moléculas de ácido nucleico de que se unen a SDF-1 de acuerdo con la presente invención - e inhibe la función de SDF-1, preferiblemente en un modelo de ensayo in vitro o in vivo como se describe en los Ejemplos.
Está dentro de la presente invención que el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención sea una molécula de ácido nucleico. Por tanto, los términos ácido nucleico y molécula de ácido nucleico se usan en esta memoria de manera sinónima, si no se indica lo contrario. Por otra parte, tales ácidos nucleicos también se denominan en este documento preferentemente las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, los ácidos nucleicos de la invención o las moléculas de ácido nucleico de la invención.
Las características del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención como se describen en esta memoria, se pueden materializar en cualquier aspecto de la presente invención en donde se emplea el ácido nucleico, ya sea solo o en cualquier combinación.
Como se indica con más detalle en este documento, los presentes inventores han identificado una serie de diferentes moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1, en donde las moléculas de ácido nucleico se pueden caracterizar en términos de tramos de nucleótidos que también se denominan en este documento Cajas (véase el Ejemplo 1). Como se muestra experimentalmente en los ejemplos 5 a 11, los inventores pudieron demostrar sorprendentemente en varios sistemas que las moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 son adecuadas para el tratamiento del cáncer y son capaces realmente de tratar el cáncer.
Los diferentes tipos de moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 comprenden tres tramos diferentes de nucleótidos: el primer tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y el segundo tramo terminal de nucleótidos. En general, las moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de la presente invención comprenden en su extremo 5' y en el extremo 3' los tramos terminales de nucleótidos: el primer tramo terminal de nucleótidos y el segundo tramo terminal de nucleótidos (también denominados tramo 5'-terminal de nucleótidos y tramo 3'-terminal de nucleótidos). El primer tramo terminal de nucleótidos y el segundo tramo terminal de nucleótidos se pueden, en principio debido a su complementariedad de bases, hibridar entre sí, por lo que tras la hibridación se forma una estructura de doble cadena. Sin embargo, una hibridación de este tipo no se realiza necesariamente en la molécula en condiciones fisiológicas y/o no fisiológicas. Los tres tramos de nucleótidos de moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 - el primer tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y el segundo tramo terminal de nucleótidos - están dispuestos entre sí en dirección 5' ^ 3': el primer tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y el segundo tramo terminal de nucleótidos. Sin embargo, alternativamente, el segundo tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y el primer tramo terminal de nucleótidos están dispuestos entre sí en dirección 5' ^ 3'.
Las diferencias en las secuencias de las cajas o tramos definidos entre las diferentes moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 influyen en la afinidad de la unión a SDF-1. Basándose en un análisis de la unión de las diferentes moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de la presente invención, el tramo central y los nucleótidos que lo forman son individualmente y más preferiblemente en su totalidad esenciales para la unión a SDF-1 humano.
El término 'tramo' y la expresión 'tramo de nucleótidos' se utilizan en el presente documento de una manera sinónima, si no se indica lo contrario.
En una realización preferida, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es una molécula sencilla de ácido nucleico. En una realización adicional, la molécula sencilla de ácido nucleico está presente como una plurali
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dad de moléculas sencillas de ácido nucleico o como una pluralidad de especies de moléculas sencillas de ácido nucleico.
Los expertos en la técnica reconocerán que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención consiste preferiblemente en nucleótidos que están ligados covalentemente entre sí, preferiblemente a través de uniones o enlaces fosfodiéster.
Está dentro de la presente invención que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención que comprenden dos o más tramos o parte(s) de los mismos, en principio, se pueden hibridar entre sí. Tras dicha hibridación se forma una estructura de doble hebra. Los expertos en la técnica reconocerán que tal hibridación puede tener lugar o no, en particular en condiciones in vitro y/o in vivo. También, en caso de una hibridación de este tipo, no es necesariamente el caso en el que la hibridación se produce a lo largo de toda la longitud de los dos tramos en los que, al menos basándose en las reglas de apareamiento de bases, tal hibridación y por lo tanto la formación de una estructura de doble hebra se puede producir, en principio. Tal como se utiliza preferiblemente en la presente memoria, una estructura de doble hebra es una parte de una molécula de ácido nucleico o una estructura formada por dos o más hebras distintas o dos tramos distintos espacialmente de una sola hebra de una molécula de ácido nucleico, en donde al menos una, preferiblemente dos o más pares de bases están presentes, las cuales forman parte del apareamiento de bases, preferentemente de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick. También reconocerán los expertos en la técnica que otros apareamientos de bases, tales como el apareamiento de bases de Hoogsten puede tener lugar o formar dicha estructura de doble hebra. También se reconocerá que la característica de dos tramos que se hibridan preferiblemente indica que tal hibridación se supone que tiene que suceder debido a la complementariedad de bases de los dos tramos.
En una realización preferida, el término disposición, tal como se usa en el presente documento, significa el orden o la secuencia de características o elementos estructurales o funcionales descritos en este documento, en relación con los ácidos nucleicos descritos en este documento.
La persona experta en la técnica reconocerá que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención son capaces de unirse a SDF-1. Sin desear estar ligado a ninguna teoría, los presentes inventores suponen que la unión a SDF-1 se produce como resultado de una combinación de rasgos tridimensionales o elementos de la molécula de ácido nucleico reivindicada, que son causados por la orientación y los patrones de plegamiento de la secuencia de nucleótidos primaria que forman tales rasgos o elementos, en donde preferiblemente tales rasgos o elementos son el primer tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y el segundo tramo terminal de nucleótidos de moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1. Es evidente que el rasgo o elemento individual puede estar formado por varias secuencias individuales diferentes cuyo grado de variación puede variar dependiendo de la estructura tridimensional que tiene que formar tal elemento o rasgo. La característica de unión general de los ácidos nucleicos reivindicados es el resultado de la interacción de los diversos elementos y rasgos, respectivamente, que finalmente producen la interacción del ácido nucleico reivindicado con su diana, es decir, SDF-1. De nuevo, sin desear estar ligado a ninguna teoría, el tramo central de nucleótidos que es característico de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1, parece ser importante para mediar en la unión de las moléculas de ácido nucleico reivindicadas con SDF-1. En consecuencia, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención son adecuados para la interacción con SDF-1. También, la persona experta en la técnica reconocerá que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención son antagonistas de SDF-1. Debido a esto, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención son adecuados para el tratamiento y la prevención, respectivamente, de cualquier enfermedad o afección que esté asociada o causada por SDF-1. Tales enfermedades y afecciones se pueden tomar de la técnica anterior que establece que SDF-1 está implicado o asociado con dichas enfermedades y afecciones, respectivamente, proporcionando el fundamento científico para el uso terapéutico de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención.
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención también comprenderán ácidos nucleicos que son esencialmente homólogos a las secuencias particulares dadas a conocer en el presente documento. El término sustancialmente homólogo se entenderá como que la homología es de al menos 75%, preferiblemente 85%, más preferiblemente 90% y lo más preferiblemente más del 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
El porcentaje real de nucleótidos homólogos presentes en el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención dependerá del número total de nucleótidos presentes en el ácido nucleico. El porcentaje de modificación puede estar basado en el número total de nucleótidos presentes en el ácido nucleico.
La homología entre dos moléculas de ácido nucleico se puede determinar tal y como es conocido por una persona experta en la técnica. Más específicamente, un algoritmo de comparación de secuencias se puede utilizar para calcular el porcentaje de homología de secuencia para la o las secuencias de la prueba, con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designados. La secuencia de prueba es, preferiblemente, la secuencia o la molécula de ácido nucleico que se dice que es homóloga o que se va a analizar si es homóloga, y si es así, en qué grado, a una molécula de ácido nucleico diferente, en donde dicha molécula de ácido nucleico diferente también se denomina secuencia de referencia. En una realización, la secuencia de referencia es una molécula de ácido nucleico como se describe en esta memoria, preferiblemente una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 225, más preferiblemente una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ
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ID NO: 120, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 y SEQ ID NO: 144. Una alineación óptima de las secuencias para realizar una comparación, se puede realizar, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman (Smith & Waterman, 1981) mediante el algoritmo de homología por alineación de Needleman & Wunsch (Needleman & Wunsch, 1970) mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman (Pear- son & Lipman, 1988), mediante implementaciones informáticas de esos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFAS- TA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante una inspección visual.
Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia, es el algoritmo utilizado en la herramienta básica de búsqueda de alineamiento local (en adelante "BLAST"), véase, por ejemplo, Altschul et al. (Altschul et al. 1990 y Altschul et al., 1997). El programa informático para realizar análisis BLASt está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information (de aquí en adelante "NCBI"). Los parámetros por defecto utilizados en la determinación de la identidad de secuencia utilizando el programa informático disponible en NCBI, por ejemplo, BLASTN (para secuencias de nucleótidos) y BLASTP (para secuencias de aminoácidos) se describen en McGinnis et al. (McGinnis et al., 2004).
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención también comprenderán ácidos nucleicos que tienen un cierto grado de identidad con respecto a los ácidos nucleicos descritos en este documento y definidos por su secuencia de nucleótidos. Más preferiblemente, la presente invención también comprende aquellas moléculas de ácido nucleico que tienen una identidad de al menos 75%, preferiblemente 85%, más preferiblemente 90% y lo más preferiblemente más del 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con respecto a los ácidos nucleicos descritos en este documento y definidos por su secuencia de nucleótidos o una parte de la misma.
La expresión ácido nucleico de la invención o ácido nucleico de acuerdo con la presente invención también comprenderá los ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos descritas en este documento o parte de las mismas, tal como, por ejemplo, un metabolito o un derivado del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, preferiblemente en la medida en que los ácidos nucleicos o dichas partes están involucrados en o son capaces de unirse a SDF-1. Un ácido nucleico de este tipo se puede obtener a partir de los descritos en este documento, por ejemplo, mediante truncamiento. El truncamiento puede estar relacionado con uno o ambos extremos de los ácidos nucleicos tal y como se describen en esta memoria. El truncamiento también se puede relacionar con la secuencia interna de nucleótidos, es decir, puede estar relacionado con el o los nucleótidos entre el nucleóti- do del extremo 5' y 3' terminal, respectivamente. Además, el truncamiento comprenderá la deleción de tan solo un nucleótido de la secuencia de ácidos nucleicos descrita en este documento. El truncamiento también puede estar relacionado con más de un tramo del o de los ácidos nucleicos de la invención, por lo que el tramo puede tener hasta únicamente un nucleótido de longitud. La unión de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede estar determinada por los expertos en la técnica, usando ensayos de rutina o mediante el uso o la adopción de un método tal y como se describe en este documento, preferiblemente como se describe en el presente documento en la parte de los ejemplos.
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden ser o bien ácidos nucleicos D o ácidos nucleicos L. Preferiblemente, los ácidos nucleicos de la invención son ácidos nucleicos L. Además es posible que una o varias partes del ácido nucleico estén presentes como ácidos nucleicos D o al menos una o varias partes de los ácidos nucleicos sean ácidos nucleicos L. El término "parte" de los ácidos nucleicos significará tan solo un nucleótido. Tales ácidos nucleicos se denominan generalmente en este documento ácidos nucleicos D y L, respectivamente. Por lo tanto, en una realización particularmente preferida, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención consisten en nucleótidos L y comprenden al menos un nucleótido D. Tal nucleótido D se fija preferiblemente en una parte diferente de los tramos que definen los ácidos nucleicos según la presente invención, preferiblemente en aquellas partes de los mismos en donde está implicada una interacción con otras partes del ácido nucleico. Preferiblemente, un nucleótido D de este tipo está fijado en un extremo de cualquiera de los tramos y de cualquier ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, respectivamente. En una realización preferida adicional, tales nucleótidos D pueden actuar como un espaciador o un enlazador, preferiblemente fijando modificaciones tales como PEG y HES a los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención.
También está dentro de la presente invención que cada una y cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento en su totalidad en términos de secuencia(s) de ácido nucleico, se limitan a la o las secuencias de nucleótidos particulares. En otras palabras, las expresiones "que comprende" o "comprende" deberán interpretarse en una realización de este tipo, en el sentido de que contienen o que consisten en.
También está dentro de la presente invención que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención formen parte de un ácido nucleico más largo, en donde este ácido nucleico más largo comprende varias partes en donde al menos una parte de este tipo es un ácido nucleico, o una parte del mismo, de acuerdo con la presente invención. La o las otras partes de estos ácidos nucleicos más largos puede ser o bien uno o varios ácidos nucleicos D o ácidos nucleicos L. Se puede emplear cualquier combinación en relación con la presente invención. Esta o estas otras partes del ácido nucleico más largo pueden mostrar una función que es diferente de la unión, de preferencia de la unión a SDF-1. Una función posible es permitir la interacción con otras moléculas, en donde tales otras moléculas son preferiblemente diferentes de SDF-1, tal como, por ejemplo, para la inmovilización, reticulación, detección o amplifi
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cación. En una realización adicional de la presente invención, los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención comprenden, como restos individuales o combinados, varios de los ácidos nucleicos de la presente invención. Un ácido nucleico de este tipo que comprende varios de los ácidos nucleicos de la presente invención, también está incluido en el término ácido nucleico más largo.
Los ácidos nucleicos L tal y como se usan en este documento, son ácidos nucleicos que consisten en nucleótidos L, preferiblemente que consisten completamente en nucleótidos L.
Los ácidos nucleicos D tal y como se usan en este documento, son ácidos nucleicos que consisten en nucleótidos D, preferiblemente que consisten completamente en nucleótidos D.
Las expresiones ácido nucleico y molécula de ácido nucleico se usan en el presente documento de forma intercambiable si no se indica explícitamente lo contrario.
Además, si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de nucleótidos se indica en este documento en dirección 5' ^ 3'.
Tal y como se utiliza preferiblemente en el presente documento, cualquier posición de un nucleótido se determina o se hace referencia a la misma en relación con el extremo 5' de una secuencia, un tramo o un subtramo. Por consiguiente, un segundo nucleótido es el segundo nucleótido contado a partir del extremo 5' de la secuencia, tramo y subtramo, respectivamente. También, de acuerdo con ello, un penúltimo nucleótido es el segundo nucleótido contado a partir del extremo 3' de una secuencia, tramo y subtramo, respectivamente.
Independientemente de si el ácido nucleico de la invención consiste en nucleótidos D, nucleótidos L o una combinación de ambos, en donde la combinación es, por ejemplo, una combinación aleatoria o una secuencia definida de tramos que consisten en al menos un nucleótido L y al menos un ácido nucleico D, el ácido nucleico puede consistir en desoxirribonucleótido(s), ribonucleótido(s) o combinaciones de los mismos.
El diseño de los ácidos nucleicos de la invención como ácido nucleico L es ventajoso por varias razones. Los ácidos nucleicos L son enantiómeros de ácidos nucleicos naturales. Los ácidos nucleicos D, sin embargo, no son muy estables en soluciones acuosas y en particular en sistemas biológicos o muestras biológicas, debido a la presencia generalizada de nucleasas. Las nucleasas presentes en la naturaleza, en particular las nucleasas de células animales, no son capaces de degradar los ácidos nucleicos L. Debido a ello, la semivida biológica del ácido nucleico L es significativamente mayor en un sistema de este tipo, incluyendo el cuerpo animal y humano. Debido a la falta de degradación del ácido nucleico L, no se generan productos de degradación con nucleasas y por lo tanto no hay efectos secundarios que surjan de los mismos. Este aspecto delimita el ácido nucleico L, de facto de todos los demás compuestos que se utilizan en la terapia de enfermedades y/o trastornos que implican la presencia de SDF-1. Los ácidos nucleicos L que se unen específicamente a una molécula diana a través de un mecanismo diferente al emparejamiento de bases de Watson Crick, o los aptámeros que consisten parcial o completamente en nucleótidos L, particularmente aquellos en los que las partes del aptámero están implicadas en la unión del aptámero a la molécula diana, también se llaman Spiegelmers. Los aptámeros y Spiegelmers como tales son conocidos por una persona experta en la técnica y se describen, entre otras publicaciones, en 'The Aptamer Handbook' (compilador, Klussmann, 2006).
También está dentro de la presente invención que los ácidos nucleicos de la invención, independientemente de si están presentes como ácidos nucleicos D, ácidos nucleicos L o ácidos nucleicos D,L o si son ADN o ARN, pueden estar presentes como ácidos nucleicos de cadena de cadena sencilla o doble. Típicamente, los ácidos nucleicos de la invención son ácidos nucleicos monocatenarios que muestran estructuras secundarias definidas debido a la secuencia primaria y por lo tanto también pueden formar estructuras terciarias. Los ácidos nucleicos de la invención, sin embargo, también pueden ser de doble cadena en el sentido de que dos hebras que son complementarias o parcialmente complementarias entre sí, se hibridan entre sí.
Los ácidos nucleicos de la invención se pueden modificar. Tales modificaciones pueden estar relacionadas con el nucleótido aislado del ácido nucleico y son bien conocidas en la técnica. Ejemplos de tales modificaciones se describen, entre otros, en Venkatesan et al. (Venkatesan, Kim et al. 2003) y Kusser (Kusser 2000). Una modificación de este tipo puede ser un átomo de H, un átomo de F o un grupo O-CH3 o un grupo NH2 en la posición 2' del nucleótido individual en el que consiste el ácido nucleico. También, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender al menos un nucleótido LNA. En una realización, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención consiste en nucleótidos LNA.
En una realización, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden ser un ácido nucleico de partes múltiples. Un ácido nucleico de partes múltiples tal y como se emplea en esta memoria, es un ácido nucleico que consiste en al menos dos cadenas de ácido nucleico distintas. Estas al menos dos cadenas de ácido nucleico forman una unidad funcional en donde la unidad funcional es un ligando de una molécula diana. Las al menos dos cadenas de ácido nucleico se pueden obtener a partir de cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención, escindiendo la molécula de ácido nucleico para generar dos hebras o sintetizando un ácido nucleico que corresponde a una primera parte del ácido nucleico de la invención, es decir, el ácido nucleico general y otro ácido nucleico correspondiente a la segunda parte del ácido nucleico general. Se ha de tener en cuenta que tanto la escisión como la síntesis se pueden aplicar para generar un ácido nucleico de partes múltiples en donde hay más de dos hebras
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como se ha ejemplificado anteriormente. En otras palabras, las al menos dos cadenas de ácido nucleico distintas son típicamente diferentes de dos hebras que son complementarias y que se hibridan entre sí, a pesar de que puede existir un cierto grado de complementariedad entre dichas al menos dos hebras de ácido nucleico distintas y en donde tal complementariedad puede producir la hibridación de dichas hebras distintas.
Por último, también está dentro de la presente invención que se materialice una estructura circular, es decir, completamente cerrada para los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, es decir, que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención están cerrados en una realización, preferiblemente a través de un enlace co- valente, en donde más preferiblemente tal enlace covalente se establece entre el extremo 5' y el extremo 3' de las secuencias de ácidos nucleicos como se describen en esta memoria o cualquier derivado de los mismos.
Una posibilidad para determinar las constantes de unión de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, es el uso de los métodos como se describe en el ejemplo 3 y 4, lo que confirma el hallazgo anterior de que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención presentan un intervalo de valor Kd favorable. Una medida apropiada con el fin de expresar la intensidad de la unión entre la molécula de ácido nucleico individual y la diana que en el presente caso es SDF-1, es el llamado valor Kd, el cual así como el método para su determinación son conocidos por el experto en la técnica.
Preferiblemente, el valor Kd mostrado por los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención es inferior a 1 |jM. Un valor Kd de aproximadamente 1 jM se dice que es característico de una unión no específica de un ácido nucleico a una diana. Como reconocerán los expertos en la técnica, el valor Kd de un grupo de compuestos tales como los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, está dentro de un cierto intervalo. El valor Kd anteriormente mencionado de aproximadamente 1 jM es un límite superior preferido para el valor Kd. El límite inferior para el Kd de los ácidos nucleicos que se unen a la diana puede ser tan bajo como aproximadamente 10 picomolar o puede ser mayor. Está dentro de la presente invención que los valores Kd de ácidos nucleicos individuales que se unen a SDF-1 están preferiblemente dentro de ese intervalo. Los intervalos preferidos pueden ser definidos mediante una elección de cualquier primer número dentro de ese intervalo y cualquier segundo número dentro de este intervalo. Valores Kd superiores preferidos son 250 nM y 100 nM, valores Kd inferiores preferidos son 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM y 10 pM. El valor Kd superior más preferido es 2,5 nM, el valor Kd inferior más preferido es 100 pM.
Además de las propiedades de unión de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención inhiben la función de la molécula diana respectiva que en el presente caso es SDF-1. La inhibición de la función de SDF-1, por ejemplo, la estimulación de los receptores respectivos como se ha descrito anteriormente, se consigue mediante la unión de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención a SDF-1 y la formación de un complejo de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y MCP-1 y SDF-1. Un complejo de este tipo de una molécula de ácido nucleico y SDF-1 no puede estimular los receptores que normalmente son estimulados por SDF-1. Por tanto, la inhibición de la función receptora mediante moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención es independiente del receptor respectivo que se puede estimular con SDF-1 pero es el resultado de la prevención de la estimulación del receptor mediante MCP-1 y SDF-1 mediante las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.
Una posibilidad para determinar la constante de inhibición de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, es el uso de los métodos como se describen en el ejemplo 5 y 6 (para CXCR4 y CXCR7, respectivamente) lo que confirma el hallazgo anterior de que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención muestran una constante de inhibición favorable que permite el uso de dichos ácidos nucleicos en un esquema de tratamiento terapéutico. Una medición apropiada con el fin de expresar la intensidad del efecto inhibidor de la molécula de ácido nucleico individual sobre la interacción de la diana que en el presente caso es SDF-1 y el receptor respectivo, es la denominada concentración inhibidora media máxima (abrev. CI50), que, como tal, así como el método para su determinación son conocidos por los expertos en la técnica.
Preferiblemente, el valor de CI50 mostrado por las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es inferior a 1 jM. Un valor de CI50 de aproximadamente 1 jM se dice que es característico de una inhibición no específica de funciones diana mediante una molécula de ácido nucleico. Como reconocerán los expertos en la técnica, el valor de CI50 de un grupo de compuestos tales como las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, está dentro de un cierto intervalo. El CI50 mencionado anteriormente de aproximadamente 1 jM es un límite superior preferido para el valor de CI50. El límite inferior para la CI50 de moléculas de ácido nucleico que se unen a la diana puede ser tan bajo como aproximadamente 10 picomolar o puede ser mayor. Está dentro de la presente invención que los valores de CI50 de ácidos nucleicos individuales que se unen a SDF-1 están preferiblemente dentro de este intervalo. Los intervalos preferidos pueden ser definidos mediante la elección de cualquier primer número dentro de este intervalo y cualquier segundo número dentro de este intervalo. Valores de CI50 superiores preferidos son 250 nM y 100 nM, valores de CI50 inferiores preferidos son 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM y 10 pM. El valor de CI50 superior más preferido es 2,5 nM, el valor de CI50 inferior más preferido es 100 pM.
Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención pueden tener cualquier longitud, siempre que todavía sean capaces de unirse a la molécula diana. Se reconocerá en la técnica que existen longitudes preferidas de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Típicamente, la longitud es de entre 15 y 120 nucleó- tidos. Los expertos en la técnica reconocerán que cualquier número entero entre 15 y 120 es una longitud posible
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para los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Los intervalos más preferidos para la longitud de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, son longitudes de aproximadamente 20 a 100 nucleótidos, aproximadamente 20 a 80 nucleótidos, aproximadamente 20 a 60 nucleótidos, aproximadamente 20 a 50 nucleótidos y aproximadamente 29 a 450 nucleótidos.
Está dentro de la presente invención que los ácidos nucleicos descritos en el presente documento comprenden un resto que preferiblemente es un resto de alto peso molecular y/o que preferiblemente permite modificar las características del ácido nucleico en términos de, entre otros, tiempo de residencia en el cuerpo del animal, preferiblemente el cuerpo humano. Una realización particularmente preferida de tal modificación es la PEGilación y la HESilación de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Tal y como se utiliza en esta memoria, PEG significa polietilenglicol y HES es almidón hidroxietílico. Una PEGilación, tal y como se emplea preferiblemente en esta memoria, es la modificación de un ácido nucleico según la presente invención, en donde tal modificación consiste en un resto PEG que está fijado a un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Una HESilación, tal y como se emplea preferiblemente en esta memoria, es la modificación de un ácido nucleico según la presente invención, en donde tal modificación consiste en un resto HES que está fijado a un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Estas modificaciones, así como el procedimiento de modificación de un ácido nucleico usando tales modificaciones, se describen en el documento de solicitud de patente europea EP 1 306 382.
En el caso de que PEG sea un resto de alto peso molecular de este tipo, el peso molecular es preferiblemente de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 120.000 Da, más preferiblemente de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 80.000 Da y lo más preferiblemente de aproximadamente 40.000 Da. En el caso de que HES sea un resto de alto peso molecular de este tipo, el peso molecular es preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 1.000 kDa, más preferiblemente de aproximadamente 100 a aproximadamente 700 kDa y lo más preferiblemente de 200 a 500 kDa. HES muestra una sustitución molar de 0,1 a 1,5, más preferiblemente de 1 a 1,5 y presenta una sustitución de muestra expresada como la relación C2/C6 de aproximadamente 0,1 a 15, preferiblemente de aproximadamente 3 a 10. El procedimiento de modificación de HES se describe, por ejemplo, en el documento de solicitud de patente alemana DE 1 2004 006 249.8.
La modificación se puede realizar, en principio, en las moléculas de ácido nucleico de la presente invención en cualquier posición de las mismas. Preferiblemente, tal modificación se realiza ya sea en el nucleótido 5'-terminal, el nu- cleótido 3'-terminal y/o cualquier nucleótido entre el nucleótido 5' y el nucleótido 3' de la molécula de ácido nucleico.
La modificación y preferiblemente el resto PEG y/o HES se puede fijar a la molécula de ácido nucleico de la presente invención, ya sea directa o indirectamente, preferentemente a través de un enlazador. También está dentro de la presente invención que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprende una o varias modificaciones, preferiblemente uno o varios restos PEG y/o HES. En una realización, la molécula enlazadora individual fija más de un resto PEG o resto HES a una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El enlazador utilizado en conexión con la presente invención puede ser el mismo lineal o ramificado. Este tipo de enlazadores son conocidos por los expertos en la técnica y se describen adicionalmente en los documentos de solicitudes de patente WO2005/074993 y WO2003/035665.
En una realización preferida, el enlazador es un enlazador biodegradable. El enlazador biodegradable permite modificar las características del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en términos de, entre otros, tiempo de residencia en un cuerpo animal, preferiblemente en un cuerpo humano, debido a la liberación de la modificación desde el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El uso de un enlazador biodegradable puede permitir un mejor control del tiempo de residencia del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Una realización preferida de tal enlazador biodegradable es un enlazador biodegradable como se describe, pero no limitado a, en los documentos de solicitudes de patente internacional WO2006/052790, WO2008/034122, WO2004/092191 y WO2005/099768.
Está dentro de la presente invención que la modificación o el grupo de modificaciones sea una modificación biode- gradable, en donde la modificación biodegradable se puede fijar a la molécula de ácido nucleico de la presente invención, ya sea directa o indirectamente, preferentemente a través de un enlazador. La modificación biodegradable permite modificar las características del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en términos de, entre otros, tiempo de residencia en un cuerpo animal, preferiblemente en un cuerpo humano, debido a la liberación o la degradación de la modificación desde el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El uso de una modificación biodegradable puede permitir un mejor control del tiempo de residencia del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Una realización preferida de tal modificación biodegradable es una modificación biodegradable como se describe, pero no limitada a, en los documentos de solicitudes de patente internacional WO2002/065963, WO2003/070823, WO2004/113394 y WO2000/41647, preferiblemente en WO2000/41647, página 18, línea 4 a 24.
Además de las modificaciones tal y como se han descrito anteriormente, otras modificaciones se pueden utilizar para modificar las características de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, en donde tales otras modificaciones se pueden seleccionar a partir del grupo de proteínas, lípidos tales como colesterol y cadenas de azúcar tales como amilasa, dextrano, etc.
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Sin desear estar ligado a ninguna teoría, parece que mediante la modificación de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención con un resto de alto peso molecular, tal como un polímero y más particularmente uno o varios de los polímeros descritos en el presente documento, que son preferiblemente fisiológicamente aceptables, la cinética de excreción cambia. Más particularmente, parece que debido al mayor peso molecular de tales ácidos nucleicos de la invención modificados y debido a que los ácidos nucleicos de la invención no están sujetos al metabolismo, en particular cuando están en la forma L, disminuye la excreción desde un cuerpo animal, preferiblemente desde un cuerpo de mamífero y más preferiblemente desde un cuerpo humano. Como la excreción se produce normalmente a través de los riñones, los presentes inventores suponen que la tasa de filtración glomerular de los ácidos nucleicos modificados se reduce de este modo significativamente, en comparación con los ácidos nucleicos que no tienen este tipo de modificación con peso molecular elevado, que da como resultado un aumento del tiempo de residencia en el cuerpo animal. En relación con ello, es especialmente digno de mención que, a pesar de que tal modificación con peso molecular elevado, la especificidad de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención no se ve afectada de manera perjudicial. Por ello, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención tienen entre otras, la característica sorprendente - que normalmente no se puede esperar de compuestos farmacéuticamente activos - de que una formulación farmacéutica que proporciona una liberación sostenida no se requiere necesariamente para proporcionar una liberación sostenida de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. En su lugar, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención en su forma modificada que comprende un resto de elevado peso molecular, se pueden utilizar ya como tales, como una formulación de liberación sostenida, ya que actúan, debido a su modificación, como si ellos fueran liberados desde una formulación de liberación sostenida. Por lo tanto, la(s) modificación(es) de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención tal y como se describen en el presente documento y las moléculas de ácido nucleico modificadas de este modo de acuerdo con la presente invención y cualquier composición que las comprende, pueden proporcionar una farmacoci- nética y biodistribución de las mismas, preferiblemente controlada y distinta. Esto también incluye un tiempo de residencia en la circulación y la distribución a los tejidos. Tales modificaciones se describen adicionalmente en el documento de solicitud de patente WO2003/035665.
Sin embargo, también está dentro de la presente invención que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención no comprenden ninguna modificación y, en particular, ninguna modificación con peso molecular elevado, tal como PEGilación o HESilación. Una realización de este tipo es particularmente preferida cuando el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención muestra una distribución preferencial a cualquier órgano o tejido diana en el cuerpo o cuando se desea un aclaramiento rápido del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención desde el cuerpo después de la administración. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, tal y como se describen en este documento, con un perfil de distribución preferencial a cualquier órgano o tejido diana en el cuerpo, permitirán un establecimiento de concentraciones locales eficaces en el tejido diana, manteniendo al mismo tiempo la concentración sistémica de los ácidos nucleicos baja. Esto permitiría el uso de dosis bajas, que no solo son beneficiosas desde un punto de vista económico, sino que también reducen una exposición innecesaria de otros tejidos al agente de ácido nucleico, reduciendo de este modo el riesgo potencial de efectos secundarios. Un aclaramiento rápido de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención desde el cuerpo, después de la administración, podría ser deseable, entre otros, en caso de formación de imágenes in vivo o requerimientos específicos de una dosificación terapéutica, utilizando los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención o medicamentos que comprenden los mismos.
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención y/o los antagonistas de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar para la generación o la preparación de un medicamento. Tal medicamento o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, contiene al menos uno de los ácidos nucleicos de la invención seleccionado a partir del grupo de ácidos nucleicos que se unen a SDF-1, opcionalmente junto con otros compuestos farmacéuticamente activos, en donde el ácido nucleico de la invención preferiblemente actúa el mismo como compuesto farmacéuticamente activo. Tales medicamentos comprenden en realizaciones preferidas, al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo de este tipo puede ser, por ejemplo, agua, tampón, PBS, solución de glucosa, preferiblemente una solución equilibrada con 5% de sal de glucosa, almidón, azúcar, gelatina o cualquier otra sustancia vehículo aceptable. Tales vehículos son generalmente conocidos por el experto en la técnica. La persona experta en la técnica reconocerá que cualquiera de las realizaciones, el uso y aspectos o relacionados con el medicamento de la presente invención también son aplicables a la composición farmacéutica de la presente invención y viceversa.
La indicación, enfermedades y trastornos para cuyo tratamiento y/o prevención los ácidos nucleicos, las composiciones farmacéuticas y medicamentos de acuerdo con o preparados de acuerdo con la presente invención, son el resultado de la participación, ya sea directa o indirecta, de SDF-1 en el mecanismo patógeno respectivo.
Por supuesto, debido a que los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de acuerdo con la presente invención interaccionan con o se unen a SDF-1 humano o murino, una persona experta en la técnica entenderá generalmente que los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar fácilmente para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de cualquier enfermedad de seres humanos y animales, tal y como se describen en esta memoria. En relación con ello, es preciso reconocer que las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar para el tratamiento y la prevención de cualquiera de las enfermedades, trastornos o afecciones descritas en el presente documento, con independencia del modo de acción que subyace a tal enfermedad, trastorno y afección.
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A continuación, se proporciona la racionalización para el uso de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, en relación con las diversas enfermedades, trastornos y afecciones, haciendo de este modo que sea plausible la aplicabilidad terapéutica, preventiva y de diagnóstico reivindicada de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Con el fin de evitar cualquier repetición innecesaria, se debe reconocer que debido a la implicación del eje SDF-1 - receptor de SDF-1 como se describe en relación con esto, dicho eje puede estar dirigido por las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, de tal manera que se logra el efecto terapéutico, preventivo y de diagnóstico reivindicado. Además, debe reconocerse que las particularidades de las enfermedades, trastornos y afecciones, de los pacientes y cualquier detalle del régimen de tratamiento descrito en conexión con esto, puede ser un objeto de las realizaciones preferidas de la presente solicitud.
Para las neoplasias hematológicas, en particular, hay una evidencia considerable de que las células de leucemia pueden estar protegidas de las terapias convencionales (quimioterapia combinada con diversos agentes dirigidos a una diana, tales como anticuerpos específicos o inhibidores de cinasa) dentro de microambientes tisulares particulares, denominados nichos. Tales nichos se encuentran particularmente en la médula ósea en donde pueden albergar células malignas que luego son capaces de expandirse y producir una recaída después de la terapia inicial (Burger y Kipps, 2002; Burger y Burkle, 2007; Meads et al., 2008; Burger, Ghia et al., 2009). Esta conservación de las células malignas durante la quimioterapia se piensa que es debida en gran parte a un contacto directo entre las células malignas y las células del estroma (Lagneaux, Delforge et al. 1998; Kurtova, Balakrishnan et al., 2009; Damiano, Cress et al., 1999) sin embargo en la complejidad de este microambiente hay múltiples señales celulares y moleculares que pueden conducir a una resistencia de las células malignas frente a la quimioterapia. A pesar de esta complejidad, es evidente que las células del estroma producen la quimiocina SDF-1 y que las células normales y malignas que expresan CXCR4 migran ahí y se mantienen en tales nichos. Que esta vía molecular es una clave para esta interacción se demuestra por el hecho de que una inhibición específica de esta interacción es suficiente para liberar tanto células normales como malignas desde los nichos (Broxmeyer, Orschell et al., 2005; Devine, Flomenberg et al., 2004; Azab, Runnels et al., 2009). Además de debilitar la interacción con los nichos, se ha mostrado en numerosas neoplasias hematológicas que la interrupción del eje SDF-1 - CXCR4 produce un aumento de la vulnerabilidad de las células frente a otras terapias - la llamada 'quimiosensibilización'. Este quimiosensibilización se ha descrito para el mieloma múltiple (Azab, Runnels et al., 2009) y diversas leucemias agudas y crónicas (Dillmann, Veldwijk et al., 2009; Lagneaux, Delforge et al. 1998).
Por lo tanto el uso de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de acuerdo con la presente invención para interrumpir la interacción entre células malignas y su medio para sensibilizarlas a otras terapias, es una estrategia atractiva para el tratamiento de neoplasias hematológicas. Los ejemplos de terapias que se pueden mejorar mediante una combinación con ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de acuerdo con la presente invención, incluyen pero no se limitan a los siguientes, fludarabina, ciclofosfamida, rituxán, clorambucilo, lenalidomida, bortezomib, dexametasona, melfalán, imatinib o nilotinib.
La anterior descripción ha destacado el papel de las células del estroma de la médula ósea y de los nichos de la médula ósea en la protección de las células malignas frente a los efectos de la quimioterapia u otras terapias dirigidas contra las neoplasias hematológicas. Sin embargo, hay pruebas de interacciones similares que se producen de forma local dentro de tumores sólidos, ya que una gran proporción de las células en los tumores sólidos no son células cancerosas, sino que son células del estroma, células inmunes o vasculares obtenidas a partir del hospedador que interaccionan íntimamente con las células tumorales. Hay muchos tipos de tumores sólidos que expresan receptores CXCR4 (Engl, Relja et al., 2006; Müller, Homey et al., 2001; Koshiba, Hosotani et al., 2000, Ehtesham, Steven- son, et al., 2008; Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al., 2003; Sauer, Seidler et al., 2005; Su, Zhang et al., 2005) y/o CXCR7 (Bums, Summers et al. 2006; Miao et al., 2007; Wang et al., 2008; Zheng, Li et al., 2010) ya sea constitutivamente o como respuesta a una hipoxia o a diversos tratamientos. Las células malignas pueden usar esta vía de señalización para la supervivencia y la migración mediante la activación de Akt y Erk. SDF-1 puede ser producido por las mismas células malignas o por células del estroma dentro del tumor. Una vez más en este entorno complejo, el mecanismo exacto por el cual las células tumorales crecen y se escapan de la quimioterapia u otros enfoques terapéuticos, no está claramente definido. Sin embargo, es claro que el eje SDF-1 - CXCR4 y el eje SDF-1 - CXCR7 tienen un papel importante. Por ejemplo la inhibición de CXCR4 sensibiliza líneas celulares de glioma a una quimioterapia in vitro (Redjal et al., 2006) y una expresión elevada de CXCR4 es predictiva de un resultado malo en el cáncer de mama (Holm, Abreo et al., 2008; Mizell, Smith et al., 2009) y cánceres gastrointestinales (Schimanski et al., 2008). Por lo tanto el uso de ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de acuerdo con la presente invención para inhibir la acción de SDF-1 sobre cualquiera de los receptores CXCR4 o CXCR7 en una amplia variedad de tumores sólidos, mejorará la terapia actual haciendo que las células sean más vulnerables a la terapia, ya sea por una acción directa o mediante el bloqueo de las interacciones con otras células en el tumor.
Además de los aspectos anteriores, CXCR4 también transmite señales que se cree que son decisivas para el reclutamiento y la retención de células obtenidas a partir de la médula ósea proangiogénicas e inmunosupresoras (BMDCs). Esta vía, por lo tanto, también se puede utilizar para una angiogénesis independiente de VEGF. Como consecuencia, el bloqueo del eje SDF1-CXCR4 para sensibilizar los tumores frente a una terapia anti-VEGF o una radiación, ha surgido como un tratamiento estratégico atractivo para cánceres sólidos.
Sin embargo, existe una preocupación de que el bloqueo de CXCR4 pueda no ser suficiente para bloquear los efectos de SDF-1, que también puede unirse a CXCR7 en las células cancerosas o del estroma. Por ejemplo, se ha
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informado recientemente de que CXCR7 se expresa en células tumorales cerebrales y media en los efectos anti- apoptóticos y también se ha mostrado que regula la invasión, la angiogénesis y el crecimiento tumoral de los carcinomas hepatocelulares humanos. En tales casos, la acción de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 para bloquear la acción de SDF-1 sobre ambos receptores CXCR7 y CXCR4 en un único agente, proporcionaría una eficacia especial en comparación con los bloqueadores específicos de receptores.
El medicamento de acuerdo con la presente invención se puede utilizar en combinación con un medicamento adicional o un agente farmacéuticamente activo adicional, en donde el medicamento adicional o el agente farmacéuticamente activo adicional, daña, destruye y/o marca (las) células cancerosas. Si se utiliza la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención con un medicamento adicional o un agente farmacéuticamente activo adicional, la terapia que se basa en la molécula de ácido nucleico, es preferiblemente una terapia complementaria a la terapia que se está empleando o en la que se basa el medicamento adicional o el agente farmacéuticamente activo adicional. Tal medicamento adicional o agente farmacéuticamente activo adicional se selecciona preferiblemente a partir del grupo, pero no se restringe al mismo, que comprende
a) anticuerpos tales como Rituximab (diana: CD20), Cetuximab (diana: receptor del factor de crecimiento epidérmico), Ibritumomab-Tiuxetan (diana: CD20), Tositumomab (diana: CD20), Trastuzumab (diana: HER2/neu), Bevacizumab (diana: VEGF), Alemtuzumab (diana: CD52);
b) agentes alquilantes tales como cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clo- rambucilo, doxorrubicina, doxorrubicina liposómica, bendamustina, melfalán, temozolomida;
c) antimetabolitos tales como purinazatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina, cladribina;
d) alcaloides vegetales tales como alcaloides de la vinca, terpenoides vegetales tales como taxanos, preferiblemente docetaxel, paclitaxel, podofilotoxina, epotilona;
e) inhibidores de la topoisomerasa, tales como camptotecinas, irinitecán, mitoxantrona;
f) y otros tales como leucovorina, metotrexato, tamoxifeno, sorafenib, lenalidomida, bortezomib, dexameta- sona, flurouracilo y prednisona.
Otros agentes que se pueden utilizar como agente farmacéuticamente activo adicional en el tratamiento del cáncer, son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, fármacos inmunosupresores, citocinas y fármacos citostáticos (para una referencia: "Allgemeine und Spezielle Pharmakologie und Toxikologie 2011", compilador: Thomas Karow; Pulheim, Germany). Tales agentes bien conocidos en la técnica se utilizan en el tratamiento del cáncer de acuerdo con el estándar actual de cuidados para la población particular de pacientes con cáncer.
Se reconocerá que los agentes farmacéuticamente activos adicionales especificados anteriormente se pueden utilizar en conexión con cada uno y cualquier aspecto de la presente invención que hace uso de tal agente farmacéuticamente activo adicional.
El medicamento o el agente farmacéuticamente activo adicional tiene o puede proporcionar la función de una quimioterapia. Se puede emplear la radioterapia de forma alternativa o adicional a la quimioterapia.
El medicamento de acuerdo con la presente invención, en combinación con o sin el medicamento o agente farmacéuticamente activo adicional y con o sin radioterapia, se puede utilizar para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, preferiblemente
a) cáncer hematológico, en donde más preferiblemente el cáncer hematológico se selecciona a partir del grupo de leucemia y mieloma.
b) tumores sólidos, en donde más tumores sólidos se seleccionan a partir del grupo de glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de mama, linfoma, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer renal y cáncer de ovario
Preferiblemente el cáncer de mama se selecciona a partir del grupo de cáncer de mama negativo para HER2 avanzado.
Preferiblemente la leucemia se selecciona a partir del grupo de leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda. Preferiblemente el mieloma se selecciona a partir del grupo de mieloma múltiple.
El medicamento adicional preferido o un agente farmacéuticamente activo adicional para el tratamiento del glioblastoma es la radioterapia o la quimioterapia con temozolomida o la terapia con bevacizumab. El medicamento adicional preferido o un agente farmacéuticamente activo adicional para el tratamiento del cáncer colorrectal, se selecciona a partir del grupo que comprende fluorouracilo, leucovorina, oxaliplatino, irinotecán y bevacizumab.
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El medicamento adicional preferido o un agente farmacéuticamente activo adicional para el tratamiento del cáncer de mama negativo para HER2 avanzado, se selecciona a partir del grupo de doxorrubicina, paclitaxel, docetaxel, metotrexato, fluorouracilo, bevacizumab, tamoxifeno e inhibidores de la aromatasa.
El medicamento adicional preferido o un agente farmacéuticamente activo adicional para el tratamiento de la leucemia linfoide crónica, se selecciona a partir del grupo que comprende fludarabina, ciclofosfamida, rituximab, cloram- bucilo, alemtuzumab, vincristina, pentostatina, mitoxantrona, doxorrubicina, cladribina y bendamustina.
El medicamento adicional preferido o un agente farmacéuticamente activo adicional para el tratamiento del mieloma múltiple, se selecciona a partir del grupo que comprende lenalidomida, bortezomib, dexametasona, melfalán, ciclofosfamida, doxorrubicina liposómica y prednisona.
En una realización del medicamento de la presente invención, tal medicamento es para uso en combinación con otros tratamientos para cualquiera de las enfermedades descritas en este documento, en particular aquellas en las que se va a emplear el medicamento de la presente invención.
Una "terapia de combinación" (o "coterapia") incluye la administración de un medicamento de la invención y al menos un segundo agente o un agente adicional como parte de un régimen de tratamiento específico, destinado a proporcionar el efecto beneficioso a partir de la acción conjunta de estos agentes terapéuticos, es decir, el medicamento de la presente invención y dicho segundo agente o agente adicional. El efecto beneficioso de la combinación incluye, pero no se limita a, una acción conjunta farmacocinética o farmacodinámica resultante de la combinación de agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación, normalmente se lleva a cabo durante un período de tiempo definido (normalmente minutos, horas, días o semanas dependiendo de la combinación seleccionada).
"Una "terapia de combinación" puede intentar incluir, pero no lo hace generalmente, la administración de dos o más de estos agentes terapéuticos como parte de regímenes de monoterapia distintos. Una "terapia de combinación" se entiende que incluye la administración de esos agentes terapéuticos de una manera secuencial, es decir, en donde cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de esos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, de una manera sustancialmente simultánea. Una administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, mediante la administración a un sujeto de una única cápsula que tiene una proporción fija de cada agente terapéutico o en múltiples cápsulas, individuales para cada uno de los agentes terapéuticos.
La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico puede efectuarse por cualquier vía apropiada incluyendo, pero no limitadas a, vías tópicas, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares y absorción directa a través de tejidos de membranas mucosas. Los agentes terapéuticos se pueden administrar por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada, se puede administrar mediante inyección, mientras que los otros agentes terapéuticos de la combinación se pueden administrar por vía tópica.
Alternativamente, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos se pueden administrar por vía tópica o todos los agentes terapéuticos se pueden administrar mediante inyección. La secuencia con la que se administran los agentes terapéuticos no es muy decisiva, a menos que se indique lo contrario. Una "terapia de combinación" también puede incluir la administración de los agentes terapéuticos como se han descrito anteriormente, en combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos. Cuando la terapia de combinación comprende además un tratamiento no farmacológico, el tratamiento no farmacológico se puede realizar en cualquier momento adecuado, siempre que se logre un efecto beneficioso de la acción conjunta de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento no farmacológico. Por ejemplo, en los casos apropiados, el efecto beneficioso se consigue todavía cuando el tratamiento no farmacológico se retira temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, quizá durante días o incluso semanas.
Como se ha indicado en términos generales anteriores, el medicamento según la presente invención se puede administrar, en principio, en cualquier forma conocida por los expertos en la técnica. Una ruta de administración preferida es la administración sistémica, más preferiblemente mediante administración parenteral, preferiblemente mediante inyección. Alternativamente, el medicamento se puede administrar localmente. Otras vías de administración comprenden la vía intramuscular, intraperitoneal y subcutánea, oralmente, intranasal, intratraqueal o pulmonar, con una preferencia dada a la vía de administración que sea menos invasiva, garantizando al mismo tiempo la eficacia.
La administración parenteral se utiliza generalmente para las inyecciones e infusiones subcutáneas, intramusculares o intravenosas. Además, un enfoque para la administración parenteral emplea la implantación de sistemas de liberación lenta o de liberación sostenida, que aseguran el mantenimiento de un nivel constante de dosificación, que son bien conocidos por el experto normal en la técnica.
Además, los medicamentos preferidos de la presente invención se pueden administrar en forma intranasal mediante el uso tópico de vehículos intranasales, inhalantes adecuados o mediante vías transdérmicas, usando las formas de parches cutáneos transdérmicos bien conocidos por los expertos normales en la técnica. Para una administración en forma de un sistema de suministro transdérmico, la administración de la dosificación será, por supuesto, continua en
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lugar de intermitente durante todo el régimen de dosificación. Otras preparaciones tópicas preferidas incluyen cremas, pomadas, lociones, aerosoles y geles.
Los ámbitos que responderán favorablemente al método de la invención incluyen los ámbitos médicos y veterinarios en general, incluyendo seres humanos y pacientes humanos. Entre otros ámbitos para los que son útiles los métodos y medios de la invención, se encuentran los gatos, perros, animales grandes, aves tales como pollos y similares.
El medicamento de la presente invención generalmente comprenderá una cantidad eficaz del o de los componentes activos de la terapia, incluyendo, pero no limitados a, una molécula de ácido nucleico de la presente invención, disuelta o dispersada en un medio farmacéuticamente aceptable. Medios o vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifún- gicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares. El uso de tales medios y agentes con sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. También se pueden incorporar ingredientes activos complementarios en el medicamento de la presente invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica. Tal composición farmacéutica comprende al menos uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención y, preferiblemente, un aglutinante farmacéuticamente aceptable. Tal aglutinante puede ser cualquier aglutinante utilizado y/o conocido en la técnica. Más particularmente, un aglutinante de este tipo es cualquier aglutinante como se describe en relación con la preparación del medicamento descrito en el presente documento. En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende un agente farmacéuticamente activo adicional.
La preparación de un medicamento y una composición farmacéutica es conocida por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Típicamente, tales composiciones se pueden preparar como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, un líquido antes de la inyección; como comprimidos u otros sólidos para administración oral; como cápsulas de liberación con el tiempo; o en cualquier otra forma usada en la actualidad, incluyendo gotas para los ojos, cremas, lociones, pomadas, inhalantes y similares. El uso de formulaciones estériles, tales como lavados a base de solución salina, por parte de cirujanos, médicos o trabajadores sanitarios para el tratamiento de un área en particular en el campo de operación, también puede ser particularmente útil. Las composiciones también se pueden administrar mediante un microdispositivo, una micropartícula o una esponja.
Después de la formulación, un medicamento se administrará de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea farmacológicamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear las cápsulas de liberación de fármaco y similares.
El medicamento de la invención también se puede administrar en formas de dosificación oral como comprimidos o cápsulas, píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, suspensiones, jarabes y emulsiones de liberación retardada con el tiempo y liberación sostenida. Los supositorios se preparan ventajosamente a partir de emulsiones o suspensiones grasas.
La composición farmacéutica o el medicamento se puede esterilizar y/o contener adyuvantes, tales como agentes conservantes, estabilizantes, humectantes o emulsionantes, promotores de solución, sales para regular la presión osmótica y/o tampones. Además, también pueden contener otras sustancias terapéuticamente valiosas. Las composiciones se preparan de acuerdo con métodos convencionales de mezcla, granulación o recubrimiento y típicamente contienen aproximadamente 0,1% a 75%, preferiblemente aproximadamente 1% a 50%, del ingrediente activo.
Las composiciones líquidas, particularmente inyectables se pueden preparar, por ejemplo, disolviendo, dispersando, etc. El compuesto activo se disuelve o se mezcla con un disolvente farmacéuticamente puro tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar de este modo la solución o suspensión inyectable. Adicionalmente, se pueden formular formas sólidas adecuadas para disolver en líquido antes de la inyección.
Los medicamentos y las moléculas de ácido nucleico, respectivamente, de la presente invención también se pueden administrar en forma de sistemas de liberación de liposomas, tales como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares. Los liposomas se pueden formar a partir de una variedad de fosfolípidos, que contienen colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. En algunas realizaciones, una película de componentes lipídicos se hidrata con una solución acuosa de fármaco para proporcionar una capa en forma de lípi- dos que encapsulas el fármaco, lo que es bien conocido por el experto normal en la técnica. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento se pueden proporcionar como un complejo con un compuesto lipófilo o no inmunogénico, un compuesto de alto peso molecular construido usando métodos conocidos en la técnica. Adicionalmente, los liposomas pueden ser portadores de tales moléculas de ácido nucleico en su superficie para dirigirse a una diana y transportar agentes citotóxicos internamente para mediar en la muerte celular. Un ejemplo de complejos asociados a ácido nucleico se proporciona en el documento de Patente de EE.UU. n° 6.011.020.
Los medicamentos y las moléculas de ácido nucleico, respectivamente, de la presente invención también se pueden acoplar con polímeros solubles como vehículos de fármacos dirigibles. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirroli-
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dona, copolímero de pirano, polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, polidroxietilaspanamidafenol o polietilenoxidopolili- sina sustituida con residuos de palmitoilo. Además, los medicamentos y las moléculas de ácido nucleico, respectivamente, de la presente invención se pueden acoplar a una clase de polímeros biodegradables útiles para conseguir la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, poli(ácido láctico), poliepsilon capro lactona, poli(ácido hidroxi- butírico), poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloque reticulados o anfipáticos de hidrogeles.
Si se desea, la composición farmacéutica y el medicamento, respectivamente, que se va a administrar también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH y otras sustancias tales como, por ejemplo, acetato de sodio y oleato de trie- tanolamina.
El régimen de dosificación que emplea las moléculas de ácido nucleico y los medicamentos, respectivamente, de la presente invención se selecciona de acuerdo con una variedad de factores que incluyen el tipo, la especie, la edad, el peso, el sexo y el estado médico del paciente; la gravedad de la afección a tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y el aptámero o sal particular del mismo, empleado. Un médico o un veterinario experto en la materia puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad eficaz del fármaco requerido para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la afección.
Los niveles plasmáticos eficaces del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención varían preferiblemente de 500 fM a 200 |jM, preferiblemente de 1 nM a 20 jM, más preferiblemente de 5 nM a 20 jM, lo más preferiblemente 50 nM a 20 jM en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades descritas en este documento.
Las moléculas de ácido nucleico y los medicamentos, respectivamente, de la presente invención se pueden administrar preferiblemente en una dosis diaria única, cada segundo o tercer día, de forma semanal, cada dos semanas, en una dosis única mensual o cada tres meses.
Está dentro de la presente invención que el medicamento, tal como se describe en este documento, constituye la composición farmacéutica descrita en este documento.
También se describe un método para el tratamiento de un sujeto que se encuentra en necesidad de tal tratamiento, en donde el método comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente activa de al menos uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. En una realización, el sujeto padece una enfermedad o tiene riesgo de desarrollar tal enfermedad, en donde la enfermedad es cualquiera de las descritas en este documento, particularmente cualquiera de las enfermedades descritas en conexión con el uso de cualquiera de los ácidos nucleicos según la presente invención para la preparación de un medicamento.
Tal y como se utiliza preferiblemente en el presente documento, el término tratamiento comprende en una realización preferida de forma adicional o alternativamente, prevención y/o seguimiento.
Tal y como se utiliza preferiblemente en el presente documento, los términos enfermedad y trastorno se utilizan de forma intercambiable, si no se indica lo contrario.
Tal y como se utiliza en este documento, el término "comprenden", preferiblemente, no está destinado a limitar la materia objeto seguida o descrita por dicho término. Sin embargo, en una realización alternativa el término comprende se entenderá en el sentido de que contiene y por lo tanto como limitante de la materia objeto seguida o descrita por dicho término.
Las diversas SEQ ID NOs, la naturaleza química de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y las moléculas diana SDF-1 tal y como se utilizan en esta memoria, la secuencia real de las mismas y el número de referencia interno, se resumen en la siguiente tabla. Se debe tener en cuenta que los ácidos nucleicos se caracterizaron en el aptámero, es decir, a nivel de ácido nucleico D (D-ARN) con D-SDF-1 humano biotinilado (SEQ ID NO: 4) o a nivel de Spiegelmer, es decir, ácido nucleico L (L-ARN) con la configuración natural de SDF-1, L-SDF- 1 (SDF-1a humano, SEQ ID NO: 1). Los diferentes ácidos nucleicos comparten un nombre de referencia interna, pero una SEQ ID NO: para la molécula de D-ARN (aptámero) y una SEQ ID NO: para la molécula de L-ARN (Spie- gelmer), respectivamente.
TABLA I
SEQ ID NO:
ARN/ Péptido Secuencia Referencia interna
1
L- péptido KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNR QVCIDPKLKWIQEYLEKALNK SDF-1a hu- mano/mono/gato SDF-1 hu- mano/mono/gato
2
L- péptido KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNR QVCIDPKLKWIQEYLEKALNKRFKM SDF-1P hu- mano/mono/gato
3
L- péptido KPVSLSYRCPCRFFESHIARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNR QVCIDPKLKWIQEYLEKALNK SDF-1a murino
SDF-1 murino
4
D- péptido KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNR QVCIDPKLKWIQEYLEKALNKRFK-Biotin hu D-SDF-1 bioti- nilado
5
L-ARN AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGCU 193-C2-001
6
L-ARN AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGCU 193-G2-001
7
L-ARN AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGCU 193-F2-001
8
L-ARN GCGAGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGC 193-G1-002
9
L-ARN GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGC 193-D2-002
10
L-ARN GCAUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCCC 193-A1-002
11
L-ARN GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAUGGCUGAUCCUAGUCAGGGACGC 193-D3-002
12
L-ARN GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGAGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-B3-002
13
L-ARN GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAAGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-H3-002
14
L-ARN GUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGUUCCUAGUCAGGUAUGC 193-E3-002
15
L-ARN GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUUAGGUACGC 193-D1-002
16
L-ARN GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-C2-002
17
L-ARN CGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACG 193-C2-003
18
L-ARN GUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUAC 193-C2-004
19
L-ARN UGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUA 193-C2-005
20
L-ARN GGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGU 193-C2-006
21
L-ARN GUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGG 193-C2-007
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21-V-XON '03d -S-21.0-20-961.
ooovnoovonovnoonvonooonnvnonvovnonvononoonooo -O3d-eo>l Ofr-,s NdV-1 82
Z 1.0-20-961.
oooooovonovnoonvonooonnvnonvovnonvononooooo NdV-1 Z2
91.0-20-961.
oooooovonovnoonvonooonnvnonvovnonvononooooo NdV-1 92
S 1.0-20-961.
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^1.0-20-961.
oooooovonovnoonvonooonnvnonvovnonvononooooo NdV-1 VZ
91.0-20-961.
ooooooovonovnoonvonooonnvnonvovnonvononoooooo NdV-1 82
21.0-20-961.
ooovnoovonovnoonvonooonnvnonvovnonvononoonooo NdV-1 22
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epuanoag opijdad /nuv :ON ai D3S
8U03-Z0-ZU
9ZZZSZW3
0Ua-26U
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UH-261.
Q0vnvoown00vw0nwon0nvown0vw0nvno0 N3V-1 69
W 0-261.
Q0novoown00vw0nwon0nvown0vw0n0no0 N3V-1 89
ua-26i.
Q0vovoown00vw0nwon0nvown0vw0n0vo0 N3V-1 Z9
OUO-26U
Q0vovoown00vw0nwon0wown0vw0n0no0 N3V-1 99
0U3-26U
O0vovnown00vw0nwon0wown0wwn0no0 N3V-1 S9
60-261.
O0vovnown00vw0nwon0nvown0wwn0no0 N3V-1 t?9
ua-26i.
Q0vovoown00vw0nwon0ovown0vw0n0no0 N3V-1 69
Ol.d-261.
Q0vo0oown00vw0nwon0ovown0vw0n0no0 N3V-1 29
01.0-261.
Q0vovoown00vw0nwon0nvown0vw0n0no0 N3V-1 1.9
U00-0UV-26U
Q0vo0oo0vn00vw0nwon0nvowo0vw0n0no0 N3V-1 09
ooonowonnoooovnnoo N3V-1 6S
ooonowoonoooovnnoo N3V-1 8S
ooonowovnoooovnnoo N3V-1 ZS
ooonovwnoooovn 000 N3V-1 9S
Q0vn00vw0nwon0nvowo0vw N3V-1 SS
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Z 1.0-20-661.
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91.0-20-661.
Qo0000von0vnoonv0no00nnvn0nv0vnonv0n0n0oo00 Nav-a os
S 1.0-20-661.
ooo000von0vnoonv0no00nnvn0nv0vnonv0n0n0Q000 Nav-a 6V
H 0-20-661.
Q0o000von0vnoonv0no00nnvn0nv0vnonv0n0n0o0o0 N3V-a 8fr
61.0-20-661.
O0o0o00von0vnoonv0no00nnvn0nv0vnonv0n0n00o0o0 N3V-a ¿V
eujajuj Bjoueje^ey
epuanoag opijded /i\iav :ON ai D3S
SEQ ID NO:
ARN/ Péptido Secuencia Referencia interna
71
L-ARN GCUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCACAGC 192-E9
72
L-ARN GCUGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-H9
73
L-ARN AGCGUGAAAGUAACACGUAAAAUGAAAGGUAACCACGCU 191-A6
74
L-ARN AAAGYRACAHGUMAAXaUGAAAGGUARC; Xa = A o ausente Fórmula-1 de tipo A
75
L-ARN AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC Fórmula-2 de tipo A
76
L-ARN aaagyracahgumaaaugaaagguarc Fórmula-3 de tipo A
77
L-ARN AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC Fórmula-4 de tipo A
78
L-ARN CUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAG 192-A10-002
79
L-ARN UGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCA 192-A10-003
80
L-ARN GUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGC 192-A10-004
81
L-ARN UGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCG 192-A10-005
82
L-ARN GAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCC 192-A10-006
83
L-ARN AAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGC 192-A10-007
84
L-ARN GCGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCGC 192-A10-008
85
L-ARN GCGCGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCGC 192-A10-015
86
L-ARN GCGGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCCGC 192-A10-014
87
L-ARN CGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCG 192-A10-016
88
L-ARN GCGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGUGC 192-A10-017
89
L-ARN GUGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGCGC 192-A10-018
90
L-ARN CGCGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGUG 192-A10-019
91
L-ARN GGGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGCCC 192-A10-020
92
L-ARN GGCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGCC 192-A10-021
93
L-ARN GCCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGGC 192-A10-022
94
L-ARN CCCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGGG 192-A10-023
SEQ ID NO:
ARN/ Péptido Secuencia Referencia interna
95
L-ARN GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-B2
96
L-ARN AGCGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACGCU 191-D5-001
97
L-ARN GUGUUGCGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCAGCAGCAC 197-H1
98
L-ARN CGUGCGGCCUAAGAGGUUAGGGCUUAAAGUCGGUCUUUGGCCA ACACG 190-D3
99
L-ARN CGUGCGCUUGAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUC UCACG 190-A3-001
100
L-ARN CGUGAUUGGUGAGGGGUUAGGGCUUGAAGUCGGCCUUGUCCAG UCACG 190-A2
101
L-ARN AGCGUGAAGGGGUUAGGGCUCGAAGUCGGCUGACACGCU 191-A5
102
L-ARN GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUCGAAGUCGGCCCGCAGCAC 197-H3
103
L-ARN GUGUUCCCGGGGUUAGGGCUUGAAGUCGGCCGGCAGCAC 197-B1
104
L-ARN GUGUUGCAGGGGUUAGGGCUUGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-E3
105
L-ARN GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUCAAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-H2
106
L-ARN GUGCUGCCGGGGUUAGGGCUAA-AGUCGGCCGACAGCAC 197-D1
107
L-ARN GUGCUGUGGGGGUCAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-D2
108
L-ARN GGUYAGGGCUHRXaAGUCGG; Xa = A o ausente Fórmula-1 de tipo C
109
L-ARN GGUYAGGGCUHRAAGUCGG Fórmula-2 de tipo C
110
L-ARN GGUYAGGGCUHRAGUCGG Fórmula-3 de tipo C
111
L-ARN GGUUAGGGCUHGAAGUCGG Fórmula-4 de tipo C
112
L-ARN UGAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCUCA 190-A3-003
113
L-ARN GAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCUC 190-A3-004
114
L-ARN GGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCU 190-A3-007
115
L-ARN GCGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACGC 191-D5-002
116
L-ARN CGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACG 191-D5-003
0 od|; ep .g-g-einujjoj
yoAsonas>iy N3V-1 Ot^U
0 od|; ep .s-g-einiujoj
AI/\ISSV03NAA N3V-1 601.
0 od|; ©p .g-g-einujjoj
yoANsnas>iy N3V-1 801.
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ooooooooonowovnoooovnnoooooooo N3V-1 Z01
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ooooooooonowovnoooovn noooooooo N3V-1 901.
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oooooooonowovnoooovnnooooooo N3V-1 501.
S00-Z3-Z6I-
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t^00-3a-Z61.
voonooooonowovnoooovnnooooooon N3V-1 001.
0oo-2a-z6i.
ovoonooooonowovnoooovnnooooooono N3V-1 201.
200-2a-z6i.
oovoonooooonowovnoooovnnooooooonoo N3V-1 U0U
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voovoonooooonowovnoooovnnooooooonoon N3V-1 001.
962-^20-50-1.61.
oooooooonowovnoooovnnooooooo N3V-1 621.
662-^20-50-1.61.
oooooooonowovnoooovnnooooooo N3V-1 821.
662-61.0-50-1.61.
oooooooonowovnoooovnnooooooo N3V-1 Z2U
962-Z 1.0-50-1-61.
oooooooonowovnoooovnnooooooo N3V-1 921.
B62-ZUO-SO-U6U
oooooooonowovnoooovnnooooooo N3V-1 521.
^20-50-1.61.
ooooooonowovnoooovnnoooooo N3V-1 t^2U
620-50-1.61.
ooooooonowovnoooovnnoooooo N3V-1 021.
Z 1.0-50-1.61.
ooooooonowovnoooovnnoooooo N3V-1 221.
01.0-50-1.61.
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ZOO-SO-1.61.
oooonooonowovnoooovnnoovoooo N3V-1 021.
900-50-1.61.
ooooonooonowovnoooovnnoovooooo N3V-1 611
500-50-1.61.
oooooonooonowovnoooovnnoovoooooo N3V-1 8W
t¡'00-sa-u6u
ooovoonooonowovnoooovnnoovoooooo N3V-1 Lii
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S00-01.V-261.
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ooooovnoovwonwononvowoovwono Nav-a 291.
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vooooovnoovwonwononvowoovwonon Nav-a 191
200-0 l.V-261.
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6H-261.
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63-261-
oovovooovnoovwonwononvowoovwononoo Nav-a ZSU
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U 0-261-
oonovoownoovwonwononvownovwononoo Nav-a V91
U.a-261.
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01-0-261-
oovovoownoovwonwonowownovwononoo Nav-a 2SU
01-3-261-
oovovnownoovwonwonowownowwnonoo Nav-a 191
60-261-
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ua-26i.
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01-0-261-
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1.00-0 l.V-261.
oovooooovnoovwonwononvowoovwononoo Nav-a 9H
03d -S-800-0 l.V-261.
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frOO-2Ua-96U
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U00-2V-^6U
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0 od|; 0p .g-g-einujjoj
AlAISSVOdNOA NdV-1 ivi
eujajuj
epuanoas opudad /nuv :ON ai D3S
SEQ ID NO:
ARN/ Péptido Secuencia Referencia interna
164
D-ARN GAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCC 192-A10-006
165
D-ARN AAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGC 192-A10-007
166
D-ARN GCGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCGC 192-A10-008
167
D-ARN GCGCGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCGC 192-A10-015
168
D-ARN GCGGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCCGC 192-A10-014
169
D-ARN CGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCG 192-A10-016
170
D-ARN GCGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGUGC 192-A10-017
171
D-ARN GUGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGCGC 192-A10-018
172
D-ARN CGCGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGUG 192-A10-019
173
D-ARN GGGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGCCC 192-A10-020
174
D-ARN GGCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGCC 192-A10-021
175
D-ARN GCCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGGC 192-A10-022
176
D-ARN CCCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGGG 192-A10-023
177
D-ARN GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-B2
178
D-ARN AGCGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACGCU 191-D5-001
179
D-ARN GUGUUGCGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCAGCAGCAC 197-H1
180
D-ARN CGUGCGGCCUAAGAGGÜUAGGGCUUAAAGUCGGUCUUUGGCCA ACACG 190-D3
181
D-ARN CGUGCGCUUGAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUC UCACG 190-A3-001
182
D-ARN CGUGAUUGGUGAGGGGUUAGGGCUUGAAGUCGGCCUUGUCCAG UCACG 190-A2
183
D-ARN AGCGUGAAGGGGUUAGGGCUCGAAGUCGGCUGACACGCU 191-A5
184
D-ARN GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUCGAAGUCGGCCCGCAGCAC 197-H3
185
D-ARN GUGUUCCCGGGGUUAGGGCUUGAAGUCGGCCGGCAGCAC 197-B1
186
D-ARN GUGUUGCAGGGGUUAGGGCUUGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-E3
187
D-ARN GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUCAAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-H2
ze
S00-Z9-Z6I-
oonooooonowovnoooovn nooooooo Nyv-a 21.2
t^00-3a-Z61.
voonooooonowovnoooovnnooooooon Nav-a UZ
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ovoonooooonowovnoooovnnooooooono Nyv-a 0U2
200-2a-z6i.
oovoonooooonowovnoooovnnooooooonoo Nav-a 602
uoo-sa-z6u
voovoonooooonowovnoooovnnooooooonoon Nav-a 802
q62-t?so-sa-u6u
oooooooonowovnoooovnnooooooo Nav-a Z02
B62-t^0-SCH6l.
oooooooonowovnoooovnnooooooo Nav-a 902
B62-61.0-Sa-l.61.
oooooooonowovnoooovnnooooooo Nav-a S02
q62-zi.o-sa-i.6i.
oooooooonowovnoooovnnooooooo Nav-a VOZ
B62-Zl.0-Sa-l.61.
oooooooonowovnoooovnnooooooo Nav-a 802
t?20-sa-|.6l.
ooooooonowovnoooovnnoooooo Nav-a 202
620-SO-U6U
ooooooonowovnoooovnnoooooo Nav-a 1.02
zi.o-sa-i.6i.
ooooooonowovnoooovnnoooooo Nav-a 002
0I.0-S0-I.6I.
ooonooonowovnoooovnnoovooo Nav-a 661.
zoo-sa-i.61.
oooonooonowovnoooovnnoovoooo Nav-a 861.
900-SO-U6U
ooooonooonowovnoooovnnoovooooo Nav-a Z6U
soo-sa-i.61.
oooooonooonowovnoooovnnoovoooooo Nav-a 961.
t700-sa-u6u
ooovoonooonowovnoooovnnoovoooooo Nav-a S6U
eoo-sa-i.61.
oovovoonooonowovnoooovnnoovoooonoo Nav-a V61
200-SO-U6U
ooovovoonooonowovnoooovnnoovoooonooo Nav-a 861.
zoo-ev-06i.
nonnvonoooonovwnnoooovnnoooo Nav-a 261.
froo-ev-06i.
ononnvonoooonovwnnoooovnnoooovnvovo Nav-a 161
eoo-ev-06i.
vononnvonoooonovwnnoooovnnoooovnvovon Nav-a 061.
20-Z61.
ovoovoonooooonowovnoooovonooooononoono Nav-a 681.
ua-z6u
ovoovovoooooonov-wnoooovnnooooooonoono Nav-a 881.
eujajuj Bjoueje^ey
epuanoag opijdad /Nav :ON ai D3S
SEQ ID NO:
ARN/ Péptido Secuencia Referencia interna
213
D-ARN GCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGC 197-B2-006
214
D-ARN GGCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGCC 197-B2-006-31a
215
D-ARN CGCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGCG 197-B2-006-31b
216
D-ARN CGUGGUCCGUUGUGUCAGGUCUAUUCGCCCCGGUGCAGGGCAUC- CGCG 194-A2-001
217
D-ARN GCAGUGUGACGCGGACGUGAUAGGACAGAGCUGAUCCCGCUCA- GGUGAG 196-B12-003
218
D-ARN CAACAGCAGUGUGACGCGGACGUGAUAGGACAGAGCUGAUCCCGCU- CAG 196-B12-004
219
L-ARN 5'-40 kDa-PEG- UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGUAGCGCUGUGCAGAGCU Spiegelmer de control
220
L-ARN CGUGCGCUUGAGAUAGG
221
L-ARN CUGAUUCUCACG
222
L-ARN CUGAUUCUCA
223
L-ARN 5'-40 kDa-PEG-GCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGC 197-B2-006-5'- PEG
224
L-ARN 5'-40 kDa-PEG-CGGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCCCG 191-D5-007- 5'PEG
225
L-ARN 5'-40 kDa-PEG- CGCAUGGACUGAUCCUAGUCGGUUAUGUAGAUCUAGUGUGGUGC G revNOX-A12
5
10
La presente invención se ilustra adicionalmente con las figuras, los ejemplos y la lista de secuencias a partir de las
cuales pueden tomarse otras características, realizaciones y ventajas, en donde
Fig. 1 muestra un alineamiento de secuencias de moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de "tipo
A"
Figs. 2A+B muestran derivados de una molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1, 192-A10-001 (moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de "tipo A");
Fig. 3 muestra un alineamiento de secuencias de moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de "tipo
B";
Figs. 4A+B muestran derivados de moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1, 193-C2-001 y 193-G2-001 (moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de tipo B);
Fig. 5 muestra un alineamiento de secuencias de moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de "tipo
C";
Fig. 6 muestra derivados de una molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1, 190-A3-001 (moléculas de
ácido nucleico que se unen a SDF-1 de "tipo C");
Figs. 7A+B muestran derivados de moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1, 190-D5-001 (moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de "tipo C");
Fig. 8
Fig. 9
5
Fig. 10
10
Fig. 11A
15
Fig. 11B
20
Fig. 12
25
Fig. 13
30
Fig. 14
35
Fig. 15
40
Fig. 16 45
50
Fig. 17
muestra derivados de una molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1, 197-B2 (molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de "tipo C");
muestra moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 adicionales, moléculas a las que se hace referencia, además de otras moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1, como moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de "tipo D";
muestra la eficacia de los Spiegelmers que se unen a SDF-1, 193-G2-012-5'-PEG (también denominado NOX-A12), 197-B2-006-5'-PEG, 191-D5-007-5'-PEG y 191-A10-008-5'-PEG en un ensayo de quimiotaxis con la línea celular Jurkat de linfocitos T de leucemia humana, mediante el cual se permitió que las células migraran hacia SDF-1 humano 0,3 nM preincubado a 37°C con diversas cantidades de los Spiegelmers 193-G2-012-5'-PEG, 197-B2-006-5'-PEG, 191-D5-007-5'-PEG y 191-A10-008-5'-PEG, representadas como porcentaje de control sobre la concentración de los Spiegelmers 193-G2-012-5'- PEG, 197-B2-006-5'-PEG, 191-D5-007-5'-PEG y 191-A10-008-5'-PEG;
muestra la eficacia del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 en un ensayo de quimiotaxis con la línea celular pre-B ALL humana, Nalm-6, en donde se permitió que las células migraran hacia SDF-1 humano 0,3 nM preincubado a 37°C con diversas cantidades del Spiegelmer NOX-A12, representadas como porcentaje de control sobre la concentración del Spiegelmer NOX-A12;
muestra la eficacia del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 en un ensayo de quimiotaxis con la línea celular humana de linfoma de monocitos leucémicos, U9037, en donde se permitió que las células migraran hacia SDF-1 humano 3 nM preincubado a 37°C con diversas cantidades del Spiegelmer NOX-A12, representadas como porcentaje de control sobre la concentración del Spiegelmer NOX- A12;
muestra la eficacia del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 en un ensayo de quimiotaxis con la línea celular humana de leucemia de linfocitos pre-B, BV-173, en donde se permitió que las células migraran hacia SDF-1 humano 3 nM preincubado a 37°C con diversas cantidades del Spiegelmer NOX-A12, representadas como porcentaje de control sobre la concentración del Spiegelmer NOX- A12;
muestra la eficacia del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 en un ensayo de complementación con células CHO que expresan de forma estable CXCR7 y p-arrestina ambos fusionados a un fragmento de p-galactosidasa, en donde los CXCR7 de las células se activaron hacia SDF-1 humano 0,3 nM preincubado a 37°C con diversas cantidades del Spiegelmer NOX-A12, representadas como porcentaje de control sobre la concentración del Spiegelmer NOX-A12;
muestra la inhibición del brote inducido por SDF-1 mediante el Spiegelmer que se une a SDF-1, 193- G2-012-5'-PEG (también denominado NOX-A12) y por el Spiegelmer PEGilado de control en el ensayo de brote en el anillo aórtico, en donde los anillos de la aorta de rata se incrustaban en una matriz de colágeno y se incubaban durante 6 días con SDF-1 con o sin Spiegelmers (a: control; b: SDF-1 10 nM; c: SDF-1 10 nM + Spiegelmer humano que se une a SDF-1 1 pM, 193-G2-012-5'-PEG; d: SDF-1 10 nM + Spiegelmer PEGilado de control 1 pM);
muestra la inhibición del brote inducido por SDF-1 mediante el Spiegelmer que se une a SDF-1, 193- G2-012-5'-PEG (también denominado NOX-A12) y mediante el Spiegelmer PEGilado de control en el ensayo de brote en el anillo aórtico, en donde se muestran los índices de brotes como la media +/- SD de 5 anillos por condición (*: el valor de SDF-1 es significativamente diferente del control (prueba de Mann-Whitney; p= 0,009); **: el valor de SDF-1 + Spiegelmer que se une a SDF-1 humano 193-G2- 012-5'-PEG es significativamente diferente del de SDF-1 (prueba de Mann-Whitney; p= 0,028)
muestra la eficacia del Spiegelmer humano que se une a SDF-1, NOX-A12 para sensibilizar a las células RPMI-8226 MM frente a F-ara-A (fludarabina), en donde células MS-5 confluentes murinas de estroma BM secretoras de SDF-1 se incubaron con el Spiegelmer que se une a SDF-1 humano, NOX- A12 o revNOX-A12 no funcional y, posteriormente, se cocultivaron con células RPMI-8226 MM; las células se trataron con F-ara-A 1 pM durante 40 horas y la viabilidad celular se midió por citometría de flujo utilizando el reactivo ViaCount; las barras de error indican SD, N=5, * p = 0,0134, *** p = 0,0003 (prueba t no emparejada de dos colas);
muestra la eficacia del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 para inhibir la proliferación de células Jurkat en cocultivo con células MS-5 del estroma, en donde las células MS-5 de estroma murino secretoras de SDF-1 se incubaron con concentraciones crecientes del Spiegelmer que se une a SDF- 1, NOX-A12; se añadieron las células Jurkat a la capa de células MS-5 confluentes y se realizaron recuentos de las células después de 40 horas mediante citometría de flujo utilizando el reactivo ViaCount. las barras de error indican SD, N=4, *** p = 0,0008 (prueba t no emparejada de dos colas);
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Fig. 18A+B muestran la eficacia del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 para revertir la adhesión dependiente de la dosis de SDF-1 de las células Jurkat a la fibronectina, en donde las células Jurkat se incubaron con SDF-1 solo (A), con SDF-1 y concentraciones crecientes del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 o con SDF-1 y concentraciones crecientes del Spiegelmer de control revNOX-A12 (B) durante 30 minutos y se sembraron sobre placas recubiertas con fibronectina durante 15 minutos; las células se lavaron posteriormente con los medios y las células fijadas se cuantificaron utilizando el reactivo Cella Titear Gol; las barras de error indican sD.
Ejemplo 1: Ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 humano
A continuación, las expresiones 'ácido nucleico' y 'molécula de ácido nucleico' se utilizan en este documento de una manera sinónima, si no se indica lo contrario. Además, el término y la expresión 'tramo' y 'tramo de nucleótidos' se utilizan en el presente documento de una manera sinónima, si no se indica lo contrario.
Las moléculas de ácido nucleico L que se unen a SDF-1 humano y las respectivas secuencias de nucleótidos se representan en las Figuras 1 a 9. Los ácidos nucleicos se caracterizaron sobre el aptámero, es decir, a nivel de ácido nucleico D, utilizando ensayos de unión competitiva o de captación directa con D-SDF-1 humano biotinilado (protocolo, véase el Ejemplo 3). Los Spiegelmers se sometieron a ensayo con la configuración natural de SDF-1 (L- SDF-1) mediante una medición de la resonancia de plasmón superficial, usando un aparato Biacore 2000 (protocolo, véase el Ejemplo 5) y un ensayo de quimiotaxis con cultivo celular in vitro (protocolo, véase el Ejemplo 4).
Las moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 muestran diferentes motivos de secuencia, tres tipos principales se definen en las Figs. 1,2A y 2B (Tipo A), Figs. 3, 4A y 4B (Tipo B), Figs. 5, 4, 7A, 7B y 8 (Tipo C). Las moléculas de ácido nucleico muestran diferentes motivos de secuencia. Para una definición de motivos de secuencia de nucleótidos, se emplean las abreviaturas de la IUPAC para nucleótidos ambiguos:
S
fuerte G o C;
W
débil A o U;
R
purina G o A;
Y
pirimidina O o c
K
ceto G o U;
M
imino A o C;
B
no A C o U o G;
D
no C A o G o U;
H
no G A o C o U;
V
no U A o C o G;
N
todos A o G o C o U
Si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de ácido nucleico o secuencia de tramos y cajas, respectivamente, se indica en la dirección 5' ^ 3'.
Moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de tipo A
Como se muestra en la Fig. 1, todas las secuencias de moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de tipo A comprenden un tramo central de nucleótidos que está flanqueado por el primer tramo (5')-terminal y el segundo tramo (3')-terminal de nucleótidos (también denominados primer tramo terminal de nucleótidos y segundo tramo de nucleótidos) en donde ambos tramos se pueden hibridar entre sí. Sin embargo, esa hibridación no se proporciona necesariamente en la molécula.
A continuación, las expresiones 'moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de tipo A' y 'ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de tipo A' o 'moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 tipo A' se emplean en el presente documento de una manera sinónima si no se indica lo contrario.
Las secuencias de las cajas o tramos de nucleótidos definidos pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de tipo A, lo que influye en la afinidad de la unión a SDF-1. Basándose en análisis de la unión de los diferentes ácidos nucleicos que se unen a SDF-1, resumidos como ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A, el tramo central de nucleótidos y sus secuencias de nucleótidos tal y como se describen a continuación, son esenciales de forma individual y más preferiblemente en su totalidad para la unión a SDF-1.
El tramo central de nucleótidos de todas las secuencias identificadas de ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A, comparten la secuencia
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(Fórmula-1 de tipo A, SEQ ID NO: 74), en donde Xa está o bien ausente o es 'A'. Si 'A' está ausente, la secuencia de la secuencia de nucleótidos central se puede resumir como Fórmula-2 de Tipo A
(lAAAGYRACAHGUMAA-UGAAAGGUARCl,
SEQ ID NO: 75. Ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo A 191-A6 (secuencia de nucleótidos central:
SEQ ID NO: 54) que es portadora del nucleótido adicional 'A' dentro de la secuencia de nucleótidos central y que todavía se une a SDF-1, permite concluir una secuencia de nucleótidos central alternativa
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Fórmula-3 de Tipo A, SEQ ID NO: 76). A modo de ejemplo para todos los otros ácidos nucleicos de ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A, el ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo A, 192-A10-001, se caracterizó por su afinidad de unión a SDF-1 humano. La constante de unión en equilibrio Kd se determinó usando el ensayo de unión por captación ( Kd = 1,5 nM) y mediante medición de la resonancia de plasmón superficial (Kd = 1,0 nM). La CI 50 (concentración inhibidora del 50%) de 0,12 nM para 192-A10-001 se midió usando un ensayo de quimiotaxis con cultivo de células in vitro. En consecuencia, todos los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A como se representan en la Fig. 1, se analizaron en un ensayo de unión por captación competitiva frente a 192-A10-001. Los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A, 192-B11 y 192-C10 mostraban afinidades de unión iguales a 192- A10-001 en esos experimentos de competición. Se determinó una afinidad de unión más débil para los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A 192-G10, 192-F10, 192-C9, 192-E10, 192-D11, 192-G11, 192-H11 y 191-A6. Los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A 192-D10, 192-E9 y 192-H9 tienen una afinidad de unión mucho más débil que 192-A10-001.
Como se ha mencionado anteriormente, los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A, 192-B11 y 192-C10 mostraban afinidades de unión iguales a las de 192-A10-001. Sin embargo, mostraban ligeras diferencias en la secuencia de nucleótidos del tramo central de nucleótidos. Por lo tanto la secuencia de consenso de las tres moléculas que se unen a SDF-1 con casi la misma afinidad alta, se puede resumir mediante la secuencia de nucleótidos
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(Fórmula-4 de Tipo A, SEQ ID NO: 77)) en donde la secuencia de nucleótidos del tramo central de nucleótidos de 192-A10-001 (secuencia de nucleótidos:
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SEQ ID NO: 84) representa la secuencia de nucleótidos con la mejor afinidad de unión de ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A.
Cinco o seis de los seis nucleótidos del tramo 5'-terminal (también denominado como primer tramo terminal) de ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A, se pueden hibridar con los respectivos cinco o seis nucleótidos de los seis nucleótidos del tramo 3'-terminal (también denominado segundo tramo terminal) para formar una hélice terminal. Aunque estos nucleótidos son variables en varias posiciones, los diferentes nucleótidos permiten la hibridación de cinco o seis de los seis nucleótidos de los tramos extremos 5' y 3' terminales cada uno. Los tramos 5'-terminal y 3'- terminal de ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A como se muestra en la Fig. 1, se pueden resumir en una fórmula genérica para el tramo 5'-terminal ('RSHRYR', Fórmula-5-5' de Tipo A) y para el tramo 3'-terminal ('YRYDSY', Fórmula-5-3' de Tipo A). Los derivados truncados del ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo A 192- A10-001, se analizaron en un ensayo de unión por captación competitiva frente a la molécula original 192-A10-001 y 192-A10-008 (Fig. 2A y 2B). Estos experimentos mostraron que una reducción de los seis nucleótidos terminales (extremo 5': GCUGUG; extremo 3': CGCAGC) de 192-A10-001 a cinco nucleótidos (extremo 5': CUGUG; extremo 3': CGCAG) del derivado de 192-A10-002 se podía realizar sin una reducción de la afinidad de la unión. Sin embargo, el truncamiento a cuatro nucleótidos terminales (extremo 5': UGUG; extremo 3': CGCA; 192-A10-003) o menos (192- A10-004/ -005/ -006/ -007) daba lugar a una afinidad de la unión a SDF-1 reducida (Fig. 2A). Los tramos 5'-terminal y 3'-terminal determinados con una longitud de cinco y cuatro nucleótidos de los derivados del ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A 192-A10-001, como se muestran en las Figs. 2A y 2B, se pueden describir en una fórmula genérica para el tramo 5'-terminal ('X2BBBS', Fórmula-6-5' de Tipo A) y el tramo 3'-terminal ('SBBVX3'; Fórmula-6-3' de Tipo A), en donde X2 está o bien ausente o es 'S' y X3 está o bien ausente o es 'S'.
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La secuencia de nucleótidos de los tramos 5'-terminal y 3'-terminal tiene una influencia sobre la afinidad de la unión de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A. Esto no solo se muestra por los ácidos nucleicos 192-F10 y
192- E10, sino también por los derivados de 192-A10-001 (Fig. 2B). El tramo central de 192-F10 y 192-E10 es idéntico al de 192-B11 y 192-C10, pero comprende ligeras diferencias en el extremo 3' del tramo 5'-terminal y en el extremo 5' del tramo 3'-terminal, lo que da como resultado una afinidad de la unión reducida.
La sustitución de los nucleótidos 5-terminal y 3'-terminal 'CUGUG' y 'CGCAG' del ácido nucleico que se une a SDF- 1 de Tipo A 192-A10-002, mediante 'GCGCG' y 'CGCGC' (192-A10-015) daba como resultado una afinidad de la unión reducida, mientras que las sustituciones por 'GCGUG' y 'CGCGC' (192-A10-008) daban como resultado la misma afinidad de la unión que la que se muestra para 192-A10-002 (Fig. 2B). Además, nueve derivados del ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo A 192-A10-001 (192-A10-014/-015/-016/-017/-018/-019/-020/-021/-022/-023) que eran portadores de cuatro nucleótidos 5-terminal y 3'-terminal respectivamente, se sometieron a ensayo como aptámeros para estudiar su afinidad de la unión frente a 192-A10-001 o su derivado 192-A10-008 (ambos tienen la misma afinidad de unión hacia SDF-1). Todas las moléculas mostraron una afinidad de la unión más débil, mucho más débil o todavía mucho más débil hacia SDF-1 que 192-A10-001 (seis nucleótidos que forman una hélice terminal) o que 192-A10-008 con cinco nucleótidos terminales, respectivamente (Fig. 2B). Por consiguiente, la secuencia y el número de nucleótidos de los tramos 5'-terminal y 3'-terminal son esenciales para una unión eficaz a SDF-1. Como se muestra para los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A 192-A10-002 y 192-A10-08, la combinación preferida de tramos 5'-terminal y 3'-terminal es 'CUGUG' y 'CGCAG' (tramos 5'-terminal y 3'-terminal del ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo A 192-A10-002) y 'GcGuG' y 'CgCgC' (tramos 5'-terminal y 3'-terminal del ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo A 192-A10-008).
Sin embargo, al combinar los tramos 5'-terminal y 3'-terminal de todos los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A sometidos a ensayo, la fórmula genérica para el tramo 5'-terminal de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A es 'X1X2NNBV' (Fórmula-7-5' de Tipo A) y la fórmula genérica para el tramo 3'-terminal de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo A es 'BNBNX3X4' (Fórmula-7-3' de Tipo A), en donde
X1 es 'R' o está ausente, X2 es 'S', X3 es 'S' y X4 es 'Y' o está ausente;
o
X1 está ausente, X2 es 'S' o está ausente, X3 es 'S' o está ausente y X4 está ausente.
Con el fin de prolongar el tiempo de residencia en plasma de los Spiegelmers in vivo, el Spiegelmer 192-A10-008 se acopló covalentemente con un resto de 40 kDa de polietilenglicol (PEG) en el extremo 5' como se describe en el capítulo 2. El resto PEG no influye sobre la potencia de los Spiegelmers para inhibir la quimiotaxis inducida con SDF-1.
Moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de tipo B
Como se describe en la Fig. 3, todas las secuencias de ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de tipo B comprenden un tramo central de nucleótidos que está flanqueado por tramos 5'-terminal y 3'-terminal (también denominados primer y segundo tramo terminal de nucleótidos) que se pueden hibridar entre sí. Sin embargo, esa hibridación no se proporciona necesariamente en la molécula.
A continuación, las expresiones 'moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de tipo B' y ''ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo B o 'moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 tipo B' se emplean en el presente documento de una manera sinónima si no se indica lo contrario.
Las secuencias de las cajas o tramos definidos pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos que se unen a SDF- 1, lo que influye sobre la afinidad de la unión a SDF-1. Basándose en el análisis de la unión de los diferentes ácidos nucleicos que se unen a SDF-1, el tramo central de nucleótidos y sus secuencias de nucleótidos como se describen a continuación, son esenciales de forma individual y más preferiblemente en su totalidad para la unión a SDF-1.
El tramo central de nucleótidos de todas las secuencias identificadas de ácidos nucleicos que se unen a SDF 193- C2-001, 193-G2-001, 193-F2-001, 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002, 193-D3-002, 193-B3-002, 193-H3-002,
193- E3-002 y 193-D1-002 comparten la secuencia
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(Fórmula-1 de Tipo B, SEQ ID NO: 52). Los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 193-G2-001, 193-C2-001 y 193- F2-001 que difieren en una sola posición del tramo central de nucleótidos (secuencia de consenso del tramo central de nucleótidos:
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(Fórmula-2 de Tipo B, SEQ ID NO: 53) se analizaron en un ensayo de unión por captación competitiva frente al ácido nucleico que se une a SDF-1, 192-A10-001 (Kd de 1,5 nM determinada en un ensayo de unión por captación, CI50 de 0,12 nM). Cada uno de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1, 193-G2-001, 193-C2-001 y 193-F2 mostraron una unión a SDF-1 humano superior, en comparación con el ácido nucleico que se une a SDF-1, 192-A10-001, en donde la afinidad de la unión de 193-G2-001 es tan buena como la de 193-C2-001 y 193-F2-001 (Fig. 3). Los datos sugieren que la diferencia en la secuencia de nucleótidos del tramo central de nucleótidos de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1, 193-G2-001, 193-C2-001 y 193-F2-001 no influye sobre la afinidad de unión a SDF-1. Los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1, 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002, 193-D3-002, 193-B3-002, 193-H3- 002, 193-E3-002 y 193-D1-002 mostraron una reducción de la unión a SDF-1 humano en comparación con el ácido nucleico que se une a SDF-1, 193-G2-001. El ácido nucleico que se une a SDF-1, 193-G2-001 se caracterizó por su afinidad de unión a SDF-1 humano. La constante de unión en equilibrio Kd se determinó usando el ensayo de unión por captación (Kd = 0,3 nM). La CI50 (concentración inhibidora del 50%) de 0,08 nM para 193-G2-001 se midió usando un ensayo de quimiotaxis con cultivo de células in vitro.
Cuatro, cinco o seis nucleótidos de los seis nucleótidos del tramo 5'-terminal de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 se pueden hibridar con los respectivos cuatro, cinco o seis de los seis nucleótidos del tramo 3'-terminal de ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 para formar una hélice terminal.
Aunque los nucleótidos son variables en varias posiciones, los diferentes nucleótidos permiten la hibridación de cuatro, cinco o seis nucleótidos de los seis nucleótidos de cada tramo 5'-terminal y 3'-terminal. Los tramos 5'-terminal y 3'-terminal de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 tal y como se muestran en la Fig. 3, se pueden resumir en una fórmula genérica para el tramo 5'-terminal ('X1X2GCRWG' en donde X1 es 'A' o está ausente, X2 es 'G') y del tramo 3'-terminal ('KRYSCX3X4' en donde X3 es 'G', X4 es 'U' o está ausente). Los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002 y 193-D3-002 tienen afinidades de unión más débiles hacia SDF-1, aunque comparten el tramo central de nucleótidos idéntico al de 193-C2-001, 193-G2-001 y 193-F2-001 (Fig. 3). Las propiedades de unión no favorables de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1, 193-G1-002, 193-D2-002, 193- A1-002 y 193-D3-002 pueden ser debidas al número de nucleótidos y a la secuencia de los tramos 5'-terminal y 3'- terminal .
Los derivados truncados de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1, 193-G2-001 y 193-C2-001 fueron analizados en un ensayo de unión por captación competitiva frente a 193-G2-001 y 193-G2-012, respectivamente (Fig. 4A y 4B). Estos experimentos mostraron que una reducción de los seis nucleótidos terminales (extremo 5': AGCGUG; extremo 3': uAcGCU) de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 193-G2-001 y 193-C2-001 a cinco nucleótidos (extremo 5': GCGUG; extremo 3': UACGC) conducía a moléculas con una afinidad de unión similar (193-C2-002 y 193-G2-012). La constante de disociación en equilibrio Kd se determinó usando el ensayo de unión por captación (Kd = 0,3 nM). Un truncamiento a cuatro (extremo 5': CGUG; extremo 3': UACG; 193-C2-003) o menos nucleótidos (193-C2-004, 193-C2-005, 193-C2-006, 193-C2-007) daba como resultado una afinidad de unión menor a SDF-1 que se midió empleando el ensayo de unión por captación competitiva (Fig. 4A). La secuencia de nucleótidos de los cinco nucleótidos terminales en el extremo 3' y 5', respectivamente, influye sobre la afinidad de la unión de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1. La sustitución de los nucleótidos 5'-terminal y 3'-terminal 'GCGUG' y 'UACGC' (193-C2-002, 193-G2-12) por 'GCGCG' y 'CGCGC' (193-G2-013) daba como resultado una afinidad de la unión reducida. Además, se sometieron a ensayo los cuatro derivados diferentes del ácido nucleico que se une a SDF-1, 193-G2-001 con una hélice terminal con una longitud de cuatro nucleótidos de apareamiento de bases (193-G2-014/ -015/ -016/ -017). Todos ellos mostraron una afinidad de unión a SDF-1 reducida (Fig. 4B). Por lo tanto, la secuencia y la longitud de los nucleótidos 5'-terminal y 3'-terminal son esenciales para una unión eficaz a SDF-1. Los tramos 5'- terminal y 3'-terminal con una longitud de cinco y cuatro nucleótidos de los derivados de ácidos nucleicos que se unen a SDF-1,193-C2-003 y 193-G2-012 como se muestran en las Figs. 4A y 4B, se pueden describir en una fórmula genérica para el tramo 5'-terminal ('X1X2SSBS'), en donde X1 está ausente, X2 está o bien ausente o es 'G', y el tramo 3'-terminal ('BVSSX3X4'), y en donde X3 está o bien ausente o es 'C' y X4 está ausente. Como se muestra para los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1,193-G2-001 y 193-C2-01 y sus derivados 193-G2-012 y 193-C2-002, la combinación preferida de tramos 5'-terminal y 3'-terminal es 'X1X2GCGUG' (tramo 5'-terminal) y 'UACGCX3X4' (tramo 3'-terminal), en donde X1 es o bien 'A' o está ausente, X2 es 'G' y X3 es 'C' y 'X4 es 'U' o está ausente.
Sin embargo, al combinar los tramos 5'-terminal y 3'-terminal de todos los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 sometidos a ensayo, la fórmula genérica para el tramo 5'-terminal de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 es 'X1X2SVNS' y fórmula genérica para el tramo 3'-terminal de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 es 'BVBSX3X4', en donde
X1 es 'A' o está ausente, X2 es 'G', X3 es 'C' y X4 es 'U' o está ausente; o X1 está ausente, X2 es 'G' o está ausente, X3 es 'C' o está ausente y X4 está ausente.
Con el fin de prolongar el tiempo de residencia en plasma de los Spiegelmers in vivo, el Spiegelmer 193-G2-012 se acopló covalentemente a un resto de 40 kDa de polietilenglicol (PEG) en el extremo 5' como se describe en el capítulo 2 (molécula de ácido nucleico PEGilada: 193-G2-012-5'-PEG también denominada NOX-A12). El Spiegelmer PEGilado NOX-A12 se analizó en un cultivo celular en un ensayo de quimiotaxis in vitro y se determinó una inhibi
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ción de la quimiotaxis inducida con SDF-1 (CI50 de 0,2 nM). El Spiegelmer PEGilado NOX-A12 se analizó mediante una medición con Biacore y se determinó una constante de unión (Kd) de 0,2 nM.
Moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de tipo C
Como se describe en la Fig. 12 todas las secuencias de ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de tipo C comprenden un tramo central de nucleótidos que está flanqueado por los tramos 5'-terminal y 3'-terminal (también denominados primer tramo terminal y segundo tramo terminal de nucleótidos) que se pueden hibridar entre sí. Sin embargo, esa hibridación no se proporciona necesariamente en la molécula.
A continuación, las expresiones 'moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de tipo C' y ''ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo C o 'moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 Tipo C' se emplean en el presente documento de una manera sinónima si no se indica lo contrario.
Las secuencias de las cajas o tramos definidos pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos que se unen a SDF- 1 de Tipo C, lo que influye en la afinidad de unión a SDF-1. Basándose en el análisis de la unión de los diferentes ácidos nucleicos que se unen a SDF-1, resumidos como ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo C, el tramo central de nucleótidos y su secuencia de nucleótidos tal y como se describen a continuación, son esenciales de forma individual y más preferiblemente en su totalidad para la unión a SDF-1.
El tramo central de nucleótidos de todas las secuencias identificadas de ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo C, comparten la secuencia
GGUYAGGGCUHRXaAGUCGG
(Fórmula-1 de Tipo C, SEQ ID NO: 108), en donde Xa está o bien ausente o es 'A'. Con la excepción del ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo C 197-D1, el tramo central de nucleótidos de todas las secuencias identificadas de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo C, comparten la secuencia de nucleótidos
IGGUYAGGGCUHRAAGUCGG
(Fórmula-2 de Tipo C, SEQ ID NO: 109). El ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo C 197-D1 (tramo central de nucleótidos:
GGUUAGGGCUAA-AGUCGG
(SEQ ID NO: 56) que carece de un nucleótido 'A' en el tramo central de nucleótidos y todavía se une a SDF-1, permite concluir un tramo central de nucleótidos alternativo
(GGU YAGGGCUHR-AGUCGG,
Fórmula-3 de Tipo C, SEQ ID NO: 110). Inicialmente, todos los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo C como se representan en la Fig. 5, se analizaron en un ensayo de unión por captación competitiva frente al ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo A, 192-A10-001 (Kd = 1,5 nM determinada mediante un ensayo de captación y mediciones de la resonancia de plasmón superficial; CI50 = 0,12 nM). Los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo C 191-D5-001, 197-B2, 190-A3-001, 197-H1, 197-H3 y 197-E3 mostraban afinidades de la unión más débiles que 192-A10-001 en experimentos de competencia. Una afinidad de la unión mucho más débil se determinó para 191-A5, 197-B1, 197-D1, 197-H2 y 197-D2 (Fig. 5). Las moléculas o derivados de las mismas se caracterizaron además mediante otros ensayos de unión por captación competitiva, mediciones de resonancia de plasmón y un ensayo de quimiotaxis in vitro. El ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo C, 191-D5-001 se caracterizó por su afinidad de la unión a SDF-1 humano, mientras que la constante de unión en equilibrio Kd se determinó mediante una medición de la resonancia de plasmón superficial (Kd = 0,8 nM). La CI50 (concentración inhibidora del 50%) de 0,2 nM para 191-D5-001 se midió usando un ensayo de quimiotaxis con cultivo de células in vitro. La afinidad de la unión del ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo C, 197-B2 hacia SDF-1 humano se determinó mediante una medición de la resonancia de plasmón superficial (Kd = 0,9 nM), su CI50 (concentración inhibidora al 50%) de 0,2 nM se analizó en un ensayo de quimiotaxis en un cultivo celular in vitro. Estos datos indican que los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo C 191-D5-001 y 197-B2 tienen una afinidad de la unión similar hacia SDF-1 (Fig. 5 y 8).
El ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo C, 190-A3-001 comprende un tramo 5'-terminal de 17 nucleótidos ('CGUGCGCUUGAGAUAGG', SEQ ID NO: 220) y un tramo 3'-terminal de 12 nucleótidos ('CUGAUUCUCACG', SEQ ID NO: 221), en donde por una parte los cuatro nucleótidos en el extremo 5' del tramo 5'-terminal y los cuatro nucleótidos en el extremo 3' del tramo 3'-terminal se pueden hibridar entre sí para formar una hélice terminal. Alternativamente, los nucleótidos 'UGAGA' en el tramo 5'-terminal se pueden hibridar con los nucleótidos 'UCUCA' en el tramo 3'-terminal para formar una hélice terminal. Una reducción a nueve nucleótidos del tramo 5'-('UGAGAUAGG') y a
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diez nucleótidos ('CUGAUUCUC', SEQ ID NO: 222) del tramo 3'-terminal ('CUGAUUCUC') de la molécula 190-A3- 001 no influye sobre la afinidad de la unión a SDF-1 (190-A3-003; Fig. 13). Una reducción a ocho nucleótidos del tramo 5'-terminal ('GAGAUAGG') y a nueve nucleótidos del tramo 3'-terminal ('CUGAUUCUC') de la molécula 190- A3-001 no influye sobre la afinidad de la unión a SDF-1 (190-A3-004; Fig. 6). La constante de unión en equilibrio Kd de 190-A3-004 se determinó usando el ensayo de unión por captación (Kd = 4,6 nM) y mediante una medición con resonancia de plasmón superficial (Kd = 4,7 nM). La CI50 (concentración inhibidora del 50%) de 0,1 nM para 190-A3- 004 se midió usando un ensayo de quimiotaxis con cultivo de células in vitro. Sin embargo el truncamiento a dos nucleótidos en el tramo 5'-terminal conduce a una reducción muy fuerte de la afinidad de la unión (190-A3-007; Fig. 6).
Los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo C, 191-D5-001, 197-B2 y 197-H1 (tramo central de nucleótidos:
imagen8
SEQ ID 57, 197-H3/191-A5 (tramo central de nucleótidos:
iGGUUAGGGCUCGAAGUCGGj
SEQ ID NO: 58 y 197-E3/197-B1 (tramo central de nucleótidos:
GGUUAGGGCUUGAAGUCGGj,
SEQ ID NO: 59, comparten un tramo central de nucleótidos casi idéntico (fórmula-4 de Tipo C; secuencia de nucleó- tidos:
gguuagggcuhgaagucggI
SEQ ID NO: 111). 191-D5-001, 197-B2 y 197-H1 no comparten un tramo 5'-terminal y 3'-terminal similar (197-H3 y 197-E3 tienen el tramo 5'-terminal y 3'-terminal idéntico a 197-B2). Sin embargo, los respectivos diez nucleótidos (197-B2, 197-E3, 197-H3) o nueve de los diez (191-D5-001, 197-H1) nucleótidos del tramo 5'-terminal se pueden hibridar con los respectivos diez (197-B2, 197-E3, 197-H3) o nueve de los diez (191-D5-001, 197-H1) nucleótidos del tramo 3'-terminal (Fig. 5). Por tanto, el tramo 5'-terminal de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo C, 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 y 197-H3 como se han mencionado anteriormente, más 191-A5, 197-B1, 197- H2, 197-D1 y 197-D2 comprenden una secuencia de nucleótidos genérica común de 'RKSBUSNVGR' (Fórmula-5-5' de Tipo C, SEQ ID NO: 138). El tramo 3'-terminal de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo C, 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 y 197-H3 como se han mencionado anteriormente, más 191-A5, 197-B1, 197-H2, 197- D1 y 197-D2 comprenden una secuencia de nucleótidos genérica común de 'YYNRCASSMY' (Fórmula-5-3' de Tipo C, SEQ ID NO: 139), en donde se prefieren los tramos 5'-terminal y 3'-terminal de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo C, 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 y 197-h3. Estos tramos 5'-terminal y 3'-terminal preferidos de los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo C, 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 y 197-H3 se pueden resumir en la fórmula genérica 'RKSBUGSVGR' (Fórmula-6-5' de Tipo C; tramo 5'-terminal, SeQ ID NO: 140) y 'YCNRCASSMY' (Fórmula-6-3' de Tipo C; tramo 3'-terminal, SEQ ID NO: 141).
Los derivados truncados del ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo C, 191-D5-001 se construyeron y se sometieron a ensayo en un ensayo de unión por captación competitiva frente a la molécula original 191-D5-001 (Fig. 7A, Fig. 7B). Al principio, la longitud de los tramos 5'-terminal y 3'-terminal se acortó de diez nucleótidos (191-D5-001) cada uno a siete nucleótidos cada uno (191-D5-004) como se representa en la Fig. 14A, en donde nueve de los diez nucleótidos (191-D5-001) o seis de los siete nucleótidos (191-D5-004) del tramo 5'-terminal y del tramo 3'-terminal, respectivamente se pueden hibridar entre sí. La reducción a siete nucleótidos del tramo 5'-terminal y 3'-terminal respectivamente (en donde seis de los siete nucleótidos se pueden hibridar entre sí) condujo a una reducción de la afinidad de la unión a SDF-1 (191-D5-004). Los tramos terminales del ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo C, 191-D5-004 se modificaron, en donde el nucleótido 'A' no apareado en el tramo 3'-terminal de 191-D5-004 fue sustituido por una 'C' (191-D5-005). Esta modificación dio lugar a una mejora de la unión. Este derivado, ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo C 191-D5-005, mostraba una unión similar a SDF-1 que la de 191-D5-001. Un truncamiento adicional del tramo 5'-terminal y 3'-terminal a cinco nucleótidos respectivamente, condujo a una molécula con una longitud total de 29 nucleótidos (191-D5-007). Debido a las similitudes de 191-D5-001 y los ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo C, 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 191-A5, 197-H3, 197-B1, 197-E3, 197-D1, 197-H2 y 197- D2 y debido a los datos que se muestran para 191-D5-007, se puede suponer que el tramo 5'-terminal y 3'-terminal se puede truncar en principio reduciendo hasta cinco nucleótidos, por lo que la secuencia de nucleótidos 'CGGGA' para el tramo 5'-terminal y 'UCCCG' para el tramo 3'-terminal se analizó con éxito (ácido nucleico que se une a SDF- 1 de Tipo C, 191-D5-007). El ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo C, 191-D5-007, se une sorprendentemente algo mejor a SDF-1 que 191-D5-001 (determinado a nivel de aptámero usando el ensayo de unión competitiva). La constante de unión en equilibrio Kd de 191-D5-007 se determinó usando el ensayo de unión por captación (Kd = 2,2 nM) y mediante una medición con resonancia de plasmón superficial (Kd = 0,8 nM). La CI50 (concentración inhibidora
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del 50%) de 0,1 nM para 191-D5-007 se midió usando un ensayo de quimiotaxis con cultivo de células in vitro. Un truncamiento adicional de ambos tramos terminales fue a cuatro nucleótidos (191-D5-010, Fig.7A).
Otros derivados del ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo C, 191-D5-001 (191-D5-017/-024/-029) que eran portadores de tramos 5'-terminal y 3'-terminal de respectivamente cuatro nucleótidos, también mostraron una reducción de la afinidad de la unión a SDF-1 en el ensayo de unión por captación competitiva frente a 191-D5-007 (Fig. 7B). Tramos 5'-terminal y 3-terminal alternativos con una longitud de respectivamente cinco nucleótidos, se sometieron a ensayo adicionalmente, también (191-D5-017-29a, 191-D5-017-29b, 191-D5-019-29a, 191-D5-024-29a, 191- D5-024-29b). La fórmula genérica de estos derivados para el tramo 5'-terminal es 'XsSSSV' (Fómula-7-5' de Tipo C) y para el tramo 3' es 'BSSSXs' Fórmula-7-3' de Tipo C), en donde Xs está ausente o es S'. Dos de las cinco variantes sometidas a ensayo mostraron una afinidad de la unión a SDF-1 idéntica a la de 191-D5-007 (191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b; Fig. 7B). Las secuencias de los tramos 5'-terminal y 3-terminal de los derivados de 191-D5-001 que muestran la mejor afinidad de unión a SDF-1 y comprenden un tramo 5'-terminal y 3'-terminal de cinco nucleótidos respectivamente (191-D5-007, 191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b) se pueden resumir en una fórmula genérica (tramo 5'-terminal: 'SGGSR', Fórmula-8-5' de Tipo C'; tramo 3'-terminal: , YSCCS', Fórmula-8-3' de Tipo C).
Derivados truncados del ácido nucleico que se une a SDF-1 de Tipo C, 97-B2, se analizaron en un ensayo de unión por captación competitiva frente la molécula original 197-B2 y 191-D5-007 (Fig. 7). Usando el ensayo de unión por captación competitiva frente a 191-D5-007, se mostró que 197-B2 tiene la misma afinidad de unión hacia SDF-1 que 191-D5-007. Los tramos 5'-terminal y 3'-terminal se acortaron sin pérdida de afinidad de la unión desde diez nucleótidos (197-B2) cada uno a cinco nucleótidos cada uno (197-B2-005), en donde los nucleótidos del tramo 5'-terminal y del tramo 3'-terminal se pueden hibridar completamente entre sí. Si el tramo 5'-terminal ('GCGGG') y el tramo 3'- terminal ('CCUGC') de 197-B2-005 se sustituían con 'GCCGG' (tramo 5'-terminal) y con 'cCgGC' (tramo 3'-terminal) de 197-B2-006, la afinidad de la unión a SDF-1 persistía completamente. Debido a que 197-B2 y 191-D5-001 (y sus derivados) comparten la secuencia de nucleótidos central idéntica y se sometieron a ensayo varios derivados de 191-D5 con tramos 5'-terminal y 3'-terminal con una longitud de respectivamente cuatro nucleótidos, se omitió un truncamiento adicional del tramo 5'-terminal y 3'-terminal. Se diseñaron otros dos derivados que comprenden seis nucleótidos en el extremo 5' y 3' (tramos 5'-terminal y 3'-terminal), respectivamente. La afinidad de la unión a SDF-1 de ambas moléculas (197-B2-006-31a y 197-B2-006-31b) es la misma que la que se muestra para 191-D5-007 y 197-B2-006 (Fig. 15). Las secuencias de los tramos 5'-terminal y 3'-terminal de los derivados de 197-B2 que muestran la mejor afinidad hacia SDF-1 y comprenden un tramo 5'-terminal y 3'-terminal de cinco nucleótidos respectivamente, se pueden resumir en una fórmula genérica (tramo 5'-terminal: 'GCSGG', Fórmula-9-5' de Tipo C; tramo 3'- terminal: ,CCKGC', Fómula-9-3' de Tipo C)
Combinando los tramos preferidos 5'-terminal y 3'-terminal de derivados truncados de ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 de Tipo C, 191-D5-001 (tramo 5'-terminal: 'SGGSR', Fórmula-8-5' de Tipo C'; tramo 3'-terminal: ,YSCCS', Fórmula-8-3' Tipo C') y 197-B2 (tramo 5'-terminal: 'GCSGG', Fórmula-9-5' de Tipo C; tramo 3'-terminal: ,CCKGC', Fórmula-9-3' Tipo C), la fórmula genérica preferida común para el tramo 5'-terminal y 3'-terminal es 'SSSSR' (tramo 5'-terminal, Fórmula-10-5' de Tipo C) e 'YSBSS' (tramo 3'-terminal: Fórmula-10-3' de Tipo C
Con el fin de prolongar el tiempo de residencia en plasma in vivo de los Spiegelmers, los Spiegelmers 197-B2-006 y 191-D5-007 se acoplaron de forma covalente a un resto de 40 kDa de polietilenglicol (PEG) en sus extremos 5' como se describe en el capítulo 2. Los Spiegelmers PEGilados 197-B2-006 y 191-D5-007 se analizaron en un cultivo celular en una quimiotaxis in vitro. El resto PEG no influye sobre la potencia de los Spiegelmers para inhibir la quimiotaxis inducida con SDF-1.
Moléculas de ácido nucleico que se unen a SDF-1 de tipo D
Además, se identificaron otros tres ácidos nucleicos que se unen a SDF-1 que no comparten los motivos de unión a SDF-1 de 'Tipo A', 'Tipo B' y 'Tipo C' y se denominan en esta memoria "tipo D". Se analizaron como aptámeros utilizando el ensayo de unión por captación (Fig. 9).
Se ha de entender que cualquiera de las secuencias mostradas en las Figs. 1 a 9 son moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, incluyendo las formas truncadas de las mismas, pero incluyendo también las formas extendidas de las mismas, con la condición, sin embargo, de que las moléculas de ácido nucleico truncadas y extendidas sean todavía capaces de unirse a la diana.
Ejemplo 2: Síntesis y derivatización de aptámeros y Spiegelmers
Síntesis a pequeña escala
Los aptámeros y los Spiegelmers se produjeron mediante síntesis en fase sólida con un sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), utilizando química de la fosforamidita 2'TBDMS RNA (Damha y Ogilvie, 1993). Las fosforamiditas rA(N-Bz), rC(Ac), rG(N-ibu) y rU en la configuración D y L se adquirieron en ChemGenes, Wilmington, MA. Los aptámeros y los Spiegelmers se purificaron por electroforesis en gel.
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Síntesis a gran escala más modificación
Los Spiegelmers se produjeron mediante síntesis en fase sólida con un sintetizador ÁktaPilot100 (Amersham Bios- ciences; General Electric Healthcare, Freiburg) utilizando química de la fosforamidita 2'TBDMS RNA (Damha y Ogil- vie, 1993). Las fosforamiditas L-rA(N-Bz), L-rC(Ac), L-rG(N-ibu) y L-rU se adquirieron en ChemGenes (Wilmington, MA, EE.UU.). El modificador 5'-amino se adquirió en American International Chemicals Inc. (Framingham, MA, EE.UU.). La síntesis de los Spiegelmers se inició sobre L-riboG; L-riboC, L-riboA, L-riboU respectivamente, con un tamaño de poro CPG modificado de 1000 A (Link Technology, Glasgow, GB). Para el acoplamiento (15 min por ciclo), se utilizó benciltiotetrazol 0,3 M (American International Chemicals Inc., Framingham, MA, EE.UU.) en acetoni- trilo y 3,5 equivalentes de la solución de fosforamidita 0,2 M respectiva en acetonitrilo. Se utilizó un ciclo de tapado con sello mediante oxidación. Otros disolventes y reactivos convencionales para la síntesis de oligonucleótidos se adquirieron en Biosolve (Valkenswaard, NL). Los Spiegelmers se sintetizaron DMT-ON; después de la desprotección, se purificaron mediante RP-HPLC preparativa (Wincott F. et al., 1995) usando medio Source15RPC (Amersham). El grupo 5'DMT se eliminó con ácido acético al 80% (90 min a TA). Posteriormente, se añadió solución acuosa de NaOAc 2 M y el Spiegelmer se desaló por filtración con flujo tangencial usando una membrana de celulosa regenerada de 5 K (Millipore, Bedford, MA).
PEGgilación
Con el fin de prolongar el tiempo de residencia en plasma de los Spiegelmers in vivo, los Spiegelmers se acoplaron de forma covalente a un resto de 40 kDa de polietilenglicol (PEG) en el extremo 5'.
Para la PEGilación (para más detalles técnicos del método de PEGilación, véase el documento de solicitud de patente europea EP 1 306 382), los Spiegelmers modificados en 5'-amino purificado se disolvieron en una mezcla de H2O (2,5 ml), DMF (5 ml) y tampón A (5 ml; preparado mezclando ácido cítrico • H2O [7 g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico [2,26 ml] y NaOH 1 M [343 ml] y añadiendo agua hasta un volumen final de 1 1; el pH = 8,4 se ajustó con HCl 1 M).
El pH de la solución de Spiegelmer se llevó a 8,4 con NaOH 1 M. Después, se añadieron 40 kDa de éster de PEG- NHS (JenKem Technology USA Inc., Allen, TX) a 37°C cada 30 minutos en seis porciones de 0,25 equivalentes, hasta que se alcanzó un rendimiento máximo de 75 a 85%. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a 8 - 8,5 con NaOH 1 M durante la adición del éster de PEG-NHS.
La mezcla de reacción se mezcló con 4 ml de solución de urea (8 M) y 4 ml de tampón B (acetato de trietilamonio 0,1 M en H2O) y se calentó a 95°C durante 15 min. El Spiegelmer PEGilado se purificó después mediante RP-HPLC con medio Source 15RPC (Amersham), utilizando un gradiente de acetonitrilo (tampón B; tampón C: acetato de trietilamonio 0,1 M en acetonitrilo). El exceso de PEG eluyó con 5% de tampón C, el Spiegelmer PEGilado con 10 - 15% de tampón C. Las fracciones del producto con una pureza de >95% (como se determinó por HPLC) se combinaron y se mezclaron con 40 ml de NaOAc 3 M. El Spiegelmer PEGilado se desaló mediante filtración en flujo tangencial (membrana de celulosa regenerada de 5 K, Millipore, Bedford MA).
Ejemplo 3: Determinación de las constantes de unión (ensayo de unión por captación)
Ensayo de unión por captación directa
La afinidad de los aptámeros hacia D-SDF-1 humano biotinilado se midió en un formato de ensayo de unión por captación a 37°C. Los aptámeros se marcaron en el 5'-fosfato con una polinucleótido cinasa de T4 (Invitrogen, Karls- ruhe, Alemania) utilizando ATP [y-32P] marcado con (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemania). La radiactividad específica de los aptámeros marcados era 200.000 - 800.000 cpm/pmol. Los aptámeros se incubaron después de la desnaturalización y renaturalización a una concentración de 10, 20, 30 o 40 pM, a 37°C en tampón de selección (Tris-HCl 20 mM pH 7,4; NaCl 137 mM; KCl 5 mM; MgCh 1 mM; CaCh 1 mM; ,0,1% [p/vol] de Tween-20) junto con cantidades variables de D-SDF-1 humano biotinilado durante 4 -12 horas, con el fin de alcanzar el equilibrio a bajas concentraciones. El tampón de selección estaba complementado con 10 pg/ml de albúmina de suero humano (Sig- ma-Aldrich, Steinheim, Alemania) y 10 pg/ml de ARN de levadura (Ambion, Austin, EE.UU.) con el fin de evitar una adsorción de los ligandos con superficies del material de plástico usado o la matriz de inmovilización. El intervalo de concentración de D-SDF-1 humano biotinilado se estableció desde 8 pM a 100 nM; el volumen total de reacción era de 1 ml. El péptido y los complejos péptido-aptámero se inmovilizaron sobre 1,5 pl de partículas de estreptavidina Ultralink Plus (Pierce Biotechnology, Rockford, EE.UU.) que se habían equilibrado previamente con tampón de selección y se resuspendieron en un volumen total de 6 pl. Las partículas se mantuvieron en suspensión durante 30 min a la temperatura respectiva en un termomezclador. La radiactividad inmovilizada se cuantificó en un contador de centelleo después de separar el material sobrenadante y un lavado apropiado. El porcentaje de unión se representó frente a la concentración de D-SDF-1 humano biotinilado y las constantes de disociación se obtuvieron mediante el uso de programas informáticos de algoritmos (GRAFIT; Erithacus Software; Surrey G.B.) asumiendo una estequio- metría de 1:1.
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Ensayo de unión por captación competitiva
Con el fin de comparar los diferentes aptámeros que se unen a D-SDF-1, se realizó un ensayo de clasificación competitiva. Para este fin, el aptámero más afín disponible se marcó radiactivamente (véase más arriba) y sirvió como referencia. Después de la desnaturalización y renaturalización se incubó a 37°C con D-SDF-1 humano biotinilado en 1 ml de tampón de selección en condiciones que dieron lugar a alrededor de un 5 - 10% de unión con el péptido después de la inmovilización y el lavado en agarosa NeutrAvidin o estreptavidina Ultralink Plus (ambas de Pierce) sin competencia. Se añadió un exceso de variantes de aptámeros no marcados de D-ARN desnaturalizados y renaturalizados a diferentes concentraciones (por ejemplo, 2, 10 y 50 nM) con el aptámero de referencia marcado para las reacciones de unión paralelas. Los aptámeros que se iban a someter a ensayo competían con el aptámero de referencia en la unión a la diana, disminuyendo de este modo la señal de unión dependiendo de sus características de unión. El aptámero que se encontró más activo en este ensayo podía servir después como una nueva referencia para un análisis comparativo de variantes adicionales de aptámeros.
Ejemplo 4: Análisis de unión mediante medición de la resonancia de plasmón superficial
El instrumento Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) se utilizó para analizar la unión de los Spiegelmers a SDF-1a humano. Cuando el acoplamiento de SDF-1a humano se iba a realizar a través de grupos amina, SDF-1a humano se dializó frente a agua durante 1 - 2 h (ésteres de celulosa mezclados de Millipore VSWP; tamaño de poro, 0,025 |jM) para eliminar las aminas que interferían. Los chips sensores CM4 (Biacore Ab, Uppsala, Suecia) se activaron antes del acoplamiento de proteínas mediante una inyección de 35 jl de una dilución 1:1 de NHS 0,4 M y EDC 0,1 M con un caudal de 5 jl/min. MCP-1 humana o SDF-1a humano se inyectó entonces en concentraciones de 0,1 - 1,5 jg/ml con un caudal de 2 jl/min hasta que la respuesta del instrumento estaba en el intervalo de 1000 a 2000 UR (unidades relativas). Los ésteres de NHS sin reaccionar se desactivaron mediante una inyección de solución de 35 jl de clorhidrato de etanolamina (pH 8,5) con un caudal de 5 jl/min. El chip sensor se cebó dos veces con tampón de unión y se equilibró a 10 jl/min durante 1 - 2 horas hasta que la línea de base apareció estable. Para todas las proteínas, los parámetros y las constantes de disociación cinética se evaluaron mediante una serie de inyecciones de Spiegelmers a concentraciones de 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 y 0 nM en tampón de selección (Tris- HCl, 20 mM; NaCl 137 mM; KCl 5 mM; CaCh 1 mM; MgCh 1 mM; Tween20, 0,1% [p/v]; pH 7,4). En todos los experimentos, el análisis se realizó a 37°C utilizando el comando Kinject que define un tiempo asociación de 180 y un tiempo de disociación de 360 segundos con un caudal de 10 jl/min. Un análisis de los datos y el cálculo de las constantes de disociación (Kd) se realizó con el programa informático BIAevaluation 3.0 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) usando el algoritmo de ajuste estequiométrico de Langmuir 1:1.
Ejemplo 5: Análisis de la inhibición de la quimiotaxis inducida por SDF-1 mediante Spiegelmers que se unen a SDF-1
La línea celular humana Jurkat de linfocitos T de leucemia Jurkat, la línea celular leucémica de linfoma de monocitos humanos U937, la línea celular humana de leucemia de linfocitos pre-B BV-173 y la línea celular humana pre-B ALL Nalm-6, expresan CXCR4. Mientras que las células Jurkat no expresan CXCR7, las líneas de leucemia BV-173 y U- 937 eran positivas para la expresión de CXCR7. Todas las células utilizadas se obtuvieron de la DSMZ (Braunsch- weig). Todas las líneas celulares se cultivaron a 37°C y 5% de CO2 en medio RPMI 1640 con Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) que contenía suero bovino fetal al 10%, 100 unidades/ml de penicilina y 100 jg/ml de estreptomicina (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Un día antes del experimento, las células se sembraron en un nuevo matraz T175 con una densidad de 0,3 x 106/ml (Jurkat, U937, BV-173) o 0,75 x 106/ml (Nalm-6), respectivamente.
Para el experimento, las células se centrifugaron (5 min a 300 g), se resuspendieron, se contaron y se lavaron una vez con 15 ml de HBH (solución salina equilibrada de Hanks que contenía 1 mg/ml de seroalbúmina bovina y HE- PES 20 mM; Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Después, las células se resuspendieron a 1,33 x 106/ml (Jurkat, U937, BV-173) o 2,67 x 106/ml (Nalm-6), respectivamente. Se permitió que las células migraran a través de las membranas porosas de las placas de filtro durante tres horas hacia una solución que contenía SDF-1 y diversas cantidades de Spiegelmers. Las soluciones de estimulación (SDF-1 + diversas concentraciones de Spiegelmers) se prepararon como soluciones 10X en una placa de 96 tubos de 0,2 ml de perfil bajo. Se pipetearon 212 jl de HBH en los compartimentos inferiores de la placa de transporte y se añadieron 23,5 jl de las soluciones de estimulación. Todas las condiciones se realizaron por triplicado. Después de 20 a 30 minutos, la placa de filtro se insertó en la placa que contenía las soluciones de estimulación y 75 jl de una suspensión de células con 1,33 x 106 /ml o 2,67 x 106/ml, respectivamente, se añadieron a los pocilios de la placa de filtro (1 x 105 o 2 x 105 células/pocillo). A continuación, se permitió que las células migraran durante 3 horas a 37°C. Para la calibración, se añadieron 0, 10 y 30 jl de la suspensión celular a 235, 225 y 205 jl de HBH, respectivamente, en los pocillos de una placa de 96 pocillos distinta. Después de 3 horas de incubación, la placa de inserción se retiró y se añadieron 30 jl de solución de trabajo con resazurina (440 jM en PBS) a los pocillos inferiores y a los pocillos de la placa de calibración. Las placas se incubaron a continuación a 37°C durante 2,5 h. Después de la incubación, 100 jl de cada pocillo fueron transferidos a una placa negra de 96 pocillos.
Para la evaluación, los valores de fluorescencia se corrigieron para la fluorescencia de fondo (sin células en el pocillo). Después se calculó la diferencia entre las condiciones experimentales, con y sin SDF-1. El valor para la muestra sin Spiegelmer (solo SDF-1) se estableció en 100% y los valores para las muestras con Spiegelmer se calcularon
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como porcentaje de este valor. Para una curva de dosis-respuesta los valores en tanto por ciento se representaron frente a la concentración de Spiegelmer y el valor de CI50 (concentración de Spiegelmer a la que está presente un 50% de la actividad sin Spiegelmer) se determinó gráficamente a partir de la curva resultante.
Resultados
Se encontró que SDF-1 humano estimula la migración de las células Jurkat de una manera dependiente de la dosis, con una estimulación semimáxima a aproximadamente 0,3 nM.
Se encontró que SDF-1 humano estimula la migración de las células de la línea celular humana leucémica de linfo- ma de monocitos U937 de una manera dependiente de la dosis, con una estimulación semimáxima a aproximadamente 3 nM.
Se encontró que SDF-1 humano estimula la migración de las células de la línea celular humana de leucemia de linfocitos pre-B VB-173 de una manera dependiente de la dosis, con una estimulación semimáxima a aproximadamente 3 nM.
Se encontró que SDF-1 humano estimula la migración de las células de la línea celular humana pre-B ALL Nalm-6 de una manera dependiente de la dosis, con una estimulación semimáxima a aproximadamente 0,3 nM.
Cuando se permitió que las células migraran hacia una solución que contenía SDF-1 humano más concentraciones crecientes de Spiegelmers que se unen a SDF-1, se observó una inhibición dependiente de la dosis. Los valores respectivos de CI50 de los Spiegelmers sometidos a ensayo según lo especificado en el Ejemplo 1, se determinaron en células Jurkat de la línea celular de leucemia de linfocitos T humanos. Por ejemplo, para el Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 (también denominado 193-G2-012-5'-PEG) se determinó una CI50 de 0,2 nM (Fig. 10). Cuando se utilizó un Spiegelmer de control no específico, en lugar de los Spiegelmers que se unen a SDF-1, no se observó ningún efecto inhibidor hasta 1 pM.
La inhibición de la quimiotaxis inducida por SDF-1 mediante el Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 también se observó en otros tres tipos de células de leucemia diferentes: la línea celular humana de leucemia de linfoma de monocitos U937 (Fig. 11B), la línea celular humana de leucemia de linfocitos pre-B BV-173 (Fig. 12) y la línea celular humana pre-B ALL Nalm-6 (Fig. 11A). Además, tenemos pruebas de que las células de leucemia linfocítica crónica primarias migran hacia SDF-1 y que la quimiotaxis dependiente de SDF-1 es bloqueada eficazmente por NOX-A12.
Las líneas de leucemia BV-173 y U-937 se sometieron a un ensayo positivo también para estudiar la expresión de CXCR7. La potencia del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12, para bloquear la interacción de SDF-1 y CXCR7, se determinó como se muestra en el Ejemplo 6.
Ejemplo 6: Inhibición de la activación de CXCR7 mediante el Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12
Además de CXCR4, SDF-1 también se une al receptor de quimiocinas CXCR7. El potencial inhibitorio del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12, frente a CXCR7 se sometió a un ensayo de complementación con células CHO que expresaban de forma estable CXCR7 y p-arrestina, ambos fusionados a un fragmento de p-galactosidasa (ensayo de p-arrestina PathHunterTM, DiscoveRX, CA, USA). En el momento de la unión de SDF-1, la p-arrestina formaba un complejo con CXCR7 y, esto conducía a una complementación y activación de la p-galactosidasa, que se midió con un sustrato de quimioluminiscencia.
Método
Se sembraron células CHO-K1 de CXCR7 p-arrestina PathHunter eXpress humanas durante 48 horas en medio OCC2 y se estimularon con SDF-1 10 nM y diversas concentraciones del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX- A12, durante 90 minutos. Después de la estimulación, se detectó la señal usando el kit de detección PathHunter y el protocolo recomendado por el fabricante.
Resultados
La estimulación de p-galactosidasa y por lo tanto la activación de CXCR7 con SDF-1 humano 10 nM fue bloqueada eficazmente por el Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 con una CI50 de 5,4 nM (Fig. 13).
Ejemplo 7: Análisis funcional del Spiegelmer que se une a SDF-1 humano, 193-G2-012-5'-PEG en un ensayo de brote de anillo aórtico
Para someter a ensayo si el Spiegelmer que se une a SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG es funcional también en un ensayo estándar de cultivo de órganos con angiogénesis, se realizaron ensayos de brote de anillo aórtico. Este ensayo, en el que se evalúan la longitud y la abundancia de extensiones de tipo vascular procedentes de explantes, se ha convertido en el modelo de cultivo de órganos utilizado más ampliamente para la angiogénesis (Auerbach et al. 2003). Ya se ha mostrado que SDF-1 induce el brote en este tipo de ensayo (Salcedo et al. 1999).
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Aortas de rata se cortaron en anillos, se incluyeron en una matriz de colágeno y se incubaron con SDF-1 y SDF-1 más el Spiegelmer humano que se une a SDF-1, 193-G2-012-5'-PEG o SDF más un Spiegelmer PEGilado no funcional de control que no se une a SDF-1. Después de 6 a 7 días, el brote (es decir, la excrecencia de células endote- liales) se analizó mediante la toma de imágenes y determinación de un índice de brote.
Método
Las aortas de ratas machos se obtuvieron de Bagheri Life Sciences (Berlín, Alemania). Las aortas se prepararon en el momento y se transportaron sobre hielo en medio MCDB 131 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) que contenía 50 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina (ambas de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y 2,5 pg/ml de fungizona (Cambrex, EE.UU.).
Para un experimento, una única aorta se transfirió a una placa de cultivo celular junto con el medio y el tejido conectivo residual se eliminó. A continuación, la aorta se cortó con un bisturí en anillos de aproximadamente 1 a 2 mm de longitud. Los anillos se lavaron a fondo (al menos cinco veces) en medio 199 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y después se colocaron en pocillos de una placa de 24 pocillos, que contenía 450 pl de solución de colágeno por poci- llo. Esta solución de colágeno se preparó mezclando 9 ml de colágeno de cola de rata (3 mg/ml en ácido acético al 0,1%; Sigma, Deisenhofen, Alemania) con 1,12 ml de 10X medio 199 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), 1,12 ml de 10X tampón de colágeno (NaOH 0,05 N, HEPES 200 mM, NaHCO3 260 mM) y 0,6 ml de glutamina 200 mM. Los anillos se orientaron de tal manera que los bordes recortados eran perpendiculares a la parte inferior del pocillo. Se permitió que el colágeno solidificara mediante la incubación de las placas durante al menos una hora a 37°C. A continuación, se añadió 1 ml de medio MCDB131 con adiciones (SDF-1 y Spiegelmers) por pocillo. Los anillos se incubaron después a 37°C durante seis a siete días. Como control de los brotes, los experimentos se realizaron adicionalmente con VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular).
El brote fue documentado mediante la toma de fotografías con una cámara digital. En algunos casos los anillos se fijaron mediante la adición de 1 ml de paraformaldehído al 10% y se almacenaron a 2-8°C para una documentación posterior. Las imágenes se analizaron con el programa informático de procesamiento de imágenes Scion Image. Después de la calibración con ayuda de una imagen tomada de un micrómetro de etapas, se trazó una línea a una distancia de 0,33 mm desde un borde de un anillo. Se generó un histograma de trazo a lo largo de esta línea mediante el programa informático, los histogramas se imprimieron y se contaron los picos (que representaban los brotes que cruzaban la línea). Este número se tomó como índice de los brotes. Se evaluaron 4 a 5 anillos por condición. El análisis estadístico se realizó con WinSTAT de Excel.
Resultados
Se pudo demostrar que SDF-1 induce el brote y que este efecto se podía bloquear con el Spiegelmer que se une a SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG. No se observó un bloqueo de la inducción de brotes a través de SDF-1 con el Spiegelmer PEGilado de control (Fig. 14 y 15).
Ejemplo 8: Efecto del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12, sobre la quimiosensibilización de células de leucemia
Hay pruebas evidentes de que las células de leucemia se pueden proteger de las quimioterapias convencionales mediante una interacción entre sus receptores CXCR4 con SDF-1 secretado por las células del estroma, dentro de microambientes tisulares particulares, tales como el nicho de la médula ósea (abrev. BM). Por lo tanto, dirigir el eje CXCR4-SDF-1 utilizando el Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12, es un enfoque atractivo para interrumpir los efectos protectores de las células del estroma que secretan SDF-1 y para sensibilizar las células de leucemia frente a una quimioterapia posterior.
Con el fin de imitar la interacción in vivo del microambiente de la BM con células de leucemia, se estableció un sistema de cocultivo in vitro con células MS-5 del estroma de BM murinas y la línea celular de mieloma múltiple (abrev. MM) RPMI 8226. El objetivo del experimento era mostrar si el Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12, sensibiliza a las células de MM en cocultivo con células del estroma, frente a los efectos de agentes quimioterapéuticos. Las células del estroma MS-5 que secretan SDF 1 se incubaron con el Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 o revNOX-A12 no funcional. La línea celular de MM RPMI-8226 se añadió a la capa de células del estroma confluentes. Las células se incubaron a continuación con el agente quimioterapéutico F ara A (fludarabina) durante 40 horas. Se midió la viabilidad celular.
Método
La línea de células del estroma murinas MS-5 (ACC 441) se adquirió en la DSMZ, la línea celular de mieloma múltiple RPMI8226 (CCL-155) se adquirió en la ATCC. La línea celular de mieloma múltiple RPMI8226 se mantuvo en medio RPMI 1640 GlutaMAX (Invitrogen) complementado con 10% de FBS (Biochrom) y penicilina-estreptomicina, las células MS-5 se cultivaron en MEM alfa GlutaMAX (Invitrogen) con 10% de FBS y penicilina estreptomicina. Para los experimentos de cocultivo de quimiosensibilización, las células del estroma MS-5 se sembraron el día antes en placas de 24 pocillos (los ocho pocillos interiores) a una concentración de 8 x 104 / ml / pocillo en medio MEM alfa GlutaMAX (+ 10% de FBS) y se incubaron a 37°C en 5% de CO2. La capa de células confluentes del estroma se
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lavó y se añadieron 0,5 ml de medio RPMI 1640 (+ 1% de FBS) a los pocilios. El Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 o revNOX-A12 se añadió posteriormente a los pocillos hasta una concentración final de 100 nM y se incubó durante cuatro horas. Se añadieron 3,5 x 105 células RPMI8226 en medio RPMI 1640 (+ 1% de FBS) a la capa de células del estroma. Cuatro horas más tarde, se añadió 1 pM de F-ara-A (Sigma Aldrich) a las células cuando era indicado. Después de 40 horas de incubación, las células se recogieron en tubos de 15 ml, en primer lugar se recogió el material sobrenadante y luego se tripsinizaron las células fijadas incluyendo las células MS-5. Las células recogidas se lavaron dos veces con PBS (+ 1% de BSA) y se resuspendieron en 2 ml de PBS (+ 1% de BSA). Se transfirieron 150 pl de la suspensión celular a una placa en forma de U de 96 pocillos y después se incubaron con 50 pl de reactivo ViaCount (Millipore) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La viabilidad celular y el número de células se determinaron mediante citometría de flujo usando Guava EasyCyte 6HT/2L (Millipore).
Resultados
La viabilidad celular de las células RPMI-8226 cocultivadas con las células del estroma MS-5 estaba solo ligeramente afectada por el Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12. F-ara-A 1 pM no mostraba ningún efecto significativo sobre la viabilidad de las células RPMI-8226. Sin embargo, cuando NOX-A12 y F-ara-A se combinaban, se observó una disminución sinérgica de la viabilidad celular (Fig. 16). Por tanto, se mostró que el Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 sensibiliza la línea celular de MM RPMI-8226 frente a un tratamiento del agente quimioterapéutico F-ara-A cuando se cocultiva con la línea de células de estroma de BM MS-5. La viabilidad de las células del estroma MS-5 no se ve afectada por F-ara-A ni por NOX-A12 (datos no mostrados). Estos resultados muestran una prueba de principio en el potencial de NOX-A12 para interrumpir los efectos protectores de SDF-1 secretado por las células del estroma de BM.
Ejemplo 9: Efecto del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12, sobre la proliferación de las células de leucemia
El objetivo del experimento era mostrar si el Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12, tiene un impacto sobre la proliferación de las células de leucemia en cocultivo con células del estroma de médula ósea (abrev. BM). Las células del estroma MS-5 murinas que secretan SDF-1 se incubaron con Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 o el Spiegelmer no funcional, revNOX-A12. La línea de linfocitos T leucémicos Jurkat se añadió a la capa de células del estroma confluentes y se incubó durante 40 horas a 37°C y 5% de CO2. La cantidad de células se cuantificó por citometría de flujo utilizando Guava EasyCyte y el reactivo ViaCount.
Método
La línea de células del estroma murinas MS-5 (ACC 441) fue adquirida en la DSMZ y se cultivó en MEM alfa Gluta- MAX (Invitrogen) con 10% de FBS y penicilina-estreptomicina. Para los experimentos de cocultivo de proliferación, las células del estroma MS-5 se sembraron el día antes en placas de 24 pocillos (los ocho pocillos interiores) a una concentración de 8 x 104 / ml / pocillo en medio MEM alfa GlutaMAX (+ 10% de FBS) y se incubaron a 37°C en 5% de CO2. La capa de células del estroma confluentes se lavó y se añadieron 0,5 ml de medio RPMI 1640 (+ 1% de FBS) a los pocillos. El Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12, o el Spiegelmer revNOX-A12 se añadió posteriormente a los pocillos hasta una concentración final de 100 nM y se incubó durante cuatro horas. Se añadieron 2 x 105 células Jurkat (-fase de crecimiento logarítmico; se lavaron una vez) en medio RPMI 1640 (+ 1% de FBS) a la capa de células del estroma confluentes y se incubaron durante 48 horas a 37°C con 5% de CO2. Después las células se recogieron en tubos de 15 ml, las células fijadas se tripsinizaron incluyendo las células MS-5. Las células recogidas se lavaron dos veces con PBS (+ 1% de BSA). Se transfirieron 150 pl de esta suspensión celular a una placa en forma de U de 96 pocillos y después se incubaron con 50 pl de reactivo ViaCount (Millipore) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La viabilidad celular y el número de células se determinaron mediante citometría de flujo usando Guava EasyCyte 6HT/2L.
Resultados
Mientras que 1 nM del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 no mostraba ningún efecto sobre el número de células Jurkat después de 40 horas de cultivo, el número de células se redujo hasta el 20% cuando las células del estroma MS-5 se preincubaron con 10 o 100 nM de Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 (Fig. 17). Por lo tanto, el SDF-1 secretado por las células del estroma estimula aparentemente la proliferación de las células Jurkat. La inducción dependiente de SDF-1 de la proliferación se puede bloquear con el Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12, lo que conduce a la detección de una cantidad inferior de células leucémicas.
Ejemplo 10: Efecto del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12, sobre las propiedades adhesivas de las células de leucemia
La interacción de las células leucémicas con proteínas de la matriz extracelular (abrev. ECM) tiene un papel crucial en la patogénesis de la leucemia. Por lo tanto, se sometió a ensayo el efecto del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12, sobre la adhesión de las células de leucemia sobre la proteína fibronectina de la ECM. La estimulación de la línea de leucemia de linfocitos T Jurkat con SDF-1 condujo a una modulación dependiente de la dosis de la adhesión a fibronectina.
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Métodos
Las células de leucemia de linfocitos T Jurkat (ACC 282) se adquirieron en la DSMZ y se conservaron en medio RPMI 1640 GlutaMAX (Invitrogen) complementado con 10% de FBS (Biochrom) y penicilina-estreptomicina. Para los experimentos de adhesión, placas de cultivo de 96 pocillos se incubaron con 10 pg/ml de fibronectina humana (R&D Systems) en PBS durante 2 horas a 37°C. Las placas se lavaron dos veces con 100 pl de PBS y posteriormente se bloquearon con PBS-BSA (0,1%) durante dos horas a 37°C. Los pocillos se lavaron con medio RPMI. Las células Jurkat de la fase de crecimiento logarítmico se lavaron con medio RPMI (+ 0,1% de BSA) y se incubaron con diversas concentraciones de SDF-1 humano (R&D Systems) y NOX-A12 durante 15 minutos a 37°C. NOX-A12 y SDF-1 se preincubaron durante 30 minutos. Se sembraron 1x 105 células Jurkat estimuladas en placas de 96 pocillos recubiertas con fibronectina y se incubaron durante 30 minutos. A continuación, las placas se lavaron cinco veces con medio RPMI. Las células fijadas se cuantificaron mediante el uso del reactivo Cell Titer Glo (Promega). Para ello, se añadieron 50 pl de medio RPMI a cada pocillo, seguido de 50 pl de reactivo Cell Titer Glo. Las placas se mezclaron durante dos minutos, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos. El número de células se cuantificó mediante la señal de luminiscencia relativa.
Resultados
Concentraciones de bajas a medianas de SDF-1 (1 - 10 nM) disminuían la adhesión de las células Jurkat a la fibronectina, mientras que concentraciones más altas (30 - 300 nM) aumentaban las propiedades adhesivas de las células Jurkat (Fig. 18A). Se mostró que el Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 revertía este efecto, el Spiegel- mer de control revNOX-A12 no lo hacía (Fig. 18B). Por lo tanto, el Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12, podía tener un impacto sobre la interrupción de las interacciones de las células leucémicas con su entorno protector de ECM. Además, este ejemplo podría explicar el desprendimiento dependiente del Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12 y la movilización de las células hematopoyéticas desde el nicho de la médula ósea.
Ejemplo 11: Interrupción de la interacción de las células de mieloma múltiple con el entorno de la médula ósea in vivo para mejorar de este modo la sensibilidad de las células de mieloma múltiple frente a la terapia
El eje SDF-1/CXCR4 tiene un papel importante en la migración dirigida y el tráfico de las células de mieloma múltiple (abrev. MM) hacia la médula ósea (abrev. BM). Por lo tanto, la falta de adhesión de las células de MM del medio de BM circundante a través de la inhibición de SDF-1, aumenta la sensibilidad del MM a los agentes terapéuticos. Azab et al. publicaron un protocolo para someter a ensayo la potencia del inhibidor de CXCR4, AMD3100, para interrumpir la interacción de las células de MM con el entorno de BM in vivo, lo que afecta a la localización de las células de MM, lo que a su vez, potencia la sensibilidad de las células de MM a la quimioterapia. Se informó que el bloqueo del receptor de SDF-1, CXCR4, a través del antagonista específico de CXCR4 conducía a una interrupción de la interacción de las células de MM con el entorno de BM in vivo, a una mayor sensibilidad de las células de MM frente a la terapia y como resultado a una mayor reducción del tumor inducida por bortezomib (Azab et al. 2009). Basándose en este protocolo (Azab et al. 2009), el Spiegelmer que se une a SDF-1, NOX-A12, se somete a ensayo para estudiar su potencia para interrumpir la interacción de las células de MM con el entorno de BM in vivo, mejorando de este modo la sensibilidad de las células de MM frente a la terapia.
Para el modelo animal de MM, se emplean ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID), para lo cual se inyectaron células Luc+/GFP+MM.1S (2 X 106/ratón) en la vena de la cola de los ratones sCiD. Después de 3 a 4 semanas, se detecta una progresión del tumor suficiente mediante la formación de imágenes por bioluminiscencia (para el protocolo, véase Azab et al. 2009). Los ratones se dividen aleatoriamente en 4 grupos: grupo 1, ratones de control (recibieron vehículo: 5% de glucosa); grupo 2, ratones tratados cada dos días con 20 mg/kg de inyección subcutánea de NOX-A12; grupo 3, ratones tratados con una inyección intraperitoneal de bortezomib de 0,5 mg/kg dos veces a la semana; grupo 4, ratones tratados con una inyección intraperitoneal de bortezomib de 0,5 mg/kg dos veces a la semana y cada dos días con una inyección subcutánea de 20 mg/kg de NOX-A12.
La localización de las células tumorales de MM en la médula ósea se determina in vivo con microscopía confocal, usando un anticuerpo anti-SDF marcado con fluorescencia (para el protocolo, véase Azab et al. 2009), en donde la administración de NOX-A12 conduce a una movilización de las células MM desde la médula ósea a la sangre (tal como se determina por citometría de flujo ex vivo; para el protocolo, véase Azab et al. 2009) y a una reducción del crecimiento del tumor cuando se administra junto con bortezomib (mediante una detección in vivo de la bioluminiscencia; para el protocolo, véase Mitsiades et al., 2003; Mitsiades et al., 2004). Los efectos más fuertes sobre el crecimiento tumoral de bortezomib más NOX-A12 en comparación con un tratamiento solo con bortezomib, apoyan los datos del Ejemplo 8 que muestran unos efectos positivos de NOX-12 sobre la quimiosensibilización de las células de MM.
Referencias
Los datos bibliográficos completos de los documentos citados en esta memoria son, si no se indica lo contrario, los siguientes.
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Claims (39)

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    1. Una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 y de bloquear la interacción entre SDF-1 y el receptor de SDF-1, CXCR7, en donde la molécula de ácido nucleico es para uso en un método para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno, o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno, como una terapia complementaria, o para uso como un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, en donde la enfermedad o el trastorno es un cáncer que expresa el receptor de SDF-1, CXCR7.
  2. 2. La molécula de ácido nucleico para uso según la reivindicación 1, en donde el cáncer es un cáncer seleccionado a partir del grupo de cáncer hematológico y tumores sólidos, en donde preferiblemente el cáncer hematológico se selecciona a partir del grupo que comprende leucemia y mieloma y los tumores sólidos se seleccionan a partir del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de mama, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.
  3. 3. La molécula de ácido nucleico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la terapia complementaria sensibiliza al sujeto, por lo que el sujeto sensibilizado es más sensible a una terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno.
  4. 4. La molécula de ácido nucleico para uso según la reivindicación 3, en donde la terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o radiar al sujeto y/o una cirugía y/o una terapia celular.
  5. 5. La molécula de ácido nucleico para uso según la reivindicación 4, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional se selecciona a partir del grupo que comprende un anticuerpo, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, un terpenoide vegetal, un inhibidor de la topoisomerasa, leucovorina, metotrexato, tamoxifeno, sorafenib, lenalidomida, bortezomib, dexametasona, fluorouracilo y prednisona.
  6. 6. La molécula de ácido nucleico para uso según una cualquiera de 1 a 5, en donde el tratamiento o la prevención de la enfermedad o el trastorno se produce mediante la molécula de ácido nucleico inhibiendo la interacción entre SDF- 1 y el receptor de SDF-1, CXCR7.
  7. 7. La molécula de ácido nucleico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende en dirección 5'->3' un primer tramo terminal de nucleótidos, un tramo central de nucleótidos y un segundo tramo terminal de nucleótidos, o un segundo tramo terminal de nucleótidos, un tramo central de nucleótidos y un primer tramo terminal de nucleótidos,
    en donde la molécula de ácido nucleico se selecciona a partir del grupo que comprende una molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B, una molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C, una molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A y una molécula de ácido nucleico que se une a sDF-1 de tipo D;
    en donde el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B comprende la siguiente secuencia de nucleótidos:
    5' GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3' (SEQ ID NO: 52), y
    en donde el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' X1X2SVNS 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BVBSX3X4 3', en donde
    X1 está o bien ausente o es A, X2 es G, X3 es C y X4 está o bien ausente o es U; o
    X1 está ausente, X2 está o bien ausente o es G, X3 está o bien ausente o es C y X4 está ausente;
    en donde el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende la siguiente secuencia de nucleótidos: GGUYAGGGCUHRXaAGUCGG (SeQ ID NO: 108),
    en donde Xa está o bien ausente o es A, y
    en donde el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' RKSBUSNVGR 3' (SEQ ID NO: 138) y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' YYNRCASSMY 3' (SEQ ID NO: 139),
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    en donde el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' XsSSSV 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BSSSXs 3', en donde Xs está o bien ausente o es S,
    o
    en donde el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CGUGCGCUUGAGAUAGG 3' (SEQ iD NO: 220) y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CUGAUUCUCACG 3' (SEQ ID NO: 221);
    o
    el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' UGAGAUAGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CUGAUUCUCA 3' (SEQ ID NO: 222);
    o
    el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GAGAUAGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CUGAUUCUC 3';
    en donde el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' AAAGYRACAHGUMAAXaUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID NO: 74),
    en donde Xa está o bien ausente o es A, y
    en donde el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' X1X2NNBV 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BNBNX3X4 3',
    en donde X1 está o bien ausente o es R, X2 es S, X3 es S y X4 está ausente o es Y,
    o
    X1 está ausente, X2 está o bien ausente o es S, X3 está o bien ausente o es S y X4 está ausente; y
    en donde la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo D comprende una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de SEQ ID NO: 142 a SEQ ID NO: 144.
  8. 8. La molécula de ácido nucleico para uso según la reivindicación 7, en donde el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B comprende la siguiente secuencia de nucleótidos:
    5' GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG 3' (SEQ ID NO: 53).
  9. 9. La molécula de ácido nucleico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en donde el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' X1X2SSBS 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BVSSX3X4 3',
    en donde X1 está ausente, X2 está o bien ausente o es G, X3 está o bien ausente o es C y X4 está ausente, preferiblemente el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GCGUG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' UACGC 3'.
  10. 10. La molécula de ácido nucleico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 22 a SEQ ID NO: 28.
    preferiblemente una cualquiera de SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 28, y
    más preferiblemente una cualquiera de SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 28.
  11. 11. La molécula de ácido nucleico para uso según la reivindicación 7, en donde el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GGUYA- GGGCUHRAAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 109), 5' GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 110) o 5'
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    GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 111), preferiblemente 5' GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 111).
  12. 12. La molécula de ácido nucleico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 11, en donde el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' RKSBUGSVGR 3' (SEQ ID NO: 140) y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' YCNR- CASSMY 3' (SEQ ID NO: 141).
  13. 13. La molécula de ácido nucleico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 11, en donde el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' SGGSR 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de 5' YSCCS 3'.
  14. 14. La molécula de ácido nucleico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 11 a 13, en donde la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 95 a SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 112 a SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 224, y
    preferiblemente una cualquiera de SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 224.
  15. 15. La molécula de ácido nucleico para uso según la reivindicación 7, en donde el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de
    5' AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID NO: 75), o
    5' AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID NO: 76), o
    5' AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID NO: 77), preferiblemente el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID NO: 77).
  16. 16. La molécula de ácido nucleico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 15, en donde el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' X2BBBS 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' SBBVX3 3',
    en donde X2 está o bien ausente o es S y X3 está o bien ausente o es S;
    preferiblemente, el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CUGUG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CGCAG 3';
    o el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GCGUG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CGCGC 3'.
  17. 17. La molécula de ácido nucleico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 15 a 16, en donde la molécula de ácido nucleico que se une a SDF-1 de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 60 a SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78 a SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 a SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89 a SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 145,
    preferiblemente una cualquiera de SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 146, y
    más preferiblemente una cualquiera de SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 146.
  18. 18. La molécula de ácido nucleico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una modificación, en donde la modificación es preferiblemente un resto de alto peso molecular y/o en donde la modificación permite preferiblemente modificar las características de la molécula de ácido nucleico en términos de tiempo de residencia en un cuerpo animal o humano, preferiblemente un cuerpo humano.
  19. 19. La molécula de ácido nucleico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico L.
  20. 20. Una composición farmacéutica que comprende como primer agente farmacéuticamente activo la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y opcionalmente un componente adicional, en
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    donde el componente adicional se selecciona a partir del grupo que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable, un vehículo farmacéuticamente aceptable y un agente farmacéuticamente activo adicional, y en donde la composición farmacéutica es para uso en un método para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, o para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno, o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno, como una terapia complementaria, o para uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, en donde la enfermedad o el trastorno es un cáncer que expresa el receptor de SDF-1, CXCR7.
  21. 21. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 20, en donde la terapia complementaria sensibiliza al sujeto, por lo que el sujeto sensibilizado es más sensible a una terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno.
  22. 22. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 21, en donde la terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o radiar al sujeto y/o una cirugía y/o una terapia celular.
  23. 23. La composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional es un agente farmacéuticamente activo seleccionado a partir del grupo que comprende un anticuerpo, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, preferiblemente vincristina, un terpenoide vegetal, un inhibidor de la topoisomerasa, leucovorina, metotrexato, tamoxifeno, sorafenib, lenalidomi- da, bortezomib, dexametasona, fluorouracilo y prednisona.
  24. 24. La composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde el cáncer es un cáncer seleccionado a partir del grupo de cáncer hematológico y tumores sólidos, en donde preferiblemente el cáncer hematológico se selecciona a partir del grupo de leucemia y mieloma y los tumores sólidos se seleccionan a partir del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de mama, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.
  25. 25. Un medicamento que comprende una o varias unidades de dosificación de al menos un primer agente farmacéuticamente activo, en donde el primer agente farmacéuticamente activo es una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde el medicamento es para uso en un método para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, o para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno, o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno, como una terapia complementaria, o para uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno, en donde la enfermedad o el trastorno es un cáncer que expresa el receptor de SDF-1, CXCR7.
  26. 26. El medicamento para uso según la reivindicación 25, en donde la terapia complementaria sensibiliza al sujeto, por lo que el sujeto sensibilizado es más sensible a una terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno.
  27. 27. El medicamento para uso según la reivindicación 26, en donde la terapia para el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades o el trastorno comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o radiar al sujeto y/o una cirugía y/o una terapia celular.
  28. 28. El medicamento para uso según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en donde el medicamento comprende un agente farmacéuticamente activo adicional, preferentemente una o varias unidades de dosificación de un agente farmacéuticamente activo adicional, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional se selecciona a partir del grupo que comprende un anticuerpo, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, preferiblemente vincristina, un terpenoide vegetal, un inhibidor de la topoisomerasa, leucovorina, metotrexato, tamoxifeno, sorafenib, lenalidomida, bortezomib, dexametasona, fluorouracilo y prednisona.
  29. 29. El medicamento para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en donde el cáncer es un cáncer seleccionado a partir del grupo de cáncer hematológico y tumores sólidos, en donde preferiblemente el cáncer hematológico se selecciona a partir del grupo que comprende leucemia y mieloma y los tumores sólidos se seleccionan a partir del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de mama, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.
  30. 30. Uso de una molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o un trastorno o para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno, como una terapia complementaria, en donde la enfermedad o el trastorno es un cáncer que expresa el receptor de SDF-1, CXCR7.
  31. 31. Uso según la reivindicación 30, en donde la terapia complementaria sensibiliza al sujeto, por lo que el sujeto sensibilizado es más sensible a una terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
  32. 32. Uso según la reivindicación 31, en donde la terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o radiar al sujeto y/o una cirugía y/o una terapia celular.
  33. 33. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, preferiblemente la reivindicación 30, en donde el medicamento se usa en combinación con un agente farmacéuticamente activo adicional, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional es un agente farmacéuticamente activo seleccionado a partir del grupo que comprende un anticuerpo, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, preferiblemente vincristina, un terpenoide vegetal, un inhibidor de la topoisomerasa, leucovorina, metotrexato, tamoxifeno, sorafenib, lenalidomida, bortezomib, dexametasona, fluorouracilo y prednisona.
  34. 34. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, en donde el cáncer es un cáncer seleccionado a partir del grupo de cáncer hematológico y tumores sólidos, en donde preferiblemente el cáncer hematológico se selecciona a partir del grupo que comprende leucemia y mieloma y los tumores sólidos se seleccionan a partir del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de mama, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.
  35. 35. Una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que padece o que tiene riesgo de desarrollar un cáncer que expresa el receptor de SDF-1, CXCR7, en donde el método comprende
    - una etapa a) de administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de la molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20; y
    - una etapa b) de radiar al sujeto y/o una cirugía y/o una terapia celular y/o administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un agente farmacéuticamente activo adicional al sujeto, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional es un agente farmacéuticamente activo seleccionado a partir del grupo que comprende un anticuerpo, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, preferiblemente vincristina, un terpenoide vegetal, un inhibidor de la topoisomerasa, leucovorina, metotrexato, tamoxifeno, sorafenib, lenalidomida, bortezomib, dexametasona, fluorouracilo y prednisona.
  36. 36. La molécula de ácido nucleico para uso según la reivindicación 35, en donde la cantidad farmacéuticamente eficaz de una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a SDF-1 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, se administra como una terapia complementaria o parte de una terapia complementaria.
  37. 37. La molécula de ácido nucleico para uso según la reivindicación 36, en donde la terapia complementaria sensibiliza al sujeto, por lo que el sujeto sensibilizado es más sensible a una terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno.
  38. 38. La molécula de ácido nucleico para uso según la reivindicación 37, en donde la terapia para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad o el trastorno comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o radiar al sujeto y/o una cirugía y/o una terapia celular como se realiza en la etapa b).
  39. 39. La molécula de ácido nucleico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, en donde el cáncer es un cáncer seleccionado a partir del grupo de cáncer hematológico y tumores sólidos, en donde preferiblemente el cáncer hematológico se selecciona a partir del grupo que comprende leucemia y mieloma y los tumores sólidos se seleccionan a partir del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de mama, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.
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