BR112013005664B1

BR112013005664B1 - Ácidos nucleicos que se ligam a sdf-1 e uso dos mesmos no tratamento de câncer

Info

Publication number: BR112013005664B1
Application number: BR112013005664-9A
Authority: BR
Inventors: Werner Purschke; Florian Jarosch; Dirk Eulberg; Sven Klussmann; Klaus Buchner; Christian Maasch; Nicole Dinse; Dirk Zboralski
Original assignee: Noxxon Pharma Ag
Priority date: 2010-09-09
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2021-11-03
Also published as: SG10201506725QA; ES2678497T3; US20160095875A1; US20130310442A1; EP2613789B1; RU2679495C2; RU2013115739A; JP2013540725A; BR112013005664A2; JP6243736B2; AU2011300818A1; AU2011300818B2; EP2613789A1; KR20130114094A; MX357770B; US20160355821A1; CN103108641B; CA2810950A1; DK2613789T3; HK1184699A1

Abstract

ÁCIDOS NUCLEICOS QUE SE LIGAM A SDF-1 E USO DOS MESMOS NO TRATAMENTO DE CÂNCER. A presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de se ligar a SDF-1, preferencialmente, capaz de inibir SDF- 1, em que a molécula de ácido nucleico é para uso em um método para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio, para uso em um método para p tratamento de um indivíduo sofrendo de uma doença ou distúrbio ou em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio com uma terapia adjunta, ou para uso como um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio, sendo que a doença ou distúrbio é câncer.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico que se ligam ao fator 1 derivado de células do estroma - quimiocina CXC (SDF-1), métodos para o tratamento de câncer, e seu uso na fabricação de um medicamento.

Antecedentes da Invenção

O fator 1 derivado de células do estroma [abreviação: SDF-1, si nônimos, CXCL12, PBSF (fator de estimulação de crescimento de células pré-B), TPAR-1 (gene 1 reprimido por TPA), SCYB12, TLSF (fator de estimulação de células de linfoma tímico), hIRH (intercrina humana reduzida em hepatomas)] é uma quimiocina CXC angiogênica que não contém o motivo

ELR típico das quimiocinas tipo IL-8 (Salcedo, Wasserman e outros, 1999; Salcedo e Oppenheim 2003), mas se liga e ativa o receptor acoplado à proteína G CXCR4. Como um resultado de combinação alternativo, há duas formas de SDF-1, SDF-1 α (69 aminoácidos, SEQ ID NO: 1) e SDF-1 β (SEQ ID NO: 2), que, comparada a SDF-1 α carrega cinco aminoácidos adicionais no terminal C (Shirozu, Nakano e outros, 1995).

A conservação da sequência de aminoácido entre SDF-1 de di-ferentes espécies é notável: SDF-1 α humano (SEQ. ID NO: 1) e SDF-1 α mu- rinho (SEQ ID NO: 3) são virtualmente idênticos. Há somente uma única mudança conservative de V para I na posição 18 (Shirozu, Nakano e outros, 25 1995).

Como o receptor de SDF-1 CXCR4 é amplamente expresso em leucócitos, as células dendríticas maduras, células endoteliais, células cere-brais, e megacariócitos, as atividades de SDF-1 são pleiotrópicas. Essa qui-miocina, mais do que qualquer outra identificada até agora, exibe a mais ampla faixa de funções biológicas. Os efeitos funcionais mais significativos de SDF-1 são: - Atuar no órgão-alvo e acoplar células epiteliais a sítios neovas- culares na parte coroide da retina; - SDF-1 é exigido para manter as células-tronco e células proge-nitoras, por exemplo, células progenitoras hematopoiéticas (geralmente CD34+) na medula óssea do adulto; - SDF-1 suporta a proliferação de células pré-B e aumenta o crescimento de células progenitoras B de medula óssea e induz a migração específica de células pré- e pró-B, enquanto não agindo como um quimioa- traente significativo para células maduras; - SDF-1 é um dos quimioatraentes de células T mais eficazes; e t 10 - SDF-1 e seu receptor CXCR4 são essenciais para o desenvolvimento embrionário.

Os níveis de expressão alterados de SDF-1 ou seu receptor CXCR4 ou respostas alteradas em direção às moléculas estão associados com muitas doenças humanas, tal como retinopatia (Brooks, Caballero e 15 outros, 2004; Butler, Guthrie e outros, 2005; Meleth, Agron et al. 2005); câncer de mama (Muller, Homey e outros, 2001 ; Cabioglu, Sahin e outros, 2005), ovários (Scotton, Wilson e outros 2002), pâncreas (Koshiba, Hosotani e outros, 2000), tiroide (Hwang, Chung e outros, 2003) e nasofaringe (Wang, Wu e outros 2005); glioma (Zhou, Larsen e outros 2002); neuroblastoma 20 (Geminder, Sagi-Assif e outros, 2001); leucemia linfocítica crônica de células B (Burger, Tsukada e outros, 2000); síndrome WHIM (WHIM é uma abreviação para Warts, Hipogamaglobulinemia, Infecções, Síndrome de Mielocate- xia) (Gulino, Moratto e outros, 2004; Balabanian, Lagane e outros, 2005b; Kawai, Choi e outros, 2005); síndromes de deficiência imunológica (Arya, 25 Ginsberg e outros, 1999; Marechal, Arenzana-Seisdedos e outros, 1999; Soriano, Martinez e outros, 2002); neovascularização patológica (Salvucci, Yao e outros, 2002; Yamaguchi, Kusano e outros, 2003; Grunewald, Avraham e outros, 2006); inflamação (Murdoch 2000; Fedyk, Jones e outros, 2001; Wang, Guan e outros, 2001); esclerose múltipla (Krumbholz, Theil e outros, 30 2006); artrite reumatoide / osteoartrite (Buckley, Amft e outros, 2000; Kanbe,Takagishi e outros, 2002; Grassi, Cristino e outros, 2004).

Os tumores (incluindo malignidades e neoplasias sólidas e he- matológicas) são não somente massas de células cancerosas: infiltração de tumores com células imunes é uma característica de câncer. Muitos cânceres humanos têm uma rede de quimiocina complexa que influencia na extensão e fenótipo desse infiltrado, bem como o crescimento do tumor, sobre- vida, migração e angiogênese. A maior parte dos tumores sólidos contém células do estroma não malignas. De fato, as células do estroma às vezes são de maior número que as células de câncer. As células do estroma predominantes que são encontradas em cânceres são macrófagos, linfócitos, células endoteliais e fibroblastos.

As células de diferentes tipos de câncer têm perfis diferentes deexpressão de receptor de quimiocina, mas o receptor de SDF-1 CXCR4 é mais geralmente encontrado em células tumorais de camundongos e de humanos: células tumorais de ao menos 23 tipos diferentes de cânceres humanos de origem epitelial, mesenquimal e hematopoiética que expressam CXCR4 (Balkwill 2004) com SDF-1 sendo o único ligante conhecido para CXCR4. À parte da medula óssea e tecido linfoide secundário, onde ele é constitutivamente expresso, SDF-1 é encontrado em sítios de tumor primário em linfomas (Corcione, Ottonello e outros, 2000) e tumores de cérebro tanto de linhagem neuronal quanto de linhagem astrocítica.

Ademais, ele está pre- sente em altos níveis em câncer de ovário (Scotton, Wilson e outros, 2002) e câncer pancreático (Koshiba, Hosotani e outros, 2000), bem como em sítios de metástase em câncer de mama (Muller, Homey e outros, 2001) e câncer de tiroide (Hwang, Chung e outros, 2003), neuroblastoma e malignidades hematológicas (Geminder, Sagi-Assif e outros, 2001).

Além de CXCR4, outro receptor de SDF-1 foi identificado:RDC1/CXCR7 (Balabanian, Lagane e outros, 2005a, Burns, Summers e ou-tros, 2006). Estudos in vitro e in vivo com linhagens de células de câncer de próstata sugerem que alterações na expressão de CXCR7/RDC1 estão as-sociados com atividades adesivas e invasivas aprimoradas em adição a uma vantagem de sobrevida. Estudos in vitro e in vivo mostraram que ambos os receptores para SDF-1, ou seja, CXCR4 e CXCR7 promovem o crescimento de tumor, por exemplo, câncer de mama, glioblastomas, câncer de ovário, neuroblastoma, câncer de pulmão, colorretal e câncer de próstata (Burns e outros, 2006; Li e outros, 2008; Scotton e outros, 2002; Yang e outros, 2008; Zagzag e outros, 2008).

A expressão de CXCR4 e CXCR7 assim parece ser uma carac- 5 terística geral de vários tumores.

O problema que dá suporte à presente invenção é fornecer meios que especificamente interagem com SDF-1, sendo que os meios são a- dequados para a prevenção e/ou tratamento de câncer.

Outro problema que dá suporte à presente invenção é fornecer„ meios que suportem a terapia de câncer, sendo que tal terapia de câncer tipicamente faz uso de quimioterapia e/ou radiação.

Um problema adicional que dá suporte à presente invenção é fornecer meios que seja adequados para usar uma terapia adjunta no trata-mento de câncer.

Um problema ainda adicional que dá suporte à presente invenção é fornecer um meio que seja capaz de quimiossensibilizar um paciente que sofre de câncer e/ou quimiossensibilizar células que formam ou são parte de um câncer.

Esses e outros problemas que dão suporte à presente invenção são resolvidos pelo assunto das reivindicações independentes em anexo. As modalidades preferenciais podem ser obtidas a partir das reivindicações de-pendentes.

Mais especificamente, o problema que dá suporte à presente in-venção é resolvido em um primeiro aspecto que é também a primeira moda- lidade do primeiro aspecto, por uma molécula de ácido nucleico capaz de se ligar a SDF-1, preferencialmente capaz de inibir SDF-1, onde a molécula de ácido nucleico é para uso em um método para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio, para uso em um método para o tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio ou que está em risco de desenvolver a doença ou distúrbio como uma terapia adjunta, ou para uso como um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio, onde a doença ou distúrbio é câncer.

Em uma segunda modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do primeiro aspecto, o câncer é um câncer selecionado a partir do grupo de câncer hematológico, onde preferencialmente o câncer hematológico é selecionado a partir do grupoque consiste em leucemia e mieloma.

Em uma terceira modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da segunda modalidade do primeiro aspecto, a leucemia é selecionada a partir do grupo que compreende leucemia linfoide crônica e leucemia mieloide aguda.

Em uma quarta modalidade do primeiro aspecto, que é tambémuma modalidade da segunda modalidade do primeiro aspecto, o mieloma é mieloma múltiplo.

Em uma quinta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do primeiro aspecto, o câncer é um 15 câncer selecionado a partir do grupo de tumores sólidos, onde preferencialmente os tumores sólidos são selecionados a partir do grupo que compreende glioblastoma, câncer colorretal, câncer de mama, linfoma, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer renal, câncer de ovário e câncer de pulmão.

Em uma sexta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta e quinta modalidade do primeiro aspecto, a terapia adjunta sensibiliza o indivíduo, onde o indivíduo sensibilizado é mais responsivo a uma terapia para o tratamento e/ou prevenção da doença ou distúrbio.

Em uma sétima modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da sexta modalidade do primeiro aspecto, a terapia para o tratamento e/ou prevenção das doenças ou distúrbios compreende administrar um agente farmaceuticamente ativo adicional e/ou irradiar o indivíduo e/ou cirurgia e/ou terapia celular.

Em uma oitava modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da sétima modalidade do primeiro aspecto, o agente far-maceuticamente ativo adicional é selecionado a partir do grupo que compre-ende um anticorpo, um agente alquilante, um antimetabólito, um alcaloide de planta, um terpenoide de planta, um inibidor de topoisomerase, Leucovorin, Metotrexato, Tamoxifeno, Sorafenibe, Lenalidomida, Bortezomibe, Dexame- tasona, Flurouracil e Prednisona.

Em uma nona modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da oitava modalidade do primeiro aspecto, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que compreende Rituximabe, Ofatumumabe, Cetuximabe, Ibritumomabe-Tiuxetano, Tositumomabe, Trastuzumabe, Beva- cizumabe, e Alentuzumabe.

Em uma décima modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da oitava modalidade do primeiro aspecto, o agente alqui- lante é selecionado a partir do grupo que compreende cisplatina, carboplati- na, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, doxorrubicina, doxorrubicina lipossomal, bendamustina, temozolomida e Melfalano.

Em uma décima primeira modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da oitava modalidade do primeiro aspecto, o anti- metabólito é selecionado a partir do grupo que compreende purina- azatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina, e cladribina.

Em uma décima segunda modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da oitava modalidade do primeiro aspecto, o ter-penoide de planta é selecionado a partir do grupo que compreende um taxa- no mais preferencialmente selecionado a partir do grupo que compreende Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina e epotilona.

Em uma décima terceira modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da oitava modalidade do primeiro aspecto, o inibidor de topoisomerase é selecionado a partir do grupo que compreende camptotecina, irinotecano e mitoxantrona.

Em uma décima quarta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda e décima terceira modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico é capaz de bloquear a interação entre SDF-1 e um receptor de SDF-1, onde o receptor de SDF-1 é selecionado a partir do grupo que compreende CXCR4 e CXCR7.

Em uma décima quinta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira e décima quarta modalidade do primeiro aspecto, o tratamento ou prevenção da doença ou distúrbio é causado pela molécula de ácido nucleico inibindo a interação entre SDF-1 e um receptor de SDF-1.

Em uma décima sexta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta e décima quinta modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que compreende uma molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo B, uma molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C, uma molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A e uma molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo D.

Em uma décima sétima modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima sexta modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo B compreende uma extensão central de nucleotídeos, onde a extensão central de nucleotídeos compreende a seguinte sequência de nucleotídeo:5' GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3’ (SEQ ID NO: 52).

Em uma décima oitava modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima sétima modalidade do primeiro aspecto, a extensão central de nucleotídeos compreende a seguinte sequência de nucleotídeo:5' GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG 3’ (SEQ ID NO: 53).

Em uma décima nona modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima sétima e da décima oitava modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo B compreende na direção 5’ -> 3’ uma primeira extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos, e uma segunda extensão terminal de nucleotídeos.

Em uma vigésima modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima sétima e da décima oitava modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo B compreende na direção 5’ -> 3’ uma segunda extensão terminal de nucleotí-deos, a extensão central de nucleotídeos, e uma primeira extensão terminal de nucleotídeos.

Em uma vigésima primeira modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima nona e vigésima modalidade do primeiro aspecto, a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ X1X2SVNS 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ BVBSX3X4 3’, onde Xi está ou ausente ou é A, X2 é G, X3 é C e X4 está ou ausente ou é U; ou X! está ausente, X2 está ou ausente ou é G, X3 está ou ausente ou é C e X4 está ausente.

Em uma vigésima segunda modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima nona, vigésima e vigésima primeira modalidade do primeiro aspecto, preferencialmente a vigésima primeira, a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ X1X2CRWG 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotí-deos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ KRYSX3X4 3’, onde Xi está ausente ou é A, X2 é G, X3 é C e X4 está ou ausente ou é U. Em uma vigésima terceira modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima nona, vigésima, vigésima primeira e vigésima segunda modalidade do primeiro aspecto, preferencialmente a vi-gésima primeira e a vigésima segunda, a primeira extensão terminal de nu-cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ X1X2CGUG 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ UACGX3X4 3’, onde Xi está ou ausente ou é A, X2 é G, X3 é C, e X4 está ou au-sente ou é U, preferencialmente a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ AGCGUG 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotí-deo de 5’ UACGCU 3’.

Em uma vigésima quarta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima nona, vigésima e vigésima primeira modalidade do primeiro aspecto, preferencialmente a vigésima primeira, a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ XÍXZSSBS 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ BVSSX3X4 3’, onde Xi está ausente, X2 está ou ausente ou é G, X3 está ou au-sente ou é C, e X4 está ausente, preferencialmente a primeira extensão ter-minal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ GCGUG 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ UACGC 3’.

Em uma vigésima quinta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima primeira, vigésima segunda, vigésima ter-ceira e vigésima quarta modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo B compreende uma sequência de nucleotídeo de acordo com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 22 a SEQ ID NO: 28, preferencialmente qualquer uma dentre SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 28, mais preferencialmente qualquer uma dentre SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 28.

Em uma vigésima sexta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima sexta modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma extensão central de nucleotídeos, sendo que a extensão central de nu- cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de GGUYAGGGCU- HRXAAGUCGG (SEQ ID NO: 108),onde XA está ou ausente ou é A.

Em uma vigésima sétima modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da vigésima sexta modalidade do primeiro aspecto, a extensão central de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3* (SEQ ID NO: 109), 5' GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 110) ou 5’ GGUUAGGG- CUHGAAGUCGG 3’ (SEQ ID NO: 111), preferencialmente 5' GGUUAGGG- CUHGAAGUCGG 3’ (SEQ ID NO: 111).

Em uma vigésima oitava modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da vigésima sexta e da vigésima sétima modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende na direção 5’ -> 3’ uma primeira extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos, e uma segunda extensão terminal de nucleotídeos.

Em uma vigésima oitava modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da vigésima sexta e vigésima sétima modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende na direção 5’ -> 3’ uma primeira extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos, e uma segunda extensão terminal de nucleotídeos.

Em uma vigésima nona modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da vigésima sexta e da vigésima sétima modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende na direção 5’ -> 3’ uma segunda extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos, e uma primeira extensão terminal de nucleotídeos.

Em uma trigésima modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da vigésima oitava e da vigésima nona modalidade do primeiro aspecto, a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' RKSBUSNVGR 3' (SEQ ID NO: 138) e a segunda extensão de nucleotídeo compreende uma sequência de nucleo-tídeo de 5’ YYNRCASSMY 3' (SEQ ID NO: 139),preferencialmente, a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' RKSBUGSVGR 3' (SEQ ID NO: 140) e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ YCNRCASSMY 3' (SEQ ID NO: 141).

Em uma trigésima primeira modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da vigésima oitava e da vigésima nona modalidade do primeiro aspecto, a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' XsSSSV 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' BSSSXs 3', onde Xs está ou ausente ou é S, preferencialmente, a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ SGGSR 3’ e a segunda extensão de terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucle-otídeo de 5’ YSCCS 3’.

Em uma trigésima segunda modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da vigésima oitava e da vigésima nona modalidade do primeiro aspecto, (a) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ GCCGG 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ CCGGC 3’; ou (b) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CGUGCGCUUGAGAUAGG 3' (SEQ ID NO: 220) e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CUGAUUCUCACG 3' (SEQ ID NO: 221); ou (c) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' UGAGAUAGG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CUGAUUCUCA 3' (SEQ ID NO: 222); ou (d) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GAGAUAGG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CUGAUUCUC 3'.

Em uma trigésima terceira modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da vigésima sexta, vigésima sétima, vigésima oitava, vigésima nona, trigésima, trigésima primeira, e trigésima segunda modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma sequência de nucleotídeo de acordo com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 95 a SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 112 a SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 223 e SEQ ID NO: 224,preferencialmente qualquer um dentre SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 223 e SEQ ID NO: 224.

Em uma trigésima quarta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima sexta modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende uma extensão central de nucleotídeos, onde a extensão central de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' AAAGYRACAHGUMAA- XAUGAAAGGUA C 3' (SEQ ID NO: 74), onde XAestá ou ausente ou é A.

Em uma trigésima quinta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da trigésima quarta modalidade do primeiro aspecto, a extensão central de nucleotídeos compreende uma sequência de nu-cleotídeo de 5 ' AAAG YRAC AHGUM AAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID NO: 75), ou 5’ AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID NO: 76), ou 5* AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3'(SEQ ID NO: 77), preferenci-almente a extensão central de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3‘ (SEQ ID NO: 77).

Em uma trigésima sexta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da trigésima quarta e da trigésima quinta modali-dade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende na direção 5’ -> 3’ uma primeira extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos, e uma segunda extensão terminal de nucleotídeos.

Em uma trigésima sétima modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da trigésima quarta e da trigésima quinta modali-dade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende na direção 5’ -> 3’ uma segunda extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos, e uma primeira extensão terminal de nucleotídeos.

Em uma trigésima oitava modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da trigésima sexta e da trigésima sétima modalidade do primeiro aspecto, a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' X1X2NNBV 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotí-deo de 5' BNBNX3X4 3', onde Xi está ou ausente ou é R, X2 é S, X3 é S e X4 está ou au-sente ou é Y; ou Xi está ausente, X2 está ou ausente ou é S, X3 está ou ausente ou é S; e X4 está ausente.

Em uma trigésima nona modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da trigésima sexta, da trigésima sétima e da trigé-sima oitava modalidade do primeiro aspecto, preferencialmente a trigésima oitava modalidade do primeiro aspecto, a primeira extensão terminal de nu-cleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ RSHRYR 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ YRYDSY 3’, preferencialmente, a primeira extensão ter-minal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ GCUGUG 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ CGCAGC 3’.

Em uma quadragésima modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da trigésima sexta, trigésima sétima e trigésima oitava, preferencialmente a trigésima oitava modalidade do primeiro aspecto, a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ X2BBBS 3’, e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ SBBVX3 3’, onde X2 está ou ausente ou é S e X3 está ou ausente ou é S; preferencialmente, a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ CUGUG 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotí-deo de 5’ CGCAG 3’; ou a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ GCGUG 3’, e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5’ CGCGC 3’.

Em uma quadragésima primeira modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da trigésima quarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima sétima, trigésima oitava, trigésima nona e quadragésima modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende uma sequência de nucleotídeo de acordo com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 60 a SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78 a SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 a SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89 a SEQ ID NO: 94, e SEQ ID NO: 145, preferencialmente qualquer uma dentre SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84, e SEQ ID NO: 146, mais preferencialmente qualquer uma dentre SEQ ID NO: 84 e SEQ ID NO: 146.

Em uma quadragésima segunda modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima sexta modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo D com-preende uma sequência de nucleotídeo de acordo com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 142 a SEQ ID NO: 144.

Em uma quadragésima terceira modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima primeira, vigésima segunda, vigésima terceira, vigésima quarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima sétima, vigésima oitava, vigésima nona, trigésima, trigésima primeira, trigésima segunda, trigésima terceira, trigésima quarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima sétima, trigésima oitava, trigésima nona, quadragésima, quadragésima primeira e quadragésima segunda modalidade do primeiro aspecto, o SDF-1 é SDF-1 humano, onde preferencialmente o SDF-1 humano é SDF-1 humano alfa ou beta, mais preferencialmente o SDF-1 humano é SDF-1 humano alfa.

Em uma quadragésima quarta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima primeira, vigésima segunda, vigésima terceira, vigésima quarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima sétima, vigésima oitava, vigésima nona, trigésima, trigésima primeira, trigésima segunda, trigésima terceira, trigésima quarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima sétima, trigésima oitava, trigésima nona, quadragésima, quadragésima primeira, quadragésima segunda e quadragésima terceira modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico compreende uma modificação, onde a modificação é preferencialmente uma porção de alto peso molecular e/ou onde a modificação preferencialmente permite modificar as características da molécula de ácido nucleico em termos de tempo de residência no corpo humano ou de animal, preferencialmente o corpo humano.

Em uma quadragésima quinta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da quadragésima quarta modalidade do primeiro aspecto, a modificação é selecionada a partir do grupo que compreende uma porção HES, uma porção PEG, modificações biodegradáveis e combinações dessas.

Em uma quadragésima sexta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da quadragésima quinta modalidade do pri- meiro aspecto, a modificação é uma porção PEG consistindo de um PEG linear ou ramificado, onde preferencialmente o peso molecular do PEG linear ou ramificado é de aproximadamente 20.000 a 120.000 Da, mais preferenci-almente de aproximadamente 30.000 a 80.000 Da e mais preferencialmente aproximadamente 40.000 Da.

Em uma quadragésima sétima modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da quadragésima quinta modalidade do primeiro aspecto, a modificação é uma porção HES, onde preferencialmente o peso molecular da porção HES é de aproximadamente 10.000 a 200.000 Da, mais preferencialmente de aproximadamente 30.000 a 170.000 Da e mais preferencialmente aproximadamente 150.000 Da.

Em uma quadragésima oitava modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da quadragésima quarta, quadragésima quinta, quadragésima sexta e quadragésima sétima modalidade do primeiro aspecto, a modificação é acoplada à molécula de ácido nucleico via um li- gante, onde preferencialmente o ligante é um ligante bioestável ou biodegradável.

Em uma quadragésima nona modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da quadragésima quarta, quadragésima quinta, quadragésima sexta, quadragésima sétima e quadragésima oitava modalidade do primeiro aspecto, a modificação é acoplada à molécula de ácido nucleico no nucleotídeo 5’-terminal da molécula de ácido nucleico e/ou no nucleotídeo 3’-terminal da molécula de ácido nucleico e/ou a um nucleotídeo da molécula de ácido nucleico entre o nucleotídeo 5’-terminal da molécula de ácido nucleico e o nucleotídeo 3’-terminal da molécula de ácido nucleico.

Em uma quinquagésima modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima primeira, vigésima segunda, vigésima terceira, vigésima quarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima sétima, vigésima oitava, vigésima nona, trigésima, trigésima primeira, trigésima segunda, trigésima terceira, trigésima quarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima sétima, trigésima oitava, trigésima nona, quadragésima, quadragésima primeira, quadragésima segunda, quadragésima terceira, quadragésima quarta, quadragésima quinta, quadragésima sexta, quadragé-sima sétima, quadragésima sétima, quadragésima oitava e quadragésima nona modalidade do primeiro aspecto, os nucleotídeos da molécula de ácido nucleico ou os nucleotídeos formando a molécula de ácido nucleico são L- nucleotídeos.

Em uma quinquagésima primeira modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima primeira, vigésima segunda, vigésima terceira, vigésima quarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima sétima, vigésima oitava, vigésima nona, trigésima, trigésima primeira, trigésima segunda, trigésima terceira, trigésima quarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima sétima, trigésima oitava, trigésima nona, quadragésima, quadragésima primeira, quadragésima segunda, quadragésima terceira, quadragésima quarta, quadragésima quinta, quadragésima sexta, quadragésima sétima, quadragésima sétima, quadragésima oitava, quadragésima nona e quinquagésima modalidade do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido L-nucleico.

O problema que dá suporte à presente invenção é resolvido em um segundo aspecto que é também a primeira modalidade do segundo aspecto, por uma composição farmacêutica compreendendo como um primeiro agente farmaceuticamente ativo a molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma dentre a primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sé-tima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima primeira, vigésima segunda, vigésima terceira, vigésima quarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima sétima, vigésima oitava, vigésima nona, trigésima, trigésima primeira, trigésima se-gunda, trigésima terceira, trigésima quarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima sétima, trigésima oitava, trigésima nona, quadragésima, quadragé-sima primeira, quadragésima segunda, quadragésima terceira, quadragésima quarta, quadragésima quinta, quadragésima sexta, quadragésima sétima, quadragésima sétima, quadragésima oitava, quadragésima nona, quin-quagésima e quinquagésima primeira modalidade do primeiro aspecto, e opcionalmente um constituinte adicional, onde o constituinte adicional é se-lecionado a partir do grupo que compreende um excipiente farmaceutica- mente aceitável, um carreador farmaceuticamente aceitável e um agente farmaceuticamente ativo adicional, e onde a composição farmacêutica é para uso em um método para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio, ou para uso em um método para o tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio ou que está em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio como uma terapia adjunta, ou para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio, onde a doença ou distúrbio é câncer.

Em uma segunda modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do segundo aspecto, a terapia adjunta sensibiliza o indivíduo, onde o indivíduo sensibilizado é mais respon-sive a uma terapia para o tratamento e/ou prevenção da doença ou distúrbio.

Em uma terceira modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da segunda modalidade do segundo aspecto, a terapia para o tratamento e/ou prevenção da doença ou distúrbio compreende administrar um agente farmaceuticamente ativo adicional e/ou irradiar o indivíduo e/ou cirurgia e/ou terapia celular.

Em uma quarta modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda e terceira modalidade do segundo aspecto, o agente farmaceuticamente ativo adicional é um agente farmaceu-ticamente ativo selecionado a partir do grupo que compreende um anticorpo, um agente alquilante, um antimetabólito, um alcaloide de planta, preferenci-almente vincristina, um terpenoide de planta, um inibidor de topoisomerase, Leucovorina, Metotrexato, Tamoxigeno, Sorafenibe, Lenalidomida, Bortezo- mibe, Dexametasona, Flurouracil e Prednisona.

Em uma quinta modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da quarta modalidade do segundo aspecto, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que compreende Rituximabe, Ofatumumabe, Cetuximabe, Ibritumomabe-Tiuxetano, Tositumomabe, Trastuzumabe, Beva- cizumabe e Alentuzumabe.

Em uma sexta modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da quarta modalidade do segundo aspecto, o agente alqui- lante é selecionado a partir do grupo que consiste em cisplatina, carboplati- na, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, doxorrubicina, doxorrubicina lipossomal, bendamustina, temozolomida e Melfalano.

Em uma sétima modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da quarta modalidade do segundo aspecto, o antimetabólito é selecionado a partir do grupo que compreende purina-azatioprina, mercap- topurina, fludarabina, pentostatina, e cladribina.

Em uma oitava modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da quarta modalidade do segundo aspecto, o terpenoide de planta é selecionado a partir do grupo que compreende um taxano mais pre-ferencialmente selecionado a partir do grupo que compreende Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina e epotilona.

Em uma nona modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da quarta modalidade do segundo aspecto, o inibidor de topoisomerase é selecionado a partir do grupo que compreende camptoteci- na, irinotecano e mitoxantrona.

Em uma décima modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava e nona modalidade do segundo aspecto, o câncer é um câncer selecionado a partir do grupo de câncer hematológico, onde preferencialmente o câncer hematológico é selecionado a partir do grupo de leucemia e mieloma.

Em uma décima primeira modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da décima modalidade do segundo aspecto, a leucemia é selecionada a partir do grupo que compreende leucemia linfoide crônica e leucemia mieloide aguda.

Em uma décima segunda modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da décima modalidade do segundo aspecto, o mie- loma é mieloma múltiplo.

Em uma décima terceira modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava e nona modalidade do segundo aspecto, o câncer é um câncer selecionado a partir do grupo de tumores sólidos, onde preferencialmente os tumores sólidos são selecionados a partir do grupo que compreende glioblastoma, câncer colorretal, câncer de mama, linfoma, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer renal, câncer de ovário e câncer de pulmão.

O problema que dá suporte à presente invenção é resolvido em um terceiro aspecto que é também a primeira modalidade do terceiro aspecto, por um medicamento compreendendo uma ou várias dosagens unitárias de ao menos um primeiro agente farmaceuticamente ativo, onde o primeiro agente farmaceuticamente ativo é uma molécula de ácido nucleico capaz de se ligar a SDF-1, como definido em qualquer uma dentre a primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima primeira, vigésima segunda, vigésima terceira, vigésima quarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima sétima, vigésima oitava, vigésima nona, trigésima, trigésima primeira, trigésima segunda, trigésima terceira, trigésima quarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima sétima, trigésima oitava, trigésima nona, quadragésima, quadragésima primeira, quadragésima segunda, quadragésima terceira, quadragésima quarta, quadragésima quinta, quadragésima sexta, quadragésima sétima, quadragésima sétima, quadra-gésima oitava, quadragésima nona, quinquagésima e quinquagésima primeira modalidade do primeiro aspecto, onde o medicamento é para uso em um método para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio, ou para uso em um método para o tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio ou que está em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio como uma terapia adjunta, ou para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio, onde a doença ou distúrbio é câncer.

Em uma segunda modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do terceiro aspecto, a terapia adjunta sensibiliza o indivíduo, onde o indivíduo sensibilizado é mais responsive a uma terapia para o tratamento e/ou prevenção da doença ou distúrbio.

Em uma terceira modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da segunda modalidade do terceiro aspecto, a terapia para o tratamento e/ou prevenção das doenças ou distúrbio compreende administrar um agente farmaceuticamente ativo adicional e/ou irradiar o indivíduo e/ou cirurgia e/ou terapia celular.

Em uma quarta modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda e da terceira modalidade, prefe-rencialmente a primeira modalidade, do terceiro aspecto, o medicamento compreende um agente farmaceuticamente ativo adicional, preferencialmente uma ou várias dosagens unitárias de um agente farmaceuticamente ativo adicional, onde o agente farmaceuticamente ativo adicional é selecionado a partir do grupo que compreende um anticorpo, um agente alquilante, um an- timetabólito, um alcaloide de planta, preferencialmente vincristina, um terpe- noide de planta, um inibidor de topoisomerase, Leucovorin, Metotrexato, Tamoxifeno, Sorafenibe, Lenalidomida, Bortezomibe, Dexametasona e Flu- rouracil.

Em uma quinta modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da terceira modalidade do terceiro aspecto, o medicamento compreende o agente farmaceuticamente ativo adicional, preferencialmente uma ou várias dosagens unitárias do agente farmaceuticamente ativo adi-cional, onde o agente farmaceuticamente ativo adicional é selecionado a partir do grupo que compreende um anticorpo, um agente alquilante, um an- timetabólito, um alcaloide de planta, preferencialmente vincristina, um terpe- noide de planta, um inibidor de topoisomerase, Leucovorin, Metotrexato, Tamoxifeno, Sorafenibe, Lenalidomida, Bortezomibe, Dexametasona, Flu- rouracil e Prednisona.

Em uma sexta modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da quarta e da quinta modalidade do terceiro aspecto, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que compreende Rituximabe, Ofa- tumumabe, Cetuximabe, Ibritumomabe-Tiuxetano, Tositumomabe, Trastu- zumabe, Bevacizumabe e Alentuzumabe.

Em uma sétima modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da quarta e da quinta modalidade do terceiro aspecto, o agente alquilante é selecionado a partir do grupo que consiste em cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, doxor-rubicina, doxorrubicina lipossomal, bendamustina, temozolomida e Melfala- no.

Em uma oitava modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da quarta e da quinta modalidade do terceiro aspecto, o antimetabólito é selecionado a partir do grupo que compreende purina- azatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina, e cladribina.

Em uma nona modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da quarta e da quinta modalidade do terceiro aspecto, o terpenoide de planta é selecionado a partir do grupo que compreende um taxano mais preferencialmente selecionado a partir do grupo que compreende Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina e epotilona.

Em uma décima primeira modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da quarta e da quinta modalidade do terceiro as-pecto, o inibidor de topoisomerase é selecionado a partir do grupo que com-preende camptotecina, irinotecano e mitoxantrona.

Em uma décima primeira modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona e décima modalidade do terceiro aspecto, o câncer é um câncer selecionado a partir do grupo de câncer hematológico, onde pre-ferencialmente o câncer hematológico é selecionado a partir do grupo que compreende leucemia e mieloma.

Em uma décima segunda modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da décima primeira modalidade do terceiro aspecto, a leucemia é selecionada a partir do grupo que compreende leucemia linfoide crônica e leucemia mieloide aguda.

Em uma décima terceira modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da décima primeira modalidade do terceiro aspecto, o mieloma é mieloma múltiplo.

Em uma décima quarta modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona e décima modalidade do terceiro aspecto, o câncer é um câncer selecionado a partir do grupo de tumores sólidos, onde preferen-cialmente os tumores sólidos são selecionados a partir do grupo que com-preende glioblastoma, câncer colorretal, câncer de mama, linfoma, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer renal, câncer de ovário e câncer de pulmão.

O problema que dá suporte à presente invenção é resolvido em um quarto aspecto que é também a primeira modalidade do quarto aspecto, pelo uso de uma molécula de ácido nucleico como definido em qualquer uma dentre a primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima primeira, vigésima segunda, vigésima terceira, vigésima quarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima sétima, vigésima oitava, vigésima nona, trigésima, trigésima primeira, trigésima segunda, trigésima terceira, trigésima quarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima sétima, trigésima oitava, trigésima nona, quadragésima, quadragésima primeira, quadragésima segunda, quadragésima terceira, quadragésima quarta, quadragésima quinta, quadragésima sexta, quadragésima sétima, qua-dragésima sétima, quadragésima oitava, quadragésima nona, quinquagésima e quinquagésima primeira modalidade do primeiro aspecto, para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio, ou para uso em um método para o tratamento de um indiví duo que sofre de uma doença ou distúrbio ou que está em risco de desen-volver uma doença ou distúrbio como uma terapia adjunta, onde a doença ou distúrbio é câncer.

Em uma segunda modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do quarto aspecto, a terapia adjunta sensibiliza o indivíduo, onde o indivíduo sensibilizado é mais responsivo a uma terapia para o tratamento e/ou prevenção da doença ou distúrbio.

Em uma terceira modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da segunda modalidade do quarto aspecto, a terapia para o tratamento e/ou prevenção das doenças ou distúrbios compreende administrar um agente farmaceuticamente ativo adicional e/ou irradiar o indivíduo e/ou cirurgia e/ou terapia celular.

Em uma quarta modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda e terceira modalidade, preferencialmente a primeira modalidade, do quarto aspecto, o medicamento é usado em combinação com um agente farmaceuticamente ativo adicional, o medi-camento é usado em combinação com um agente farmaceuticamente ativo adicional, onde o agente farmaceuticamente ativo adicional é um agente farmaceuticamente ativo selecionado a partir do grupo que compreende um anticorpo, um agente alquilante, um antimetabólito, um alcaloide de planta, preferencialmente vincristina, um terpenoide de planta, um inibidor de topoi-somerase, Leucovorin, Metotrexato, Tamoxifeno, Sorafenibe, Lenalidomida, Bortezomibe, Dexametasona, Flurouracil e Prednisona.

Em uma quinta modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da terceira modalidade do quarto aspecto, o agente farma-ceuticamente ativo adicional é um agente farmaceuticamente ativo adicional selecionado a partir do grupo que compreende um anticorpo, um agente al-quilante, um antimetabólito, um alcaloide de planta, preferencialmente vin-cristina, um terpenoide de planta, um inibidor de topoisomerase, Leucovorin, Metotrexato, Tamoxifeno, Sorafenibe, Lenalidomida, Bortezomibe, Dexame-tasona, Flurouracil e Prednisona.

Em uma sexta modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da quarta e da quinta modalidade do quarto aspecto, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que compreende Rituximabe, Cetu- ximabe, Ibritumomabe-Tiuxetano, Tositumomabe, Trastuzumabe, Bevacizu- mabe e Alentuzumabe.

Em uma sétima modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da quarta e da quinta modalidade do quarto aspecto, o a- gente alquilante é selecionado a partir do grupo que consiste em cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, doxor-rubicina, doxorrubicina lipossomal, bendamustina, temozolomida e Melfala- no.

Em uma oitava modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da quarta e da quinta modalidade do quarto aspecto, o an- timetabólito é selecionado a partir do grupo que compreende purina- azatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina, e cladribina.

Em uma nona modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da quarta e da quinta modalidade do quarto aspecto, o terpenoi- de de planta é selecionado a partir do grupo que compreende um taxano, mais preferencialmente selecionado a partir do grupo que compreende Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina e epotilona.

Em uma décima primeira modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da quarta e da quinta modalidade do quarto aspecto, o inibidor de topoisomerase é selecionado a partir do grupo que compreende camptotecina, irinotecano e mitoxantrona.

Em uma décima primeira modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da quarta e da quinta modalidade do quarto aspecto, o câncer é um câncer selecionado a partir do grupo de câncer hematológico, onde preferencialmente o câncer hematológico é selecionado a partir do grupo que compreende leucemia e mieloma.

Em uma décima segunda modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da décima primeira modalidade do quarto aspecto, a leucemia é selecionada a partir do grupo que compreende leucemia linfoi- de crônica e leucemia mieloide aguda.

Em uma décima terceira modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da décima primeira modalidade do quarto aspecto, o mieloma é mieloma múltiplo.

Em uma décima quarta modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona e décima modalidade do quarto aspecto, o câncer é um câncer selecionado a partir do grupo de tumores sólidos, onde preferen-cialmente os tumores sólidos são selecionados a partir do grupo que com-preende glioblastoma, câncer colorretal, câncer de mama, linfoma, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer renal, câncer de ovário e câncer de pulmão.

O problema que dá suporte à presente invenção é resolvido em um quinto aspecto que é também a primeira modalidade do quinto aspecto, por um método para o tratamento de um indivíduo que sofre ou está em risco de desenvolver câncer, onde o método compreende: - uma etapa (a) de administrar ao indivíduo uma quantidade far- maceuticamente eficaz de uma molécula de ácido nucleico capaz de se ligar a SDF-1 como definido em qualquer uma dentre a primeira modalidade do quarto aspecto, pelo uso de uma molécula de ácido nucleico como definido em qualquer uma dentre a primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima ter-ceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima primeira, vigésima segunda, vigésima terceira, vigésima quarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima sétima, vigésima oitava, vigésima nona, trigésima, trigésima primeira, trigésima segunda, trigésima terceira, trigésima quarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima sétima, trigésima oitava, trigésima nona, quadragésima, quadragésima primeira, quadragésima segunda, quadragésima terceira, quadragésima quarta, quadragésima quinta, quadragésima sexta, quadragé-sima sétima, quadragésima sétima, quadragésima oitava, quadragésima nona, quinquagésima e quinquagésima primeira modalidade do primeiro aspecto.

Em uma segunda modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do quinto aspecto, o método com-preende: - uma etapa (b) de irradiar o indivíduo e/ou cirurgia e/ou terapia celular e/ou administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um agente farmaceuticamente ativo adicional ao indivíduo, onde o agente far-maceuticamente ativo adicional é um agente farmaceuticamente ativo sele-cionado a partir do grupo que compreende um anticorpo, um agente alqui-lante, um antimetabólito, um alcaloide de planta, preferencialmente vincristina, um terpenoide de planta, um inibidor de topoisomerase, Leucovorin, Me-totrexato, Tamoxifeno, Sorafenibe, Lenalidomida, Bortezomibe, Dexameta- sona, Flurouracil, e Prednisona.

Em uma terceira modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da segunda modalidade do quinto aspecto, a quantidade farmaceuticamente eficaz de uma molécula de ácido nucleico capaz de se ligar a SDF-1 como definido em qualquer uma dentre a primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima primeira, vigésima segunda, vigésima terceira, vigésima quarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima sétima, vigésima oitava, vigésima nona, trigésima, trigésima primeira, trigésima segunda, trigésima terceira, trigésima quarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima sétima, trigésima oitava, trigésima nona, quadragésima, quadragésima primeira, quadragésima segunda, quadragésima terceira, quadragésima quarta, quadragésima quinta, quadra-gésima sexta, quadragésima sétima, quadragésima sétima, quadragésima oitava, quadragésima nona, quinquagésima e quinquagésima primeira mo-dalidade do primeiro aspecto é administrada como uma terapia adjunta ou parte de uma terapia adjunta.

Em uma quarta modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da terceira modalidade do quinto aspecto, a terapia adjunta sensibiliza o indivíduo, onde o indivíduo sensibilizado é mais responsive a uma terapia para o tratamento e/ou prevenção da doença ou distúrbio.

Em uma quinta modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da quarta modalidade do quinto aspecto, a terapia para o tratamento e/ou prevenção da doença ou distúrbio compreende administrar um agente farmaceuticamente ativo adicional e/ou irradiar o indivíduo e/ou cirurgia e/ou terapia celular como executado na etapa (b).

Em uma sexta modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da segunda, terceira, quarta e da quinta modalidade do quinto aspecto, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que compreende Ritu- ximabe, Cetuximabe, Ibritumomabe-Tiuxetano, Tositumomabe, Trastuzuma- be, Bevacizumabe e Alentuzumabe.

Em uma sétima modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da segunda, terceira, quarta e da quinta modalidade do quinto aspecto, o agente alquilante é selecionado a partir do grupo que consiste em cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, doxorrubicina, doxorrubicina lipossomal, bendamustina, temozo- lomida e Melfalano.

Em uma oitava modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da segunda, terceira, quarta e da quinta modalidade do quinto aspecto, o antimetabólito é selecionado a partir do grupo que compreende purina-azatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina, e cla- dribina.

Em uma nona modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da segunda, terceira, quarta e da quinta modalidade do quinto aspecto, o terpenoide de planta é selecionado a partir do grupo que compre-ende um taxano, mais preferencialmente selecionado a partir do grupo que compreende Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina e epotilona.

Em uma décima primeira modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da segunda, terceira, quarta e da quinta modalidade do quinto aspecto, o inibidor de topoisomerase é selecionado a partir do grupo que compreende camptotecina, irinotecano e mitoxantrona.

Em uma décima primeira modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona e décima modalidade do quinto aspecto, o câncer é um câncer selecionado a partir do grupo de câncer hematológico, onde preferencialmente o câncer hematológico é selecionado a partir do grupo que compreende leucemia e mieloma.

Em uma décima segunda modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da décima primeira modalidade do quinto aspecto, a leucemia é selecionada a partir do grupo que compreende leucemia linfoi- de crônica e leucemia mieloide aguda.

Em uma décima terceira modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da décima primeira e da décima segunda modali-dade do quinto aspecto, o mieloma é mieloma múltiplo.

Em uma décima quarta modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona e décima modalidade do quinto aspecto, o câncer é um câncer selecionado a partir do grupo de tumores sólidos, onde preferen-cialmente os tumores sólidos são selecionados a partir do grupo que com-preende glioblastoma, câncer colorretal, câncer de mama, linfoma, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer renal, câncer de ovário e câncer de pulmão.

Como não desejam estar limitados por qualquer teoria, os pre-sentes inventores concluíram que as moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção inibem a ligação de SDF-1 a seus receptores de SDF-1 e assim, direta ou indiretamente, são usadas para o tratamento de câncer. Ademais, os presentes inventores concluíram que as moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção são adequadas para blo-quear a interação de SDF-1 com os receptores de SDF-1 CXCR4 e CXCR7, respectivamente. Até agora, a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF- 1 de acordo com a presente invenção não pode ser vista como antagonista de CXCR4 e CXCR7, respectivamente.

Como para as várias doenças, condições e distúrbios que podem ser tratados ou prevenidos através do uso de moléculas de ácido nucle- ico de acordo com a presente invenção ou composições, preferencialmente composições farmacêuticas compreendendo as mesmas, sabe-se que tais doenças, condições e distúrbios são aqueles que são descritos aqui, incluin-do e em particular, aqueles descritos e apresentados na parte introdutória do presente pedido. As respectivas passagens formam uma parte integrada da presente descrição ensinando a adequabilidade das moléculas de ácido nu-cleico para a prevenção e tratamento, respectivamente, para as ditas doenças, condições e distúrbios.

Como usado aqui, o termo SDF-1 refere-se a qualquer SDF-1 incluindo, mas não limitado a SDF-1 de mamífero. Preferencialmente, o SDF-1 de mamífero é selecionado a partir do grupo que compreende camundongo, rato, coelho, hamster, macaco e SDF-1 humano. Mais preferencialmente, o SDF-1 é SDF-1 humano também chamado de SDF-1 α (SEQ ID NO: 1) e/ou SDF-1 β (SEQ ID NO: 2), mais preferencialmente SDF-1 humano também como SDF-1 α (SEQ ID NO: 1).

O SDF-1 age através de dois receptores diferentes, os receptores CXCR4 e RDC1/CXCR7 (Balabanian, Lagane e outros, 2005a, Summers e outros, 2006) (ver a parte introdutória do presente pedido). A expressão elevada de CXCR4 e CXCR7 foi mostrada para vários tipos de câncer, como descrito aqui.

Como o SDF-1 age através de dois receptores diferentes, um tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado a SDF-1 por um composto específico para um dos dois receptores de SDF-1 CXCR4 e CXCR7: (a) deveria ser menos eficaz devido aos dois receptores de SDF- 1 diferentes expressos nas células, preferencialmente células de câncer; (b) é limitado a uma população distinta de células, preferencial-mente a uma população distinta de células de câncer, devido aos receptores de SDF-1 individuais expressos nas células.

Câncer é um termo para neoplasmas malignos, um grupo grande e heterogêneo de doenças no qual as células exibem crescimento des-controlado, invasão e frequentemente metástase, onde as células de câncer se espalham para outras localizações no corpo, os nódulos linfáticos regio- nais ou sítios do corpo distantes como cérebro, osso, fígado, ou outros órgãos. Essas três propriedades malignas do câncer diferenciam os tumores malignos dos tumores benignos, onde, como usado aqui, o termo câncer deveria também abranger tumores malignos que, por sua vez, são também chamados aqui de tumores. Os tumores malignos estão em duas categorias com base em sua origem: tumores hematológicos e tumores sólidos. Os tumores hematológicos são tipos de câncer que afetam o sangue, medula óssea, e nódulos linfáticos. Os tumores sólidos são formados por um crescimento anormal de células de tecido do corpo que não o sangue, medula óssea e células linfáticas.

As formas preferenciais de câncer são as seguintes: Carcinoma adrenocortical Cânceres relacionados à AIDS tal como Sarcoma de Kaposi e Linfoma Câncer anal Câncer de apêndice Tumor Teratoide/Rabdoide atípico Carcinoma basocelular Câncer do duto biliar, Extra-hepático Câncer de bexiga Câncer nos ossos Osteossarcoma Histiocitoma fibroso maligno Glioma de hastes do cérebro Tumor no cérebro tal como astrocitomas, tumores no cérebro e medula espinhal, glioma de hastes do cérebro, tumor teratoide/rabdoide atípico do sistema nervoso central, tumores embrionários do sistema nervoso central, craniofaringioma, ependimoblastoma, ependimoma, meduloblasto- ma, meduloepitelioma, tumores parenquimais pineais de diferenciação in-termediária, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais e pineo- blastoma Câncer de mama Tumores brônquicos Tumor carcinoide Carcinoma de sítio primário desconhecido Câncer do sistema nervoso central tal como tumor teratoi- de/rabdoide atípico e linfoma Câncer cervical Câncer infantil Cordoma Distúrbios mieloproliferativos crônicos Câncer de cólon Câncer colorretal Craniofaringioma Linfoma de células T cutâneas Tumores embrionários Câncer endometrial Ependimoblastoma Ependimoma Câncer esofageal Estesioneuroblastoma Família de tumores de Sarcoma de Ewing Tumor de células germinativas extracranianas Tumor de células germinativas extragonadais Câncer do duto biliar extra-hepático Câncer no olho tal como melanoma intraocular e retinoblastoma Histiocitoma fibroso dos ossos Osteossarcoma Câncer de vesícula Câncer gástrico (estômago) T umor carcinoide gastrointestinal Tumores estromais gastrointestinais (GIST) Tumor de células germinativas (extracranianas, extragonadais ou ovarianas) Tumor trofoblástico gestacional Glioma Leucemia de células pilosas Câncer de cabeça e pescoço Câncer de coração Câncer hepatocelular (fígado) Histiocitose Câncer hipofaringeal Melanoma intraocular Tumores de células das ilhotas (pâncreas endócrino) Sarcoma de Kaposi Câncer dos rins Histiocitose de células de Langerhans Câncer laringeal Leucemia tal como leucemia linfoblástica aguda (abrev. ALL), leucemia mieloide aguda (abrev. AML), leucemia linfocítica crônica (abrev. CLL), leucemia mielógena crônica (abrev. CML) e leucemia de células pilosas Câncer da cavidade oral e bábios Câncer de fígado (primário) Carcinoma lobular in situ (LCIS) Câncer de pulmão Linfoma tai como linfoma relacionado à AIDS, Burkitt, micose fungoide e Síndrome de Sézary, Hodgkin, Não Hodgkin e leucemia do sistema nervoso central primário (abrev. SNC) Macroglobulinemia Histiocitoma fibroso maligno de ossos e Osteossarcoma Meduloblastoma Meduloepitelioma Melanoma Carcinoma de células de Merkel Mesotelioma Câncer escamoso metastático de pescoço com sítio primário o- culto Carcinoma de linha média envolvendo gene NUT Câncer de boca Síndromes de neoplasia endócrina múltipla Mieloma múltiplo Micose fungoide Síndromes mielodisplásicas Neoplasmas mielodisplásicos/mieloproliferativos Distúrbios mieloproliferativos Câncer do sino paranasal e cavidade nasal Câncer nasofaringeal Neuroblastoma Câncer de células não pequenas do pulmão Câncer oral Câncer da cavidade oral Câncer orofaringeal Osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno dos ossos Câncer dos ovários Câncer pancreático Papilomatose Paraganglioma Câncer do sino paranasal e da cavidade nasal Câncer de paratireoide Câncer do pênis Câncer faringeal Feocromocitoma Tumores parenquimais pineais de diferenciação intermediária Pineoblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supra- tentoriais Tumor da pituitária Neoplasma de células do plasma/mieloma múltiplo Blastoma pleuropulmonar, infantil Linfoma do sistema nervoso central primário (abrev. SNC) Câncer de próstata Câncer retal Câncer de células renais (rins) Câncer de células transicionais, pélvis renal e ureter Retinoblastoma Rabdomiossarcoma Câncer das glândulas salivares Sarcoma tal como a família de tumores de Sarcoma de Ewing, Sarcoma de Kaposi, Sarcoma dos tecidos moles, sarcoma uterino Câncer de pele tal como melanoma, carcinoma de células de Merkel e não-melanoma Câncer de pequenas células do pulmão Câncer do intestino delgado Sarcoma de tecidos moles Carcinoma de células escamosas Câncer de células escamosas do pescoço Câncer do estômago (gástrico) Tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais Linfoma de células T Câncer testicular Câncer de garganta Timoma e carcinoma tímico Câncer de tireoide Câncer de células transicionais da pélvis renal e ureter Tumor trofoblástico, gestacional Câncer uretral Câncer uterino, endometrial Sarcoma uterino Câncer vaginal Câncer vulvar Macroglobulinemia de Waldenstrom Tumor de Wilms O eixo SDF-1 - CXCR4 mostrou desempenhar uma função na mobilização de células-tronco incluindo células-tronco cancerosas, vasculo- gênese, crescimento de tumor e metástase. O receptor de SDF-1 CXCR4 é expresso em uma variedade de cânceres e malignidades hematológicas in vivo como é CXCR7 (Maksym, Tarnowski e outros, 2009; Wang, Shiosawa e outros, 2008; Miao, Lucker e outros, 2007). O sinal de crescimento e invasão para células tumorais é SDF-1, em particular, se as células expressam os receptores para SDF-1 (Batchelor e outros, 2007; Zhu e outros, 2009; Xu e outros, 2009; Kozin e outros, 2010). CXCR4, bem como SDF-1, são induzidos por hipóxia (Ceradini e outros, 2004). Junto com VEGF, eles representam um eixo sinergístico potente que inicia e mantém as vias angiogênicas/vasculogênicas (Kryczek e outros, 2005). A função em vasculogênese é suportada pela evidência de que SDF-1 atrai células progenitoras endoteliais expressando CXCR4 a partir da circulação (Sengupta e outros, 2005). O recrutamento mediado por SDF-1 - CXCR4 de células derivadas da medula óssea que suportam a vascularização pode também ser a razão para a recorrência de glioblastoma após terapia de irradiação (Kioi e outros, 2010). Como demonstrado por Kioi e outros em um modelo de xenoenxerto de camundongo de glioblastoma intracraniano multiforme (abrev. GBM), o tratamento de paciente com GBM com alta dose de radiação é menos eficaz devido ao recrutamento induzido por irradiação de células derivadas da medula óssea (abrev. BMDCs). O bloqueio da interação de SDF-1 e seu receptor CXCR4 pelo antagonista de CXCR4 AMD3100 impediu o influxo de BMDCs no tumor irradiado (Kioi e outros, 2010). Em 2010, Tseng e outros apresentaram dados com um modelo em ratos de gliblastoma, um modelo que simula intimamente GBM humano, que além de CXCR4 e CXCR7, está envolvido no recrutamento induzido por irradiação de BMDCs. Nesse estudo, o antagonista de CXCR7 CCX2206 impediu o influxo de BMDCs no tumor irradiado (Tseng e outros, 2010). De acordo com esses e como as moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção são capazes de bloquear a interação de ambos SDF-1 e CXCR4 e SDF-1 e CXCR7, espera-se que o efeito na sobrevida após a radiação seja melhor do que o mostrado para o uso de um dos antagonistas CXCR4 e CXCR7 sozinho.

Em adição, SDF-1 induz a secreção de VEGF, enquanto VEGF aumenta a expressão de CXCR4 (Salcedo e outros, 1999) e sinais de angio- gênese. Então, a inibição do eixo SDF-1 - CXCR4 pode reduzir ou prevenir o crescimento de tumor através da inibição de angiogênese/vasculogênese ou com monoterapia ou particularmente, em combinação com outros agentes antivasculares tal como inibidores de VEGF.

Ademais, sugere-se que a ‘atuação no órgão-alvo’ de células cancerosas expressando CXCR4 para órgãos expressando SDF-1 direciona as células metastáticas preferencialmente para o fígado, medula óssea, pulmão e nódulos linfáticos (Alsayed e outros, 2007; Burger & Peled, 2009) e então o eixo SDF-1 - CXCR4 desempenha uma função na metástase.

Portanto, a inibição do eixo SDF-1 - CXCR4 e o eixo SDF-1 - CXCR7 com somente um composto tal como a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 de acordo com a presente invenção deveria ser eficaz no tratamento de câncer e/ou tumores, em particular, uma ampla faixa de tumores hematológicos e sólidos ou como monoterapia ou em combinação com outros tratamentos tais como, mas não limitados à terapia com fárma- cos, terapia celular, irradiação e cirurgia. Ademais, em comparação com um composto que se liga e inibe um dos receptores de SDF-1 CXCR4 e CXCR7, a inibição do eixo SDF-1 - CXCR4 e do eixo SDF-1 - CXCR7 com somente um composto tal como a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 de acordo com a presente invenção deveria ser mais eficaz no tratamento de câncer e/ou tumores, em particular, uma ampla faixa de tumores hematológicos e sólidos ou como monoterapia ou em combinação com outros tratamentos tal como, mas não limitados à terapia com fármacos, terapia celular, irradiação e cirurgia.

Está dentro da presente invenção que a terapia com fármacos compreende o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio por um fármaco, preferencialmente um agente farmaceuticamente ativo, mais preferencialmente um agente farmaceuticamente ativo como definido aqui.

Como preferencialmente usado aqui, em terapia celular também chamada de terapia de células, o tecido processado dos órgãos, embriões, ou fetos de animais, tal como ovelha ou vacas, é injetado em um indivíduo que sofre ou está em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio, onde preferencialmente a doença ou distúrbio é câncer e a terapia celular é uma forma de tratamento de câncer.

Na teoria, os cânceres não hematológicos podem ser curados se inteiramente removidos por cirurgia. Quando o câncer metastiza para outros sítios no corpo antes da cirurgia, a excisão cirúrgica completa é geralmente impossível. Exemplos de procedimentos cirúrgicos ou cirurgia para câncer incluem mastectomia para câncer de mama, prostatectomia para câncer de próstata, e cirurgia de câncer de pulmão para câncer de não pequenas células do pulmão. O objetivo da cirurgia pode ser ou a remoção somente do tumor, ou do órgão inteiro. A cirurgia é frequentemente combinada com outros tratamentos ou terapias para o câncer, tal como quimioterapia e radiação. A cirurgia de câncer pode ser usada para alcançar um ou mais objetivos. Tais objetivos podem incluir, mas não estão limitados à prevenção de câncer, diagnóstico, estadiamento, tratamento primário, redução de volume e sintomas de alívio ou efeitos colaterais.

A radioterapia (também chamada de terapia de raios X ou irradiação) é o uso de radiação ionizante para matar células cancerosas. A radioterapia é usada no campo médico para tratar quase todo tipo de tumor sólido. A irradiação é também usada para tratar leucemia e linfoma. A radioterapia lesiona ou destrói as células na área que está sendo tratada danificando seu material genético, tornando impossível que essas células continuem a crescem e se dividir. A dose de radiação em cada sítio depende de um número de fatores, incluindo a radiossensibilidade de cada tipo de câncer e se há tecidos e órgãos próximos que podem ser danificados por radiação. O objetivo da radioterapia é danificar o maior número possível de células cancerosas, enquanto limitando prejudicar o tecido saudável próximo.

Adicionalmente, uma molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 de acordo com a presente invenção é preferencial se o efeito fisiológico do eixo SDF-1 - CXCR4 e/ou eixo SDF-1 - CXCR7 está relacionado a níveis de plasma mais altos de SDF-1. Por exemplo, agentes terapêuticos particulares, tal como paclitaxel e bevacizumabe, produzem uma avaliação dos níveis de SDF-1 no plasma, que têm um efeito negativo na terapia de tumor liberando mais células progenitoras endoteliais derivadas de medula óssea ou estimulando o crescimento, invasividade ou metástase (Shaked, Henke e outros, 2008; Xu, Duda e outros, 2009). Nesse caso, a coaplicação de um ácido nucleico que se liga a SDF-1 melhorará os efeitos de níveis elevados de SDF-1 no plasma.

Ademais, a inibição do eixo SDF-1 - CXCR4 e/ou eixo SDF-1 - CXCR7 por uma molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 de acordo com a presente invenção melhorará os efeitos antitumorais de outros agentes terapêuticos rompendo as interações adesivas entre células estromais com leucemia e outras células cancerosas que conferem sobrevida e resistência a fármacos para essas terapias (Jin e outros, 2008; Nervi e outros, 2009). Tal uso de molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 é conhecido como um processo conhecido como quimiossensibilização.

A sensibilização de células tumorais à quimioterapia ou radioterapia é conhecida como ‘quimiossensibilização* ou ‘radiossensibilização’, respectivamente. Tal ‘quimiossensibilização’ ou ‘radiossensibilização’, preferencialmente pelas moléculas de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, sensibiliza o indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio, onde o indivíduo sensibilizado é mais responsivo a uma terapia para o tratamento e/ou prevenção da doença ou distúrbio, onde preferencialmente a doença ou distúrbio é câncer. Tal tratamento usado junto com um tratamento primário, preferencialmente um tratamento de câncer, é uma terapia adjunta de acordo com a presente invenção e também chamado de terapia adjunta. O propósito de tal terapia adjunta é ajudar um tratamento primário, preferencialmente um tratamento de câncer primário. Portanto, a inibição do eixo SDF-1 - CXCR4 e/ou SDF-1 - CXCR7 será particularmente eficaz ao tratar uma ampla faixa de tumores hematológicos e sólidos ou como monoterapia ou em combinação com outros tratamentos, tal como, mas não limitados à terapia com fármacos, terapia celular, irradiação e cirurgia.

Por esses meios e em vista do envolvimento descrito de SDF-1 e receptores de SDF-1 - tal como CXCR4 e CXCR7 - a ligação a SDF-1 e a interação entre SDF-1 e moléculas de ácido nucleico inibindo receptor de SDF-1, de acordo com a presente invenção, podem ajudar a atenuar tais doenças, onde a inibição de SDF-1 pelas moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 de acordo com a presente invenção leva à quimiossensibi- lização de células malignas a serem tratadas por quimioterapia, redução ou inibição de crescimento e invasividade, inibição de angiogênese/vasculogê- nese, inibição de metástase e/ou inibição de níveis elevados de SDF-1 no plasma derivados da resposta do hospedeiro à quimioterapia.

Ademais, a presente invenção é baseada na conclusão surpre-endente de que é possível gerar moléculas de ácido nucleico se ligando especificamente e com alta afinidade a SDF-1, inibindo e antagonizando assim os efeitos de SDF-1, em particular, os efeitos de SDF-1 em seus receptores tal como CXCR4 e CXCR7.

Um antagonista a SDF-1 é uma molécula que se liga a SDF-1, tal como as moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 de acordo com a presente invenção, e inibe a função de SDF-1, preferencialmente em um ensaio in vitro ou em um modelo in vivo, como descrito nos Exemplos.

Está dentro da presente invenção que o ácido nucleico de acordo com a presente invenção é uma molécula de ácido nucleico. Os termos ácido nucleico e molécula de ácido nucleico são usados aqui de uma maneira sinônima, se não indicado ao contrário. Ademais, tais ácido nucleicos são preferencialmente também chamados aqui de moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, os ácidos nucleicos inventivos ou as moléculas de ácido nucleico inventivas.

As características do ácido nucleico de acordo com a presente invenção, como descrito aqui, podem ser realizadas em qualquer aspecto da presente invenção, onde o ácido nucleico é usado, ou sozinho ou em qualquer combinação.

Como descrito aqui em mais detalhes, os presentes inventores identificaram um número de diferentes moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 , onde as moléculas de ácido nucleico podem ser caracterizadas em termos de extensões de nucleotídeos que são também chamados aqui de Caixas (ver Exemplo 1). Como experimentalmente mostrado nos Exemplos 5 a 11, os inventores poderiam demonstrar surpreendentemente em vários sistemas que as moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF- 1 são adequadas para o tratamento de câncer e realmente capazes de tratar câncer.

Os diferentes tipos de moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 compreendem três extensões diferentes de nucleotídeos: a primeira extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos e a segunda extensão terminal de nucleotídeos. Em geral, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção compreendem em sua extremidade 5’ e extremidade 3’ as extensões terminais de nucleotídeos: a primeira extensão terminal de nucleotídeos e a segunda extensão terminal de nucleotídeos (também chamado de extensão 5’-terminal de nucleotídeos e a extensão 3’- terminal de nucleotídeos). A primeira extensão terminal de nucleotídeos e a segunda extensão terminal de nucleotídeos podem, em princípio devido à sua complementariedade base, hibridizar entre si, onde mediante a hibridi- zação, uma estrutura de fita dupla é formada. Entretanto, tal hibridização não é necessariamente realizada na molécula sob condições fisiológicas e/ou não fisiológicas. As três extensões de nucleotídeos de moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 - a primeira extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos e a segunda extensão terminal de nucleotídeos - são dispostas entre si na direção 5’ -> 3: a primeira extensão terminal de nucleotídeos - a extensão central de nucleotídeos - a segunda extensão terminal de nucleotídeos. Entretanto, alternativamente, a segunda extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos e a primeira extensão terminal de nucleotídeos são dispostas entre si na direção5’ -> 3’.

As diferenças nas sequências das caixas definidas ou extensões entre as diferentes moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 influenciam na atividade de ligação a SDF-1. Com base na análise de ligação das diferentes moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 da presente invenção, a extensão central e os nucleotídeos formando o mesmo são individualmente e mais preferencialmente em sua integridade essenciais à ligação a SDF-1 humano.

Os termos ‘extensão’ e ‘extensão de nucleotídeo’ são usados aqui de uma maneira sinônima, se não indicado ao contrário.

Em uma modalidade preferencial, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção é uma molécula de ácido nucleico única. Em uma modalidade adicional, a molécula de ácido nucleico única está presente como várias das moléculas de ácido nucleico únicas ou como várias das espécies de moléculas de ácido nucleico únicas.

Os versados na técnica sabem que a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção consiste preferencialmente de nucleotídeos que são covalentemente ligados entre si, preferencialmente através de ligações fosfodiéster.

Está dentro da presente invenção que os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção compreendem dois ou mais extensões ou parte(s) desses podem, em princípio, hibridizar entre si. Mediante tal hibridização, uma estrutura de fita dupla é formada. Os versados na técnica sabem que tal hibridização pode ou não ocorrer, particularmente, sob condições in vitro ou in vivo. Também, no caso de tal hibridização, não é necessariamente o caso em que a hibridização ocorre ao longo do comprimento inteiro das duas extensões onde, ao menos com base nas regras para pareamento base, tal hibridização e assim formação de uma estrutura de fita dupla podem, em princípio, ocorrer. Como preferencialmente usado aqui, uma estrutura de fita dupla é uma parte de uma molécula de ácido nucleico ou uma estrutura formada por dois ou mais extensões separados ou dois extensões espacialmente separados de uma fita simples de uma molécula de ácido nucleico, onde ao menos um, preferencialmente dois ou mais pares de base existem, ou seja, pareamento de bases preferencialmente de acordo com as regras de pareamento de bases de Watson-Crick. Os versados na técnica sabem também que outro pareamento de bases tal como o pareamento de bases de Hoogsten pode existir na forma de estrutura de fita dupla. Sabe-se também que a característica de que duas extensões hibridizam preferencialmente indica que se assume que tal hibridização acontece devido à complemen- tariedade base das duas extensões.

Em uma modalidade preferencial, o termo disposição, como u- sado aqui, significa a ordem ou sequência de características estruturais ou funcionais ou elementos descritos aqui em conjunto com os ácidos nucleicos descritos aqui.

Os versados na técnica sabem que os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são capazes de se ligar a SDF-1. Sem desejar estar limitado a qualquer teoria, os presentes inventores assumem que a ligação a SDF-1 resulta de uma combinação de características ou elementos estruturais tridimensionais da molécula de ácido nucleico reivindicada, que são causados por orientação e padrões de dobragem da sequência primária de nucleotídeos formando tais características ou elementos, onde preferencialmente tais características ou elementos são a primeira extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos e a segunda extensão terminal de nucleotídeos de moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 . Está evidente que a característica ou elemento individual pode ser formado por várias sequências individuais diferentes, cujo grau de variação pode variar dependendo da estrutura tridimensional que tal elemento ou característica tem que formar. A característica de ligação geral do ácido nucleico reivindicado resulta da interação dos vários elementos e características, respectivamente, que, por fim, resulta na interação do ácido nucleico reivindicado com seu alvo, isto é, SDF-1. Novamente sem estar limitado a qualquer teoria, a extensão central de nucleotídeos que é característico para os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 parece ser importante para mediar a ligação das moléculas de ácido nucleico reivindicada com SDF-1. Conse quentemente, os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, são adequados para a interação com SDF-1. Também, os versados na técnica sabem que os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são antagonistas a SDF-1. Como esses ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são adequados para o tratamento e prevenção, respectivamente, de qualquer doença ou condição que está associada com SDF-1 ou causada por ele. Tais doenças e condições podem ser obtidas a partir da técnica anterior que estabelece que SDF-1 está envolvido ou associado com as ditas doenças e condições, respectivamente, e que está incorporado aqui por referência fornecendo o raciocínio científico para o uso terapêutico dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção.

Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção devem também compreender ácidos nucleicos que são essencialmente homólogos às sequências particulares descritas aqui. O termo ‘substancialmente homólogo’ deve ser entendido de modo que a homologia seja ao menos 75%, preferencialmente 85%, mais preferencialmente 90%, e mais preferencialmente mais do que 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.

A porcentagem real de nucleotídeos homólogos presentes no á- cido nucleico de acordo com a presente invenção dependerá do número total de nucleotídeos presente no ácido nucleico. A modificação percentual pode ser baseada no número total de nucleotídeos presentes no ácido nucleico.

A homologia entre as duas moléculas de ácido nucleico pode ser determinada como conhecido pelos versados na técnica. Mais especificamente, um algoritmo de comparação de sequência pode ser usado para calcular a homologia de sequência percentual para a sequência(s) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa designados. A sequência de teste é preferencialmente a sequência ou molécula de ácido nucleico que é homologa ou a ser testada se é homologa, se se for, em qual grau, a uma molécula de ácido nucleico diferente, onde tal molécula de ácido nucleico diferente é também chamada de sequência de referência. Em uma modalidade, a sequência de referência é uma molécula de ácido nucleico, como descrita aqui, preferencialmente uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de acordo com qualquer uma dentre a SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 225, mais preferencialmente uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de acordo com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, e SEQ ID NO: 144. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman (Smith & Waterman, 1981) pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch (Needleman & Wunsch, 1970), pela busca por método de similaridade de Pearson & Lipman (Pearson & Lipman, 1988), por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ou por inspeção visual.

Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a identidade de sequência percentual é o algoritmo usado na ferramenta de busca de alinhamento local básica (em seguida “BLAST”), ver, por exemplo, Altschul e outros (Altschul e outros, 1990 e Altschul e outros, 1997). O software para executar análises BLAST está publicamente disponível através do Centro Nacional para Informação de Biotecnologia (em seguida “NCBI”). Os parâmetros padrão usados na determinação da identidade de sequência u- sando o software disponível a partir de NCBI, por exemplo, BLASTN (para sequências de nucleotídeo) e BLASTP (para sequências de aminoácido) são descritos em McGinnis e outros (McGinnis e outros, 2004).

Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção devem também compreender ácidos nucleicos que têm um certo grau de identidade em relação aos ácidos nucleicos descritos aqui e definidos por suas sequências de nucleotídeo. Mais preferencialmente, a presente invenção também compreende aquelas moléculas de ácido nucleico que têm uma identidade de ao menos 75%, preferencialmente 85%, mais preferencialmente 90% e mais preferencialmente mais do que 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em rela-ção aos ácidos nucleicos descritos aqui e definidos por sua sequência de nucleotídeo ou uma parte dessa.

O termo ácido nucleico da invenção ou ácido nucleico de acordo com a presente invenção deve também compreender aqueles ácidos nuclei- cos compreendendo sequências de ácidos nucleicos descritas aqui ou parte dessas, tal como, por exemplo, um metabólito ou derivado do ácido nucleico de acordo com a presente invenção, preferencialmente até o grau em que os ácidos nucleicos ou as ditas partes estão envolvidos ou são capazes de se ligar a SDF-1. Tal ácido nucleico pode ser derivado dos descritos aqui, por exemplo, por truncamento.

O truncamento pode estar relacionado a qualquer uma ou ambas as extremidades dos ácidos nucleicos como descrito aqui. Também, o truncamento pode estar relacionado à sequência interna de nucleotídeos, isto é, pode estar relacionado ao nucleotídeo(s) entre o nucleotídeo 5’ e 3’ terminal, respectivamente.

Ademais, o truncamento deve com-preender a deleção de, no mínimo, um único nucleotídeo a partir da sequên-cia dos ácidos nucleicos descritos aqui. O truncamento pode também estar relacionado a mais de uma extensão do ácido nucleico da invenção, onde a extensão pode ter comprimento de no mínimo um nucleotídeo.

A ligação de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser determinadapelos versados na técnica usando experimentos de rotina ou usando ou adotando um método, como descrito aqui, preferencialmente como descrito aqui na parte de exemplos.

Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem ou ser ácidos D-nucleicos ou ácidos L-nucleicos. Preferencialmente, os áci- dos nucleicos da invenção são ácidos L-nucleicos. Em adição, é possível que uma ou várias partes do ácido nucleico estejam presentes como ácidos D-nucleicos ou ao menos uma ou várias partes dos ácidos nucleicos são ácidos L-nucleicos. O termo “parte” dos ácidos nucleicos deve significar no mínimo um nucleotídeo. Tais ácidos nucleicos são geralmente chamados aqui de ácidos D- e L-nucleicos, respectivamente. Então, em uma modalida-de particularmente preferencial, os ácidos nucleicos de acordo com a pre-sente invenção consistem de L-nucleotídeos e compreendem ao menos umD-nucleotídeo. Tal D-nucleotídeo é preferencialmente acoplado a uma parte diferente das extensões que definem os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, preferencialmente aquelas partes desses, onde uma inte-ração com outras partes do ácido nucleico está envolvida. Preferencialmen- 5 te, tal D-nucleotídeo é acoplado a um término de qualquer um das extensões e de qualquer ácido nucleico de acordo com a presente invenção, respecti-vamente. Em uma modalidade preferencial adicional, tais D-nucleotídeos podem agir como um espaçador ou um ligante, preferencialmente modificações de acoplamento tal como PEG e HES aos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção.

Está também dentro da presente invenção que cada uma e qualquer das moléculas de ácido nucleico descritas aqui em sua integridade em termos de sua sequência(s) de ácido nucleico estão limitadas à sequên- cia(s) de nucleotídeo particular. Em outras palavras, os termos “compreen- 15 dendo” ou “compreende” devem ser interpretados em tal modalidade no sentido de conter ou consistir de.

Está também dentro da presente invenção que os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são parte de um ácido nucleico mais longo, onde esse ácido nucleico mais longo compreende várias partes onde 20 ao menos uma tal parte é um ácido nucleico, ou uma parte desse, de acordo com a presente invenção. As outras parte(s) desses ácidos nucleicos mais longos podem ser qualquer uma ou vários ácidos D-nucleicos ou ácidos L- nucleicos. Qualquer combinação pode ser usada em conjunto com a presen-te invenção. Essas outras partes do ácido nucleico mais longo podem exibir 25 uma função que é diferente da ligação, preferencialmente da ligação a SDF- 1. Uma função possível é permitir a interação com outras moléculas, onde tais outras moléculas são preferencialmente diferentes de SDF-1, tal como, por exemplo, para imobilização, reticulação, detecção ou amplificação. Em uma modalidade adicional da presente invenção, os ácidos nucleicos de a- 30 cordo com a invenção compreendem, como porções individuais ou combinadas, vários dos ácidos nucleicos da presente invenção. Tal ácido nucleico compreendendo vários dos ácidos nucleicos da presente invenção é também abrangido pelo termo ácido nucleico mais longo.

Os ácidos L-nucleicos, como usados aqui, são ácidos nucleicos que consistem de L-nucleotídeos, preferencialmente consistindo completa-mente de L-nucleotídeos.

Os ácidos D-nucleicos, como usados aqui, são ácidos nucleicos que consistem de D-nucleotídeos, preferencialmente, consistindo completa-mente de D-nucleotídeos.

Os termos ácido nucleico e molécula de ácido nucleico são usa-dos aqui de uma maneira intercambiável, se não explicitamente indicado ao contrário.

Também, se não indicado ao contrário, qualquer sequência de nucleotídeo é apresentada aqui na direção 5’ -> 3’.

Como preferencialmente usado aqui, qualquer posição de um nucleotídeo é determinada ou referida em relação à extremidade 5’ de uma sequência, uma extensão ou uma subextensão. Consequentemente, um segundo nucleotídeo é o segundo nucleotídeo contado a partir da extremidade 5’ da sequência, extensão e subextensão, respectivamente. Também, de acordo com esses, um penúltimo nucleotídeo é o segundo nucleotídeo contado a partir da extremidade 3’ de uma sequência, extensão e subextensão, respectivamente.

Independente se o ácido nucleico da invenção consiste em D- nucleotídeos, L-nucleotídeos ou uma combinação de ambos com a combi-nação sendo, por exemplo, uma combinação aleatória ou uma sequência definida de extensões consistindo de ao menos um L-nucleotídeo e ao me-nos um ácido D-nucleico, o ácido nucleico pode consistir de desoxirribonu- cleotídeo(s), ribonucleotídeo(s), ou combinações desses.

Projetar os ácidos nucleicos da invenção como ácido L-nucleico é vantajoso por várias razões. Os ácidos L-nucleicos são enantiômeros de ácidos nucleicos ocorrendo naturalmente. Os ácidos D-nucleicos, entretanto, não são muito estáveis em soluções aquosas e particularmente m sistemas biológicos ou amostras biológicas devido à presença amplamente difundida de nucleases. As nucleases naturalmente ocorrendo, particularmente nucle- ases de células animais, não são capazes de degradar ácidos L-nucleicos. Por causa disso, a meia-vida biológica do ácido L-nucleico é significativa-mente aumentada em tal sistema, incluindo o corpo animal e humano. Devido à ausência de degradabilidade de ácido L-nucleico, nenhum produto de degradação de nuclease é gerado e assim nenhum efeito colateral surgindo dele é observado. Esse aspecto delimita o ácido L-nucleico de todos os outros compostos que são usados na terapia de doenças e/ou distúrbios envolvendo a presença de SDF-1. Os ácidos L-nucleicos que se ligam especificamente a uma molécula-alvo através de um mecanismo diferente do pareamento de bases de Watson Crick, ou aptâmeros que consistem parcial ou completamente de L-nucleotídeos, particularmente com aquelas partes do aptâmero que estão envolvidas na ligação do aptâmero à molécula-alvo, são também chamadas spiegelmers. Os aptâmeros e spiegelmers, como tal, são conhecidos pelos versados na técnica e são, entre outros, descritos no ‘The Aptamer Handbook’ (eds. Klussmann, 2006).

Está também dentro da presente invenção que os ácidos nucleicos da invenção, independente se eles estão presentes como ácidos D- nucleicos, ácidos L-nucleicos ou ácidos D,L-nucleicos ou se eles são DNA ou RNA, podem estar presentes como ácidos nucleicos de fita simples ou de fita dupla. Tipicamente, os ácidos nucleicos da invenção são ácidos nucleicos de fita simples que exibem estruturas secundárias definidas devido à sequência primária e podem assim também formar estruturas terciárias. Os ácidos nucleicos da invenção, entretanto, podem também ser fita dupla no sentido de que duas fitas que são complementares ou parcialmente complementares entre si são hibridizados entre si.

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser modificados. Tais modificações podem estar relacionadas ao nucleotídeo simples do ácido nucleico e são bem conhecidos na técnica. Os exemplos para tal modificação são descritos, entre outros, por Venkatesan e outros (Venkatesan, Kim e outros, 2003) e Kusser (Kusser, 2000). Tal modificação pode ser um átomo H, um átomo F ou um grupo O-CH3 ou NH2 na posição 2’ do nucleotídeo individual do qual o ácido nucleico consiste. Também, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode compreender ao menos um nucleotí-deo de LNA. Em uma modalidade, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção consiste em nucleotídeos de LNA.

Em uma modalidade, os ácidos nucleicos de acordo com a pre-sente invenção podem ser um ácido nucleico multiparte. O ácido nucleico multiparte, como usado aqui, é um ácido nucleico que consiste em ao menos duas fitas de ácido nucleico separadas. Ao menos duas fitas de ácido nucleico formam uma unidade funcional onde a unidade funcional é um ligando a uma molécula-alvo. Ao menos duas fitas de ácido nucleico podem ser derivadas de qualquer um dos ácidos nucleicos da invenção ou clivando-se a molécula de ácido nucleio para gerar duas fitas ou sintetizando-se um ácido nucleico correspondente a uma primeira parte da invenção, isto é, ácido nucleico geral e outro ácido nucleico correspondente à segunda parte do ácido nucleico geral. Sabe-se que ambas a clivagem e a síntese podem ser aplicadas para gerar um ácido nucleico multiparte, onde há mais de duas fitas, como exemplificado acima. Em outras palavras, ao menos duas fitas de ácido nucleico separadas são tipicamente diferentes de duas fitas complementares e hibridizando entre si, embora um certo grau de complementariedade entre ao menos duas ditas fitas de ácido nucleico separadas possa existir e onde tal complementariedade pode resultar na hibridização das ditas fitas separadas.

Finalmente, está também dentro da invenção que uma estrutura circular, isto é, completamente fechada para os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção é realizada, isto é, que os ácidos nucleicos de a- cordo com a presente invenção são fechados em uma modalidade, preferencialmente através de uma ligação covalente, onde mais preferencialmente, tal ligação covalente é feita entre a extremidade 5’ e a extremidade 3’ das sequências de ácido nucleico, como descrito aqui ou qualquer derivado dessa.

Uma possibilidade de determinar as constantes de ligação das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é o uso dos métodos como descrito no Exemplo 3 e 4 que confirma a conclusão acima que os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção exibem uma faixa de valor KD favorável. Uma medida apropriada de modo a expressar a intensidade da ligação entre a molécula de ácido nucleico individual e o alvo que está no presente caso, SDF-1 é o valor assim chamado KD que, como tal, o método para sua determinação é conhecido pelos versados na técnica.

Preferencialmente, o valor KD mostrado pelos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção está abaixo de 1 μM. Um valor KD de aproximadamente 1 μM é dito como sendo característico para uma ligação não específica de um ácido nucleico a um alvo. Como será conhecido pelos versados na técnica, o valor KD de um grupo de compostos, tal como os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, está dentro de uma certa faixa. O KD mencionado acima de aproximadamente 1 μM é um limite superior preferencial para o valor KD. O limite inferior para o KD de ácidos nucleicos de ligação ao alvo pode ser no mínimo aproximadamente 10 picomola- res ou pode ser maior. Está dentro da presente invenção que os valores KD de ácidos nucleicos individuais se ligando a SDF-1 estão preferencialmente dentro dessa faixa. As faixas preferenciais podem ser definidas escolhendo qualquer primeiro número dentro dessa faixa e qualquer segundo número dentro dessa faixa. Os valores KD superiores preferenciais são 250 nM e 100 nM, os valores KD inferiores preferenciais são 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM e 10 pM. O valor KD superior mais preferencial é 2,5 nM, o valor KD inferior mais preferencial é 100 pM.

Em adição às propriedades de ligação das moléculas de ácido nucleico de acordo com apresente invenção, as moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção inibem a função da respectiva molécula- alvo que é no presente caso, SDF-1. A inibição da função de SDF-1, por e- xemplo, o estímulo dos respectivos receptores, como descrito anteriormente, é alcançada por ligação de moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção a SDF-1 e formando um complexo de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção e MCP-1 e SDF-1. Tal complexo de uma molécula de ácido nucleico e SDF-1 não pode estimular os receptores que normalmente são estimulados por SDF-1. Consequente- mente, a inibição da função de receptor por moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é independente do respectivo receptor que pode ser estimulado por SDF-1, mas resulta de impedir o estímulo do receptor por MCP-1 e SDF-1 pelas moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

Uma possibilidade de determinar a constante inibidora das mo-léculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é o uso dos métodos descritos no Exemplo 5 e 6 (para CXCR4 e CXCR7, respectiva-mente) que confirma a conclusão acima de que os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção exibem uma constante inibidora favorável que permite o uso dos ditos ácidos nucleicos em um esquema de tratamento terapêutico. Uma medida apropriada de modo a expressar a intensidade do efeito inibidor da molécula de ácido nucleico individual na interação do alvo que é no presente caso, SDF-1 e o respectivo receptor, é a assim chamada concentração inibitória máxima (abrev. IC50) que como tal, bem como o método para sua determinação, são conhecidos pelos versados na técnica.

Preferencialmente, o valor IC50 mostrado pelas moléculas de á- cido nucleico de acordo com a presente invenção está abaixo de 1 μM. Um valor IC50 de aproximadamente 1 μM é dito característico para uma inibição não específica de funções alvo por uma molécula de ácido nucleico. Como será conhecido pelos versados na técnica, 0 valor IC50 de um grupo de compostos, tal como as moléculas de ácido nucleico de acordo com a pre-sente invenção, está dentro de uma certa faixa. O IC50 mencionado acima de aproximadamente 1 μM é um limite superior preferencial para o valor ICso- O limite inferior para o IC50 de moléculas de ácido nucleico de ligação ao alvo pode ser de no mínimo 10 picomolares ou pode ser maior. Está dentro da presente invenção que os valores IC50 de ácidos nucleicos individuais se ligando a SDF-1 é preferencialmente dentro dessa faixa e qualquer segundo número dentro dessa faixa. Os valores IC50 superiores preferenciais são 250 nM e 100 nM, os valores IC50 inferiores preferenciais são 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM e 10 pM. O valor IC50 superior mais preferencial é 2,5 nM, o valor IC50 inferior mais preferencial é 100 pM.

As moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente in-venção podem ter qualquer comprimento já que elas são ainda capazes de se ligar à molécula-alvo. Sabe-se que há comprimentos preferenciais dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. Tipicamente, o com-primento está entre 15 e 20 nucleotídeos. Os versados na técnica sabem que qualquer inteiro entre 15 e 120 é um comprimento possível para os áci-dos nucleicos de acordo com a presente invenção. As faixas mais preferenciais para o comprimento dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são comprimentos de aproximadamente 20 a 100 nucleotídeos, aproximadamente 20 a 80 nucleotídeos, aproximadamente 20 a 60 nucleotídeos, aproximadamente 20 a 50 nucleotídeos e aproximadamente 29 a 450 nucleotídeos.

Está dentro da presente invenção que os ácidos nucleicos des-critos aqui compreendem uma porção que preferencialmente é uma porção de alto peso molecular e/ou que preferencialmente permite modificar as ca-racterísticas do ácido nucleico em termos, entre outros, do tempo de resi-dência no corpo animal, preferencialmente o corpo humano. Uma modalidade particularmente preferencial de tal modificação é PEGilação e HESilação dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. Como usado aqui, PEG representa poli(etileno glicol) e HES para hidroxietil amido. A PEGilação, como preferencialmente usada aqui, é a modificação de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, onde tal modificação consiste em uma porção PEG que é acoplada a um ácido nucleico de acordo com a presente invenção. HESilação, como preferencialmente usada aqui, é a modificação de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção onde tal modificação consiste em uma porção HES que é acoplada a um ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Essas modificações, bem como o processo de modificar um ácido nucleico usando tais modificações, são descritas no pedido de patente europeia EP 1 306 382, cuja descrição é aqui incorporada por referência.

No caso de PEG ser tal porção de alto peso molecular, o peso molecular é preferencialmente aproximadamente 20.000 a aproximadamente 120.000 Da, mais preferencialmente de aproximadamente 30.000 a aproxi-madamente 80.000 Da e mais preferencialmente aproximadamente 40.000 Da. No caso de HER ser tal porção de alto peso molecular, o peso molecular é preferencialmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 KDa, mais preferencialmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 700 kDa, e mais preferencialmente de 200 a 500 kDa. HES exibe uma substituição molar de 0,1 a 1,5, mais preferencialmente de 1 a 1,5 e exibe uma a- mostra de substituição expressa como a relação C2/C6 de aproximadamente 0,1 a 15, preferencialmente de aproximadamente 3 a 10. O processo de modificação HES é, por exemplo, descrito no pedido de patente alemã DE 1 2004 006 249.8, cuja descrição é aqui incorporada por referência.

A modificação pode, em princípio, ser feita nas moléculas de á- cido nucleico da presente invenção em qualquer posição dessas. Preferencialmente, tal modificação é feita ou no nucleotídeo 5’-terminal, nucleotídeo 3’-terminal e/ou em qualquer nucleotídeo entre o 5’ nucleotídeo e o 3’ nucleotídeo da molécula de ácido nucleico.

A modificação e preferencialmente, a porção PEG e/ou HES, pode ser acoplada à molécula de ácido nucleico da presente invenção ou direta ou indiretamente, preferencialmente através de um ligante. Está tam-bém dentro da presente invenção que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção compreende uma ou mais modificações, preferencialmente uma ou mais dentre a porção PEG e/ou HES. Em uma modalidade, a molécula de ligante individual acopla mais de uma porção PEG ou HES a uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. O ligante usado em conjunto com a presente invenção pode ser ou linear ou ramificado. Esse tipo de ligantes é conhecido pelos versados na técnica e é descrito ainda nos pedidos de patente WO 2005/074993 e WO 2003/035665.

Em uma modalidade preferencial, o ligante é um ligante biode-gradável. O ligante biodegradável permite modificar as características do ácido nucleico de acordo com a presente invenção em termos, entre outros, do tempo de residência no corpo de um animal, preferencialmente, em um corpo humano, devido à liberação da modificação do ácido nucleico de acor- do com a presente invenção. O uso de um ligante biodegradável pode permitir um melhor controle do tempo de residência do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Uma modalidade preferencial de tal ligante biodegradável é um ligante biodegradável como descrito, mas não limitado, a pedidos de patente internacionais WO 2006/052790, WO 2008/034122, WO 2004/092191 eWO 2005/099768.

Está dentro da presente invenção que a modificação ou grupo de modificação é uma modificação biodegradável, onde a modificação bio-degradável pode ser acoplada à molécula de ácido nucleico da presente in-venção, ou direta ou indiretamente, preferencialmente através de um ligante. A modificação biodegradável permite modificar as características do ácido nucleico de acordo com a presente invenção em termos, entre outros, do tempo de residência em um corpo animal, preferencialmente em um corpo humano, devido à liberação ou degradação da modificação do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. O uso da modificação biodegradável pode permitir um melhor controle do tempo de residência do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Uma modalidade preferencial de tal modificação biodegradável é biodegradável como descrito, mas não restrito aos pedidos de patente internacional WO 2002/065963, WO 2003/070823, WO 2004/113394 e WO 2000/41647, preferencialmente em W02000/41647, página 18, linhas 4 a 24.

Além das modificações descritas acima, outras modificações podem ser usadas para modificar as características dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, onde tais outras modificações podem ser selecionadas a partir do grupo de proteínas, lipídios tal como colesterol e cadeias de açúcar tal como amilase, dextrano, etc.

Sem estar limitado por qualquer teoria, parece que ao modificar os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção com porção de alto peso molecular tal como um polímero e mais particularmente a um ou vários dos polímeros descritos aqui, que são preferencialmente fisiologicamente aceitáveis, a excreção cinética é mudada. Mais particularmente, parece que devido ao peso molecular aumentado de tais ácidos nucleicos da invenção modificados e devido aos ácidos nucleicos da invenção não sendo submetidos a metabolismo, particularmente quando na forma L, a excreção de um corpo animal, preferencialmente de um corpo de mamífero e mais preferencialmente de um corpo humano, é diminuída. Como a excreção ocorre tipicamente via os rins, os presentes inventores assumem que a taxa de filtração glomerular dos ácidos nucleicos assim modificados é significativamente reduzida comparada aos ácidos nucleicos não tendo esse tipo de modificação de alto peso molecular que resulta em um aumento no tempo de residência no corpo de animal. Em conjunto com esse, é particularmente notável que, apesar de tal modificação de alto peso molecular, a especificidade dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção não é afetada de uma maneira prejudicial. Então, os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção têm, entre outros, a característica surpreendente, que normalmente não pode ser esperada de compostos farmaceuticamente ativos, tal que uma formulação farmacêutica fornecendo uma liberação sustentada não é necessariamente exigida para fornecer uma liberação sustentada dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. De preferência, os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção em sua forma modificada compreendendo uma porção de alto peso molecular, podem já ser usados como uma formulação de liberação sustentada como eles agem, devido à sua modificação, já como se eles fossem liberados a partir de uma formulação de liberação sustentada. Então, as modificações das moléculas de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção como descritas aqui, e assim as mo-léculas de ácido nucleico modificadas de acordo com a presente invenção e qualquer composições compreendendo as mesmas podem fornecer uma farmacocinética distinta e preferencialmente controlada e biodistribuição dessa. Isso também inclui o tempo de residência na circulação e distribuição a tecidos. Tais modificações são ainda descritas no pedido de patente WO 2003/035665.

Entretanto, está dentro da presente invenção que os ácidos nu-cleicos de acordo com a presente invenção não compreendem qualquer modificação e particularmente nenhuma modificação de alto peso molecular tal como PEGilação e HÈSilação. Tal modalidade é particularmente preferencial quando o ácido nucleico de acordo com a presente invenção mostra a distribuição preferencial para qualquer órgão-alvo ou tecido no corpo ou quando uma folga rápida do ácido nucleico de acordo com a presente invenção do corpo após a administração é desejada. Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, como descrito aqui, com um perfil de distribuição preferencial a qualquer órgão-alvo ou tecido no corpo permitiriam o estabelecimento de concentrações locais eficazes no tecido alvo, enquanto mantendo a concentração sistêmica dos ácidos nucleicos baixa. Isso permitiria o uso de baixas doses que não são somente benéficas a partir de um ponto de vista econômico, mas também reduzem a exposição desnecessária de outros tecidos ao agente ácido nucleico, reduzindo assim o potencial risco de efeitos colaterais. A folga rápida dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção do corpo após a administração deve ser desejada, entre outros, no caso de imagiologia in vivo ou exigências de dosagem terapêutica específica usando os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção ou medicamentos compreendendo os mesmos.

Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, e/ou os antagonistas de acordo com a presente invenção podem ser usados para a geração ou fabricação de um medicamento. Tal medicamento ou composição farmacêutica de acordo com a presente invenção contém ao menos um dos ácidos nucleicos da invenção selecionados a partir do grupo de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 , opcionalmente junto com compostos far- maceuticamente ativos adicionais, onde o ácido nucleico da invenção age preferencialmente como o próprio composto farmaceuticamente ativo. Tais medicamentos compreendem em modalidades preferenciais ao menos um carreador farmaceuticamente aceitável. Tal carreador pode ser, por exemplo, água, tampão, PBS, solução de glicose, preferencialmente uma solução equilibrada de sal e glicose a 5%, amido, açúcar, gelatina, ou qualquer outra substância carreadora aceitável. Tais carreadores são geralmente conhecidos pelos versados na técnica. Os versados na técnica sabem que quaisquer modalidades, usos e aspectos relacionados ao medicamento da pre- sente invenção são também aplicáveis à composição farmacêutica da pre-sente invenção e vice versa.

A indicação, doenças e distúrbios para o tratamento e/u preven-ção dos quais os ácidos nucleicos, as composições farmacêuticas e medi-camentos de acordo com ou preparados de acordo com a presente invenção resultam do envolvimento, ou direto ou indireto, de SDF-1 no respectivo mecanismo patogenético.

É claro, como os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 de a- cordo com a presente invenção, interagem ou se ligam a SDF-1 humano ou murinho, um versado na técnica geralmente entenderá que os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 de acordo com a presente invenção podem ser facilmente usados para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de qualquer doença como descrito aqui de humanos e animais. Em conjunto com esses, sabe-se que as moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção podem ser usadas para o tratamento e prevenção de quaisquer das doenças, distúrbios ou condições descritos aqui, independente do modo de ação que dá suporte a tal doença, distúrbio e condição.

Em seguida, o raciocínio para o uso das moléculas de ácido nu-cleico de acordo com a presente invenção em conjunto com as várias doen-ças, distúrbios e condições é fornecido, tornando assim a aplicabilidade te-rapêutica, preventiva e diagnóstica reivindicada das moléculas de ácido nu-cleico de acordo com a presente invenção plausível. De modo a evitar qual-quer repetição desnecessária, dever-se-ia saber que devido ao envolvimento do eixo SDF-1 - receptor de SDF-1 como descrito em conjunto com ele, o dito eixo pode se abordado pelas moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção tal que o efeito terapêutico, preventivo e diagnóstico é alcançado. Dever-se-ia saber ainda que as particularidades das doenças, distúrbios e condições dos pacientes e qualquer detalhe do regime de tratamento descrito em conjunto com esses podem ser submetidos a modalidades preferenciais do presente pedido.

Para malignidades hematológicas, em particular, há considerável evidência de que as células de leucemia podem ser protegidas de terapias convencionais (quimioterapia combinada com vários agentes-alvo, tal como anticorpos específicos ou inibidores de quinase) dentro dos microambientes de tecido particulares, chamados de nichos. Tais nichos são encontrados particularmente na medula óssea, onde eles podem abrigar células malignas que são capazes de se expandir e produzir uma reincidência após a terapia inicial (Burger e Kipps, 2002; Burger e Burkle, 2007; Meads e outros, 2008; Burger, Ghia e outros, 2009). Essa preservação de células malignas durante a quimioterapia é grande devido ao contato direto entre as células malignas e as células estromais (Lagneaux, Delforge e outros, 1998; Kurtova, Balakri- shnan e outros, 2009; Damiano, Cress e outros, 1999), entretanto, na complexidade desse microambiente, há múltiplos sinais celulares e moleculares que podem levar à resistência que podem levar à resistência das células malignas à quimioterapia. Apesar dessa complexidade, está claro que as células estromais produzem a quimiocina SDF-1 e que ambas as células normais e malignas que expressam CXCR4 migram e são mantidas em tais nichos. Essa via molecular que é chave para essa interação é demonstrada pelo fato de que a inibição específica dessa interação é suficiente para liberar tanto células normais quanto células malignas dos nichos (Broxmeyer, Orschell e outros, 2005; Devine, Flomenberg e outros, 2004; Azab, Runnels e outros, 2009). Em adição ao enfraquecimento da interação com os nichos, mostrou-se para numerosas malignidades hematológicas que o rompimento do eixo SDF-1 - CXCR4 resulta em aumento da vulnerabilidade das células a outras terapias, então chamadas de ‘quimiossensibilização’. Essa quimios- sensibilização foi descrita para mieloma múltiplo (Azab, Runnels e outros, 2009) e várias leucemias agudas e crônicas (Dillman, Veldwijk e outros, 2009; Lagneaux, Delforge e outros, 1998).

Então, o uso de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 de acor-do com a presente invenção para romper a sinalização cruzada entre as cé-lulas malignas e seu meio para sensibilizá-las a outras terapias é uma estratégia atraente para o tratamento de malignidades hematológicas. Exemplos de terapias que podem ser aprimoradas pela combinação com ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 de acordo com a presente invenção incluem os seguintes, mas não limitados a Fludarabina, Ciclofosfamida, Rituxano, Clo- rambucil, Lenalidomida, Bortezomibe, Dexametasona, Melfalano, Imatinibe ou Nilotinibe.

A descrição anterior enfatizou a função de células estromais da medula óssea e nichos de medula óssea na proteção de células malignas a partir dos efeitos de quimioterapia ou outras terapias direcionadas para ma-lignidades hematológicas. Entretanto, há evidência de interações similares ocorrendo localmente dentro de tumores sólidos como uma grande propor-ção das células em tumores sólidos não sejam células cancerosas, mas de preferência, células estromais, imunes ou vasculares derivadas do hospedeiro que interagem intimamente com as células tumorais. Muitos tipos diferentes de tumores sólidos expressam receptores CXCR4 (Engl, Relja e outros, 2006; Müller, Homey e outros, 2001; Koshiba, Hosotani e outros, 2000, Eh- tesham, Stevenson, e outros, 2008; Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle e outros, 2003; Sauer, Seidler e outros, 2005; Su, Zhang e outros, 2005) e/ou CXCR7 (Burns, Summers e outros 2006; Miao e outros, 2007; Wang e outros, 2008; Zheng, Li e outros, 2010) ou constitutivamente ou em resposta à hipóxia ou vários tratamentos. As células malignas podem usar essa via de sinalização para sobrevida e migração por ativação de Akt e Erk. O SDF-1 pode ser produzido pelas próprias células malignas ou pelas células estromais dentro do tumor. Mais uma vez nesse ambiente complexo, o mecanismo exato pelo qual as células tumorais crescem e escapam da quimioterapia ou outras a- bordagens terapêuticas não é claramente definido. Entretanto, está claro que o eixo SDF-1 - CXCR4 e o eixo SDF-1 - CXCR7 desempenham uma função importante. Por exemplo, a inibição de CXCR4 sensibiliza linhagens de células de glioma à quimioterapia in vitro (Redjal e outros, 2006) e a alta expressão de CXCR4 é preditiva de resultado pobre em câncer de mama (Holm, Abreo e outros, 2008; Mizell, Smith e outros, 2009) e cânceres gastrointestinais (Schimanski e outros, 2008). Então, o uso de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 de acordo com a presente invenção para inibir a ação de SDF-1 ou em receptor CXCR4 ou em receptor CXCR7 em uma ampla variedade de tumores sólidos aprimorará a terapia atual de tornar as células mais vulneráveis à terapia ou por ação direta ou bloqueando interações com ou-tras células no tumor.

Em adição aos aspectos acima, CXCR4 também conduz sinais que são cruciais para o recrutamento e retenção de células derivadas da medula óssea pró-angiogênicas e imunossupressoras (BMDCs). Essa via pode então ser também usada para angiogênese independente de VEGF. Como uma consequência, o bloqueio do eixo SDF-1 - CXCR4 para sensibi-lizar tumores à terapia anti-VEGF ou radiação emergiu como um tratamento de estratégia atraente para cânceres sólidos.

Entretanto, há uma preocupação de que o bloqueio de CXCR4 possa não ser suficiente para bloquear os efeitos de SDF-1, que pode tam-bém se ligar a CXCR7 em células cancerosas ou estromais. Por exemplo, CXCR7 foi recentemente relatado como expresso em células tumorais no cérebro e como mediando efeitos antiapoptóticos, e também mostrou-se re-gular a invasão, angiogênese e crescimento de tumor de carcinomas hepa- tocelulares humanos. Em tais casos, a ação de ácidos nucleicos que se li-gam a SDF-1 para bloquear a ação de SDF-1 tanto em receptores CXCR4 quando em receptores CXCR7 em um único agente forneceria uma eficácia particular comparada a bloqueadores de receptor específicos.

O medicamento de acordo com a presente invenção pode ser usado em combinação com um medicamento adicional ou um agente farmaceuticamente ativo adicional, onde o medicamento adicionai ou o agente farmaceuticamente ativo adicional danifica, destrói e/ou marca as células cancerosas. Se a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção for usada com um medicamento adicional ou um agente farmaceuticamente ativo adicional, a terapia que é baseada na molécula de ácido nucleico é preferencialmente uma terapia adjunta à terapia que faz uso ou é baseada no medicamento ou agente farmaceuticamente ativo. Tal medicamento ou agente farmaceuticamente ativo são preferencialmente selecionados a partir, mas não restritos, ao grupo que compreende: (a) anticorpos tais como Rituximabe (alvo: CD20), Cetuximabe (alvo: receptor do fator de crescimento epidérmico), Ibritumomabe-Tiuxetano (alvo: CD20), tositumomabe (alvo: CD20), Trastuzumabe (alvo: HER2/neu), Bevacizumabe (alvo: VEGF), Alentuzumabe (alvo: CD52); (b) agentes alquilantes tais como cisplatina, carboplatina, oxali- platina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, Doxorrubicina, Doxorrubicina lipossomal, bendamustina, Melfalano, temozolomida; (c) antimetabólitos tal como purina-azatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina, cladribina; (d) alcaloides de planta tal como alcaloides da vinca, terpenoides de planta tal como taxanos, preferencialmente Docetaxel, Paclitaxel, podofi- lotoxina, epotilona; (e) inibidores de topoisomerase tal como camptotecina, irinote- cano, mitoxantrona; (f) e outros tais como Leucovorina, Metotrexato, Tamoxifeno, So- rafenibe, Lenalidomida, Bortezomibe, Dexametasona, Flurouracil e Predni- sona.

Outros agentes que podem ser usados como um agente farma-ceuticamente ativo adicional no tratamento de câncer são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a fármacos imunossupresso- res, citocinas, e fármacos citostáticos (para referência: “Allgemeine und Spe- zielle Pharmakologie und Toxikologie 2011”, editor: Thomas Karow; Pulheim, Alemanha). Tais agentes bem conhecidos na técnica são usados no tratamento de câncer de acordo com o padrão atual de cuidado para a população de pacientes com câncer particular.

Sabe-se que os agentes farmaceuticamente ativos especificados acima podem ser usados em conjunto com qualquer aspecto da presente invenção que faz uso de tal agente farmaceuticamente ativo.

O medicamento ou o agente farmaceuticamente ativo tem ou pode fornecer a função de quimioterapia. Alternativa ou adicionalmente à quimioterapia, a radioterapia pode ser usada.

O medicamento de acordo com a presente invenção, em combi-nação com ou sem o medicamento adicional ou agente farmaceuticamente ativo adicional, e com ou sem radioterapia, pode ser usado para o tratamen- to e/ou prevenção de câncer, preferencialmente (a) câncer hematológico, onde mais preferencialmente o câncer hematológico é selecionado a partir do grupo que consiste em leucemia e mieloma. (b) tumores sólidos, onde mais tumores sólidos são seleciona-dos a partir do grupo que consiste em glioblastoma, câncer colorretal, câncer de mama, linfoma, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer renal, e câncer de ovário.

Preferencialmente, o câncer de mama é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama HER2-negativo avançado.

Preferencialmente, a leucemia é selecionada a partir do grupo que consiste em leucemia linfoide crônica e leucemia mieloide aguda.

Preferencialmente, o mieloma é selecionado a partir do grupo que consiste em mieloma múltiplo.

O medicamento adicional preferencial ou agente farmaceutica-mente ativo adicional para o tratamento de glioblastoma é radioterapia ou quimioterapia com temozolomida ou terapia com bevacizumabe. O medica-mento adicional ou agente farmaceuticamente ativo adicional preferencial; para o tratamento de câncer colorretal é selecionado a partir do grupo que consiste em flurouracil, Leucovorin, Oxaliplatina, Irinotecano, e bevacizumabe.

O medicamento adicional ou um agente farmaceuticamente ativo adicional preferencial para o tratamento de câncer de mama HER2-negativo avançado é selecionado a partir do grupo que consiste em Doxorrubicina, Paclitaxel, Docetaxel, Metotrexato, Flurouracil, Bevacizumabe, Tamoxifeno e inibidores de aromatase.

O medicamento adicional ou um agente farmaceuticamente ativo adicional preferencial para o tratamento de leucemia linfoide crônica é selecionado a partir do grupo que compreende fludarabina, ciclofosfamida, ritu- ximabe, Clorambucil, alentuzumabe, vincristina, pentostatina, mitoxantrona, doxorrubicina, cladribina, e bendamustina.

O medicamento adicional ou um agente farmaceuticamente ativo adicional preferencial para o tratamento de mieloma múltiplo é selecionado a partir do grupo que compreende Lenalidomida, Bortezomibe, Dexametasona, Melfalano, Ciclofosfamida, doxorrubicina lipossomal, e prednisona.

Em uma modalidade do medicamento da presente invenção, tal medicamento é para uso em combinação com outros tratamentos para qual-quer das doenças descritas aqui, particularmente aquelas para as quais o medicamento da presente invenção será usado.

A “terapia de combinação” (ou “coterapia”) inclui a administração de um medicamento da invenção e ao menos um segundo agente ou agente adicional como parte de um regime de tratamento específico destinado a fornecer o efeito benéfico a partir da coação desses agentes terapêuticos, isto é, o medicamento da presente invenção e o dito segundo agente ou a- gente adicional. O efeito benéfico da combinação inclui, mas não está limitado à coação farmacocinética ou farmacodinâmica resultante da combinação de agentes terapêuticos. A administração desses agentes terapêuticos em combinação tipicamente é executada ao longo de um período de tempo definido (geralmente minutos, horas, dias, ou semanas dependendo da combinação selecionada).

A “terapia de combinação” pode ser, mas geralmente não é des-tinada a abranger a administração de dois ou mais desses agentes terapêu-ticos como parte de regimes de monoterapia separados. A “terapia de com-binação” é destinada a abranger a administração desses agentes terapêuti-cos de uma maneira sequencial, isto é, onde cada agente terapêutico é ad-ministrado em um tempo diferente, bem como a administração desses agentes terapêuticos, ou ao menos dois dos agentes terapêuticos, de uma maneira substancialmente simultânea. Substancialmente, a administração simultânea pode ser executada, por exemplo, através da administração a um indivíduo de uma única cápsula tendo uma razão fixa de cada agente terapêutico ou em múltiplas cápsulas únicas para cada um dos agentes terapêuticos.

A administração sequencial ou substancialmente simultânea de cada agente terapêutico pode ser efetuada por qualquer via apropriada incluindo, mas não limitada a vias tópicas, vias orais, vias intravenosas, vias in- tramusculares, e absorção direta através de tecidos da membrana mucosa. Os agentes terapêuticos podem ser administrados pela mesma via ou por vias diferentes. Por exemplo, um primeiro agente terapêutico da combinação selecionada pode ser administrado por injeção, enquanto os outros agentes terapêuticos da combinação podem ser administrados topicamente.

Alternativamente, por exemplo, todos os agentes terapêuticos podem ser administrados topicamente ou todos os agentes terapêuticos po-dem ser administrados por injeção. A sequência na qual os agentes terapêuticos são administrados não é estreitamente crucial, a menos que notado de outra forma. A “terapia de combinação” pode também abranger a administração dos agentes terapêuticos como descrito acima em combinação adicional com outros ingredientes biologicamente ativos. Quando a terapia de combinação compreende ainda um tratamento sem fármaco, este pode ser conduzido em qualquer tempo adequado contanto que um efeito benéfico a partir da coação da combinação dos agentes terapêuticos e do tratamento sem fármaco seja alcançado. Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico é ainda alcançado quando o tratamento sem fármaco é temporariamente removido da administração dos agentes terapêuticos, talvez por dias ou até semanas.

Como descrito em termos gerais acima, o medicamento de a- cordo com a presente invenção pode ser administrado, em princípio, de qualquer forma conhecida pelos versados na técnica. Uma via preferencial de administração é administração sistêmica, mais preferencialmente por administração parenteral, preferencialmente por injeção. Alternativamente, o medicamento pode ser administrado localmente. Outras vias de administração compreendem intramuscular, intraperitoneal, e subcutânea, via oral, intranasal, intratecal, ou pulmonar com preferência dada à via de administração que é a menos invasiva, enquanto assegurando eficácia.

A administração parenteral é geralmente usada para injeções subcutâneas, intramusculares ou intravenosas e infusões. Adicionalmente, uma abordagem para a administração parenteral emprega a implantação de sistemas de liberação lenta ou de liberação sustentada, que assegura que um nível constante de dosagem é mantido, que são bem conhecidos pelos versados na técnica.

Ademais, medicamentos preferenciais da presente invenção po-dem ser administrados na forma intranasal via o uso tópico de veículos in- tranasais adequados, inalantes ou por vias transdérmicas, usando aquelas formas de emplastros de pele transdérmicos bem conhecidos pelos versa-dos na técnica. Para ser administrado na forma de um sistema de liberação transdérmica, a administração de dosagem, é claro, será contínua ao invés de intermitente por todo o regime de dosagem. Outras preparações tópicas preferenciais incluem cremes, pomadas, loções, aerossóis e géis.

Os indivíduos que responderão favoravelmente ao método da invenção incluem indivíduos médicos e veterinários geralmente, incluindo seres humanos e pacientes humanos. Dentre os indivíduos para quem os métodos e dispositivos da invenção são úteis estão gatos, cães, grandes animais, aves tal como galinhas, e similares.

O medicamento da presente invenção compreenderá geralmente uma quantidade eficaz do componente(s) ativo(s) da terapia, incluindo, mas não limitado a uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, dissolvido ou disperso em um meio farmaceuticamente aceitável. Os meios ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e anti- fúngicos, agentes isotônicos e de retardamento de absorção e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Ingredientes ativos suplementares podem também ser incorporados no medicamento da presente invenção.

Em um aspecto adicional, a presente invenção está relacionada a uma composição farmacêutica. Tal composição farmacêutica compreende ao menos um dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção e preferencialmente um ligante farmaceuticamente aceitável. Tal ligante pode ser qualquer ligante usado e/ou conhecido na técnica. Mais particularmente, tal ligante é qualquer ligante como discutido em conjunto com a fabricação do medicamento descrito aqui. Em uma modalidade adicional, a composição farmacêutica compreende um agente farmaceuticamente ativo adicional.

A preparação de um medicamento e de uma composição farma-cêutica será conhecida pelos versados na técnica face à presente descrição. Tipicamente, tais composições podem ser preparadas como injetáveis, ou como soluções líquidas ou suspensões; formas sólidas adequadas para solução em líquido ou suspensão em líquido antes da injeção; como comprimidos ou outros sólidos para administração oral; como cápsulas de liberação ao longo do tempo; ou em qualquer outra forma atualmente usada, incluindo colírios, cremes, loções, pomadas, inalantes e similares. O uso de formulações estéreis, tal como lavagens à base de solução salina, por cirurgiões, médicos ou profissionais de assistência médica para tratar uma área particular no campo de operação pode também ser particularmente útil. As composições podem também ser entregues via microdispositivos, micropartículas ou esponja.

Mediante a formulação, um medicamento será administrado de uma maneira compatível com a formulação de dosagem, e em tal quantida-de como farmacologicamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tal como o tipo de soluções injetáveis descritas acima, mas cápsulas de liberação de fármacos e similares podem ser empregadas.

O medicamento da invenção pode também ser administrado em formas de dosagem oral como comprimidos ou cápsulas de liberação controlada e sustentada, pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes, e emulsões. Os supositórios são vantajosamente preparados a partir de emulsões graxas ou suspensões.

A composição farmacêutica ou medicamento pode ser esterilizado e/ou conter adjuvantes, tal como agentes conservantes, estabilizantes, umectantes ou emulsificantes, promotores de solução, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões. Em adição, eles podem conter outras substâncias terapeuticamente valiosas. As composições são preparadas de a- cordo com métodos de misturação convencionais, granulação, ou revestimento, e tipicamente contêm aproximadamente 0,1% a 75%, preferencialmente aproximadamente 1 % a 50% do ingrediente ativo.

As composições líquidas, particularmente injetáveis podem, por exemplo, ser preparadas por dissolução, dispersão, etc. O composto ativo é dissolvido ou misturado com um solvente farmaceuticamente puro tal como, por exemplo, água, solução salina, dextrose aquosa, glicerol, etanol, e simi-lares, para formar assim a solução injetável ou suspensão. Adicionalmente, formas sólidas adequadas para dissolução em líquido antes da injeção po-dem ser formuladas.

Os medicamentos e moléculas de ácido nucleico, respectiva-mente, da presente invenção podem também ser administrados na forma de sistemas de liberação de lipossoma, tal como pequenas vesículas unilamela- res, grandes vesículas unilamelares e vesículas multilamelares. Os liposso- mas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolipídios, contendo colesterol, estearilamina, ou fosfatidilcolinas. Em algumas modalidades, uma película de componentes lipídicos é hidratada com uma solução aquosa de fármaco para formar uma camada de lipídio encapsulando o fármaco, o que é bem conhecido pelos versados na técnica. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico descritas aqui podem ser fornecidas como um complexo com um composto lipofílico ou composto de alto peso molecular não imuno- gênico construído usando métodos conhecidos na técnica. Adicionalmente, os lipossomas podem apresentar tais moléculas de acido nucleico em sua superfície para direcionar e carregar agentes citotóxicos internamente para mediar a morte celular. Um exemplo de complexos associados a ácido nucleico é fornecido na Patente US. No. 6.011.020.

Os medicamentos e moléculas de ácido nucleico, respectiva-mente, da presente invenção podem ser acoplados com polímeros solúveis como carreadores de fármaco direcionáveis. Tais polímeros podem incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, poli-hidroxipropil-metacrilamida- fenol, poli-hidroxietilaspanamidafenol, ou polietileno-oxidopolilisina substituída com resíduos de palmitoil. Ademais, os medicamentos e moléculas de ácido nucleico, respectivamente, da presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis úteis em alcançar a liberação controlada de um fármaco, por exemplo, ácido polilático, poliepsilon capro- plactona, ácido poli-hidróxi butírico, poliortoésteres, poliacetais, poli-di- hidropiranos, policianoacrilatos e copolímeros de bloco reticulados ou antipáticos de hidrogéis.

Se desejado, a composição farmacêutica e medicamento, res-pectivamente, a serem administrados podem também conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas tal como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, e outras substâncias tal como, por exemplo, acetato de sódio, e oleato de trietanolamina.

O regime de dosagem utilizando as moléculas de ácido nucleico e medicamentos, respectivamente, da presente invenção é selecionado de acordo com uma variedade de fatores incluindo tipo, espécie, idade, peso, sexo e condição médica do paciente, a gravidade da condição a ser tratada, a via de administração, a função renal e hepática do paciente, e o aptâmero particular ou o sal desse empregado. Um médico ou veterinário versado na técnica pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz do fármaco exigida para impedir, opor ou interromper o progresso da condição.

Os níveis eficazes de plasma do ácido nucleico de acordo com a presente invenção preferencialmente estão na faixa de 500 fM a 200 μM, preferencialmente de 1 nM a 20 μM, mais preferencialmente de 5 nM a 20 μM, mais preferencialmente 50 nM a 20 μM no tratamento de qualquer uma das doenças descritas aqui.

As moléculas de ácido nucleico e medicamentos, respectiva-mente, da presente invenção podem ser preferencialmente administrados em uma única dose diária, a cada segundo ou terceiro dia, semanalmente, a cada segunda semana, em uma única dose mensal ou a cada terceiro mês.

Está dentro da presente invenção que o medicamento como descrito aqui constitui a composição farmacêutica descrita aqui.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento de um indivíduo que está em necessidade de tal tratamento, onde o método compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamente ativa de ao menos um dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o indivíduo sofre de uma doença ou está em risco de desenvolver tal doença, onde a doença é qual-quer uma das descritas aqui, particularmente qualquer das doenças descri-tas em conjunto com o uso de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medicamento.

Como preferencialmente usado aqui, o termo ‘tratamento’ com-preende em uma modalidade preferencial adicional ou alternativamente pre-venção e/ou acompanhamento.

Como preferencialmente usado aqui, os termos ‘doença’ e ‘distúrbio’ devem ser usados de uma maneira intercambiável, se não indicado ao contrário.

Como usado aqui, o termo ‘compreende’ é preferencialmente não destinado a limitar o assunto seguido ou descrito por tal termo. Entretanto, em uma modalidade alternativa, o termo ‘compreende’ deve ser entendido no sentido de conter e assim como limitando o assunto seguido ou descrito por tal termo.

As várias SEQ ID NOs, a natureza química das moléculas de á- cido nucleico de acordo com a presente invenção e as moléculas alvo SDF-1 como usadas aqui, a sequência real dessas e o número de referência interno são resumidos na seguinte tabela. Deve-se notar que os ácidos nucleicos foram caracterizados no aptâmero, isto é, nível de ácido D-nucleico (D-RNA) com o D-SDF-1 humano biotinilado (SEQ ID NO: 4) ou no nível de spiegel- mer, isto é, ácido L-nucleico (L-RNA) com a configuração natural de SDF-1, o L-SDF-1 (SDF-1 humano α, SEQ ID NO: 1). Os diferentes ácidos nucleicos compartilham um nome de referência interno, mas uma SEQ ID NOs: para a molécula de D-RNA (aptâmero) e uma SEQ ID NOs: para a molécula de L- RNA (spiegelmer), respectivamente.Tabela 1

A presente invenção é ainda ilustrada pelas figuras, exemplos ea listagem de sequência a partir dos quais características, modalidades e vantagens adicionais podem ser obtidas, onde:

A FIG. 1 mostra um alinhamento de sequências de moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do “tipo A”.

As Figuras 2A e 2B mostram derivados da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 192-A10-001 (moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do “tipo A”).

A FIG. 3 mostra um alinhamento de sequências de moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do “tipo B”.

As Figuras 4A e 4B mostram derivados de moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 193-C2-001 e 193-G2-001 (moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do tipo B).

A FIG. 5 mostra um alinhamento de sequências de moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do “tipo C”.

A FIG. 6 mostra derivados da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 190-A3-001 (moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do “tipo C”).

As Figuras 7A e 7B mostram derivados da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 190-D5-001 (moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do “tipo C”).

A FIG. 8 mostra derivados da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 197-B2 (moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do “tipo C”).

A FIG. 9 mostra ainda moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 que são, em adição a outras moléculas de ácido nucleico de ligação a a SDF-1, também chamadas de moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do “tipo D”.

A FIG. 1O mostra a eficácia de spiegelmers que se ligam a SDF- 1 193-G2-012-5-PEG (também chamados de NOX-A12), 197-B2-006-5’- PEG, 191-D5-007-5’-PEG e 191-A10-008-5’-PEG em um ensaio de quimio- taxia com a linhagem de células de leucemia em células T humanas Jurkat onde as células são permitidas a migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano pré-incubado a 37°C com várias quantidade de spiegelmers 193-G2- 012-5’-PEG, 197-B2-006-5’-PEG, 191-D5-007-5’-PEG e 191-A10-008-5’- PEG, representados como porcentagem de controle sobre a concentração de spiegelmers 193-G2-012-5’-PEG, 197-B2-006-5’-PEG, 191-D5-007-5’- PEG e 191-A10-008-5-PEG.

A FIG. 11A mostra a eficácia do spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 em um ensaio de quimiotaxia com a linhagem de células ALL pré- B Nalm-6, onde as células foram deixadas migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano pré-incubadas a 37°C com várias quantidades de spiegelmer NOX-A12 representadas como a porcentagem de controle sobre a concentração de spiegelmer NOX-A12.

A FIG. 11B mostra a eficácia do spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 em um ensaio de quimiotaxia com a linhagem de células de linfo- ma em monócitos humanas leucêmicos U937, onde as células foram deixadas migrar em direção a 3 nM de SDF-1 humano pré-incubadas a 37°C com várias quantidades de spiegelmer NOX-A12 representadas como a porcentagem de controle sobre a concentração de spiegelmer NOX-A12.

A FIG. 12 mostra a eficácia do spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 em um ensaio de quimiotaxia com a linhagem de células de leucemia pré-B BV-173, onde as células foram deixadas migrar em direção a 3 nM de SDF-1 humano pré-incubadas a 37°C com várias quantidades de spiegelmer NOX-A12 representadas como a porcentagem de controle sobre a concentração de spiegelmer NOX-A12.

A FIG. 13 mostra a eficácia de spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 em um ensaio de complementação com células CHO estavelmen- te expressando CXCR7 e β-arrestina ambos fundidos a um fragmento de β- galactosidase, onde CXCR7 das células foi ativado em direção a 10 nM de SDF-1 humano pré-incubado a 37°C com várias quantidades de spiegelmer NOX-A12 representado como porcentagem de controle sobre a concentração de spiegelmer NOX-A12.

A FIG. 14 mostra a inibição de brotamento induzido por SDF-1 por spiegelmer que se liga a SDF-1 humano 193-G2-012-5’-PEG (também chamado de NOX-A12) e por spiegelmer de controle PEGilado em ensaio de brotamento de anel aórtico, onde os anéis da aorta de ratos foram embebidos em matriz de colágeno e incubados por 6 dias com SDF-1 com ou sem spiegelmers (a: controle; b: 10 nM SDF-1; c: 10 nM SDF-1 + 1 μM de spiegelmer que se liga a SDF-1 humano 193-G2-012-5’-PEG; d: 10 nM SDF-1 + 1 μM de spiegelmer de controle PEGilado).

A FIG. 15 mostra a inibição de brotamento induzido por SDF-1 por spiegelmer que se liga a SDF-1 humano 193-G2-012-5’-PEG (também chamado de NOX-A12) e por spiegelmer de controle PEGilado em ensaio de brotamento de anel aórtico, onde os índices de brotamento são mostrados como média +/- SD para 5 anéis por condição (*: o valor para SDF-1 é significativamente diferente do controle (teste de Mann-Whitney; p = 0,008); **: o valor para SDF-1 + spiegelmer que se liga a SDF-1 humano 193-G2-012-5’- PEG é significativamente diferente do valor para SDF-1 (teste de Mann- Whitney; p = 0,028).

A FIG. 16 mostra a eficácia de spiegelmer que se liga a SDF-1 humano NOX-A12 para sensibilizar células RPMI-8226 MM a F-ara-A (Flu- darabina), onde as células MS-5 murinas confluentes secretando SDF-1 foram incubadas com spiegelmer que se liga a SDF-1 humano NOX-A12 ou com revNOX-A12 não funcional e subsequentemente cocultivadas com células RPMI-8226 MM; as células foram tratadas com 1 μM de F-ara-A por 40 horas e a viabilidade celular foi medida por citometria de fluxo usando Reagente ViaCount As barras de erro indicam SD, N = 5, * p = 0,0134, *** p = 0,0003 (duas caudas, teste-t não pareado).

A FIG. 17 mostra a eficácia de spiegelmer que se liga a SDF-1 humano NOX-A12 para inibir a proliferação de células Jurkat em cocultura om células MS-5 estromais, onde as células MS-5 estromais murinas secre- tando SDF-1 foram incubadas com concentrações crescentes de spiegelmer que se liga a SDF-1 humano NOX-A12; as células Jurkat foram adicionadas à camada de células MS-5 confluentes e as contagens de células foram medidas após 40 horas por citometria de fluxo usando Reagente ViaCount. As barras de erro indicam SD, N = 4, *** p = 0,0008 (duas caudas, teste-t não pareado).

As Figuras 18A e 18B mostram a eficácia de spiegelmer que se liga a SDF-1 humano NOX-A12 para reverter a adesão dose-dependente de SDF-1 de células Jurkat à fibronectina, onde as células Jurkat foram incubadas com SDF-1 sozinho (A), com SDF-1 e concentrações crescentes de spiegelmer que se liga a SDF-1 humano NOX-A12 ou com SDF-1 e concentrações crescentes de spiegelmer de controle revNOX-A12 (B) por 30 minutos e semeadas em placas revestidas com fibronectina por 15 minutos; as células foram subsequentemente removidas por lavagem com meios e as células acopladas foram quantificadas usando Reagente Cell Titer Gio. As barras de erro indicam SD.

Exemplo 1: Ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 humano.

Em seguida, os termos ‘ácido nucleico’ e ‘molécula de ácido nucleico’ são usados aqui de uma maneira sinônima, se não indicado ao contrário. Ademais, os termos ‘extensão’ e ‘extensão de nucleotídeo’ são usados aqui de uma maneira sinônima, se não indicado ao contrário.

As moléculas de ácido L-nucleico que se ligam a SDF-1 e as respectivas sequências de nucleotídeo são representadas nas Figuras 1 a 9. Os ácidos nucleicos foram caracterizados no aptâmero, isto é, nível do ácido D-nucleico usando ensaios de ligação “Pull-down” competitivos ou diretos com D-SDF-1 humano biotinilado (protocolo, ver Exemplo 3). Os spiegelmers foram testados com a configuração natural de SDF-1 (L-SDF-1) por medição de ressonância plasmônica de superfície usando instrumento Bia- core 2000 (protocolo, ver Exemplo 5) e um ensaio de quimiotaxia in vitro da cultura de células (protocolo, ver Exemplo 4).

As moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 exibem diferentes motivos de sequência, três tipos principais são definidos nas Figuras 1, 2A e 2B (Tipo A), Figuras 3, 4A e 4B (Tipo B), Figuras 5, 4, 7A, 7B e 8 (tipo C). As moléculas de ácido nucleico exibem diferentes motivos de sequência. Para a definição de motivos de sequência de nucleotídeo, as abreviações lUPAC para nucleotídeos ambíguos são usadas:

Se não indicado ao contrário, qualquer sequência de ácido nucleico ou sequência de extensões e caixas, respectivamente, é indicada na direção 5’ -> 3’.

Moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do tipo A Como descrito na FIG. 1, todas as sequências de moléculas deácido nucleico que se ligam a SDF-1 do tipo A compreendem uma extensão central de nucleotídeos que é flanqueado pelo primeiro (5’-)terminal e a segunda extensão (3’-)terminal de nucleotídeos (também chamados de primeira extensão terminal de nucleotídeos e segunda extensão terminal de nucle- otídeos), onde ambos as extensões podem hibridizar entre si. Entretanto, tal hibridização não é necessariamente dada na molécula.

Em seguida, os termos “moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do tipo A” e “ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A” ou “moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do tipo A” são usados aqui de uma maneira sinônima, se não indicado ao contrário.

As sequências das caixas ou extensões definidos de nucleotídeos podem ser diferentes entre os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A que influencia a afinidade de ligação a SDF-1. Com base na análise da ligação de diferentes ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 resumidos como ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A, a extensão central de nucleotídeos e suas sequências de nucleotídeo, como descrito em seguida, são individualmente e mais preferencialmente em sua integridade essenciais para a ligação a SDF-1.

A extensão central de nucleotídeos de todas as sequências de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A compartilham a sequência AAAGYRACAHGUMAAXAUGAAAGGUARCI (Fórmula 1 Tipo A, SEQ ID NO: 74), onde XA está ou ausente ou é ‘A’. Se ‘A’ estiver ausente, a sequência do nucleotídeo central pode ser resumida como Fórmula 2 Tipo A, (|AAAGYRA- CAHGUMAA-UGAAAGGUARCI, SEQ ID NO: 75). O ácido nucleico que se liga a SDF-1 191-A6 (sequência de nucleotídeo central: |AAAGUAACAC- GUAAAAUGAAAGGUAAC|, SEQ ID NO: 54) carregando o nucleotídeo adicional ‘A’ dentro da sequência de nucleotídeo central e ainda se ligando a SDF-1 faz concluir uma sequência de nucleotídeo central alternativa (|AA- AGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARCI, Fórmula 3 Tipo A, SEQ ID NO: 76). De forma exemplificada para todos os outros ácidos nucleicos dos ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A, o ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A 192-A10-001 foi caracterizado por sua afinidade de ligação a SDF-1 humano. A constante de ligação de equilíbrio KD foi determinada usando o ensaio de ligação “Pull-down” (KD =1,5 nM) e por medição de ressonância plasmônica de superfície (KD = 1,0 nM). O IC50 (concentração inibitória para 50%) de 0,12 nM para 192-A10-001 foi medida usando um ensaio de quimiotaxia in vitro de cultura celular. Consequentemente, todos os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A, como descrito na FIG. 1, foram analisados em um ensaio de ligação de “Pull-down” competitivo versus 192-A10-001. Os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A 192-B11 e 192-C10 mostraram afinidades de ligação iguais a 192-A10-001 nesses experimentos de competição. A afinidade de ligação mais fraca foi determi-nada para os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A 192-G10, 192-F10, 192-C9, 192-E10, 192-D11, 192-G11, 192-H11 e 191-A6. Os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A 192-D10, 192-E9 e 192-H9 têm afinidade de ligação muito mais fraca do que 192-A10-001.

Como mencionado acima, os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A 192-B11 e 192-C10 exibem afinidade de ligação a SDF-1 igual a 192-A10-001. Entretanto, eles mostram leves diferenças na sequência de nucleotídeos da extensão central de nucleotídeos. Então, a sequência consenso das três moléculas que se ligam a SDF-1 com quase a mesma afinidade pode ser resumida pela sequência de nucleotídeo [AAAGYA/V CAHGUCAAUGAAAGGUARCl (Fórmula 4 tipo A, SEQ ID NO: 77), onde a sequência de nucleotídeo da extensão central de nucleotídeos de 192-A10- 001 (sequência de nucleotídeo: |AAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGC|, SEQ ID NO: 84) representa a sequência de nucleotídeo com a melhor afinidade de ligação de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1.

Cinco ou seis dos seis nucleotídeos da extensão 5’-terminal (também chamado de primeira extensão terminal) de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A podem hibridizar para os respectivos cinco ou seis nucleotídeos dos seis nucleotídeos da extensão 3’-terminal (também chamado de segunda extensão terminal) para formar uma hélice terminal. Embora esses nucleotídeos estejam disponíveis em várias posições, os diferentes nucleotídeos permitem a hibridização de cinco ou seis dos seis nucleotídeos das extensões 5’- e 3’-terminal. As extensões 5’-terminal e 3’- terminal de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A, como mostrado na FIG. 1, podem ser resumidos em uma fórmula genérica para a extensão 5’-terminal (‘RSHRYR’, Fórmula 5-5’ tipo A) e para a extensão 3’-terminal (‘YRYDSY’, Fórmula 5-3’ tipo A). Os derivados truncados do ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A 192-A10-001 foram analisados em um ensaio de ligação “Pull-down” competitivo versus a molécula original 192-A10-001 e 192-A10-008 (FIG. 2A e 2B). Esses experimentos mostraram que uma redução dos seis nucleotídeos terminais (extremidade 5’: GCUGUG; extremidade 3’: CGCAGC) de 192-A10-001 para cinco nucleotídeos (extremidade 5’: CUGUG; extremidade 3’: CGCAG) do derivado 192-A10-002 poderia ser feita sem redução da afinidade de ligação. Entretanto, o truncamento para quatro nucleotídeos terminais (extremidade 5’: UGUG; extremidade 3’: CG- CA; 192-A10-003) ou menos (192-A10-004/ -005/ -006/ -007) levou à afinidade de ligação a SDF-1 reduzida (FIG. 2A). As extensões 5’-terminal e 3’- terminal determinados com um comprimento de cinco e quatro nucleotídeos dos derivados de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A 192-A10-001, como mostrado nas Figuras 2A e 2B, podem ser descritos em uma fórmula genérica para a extensão 5’-terminal (‘X2BBBS’, Fórmula-6-5’ tipo A) e da extensão 3’-terminal (‘SBBVX3’; Fórmula-6-3’ tipo A), onde X2 está ou ausente ou é ‘S’ e X3 está ou ausente ou é ‘S’.

A sequência de nucleotídeo das extensões 5’-terminal e 3’- terminal tem uma influência na afinidade de ligação de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A. Isso não é somente mostrado pelos ácidos nucleicos 192-F10 e 192-E10, mas também por derivados de 192-A10-001 (FIG. 2B). A extensão central de 192-F10 e 192-E10 são idênticos a 192-B11 e 192-C10, mas compreendem leves diferenças na extremidade 3’ da extensão 5’-terminal e na extremidade 5’ da extensão 3’-terminal resultando em afinidade de ligação reduzida.

A substituição de nucleotídeos 5’-terminal e 3’-terminal ‘CUGUG’ e ‘CGCAG’ do ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A 192-A10-002 por ‘GCGCG’ e ‘CGCGC’ (192-A10-015) resultou em uma afinidade de ligação reduzida, onde as substituições por ‘GCGUG’ e ‘CGCGC’ (192-A10-008) resultaram na mesma afinidade de ligação como mostrado para 192-A10- 002 (Fig. 2B). Adicionalmente, nove derivados de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A 192-A10-001 (192-A10-014/-015/ -016/ -017/ -018/ -019/ - 020/ -021/ -022/ -023) dotados de quatro nucleotídeos 5’-terminal e 3’- terminal respectivamente foram testados como aptâmeros para sua afinidade de ligação versus 192-A10-001 ou seu derivado 192-A10-008 (ambos têm a afinidade de ligação idêntica a SDF-1). Todas as moléculas mostraram afinidade de ligação a SDF-1 mais fraca ou muito mais fraca como 192-A10- 001 (seis nucleotídeos formando uma hélice terminal) ou como 192-A10-008 com cinco nucleotídeos terminais, respetivamente (FIG. 2B). Consequentemente, a sequência e 0 número de nucleotídeos das extensões 5’-terminal e 3’-terminal são essenciais para uma ligação eficaz a SDF-1. Como mostrado para os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A 192-A10-002 e 192-A10-008, a combinação preferencial de extensões 5’-terminal e 3’- terminal são ‘CUGUG’ e ‘CGCAG’ (extensões 5’-terminal e 3’-terminal de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A 192-A10-002) e ‘GCGUG’ e ‘CGCGC’ (extensões 5’-terminal e 3’-terminal de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A 192-A10-008).

Entretanto, combinando-se as extensões 5’-terminal e 3’-terminal de todos os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A, a fórmula genérica para a extensão 5’-terminal de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A é ‘XIX2NNBV’ (Fórmula-7-5’ tipo A) e a fórmula genérica para a extensão 3’-terminal de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo A é ‘BNBNX3X4’ (Fórmula-7-3’ tipo A), onde Xi é ‘R’ ou está ausente, X2 é ‘S’, X3 é ‘S’ e X4 é ‘Y’ ou está ausente; ou Xi está ausente, X2 é ‘S’ ou está ausente, X3 é ‘S’ ou está ausente e X4 está ausente.

De modo a prolongar o tempo de residência de plasma do spiegelmer in vivo, os spiegelmers 192-A10-008 foram covalentemente acoplados a uma porção de 40 kDa de polietileno glicol (PEG) na extremidade 5’ como descrito no capítulo 2. A porção PEG não teve influência na potência dos spiegelmers em inibir a quimiotaxia induzida por SDF-1.

Moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do tipo B Como descrito na FIG. 3, todas as sequências de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo B compreendem uma extensão central de nucleotídeos que é flanqueado por extensões 5’-terminal e 3’-terminal (também chamados de primeiro e segunda extensão terminal de nucleotídeos) que podem hibridizar entre si. Entretanto, tal hibridização não é necessariamente dada na molécula.

Em seguida, os termos ‘moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do tipo B’ e ‘ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo B’ ou ‘moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do tipo B’ são usados aqui de uma maneira sinônima se não indicado ao contrário.

As sequências das caixas ou extensões definidos podem ser diferentes entre os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 que influenciam a afinidade de ligação a SDF-1. Com base na análise de ligação dos diferentes ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1, a extensão central de nucleotídeos e suas sequências de nucleotídeo, como descrito em seguida, são individualmente e mais preferencialmente em sua integridade essenciais para ligação a SDF-1.

A extensão central de nucleotídeos de todas as sequências iden-tificadas de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 193-C2-001, 193-G2- 001, 193-F2-001, 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002, 193-D3-002, 193- B3-002, 193-H3-002, 193-E3-002 e 193-D1-002 compartilham a sequência GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG|(Fórmula-1 tipo B, SEQ ID NO: 52). Os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 193-G2-001, 193-C2-001 e 193-F2-001 que diferem em uma posição da extensão central de nucleotídeos (sequência consenso de extensão central de nucleotídeos: GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGGl (Fórmula-2 tipo B, SEQ ID NO: 53) foram analisados em um ensaio de ligação “Pull-down” competitivo versus o ácido nucleico que se liga a SDF-1 192-A10-001 (KD de 1,5 nM terminado em um ensaio de ligação “pull-down”, IC5o de 0,12 nM). Cada um dos ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 193-G2-001, 193-C2- 001 e 193-F2 mostrou ligação superior a SDF-1 humano em comparação ao ácido nucleico que se liga a SDF-1 192-A10-001, onde a afinidade de ligação de 193-G2-001 é tão boa quanto a de 193-C2-001 e 193-F2-001 (FIG. 3). Os dados sugerem que a diferença na sequência de nucleotídeo da extensão central de nucleotídeos de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 193-G2-001, 193-C2-001 e 193-F2-001 não teve influência na afinidade de ligação a SDF-1. Os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002, 193-D3-002, 193-B3-002, 193-H3-002, 193-E3- 002 e 193-D1-002 mostraram ligação reduzida a SDF-1 humano em comparação ao ácido nucleico que se liga a SDF-1 193-G2-001. O ácido nucleico que se liga a SDF-1 193-G2-001 foi caracterizado por sua afinidade de ligação a SDF-1 humano. A constante de ligação em equilíbrio KD foi determinada usando o ensaio de ligação “pull-down” (KD = 0,3 nM). A IC50 (concentração inibitória para 50%) de 0,08 nM para 193-G2-001 foi medida usando um ensaio de quimiotaxia in vitro de cultura celular.

Quatro, cinco ou seis nucleotídeos dos seis nucleotídeos da extensão 5’-terminal de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 podem hibridi- zar aos respectivos quatro, cinco ou seis dos seis nucleotídeos da extensão 3’- terminal de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 para formar uma hélice terminal.

Embora os nucleotídeos sejam variáveis em várias posições, os diferentes nucleotídeos permitem a hibridização para quatro, cinco ou seis nucleotídeos dos seis nucleotídeos das extensões 5’-terminal e 3’-terminal. As extensões 5’-terminal e 3’-terminal de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1, como mostrado na FIG. 3, podem ser resumidos em uma fórmula genérica para a extensão 5’-terminal (‘X^GCRWG’ onde Xi é ‘A ou está ausente, X2 é ‘G’) e da extensão 3’-terminal (‘KRYSCX3X4 onde X3 é ‘G’, X4 é ‘U’ ou está ausente). Os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 193-G1- 002, 193-D2-002, 193-A1-002 e 193-D3-002 têm afinidades de ligação a SDF-1 mais fracas embora eles compartilhem a extensão central idêntico de nucleotídeos com 193-C2-001, 193-G2-001 e 193-F2-001 (Fig. 3). As propriedades de ligação desfavoráveis de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002 e 193-D3-002 podem ser devido ao número de nucleotídeos e sequência das extensões 5’-terminal e 3’-terminal.

Os derivados truncados dos ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 193-G2-001 e 193-C2-001 foram analisados em um ensaio de ligação “pull-down” competitivo versus 193-G2-001 e 193-G2-012, respectivamente (Fig. 4A e 4B). Esses experimentos mostraram que uma redução dos seis nucleotídeos terminais (extremidade 5’: AGCGUG; extremidade 3’: UACG- CU) de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 193-G2-001 e 193-C2-001 para cinco nucleotídeos (extremidade 5’: GCGUG; extremidade 3’: UACGC) levam a moléculas com afinidade de ligação similar (193-C2-002 e 193-G2- 012). A constante de dissociação em equilíbrio KD foi determinada usando o ensaio de ligação “pull-down” (KD = 0,3 nM). Um truncamento para quatro (extremidade 5’: CGUG; extremidade 3’: UACG; 193-C2-003) ou menos nu-cleotídeos (193-C2-004, 193-C2-005, 193-02-006, 193-C2-007) resultou em uma afinidade de ligação a SDF-1 reduzida, que foi medida usando o ensaio de ligação “pull-down” de competição (FIG. 4A). A sequência de nucleotídeo dos cinco nucleotídeos terminais na extremidade 5’ e na extremidade 3’, respectivamente, tem uma influência na afinidade de ligação de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1. A substituição de nucleotídeos 5’-terminal e 3’-terminal ‘GCGUG’ e ‘UACGC’ (193-C2-002, 193-G2-12) por ‘GCGCG’ e ‘CGCGC’ (193-G2-013) resultou em uma afinidade de ligação reduzida. Adicionalmente, os quatro derivados diferentes do ácido nucleico que se liga a SDF-1 193-G2-001 com uma hélice terminal com um comprimento de quatro nucleotídeos de pareamento de bases (193-G2-014Z -015/ -016/ -017) foram testados. Todos eles mostraram afinidade de ligação a SDF-1 reduzida (FIG. 4B). Então, a sequência e o comprimento dos nucleotídeos 5’-terminal e 3’- terminal são essenciais para uma ligação eficaz a SDF-1. As extensões 5’- terminal e 3’-terminal com um comprimento de cinco e quatro nucleotídeos dos derivados de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 193-C2-003 e 193- G2-012, como mostrado nas Figuras 4A e 4B, podem ser descritos em uma fórmula genérica para a extensão 5’-terminal (‘X1X2SSBS’), onde Xi está ausente, X2 está ou ausente ou é ‘G’, e da extensão 3’-terminal (‘BVSSX3X4), e onde X3 está ou ausente ou é ‘C’ e X4 está ausente. Como mostrado para os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 193-G2-001 e 193- C2-01 e seus derivados 193-G2-012 e 193-C2-002, a combinação preferencial de extensões 5’-terminal e 3’-terminal é ‘X1X2GCGUG’ (extensão 5’- terminal) e ‘UACGCX3X4’ (extensão 3’-terminal), onde Xi é ou ‘A’ ou está ausente, X2 é ‘G’ e X3 é ‘C’ e ’X4 é ‘U’ ou está ausente.

Entretanto, combinando-se as extensões 5’-terminal e 3’-terminal de todos os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 testados, a fórmula genérica para a extensão 5’-terminal de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 é ‘X1X2SVNS’ e a fórmula genérica para a extensão 3’-terminal de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 é ’BVBSX3X4’, onde Xi é ‘A’ ou está ausente, X2 é ‘G’, X3 é ‘C’ e X4 é ‘U’ ou está ausente; ou XÍ está ausente, X2 é ‘G’ ou está ausente, X3 é ‘C’ ou está ausente e X4 está ausente.

De modo a prolongar o tempo de residência em plasma do spiegelmer in vivo, 0 spiegelmer 193-G2-012 foi covalentemente acoplado a uma porção de 40 kDA de polietileno glicol (PEG) na extremidade 5’ como descrito no capítulo 2 (molécula de ácido nucleico PEGilada: 193-G2-012-5’-PEG também chamada de NOX-A12). O spiegelmer PEGilado NOX-A12 foi analisado em cultura celular em um ensaio de quimiotaxia in vitro e uma inibição de quimiotaxia induzida por SDF-1 foi determinada (IC50 de 0,2 nM). O spiegelmer PEGilado NOX-A12 foi analisado por medição Biacore e uma constante de ligação (KD) de 0,2 nM foi determinada.

Moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do tipo C

Como representado na FIG. 12, todas as sequências de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo C compreendem uma extensão central de nucleotídeo que é flanqueado por extensões 5’-terminal e 3’-terminal (também chamado de primeira extensão terminal e segunda extensão terminal de nucleotídeos) que podem hibridizar entre si. Entretanto, tal hibridização não é necessariamente dada na molécula.

Em seguida, os termos ‘moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do tipo C’ e ‘ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo C’ ou ‘moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do tipo C’ são usados aqui de uma maneira sinônima, se não indicado ao contrário.

As sequências das caixas ou extensões definidos podem ser diferentes entre os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo que influencia a afinidade de ligação a SDF-1. Com base na análise de ligação dos diferentes ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 resumidos como ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo C, a extensão central de nucleotídeos e sua sequência de nucleotídeo como descrita em seguida são individualmente e mais preferencialmente em sua integridade essenciais para a ligação a SDF-1.

As extensões centrais de nucleotídeos de todas as sequências identificadas de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo C compartilham a sequência |GGUYAGGGCUHRXAAGUCGG (Fórmula-1 tipo C, SEQ ID NO: 108), onde XA está ou ausente ou é ‘A’. Com a exceção do ácido nucleico que se liga a SDF-1 197-D1, a extensão central de nucleotídeos de todas as sequências de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo C compartilham a sequência de nucleotídeo |GGUYAGGGCUHRAAGUCGG| (Fórmula-2 tipo C, SEQ ID NO: 109). O ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C 197-D1 (extensão central de nucleotídeos: |GGUUAGGGCUA-| |A-AGUCGG| (SEQ ID NO: 56) com a falta de um nucleotídeo A’ dentro da extensão central de nucleotídeos e ainda se ligando a SDF-1 faz concluir uma extensão central alternativo de nucleotídeos (GGUYAGGGCU- |HR-AGUCGG, Fórmula-3 tipo C, SEQ ID NO: 110). Inicialmente, todos os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo C, como descritos na FIG. 5, foram resumidos em um ensaio de ligação “pull-down” competitivo versus o ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A 192-A10-001 (KD = 1,5 nM de-terminado por ensaio “pull-down” e por medições de ressonância plasmônica de superfície; IC5o = 0,12 nM). Os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo C 191-D5-001, 197-B2, 190-A3-001, 197-H1, 197-H3 e 197-E3 mostraram afinidades de ligação mais fracas do que 192-A10-001 em experimentos de competição. A afinidade de ligação muito mais fraca foi determinada para 191-A5, 197-B1, 197-D1, 197-H2 e 197-D2 (FIG. 5). As moléculas ou derivados dessas foram ainda caracterizados por ensaios de ligação “pull-down” competitivos, medições de ressonância plasmônica e um ensaio de quimiotaxia in vitro. O ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C 191-D5-001 foi caracterizado por sua afinidade de ligação a SDF-1 humano, onde a constante de ligação em equilíbrio KD foi determinada por medição de ressonância de superfície plasmônica (KD = 0,8 nM). O IC50 (concentração inibitória para 50%) de 0,2 nM para 191-D5-001 foi medido usando ensaio de quimiotaxia in vitro de cultura celular.

A afinidade de ligação do ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C 197-B2 para SDF-1 humano foi determinada por medição de ressonância plasmônica de superfície (KD = 0,9 nM), seu IC50 (concentração inibitória para 50%) de 0,2 nM foi analisada em um ensaio de quimiotaxia in vitro de cultura celular. Esses dados indicam que ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo C 191-D5-001 e 197-B2 têm a afinidade de ligação a SDF-1 similar (Figuras 5 e 8).

O ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C 190-A3-001 compreende uma extensão 5’-terminal de 17 nucleotídeos (‘CGUGCGCUU- GAGAUAGG', SEQ ID NO: 220) e uma extensão 3’-terminal de 12 nucleotídeos (‘CUGAUUCUCACG’, SEQ ID NO: 221), onde, por outro lado, os quatro nucleotídeos na extremidade 5’ da extensão 5’-terminal e os quatro nucleotídeos na extremidade 3’ da extensão 3’-terminal podem hibridizar entre si para formar uma hélice terminal. Alternativamente, os nucleotídeos ‘U- GAGA’ na extensão 5’-terminal podem hibridizar para os nucleotídeos ‘U- CUCA’ na extensão 3’-terminal para formar uma hélice terminal. Uma redução para nove nucleotídeos da extensão 5’-terminal (‘UGAGAUAGG’) e para dez (‘CUGAUUCUCA’, SEQ ID NO: 222) nucleotídeos da extensão 3’- terminal (‘CUGAUUCUC’) da molécula 190-A3-001 não tem uma influência na afinidade de ligação a SDF-1 (190-A3-003; FIG. 13). Uma redução para oito nucleotídeos da extensão 5’-terminal (‘GAGAUAGG’) e para nove nucleotídeos da extensão 3’-terminal (‘CUGAUUCUC’) da molécula 190-A3- 001 não tem uma influência na afinidade de ligação a SDF-1 (190-A3-004; FIG. 6). A constante de ligação em equilíbrio KD de 190-A3-004 foi determi-nada usando o ensaio de ligação “pull-down” (KD = 4,6 nM) e por medição de ressonância plasmônica de superfície (KD = 4,7 nM). O IC50 (concentração inibitória para 50%) de 0,1 nM para 190-A3-004 foi medido usando um ensaio de quimiotaxia in vitro de cultura celular. Entretanto, o truncamento para dois nucleotídeos na extensão 5’-terminal leva a uma redução muito forte da afinidade de ligação (190-A3-007; FIG. 6).

Os ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo C 191-D5- 001, 197-B2 e 197-H1 (extensão central de nucleotídeos: jGGUUAGGGCU- IAGAAGUCGGI, SEQ ID 57), 197-H3/191-A5 (extensão central de nucleotídeos: iGGUUAGGGCUCGAAGUCGGl, SEQ ID NO: 58) e 197-E3/197-B1 (extensão central de nucleotídeos: GGUUAGGGCUUGAAGUCGG|, SEQ IP NO: 59) compartilham uma extensão central quase idêntico de nucleotídeos (fórmula-4 tipo C; sequência de nucleotídeo: |GGUUAGGGCUHGAA-| GUCGGI SEQ ID NO: 111). 191-D5-001, 197-B2 e 197-H1 não compartilham uma extensão 5’-terminal e 3’-terminal (197-H3 e 197-E3 têm as extensões 5'- e 3’-terminal idênticos a 197-B2). Entretanto, os respectivos dez (197-B2, 197-E3, 197-H3) ou nove dos dez (191-D5-001, 197-H1) nucleotídeos da extensão 5’-terminal podem hibridizar para os respectivos dez (197- B2, 197-E3, 197-H3) ou nove dos dez (191-D5-001, 197-H1) nucleotídeos da extensão 3’-terminal (FIG. 5). Assim, a extensão 5’-terminal dos ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 e 197-H3 como mencionado acima mais 191-A5, 197-B1, 197-H2, 197-D1 e 197-D2 compreendem uma sequência de nucleotídeo genérica comum de ‘RKSBUSNVGR’ (Fórmula-5-5’ tipo C, SEQ ID NO: 138). A extensão 3’- terminal dos ácidos nucleicos que se ligam a C SDF-1 do tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3, e 197-H3, como mencionado acima, mais 191- A5, 197-B1, 197-H2, 197-D1 e 197-D2 compreendem uma sequência de nucleotídeo genérica comum de ‘YYNRCASSMY’ (Fórmula-5-3’ tipo C, SEQ ID NO: 139), onde as extensões 5’-terminal e 3’-terminal dos ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 e 197- H3 são preferenciais. Essas extensões 5’- e 3’-terminal dos ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 e 197- H3 podem ser resumidos na fórmula genérica ‘RKSBUGSVGR’ (Fórmula-6- 5’ tipo C; extensão 5’-terminal, SEQ ID NO: 140) e ‘YCNRCASSMY’ (Fórmu- la-6-3’ tipo C; extensão 3’-terminal, SEQ ID NO: 141).

Os derivados truncados do ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C 191-D5-001 foram construídos e testados em um ensaio de ligação “pull-down" competitivo versus a molécula original 191-D5-001 (FIG. 7A, FIG. 7B). Primeiro, o comprimento das extensões 5’-terminal e 3’-terminal foram encurtados de dez nucleotídeos (191-D5-001) cada para sete nucleotídeos cada (191-D5-004) como representado na FIG. 14A, onde nove dos dez (191-D5-001) ou seis dos sete nucleotídeos (191-D5-004) da extensão 5- terminal e da extensão 3-terminal, respectivamente, podem hibridizar entre si. A redução para sete nucleotídeos da extensão 5’-terminal e 3’-terminal respectivamente (onde seis dos sete nucleotídeos podem hibridizar entre si) levou à afinidade de ligação a SDF-1 reduzida (191-D5-004). As extensões terminais do ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C 191-D5-004 foram modificados, sendo que o nucleotídeo de não pareamento ‘A’ dentro da extensão 3’-terminal de 191-D5-004 foi substituído por um ‘C’ (191-D5-005). Essa modificação levou a um aprimoramento de ligação. Esse derivado, ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C 191-D5-005, mostrou ligação a SDF-1 similar a 191-D5-001. O truncamento adicional da extensão 5’- e 3’- terminal para cinco nucleotídeos respectivamente levou a uma molécula com um comprimento de 29 nucleotídeos totais (191-D5-007). Por causa das similaridades de 191-D5-001 e dos ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 191-A5, 197-H3, 197-B1, 197-E3, 197- D1, 197-H2 e 197-D2 e por causa dos dados mostrados para 191-D5-007, assume-se que a extensão 5’- e 3’-terminal pode, em princípio, ser truncada para cinco nucleotídeos, sendo que a sequência de nucleotídeo ‘CGGGA’ para a extensão 5’-terminal e ‘UCCCG’ para a extensão 3-terminal foi testada com sucesso (ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C 191-D5-007). O ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C 191-D5-007 surpreendentemente se liga um pouco melhor a SDF-1 do que 191-D5-001 (determinado no nível do aptâmero usando o ensaio de ligação de competição). A constante de ligação em equilíbrio KD de 191-D5-007 foi determinada usando o ensaio de ligação “pull-down” (KD = 2,2 nM) e por medição de ressonância plasmônica de superfície (KD = 0,8 nM). O IC50 (concentração inibitória para 50%) de 0,1 nM para 191-D5-007 foi medido usando um ensaio de quimiotaxia in vitro de cultura celular. O truncamento adicional para ambas as extensões terminais para quatro nucleotídeos (191-D5-010, FIG. 7A).

Além disso, derivados do ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C 191-D5-001 (191-D5-017Z -024/ -029) dotado de extensões 5’- e 3’- terminal dos respectivos quatro nucleotídeos também mostraram afinidade de ligação a SDF-1 reduzida no ensaio de ligação “pull-down” de competição versus 191-D5-007 (Fig. 7B). Extensões 5’- e 3’-terminal altemativas com um comprimento de respectivamente cinco nucleotídeos foram adicionalmente testadas (191-D5-017-29a, 191-D5-017-29b, 191-D5-019-29a, 191-D5-024- 29a, 191-D5-024-29b). A fórmula genérica desses derivados para a extensão 5’-terminal é ‘XsSSSV’ (Fórmula-7-5’ tipo C) e para a extensão 3’-stretch é ‘BSSSXs’ (Fórmula-7-3’ tipo C), onde Xs está ausente ou é S’. Duas das cinco variantes testadas mostraram afinidade de ligação a SDF-1 idêntica a 191-D5-007 (191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b; FIG. 7B). As sequências das extensões 5’-terminal e 3’-terminal de derivados de 191-D5-001, que mostraram a melhor afinidade de ligação a SDF-1 e compreendem uma extensão 5’-terminal e 3’-terminal de cinco nucleotídeos respectivamente (191- D5-007, 191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b), podem ser resumidas em uma fórmula genérica (extensão 5’-terminal: ‘SGGSR’, Fórmula-8-5’ tipo C; extensão 3’-terminal: YSCCS’, Fórmula-8-3’ tipo C.

Os derivados truncados do ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C 197-B2 foram analisados em um ensaio de ligação “pull-down” competitivo versus a molécula original 197-B2 e 191-D5-007 (FIG. 7). Usando-se o ensaio de ligação “pull-down” competitivo versus 191-D5-007, reve- lou-se que 197-B2 tem a mesma afinidade de ligação a SDF-1 que 191-D5- 007. As extensões 5’- e 3’-terminal foram encurtadas sem perda de afinidade de ligação de dez nucleotídeos (197-B2) cada para cinco nucleotídeos cada (197-B2-005)onde os nucleotídeos da extensão 5’-terminal e da extensão 3’- terminal podem hibridizar completamente entre si. Se a extensão 5’-terminal (‘GCGGG’) e 3’-terminal (‘CCUGC’) de 197-B2-005 fosse substituída por ‘GCCGG’ (extensão 5’-terminal) e por ‘CCGGC’ (extensão 3’-terminal) de 197-B2-006, a afinidade de ligação a SDF-1 persistiu completamente. Como 197-B2 e 191-D5-001 (e seus derivados) compartilham a sequência de nucleotídeo central idêntica e vários derivados de 191-D5 com extensões 5’- e 3’-terminal com um comprimento de respectivamente quatro nucleotídeos foram testados, um truncamento adicional da extensão 5’-terminal e 3’- terminal foi omitido. Dois derivados adicionais que foram projetados compre-endem seis nucleotídeos nas extremidades 5’ e 3’ (extensões 5’- e 3’- terminal), respectivamente. A afinidade de ligação a SDF-1 de ambas as moléculas (197-B2-006-31a e 197-B2-006-31b) é a mesma mostrada para 191- D5-007 e 197-B2-006 (FIG. 15). As sequências das extensões 5’-terminal e 3’-terminal de derivados de 197-B2 que mostraram a melhor afinidade de ligação a SDF-1 e compreendem uma extensão 5’-terminal e 3’-terminal de cinco nucleotídeos respectivamente podem ser resumidas em uma fórmula genérica (extensão 5’-terminal: ‘GCSGG’, Fórmula-9-5’ tipo C; extensão 3’- terminal: ‘CCKGC’, Fórmula-9-3’ tipo C).

Combinando-se as extensões 5’- e 3’-terminal de derivados truncados de ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 do tipo C 191-D5-001 (extensão 5’-terminal: ‘SGGSR’, Fórmula-8-5’ tipo C; extensão 3’-terminal: ,YSCCS’, Fórmula-8-3’ tipo C) e 197-B2 (extensão 5’-terminal: ‘GCSGG’, Fórmula-9-5’ tipo C; extensão 3’-terminal: ‘CCKGC’, Fórmula-9-3’ tipo C), a fórmula genérica preferencial comum para a extensão 5’-terminal e a extensão 3’-terminal é ‘SSSSR’ (extensão 5’-terminal, Fórmula-10-5’ tipo C) e ‘YSBSS’ (extensão 3’-terminal: Fórmula-10-3’ tipo C).

De modo a prolongar o tempo de residência em plasma do spiegelmer in vivo, os spiegelmers 197-B2-006 e 191-D5-007 foram acoplados a uma porção de 40 kDa de polietileno glicol (PEG) em suas extremidades 5’, como descrito no capítulo 2. Os spiegelmers PEGilados 197-B2-006 e 191- D5-007 foram analisados em cultura celular em uma quimiotaxia in vitro. A porção PEG não tem influência na potência de spiegelmers de inibirem a quimiotaxia induzida por SDF-1.

Moléculas de ácido nucleico que se ligam a SDF-1 do tipo D

Adicionalmente, três ácidos nucleicos que se ligam a SDF-1 adi cionais que não compartilham os motivos de ligação a SDF-1 do ‘tipo A’, do ‘tipo B’ e do ‘tipo C’ foram identificados e chamados aqui de ‘tipo D’. Eles foram analisados como aptâmeros usando o ensaio de ligação “pull-down” (FIG. 9).

Entende-se que qualquer das sequências mostradas na FIG. 1 a 9 são moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, incluindo aquelas formas truncadas dessas, mas também incluindo aquelas formas estendidas sob a condição de que, entretanto, as moléculas de ácido nucleico assim truncadas e estendidas, respectivamente, são ainda capazes de se ligar ao alvo.

Exemplo 2: Síntese e derivação de aptâmeros e spiegelmers Síntese em pequena escala

Aptâmeros e spiegelmers foram produzidos por síntese de fase sólida com um sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) de 2’TBDMS RNA usando química de fosforamidita (Damha e Ogilvie, 1993). rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)-, e rU-fosforamiditas na configuração D e L foram adquiridas a partir de ChemGenes, Wilmington, MA. Os aptâmeros e spiegelmers foram purificados por eletroforese em gel.

Síntese em grande escala mais modificação

Os spiegelmers foram produzidos por síntese de fase sólida com um sintetizador AktaPilotl 00 (Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Freiburg) de 2’TBDMS RNA usando química de fosforamidita chemistry (Damha e Ogilvie, 1993). L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, e L-rU- fosforamiditas foram adquiridos a partir de ChemGenes (Wilmington, MA, USA). O 5’-amino-modificador foi adquirido a partir de American International Chemicals Inc. (Framingham, MA, USA). A síntese de spiegelmers foi iniciada em CPG respectivamente modificado pon-riboG; L-riboC, L-riboA, L-riboU de tamanho de poro 1000 Â (Link Technology, Glasgow, UK). Para acoplar (15 min por ciclo), 0,3 M de benziltiotetrazol (American International Chemicals Inc., Framingham, MA, USA) em acetonitrilo, e 3,5 equivalentes da respectiva solução de 0,2 M de fosforamidita em acetonitrilo foram usados. Solventes e reagentes padrão adicionais para a síntese de oligonucleotídeo foram adquiridos a partir de Biosolve (Valkenswaard, NL). Os spiegelmers foram sintetizados DMT-ON; após desproteção, eles foram purificados via RP- HPLC preparativo (Wincott F. eoutros, 1995) usando meio Source15RPC (Amersham). O grupo 5’DMT foi removido com 80% de ácido acético (90 min em temperatura ambiente). Subsequentemente, 2 M de solução aquosa de NaOAc foram adicionados e o spiegelmer foi dessalinizado por filtração de fluxo tangencial usando uma membrana de celulose regenerada de 5 K (Mil-lipore, Bedford, MA).

PEGilação

De modo a prolongar o tempo de residência em plasma do spiegelmer in vivo, os spiegelmers foram covalentemente acoplados a uma porção de 40 kDa de polietileno glicol (PEG) na extremidade Para PEGilação (para detalhes técnicos do método para PEGilação, ver pedido de patente europeia EP 1 306 382), os spiegelmers 5’-amino modificados purificados foram dissolvidos em uma mistura de H2O (2,5 ml), DMF (5 ml), e tampão A (5 ml; preparado misturando-se ácido cítrico • H2O [7g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico [2,26 ml], e 1 M de NaOH [343 ml] e adicionando-se água até um volume final de 1 L; pH = 8,4 foi ajustado com 1 M de HCl).

O pH da solução de spiegelmer foi levado para 8,4 com 1 M de NaOH. Então, 40 kDa de éster NHS de PEG (JenKem Technology USA Inc., Allen, TX) foram adicionados a 37°C a cada 30 min em seis porções de 0,25 equivalentes até um rendimento máximo de 75 a 85% ser alcançado. O pH da mistura reacional foi mantido em 8 a 8,5 com 1 M de NaOH durante a adição do éster NHS de PEG.

A mistura reacional foi blindada com 4 mL de solução de ureia (8 M), e 4 mL de tampão B (0,1 M de acetato de trietilamônio em H2O) e aquecida a 95°C por 15 min. O spiegelmer PEGilado foi então purificado por RP- HPLC com meio Source 15RPC (Amersham), usando um gradiente de ace- tonitrilo (tampão B; tampão C: 0,1 M de acetato de trietilamônio em acetoni- trilo). PEG em excesso eluído em tampão C a 5%, spiegelmer PEGilado em tampão C a 10 - 15%. As frações de produto com uma pureza de > 95% (como avaliado por HPLC) foram combinadas e misturadas com 40 mL de NaOAc a 3 M. O spiegelmer PEGilado foi dessalinizado por filtração de fluxo tangencial (membrana de celulose regenerada de 5 K, Millipore, Bedford, MA).

Exemplo 3: Determinação de constantes de ligação (ensaio de ligação “Pull-down”) Ensaio de ligação “pull-down” direto

A afinidade de aptâmeros a D-SDF-1 humano biotinilado foi medida em um ensaio de ligação “pull-down” a 37°C. Os aptâmeros foram marcados com 5’-fosfato por T4 polinucleotídeo quinase (Invitrogen, Karlsruche, Alemanha) usando ATP marcado com [y-32P] (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemanha). A radioatividade específica de aptâmeros marcados foi 200.000 a 800.000 cpm/mol. Os aptâmeros foram incubados após a desnaturação e renaturação em concentração de 10, 20, 30 ou 40 pM a 37°C em tampão de seleção (20 mM Tris-HCI pH 7,4; 137 mM NaCI; 5 mM KCI; 1 mM MgCI2; 1 mM CaCk; 0,1% [peso/vol] Tween-20) junto com quantidades variadas de D-SDF-1 humano biotinilado por 4 a 12 horas de modo a alcançar o equilíbrio em concentrações baixas. O tampão de seleção foi suplementado com 10 μg/ml de albumina de soro humano (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha), e 10 μg/ml de RNA de levedura (Ambion, Austin, USA) de modo a impedir a absorção de parceiros de ligação com superfícies usadas de plástico ou matriz de imobilização. A faixa de concentração de D-SDF-1 humano biotinilado foi ajustada de 8 pM para 100 nM; o volume de reação total foi 1 mL. Peptideo e complexos peptídeo-aptâmero foram imobilizados em 1,5 μL de partículas de streptavidina Ultralink Plus (Pierce Biotechnology, Rockford, USA), que foram pré-equilibradas com tampão de seleção e ressuspensas em urn volume total de 6 μL. As partículas foram mantidas em suspensão por 30 min na respectiva temperatura em um termomisturador. A radioatividade imobilizada foi quantificada em um contador de cintilação após desa- coplar o sobrenadante e lavagem apropriada. A porcentagem de ligação foi plotada contra a concentração de D-SDF-1 biotinilado e as constantes de dissociação foram obtidas usando algoritmos de software (GRAFIT; Eritha- cus Software; Surrey U.K.) assumindo-se estequiometria 1:1.

Ensaio de ligação “pull-down” competitivo

De modo a comparar diferentes aptâmeros de ligação a D-SDF- 1, um ensaio de competição competitivo foi executado. Para esse propósito, o aptâmero mais afim disponível foi radioativamente marcado (ver acima) e serviu como referência. Após a desnaturação e renaturação, ele foi incubado a 37°C com D-SDF-1 humano biotinilado em 1 mL de tampão de seleção em condições que resultaram em torno de 5 a 10% de ligação com o peptídeo após a imobilização e lavagem em agarose NeutrAvidin ou streptavidina Ultralink Plus (ambos de Pierce) sem competição. Um excesso de variantes de aptâmero D-RNA não marcado renaturado e desnaturado foi adicionado em diferentes concentrações (por exemplo, 2, 10 e 50 nM) com o aptâmero de referência marcado para reações de ligação paralela. Os aptâmeros a serem testados competiram com o aptâmero de referência para ligação ao alvo, diminuindo assim o sinal de ligação em dependência de suas características de ligação. O aptâmero que se concluiu ser mais ativo neste ensaio poderia então servir como uma nova referência para análise comparativa de variantes de aptâmero adicionais.

Exemplo 4: Análise de ligação por medição de ressonância plasmônica de superfície

O instrumento Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) foi usado para analisar a ligação de spiegelmers a SDF-1 α humano. Quando o acoplamento de SDF1-a humano foi alcançado via grupos amina, o SDF-1 α humano foi dialisado contra água por 1 a 2 h (ésteres de celulose misturados VSWP, Millipore, tamanho de poros, 0,025 μM) para remover as aminas in-terferentes. Chips sensores CM4 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) foram ativados antes do acoplamento de proteína por uma injeção de 35 μL de uma diluição 1:1 de 0,4 M de NHS e 0,1 M de EDC em um fluxo de 5 μL/min. O MCP-1 humano ou SDF-1 α humano foi então injetado em concentrações de 0,1 a 1,5 μg/mL em um fluxo de 2 μL/min até que a resposta do instrumento estivesse na faixa de 1000 a 2000 RU (unidades relativas). Os ésteres NHS foram desativados por injeção de 35 μL de solução de cloridrato de etanola- mina (pH 8,5) em um fluxo de 5 μL/min. O chip sensor foi primado duas vezes com tampão de ligação e equilibrado a 10 μL/min por 1 a 2 horas até a linha de base aparecer estável. Para todas as proteínas, os parâmetros cinéticos e constantes de dissociação foram avaliados por uma série de injeções de spiegelmer em concentrações de 1000, 500, 250,126, 62,5, 31,25 e 0 nM em tampão de seleção (Tris-HCI, 20 mM; NaCI, 137 mM; KCI, 5 mM; CaCfe, 1 mM; MgCh, 1 mM; Tween20, 0,1% [w/v]; pH 7,4). Em todos os experimen- tos, a análise foi executada a 37° C usando o comando Kinject definindo um tempo de associação de 180 e um tempo de dissociação de 360 segundos em um fluxo de 10 μL/min. A análise de dados e o cálculo das constantes de dissociação (KD) foi feita com o software BIAevaluation 3.0 (BIACORE AB, Uppsala, Suécia) usando o algoritmo de ajuste estequiométrico Langmuir 1:1.

Exemplo 5: Análise da inibição de quimiotaxia induzida por SDF- 1 por spiegelmers de ligação a SDF-1

A linhagem de células de leucemia de células T humanas Jurkat, a linhagem de células de linfoma de monócitos leucêmico U937, a linhagem de células de leucemia de células pré-B humanas BV-173 e a linhagem de células ALL pré-B humanas Nalm-6 expressam CXCR4. Enquanto as células Jurkat não expressam CXCR7, as linhagens de leucemia BV-173 e U-937 foram testadas positivas para a expressão de CXCR7. Todas as células foram obtidas a partir do DSMZ (Braunschweig). Todas as linhagens celulares foram cultivadas a 37°C e CO2 a 5% em meio RPMI 1640 com Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) que contém soro bovino fetal a 10%, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). Um dia antes do experimento, as células foram semeadas em um frasco T175 novo com uma densidade de 0,3 x 106/mL (Jurkat, U937, BV-173) ou 0,75 x 106/mL (Nalm-6), respectivamente.

Para O experimento, as células foram centrifugadas (5 min a 300 g), ressuspensas, contadas e lavadas uma vez com 15 mL de HBH (solução salina balanceada de Hanks contendo 1 mg/mL de albumina de soro bovino e 20 mM de HEPES; Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). Então, as células foram ressuspensas em 1,33 x 106/mL (Jurkat, U937, BV-173) ou 2,67 x 106/mL (Nalm-6), respectivamente. As células foram então deixadas migrar através das membranas porosas das placas de filtro por três horas em direção a uma solução contendo SDF-1 e várias quantidades de spiegelmer. As soluções de estimulação (SDF-1 + várias concentrações de spiegelmer) foram constituídas como soluções 10X em uma placa de 96 tubos de baixo perfil de 0,2 mL. 212 μL de HBH foram pipetados nos compartimentos inferi- ores da placa de transporte e 23,5 μL das soluções de estimulação foram adicionados. Todas as condições foram constituídas como triplicatas. Após 20 a 30 min, a placa de filtro foi inserida na placa contendo as soluções de estimulação e 75 μL de uma suspensão de células com 1,33 x 106/mL ou 2,67 x 106/mL, respectivamente, foram adicionados às cavidades da placa de filtro (1 x 105 ou 2 x 105 células/cavidade). As células foram então deixadas migrar por 3 h a 37°C. Para calibração, 0, 10 e 30 μL da suspensão celular foram adicionados a 235, 225 e 205 μL de HBH, respectivamente, em cavidades de uma placa com 96 cavidades separadas. Após 3 horas de incubação, a placa de inserção foi removida e 30 μL de solução de trabalho de resazurin (400 μM em PBS) foram adicionados às cavidades inferiores e às cavidades da placa de calibração. As placas foram então incubadas a 37°C por 2,5 h. Após incubação, 100 μL de cada cavidade foram então transferido para uma placa preta com 96 cavidades.

Para avaliação, os valores de fluorescência foram corrigidos para fluorescência de fundo (nenhuma célula na cavidade). Então, a diferença entre as condições experimentais com e sem SDF-1 foi calculada. O valor para a amostra sem spiegelmer (SDF-1 somente) foi ajustado para 100% e os valores para as amostras com spiegelmer foram calculados como porcentagem desse. Para a curva de dose-resposta, os valores percentuais foram plotados contra a concentração de spiegelmer e o valor IC5o (concentração de spiegelmer na qual 50% da atividade sem spiegelmer está presente) foi determinado graficamente a partir da curva resultante.

Resultados

Verificou-se que o SDF-1 humano estimula a migração de células Jurkat de uma maneira dose-dependente com metade da estimulação máxima em aproximadamente 0,3 nM.

Verificou-se que o SDF-1 humano estimula a migração de células da linhagem de células de linfoma de monócitos leucêmicos humanos U937 de uma maneira dose-dependente, com metade da estimulação máxima em aproximadamente 3 nM.

Verificou-se que o SDF-1 humano estimula a migração de célu- las da linhagem de células de leucemia de células pré-B humanas BV-173 de uma maneira dose-dependente, com metade da estimulação máxima em aproximadamente 3 nM.

Verificou-se que o SDF-1 humano estimula a migração de célu- 5 las da linhagem de células ALL pré-B humanas Nalm-6 de uma maneira dose-dependente, com metade da estimulação máxima em aproximadamente 0,3 nM.

Quando as células foram deixadas migrar em direção a uma solução contendo SDF-1 humano mais concentrações crescentes de spiegel- 10 mers que se ligam a SDF-1, a inibição dose-dependente foi observada. Os respectivos IC50 dos spiegelmers testados como especificado no Exemplo 1 foram determinados em células Jurkat de linhagem de células de leucemia de células T humanas. Por exemplo, para o spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 (também chamado de 193-G2-012-5’-PEG), um IC50 de 0,2 nM foi determinado (FIG. 10). Quando um spiegelmer de controle não específico foi usado ao invés de spiegelmers que se ligam a SDF-1, nenhum efeito inibitório foi observado até 1 μM.

A inibição da quimiotaxia induzida por SDF-1 por spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 foi também observada em três outros tipos de cé- 20 lulas de leucemia diferentes: a linhagem de células de linfoma de monócitos leucêmicos humanos U937 (FIG. 11B), a linhagem de células de leucemia de células pré-B humanas BV-173 (FIG. 12) e a linhagem de células ALL pré-B humanas Nalm-6 (FIG. 11A). Ademais, tem-se evidência de que as células de leucemia linfocítica crônica primária migram em direção a SDF-1 e que a quimiotaxia dependente de SDF-1 é eficazmente bloqueada por NOX-A12.

As linhagens de leucemia BV-173 e U-937 foram testadas positivas também para a expressão de CXCR7. A potência do spiegelmer que se liga a SFD-1 NOX-A12 de bloquear a interação de SDF-1 e CXCR7 foi de- 30 terminada como mostrado no Exemplo 6.

Exemplo 6: Inibição da ativação de CXCR7 pelo spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12

Além de CXCR4, o SDF-1 também se liga ao receptor de quimiocina CXCR7. O potencial inibidor do spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX- A12 em direção a CXCR7 foi testado em um ensaio de complementação com células CHO expressando estavelmente CXCR7 e β-arrestina ambos fundidos a um fragmento de β-galactosidase (PathHunterTM - β-arrestin assay, DiscoveRX, CA, USA). Mediante SDF-1, a β-arrestina de ligação com- plexou com CXCR7 e assim levou à complementação e ativação da β- galactosidase que foi medida com um substrato de quimioluminescência.

Método

Células de β-arrestina CXCR7 humanas CHO-K1 expressas por PathHunter foram colocadas em placas por 48 horas em meio OCC2 e esti-muladas com 10 nM de SDF-1 e várias concentrações de spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 por 90 minutos. Após a estimulação, o sinal foi detectado usando o Kit de Detecção PathHunter e o protocolo recomendado do fabricante (DiscoveRX, CA, USA).

Resultados

A estimulação de β-galactosidase e, portanto, a ativação de CX- CR7 com 10 nM de SDF-1 humano foi eficazmente bloqueada por spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 com um IC50 de 5,4 nM (FIG. 13).

Exemplo 7: Análise funcional de spiegelmer que se liga a SDF-1 humano 193-G2-012-5-PEG em um ensaio de brotamento de anel aórtico

Para testar se O spiegelmer que se liga a SDF-1 193-G2-012-5’- PEG é funcional também em um ensaio de cultura de órgão para angiogê- nese padrão, os ensaios de brotamento de anel aórtico foram executados. Esse ensaio, no qual o comprimento e a abundância de extensões tipo vasos dos explantes são avaliados, se tornou o modelo de cultura de órgão mais amplamente usado para angiogênese (Auerbach e outros, 2003). Já se mostrou que o SDF-1 induz brotamento nesse tipo de ensaio (Salcedo e outros, 1999).

As aortas de ratos foram cortadas em anéis, embebidos em uma matriz de colágeno e incubados com SDF-1 e SDF-1 mais spiegelmer que se liga a SDF-1 humano 193-G2-012-5’-PEG ou SDF mais um spiegelmer de controle PEGilado não funcional que não se liga a SDF-1. Após 6 a 7 dias, o brotamento (isto é, crescimento de células endoteliais) foi analisado tirando- se fotos e determinando-se um índice de brotamento.

Método

As aortas de ratos machos foram obtidas a partir de Bagheri Life Sciences (Berlin, Alemanha). As aortas foram preparadas recentemente e transportadas em gelo em meio MCDB 131 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) e 2,5 μL de fungizona (Cambrex, USA).

Para um experimento, uma única aorta foi transferida para um prato de cultura celular junto com o meio e o tecido conjuntivo residual foi removido. Então, a aorta foi cortada com um bisturi em anéis de aproximadamente 1 a 2 mm de comprimento. Os anéis foram lavados intensivamente (ao menos cinco vezes) em meio 199 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) e então colocados em cavidades de uma placa com 24 cavidades, contendo 450 μL de solução de colágeno por cavidade. Essa solução de colágeno foi preparada misturando-se 1,12 mL de meio 199 10X (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), 1,12 mL de tampão de colágeno 10X (0,05 N NaOH, 200 mM HEPES, 260 mM NaHCO3) e 0,6 ml de Glutamina a 200 mM. Os anéis foram orientados de modo que as bordas cortadas estavam perpendiculares ao fundo da cavidade. O colágeno foi deixado solidificar incubando-se as placas por ao menos uma hora a 37°C. Então, 1 ml de meio MCDB131 com adições (SDF-1 e spiegelmers) foi adicionado por cavidade. Os anéis foram então incubados a 37°C por seis a sete dias. Como controle para brotamento, os experimentos foram adicionalmente feitos com VEGF (fator de crescimento endotelial vascular).

O brotamento foi documentado tirando-se fotos com uma câmera digital. Em alguns casos, os anéis foram fixados pela adição de 1 mL de paraformaldeído a 10% e armazenados a 2-8°C para mais documentação. As fotos foram analisadas com o software de processamento de imagem Scion Image. Após a calibração com a ajuda de uma foto tirada a partir de um micrômetro de estágios, uma linha foi desenhada a uma distância de 0,33 mm de uma borda de um anel. Um histograma ao longo dessa linha foi gerado pelo software, os histogramas foram impressos e os picos (representados brotamentos cruzando a linha) foram contados. Esse número foi tomado como o índice de brotamento. Quatro a cinco anéis por condição foram avaliados. A análise estatística foi executada com WinSTAT para Excel.

Resultados

Poder-se-ia demonstrar que o SDF-1 induz brotamento e que esse efeito poderia ser bloqueado com spiegelmer que se liga a SDF-1 humano 193-G2-012-5’-PEG. Nenhum bloqueio de brotamento induzido por SDF-1 foi observado pelo spiegelmer de controle PEGilado não funcional (FIG. 14 e 15).

Exemplo 8: Efeito do spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 na quimiossensibilização de células de leucemia

Há evidência considerável de que células de leucemia podem ser protegidas a partir de quimioterapias convencionais pela interação entre seus receptores CXCR4 com SDF-1 secretado por células estromais dentro de microambientes de tecido particulares tal como o nicho de medula óssea (abrev. BM). Então, o direcionamento do eixo CXCR4 - SDF-1 usando o spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 é uma abordagem atraente para romper os efeitos protetores de células estromais secretando SDF-1 para sensibilizar células de leucemia em direção à subsequente quimioterapia.

De modo a simular a interação in vivo do microambiente BM com células de leucemia, um sistema de cocultura in vitro com células MS-5 estromais BM murinas e a linhagem de células de mieloma múltiplo (abrev. MM) RPMI 8226 foi estabelecido. O objetivo do experimento foi mostrar se o spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 sensibiliza as células MM em cocultura com células estromais para efeitos de agentes quimioterápicos. As células MS-5 estromais secretando SDF-1 foram incubadas com spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 ou o revNOX-A12 não funcional. A linhagem de células MM RPMI-8226 foi adicionada à camada de células estromais confluentes. As células foram então incubadas com o agente quimioterápico F ara A (Flurarabina) por 40 horas e a viabilidade celular foi medida.

Método

A linhagem de células estromais murinas MS-5 (ACC 441) foi adquirida a partir de DSMZ, a linhagem de celuas de mieloma múltiplo RPMI 8226 (CCL-155) foi adquirida a partir de ATCC. A linhagem de células de mieloma múltiplo RPMI 8226 foi mantida em meio RPMI 1640 GlutaMAX (Invitrogen) suplementado com FBS a 10% (Biochrom) e penicilina-estrepto- micina, as células MS-5 foram cultivadas em MEM alfa GlutaMAX (Invitrogen) com FBS a 10% e penicilina-estroptomicina. Para experimentos de co- cultura de quimiossensibilização, as células MS-5 estromais foram semeadas no dia antes em placas com 24 cavidades (as oito cavidades internas) em uma concentração de 8 x 104/ml_/cavidade em meio MEM alfa GlutaMAX (+ FBS a 10%) e incubadas a 37°C em CO2 a 5%. A camada de células estromais confluentes foi lavada e 0,5 mL de meio RPMI 1640 (+ FBS a 1%) foram adicionados às cavidades. O spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX- A12 ou revNOX-A12 foi subsequentemente adicionado às cavidades até uma concentração final de 100 nM e incubado por quatro horas. 3,5 x 105 células RPMI 8226 em meio RPMI 1640 (+ FBS a 1%) foram adicionadas à camada de células estromais. Quatro horas mais tarde, 1 μM de F-ara-A (Sigma Aldrich) foi adicionado às células quando indicado. Após 40 horas de incubação, as células foram coletadas em tubos de 15 mL, primeiro o sobrenadante foi colhido e então as células acopladas foram tripsinizadas incluindo células MS-5. As células coletadas foram lavadas com PBS (BSA a 1%) e ressuspensas em 2 mL de PBS (+ BSA a 1%). 150 μL da suspensão de células foram transferidos para uma placa com 96 cavidades em forma de U e então incubadas com 50 μL de Reagente ViaCount (Millipore) por 15 minutos em temperatura ambiente. A viabilidade celular e o número de células foram determinados por citometria de fluxo usando o Guava EasyCyte 6HT/2L (Millipore).

Resultados

A viabilidade celular de células RPMI-8226 cocultivadas com células MS-5 estromais foi somente levemente afetada pelo spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12. 1 μM de F-ara-A não mostrou efeito significativo na viabilidade de células RPMI-8826. Entretanto, quando NOX-A12 e F-ara-A foram combinados, uma diminuição sinergística da viabilidade celular foi ob-servada (FIG. 16). Assim, verificou-se que o spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 sensibiliza a linhagem de células MM RPMI-8826 em direção ao tratamento do agente quimioterápico F-ara-A quando cocultivadas com a linhagem de células estromais BM MS 5. A viabilidade de células estromais MS-5 não é nem afetada por F-ara-A nem por NOX-A12 (dados não mostrados). Esses resultados demonstram uma prova de princípio no potencial de NOX-A12 em romper os efeitos protetores de SDF-1 secretado por células estromais BM.

Exemplo 9: Efeito do spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 na proliferação de células de leucemia

O objetivo do experimento foi mostrar se o spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 tem um impacto na proliferação de células de leucemia em cocultura com células estromais da medula óssea (abrev. BM). As células MS-5 estromais murinas secretando SDF-1 foram incubadas com spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 ou o spiegelmer não funcional revNOX-A12. A linhagem de células T leucêmicas Jurkat foi adicionada à camada de células estromais confluentes e incubadas por 40 horas a 37°C e CO2 a 5%. Os número de células foram quantificados por citometria de fluxo usando o Guava EasyCyte e reagente ViaCount.

Método

A linhagem de células estromais murinas MS-5 (ACC 441) foi adquirida a partir de DSMZ e foi cultivada em MEM alfa GutaMAX (Invitro- gen) com FBS a 10% e penicilina-estreptomicina. Para experimentos de cocultura de proliferação, as células MS-5 estromais foram semeadas no dia antes em placas com 24 cavidades (as oito cavidades internas) em uma concentração de 8 x 104/ml_/cavidade em meio MEM alfa GlutaMAX (+ FBS a 10%) e incubadas a 37°C em CO2 a 5%. A camada de células estromais confluentes foi lavada e 0,5 mL de meio RPMI 1640 (+ FBS a 1%) foi adicionada às cavidades. O spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 ou spiegelmer revNOX-A12 foi subsequentemente adicionado às cavidades até uma concentração final de 100 nM e incubadas por quatro horas. 2 x 105 de célu- las Jurkat (fase de crescimento logarítmico; lavadas uma vez) em meio RPMI 1640 (+ FBS a 1%) foram adicionadas à camada de células estromais confluentes e incubadas por 48 horas a 37°C com CO2 a 5%. As células foram então coletadas em tubos de 15 ml_, as células acopladas foram tripsini- zadas incluindo células MS-5. As células coletadas foram lavadas duas vezes com PBS (+ BSA a 1%). 150 μL dessa suspensão celular foram transferidos para uma placa com 96 cavidades em forma de U e então incubados com 50 μL de reagente ViaCount (Millipore) por 15 minutos em temperatura ambiente. A viabilidade celular e o número de células foram determinados por citometria de fluxo usando Guava EasyCyte 6HT/2L.

Resultados

Enquanto 1 nM de spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 não mostrou nenhum efeito no número de células Jurkat após 40 horas de cultivo, o número de células foi reduzido até 20%, quando as células MS-5 estromais foram pré-incubadas com 10 ou 100 nM de spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 (FIG. 17). Assim, o SDF-1 secretado por células estromais estimula aparentemente a proliferação de células Jurkat. A indução dependente de SDF-1 de proliferação pode ser bloqueada por spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 levando à detecção de menos quantidade de células leucêmicas.

Exemplo 10: Efeito de spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 nas propriedades adesivas de células leucêmicas.

A interação de células leucêmicas com proteínas de matriz ex- tracelular (abrev. ECM) desempenha uma função crucial na patogênese leucemia. Então, testou-se o efeito do spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX- A12 na adesão de células de leucemia na fibronectina de proteína ECM. A estimulação da linhagem de células T de leucemia Jurkat com SDF-1 levou a uma modulação dose-dependente de adesão à fibronectina.

Métodos

A linhagem de células de leucemia de células T Jurkat (ACC 282) adquirida a partir de DSMZ foi mantida em meio RPMI 1640 GlutaMAX (Invitrogen) suplementado com FBS a 10% (Biochrom) e penicilina-estrepto- micina. Para os experimentos de adesão, as placas de cultura com 96 cavidades foram incubadas com 10 μg/mL de fibronectina humana (R&D Systems) em PBS por 2 horas a 37°C. As placas foram lavadas duas vezes com 100 μL de PBS e subsequentemente bloqueadas com PBS-BSA (0,1%) por duas horas a 37°C. As cavidades foram então lavadas com meio RPMI. As células Jurkat da fase de crescimento logarítmico foram lavadas com meio RPMI (+ BSA a 0,1%) e incubadas com várias concentrações de SDF-1 humano (R&D Systems) e NOX-A12 por 15 minutos a 37°C. NOX-A12 e SDF-1 foram pré-incubados por 30 minutos. 1 x 105 células Jurkat estimuladas foram semeadas em placas com 96 cavidades revestidas com Fibronectina e incubadas por 30 minutos. As placas foram então lavadas cinco vezes com meio RPMI. As células acopladas foram quantificadas usando Reagente Cell Titer Gio (Promega). As placas foram misturadas por dois minutos, seguidas por incubação em temperatura ambiente por 10 minutos. O número de células foi quantificado por sinal de luminescência relativo.

Resultados

As concentrações baixa a média de SDF-1 (1 a 10 nM) diminuíram a adesão de células Jurkat à fibronectina, enquanto as concentrações mais altas (30 a 300 nM) aumentaram as propriedades adesivas das células Jurkat (FIG. 18A). Verificou-se que o spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX- A12 reverte esse efeito, o spiegelmer de controle revNOX-A12 (FIG. 18B). Assim, o spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 tem um impacto no rompimento de interações de células leucêmicas com seu ambiente ECM protetor. Ademais, esse exemplo explica o desacoplamento dependente do spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 de células hematopoiéticas do nicho de medula óssea.

Exemplo 11: Rompimento da interação de células de mieloma múltiplo com o ambiente de medula óssea in vivo melhorando assim a sensibilidade das células de mieloma múltiplo à terapia.

O eixo SDF-1/CXCR4 desempenho uma função principal na atuação no órgão-alvo e tráfego de células de mieloma múltiplo (abrev. MM) para a medula óssea (abrev. BM). Então, a desadesão de células MM do meio BM circundante através da inibição de SDF-1 melhora a sensibilidade das MM a agentes terapêuticos. Azab e outros publicaram um protocolo para testar a potência do inibidor de CXCR4 AMD3100 de romper a interação de células MM com o ambiente BM in vivo que afeta a localização das células MM, que, por sua vez, melhora a sensibilidade das células MM à quimioterapia. Eles relataram que o bloqueio do receptor de SDF-1 CXCR4 pelo antagonista específico de CXCR4 levou a um rompimento da interação de células MM com o ambiente BM in vivo, para melhorar a sensibilidade das células MM à terapia, e como um resultado, para intensificar a redução de tumor induzida por bortezomibe (Azab e outros, 2009). Com base nesse protocolo (Azab e outros, 2009), o spiegelmer que se liga a SDF-1 NOX-A12 é testado quanto a sua potência para romper a interação de células MM com o ambiente BM in vivo, melhorando assim a sensibilidade das células MM à terapia.

Para o modelo animal MM severo, camundongos imunodeficien- tes combinados (SCID) são usados onde células Luc+/GFP+ MM.1S (2 x 106/camundongo) são injetadas na veia da cauda de camundongos SCID. Após 3 a 4 semanas, a progressão suficiente do tumor é detectada por ima- giologia de bioluminescência (para o protocolo, ver Azab e outros, 2009). Os camundongos são aleatoriamente divididos em 4 grupos: grupo 1, camundongos de controle (veículo recebido: 5% glicose); grupo 2, camundongos tratados de dois em dois dias com 20 mg/kg de injeção subcutânea de NOX- A12; grupo 3, camundongos tratados com injeção de bortezomibe intraperitoneal de 0,5 mg/kg duas vezes por semana; grupo 4, camundongos tratados com injeção de bortezomibe intraperitoneal de 0,5 mg/kg duas vezes por semana e de dois em dois dias com 20 mg/kg de injeção subcutânea de NOX-A12.

A localização das células tumorais MM na medula óssea é determinada in vivo por microscopia confocal usando anticorpo anti-SDF marcado com fluorescência (para protocolo, ver Azab e outros, 2009), onde a administração de NOX-A12 leva à mobilização de células MM da medula óssea para o sangue (como determinado por citometria de fluxo ex vivo; para protocolo, ver Azab e outros, 2009) e para uma redução do crescimento de tumor quando administrado junto com bortezomibe (por detecção de bio- luminescência in vivo; para protocolo, ver Mitsiades e outros, 2003; Mitsia- des e outros, 2004). Os efeitos mais fortes no crescimento de tumor por bortezomibe mais NOX-A12 em comparação ao tratamento com bortezomibe sozinho suportam os dados do Exemplo 8 mostrando efeitos positivos de NOX-A12 na quimiossensibilização de células MM. 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As características da presente invenção descritas na especificação, as reivindicações e/ou os desenhos podem ser separadamente e em combinação material para realizar a invenção em suas várias formas.

Claims

1. Uso de uma molécula de ácido nucleico capaz de se ligar a SDF-1 e de bloquear a interação entre SDF-1 e receptor de SDF-1 CXCR7, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio ou para tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio ou que está em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio como uma terapia adjunta, em que a doença ou distúrbio é câncer que expressa receptor de SDF-1 CXCR7.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer selecionado do grupo de câncer hematológico e tumores sólidos, em que preferencialmente o câncer hematológico é selecio-nado do grupo que compreende leucemia e mieloma e os tumores sólidos são selecionados do grupo compreendendo glioblastoma, câncer colorretal, câncer de mama, linfoma, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer renal, câncer de ovário e câncer de pulmão.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a terapia adjunta sensibiliza o indivíduo, em que o indivíduo sen-sibilizado é mais responsivo a uma terapia para o tratamento e/ou prevenção da doença ou distúrbio.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a terapia para o tratamento e/ou prevenção da doença ou distúrbio compreende administrar um agente farmaceuticamente ativo adicional e/ou irradiar o indivíduo e/ou cirurgia e/ou terapia celular.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o medicamento é usado em combinação com um agente farmaceuticamente ativo adicional, em que o agente farmaceutica- mente ativo adicional é selecionado do grupo que compreende um anticorpo, um agente alquilante, um antimetabólito, um alcaloide de planta, preferencial-mente vincristina, um terpenoide de planta, um inibidor de topoisomerase, Leucovorin, Metotrexato, Tamoxifeno, Sorafenibe, Lenalidomida, Borte- zomibe, Dexametasona, Flurouracil e Prednisona.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o tratamento e/ou prevenção da doença ou distúrbio é causado pela molécula de ácido nucleico que inibe a interação entre SDF-1 e receptor de SDF-1 CXCR7.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende na direção 5’->3’ uma primeira extensão terminal de nucleotídeos, uma extensão central de nucleotídeos e uma segunda extensão terminal de nucleotídeos, ou uma segunda extensão terminal de nucleotídeos, uma extensão central de nucleotídeos e uma primeira extensão terminal de nucleotídeos, em que a molécula de ácido nucleico é selecionada do grupo com-preendendo uma molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo B, uma molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C, uma molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A e uma molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo D, em que a extensão central de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo B compreende a seguinte sequência de nucleotídeos: . GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3’ (SEQ ID NO: 52), e em que a primeira extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo B compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ X1X2SVNS 3’ e a segunda extensão terminal de nucle- otídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo B compre-ende uma sequência de nucleotídeos de 5’ BVBSX3X4 3’, em que . é ausente ou é A, X2 é G, X3 é C e X4 é ausente ou é U; ou . é ausente, X2 é ausente ou é G, X3 é ausente ou é C e X4 é ausente; em que a extensão central de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende a seguinte sequência de nucleotídeos: GGUYAGGGCUHRXAAGUCGG (SEQ ID NO: 108), em que XA é ausente ou é A, e em que a primeira extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma sequencia de nucleotídeos de 5’ RKSBUSNVGR 3’ (SEQ ID NO: 138) e a segunda extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ YYNR- CASSMY 3’ (SEQ ID NO: 139), ou em que a primeira extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ XSSSSV 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotí- deos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ BSSSXS 3’, em que XS é ausente ou é S, ou em que a primeira extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ CGUGCGCUUGAGAUAGG 3’ (SEQ ID NO: 220) e a segunda extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ CUGAUUCUCACG 3’ (SEQ ID NO: 221), ou em que a primeira extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ UGAGAUAGG 3’ e a segunda extensão terminal de nu- cleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C com-preende uma sequência de nucleotídeos de 5’ CUGAUUCUCA 3’ (SEQ ID NO: 222), ou em que a primeira extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GAGAUAGG 3’ e a segunda extensão terminal de nu- cleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C com-preende uma sequência de nucleotídeos de 5’ CUGAUUCUC 3’, em que a extensão central de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende uma sequência de nucle- otídeos de 5’ AAAGYRACAHGUMAAXAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ ID NO: 74), em que XA é ausente ou é A, e em que a primeira extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ X1X2NNBV 3’ e a segunda extensão terminal de nucle- otídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compre-ende uma sequência de nucleotídeos de 5’ BNBNX3X4 3’, em que X1 é ausente ou é R, X2 é S, X3 é S e X4 é ausente ou Y, ou X1 é ausente, X2 é ausente ou é S, X3 é ausente ou S e X4 é ausente, e em que a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo D compreende uma sequência de nucleotídeos de acordo com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 142 a SEQ ID NO: 144.

8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a extensão central de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo B compreende a seguinte sequência de nucleotídeos: 5’ GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG 3’ (SEQ ID NO: 53).

9. Uso de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a primeira extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo B compreende uma sequência de nucle- otídeos de 5’ X1X2SSBS 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo B compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ BVSSX3X4 3’, em que X1 é ausente, X2 é ausente ou é G, X3 é ausente ou é C, X4 é ausente; preferencialmente a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GCGUG 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotí- deos de 5’ UACGC 3’.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF- 1 do tipo B compreende uma sequência de nucleotídeos de acordo com qual-quer uma dentre SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 22 a SEQ ID NO: 28, preferencialmente qualquer uma dentre SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 28, e mais preferencialmente qualquer uma dentre SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 28.

11. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a extensão central de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3’ (SEQ ID NO: 109), 5’ GGUYAGGGCU- HRAGUCGG 3’ (SEQ ID NO: 110) ou 5’ GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3’ (SEQ ID NO: 111), preferencialmente 5’ GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3’ (SEQ ID NO: 111).

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que a primeira extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ RKSBUGSVGR 3’ (SEQ ID NO: 140) e a segunda extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ YCNRCASSMY 3’ (SEQ ID NO: 141).

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que a primeira extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ SGGSR 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo C compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ YSCCS 3’.

14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 e 11 a 13, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico que se ligar a SDF-1 do tipo C compreende uma sequência de nucleotídeos de acordo com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 95 a SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 112 a SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 223 e SEQ ID NO: 224, preferencialmente qualquer um dentre SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 223 e SEQ ID NO: 224.

15. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a extensão central de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ ID NO: 75), ou 5’ AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ ID NO: 76), ou 5’ AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’(SEQ ID NO: 77), preferencialmente a extensão central de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ ID NO: 77).

16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 15, caracterizado pelo fato de que a primeira extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ X2BBBS 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ SBBVX3 3’, em que X2 é ausente ou é S, e X3 é ausente ou é S, preferencialmente a primeira extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ CUGUG 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ CGCAG 3’; ou a primeira extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ GCGUG 3’ e a segunda extensão terminal de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende uma sequência de nucleotídeos de 5’ CGCGC 3’.

17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 7, 15 e 16, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico que se liga a SDF-1 do tipo A compreende uma sequência de nucleotídeos de acordo com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 60 a SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78 a SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 a SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89 a SEQ ID NO: 94, e SEQ ID NO: 145, preferencialmente qualquer uma dentre SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84, e SEQ ID NO: 146, e mais preferencialmente qualquer uma dentre SEQ ID NO: 84 e SEQ ID NO: 146.

18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende uma modificação, em que a modificação é preferencialmente uma porção de alto peso molecular e/ou em que a modificação preferencialmente permite modificar as características da molécula de ácido nucleico em termos de tempo de residência em um corpo humano ou animal, preferencialmente um corpo hu-mano.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido L-nucleico.

20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende, como um primeiro agente farmaceuticamente ativo, a molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 e opcionalmente um constituinte adicional, em que o constituinte adicional é selecionado do grupo que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável, um veículo farmaceuticamente aceitável e um agente farmaceutica- mente ativo adicional, e em que a composição farmacêutica é para uso em um método para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio, ou para uso em um método para o tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio ou que está em risco de desenvolver uma doença ou dis-túrbio como uma terapia adjunta, ou para uso no tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio, em que a doença ou distúrbio é câncer que expressa receptor de SDF-1 CXCR7.

21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a terapia adjunta sensibiliza o indivíduo, em que o indivíduo sensibilizado é mais responsivo a uma terapia para o tratamento e/ou prevenção da doença ou distúrbio.

22. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a terapia para o tratamento e/ou prevenção da doença ou distúrbio compreende administrar um agente farmaceuticamente ativo adicional e/ou irradiar o indivíduo e/ou cirurgia e/ou terapia celular.

23. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizada pelo fato de que o agente farmaceutica- mente ativo adicional é um agente farmaceuticamente ativo selecionado do grupo que compreende um anticorpo, um agente alquilante, um antimetabó- lito, um alcaloide de planta, preferencialmente vincristina, um terpenoide de planta, um inibidor de topoisomerase, Leucovorina, Metotrexato, Tamoxifeno, Sorafenibe, Lenalidomida, Bortezomibe, Dexametasona, Flurouracil e Predni- sona.

24. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizada pelo fato de que o câncer é um câncer selecionado do grupo de câncer hematológico e tumores sólidos, em que pre-ferencialmente o câncer hematológico é selecionado do grupo de leucemia e mieloma e os tumores sólidos são selecionados do grupo compreendendo glioblastoma, câncer colorretal, câncer de mama, linfoma, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer renal, câncer ovariano e câncer de pulmão.