MX2013002722A

MX2013002722A - Acidos nucleicos de enlace sdf-1 y el uso de los mismos en el tratamiento de cancer.

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Publication number: MX2013002722A
Application number: MX2013002722A
Authority: MX
Inventors: Sven Klussmann; Dirk Eulberg; Christian Maasch; Klaus Buchner; Florian Jarosch; Werner Purschke; Nicole Dinse; Dirk Zboralski
Original assignee: Noxxon Pharma Ag
Priority date: 2010-09-09
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2013-06-28
Also published as: RU2013115739A; US20160095875A1; AU2011300818B2; SG10201506725QA; CA2810950C; US10093934B2; MX357770B; CN103108641A; CN103108641B; EP2613789B1; DK2613789T3; WO2012031773A1; BR112013005664A2; ES2678497T3; BR112013005664B8; KR20130114094A; US20130310442A1; JP6243736B2; AU2011300818A1; US9387221B2

Abstract

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico con la capacidad de enlazar a SDF-1, preferentemente con la capacidad de inhibir SDF-1, en donde la molécula de ácido nucleico es para utilizarse en un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno, para utilizarse en un método para tratamiento de un sujeto que padece de una enfermedad o trastorno o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno como una terapia adjunta, o para utilizarse como un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno, en donde la enfermedad o trastorno es cáncer.

Description

ÁCIDOS NUCLEICOS DE ENLACE SDF-1 Y EL USO DE LOS MISMOS EN EL TRATAMIENTO DE CÁNCER Campo de la Invención La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que enlazan al factor derivado de célula estromal-1 (SDF-1) de quimocina CXC, métodos para el tratamiento de cáncer y su uso en la fabricación de un medicamento.

Antecedentes de la Invención El factor- derivado de célula estromal (abreviatura: SDF- 1; sinónimo, CXCL12; PBSF [factor de estimulación de crecimiento de célula pre-B]; TPAR-1 [gen reprimido 1 TPA]; SCYB12; TLSF [factor de estimulación de célula de linfoma tímica]; hIRH [intercrina humana reducida en hepatomas]) es una quimiocina CXC angiogénica que no contiene el motivo ELR típico de las quimiocinas tipo IL-8 (Salcedo, Wasserman et al. 1999; Salcedo y Oppenheim 2003) pero enlaza y activa el receptor CXCR4 acoplado por proteína-G. Como resultado de la división alternativa, existen dos formas de SDF-1, SDF-1a (68 aminoácidos, SEC ID NO: 1) y SDF-?ß (SEC ID NO: 2), los cuales, en comparación con SDF-1, llevan cinco aminoácidos adicionales en el C-término (Shirozu, Nakano et al. 1995).

La conservación de la secuencia de aminoácido entre SDF-1 de diferentes especies es remarcable: SDF-1a humano (SEC. ID. 1) y SDF-1a de múrido (SEC ID NO: 3) son virtualmente idénticos. Existe únicamente un cambio conservador simple de V a I en la posición 18 (Shirozu, Nakano et al. 1995).

Ya que el receptor CXCR4 SDF-1 está ampliamente expresado en leucocitos, células dendríticas maduras, células endoteliales, células de cerebro y megacariocitos, las actividades de SDF-1 son pleyotrópicas. Esta quimiocina, más que cualquier otra identificada, exhibe el rango más amplio de funciones biológicas. Los efectos funcionales más significativos de SDF-1 son: Residencia y adhesión de células epiteliales a sitios neovasculares en la porción coroide de la retina; Se requiere SDF-1 para mantener células madre y células progenitoras, por ejemplo, células progenitoras hematopoyéticas (normalmente CD34 + ) en la médula ósea del adulto; SDF-1 soporta la proliferación de las células pre-B y aumenta el crecimiento de progenitores de célula B de médula ósea e induce a la migración específica de células pre- y pro-B, mientras que no actúa como un quimioatrayente significativo para las células B maduras; SDF-1 es uno de los quimioatrayentes de célula T más eficaces; y SDF-1 y su receptor CXCR4, son esenciales para el desarrollo embriónico.

Se dice que los niveles de expresión alterados de SDF-1 o su receptor CXCR4 o las respuestas alteradas hacia las moléculas, estarán asociados con muchas enfermedades humanas, tal como retinopatía (Brooks, Caballero et al. 2004; Butler, Guthrie et al. 2005; Meleth, Agron et al. 2005); cáncer de seno (Muller, Homey et al. 2001; Cabioglu, Sahin et al. 2005), ovarios (Scotton, Wilson et al. 2002), páncreas (Koshiba, Hosotani et al. 2000), tiroides (Hwang, Chung et al. 2003), y nasofaringe (Wang, Wu et al. 2005),. glíoma (Zhou, Larsen et al. 2002); neuroblastoma (Geminder, Sagi-Assif et al. 2001 ); leucemia linfocítica crónica de célula B (Burger, Tsukada et al. 2000); síndrome WHIM (WHIM es una abreviatura de Verrugas, Hipogammaglobulinemia, Infecciones, síndrome de Mielokatexis) (Gulino, Moratto et al. 2004; Balabanian, Lagane et al. 2005b; Kawai, Choi et al. 2005); síndrome de inmunodeficiencia inmunológica (Arya, Ginsberg et al. 1999; Marechal, Arenzana-Seisdedos et al. 1999; Soríano, Martínez et al. 2002); neovascularización patológica (Salvucci, Yao et al. 2002; Yamaguchi, Kusano et al. 2003; Grunewald, Avraham et al. 2006), inflamación (Murdoch 2000; Fedyk, Jones et al. 2001; Wang, Guan et al. 2001 ); esclerosis múltiple (Krumbholz, Theil et al. 2006); artritis reumatoide/osteoartritis (Buckley, Amft et al. 2000; Kanbe, Takagishi et al. 2002; Grassi, Cristino et al. 2004).

Los tumores (incluyendo neoplasias sólidas y hematológicas y malignidades) son no sólo masas de células de cáncer: la infiltración de tumores con células inmune es una característica de cáncer. Muchos cánceres humanos tienen una red de quimiocina compleja que tiene influencia en el grado y fenotipo de este infiltrado, así como el crecimiento de tumor, supervivencia, migración y angiogénesis. La mayor parte de los tumores sólidos contienen muchas células estromales no malignas. De hecho, las células estromales algunas veces superan a las células de cáncer. Las células estromales predominantes que se encuentran en cánceres son macrófagos, linfocitos, células endoteliales y fibroblastos.

Las células de diferentes tipos de cáncer tienen diferentes perfiles de expresión de quimiocina-receptor, aunque el receptor CXCR4 de SDF-1 es el más comúnmente encontrado en células de tumor de ratón y hombre: las células de tumor de al menos 23 diferentes tipos de cánceres humanos de origen epitelial, mesenquimal y hematopoyético expresan CXCR4 (Balkwill 2004) con SDF-1 siendo el único ligando conocido para CXCR4. Además del tejido linfoide secundario y de la médula ósea, en donde se expresa en forma constitutiva, se encuentra SDF-1 en sitios de tumor primario en linfoma (Corcione, Ottonello et al. 2000) y tumores cerebrales de linaje tanto neuronal como astrocítico. Además, está presente en altos niveles en cáncer de ovario (Scotton, Wilson et al. 2002) y pancreático (Koshiba, Hosotani et al. 2000) así como en sitios de metástasis en cáncer de seno (Muller, Homey et al. 2001) y tiroide (Hwang, Chung et al. 2003), neuroblastoma y malignidades hematológicas (Geminder, Sagi-Assif et al. 2001).

Además de CXCR4, se identificó otro receptor de SDF-1: RDC1/CXCR7 (Balabanian, Lagane et al. 2005a, Burns, Summers et al. 2006). Los estudios in vitro y in vivo con líneas de célula de cáncer de próstata, sugieren que las alteraciones en expresión CXCR7/RDC1 están asociadas con actividades adhesivas e invasivas incrementadas, además de una ventaja de supervivencia. Los estudios in vitro y in vivo han mostrado que ambos receptores para SDF-1, es decir CXCR4 y CXCR7 promueven el crecimiento de tumor, el potencial metastático y la resistencia a (inducida por quimioterapia) apoptosis en una cantidad de tumores, por ejemplo cáncer de seno, glioblastomas, cáncer de ovario, neuroblastoma, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal y de próstata (Burns et al, 2006; Li et al, 2008; Scotton et al, 2002; Yang et al, 2008; Zagzag et al, 2008).

La expresión de CXCR4 y CXCR7 por lo tanto parecer ser una característica general de diversos tumores.

Breve Descripción de la Invención El problema que subyace la presente invención, es proporcionar un medio que interactúa en forma específica con SDF-1, mediante lo cual los medios son adecuados para la prevención y/o tratamiento de cáncer.

Otro problema que subyace la presente invención, es proporcionar un medio que soporte la terapia de cáncer, mediante lo cual la terapia de cáncer normalmente hace uso de quimioterapia y/o radiación.

Un problema adicional que subyace la presente invención, es proporcionar un medio, que sea adecuado para utilizar una terapia adjunta en el tratamiento de cáncer.

Aún otro problema adicional que subyace la presente invención, es proporcionar un medio que tenga la capacidad de quimiosensibilizar al paciente que padece de cáncer y/o quimiosensibilizar células que forman o son parte de un cáncer.

Estos y otros problemas que subyacente la presente invención, serán resueltos a través del asunto materia de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las modalidades preferidas se pueden tomar de las reivindicaciones dependientes.

Más específicamente, el problema que subyace la presente invención, se resuelve en un primer aspecto, el cual también es la primera modalidad del primer aspecto, a través de una molécula de ácido nucleico con la capacidad de enlazar a SDF-1, preferentemente con la capacidad de medir SFD-1, mediante lo cual, la molécula de ácido nucleico es para utilizarse en un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno, para utilizarse en un método para el tratamiento de un sujeto que padece de una enfermedad o trastorno, o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno como una terapia adjunta, o para utilizarse como un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno, en donde la enfermedad o trastorno es cáncer.

En una segunda modalidad del primer aspecto, el cual también es una modalidad de la primera modalidad del primer aspecto, el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de cáncer hematologico, en donde preferentemente el cáncer hematologico se selecciona del grupo que comprende leucemia y mieloma.

En una tercera modalidad del primer aspecto, el cual también es una modalidad de la segunda modalidad del primer aspecto, la leucemia se selecciona del grupo que comprende leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.

En una cuarta modalidad del primer aspecto, el cual también es una modalidad de la segunda modalidad del primer aspecto, el mieloma es mieloma múltiple.

En una quinta modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de de la primera modalidad del primer aspecto, el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en tumores sólidos, en donde preferentemente los tumores sólidos se seleccionan del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de seno, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.

En una sexta modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta modalidad del primer aspecto, la terapia adjunta sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto que es sensibilizado responde más a una terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno.

En una séptima modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la sexta modalidad del primer aspecto, la terapia para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o trastornos, comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o irradiar al sujeto y/o cirugía y/o terapia celular.

En una octava modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la séptima modalidad del primer aspecto, el agente farmacéuticamente activo adicional se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo, un agente de alquilación, un anti-metabolito, un alcaloide de planta, un terpenoide de planta, un inhibidor de topoisomerasa, Leucovorin, Metotrexato, Tamoxifen, Sorefenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona , Flurouracilo y Prednisona.

En una novena modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la octava modalidad del primer aspecto, el anticuerpo se selecciona del grupo que comprende Rituximab, Ofatumumab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab y Alemtuzumab.

En una décima modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la octava modalidad del primer aspecto, el agente de alquilación se selecciona del grupo que comprende cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, doxorrubicina, doxorrubicina liposomal, bendamustina, temozolomida y Melfalan.

En una decimoprimera modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la octava modalidad del primer aspecto, el antimetabolito se selecciona del grupo que comprende purinoazatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina y cladribina.

En una decimosegunda modalidad de primer aspecto, la cual también es una modalidad de la octava modalidad del primer aspecto, el terpenoide de planta se selecciona del grupo que comprende un taxano, más preferentemente se selecciona del grupo que comprende Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina y epotilona.

En una decimotercera modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la octava modalidad del primer aspecto, el inhibidor de topoisomerasa se selecciona del grupo que comprende camptotecina, irinotecan y mitoxantrona .

En una decimocuarta modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta,, la sexta, la séptima, la octava, la novena, la décima, la decimoprimera, la decimosegunda y la decimotercera modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido tiene la capacidad de bloquear la interacción entre SDF-1 y un receptor SDF-1, mediante lo cual el receptor SDF-1 se selecciona del grupo que comprende CXCR4 y CXCR7.

En una decimoquinta modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena, la décima, la decimoprimera, la decimosegunda, la decimotercera, la decimocuarta modalidad del primer aspecto, el tratamiento o prevención de la enfermedad o trastorno, se origina a través de la molécula de ácido nucleico que inhibe la interacción entre SDF-1 y un receptor de SDF-1.

En una decimosexta modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena, la décima, la decimoprimera, la decimosegunda, la decimotercera, la decimocuarta y la decimoquinta modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende una molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo B, una molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo C, una molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo A y una molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo D.

En una decimoséptima modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la decimosexta modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo B, comprende una extensión central de nucleótidos, en donde la extensión central de nucleótidos comprende la siguiente secuencia de nucleótido. 5' GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3" (SEC ID NO: 52).

En una decimoctava modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la decimoséptima modalidad del primer aspecto, la extensión central de nucleótidos comprende la siguiente secuencia de nucleótido: 5' GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG 3' (SEC ID NO: 53).

En una decimonovena modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la decimoséptima y la decimoctava modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo B, comprende en la dirección 5'->3', una primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos y una segunda extensión terminal de nucleótidos.

En una vigésima modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la decimoséptima y decimoctava modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo B, comprende en la dirección 5'->3' una segunda extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos y una primera extensión terminal de nucleótidos.

En una vigésima primera modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la decimonovena y vigésima modalidad del primer aspecto, la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' X X2SVMS 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' BVBSX3X4 3', en donde Xi está ya sea ausente o es A, X2 es G, X3 es C y X4 está ya sea ausente o es U; X1 está ausente, X2 está ya sea ausente o es G, X3 está ya sea ausente o es C y X4 está ausente.

En una vigesimosegunda modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la decimonovena, la vigésima y la vigesi mopri mera , preferentemente la vigesimoprimera modalidad del primer aspecto, la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' X1X2CRWG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' KRYSX3X4 3', mediante lo cual X^ está ya sea ausente o es A, X2 es G, X3 es C y X4 está ya sea ausente o es U.

En una vigesimotercera modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la decimonovena, la vigésima, la vigésima primera y la vigésima segunda, preferentemente la vigésima primera o la vigésima segunda modalidad del primer aspecto, la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' X1X2CGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' UACGX3X4 3', en donde está ya sea ausente o es A, X2 es G, X3 es C y X4 está ya sea ausente o es U, preferentemente la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' AGCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' UACGCU 3'.

En una vigesimocuarta modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la decimonovena, la vigésima y la vigésima primera, preferentemente la vigésima primera modalidad del primer aspecto, la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' XiX2SSBS 3' y una segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' BVSSX3X4 3', en donde X1 está ausente, X2 está ya sea ausente o es G, X3 está ya sea ausente o es C, y X4 está ausente, preferentemente la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleotidos de 5' GCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleotidos de 5' UACGC 3'.

En una vigesimoquinta modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la decimosexta, la decimoséptima, la decimoctava, la decimonovena, la vigésima, la vigésima primera, la vigésima segunda, la vigesimotercera y la vigesimocuarta modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo B, comprende una secuencia de nucleótido de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 22 a SEQ ID NO: 28, preferentemente cualquiera de las SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 28, más preferentemente cualquiera de SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 28.

En una vigésima sexta modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la vigésima séptima modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo C comprende una extensión central de nucleótidos, en donde la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de GGUYAGGGCUHRXAAGUCGG (SEQ ID NO: 108), en donde XA está ya sea ausente o es A.

En una vigésima séptima modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la vigésima sexta modalidad del primer aspecto, la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 109), 51 GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 110) o 5' GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 111), preferentemente 5' GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3" (SEQ ID NO: 111).

En una vigesi moctava modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la vigésima sexta y vigésima séptima modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo C comprende en la dirección 5'->3\ una primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos, y una segunda extensión terminal de nucleótidos.

En una vigesimonovena modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la vigésima sexta y la vigésima séptima modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo C, comprende en la dirección 5'->3' una segunda extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos, y la primera extensión terminal de nucleótidos.

En una trigésima modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la vigesimoctava y la vigesimonovena modalidad del primer aspecto, la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' RKSBUSNVGR 3' (SEQ ID NO: 138) y la segunda extensión de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5" YYNRCASS Y 3' (SEQ ID NO: 139), preferentemente la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' RKSBUGSVGR 3' (SEQ ID NO: 140) y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' YCN CASSMY 3' (SEQ ID NO: 141).

En una trigésimo primera modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la vigesimoctava y la vigésimo novena modalidad del primer aspecto, la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' XSSSSV 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' BSSSXs 3', en donde Xs está ya sea ausente o es S, preferentemente la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' SGGSR 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' YSCCS 3'.

En una trigésimo segunda modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la vigesimoctava y la vigesimonovena modalidad del primer aspecto, a) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCCGG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGGC 3'; o b) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CGUGCGCUUGAGAUAGG 3 '(SEQ ID NO: 220) y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUGAUUCUCACG 3' (SEQ ID NO: 221); o c) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' UGAGAUAGG 3' y una segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUGAUUCUCA 3' (SEQ ID NO: 222); o d) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GAGAUAGG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUGAUUCUC 3".

En una trigésimo tercera modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la vigésima sexta, la vigésima séptima, la vigesimoctava, la vigesimonovena, la trigésima, la trigésimo primera y trigésimo segunda modalidad del primer aspecto de la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 tipo C comprende una secuencia de nucleótido de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO: 95 a SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 112 a SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 224, preferentemente cualquiera de SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 224.

En una trigésimo cuarta modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la decimosexta modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo A comprende una extensión central de nucleotidos, en donde la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' AAAGYRACAHGUMAAXAUGAAAGGUA C 3' (SEQ ID NO: 74), en donde XA está ya sea ausente o es A.

En una trigésimo quinta modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la trigésimo cuarta modalidad del primer aspecto, la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5 1 AAAGYRACAHG UMAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ ID NO: 75), o 5' AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGU ARC 3' (SEQ ID NO: 76) , o 5' AAAG YAAC AHG UC AAU G AAAGG UARC 3' (SEQ ID NO: 77) , preferentemente la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' AAAG YAACAHGU CAA UGAAAGG UARC 3' (SEQ ID NO: 77).

En una trigésimo sexta modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la trigésimo cuarta y trigésimo quinta modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de enlace SDF- del tipo A comprende en la dirección 5'->3' una primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos, y una segunda extensión terminal de nucleótidos.

En una trigésimo séptima modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la trigésimo cuarta y la trigésimo quinta modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo A comprende en la dirección 5'->3', una segunda extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos, y la primera extensión terminal de nucleótidos.

En una trigésimo octava modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la trigésimo sexta y trigésimo séptima modalidad del primer aspecto, la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' XiX2NNBV 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' BNBNX3X4 3' en donde X1 está ya sea ausente o es R, X2 es S, X3 es S y X4 está ya sea ausente o es Y; o Xi está ausente, X2 está ya sea ausente o es S, X3 está ya sea ausente o es S y X4 está ausente.

En una trigésimo novena modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la trigésimo sexta, trigésimo séptima y trigésimo octava, preferentemente trigésimo octava modalidad del primer aspecto, la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5" RSHRYR 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' YRYDSY 3', preferentemente la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCUGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CGCAGC 3'.

En una cuadragésima modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la trigésimo sexta, la trigésimo séptima y la trigésimo octava, preferentemente la trigésimo octava modalidad del primer aspecto, la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' X2BBBS 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' SBBVX3 3', en donde X2 está ausente o es S, y X3 está ausente o es S; preferentemente la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CGCAG 3'; o la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CGCGC 3'.

En una cuadragésimo primera modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la trigésimo cuarta, la trigésimo quinta, la trigésimo sexta, la trigésimo séptima, la trigésimo octava, la trigésimo novena y cuadragésima modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo A comprende una secuencia de nucleótido de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 60 a SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78 a SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 a SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89 a SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 145, preferentemente cualquiera de SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 146, más preferentemente, cualquiera de SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 146.

Una cuadragésimo segunda modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la decimosexta modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo D, comprende una secuencia de nucleótido de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO: 142 a SEQ ID NO: 144.

En una cuadragésimo tercera modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena, la décima, la decimoprimera, la decimosegunda, la decimotercera, la decimocuarta, la decimoquinta, la decimosexta, la decimoséptima, la decimoctava, la decimonovena, la vigésima, la vigésima primera, la vigésima segunda, la vigesimotercera, la vigesimocuarta, la vigesimoquinta, la vigésima sexta, la vigésima séptima, la vigesimoctava, la vigesimonovena, la trigésima, la trigésimo primera, la trigésimo segunda, la trigésimo tercera, la trigésimo cuarta, la trigésimo quinta, la trigésimo sexta, la trigésimo séptima, la trigésimo octava, la trigésimo novena, la cuadragésima, la cuadragésimo primera y la cuadragésimo segunda modalidad del primer aspecto, el SDF-1 es SDF-1 humano, en donde preferentemente el SDF-1 humano es SDF-1 humano alfa o SDF-1 humano beta, más preferentemente SDF-1 humano es SDF-1 humana alfa.

En una cuadragésimo cuarta modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena, la décima, la decimoprimera, la decimosegunda, la decimotercera, la decimocuarta, la decimoquinta, la decimosexta, la decimoséptima, la decimoctava, la decimonovena, la vigésima, la vigésima primera, la vigésima segunda, la vigesimotercera, la vigesimocuarta, la vigesimoquinta, la vigésima sexta, la vigésima séptima, la vigesimoctava, la vigesimonovena, la trigésima, la trigésimo primera, la trigésimo segunda, la trigésimo tercera, la trigésimo cuarta, la trigésimo quinta, la trigésimo sexta, la trigésimo séptima, la trigésimo octava, la trigésimo novena, la cuadragésima, la cuadragésimo primera, la cuadragésimo segunda y la cuadragésimo tercera modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende una modificación, en donde la modificación es preferentemente una porción de alto peso molecular y/o en donde la modificación permite preferentemente modificar las características de la molécula de ácido nucleico en términos de tiempo de residencia en el animal o cuerpo humano, preferentemente el cuerpo humano.

En una cuadragésimo quinta modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la cuadragésimo cuarta modalidad del primer aspecto, la modificación se selecciona del grupo que comprende una porción HES, una porción PEG, modificaciones biodeg ra dables y combinaciones de las mismas.

En una cuadragésimo sexta modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la cuadragésimo quinta modalidad del primer aspecto, la modificación es una porción PEG que consiste en una PEG de cadena recta o ramificada, en donde preferentemente el peso molecular del PEG recto o ramificado es de aproximadamente 20,000 hasta 120,000 Da, más preferentemente de aproximadamente 30,000 hasta 80,000 Da y lo más preferentemente aproximadamente 40,000 Da.

En una cuadragésimo séptima modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la cuadragésimo quinta modalidad del primer aspecto, la modificación es una porción HES, en donde preferentemente el peso molecular de la porción HES es de aproximadamente 10,000 a 200,000 Da, más preferentemente de aproximadamente 30,000 a 170.000 Da y lo más preferentemente aproximadamente 150,000 Da.

En una cuadragésimo octava modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la cuadragésimo cuarta, la cuadragésimo quinta, la cuadragésimo sexta y cuadragésimo séptima del primer aspecto, la modificación se adhiere a la molécula de ácido nucleico a través de un enlazador, en donde preferentemente el enlazador es un enlazador bioestable o biodegradable.

En una cuadragésimo novena modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la cuadragésimo cuarta, la cuadragésimo quinta, la cuadragésimo sexta, la cuadragésimo séptima y la cuadragésimo octava del primer aspecto, la modificación se adhiere a una molécula de ácido nucleico en el nucleótido 5'-terminal de la molécula de ácido nucleico y/o en el nucleótido 3'-terminal de la molécula de ácido nucleico y/o a un nucleótido de la molécula de ácido nucleico entre el nucleótido 5'-terminal de la molécula de ácido nucleico y el nucleótido 3'-terminal de la molécula de ácido nucleico.

En una quincuagésima modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena, la décima, la decimoprimera, la decimosegunda, la decimotercera, la decimocuarta, la decimoquinta, la decimosexta, la decimoséptima, la decimoctava, la decimonovena, la vigésima, la vigésima primera, la vigésima segunda, la vigesimotercera, la vigesimocuarta, la vigesimoquinta, la vigésima sexta, la vigésima séptima, la vigesimoctava, la vigesimonovena, la trigésima, la trigésimo primera, la trigésimo segunda, la trigésimo tercera, la trigésimo cuarta, la trigésimo quinta, la trigésimo sexta, la trigésimo séptima, la trigésimo octava, la trigésimo novena, la cuadragésima, la cuadragésimo primera, la cuadragésimo segunda, la cuadragésimo tercera, la cuadragésimo cuarta, la cuadragésimo quinta, la cuadragésimo sexta, la cuadragésimo séptima, la cuadragésimo octava, la cuadragésimo novena modalidad del primer aspecto, los nucleótidos de la molécula de ácido nucleico o los nucleótidos que forman la molécula de ácido nucleico son L-nucleótidos.

En una quincuagésima primera modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena, la décima, la decimoprimera, la decimosegunda, la decimotercera, la decimocuarta, la decimoquinta, la decimosexta, la decimoséptima, la decimoctava, la decimonovena, la vigésima, la vigésima primera, la vigésima segunda, la vigesimotercera, la vigesimocuarta, la vigesimoquinta, la vigésima sexta, la vigésima séptima, la vigesimoctava, la vigesimonovena, la trigésima, la trigésimo primera, la trigésimo segunda, la trigésimo tercera, la trigésimo cuarta, la trigésimo quinta, la trigésimo sexta, la trigésimo séptima, la trigésimo octava, la trigésimo novena, la cuadragésima, la cuadragésimo primera, la cuadragésimo segunda, la cuadragésimo tercera, la cuadragésimo cuarta, la cuadragésimo quinta, la cuadragésimo sexta, la cuadragésimo séptima, la cuadragésimo octava, la cuadragésimo novena y la quincuagésima modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico-L.

El problema que subyace la presente invención, se resuelve en un segundo aspecto el cual también es la primera modalidad del segundo aspecto, a través de una composición farmacéutica que comprende como un primer agente farmacéuticamente activo, la molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena, la décima, la deci mopri mera , la decimosegunda, la decimotercera, la decimocuarta, la decimoquinta, la decimosexta, la decimoséptima, la decimoctava, la decimonovena, la vigésima, la vigésima primera, la vigésima segunda, la vigesimotercera, la vigesimocuarta, la vigesimoquinta, la vigésima sexta, la vigésima séptima, la vigesimoctava, la vigesimonovena, la trigésima, la trigésimo primera, la trigésimo segunda, la trigésimo tercera, la trigésimo cuarta, la trigésimo quinta, la trigésimo sexta, la trigésimo séptima, la trigésimo octava, la trigésimo novena, la cuadragésima, la cuadragésimo primera, la cuadragésimo segunda, la cuadragésimo tercera, la cuadragésimo cuarta, la cuadragésimo quinta, la cuadragésimo sexta, la cuadragésimo séptima, la cuadragésimo octava, la cuadragésimo novena, la quincuagésima y la quincuagésima primera modalidad del primer aspecto, y opcionalmente un constituyente adicional, mediante lo cual el constituyente adicional se selecciona del grupo que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable, un transportador farmacéuticamente aceptable y un agente farmacéuticamente activo adicional, y mediante lo cual la composición farmacéutica es para utilizarse en un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno, o para utilizarse en un método para el tratamiento de un sujeto que padece de una enfermedad o trastorno o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno, como una terapia adjunta, o para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno, en donde la enfermedad o trastorno es cáncer.

En una segunda modalidad del segundo aspecto, la cual también es una modalidad de la primera modalidad del segundo aspecto, la terapia adjunta sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto sensibilizado responde más a una terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno.

En una tercera modalidad del segundo aspecto, la cual también es una modalidad de la segunda modalidad del segundo aspecto, la terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno, comprenden la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o irradiar al sujeto y/o cirugía y/o terapia celular.

En una cuarta modalidad del segundo aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda y la tercera modalidad del segundo aspecto, el agente farmacéuticamente activo adicional es un agente farmacéuticamente activo seleccionado del grupo que comprende un anticuerpo, un agente de alquilación, un antimetabolito, una planta alcaloide preferentemente vincristina, una planta terpenoide, un inhibidor de topoisomerasa, Leucovorina, Metotrexato, Tamoxifen, Sorafenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona, Flurouracil y Prednisona.

En una quinta modalidad del segundo aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta modalidad del segundo aspecto, el anticuerpo se selecciona del grupo que comprende Rituximab, Ofatumumab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab y Alemtuzumab.

En una sexta modalidad del segundo aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta modalidad del segundo aspecto, el agente de alquilación se selecciona del grupo que comprende cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, doxorrubicina, doxorrubicina liposomal, bendamustina, temozolomida y Melfalan.

En una séptima modalidad del segundo aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta modalidad del segundo aspecto, el anti-metabolito se selecciona del grupo que comprende purinoazatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina y cladribina.

En una octava modalidad del segundo aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta modalidad del segundo aspecto, la planta terpenoide se selecciona del grupo que comprende un taxano, más preferentemente seleccionado del grupo que comprende en Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina y epotilona.

En una novena modalidad del segundo aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta modalidad del segundo aspecto, el inhibidor de topoisomerasa se selecciona del grupo que comprende camptotecina, irinotecan y mitoxantrona.

En una décima modalidad del segundo aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava y la novena modalidad del segundo aspecto, el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de cáncer hematológico, en donde preferentemente el cáncer hematológico se selecciona del grupo de leucemia y mieloma.

En una decimoprimera modalidad del segundo aspecto, la cual también es una modalidad de la décima modalidad del segundo aspecto, la leucemia se selecciona del grupo que comprende leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.

En una decimosegunda modalidad del segundo aspecto, la cual también es una modalidad de la décima modalidad del segundo aspecto, el mieloma es mieloma múltiple.

En una decimotercera modalidad del segundo aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava y la novena modalidad del segundo aspecto, el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de tumores sólidos, en donde preferentemente los tumores sólidos se seleccionan del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de seno, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.

El problema que subyace la presente invención, se resuelve en un tercer aspecto el cual también es la primera modalidad del tercer aspecto, a través de un medicamento que comprende una o diversas unidades de dosificación de al menos un primer agente farmacéuticamente activo, en donde el primer agente farmacéuticamente activo es una molécula de ácido nucleico con la capacidad de enlazar a SDF-1, tal como se define en cualquiera de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena, la décima, la decimoprimera, la decimosegunda, la decimotercera, la decimocuarta, la decimoquinta, la decimosexta, la decimoséptima, la decimoctava, la decimonovena, la vigésima, la vigésima primera, la vigésima segunda, la vigesimotercera, la vigesimocuarta, la vigesimoquinta, la vigésima sexta, la vigésima séptima, la vigesimoctava, la vigesimonovena, la trigésima, la trigésimo primera, la trigésimo segunda, la trigésimo tercera, la trigésimo cuarta, la trigésimo quinta, la trigésimo sexta, la trigésimo séptima, la trigésimo octava, la trigésimo novena, la cuadragésima, la cuadragésimo primera, la cuadragésimo segunda, la cuadragésimo tercera, la cuadragésimo cuarta, la cuadragésimo quinta, la cuadragésimo sexta, la cuadragésimo séptima, la cuadragésimo octava, la cuadragésimo novena, la quincuagésima y la quincuagésima primera modalidad del primer aspecto, en donde el medicamento es para utilizarse en un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno, o para utilizarse en un método para el tratamiento de un sujeto que padece de una enfermedad o trastorno o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno como una terapia adjunta, o para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno, en donde la enfermedad o trastorno es cáncer.

En una segunda modalidad del tercer aspecto, la cual también es una modalidad de la primera modalidad del tercer aspecto, la terapia adjunta sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto sensibilizado responde más a una terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno.

En una tercera modalidad del tercer aspecto, la cual también es una modalidad de la segunda modalidad del tercer aspecto, la terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o irradiar al sujeto y/o cirugía y/o terapia celular.

En una cuarta modalidad del tercer aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda y la tercera, preferentemente la primera modalidad del tercer aspecto, el medicamento comprende un agente farmacéuticamente activo adicional, preferentemente en una o varias unidades de dosificación de un agente farmacéuticamente activo adicional, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo, un agente de alquilación, un antimetabolito, un alcaloide de planta, preferentemente vincristina, un terpenoide de planta, un inhibidor de topoisomerasa, Leucovorina, Metotrexato , Tamoxifen, Sorafenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona y Flurouracil.

En una quinta modalidad del tercer aspecto, la cual también es una modalidad de la tercera modalidad del tercer aspecto, el medicamento comprende el agente farmacéuticamente activo adicional, preferentemente una o más unidades de dosificación del agente farmacéuticamente activo adicional, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo, un agente de alquilación, un agente antimetabolito, un alcaloide de planta, preferentemente vincristina, un terpenoide de planta, un inhibidor de topoisomerasa, Leucovorin, Metotrexato, Tamoxifen, Sorafenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona Flurouracil y Prednisona.

En una sexta modalidad del tercer aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta y la quinta modalidad del tercer aspecto, el anticuerpo se selecciona del grupo que comprende Rituximab, Ofatumumab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab y Alemtuzumab.

En una séptima modalidad del tercer aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta y la quinta modalidad del tercer aspecto, el agente de alquilación se selecciona del grupo que comprende cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida , clorambucilo, doxorrubicina, doxorrubicina liposomal, bendamustina, temozolomida y Melfalan.

En una octava modalidad del tercer aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta y la quinta modalidad del tercer aspecto, el antimetabolito se selecciona del grupo que comprende purinoazatioprina, fludarabina de mercaptopurina, pentostatina y cladribina.

En una novena modalidad del tercer aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta y la quinta modalidad del tercer aspecto, el terpenoide de planta se selecciona del grupo de un taxano, más preferentemente seleccionado del grupo que comprende Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina y epotilona.

En una décima modalidad del tercer aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta y la quinta modalidad del tercer aspecto, el inhibidor de topoisomerasa se selecciona del grupo que comprende ca m ptoteci na , irinotecan y mitoxantrona.

En una decimoprimera modalidad del tercer aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena, la décima modalidad del tercer aspecto, en donde el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de cáncer hematológico, en donde preferentemente el cáncer hematológico se selecciona del grupo que comprende leucemia y mieloma.

En una decimosegunda modalidad del tercer aspecto, la cual también es una modalidad de la decimoprimera modalidad del tercer aspecto, la leucemia se selecciona del grupo que comprende leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.

En una decimotercera modalidad del tercer aspecto, la cual también es una modalidad de la decimoprimera modalidad del tercer aspecto, el mieloma es mieloma múltiple.

En una decimocuarta modalidad del tercer aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena y la décima del tercer aspecto, el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de tumores sólidos, en donde preferentemente los tumores sólidos se seleccionan del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de seno, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.

El problema que subyace la presente invención, se resuelve en un cuarto aspecto, la cual también es la primera modalidad del cuarto aspecto, a través del uso de una molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena, la décima, la decimoprimera, la decimosegunda, la decimotercera, la decimocuarta, la decimoquinta, la decimosexta, la decimoséptima, la decimoctava, la decimonovena, la vigésima, la vigésima primera, la vigésima segunda, la vigesimotercera, la vigesimocuarta, la vigesimoquinta, la vigésima sexta, la vigésima séptima, la vigesimoctava, la vigesimonovena, la trigésima, la trigésimo primera, la trigésimo segunda, la trigésimo tercera, la trigésimo cuarta, la trigésimo quinta, la trigésimo sexta, la trigésimo séptima, la trigésimo octava, la trigésimo novena, la cuadragésima, la cuadragésimo primera, la cuadragésimo segunda, la cuadragésimo tercera, la cuadragésimo cuarta, la cuadragésimo quinta, la cuadragésimo sexta, la cuadragésimo séptima, la cuadragésimo octava, la cuadragésimo novena, la quincuagésima y la quincuagésima primera modalidad del primer aspecto, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno o para utilizarse en un método para el tratamiento de un sujeto que padece de una enfermedad o trastorno o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno como una terapia adjunta, en donde la enfermedad o trastorno es cáncer.

En una segunda modalidad del cuarto aspecto, la cual también es una modalidad de la primera modalidad del cuarto aspecto, la terapia adjunta sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto sensibilizado responde más a una terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno.

En una tercera modalidad del cuarto aspecto, la cual también es una modalidad de la segunda modalidad del cuarto aspecto, la terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o irradiar al sujeto y/o cirugía y/o terapia celular.

En una cuarta modalidad del cuarto aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda y la tercera, preferentemente la primera modalidad del cuarto aspecto, el medicamento se utiliza en combinación con un agente farmacéuticamente activo adicional, mediante lo cual el agente farmacéuticamente activo adicional es un agente farmacéuticamente activo seleccionado del grupo que comprende un anticuerpo, un agente de alquilación, un anti-metabolito, un alcaloide de planta, preferentemente vincristina, un terpenoide de planta, un inhibidor de topoisomerasa, Leucovorina, Metotrexato, Tamoxifen, Sorafenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona, Flurouracil y Prednisona.

En una quinta modalidad del cuarto aspecto, la cual también es una modalidad de la tercera modalidad del cuarto aspecto, el agente farmacéuticamente activo adicional es un agente farmacéuticamente activo seleccionado del grupo que comprende un anticuerpo, un agente de alquilación, un antimetabolito, un alcaloide de planta, preferentemente vincristina, un terpenoide de planta, un inhibidor de topoisomerasa, Leucovorina, Metotrexato, Tamoxifen, Sorafenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona, Flurouracil y Prednisona.

En una sexta modalidad del cuarto aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta y la quinta modalidad del cuarto aspecto, el anticuerpo se selecciona del grupo que comprende Rituximab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab y Alemtuzumab.

En una séptima modalidad del cuarto aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta y la quinta modalidad del cuarto aspecto, el agente de alquilación se selecciona del grupo que comprende cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, doxorrubicina, doxorrubicina liposomal, bendamustina, temozolomida y Melfalan.

En una octava modalidad del cuarto aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta y la quinta modalidad del cuarto aspecto, el anti-metabolito se selecciona del grupo que comprende purinoazatioprina, fludarabina de mercaptopurina, pentostatina y cladribina.

En una novena modalidad del cuarto aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta y la quinta modalidad del cuarto aspecto, el terpenoide de planta se selecciona del grupo que comprende un taxano, se selecciona más preferentemente del grupo de Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina y epotilona.

En una décima modalidad del cuarto aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta y la quinta modalidad del cuarto aspecto, el inhibidor de topoisomerasa se selecciona del grupo que comprende camptotecina, irinotecan y mitoxantrona .

En una decimoprimera modalidad del cuarto aspecto, la cual también es una modalidad de la cuarta y la quinta modalidad del cuarto aspecto, el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de cáncer hematológico, en donde preferentemente el cáncer hematológico se selecciona del grupo que comprende leucemia y mieloma.

En una decimosegunda modalidad del cuarto aspecto, la cual también es una modalidad de la decimoprimera modalidad del cuarto aspecto, la leucemia se selecciona del grupo que comprende leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.

En una decimotercera modalidad del cuarto aspecto, la cual también es una modalidad de la decimoprimera modalidad del cuarto aspecto, el mieloma es mieloma múltiple.

En una decimocuarta modalidad del cuarto aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena y la décima modalidad del cuarto aspecto, el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de tumores sólidos, en donde preferentemente los tumores sólidos se seleccionan del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de seno, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.

El problema que subyace la presente invención se resuelve en un quinto aspecto, la cual también es la primera modalidad del quinto aspecto, a través de un método para el tratamiento de un sujeto que padece de, o que está en riesgo de desarrollar cáncer, en donde el método comprende: un paso a) de administración al sujeto de una cantidad farmacéuticamente efectiva de una molécula de ácido nucleico con la capacidad de enlazar a SDF-1, tal como se define en cualquiera de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena, la décima, la decimoprimera, la deci moseg unda , la decimotercera, la decimocuarta, la decimoquinta, la decimosexta, la decimoséptima, la decimoctava, la decimonovena, la vigésima, la vigésima primera, la vigésima segunda, la vigesimotercera, la vigesimocuarta, la vigesimoquinta, la vigésima sexta, la vigésima séptima, la vigesimoctava, la vigesimonovena, la trigésima, la trigésimo primera, la trigésimo segunda, la trigésimo tercera, la trigésimo cuarta, la trigésimo quinta, la trigésimo sexta, la trigésimo séptima, la trigésimo octava, la trigésimo novena, la cuadragésima, la cuadragésimo primera, la cuadragésimo segunda, la cuadragésimo tercera, la cuadragésimo cuarta, la cuadragésimo quinta, la cuadragésimo sexta, la cuadragésimo séptima, la cuadragésimo octava, la cuadragésimo novena, la quincuagésima y la quincuagésima primera modalidad del primer aspecto.

En una segunda modalidad del quinto aspecto, la cual también es una modalidad de la primera modalidad del quinto aspecto, el método comprende: un paso b) para irradiar al sujeto y/o cirugía y/o terapia celular y/o administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente farmacéuticamente activo adicional al sujeto, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional es un agente farmacéuticamente activo seleccionado del grupo que comprende un anticuerpo, un agente de alquilación, un antimetabolito, un alcaloide de planta, preferentemente vincristina, un terpenoide de planta, un inhibidor de topoisomerasa, Leucovorina, Metotrexato, Tamoxifen, Sorafenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona, Flurouracil y Prednisona.

En una tercera modalidad del quinto aspecto, la cual también es una modalidad de la segunda modalidad del quinto aspecto, la cantidad farmacéuticamente efectiva de una molécula de ácido nucleico con la capacidad de enlazar a SDF-1, tal como se define en cualquiera de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena, la décima, la decimoprimera, la decimosegunda, la decimotercera, la decimocuarta, la decimoquinta, la decimosexta, la decimoséptima, la decimoctava, la decimonovena, la vigésima, la vigésima primera, la vigésima segunda, la vigesimotercera, la vigesimocuarta, la vigesimoquinta, la vigésima sexta, la vigésima séptima, la vigesimoctava, la vigesimonovena, la trigésima, la trigésimo primera, la trigésimo segunda, la trigésimo tercera, la trigésimo cuarta, la trigésimo quinta, la trigésimo sexta, la trigésimo séptima, la trigésimo octava, la trigésimo novena, la cuadragésima, la cuadragésimo primera, la cuadragésimo segunda, la cuadragésimo tercera, la cuadragésimo cuarta, la cuadragésimo quinta, la cuadragésimo sexta, la cuadragésimo séptima, la cuadragésimo octava, la cuadragésimo novena, la quincuagésima y la quincuagésima primera modalidad del primer aspecto, se administra como una terapia adjunta o como parte de una terapia adjunta.

En una cuarta modalidad del quinto aspecto, la cual también es una modalidad de la tercera modalidad del quinto aspecto, la terapia adjunta sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto sensibilizado responde más a una terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno.

La quinta modalidad del quinto aspecto, que también es una modalidad de la cuarta modalidad del quinto aspecto, la terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o irradiar al sujeto y/o cirugía y/o terapia celular tal como se lleva a cabo en el paso b).

En una sexta modalidad del quinto aspecto, la cual también es una modalidad de la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta modalidad del quinto aspecto, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Rituximab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab y Alemtuzumab.

En una séptima modalidad del quinto aspecto, la cual también es una modalidad de la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta modalidad del quinto aspecto, el agente de alquilación se selecciona del grupo que consiste en cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, doxorrubicina, doxorrubicina liposomal, bendamustina, temozolomida y Melfalan.

En una octava modalidad del quinto aspecto, la cual también es una modalidad de la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta modalidad del quinto aspecto, el antimetabolito se selecciona del grupo que comprende purinoazatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina y cladribina.

En una novena modalidad del quinto aspecto, la cual también es una modalidad de la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta modalidad del quinto aspecto, el terpenoide de planta se selecciona del grupo que comprende taxanos, más preferentemente se selecciona del grupo de Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina y epotilona.

En una décima modalidad del quinto aspecto, la cual también es una modalidad de la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta modalidad del quinto aspecto, el inhibidor de topoisomerasa se selecciona del grupo que comprende camptotecina, irinotecan y mitoxantrona.

En una decimoprimera modalidad del quinto aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena y la décima modalidad del quinto aspecto, el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de cáncer hematológico, en donde preferentemente el cáncer hematológico se selecciona del grupo que comprende leucemia y mieloma.

En una deci moseg unda modalidad del quinto aspecto, la cual también es una modalidad de la decimoprimera modalidad del quinto aspecto, la leucemia se selecciona del grupo que comprende leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.

En una decimotercera modalidad del quinto aspecto, la cual también es una modalidad de la decimoprimera y la decimosegunda modalidad del quinto aspecto, el mieloma es mieloma múltiple.

En una decimocuarta modalidad del quinto aspecto, la cual también es una modalidad de la primera, la segunda, la tercera, la cuarta, la quinta, la sexta, la séptima, la octava, la novena y la décima modalidad del quinto aspecto, el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de tumores sólidos, en donde preferentemente los tumores sólidos se seleccionan del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de seno, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.

Sin pretender limitarse a teoría alguna, los inventores de la presente invención han descubierto que las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, inhiben el enlace de SDF-1 a sus receptores SDF-1, y por lo tanto, ya sea directa o indirectamente, se utilizan para el tratamiento de cáncer. Además, los inventores de la presente Invención han descubierto que las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, son adecuadas para bloquear la interacción de SDF-1 con los receptores SDF-1 CXCR4 y CXCR7, respectivamente. Por lo tanto, la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 de acuerdo con la presente invención, también se puede observar como antagonista de CXCR4 y CXCR7, respectivamente.

Como para las diversas enfermedades, condiciones y trastornos que se pueden tratar o prevenir a través del uso de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención o composiciones, preferentemente composiciones farmacéuticas que comprenden las mismas, se reconoce que las enfermedades, condiciones y trastornos son aquellas que se describen en la presente invención, incluyendo y en particular las descritas y establecidas en la parte introductoria de la presente solicitud. Por lo tanto, los pasajes respectivos forman una parte integral de la presente descripción, que enseña la capacidad de adecuación de las moléculas de ácido nucleico para la prevención y tratamiento, respectivamente, de las enfermedades, condiciones y trastornos.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término SDF-1 se refiere a cualquier SDF-1 incluyendo pero sin limitarse a SDF-1 de mamífero. Preferentemente el SDF-1 de mamífero se selecciona del grupo que comprende SDF-1 de ratón, rata, conejo, hámster, mono y humano. Más preferentemente el SDF-1 es SDF-1 humano, aunque también es referido como SDF-1a (SEQ ID NO: 1) y/o SDF-?ß humano (SEQ ID NO: 2), lo más preferentemente SDF-1 humano, también referido como SDF-1a (SEQ ID NO: 1).

SDF-1 actúa a través de dos diferentes receptores, los receptores CXCR4 y RDC1/CXCR7 (Balabanian, Lagane et al. 2005a, Burns, Summers et al. 2006) (ver la parte introductoria de la presente solicitud). La expresión elevada de CXCR4 y CXCR7 fue mostrada para diversos tipos de cáncer tal como aquí se describe.

Debido a que SDF-1 actúa a través de dos diferentes receptores, el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con SDF-1 a través de un compuesto específico para uno de los dos receptores SDF-1 CXCR4 y CXCR7: a) debe ser menos efectivo debido a los dos diferentes receptores SDF-1 expresados en las células, preferentemente células de cáncer; b) se limita a una distinta población de células, preferentemente una distinta población de células de cáncer, debido a los receptores SDF-1 individuales expresados en las células.

El cáncer es un término para neoplasmas malignos, un grupo grande y heterogéneo de enfermedades en las cuales las células muestran crecimiento incontrolado, invasión y con frecuencia metástasis, en donde las células de cáncer se dispersan a otros lugares en el cuerpo, a los nodos linfáticos regionales o sitios distantes del cuerpo tipo cerebro, huesos, hígado u otros órganos. Estas tres propiedades malignas del cáncer, diferencian los tumores malignos de los tumores benignos, en donde tal como se utiliza en la presente invención, el término cáncer también debe comprender tumores malignos los cuales a su vez también son referidos en la presente invención como tumores. Los tumores malignos caen en dos categorías con base en su origen: tumores hematológicos y sólidos.

Los tumores hematológicos son tipos de cáncer que afectan la sangre, médula ósea y nodos linfáticos. Los tumores sólidos se forman a través de un crecimiento anormal de células de tejido corporal diferente a la sangre, médula ósea y células linfáticas.

Las formas preferidas de cáncer son las siguientes: Carcinoma Adrenocortical Cánceres relacionados con SIDA tales como Sarcoma de Kaposi y Linfoma Cáncer Anal Cáncer de Apéndice Tumor Teratoide/Rabdoide Atípico Carcinoma de Célula Basal Cáncer de Ducto Biliar, Extrahepático Cáncer de Vejiga Cáncer de Huesos Osteosarcoma Histiocitoma Fibroso Maligno Glioma de Tronco Cerebral Tumor Cerebral tal como Astrocitomas, Tumores de Cerebro y Médula Espinal, Glioma de Tronco Cerebral, Tumor Teratoide/Rabdoide Atípico del Sistema Nervioso Central, de la Niñez, Tumores Embrionarios del Sistema Nervioso Central, Craneofaringioma, Ependimoblastoma, Ependimoma, Meduloblastoma, Meduloepitelioma, Tumores Parenquimales Pineales de Diferenciación Intermedia, Tumores Neuroectodérmicos Primitivos Suprasensoriales y Pineoblastoma.

Cáncer de Seno Tumores Bronquiales Tumor Carcinoide Carcinoma de Origen Desconocido Cáncer del Sistema Nervioso Central tal como Tumor Teratoide/Rabdoide Atípico del Sistema Nervioso Central y Línfoma Cáncer Cervical Cánceres de la Niñez Cordoma Trastornos Mieloproliferativos Crónicos Cáncer de Colon Cáncer Colorrectal Craneofaringioma Linfoma de Célula T Cutáneo Tumores Embrionales Cáncer Endometrial Ependimoblastoma Ependimoma, Cáncer Esofageal Estesioneuroblastoma Familia de Tumores de Sarcoma de Ewing Tumor de Célula Germinal Extracraneal Tumor de Célula Germinal Extragonadal Cáncer de Ducto Biliar Extrahepático Cáncer de Ojos tal como Melanoma Intraocular Retinoblastoma Histiocitoma Fibroso de Huesos Osteosarcoma Cáncer de Vesícula Cáncer Gástrico (Estómago) Tumor Carcinoide Gastrointestinal Tumores Estromales Gastrointestinales (GIST) Tumor de Célula Germinal (extracraneal, extragonadal de ovario) Tumor Trofoblástico Gestacional Glioma Leucemia de Célula Peluda Cáncer de Cabeza y Cuello Cáncer de Corazón Cáncer Hepatocelular (Hígado) Histiocitosis Cáncer Hipofaríngeo Melanoma Intraocular Tumores de Célula de Isleto (Páncreas Endocrino) Sarcoma de Kaposi Cáncer de Riñon Histiocitosis de Célula de Langerhans Cáncer de Laringe Leucemia tal como Leucemia Linfoblástica Aguda (abreviatura ALL), Leucemia Mieloide Aguda (abreviatura AML), Leucemia Linfocítica Crónica (abreviatura CLL), Leucemia Mielogenosa Crónica (abreviatura CML) y Leucemia de Célula Peluda Cáncer de Cavidad Oral y Labio Cáncer de Hígado (Primario) Carcinoma Lobular In Situ (LCIS) Cáncer de Pulmón Linfoma tal como Linfoma Relacionado con SIDA, Burkitt, Micosis Fungoides y Síndrome de Sézary, Hodgkin, No Hodgkin y leucemia del Sistema Nervioso Central Primario (abreviatura CNS) Macroglobulinemia Histiocitoma Fibroso Maligno de Hueso y Osteosarcoma Medu loblastoma Meduloepitelioma Melanoma Carcinoma de Célula de Merkel Mesotelioma Cáncer de Cuello Escamoso Metastático con Origen Primario Oculto Carcinoma de Tracto de Línea Media que implica Gen NUT Cáncer de Boca Síndromes de Neoplasia Endocrina Múltiple Mieloma Múltiple Fungoides de Micosis Síndromes Mielodisplásicos Neoplasmas Mielodisplásicos/Mieloproliferativos Trastornos Mieloproliferativos Cáncer de Cavidad Nasal y Seno Paranasal Cáncer Nasofaríngeo Cáncer de Pulmón de Célula no Pequeña Cáncer Oral Cáncer de Cavidad Oral Cáncer Orofaríngeo Osteosarcoma e Histiocitoma Fibroso Maligno de Huesos Cáncer de Ovario Cáncer Pancreático Papilomatosis Paraganglioma Cáncer de Cavidad Nasal y Seno Paranasal Cáncer Paratiroides Cáncer de Pene Cáncer Faríngeo Feocromocitoma Tumores Parenquimales Pineales de Diferenciación Intermedia Pineoblastoma y Tumores Neuroectodérmicos Primitivos Suprasensoriales Tumor de Pituitaria Mieloma Múltiple/Neoplasma de Célula de Plasma Blastoma Pleuropulmonar, Niñez Linfoma de Sistema Nervioso Central Primario (abreviatura CNS) Cáncer de Próstata Cáncer Rectal Cáncer de Célula Renal (Riñon) Cáncer de Célula Transicional, de Pelvis Renal y Uretra Retinoblastoma Rabdomiosarcoma Cáncer de Glándula Salival Sarcoma tal como Familia de Tumores de Sarcoma de Ewing, Sarcoma de Kaposi, Sarcoma de Tejido Blando, Sarcoma Uterino Cáncer de Piel tal como Melanoma, Carcinoma de Célula de Merkel y Nonmelanoma Cáncer de Pulmón de Célula Pequeña Cáncer de Intestino Delgado Sarcoma de Tejido Blando Carcinoma de Célula Escamosa Cáncer de Cuello Escamoso Cáncer de Estómago (Gástrico) Tumores Neuroectodérmicos Primitivos Suprasensoriales Linfoma de Célula T Cáncer de Testículo Cáncer de Garganta Carcinoma de Timoma y Tímico Cáncer de Tiroides Cáncer de Célula de Transición de la Pelvis Renal y Uretra Tumor Trofoblástico, Gestacional Cáncer de Célula Transicional, Pelvis Renal y Uretra Cáncer de Uretra Cáncer Uterino, Endometrial Sarcoma Uterino Cáncer Vaginal Cáncer Vulvar acroglobulinemia de Waldenstróm Tumor de Wilms El eje SDF-1-CXCR4 ha mostrado desempeñar un papel en la movilización de célula madre incluyendo células madre de cáncer, vasculogénesis, crecimiento de tumor y metástasis. El receptor SDF-1 CXCR4 expresa una variedad de cánceres y malignidades hematológicas in vivo, tal como CXCR7 (Maksym, Tarnowski et al., 2009; Wang, Shiosawa et al., 2008; Miao, Lucker et al., 2007). La señal de crecimiento e invasión de células de tumores SDF-1, en particular, si las células expresan los receptores para SDF-1 (Batchelor et al., 2007; Zhu et al., 2009; Xu et al., 2009; Kozin et al., 2010).

CXCR4 asi como SDF-1 son inducidos por hipoxia (Ceradini et al. 2004). Junto con VEGF representan un eje sinérgico potente que inicia y mantiene las trayectorias angiogénicas/vascologénicas (Kryczek et al. 2005). El desempeño en la vasculogénesis está soportado por la evidencia de que SDF-1 atrae CXCR4 que expresan células progenitoras endoteliales de la circulación (Sengupta et al. 2005). El reclutamiento transmitido por SDF-1 -CXCR4 de las células derivadas de médula ósea que soporta la vascularización, también puede ser la razón para la recurrencia de glioblastoma después de terapia de irradiación (Kioi et al., 2010). Tal como lo demuestra Kioi et al., en un modelo de xenoinjerto de ratón multiforme de glioblastoma intracraneal (abreviatura GBM) el tratamiento de pacientes GB con altas dosis de radiación, es menos efectivo debido a que la radiación indujo el reclutamiento de células derivadas de médula ósea (abreviatura BMDCs). El bloqueo de la interacción de SDF-1 y su receptor CXCR4 a través del antagonista CXCR4 AMD3100, previno el influjo de BMDCs en el tumor irradiado (Kioi et al., 2010). En 2010, Tseng y asociados presentó datos con un modelo de rata de glioblastoma inducido mediante ENU, un modelo que mimetiza cercanamente GBM humano, en donde además de CXCR4, CXCR7 también estuvo implicado en el reclutamiento de BMDCs inducido por la irradiación. En este estudio, el antagonista CXCR7 CCX2206 previno el influjo de BMDCs en el tumor irradiado (Tseng et al., 2010). De acuerdo con esto y debido a que las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención también tienen la capacidad de bloquear la interacción tanto de SDF-1 como de CXCR4 y SDF-1 como CXCR7, se espera que el efecto en la supervivencia después de la irradiación, sea mejor que el mostrado para el uso de uno de los antagonistas CXCR4 y CXCR7 solos.

Además, SDF-1 induce secreción VEGF, en tanto que VEGF incrementa la expresión de CXCR4 (Salcedo et al. 1999) y las señales de angiogénesis. Por consiguiente la inhibición del eje SDF-1 - CXCR4 puede reducir o prevenir el crecimiento de tumor mediante la inhibición de angiogénesis/vasculogénesis ya sea con monoterapia o particularmente en combinación con otros agentes antivasculares tales como inhibidores VEGF.

Además, se sugiere que el "homing" de las células de cáncer que expresan CXCR4 para órganos que expresan SDF-1-, dirija células metastáticas preferentemente al hígado, médula ósea, pulmón y nodos linfáticos (Alsayed et al. 2007; Burger & Peled 2009) y por consiguiente el eje SDF-1 - CXCR4 desempeña un papel importante en la metástasis.

Por lo tanto, la inhibición del eje SDF-1 - CXCR4 y el eje SDF-1 - CXCR7 únicamente con un compuesto tal como la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 de acuerdo con la presente invención, debe ser efectiva para tratar cáncer y/o tumores, en particular un amplio rango de tumores tanto hematológicos como sólidos, ya sea como monoterapia o en combinación con otros tratamientos, tales como pero sin limitarse a fármacos terapia, terapia celular, irradiación y cirugía. Además, en comparación con un compuesto que enlaza e inhibe uno de los dos receptores SDF-1 CXCR4 y CXCR7, la inhibición del eje SDF-1 - CXCR4 y del eje SDF-1 - CXCR7 únicamente con un compuesto tal como la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 de acuerdo con la presente invención, debe ser más efectiva para tratar cáncer y/o tumores, en particular un amplio rango de tumores hematológicos y sólidos, ya sea como monoterapia o en combinación con otros tratamientos tales como pero sin limitarse a terapia de fármaco, terapia celular, irradiación y cirugía.

Está dentro de la presente invención que la terapia de fármaco comprende el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno a través de un fármaco, preferentemente un agente activo, más preferentemente un agente farmacéuticamente activo tal como aquí se define.

Tal como se utiliza preferentemente en la presente invención, en terapia de célula, también referida como terapia celular, el tejido procesado procedente de órganos, embriones o fetos de animales tales como oveja o vacas, se inyecta en un sujeto que padece de o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno, en donde preferentemente la enfermedad o trastorno es cáncer y la terapia de célula una forma de tratamiento de cáncer.

En teoría, se pueden curar los cánceres no hematológicos y se elimina completamente mediante cirugía. Cuando el cáncer ha hecho metástasis a otros sitios en el cuerpo antes de la cirugía, la extirpación quirúrgica completa normalmente es imposible. Los ejemplos de procedimientos quirúrgicos o cirugía para cáncer incluyen mastectomía de cáncer de seno, prostatectom ía de cáncer de próstata y cirugía de cáncer de pulmón para cáncer de pulmón de célula no pequeña. La meta de la cirugía puede ser ya sea la eliminación únicamente del tumor, o de todo el órgano. Con frecuencia la cirugía se combina con otros tratamientos o terapias de cáncer, tal como quimioterapia y radiación. La cirugía de cáncer se puede utilizar para lograr una o más metas. Las metas pueden incluir pero no se limitan a prevención, diagnóstico, determinación de etapas, tratamiento primario, eliminación de volumen y liberación de síntomas o efectos secundarios de cáncer.

La radioterapia (también referida como terapia de rayos X o irradiación) es el uso de radiación por ionización para aniquilar células de cáncer. La radioterapia se utiliza en las artes médicas para tratar casi cualquier tipo de tumor sólido. La irradiación también se utiliza para tratar leucemia y linfoma. La radioterapia lesiona o destruye células en el área que está siendo tratada, dañando su material genético, haciendo imposible que estas células continúen creciendo y dividiéndose. Los efectos de la radioterapia se localizan y confinan a la región que está siendo tratada. La dosis de radiación para cada sitio depende de una cantidad de factores, incluyendo la radiosensibllidad de cada tipo de cáncer, y si existen tejidos y órganos cercanos que puedan ser dañados por la radiación. La meta de la radioterapia es dañar tantas células de cáncer como sea posible, limitando al mismo tiempo el daño a tejidos saludables cercano.

Además, una molécula de áci.do nucleico de enlace SDF-1 de acuerdo con la presente invención, se prefiere si el efecto fisiológico del eje SDF-1 - CXCR4 y/o eje SDF-1 - CXCR7, está relacionado con mayores niveles en plasma de SDF-1. Por ejemplo, los agentes terapéuticos particulares tales como paclitaxel y bevacizumab producen una elevación de los niveles de SDF-1 en plasma, que pueden tener un efecto negativo en la terapia de tumor, mediante la liberación de más células progenitoras endoteliales derivadas de médula ósea, o mediante la estimulación de crecimiento, invasividad o metástasis (Shaked, Henke et al., 2008; Xu, Duda et al., 2009). En este caso, la aplicación conjunta de un ácido nucleico de enlace SDF-1, disminuirá los efectos de los niveles de SDF-1 en plasma elevados.

Además, la inhibición del eje SDF-1 - CXCR4 y/o el eje SDF-1 - CXCR7 a través de una molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 de acuerdo con la presente invención, incrementará los efectos anti-tumor de otros agentes terapéuticos, interrumpiendo las interacciones estromales adhesivas con leucemia y otras células de cáncer que confieren supervivencia y resistencia a fármacos para estas terapias (Jin et al. 2008; Nervi et al. 2009). El uso de las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 es conocido como un proceso conocido como quimiosensibilización.

La sensibilización de células de tumor a la quimioterapia o radioterapia es conocida como "quimiosensibilización" o "radiosensibilización", respectivamente. Dicha "quimiosensibilización" o "radiosensibilización", preferentemente a través de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, sensibiliza al sujeto que padece de una enfermedad o trastorno, en donde el sujeto sensibilizado responde más a una terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno, en donde preferentemente la enfermedad o el trastorno es cáncer. El tratamiento utilizado junto con un tratamiento primario, preferentemente un tratamiento de cáncer, es una terapia adjunta de acuerdo con la presente invención, y también referida como terapia adjunta. El propósito de la terapia adjunta es ayudar a un tratamiento primario, preferentemente un tratamiento de cáncer primario. Por lo tanto, la inhibición del eje SDF-1 - CXCR4 y/o el eje SDF-1 - CXCR7 será particularmente efectiva en el tratamiento de un amplio rango de tumores tanto sólidos como hematológicos, ya sea como monoterapia o en combinación con otros tratamientos tales como pero sin limitarse a terapia de fármacos, terapia celular, irradiación y cirugía.

A través de estos medios y en virtud de la implicación señalada de SDF-1 y receptores SDF-1, tales como CXCR4 y CXCR7 -, el enlace SDF-1 y la interacción entre SDF-1 y las moléculas de ácido nucleico que inhiben el receptor SDF-1 de acuerdo con la presente invención, puede ayudar a atenuar las enfermedades, en donde la inhibición de SDF-1 a través de las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 de acuerdo con la presente invención, conduce a la quimiosensibilización de células malignas para ser tratadas mediante quimioterapia, reducción o inhibición de crecimiento e invasividad, inhibición de angiogénesis/vasculogénesis, inhibición de metástasis y/o inhibición de niveles SDF-1 en plasma elevados derivados de la respuesta del huésped a la quimioterapia.

Además, la presente invención está basada en el sorprendente descubrimiento de que es posible generar moléculas de ácido nucleico de enlacen específicamente, y con alta afinidad a SDF-1, inhibiendo o antagonizando de esta forma los efectos de SDF-1, en particular los efectos de SDF-1 en sus receptores tales como CXCR4 y CXCR7.

Un antagonista para SDF-1 es una molécula que enlaza a SDF-1 - tal como las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 de acuerdo con la presente invención - e inhibe la función de SDF-1, preferentemente en un ensayo in vitro o en un modelo in vivo, tal como se describe en la sección de Ejemplos.

Está dentro de la presente invención, que el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención sea una molécula de ácido nucleico. Por lo tanto los términos ácido nucleico y molécula de ácido nucleico se utilizan en la presente invención en una forma sinónima, sino se indica lo contrario. Además, los ácidos nucleicos también son referidos preferentemente en la presente invención como las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, los ácidos nucleicos de la presente invención o las moléculas de ácido nucleico de la presente invención.

Las características del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, tal como aquí se describen, se pueden materializar en cualquier aspecto de la presente invención, en donde se utiliza el ácido nucleico, ya sea solo o en cualquier combinación.

Tal como se indica con mayor detalle en la presente invención, los inventores de la misma han identificado un número de diferentes moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1, en donde las moléculas de ácido nucleico pueden ser caracterizadas en término de extensiones de nucleótidos, las cuales también son referidas en la presente invención como "Cajas" (ver Ejemplo 1). Tal como se muestra en forma experimental en los Ejemplos del 5 al 10, los inventores pueden demostrar en forma sorprendente en diversos sistemas, que las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 son adecuadas para el tratamiento de cáncer, y realmente tienen la capacidad de tratar cáncer.

Los diferentes tipos de molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 comprenden tres diferentes extensiones de nucleótidos: la primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos. En general, las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 de la presente invención, comprenden en su extremo 5' y en su extremo 3', las extensiones terminales de nucleótidos: la primera extensión terminal de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos (también referida como extensión 5'-terminal de nucleótidos y extensión 3'-terminal de nucleótidos). La primera extensión terminal de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos puede, en principio debido a su complementariedad base, hibridar entre sí, mediante lo cual al momento de la hibridación se forma una estructura de hebra doble. Sin embargo, la hibridación no se materializa necesariamente en la molécula bajo condiciones fisiológicas y/o no fisiológicas. Las tres extensiones de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 - la primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos - se distribuyen entre sí en la dirección 5' - 3': la primera extensión terminal de nucleótidos - la extensión central de nucleótidos - la segunda extensión terminal de nucleótidos. Sin embargo, como alternativa, la segunda extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos y la primera extensión terminal de nucleótidos, se distribuyen entre sí en la dirección 5' - 3'-.

Las diferencias en las secuencias de las cajas o extensiones definidas entre las diferentes moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1, influencian la afinidad de enlace para SDF-1. Con base en el análisis de enlace de las diferentes moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 de la presente invención, la extensión central y los nucleótidos que forman la misma, están individual y más preferentemente en su totalidad esencial para enlazar a SDF-1 humano.

Los términos "extensión" y "extensión de nucleótido" se utilizan en la presente invención en una forma sinónima si no se indica lo contrario.

En una modalidad preferida, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, es una molécula de ácido nucleico simple. En una modalidad adicional, la molécula de ácido nucleico simple está presente como una pluralidad de moléculas de ácido nucleico, o como una pluralidad de especies de moléculas de ácido nucleico simple.

Los expertos en la técnica podrán reconocer, que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, consiste preferentemente en nucleótidos los cuales son enlazados covalentemente entre sí, preferentemente a través de enlaces o ligaduras de fosfodiéster.

Está dentro de la presente invención, que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención comprendan dos o más extensiones o una parte(s) de los mismos, en principio, puede hibridar entre sí. Al momento de la hibridación, se forma una estructura de hebra doble. Los expertos en la técnica podrán reconocer que la hibridación puede o no ocurrir, particularmente bajo condiciones in vitro y/o in vivo. Asimismo, en el caso de la hibridación, no es necesariamente el caso en que la hibridación ocurre en toda la longitud de las dos extensiones en donde, al menos con base en las reglas para el emparejamiento base, la hibridación, y por lo tanto la formación de una estructura de hebra doble en principio puede ocurrir. Tal como se utiliza preferentemente en la presente invención, una estructura de hebra doble es una parte de la molécula de ácido nucleico o una estructura formada por dos o más hebras separadas o dos extensiones separadas en espacio de una hebra simple de una molécula de ácido nucleico, en donde existe preferentemente uno, preferentemente dos o más pares base, los cuales son el emparejamiento base preferentemente de acuerdo con las reglas de emparejamiento base de Watson-Crick. Los expertos en la técnica también podrán reconocer que el otro emparejamiento base, tal como el emparejamiento base de Hoogsten puede existir en, o formar la estructura de hebra doble. También se podrá reconocer que la característica de que dos extensiones hibriden, indican preferentemente que se asume que ocurre la hibridación debido a la complementariedad base de las dos extensiones.

En una modalidad preferida, el término distribución tal como aquí se utiliza, significa el orden o secuencia de características estructurales o funcionales, o elementos aquí descritos en relación con los ácidos nucleicos aquí descritos.

Los expertos en la técnica podrán reconocer que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, tienen la capacidad de enlazar a SDF-1. Sin pretender limitarse a teoría alguna, los inventores de la presente invención asumen que el enlace de SDF-1 resulta de una combinación de rasgos o elementos de estructura tridimensional de la molécula de ácido nucleico reivindicada, los cuales son originados por la orientación y patrones de doblez de la secuencia de nucleótidos primaria que forma dichos rasgos o elementos, en donde preferentemente los rasgos o elementos son la primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1. Es evidente que el rasgo o elemento individual puede formarse a través de las diferentes secuencias individuales cuyo grado de variación puede variar dependiendo de la estructura tridimensional que el elemento o rasgo tiene que formar. La característica de enlace general del ácido nucleico reivindicado resulta del juego interno de los diversos elementos y rasgos, respectivamente, lo cual finalmente da como resultado la interacción del ácido nucleico reivindicado con su objetivo, es decir SDF-1. Nuevamente sin pretender limitarse a teoría alguna, la extensión central de nucleótidos que es característica para ácidos nucleicos de enlace SDF-1, parece ser importante para transmitir el enlace de las moléculas de ácido nucleico reivindicadas con SDF-1. Por consiguiente, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, son adecuados para la interacción con SDF- 1. Asimismo, los expertos en la técnica podrán reconocer que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención son antagonistas para SDF-1. Debido a esto, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención son adecuados para el tratamiento y prevención, respectivamente, de cualquier enfermedad o condición que esté asociada con o sea originada por SDF-1. Dichas enfermedades y condiciones pueden ser tomadas de la técnica anterior, la cual establece que SDF-1 está implicado o asociado con las enfermedades y condiciones, respectivamente, y la cual se incorpora a la presente invención como referencia, para proporcionar los raciocinios científicos para el uso terapéutico de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, también deben comprender ácidos nucleicos que sean esencialmente homólogos para las secuencias particulares aquí descritas. El término sustancialmente homólogo, debe quedar entendido de manera que la homología sea de al menos el 75%, preferentemente 85%, más preferentemente 90%, y lo más preferentemente mayor a 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.

El porcentaje real de nucleótidos homólogos presentes en el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, dependerá del número total de nucleótidos presentes en el ácido nucleico. El porcentaje de modificación puede estar basado en el número total de nucleótidos presentes en el ácido nucleico.

La homología entre dos moléculas de ácido nucleico se puede determinar tal como lo conocen los expertos en la técnica. Más específicamente, se puede utilizar un algoritmo de comparación de secuencia para calcular el porcentaje de homología de secuencia de la secuencia(s) de prueba relativa a la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa designados. La secuencia de prueba es preferentemente la secuencia o molécula de ácido nucleico que se dice será homologa, o que se probará si es homologa, y si es así, hasta que grado, a una molécula de ácido nucleico diferente, mediante lo cual la molécula de ácido nucleico diferente también es referida como la secuencia de referencia. En una modalidad, la secuencia de referencia es una molécula de ácido nucleico tal como aquí se describe, preferentemente una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de acuerdo con cualesquiera de las SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 225, más preferentemente una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 y SEQ ID NO: 144. Las alineaciones de secuencias óptimas para comparación pueden llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman (Smith & Waterman, 1981) mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch (Needleman & Wunsch, 1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson & Lipman (Pearson & Lipman, 1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual.

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia, es el algoritmo utilizado en la herramienta de búsqueda de alineación local básica (en lo sucesivo "BLAST"), ver por ejemplo la Publicación de Altschul et al (Altschul et al. 1990 y Altschul et al, 1997). El software que lleva a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible en el Centro Nacional para Información de Biotecnología (en lo sucesivo "NCBI"). Los parámetros por omisión utilizados para determinar la identidad de secuencia utilizando el software disponible en NCBI, por ejemplo, BLASTN (para secuencias de nucleótido) y BLASTP (para secuencias de aminoácido) se describen en la Publicación de McGinnis et al (McGinnis et al, 2004).

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, también deben comprender ácidos nucleicos que tienen un cierto grado de identidad relativa a los ácidos nucleicos aquí descritos, y definidos a través de su secuencia de nucleótido. Más preferentemente, la presente invención también comprende las moléculas de ácido nucleico que tienen una identidad al menos 75%, preferentemente 85%, más preferentemente 90% y lo más preferentemente mayor a 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, en forma relativa a los ácidos nucleicos aquí descritos, y definida por su secuencia de nucleótidos o parte de la misma.

El término ácido nucleico de la presente invención o ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, también debe comprender los ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos aquí descritas o parte de las mismas, tal como, por ejemplo, un metabolito o derivado de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, preferentemente hasta el grado en que los ácidos nucleicos o las partes estén implicadas en, o tengan la capacidad de enlazar el SDF-1. Un ácido nucleico puede ser derivado de los descritos en la presente invención, por ejemplo, mediante truncado. El truncado puede estar relacionado con cualquiera de, o ambos de los extremos de los ácidos nucleicos aquí descritos. Asimismo, el truncado puede estar relacionado con la secuencia de nucleótidos interna, es decir, puede relacionarse con el nucleótido(s) entre el nucleótido 5' y 3' terminal, respectivamente. Además, el truncado debe comprender la eliminación de tan poco como un nucleótido simple de la secuencia de los ácidos nucleicos aquí descritos. El truncado también puede estar relacionado con más de una extensión del ácido(s) nucleico de la invención, en donde la extensión puede ser tan pequeña como de un nucleótido de largo. El enlace de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se puede determinar a través de los expertos en la técnica utilizando experimentos de rutina o utilizando o adoptando un método tal como aquí se describe, preferentemente tal como aquí se describe en la parte de ejemplos.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden ser ya sea ácidos nucleicos-D o ácidos nucleicos-L. Preferentemente, los ácidos nucleicos de la invención son ácidos nucleicos-L. Además, es posible que una o varias partes del ácido nucleico estén presentes como ácidos nucleicos-D o al menos una o varias partes de los ácidos nucleicos son ácidos nucleicos-L. El término "parte" de los ácidos nucleicos, debe significar tan poco como un nucleótido. Los ácidos nucleicos generalmente son referidos en la presente invención, ácidos nucleicos D y L, respectivamente. Por consiguiente, en una modalidad particularmente preferida, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención consisten en los nucleótidos-L y comprenden al menos un nucleótido-D. El nucleótido-D se adhiere preferentemente a una parte diferente de las extensiones que definen los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, preferentemente las partes de las mismas, en donde está implicada una interacción con otras partes del ácido nucleico. Preferentemente, el nucleótido-D se adhiere en un término de cualquiera de las extensiones y cualquier ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, respectivamente. En una modalidad preferida adicional, los nucleótidos-D pueden actuar como un espaciador o un enlazador, preferentemente adhiriendo modificaciones tales como PEG y HES a los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención-.

También está dentro de la presente invención, que cada una y cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aquí descritas, en su totalidad en términos de su secuencia(s) de ácido nucleico, se limiten a la secuencia(s) de nucleótido particulares. En otras palabras, los términos "que comprende" o "comprende" deben interpretarse en la modalidad en el significado de que contienen o consisten en.

También está dentro de la presente invención, que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención sean parte de un ácido nucleico más largo, en donde este ácido nucleico más largo comprende varias partes, en donde al menos una parte es un ácido nucleico, o una parte del mismo, de acuerdo con la presente invención. La otra parte(s) de estos ácidos nucleicos más largos puede ser ya sea uno o diversos ácidos nucleicos-D o ácidos nucleicos-L. Cualquier combinación puede utilizarse en relación con la presente invención. Estas otras partes del ácido nucleico más largo pueden exhibir una función que es diferente al enlace, preferentemente el enlace a SDF-1. Una posible función es permitir la interacción con otras moléculas, en donde las otras moléculas son preferentemente diferentes a SDF-1, tal como por ejemplo, para inmovilización, reticulación, detección o amplificación. En una modalidad adicional de la presente invención, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención comprenden, como porciones individuales o combinadas, varios de los ácidos nucleicos de la presente invención. El ácido nucleico que comprende varios de los ácidos nucleicos de la presente invención, también está comprendido por el término ácido nucleico más largo.

Los ácidos nucleicos-L tal como aquí se utilizan, son ácidos nucleicos que consisten en nucleótidos-L, que consisten preferentemente completamente en nucleótidos-L.

Los ácidos nucleicos-D tal como se utiliza en la presente invención, son ácidos nucleicos que consisten en nucleótidos-D, preferentemente consisten completamente en nucleótidos-D.

Los términos ácido nucleico y molécula de ácido nucleico se utilizan en la presente invención en una forma intercambiable, sino se indica explícitamente lo contrario.

Asimismo, si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de nucleótido se establece en la presente invención en la dirección 5' -> 3'.

Tal como se utiliza preferentemente en la presente invención, cualquier posición de un nucleótido se determina o se hace referencia en forma relativa al extremo 5' de una secuencia, una extensión o una subextensión. Por consiguiente, el segundo nucleótido es el segundo nucleótido contado desde el extremo 5' de la secuencia, extensión y subextensión, respectivamente. Asimismo, de acuerdo con esto, un penúltimo nucleótido, es el segundo nucleótido contado desde el extremo 3' de una secuencia, extensión o subextensión, respectivamente.

Sin importar si el ácido nucleico de la invención consiste en nucleótidos-D, nucleótidos-L o una combinación de ambos, siendo la combinación, por ejemplo, una combinación aleatoria o una secuencia de extensiones definidas que consisten en al menos un nucleótido-L y al menos un ácido nucleico-D, el ácido nucleico puede consistir en desoxi rri bon ucleótido(s), ribonucleótido(s) o una combinación de los mismos.

El designar los ácidos nucleicos de la invención como el ácido nucleico-L, es conveniente por diversas razones. Los ácidos nucleicos-L son enantiómeros de ácidos nucleicos que ocurren naturalmente. Los ácidos nucleicos-D, sin embargo, no son muy estables en soluciones acuosas y particularmente en sistemas biológicos o muestras biológicas debido a la amplia presencia de nucleasas. Las nucleasas que ocurren naturalmente, particularmente nucleasas de células animales, no tienen la capacidad de degradar los ácidos nucleicos-L. Debido a esto, la vida media biológica del ácido nucleico-L se incrementa en forma significativa en dicho sistema, incluyendo el cuerpo humano o de un animal. Debido a la carencia de capacidad de degradación del ácido nucleico-L, se generan productos de degradación sin nucleasa, y por lo tanto no se observan efectos laterales que surjan de los mismos. Este aspecto delimita el ácido nucleico-L de hecho de todos los otros compuestos que se utilizan en la terapia de enfermedades y/o trastornos que implican la presencia de SDF-1. Los ácidos nucleicos-L que enlazan específicamente a una molécula objetivo a través de un mecanismo diferente al emparejamiento de base Watson Crick, o aptámeros que consisten parcial o completamente en nucleótidos-L, particularmente con las partes del aptámero estando implicadas en el enlace del aptámero a la molécula objetivo, también son llamados espiegélmeros. Los aptámeros y espiegélmeros, son tal como los conocen los expertos en la técnica, y se describen, entre otras publicaciones en "Manual de Aptámero" (eds. Klussmann, 2006).

También está dentro de la presente invención que los ácidos nucleicos de la presente invención, sin importar si están presentes como ácidos nucleicos-D, ácidos nucleicos-L o ácidos nucleicos-D, L o si son ADN o ARN, pueden estar presentes como ácidos nucleicos de hebra simple o hebra doble. Normalmente, los ácidos nucleicos de la invención son ácidos nucleicos de hebra simple, que exhiben estructuras secundarias definidas debido a la secuencia primaria, y por lo tanto también pueden formar estructuras terciarias. Sin embargo, los ácidos nucleicos de la presente invención, también pueden ser de hebra doble, significando que dos hebras, las cuales son complementarias o parcialmente complementarias entre sí, son hibridadas entre sí.

Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser modificados. Las modificaciones pueden estar relacionadas con el nucleótido simple del ácido nucleico, y son bien conocidas en la técnica. Los ejemplos de dicha modificación se describen, entre otras publicaciones en Venkatesan et al. (Venkatesan, Kim et al. 2003) y Kusser (Kusser 2000). La modificación puede ser un átomo H, un átomo F, un grupo 0-CH3 o un grupo NH2 en la posición 2' del nucleótido individual del cual consiste el ácido nucleico. Asimismo, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender al menos un nucleótido LNA. En una modalidad, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención consiste en nucleótidos LNA.

En una modalidad, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden ser un ácido nucleico de partes múltiples. Un ácido nucleico de partes múltiples tal como aquí se utiliza, es un ácido nucleico que consiste en al menos dos hebras de ácido nucleico separadas. Estas al menos dos hebras de ácido nucleico forman una unidad funcional, en donde la unidad funcional es un ligando para una molécula objetivo. Las al menos dos hebras de ácido nucleico pueden derivarse de cualesquiera de los ácidos nucleicos de la presente invención, ya sea disociando la molécula de ácido nucleico para generar dos hebras, o sintetizando un ácido nucleico que corresponde a una primera parte de la invención, es decir, ácido nucleico general y otro ácido nucleico que corresponde a la segunda parte del ácido nucleico general. Se podrá reconocer que tanto la disociación como la síntesis pueden ser aplicadas para generar un ácido nucleico de partes múltiples, en donde existen más de dos hebras tal como se ejemplificó anteriormente. En otras palabras, las al menos dos hebras separadas de ácido nucleico normalmente son diferentes a las dos hebras que son complementarias e hibridan entre sí, aunque puede existir un cierto grado de complementariedad entre las al menos dos hebras de ácido nucleico separadas, y por lo tanto la complementariedad, puede dar como resultado la hibridación de las hebras separadas.

Finalmente, también está dentro de la presente invención, que se materialice una estructura completamente cerrada, es decir circular para los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, es decir que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención estén cerrados sin una modalidad, preferentemente a través de un enlace covalente, en donde más preferentemente el enlace covalente se elabora entre el extremo 5' y el extremo 3' de las secuencias de ácido nucleico tal como aquí se describen, o cualquier derivado de las mismas.

Una posibilidad para determinar las constantes de enlace de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, es el uso de los métodos tal como aquí se describen en el ejemplo 3 y 4, lo cual confirma el descubrimiento anterior de que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, exhiben un rango de valor KD favorable. Una medida adecuada, con el objeto de expresar la intensidad del enlace entre la molécula de ácido nucleico individual y el objetivo, la cual está en el presente caso de SDF-1, también es llamada el valor KD, el cual así como el método para su determinación, son conocidos para un experto en la técnica.

Preferentemente, el valor KD mostrado por los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, está debajo de µ?. Se dice que un valor KD de aproximadamente 1 µ? será característico de un enlace no específico de un ácido nucleico a un objetivo. Tal como lo reconocerán los expertos en la técnica, el valor KD de un grupo de compuestos, tal como los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, está dentro de cierto rango. La KD mencionada anteriormente de aproximadamente 1 µ?, es un límite superior preferido para el valor KD. El límite inferior para el KD de los ácidos nucleicos de enlace objetivo, puede ser tan pequeño como de aproximadamente 10 picomolar o puede ser mayor. Está dentro de la presente invención, que los valores KD de los ácidos nucleicos individuales que enlazan a SDF-1, estén preferentemente dentro de este rango. Los rangos preferidos pueden ser definidos eligiendo cualquier primer número dentro de este rango, y cualquier segundo número dentro de este rango. Los valores KD superiores preferidos, son 250 nM y 100 nM, los valores KD inferiores preferidos son 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM y 10 pM. El valor KD superior más preferido es 2.5 nM, el valor KD inferior más preferido es 100 pM.

Además de las propiedades de enlace de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención inhiben la función de la molécula objetivo respectiva, la cual es en el presente caso SDF-1. La inhibición de la función de SDF-1 - por ejemplo el estímulo de los receptores receptivos tal como se describió previamente - se logra enlazando las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente Invención a SDF-1, y forman un complejo de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y MCP-1 y SDF-1. Dicho complejo de molécula de ácido nucleico y SDF-1, no puede estimular los receptores que normalmente son estimulados por SDF-1. Por consiguiente, la inhibición de la función receptora mediante moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, depende del receptor respectivo que puede ser estimulado mediante SDF-1, pero resulta de la prevención del estímulo del receptor mediante MCP-1 y SDF-1, a través de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.

Una posibilidad para determinar la constante de inhibición de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, es el uso de los métodos tal como se describe en el ejemplo 5 y 6 (para CXCR4 y CXCR7, respectivamente) lo cual confirma el descubrimiento anterior de que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención exhiben una constante de inhibición favorable que permite el uso de los ácidos nucleicos en un esquema de tratamiento terapéutico. Una medida adecuada con el objeto de expresar la intensidad del efecto inhibidor de la molécula de ácido nucleico individual en la interacción del objetivo, la cual está en el presente caso SDF-1 y el receptor respectivo, es la llamada media concentración inhibidora máxima (abreviada IC50), la cual así como el método para su determinación, son conocidos para los expertos en la técnica. Preferentemente, el valor IC50 mostrado por las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es inferior a 1 µ?. Un valor IC50 de aproximadamente 1 µ?, se dice que será característico de una inhibición no específica de funciones objetivo a través de la molécula de ácido nucleico. Tal como lo reconocerán los expertos en la técnica, el valor IC50 de un grupo de compuestos, tal como las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, está dentro de cierto rango. El IC5o antes mencionado de aproximadamente 1 µ?, es un límite superior preferido del valor IC50- El límite inferior para el IC5o de las moléculas de ácido nucleico de enlace objetivo, puede ser tan pequeño como de aproximadamente 10 picomolar o puede ser mayor. Está dentro de la presente invención que los valores IC50 de ácidos nucleicos individuales que enlazan a SDF- , esté preferentemente dentro de este rango. Se pueden definir rangos preferidos eligiendo cualquier primer número dentro de este rango y cualquier segundo número dentro de este rango. Los valores IC50 superiores preferidos son 250 nM y 100 nM, los valores IC5o inferiores preferidos son 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM y 10 pM. El valor IC50 superior más preferido es 2.5 nM, el valor IC5o inferior más preferido es 100 pM.

Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención pueden tener cualquier longitud siempre que aún tengan la capacidad de enlazar a la molécula objetivo. Se reconocerá en la técnica, que son longitudes preferidas de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Normalmente, la longitud es de entre 15 y 120 nucleótidos. Será reconocido por los expertos en la técnica, que cualquier entero entre 15 y 120 es una longitud posible para los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Los rangos más preferidos para la longitud de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, son longitudes de aproximadamente 20 a 100 nucleótidos, de aproximadamente 20 a 80 nucleótidos, de aproximadamente 20 a 60 nucleótidos, de aproximadamente 20 a 50 nucleótidos y de aproximadamente 29 a 450 nucleótidos.

Está dentro de la presente invención que los ácidos nucleicos aquí descritos comprenden una porción que preferentemente es una porción de alto peso molecular y/o que permita preferentemente modificar las características del ácido nucleico en términos, entre otros, de tiempo de residencia en el cuerpo del animal, preferentemente el cuerpo humano. Una modalidad particularmente preferida de dicha modificación es PEGilación y HESilación de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Tal como se usa en la presente invención, PEG permanece para poli(etilenglicol) y HES para almidón de hidroxieilo. La PEGilación, tal como se utiliza preferentemente en la presente invención, es la modificación de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, en donde la modificación consiste en una porción PEG la cual se adhiere a un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. La HESilación, tal como se utiliza preferentemente en la presente invención, es la modificación de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, en donde la modificación consiste en una porción HES, la cual se adhiere a un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Estas modificaciones, así como el proceso para modificar un ácido nucleico utilizando dichas modificaciones, se describe en la Solicitud de Patente Europea EP 1 306 382, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia .

En el caso de que PEG sea la porción de alto peso molecular, el peso molecular es preferentemente de aproximadamente 20,000 hasta aproximadamente 120,000 Da, más preferentemente de aproximadamente 30,000 hasta aproximadamente 80,000 Da y lo más de preferentemente aproximadamente 40,000 Da. En el caso de que HES sea la porción de alto peso molecular, el peso molecular es preferentemente de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 1000 kDa, más preferentemente de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 700 kDa y lo más preferentemente de 200 hasta 500 kDa. HES exhibe una sustitución molar de 0.1 a 1.5, más preferentemente de 1 a 1.5 y exhibe una muestra de sustitución expresada como una proporción de C2/C6 de aproximadamente 0.1 a 15, preferentemente de aproximadamente 3 a 10. Por ejemplo, el proceso de modificación HES se describe en la Solicitud de Patente Alemana DE 1 2004 006 249.8, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

La modificación, en principio, puede realizarse a las moléculas de ácido nucleico de la presente invención en cualquier posición de las mismas. Preferentemente, la modificación se elabora ya sea al nucleótido 5' - terminal, al nucleótido 3' - terminal y/o cualquier nucleótido entre el 5' nucleótido y el 3' nucleótido de la molécula de ácido nucleico.

La modificación y preferentemente la porción PEG y/o HES se pueden adherir a la molécula de ácido nucleico de la presente invención, ya sea directa o indirectamente, preferentemente a través de un enlazador. También está dentro de la presente invención, que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, comprenda una o más modificaciones, preferentemente una o más porciones PEG y/o HES. En una modalidad, la molécula enlazadora individual adhiere más de una porción PEG o porción HES a una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El enlazador utilizado en relación con la presente invención, por si mismo puede ser ya sea lineal o ramificado. Este tipo de enlazadores son conocidos por los expertos en la técnica, y se describen en forma adicional en las Solicitudes de Patente WO2005/074993 y WO2003/035665.

En una modalidad preferida, el enlazador es un enlazador biodegradable. El enlazador biodegradable permite modificar las características del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención entre otros, en términos de tiempo de residencia en el cuerpo de un animal, preferentemente un cuerpo humano, debido a la liberación de la modificación del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El uso del enlazador biodegradable puede permitir un mejor control del tiempo de residencia de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Una modalidad preferida de dicho enlazador biodegradable es un enlazador biodegradable tal como se describe en, pero sin limitarse, a las solicitudes de Patente Internacional WO2006/052790, WO2008/034122, WO2004/092191 y WO2005/099768.

Está dentro de la presente invención que la modificación o grupo de modificaciones sea una modificación biodegradable, en donde una modificación biodegradable puede ser adherida a la molécula de ácido nucleico de la presente invención, ya sea directa o indirectamente, preferentemente a través de un enlazador. La modificación biodegradable permite modificar las características del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en términos, entre otros, de tiempo de residencia en un cuerpo de animal, preferentemente en un cuerpo humano, debido a la liberación o degradación de la modificación del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El uso de una modificación biodegradable puede permitir un mejor control del tiempo de residencia del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Una modalidad preferida de dicha modificación biodegradable es tal como se describe, pero no se restringe a las Solicitudes de Patente Internacional WO2002/065963, WO2003/070823, WO2004/1 13394 y WO2000/41647, preferentemente en WO2000/41647, página 18, líneas 4 a 24.

Además de las modificaciones descritas anteriormente, se pueden utilizar otras modificaciones para modificar las características de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, en donde las otras modificaciones pueden ser seleccionadas de los grupos de proteínas, lípidos tales como colesterol y cadenas de azúcar tales como amilasa, dextrano, etc.

Sin pretender limitarse a teoría alguna, parece que modificando los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención con una porción de alto peso molecular, tal como un polímero y más particularmente uno o diversos de los polímeros aquí descritos, los cuales son preferentemente fisiológicamente aceptables, se cambia la cinética de excreción. Más particularmente, parece que debido al peso molecular incrementado de los ácidos nucleicos de la presente invención modificados, y debido a los ácidos nucleicos de la presente invención que no están sujetos al metabolismo particularmente cuando están en la forma L, se disminuye la excreción de un cuerpo de animal, preferentemente de un cuerpo de mamífero, y más preferentemente de un cuerpo humano. Ya que la excreción normalmente ocurre a través de los ríñones, los inventores de la presente invención asumen que el rango de filtración glomerular de los ácidos nucleicos modificados de esta forma, se reduce en forma significativa en comparación con los ácidos nucleicos que no tienen este tipo de modificación de alto peso molecular, que da como resultado un incremento en el tiempo de residencia en el cuerpo del animal. En relación con esto, es particularmente notable, que a pesar de dicha modificación de alto peso molecular, la especificidad de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención no se ve afectada en una forma perjudicial. Por lo tanto, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención entre otras cosas, tienen la sorprendente característica - la cual normalmente no puede esperarse de compuestos farmacéuticamente activos - de que no se requiera necesariamente una formulación farmacéutica que proporcione liberación sostenida para proporcionar la liberación sostenida de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. En lugar de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención en su forma modificada, que comprenden una porción de alto peso molecular, puede estar lista para ser utilizada como una formulación de liberación sostenida ya que actúan, debido a su modificación, listos como si fueran liberados de una formulación de liberación sostenida. Por lo tanto, la modificación(s) de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, tal como aquí se describe y por lo tanto las moléculas de ácido nucleico modificadas de acuerdo con la presente invención y cualquier composición que comprende las mismas, farmacocinéticas y la biodistribución de las mismas preferentemente controladas, y distintas. Esto también incluye el tipo de residencia en la circulación, y la distribución a los tejidos. Las modificaciones se describen en forma adicional en la Solicitud de Patente WO2003/035665.

Sin embargo, también está dentro de la presente invención, que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención no comprendan cualquier modificación y particularmente ninguna modificación de alto peso molecular, tal como PEGilación o HESilación. La modalidad es particularmente preferida cuando el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, muestra una distribución preferencial para cualquier órgano o tejido objetivo en el cuerpo o cuando se desee un despeje rápido del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención del cuerpo después de la administración. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, tal como aquí se describen con un perfil de distribución preferencial para cualquier órgano o tejido objetivo en el cuerpo, pueden permitir el establecimiento de concentraciones locales efectivas en el tejido objetivo, manteniendo al mismo tiempo baja la concentración sistémica de los ácidos nucleicos. Esto puede permitir el uso de bajas dosis que no son únicamente benéficas desde un punto de vista económico, sino también reducen la exposición innecesaria de otros tejidos al agente de ácido nucleico, reduciendo de esta forma el riesgo potencial de efectos secundarios. El rápido despeje de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención del cuerpo después de la administración puede ser conveniente, entre otros casos, en el caso de generación de imágenes in vivo o requerimientos específicos de dosificación terapéutica utilizando los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención o medicamentos que comprenden los mismos.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, y/o los antagonistas de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar para la generación o fabricación de un medicamento. El medicamento o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, contiene al menos uno de los ácidos nucleicos de la invención seleccionados del grupo de ácidos nucleicos de enlace SDF-1, opcionalmente junto con compuestos farmacéuticamente activos adicionales, en donde el ácido nucleico de la invención actúa preferentemente por sí mismo como un compuesto farmacéuticamente activo. Dichos medicamentos comprenden en modalidades preferidas, al menos un transportador farmacéuticamente aceptable. El transportador puede ser por ejemplo agua, amortiguador, PBS, solución de glucosa, preferentemente una solución equilibrada con sal de glucosa al 5% de almidón, azúcar, gelatina o cualquier otra sustancia transportadora aceptable. Los transportadores son generalmente conocidos para los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica reconocerán que cualquiera modalidades, usos y aspectos de, o relacionados con el medicamento de la presente invención, también son aplicables a la composición farmacéutica de la presente invención y vice versa.

La indicación, enfermedades y trastornos para el tratamiento y/o prevención de los ácidos nucleicos, las composiciones farmacéuticas y medicamentos de acuerdo con, o que se preparan de acuerdo con la presente invención, resultan de la implicación, ya sea directa o indirecta de SDF-1 en el mecanismo patógenético respectivo.

Por supuesto, debido a que los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 de acuerdo con la presente invención interactúan con o enlazan al SDF-1 de humano o múrido, un experto en la técnica comprenderá generalmente que los ácidos nucleicos de enlace de SDF-1 de acuerdo con la presente invención, pueden ser utilizados fácilmente para el tratamiento, prevención y/o un diagnóstico de cualquier enfermedad de humanos y animales tal como aquí se describen. En relación con esto, se reconocerá que las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar para el tratamiento y prevención de cualquiera enfermedades, trastornos o condiciones aquí descritas, sin importar el modo de acción que subyace dicha enfermedad, trastorno y condición.

A continuación se proporciona la racionalización para el uso de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, en relación con diversas enfermedades, trastornos y condiciones, haciendo plausible la aplicabilidad terapéutica, preventiva y de diagnóstico reivindicada de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Con el objeto de evitar cualquier repetición innecesaria, deberá reconocerse que debido a la implicación del eje del receptor SDF-1 - SDF-1, tal como se describe en relación con esto, el eje puede ser dirigido por las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, de modo que se logre el efecto terapéutico, preventivo y de diagnóstico reivindicado. Se deberá reconocer en forma adicional, que las particularidades de las enfermedades, trastornos y condiciones de los pacientes y cualquier detalle en el régimen de tratamiento descrito en relación con esto, puede someterse a modalidades preferidas de la presente solicitud.

Para malignidades hematológicas, en particular, existe evidencia considerable de que las células de leucemia puedan ser protegidas de terapias convencionales (quimioterapia combinada con diversos agentes dirigidos, tales como anticuerpos específicos o inhibidores de cinasa) dentro de los m icroam bientes del tejido en particular, referidos como nichos. Los nichos se encuentran particularmente en la médula ósea en donde pueden albergar células malignas, las cuales posteriormente tienen la capacidad de expandirse y producir una recurrencia después de la terapia inicial (Burger y Kipps, 2002; Burger y Burkle, 2007; Meads et al., 2008; Burger, Ghia et al., 2009). Esta conservación de células malignas durante quimioterapia, se considera en gran parte debido al contacto directo entre las células malignas y las células estromales (Lagneaux, Delforge et al. 1998; Kurtova, Balakrishnan et al., 2009; Damiano, Cress et al., 1999), sin embargo en la complejidad de este microambiente, existen múltiples señales celulares y moleculares que pueden conducir a resistencia de las células malignas a la quimioterapia. A pesar de esta complejidad, queda claro que las células normales producen la quimiocina SDF- , y que las células tanto normales como malignas que expresan CXCR4, emigran hacia y se mantienen en dichos nichos. Por lo tanto esta trayectoria molecular es clave para la interacción lo cual se demuestra a través del hecho de que la inhibición específica de esta interacción, es suficiente para liberar de los nichos células tanto normales como malignas (Broxmeyer, Orschell et al., 2005; Devine, Flomenberg et al., 2004; Azab, Runnels et al., 2009). Además de debilitar la interacción con los nichos, se ha mostrado que numerosas malignidades hematológicas que interrumpen el eje SDF-1-CXCR4, dan como resultado incremento en la vulnerabilidad de las células a otras terapias - llamada "quimiosensibilización". Esta quimiosensibilización ha sido descrita para mieloma múltiple (Azab, Runnels et al., 2009) y diversas leucemias agudas y crónicas (Dillmann, Veldwijk et al., 2009; Lagneaux, Delforge et al. 1998).

Por lo tanto, el uso de ácidos nucleicos de enlace SDF-1 de acuerdo con la presente invención, para interrumpir la interacción entre células malignas y su medio para sensibilizarlas a otras terapias, es una estrategia atractiva para el tratamiento de malignidades hematológicas. Los ejemplos de terapias que pueden ser incrementadas mediante la combinación de ácidos nucleicos de enlace SDF-1 de acuerdo con la presente invención, incluyen pero no se limitan a las siguientes Fludarabina, Ciclofosfamida, Rituxan, Clorambucil, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona, Melfalan, Imatinib o Nilotinib.

La descripción anterior enfatizó el papel de las células estromales de médula ósea y los nichos de médula ósea en la protección de células malignas de los efectos de la quimioterapia u otras terapias dirigidas para malignidades hematológicas. Sin embargo existe evidencia de que ocurren localmente interacciones similares dentro de tumores sólidos, como una gran proporción de células en tumores sólidos que no son células cancerígenas sino más bien células estromales, inmune o vasculares, derivadas del huésped, que interactúan profundamente con células de tumor. Muchos diferentes tipos de tumores sólidos se expresan receptores CXCR4 (Engl, Relja et al, 2006; Muller, Homey et al., 2001 ; Koshiba, Hosotani et al., 2000, Ehtesham, Stevenson, et al., 2008; Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al., 2003; Sauer, Seidler et al., 2005; Su, Zhang et al., 2005) y/o CXCR7 (Burns, Summers et al. 2006; Miao et al., 2007; Wang et al., 2008; Zheng, L¡ et al., 2010) ya sea en forma constitutiva o en respuesta a hipoxia o diversos tratamientos. Las células malignas pueden utilizar esta trayectoria de señalización para la supervivencia y migración mediante la activación de Akt y Erk. SDF-1 se puede producir a través de las propias células malignas o mediante células estromales dentro del tumor. Una vez más en este ambiente complejo, el mecanismo exacto entre cual crecen las células de tumor y se escapan de la quimioterapia u otros métodos terapéuticos, no están claramente definidos. Sin embargo, queda claro que el eje SDF-1 - CXCR4 y el eje SDF-1 - CXCR7, desempeñan un papel importante. Por ejemplo, la inhibición de CXCR4 sensibiliza las líneas de célula de glioma a quimioterapia in vitro (Redjal et al., 2006) y la alta expresión de CXCR4 es predictiva de un resultado deficiente en cáncer de seno (Holm, Abreo et al., 2008; Mizell, Smith et al., 2009) y cánceres gastrointestinales (Schimanski et al., 2008). Por consiguiente, el uso de ácidos nucleicos de enlace SDF-1 de acuerdo con la presente invención para inhibir la acción de SDF-1, ya sea en receptores CXCR4 o CXCR7 en una amplia variedad de tumores sólidos, incrementará la terapia actual haciendo las células más vulnerables a la terapia, ya sea mediante acción directa o mediante el bloqueo de interacciones con otras células en el tumor.

Además de los aspectos anteriores, CXCR4 también lleva señales que se consideran importantes para el reclutamiento y retención de células proangiogénicas y derivadas de médula ósea inmunosupresoras (BMDCs). Esta trayectoria por consiguiente se puede utilizar para angiogénesis independiente de VEGF. Como una consecuencia, el bloqueo del eje SDF1-CXCR4 para sensibilizar tumores a terapia anti-VEGF o radiación, ha surgido como un tratamiento de estrategia atractiva para cánceres sólidos.

Sin embargo, existe un aspecto para el cual el bloque de CXCR4 puede no ser suficiente para bloquear los efectos de SDF-1, el cual también puede enlazar a CXCR7 en cáncer o células estromales. Por ejemplo, se ha reportado recientemente que CXCR7 será expresado en células de tumor cerebral, y transmiten efectos antiapoptóticos y también ha mostrado regular la invasión, angiogénesis y crecimiento de tumor de carcinomas hepatocelulares humanos. En dichos casos, la acción de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 para boquear la acción de SDF-1 tanto en los receptores CXCR7 como CXCR4 en un agente simple, puede proporcionar una eficacia particular en comparación con bloqueadores de receptor específicos.

El medicamento de acuerdo con la presente invención se puede utilizar en combinación con un medicamento adicional o un agente farmacéuticamente activo adicional, en donde el medicamento adicional o el agente farmacéuticamente activo adicional al daño destruye y/o etiqueta (las) células de cáncer. Si la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se utiliza con un medicamento adicional o un agente farmacéuticamente activo adicional, la terapia que está basada en la molécula de ácido nucleico es preferentemente una terapia adjunta a la terapia, haciendo uso de o estando basada en el medicamento adicional o en el agente farmacéuticamente activo adicional. Dicho medicamento adicional o agente farmacéuticamente activo adicional, se selecciona preferentemente pero no se restringe al grupo que comprende: a) anticuerpos tales como Rituximab (objetivo: CD20), Cetuximab (objetivo: receptor de factor de crecimiento epidérmico), Ibritumomab-Tiuxetan (objetivo: CD20), Tositumomab (objetivo: CD20), Trastuzumab (objetivo: HER2/neu), Bevacizumab (objetivo: VEGF), Alemtuzumab (objetivo: CD52); b) agentes de alquilación tales como cisplatina, carboplatina, oxaliplatina , mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, Doxorubicina, Doxorubicina liposomal, bendamustina, Melfalan, temozolomida; c) antimetabolitos tales como purinoazatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina, cladribina; d) plantas alcaloides tales como alcaloides vinca, plantas terpenoides tales como taxanos, preferentemente Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina , epotilona; e) inhibidores de topoisomerasa tales como camptotecinas, irinitecan, mitoxantrona; f) y otros tales como Leucovorina, Metotrexato, Tamoxifen, Sorafenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona, Flurouracil y Prendnisona.

Otros agentes que se pueden utilizar como un agente farmacéuticamente activo adicional en el tratamiento de cáncer, son bien conocidos en la técnica e incluyen pero no se limitan a fármacos inmunosupresores, citocinas y fármacos citoestáticos (para referencia: "Allgemeine und Spezielle Pharmakologie und Toxikologie 2011", editor: Thomas Karow; Pulheim, Alemania). Los agentes bien conocidos en la técnica se utilizan en el tratamiento de cáncer de acuerdo con los estándares de cuidado actuales para la población particular de pacientes con cáncer.

Será reconocido que los agentes farmacéuticamente activos adicionales especificados anteriormente, se pueden utilizar en relación con cualquier aspecto de la presente invención que hace uso del agente farmacéuticamente activo adicional.

El medicamento o agente farmacéuticamente activo adicional, tiene o puede proporcionar la función de una quimioterapia. En forma alternativa o adicional a la quimioterapia, se puede utilizar radioterapia.

El medicamento de acuerdo con la presente invención, en combinación con o sin el medicamento adicional o el agente farmacéuticamente activo adicional, y con o sin radioterapia, se puede utilizar para el tratamiento y/o prevención de cáncer, preferentemente a) cáncer hematológico, en donde más preferentemente el cáncer hematológico se selecciona del grupo de leucemia, y mieloma. b) tumores sólidos, en donde más tumores sólidos son seleccionados del grupo de glioblastoma, cáncer colorectal, cáncer de seno, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer renal y cáncer ovariano.

Preferentemente el cáncer de seno se selecciona del grupo de cáncer de seno negativo-H ER2 avanzado.

Preferentemente la leucemia se selecciona del grupo de leucemia de linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.

Preferentemente el mieloma se selecciona del grupo de mieloma múltiple.

El medicamento preferido adicional o el agente farmacéuticamente activo adicional para el tratamiento de Glioblastoma es radioterapia o quimioterapia con temozolomida o terapia con bevacizumab. El medicamento adicional o el agente farmacéuticamente activo adicional preferidos para el tratamiento de cáncer colorectal se selecciona del grupo que comprende fluorouracil, Leucovorin, Oxaliplatin, Irinotecan y bevacizumab.

El medicamento adicional o el agente farmacéuticamente activo adicional preferido para el tratamiento de cáncer de seno negati vo-H ER2 avanzado se selecciona del grupo de Doxorubicin, -Paclitaxel, Docetaxel,- etotrexato, Fluorouracil, -Bevacizumab, Tamoxifen, e inhibidores de aromatasa.

El medicamento adicional o un agente farmacéuticamente activo adicional preferido para el tratamiento de leucemia linfoide crónica, se selecciona del grupo que comprende fludarabina, ciclofosfamida, rituximab, clorambucil, alemtuzumab, vincristina, pentostati na , mitoxantrona, doxorubicina , cladribina, y bendamustina.

El medicamento adicional o el agente farmacéuticamente activo adicional preferidos para el tratamiento de mieloma múltiple, se selecciona del grupo que comprende Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona, Melfalan, Ciclofosfamida, doxorubicina liposomal, y prednisona.

En una modalidad del medicamento de la presente invención, el medicamento es para utilizarse en combinación con otros tratamientos para cualquier enfermedad aquí descrita, particularmente para las cuales se utilizará el medicamento de la presente invención.

La "terapia de combinación" (o "coterapia") incluye la administración de un medicamento de la presente invención y al menos un segundo agente o agente adicional como parte de un régimen de tratamiento específico proyectado para proporcionar el efecto benéfico de la coacción de estos agentes terapéuticos, es decir, el medicamento de la presente invención y el segundo agente o agente adicional. El efecto benéfico de la combinación incluye, pero no se limita a, coacción farmacocinética o farmacodinámica que resulta de la combinación de agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación, realmente se lleva a cabo en un período de tiempo definido (normalmente, minutos, horas, días o semanas dependiendo de la combinación seleccionada).

La "terapia de combinación" puede, pero generalmente no está proyectada para comprender la administración de dos o más de estos agentes terapéuticos como parte de regímenes de monoterapia separados. La "terapia de combinación" pretende abarcar la administración de estos agentes terapéuticos en una forma secuencial, esto es, en donde cada agente terapéutico se administra en un diferente momento, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos en una forma sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea puede lograrse, por ejemplo, mediante la administración a un sujeto de una cápsula simple que tiene una proporción fija de cada agente terapéutico o en cápsulas simples, múltiples para cada uno de los agentes terapéuticos.

La administración en secuencias o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico se puede llevar a cabo a través de cualquier ruta adecuada, incluyendo pero sin limitarse a rutas tópicas, rutas orales, rutas intravenosas, rutas intramusculares, y absorción directa a través de los tejidos de membrana mucosa. Los agentes terapéuticos se pueden administrar a través de la misma ruta o mediante diferentes rutas, por ejemplo, el primer agente terapéutico de la combinación seleccionada se puede administrar mediante inyección, en tanto que los otros agentes terapéuticos de la combinación se pueden administrar en la forma tópica.

Como alternativa, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos se pueden administrar en forma tópica o todos los agentes terapéuticos se pueden administrar mediante inyección. La secuencia en la cual se administran los agentes terapéuticos, no es muy importante a menos que se indique lo contrario. La "terapia de combinación" también puede abarcar la administración de los agentes terapéuticos tal como se describió anteriormente en combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos. Cuando la terapia de combinación comprende además un tratamiento sin fármaco, el tratamiento sin fármaco puede llevarse a cabo en cualquier momento adecuado siempre que se logre el efecto benéfico de la coacción de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento sin fármacos. Por ejemplo, en casos adecuados, el efecto benéfico aún se logra cuando el tratamiento sin fármaco se elimina temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, posiblemente por días o incluso semanas.

Tal como se describe en términos generales anteriormente, el medicamento de acuerdo con la presente invención puede administrarse en principio, o en cualquier forma conocida para los expertos en la técnica. Una ruta de administración preferida es administración sistémica, más preferentemente administración parenteral, preferentemente mediante inyección. Como alternativa, el medicamento se puede administrar en forma local. Otras rutas de administración comprenden intramuscular, intraperitoneal, y subcutánea, per orum, intranasal, intratraqueal o pulmonar, dando preferencia a la ruta de administración que es la menos invasiva, asegurando al mismo tiempo la eficacia.

La administración parenteral generalmente se utiliza para inyección e infusión subcutánea, intramuscular o intravenosa. Además, un método para administración parenteral emplea el implante de sistemas de liberación lenta, o liberación sostenida, lo cual asegura que se mantenga un nivel de dosificación constante, que son bien conocidos para los expertos en la técnica.

Además, se pueden administrar medicamentos preferidos de la presente invención en forma intranasal, mediante uso tópico o de vehículos intranasales, adecuados, inhalantes o mediante rutas transdérmicas, utilizando unas formas de parches de piel transdérmica, conocidas por los expertos en la técnica. Para administrarse en la forma de un sistema de suministro transdérmico, por supuesto la administración de la dosificación será continua, en lugar de intermitente a lo largo todo el régimen de dosificación. Otras preparaciones tópicas preferidas incluyen cremas, ungüentos, lociones, rocíos de aerosol y geles.

Los sujetos que responderán favorablemente al método de la presente invención, incluyen sujetos de medicina y veterinarios generalmente incluyendo seres humanos y pacientes humanos. Entre otros sujetos para los cuales son útiles los métodos y medios de la presente invención, son gatos, perros, animales grandes, aves tales como pollos y similares.

El medicamento de la presente invención comprenderá generalmente una cantidad efectiva del componente(s) activo de la terapia, incluyendo pero sin limitarse a, una molécula de ácido nucleico de la presente invención, disuelta o dispersa en un medio farmacéuticamente aceptable. El medio o transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos, y antifúngicos, agentes isotónicos o de retraso de absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activos es bien conocido en la técnica. Los ingredientes activos suplementarios pueden incorporarse en el medicamento de la presente invención.

En un aspecto adicional, la presente invención está relacionada con una composición farmacéutica. La composición farmacéutica comprende al menos uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, y preferentemente un enlazador farmacéuticamente aceptable. El enlazador puede ser cualquier enlazador utilizado y/o conocido en la técnica. Más particularmente, el enlazador en cualquier enlazador tal como se describió con relación a la fabricación del medicamento aquí descrito. En una modalidad adicional, la composición farmacéutica comprende un agente farmacéuticamente activo adicional.

La preparación de un medicamento y la composición farmacéutica serán conocidos por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Normalmente, las composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en líquidos antes de la inyección, como tabletas u otros sólidos para administración oral; como cápsulas de liberación con el tiempo; o en cualquier otra forma actualmente utilizada, incluyendo gotas para los ojos, cremas, lociones, ungüentos, inhalantes y similares. También puede ser particularmente útil el uso de formulaciones estériles, tal como lavados a base de solución salina, por parte de cirujanos, físicos y trabajadores para el cuidado de la salud para tratar un área en particular en el campo de la operación. Las composiciones también se pueden suministrar mediante microdispositivos, micropartículas o esponjas.

Al momento de la formulación, se administró un medicamento en una forma compatible con la formulación de la dosificación, y en una cantidad tal que sea farmacológicamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tal como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármacos y similares.

El medicamento de la presente invención también se puede administrar en formas de dosificación oral como tabletas o cápsulas, polvos, gránulos, elíxires, tinciones, suspensiones, jarabes y emulsiones de liberación programada y liberación sostenida. Los supositorios se preparan en forma conveniente a partir de emulsiones o suspensiones grasas.

La composición farmacéutica o el medicamento pueden ser esterilizados y/o contener adyuvantes, tal como agentes de conservación, estabilización, humectación o emulsificación, promotores de solución, sales para regular la presión osmótica y/o amortiguadores. Además, también puede contener otras sustancias terapéuticamente valiosas. Las composiciones se preparan de acuerdo con métodos de mezclado, granulación o recubrimiento convencionales, y normalmente contienen de aproximadamente 0.1% a 75%, preferentemente de aproximadamente 1% a 50%, del ingrediente activo.

Las composiciones líquidas, particularmente inyectables por ejemplo, pueden ser preparadas mediante disolución, dispersión, etc. El compuesto activo se disuelve o se mezcla con un solvente farmacéuticamente puro, tal como por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar de esta manera la solución o suspensión inyectable. Además, se pueden formular formas sólidas adecuadas para disolución en líquido antes de la inyección.

Los medicamentos y las moléculas de ácido nucleico, respectivamente, de la presente invención también pueden administrarse en la forma de sistemas de suministro de liposomas, tal como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamilares grandes y vesículas multilamelares. Los liposomas se pueden formar de una variedad de fosfol ípidos, que contienen colesterol, esterarilamina o fosfatidilcolinas. En algunas modalidades, se hidrata una película de componentes lípidos con una solución acuosa de fármacos para una forma de capa de lípido que encapsula el fármaco, lo cual es bien conocido para los expertos en la técnica. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico aquí descritas pueden ser proporcionadas como un complejo con un compuesto lipofílico o un compuesto no inmunogénico de alto peso molecular construido utilizando los métodos conocidos en la técnica. Además, los liposomas pueden contener las moléculas de ácido nucleico en su superficie para dirigir y llevar agentes citotóxicos en forma interna, para transmitir la aniquilación celular. Un ejemplo de complejos asociados con ácido nucleico se proporciona en la Patente Norteamericana No. 6,011,020.

Los medicamentos y moléculas de ácido nucleico, respectivamente, de la presente invención también se pueden acoplar con polímero solubles como transportadores de fármaco dirigibles. Los polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de piran, polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, polihidroxietilaspanamidafenol, o polietileneoxidepolilisina sustituido con residuos de palmitoilo. Además, los medicamentos y moléculas de ácido nucleico, respectivamente, de la presente invención se pueden acoplar a una clase de polímeros biodegradables útiles para lograr la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, caprolactona de poliepsilon, ácido polihidroxi butírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloque de hidrogeles reticulados o amfipáticos.

Si se desea, la composición farmacéutica y el medicamento, respectivamente, que serán administrados también pueden contener cantidades mínimas menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes de humectación o emulsificación, agentes de amortiguación de pH, y otras sustancias tales como por ejemplo, acetato de sodio y oleato de trietanolamina.

El régimen de dosificación que utiliza las moléculas de ácido nucleico y los medicamentos, respectivamente, de la presente invención, se seleccionan de acuerdo con una variedad de factores que incluyen el tipo, especie, edad, peso, sexo y condición médica del paciente; la severidad de la condición que será tratada, la ruta de administración; la función renal y hepática del paciente y el aptámero particular o sal de la misma empleado. Un médico o veterinario experto en la técnica, podrá determinar prescribir fácilmente la cantidad efectiva del fármaco requerida para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la condición.

Los niveles en plasma objetivos del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención fluctúan preferentemente de 500 fM a 200 µ?, preferentemente de 1 nM a 20 µ?, más preferentemente de 5 nM a 20 µ?, lo más preferentemente 50 nM a 20 µ? en el tratamiento de cualquier enfermedad aquí descrita .

Las moléculas de ácido nucleico y los medicamentos, respectivamente, de la presente invención pueden ser administrados preferentemente en una dosificación diaria simple, cada segundo o tercer día, en forma semanal, cada dos semanas, en una dosis mensual simple o cada tres meses.

Esta dentro de la presente invención, que el medicamento tal como aquí se describe constituya la composición farmacéutica aquí descrita.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un método para el tratamiento de un sujeto quien está en necesidad del tratamiento, en donde el método comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente activo de al menos uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. En una modalidad el sujeto padece de una enfermedad o está en riesgo de desarrollar la enfermedad, en donde la enfermedad es cualquiera de las aquí descritas, particularmente cualquiera de las enfermedades descritas en relación con el uso de cualesquiera ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención para la fabricación de un medicamento.

Tal como se utiliza preferentemente en la presente invención, el término tratamiento comprende en una modalidad preferida, en forma adicional o alternativa la prevención y/o seguimiento.

Tal como se utiliza preferentemente en la presente invención, los términos enfermedad y padecimiento deben ser utilizados en una forma intercambiable, si no se indica lo contrario.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término comprende, no está proyectado preferentemente para limitar el asunto o materia seguido o descrito por dicho término. Sin embargo, en una modalidad alternativa, el término comprende, deberá quedar entendido dentro del significado de que contiene y por lo tanto limita el asunto o materia seguido o descrito por dicho término.

Las diversas SEQ ID NOs:, la naturaleza química de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y las moléculas objetivo SDF-1 tal como aquí se utilizan, la secuencia real de las mismas y el número de referencia interno se resume en la siguiente tabla. Se ha observado que los ácidos nucleicos fueron caracterizados en el aptámero, es decir, el nivel de ácido nucleico-D (D-ARN) con el D-SDF-1 humano biotinilado (SEQ ID NO: 4) o en el nivel de Spiegelmer, es decir, ácido nucleico-L (L-ARN) con la configuración natural de SDF-1, el L-SDF-1 (SDF-1a humano, SEQ ID NO: 1). Los diferentes ácidos nucleicos comparten un nombre de referencia interno, pero una SEQ ID Nos: para la molécula de D-ARN (Aptámero) y una SEQ ID Nos: para la molécula de L-ARN (Spiegelmer), respectivamente.

OI en oí TABLA 1 en o en en OI CJI oí en en en N> en o en en OI oí oí en en en en en en en en OI OI OI (Si O Oí OI a? o en OI OI OI OI en o> en en OI 01 Oí en en en Breve Descripción de las Figuras La presente invención se ilustra en forma adicional a través de las figuras, ejemplos y el listado de secuencias de los cual se pueden tomar características, modalidades y ventajas adicionales, en donde La figura 1, muestra una alineación de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del "tipo A".

Las figuras 2A, 2B muestran derivados de la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 192-A10-001 (moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del "tipo A"); La figura 3, muestra una alineación de secuencias de las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del "tipo B"; Las figuras 4A, 4B, muestran derivados de las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 193-C2-001 y 193-G2-001 (moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo B); La figura 5, muestra una alineación de secuencias de las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del "tipo C"; La figura 6, muestra derivados de la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 190-A3-001 (moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del "tipo C"); Las figuras 7A, 7B, muestran derivados de las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 190-D5-001 (moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del "tipo C"); La figura 8, muestra derivados de la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 197-B2 (molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del "tipo C"); La figura 9, muestra las moléculas de las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 adicionales que, además de las otras moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1, también son referidas como moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del "tipo D"; La figura 10, muestra la eficacia de los Espiegélmeros de enlace SDF-1 193-G2-012-5'-PEG (también referidos como NOX-A12), 197-B2-006-5'-PEG, 191 -D5-007-5'-PEG y 191-A10-008-5'-PEG en un ensayo de quimiotaxis con la línea de célula de leucemia de célula T humana Jurkat, en donde se permita a las células migrar hacia SDF-1 humano 0.3 nM incubado previamente a una temperatura de 37°C con diversas cantidades de Espiegélmeros 193-G2-012-5'-PEG, 197-B2-006-5'-PEG, 191-D5-007-5'-PEG y 191 -A10-008-5'-PEG, representados como el porcentaje de control con respecto a la concentración de Espiegélmeros 193-G2-012-5'-PEG, 197-B2-006-5'-PEG, 191-D5-007-5'-PEG y 191 -A10-008-5'-PEG ; La figura 11A, muestra la eficiencia del Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 en un ensayo de quimiotaxis con la línea de célula ALL pre-B humana Nalm-6, en donde se permite a las células migrar hacia SDF-1 humano 0.3 nM incubado previamente a una temperatura de 37°C con diversas cantidades de Espiegélmero NOX-A12, representado como el porcentaje de control con respecto a la concentración de Espiegélmero NOX-A12; La figura 11B, muestra la eficacia del Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 en un ensayo de quimiotaxis con la línea de célula de linfoma de monocito leucémico humano U937, en donde se permite a las células migrar hacia SDF-1 humano 3 nM incubado previamente a una temperatura de 37°C con diversas cantidades de Espiegélmero NOX-A12, representado como el porcentaje de control con respecto a la concentración de Espiegélmero NOX-A12; La figura 12, muestra la eficacia del Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 en un ensayo de quimiotaxis con la línea de célula de leucemia de célula pre-B humana BV-173, en donde se permite a las células migrar hacia SDF-1 humano 3 nM incubado previamente a una temperatura de 37°C con diversas cantidades de Espiegélmero NOX-A12, representado como el porcentaje de control con respecto a la concentración de Espiegélmero NOX-A12; La figura 13, muestra la eficacia del Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 en un ensayo de complementación con células CHO se expresan en forma estable CXCR7 y arrestina-ß, ambas fusionadas a un fragmento de ß-galactosidasa, en donde CXCR7 de las células se activaron hacia SDF-1 humano 10 nM incubado previamente a una temperatura de 37°C con diversas cantidades de Espiegélmero NOX-A12 representado como el porcentaje de control sobre la concentración de Espiegélmero NOX-A12; La figura 14, muestra la inhibición del brote inducido por SDF-1 mediante el Espiegélmero de enlace SDF-1 193-G2-012-5'-PEG humano (también referido como NOX-A12) y mediante el Espiegélmero de Control PEGilado en ensayo de brote de anillo aórtico, en donde los anillos de aorta de ratas, se incrustaron en matriz de colágeno y se incubaron durante 6 días con SDF-1 con y sin Espiegélmeros (a: control; b: 10 nM SDF-1; c: 10 nM SDF-1 + 1 µ? de Espiegélmero de enlace SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG; d: 10 nM SDF-1 + 1 µ? de Espiegélmero de Control PEGilado); La figura 15, muestra la inhibición del brote inducido por SDF-1 mediante el Espiegélmero de enlace SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG (también referido como NOX-A12) y mediante el Espiegélmero de Control PEGilado en un ensayo de brote de anillo aórtico, en donde el brote indica, tal como se muestra al promedio +/- SD de 5 anillos por condición (*: el valor de SDF-1 es significativamente diferente del control (prueba Mann-Whitney-; p= 0.009); **: el valor para SDF-1 + el Espiegélmero de enlace SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG es significativamente diferente al de SDF-1 (prueba Mann-Whitney; p= 0.028) La figura 16, muestra la eficacia del Espiegélmero de enlace SDF-1 humano NOX-A12 para sensibilizar células RPMI-8226 MM a F-ara-A (Fludarabina), en donde se incubaron células MS-5 estromales BM de múrido confluentes que segregan SDF-1, con el Espiegélmero de enlace SDF-1 humano NOX-A12 o el revNOX-A12 no funcional y subsecuentemente se cultivaron junto con células RPMI-8226 M; las células se trataron con 1 µ? F-ara-A durante 40 horas, y se midió la viabilidad celular mediante Citometría de Flujo utilizando el Reactivo ViaCount; las barras de Error indican SD, N = 5, * p = 0.0134, *** p = 0.0003 (prueba t, de doble diseño); La figura 17, muestra la eficacia del Espiegélmero de enlace SDF-1 humano NOX-A12 para inhibir la proliferación de células Jurkat en cultivo junto con células MS-5 estromales, en donde las células MS-5 estromales de múrido que segregan SDF-1, se incubaron con concentraciones en incremento del Espiegélmero de enlace SDF-1 humano NOX-A12; las células Jurkat se agregaron a la capa de célula MS-5 confluente, y se midieron los conteos celulares después de 40 horas mediante Citometría de Flujo utilizando el Reactivo ViaCount. Las barras de error indican SD, N = 4, *** p = 0.0008 (prueba t, de doble diseño); Las figuras 18A, 18B, muestran la eficacia del Espiegélmero de enlace SDF-1 humano NOX-A12 para la adhesión dependiente de la dosis SDF-1 inversa de células Jurkat a fibronectina, en donde las células Jurkat se incubaron con SDF-1 solo (A), con SDF-1 y concentraciones en incremento de Espiegélmero de enlace SDF-1 humano NOX-A12 o con SDF- 1, y concentraciones en incremento del Espiegélmero de control revNOX-A12 (B) durante 30 minutos y se sembraron en placas recubiertas con fibronectina durante 15 minutos; las células se lavaron subsecuentemente con medio, y las células adheridas se cuantificaron utilizando el Reactivo Cell Titer Glo; las barras de error indican SD.

Ejemplo 1: Ácidos nucleicos que enlazan SDF-1 humano A continuación los términos "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se utilizan en la presente invención en una forma sinónima, si no se indica lo contrario. Además, los términos "extensión" y "extensión de nucleótido" se utilizan en la presente invención en una forma sinónima, si no se indica lo contrario.

Las moléculas de ácido nucleico-L que enlazan a SDF-1 humano y las secuencias de nucleótido respectivas se ilustran en las figuras 1 a 9. Los ácidos nucleicos se caracterizaron en el aptámero, es decir, el nivel de ácido nucleico-D utilizando Análisis vomculantes competitivos o de captación directa con ?-SDF-1 humano biotinilado (protocolo, ver Ejemplo 3). Los espiegélmeros se probaron con la configuración natural de SDF-1 (D-SDF-1) mediante la medida de resonancia de plasmón de superficie utilizando un instrumento Biacore 2000 (protocolo, ver Ejemplo 5) y un ensayo de quimiotaxis de cultivo celular (protocolo, ver Ejemplo 4).

Las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 exhiben tres diferentes motivos de secuencia, se definen tres tipos principales en las figuras 1, 2A y 2B (Tipo A), figuras 3, 4A y 4B (Tipo B), figuras 5, 4, 7A, 7B y 8 (Tipo C). Las moléculas de ácido nucleico exhiben diferentes motivos de secuencia. Para la definición de los motivos de secuencia de nucíeótidos, se utilizan las abreviaturas de IUPAC para nucíeótidos antiguos. s fuerte GoC; w débil Ao U; R purina Go A; Y pirimidina Co U; K ceto GoU; M ¡mino AoC; B sin A Co UoG; D sin C AoGoU; H sin G AoCoU; V sin U Ao C o G N todos AoGoCoU Si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de ácido nucleico y secuencia de extensiones y cuadros, respectivamente, se indica en la dirección 5' -> 3'.

Moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo A Tal como se ilustra en la figura 1, todas las secuencias de las moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo A comprende una extensión central de nucíeótidos, que está flanqueada por la primera extensión (5'-) terminal y la segunda extensión (3'-) terminal de nucíeótidos (también referida como la primera extensión terminal de nucíeótidos y la segunda extensión de nucleótidos), en donde ambas extensiones pueden hibridar entre sí. Sin embargo, la hibridación no es proporcionada necesariamente en la molécula.

En los siguientes términos, las "moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo A" y los "ácidos nucleicos de enlace SDF-1 tipo A" o moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo A, se utilizan en la presente invención en una forma sinónima, si no se indica lo contrario.

Las secuencias de los cuadros y extensiones de nucleótidos definidos, pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 del tipo A, que tienen influencia en la afinidad de enlace para SDF-1. Con base en el análisis de enlace de los diferentes ácidos nucleicos de enlace SDF-1 resumidos como ácidos nucleicos de enlace SDF-1 tipo A, la extensión central de nucleótidos y sus secuencias de nucleótidos, tal como se describe a continuación, son esenciales de manera individual y más preferentemente en su totalidad, para el enlace a SDF-1.

La extensión central de nucleótidos de todas las secuencias identificadas de ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo A, comparten la secuencia AAAGYRACAHGUMAAXAUGAAAGGUARC| (Fórmula 1 Tipo A, SEQ ID NO: 74), en donde XA está ya sea ausente o es '?'. Si 'A' está ausente, la secuencia de la secuencia de nucleótido central puede ser resumida como Fórmula 2 Tipo A AAAG YRACAHGUMAA-UGAAAGGU ARCj SEQ ID NO: 75. ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo A 191-A6 (secuencia nucleótido central: kAAGU AACACGU AAAAUGAAAGGU AAC SEQ ID NO: 54) que lleva el nucleótido adicional 'A' dentro de la secuencia de nucleótido central, y que aún enlaza a SDF-1, permite concluir una secuencia de nucleótido central alternativa |AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC|, Fórmula 3 Tipo A, SEQ ID NO: 76). A manera de Ejemplo para todos los otros ácidos nucleicos de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 tipo A, el ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo A 192-A10-001 fue caracterizado por su afinidad de enlace a SDF-1 humano. Se determinó la constante de enlace de equilibrio KD utilizando el análsis vinculante de captación (KD = 1.5 nM) y mediante la medida de resonancia de plasmón de superficie (KD = 1.0 nM). La IC50 (concentración inhibidora al 50%) de 0.12 nM para 192-A10-001, se midió utilizando un ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro. En síntesis, todos los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo A tal como se ilustran en la figura 1, se analizaron en un análsis vinculante de captación competitivo versus 192-A10-001. Los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo A 192-B11 y 192-C10, mostraron afinidades de enlace iguales a 192-A10-001 en estos experimentos de competición. Se determinó la afinidad de enlace más débil para los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo A 192-G10, 192-F10, 192-C9, 192-E10, 192-D11, 192-G11, 192-H11 y 191-A6. Los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo A 192-D10, 192-E9 y 192-H9, tienen afinidad de enlace mucho más débil que 192-A10-001.

Tal como se mencionó anteriormente, el ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo A 192-B11 y 192-C10 exhibe afinidad de enlace igual a SDF-1 como 192-A10-001. Sin embargo, muestran ligeras diferencias en la secuencia de nucleótido de la extensión central de nucleotidos. Por consiguiente, la secuencia de consenso de las tres moléculas que enlazan a [AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARCl, casi con la misma alta afinidad, se pueden resumir mediante la secuencia de nucleotidos (Fórmula-4 Tipo A, SEQ ID NO: 77)) en donde la secuencia de nucleótido de la extensión central de nucleotidos de 192-A10-001 (secuencia de nucleótido: [AAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCl, SEQ ID NO: 84) representa la secuencia de nucleótido con la mejor afinidad de enlace de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo A.

Cinco o seis de los seis nucleotidos de la extensión 5'-terminal (también referida como la primera extensión terminal) de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo A, pueden hibridar a los cinco o seis nucleotidos respectivos de los seis nucleotidos de la extensión 3'-terminal (también referida como la segunda extensión terminal) para formar una hélice terminal. Aunque estos nucleotidos son variables en algunas posiciones, los nucleotidos diferentes permiten la hibridación de cinco o seis de los seis nucleotidos de cada una de las extensiones 5'- y 3'-terminal. Las extensiones 5'-terminal y 3'-terminal de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo A, tal como se muestra en la figura 1, se pueden resumir en una fórmula genérica para la extensión 5'-terminal ('RSHRYR', Fórmula-5-5' Tipo A) y para la extensión 3'-terminal ('YRYDSY' , Fórmula-5-3' Tipo A). Los derivados truncados del ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo A 192-A10-001, se analizaron en un análsis vinculante de captación competitivo versus la molécula original 192-A10-001 y 192-?1?-008 (figura 2A y 2B). Estos experimentos mostraron que se puede realizar una reducción de los seis nucleótidos terminales (extremo 5': GCUGUG; extremo 3': CGCAGC) de 192-A10-001 a cinco nucleótidos (extremo 5': CUGUG; extremo 3': CGCAG) del derivado 192-A10-002, sin la reducción de la afinidad de enlace. Sin embargo, el truncado para los cuatro nucleótidos terminales (extremo 5': UGUG; extremo 3': CGCA; 192-A10-003) o menos ( 92-A10-004/-005/-006/-007), conduce a una afinidad de enlace reducida para SDF-1 (figura 2A). Las extensiones 5'-terminal y 3'-terminal determinadas con una longitud de cinco y cuatro nucleótidos de los derivados del ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo A 192-A10-001, tal como se muestra en las figuras 2A y 2B, se pueden describir en una fórmula genérica para la extensión 5'-terminal ('X2BBBS', Fórmula-6-5' Tipo A) y la extensión 3'-terminal ('SBBVXa'; Fórmula-6-3' Tipo A), en donde X2 está ya sea ausente o es 'S\ y X3 está ya sea ausente o es 'S'.

La secuencia de nucleótido de las extensiones 5'- y 3'-terminal tiene influencia en la afinidad de enlace de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo A. Esto no únicamente se muestra a través de los ácidos nucleicos 192-F10 y 192-E10, si no también mediante los derivados de 192-A10-001 (figura 2B). La extensión central de 192-F10 y 192-E10, es idéntica a 192-B11 y 192-C10, aunque comprenden ligeras diferencias en el extremo-3' de la extensión 5'-terminal y el extremo-5' de la extensión 3'-terminal, dando como resultado una afinidad de enlace reducida.

La sustitución de los nucleótidos 5'- y 3'-terminal 'CUGUG* y 'CGCAG' del ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo A 192-A10-002 por 'GCGCG' y 'CGCGC (192-A10-015), dio como resultado una afinidad de enlace reducida, mientras que las sustituciones por 'GCGUG' y 'CGCGC' ( 192-A10-008) dio como resultado la misma afinidad de enlace tal como se muestra para 192-A10-002 (figura 2B). Además, se probaron nueve derivados del ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo A 192-A10-001 (192-A10-0 4/-015/-016/-017/-018/-019/-020/-021/-022/-023) que contiene cuatro nucleótidos 5'- y 3'-terminal respectivamente, en la forma de aptámeros para su afinidad de enlace versus 192-A10-001 o su derivado 192-A10-008 (ambos tienen afinidad de enlace idéntica a SDF-1). Todas las moléculas mostraron afinidad de enlace más débil, muy débil o mucho más débil para SDF-1 en comparación con 192-A10-001 (seis nucleótidos que forman una hélice terminal) o 192-A10-008 con cinco nucleótidos terminales, respectivamente (figura 2B). En consecuencia, la secuencia y número de nucleótidos de las extensiones 5'- y 3'-terminal, son esenciales para un enlace efectivo a SDF-1. Tal como se muestra para los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo A 192-A10-002 y 192-A10-08, la combinación preferida de extensiones 5'- y 3'-terminal es 'CUGUG' y 'CGCAG' (extensiones 5'- y 3'-terminal del ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo A 192-A10-002) y 'GCGUG' y 'CGCGC (extensiones 5'- y 3'-terminal del ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo A 192-A10-008).

Sin embargo, al combinar las extensiones 5'- y 3'-terminal de todos los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo A probados, la fórmula genérica para la extensión 5'-terminal de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo A es 'X1X2NNBV' (Fórmula-7-5' Tipo A) y la fórmula genérica para la extensión 3'-terminal de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo A es '?????3?4' (Fórmula-7-3' Tipo A), en donde es 'R' o está ausente, X2 es 'S\ X3 es 'S' y X4 es ?' o está ausente; o Xi está ausente, X2 es 'S' o está ausente, X3 es 'S' o está ausente y X4 está ausente.

Con el objeto de prolongar el tiempo de residencia en plasma in vivo del Espiegélmero, el Espiegélmero 192-A10-008 se acopló en forma covalente a una porción de polietilenglicol (PEG) 40 kDa en el extremo 5' tal como se describe en el capítulo 2. La porción PEG no tiene influencia en la potencia de los Espiegélmeros para inhibir la quimiotaxis inducida por SDF-1.

Moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo B Tal como se ilustra en la figura 3, todas las secuencias de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 del tipo B, comprenden una extensión central de nucleótidos, que está flanqueada por las extensiones 5'- y 3'-terminal (también referidas como la primera y segunda extensión terminal de nucleótidos) que pueden hibridar entre sí. Sin embargo, la hibridación no es proporcionada necesariamente en la molécula.

En los términos que se encuentran a continuación, las "moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo B" y los "ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo B" o las "moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 de Tipo B" se utilizan en la presente invención en una forma sinónima, si no se indica lo contrario.

Las secuencias de los cuadros y extensiones definidas, pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 que tienen influencia en la afinidad de enlace para SDF-1. Con base en el análisis de enlace de diferentes ácidos nucleicos de enlace SDF-1, la extensión central de nucleótidos y sus secuencias de nucleótido, tal como se describen a continuación, son esenciales en forma individual, y más preferentemente en su totalidad, para el enlace a SDF-1.

La extensión central de nucleótidos de todas las secuencias identificadas de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 193-C2-001, 193-G2-001, 193-F2-001, 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002, 193-D3-002, 193-B3-002, 193-H3-002, 193-E3-002 y 193-D1-002, comparten la secuencia [GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG |( Fórmula- 1 Tipo B, SEQ ID NO: 52). Los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 193-G2-001, 193-C2-001 y 193-F2-001 que difieren en una posición de la extensión central de nucleótidos (secuencia de consenso de la extensión central de nucleótidos: GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGGl (Fórmula-2 Tipo B, SEQ ID NO: 53), se analizaron en un análsis vinculante de captación competitivo versus el ácido nucleico de enlace SDF-1192-A10-001 (KD de 1.5 nM determinado en un análsis vinculante de captación, IC50 de 0.12 nM). Cada uno de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 193-G2-001, 193-C2-001 y 193-F2, mostraron enlace superior a SDF-1 humano, en comparación con el ácido nucleico de enlace SDF-1 192-A10-001, en donde la afinidad de enlace de 193-G2-001 es tan buena como la de 193-C2-001 y 193-F2-001 (figura 3). Los datos sugieren que la diferencia en la secuencia de nucleótido de la extensión central de nucleótidos de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 193-G2-001, 193-C2-001 y 193-F2-001, no tiene influencia en la afinidad de enlace a SDF-1. Los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002, 193-D3-002, 193-B3-002, 193-H3-002, 193-E3-002 y 193-D1-002, mostraron enlace reducido a SDF-1 humano en comparación con el ácido nucleico de enlace SDF-1 193-G2-001. El ácido nucleico de enlace SDF-1 193-G2-001 fue caracterizado por su afinidad de enlace a SDF-1 humano. Se determinó la constante de enlace de equilibrio KD utilizando el ensayo de enlace (KD = 0.3 nM). La IC50 (concentración de inhibición al 50%) de 0.08 nM para 193-G2-001, se midió utilizando el ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro.

Cuatro, cinco o seis nucleótidos de los seis nucleótidos de la extensión 5'-terminal de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1, pueden hibridar a los respectivos cuatro, cinco o seis de los seis nucleótidos de la extensión 3'-terminal de ácidos nucleicos de enlace SDF-1 para formar una hélice.

Aunque los nucleótidos son variables en diversas posiciones, los diferentes nucleótidos permiten la hibridación para cuatro, cinco o seis nucleótidos de los seis nucleótidos de cada una de las extensiones 5'- y 3'-terminal. Las extensiones 5'-terminal y 3'-terminal de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1, tal como se muestra en la figura 3, se pueden resumir en una fórmula genérica para la extensión 5'-terminal ('X1X2GCRWG' en donde X, es '?' o está ausente, X2 es 'G') y de la extensión 3'-terminal ('KRYSCX3X4', en donde X3 es 'G', X4 es 'U1 o está ausente). Los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 193-GI-002, 193-D2-002, 193-A1-002 y 193-D3-002 tienen afinidades de enlace más débiles para SDF-1, aunque comparten la extensión central idéntica de nucleótidos con 193-C2-001, 193-G2-001 y 193-F2-001 (figura 3). Las propiedades de enlace no favorables de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002 y 193-D3-002 pueden ser debido al número de nucleótidos y la secuencia de las extensiones 5'- y 3'-terminal.

Los derivados truncados de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 193-G2-001 y 193-C2-001, se analizaron en un análsis vinculante de captación competitivo versus 193-G2-001 y 193-G2-012, respectivamente (figura 4A y 4B). Estos experimentos mostraron que una reducción de los seis nucleótidos terminales (extremo 5': AGCGUG; extremo 3': UACGCU) de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1193-G2-001 y 193-C2-001 para cinco nucleótidos (extremo 5': GCGUG; extremo 3': UACGC) conduce a moléculas con afinidad de enlace similar (193-C2-002 y 193-G2-012). La constante de disociación de equilibrio KD se determinó utilizando el análsis vinculante de captación (KD = 0.3 nM). Un truncado de cuatro (extremo 5': CGUG; extremo 3': UACG; 193-C2-003) o menos nucleótidos (193-C2-004, 193-C2-005, 193-C2-006, 193-C2-007) dio como resultado una afinidad de enlace reducida para SDF-1, la cual se midió utilizando el análsis vinculante de captación competitivo (figura 4A). La secuencia de nucleótido de los cinco nucleótidos terminal en el extremo 5'- y 3'-, respectivamente, tiene influencia en la afinidad de enlace de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1. La sustitución de los nucleótidos 5'- y 3'-terminal 'GCGUG' y 'UACGC (193-C2-002, 193-G2-12) por 'GCGCG' y 'CGCGC ( 193-G2-013), dio como resultado una afinidad de enlace reducida. Además, se probaron los cuatro diferentes derivados del ácido nucleico de enlace SDF-1 193-G2-001 con una hélice terminal con una longitud de cuatro nucleótidos de emparejamiento base (193-G2-014/-015/-016/-017). Todos mostraron afinidad de enlace reducida para SDF-1 (figura 4B). Por consiguiente, la secuencia y la longitud de los nucleótidos 5'- y 3'-terminal, son esenciales para un enlace efectivo a SDF-1. Las extensiones 5'-terminal y 3'-terminal con una longitud de cinco y cuatro nucleótidos de los derivados de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 193-C2-003 y 193-G2-012 tal como se muestra en las figuras 4A y 4B, se pueden describir en una fórmula genérica para la extensión 5'-terminal ('XiXaSSBS'), en donde X está ausente, X2 está ya sea ausente o es 'G', y de la extensión 3'-terminal ('BVSSX3X4'), y en donde X3 está ya sea ausente o es 'C y X4 está ausente. Tal como se muestra para los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 193-G2-001 y 193-C2-01, y sus derivados 193-G2-012 y 193-C2-002, la combinación preferida de extensiones 5'- y 3'-term¡nal es 'XiX2GCGUG' (extensión 5'-terminal) y 'UACGCX3X4' (extensión 3'-terminal), en donde Xi es ya sea 'A' o está ausente, X2 es 'G' y X3 es 'C y '?4 es 'IT o está ausente.

Sin embargo, al combinar las extensiones 5'- y 3'-terminal de los cuatro ácidos nucleicos de enlace SDF-1 probados, la fórmula genérica para la extensión 5'-terminal de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 es 'X)X2SV S', y la fórmula genérica para la extensión 3'-terminal de ácidos nucleicos de enlace SDF-1 es 'BVBSX3X4\ en donde XT es 'A' o está ausente, X2 es 'G\ X3 es 'C y X4 es 'U' o está ausente; o Xi está ausente, X2 es 'G' o está ausente, X3 es 'C o está ausente y X4 está ausente.

Con el objeto de prolongar el tiempo de residencia en plasma del Espiegélmero in vivo, los Espiegélmeros 193-G2-012 se acoplaron covalentemente a una porción de polietilenglicol (PEG) de 40 kDa en el extremo 5'- tal como se describe en el capitulo 2 (molécula de ácido nucleico-PEGilada: 193-G2-012-5'-PEG también referida como NOX-A12). El Espiegélmero PEGilado NOX-A12, se analizó en un cultivo celular en un ensayo de quimiotaxis in vitro y se determinó la inhibición de quimiotaxis inducida mediante SDF-1 (IC50 de 0.2 nM). El Espiegélmero PEGilado NOX-A12 fue analizado a través de una medida Biacore y se determinó una constante de enlace (KD) de 0.2 nM.

Moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo C Tal como se ilustra en la figura 12, todas las secuencias de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 del tipo C, comprenden una extensión central de nucleótidos, que está flanqueada por extensiones 5'- y 3'-terminal (también referidas como una primera extensión terminal y una segunda extensión terminal de nucleótidos) que pueden hibridar entre sí. Sin embargo, dicha hibridación no es proporcionada necesariamente en la molécula.

A continuación, los términos "moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo C" y "ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo C" o "moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo C" se utilizan en la presente invención en una forma sinónima, si no se indica lo contrario.

Las secuencias de los cuadros y extensiones definidas, pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 del Tipo C, que tienen influencia en la afinidad de enlace para SDF-1. Con base en el análisis de enlace de diferentes ácidos nucleicos de enlace SDF-1 resumidos como ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo C, la extensión central de nucleótidos y su secuencia de nucleótido tal como se describe a continuación, son esenciales ya sea en forma individual y más preferentemente en su totalidad para el enlace a SDF-1.

La extensión central de nucleótidos de todas las secuencias identificadas de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo C, comparten la secuencia |GGUYAGGGCUHRXAAGUCGG| (Fórmula-1 Tipo C, SEQ ID NO: 108), en donde XA está ya sea ausente o es ?'. Con excepción del ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo C 197-D1, la extensión central de nucleótidos de todas las secuencias identificadas de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo C, comparten la secuencia de nucleótido |GGUYAGGGCUHRAAGUCGG[ (Fórmula-2 Tipo C, SEQ ID NO: 109). Ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo C 197-D1 (extensión central de nucleótidos: |GGUUAGGGCUAA-AGUCGG| (SEQ ID NO: 56) faltando un nucleótido 'A' dentro de la extensión central de nucleótidos, y aún enlazando a SDF-1, permite concluir la extensión central alternativa de nucleótidos ([GGUYAGGGCUHR [A G U C G G I, Fórmula-3 Tipo C, SEQ ID NO: 110). Inicialmente, todos los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo C, tal como se ilustra en la figura 5, se analizaron en un análsis vinculante de captación competitivo versus el ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo A 192-A10-001 (KD = 1.5 nM determinada mediante análisis de captación y mediante medidas de resonancia de plasmón de enlace; IC50 = 0.12 nM). Los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo C 191-D5-001, 197-B2, 190-A3-001, 197-H1, 197-H3 y 197-E3, mostraron afinidades de enlace más débiles que 192-A10-001 en los experimentos de competición. Se determinó la afinidad de enlace mucho más débil para 191-A5, 197-B1, 197-D1, 197-H2 y 197-D2 (figura 5). Las moléculas o derivados de los mismos, se caracterizaron en forma adicional mediante análsis vinculante de captación competitivos adicionales, medidas de resonancia de plasmón y ensayo de quimiotaxis in vitro. El ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo C 191-D5-001, estuvo caracterizado por su afinidad de enlace a SDF-1 humano, mientras que se determinó la constante de enlace de equilibrio KD mediante la medida de resonancia de plasmón de superficie (KD = 0.8 nM). La IC50 (concentración de inhibición al 50%) de 0.2 nM para 191-D5-001, se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro. La afinidad de enlace del ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo C 197-B2 para SDF-1 humano, se determinó mediante la medida de resonancia de plasmón de superficie (KD = 0.9 nM), su IC50 (concentración de inhibición al 50%) de 0.2 nM se analizó en un ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro. Estos datos indican que los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo C 191-D5-001 y 197-B2, tienen afinidad de enlace similar a SDF-1 (figura 5 y 8).

El ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo C 190-A3-001, comprende una extensión 5'-terminal de 17 nucleótidos ('CGUGCGCUUGAGAUAGG', SEQ ID NO: 220) y una extensión 3'-terminal de 12 nucleótidos ('CUGAUUCUCACG', SEQ ID NO: 221), en donde, por un lado los cuatro nucleótidos en el extremo 5'- de la extensión 5'-terminal, y los cuatro nucleótidos en el extremo 3'- de la extensión 3'-terminal, pueden hibridar entre sí para formar una hélice terminal. Como alternativa, los nucleótidos 'UGAGA' en la extensión 5'-terminal pueden hibridar a los nucleótidos "UCUCA" en la extensión 3'-terminal para formar una hélice terminal. Una reducción a nueve nucleotidos de la extensión 5'-terminal ('UGAGAUAGG') y a diez fCUGAUUCUCA*, SEQ ID NO: 222) nucleotidos de la extensión 3'-terminal ('CUGAUUCUC') de la molécula 190-A3-001, no tiene influencia en la afinidad de enlace para SDF-1 (190-A3-003; figura 13). Una reducción a ocho nucleotidos de la extensión 5'-terminal ('GAGAUAGG') y a nueve nucleotidos de la extensión 3'-terminal ('CUGAUUCUC') de la molécula 190-A3-001, no tiene influencia en la afinidad de enlace a SDF-1 (190-A3-004; figura 6). La constante de enlace de equilibrio KlJ de 190-A3-004, fue determinada utilizando el análsis vinculante de captación (KD = 4.6 nM) y mediante la medida de resonancia de plasmón de superficie (KD = 4.7 nM). La IC50 (concentración de inhibición al 50%) de 0.1 nM para 190-A3-004, se midió utilizando el ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro. Sin embargo, el truncado para los dos nucleotidos en la extensión 5'-terminal, conduce a una reducción muy fuerte de afinidad de enlace (190-A3-007; figura 6).

Los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo C 191-D5-001, 197-B2 y 197-H1 (extensión central de nucleotidos: [GGUUAGGGCUAGAAGUCGGl, SEQ ID 57, 197-H3/191 -A5 (extensión central de nucleotidos: |GGUUAGGGCUCGAAGUCGG SEQ ID NO: 58 y 197-E3/197-B1 (extensión central nucleotidos: |GGUUAGGGCUUGAAGUCGG[, SEQ ID NO: 59, comparten una extensión central de nucleotidos casi idéntica (formula-4 Tipo C; secuencia de nucleótido: GGUUAGGGCUHGAAGUCGl SEQ ID NO: 111). 191-D5-001, 197- B2 y 197-H1 no comparten una extensión 5'- y 3'-terminal similar (197-H3 y 197-E3 tienen una extensión 5'- y 3'-terminal idéntica en 197-B2). Sin embargo, los respectivos diez (197-B2, 197-E3, 197-H3) o nueve de los diez (191-D5-001, 197-H1) nucleótidos de la extensión 5'-terminal, pueden hibridar para los respectivos diez (197-B2, 197-E3, 197-H3) o nueve de los diez (191-D5-001, 197-H1) nucleótidos de la extensión 3'-terminal (figura 5). Por lo tanto, la extensión 5'-terminal de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 y 197-H3, tal como se mencionó anteriormente más 191-A5, 197-B1, 197-H2, 197-D1 y 197-D2, comprenden una secuencia de nucleótido genérica común de 'RKSBUSNVGR' (Fórmula-5-5' Tipo C, SEQ ID NO: 138). La extensión 3'-terminal de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 y 197-H3 tal como se mencionó anteriormente más 191-A5, 197-B1, 197-H2, 197-D1 y 197-D2, comprenden una secuencia de nucleótidos genérica común de 'YYNRCASSMY' (Fórmula-5-3' Tipo C, SEQ ID NO: 139), en donde las extensiones 5' y 3'-terminal de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 y 197-H3, son las preferidas. Estas extensiones 5'- y 3'-terminal preferidas de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 y 197-H3, se pueden resumir en la fórmula genérica 'RKSBUGSVGR' (Fórmula-6-5' Tipo C; la extensión 5'-terminal, SEQ ID NO: 140) y 'YCNRCASSMY' (Fórmula-6-3' Tipo C; extensión 3'-terminal, SEQ ID NO: 141).

Los derivados truncados del ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo C 191-D5-001, se construyeron y probaron en un análsis vinculante de captación competitivo versus la molécula original 191-D5-001 (figura 7A, figura 7B). Primero, la longitud de las extensiones 5'- y 3'-terminal se acortaron de los diez nucleotidos ( 91 -D5-00 ), cada uno es siete nucleotidos cada uno (191-D5-004) tal como se ilustra en la figura 14A, en donde nueve de los diez (191-D5-001) o seis de los siete nucleotidos (191-D5-004) de la extensión 5'-terminal y la extensión 3'-terminal, respectivamente, pueden hibridar entre sí. La reducción a siete nucleotidos de la extensión 5'- y 3'-terminal respectivamente (en donde seis de los siete nucleotidos pueden hibridar entre sí) conduce a una afinidad de enlace reducida para SDF-1 (191 -D5-004). Las extensiones terminales del ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo C 191-D5-004, se modificaron, mediante lo cual el nucleótido ?' no emparejado dentro de la extensión 3'-terminal de 191-D5-004, se sustituyó por una 'C (191 -D5-005). Esta modificación conduce a una mejoría de enlace. Este derivado, el ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo C 191-D5-005, mostró enlace similar a SDF-1 igual que 191-D5-001. El truncado adicional de la extensión 5'- y 3'-terminal para cinco nucleotidos respectivamente, conducen a una molécula con una longitud total de 29 nucleótidos (191 -D5-007). Debido a las similitudes de 191-D5-001 y de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 191-A5, 197-H3, 197-B1, 197-E3, 197-D1, 197-H2 y 197-D2, y debido a los datos mostrados para 191-D5-007, se asume que la extensión 5'- y 3'-terminal en principio puede ser truncada debajo de cinco nucleótidos, en donde la secuencia de nucleótidos 'CGGGA' de la extensión 5'-terminal y 'UCCCG' de la extensión 3'-terminal, se probó con éxito (ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo C 191-D5-007). El ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo C 191-D5-007, enlaza en forma sorprendentemente un poco mejor a SDF-1 que 191-D5-001 (determinado en el nivel de apt mero utilizando el ensayo de enlace de competición). La constante de enlace de equilibrio KD de 191-D5-007, se determinó utilizando el análsis vinculante de captación (KD = 2.2 nM) y la medida de resonancia de plasmón de superficie (KD = 0.8 nM). La IC50 (concentración de inhibición al 50%) de 0.1 nM para 191-D5-007, se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis de cultivo celular in vitro. El truncado adicional de ambas extensiones terminales fue para cuatro nucleótidos (191-D5-010, figura 7A).

Los derivados adicionales del ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo C 191-D5-001 ( 191 -D5-017/-024/-029 ) que contiene extensiones 5'- y 3'-terminal respectivamente de los cuatro nucleótidos, también mostraron afinidad de enlace reducida para SDF-1 en el análsis vinculante de captación de competición versus 191-D5-007 (figura 7B). Como alternativa, las extensiones 5'- y 3'-terminal con una longitud respectivamente de los cinco nucleótidos se probaron en forma adicional, también (191 -D5-017-29a, 191 -D5-017-29b, 191-D5-019-29a, 191 -D5-024-29a, 191 -D5-024-29b). La fórmula genérica de estos derivados para la extensión 5'-terminal es 'XsSSSV (Fórmula-7-5' Tipo C) y para la extensión 3'- es de 'BSSSXs' Fórmula-7-3' Tipo C), en donde Xs está ausente o es S'. Dos de las cinco variantes probadas mostraron afinidad de enlace idéntica SDF-1 como 191-D5-007 ( 191 -D5-024-29a , 191-D5-024-29b; figura 7B). Las secuencias de las extensiones 5'-terminal y 3'-terminal de los derivados 191-D5-001- que muestran la mejor afinidad de enlace para SDF-1 y comprenden una extensión 5'-terminal y 3'-extensión de cinco nucleótidos respectivamente (191-D5-007, 191 -D5-024-29a , 191-D5-024-29b) se puede resumir en una fórmula genérica (extensión 5'-terminal: 'SGGSR', Fórmula-8-5' Tipo C; extensión 3'-terminal: YSCCS', Fórmula-8-3' Tipo C).

Los derivados truncados del ácido nucleico de enlace SDF-1 Tipo C 197-B2, se analizaron en un análsis vinculante de captación competitivo versus la molécula original 197-B2 y 191-D5-007 (figura 7). Utilizando el análsis vinculante de captación competitivo versus 191-D5-007, se mostró que 197-B2 tiene la misma afinidad de enlace para SDF-1 que 191-D5-007. Las extensiones 5'- y 3'-terminal se acortaron sin pérdida de afinidad de enlace de los diez nucleótidos (197-B2) a cinco nucleótidos cada uno (197-B2-005), en donde los nucleótidos de la extensión 5'-terminal y la extensión 3'-terminal pueden hibridar completamente entre sí. Si la extensión 5'-terminal ('GCGGG') y 3'-terminal ('CCUGC') de 197-B2-005 fue sustituida por 'GCCG6' (extensión 5'-terminal) y por XCGGC (extensión 3'-terminal) de 197-B2-006, la afinidad de enlace para SDF- persistió completamente. Debido a que 197-B2 y 191-D5-001 (y sus derivados) comparten una secuencia de nucleótidos del centro idéntica y a que se probaron varios derivados de 191-D5 con extensiones 5'- y 3'-terminal con una longitud respectivamente de cuatro nucleótidos, se omitió un truncado adicional de la extensión 5'- y 3'-terminal. Se diseñaron dos derivados adicionales que comprenden seis nucleótidos en el extremo 5'- y 3'- (extensiones 5'- y 3'-terminal) respectivamente. La afinidad de enlace para SDF-1 o ambas moléculas ( 197-B2-006-31 a y 197-B2-006-31 b) es la misma a la mostrada para 191-D5-007 y 197-B2-006 (figura 15). Las secuencias de las extensiones 5'-terminal y 3'-terminal de los derivados 197-B2, que muestran la mejor afinidad de enlace para SDF-1, y comprenden la extensión 5'-terminal y 3'-terminal de cinco nucleótidos respectivamente, se pueden resumir en una fórmula genérica (extensión 5'-terminal: 'GCSGG', Fórmula-9-5' Tipo C; extensión 3'-terminal:, CCKGC, Fórmula-9-3' Tipo C).

Al combinar la extensiones 5'- y 3'- preferidas de los derivados truncados de los ácidos nucleicos de enlace SDF-1 Tipo C 191-D5-001 (extensión 5'-terminal: 'SGGSR', Fórmula-8-5' Tipo C; extensión 3'-terminal: , YSCCS', Fórmula-8-3' Tipo C) y 197-B2 (extensión 5'-terminal: 'GCSGG', Fórmula-9-5' Tipo C; extensión 3'-terminal: , CCKGC, Fórmula-9-3' Tipo C) la fórmula genérica preferida común para la extensión 5'-terminal y 3'-terminal es 'SSSSR' (extensión 5'-terminal, Fórmula-10-5" Tipo C) y 'YSBSS' (extensión 3'-terminal: Fórmula-10-3' Tipo C).

Con el objeto de prolongar el tiempo de residencia en plasma in vivo del Espiegélmero, los Espiegélmeros 197-B2-006 y 191-D5-007 se acoplaron en forma covalente a una porción de polietilenglicol (PEG) de 40 kDa en sus extremos 5'-, tal como se describe en el capítulo 2. Los Espiegélmeros PEGilados 197-B2-006 y 191-D5-007, fueron analizados en un cultivo celular en una quimiotaxis in vitro. La porción PEG, no tiene influencia en la potencia que tienen los Espiegélmeros para inhibir la quimiotaxis inducida por SDF-1.

Moléculas de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo D Además, se identificaron tres ácidos nucleicos de enlace SDF-1 adicionales que no comparten los motivos de enlace SDF-1 de "Tipo A", "Tipo B" y "Tipo C", y son referidos en la presente invención como "tipo D". Se analizaron como aptámeros utilizando el análsis vinculante de captación (figura 9).

Quedará entendido que cualesquiera de las secuencias mostradas en las figuras 1 a 9, son moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, incluyendo las formas truncadas de las mismas, aunque también incluyendo las formas extendidas de las mismas, sin embargo, con la producción de que las moléculas de ácido nucleico truncadas y extendidas, respectivamente, aún tienen la capacidad de enlazar al objetivo .

Ejemplo 2: Síntesis y derivación de Aptámeros y Espiegélmeros SÍNTESIS DE ESCALA PEQUEÑA Se produjeron Aptámeros y Espiegélmeros mediante síntesis de fase sólida con un sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), utilizando química de fosforoamidita de ARN 2'TBDMS (Damha y Ogilvie, 1993). Las fosforoamiditas-rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)- y rU- en la configuración D- y L-, se compraron en ChemGenes, Wilmington, MA. Los aptámeros y Espiegélmeros se purificaron mediante electroforesis de gel.

SÍNTESIS A GRAN ESCALA MÁS MODIFICACIÓN Los Espiegélmeros se produjeron medíante síntesis de fase sólida con un sintetizador ÁktaPilot OO (Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Freiburg), utilizando química de fosforoamidita de ARN 2'TBDMS (Damha y Ogilvie, 1993). Se compraron fosforoamiditas-L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L- rG(N-ibu)- y L-rU- en ChemGenes (Wilmington, MA, USA). Se compró el modificador 5'-amino en American International Chemicals Inc. (Framingham, MA, USA). La síntesis de los Espiegélmeros inició en L-riboG; L-riboC, L-riboA, L-riboU, respectivamente, con tamaño de poro CPG modificado 1000 A (Link Technology, Glasgow, UK). Para acoplamiento (15 minutos por ciclo), se utilizó 0.3 M benciltiotetrazol (American International Chemicals Inc., Framingham, MA, USA) en acetonitrilo, y 3.5 equivalentes de la solución de 0.2 M fosforamidita respectiva en acetonitrilo. Se utilizó un ciclo de tapado con sello mediante oxidación. Se compraron solventes y reactivos estándar adicionales para la síntesis de oligonucleótido en Biosolve (Valkenswaard, NL). Los Espiegélmeros se sintetizaron DMT-ON; después de la desprotección, se purificaron mediante RP-HPLC de preparación (Wincott F. et al, 1995) utilizando un medio Sourcel5RPC (Amersham). El grupo 5'DMT fue eliminado con ácido acético al 80% (90 minutos en RT). En forma subsecuente, se agregó la solución acuosa NaOAc 2 M y al Espiegélmero se le extrajo la sal mediante filtración de flujo tangencial utilizando una membrana de celulosa regenerada 5 K (Millipore, Bedford, MA). PEGILACIÓN Con el objeto de prolongar el tiempo de residencia en plasma in vivo del Espiegélmero, los Espiegélmeros se acoplaron en forma covalente a una porción de polietilenglicol (PEG) de 40 kDa en el extremo 5'-.

Para PEGilación (para detalles técnicos del método de PEGilación consultar la Solicitud de Patente Europea EP 1 306 382), se disolvieron los Espiegélmeros modificados con 5'-amino purificados en una mezcla de H20 (2.5 mi), DMF (5 mi), y amortiguador A (5 mi; preparada mezclando ácido cítrico · H20 [7 g], ácido bórico [3.54 g], ácido fosfórico [2.26 mi], y 1 M NaOH [343 mi] y agregando agua a un volumen final de 11; el pH = 8.4 se ajustó con 1 M HCI).

El pH de la solución de Espiegélmero se llevó a 8.4 con 1 M NaOH. Posteriormente, se agregó éster PEG-NHS de 40 kDa (JenKem Technology USA Inc., Alien, TX) a una temperatura de 37°C cada 30 minutos en seis porciones de 0.25 equivalentes hasta que se alcanzó un rendimiento máximo de 75 a 85%. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo en 8 a 8.5 con 1 M NaOH durante la adición del éster PEG-NHS.

La mezcla de reacción se combinó con 4 mi de solución de urea (8 M), y 4 mi de amortiguador B (0.1 M de acetato de trietilamonio en H20) y se calentó a una temperatura de 95°C durante 15 minutos. Posteriormente el Espiegélmero PEGilado se purificó mediante RP-HPLC con un medio Source15RPC (Amersham), utilizando un gradiente de acetonitrilo (amortiguador B; amortiguador C: 0.1 M de acetato de trietilamonio en acetonitrilo). El exceso de PEG diluido en amortiguador C al 5%, Espiegélmero PEGilado en amortiguador C al 10 a 15%. Las fracciones del producto con una pureza del >95% (tal como se evalúa mediante HPLC) se combinaron y mezclaron con 40 mi de 3 M NaOAC. Al Espiegélmero PEGilado se le extrajo la sal mediante filtración del flujo tangencial (5 K de membrana de celulosa regenerada, M i 11 i p o re , Bedford MA). Ejemplo 3: Determinación de constantes de enlace (análsis vinculante de captación) Análsis vinculante de captación directo Se midió la afinidad de los aptámeros a D-SDF-1 humano biotinilado en un formado de análsis vinculante de captación a una temperatura de 37°C. Los aptámeros fueron etiquetados con 5'-fosfato mediante cinasa de polín ucleótido T4 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) utilizando ATP etiquetado-[y-3 P] (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemania). La radioactividad específica de los aptámeros etiquetados fue de 200,000 a 800,000 cpm/pmol. Los aptámeros se incubaron después de la des y renaturalización en una concentración de 10, 20, 30 o 40 pM a una temperatura de 37°C en amortiguador de enlace (20 mM Tris-HCI pH 7.4; 137 mM NaCI; 5 mM KCI; 1 mM gCI2; 1 mM CaCI2; 0.1% [p/vol] Tween-20) junto con cantidades diversas de D-SDF-1 humano biotinilado durante 4 a 12 horas con el objeto de alcanzar el equilibrio en bajas concentraciones. El amortiguador de selección se suplemento con 10 g/ml de albúmina de suero humana (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania), y 10 pg/ml de ARN de levadura (Ambion, Austin, USA), con el objeto de evitar la absorción de partes de enlace con superficies de utensilios de plástico usados o la matriz de inmovilización. El rango de concentración del D-SDF-1 humano biotinilado, se ajustó de 8 pM a 100 nM; el volumen de reacción total fue de 1 mi. El péptido y los complejos de péptido-aptámero fueron inmovilizados en 1.5 µ? de partículas de Estreptavidina Ultralink Plus (Pierce Biotech nology, Rockford, USA), que habían sido equilibradas previamente con amortiguador de selección y resuspendidas en un volumen total de 6 µ?. Las partículas se mantuvieron en suspensión durante 30 minutos a la temperatura respectiva en un termomezclador. Se cuantificó la radiactividad inmovilizada en un contador de centelleo después de separar el sobrenadante y después del lavado adecuado. El porcentaje de enlace se trazó contra la concentración de D-SDF-1 humano biotinilado y se obtuvieron constantes de disociación utilizando algoritmos de software (GRAFIT; Erithacus Software; Surrey U.K.) asumiendo una estequiometría de 1:1.

Análsis vinculante de captación competitivo Con el objeto de comparar diferentes aptámeros de enlace D-SDF-1, se llevó a cabo un ensayo de clasificación competitivo. Para este propósito, se etiquetó en forma radioactiva la mayor parte del aptámero a fin disponible (ver anteriormente) y sirvió como referencia. Después de la des y renaturalización, se incubó a una temperatura de 37°C con D- SDF-1 humano biotinilado en 1 mi de amortiguador de selección en condiciones que dieron como resultado del 5 al 10% de enlace al péptido después de la inmovilización y el lavado en agarosa NeutrAvidin o Streptavidin Ultralink Plus (ambos de Pierce) sin competición. Se agregó un exceso de variantes de aptámero de U-ARN no etiquetadas des y renaturalizadas a diferentes concentraciones (por ejemplo 2, 10 y 50 nM) con el aptámero de referencia etiquetado para reacciones de enlace paralelas. Los aptámeros que serán probados compitieron con el aptámero de referencia para enlace objetivo, disminuyendo de esta forma la señal de enlace que depende de sus características de enlace. El aptámero que se encontró como más activo en este ensayo, posteriormente puede servir como una nueva referencia para el análisis comparativo de las variantes de aptámero adicionales.

Ejemplo 4: Análisis de Ensayo mediante Medida de Resonancia de Plasmón de Superficie Se utilizó el instrumento Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) para analizar el enlace de Espiegélmeros a SDF-1a humano. Cuando se logró el acoplamiento de SDF-1a humano a través de grupos amina, el SDF-1 a humano se dializó contra agua durante 1 a 2 horas (Millipore VSWP esteres de celulosa mezclados; tamaño de poro 0.025 µ?) para eliminar aminas de interferencia. Se activaron chips de sensor CM4 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) antes del acoplamiento de proteína mediante una inyección de 35-µ? de una dilución 1:1 de 0.4 M NHS y 0.1 M EDC en un flujo de 5 µ?/min. Posteriormente se inyectó MCP-1 humano o SDF-1a humano en concentraciones de 0.1 a 1.5 pg/ml en un flujo de 2 µ?/min hasta que la respuesta del instrumento estuvo dentro del rango de 1000 a 2000 RU (unidades relativas). Se desactivaron ésteres NHS no reactivados mediante inyección de 35 µ? de una solución de clorhidrato de etanolamina (pH 8.5) en un flujo de 5 µ?/min. El chip del sensor se imprimó dos veces con amortiguador de enlace y se equilibró en 10 µ?/min durante 1 a 2 horas, hasta que la línea de base pareció estable. Para todas las proteínas, se evaluaron los parámetros cinéticos y las constantes de disociación a través de una serie de inyecciones de Espiegélmero en concentraciones de 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 y 0 nM en amortiguador de selección (Tris-HCI, 20 mM; NaCI, 137 mM; Cl, 5 mM; CaCI2, 1 mM; MgCI2, 1 mM; Tween20, 0.1% [p/v]; pH 7.4). En todos los experimentos, el análisis se llevó a cabo a una temperatura de 37°C utilizando el comando Kinject que define un tiempo de asociación de 180 y un tiempo de disociación de 360 en un flujo de 10 µ?/min. El análisis de datos y el cálculo de las constantes de disociación (KD), se llevó a cabo con el software Bl Aevaluation 3.0 (BIACORE AB, Uppsala, Suecia) utilizando el algoritmo de ajuste estequiométrico 1:1.

Ejemplo 5: Análisis de la inhibición de la quimiotaxis inducida mediante SDF-1 a través de Espiegélmeros de enlace SDF-1 La línea de célula de leucemia de célula T humana Jurkat, la línea de célula de linfoma de monocito leucémico humano U937, la línea de célula de leucemia de célula pre-B humana BV- 73 y la línea de célula ALL pre-B humana Nalm-6, expresan CXCR4. Aunque las células Jurkat no expresan CXCR7, las líneas de leucemia BV-173 y U-937 probaron positivo para la expresión de CXCR7. Todas las células utilizadas fueron obtenidas en DSMZ (Braunschweig). Todas las líneas celulares se cultivaron a una temperatura de 37°C y 5% C02 en un medio RPMI 1640 con Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) que contiene suero de bovino fetal al 10%, 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Un día antes del experimento, las células fueron sembradas en un nuevo frasco T175 con una densidad de 0.3 x 106/ml (Jurkat, U937, BV-173) o 0,75 x 106/ml (Nalm-6), respectivamente.

Para el experimento, las células fueron centrifugadas (5 minutos en 300 g), resuspendidas, contadas y lavadas una vez con 15 mi de HBH (solución de sal equilibrada de Hanks que contiene 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino y 20 mM de HEPES; Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Posteriormente las células se volvieron a suspender en 1.33 x 106/ml (Jurkat, U937, BV-173) o 2.67 x 106/ml (Nalm-6), respectivamente. Posteriormente las células se dejaron migrar a través de las membranas porosas de las placas del filtro durante tres horas hacia una solución que contiene SDF-1 y diversas cantidades de Espiegélmero. Las soluciones de estimulación (SDF-1 + diversas concentraciones de Espiegélmero) se elaboraron como soluciones 10X en una placa de 96 tubos de bajo perfil de 0.2 mi. Se pipetearon 212 µ? de HBH en los compartimentos inferiores de la placa de transporte y se agregaron 23,5 µ? de las soluciones de estímulo. Todas las condiciones se elaboraron como triplicados. Después de 20 a 30 minutos, la placa del filtro se insertó en la placa que contiene las soluciones de estimulación y 75 µ? de una suspensión celular con 1.33 x 106/ml o 2.67 x 106/ml, respectivamente, fueron agregadas a los depósitos de la placa del filtro (1 x 105 o 2 x 105 células/depósito). Posteriormente las células se dejaron migrar durante 3 horas a una temperatura de 37"C. Para calibración, se agregaron 0, 10 y 30 µ? de la suspensión celular a 235, 225 y 205 µ? de HBH, respectivamente, en depósitos de una placa de 96 depósitos separados. Después de 3 horas de incubación, la placa de inserto se eliminó y se agregaron 30 µ? de solución de trabajo de resazurina (440 µ? en PBS) a los depósitos inferiores y a los depósitos de la placa de calibración. Posteriormente las placas se incubaron a una temperatura de 37°C durante 2.5 horas. Después de la incubación, se transfirieron 100 µ? de cada depósito a una placa color negro de 96 depósitos.

Para evaluación, se corrigieron los valores de fluorescencia para fluorescencia del fondo (sin células en el depósito). Posteriormente, la diferencia entre las condiciones experimentales con o sin SDF-1 fue calculada. El valor para la muestra sin Espiegélmero (SDF-1 únicamente) se ajustó al 100% y los valores para las muestras con Espiegélmero se calcularon como un porcentaje de esto. Para una curva de dosis-respuesta, los valores por ciento fueron trazados contra la concentración de Espiegélmero, y se determinó en forma gráfica a partir de la curva resultante el valor IC5o (concentración de Espiegélmero en donde está presente el 50% de la actividad sin Espiegélmero).

Resu Itados Se descubrió que SDF-1 humano estimula la migración de las células Jurkat en una forma dependiente de la dosis, con un estímulo máximo medio de aproximadamente 0.3 nM.

Se descubrió que SDF-1 humano estimula la migración de células de la línea de célula de linfoma de monocito leucémico humano U937 en una forma dependiente de la dosis, con el estímulo máximo medio en aproximadamente 3 nM.

Se descubrió que SDF-1 humano estimula la migración de células de la línea de célula de leucemia de célula pre-B humana BV-173 en una forma dependiente de la dosis, con el estímulo máximo medio en aproximadamente 3 nM.

Se descubrió que SDF-1 humano estimula la migración de las células de la línea de célula ALL pre-B humana Nalm-6 en una forma dependiente de la dosis, con el estímulo máximo medio en aproximadamente 0.3 nM.

Cuando se permitió que las células migraran hacia una solución que contiene SDF-1 humano más concentraciones en incremento de Espiegélmeros de enlace SDF-1, se observó inhibición dependiente de la dosis. Las IC50s respectivas de los Espiegélmeros probados tal como se especifica en el Ejemplo 1, se determinaron en las células Jurkat de la línea de célula de leucemia de célula T humana. Por ejemplo, para el Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 (también referido como 193-G2-012-5'-PEG) se determinó una IC50 de 0.2 nM (figura 10). Cuando se utilizó un Espiegélmero de Control no específico en lugar de Espiegélmeros de enlace SDF-1, no se observó un efecto inhibidor hasta 1 µ?.

La inhibición de la quimiotaxis inducida mediante SDF-1 mediante el Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12, también se observó en tres diferentes tipos de célula de leucemia: la línea de célula de linfoma de monocito leucémico humano U937 (figura 11B), la línea de célula de leucemia de célula pre-B humana BV-173 (figura 12) y la línea de célula ALL pre-B humana Nalm-6 (figura 11A). Además, tenemos evidencia de que las células de leucemia linfocítica crónica primaría migran hacia el SDF-1 y que la miotaxis dependiente de SDF-1 es bloqueada efectivamente a través de NOX-A12.

Las líneas de leucemia BV-173 y U-937 probaron positivo también para la expresión de CXCR7. La potencia del Espiegélmero de enlace-SDF NOX-A12 para bloquear la interacción de SDF-1 y CXCR7, se determinó tal como se muestra en el Ejemplo 6.

Ejemplo 6: Inhibición de activación CXCR7 mediante Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 Además de CXCR4, SDF-1 también enlaza al receptor de quimiocina CXCR7. El potencial de inhibición del Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 hacia CXCR7, se probó en un ensayo de complementacion con células CHO que expresan en forma estable CXCR7 y ß-arrestina, ambas fusionadas a un fragmento de ß-galactosidasa (PathHunterTM - ensayo de ß-arrestina, DiscoveRX, CA, USA). Al momento del enlace SDF-1, la ß-arrestina se combinó con CXCR7 y de esta forma condujo a una complementacion y activación de la ß-galactosidasa la cual se midió con un substrato de quimioluminiscencia.

Método Se revistieron células ß-arrestina CXCR7 humanas CHO-K1 PathHunter eXpress durante 48 horas en un medio OCC2, y se estimularon con 10 nM de SDF-1 y diversas concentraciones del Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 durante 90 minutos. Después del estímulo, se detectó la señal utilizando el equipo de Detección PathHUnter y el protocolo recomendado por el fabricante (DiscoveRX, CA, USA).

Resultados El estímulo de ß-galactosidasa y por lo tanto la activación de CXCR7 con 10 nM de SDF-1 humano, se bloqueó de manera eficiente mediante el Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 con un IC50 de 5.4 nM (figura13).

Ejemplo 7: Análisis funcional de Espiegélmero de enlace SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG en un ensayo de brote de anillo aórtico Para probar si el Espiegélmero de enlace SDF-1 humano 193-G2-0 2-5'-PEG es funcional también en un ensayo de cultivo de órgano de angiogénesis estándar, se llevaron a cabo ensayos de brote de anillo aórtico. Este ensayo, en el cual se evalúan la longitud y la abundancia de las extensiones tipo envase procedentes de las explantas, se ha vuelto el modelo de cultivo de órganos más ampliamente utilizado para angiogénesis (Auerbach et al. 2003). Ya se ha mostrado que SDF-1 induce el brote en este tipo de ensayo (Salcedo et al. 1999).

Las aortas de rata se cortaron en anillos, se incrustaron en una matriz de colágeno y se incubaron con SDF-1 y SDF-1 más Espiegélmero de enlace SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG o SDF más un Espiegélmero de Control PEGilado no funcional que no enlaza SDF-1. Después de 6 a 7 días, se analizó el brote (es decir, la excrecencia de las células endoteliales), tomando imágenes y determinando un índice de brote.

Método Las aortas de ratas macho se obtuvieron en Bagheri Life sciences (Berlín, Alemania). Las aortas se prepararon en forma reciente y se transportaron sobre hielo en un medio MCDB 131 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) que contiene 50 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina (ambas de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y 2.5 pg/ml de fungizona (Cambrex, USA).

Para un experimento se transfirió una aorta simple a un plato de cultivo celular junto con el medio y se eliminó el tejido conectivo residual. Posteriormente, se cortó la aorta con un bisturí en anillos de aproximadamente 1 a 2 mm de longitud. Los anillos se lavaron en forma intensa (al menos cinco veces) en el Medio 199 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), y posteriormente se colocaron en depósitos de una placa de 24 depósitos, que contiene 450 µ? de solución de colágeno por depósito. Esta solución de colágeno se preparó mezclando 9 mi de colágeno de cola de rata (3 mg/ml en 0,1% de ácido acético; Sigma, Deisenhofen, Alemania) con 1.12 mi 10X de Medio 199 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), 1,12 mi 10X de amortiguador de colágeno (0,05 N NaOH, 200 mM HEPES, 260 mM NaHC03) y 0.6 mi 200 mM de Glutamina. Los anillos se orientaron de modo que los bordes recortados fueran perpendiculares a la parte inferior del depósito. El colágeno se dejó solidificar incubando las placas durante al menos una hora a una temperatura de 37°C. Posteriormente, se agregó con adiciones 1 mi de medio MCDB 131 (SDF-1 y Espiegélmeros) por depósito. Posteriormente los anillos se incubaron a una temperatura de 37°C durante seis a siete días. Como control para el brote, los experimentos se llevaron a cabo en forma adicional con VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular).

El brote se documentó tomando fotografías con una cámara digital. En algunos casos los anillos se fijaron mediante la adición de 1 mi de paraformaldehído al 10% y se almacenaron a una temperatura de 2 a 8°C para documentación adicional. Las fotografías fueron analizadas con el software de procesamiento de imágenes Scion Image. Después de la calibración con la ayuda de una fotografía tomada de un micrómetro de etapas, se dibujó una línea a una distancia de 0.33 mm desde un borde de un anillo. Se generó mediante el software un histograma de trazo a lo largo de esta línea, los histogramas se imprimieron y se contaron los picos (que representan brotes que cruzan la línea). Este número se tomó como un índice de brote. Se evaluaron 4 a 5 anillos por condición. Se llevó a cabo el análisis estadístico con WinSTAT de Excel.

Resultados Se puede demostrar que SDF-1 induce el brote y que este efecto puede ser bloqueado con el Espiegélmero de enlace SDF-1 humano 193-G2-012-5'-PEG . No se observó bloqueo del brote inducido por SDF-1 a través del Espiegélmero de Control PEGilado no funcional (figura 14 y 15).

Ejemplo 8: Efecto de Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 en quimiosensibilización de células de leucemia Existe evidencia considerable de que las células de leucemia puedan ser protegidas de quimioterapias convencionales mediante la interacción entre sus receptores CXCR4 con SDF-1 secretados mediante células estromales dentro de microambientes de tejido o particulares, tal como el nicho de la médula ósea (abreviatura BM). Por consiguiente, la dirección del eje CXCR4-SDF-1 utilizando el Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12, es un método atractivo para interrumpir los efectos protectores de células estromales que segregan SDF-1, y para sensibilizar células de leucemia hacia quimioterapia subsecuente.

Con el objeto de mimetizar la interacción in vivo de los microambientes BM con células de leucemia, se estableció un sistema de cocultivo in vitro con células MS-5 estromales BM de múrido y la línea de célula de mieloma múltiple (abreviatura MM) RPMI 8226. El objetivo del experimento fue mostrar si el Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 sensibiliza las células MM en un cocultivo con células estromales a los efectos de agentes quimioterapéuticos. Las células MS-5 estromales que segregan SDF 1, se incubaron con Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 o el revNOX-A12 no funcional. La línea de célula MM RPMI-8226 fue agregada a la capa de célula estromal confluente. Las células se incubaron posteriormente con el agente quimioterapéutico F ara A (Fludarabina) durante 40 horas. Se midió la viabilidad celular.

Método Se compró la línea de célula estromal de múrido MS-5 (ACC 441) en DSMZ, la línea de célula de Mieloma Múltiple RPMI8226 (CCL-155) se compró en ATCC. Se mantuvo la línea de célula de Mieloma Múltiple RPMI8226 en un medio RPMI 1640 GlutaMAX (Invitrogen) suplementado con 10% FBS (Biochrom) y penicilina-estreptomicina, las células MS-5 se cultivaron en MEM alfa GlutaMAX (Invitrogen) con 10% FBS y penicilina-estreptomicina. Para experimentos de cocultivo de quimiosensibilización, se sembraron células MS-5 estromales el día anterior sobre placas de 24 depósitos (los ocho depósitos internos) en concentraciones de 8 x 104/mL/depósito en un medio MEM alfa GlutaMAX (+ 10% FBS) y se incubaron a una temperatura de 37°C en 5% C02. Se lavó la capa de célula estromal confluente y se agregaron a los depósitos 0.5 ml_ de medio RPMI 1640 ( + 1 % FBS). El Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 o revNOX-A12 se agregó en forma subsecuente a los depósitos a una concentración final de 100 nM y se incubó durante cuatro horas. Se agregaron a la capa de célula estromal 3.5 x 105 de células RPMI8226 en medio RPMI 1640 ( + 1% FBS). Cuatro horas después, se agregaron a las células, cuando se indicó, 1 µ? de F-ara-A (Sigma Aldrich). Después de 40 horas de incubación, las células se recolectaron en tubos de 15 ml_, primero se recolectó el sobrenadante y posteriormente las células adheridas fueron tripsinizadas incluyendo células MS-5. Las células recolectadas se lavaron dos veces con PBS ( + 1% BSA) y se volvieron a suspender en 2 ml_ PBS ( + 1%BSA). Se transfirieron 150 µ?_ de la suspensión celular en una placa de 96 depósitos en forma de u y posteriormente se incubaron con 50 µ?_ de ViaCount Reagent (Millipore) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se determinó la viabilidad celular y el número de células mediante Citometría de Flujo utilizando Guava EasyCyte 6HT/2L (Millipore).

Resultados La viabilidad celular de células RPMI-8226 cocultivadas con células MS-5 estromales, se vio afectada únicamente en forma ligera por el Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX A12. 1 µ? de F-ara-A no mostró efecto significativo en la viabilidad de células RPMI-8226. Sin embargo, cuando se combinaron NOX-A12 y F-ara-A, se observó una disminución sinérgica de la viabilidad celular (figura 16). Por lo tanto, el Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 mostró sensibilizar la línea de célula MM RPMI-8226 hacia el tratamiento del agente quimioterapéutico F-ara-A, cuando se cultivó junto con la línea de célula estromal BM MS 5. La viabilidad de células MS-5 estromales ni se vio afectada por F-ara-A ni por NOX-A12 (datos no mostrados). Los resultados demuestran una prueba del principio en el potencial de NOX A12 para interrumpir los efectos protectores de SDF-1 secretado por células estromales BM.

Ejemplo 9: Efecto de Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 en la proliferación de células de leucemia El objetivo del experimento fue mostrar si el Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 tiene impacto en la proliferación de células de leucemia en un cocultivo con células estromales de médula ósea (abreviatura BM). Las células MS-5 estromales de múrido que segregan SDF-1, se incubaron con el Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 o el Espiegélmero no funcional revNOX-A12. La línea de célula leucémica Jurkat, se agregó a la capa de célula estromal confluente y se incubó durante 40 horas a una temperatura de 37°C y en 5% C02. Se cuantificaron los números de células mediante Citometría de Flujo utilizando el Guava EasyCyte y el Reactivo ViaCount.

Método Se compró la línea de célula estromal de múrido MS-5 (ACC 441) en DSMZ y se cultivaron en MEM alfa GlutaMAX (Invitrogen) con 10% de FBS y penicilina-estreptomicina. Para experimentos de proliferación de cocultivo, se sembraron células MS-5 estromales el día anterior en placas de 24 depósitos (los ocho depósitos internos) en una concentración de 8 x 104/mL/depósito en un medio MEM alfa GlutaMAX (+ 10% FBS) y se incubaron a una temperatura de 37°C en 5% C02. La capa de célula estromal confluente se lavó y se agregaron a los depósitos 0.5 ml_ de medio RPMI 1640 ( + 1% FBS). El Espiegélmero de enlace SDF-1 NOX-A12 o el Espiegélmero revNOX A12, se agregó subsecuentemente a los depósitos a una concentración final de 100 nM y se incubaron durante cuatro horas. Se agregaron células Jurkat 2 x 105 (~ fase de crecimiento logarítmico; lavado una vez) en medio RPMI 1640 ( + 1% FBS) se agregaron a la capa de célula estromal confluente y se incubaron durante 48 horas a una temperatura de 37°C con 5% C02. Las células se recolectaron posteriormente en tubos de 15 mL, las células adheridas se tripsinizaron incluyendo células MS-5. Las células recolectadas se lavaron dos veces con PBS (+1% BSA). Se transfirieron 150 pL de esta suspensión celular en una placa de 96 depósitos con forma de u y posteriormente se incubó con 50 pL de Reactivo ViaCount (Millipore) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se determinó la viabilidad celular y el número de células mediante Citometría de Flujo utilizando el Guava EasyCyte 6HT/2L.

Resultados Aunque 1 nM de Espielgémero de enlace SDF-1 NOX-A12 no mostró efecto en el número de células Jurkat después de 40 horas de cultivo, se redujo el número de células hasta el 20% cuando se incubaron previamente células MS-5 con 10 o 100 nM de Espielgémero de enlace SDF-1 NOX-A12 (figura 17). Por lo tanto, SDF-1 segregado por células estromales se estimula aparentemente la proliferación de las células Jurkat. La inducción de proliferación dependiente de SDF-1 puede ser bloqueada mediante Espielgémero de enlace SDF-1 NOX-A12 conduciendo a la detección de menos de una menor cantidad de células leucémicas.

Ejemplo 10: Efecto de Espielgémero de enlace SDF-1 NOX-A12 en las propiedades de adhesión de células de leucemia La interacción de células leucémicas con proteínas de matriz extracelular (abreviatura ECM) desempeña un papel crucial en la patogénesis de leucemia. Por consiguiente, probamos el efecto del Espielgémero de enlace SDF-1 NOX-A12 en la adhesión de células de leucemia en la fibronectina de proteína ECM. El estímulo de la línea de célula-T de leucemia Jurkat con SDF-1, condujo a una modulación de adhesión dependiente de la dosis en la fibronectina.

Métodos Se compraron células de leucemia de célula T Jurkat (ACC 282) en DSMZ, se mantuvieron en un medio RPMI 1640 GlutaMAX (Invitrogen) suplementado con 10% FBS (Biochrom) y penicilina-estreptomicina. Para los experimentos de adhesión, se incubaron placas de cultivo de 96 depósitos con 10 pg/mL de fibronectina humana (R&D systems) en PBS durante 2 horas a una temperatura de 37°C. Las placas de lavaron dos veces con 100 L, de PBS y se bloquearon en forma subsecuente con PBS-BSA (0.1 %) durante dos horas a una temperatura de 37°C. Posteriormente las células se lavaron con medio RPMI. Las células Jurkat de la fase de crecimiento logarítmica se lavaron con medio RPMI (+ 0.1% BSA) y se incubaron con diversas concentraciones de SDF-1 humano (R&D systems) y NOX-A12 durante 15 minutos a una temperatura de 37°C. NOX-A12 y SDF-1 se incubaron previamente durante 30 minutos. Se sembraron 1 x 105 células Jurkat estimuladas en las places de 96 depósitos recubiertas con Fibronectina y se incubaron durante 30 minutos. Posteriormente las placas se lavaron cinco veces con medio RPMI. Las células adheridas fueron cuantificadas utilizando el Reactivo Cell Titer Glo (Promega). Por consiguiente, se agregaron a cada depósito 50 de medio RPMI, seguido de 50 L de Reactivo Cell Titer Glo. Las placas se mezclaron durante dos minutos, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos. El número de células fue cuantificado mediante señal de luminiscencia relativa.

Resultados Las concentraciones de bajas a medias de SDF-1 (1 a 10 nM) disminuyeron la adhesión de células Jurkat a fibronectina, mientras que las concentraciones mayores (30 a 300 nM) incrementaron las propiedades de adhesión de células Jurkat (figura 18A). Se mostró que el Espielgémero de enlace SDF-1 NOX-A12 invierte este efecto, el Espielgémero revNOX-A12 de control no lo hace (figura 18B). Por lo tanto, el Espielgémero de enlace SDF-1 N0X-A12 puede tener impacto en la interrupción de interacciones de célula leucémica con su ambiente ECM protector. Además, este ejemplo debe explicar la separación dependiente de Espielgémero de enlace SDF-1 NOX-A12 y la movilización de células hematopoyéticas del nicho de la médula ósea.

Ejemplo 11: Interrupción de interacción de células de mieloma múltiple con el ambiente in vivo de la médula ósea, para incrementar de esta forma la sensibilidad de las células de mieloma múltiple a la terapia El eje SDF-1/CXCR4 desempeña un papel importante en la residencia y tráfico de células de mieloma múltiple (abreviatura MM) a la médula ósea (abreviatura BM). Por consiguiente, la desadhesión de células MM del medio BM circundante a través de la inhibición de SDF-1, incrementa la sensibilidad de MM a los agentes terapéuticos. Azab et al., publicó un protocolo para probar la potencia del inhibidor CXCR4 para interrumpir la interacción de células AMD3100 MM con el ambiente BM in vivo, lo cual afecta la localización de las células MM lo cual a su vez incrementa la sensibilidad de células MM a quimioterapia. Reportaron que el bloqueo del receptor SDF-1 CXCR4 mediante el antagonista específico de CXCR4, condujo a una interrupción de la interacción de células MM con el ambiente BM in vivo, para una sensibilidad incrementada de las células MM a la terapia, y como resultado a la reducción de tumor incrementada inducida por bortezomib (Azab et al., 2009). Con base en este protocolo (Azab et al., 2009), el Espielgémero de enlace SDF-1 NOX-A12 se prueba con respecto a su potencia para interrumpir la interacción de células MM con el ambiente BM in vivo, para incrementar de esta forma la sensibilidad de células MM a la terapia .

Para el modelo de animal MM, se utilizaron ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), para lo cual se inyectaron células Luc + /GFP+ MM. 1S (2 X 106/ratón) en la vena de la cola de los ratones SCID Después de 3 a 4 semanas, se detectó suficiente progreso del tumor mediante generación de imágenes de bioluminiscencia (para el protocolo ver la Publicación de Azab et al., 2009). Los ratones fueron divididos en forma aleatoria 4 grupos: grupo 1, ratones de control (vehículo recibido: 5% de glucosa); grupo 2, ratones tratados un día sí y un día no con 20 mg/kg de inyección subcutánea de NOX-A12; grupo 3, ratones tratados con inyección de bortezomib intraperitoneal de 0.5 mg/kg dos veces a la semana; grupo 4, ratones tratados con inyección de bortezomib intraperitoneal de 0.5 mg/kg dos veces a la semana y un día sí y un día no con 20 mg/kg NOX-A12 de inyección subcutánea.

La localización de las células de tumor MM en la médula ósea, se determina a través de un microscopio confocal in vivo, utilizando un anticuerpo anti-SDF etiquetado con fluorescencia (para el protocolo ver la Publicación de Azab et al., 2009), mediante lo cual la administración de NOX-A12 conduce a la movilización de células MM de la médula ósea a la sangre (tal como se determina mediante citometría de flujo; para protocolo ver la Publicación de Azab et al., 2009) y a una reducción del crecimiento del tumor cuando se administra junto con bortezomib (mediante detección de bioluminiscencia in vivo; para protocolo ver las Publicaciones de Mitsiades et al., 2003; Mitsiades et al., 2004). Los efectos más fuertes en el crecimiento del tumor mediante bortezomib más NOX-A12, en comparación con un tratamiento con bortezomib solo, soporta los datos del Ejemplo 8, que muestra los efectos positivos de NOX-12 en la quimiosensibilización de células MM.

Referencias Los ciatos bibliográficos completos de los documentos aquí mencionados, si no se indica lo contrario, son tal como se indica, por lo cual la descripción de dichas referencias está incorporada a la presente invención como referencia Alsayed Y., Ngo H., et al., (2007) Mecanismos de regulación de migración dependiente de CXCR4/SDF-1 (CXCL12) y residencia en mieloma múltiple (Mechanisms of regulation of CXCR4/SDF-1 (CXCL12)-dependent migration and homing in múltiple mieloma). Blood 109(7): 2708-17.

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Las características de la presente invención descritas en la presente especificación, las reivindicaciones y/o los dibujos, pueden ser tanto por separado, como en combinación de las mismas, material para materializar la invención en diversas formas de la misma.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico con la capacidad de enlazar a SDF-1, preferentemente con la capacidad de inhibir SDF-1, en donde la molécula de ácido nucleico es para utilizarse en un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno, para utilizarse en un método para el tratamiento de un sujeto que padece de una enfermedad o trastorno, o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno, como una terapia adjunta, o para utilizarse como un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno, en donde la enfermedad o trastorno es cáncer.

2. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de cáncer hematológico, en donde preferentemente el cáncer hematológico se selecciona del grupo que comprende leucemia y mieloma.

3. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizada porque la leucemia se selecciona del grupo que comprende leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.

4. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizada porque el mieloma es mieloma múltiple.

5. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de tumores sólidos, en donde preferentemente los tumores sólidos se seleccionan del grupo que comprende g lioblastoma , cáncer colorectal, cáncer de seno, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.

6. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizada porque la terapia adjunta sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto sensibilizado responde más a una terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno.

7. El ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque la terapia para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o trastornos comprenden la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o irradiación al sujeto y/o cirugía y/o terapia celular.

8. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 7, caracterizada porque el agente farmacéuticamente activo adicional se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo, un agente de alquilación, un anti-metabolito, un alcaloide de planta, un terpenoide de planta, un inhibidor de topoisomerasa, Leucovorina, Metotrexato, Tamoxifen, Sorafenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona, Flurouracil y Prednisona.

9. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizada porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Rituximab, Ofatumumab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab y Alemtuzumab.

10. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizada porque el agente de alquilación se selecciona del grupo que comprende cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, doxorubicina, doxorubicina liposomal, bendamustina, temozolomida y Melfalan.

11. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizada porque el antimetabolito se selecciona del grupo que comprende purinoazatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina y cladribina.

12. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizada porque el terpenoide de planta se selecciona del grupo que comprende un taxano más preferentemente se selecciona del grupo que comprende Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina y epotilona.

13. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizada porque el inhibidor de topoisomerasa se selecciona del grupo que comprende camptotecina, irinotecan y mitoxantrona.

14. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico tiene la capacidad de bloquear la interacción entre SDF-1 y un receptor SDF-1, en donde el receptor SDF-1 se selecciona del grupo que comprende CXCR4 y CXCR7.

15. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, caracterizada porque el tratamiento o prevención de la enfermedad o trastorno se origina mediante la molécula de ácido nucleico que inhibe la interacción entre SDF-1 y un receptor SDF-1.

16. El ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende una molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo B, una molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo C, una molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo A y una molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo D.

17. El ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 16, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo B, comprende una extensión central de nucleótidos, en donde la extensión central de nucleótidos comprende la siguiente secuencia de nucleótidos: 5' GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3' (SEQ ID NO: 52).

18. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizada porque la extensión central de nucleótidos comprende la siguiente secuencia de nucleótidos: 5' GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG 3' (SEQ ID NO: 53).

19. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 17 y 18, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo B comprende en la dirección 5'->3', una primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos, y una segunda extensión terminal de nucleótidos.

20. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 17 y 18, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo B comprende en la dirección 5'->3', una segunda extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos, y una primera extensión terminal de nucleótidos.

21. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 19 y 20, caracterizada porque la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' X1X2SVNS 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' BVBSX3X4 3', en donde X1 está ya sea ausente o es A, X2 es G, X3 es C y X4 está ausente o es U; o X1 está ausente, X2 está ya sea ausente o es G, X3 está ya sea ausente o es C y X4 está ausente.

22. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 21, preferentemente la reivindicación 21, caracterizada porque la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' X1X2CRWG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' KRYSX3X4 3', en donde X1 está ya sea ausente o es A, X2 es G, X3 es C y X4 está ya sea ausente o es U.

23. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 22, preferentemente las reivindicaciones 21 o 22, caracterizada porque la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' X1X2CGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' UACGX3X4 3', en donde X1 está ya sea ausente o es A, X2 es G, X3 es C y X4 está ausente o U, preferentemente la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' AGCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' UACGCU 3'.

24. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 21, preferentemente la reivindicación 21, caracterizada porque la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' X1X2SSBS 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' BVSSX3X4 3', en donde X1 está ausente, X2 está ya sea ausente o es G, X3 está ya sea ausente o es C, y X4 está ausente, preferentemente la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' UACGC 3'.

25. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 16 a la 24, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo B comprende una secuencia de nucleótido de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 22 a SEQ ID NO: 28, preferentemente cualquiera de las SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 28, más preferentemente cualquiera de las SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 28.

26. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 16, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo C, comprende una extensión central de nucleótidos, en donde la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de GGUYAGGGCUHRXAAGUCGG (SEQ ID NO: 108), en donde XA está ya sea ausente o es A.

27. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 26, caracterizada porque la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 109), 5' GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 110) o 5' GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 111), preferentemente 5' GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ ID NO: 1 1).

28. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 26 y 27, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo C comprende en la dirección 5'->3', una primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos, y una segunda extensión terminal de nucleótidos.

29. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 26 y 27, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo C, comprende en la dirección 5'->3' una segunda extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos, y una primera extensión terminal de nucleótidos.

30. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 28 y 29, caracterizada porque la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' RKSBUSNVGR 3' (SEQ ID NO: 138), y la segunda extensión de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' YYNRCASSMY 3' (SEQ ID NO: 139), preferentemente la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' RKSBUGSVGR 3' (SEQ ID NO: 140), y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' YCNRCASSMY 3' (SEQ ID NO: 141).

31. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 28 y 29, caracterizada porque la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' XSSSSV 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' BSSSXS 3', en donde Xs está ya sea ausente o es S, preferentemente la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' SGGSR 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' YSCCS 3'.

32. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 28 y 29, caracterizada porque a) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCCGG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGGC 3'; o b) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CGUGCGCUUGAGAUAGG 3 '(SEQ ID NO: 220), y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUGAUUCUCACG 3' (SEQ ID NO: 221); o c) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' UGAGAUAGG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUGAUUCUCA 3' (SEQ ID NO: 222); o d) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GAGAUAGG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUGAUUCUC 3'.

33. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 32, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 tipo C comprende una secuencia de nucleótido de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO: 95 a SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 112 a SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 224, preferentemente cualquiera de SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 224.

34. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 16, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo A comprende una extensión central de nucleotidos, en donde la extensión central de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' AAAG YR AC AHG U M AAXAUG AAAGG U ARC 3' (SEQ ID NO: 74), en donde XA está ya sea ausente o es A.

35. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 34, caracterizada porque la extensión central de nucleotidos comprende la secuencia de nucleótido de 5 ' AAAGYRACAHGUM AAUG AAAGG U ARC 3' (SEQ ID NO: 75) , o 5' AAAGYRACAHG U MAAAUG AAAGG U ARC 3' (SEQ ID NO: 76) , o 5' AAAG YAACAHG UCAAU G AAAGG U ARC 3'(SEQ ID NO: 77) , preferentemente la extensión central de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' AAAG YAACAHG UCAAU G AAAGG U ARC 3' (SEQ ID NO: 77).

36. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 34 y 35, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo A comprende en la dirección 5'->3' una primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos, y una segunda extensión terminal de nucleótidos.

37. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 34 y 35, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo A comprende en la dirección 5'->3' una segunda extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos, y una primera extensión terminal de nucleótidos.

38. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 36 y 37, caracterizada porque la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' X1X2NNBV 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' BNBNX3X4 3', en donde X1 está ya sea ausente o es R, X2 es S, X3 es S y X4 está ya sea ausente o es Y; o X1 está ausente, X2 está ya sea ausente o es S, X3 está ya sea ausente o es S y X4 está ausente.

39. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 36 a la 38, preferentemente la reivindicación 38, en donde la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' RSHRYR 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' YRYDSY 3', preferentemente la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCUGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CGCAGC 3'.

40. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 36 a la 38, preferentemente la reivindicación 38, caracterizada porque la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' X2BBBS 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' SBBVX3 3', en donde X2 está ya sea ausente o es S y X3 está ya sea ausente o es S; preferentemente la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CGCAG 3'; o la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CGCGC 3'.

41. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 40, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo A comprende una secuencia de nucleotido de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 60 a SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78 a SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 a SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89 a SEQ ID NO: 94, y SEQ ID NO: 145, preferentemente cualquiera de las SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO: 84, y SEQ ID NO: 146, más preferentemente cualquiera de las SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 146.

42. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 16, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico de enlace SDF-1 del tipo D comprende una secuencia de nucleotido de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 142 a SEQ ID NO: 144.

43. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 42, caracterizada porque SDF-1 es SDF-1 humano, en donde preferentemente el SDF-1 humano es SDF-1 alfa humano o SDF-1 beta humano, más preferentemente el SDF-1 humano es SDF-1 alfa humano.

44. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 43, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico comprende una modificación, en donde la modificación es preferentemente una porción de alto peso molecular y/o en donde la modificación permite preferentemente modificar las característica de la molécula de ácido nucleico en términos de tiempo de residencia en el cuerpo del animal o humano, preferentemente el cuerpo humano.

45. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizada porque la modificación se selecciona del grupo que consiste una porción HES, una porción PEG, modificaciones biodeg radables y combinaciones de las mismas.

46. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 45, caracterizada porque la modificación es una porción PEG que consiste en un PEG recto o ramificado, en donde el peso molecular del PEG recto o ramificado es de aproximadamente 20,000 a 120,000 Da, más preferentemente de aproximadamente 30,000 a 80,000 Da y lo más preferentemente aproximadamente 40,000 Da.

47. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 45, caracterizada porque la modificación es una porción HES, en donde preferentemente el peso molecular de la porción HES es de aproximadamente 10,000 a 200,000 Da, más preferentemente de aproximadamente 30,000 a 170.000 Da y lo más preferentemente aproximadamente 150,000 Da.

48. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 44 a la 47, caracterizada porque la modificación se adhiere a la molécula de ácido nucleico a través de un enlazador, en donde preferentemente el enlazador es un enlazador bioestable o biodegradable.

49. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 44 a la 48, caracterizada porque la modificación se adhiere a la molécula de ácido nucleico en el nucleotido 5'-terminal de la molécula de ácido nucleico y/o el nucleotido 3'-terminal de la molécula de ácido nucleico y/o al nucleotido de la molécula de ácido nucleico entre el nucleotido 5'-terminal de la molécula de ácido nucleico y el nucleotido 3'-terminal de la molécula de ácido nucleico.

50. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 49, caracterizada porque los nucleótidos de la molécula de ácido nucleico o los nucleótidos que forman la molécula de ácido nucleico, son nucleótidos-L.

51. La molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 50, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico-L.

52. Una composición farmacéutica que comprende un primer agente farmacéuticamente activo, la molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 51 y opcionalmente, un constituyente adicional, caracterizada porque el constituyente adicional se selecciona del grupo que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable, un transportador farmacéuticamente aceptable y un agente farmacéuticamente activo adicional, y en donde la composición farmacéutica es para utilizarse en un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno, o para utilizarse en un método para el tratamiento de un sujeto que padece de una enfermedad o trastorno o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno como una terapia adjunta, o para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno, en donde la enfermedad o trastorno es cáncer.

53. La composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 52, caracterizada porque la terapia adjunta sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto sensibilizado responde más a una terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno.

54. La composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 53, caracterizada porque la terapia para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o trastornos comprenden la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o irradiación al sujeto y/o cirugía y/o terapia celular.

55. La composición farmacéutica tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 52 a 54, caracterizada porque el agente farmacéuticamente activo adicional es un agente farmacéuticamente activo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un agente de alquilación, un anti-metabolito, un alcaloide de planta, preferentemente vincristina, terpenoide de planta, un inhibidor de topoisomerasa, Leucovorin, Metotrexato, Tamoxifen, Sorafenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona, Flurouracil y Prednisona.

56. La composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 55, caracterizada porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Rituximab, Ofatumumab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab, y Alemtuzumab.

57. La composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 55, caracterizada porque el agente de alquilación se selecciona del grupo que comprende cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, doxorubicina, doxorubicina liposomal, bendamustina, temozolomida y Melfalan.

58. La composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 55, caracterizada porque el anti-metabolito se selecciona del grupo que comprende purinoazatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina , y cladribina.

59. La composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 55, caracterizada porque el terpenoide de planta se selecciona del grupo que comprende un taxano más preferentemente se selecciona del grupo que comprende Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina y epotilona.

60. La composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 55, caracterizada porque el inhibidor de topoisomerasa se selecciona del grupo que comprende ca mptoteci na , irinotecan y mitoxantrona.

61. La composición farmacéutica tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 52 a la 60, caracterizada porque el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer hematológico, en donde preferentemente el cáncer hematológico se selecciona del grupo de leucemia y mieloma.

62. La composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 61, caracterizada porque la leucemia se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.

63. La composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 61, caracterizada porque el mieloma es mieloma múltiple.

64. La composición farmacéutica tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 52 a la 60, caracterizada porque el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de tumores sólidos, en donde preferentemente los tumores sólidos se seleccionan del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorectal, cáncer de seno, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.

65. Un medicamento que comprende una o diversas unidades de dosificación de al menos un primer agente farmacéuticamente activo adicional, en donde el primer agente farmacéuticamente activo adicional es una molécula de ácido nucleico con la capacidad de enlazar a SDF-1, tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 51, en donde el medicamento es para utilizarse en un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno, o para utilizarse en un método para el tratamiento de un sujeto que padece de una enfermedad o trastorno o que está riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno como una terapia adjunta, o para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno, en donde la enfermedad o trastorno es cáncer.

66. El medicamento tal como se describe en la reivindicación 65, caracterizado porque la terapia adjunta sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto es sensibilizado responde más a una terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno.

67. El medicamento tal como se describe en la reivindicación 66, caracterizado porque la terapia para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o trastornos comprende la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o irradiación al sujeto y/o cirugía y/o terapia celular.

68. El medicamento tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 67, preferentemente la reivindicación 65, caracterizado porque el medicamento comprende un agente farmacéuticamente activo adicional, preferentemente una o diversas unidades de dosificación de un agente farmacéuticamente activo adicional, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo, un agente de alquilación, un anti-metabolito, un alcaloide de planta, preferentemente vincristina, terpenoide de planta, un inhibidor de topoisomerasa, Leucovorin, Metotrexato, Tamoxifen, Sorafenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona y Flurouracil.

69. El medicamento tal como se describe en la reivindicación 67, caracterizado porque el medicamento comprende el agente farmacéuticamente activo adicional, preferentemente una o diversas unidades de dosificación del agente farmacéuticamente activo adicional, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo, un agente de alquilación, un anti-metabolito, un alcaloide de planta, preferentemente vincristina, terpenoide de planta, un inhibidor de topoisomerasa, Leucovorin, Metotrexato, Tamoxifen, Sorafenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona , Flurouracil y Prednisona.

70. El medicamento tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 68 y 69, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Rituximab, Ofatumumab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab y Alemtuzumab.

71. El medicamento tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 68 y 69, caracterizado porque el agente de alquilación se selecciona del grupo que comprende cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, doxoru bicina , doxorubicina liposomal, bendamustina, temozolomida y Melfalan.

72. El medicamento tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 68 y 69, caracterizado porque el anti-metabolito se selecciona del grupo que comprende purinoazatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina, y cladribina.

73. El medicamento tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 68 y 69, caracterizado porque el terpenoide de planta se selecciona del grupo que comprende un taxano más preferentemente se selecciona del grupo que comprende Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina y epotilona.

74. El medicamento tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 68 y 69, caracterizado porque el inhibidor de topoisomerasa se selecciona del grupo que comprende campíotecina, irinotecan y mitoxantrona .

75. El medicamento tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 74, caracterizado porque el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer hematológico, en donde preferentemente el cáncer hematológico se selecciona del grupo de leucemia y mieloma.

76. El medicamento tal como se describe en la reivindicación 75, caracterizado porque la leucemia se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.

77. El medicamento tal como se describe en la reivindicación 75, caracterizado porque el mieloma es mieloma múltiple.

78. El medicamento tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 74, caracterizado porque el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de tumores sólidos, en donde preferentemente los tumores sólidos se seleccionan del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorectal, cáncer de seno, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.

79. El uso de una molécula de ácido nucleico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 51, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno o para utilizarse en un método para el tratamiento de un sujeto que padece de una enfermedad o trastorno o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno como una terapia adjunta, en donde la enfermedad o trastorno es cáncer.

80. El uso tal como se describe en la reivindicación 79, caracterizado porque la terapia adjunta sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto sensibilizado responde más a una terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno.

81. El uso tal como se describe en la reivindicación 80, caracterizado porque la terapia para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o trastornos comprenden la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o irradiación al sujeto y/o cirugía y/o terapia celular.

82. El uso tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 79 a la 81, preferentemente la reivindicación 79, caracterizado porque el medicamento se utiliza en combinación con un agente farmacéuticamente activo adicional, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional es un agente farmacéuticamente activo seleccionado del grupo que comprende un anticuerpo, un agente de alquilación, un anti-metabolito, un alcaloide de planta, preferentemente vincristina, terpenoide de planta, un inhibidor de topoisomerasa , Leucovorin, Metotrexato, Tamoxifen, Sorafenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona, Flurouracil y Prednisona.

83. El uso tal como se describe en la reivindicación 81, caracterizado porque el agente farmacéuticamente activo adicional es un agente farmacéuticamente activo seleccionado del grupo que comprende un anticuerpo, un agente de alquilación, un anti-metabolito, un alcaloide de planta, preferentemente vincristina, terpenoide de planta, un inhibidor de topoisomerasa , Leucovorin, Metotrexato, Tamoxifen, Sorafenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona, Flurcfuracil y Prednisona.

84. El uso tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 82 y 83, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Rituximab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab y Alemtuzumab.

85. El uso tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 82 y 83, caracterizado porque el agente de alquilación se selecciona del grupo que comprende cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, doxorubicina, doxorubicina liposomal, bendamustina, temozolomida y Melfalan.

86. El uso tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 82 y 83, caracterizado porque el anti-metabolito se selecciona del grupo que comprende purinoazatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina , y cladribina.

87. El uso tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 82 y 83, caracterizado porque el terpenoide de planta se selecciona del grupo que comprende un taxano más preferentemente se selecciona del grupo que comprende Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina y epotilona.

88. El uso tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 82 y 83, caracterizado porque el inhibidor de topoisomerasa se selecciona del grupo que comprende camptotecina, irinotecan y mitoxantrona.

89. El uso tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 82 y 83, caracterizado porque el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer hematológico, en donde preferentemente el cáncer hematológico se selecciona del grupo de leucemia y mieloma.

90. El uso tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque la leucemia se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.

91. El uso tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el mieloma es mieloma múltiple.

92. El uso tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 79 a la 88, caracterizado porque el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en tumores sólidos, en donde preferentemente los tumores sólidos se seleccionan del grupo que comprende glioblastoma, cáncer colorectal, cáncer de seno, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.

93. Un método para el tratamiento de un sujeto que padece o que está en riesgo de desarrollar cáncer, caracterizado porque el método comprende - un paso a) para administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente efectiva de una molécula de ácido nucleico con la capacidad de enlazar a SDF-1 , tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 51.

94. El método tal como se describe en la reivindicación 93, caracterizado porque el método comprende: - un paso b) para irradiar al sujeto y/o cirugía y/o terapia celular y/o administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente farmacéuticamente activo adicional al sujeto, en donde el agente farmacéuticamente activo adicional es un agente farmacéuticamente activo seleccionado del grupo que comprende un anticuerpo, un agente de alquilación, un anti-metabolito, un alcaloide de planta, preferentemente vincristina, terpenoide de planta, un inhibidor de topoisomerasa, Leucovorin, Metotrexato, Tamoxifen, Sorafenib, Lenalidomida, Bortezomib, Dexametasona, Flurouracil y Prednisona.

95. El método tal como se describe en la reivindicación 94, caracterizado porque la cantidad farmacéuticamente efectiva de una molécula de ácido nucleico con la capacidad de enlazar a SDF-1 , tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 51, se administra como una terapia adyuvante o como parte de terapia adyuvante.

96. El método tal como se describe en la reivindicación 95, caracterizado porque la terapia adjunta sensibiliza al sujeto, en donde el sujeto sensibilizado responde más a una terapia para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o trastorno.

97. El método tal como se describe en la reivindicación 96, caracterizado la terapia para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades o trastornos comprenden la administración de un agente farmacéuticamente activo adicional y/o irradiación al sujeto y/o cirugía y/o terapia celular tal como se lleva a cabo en el paso b).

98. El método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 94 a la 97, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Rituximab, Cetuximab, Ibritumomab-Tiuxetan, Tositumomab, Trastuzumab, Bevacizumab y Alemtuzumab.

99. El método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 94 a la 97, caracterizado porque el agente de alquilación se selecciona del grupo que comprende cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, doxorubicina, doxorubicina liposomal, bendamustina, temozolomida y Melfalan.

100. El método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 94 a la 97, caracterizado porque el anti-metabolito se selecciona del grupo que comprende purinoazatioprina, mercaptopurina, fludarabina, pentostatina, y cladribina.

101. El método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 94 a la 97, caracterizado porque el terpenoide de planta se selecciona del grupo que comprende un taxano más preferentemente se selecciona del grupo que comprende Docetaxel, Paclitaxel, podofilotoxina y epotilona.

102. El método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 94 a la 97, caracterizado porque el inhibidor de topoisomerasa se selecciona del grupo que comprende camptotecina, irinotecan, y mitoxantrona.

103. El método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 93 a la 102, caracterizado porque el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer hematológico, en donde preferentemente el cáncer hematológico se selecciona del grupo de leucemia y mieloma.

104. El método tal como se describe en la reivindicación 103, caracterizado porque la leucemia se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfoide crónica y leucemia mieloide aguda.

105. El método tal como se describe en la reivindicación 103, caracterizado porque el mieloma es mieloma múltiple.

106. El método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 93 a la 102, caracterizado porque el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de tumores sólidos, en donde preferentemente los tumores sólidos se seleccionan del grupo que comprende glioblastoma , cáncer colorectal, cáncer de seno, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario y cáncer de pulmón.