KR20090055623A - 올리고뉴클레오티드 전달을 위한 방해된 에스테르 기재 생분해성 링커 - Google Patents

올리고뉴클레오티드 전달을 위한 방해된 에스테르 기재 생분해성 링커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체 내에서 올리고뉴클레오티드의 전달을 위한 방해된 에스테르 기재 생분해성 링커, 및 그의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
올리고뉴클레오티드, 전달, 방해된 에스테르, 생분해성 링커, 세포

Description

올리고뉴클레오티드 전달을 위한 방해된 에스테르 기재 생분해성 링커{HINDERED ESTER-BASED BIODEGRADABLE LINKERS FOR OLIGONUCLEOTIDE DELIVERY}
<관련 출원에 대한 교차 참조>
본원은 그 내용이 본원에 참고로 포함된, 2006년 9월 15일 출원된 미국 특허 가출원 60/845,028을 기초로 한 우선권을 주장한다.
본 발명은 생체 내에서 올리고뉴클레오티드의 전달을 위한 에스테르-기재 생분해성 링커를 제공한다.
의료에서 전통적인 치료 개입은 전형적으로 질병 유발 또는 질병 악화 기능을 완화시키기 위해서 신체 단백질, 예를 들어 수용체, 효소, 호르몬 등과의 상호작용에 촛점을 맞추었다. 보다 새로운 치료 방식에서, 상기 단백질의 실제 생산의 조절이 요구된다. 단백질의 생산을 저해함으로써, 부작용을 최소화하면서 최대 치료 효과를 달성할 수 있다. 따라서, 상기 치료 방식의 일반적인 목적은 목적하지 않는 단백질 형성을 야기하는 유전자 발현을 저해하거나 달리 조절하는 것이다.
특정 유전자의 발현을 억제하는 한 방법은 올리고뉴클레오티드, 특히 특이적인 표적 메신저 RNA (mRNA) 서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 일 반적으로, 유전자 전사 산물 (예를 들어, mRNA)에 상보성인 핵산 서열은 "안티센스"로 지정되고, 전사체와 동일한 서열을 갖거나 전사체로서 생산되는 핵산 서열은 "센스"로 지정된다. 예를 들어, 문헌 [Crooke, 1992, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 329-376]을 참조한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 유전자의 발현을 조정하는 방식으로 유전자의 전부 또는 일부에 혼성화하도록 선택될 수 있다. 전사 인자는 전사 조절 동안 이중가닥 DNA와 상호작용한다. 올리고뉴클레오티드는 그의 작용을 조정하는 전사 인자의 경쟁적 억제제로서 기능할 수 있다. 최근에 발표된 여러 보고서는 상기 상호작용을 설명한 바 있다 (문헌 [Bielinska, A., et al., 1990, Science, 250: 997-1000]; 및 [Wu, H., et al., 1990, Gene 89: 203-209] 참조).
원치 않는 유전자 발현을 하향조절하기 위한 분자 전략이 개발되고 있다. 최근에, 변형된 올리고뉴클레오티드 화합물의 사용이 바이러스 감염, 염증 및 유전자 질환 및 중요하게는 암에 대한 유망한 치료 방법으로 개발되었다. 안티센스 DNA는 자연 발생 핵산에 대해 작용하는 알킬화 상보성 올리고데옥시뉴클레오티드로서 먼저 고안되었다 (Belikova, et al., Tetrahedron Lett. 37:3557-3562, 1967). 자메크닉 (Zamecnik) 및 스티븐슨 (Stephenson)은 먼저 치료 목적을 위한 합성 안티센스 올리고뉴클레오티드의 용도를 처음 제안하였다 ([Zamecnik & Stephenson, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 75:285-289]; [Zamecnik & Stephenson, 1978, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 75:280-284]). 이들은 라우스 (Rous) 육종 바이러스의 RNA에 상보성인 올리고뉴클레오티드 13-mer의 사용이 세포 배양시에 바 이러스의 성장을 억제하였음을 보고하였다. 이때 후부터, 바이러스, 예를 들어 수포성 구내염 바이러스 (Leonetti et al., 1988, Gene, 72:323), 단순 포진 바이러스 (Smith et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:2787), 및 인플루엔자 바이러스 (Seroa; et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:9909)의 성장에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제의 시험관내 효능을 증명하는 많은 다른 연구가 발표되었다.
또한, 올리고뉴클레오티드는 특히 진단 시험, 연구 시약, 예를 들어 PCR 기술에서의 프라이머 및 다른 실험 절차에서 유용성이 밝혀졌다. 올리고뉴클레오티드는 목적하는 용도에 적합하게 맞추어진 특성을 보유하도록 통상적으로 합성될 수 있다. 따라서, 진단제, 연구 시약 및 치료 물질로서 그의 유용성을 증가시키기 위해 많은 화학적 변형이 올리고머 화합물에 도입되었다.
올리고뉴클레오티드, 특히 안티센스 올리고뉴클레오티드가 치료제로서 유망하지만, 이 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 대한 감수성이 크고, 표적 세포에 도입되기 전과 도입된 후에 빠르게 분해되어 비변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 생체내 시스템에 사용하기에는 적합하지 않게 만들 수 있다. 분해를 담당하는 효소는 대부분의 조직에서 발견되기 때문에, 올리고뉴클레오티드에 대한 변형은 화합물을 안정화시키고 상기 문제를 해결하기 위한 시도로 이루어졌다. 가장 널리 시험된 변형은 올리고뉴클레오티드 화합물의 백본 부분에 대해 실시되었다. 일반적으로, 문헌 [Uhlmann and Peymann, 1990, Chemical Reviews 90, at pages 545-561] 및 여기에서 인용된 문헌을 참고한다. 제조된 많은 상이한 백본 중에서, 포 스포로티오에이트만이 유의한 안티센스 활성을 보였다. 예를 들어, 문헌 [Padmapriya and Agrawal, 1993, Bioorg. & Med. Chem. Lett. 3, 761]을 참고한다. 황 원자를 백본에 도입하면 효소 분해 속도가 느려지고, 동시에 독성이 증가한다. 황 원자 첨가의 또다른 단점은 황 원자가 백본을 비키랄로부터 키랄로 변경시켜 2n 부분 입체 이성질체를 생성시킨다는 것이다. 이것은 추가의 부작용을 야기할 수 있다. 존재하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 또다른 단점은 주로 친지질 세포막을 통과하는 그의 능력을 억제하는, 포스페이트기 상에 음전하를 보유할 수 있다는 것이다. 보다 긴 화합물이 세포 외부에 유지되면 될수록, 보다 많이 분해되어 표적에 도달하는 활성 화합물의 양이 적어지게 된다. 존재하는 안티센스 화합물의 또다른 단점은 올리고뉴클레오티드가 2차 및 고차 용액 구조를 형성하는 경향이 있다는 점이다. 일단 상기 구조가 형성되면, 이들은 결합을 위한 다양한 효소, 단백질, RNA, 및 DNA의 표적이 된다. 이것은 비특이적인 부작용 및 mRNA에 결합하는 활성 화합물의 양 감소를 야기한다. 올리고뉴클레오티드 요법을 개선시키기 위한 다른 시도는 연결 모이어티 및 폴리에틸렌 글리콜의 부가를 포함하였다. 예를 들어, 문헌 [Kawaguchi, et al., Stability, Specific Binding Activity, and Plasma Concentration in Mice of an Oligodeoxynucleotide Modified at 5'-Terminal with Poly(ethylene glycol), Biol. Pharm. Bull., 18(3) 474-476 (1995)], 및 미국 특허 제4,904,582호를 참조한다. 상기 두 예에서, 변형은 분해에 대해 올리고뉴클레오티드를 안정화시키고 세포 투과성을 증가시키기 위해서 특성상 영구적인 연결 모 이어티의 사용을 수반한다. 그러나, 상기 노력은 임의의 생체내 효능을 제공하지 못하였다.
보다 최근에, 그 전부가 본원에 참고로 포함된, 공동 소유된 미국 특허 출원 10/822,205에서, 아미노-방출가능한 중합체 컨쥬게이팅된 올리고뉴클레오티드가 제시되었다. 그러나, 아미노-테일 (tail) 링커를 필요로 하지 않으면서 제어된 방식으로 올리고뉴클레오티드를 혈장에 방출하는 것이 훨씬 더 바람직할 것이다.
현재 사용되는 방법의 부적합성 때문에, 안정성 및 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 개선하고 독성을 감소시키고 올리고뉴클레오티드 화합물의 mRNA에 대한 결합 친화도를 증가시킬 필요성이 존재한다. 현재 실시되고 있는 올리고뉴클레오티드 요법은 비용이 많이 소요된다. 이것은 주로 분해 문제 때문이다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물을 분해에 대해 보호하고, 고차 구조의 형성을 억제하고, 동시에 충분한 양의 활성 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물을 표적에 전달할 실질적인 필요성이 존재한다. 본 발명은 상기 개선을 제공한다.
<발명의 개요>
본 발명의 한 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I에 따른 구조를 포함하는, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 생체내 전달을 위한 화합물을 제공한다.
Figure 112009020898954-PCT00001
여기서,
A는 캐핑(capping)기 또는
Figure 112009020898954-PCT00002
이고,
R1은 실질적으로 비-항원성 수용성 중합체이고;
L1 및 L'1은 C(=Y1) 또는 C(=Y'1)로부터 4 내지 10개의 원자, 바람직하게는 C(=Y1) 또는 C(=Y'1)로부터 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 내지 5개의 원자에 위치한 자유 전자쌍을 갖는 독립적으로 선택되는 스페이서이고;
L2 및 L'2는 독립적으로 선택되는 2관능성 링커이고;
Y1 및 Y'1은 독립적으로 O, S, 또는 NR5이고;
X 및 X'는 독립적으로 O 또는 S이고;
R2, R'2, R3, R'3 및 R5는 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -19 분지쇄 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2 -6 치환된 알키 닐, C3 -8 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 아릴옥시, C1 -6 헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C2 -6 알카노일, 아릴카르보닐, C2 -6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C2 -6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C2 -6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시 및 치환된 아릴카르보닐옥시 중에서 독립적으로 선택되거나, 또는 R2는 R3과 함께 및 R'2는 R'3과 함께 적어도 3개의 탄소를 함유하는 치환된 또는 비치환된 비-방향족 시클로히드로카본을 독립적으로 형성하고;
R4 및 R'4는 독립적으로 선택된 폴리뉴클레오티드 및 그의 유도체이고;
(p) 및 (p')는 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게는 0 또는 약 1 내지 약 3의 정수, 보다 바람직하게는 0 또는 1이고;
(q) 및 (q')는 독립적으로 0 또는 1이되,
R3은 R2가 H일 때 적어도 3개의 탄소를 갖는 치환된 또는 비치환된 탄화수소이고, L1은 C(R2)(R3)과 동일하지 않다.
본 발명의 상기 측면의 특정한 바람직한 실시태양에서, 실질적으로 비-항원성 중합체는 폴리알킬렌 옥시드이고, 보다 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 (이하에서 PEG)이다. 다른 측면에서, PEG는 한 말단에서 CH3 기로 캐핑되고, 즉 mPEG이 고, 다른 실시태양에서, 화학식에 대응하는 것과 같은 비스-활성화된 PEG가 제공된다.
본 발명의 또다른 측면은 방해된 에스테르를 함유하는 컨쥬게이트의 제조 방법 및 생물학적 활성 모이어티를 함유하는 컨쥬게이트의 유효량을 그를 필요로 하는 환자 (포유동물)에게 투여하는 것을 기초로 한 치료 방법을 포함한다. 그 치료를 필요로 하는 세포에게 컨쥬게이트를 전달하는 방법도 포함된다.
본원에서 설명되는 중합체 전달 시스템은 중합체와 생물학적 활성 모이어티, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 사이에 방출가능한 결합, 예를 들어 에스테르 결합을 형성할 수 있는 신규한 링커를 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 방해된 에스테르가 저장 동안 안정하지만, 포스포디에스테르 또는 포스포티오에스테르 결합을 가수분해시킴으로써 임의의 테일이 없는 천연 올리고뉴클레오티드를 방출할 수 있다. 또한, 본 발명의 중합체 화합물은 링커로부터의 분자내 이웃 (enchimeric) 도움에 의해 안정한 방해된 에스테르 결합의 가수분해를 촉진시킬 수 있다.
본원에서 설명되는 방해된 에스테르 기재 중합체 수송 시스템의 한가지 잇점은 중합체 전달 시스템이 개선된 안정성을 갖는다는 점이다. 임의의 이론에 기초하지는 않지만, 입체 방해된 환경에서 중합체와 모이어티, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 사이의 에스테르 결합은 에스테르 연결이 염기성 수성 매질 또는 효소에 노출되는 것을 억제하여, 공유 연결을 안정화시킨다. 중합체 시스템의 안정성은 중합체 컨쥬게이트의 보다 긴 저장 수명을 허용한다. 개선된 안정성은 비용 효율을 증가시킨다.
본원에 기재된 중합체 전달 시스템은 올리고뉴클레오티드 및 관련 안티센스, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 또는 잠금 핵산 (LNA) 화합물과 함께 사용하기 적합하다는 점이다. 부착된 올리고뉴클레오티드에 근접하여 방해된 에스테르기가 존재하면 개선된 안정성 및 뉴클레아제 분해에 대한 저항성이 제공된다. 또한, 이것은 독성 감소 및 올리고뉴클레오티드 화합물의 mRNA에 대한 결합 친화도의 증가를 돕는다. 본 발명에 따라 제조된 컨쥬게이트는 분해에 대해 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물을 보호하고, 고차 구조의 형성을 방지하기 위한 수단을 제공한다. 또한, 중합체 컨쥬게이트를 사용하여 기술자는 충분한 양의 활성 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물을 표적에 전달할 수 있다.
본 발명의 링커는 수성 형태로 동물 또는 인간 정맥내 투여에 적합한 모든 버퍼 조건 하에 안정하다. 본 발명의 링커는 혈장 효소의 존재 하에 혈장 내에서 가수분해되어 무손상 올리고뉴클레오티드를 방출할 것이다. 링커에 대한 입체 방해의 변화는 특정 전달 시스템에 필요한 가수분해 속도를 변경시킬 것이다.
방해된 에스테르를 함유하는 활성화된 중합체의 또다른 잇점은 기술자가 선택되는 올리고뉴클레오티드를 보다 쉽게 컨쥬게이팅할 수 있다는 점이다. PEG화 전에 올리고뉴클레오티드 또는 표적 모이어티를 방해된 에스테르로 변형할 필요가 없다. 올리고뉴클레오티드는 있는 그대로의 상태로 선택하고, 그 위에 목적하는 방해된 에스테르 보호기를 함유하는 활성화된 PEG 링커로 PEG화된다.
또다른 잇점은 본 발명의 링커를 임의의 뉴클레오티드 (A, G, C, T, U 등)과 컨쥬게이팅시킨 후, 예를 들어 그의 포스포아미다이트로 전환시킬 수 있다는 점이 다. 포스포아미다이트는 이어서 올리고뉴클레오티드 분자를 제조하기 위해 일반적인 고상 올리고뉴클레오티드 합성 조건 하에서 사용될 수 있다. 링커와 올리고뉴클레오티드 사이의 연결은 합성 및 정제에 필요한 조건 하에서 안정하다.
다른 및 추가의 잇점은 하기 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다.
본 발명을 위해, 용어 "잔기"는 예를 들어 각각 에스테르 또는 아미드기를 형성하기 위해, 예를 들어 이용가능한 히드록실 또는 아미노기의 변형에 의해 전구약물 캐리어 부분이 부착되는 반응을 생물학적 활성 화합물이 거친 후에 유지되는, 생물학적 활성 화합물, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 부분을 의미하는 것으로 이해된다. 이와 유사하게, 실질적으로 비-항원성 중합체, 예를 들어 폴리알킬렌 옥시드 중합체의 잔기는 중합체가 링커, 스페이서 및/또는 생물학적 활성 화합물 또는 그의 잔기에 부착되는 반응을 거친 후에 유지되는 중합체의 부분이다.
본 발명의 목적을 위해, 단수 또는 복수의 사용은 언급된 항목 또는 대상의 수치를 제한함을 의미하는 것이 아니다. 따라서, 세포, 중합체 또는 약물을 언급하기 위한 단수의 사용은 하나의 세포만을 처리하거나, 하나의 분자만을 제조 또는 사용하고/하거나 하나의 약물만을 사용함을 의미하지 않으며, 복수의 사용은 분명하게 언급되지 않으면 본원을 단수의 언급된 항목으로부터 배제시키는 것이 아니다.
달리 규정되지 않으면, 본 발명을 위해
용어 "알킬"은 직쇄, 분지쇄, 치환된, 예를 들어 할로-, 알콕시-, 및 니트로 -C1 -12 알킬, C3 -8 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬 등을 포함하는 것으로 이해되고;
용어 "치환된"은 관능기 또는 화합물 내에 함유된 하나 이상의 원자를 하나 이상의 상이한 원자로 대체하거나 부가하는 것을 포함하는 것으로 이해되고;
용어 "치환된 알킬"은 카르복시알킬, 아미노알킬, 디알킬아미노, 히드록시알킬 및 머캅토알킬을 포함하고;
용어 "치환된 시클로알킬"은 4-클로로시클로헥실과 같은 모이어티를 포함하고; 아릴은 나프틸과 같은 모이어티를 포함하고; 치환된 아릴은 3-브로모페닐과 같은 모이어티를 포함하고; 아르알킬은 톨루일과 같은 모이어티를 포함하고; 헤테로알킬은 에틸티오펜과 같은 모이어티를 포함하고;
용어 "치환된 헤테로알킬"은 3-메톡시-티오펜과 같은 모이어티를 포함하고; 알콕시는 메톡시와 같은 모이어티를 포함하고; 페녹시는 3-니트로페녹시와 같은 모이어티를 포함하고;
용어 "할로"는 플루오로, 클로로, 요오도 및 브로모를 포함하는 것으로 이해되고;
본 발명의 목적을 위해 용어 "충분한 양" 및 "유효량"은 당업자가 이해하는 바와 같은 치료 효과를 달성하는 양을 의미한다.
도 1은 실시예 1-9에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 실시예 10에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 실시예 11-13에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 실시예 14에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도시한 것이다.
A. 개요
본 발명은 생체 내에서 올리고뉴클레오티드 전달을 위한 방해된 에스테르 기재 생분해성 링커를 제공한다. 따라서, 본 발명은 진단 및 분석 시약, 시험관 내 및 생체 내에서의 연구 및 조사 도구, 및 치료제로서의 용도를 포함하여 많은 실제적인 용도를 갖는 유용한 중합체-연결된 올리고뉴클레오티드 전구약물을 제공한다. 상기 내용에 따라, 하기 화학식 I의 화합물이 제공된다.
<화학식 I>
Figure 112009020898954-PCT00003
여기서,
A는 캐핑기 또는
Figure 112009020898954-PCT00004
이고,
R1은 실질적으로 비-항원성 수용성 중합체이고;
L1 및 L'1은 C(=Y1) 또는 C(=Y'1)로부터 4 내지 10개의 원자, 바람직하게는 C(=Y1) 또는 C(=Y'1)로부터 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 내지 5개의 원자에 위치한 자유 전자쌍을 갖는 독립적으로 선택되는 스페이서이고;
L2 및 L'2는 독립적으로 선택되는 2관능성 링커이고;
Y1 및 Y'1은 독립적으로 O, S, 또는 NR5이고;
X 및 X'는 독립적으로 O 또는 S이고;
R2, R'2, R3, R'3 및 R5는 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -19 분지쇄 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2 -6 치환된 알키닐, C3 -8 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 아릴옥시, C1 -6 헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C2 -6 알카노일, 아릴카르보닐, C2 -6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C2 -6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C2 -6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시 및 치환된 아릴카르보닐옥시 중에서 독립적으로 선택되거나, 또는 R2는 R3과 함께 및 R'2는 R'3과 함께 적어도 3개의 탄소를 함유하는 치환된 또는 비치환된 비-방향족 시클로히드로카본을 독립적으로 형성하고;
R4 및 R'4는 독립적으로 선택된 폴리뉴클레오티드 및 그의 유도체이고;
(p) 및 (p')는 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게는 0 또는 약 1 내지 약 3의 정수, 보다 바람직하게는 0 또는 1이고;
(q) 및 (q')는 독립적으로 0 또는 1이되,
R3은 R2가 H일 때 적어도 3개의 탄소를 갖는 치환된 또는 비치환된 탄화수소이고, L1은 C(R2)(R3)과 동일하지 않다.
본 발명의 몇몇 측면에서, 본원에서 설명되는 화합물은 하기 화학식 Ia에 따른 중합체를 함유한다.
<화학식 Ia>
Figure 112009020898954-PCT00005
여기서, (q)는 1이다.
본 발명의 상기 측면의 특정한 바람직한 실시태양에서, 실질적으로 비-항원성 중합체는 폴리알킬렌 옥시드이고, 보다 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 (이하에서 PEG)이다. 다른 측면에서, PEG는 한 말단에서 CH3 기로 캐핑되고, 즉 mPEG이다.
다른 실시태양에서, 화학식 II에 대응하는 것과 같은 비스-활성화된 PEG가 제공된다:
Figure 112009020898954-PCT00006
본 발명의 상기 측면 내에서, R2, R'2, R3, R'3 및 R5에 대응하는 모이어티가 치환될 수 있는 것으로서 표시되는, 치환을 위해 고려되는 치환체는 예를 들어 아실, 아미노, 아미도, 아미딘, 아라-알킬, 아릴, 아지도, 알킬머캅토, 아릴머캅토, 카르보닐, 카르복실레이트, 시아노, 에스테르, 에테르, 포르밀, 할로겐, 헤테로아릴, 헤테로시클로알킬, 히드록시, 이미노, 니트로, 티오카르보닐, 티오에스테르, 티오아세테이트, 티오포르메이트, 알콕시, 포스포릴, 포스포네이트, 포스피네이트, 실릴, 술프히드릴, 술페이트, 술포네이트, 술파모일, 술폰아미드, 및 술포닐을 포함할 수 있다.
바람직하게는, L1 및 L'1은 C(=Y1) 또는 C(=Y'1)로부터 4 내지 8개의 원자, 바람직하게는 4 내지 6개의 원자에 위치한 자유 전자쌍을 갖는 독립적으로 선택되는 스페이서이고; Y 및 Y'1은 모두 O이다.
본 발명의 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 약 2 내지 약 100개의 올리고머, 보다 바람직하게는 약 3 내지 약 50개의 올리고머, 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 30개의 올리고머를 포함한다.
또다른 측면에서, A는 H, NH2, OH, CO2H, C1 -6 알콕시, 및 C1 -6 알킬 중에서 선택될 수 있다. 일부의 바람직한 실시태양에서, A는 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, H, 및 OH일 수 있다. A는 보다 바람직하게는 메틸 또는 메톡시이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 연장하기 위한 중간체를 제공한다. 상기 측면에 따르면, 화학식 I의 화합물은 N,N-테트라이소프로필-시아노에틸 포스포르아미다이트를 추가로 포함하고, 하기 화학식 Ib의 화합물을 형성한다.
Figure 112009020898954-PCT00007
상기 측면과 관련하여, (q)는 0이 바람직하다.
B. 실질적으로 비-항원성 수용성 중합체
본원에서 설명되는 중합체 전달 시스템에 사용되는 중합체는 바람직하게는 수용성 중합체 및 실질적으로 비-항원성 폴리알킬렌 옥시드 (PAO)이다.
본 발명의 한 측면에서, 본원에서 설명되는 화합물은 선형, 말단 분지쇄 또는 다중 아암형 (multi-armed) 폴리알킬렌 옥시드를 포함한다. 일부의 바람직한 실시태양에서, 폴리알킬렌 옥시드는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다.
폴리알킬렌 옥시드의 평균 분자량은 약 2,000 내지 약 100,000 달톤, 바람직하게는 약 5,000 내지 약 60,000 달톤이다. 몇몇 측면에서, 폴리알킬렌 옥시드는 단백질 또는 올리고뉴클레오티드가 부착될 때 약 5,000 내지 약 25,000, 바람직하게는 약 12,000 내지 약 20,000 달톤 또는 별법으로 제약상 활성 화합물 (소분자)이 본원에서 설명되는 화합물에 사용될 때 약 20,000 내지 약 45,000 달톤, 바람직하게는 약 30,000 내지 약 40,000 달톤일 수 있다.
폴리알킬렌 옥시드는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다. 보다 바람직하게는, 폴리알킬렌 옥시드는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. PEG는 일반적으로 하기 화학식으로 제시된다:
-0-(CH2CH2O)n-
여기서, (n)은 약 10 내지 약 2,300의 정수이고, 다중 아암 중합체가 사용될 때 중합체 아암의 수에 따라 결정된다. 별법으로, 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 잔기는 다음 중에서 선택될 수 있다:
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2CH2Y71-,
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2C(=Y72)-Y71-,
-Y71-C(=Y72)-(CH2)a2-Y73-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a2-C(=Y72)-Y71-, 및
-Y71-(CR71R72)a2-Y73-(CH2)b2-O-(CH2CH2O)n-(CH2)b2-Y73-(CR71R72)a2-Y71-
여기서,
Y71 및 Y73은 독립적으로 O, S, SO, SO2, NR73 또는 결합이고;
Y72는 O, S, 또는 NR74이고;
R71 -74는 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -19 분지쇄 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2 -6 치환된 알키닐, C3 -8 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 아릴옥시, C1 -6 헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C2 -6 알카노일, 아릴카르보닐, C2 -6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C2 -6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C2 -6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시 및 치환된 아릴카르보닐옥시 중에서 독립적으로 선택되고;
(a2) 및 (b2)는 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게는 0 또는 약 1 내지 약 6의 정수, 보다 바람직하게는 1이고;
(n)은 약 10 내지 약 2300의 정수이다.
분지쇄 또는 U-PEG 유도체는 각각 그 개시 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,643,575호, 제5,919,455호, 제6,113,906호 및 제6,566,506호에 기재되어 있다. 상기 중합체의 비제한적인 목록은 하기 구조를 갖는 중합체 시스템 (i) - (vii)에 대응한다:
Figure 112009020898954-PCT00008
Figure 112009020898954-PCT00009
여기서,
Y61 -62는 독립적으로 O, S 또는 NR61이고;
Y63은 O, NR62, S, SO 또는 SO2이고;
(w62), (w63) 및 (w64)는 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게는 0 또는 약 1 내지 약 3의 정수이고;
(w61)은 0 또는 1이고;
mPEG는 메톡시 PEG이고, 여기서 PEG는 상기 정의된 바와 같고, 중합체 부분의 총 분자량은 약 2,000 내지 약 100,000 달톤이고;
R61 및 R62는 독립적으로 R73에 대해 사용될 수 있는 바와 동일한 모이어티이 다.
또다른 측면에서, 중합체는 다중 아암 PEG-OH 또는 "스타-PEG" 생성물, 예를 들어 그 개시 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [NOF Corp. Drug Delivery System catalog, Ver. 8, April 2006]에 기재된 것을 포함한다. 다중 아암 중합체 컨쥬게이트는 4개 이상의 중합체 아암, 바람직하게는 4 또는 8개의 중합체 아암을 포함한다.
제한하는 것이 아니라 단지 예시하기 위해, 다중 아암 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 잔기는 다음의 화합물일 수 있다:
Figure 112009020898954-PCT00010
여기서,
x는 O 및 양의 정수, 즉 약 0 내지 약 28이고;
n은 중합도이다.
본 발명의 한 특정 실시태양에서, 다중 아암 PEG는 다음과 같은 구조를 갖는다:
Figure 112009020898954-PCT00011
여기서, n은 양의 정수이다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 중합체의 총 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 60,000 Da, 바람직하게는 12,000 Da 내지 40,000 Da이다.
또다른 특정 실시태양에서, 다중 아암 PEG는 다음과 같은 구조를 갖는다:
Figure 112009020898954-PCT00012
여기서, n은 양의 정수이다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 다중 아암 중합체의 중합도 (n)는 총 분자량이 약 5,000 Da 내지 약 60,000 Da인 중합체를 제공하도록 약 28 내지 약 350이고, 바람직하게는 총 분자량이 약 12,000 Da 내지 약 45,000 Da인 중합체를 제공하도록 약 65 내지 약 270이다. 이것은 중합체 사슬 내의 반복 단위의 수를 나타내고, 중합체의 분자량에 따라 결정된다.
중합체는 미국 특허 제5,122,614호 또는 제5,808,096호에 기재된 활성화 기술을 사용하여 적합하게 활성화된 중합체로 전환될 수 있다. 구체적으로, 상기 PEG는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure 112009020898954-PCT00013
여기서,
(u')는 약 4 내지 약 455의 정수이고; 잔기의 3개 이하의 말단 부분은 메틸 또는 다른 저급 알킬로 캐핑된다.
일부의 바람직한 실시태양에서, 4개의 모든 PEG 아암은 방향족 기에 대한 부착을 용이하게 하기 위해 적합한 활성화 기로 전환될 수 있다. 전환 전의 상기 화합물은 다음을 포함한다:
Figure 112009020898954-PCT00014
Figure 112009020898954-PCT00015
본원에 포함되는 중합체 물질은 바람직하게는 실온에서 수용성이다. 상기 중합체의 비제한적인 목록은 폴리알킬렌 옥시드 단일중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화 폴리올, 그의 공중합체 및 그의 블록 공중합체 (블록 공중합체의 수용해도가 유지된다면)를 포함한다.
추가의 실시태양에서 및 PAO-기재 중합체에 대한 대안으로서, 하나 이상의 효과적인 비-항원성 물질, 예를 들어 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 탄수화물-기재 중합체, 히드록시프로필메타크릴아미드 (HPMA), 폴리알킬렌 옥시드, 및/또는 그의 공중합체를 사용할 수 있다. 또한, 공동으로 양도된, 그 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 6,153,655를 참조한다. 당업자는 PAO, 예를 들어 PEG에 대해 본원에서 설명된 바와 동일한 종류의 활성화가 사용됨을 이해할 것이다. 당업자는 또한 상기 목록이 단지 예시적인 것이고 본원에서 설명되는 품질을 갖는 모든 중합체 물질이 고려됨을 알 것이다. 본 발명의 목적을 위해, "실질적으로 또는 효과적으로 비-항원성인"은 비독성이고 포유동물에서 평가가능한 면역원 반응을 유발하지 않는 것으로 당업계에서 이해되는 모든 물질을 의미한다.
몇몇 측면에서, 말단 아민기를 갖는 중합체가 본원에서 설명되는 화합물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 말단 아민을 함유하는 중합체를 고 순도로 제조하는 방법은 각각 그 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 11/508,507 및 11/537,172에 기재되어 있다. 예를 들어, 아지드를 갖는 중합체는 포스핀-기재 환원제, 예를 들어 트리페닐포스핀 또는 알칼리 금속 보로히드라이드 환원제, 예를 들어 NaBH4와 반응한다. 별법으로, 이탈기를 포함하는 중합체는 보호된 아민염, 예를 들어 메틸-tert-부틸 이미도디카르보네이트의 칼륨염 (KNMeBoc) 또는 디-tert-부틸 이미도디카르보네이트의 칼륨염 (KNBoc2)과 반응한 후, 보호된 아민기를 탈보 호시킨다. 상기 과정에 의해 형성된 말단 아민을 함유하는 중합체의 순도는 약 95% 초과, 바람직하게는 99% 초과이다.
다른 측면에서, 말단 카르복실산기를 갖는 중합체가 본원에서 설명되는 중합체 전달 시스템에 사용될 수 있다. 말단 카르복실산을 갖는 중합체를 고 순도로 제조하는 방법은 그 개시 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 11/328,662에 기재되어 있다. 이 방법은 먼저 폴리알킬렌 옥시드의 3급 알킬 에스테르의 제조, 이어서 그의 카르복실산 유도체로의 전환을 포함한다. 상기 과정에서 PAO 카르복실산을 제조하는 제1 단계는 폴리알킬렌 옥시드 카르복실산의 중간체, 예를 들어 t-부틸 에스테르의 형성을 포함한다. 이 중간체는 염기, 예를 들어 칼륨 t-부톡시드의 존재 하에 PAO를 t-부틸 할로아세테이트와 반응시켜 형성된다. 일단 t-부틸 에스테르 중간체가 형성된 후에, 폴리알킬렌 옥시드의 카르복실산 유도체는 92% 초과, 바람직하게는 97% 초과, 보다 바람직하게는 99% 초과, 가장 바람직하게는 99.5% 초과의 순도로 쉽게 제공될 수 있다.
C. 방해된 에스테르
본 발명의 목적을 위해, "방해된"은 C(=Y1) 주위의 입체적으로 복잡한 환경을 의미하거나 포함하는 것으로 이해된다. 상기 환경은 전형적으로 벌크 (bulk) 치환체, 예를 들어 시클릭 또는 분지쇄 모이어티를 포함함으로써 형성될 수 있다. 화학식 I에 따라 C(=Y1) 및 C(=Y'1)에 인접한 각각의 CR2R3 및 CR'2R'3 모이어티는 방해된 에스테르를 형성한다. R2, R'2, R3, R'3 및 R5는 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -19 분지쇄 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2 -6 치환된 알키닐, C3 -8 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 아릴옥시, C1 -6 헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C2 -6 알카노일, 아릴카르보닐, C2 -6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C2 -6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C2 -6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시 및 치환된 아릴카르보닐옥시 중에서 선택될 수 있다. R2와 R3 (R'2와 R'3) 둘 모두가 동시에 H가 아니라면, R2 및 R3 (R'2 및 R'3)에 대해 본원에서 설명된 가능한 임의의 기가 사용될 수 있다. R2 및 R3 (R'2 및 R'3) 중의 하나가 H일 경우, 다른 하나는 적어도 3개의 탄화수소를 함유한다.
하나의 바람직한 실시태양에서, R2, R'2, R3 및 R'3은 메틸, 에틸 및 이소프로필을 포함한다.
다른 실시태양에서, R2는 R3과 함께 및 R'2는 R'3과 함께 적어도 3개의 탄소를 함유하는 치환된 또는 비치환된 비-방향족 시클로히드로카본을 형성할 수 있다.
D. 스페이서 : L 1 및 L' 1
본 발명의 다른 측면에서, CR2R3 및 CR'2R'3 모이어티에 연결된 L1 및 L'1 스 페이서의 자유 전자쌍은 분자내 이웃 (enchimeric) 효과를 제공한다. 임의의 이론에 기초하지는 않지만, C(=Y1)로부터 4 내지 10개의 원자에 위치한 자유 전자쌍은 본원에서 설명되는 중합체 전달 시스템으로부터 생물학적 활성 모이어티, 표적기 및 진단제의 방출 속도를 촉진 (변형)시킨다.
하나의 바람직한 실시태양에서, L1 및 L'1 스페이서는 다음 중에서 선택될 수 있다:
-NR11(CR12R13)s-,
-S(CR12R13)s-,
-0(CR12R13)s-,
-[C(=O)]r(CR12R13)s-,
-NR11(CR12R13)sO(CR14R15)s'-,
-NR11(CR12R13)sS(CR14R15)s'-,
-NR11(CR12R13)sNR16(CR14R15)s'-,
-NR11(CR12R13O)s(CR14R15)s'-,
-0(CR12R13)sO(CR14R15)s'-,
-0(CR12R13)sS(CR14R15)s'-,
-O(CR12R13)sNR16(CR14R15)s'-,
-0(CR12R13O)s(CR14R15)s'-
여기서,
R11-R16은 수소, 아미노, 치환된 아미노, 아지도, 카르복시, 시아노, 할로, 히드록실, 니트로, 실릴 에테르, 술포닐, 머캅토, C1 -6 알킬머캅토, 아릴머캅토, 치환된 아릴머캅토, 치환된 C1 -6 알킬티오, C1 - 6알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -19 분지쇄 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2 -6 치환된 알키닐, C3 -8 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 아릴옥시, C1 -6 헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C2 -6 알카노일, 아릴카르보닐, C2 -6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C2 -6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C2 -6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시, 치환된 및 아릴카르보닐옥시 중에서 독립적으로 선택되고;
(s) 및 (s')는 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게는 약 1 내지 약 4이고;
(r)은 O 또는 1이다.
별법으로, L1 및 L'1 기는 다음 중에서 선택될 수 있다:
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-, -C(=O)-(CH2)p-, -NH-(CH2)p-,
-S-(CH2)p-,
-NH-(CH2)P-O-CH2- 및
-NH-C(=O)-(CH2)p-NH-C(=O)-(CH2)q-
여기서,
(p)는 약 1 내지 약 12, 바람직하게는 약 1 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 5의 정수이고;
(q)는 독립적으로 양의 정수, 바람직하게는 약 1 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 4이다.
L1 및 L'1은 바람직하게는 -(CH2)x21- 또는 -(CH2)x21-W-(CH2)x22-를 포함하고, 여기서 (x21) 및 (x22)는 1 내지 7의 정수이고, W는 O 또는 NH이다.
또다른 바람직한 실시태양에서, L1 -2 및 L'1 -2 스페이서의 자유 전자쌍은 C(=Y1) 및 C(=Y'1)로부터 4 내지 8개의 원자에 위치한다. 보다 바람직하게는, 전자쌍은 C(=Y1) 및 C(=Y'1)로부터 4 내지 5개의 원자에 위치한다.
바람직한 측면에 따른 바람직한 실시태양은 -L1-C(R2)(R3)-C(=Y1)- 및 -L'1-C(R'2)(R'3)-C(=Y'1)이고, 다음을 포함한다:
Figure 112009020898954-PCT00016
다른 측면에서, 본원에서 설명되는 중합체 전달 시스템은 R2가 H일 때 R3이 적어도 3개의 탄소를 갖는 치환된 또는 비치환된 탄화수소이고, L1은 C(R2)(R3)과 동일하지 않은 화합물을 포함한다.
E. 2관능성 링커
본원에서 설명되는 화합물은 2관능성 링커를 포함할 수 있다. 2관능성 링커는 아미노산 또는 아미노산 유도체를 포함한다. 아미노산은 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산일 수 있다. 자연 발생 아미노산의 유도체 및 유사체, 및 당업계에 공지된 다양한 비-자연 발생 아미노산 (D 또는 L), 소수성 또는 비-소수성 아미노산도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 고려된다. 비-자연 발생 아미노산의 적합한 비제한적인 목록은 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 베타-아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 피페리딘 산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 2,4-아미노부티르산, 데스모신, 2,2-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피 온산, N-에틸글라이신, N-에틸아스파라긴, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸글라이신, 사르코신, N-메틸-이소류신, 6-N-메틸-라이신, N-메틸발린, 노르발린, 노르류신, 및 오르니틴을 포함한다. 몇몇 바람직한 아미노산 잔기는 글라이신, 알라닌, 메티오닌 및 사르코신으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 글라이신이다.
별법으로, L2 및 L'2는 다음 중에서 선택될 수 있다:
-[C(=O)]v(CR22R23)t[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]v(CR22R23)t-O[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]v(CR22R23)t-NR26[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vO(CR22R23)t[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vO(CR22R23)tO[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vO(CR22R23)tNR26[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)t[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)tO[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)tNR26[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]v(CR22R23)tO-(CR28R29)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]v(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]v(CR22R23)tS-(CR28R29)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vO(CR22R23)tO-(CR28R29)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vO(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vO(CR22R23)tS-(CR28R29)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)tO-(CR28R29)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)tS-(CR28R29)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]v(CR22R23CR28R29O)tNR26[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]v(CR22R23CR28R29O)t[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vO(CR22R23CR28R29O)tNR26[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vO(CR22R23CR28R29O)t[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)tNR26[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]v(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vO(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]v(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t'NR26[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vO(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t'O[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vO(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vO(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t'NR26[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t'O[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t'[C(=O)]v'-,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t'NR26[C(=O)]v'-,
Figure 112009020898954-PCT00017
여기서,
R21 -29는 수소, C1 -6 알킬, C3 -12 분지쇄 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C3 -8 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1-6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 페녹시 및 C1 -6 헤테로알콕시로부터 독립적으로 선택되고;
(t) 및 (t')는 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게는 0 또는 약 1 내지 약 12의 정수, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 8의 정수, 가장 바람직하게는 1 또는 2이고;
(v) 및 (v')는 독립적으로 0 또는 1이다.
바람직한 실시태양에서, L2 및 L'2는 다음 중에서 선택될 수 있다:
-[C(=O)]rNH(CH2)2CH=N-NHC(=O)-(CH2)2-,
-[C(=O)]rNH(CH2)2(CH2CH2O)2(CH2)2NH[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2)(CH2CH2O)2NH[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2)sNH(CH2CH2)s'[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2)sS(CH2CH2)s'[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2)(CH2CH2O)[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2)sO(CH2CH2)s'[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2O)(CH2)NH[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rNH(CH2CH20)2(CH2)[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2O)s(CH2)s'[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rNHCH2CH2NH[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2)2O[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rNH(CH2CH20)[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2O)2[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rNH(CH2)3[C(=O)]r'-
-[C(=O)]rO(CH2CH2O)2(CH2)[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rO(CH2)2NH(CH2)2[C(=0)]r'-,
-[C(=O)]rO(CH2CH2O)2NH[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rO(CH2)2O(CH2)2[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rO(CH2)2S(CH2)2[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rO(CH2CH2)NH[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rO(CH2CH2)O[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rO(CH2)3NH[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rO(CH2)3O[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rO(CH2)3[C(=0)]r'-,
-[C(=O)]rCH2NHCH2[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rCH2OCH2[C(=O)]r',
-[C(=O)]rCH2SCH2[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]rS(CH2)3[C(=O)]r'-,
-[C(=O)]r(CH2)3[C(=O)]r'-,
Figure 112009020898954-PCT00018
여기서,
(r) 및 (r')는 독립적으로 0 또는 1이다.
또 다른 실시태양에서, 2관능성 링커는 다음을 포함한다:
Figure 112009020898954-PCT00019
Figure 112009020898954-PCT00020
-Val-Cit-,
-Gly-Phe-Leu-Gly-,
-Ala-Leu-Ala-Leu-,
-Phe-Lys-,
Figure 112009020898954-PCT00021
-Val-Cit-C(=O)-CH2OCH2-C(=O)-,
-Val-Cit-C(=0)-CH2SCH2-C(=O)-, 및
-NHCH(CH3)-C(=O)-NH(CH2)6-C(CH3)2-C(=O)-
여기서,
Y11 -19는 독립적으로 O, S 또는 NR48이고;
R31 -48, R50 -51 및 A51은 수소, C1 -6 알킬, C3 -12 분지쇄 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1-6 치환된 알킬, C3 -8 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 페녹시 및 C1 -6 헤테로알콕시로 이루어지는 군 중에서 독립적으로 선택되고;
Ar은 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티이고;
L11 -15는 독립적으로 선택되는 2관능성 스페이서이고;
J3 및 J'3은 표적 세포 내로 능동 수송되는 모이어티, 소수성 모이어티, 2관능성 연결 모이어티 및 이들의 조합물로부터 독립적으로 선택되고;
(c11), (h11), (k11), (l11), (m11) 및 (n11)은 독립적으로 선택되는 양의 정수이고;
(a11), (e11), (g11), (j11), (o11) 및 (q11)은 독립적으로 0 또는 양의 정수이고;
(b11), (x11), (x'11), (f11), (i11) 및 (p11)은 독립적으로 0 또는 1이다.
F. R 4 및 R' 4 기
1. 이탈기
본 발명의 목적을 위해, 이탈기는 목적하는 표적, 즉 올리고뉴클레오티드, 2관능성 스페이서, 중간체 등에서 발견되는 친핵체와 반응할 수 있는 기로서 이해되어야 한다. 따라서, 표적은 치환을 위한 기, 예를 들어 올리고뉴클레오티드에서 발견되는 OH 또는 SH 기를 함유한다.
방해된 에스테르에 부착된 이탈기는 선택되는 생물학적 활성 모이어티, 즉 제약상 활성 화합물 (저분자량 화합물), 올리고뉴클레오티드 등에 대한 공유 반응을 허용한다. 적합한 이탈기는 할로겐 (Br, Cl), 활성화된 에스테르, 시클릭 이미드 티온, N-히드록시숙신이미딜, N-히드록시프탈이미딜, N-히드록시벤조트리아졸릴, 이미다졸, 토실레이트, 메실레이트, 트레실레이트, 노실레이트, C1-C6 알킬옥 시, C1-C6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, 오르토-니트로페녹시, 파라-니트로페녹시, 펜타플루오로페녹시, 1,3,5-트리클로로페녹시, 및 1,3,5-트리플루오로페녹시 또는 당업자에게 자명한 다른 적합한 이탈기를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 이탈기는 OH, 메톡시, tert-부톡시, 파라-니트로페녹시 및 N-히드록시숙신이미딜로부터 선택될 수 있다.
2. 폴리뉴클레오티드 모이어티
본 발명의 범위를 보다 충분히 이해하기 위해서, 하기 용어가 규정된다. 기술자는 용어 "핵산" 또는 "뉴클레오티드"가 달리 특정되지 않으면 단일가닥 또는 이중가닥의 데옥시리보핵산 ("DNA"), 리보핵산 ("RNA) 및 그의 임의의 화학적 변형체에 적용됨을 이해할 것이다. "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 예를 들어 길이가 약 2 내지 약 200개 뉴클레오티드, 또는 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오티드인 비교적 짧은 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 달리 특정되지 않으면 일반적으로 합성 핵산이고, 단일가닥이다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "폴리핵산"은 또한 본원에서 동의어로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "안티센스"는 유전자 산물을 코딩하거나 조절 서열을 코딩하는 특정 DNA 또는 RNA 서열에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 용어 "안티센스 가닥"은 "센스" 가닥에 상보성인 핵산 가닥에 관하여 사용된다. 세포 대사의 정상적인 작동시에, DNA 분자의 센스 가닥은 폴리펩티드 및/또는 다른 유전자 산물을 코딩하는 가닥이다. 센스 가닥은 메신저 RNA ("mRNA") 전사체 (안티센스 가닥)의 합성을 위한 주형으로 기능하고, 전사체는 임의의 코딩되는 유전자 산물의 합성을 유도한다. 안티센스 핵산 분자는 목적하는 유전자(들)을 상보성 가닥의 합성을 허용하는 바이러스 프로모터에 역배향으로 라이게이션시켜 합성하는 것을 포함하는, 임의의 당업계에 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 일단 세포 내로 도입된 후에, 상기 전사된 가닥은 세포에 의해 생산된 천연 서열과 조합되어 이중체를 형성한다. 이어서, 상기 이중체는 추가의 전사 또는 번역을 차단한다. 이러한 방식으로, 돌연변이체 표현형이 생성될 수 있다. "음성" 또는 (-)도 안티센스 가닥을 나타내는 것으로 당업계에 공지되어 있고, "양성" 또는 (+)도 센스 가닥을 나타내는 것으로 당업계에 공지되어 있다.
예를 들어, 세포 또는 세포들에서 mRNA 전사체의 발현을 하향조절하고자 할 때, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포 내에 도입한다. 세포 내로 도입된 후, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 와슨-크릭 (Watson-Crick) 결합을 통해 대응하는 mRNA 서열에 혼성화하여 이종이중체를 형성한다. 이중체가 형성되면, 결합된 mRNA의 서열에 의해 코딩되는 단백질의 번역이 억제된다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 태그 또는 표지에 연결된 프로브, 예를 들어, 혼성화 프로브로서 당업계에서 사용되고, 또한 조사 및 치료 목적 모두를 위해 특정 세포 생성물 또는 유전자 조절 성분의 발현의 정밀한 하향조절을 제공하기 위해 사용되고 있다.
매우 다양한 폴리뉴클레오티드 모이어티가 본원에서 설명되는 활성화된 중합 체에 부착될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 그 치료가 요구되는 병태에 대한 동물, 예를 들어, 인간을 포함하는 포유동물의 치료시에 의료 또는 진단 용도로 적합하다.
또다른 측면에서, 히드록실- 또는 티올-함유 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 범위에 포함된다. 본원에 포함시키기 적합한 생물학적 활성 모이어티의 종류에 대한 유일한 제한은 캐리어 부분과 반응하여 연결시킬 수 있는 적어도 하나의 히드록실- 또는 티올-기가 이용가능하고, 본원에서 설명되는 중합체 전달 시스템에 컨쥬게이팅된 형태에서 생활성이 실질적으로 상실되지 않는다는 점이다.
별법으로, 본 발명의 중합체 수송 컨쥬게이트 화합물 내에 도입하기 적합한 모 화합물은 연결된 화합물로부터 가수분해에 의한 방출 후에 활성을 보일 수 있거나, 또는 가수분해에 의한 방출 후에 활성을 보이지 않지만 추가의 화학적 과정/반응을 거친 후에 활성을 보일 것이다. 예를 들어, 중합체 수송 시스템에 의해 혈류로 전달되는 항암제는 암 또는 종양 세포에 도입될 때까지 불활성 상태로 유지될 수 있고, 도입된 후에 암 또는 종양 세포 화학에 의해, 예를 들어 그 세포에 특유한 효소 반응에 의해 활성화된다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드가 컨쥬게이션을 위해 선택되고, 컨쥬게이션 후에, 표적은 올리고뉴클레오티드의 잔기로서 언급된다. 올리고뉴클레오티드는 임의의 포스포로디에스테르 백본 또는 포스포로티오에이트 백본을 갖는 공지의 올리고뉴클레오티드 및 올리고데옥시뉴클레오티드, 잠금 (locked) 핵산 (LNA), 펩티드 백본을 갖는 핵산 (PNA), 트리시클로-DNA, 이중가닥 올리고뉴클레오티드 (데코이 (decoy) ODN), 촉매 활성의 RNA 서열 (RNAi), 리보자임, 스피겔머 (spiegelmer), 및 CpG 올리고머 중에서 선택될 수 있다. 당업자는 상기 목록이 단지 예시적인 것으로서, 모든 핵산 물질이 고려됨을 이해할 것이다.
바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 2 내지 100 올리고머 올리고뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 3 내지 50 올리고머, 가장 바람직하게는 10 내지 30 올리고머를 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 모든 다른 적합한 크기도 고려된다.
본원에서 설명되는 화합물의 폴리뉴클레오티드는 포스포로디에스테르 백본 또는 포스포로티오에이트 백본을 포함하는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. "폴리뉴클레오티드" (또는 "올리고뉴클레오티드")는 올리고뉴클레오티드 및 올리고데옥시뉴클레오티드, 예를 들어 게나센스 (Genasense) (겐타 인크. (Genta Inc., 미국 뉴저지주 버클리 하이츠)에서 생산한 a/k/a 오블리머센 (oblimersen) 나트륨)가 갖는 것과 동일하거나 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 게나센스는 18-mer 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드, 즉 TCTCCCAGCGTGCGCCAT (서열 4)이고, 이것은 인간 bcl-2 mRNA의 개시 서열의 처음 6개의 코돈에 상보성이다 (인간 bcl-2 mRNA는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 본원에 참고로 포함된 미국 특허 6,414,134에 서열 19로 기재되어 있다). 미국 식품 의약국 (U.S. Food and Drug Administration; FDA)은 2000년 8월에 게나센스에 고아약 (Orphan Drug) 지위를 부여하였다.
또한, 본 발명에 따라 유용한 올리고뉴클레오티드 및 올리고데옥시뉴클레오 티드는 다음을 포함하고, 이로 제한되지 않는다:
천연 포스포로디에스테르 백본 또는 포스포로티오에이트 백본 또는 임의의 다른 변형된 백본 유사체를 갖는 올리고뉴클레오티드 및 올리고데옥시뉴클레오티드;
LNA (잠금 핵산);
PNA (펩티드 백본을 갖는 핵산);
트리시클로-DNA;
데코이 ODN (이중가닥 올리고뉴클레오티드);
촉매 활성의 RNA 서열;
리보자임;
스피겔머 (L-입체형태 올리고뉴클레오티드);
CpG 올리고머 등, 예를 들어 그 개시 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Tides 2002, Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences, May 6-8, 2002, Las Vegas, NV] 및 [Oligonucleotide & Peptide Technologies, 18th & 19th November 2003, Hamburg, Germany]에 개시된 것.
또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 임의로 하기 표 1에 나열된 것을 포함하여, 당업계에 공지된 임의의 적합한 뉴클레오티드 유사체 및 유도체를 포함할 수 있다.
대표적인 뉴클레오티드 유사체 및 유도체
4-아세틸시티딘 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘
5-(카르복시히드록시메틸)우리딘 베타, D-만노실퀘우오신
2'-O-메틸시티딘 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우리딘
5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘 5-메톡시카르보닐메틸우리딘
5-카르복시메틸아미노메틸우리딘 5-메톡시우리딘
디히드로우리딘 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신
2'-O-메틸슈도우리딘 N-((9-베타-D-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카르바모일)트레오닌
D-갈락토실퀘우오신 N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)N-메틸카르바모일)트레오닌
2'-O-메틸구아노신 우리딘-5-옥시아세트산-메틸에스테르
이노신 우리딘-5-옥시아세트산
N6-이소펜테닐아데노신 와이부톡소신
1-메틸아데노신 슈도우리딘
1-메틸슈도우리딘 퀘우오신
1-메틸구아노신 2-티오시티딘
1-메틸이노신 5-메틸-2-티오우리딘
2,2-디메틸구아노신 2-티오우리딘
2-메틸아데노신 4-티오우리딘
2-메틸구아노신 5-메틸우리딘
3-메틸시티딘 N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)-카르바모일)트레오닌
5-메틸시티딘 2'-O-메틸-5-메틸우리딘
N6-메틸아데노신 2'-O-메틸우리딘
7-메틸구아노신 와이부토신
5-메틸아미노메틸우리딘 3-(3-아미노-3-카르복시-프로필)우리딘
잠금 아데노신 잠금 시티딘
잠금 구아노신 잠금 티민
잠금 우리딘 잠금 -메틸시티딘
본 발명에서 고려되는 올리고뉴클레오티드에 대한 변형은 예를 들어 바람직한 중합체에 대한 올리고뉴클레오티드의 공유 연결을 허용하는 관능기 또는 모이어티를 사용한 선택 뉴클레오티드의 부가 또는 치환, 및/또는 올리고뉴클레오티드에 추가의 전하, 분극성, 수소 결합, 정전기 상호작용, 및 관능기를 도입시키는 기능성 모이어티의 부가 또는 치환을 포함한다. 상기 변형은 2'-위치 당 변형, 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 퓨린 변형, 고리 외부 (exocyclic) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모 또는 5-요오도우라실의 치환, 백본 변형, 메틸화, 염기쌍 조합, 예를 들어 이소염기 (isobase) 이소시티딘 및 이소구아니딘, 및 유사한 조합을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 올리고뉴클레오티드 변형은 3' 및 5' 변형, 예를 들어 캐핑을 포함할 수 있다. 예시적인 뉴클레오시드 유사체의 구조를 아래에 제시한다.
Figure 112009020898954-PCT00022
각각 그 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443] 및 [Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213]에 기재된 뉴클레오시드 유사체의 보다 많은 예를 참고한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 및 관련 화합물이 방해된 에스테르를 함유하는 중합체의 부착을 위한 바람직한 표적으로서 언급되었지만, R4 또는 R'4가 PEG 또는 중합체 부착으로부터 이익을 얻는 것으로 알려진 모든 폴리뉴클레오티드를 포함함이 의도된다.
바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 표적화된 종양 세포 또는 항암제에 대한 종양 세포의 내성에 관련되는 단백질의 하향조절에 관련된다. 예를 들어, 임의의 당업계에 공지된 세포성 단백질, 예를 들어 암 치료를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 하향조절을 위한 BCL-2가 본 발명에 사용될 수 있다. 그 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 10/822,205 (2004년 4월 9일 출원)를 참조한다. 바람직한 치료 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 목록은 안티센스 HIF-1a 올리고뉴클레오티드 및 안티센스 서비빈 (Survivin) 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
바람직한 실시태양은 다음을 포함한다:
(i) 안티센스 서비빈 LNA (서열 1)
mCs-Ts-mCs-As-as-ts-cs-cs-as-ts-gs-gs-mCs-As-Gs-c;
여기서, 대문자는 LNA이고, "s"는 포스포로티오에이트 백본이다;
(ii) 안티센스 Bcl2 siRNA:
센스 5' - GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT - 3' (서열 2)
안티센스 3' - dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU - 5' (서열 3)
여기서, dT는 DNA이다;
(iii) 게나센스 (포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드): (서열 4)
ts-cs-ts-cs-cs-cs-as-gs-cs-gs-ts-gs-cs-gs-cs-cs-cs-as-t
여기서, 소문자는 DNA이고, "s"는 포스포로티오에이트 백본이다;
(iv) 안티센스 HIF 1α LNA
5'-sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3' (서열 5)
여기서, 대문자는 LNA이고, "s"는 포스포로티오에이트 백본이다.
LNA는 아래 제시된 2'-O, 4'-C 메틸렌 비시클로뉴클레오티드를 포함한다:
Figure 112009020898954-PCT00023
각각 그 개시 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 11/272,124 (명칭; "LNA Oligonucleotides and the Treatmemt of Cancer") 및 10/776,934 (명칭: "Oligomeric Compounds for the Modulation Survivin Expression")에 개시된 서비빈 LNA의 상세한 설명을 참고한다. 또한, 그 개시 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 10/407,807 (명칭: "Oligomeric Compounds for the Modulation HIF-1 Alpha Expression") 및 11/271,686 (명칭: "Potent LNA Oligonucleotides for Inhibition of HIF-1A Expression")을 참고한다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 본원에서 설명되는 화합물은 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에서 방해된 에스테르-함유 (CH2)W 아미노 링커로 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 여기서 w는 바람직하게는 약 1 내지 약 10의 양의 정수, 바람직하게는 약 6이다. 중합체 화합물은 아미노 테일 (tail)이 없는 올리고뉴클레오티드를 방출할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112009020898954-PCT00024
여기서, w는 약 1 내지 약 10의 양의 정수, 바람직하게는 약 6이다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 (CH2)W 술프히드릴 링커 (티오 올리고뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 티오 올리고뉴클레오티드는 양 하전 펩티드의 시스테인에 직접 또는 말레이미딜기를 통해 컨쥬게이팅시키기 위해 사용될 수 있다. 티오 올리고뉴클레오티드는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112009020898954-PCT00025
본 발명의 추가의 측면은 임의로 본원에서 설명되는 중합체 전달 시스템에 연결된 진단 태그로 제조된 컨쥬게이트 화합물을 제공하고, 상기 태그는 진단 또는 영상화를 위해 선택된다. 따라서, 적합한 태그는 수술 과정 등의 동안에 종양 조직을 영상화할 수 있도록 임의의 적합한 모이어티, 예를 들어, 아미노산 잔기를 임의의 기술 표준물 방출 동위원소, 방사선 비투과 표지, 자기 공명 표지, 또는 자기 공명 영상화에 적합한 다른 비-방사성 동위원소 표지, 형광-타입 표지, 가시적인 색상을 보이고/보이거나 자외선, 적외선 또는 전기화학적 자극 하에서 형광을 낼 수 있는 표지에 연결시켜 제조한다. 임의로, 진단 태그는 동물 또는 인간 환자 내에서 생물학적 활성의 치료 물질의 분포를 모니터링하기 위해 컨쥬게이팅된 치료 모이어티에 통합되고/되거나 연결된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명의 태깅된 (tagged) 컨쥬게이트는 임의의 적합한 표지, 예를 들어, 방사성 동위원소 표지를 사용하여 당업계에 공지된 방법에 의해 쉽게 제조된다. 예를 들어, 이들은 생체 내에서 종양 세포 내로의 선택적인 흡수를 위해 방사선 면역섬광사진술제 (radioimmunoscintigraphic agent)를 생성시키기 위한 131요오드, 125요오드, 99m테크네튬 및/또는 111인듐을 포함한다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,328,679; 5,888,474; 5,997,844; 및 5,997,845에 제시된 것을 포함하여 펩티드를 Tc-99m에 연결하는, 많은 당업계에 공지된 방법이 존재한다.
F. 화학식 I에 대응하는 바람직한 실시태양
화학식 I에 따른 화합물은 실질적으로 비항원성인 중합체, 예를 들어 폴리알킬렌 옥시드에 공유 컨쥬게이팅된다. 특정한 바람직한 실시태양에서, 화학식 I에 따른 화합물은 다음을 포함한다:
Figure 112009020898954-PCT00026
Figure 112009020898954-PCT00027
Figure 112009020898954-PCT00028
Figure 112009020898954-PCT00029
Figure 112009020898954-PCT00030
여기서,
R4는 센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 잠금 핵산 (LNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 앱타머, 펩티드 핵산 (PNA), 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 (PMO), 트리시클로-DNA, 이중가닥 올리고뉴클레오티드 (데코이 ODN), 촉매 활성의 RNA (RNAi), 앱타머, 스피겔머, CpG 올리고머 및 이들의 조합물 중에서 선택되고;
(z)는 약 1 내지 약 10의 양의 정수이고;
(z')는 0 또는 약 1 내지 약 4의 양의 정수이고;
mPEG은 화학식 CH3-O(CH2CH2O)n-로 표시되고;
PEG는 화학식 -0(CH2CH2O)n-로 표시되고;
(n)은 약 10 내지 약 2,300의 양의 정수이다.
본 발명에 따른 바람직한 중합체 화합물은 다음을 포함한다:
Figure 112009020898954-PCT00031
R4=(서열 4)
R4에 대한 바람직한 실시태양은 다음을 포함한다:
(i) 안티센스 서비빈 LNA (서열 1)
mCs-Ts-mCs-As-as-ts-cs-cs-as-ts-gs-gs-mCs-As-Gs-c;
여기서, 대문자는 LNA이고, "s"는 포스포로티오에이트 백본이다;
(ii) 안티센스 Bcl2 siRNA:
센스 5' - GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT - 3' (서열 2)
안티센스 3' - dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU - 5' (서열 3)
여기서, dT는 DNA이다;
(iii) 게나센스 (포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드): (서열 4)
ts-cs-ts-cs-cs-cs-as-gs-cs-gs-ts-gs-cs-gs-cs-cs-cs-as-t
여기서, 소문자는 DNA이고, "s"는 포스포로티오에이트 백본이다;
(iv) 안티센스 HIF1α LNA (서열 5)
5'-sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3'
여기서, 대문자는 LNA이고, "s"는 포스포로티오에이트 백본이다.
본 발명의 목적을 위해, 게나센스 (서열 4)는 TCTCCCAGCGTGCGCCAT 또는 5'-tscstscscscsasgscsgstsgscsgscscsast-3'로서 설명된다.
G. 컨쥬게이트의 제조 방법
본 발명의 한 측면에서, 방해된 에스테르를 갖는 중합체 화합물은 말단 종결부에 OH 또는 이탈기를 갖는 중합체 화합물을 먼 말단에 보호된 방해된 에스테르 또는 방해된 산을 갖는 친핵체와 컨쥬게이팅시켜 제조할 수 있다. 생성되는 중합체 화합물의 추가의 탈보호 및 활성화가 본 발명의 화합물을 제공할 것이다. 본 발명의 말단기는 OH 또는 SH 함유 모이어티와 커플링되기 쉬운 카르복실산 형태 또는 OH 또는 SH 함유 모이어티와 컨쥬게이팅될 때 대체될 수 있는 활성화된 형태일 수 있다.
별법으로, OH 또는 SH 함유 화합물은 컨쥬게이팅되어 방해된 에스테르 중간체를 형성하고, 이것은 다시 활성화된 중합체와 반응하여 생물학적 활성 모이어티를 갖는, 방해된 에스테르를 갖는 중합체 컨쥬게이트를 생성시킬 수 있다.
예시를 위해, 방해된 아실 또는 에스테르 모이어티-함유 중합체 컨쥬게이트를 제조하는 방법은 하기 화학식 III의 화합물을 하기 화학식 V의 화합물의 형성에 충분한 조건 하에서 하기 화학식 IV의 화합물과 반응시키는 것을 포함할 수 있다.
A1-R1-M1
Figure 112009020898954-PCT00032
Figure 112009020898954-PCT00033
여기서,
A1은 캐핑기 또는 M1이고;
A2는 캐핑기 또는
Figure 112009020898954-PCT00034
이고,
M1은 이탈기, 예를 들어 할로겐, 활성화된 카르보네이트, 이소시아네이트, N-히드록시숙신이미딜, 토실레이트, 메실레이트, 트레실레이트, 노실레이트, 오르토-니트로페녹시, 이미다졸 및 당업자에게 공지된 다른 이탈기이고;
M2는 -OH, -SH, 또는 -NHR101이고;
R100은 OH 또는 OR101이고; 여기서, R101은 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -19 분지쇄 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2-6 치환된 알키닐, C3 -8 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 아릴옥시, C1 -6 헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C2 -6 알카노일, 아릴카르보닐, C2 -6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C2 -6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C2 -6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시 및 치환된 아릴카르보닐옥시 중에서 선택되고;
모든 다른 변수는 위에서 정의된 바와 같다.
화학식 IV에 따른 방해된 에스테르 모이어티의 PEG 또는 다른 중합체에 대한 부착은 당업자에게 공지된 표준 화학 합성 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 활성화된 중합체 부분, 예를 들어 SC-PEG, PEG-아민, PEG 산 등은 시판 회사로부터 얻을 수 있거나 또는 과도한 실험을 수행하지 않으면서 당업자에 의해 합성될 수 있다.
본 발명을 위해, 상기 방해된 에스테르 모이어티의 비제한적인 목록은 다음을 포함한다:
Figure 112009020898954-PCT00035
Figure 112009020898954-PCT00036
여기서, (z)는 위에서 정의된 바와 같다.
화학식 V의 화합물은 염기 및 커플링제의 존재 하에 하기 화학식 Ia의 화합물을 형성하기에 충분한 조건 하에 -OH 또는 -SH 함유 모이어티와 추가로 반응할 수 있다:
Figure 112009020898954-PCT00037
여기서,
A3은 캐핑기 또는
Figure 112009020898954-PCT00038
이고,
R103은 표적화제, 진단제 및 생물학적 활성 모이어티 중에서 선택되고; 모든 다른 변수는 위에서 정의된 바와 같다.
본 발명을 위해, R103은 화학식 V의 화합물과의 반응 후에 유지되는, OH 또는 SH 함유 모이어티의 부분으로서 이해될 것이다.
별법으로, 본원에서 설명되는 화합물은 하기 화학식 VI의 화합물을 하기 화학식 VIII의 화합물의 형성에 충분한 조건 하에서 하기 화학식 VII의 화합물과 반응시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
Figure 112009020898954-PCT00039
A4-R1-M4
Figure 112009020898954-PCT00040
여기서,
A4는 캐핑기 또는 M4이고;
A5는 캐핑기 또는
Figure 112009020898954-PCT00041
이고,
M3은 -OH, SH, 또는 -NHR105이고;
M4는 이탈기, 예를 들어 할로겐, 활성화된 카르보네이트, 이소시아네이트, N-히드록시숙신이미딜, 토실레이트, 메실레이트, 트레실레이트, 노실레이트, 오르토-니트로페녹시, 이미다졸 및 당업자에게 공지된 다른 이탈기이고;
R104는 생물학적 활성 모이어티, 표적화 기 및 진단제로부터 선택되고;
R105는 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -19 분지쇄 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2 -6 치환된 알키닐, C3 -8 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 아릴옥시, C1 -6 헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C2 -6 알카노일, 아릴카르보닐, C2 -6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C2 -6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C2 -6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시 및 치환된 아릴카르보닐옥시 중에서 선택되고;
모든 다른 변수는 위에서 정의된 바와 같다.
방해된 에스테르 함유 기의 중합체 부분에 대한 부착은 바람직하게는 커플링제의 존재 하에 수행된다. 적합한 커플링제의 비제한적인 목록은 예를 들어 시판 회사, 예를 들어 시그마-알드리치 케미칼 (Sigma-Aldrich Chemical)로부터 입수가능하거나, 또는 공지의 기술로 합성된 1,3-디이소프로필카르보디이미드 (DIPC), 임의의 적합한 디알킬 카르보디이미드, 2-할로-1-알킬-피리디늄 할라이드, (무카이야마 (Mukaiyama) 시약), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸 카르보디이미드 (EDC), 프로판 포스폰산 시클릭 안히드라이드 (PPACA) 및 페닐 디클로로포스페이트 등을 포함한다.
바람직하게는, 반응은 불활성 용매, 예를 들어 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, DMF 또는 이들의 혼합물 중에서 수행된다. 반응은 임의의 생성되는 산을 중화시키기 위해서 바람직하게는 염기, 예를 들어 디메틸아미노피리딘 (DMAP), 디이소프로필에틸아민, 피리딘, 트리에틸아민 등의 존재 하에 수행될 수 있다. 반응은 약 0℃ 내지 약 22℃ (실온)의 온도에서 수행될 수 있다.
H. 치료 방법
본 발명의 다른 측면은 포유동물에서 다양한 질병의 치료 방법을 제공한다. 이 방법은 본원에서 설명되는 화합물의 유효량을 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 중합체 컨쥬게이트 화합물은 특히 포유동물에서 모 화합물로 치료되는 것과 유사한 질병의 치료, 예를 들어 효소 대체 요법, 신생물 질병의 치료, 종양 부하의 감소, 신생물 전이의 억제 및 종양/신생물 성장의 재발 억제에 유용하다.
투여되는 중합체 컨쥬게이트의 양은 모 분자의 양에 따라 결정될 것이다. 일반적으로, 치료 방법에 사용되는 중합체 컨쥬게이트의 양은 포유동물에서 목적하는 치료 결과를 효과적으로 달성하는 양이다. 물론, 다양한 중합체 컨쥬게이트 화합물의 투여량은 모 화합물, 중합체의 분자량, 생체내 가수분해 속도 등에 따라 다소 상이할 것이다. 당업자는 의사의 경험 및 치료 적응증을 기초로 하여 선택된 중합체 수송 컨쥬게이트의 최적 용량을 결정할 것이다. 실제 투여량은 과도한 실 험을 수행하지 않으면서 당업자가 쉽게 알 수 있을 것이다.
본 발명의 화합물은 포유동물에게 투여하기 위한 하나 이상의 적합한 제약 조성물에 포함될 수 있다. 제약 조성물은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조된용액, 현탁액, 정제, 캡슐 등의 형태일 수 있다. 또한, 상기 조성물의 투여가 당업자의 필요에 따라 경구 및/또는 비경구 경로에 의해 수행될 수 있음이 고려된다. 예를 들어 임의의 당업계에 공지된 방법에 의한, 예를 들어 정맥내, 근내, 복강내, 피하 주사 등에 의한 조성물의 주사 또는 침윤을 위한 캐리어 비히클로서 조성물의 용액 및/또는 현탁액이 이용될 수 있다. 또한, 상기 투여는 신체 공간 또는 체강 내로의 주입에 의해, 및 흡입 및/또는 비내 경로에 의해 수행될 수도 있다. 그러나, 본 발명의 바람직한 측면에서, 중합체 컨쥬게이트는 그를 필요로 하는 포유동물에게 비경구로 투여된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 폴리뉴클레오티드 (올리고뉴클레오티드), 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포유동물 세포에 투여하는 방법이 제공된다. 이 방법은 본원에서 설명되는 바와 같이 제조된 유효량의 컨쥬게이트를 치료되는 병태에 전달하는 것을 포함하고, 유효량은 상기 병태에 대한 폴리뉴클레오티드 효능에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 비컨쥬게이팅된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어 안티센스 BCL2 올리고뉴클레오티드, 안티센스 서비빈 올리고뉴클레오티드)가 특정 암 또는 신생물 세포에 대해 효능을 가질 경우, 이 방법은 올리고뉴클레오티드를 함유하는 중합체 컨쥬게이트를 천연 올리고뉴클레오티드에 감수성인 세포에 전달하는 것을 포함할 것이다. 생체 내에서 적합한 제약 조성물의 일부로서 또는 생체외 환경에서 세포에 직접 전달될 수 있다. 한 특정 치료에서, 올리고뉴클레오티드 (서열 1, 서열 2 및 3, 및 서열 4)을 포함하는 중합체 컨쥬게이트가 사용될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명에 대한 추가의 이해를 제공하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것이 아니다. 실시예에서 언급되는 볼드체의 숫자는 도 1-4에 제시된 것에 대응한다. 다음과 같은 약어가 실시예 전반에 걸쳐 사용된다: DCM (디클로로메탄), DIPEA (디이소프로필에틸아민), DMAP (4-디메틸아미노피리딘), DMF (N,N'-디메틸포름아미드), EDC (1-(3-디메틸아미노-프로필)-3-에틸 카르보디이미드), IPA (이소프로판올), Mmt (4-메톡시트리페닐메틸), NHS (N-히드록시숙신이미드), PEG (폴리에틸렌 글리콜), SCA-SH (단일쇄 항체), SC-PEG (숙신이미딜 카르보네이트 폴리에틸렌 글리콜), TEAA (테트라에틸암모늄 아세테이트), TFA (트리플루오로아세트산), 및 THF (테트라히드로푸란).
일반적인 절차. 모든 반응은 무수 질소 또는 아르곤의 분위기 하에서 진행된다. 시판되는 시약을 추가의 정제 없이 사용한다. 모든 PEG 화합물은 사용 전에 진공 하에 또는 톨루엔으로부터의 공비 증류에 의해 건조된다. 13C NMR 스펙트럼은 달리 나타내지 않으면 Varian Mercury(등록상표) 300 NMR 분광계 및 용매로서 중수소화 클로로포름 및 피리딘을 사용하여 75.46 MHz에서 얻었다. 화학적 이동 (δ)은 테트라메틸실란 (TMS)의 낮은 장 (downfield)에 ppm으로 기록한다.
HPLC 방법. 중간체 및 최종 생성물의 반응 혼합물 및 순도는 Beckman Coulter System Gold(등록상표) HPLC 기기로 모니터링한다. 이는 1 mL/min의 유속으로 0.05 M 테트라에틸암모늄 아세테이트 (TFAA) 중의 아세토니트릴의 5-80%의 구배를 사용하여, ZORBAX(등록상표) 300SB C8 역상 컬럼 (150 x 4.6 mm) 또는 168 Diode Array UV 검출기가 구비된 Phenomenex Jupiter(등록상표) 300A C18 역상 컬럼 (150 x 4.6 mm)을 이용한다.
실시예 1. Br - HE - OEt , 화합물 (3)의 제조
부틸리튬 (t-BuOH 중의 1.6 M 용액, 200 mL)을 THF (500 mL) 중의 에틸 이소부티레이트 (화합물 1, 35 g)의 용액에 -78℃에서 첨가하고, 용액을 1시간 동안 동일한 온도에서 교반하였다. 1,5-디브로모펜탄 (화합물 7, 100 g)을 첨가하고, 혼합물을 실온 이하로 가온하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 수성 중탄산나트륨 (500 mL)에 부었다. 유기층을 증발시켰다. 잔기를 실리카 겔 컬럼으로 정제하고, 헥산 중의 10% 에틸 아세테이트로 용출시켜 목적하는 생성물을 액체 (29.2 g, 수율 36.7%)로서 수득하였다.
실시예 2. N 3 - HE - OEt , 화합물 (4)의 제조
에틸 7-브로모-2,2-디메틸헵타노에이트 (화합물 3, 26.5 g)를 DMF (500 mL) 중의 아지드화나트륨 (13 g)과 함께 100℃에서 2시간 동안 가열하였다. 혼합물을 농축하고, 잔사를 실리카 겔 컬럼으로 정제하고, 헥산 중의 10% 에틸 아세테이트로 용출시켜 목적하는 생성물을 액체 (20.5 g, 수율 90.3%)로서 수득하였다.
실시예 3. N 3 - HE - OH , 화합물 (5)의 제조
에틸 7-아지도-2,2-디메틸헵타노에이트 (화합물 4, 20.5 g)를 에탄올 (500 mL) 중의 수산화나트륨 (10 g, 85%)과 함께 환류 하에서 2시간 동안 가열하였다. 혼합물을 농축하고, 물 (400 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 진한 염산으로 pH 2로 산성화시키고, 에틸 아세테이트 (500 mL)로 추출하였다. 유기층을 농축하고, 잔사를 실리카 겔 컬럼으로 정제하고, 헥산 중의 50% 에틸 아세테이트로 추출하여 목적하는 생성물을 액체 (17,1 g, 수율 95%)로서 수득하였다.
실시예 4. N 3 - HE -T, 화합물 (7)의 제조
7-아지도-2,2-디메틸헵탄산 (화합물 5, 8 g)을 디클로로메탄 (200 mL)에 용해시켰다. 옥살릴 클로라이드 (6.4 g)를 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 재환류시키고 증발시켰다. 잔사를 디클로로메탄 (100 mL)에 용해시키고, 피리딘 (100 mL) 중의 3'-아세틸 티미딘 (화합물 6, 5.85 g)에 첨가하였다. 용액을 실온에서 24시간 동안 교반하고, 수성 중탄산나트륨 (500 mL) 내에 부었다. 혼합물을 디클로로메탄 (500 mL)으로 추출하고, 유기층을 농축하였다. 잔사를 실리카 겔 컬럼으로 정제하고, DCM 중의 5% 메탄올로 용출시켜 목적하는 생성물을 무색 고체 (5.6 g, 수율 61%)로서 수득하였다.
실시예 5. NH 2 - HE -T, 화합물 (8)의 제조
5'-(7-아지도-2,2-디메틸헵타노일) 3'-아세틸티미딘 (화합물 7, 4.65 g)을 Pd/C (10%, 0.5 g)의 존재 하에 30 psi 하에 1시간 동안 메탄올 (200 mL) 중에서 수소화시켰다. 혼합물을 여과하고, 여액을 증발시켜 고체 (4.4 g, 수율 100%)를 수득하였다.
실시예 6. MmtNH - HE -T, 화합물 (9)의 제조
5'-(7-아미노-2,2-디메틸헵타노일) 3'-아세틸티미딘 (화합물 8, 4.4 g), 트리에틸아민 (4 ml) 및 4-메톡시트리틸 클로라이드 (7.5 g)를 피리딘 (100 mL) 중에서 1O h 동안 교반하였다. 메틸아민 (40%, 10 mL)을 첨가하고, 용액을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 수성 중탄산나트륨 (500 mL) 내에 붓고, 디클로로메탄 (500 mL)으로 추출하였다. 유기층을 농축하였다. 잔사를 실리카 겔 컬럼으로 정제하고, 디클로로메탄 중의 5% 메탄올로 용출시켜 목적하는 생성물을 무색 고체 (4.9 g, 수율 71%)로서 수득하였다.
실시예 7. MmtNH - HE -T- 포스포로아미다이트 , 화합물 (10)의 제조
아세토니트릴 (50 ml) 중의 5'-(7-[(MMT-아미노)-2,2-디메틸헵타노일] 티미딘 (화합물 9, 4.9 g), N,N-테트라이소프로필-시아노에틸 포스포르아미다이트 (3 g) 및 테트라졸 (0.5 g)을 철야 교반하였다. 혼합물을 수성 중탄산나트륨 (500 ml)에 붓고, 디클로로메탄 (500 ml)으로 추출하였다. 유기층을 농축하였다. 잔사를 실리카 겔 컬럼으로 정제하고, 헥산 중의 50% 에틸 아세테이트로 용출시켜 목적하는 생성물을 무색 고체 (4.5 g, 수율 71%)로서 수득하였다.
실시예 8. NH 2 - HE -올리고, 화합물 (11)의 제조
화합물 10을 올리고뉴클레오티드 합성에서 마지막 모노머로서 사용하기 위해 트릴링크 바이오테크놀로니스 (Trilink Biotechnologies, 미국 캘리포니아주)로 이송하였다. Mmt 기를 합성 후에 탈보호시키고, 올리고뉴클레오티드를 RP-HPLC로 정제하고, 유리 아민으로서 화합물 11을 PEG 컨쥬게이션을 위해 수득하였다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 TCTCCCAGCGTGCGCCAT (서열 4)이었다.
실시예 9. PEG - HE -올리고, 화합물 (13)의 제조
PBS 버퍼 (5 mL, pH 7.8) 중의 화합물 11 (10 mg, 1.7 μmol)의 용액에 SC-PEG (화합물 12, Mw 30 kDa, 520 mg, 17 μmol)을 첨가하고, 실온에서 5 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 50 mL로 희석하고, 20 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 7.4) (버퍼 A)로 예비 평형화시킨 강한 음이온 교환 컬럼 (10 mm x 1.5 mm, 층 부피 ~ 16 mL)인 Poros HQ에 로딩하였다. 컬럼을 3-4 컬럼 부피의 버퍼 A로 세척하여 과량의 PEG 링커를 제거하였다. 이어서, 생성물을 20 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 7.4) (버퍼 B) 중의 0 내지 100% 1 M NaCl의 구배로 10분, 이어서 100% 버퍼 B로 10분 동안 10 mL/min의 유속으로 용출시켰다. 용출된 생성물을 HiPrep 탈염 컬럼 (50 mL)을 사용하여 탈염시키고 동결건조시켜 6 mg의 생성물을 얻었다. UV로 측정한 컨쥬게이트 내의 올리고뉴클레오티드 당량은 60% (wt/wt)이었다.
실시예 10. PEG -링커- HE -올리고 화합물 (15)의 제조
PBS 버퍼 (5 mL, pH 7.8) 중의 화합물 11 (10 mg, 1.7 μmol)의 용액에 PEG-링커-NHS (화합물 14, Mw 30 kDa, 520 mg, 17 μmol)을 첨가하고, 실온에서 5 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 50 mL로 희석하고, 20 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 7.4) (버퍼 A)로 예비 평형화시킨 강한 음이온 교환 컬럼 (10 mm x 1.5 mm, 층 부피 ~ 16 mL)인 Poros HQ에 로딩하였다. 컬럼을 3-4 컬럼 부피의 버퍼 A로 세척하여 과량의 PEG 링커를 제거하였다. 이어서, 생성물을 20 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 7.4) (버퍼 B) 중의 0 내지 100% 1 M NaCl의 구배로 10분, 이어서 100% 버퍼 B로 10분 동안 10 mL/min의 유속으로 용출시켰다. 용출된 생성물을 HiPrep 탈염 컬럼 (50 mL)을 사용하여 탈염시키고 고체로 동결건조시켜 5 mg의 목적하는 생성물을 얻었다. UV로 측정한 컨쥬게이트 내의 올리고뉴클레오티드 당량은 50% (wt/wt)이었다.
실시예 11. BocNH - HE -T, 화합물 (18)의 제조
4-Boc-아미노-2,2-디메틸부티르산 (화합물 16, 0.50 g, 2.16 mmol)을 클로로포름 (10 mL) 및 DMF (5 mL)의 혼합물에 용해시키고, 티미딘 (화합물 17, 0.79 g, 3.25 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, EDC (0.62 g, 3.25 mmol)를 첨가한 후, DMAP (0.4O g, 3.25 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 교반하면서 20시간 동안 실온으로 가온시켰다. 용매를 진공 제거하고, 잔사를 에틸 아세테이트에 현탁시키고, 0.1N HCl 및 염수로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 용매를 진공 제거하여 조 오일을 수득하였다. DCM/EtOAc (40:60, v/v)를 사용한, 실리카 겔 상의 플래시 컬럼 크로마토그래피를 통해 0.28 g의 목적하는 생성물을 수득하였다: 13C NMR δ 177.21, 164.08, 156.41, 150.80, 135.46, 111.49, 85.43, 84.30, 80.21, 71.28, 63.77, 41.67, 41.08, 40.00, 37.69, 36.99, 28.87, 26.14, 25.55, 13.06.
실시예 12. NH 2 - HE -T, 화합물 (19)의 제조
화합물 18 (0.25 g, 0.55 mmol)를 DCM (5 mL)에 용해시키고, TFA (0.25 mL)를 피펫으로 실온에서 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. TFA를 완전히 제거하기 위해 DCM과 동시에 증발시킴으로써 용매 및 TFA를 진공 제거하여 0.32 g의 생성물을 유리상 고체로서 수득하였다: 13C NMR (CD3CN) δ 176.61, 164.22, 150.81, 136.41, 136.18, 110.82, 85.14, 85.07, 84.14, 83.97, 70.99, 64.56, 41.32, 39.35, 37.13, 36.92, 25.10, 24.92, 24.75, 12.08, 11.98.
실시예 13. PEG - HE -T, 화합물 (21)의 제조
mPEG-링커-NHS (화합물 20, Mw. 20k, 0.50 g, 0.0246 mmol) 및 화합물 19 (26 mg, 0.0738 mmol)을 DCM (5 mL)과 DMF (1 mL)의 혼합물에 용해시키고, DMAP (15 mg, 0.0123 mmol)를 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 제거하고, 에틸 에테르를 첨가하여 조 생성물을 침전시켰다. 고체를 여과에 의해 수거하고, 아세토니트릴/IPA로부터 재결정화시켜 0.43 g의 생성물을 순수한 백색 고체로서 수득하였다: 13C NMR δ 177.9, 168.0, 164.0, 150.9, 134.9, 133.1, 129.8, 128.1, 110.2, 84.4, 83.9, 70.4, 67.8, 64.5, 63.2, 60.0, 58.7, 40.1, 39.4, 37.2, 25.2, 24.7, 16.1, 12.2.
실시예 14. PEG - HE -T, 화합물 (23)의 제조
mPEG-NHS (화합물 22, Mw. 20k, 1 g, 0.0492 mmol) 및 화합물 19 (26 mg, 0.1476 mmol)을 DCM (10 mL)과 DMF (2 mL)의 혼합물에 용해시키고, DMAP (30 mg, 0.246 mmol)을 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 제거하고, 에틸 에테르를 첨가하여 조 생성물을 침전시켰다. 고체를 여과에 의해 수거하고, 아세토니트릴/IPA로부터 재결정화시켜 0.90 g의 생성물을 백색 고체로서 수득하였다: 13C NMR δ 178.2, 162.9, 156.0, 149.5, 134.6, 110.3, 84.4, 83.4, 70.1, 69.1, 64.4, 63.5, 62.6, 61.2, 58.6, 40.6, 40.0, 39.4, 37.1, 12.2.
실시예 15. 버퍼 및 래트 혈장 내에서 PEG 컨쥬게이트의 안정성 결정
(a) 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 버퍼 및 (b) 아세토니트릴로 구성된 구배 이동상을 사용하는 C8 역상 컬럼 (Zorbax(등록상표) SB-C8)을 이용하여 가수분해 속도를 얻었다. 1 mL/min의 유속을 사용하였고, 파클리탁셀은 227 nm에서, 올리고뉴클레오티드는 260 nm에서 UV 검출기를 사용하여 크로마토그램을 모니터링하였다. 버퍼 내에서의 가수분해를 위해, PEG 유도체를 0.1 M (pH 7.4) PBS 또는 물에 5 mg/mL의 농도로 용해시키고, 혈장 내에서의 가수분해를 위해서는, 유도체를 증류수에 20 mg/100 ㎕의 농도로 용해시키고, 900 ㎕의 래트 혈장을 상기 용액에 첨가하였다. 혼합물을 2분 동안 볼텍싱하고, 각각의 바이알당 100 ㎕의 분취량으로 2 mL 유리 바이알에 분할하였다. 용액을 37℃에서 다양한 시간 동안 인큐베이팅하였다. 메탄올 - 아세토니트릴 (1:1, v/v, 400 ㎕)의 혼합물을 적절한 간격으 로 바이알에 넣고, 혼합물을 1분 동안 볼텍싱한 후, 0.45 mm 필터 막을 통해 여과하였다 (임의로, 0.2 mm 필터 막을 통해 2차 여과를 수행하였다). 20 ㎕의 여액 분취량을 HPLC에 주입하였다. 피크 면적을 기초로 하여, 천연 화합물 및 PEG 유도체의 양을 추정하고, 상이한 매질 중에서의 각각의 화합물의 반감기를 PEG 유도체 소멸로부터 선형 회귀 분석을 사용하여 계산하였다. 실시예의 화합물에 대한 안정성 연구 결과를 하기 표에 제시한다.
PEG 컨쥬게이트의 안정성 연구 결과
화합물 PBS 중에서의 t1 /2 (h) 래트 혈장 중에서의 t1 /2 (h)
화합물 13 >24 >24
화합물 15 >24 16.0
<110> ENZON PHARMACEUTICALS, INC. <120> HINDERED ESTER-BASED BIODEGRADABLE LINKERS FOR OLIGONUCLEOTIDE DELIVERY <130> IP09-0003K <150> 60/845,028 <151> 2006-09-15 <160> 5 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Thiobackbone <220> <221> modified_base <222> (1) <223> Methylated cytosine <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> LNA <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> LNA <220> <221> modified_base <222> (3) <223> Methylated cytosine <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> LNA <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> LNA <220> <221> modified_base <222> (13) <223> Methylated cytosine <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> LNA <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> LNA <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> LNA <400> 1 ctcaatccat ggcagc 16 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <400> 2 gcaugcggcc ucuguuugat t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <400> 3 ucaaacagag gccgcaugct t 21 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Thiobackbone <400> 4 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Thiobackbone <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> LNA <400> 5 tggcaagcat cctgta 16

Claims (30)

  1. 하기 화학식 I에 따른 구조를 포함하는 화합물.
    <화학식 I>
    Figure 112009020898954-PCT00042
    여기서,
    A는 캐핑(capping)기 또는
    Figure 112009020898954-PCT00043
    이고,
    R1은 실질적으로 비-항원성 수용성 중합체이고;
    L1 및 L'1은 C(=Y1) 또는 C(=Y'1)로부터 4 내지 10개의 원자에 위치한 자유 전자쌍을 갖는 독립적으로 선택되는 스페이서이고;
    L2 및 L'2는 독립적으로 선택되는 2관능성 링커이고;
    Y1 및 Y'1은 독립적으로 O, S, 또는 NR5이고;
    X 및 X'는 독립적으로 O 또는 S이고;
    R2, R'2, R3, R'3 및 R5는 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -19 분지쇄 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2 -6 치환된 알키닐, C3 -8 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 아릴옥시, C1 -6 헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C2 -6 알카노일, 아릴카르보닐, C2 -6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C2 -6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C2 -6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시 및 치환된 아릴카르보닐옥시 중에서 독립적으로 선택되거나, 또는 R2는 R3과 함께 및 R'2는 R'3과 함께 적어도 3개의 탄소를 함유하는 치환된 또는 비치환된 비-방향족 시클로히드로카본을 독립적으로 형성하고;
    R4 및 R'4는 독립적으로 선택된 폴리뉴클레오티드 및 그의 유도체이고;
    (p) 및 (p')는 독립적으로 0 또는 양의 정수이고;
    (q) 및 (q')는 독립적으로 0 또는 1이되,
    R3은 R2가 H일 때 적어도 3개의 탄소를 갖는 치환된 또는 비치환된 탄화수소이고, L1은 C(R2)(R3)과 동일하지 않다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 Ia의 화합물.
    <화학식 Ia>
    Figure 112009020898954-PCT00044
    여기서, (q)는 1이다.
  3. 제1항에 있어서, 하기 화학식 Ib의 화합물을 추가로 포함하는 화합물.
    <화학식 Ib>
    Figure 112009020898954-PCT00045
  4. 제1항에 있어서, L1 및 L'1이 다음으로 이루어지는 군 중에서 독립적으로 선택되는 것인 화합물.
    -NR11(CR12R13)s-,
    -S(CR12R13)s-,
    -0(CR12R13)s-,
    -[C(=O)]r(CR12R13)s-,
    -NR11(CR12R13)sO(CR14R15)s'-,
    -NR11(CR12R13)sS(CR14R15)s'-,
    -NR11(CR12R13)sNR16(CR14R15)s'-,
    -NR11(CR12R13O)s(CR14R15)s'-,
    -0(CR12R13)sO(CR14R15)s'-,
    -0(CR12R13)sS(CR14R15)s'-,
    -O(CR12R13)sNR16(CR14R15)s'-,
    -0(CR12R13O)s(CR14R15)s'-
    여기서,
    R11-R16은 수소, 아미노, 치환된 아미노, 아지도, 카르복시, 시아노, 할로, 히드록실, 니트로, 실릴 에테르, 술포닐, 머캅토, C1 -6 알킬머캅토, 아릴머캅토, 치환된 아릴머캅토, 치환된 C1 -6 알킬티오, C1 - 6알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -19 분지쇄 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2 -6 치환된 알키닐, C3 -8 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 아릴옥시, C1 -6 헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C2 -6 알카노일, 아릴카르보닐, C2 -6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C2 -6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C2 -6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시, 치환된 및 아릴카르보닐옥시 중에서 독립적으로 선택되고;
    (s) 및 (s')는 독립적으로 0 또는 양의 정수이고;
    (r)은 O 또는 1이다.
  5. 제1항에 있어서, L2 및 L'2가 다음으로 이루어지는 군 중에서 독립적으로 선택되는 것인 화합물.
    -[C(=O)]rNH(CH2)2CH=N-NHC(=O)-(CH2)2-,
    -[C(=O)]rNH(CH2)2(CH2CH2O)2(CH2)2NH[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rNH(CH2CH2)(CH2CH2O)2NH[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rNH(CH2CH2)sNH(CH2CH2)s'[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rNH(CH2CH2)sS(CH2CH2)s'[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rNH(CH2CH2)(CH2CH2O)[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rNH(CH2CH2)sO(CH2CH2)s'[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rNH(CH2CH2O)(CH2)NH[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rNH(CH2CH20)2(CH2)[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rNH(CH2CH2O)s(CH2)s'[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rNHCH2CH2NH[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rNH(CH2CH2)2O[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rNH(CH2CH20)[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rNH(CH2CH2O)2[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rNH(CH2)3[C(=O)]r'-
    -[C(=O)]rO(CH2CH2O)2(CH2)[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rO(CH2)2NH(CH2)2[C(=0)]r'-,
    -[C(=O)]rO(CH2CH2O)2NH[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rO(CH2)2O(CH2)2[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rO(CH2)2S(CH2)2[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rO(CH2CH2)NH[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rO(CH2CH2)O[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rO(CH2)3NH[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rO(CH2)3O[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rO(CH2)3[C(=0)]r'-,
    -[C(=O)]rCH2NHCH2[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rCH2OCH2[C(=O)]r',
    -[C(=O)]rCH2SCH2[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]rS(CH2)3[C(=O)]r'-,
    -[C(=O)]r(CH2)3[C(=O)]r'-,
    Figure 112009020898954-PCT00046
    여기서, (r) 및 (r')는 독립적으로 0 또는 1이다.
  6. 제1항에 있어서, L2 및 L'2가 다음으로 이루어지는 군 중에서 독립적으로 선택되는 것인 화합물.
    Figure 112009020898954-PCT00047
    -Val-Cit-,
    -Gly-Phe-Leu-Gly-,
    -Ala-Leu-Ala-Leu-,
    -Phe-Lys-,
    Figure 112009020898954-PCT00048
    -Val-Cit-C(=O)-CH2OCH2-C(=O)-,
    -Val-Cit-C(=0)-CH2SCH2-C(=O)-, 및
    -NHCH(CH3)-C(=O)-NH(CH2)6-C(CH3)2-C(=O)-
    여기서,
    Y11 -19는 독립적으로 O, S 또는 NR48이고;
    R31 -48, R50 -51 및 A51은 수소, C1 -6 알킬, C3 -12 분지쇄 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1-6 치환된 알킬, C3 -8 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 페녹시 및 C1 -6 헤테로알콕시로 이루어지 는 군 중에서 독립적으로 선택되고;
    Ar은 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티이고;
    L11 -15는 독립적으로 선택되는 2관능성 스페이서이고;
    J3 및 J'3은 표적 세포 내로 능동 수송되는 모이어티, 소수성 모이어티, 2관능성 연결 모이어티 및 이들의 조합물로부터 독립적으로 선택되고;
    (c11), (h11), (k11), (l11), (m11) 및 (n11)은 독립적으로 선택되는 양의 정수이고;
    (a11), (e11), (g11), (j11), (o11) 및 (q11)은 독립적으로 0 또는 양의 정수이고;
    (b11), (x11), (x'11), (f11), (i11) 및 (p11)은 독립적으로 0 또는 1이다.
  7. 제1항에 있어서, L2 및 L'2가 아미노산, 아미노산 유도체, 및 펩티드로 이루어지는 군 중에서 독립적으로 선택되는 것인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, -L1-C(R2)(R3)-C(=Y1)- 및 -L'1-C(R'2)(R'3)-C(=Y'1)이 다음으로 이루어지는 군 중에서 독립적으로 선택되는 것인 화합물.
    Figure 112009020898954-PCT00049
  9. 제1항에 있어서, L1 및 L'1이 독립적으로 -(CH2)x21- 또는 -(CH2)x21-W-(CH2)x22-이고, 여기서 (x21) 및 (x22)는 1 내지 7의 정수로부터 독립적으로 선택되고, W는 O 또는 NHC(O)이다.
  10. 제1항에 있어서, 하기 화학식 II의 화합물.
    <화학식 II>
    Figure 112009020898954-PCT00050
  11. 제1항에 있어서, A가 H, NH2, OH, CO2H, C1 -6 알콕시, 및 C1 -6 알킬로 이루어지 는 군 중에서 선택되는 것인 화합물.
  12. 제1항에 있어서, R4 및 R'4가 독립적으로 선택되는 올리고뉴클레오티드인 화합물.
  13. 제1항에 있어서, R4 및 R'4가 센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 잠금 핵산 (LNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 앱타머, 펩티드 핵산 (PNA), 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 (PMO), 트리시클로-DNA, 이중가닥 올리고뉴클레오티드 (데코이 ODN), 촉매 활성의 RNA (RNAi), 앱타머, 스피겔머, CpG 올리고머 및 이들의 조합물로 이루어지는 군 중에서 독립적으로 선택되는 것인 화합물.
  14. 제1항에 있어서, R4 및 R'4가 독립적으로 리보핵산, 데옥시리보핵산, 또는 이들의 조합물을 포함하는 것인 화합물.
  15. 제1항에 있어서, R4 및 R'4가 독립적으로 단일가닥 올리고뉴클레오티드 또는 이중가닥 뉴클레오티드인 화합물.
  16. 제1항에 있어서, R4 및 R'4가 독립적으로 포스포로디에스테르 백본 또는 포스포로티오에이트 백본을 포함하는 것인 화합물.
  17. 제1항에 있어서, R1이 선형, 말단 분지쇄 또는 다중 아암형 (multi-armed) 폴리알킬렌 옥시드를 포함하는 것인 화합물.
  18. 제17항에 있어서, 폴리알킬렌 옥시드가 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 화합물.
  19. 제17항에 있어서, 폴리알킬렌 옥시드가 다음으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 화합물.
    -Y71-(CH2CH2O)n-CH2CH2Y71-,
    -Y71-(CH2CH2O)n-CH2C(=Y72)-Y71-,
    -Y71-C(=Y72)-(CH2)a2-Y73-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a2-C(=Y72)-Y71-, 및
    -Y71-(CR71R72)a2-Y73-(CH2)b2-O-(CH2CH2O)n-(CH2)b2-Y73-(CR71R72)a2-Y71-
    여기서,
    Y71 및 Y73은 독립적으로 O, S, SO, SO2, NR73 또는 결합이고;
    Y72는 O, S, 또는 NR74이고;
    R71 -74는 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -19 분지쇄 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2 -6 치환된 알키닐, C3 -8 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 아릴옥시, C1 -6 헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C2 -6 알카노일, 아릴카르보닐, C2 -6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C2 -6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C2 -6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C2-6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시 및 치환된 아릴카르보닐옥시 중에서 독립적으로 선택되고;
    (a2) 및 (b2)는 독립적으로 0 또는 양의 정수이고;
    (n)은 약 10 내지 약 2300의 정수이다.
  20. 제17항에 있어서, 폴리알킬렌 옥시드가 화학식 -0-(CH2CH2O)n-의 폴리에틸렌 글리콜이고, 여기서 (n)은 약 10 내지 약 2,300의 정수인 화합물.
  21. 제1항에 있어서, R1의 평균 분자량이 약 2,000 내지 약 100,000 달톤인 화합물.
  22. 제1항에 있어서, R1의 평균 분자량이 약 5,000 내지 약 60,000 달톤인 화합물.
  23. 제1항에 있어서, R1의 평균 분자량이 약 5,000 내지 약 25,000 달톤 또는 약 20,000 내지 약 45,000 달톤인 화합물.
  24. 제1항에 있어서, R2, R'2, R3 및 R'3이 메틸, 에틸 및 이소프로필로 이루어지는 군 중에서 독립적으로 선택되는 것인 화합물.
  25. 제1항에 있어서, 다음으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 화합물.
    Figure 112009020898954-PCT00051
    Figure 112009020898954-PCT00052
    Figure 112009020898954-PCT00053
    Figure 112009020898954-PCT00054
    Figure 112009020898954-PCT00055
    여기서,
    R4는 OH, 이탈기, 표적화 기, 진단제 및 생물학적 활성 모이어티로 이루어지는 군 중에서 선택되고;
    (z)는 약 1 내지 약 10의 양의 정수이고;
    (z')는 0 또는 약 1 내지 약 4의 양의 정수이고;
    mPEG은 화학식 CH3-O(CH2CH2O)n-로 표시되고;
    PEG는 화학식 -0(CH2CH2O)n-로 표시되고;
    (n)은 약 10 내지 약 2,300의 양의 정수이다.
  26. 제1항에 있어서, R4 및 R'4가 서열 1, 서열 2 및 3, 서열 4, 및 서열 5로 이루어지는 군 중에서 독립적으로 선택되는 것인 화합물.
  27. 제1항에 있어서, 하기 화학식의 화합물.
    Figure 112009020898954-PCT00056
    여기서, R4는 서열 1, 서열 2 및 3, 서열 4, 및 서열 5로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
  28. 하기 화학식 VI의 화합물을 하기 화학식 VIII의 화합물의 형성에 충분한 조건 하에서 하기 화학식 VII의 화합물과 반응시키는 것을 포함하는, 방해된 아실 또는 에스테르 모이어티-함유 중합체 컨쥬게이트의 제조 방법.
    <화학식 VI>
    Figure 112009020898954-PCT00057
    <화학식 VII>
    A4-R1-M4
    <화학식 VIII>
    Figure 112009020898954-PCT00058
    여기서,
    A4는 캐핑기 또는 M4이고;
    A5는 캐핑기 또는
    Figure 112009020898954-PCT00059
    이고,
    M3은 -OH, SH, 또는 -NHR105이고;
    M4는 이탈기, 예를 들어 할로겐, 활성화된 카르보네이트, 이소시아네이트, N-히드록시숙신이미딜, 토실레이트, 메실레이트, 트레실레이트, 노실레이트, 오르토-니트로페녹시, 이미다졸 및 당업자에게 공지된 다른 이탈기이고;
    R104는 생물학적 활성 모이어티, 표적화 기 및 진단제로부터 선택되고;
    R105는 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -19 분지쇄 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2 -6 치환된 알키닐, C3 -8 치환된 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 아릴옥시, C1 -6 헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C2 -6 알카노일, 아릴카르보닐, C2 -6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C2 -6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C2 -6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C2 -6 치환된 알카노일옥시 및 치환된 아릴카르보닐옥시 중에서 선택되고;
    모든 다른 변수는 위에서 정의된 바와 같다.
  29. 화학식 Ia의 화합물의 유효량을 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 치료 방법.
  30. 화학식 Ia의 화합물의 유효량을 그를 필요로 하는 세포에게 전달하는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포에게 투여하는 방법.
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