MX2008012219A

MX2008012219A - Composicion farmaceutica que comprende oligonucleotidos antisentido anti-miarn.

Info

Publication number: MX2008012219A
Application number: MX2008012219A
Authority: MX
Inventors: Joacim Elmen; Phil Kearney; Sakari Kauppinen
Original assignee: Santaris Pharma As
Priority date: 2006-04-03
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2008-10-02
Also published as: WO2007112753A3; JP5872603B2; JP5814505B2; EA200870402A1; US8729250B2; US20160060627A1; WO2007112753A2; EP2194129A3; KR20080108154A; CA3042781C; JP2009532392A; US20120238618A1; WO2007112754A3; DK2666859T3; US20120083596A1; CA2648132A1; CA2649045C; EP2194129A2; US20180195062A1; US20190071672A1

Abstract

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden oligonucleótidos monocatenarios cortos, de longitud de entre 8 y 26 nucleobases que son complementarios a micro-ARN de humano seleccionados del grupo que comprende miR19b, miR21, miR122a, miR155 y miR375. Los oligonucleótidos cortos son particularmente efectivos para aliviar la represión del miARN in vivo. Se descubre que la incorporación de análogos nucleótidos de elevada afinidad en los oligonucleótidos da como resultado moléculas de anti-micro-ARN muy efectivas que parecen funcionar vía la formación de dúplex casi irreversible con el objetivo miARN, en vez de mecanismos basados en la escisión de ARN, como mecanismos asociados con ARNasaH o RISC.

Description

COMPOSICION FARMACEUTICA QUE COMPRENDE OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO ANTI-MIARN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención concierne a composiciones farmacéuticas que comprenden oligonucleótidos monocatenarios que contienen LNA capaces de inhibir micro-ARN que inducen enfermedad, particularmente, micro-ARN de humano, miR-19b, miR-21, miR-122A, miR-155 y miR-375.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Novedosos reguladores MicroARN de expresión génica Los microARN (miARN) son una clase abundante de ARN endógenos cortos que actúan como reguladores postranscripcionales de la expresión génica por el apareamiento de bases con sus ARNm con especificidades de objetivo. Los miARN maduros son procesados secuencialmente de horquillas de transcripción más largas por la ARNasa III ribonucleasa Drosha (Lee et al. 2003) y Dicer (Hutvagner et al. 2001, Ketting et al. 2001). Hasta ahora, más de 3400 miARN han sido anotados en vertebrados, invertebrados y vegetales según la base de datos miRBase de micro-ARN en octubre de 2005 (Griffith-Jones 2004, Griffith-Jones et al. 2006), y muchos miARN que corresponden a supuestos genes también han sido identificados.

Ref.196383 La mayor parte de miARN de animal reconocen sus sitios con especificidad de objetivo ubicados en 3 ' -UTRs por el apareamiento de bases incompleto, dando como resultado represión traductorial de los genes con especificidades de objetivo (Bartel 2004). Un cuerpo de investigación cada vez mayor muestra que los miARN de animal desempeñan funciones biológicas fundamentales en el crecimiento y apoptosis celular (Brennecke et al. 2003), diferenciación hematopoyética de linaje (Chen et al. 2004), regulación de vida útil (Boehm y Slack 2005), diferenciación de fotoreceptor (Li y Carthew 2005), regulación de gen homeótico (Yekta et al. 2004, Hornstein et al. 2005), asimetría neuronal (Johnston et al. 2004) , secreción de insulina (Poy et al. 2004), morfogénesis cerebral (Giraldez et al. 2005), proliferación y diferenciación muscular (Chen, Mandel et al. 2005, Kwon et al. 2005, Sokol y Ambros 2005), cardiogénesis (Zhao et al. 2005) y desarrollo embrionario tardío en vertebrados (Wienholds et al. 2005) .

MicroARN en enfermedades de humano Los miARN están implicados en una amplia variedad de enfermedades de humano. Una es la atrofia muscular espinal (SMA) , enfermedad neurodegenerativa pediátrica causada por niveles de proteína reducidos o mutaciones de pérdida de la función de la supervivencia del gen de neuronas motoras (SMN) (Paushkin et al. 2002). Se mostró recientemente que una mutación en el sitio con especificidad de objetivo de miR-189 en el gen SLITRK1 de humano tenia que ver con el síndrome de Tourette (Abelson et al. 2005), mientras que otro estudio reciente mencionó que el ARN genómico de virus de hepatitis C (HCV) se relaciona con un micro-ARN de célula hospedera, el miR-122a hepático y específico, para facilitar su replicación en el hospedero (Jopling et al. 2005). Otras enfermedades donde los miARN o su maquinaria de procesamiento han sido implicados, incluyen el síndrome X frágil (FXMR) causado por la ausencia de la proteína de síndrome X frágil (FMRP) (Nelson et al. 2003, Jin et al. 2004) y síndrome de DiGeorge (Landthaler et al. 2004). Además, los patrones de expresión de miARN perturbados han sido mencionados en muchos tumores malignos de humano. Por ejemplo, los genes miARN de humano, miR15a y miR16-l, son suprimidos o lentificados en la mayoría de casos de leucemia linfocítica crónica de linfocito B (CLL) , donde se mostró recientemente que una característica exclusiva de 13 genes de miARN se asociaba con pronóstico y progresión (Calin et al. 2002, Calin et al. 2005). La función de miARN en el cáncer es apoyada, además, por el hecho de que más del 50 % de los genes de miARN de humano están ubicados en regiones genómicas asociadas al cáncer o con sitios frágiles (Calin et al. 2004). Recientemente, el análisis de expresión sistemática de una diversidad de tumores malignos de humano reveló una regulación lentificadora general de miARN en tumores en comparación con tejidos normales (Lu et al. 2005). De manera interesante, la clasificación basada en el miARN de tumores mal diferenciados tenia éxito, mientras que los perfiles de ARNm eran muy inexactos cuando era aplicado a las mismas muestras. También se ha mostrado que los miARN son desregulados en el cáncer de mama (Lorio et al. 2005), cáncer de pulmón (Johnson et al. 2005) y cáncer de colon (Michael et al. 2004), mientras la agrupación miR-17-92, que es amplificada en linfomas de linfocito B de humano y miR-155 que es regulado aceleradamente en el linfoma de Burkitt, han sido mencionados como los primeros oncogenes de miARN de humano (Eis et al. 2005, Él et al. 2005) . Asi, los miARN de humano no sólo serian muy útiles como biomarcadores para el futuro diagnóstico del cáncer, si no que también surgen rápidamente como atractivos objetivos para la intervención de enfermedad con tecnologías de oligonucleótido.

Inhibición de micro-ARN usando oligonucleótidos monocatenarios Se han mencionado varios enfoques de oligonucleótido para la inhibición de miARN. WO03/029459 (Tuschl) reivindica los oligonucleótidos que codifican para micro-ARN y sus complementos de entre 18-25 nucleótidos de longitud que puede comprender análogos nucléotidos. Se sugiere al LNA como un posible análogo nucleótido, aunque ningún LNA que contiene oligonucleótidos haya sido descrito. Tuschl afirma que los oligonucleótidos de miARN pueden usarse en la terapia. US2005/0182005 describe a un oligorribonucleótido de 24 monómeros de 2 'OMe ARN complementario a la forma más larga de miR 21 el cual se descubrió que reduce la represión inducida de miR 21, mientras que un ADN equivalente que contiene el oligonucleótido no lo hizo. El término 2 'OMe-ARN se refiere a un análogo de ARN donde hay una substitución al metilo a la posición 2' (2'0-metilo). US2005/0227934 (Tuschl) se refiere a las moléculas antimir con residuos de ADN de hasta el 50 %. También se menciona que se usaron los antimires que contienen el 2 ' OMe ARN contra micro-ARN pancreáticos pero parece que ninguna de las estructuras de oligonucleótido actuales es descrita. US20050261218 (ISIS) reivindica un compuesto oligomerico que comprende una primera y una segunda región, donde al menos una región incluye una modificación, y una porción del compuesto oligomerico se apunta a un pequeño ácido nucléico con especificidad de objetivo de ARN no codificador, donde el pequeño ácido nucléico con especificidad de objetivo de ARN no codificador es un miARN. Los compuestos oligomericos de entre 17 y 25 nucleótidos de longitud son reivindicados. Los ejemplos se refieren completamente a los compuestos de 2' OMe PS, 21 monómeros y 20 monómeros, y 2 ' OMe oligonucleótidos de gapmer apuntados contra un intervalo de pre-miARN y objetivos miARN maduros. Boutla et al. 2003 (Nucleic Acids Research 31: 4973-4980) describen el empleo de los oligonucleótidos antisentido de ADN complementarios a 11 miARN diferentes en Drosophila asi como su empleo para inactivar los miARN por inyección de los oligonucleótidos de ADN en embriones de mosca. De los 11 oligonucleótidos antisentido de ADN, sólo 4 construcciones mostraron interferencia severa con desarrollo normal, mientras que los restantes de los 7 oligonucleótidos no mostraron ningún fenotipo probablemente debido a su inhabilidad de inhibir el miARN en cuestión. Se ha reportado un enfoque alternativo a esto por Hutvagner et al. (2004) y Leaman et al. (2005), donde los oligonucleótidos antisentido de 2 '-O-metilo, complementarios al miARN maduro podrían usarse como inhibidores potentes e irreversibles del ARN corto de interferencia (siARN) y de la función miARN in vitro e in vivo en Drosophila y C. elegans, así, induciendo un fenotipo de pérdida de la función. Un inconveniente de este método es la necesidad de concentraciones de oligonucleótido de 2' -O-metilo elevadas (100 micromolares ) en experimentos de transfección y de inyección, que pueden ser tóxicos al animal. Este método se aplicó recientemente en estudios de ratones, a través de una conjugación de oligonucleótidos antisentido de 2 ' -O-metilo complementarios a cuatro miARN diferentes con el colesterol para silenciar miARN in vivo (Krützfedt et al. 2005). Estos llamados antagomirs fueron administrados a ratones por inyecciones intravenosas. Aunque estos experimentos dieran como resultado el silenciamiento efectivo de miARN endógenos in vivo, que se descubrió ser especifico, eficiente y duradero, un inconveniente principal fue la necesidad de una dosis elevada (80mg/kg) del antagomir de 2 ' -O-Me para el silenciamiento eficiente. La inhibición de micro-ARN usando oligonucleótidos LNA-modificados ha sido descrita antes por Chan et al. Cáncer Research 2005, 65 (14) 6029-6033, Lecellier et al. Science 2005, 308, 557-560, Naguibneva et al. Nature Cell Biology 2006 8 (3), 278-84 y 0rum et al. Gene 2006, (Disponible en linea el 24 de febrero de 2006) . En todos los casos, los oligonucleótidos de antimir LNA-modificados eran complementarios al micro-ARN maduro completo, es decir 20-23 nucleótidos de longitud, que obstaculiza la absorción in vivo eficiente y la amplia biodistribución de las moléculas. Naguibneva (Naguibneva et al. Nature Cell Biology 2006 8 describe el empleo del mixmer antimir de oligonucleótido antisentido de DNA-LNA-DNA para inhibir la función de micro-ARN miR-181 in vitro, en la que se ubica un bloque de 8 nucleótidos LNA en el centro de la molécula flanqueada con 6 nucleótidos de ADN al extremo 5', y con 9 nucleótidos de ADN al extremo 3', respectivamente. Un inconveniente principal de este diseño de antisentido es una estabilidad in vivo baja debido a la resistencia de nucleasa baja de los extremos de ADN flanqueador. Mientras Chan et al. (Chan et al. Cáncer Research 2005, 65 (14) 6029-6033), y 0rum et al. (0rum et al. Gene 2006, (Disponible en linea el 24 de febrero de 2006) no describen el diseño de las moléculas antimir LNA-modificadas usadas en su estudio, Lecellier et al. (Lecellier et al. Science 2005, 308, 557-560) describen el empleo del gapmer antimir de oligonucleótido antisentido de LNA-DNA-LNA para inhibir la función de micro-ARN, donde un bloque de 4 nucleótidos LNA se ubica tanto al extremo 5', como al extremo 3', respectivamente, con una ventana de 13 nucleótidos de ADN en el centro de la molécula. Un inconveniente principal de este diseño de antisentido es la absorción baja in vivo, asi como la estabilidad baja in vivo debido a la 13 extensión de ADN nucleotidica en el oligonucleótido de antimir. Por lo tanto, existe una necesidad en el campo para los oligonucleótidos mejorados capaces de inhibir micro-ARN.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está basada en el descubrimiento que el empleo de oligonucleótidos cortos diseñados para unirse con la elevada afinidad a objetivos miARN es muy efectivo en el alivio de la represión de ARNm por micro-ARN in vivo. Sin que se desee que se relacionen con alguna teoría específica, las pruebas descritas aquí indican que la acción selectiva altamente eficiente hacia miARN in vivo se logra con el diseño de los oligonucleótidos con el objetivo de formar un dúplex muy estable con el objetivo miARN in vivo. Esto se logra por medio del empleo de análogos nucléotidos de elevada afinidad, como al menos una unidad LNA y, apropiadamente además, de análogos nucléotidos de elevada afinidad, como LNA, ARN de 2 ' -MOE de análogos nucléotidos de 2'-Fluoro, en oligonucleótidos cortos, como 10-17 o 10-16 nucleobases. En un aspecto, el objetivo es generar un oligonucleótido de una longitud que con poca probabilidad formará un complejo de siARN (es decir, un oligonucleótido corto) , y con la carga suficiente de análogos nucléotidos de elevada afinidad, que se adherirá casi permanentemente a su objetivo miARN, formando con eficacia un dúplex estable y no funcional con el objetivo miARN. Hemos descubierto que tales diseños son bastante más efectivos que los oligonucleótidos de técnica anterior, particularmente gapmer y diseños de blockmer y oligonucleótidos que tienen una longitud larga, p.ej 20-23 monómeros. El término 2'fluor-ADN se refiere a un análogo de ADN donde hay una substitución al flúor en la posición 2' (2'F) . La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de entre 8 y 17, como 10 y 17, como 8-16 o 10-16 unidades de nucleobase, un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde al menos una de las unidades de nucleobase del oligonucleótido monocatenario es un análogo nucleótido de elevada afinidad, como una unidad de nucleobase de Acido Nucleico Bloqueado (LNA en inglés), y donde el oligonucleótido monocatenario es complementario a una secuencia de micro-ARN de humano seleccionada del grupo que comprende el micro-ARN de humano miR-19b, miR-21, miR-122A, miR-155 y miR-375. La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 10 a 26 unidades de nucleobase, y un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde el oligonucleótido comprende una secuencia de ADN nuclear de posiciones dos a siete o de posiciones tres a ocho, contando del extremo 3' de 3' acgttt 5' (SEQ ID NO 6, 5'tttgca3'), donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, como dos o tres, de las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente y opcionalmente donde el oligonucleótido no comprende una región de más de 7 unidades de ADN contiguas. La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 10 a 26 unidades de nucleobase, y un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde el oligonucleótido comprende una secuencia de ADN nuclear de posiciones dos a siete o de posiciones tres a ocho, contando del extremo 3' de 3' ctcaca 5' (SEQ ID NO 7, 5' acactc 3') donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, como dos o tres, de las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente y opcionalmente donde el oligonucleótido no comprende una región de más de 7 unidades de ADN contiguas. La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 10 a 26 unidades de nucleobase, y un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde el oligonucleótido comprende una secuencia de ADN nuclear de posiciones dos a siete o de posiciones tres a ocho, contando del extremo 3' de 3' ttacga 5' ( SEQ ID NO 8 , 5' agcatt 3') donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, como dos o tres, de las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente y opcionalmente donde el oligonucleótido no comprende una región de más de 7 unidades de ADN contiguas. La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido monocatenario que tiene una longitud de 10 a 26 unidades de nucleobase, y un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde el oligonucleótido comprende una secuencia de ADN nuclear de posiciones dos a siete o de posiciones tres a ocho, contando del extremo 3 ' de 31 acaagc 5' (SEQ ID NO 9, 5' cgaaca 3') donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, como dos o tres, de las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente y opcionalmente donde el oligonucleótido no comprende una región de más de 7 unidades de ADN contiguas. La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido monocatenario que tiene una longitud de 10 a 26 unidades de nucleobase, y un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde el oligonucleótido comprende una secuencia de ADN nuclear de posiciones dos a siete o de posiciones tres a ocho, contando del extremo 3' de 3' cgaata 5' (SEQ ID NO 10, 5 'ataagc3') donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, como dos o tres, de las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente y donde el oligonucleótido no comprende una región de más de 7 unidades de ADN contiguas. Los análogos nucléotidos de elevada afinidad son análogos nucléotidos que dan como resultado el oligonucleótido que tiene una estabilidad doble térmica más elevada con un nucleótido de ARN complementario que la afinidad obligatoria de un nucleótido de ADN equivalente. Esto es comúnmente determinado cuantificando el Tm. No hemos identificado ningún efecto sin especificidad de objetivo significativo cuando se usan estos oligonucleótidos cortos de elevada afinidad apuntados contra miARN específicos. En efecto, las pruebas proporcionadas aquí indican que los efectos sobre la expresión de ARNm se deben a la presencia de una secuencia complementaria al miARN apuntado (objetivos de ARNm primarios) dentro del ARNm o a efectos secundarios sobre ARNm que son regulados por objetivos de ARNm primarios (objetivos de ARNm secundarios). No se identificó ningún efecto de toxicidad que indicara efectos sin especificidad de objetivo perjudiciales no significativos. La invención además prevé el empleo de un oligonucleótido según la invención, como aquellos que pueden formar la parte de la composición farmacéutica, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o con la sobreexpresión (regulación por incremento) del micro-ARN. La invención además proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o con la sobreexpresión del micro-ARN, que comprende la etapa de administrar una composición (como la composición farmacéutica) según la invención a una persona que necesite el tratamiento. La invención además proporciona un método para reducir la cantidad efectiva de un miARN en una célula o en un organismo, comprendiendo la administración de una composición (como la composición farmacéutica) según la invención o un oligonucleótido monocatenario de acuerdo con la invención a la célula o el organismo. Reducir la cantidad efectiva en este contexto se refiere a la reducción de miARN funcional presente en la célula u organismo. Es aceptado que los oligonucleótidos preferidos según la invención no siempre pueden reducir considerablemente la cantidad actual del miARN en la célula u organismo ya que comunmente forman dúplex muy estables con sus objetivos miARN. La invención además proporciona un método para la desrepresión de un ARNm con especificidad de objetivo de un miARN en una célula o un organismo, comprendiendo la administración de una composición (como la composición farmacéutica) o un oligonucleótido monocatenario según la invención a la célula o el organismo. La invención además prevé el empleo de un oligonucleótido monocatenario de entre 8-16, como 8-16 tal como entre 10-16 nucleobases de longitud, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o la sobreexpresión del micro-ARN. La invención además proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o la sobreexpresion del micro-ARN, comprendiendo la etapa de administrar a una persona que necesite de tratamiento una composición (como la composición farmacéutica) que incluye un oligonucleótido monocatenario de entre 8-16 como entre 10-16 nucleobases de longitud. La invención además proporciona un método para reducir la cantidad efectiva de un objetivo miARN (es decir, la cantidad de miARN que está disponible para reprimir ARNm con especificidades de objetivo) en una célula o un organismo, comprendiendo la administración de una composición (como la composición farmacéutica) que incluye un oligonucleótido monocatenario de entre 8-16 como entre 10-16 nucleobases a la célula o el organismo. La invención además proporciona un método para la desrepresión de un ARNm con especificidad de objetivo de un miARN en una célula o un organismo, comprendiendo un oligonucleótido monocatenario de entre 8-16 tal como entre 10-16 nucleobases o (o una composición que comprende el oligonucleótido) a la célula o el organismo. La invención además proporciona un método para la síntesis de un oligonucleótido monocatenario apuntado contra un micro-ARN de humano seleccionado del grupo que consiste de micro-ARN de humano miR-19b, miR-21, miR-122A, miR-155 y miR-375, como un oligonucleótido monocatenario descrito aquí, el método que comprende las etapas de: a. Opcionalmente , la selección de una primera nucleobase, contando del extremo 3', que es un análogo nucleótido, como una nucleobase LNA. b. Opcionalmente, la selección de una segunda nucleobase, contando del extremo 3', que es un análogo nucleótido, como una nucleobase LNA. c. La selección de una región del oligonucleótido monocatenario que corresponde a la región simiente de miARN, donde la región es como se define en la presente. d. Opcionalmente, la selección de una séptima y octava nucleobase es como se define en la presente. e. Opcionalmente, una selección entre 1 y 10 nucleobases adicionales que pueden ser seleccionadas del grupo que comprende los nucleótidos (x) y los análogos nucléotidos (X) , como el LNA. f. Opcionalmente, la selección de una región 5' del oligonucleótido monocatenario es como se define en la presente . g. Opcionalmente, la selección de una terminal 5' del oligonucleótido monocatenario es como se define en la presente . Donde la síntesis es llevada a cabo por la síntesis secuencial de las regiones definidas en las etapas a-g, donde la síntesis puede llevarse a cabo en la dirección 3 '-5' (a a g) o 5 ' -31 (g a a), y donde el oligonucleótido monocatenario es complementario a una secuencia del objetivo miARN. En una modalidad, se diseña el oligonucleótido de la invención para no ser reclutado por RISC o intervenir la escisión dirigida por RISC del objetivo miARN. Se ha considerado que por el empleo de oligonucleótidos largos, p.ej 21 o 22 monómeros, en particular oligonucleótidos de ARN, u oligonucleótido 'de análogo' de ARN que son complementarios al objetivo miARN, el oligonucleótido puede competir contra el ARNm con especificidad de objetivo en términos de asociación de complejo de RISC, y asi, aliviar la represión miARN de los ARNm de objetivo por medio de la introducción de un oligonucleótido que compite como un sustrato por el miARN. Sin embargo, la presente invención procura prevenir tal escisión de ARNm con especificidad de objetivo o inhibición de translación indeseables al suministrar oligonucleótidos capaces de una encuademación complementaria, y por lo visto en algunos casos casi irreversible, al micro-ARN maduro. Esto parece dar como resultado una forma de protección contra la degradación o escisión (p.ej por RISC o ARNasaH u otro endo o exo-nucleasas ) , que no puede dar como resultado la reducción sustancial o incluso significativa del miARN (p.ej como fue detectado por la técnica Northern blot usando sondas de LNA) dentro de una célula, pero asegura que la cantidad efectiva del miARN, como es cuantificado por el análisis de desrepresión se reduzca bastante. Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona oligonucleótidos que son resueltamente diseñados para no ser compatibles con el complejo de RISC, pero para quitar el miARN por la titulación por el oligonucleótido . Aunque no se desea que se relacionen a una teoría específica del por qué los oligonucleótidos de la presente invención son tan efectivos, en analogía con el ARN oligonucleótidos basados (o completo 2'0Me oligonucleótidos ) , parece que los oligonucleótidos según la presente invención trabajan por la inhibición no competitiva de la función miARN ya que quitan con eficacia el miARN disponible del citoplasma, donde, al igual que los oligonucleótidos de técnica anterior proporcionan un sustrato de miARN alternativo, que puede actuar como un inhibidor de competidor, la eficacia del cual sería mucho más dependiente de la concentración del oligonucleótido en el citoplasma, así como la concentración del ARNm con especificidad de objetivo y miARN. Aunque no se desea que se relacione con una teoría específica, una posibilidad adicional que puede existir con el empleo de los oligonucleótidos de una longitud aproximadamente similar a los objetivos miARN (es decir, el miARN) consiste en que los oligonucleótidos podrían formar un siARN como el dúplex con el objetivo miARN, una situación que reduciría la eficacia del oligonucleótido. También es posible que los mismos oligonucleótidos pudieran usarse como el hilo director dentro del complejo de RISC, así, generando la posibilidad de la degradación dirigida por RISC de objetivos no específicos que sólo resultan tener la complementariedad suficiente a la guía de oligonucleótido . Tales problemas son evitados por medio de una selección de oligonucleótidos cortos para apuntar secuencias de miARN . Los oligonucleótidos cortos que incorporan LNA son conocidos del área de reactivos, como el LNA (ver por ejemplo WO2005/098029 y WO 2006/069584) . Sin embargo las moléculas diseñadas para el diagnóstico o empleo de reactivo son muy diferentes en el diseño de aquellos para el empleo farmacéutico. Por ejemplo, las nucleobases terminales de los oligos de reactivo no son comunmente LNA, sino ADN, y los enlaces de internucleósido son comunmente distintos del fosforotioato, el enlace preferido para el empleo en los oligonucleótidos de la presente invención. La invención, por lo tanto, proporciona una novedosa clase de oligonucleótido en sí . La invención además proporciona un oligonucleótido (monocatenario ) como se describe en el contexto de la composición farmacéutica de la invención, donde el oligonucleótido comprende alguno de los siguientes: i) al menos un enlace de fosforotioato y/o ii) al menos una unidad LNA 3' terminal, y/o iü) al menos una unidad LNA 5' terminal.

Es preferible que para la mayor parte de los empleos terapéuticos, el oligonucleótido sea completamente fosforotiolado, la excepción se aplica en los oligonucleótidos terapéuticos para el uso en el CNS, tal como en el cerebro o la espina donde la fosforotioación puede ser tóxica, y debido a la ausencia de nucleasas, los enlaces de fosfodiéster pueden usarse, incluso entre unidades de ADN consecutivas. Como se refiere aquí, otros aspectos preferidos del oligonucleótido según la invención son que la segunda nucleobase 3 ' , y/o la 9na y 10ma (del extremo 3'), también pueden ser LNA. Los inventores han descubierto que, según la invención, son posibles otros métodos de evitar la escisión de ARN (como la degradación de exo-nucleasa en el suero de la sangre, o la escisión asociada RISC del oligonucleótido, y como tal, la invención también proporciona un oligonucleótido monocatenario que comprende alguno de los siguientes: a. una unidad LNA en la posición 1 y 2 al contar del extremo 3' y/o b. una unidad LNA en la posición 9 y/o 10, también contando del extremo 3', y/o c. una o dos unidades de 5' LNA. Mientras las ventajas de estos otros aspectos pueden observarse con oligonucleótidos más largos, como un nucleótido de hasta 26 unidades de nucleobase de longitud, se considera que estas características también pueden usarse con los oligonucleótidos más cortos referidos aquí, como los oligonucleótidos de entre 8-17, 8-16, 10-17 o 10-16 nucleobases descritos aquí. Se prefiere en gran medida que los oligonucleótidos comprendan análogos nucléotidos de elevada afinidad, como aquellos referidos aquí, dando mayor preferencia a las unidades LNA. Por lo tanto, los inventores descubrieron sorprendentemente que los oligonucleótidos monocatenarios cuidadosamente diseñados que comprenden unidades de ácido nucleico bloqueado (LNA) en un orden particular muestran el silenciamiento significativo de micro-ARN, dando como resultado niveles de micro-ARN reducidos. Se descubrió que era importante la encuademación estrecha de los oligonucleótidos a la llamada secuencia simiente, nucleótidos 2 a 8 o 2-7, contando del extremo 5', de los micro-ARN con especificidades de objetivo. El nucleótido 1 de los micro-ARN con especificidades de objetivo es una base de no pareo y se encuentra con mayor probabilidad escondido en una cavidad del sitio de unión en la proteina de Ago 2. Sin desear estar limitados por ninguna teoría específica, los inventores presentes consideran que al seleccionar las secuencias de región simiente, en particular con los oligonucleótidos que comprenden LNA, preferentemente las unidades LNA en la región que es complementaria a la región simiente, el dúplex entre miARN y el oligonucleótido es particularmente efectivo en la acción selectiva de miARN que evita los efectos sin especificidad de objetivo, y posiblemente proporcionan una característica adicional que previene la función miARN dirigida por RISC. Los inventores han descubierto sorprendentemente que el silenciamiento de micro-ARN es incluso más potenciado cuando los oligonucleótidos monocatenarios LNA-modificados no contienen un nucleótido en el extremo 3' correspondiente a este nucleótido 1 impar. Se descubrió además que dos unidades LNA en el extremo 3' de los oligonucleótidos, según la presente invención, hicieron a los oligonucleótidos muy resistentes a la nucleasa. Se descubrió además que los oligonucleótidos de la invención que tienen al menos un análogo nucleótido, como un nucleótido LNA en las posiciones correspondientes a las posiciones 10 y 11, contando del extremo 5', del micro-ARN con especificidad de objetivo pueden prevenir la escisión de los oligonucleótidos de la invención En consecuencia, un aspecto de la invención está relacionado con un oligonucleótido que tiene una longitud de 12 a 26 nucleótidos, donde: i) el primer nucleótido, contando a partir del extremo 3', es una unidad de ácido nucleico bloqueado (LNA); ii) el segundo nucleótido, contando a partir del extremo 31 , es una unidad LNA; y iii) el noveno y/o el décimo nucleótido, contando a partir del extremo 3', es una unidad LNA. La invención además prevé los oligonucleótidos , como se definen aquí, para su empleo como un medicamento. La invención además está relacionada con composiciones que comprenden los oligonucleótidos definidos aquí y con un portador farmacéuticamente aceptable. Como se ha mencionado, los micro-ARN están relacionados con varias enfermedades. Por lo tanto, un cuarto aspecto de la invención está relacionado con el empleo de un oligonucleótido, como se define en la presente, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión de los micro-ARN seleccionados del grupo que incluye la atrofia muscular espinal, el síndrome de Tourette, el virus de hepatitis C, el síndrome X frágil, el síndrome de DiGeorge y cáncer, como leucemia linfocítica crónica, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de colon, particularmente cáncer. Un aspecto adicional de la invención es un método para reducir los niveles del micro-ARN con especificidad de objetivo al contactar con el micro-ARN con especificidad de objetivo a un oligonucleótido como se define, donde el oligonucleótido : 1. es complementario al micro-ARN con especificidad de objetivo 2. no contiene un nucleótido en el extremo 3' que corresponde al primer nucleótido de extremo 5' del micro-ARN con especificidad de objetivo. La invención además proporciona un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleobase seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 82, SEQ ID NO 83, SEQ ID NO 84, SEQ ID NO 85, SEQ ID NO 86, SEQ ID NO 87, SEQ ID NO 88, y SEQ ID NO 89; donde una minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA; y donde las citosinas LNA son opcionalmente metiladas, o un conjugado, del mismo. La invención además proporciona un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleobase seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 90, SEQ ID NO 91, SEQ ID NO 92, SEQ ID NO 93, SEQ ID NO 94, SEQ ID NO 95, SEQ ID NO 96, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 98, SEQ ID NO 99, SEQ ID NO 100, y SEQ ID NO 101; donde una minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA; y donde las citosinas LNA son opcionalmente metiladas, o un conjugado, del mismo. La invención además proporciona un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleobase seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 102, SEQ ID NO 103, SEQ ID NO 104, y SEQ ID NO 105; donde una minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA; y donde las citosinas LNA son opcionalmente metiladas, o un conjugado, del mismo. La invención además proporciona un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleobase seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO 106, SEQ ID NO 107, SEQ ID NO 108 y SEQ ID NO 109; donde una minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA, y donde las citosinas LNA son opcionalmente metiladas, o un conjugado, del mismo. La invención además proporciona un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleobase seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO 65, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO 67, SEQ ID NO 68, y SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45, y SEQ ID NO 46, donde una minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA, y donde las citosinas LNA son opcionalmente metiladas, o un conjugado, del mismo . En una modalidad, el oligonucleotido puede tener una secuencia de nucleobase de entre 1-17 nucleobases, como 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 nucleobases y, como tal, la oligonucleobase en tal modalidad puede ser una subsecuencia contigua dentro de los oligonucleotidos descritos aquí. Los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que los oligonucleótidos antisentido de una cierta longitud que comprende una secuencia de ADN nuclear particular y ácidos nucleicos bloqueados (LNA) en la secuencia nuclear, muestran propiedades superiores que inhiben el micro-ARN.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. El efecto del tratamiento con diferentes oligonucleótidos de anti-miR LNA sobre una expresión de ácido nucleico con especificidad de objetivo en la linea celular Huh-7 que expresa miR-122a. Se muestran cantidades de miR-122a (unidades arbitrarias) derivadas de qRT-PCR especifico para miR-122a, en comparación con las células no sometidas a tratamiento (mímicas). Los oligonucleótidos de anti-miR LNA se usaron en dos concentraciones, 1 y ?????, respectivamente. Se incluye también un control de malapareamiento (SPC3350) a SPC3349 (también referido aquí como SPC3549) .

Figura 2. Evaluación de la respuesta a dosis inactivada de anti-miR-122a LNA para SPC3548 y SPC3549 en comparación con SPC3372 in vivo en hígados de ratones usando RT-PCR de tiempo real de miR-122a. Figura 2b Niveles de miR-122 en el hígado de un ratón después de tratamiento con diferentes LNA-antimiRs . Las moléculas de LNA-antimiR, SPC3372 Y SPC3649, fueron administradas en las dosis indicadas a ratones normales por medio de tres inyecciones intraperitoniales cada dos días durante un período de seis días; y 48 horas después de la última dosis fueron sacrificados. El ARN total fue extraído de los hígados de los ratones y el miR-122 fue cuantificado por qPCR específico para miR-122. Figuras 3a-3b. La evaluación de los niveles de colesterol plasmáticos en ratones sometidos a tratamiento con LNA-antimiR-122a en comparación con los ratones testigo que recibieron solución salina. Figura 4a. Evaluación de niveles de ARNm de Bckdk relativos en Ratones sometidos a tratamiento con LNA-antimiR-122a en comparación con los ratones testigo tratados con solución salina usando RT-PCR cuantitativo de tiempo real. Figura 4b. Evaluación de niveles de ARNm de aldolasa A relativos en Ratones sometidos a tratamiento con LNA-antimiR-122a en comparación con ratones testigo tratados con solución salina usando RT-PCR cuantitativo de tiempo real.

Figura 4c. Evaluación de niveles de ARNm de GAPDH en Ratones sometidos a tratamiento con LNA-antimiR-122a (animales 4-30) en comparación con los ratones testigo (animales 1-3) tratados con solución salina usando RT-PCR cuantitativo de tiempo real. Figura 5. Evaluación de respuesta a la dosis inactivada de LNA-antimiR™-122a in vivo en hígados de ratones usando miR-122a RT-PCR de tiempo real. Seis grupos de animales (5 ratones por grupo) se sometieron a tratamiento de la siguiente manera. En el grupo 1, se inyectaron a los animales con 0.2ml de solución salina por vía intravenosa durante 3 días sucesivos. El grupo 2 recibió 2.5mg/kg de SPC3372. El grupo 3 recibió 6.25 mg/kgs. El grupo 4 recibió 12.5mg/kg, y el Grupo 5 recibió 25mg/kg, mientras que el Grupo 6 recibió 25mg/kg de SPC 3373 (malapareamiento del oligonucleótido LNA-antimiR ™) , todos de la misma manera. Se repitió el experimento (por lo tanto n = 10) y se muestran los resultados combinados. Figura 6. Técnica Northern blot que compara SPC3649 con SPC3372. El ARN total de un ratón en cada grupo fue sometido a miR-122 Northern blot específico. Se indica el miR-122 maduro y el dúplex (micro-ARN bloqueado) formado entre el LNA-antimiR y miR-122. Figura 7. Se sometieron los ratones a tratamiento con 25 mg/kgs/día de LNA-antimiR o con solución salina durante tres días consecutivos y después se sacrificaron 1, 2 o 3 semanas después de la última dosis. También se incluyen los valores de los animales sacrificados 24 horas después de la última dosis (ejemplo 11 "diseño anterior"). Los niveles de miR-122 fueron evaluados por qPCR y normalizados al promedio del grupo de solución salina a cada punto temporal individual. También se incluyen los valores de los animales sacrificados 24 horas después de la última dosis (mostrado el promedio y desviación estándar, n=7, 24 h n=10). El día de sacrificio 9, 16 o 23 corresponde al sacrificio de 1, 2 o 3 semanas después de la última dosis . ) . Figura 8. Se sometieron a los ratones a tratamiento con 25mg/kg/dia de LNA-antimiR o con solución salina durante tres días consecutivos y se sacrificaron 1, 2 o 3 semanas después de la última dosis. También se incluyen los valores de los animales sacrificados 24 horas después de la última dosis (ejemplo 11 "diseño anterior"). El colesterol plasmático fue cuantificado y normalizado al grupo de solución salina a cada punto temporal (mostrado el promedio y desviación estándar, n=7, 24 h n=10) . Figura 9. El dependiente de la dosis miR-122a apunta la inducción de ARNm por la inhibición de SPC3372 DE miR-122a. Se sometieron a los ratones a un tratamiento con diferentes dosis de SPC3372 durante tres días consecutivos, como se describió anteriormente, y se sacrificaron 24 horas después de la última dosis. El ARN total extraído del hígado fue sometido a qPCR.

Los genes con el sitio con especificidad de objetivo de miR-122 predecido y que se observó que fueron regulados aceleradamente por el análisis de micromatriz fueron investigados para la inducción dependiente de la dosis a un aumento de dosis de SPC3372 usando qPCR. El ARN hepático total de 2 a 3 ratones por grupo sacrificados 24 horas después de la última dosis fue sometido a qPCR para los genes indicados. En la figura 9 se muestran los niveles de ARNm con relación al grupo de solución salina, n=2-3 (2.5-12.5mg/kg/dia : n=2, ninguna desviación estándar) . También se muestra el control de malapareamiento (mm, SPC3373) Figura 10. Inducción transitoria de los ARNm con especificidades de objetivo de miR-122a después de tratamiento con SPC3372. Se sometieron a tratamiento a los ratones hembra de NMRI con 25mg/kg/dia de SPC3372 junto con el control de solución salina durante tres días consecutivos y fueron sacrificados 1, 2 o 3 semanas después de la última dosis, respectivamente. El ARN se extrajo de los hígados y los niveles de ARNm de ARNm objetivo de miR-122a predecidos, seleccionados por datos de micromatriz fueron investigados por qPCR. Se analizaron a tres animales de cada grupo. Figura 11. Inducción de VIdIr en el hígado por tratamiento con SPC3372. Las mismas muestras de ARN hepáticas que en el ejemplo anterior (Figura 10) fueron investigadas para la inducción de VIdIr.

Figura 12. Estabilidad de dúplex de miR-122a/ SPC3372 en el plasma del ratón. Se analizó la estabilidad del dúplex de SPC3372/miR-122a y SPC3372 en el plasma del ratón a 37°C durante 96 horas. En la figura 12 se muestra un PAGE teñido con SYBR-oro. Figura 13. El secuestramiento de miR-122a maduro por SPC3372 lleva a la formación dúplex. En la figura 13 se muestra una membrana explorada con una sonda especifica para miR-122a (panel superior) y vuelta a explorar con una sonda especifica de Let-7 (panel inferior). Con la sonda de miR-122, dos bandas pudieron ser detectadas, una correspondiente a miR-122 maduro y otra correspondiente a un dúplex entre SPC3372 y miR-122. Figura 14. miR-122a secuestrado por SPC3372 junto con la distribución de SPC3372 evaluada por la hibridación in situ de las secciones hepáticas. Las crio-secciones hepáticas de animales sometidos a tratamiento fueron sometidas a hibridaciones in situ para la detección y localización de miR-122 y SPC3372. Una sonda complementaria para miR-122 podría detectar miR-122a. Una segunda sonda es complementaria para SPC3372. En la figura 14 se muestra una revestimiento, en verde se muestra la distribución y cantidades aparentes de miR-122a y SPC3372, en azul se muestra la tinción nuclear DAPI, a una amplificación 10X. Las amplificaciones 100X revelan la distribución intracelular de miR-122 y SPC13 3372 dentro de los hepatocitos de ratón. Figuras 15a-15d. Expresión génica hepática en ratones sometidos a tratamiento con miR-122 LNA-antimiR. Los ratones sometidos a tratamiento con solución salina y LNA-antimiR fueron comparados por la utilización de parametri zación de la expresión por todo el genoma usando el Genoma de Ratón de Affymetrix 430 2.0 matrices, (fig. 15a) Se señala la cantidad de sondas que muestran diferencialmente la expresión en muestras hepáticas de ratones sometidos a tratamiento con LNA-antimiR-122, sometido a tratamiento y con solución salina 24 horas después del tratamiento, (fig. 15b) El acontecimiento de secuencia simiente de miR-122 en genes diferencialmente expresados. El gráfico muestra el porcentaje de transcripciones con al menos una secuencia de reconocimiento de semilla de miR-122 en su 3' UTR. Aleatorio: se generaron y buscaron las secuencias aleatorias de secuencias de reconocimiento de semilla de miR-122. Los perfiles de expresión génica hepática temporal en ratones sometidos a tratamiento con LNA-antimiR. Se sometieron a los ratones a un tratamiento con 25mg/kg/dia de LNA-antimiR o con solución salina durante tres días consecutivos y fueron sacrificados 1, 2 o 3 semanas después de la última dosis. También se incluyen los valores de los animales sacrificados 24 horas después de la última dosis. (fig. 15c) Las muestras de ARN de puntos temporales diferentes también fueron sometidas a la parametri zación de la expresión. El análisis de agrupación jerárquico de los perfiles de expresión de genes identificados como diferencialmente expresado entre los ratones sometidos a tratamiento con LNA-antimiR y con solución salina en 24 horas, una semana o tres semanas determina el tratamiento, (fig. 15d) Los perfiles de expresión de los genes identificados como diferencialmente expresados entre los ratones sometidos a tratamiento con LNA-antimiR y con solución salina en el tratamiento fijado a 24 horas fueron deducidos con el tiempo. Las proporciones de expresión de genes regulados aceleradamente y lentificados en ratones sometidos a tratamiento con el enfoque 1 de LNA-antimiR sobre el curso del periodo de tiempo, indicando un efecto reversible del tratamiento de LNA-antimiR. Figura 16. El efecto del tratamiento con SPC3372 y 3595 sobre niveles de miR-122 en hígados de ratones. Figura 17. El efecto del tratamiento con SPC3372 y 3595 sobre niveles de Aldolasa A en hígados de ratones. Figura 18. El efecto del tratamiento con SPC3372 y 3595 sobre niveles de Bckdk en hígados de ratones. Figura 19. El efecto del tratamiento con SPC3372 y 3595 sobre niveles de CD320 en hígados de ratones. Figura 20. El efecto del tratamiento con SPC3372 y 3595 sobre niveles de Ndrg3 en hígados de ratones. Figura 21. El efecto del tratamiento a largo plazo con SPC3649 sobre el colesterol plasmático total en ratones hipercolesterolemicos y normales. Se obtuvieron las muestras semanales del plasma sanguíneo de los ratones testigo tratados con solución salina y sometidos a tratamiento con SPC3649 y una vez cada semana seguido de evaluación de colesterol plasmático total. Se sometieron a los ratones a un tratamiento con 5 mg/kgs de SPC3649, SPC3744 o con solución salina dos veces a la semana. Los ratones normales se sometieron a tratamiento en paralelo. Figura 22. El efecto del tratamiento a largo plazo con SPC3649 sobre niveles de miR-122 en ratones hipercolesterolemicos y normales. Figura 23. El efecto del tratamiento a largo plazo con SPC3649 sobre niveles de aldolasa A en ratones hipercolesterolemicos y normales. Figura 24. El efecto del tratamiento a largo plazo con SPC3649 sobre niveles de Bckdk en ratones hipercolesterolemicos y normales. Figura 25. El efecto del tratamiento a largo plazo con SPC3649 sobre niveles de AST en ratones hipercolesterolemicos y normales. Figura 26. El efecto del tratamiento a largo plazo con SPC3649 sobre niveles de ALT en ratones hipercolesterolemicos y normales . Figura 27. Modulación de la replicación de HCV por SPC3649 en un modelo celular de Huh-7. El análisis de Northern blot de ARN de HCV en células de Huh-7 después de transfeccion con LNA-antimiR diferente (SPC3648, SPC3649 y SPC3550) y moléculas de 2' OMe antago-mir-122 (panel superior) . Las intensidades de señal de hibridación fueron cuantificadas y normalizadas a señales de ARNm de espectrina en cada división (panel inferior) . Figura 28. Desrepresión funcional de renilla luciferasa con objetivo de miR- 19b, con oligonucleót idos de bloqueo de miR-19b en una linea celular que endógenamente expresa miR-19b, HeLa. "El objetivo de miR-19b" es el plásmido con el objetivo de miR-19b, pero no cotransfectado con el oligo que bloquea miR-19b y por lo tanto representa por completo la expresión de renilla luciferasa reprimida de miR- 19b. Figura 29. Desrepresión funcional de renilla luciferasa con objetivo de miR-122, por oligonucleót idos de bloqueo de miR-122 en una linea celular que endógenamente expresa miR-122, Huh-7. "El objetivo de miR-122" es el plásmido correspondiente con el objetivo de miR-122, pero no cotransfectado con el oligo que bloquea miR-122 y por lo tanto, representa por completo la expresión de renilla luciferasa reprimida de miR-122. Figura 30. Diagrama que ilustra la alineación de un oligonucleót ido según la invención y un objetivo de micro-ARN.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Comunmente el oligonucleótido de la invención es monocatenario . Por lo tanto, se piensa que, dentro del contexto de la invención, el término oligonucleótido puede usarse de modo indistinto con el término oligonucleótido monocatenario . En una modalidad, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden oligonucleótidos (monocatenarios ) cortos, de longitud de entre 8 y 17 nucleobases de longitud, tal como entre 10 y 17 nucleobases que son complementarias al micro-ARN de humano. Los oligonucleótidos cortos son particularmente efectivos a la represión miARN de alivio in vivo. Se descubre que la incorporación de análogos nucléotidos de elevada afinidad en los oligonucleótidos da como resultado moléculas de ant imicro-ARN muy efectivas que parecen funcionar vía la formación de dúplex casi irreversibles con el objetivo miARN, en vez de mecanismos basados en la escisión de ARN, como mecanismos asociados con ARNasaH o RISC. Es muy preferible que el oligonucleótido monocatenario, según la invención, comprenda una región de la secuencia de nucleobase contigua que es 100 % complementaria a la región simiente de micro-ARN de humano. Es preferible que el oligonucleótido monocatenario, según la invención, sea complementario a la secuencia madura de micro-ARN de humano.

Los oligonucleótidos preferidos, según la invención, son complementarios a una secuencia de micro-ARN seleccionada del grupo que comprende hsa-miR19b, hsa-miR21, hsa-miR 122, hsa-miR 142 a7b, hsa-miR 155, hsa-miR 375. En una modalidad, el oligonucleótido , según la invención, no comprende una nucleobase al extremo 3' que corresponde al primer nucleótido del extremo 5' del micro-ARN con especificidad de objetivo. En una modalidad, la primera nucleobase del oligonucleótido monocatenario, según la invención, que cuenta desde el extremo 3', es un análogo nucleótido, como una unidad LNA. En una modalidad, la segunda nucleobase del oligonucleótido monocatenario, según la invención, que cuenta desde el extremo 3', es un análogo nucleótido, como una unidad LNA. En una modalidad, el noveno y/o el décimo nucleótido del oligonucleótido monocatenario, según la invención, que cuenta desde el extremo 3', es un análogo nucleótido, como una unidad LNA. En una modalidad, la novena nucleobase del oligonucleótido monocatenario, según la invención, que cuenta desde el extremo 3', es un análogo nucleótido, como una unidad LNA. En una modalidad, la décima nucleobase del oligonucleótido monocatenario, según la invención, que cuenta desde el extremo 3', es un análogo nucleótido, como una unidad LNA. En una modalidad, tanto la novena como la décima nucleobase del oligonucleótido monocatenario, según la invención, calculadas desde el extremo 3', son un análogo nucleótido, como una unidad LNA. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario, según la invención, no comprende una región de más de 5 unidades de nucleótido de ADN consecutivas. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario, según la invención, no comprende una región de más de 6 unidades de nucleótido de ADN consecutivas. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario, según la invención, no comprende una región de más de 7 unidades de nucleótido de ADN consecutivas. En una ' modalidad, el oligonucleótido monocatenario, según la invención, no comprende una región de más de 8 unidades de nucleótido de ADN consecutivas. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario, según la invención, no comprende una región de más de 3 unidades de nucleótido de ADN consecutivas. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario, según la invención, no comprende una región de más de 2 unidades de nucleótido de ADN consecutivas. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos la región que comprende al menos dos unidades consecutivas de análogo nucleótido, como al menos dos unidades LNA consecutivas. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos la región que comprende al menos tres unidades consecutivas de análogo nucleótido, como al menos tres unidades LNA consecutivas. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario de la invención no comprende una región de más de 7 unidades consecutivas de análogo nucleótido, como unidades LNA. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario de la invención no comprende una región de más de 3 unidades consecutivas de análogo nucleótido, como unidades LNA. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario de la invención no comprende una región de más de 5 unidades consecutivas de análogo nucleótido, como unidades LNA. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario de la invención no comprende una región de más de 4 unidades consecutivas de análogo nucleótido, como unidades LNA. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario de la invención no comprende una región de más de 3 unidades consecutivas de análogo nucleótido, como unidades LNA. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario de la invención no comprende una región de más de 2 unidades consecutivas de análogo nucleótido, como unidades LNA. En una modalidad, la primera o segunda nucleobase 3' del oligonucleótido monocatenario corresponde al segundo nucleótido 5' de la secuencia de micro-ARN. En una modalidad, las unidades de nucleobase 1 a 6 (incluido) del oligonucleótido monocatenario cuantificadas desde el extremo 3 ' del oligonucleótido monocatenario son complementarias a la secuencia de región simiente de micro-ARN. En una modalidad, las unidades de nucleobase 1 a 7 (incluido) del oligonucleótido monocatenario cuantificadas desde el extremo 3' del oligonucleótido monocatenario son complementarias a la secuencia de región simiente de micro-ARN. En una modalidad, las unidades de nucleobase 2 a 7 (incluido) del oligonucleótido monocatenario cuantificadas desde el extremo 3' del oligonucleótido monocatenario son complementarias a la secuencia de región simiente de micro-ARN. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos una unidad de análogo nucleótido, asi como al menos una unidad LNA, en una posición dentro de la región complementaria a la región simiente de miARN . En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario puede comprender entre una y 6 o entre 1 y 7 unidades de análogo nucleótido, tal como entre 1 y 6 y 1 y 7 unidades LNA, en una posición dentro de la región complementaria a la región simiente de miARN. En una modalidad, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido monocatenario que es complementaria a la secuencia de la región simiente de micro-ARN se selecciona a partir del grupo que comprende (X)Xxxxxx, (X)xXxxxx, (X)xxXxxx, (X)xxxXxx, (X)xxxxXx y (X)xxxxxX, como se lee en una dirección 3' - 5' , donde "X" denota un análogo nucleótido, (X) denota un análogo nucleótido opcional, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN . En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos dos unidades de análogo nucleótido, como al menos dos unidades LNA, en posiciones que son complementarias a la región simiente de miARN. En una modalidad, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido monocatenario que es complementaria a la secuencia de la región simiente de micro-ARN, se selecciona a partir del grupo que comprende (X)XXxxxx, (X)XxXxxx, (X)XxxXxx, (X)XxxxXx, (X)XxxxxX, (X)xXXxxx, (X)xXxXxx, (X)xXxxXx, (X)xXxxxX, (X)xxXXxx, (X)xxXxXx, (X)xxXxxX, (X)xxxXXx, (X)xxxXxX y (X)xxxxXX, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, (X) denota un análogo nucleótido opcional, como una unidad de LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos tres unidades de análogo nucleótido, asi como al menos tres unidades LNA, en posiciones que son complementarias a la región simiente de miARN . En una modalidad, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido monocatenario que es complementaria a la secuencia de la región simiente de micro-ARN, se selecciona a partir del grupo que comprende (X)XXXxxx, (X)xXXXxx, (X)xxXXXx, (X)xxxXXX, (X)XXxXxx, (X)XXxxXx, (X)XXxxxX, (X)xXXxXx, (X)xXXxxX, (X) xxXXxX, (X) XxXXxx, (X)XxxXXx, (X ) XxxxXX , (X ) xXxXXx , (X ) xXxxXX, (X ) xxXxXX, (X) xXxXxX y (X)XxXxXx, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, (X) denota un análogo nucleótido opcional, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos cuatro unidades de análogo nucleótido, asi como al menos cuatro unidades LNA, en posiciones que son complementarias a la región simiente de miARN. En una modalidad, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido monocatenario que es complementaria a la secuencia de la región simiente de micro-ARN, se selecciona a partir del grupo que comprende (X)xxXXX, (X)xXxXXX, (X)xXXxXX, (X)xXXXxX, (X)xXXXXx, (X)XxxXXXX, (X)XxXxXX, (X)XxXXxX, (X)XxXXx, (X) XXxxXX, (X)XXxXxX, (X)XXxXXx, (X)XXXxxX, (X)XXXxXx y (X)XXXXxx, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, (X) denota un análogo nucleótido opcional, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN . En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos cinco unidades de análogo nucleótido, como al menos cinco unidades LNA, en posiciones que son complementarias a la región simiente de miAR . En una modalidad, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido monocatenario que es complementaria a la secuencia de la región simiente de micro-ARN, se selecciona a partir del grupo que comprende (X)xXXXXX, (X)XxXXXX, (X)XXxXXX, (X)XXXxXX, (X)XXXXxX y (X)XXXXXx, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, (X) denota un análogo nucleótido opcional, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende seis o siete unidades de análogo nucleótido, asi como seis o siete unidades LNA, en posiciones que son complementarias a la región simiente de miARN. En una modalidad, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido monocatenario que es complementaria a la secuencia de la región simiente de micro-ARN, se selecciona a partir del grupo que comprende XXXXXX, XxXXXXX, XXxXXXX, XXXxXXX, XXXXxXX, XXXXXxX y XXXXXXx, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, asi como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN.

En una modalidad, los dos motivos de nucleobase en las posiciones 7 a 8, que se cuentan desde el extremo 3' del oligonucleótido monocatenario se seleccionan a partir del grupo que comprende xx, XX, xX y Xx, donde "X" denota un análogo nucleótido, asi como una unidad LNA y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN . En una modalidad, los dos motivos de nucleobase en las posiciones 7 a 8, que se cuentan desde el extremo 3' del oligonucleótido monocatenario se seleccionan a partir del grupo que comprende XX, xX y Xx, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos 12 nucleobases y donde los dos motivos de nucleobase en las posiciones 11 a 12, que se cuentan desde el extremo 3' del oligonucleótido monocatenario, se seleccionan a partir del grupo que comprende xx, XX, xX y Xx, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos 12 nucleobases y donde los dos motivos de nucleobase en las posiciones 11 a 12, que se cuentan desde el extremo 3' del oligonucleótido monocatenario, se seleccionan a partir del grupo que comprende XX, xX y Xx, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos 13 nucleobases y donde los tres motivos de nucleobase en las posiciones 11 a 13, que se cuentan desde el extremo 3', se seleccionan a partir del grupo que comprende xxx, Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX y XXX, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. En una modalidad, los tres motivos de nucleobase en las posiciones 11 a 13, que se cuentan desde el extremo 3' del oligonucleótido monocatenario, se seleccionan a partir del grupo que comprende Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX y XXX, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos 14 nucleobases y donde los cuatro motivos de nucleobase en las posiciones 11 a 14, que se cuentan desde el extremo 3', se seleccionan a partir del grupo que comprende xxxx, Xxxx, xXxx, xxXx, xxxX, XXxx, XxXx, XxxX, xXXx, xXxX, xxXX, XXXx, XxXX, xXXX, XXxX y XXXX donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. En una modalidad, los cuatro motivos de nucleobase en las posiciones 11 a 14 del oligonucleótido monocatenario, que se cuentan desde el extremo 3', se seleccionan a partir del grupo que comprende Xxxx, xXxx, xxXx, xxxX, XXxx, XxXx, XxxX, xXXx, xXxX, xxXX, XXXx, XxXX, xXXX, XXxX y XXXX, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN . En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende 15 nucleobases y los cinco motivos de nucleobase en las posiciones 11 a 15, que se cuentan desde el extremo 3', se seleccionan a partir del grupo que comprende Xxxxx, xXxxx, xxXxx, xxxXx, xxxxX, XXxxx, XxXxx, XxxXx, XxxxX, xXXxx, xXxXx, xXxxX, xxXXx, xxXxX, xxxXX, XXXxx, XXxxX, XxxXX, xXXXx, xxXXX, XXxXX, XxXxX, XXXXx, XXXxX, XXxXX, XxXXXX, xXXXX, y XXXXX donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende 16 nucleobases y los seis motivos de nucleobase en las posiciones 11 a 16, que se cuentan desde el extremo 3', se seleccionan a partir del grupo que comprende Xxxxxx, xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx, xxxxXx, xxxxxX, XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXXxx, xxXxXx, xxXxxX, xxxXXx, xxxXxX, xxxxXX, XXXxxx, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, XxXXxx, XxXxXx, XxXxxX, XxxXXx, XxxXxX, XxxxXX, xXXXxx, xXXxXx, xXXxxX, xXxXXx, xXxXxX, xXxxXX, xxXXXx, xxXXxX, xxXxXX, xxxXXX, XXXXxx, XXXxxX, XXxxXX, XxxXXX, xxXXXX, xXxXXX, XxXxXX, XXxXxX, XXXxXx, xXXxXX, XxXXxX, XXxXXx, xXXXxX, XxXXXx, xXXXXx, xXXXXX, XxXXXX, XXxXXX, XXXxXX, XXXXxX, XXXXXx, y XXXXXX donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN . En una modalidad, los seis motivos de nucleobase en las posiciones 11 a 16 del oligonucleótido monocatenario, que se cuentan desde el extremo 3', son xxXxxX, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. En una modalidad, la mayoría de las tres nucleobases 5' se seleccionan a partir del grupo que comprende Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX y XXX, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. En una modalidad, x" denota una unidad de ADN. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende una unidad de análogo nucleótido, como una unidad LNA, en el extremo 5' . En una modalidad, las unidades de análogo nucleótido, tal como X, se seleccionan indistintamente a partir del grupo que comprende: unidad de 2 ' -O-alquil-ARN, unidad de 2'-OMe-ARN, unidad de 2 ' -amino-ADN, unidad de T-fluoro-ADN, unidad LNA, unidad de PNA, unidad de HNA, unidad de INA. En una modalidad, todas las nucleobases del oligonucleótido monocatenario de la invención son unidades de análogo nucleótido.

En una modalidad, las unidades de análogo nucleótido, tal como X, Se seleccionan indistintamente a partir del grupo que comprende : unidades de 2'-0Me-ARN, unidades de 2 ' -fluoro-ADN, y unidades LNA, En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende la al menos una unidad análoga LNA y al menos una unidad de análogo nucleótido adicional LNA distinto. En una modalidad, la unidad o unidades de análogo nucleótido no LNA se seleccionan indistintamente a partir de unidades de 2 ' -OME-ARN ' -OMe y unidades de 2 ' -FLUORO-ADN . En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende en al menos una secuencia XYX o YXY, donde X es LNA e Y es una unidad de 2'-OMe-RNA y una unidad de 2 ' -fluoro-ADN . En una modalidad, la secuencia de nucleobases del oligonucleótido monocatenario comprende unidades X e Y alternativas . En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende la alternancia de unidades LNA y ADN (Xx) o (xX) . En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende un motivo de alternar LNA seguido de 2 unidades de ADN (Xxx) , xXx o xxX. En una modalidad, al menos una de las unidades de análogo nucleótido de DNA o no LNA es sustituida por una nucleobase LNA en una posición seleccionada de las posiciones identificadas como unidades de nucleobase de LNA en cualquiera de las modalidades a las que se les hizo referencia anteriormente . En una modalidad, "X" dona una unidad LNA. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos 2 unidades de análogo nucleótido, asi como al menos 3 unidades de análogo nucleótido, asi como al menos 4 unidades de análogo nucleótido, asi como al menos 5 unidades de análogo nucleótido, asi como al menos 6 unidades de análogo nucleótido, asi como al menos 7 unidades de análogo nucleótido, asi como al menos 8 unidades de análogo nucleótido, asi como al menos 9 unidades de análogo nucleótido, asi como al menos 10 unidades de análogo nucleótido . En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos 2 unidades LNA, asi como al menos 3 unidades LNA, asi como al menos 4 unidades LNA, asi como al menos 5 unidades LNA, asi como al menos 6 unidades LNA, asi como al menos 7 unidades LNA, asi como al menos 8 unidades LNA, asi como al menos 9 unidades LNA, asi como al menos 10 unidades LNA. En una modalidad donde al menos uno de los análogos nucléotidos, como unidades LNA, es la citosina o la guanina, asi como entre 1 - 10 de los análogos nucléotidos, como unidades LNA, es la citosina o la guanina, asi como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 del de los análogos nucléotidos, como unidades LNA, son la citosina o la guanina. En una modalidad, al menos dos de los análogos nucléotidos, como unidades LNA, es la citosina o la guanina. En una modalidad, al menos tres de los análogos nucléotidos, como unidades LNA, es la citosina o la guanina. En una modalidad, al menos cuatro de los análogos nucléotidos, como unidades LNA, es la citosina o la guanina. En una modalidad, al menos cinco de los análogos nucléotidos, como unidades LNA, es la citosina o la guanina. En una modalidad, al menos seis de los análogos nucléotidos, como unidades LNA, es la citosina o la guanina. En una modalidad, al menos siete de los análogos nucléotidos, como unidades LNA, es la citosina o la guanina. En una modalidad, al menos ocho de los análogos nucléotidos, como unidades LNA, es la citosina o la guanina. En una modalidad preferida, los análogos nucléotidos tienen una estabilidad doble térmica más elevada en un nucleótido de ARN complementario que la afinidad obligatoria de un nucleótido de ADN equivalente al nucleótido de ARN complementario . En una modalidad, los análogos nucléotidos confieren la estabilidad de suero potenciada al oligonucleótido monocatenario . En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario forma una conformación de A-hélice con una molécula de ARN monocatenaria complementaria.

Comúnmente existe un dúplex entre dos moléculas de ARN en una conformación de forma A, asi como también existe comúnmente un dúplex entre dos moléculas de ADN en una conformación de forma B. Comúnmente existe un dúplex entre una molécula de ADN y una molécula de ARN en una conformación intermedia (forma A/B) . El empleo de análogos nucléotidos, como beta-D-oxi LNA, puede utilizarse para promover una conformación más parecida a una forma A. Los dicromismos circulares convencionales (CD, por sus siglas en inglés) o análisis de R N se utilizan para determinar la forma de los dúplex entre los oligonucleótidos de la invención y las moléculas de ARN complementarias. Debido a que se piensa que el reclutamiento por el complejo de RISC sea dependiente de la conformación estructural especifica del objetivo de miARN/ARNm, los oligonucleótidos , de conformidad con la presente invención, en una modalidad pueden formar un dúplex de forma A/B con una molécula complementaria de ARN. Sin embargo, también determinamos que puede ser efectivo el uso de análogos nucléotidos que promueven la estructura de forma A, como el isómero alfa-L de LNA. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario forma una conformación de forma A/B con una molécula de ARN monocatenaria complementaria. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario forma una conformación de forma A con una molécula de ARN monocatenaria complementaria. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario, de conformidad con la invención, no interviene en la escisión basada de ARNasaH de una molécula de ARN monocatenaria complementaria. Comunmente se requiere una extensión de al menos 5 (comunmente no efectivo para el reclutamiento de ARNasaH) , más preferentemente al menos 6, más preferentemente al menos 7 u 8 nucleobases consecutivas de ADN (o nucleobases alternativas que pueden reclutar ARNasaH, como el alfa L-amino LNA) para que un oligonucleótido sea efectivo en el reclutamiento de ARNasaH. El documento EP 1 222 309 proporciona métodos in vitro para determinar actividad de ARNasaH, que puede utilizarse para determinar la capacidad de reclutar ARNasaH. Un compuesto se considera capaz de reclutar la ARNasaH si, cuando está proveído con el objetivo de ARN complementario, tiene una tasa inicial, cuantificada en pmol/l/min, de al menos 1%, como al menos 5%, como al menos 10% o menos que el 20 % del único oligonucleótido equivalente al ADN, sin substituciones 2', con grupos de unión de fosforotioato entre todos los nucleótidos en el oligonucleótido, usando la metodología proporcionada por el Ejemplo 91 - 95 de EP 1 222 309. Un compuesto se considera esencialmente incapaz de reclutar ARNasaH si, cuando está proveído con el objetivo de ARN complementario y ARNasaH, la tasa de inicial de ARNasaH, cuantificada en pmol/l/min, es menor que 1%, como menor que 5%, como menor que 10% o menor que el 20% de la tasa inicial determinada con la utilización del único oligonucleót ido equivalente al ADN, sin substituciones 2 ' , con grupos de unión de fosfotioato entre todos los nucleótidos en el oligonucleótido, utilizando la metodología proporcionada por el Ejemplo 91 - 95 de EP 1 222 309. En una modalidad muy preferida, el oligonucleótido monocatenario de la invención es capaz de formar un dúplex con una molécula de ARN monocatenaria complementaria ácida nucleica (por lo general, aproximadamente devla misma longitud del oligonucleótido monocatenario) con enlaces de internucleósido de fosfodiéster , donde el dúplex tiene un Tm de al menos aproximadamente 60°C, de hecho se prefiere que el oligonucleótido monocatenario es capaz de formar un dúplex con una molécula ácida nucléica de ARN monocatenario complementario con enlaces de internucleósido de fosfodiéster , donde el dúplex tiene un Tm de entre aproximadamente 70°C hasta aproximadamente 95°C, así como un Tm de entre aproximadamente 70°C hasta aproximadamente 90°C, así como entre aproximadamente 70°C y sobre 85°C. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario es capaz de formar un dúplex con una molécula ácida nucleica de ADN monocatenario complementario con enlaces de internucleósido de fosfodiéster , donde el dúplex tiene un Tm de entre aproximadamente 50°C hasta aproximadamente 95°C, asi como entre aproximadamente 50°C hasta aproximadamente 90°C, asi como al menos aproximadamente 55°C, asi como al menos aproximadamente 60°C o no más que aproximadamente 95°C En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario puede tener una longitud de entre 14-16 nucleobases, incluyendo 15 nucleobases . En una modalidad, la unidad o unidades LNA se seleccionan indistintamente a partir del grupo que comprende oxi-LNA, tiol-LNA, y amino-LNA, en de las configuraciones de L-a y D-ß o en combinaciones de lo mismo. En una modalidad especifica, las unidades LNA pueden ser una nucleobase de ENA. En un la modalidad, las unidades LNA son beta D oxi-LNA.

En una modalidad, las unidades LNA están en alfa-L amino LNA. En una modalidad preferible, el oligonucleótido monocatenario comprende entre 3 y 17 unidades LNA. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos un grupo de unión de internucleósido que se diferencia del fosfato. En una modalidad, el oligonucleótido monocatenario comprende al menos un enlace de internucleósido de fosforotioato .

En una modalidad, el oligonucleotido monocatenario comprende enlaces de fosforotioato y fosfodiéster . En una modalidad, todos los enlaces de internucleósido son enlaces de fosforotioato . En una modalidad, el oligonucleotido monocatenario comprende al menos un enlace de internucleósido de fosfodiéster . En una modalidad, todos los enlaces de internucleósido del oligonucleotido monocatenario de la invención son enlaces de fosfodiéster . En una modalidad, de conformidad con la invención, la composición farmacéutica comprende un portador, como solución salina o solución salina amortiguada. En una modalidad, el método para la síntesis de un oligonucleotido monocatenario apuntado contra un micro-ARN de humano, se lleva a cabo en dirección 3' a 5' y a-f. El método para la síntesis del oligonucleotido monocatenario de conformidad con la invención puede llevarse a cabo usando la síntesis de oligonucleotido de fase sólida convencional. Otras modalidades de la invención, que pueden combinarse con las modalidades anteriores, se muestran en las reivindicaciones y con el título "Otras modalidades".

Definiciones El término 'nucleobase' se refiere a nucleótidos, como ADN y ARN, y análogos nucléotidos . El término "oligonucleótido" (o simplemente "oligo") se refiere, en el contexto de la presente invención, a una molécula formada por el enlace covalente de dos o más nucleobases. Cuando se utiliza en el contexto del oligonucleótido de la invención (también referido como oligonucleótido monocatenario) , el término "oligonucleótido" puede tener, en una modalidad, por ejemplo, entre 8-26 nucleobases, tal como entre 10 a 26 nucleobases, tal como entre 12 a 26 nucleobases. En una modalidad preferible, como se detalla aquí, el oligonucleótido de la invención tiene una longitud de entre 8-17 nucleobases, tal como entre 20-27 nucleobases tal como entre 8-16 nucleobases, tal como entre 12-15 nucleobases, En tal modalidad, el oligonucleótido de la invención puede tener una longitud de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 nucleobases. Se reconocerá que para oligonucleótidos más cortos puede ser necesario aumentar la proporción de análogos nucléotidos (de elevada afinidad) , como el LNA. Por lo tanto, en una modalidad, al menos aproximadamente el 30 % de las nucleobases son análogos nucléotidos, asi como al menos aproximadamente el 33 %, asi como al menos aproximadamente el 40 % o al menos aproximadamente el 50 % o al menos aproximadamente el 60 %, asi como al menos aproximadamente el 66 %, asi como al menos aproximadamente el 70 %, asi como al menos aproximadamente el 80 % o al menos aproximadamente el 90 %. También será evidente que el oligonucleótido puede comprender una secuencia de nucleobase que comprende sólo secuencias de análogo nucleótido. Aquí, el término "base nitrogenada" pretende cubrir purinas y pirimidinas, como las nucleobases de ADN A, C, T y G, las nucleobases de ARN A, C, U y G, asi como nucleobases de no ADN/ARN, como la 5-metilcitosina (MeC) , isocitosina, seudoisositocina , 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 5-propinil-6-fluoroluracilo, 5-metiltiazoluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina , inosina, 2 , 6-diaminopurine , 7-propin-7-deazaadenina, 7-propin-7-deazaguanina y 2-cloro-6-aminopurina, particularmente MeC . Se creerá que la selección actual de la nucleobase de no ADN/ARN dependerá de la correspondencia del nucleótido presente en el hilo de micro-ARN al cual pretende apuntar el oligonucleótido. Por ejemplo, si el nucleótido correspondiente es G será normalmente necesario seleccionar una nucleobase de no ADN/ARN que sea capaz de establecer enlaces de hidrógeno a G. En este caso especifico, donde el nucleótido correspondiente es G, un ejemplo típico de una nucleobase de no ADN/ARN preferida es MeC. El término "grupo de unión de internucleósido" pretende significar un grupo capaz de acoplar covalente y conjuntamente dos nucleobases, así como entre unidades de ADN, entre unidades de ADN y análogos nucléotidos, entre dos unidades no LNA, entre una unidad no LNA y una unidad LNA, y entre dos unidades LNA, etc. Los ejemplos preferidos incluyen fosfato, grupos de fosfodiéster y grupos de fosforot ioato . El enlace de internucleósido puede seleccionarse a partir del grupo que comprende: -0-P (0) 2-0-P (07S) -0-, -0-P(S)2-0-, -S-P(0)2-0-, -S-P (0, S) -0-, -S-P(S)2-0-, -0-P(0)2-S-, -0-P(0,S)-S-, -S-P(0)2-S-, -O-PO(RH) -0-, 0-PO (0CH3 ) -0- , -0-P0(NRH)-0-, -0-PO (OCH2CH2S-R) -0-, -0-PO ( BH3 ) -0- , -O-PO(NHRH)-0-, -0-P(0) 2-NRH-, -NRH-P (0) 2-0-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH- , y/o el enlace de internucleósido puede seleccionarse a partir del grupo que comprende: -0-CO-O-, -0-CO-NRH-, -NRH-C0-CH2- , -0-CH2-C0-NRH-, -0-CH2-CH2-NRH- , -C0-NRH-CH2- , -CH2-NRH-C0- , -0-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-0-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-S02-CH2-, -CH2-C0-NRH-, -0-CH2-CH2-NRH-CO-, -CH2-NCH3-0-CH2-, donde RH se selecciona a partir de hidrógeno y alquilo Cl-4. Apropiadamente, en algunas modalidades, el azufre (S) que contiene enlaces de internucleósido, como se dijo con anterioridad, puede ser preferido. Los términos "correspondiente a" "y corresponden a", como se usan en el contexto de oligonucleótidos se refiere a la comparación entre una secuencia de nucleobase del compuesto de la invención, y el complemento inverso de lo mismo, o en una modalidad entre una secuencia de nucleobase y una secuencia de nucleobase (idéntica) equivalente que puede comprender, por ejemplo, otras nucleobases, pero retiene la misma secuencia baja, o complemento de lo mismo. Los análogos nucléotidos se comparan directamente con sus nucleótidos naturales equivalentes o correspondientes. Las secuencias que forman el complemento inverso de una secuencia están aquí descritas como la secuencia de complemento de la secuencia. Cuando se hace referencia a la longitud de una molécula nucleotidica como está referido aquí, la longitud corresponde a la cantidad de unidades de monómero, es decir nucleobases, independientemente en cuanto a si aquellas unidades de monómero son nucleótidos o análogos nucléotidos. Con respecto a nucleobases, los términos monómero y unidad se usan de modo indistinto aquí. Hay que entender que cuando el término "aproximadamente" se usa en el contexto de valores específicos o los intervalos de los valores, la descripción debería ser leída para incluir el valor específico o intervalo al que se hace referencia. Los análogos de ADN preferidos incluyen análogos de ADN donde el grupo 2 ' -H es substituido con otra substitución que -AH (ARN) , por ejemplo, por la substitución con, -0-CH3 , -0-CH2-CH2-0-CH3, -0-CH2-CH2-CH2-NH2, -0-CH2-CH2-CH2-OH o, -F. Los análogos de ARN preferidos incluyen análogos de ARN que han sido modificados en su grupo de 2 '-OH, por ejemplo, por la substitución con otro grupo que - H (ADN) , por ejemplo, -0-CH3 , -0-CH2-CH2-O-CH3 , -0-CH2-CH2-CH2-NH2 , -0-CH2-CH2-CH2-OH o, -F. En una modalidad, el análogo nucleótido es "ENA" . Cuando se utiliza en el presente contexto, los términos "unidad LNA" , "monómero LNA" , "residuo LNA", "unidad de ácido nucleico bloqueado", "monómero de ácido nucleico- bloqueado" o "residuo de ácido nucleico bloqueado", se refiere a un análogo de nucleósido bicíclico. Entre otras cosa, las unidades LNA se describen en WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475 y WO 03/095467. La unidad LNA también puede definirse con respecto a su fórmula química. Así, una "unidad LNA", como se usa aquí, tiene la estructura química que se muestra en el siguiente Esquema de reacción: Esquema de reacción 1 donde X se selecciona a partir del grupo que comprende O, S y NRH, donde RH es H o alquilo Cl-4; Y es (-CH2) r, donde r es un número entero de 1-4; y B es una base nitrogenada. Cuando se hace referencia a la substitución de una unidad de ADN por su unidad LNA correspondiente en el contexto de la presente invención, el término "unidad LNA correspondiente" pretende significar que la unidad de ADN ha sido sustituida por una unidad LNA que contiene la misma base nitrogenada que la unidad de ADN que ha sustituido, por ejemplo, la unidad LNA correspondiente de una unidad de ADN que contiene la base nitrogenada, también contiene la base nitrogenada A. La excepción es que cuando una unidad de ADN contiene la base C, la unidad LNA correspondiente puede contener la base C o la base MeC, preferentemente MeC Aquí, el término "unidad no LNA" se refiere a un nucleósido diferente de una unidad LNA, es decir el término "unidad no LNA" incluye una unidad de ADN asi como una unidad de ARN . Una unidad no LNA preferida es una unidad de ADN. Los términos "unidad", "residuo" "y monómero" se usan aquí de modo indistinto. En el presente contexto, el término "conjugado" pretende indicar una molécula heterogénea formada por la unión covalente de un oligonucleótido como se describe aquí a una o varias porciones no nucleótidas o no polinucleotidicas . Los ejemplos de porciones no nucleótidas o no polinucleotidicas incluyen reactivos macromoleculares , como proteínas, cadenas de ácido graso, residuos de azúcar, glucoproteínas , polímeros o combinaciones de lo mismo. Comunmente las proteínas pueden ser anticuerpos para una proteína con especificidad de objetivo. Polímeros típicos pueden ser el polietilenglicol . El término "al menos un" abarca un número entero más grande que o igual a 1, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etcétera. Los términos "un" o "una", como se usan con un nucleótido, un agente, una unidad LNA, etc., pretenden significar uno o varios. En particular, la expresión "un componente (como un nucleótido, un agente, una unidad LNA, o lo similar) seleccionado a partir del grupo que comprende..." pretende significar que uno o varios de los componentes citados pueden ser seleccionados. Asi, las expresiones como "un componente seleccionado a partir del grupo que comprende A, B y C" pretenden incluir todas las combinaciones de A, B y C, es decir. A, B, C, A+B, A+C, B+C y A+B+C. El término "unidad tiol-LNA" se refiere a una unidad LNA donde X en Esquema de reacción 1 es S. Una unidad tiol-LNA puede ser tanto en la forma de beta-D como en la forma alfa-L. Generalmente, se prefiere la forma de beta-D de la unidad tiol-LNA. La forma beta-D y la forma alfa-L de una unidad tiol-LNA se muestran en el Esquema de reacción 3 como compuestos 3A y 3B, respectivamente. El término "unidad LNA amino" se refiere a una unidad LNA en la cual X en Esquema de reacción 1 es NH, o NRH, donde RH es el hidrógeno o el alquilo Cl-4. Una unidad LNA amino puede estar tanto en la forma de beta-D como en la forma alfa-L. Generalmente, se prefiere la forma de beta-D de la unidad LNA amino. La forma beta-D y la forma alfa-L de una unidad LNA amino se muestran en el Esquema de reacción 4 como compuestos 4A y 4B, respectivamente. El término "unidad LNA oxi" se refiere a una unidad LNA en la cual X en el Esquema de reacción 1 es 0. Una unidad LNA oxi puede estar tanto en la forma de beta-D como en la forma alfa-L. Generalmente, se prefiere la forma de beta-D de la unidad LNA oxi. La forma de beta-D y la forma alfa-L de una unidad LNA oxi se muestran en el Esquema de reacción 5 como compuestos 5A y 5B, respectivamente. En el contexto presente, el término "alquilo Ci-6" pretende significar una cadena de hidrocarburo saturada lineal o ramificada donde las cadenas más largas tienen de uno a seis átomos de carbono, como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, ter-butilo, pentilo, isopentilo, neopentilo y hexilo. Una cadena de hidrocarburo ramificada pretende significar que un alquilo Ci_6 substituyó a cualquier de carbono con una cadena de hidrocarburo. En el contexto presente, el término "alquilo Ci_4" pretende significar una cadena de hidrocarburo saturada lineal o ramificada donde las cadenas más largas tienen de uno a cuatro átomos de carbono, como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo y ter-butilo. Una cadena de hidrocarburo ramificada pretende significar que un alquilo Ci_4 substituyó a cualquier de carbono con una cadena de hidrocarburo.

Cuando se usa aquí, el término "alcoxilo Ci-6M pretende significar alquiloxilo Ci_6, como metoxilo, etoxilo, n-propoxilo, isopropoxilo, n-butoxilo, isobutoxilo, sec-butoxilo, ter-butoxilo, pentoxilo, isopentoxilo , neopentoxilo y hexoxilo. En el contexto presente, el término "alquenilo C2- " pretende significar un grupo de hidrocarburo lineal o ramificado que tiene de dos a seis átomos de carbono y que contiene uno o varios dobles enlaces. Los ejemplos ilustrativos de grupos de alquenilo C2-6 incluyen el alilo, el homoalilo, el vinilo, el crotilo, el butenilo, el butadienilo, el pentenilo, el pentadienilo, el hexenilo y el hexadienilo. La posición de la insaturación (doble enlace) puede estar en cualquier posición a lo largo de la cadena de carbono. En el contexto presente, el término "alquinilo C2-6" pretende significar grupos de hidrocarburo lineales o ramificados que contienen de dos a seis átomos de carbono y que contienen uno o varios enlaces triples. Los ejemplos ilustrativos de grupos de alquinilo C2-6 incluyen el acetileno, el propinilo, butinilo, el pentinilo y el hexinilo. La posición de insaturación (enlace triple) puede estar en cualquier posición a lo largo de la cadena de carbono. Más de un enlace puede estar insaturado de manera que el alquinilo "C2-6" sea una di-ina o una enedi-ina como lo conoce el experto en la técnica.

Como se usa aquí, "hibridación" significa la unión de hidrógeno, que puede ser Watson-Crick, Hoogsteen, Hoogsteen invertido, unión de hidrógeno, etc., entre nucleósido complementario o bases nucleotidicas . Las cuatro nucleobases comúnmente descubiertas en el ADN son G, A, T y C cuyos pares G son C, y A son T. En el ARN, T es sustituido por el uracilo (U) , que luego forma pares con A. Los grupos químicos en las nucleobases que participan en la formación dúplex convencional constituyen la fase Watson-Crick. Hoogsteen mostró un par de años después que las nucleobases de purina (G y A) además de su fase Watson-Crick hacen a Hoogsteen orientar hacia lo que puede ser reconocido del exterior de un dúplex, y se usa para unir oligonucleótidos de pirimidina vía la unión de hidrógeno, así formando una estructura de triple hélice. En el contexto de la presente invención "complementaria" se refiere a la capacidad para el apareamiento preciso entre dos secuencias de nucleótidos entre sí. Por ejemplo, si un nucleotido a una cierta posición de un oligonucleótido es capaz de la unión de hidrógeno con un nucleotido a la posición correspondiente de una molécula de ADN o ARN, entonces se considera que el oligonucleótido y el ADN o ARN son complementarios entre sí en aquella posición. El hilo de ADN o ARN se considera complementario entre sí cuando un número suficiente de nucleótidos en el oligonucleótido puede formar enlaces de hidrógeno con nucleótidos correspondientes en el ADN o ARN con especificidad de objetivo para permitir la formación de un complejo estable. Para ser estable in vitro o in vivo la secuencia de un oligonucleótido no tiene que ser el 100 % complementaria a su micro-ARN con especificidad de objetivo. Los términos "complementario" y "expresamente hibridizable" , implican que el oligonucleótido se une suficiente, resistente y específicamente a la molécula con especificidad de objetivo para proveer la interferencia deseada de la función normal del objetivo y no afecta a la función de ARN sin especificidad de objetivo. En un ejemplo preferido el oligonucleótido de la invención es el 100 % complementario a una secuencia de micro-ARN de humano, como una de las secuencias de micro-ARN referidas a aquí. En un ejemplo preferido, el oligonucleótido de la invención comprende una secuencia contigua que es el 100 % complementaria a la región simiente de la secuencia de micro-ARN de humano. Los microARN son ARN no codificadores, cortos, derivados de genes endógenos que actúan como reguladores postranscripcionales de la expresión génica. Son procesados a partir precursores más largos (ca 70-80 nt) parecidos a una horquilla los precursores parecidos a una horquilla llamados pre-miARN mediante la ARNasa III Dicer enzimático. Los microARN se ensamblan en complejos ribonucleoproteínicos llamados miRNPs y reconocen sus sitios con especificidad de objetivo por la complementariedad de antisentido que interviene en la regulación identificadora de sus genes con especificidades de objetivo. La complementariedad casi perfecta o perfecta entre el miARN y su sitio con especificidad de objetivo da como resultado la escisión de ARNm con especificidad de objetivo, mientras que la complementariedad limitada entre el micro-ARN y el sitio con especificidad de objetivo da como resultado la inhibición traductorial del gen con especificidad de objetivo. El término "micro-ARN" "o miARN", en el contexto de la presente invención, significa un oligonucleótido de ARN que comprende de entre 18 a 25 nucleótidos. En términos funcionales los miARN son moléculas de ARN endógenas comunmente reguladoras. Los términos "micro-ARN con especificidad de objetivo" o "miARN con especificidad de objetivo" u "objetivo miARN" se refieren a un micro-ARN con una función biológica en enfermedad de humano, por ejemplo, un miARN regulado aceleradamente, oncogénico o un miARN inhibidor de tumor en cáncer, siendo asi un objetivo para la intervención terapéutica de la enfermedad en cuestión. Los términos "gen con especificidad de objetivo" o "ARNm con especificidad de objetivo" se refieren a objetivos de ARNm reguladores de micro-ARN, donde "el gen con especificidad de objetivo" o "ARNm con especificidad de objetovo" se regula postraductorialmente mediante el micro-ARN basado la complementariedad aproximadamente casi perfecta o perfecta entre el miARN y su sitio con especificidad de objetivo dando como resultado la escisión de ARNm; o complementariedad limitada, a menudo conferida como complementariedad entre la llamada secuencia simiente (nucleótidos 2-7 del miARN) y el sitio con especificidad de objetivo dando como resultado la inhibición traductorial del ARNm con especificidad de obj etivo . En el contexto de la presente invención, el oligonucleótido es monocatenario, esto se refiere a la situación donde el oligonucleótido está en ausencia de un oligonucleótido complementario, es decir, no es un complejo de oligonucleótido bicatenario, como un siARN. En una modalidad, la composición según la invención no comprende un oligonucleótido adicional que tiene una región de complementariedad con el oligonucleótido monocatenario de cinco o más nucleobases consecutivas, tal como ocho o más, o 12 o más nucleobases más consecutivas. Se considera que el oligonucleótido adicional no está enlazado covalentemente al oligonucleótido monocatenario.

LNA que contiene oligonucleótidos de la invención Mientras las unidades LNA y las unidades no LNA pueden combinarse de varios modos para formar oligonucleótidos, ha sido sorprendentemente descubierto por los inventores de la presente invención que una cierta secuencia de ADN nuclear y una cierta presencia de unidades LNA en la secuencia de ADN dan como resultado una inhibición particularmente elevada del micro-ARN. Esta presencia de unidades LNA en la secuencia nuclear de los oligonucleótidos de la presente invención hizo los oligonucleótidos muy resistentes a la nucleasa. Los nucleótidos fuera de la secuencia nuclear pueden ser tanto unidades LNA como unidades no LNA. En una modalidad, las unidades no LNA fuera de la secuencia nuclear son unidades de ADN.

La secuencia nuclear Para los oligonucleótidos de antisentido de la presente invención para inhibir sus micro-ARN con especificidades de objetivo tan eficazmente como sea posible, debe haber un cierto grado de complementariedad entre el oligonucleótido de antisentido de la presente invención y el micro-ARN con especificidad de objetivo correspondiente. Es particularmente importante para los oligonucleótidos de la presente invención ser complementario con posiciones 3 a 8, contando del extremo 5', del micro-ARN con especificidad de objetivo correspondiente. El nucleótido 1, contando del extremo 5', en algunos micro-ARN con especificidades de objetivo es una base de no pareo y se esconde con mayor probabilidad en una cavidad del sitio de unión en la proteina de Ago 2. En consecuencia, el oligonucleótido de la invención puede o no puede tener un nucleótido en la posición 1, que se cuenta desde el extremo 3', correspondiente al nucleótido 1, que se cuenta desde el extremo 5', del micro-ARN con especificidad de objetivo correspondiente. En algunos casos, los dos primeros nucleótidos, que se cuentan desde el extremo 5', del micro-ARN con especificidad de objetivo correspondiente pueden ser mantenidos incomparables. La secuencia nuclear de los oligonucleótidos de la presente invención es por lo tanto una secuencia de ADN de posiciones uno a seis, dos a siete o posiciones tres a ocho, contando desde el extremo 3', correspondiente a posiciones tres a ocho, contando desde el extremo 5' , del micro-ARN con especificidad de objetivo correspondiente. miR-19b Un micro-ARN con especificidad de objetivo particular es llamado miR-19b. La secuencia de miR-19b de posiciones tres a ocho, contando del extremo 5', es ugcaaa (ver GenBank loci AJ421740 y AJ421739) . La secuencia de ADN correspondiente es acgttt . Los inventores de la presente invención han descubierto además que a fin de maximizar la inhibición de los micro-ARN con especificidades de objetivo, los oligonucleótidos de la presente invención deben contener al menos una unidad LNA en su secuencia nuclear. En consecuencia, un primer aspecto de la invención está relacionado con un oligonucleótido según la invención, como un oligonucleótido que tiene una longitud de 12 a 26 nucleótidos que tienen la secuencia de ADN de posiciones uno a seis, dos a siete o tres a ocho, preferentemente de posiciones dos a siete o tres a ocho, contando desde el extremo 3': acgttt, (SEQ ID NO 6) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos o tres, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. La complementariedad con nucleótidos adicionales del micro-ARN con especificidad de objetivo puede potenciar la inhibición del micro-ARN con especificidad de objetivo. Por lo tanto, una modalidad es el oligonucleótido que como se describió anteriormente tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, preferentemente de posiciones dos a ocho o tres a nueve, contando desde el extremo 3 ' : acgttta, (SEQ ID NO 70) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. En otra modalidad, el oligonucleótido según la presente invención tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, preferentemente de posiciones dos a nueve o tres a diez, contando desde el extremo 3': acgtttag, (SEQ ID NO 71) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. Aún en otra modalidad, el oligonucleótido según la presente invención tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, preferentemente de posiciones dos a diez o tres a once, contando desde el extremo 3' : acgtttagg, (SEQ ID NO 72) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres, incluso más preferentemente al menos cuatro, tal como cuatro o cinco, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. miR-122a Otro micro-ARN con especificidad de objetivo interesante es miR-122a. La secuencia de miR-122a de posiciones tres a ocho, contando desde el extremo 5', es gagugu (ver la entrada de miRBase HGNC : MIRN122A) . La secuencia de ADN correspondiente es ctcaca. En consecuencia, un segundo aspecto de la presente invención está relacionado con un oligonucleótido según la invención, como un oligonucleótido que tiene una longitud de 12 a 26 nucleótidos que tienen la secuencia de ADN de posiciones uno a seis, dos a siete o tres a ocho, preferentemente de posiciones dos a siete o tres a ocho, contando desde el extremo 3 ' : ctcaca, (SEQ ID NO 7) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos o tres, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. Una modalidad está relacionada con el oligonucleótido de antagomir de miR-122a que como se describió anteriormente tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, preferentemente de posiciones dos a ocho o tres a nueve, contando desde el extremo 3' : ctcacac, (SEQ ID NO 73) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente.

En otra modalidad, el oligonucleótido según la presente invención tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, preferentemente de posiciones dos a nueve o tres a diez, contando desde el extremo 3': ctcacact, (SEQ ID NO 74) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. En aún otra modalidad, el oligonucleótido según la presente invención tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, preferentemente de posiciones dos a diez o tres a once, contando desde el extremo 3' : ctcacactg, (SEQ ID NO 75) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres, incluso más preferentemente al menos cuatro, tal como cuatro o cinco, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. miR-155 Otro micro-ARN con especificidad de objetivo interesante es miR-155. La secuencia de miR-155 de posiciones tres a ocho, contando desde el extremo 5 ' , es aaugcu (ver la entrada de miRBase HGINC : IRN155 ) . La secuencia de ADN correspondiente es ttacga . En consecuencia, un tercer aspecto de la invención está relacionado con un oligonucleót ido según la invención, como un oligonucleót ido que tiene una longitud de 12 a 26 nucleótidos que tienen la secuencia de ADN de posiciones uno a seis, dos a siete o tres a ocho, preferentemente de posiciones dos a siete o tres a ocho, contando desde el extremo 3' : ttacga, (SEQ ID NO 8) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos o tres, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. En una modalidad, el oligonucleót ido de antagomir de miR-155 como se describió anteriormente tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, preferentemente de posiciones dos a ocho o tres a nueve, contando desde el extremo 3' : ttacgat, (SEQ ID NO 76) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. En otra modalidad, el oligonucleótido según la presente invención tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, preferentemente de posiciones dos a nueve o tres a diez, contando desde el extremo 3': ttacgatt, (SEQ ID NO 77) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. En aún otra modalidad, el oligonucleótido según la presente invención tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, preferentemente de posiciones dos a diez o tres a once, contando desde el extremo 3 ' : ttacgatta, (SEQ ID NO 78) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres, incluso más preferentemente al menos cuatro, tal como cuatro o cinco, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. miR-375 Aún otro micro-ARN con especificidad de objetivo interesante es miR-375. La secuencia de miR-375 de posiciones tres a ocho, contando del extremo 5 ' , es uguucg (ver la entrada de miRBase HGNC : MIRN375 ) . La secuencia de ADN correspondiente es acaagc. En consecuencia, un cuarto aspecto de la invención está relacionado con un oligonucleót ido según la invención, como un oligonucleót ido que tiene una longitud de 12 a 26 nucleótidos que tienen la secuencia de ADN de posiciones uno a seis, dos a siete o tres a ocho, preferentemente de posiciones dos a siete o tres a ocho, contando desde el extremo 3' : acaagc; (SEQ ID NO 9) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos o tres, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. En una modalidad, el oligonucleót ido de antagomir de miR- 375 como describe con anterioridad tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, preferentemente de posiciones dos a ocho o tres a nueve, contando desde el extremo 3 ' : acaagca, (SEQ ID NO 79) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. En otra modalidad, el oligonucleót ido según la presente invención tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, preferentemente de posiciones dos a nueve o tres a diez, contando desde el extremo 3' : acaagcaa, (SEQ ID NO 80) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. En aún otra modalidad, el oligonucleótido según la presente invención tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, preferentemente de posiciones dos a diez o tres a once, contando desde el extremo 3' : acaagcaag, (SEQ ID NO 81) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres, incluso más preferentemente al menos cuatro, tal como cuatro o cinco, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente.

Modificación de nucleótidos en la secuencia nuclear Como se menciona anteriormente, en la secuencia nuclear de los oligonucleótidos de la presente invención al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos o tres, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. Los inventores presentes han descubierto además que la inhibición de los micro-ARN con especificidades de objetivo puede ser aumentada además al asegurarse que dos unidades LNA en la secuencia nuclear están separadas por al menos una unidad de ADN.

En consecuencia, una modalidad de la invención está relacionada con el oligonucleótido como se describió anteriormente, donde al menos dos, tal como dos o tres, las unidades de ADN de posiciones uno a seis, dos a siete o tres a ocho, preferentemente de posiciones dos a siete o tres a ocho, contando desde el extremo 3', han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente y donde las unidades LNA están separadas por al menos una unidad de ADN. Los inventores presentes también han descubierto que la inhibición de micro-ARN con especificidades de objetivo puede estar aumentada incluso además al asegurarse que dos unidades LNA en la secuencia nuclear están separadas por como máximo dos unidades de ADN. En consecuencia, en una modalidad, la presente invención está relacionada con el oligonucleótido como se describió anteriormente, donde la cantidad de unidades de ADN consecutivas de posiciones uno a seis, dos a siete o tres a ocho, preferentemente de posiciones dos a siete o tres a ocho, contando desde 1 extremo 3', es como máximo dos. Las conclusiones se aplican a la secuencia nuclear en si, es decir el descubrimiento se aplica a las posiciones de los oligonucleótidos de la presente invención correspondiente a la secuencia nuclear. Por lo tanto, otra modalidad está relacionada con el oligonucleótido como se describió anteriormente, donde al menos dos, tal como dos, tres o cuatro, las unidades de ADN de posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, preferentemente de posiciones dos a ocho o tres a nueve, contando desde el extremo 3', han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente y donde las unidades LNA están separadas por al menos una unidad de AD . Otra modalidad está relacionada con el oligonucleótido como se describió anteriormente, donde la cantidad de unidades de ADN consecutivas de posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, preferentemente de posiciones dos a ocho o tres a nueve, contando desde el extremo 3', es como máximo dos. Aún otra modalidad está relacionada con el oligonucleótido como se describió anteriormente, donde al menos dos, tal como dos, tres o cuatro, las unidades de ADN de posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, preferentemente de posiciones dos a nueve o tres a diez, contando desde el extremo 3', han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente y donde las unidades LNA están separadas por al menos una unidad de ADN. Aún otra modalidad está relacionada con el oligonucleótido como se describió anteriormente, donde la cantidad de unidades de ADN consecutivas de posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, preferentemente de posiciones dos a nueve o tres a diez, contando desde el extremo 3', es como máximo dos. Todavía otra modalidad está relacionada con el oligonucleótido como se describió anteriormente, donde al menos dos, tal como dos, tres, cuatro o cinco, las unidades de ADN de posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, preferentemente de posiciones dos a diez o tres a once, contando desde el extremo 3', han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente y donde las unidades LNA están separadas por al menos una unidad de ADN. Todavía otra modalidad está relacionada con el oligonucleotido como se describió anteriormente, donde la cantidad de unidades de ADN consecutivas de posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, preferentemente de posiciones dos a diez o tres a once, contando desde el extremo 3', es como máximo dos.

Modificación de nucleótidos fuera de la secuencia nuclear Como se menciona anteriormente, los nucleótidos fuera de la secuencia nuclear pueden ser ambos unidades LNA y/o unidades no LNA. En una modalidad, la invención está relacionada con el oligonucleotido como se describió anteriormente, donde la cantidad de unidades LNA fuera de la secuencia nuclear es al menos 1, tal como 1, dos, tres o cuatro, y donde las unidades LNA están separadas por al menos una unidad no LNA. En otra modalidad, el patrón de substitución fuera de la secuencia nuclear es tal que la cantidad de unidades no LNA consecutivas fuera de la secuencia nuclear es como máximo dos.

Modificación de nucleótidos en posiciones 3 a 8 contando desde el extremo 3' A continuación las modalidades que se refieren a la modificación de nucleótidos en posiciones 3 a 8, contando desde el extremo 3', las unidades LNA pueden ser sustituidas por otros análogos nucléotidos, como aquellos referidos aquí. "X" puede, por lo tanto seleccionarse a partir del grupo que comprende unidad de 2 ' -O-alquil-RNA, unidad de 2 ' -OMe-RNA, unidad de 2 ' -amino-ADN , unidad de 2 ' -fluoro-ADN , unidad LNA, unidad de PNA, unidad de HNA, la unidad de INA, "x" es preferentemente el ADN o ARN, más preferentemente ADN. En una modalidad interesante de la invención, los oligonucleótidos de la invención son modificados en posiciones 3 a 8, contando del extremo 3 ' . El diseño de esta secuencia puede ser definido por la cantidad de las unidades no LNA presentes o por la cantidad de unidades LNA presentes. En una modalidad preferida del primero, al menos 1, tal como 1, de los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', es una unidad no LNA. En otra modalidad, al menos dos, tal como dos, de los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', son unidades no LNA. En aún otra modalidad, al menos tres, tal como tres, de los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', son unidades no LNA. En todavía otra modalidad, al menos cuatro, tal como cuatro, de los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', son unidades no LNA. En otra modalidad, al menos cinco, tal como cinco, de los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', son unidades no LNA. En aún otra modalidad, seis nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', son unidades no LNA. En una modalidad preferida, la unidad no LNA es una unidad de ADN . Como se define alternamente en una modalidad preferida, el oligonucleótido según la invención comprende al menos una unidad LNA en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3'. En una modalidad de lo mismo, el oligonucleótido según la presente invención comprende una unidad LNA en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3'. El patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', puede seleccionarse a partir del grupo que comprende Xxxxxx, xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx, xxxxXx y xxxxxX, donde "X" denota una unidad LNA y "Y"denota una unidad no LNA.

En otra modalidad, el oligonucleótido según la presente invención comprende al menos dos unidades LNA en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3'. En una modalidad de lo mismo, el oligonucleótido según la presente invención comprende dos unidades LNA en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3'. El patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando a partir del extremo 3' , puede seleccionarse a partir del grupo que comprende XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxx, xxXXxx, xxXxXx, xxXxxX, xxxXXx, xxxXxX y xxxxXX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad preferida, el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', se selecciona a partir del grupo que comprende XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXxXx, xxXxxX y xxxXxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad más preferida, el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', se selecciona a partir del grupo que comprende xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXxXx, xxXxxX y xxxXxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad incluso más preferida, el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', se selecciona a partir del grupo que comprende xXxXxx, xXxxXx y xxXxXx, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En la modalidad más preferida, el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', es xXxXxx, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En aún otra modalidad, el oligonucleótido según la presente invención comprende al menos tres unidades LNA en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3'. En una modalidad de lo mismo, el oligonucleótido según la presente invención comprende tres unidades LNA en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3'. El patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', puede ser seleccionado a partir del grupo que comprende XXXxxx, xXXXxx, xxXXXx, xxxXXX, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, XxXXxx, XxxXXx, XxxxXX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX, xXxXxX y XxXxXx, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad preferida, el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', se selecciona a partir del grupo que comprende XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, XxXXxx, XxxXXx, XxxxXX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX, xXxXxX y XxXxXx, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad más preferida, el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', se selecciona a partir del grupo que comprende xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX y xXxXxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad incluso más preferida, el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', es xXxXxX o XxXxXx, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En la modalidad más preferida, el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', es xXxXxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En otra modalidad, el oligonucleótido según la presente invención comprende al menos cuatro unidades LNA en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3'. En una modalidad de lo mismo, el oligonucleótido según la presente invención comprende cuatro unidades LNA en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3'. El patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', puede seleccionarse a partir del grupo que comprende xxXXXX, xXxXXX, xXXxXX, xXXXxX, xXXXXx, XxxXXX, XxXxXX, XxXXxX, XxXXXx, XXxxXX, XXxXxX, XXxXXx, XXXxxX, XXXxXx y XXXXxx, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En aún otra modalidad, el oligonucleótido según la presente invención comprende al menos cinco unidades LNA en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3'. En una modalidad de lo mismo, el oligonucleótido según la presente invención comprende cinco unidades LNA en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3'. El patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3', puede seleccionarse a partir del grupo que comprende xXXXXX, XxXXXX, XXxXXX, XXXxXX, XXXXxX y XXXXXx, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA.

Preferentemente, el oligonucleótido según la presente invención comprende una o dos unidades LNA en posiciones tres a ocho, contando del extremo 3'. Esto se considera ventajoso para la estabilidad de la A-hélice formada por el dúplex de oligo :micro-ARN, un dúplex que se parece a un AR : dúplex de ARN en estructura. En una modalidad preferida, la unidad no LNA es una unidad de ADN .

Variación de la longitud de los oligonucleótidos La longitud de los oligonucleótidos de la invención no tiene que emparejar la longitud de los micro-ARN con especificidades de objetivo exactamente. De hecho, se considera ventajoso tener oligonucleótidos cortos, tal como entre 10-17 o 10-16 nucleobases. En una modalidad, el oligonucleótido según el presente tiene una longitud de 8 a 24 nucleótidos, tal como 10 a 24, entre 12 a 24 nucleótidos, como una longitud de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 nucleótidos, preferentemente una longitud de 10-22, tal como entre 12 a 22 nucleótidos, como una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 nucleótidos, más preferentemente una longitud de 10-20, tal como entre 12 a 20 nucleótidos, como una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos, incluso más preferentemente una longitud de 10 a 19, tal como entre 12 a 19 nucleótidos, como una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 nucleótidos, por ejemplo, una longitud de 10 a 18, tal como entre 12 a 18 nucleótidos, como una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 nucleótidos, más preferentemente una longitud de 10-17, tal como de 12 a 17 nucleótidos, como una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 nucleótidos, el más preferentemente una longitud de 10 a 16, tal como entre 12 a 16 nucleótidos, como una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleótidos.

Modificación de nucleótidos de posición 11, contando del extremo 3', al extremo 5' El patrón de substitución para los nucleótidos de la posición 11, contando del extremo 3', al extremo 5' puede incluir unidades de análogo nucleótido (como el LNA) o puede no hacerlo. En una modalidad preferida, el oligonucleótido según la presente invención comprende al menos una unidad de análogo nucleótido (como el LNA) , como una unidad de análogo nucleótido, de la posición 11, contando del extremo 3', al extremo 5' . En otra modalidad preferida, el oligonucleótido según la presente invención comprende al menos dos unidades de análogo nucleótido, como unidades LNA, como dos unidades de análogo nucleótido, de la posición 11, contando del extremo 3', al extremo 5' .

En las siguientes modalidades que se refieren a la modificación de nucleótidos en las nucleobases de la posición 11 al extremo 5' del oligonucleótido, las unidades LNA pueden ser sustituidas por otros análogos nucléotidos, como aquellos referidos aquí. "X" puede, por lo tanto ser seleccionada a partir del grupo que comprende unidad de 2 ' -O-alquil-RNA, unidad de 2 ' -OMe-RNA, unidad de 2 ' -amino-DNA, unidad de 2'-fluoro-DNA, unidad LNA, unidad de PNA, unidad de HNA, la unidad de INA, "x" es preferentemente el ADN o ARN, más preferentemente ADN. En una modalidad, el oligonucleótido según la presente invención tiene el patrón de substitución que sigue, que es repetido del nucleótido once, contando del extremo 3' al extremo 5' : xXxX o XxXx, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En otra modalidad, el oligonucleótido según la presente invención tiene el patrón de substitución que sigue, que es repetido del nucleótido once, contando del extremo 3' al extremo 5' : XxxXxx, xXxxXx o xxXxxX, donde "X" denota que una unidad LNA y V denota una unidad no LNA. En aún otra modalidad, el oligonucleótido según la presente invención tiene el patrón de substitución que sigue, que es repetido del nucleótido once, contando del extremo 3' al extremo 5': XxxxXxxx, xXxxxXxx, xxXxxxXx o xxxXxxxX, donde "X" denota que una unidad LNA y V denota una unidad no LNA.

El patrón de substitución especifico para los nucleótidos de la posición 11, contando del extremo 3', al extremo 5' depende sobre la cantidad de nucleótidos en los oligonucleótidos según la presente invención. En una modalidad preferida, el oligonucleótido según la presente invención contiene 12 nucleótidos y el patrón de substitución para posiciones 11 a 12, contando del extremo 3', se selecciona a partir del grupo que comprende de xX y Xx, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad más preferida de lo mismo, el patrón de substitución para posiciones 11 a 12, contando del extremo 3', es xX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. Alternativamente, ninguna unidad LNA está presente en posiciones 11 a 12, contando del extremo 3', es decir el patrón de substitución es xx. En otra modalidad preferida, el oligonucleótido según la presente invención contiene 13 nucleótidos y el patrón de substitución para las posiciones 11 a 13, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX y XXX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad más preferida del mismo, el patrón de substitución para posiciones 11 a 13, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xXx, xxX y xXX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En la modalidad más preferida del mismo, el patrón de substitución para posiciones 11 a 13, contando del extremo 3', es xxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. Alternativamente, ningunas unidades LNA están presentes en posiciones 11 a 13, contando del extremo 3', es decir el patrón de substitución es xxx. Incluso en otra modalidad preferida, el oligonucleótido según la presente invención contiene 14 nucleótidos y el patrón de substitución para posiciones 11 a 14, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende Xxxx, xXxx, xxXx, xxxX, XXxx, XxXx, XxxX, xXXx, xXxX y xxXX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad preferida del mismo, el patrón de substitución para posiciones 11 a 14, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xXxx, xxXx, xxxX, xXxX y xxXX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad más preferida del mismo, el patrón de substitución para posiciones 11 a 14, contando del extremo 3', es xXxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. Alternativamente, ningunas unidades LNA están presentes en posiciones 11 a 14, contando del extremo 3', es decir, el patrón de substitución es xxxx. En una modalidad preferida adicional, el oligonucleótido según la presente invención contiene 15 nucleótidos y el patrón de substitución para posiciones 11 a 15, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende Xxxxx, xXxxx, xxXxx, xxxXx, xxxxX, XXxxx, XxXxx, XxxXx, XxxxX, xXXxx, xXxXx, xXxxX, xXXx, xxXxX, xxxXX y XxXxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad preferida del mismo, el patrón de substitución para posiciones 11 a 15, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xxXxx, XxXxx, XxxXx, xXxXx, xXxxX y xxXxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad más preferida del mismo, el patrón de substitución para posiciones 11 a 15, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xxXxx, xXxXx, xXxxX y xxXxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad incluso más preferida del mismo, el patrón de substitución para posiciones 11 a 15, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xXxxX y xxXxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En la modalidad más preferida, el patrón de substitución para posiciones 11 a 15, contando del extremo 3', es xxXxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. Alternativamente, ningunas unidades LNA están presentes en posiciones 11 a 15, contando del extremo 3', es decir, el patrón de substitución es xxxxx . En aún una modalidad preferida adicional, el oligonucleótido según la presente invención contiene 16 nucleótidos y el patrón de substitución para posiciones 11 a 16, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende Xxxxxx, xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx, xxxxXx, xxxxX, XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXXxx, xxXxXx, xxXxxX, xxxXXx, xxxXxX, xxxxXX, XXXxxx, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, XxXXxx, XxXxXx, XxXxxX, XxxXXx, XxxXxX, XxxxXX, xXXXxx, xXXxXx, xXXxxX, xXxXXx, xXxXxX, xXxxXX, xxXXXx, xxXXxX, xxXxXX y xxxXXX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad preferida del mismo, el patrón de substitución para posiciones 11 a 16, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende XxxXxx, xXxXxx, xXxxXx, xxXxXx, xxXxxX, XxXxXx, XxXxxX, XxxXxX, xXxXxX, xXxxXX y xxXxXX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad más preferida del mismo, el patrón de substitución para posiciones 11 a 16, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xXxXxx, xXxxXx, xxXxXx, xxXxxX, xXxXxX, xXxxXX y xxXxXX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad incluso más preferida del mismo, el patrón de substitución para posiciones 11 a 16, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xxXxxX, xXxXxX, xXxxXX y xxXxXX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En una modalidad todavía más preferida del mismo, el patrón de substitución para posiciones 11 a 16, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xxXxxX y xXxXxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. En la modalidad más preferida del mismo, el patrón de substitución para posiciones 11 a 16, contando del extremo 3', es xxXxxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. Alternativamente, ningunas unidades LNA están presentes en posiciones 11 a 16, contando del extremo 3', es decir, el patrón de substitución es xxxxxx. En una modalidad preferida de la invención, el oligonucleótido según la presente invención contiene una unidad LNA al extremo 5'. En otra modalidad preferida, el oligonucleótido según la presente invención contiene una unidad LNA en las dos primeras posiciones, contando del extremo 5' . En una modalidad particularmente preferida, el oligonucleótido según la presente invención contiene 13 nucleótidos y el patrón de substitución, que comienza del extremo 3', es XXxXxXxxXXxxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. La secuencia preferida para esta modalidad, que comienza del extremo 3', es CCtCaCacTGttA, donde una mayúscula denota una base nitrogenada en una unidad LNA y una minúscula denota una base nitrogenada en una unidad no LNA. En otra modalidad particularmente preferida, el oligonucleótido según la presente invención contiene 15 nucleótidos y el patrón de substitución, que comienza del extremo 3', es XXxXxXxxXXxxXxX, donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad no LNA. La secuencia preferida para esta modalidad, que comienza del extremo 3', es CCtCaCacTGttAcC, donde una mayúscula denota una base nitrogenada en una unidad LNA y una minúscula denota una base nitrogenada en una unidad no LNA. Modificación del grupo de unión de internucleósido Los grupos de unión de internucleósido típicos en oligonucleótidos son grupos fosfato, pero éstos pueden ser sustituidos por grupos de unión de internucleósido que difieren del fosfato. En una modalidad interesante adicional de la invención, el oligonucleótido de la invención es modificado en su estructura de grupo de unión de internucleósido, es decir, el oligonucleótido modificado comprende un grupo de unión de internucleósido que difiere del fosfato. En consecuencia, en una modalidad preferida, el oligonucleótido según la presente invención comprende al menos uno .

Ejemplos específicos de grupos de unión de internucleósido que difieren del fosfato (-0-P (O) 2-) incluyen- 0-P(0,S)-0-, -0-P(S)2-0-, -S-P(0)2-0-, -S-P (0, S) -0-, -S-P(S)2-0-, -0-P(0)2-S-, -0-P(0,S)-S-, -S-P(0)2-S-, -O-PO(RH) -0-, 0-PO (0CH3 ) -0- , -0-P0 ( NRH ) -0- , -0-P0 (OCH2CH2S-R) -0-, -0-P0 (BH3) -0-, -0-P0 (NHRH) -0-, -0-P(0)2- NRH-, -NRH-P (O) 2-0-, -NRH-CO-0-, -NRH-CO-IMRH- , -0-CO-O-, -0-CO-NRH-, -NRH-C0-CH2- , -0-CH2-C0-N RH-, -0-CH2-CH2-NR"-, -CO-NR"CH2-, -CH2-NRH-C0-, -0-CH2 -CH2 -S- , -S-CH2-CH2-0- , -S-CH2-CH2-S-, -CH2-S02-CH2-, -CH2-CO-NR1S-0-CH2-CH2-NRH-CO-, -CH2-NCH3-0-CH2-, donde RH es hidrógeno o alquilo Cl-4. Cuando el grupo de unión de internucleósido es modificado, el grupo de unión de internucleósido es de preferencia un grupo fosforotioato (-0-P (07S)-0-). En una modalidad preferida, todos los grupos de unión de internucleósido de los oligonucleótidos según la presente invención son fosforotioato .

Diseños para micro-ARN específicos La tabla a continuación proporciona ejemplos del oligonucleótido según la presente invención, como aquellos usados en composiciones farmacéuticas, en comparación con el tipo de moléculas de la técnica anterior. Objetivo: hsa-miR-122a MIMAT0000421 SEQ ID uggagugugacaaugguguuugu SEQ ID NO 1 Mostrado en la línea celular HUH-7 que expresa mIR-122 Oligo #, microARN objetivo, Diseño oligosecuencia 3962:miR-122 5'- Complemento SEQ ID NO 11 ACAAacaccattgtcacacTCCA-3' completo, intervalo 3965:miR-122 5'- Complemento SEQ ID NO 12 acaaacACCATTGTcacactcca-3' completo, bloque 3972:miR-122 5'- Complemento SEQ ID NO 13 acAaaCacCatTgtCacActCca-3' completo, LNA_3 3549 (3649) :miR-122 5 ' -CcAttGTcaCaCtCC- Nuevo diseño SEQ ID NO 14 3' 3975' :mIR-122 5 ' -CcAtTGTcaCACtCC-3 ' Nuevo diseño SEQ ID NO 15 potenciado 3975' :raIR-122 5 ' -ATTGTcACACtCC-3 ' ED - 13mer SEQ ID NO 16 3975" :mIR-122 5 ' -TGTcACACtCC-3 ' ED - llmer SEQ ID NO 17 3549' (3649) :mIR-122 5' - Nuevo diseño - SEQ ID NO 18 CCMATMTMGTCMAMCAMCTMCC-3' 2' MOE 3549" (3649) :mIR-122 5' - Nuevo diseño - SEQ ID NO 19 CCFATFTFGTCFAFCAFCTFCC-3' 2 ' fluoro Objetivo: hsa-mIR-19b MIMAT0000074 ugugcaaauccaugcaaaacuga SEQ ID NO 2 Mostrado en la linea celular HeLa que expresa mIR-19b Oligo #, microARN objetivo, Diseño oligosecuencia 3963:mIR-19b 5'- Complemento SEQ ID NO 20 TCAGttttgcatggatttgCACA-3' completo, intervalo 3967 :mIR-19b 5 ' -tcagttTTGCATGGattgcaca- Complemento SEQ ID NO 21 3' completo , bloque 3973:mIR-19b 5'- Complemento SEQ ID NO 22 tcAgtTttGcaTggAttTgcAca-3' completo, LNA 3 3560 :mIR-19b 5 ' -TgCatGGatTtGcAc-3 ' Nuevo diseño SEQ ID NO 23 3976:mIR-19b 5 ' -TgCaTGGatTTGcAC-3 ' Nuevo diseño SEQ ID NO 24 potenciado 3976' :mIR-19b 5' -CaTGGaTTTGcAC-3 ' Ed - 13 mer SEQ ID NO 25 3976" :mIR-19b 5 ' -TGGaTTTGcAC-3 ' ED - 11 mer SEQ ID NO 26 3560' :mIR-19b 5' -TGMCAMTMGGAMTMTTMGCMAC-3' Nuevo diseño - SEQ ID N027 2'MOE 3560" :mIR-19b 5 ' -TGFCAFTFGGAFTFTTFGCFAC-3 ' Nuevo diseño - SEQ ID NO 28 2' MOE Objetivo: has-miR-155 MIMAT0000646 uuaaugcuaaucgugauagggg SEQ ID NO 3 Mostrado en la línea celular 518A2 que expresa para miR-155 Oligo #, microARN objetivo, secuencia Diseño oligo 3964 :miR-155 5 ' -CCCCtatcacgattagcaTTAA- Complemento SEQ ID NO 29 3' completo, intervalo 3968 :miR-155 5 ' -cccctaTCACGATTagcattaa- Complemento SEQ ID NO 30 3' completo, bloque 3974 :miR-155 5 ' -cCccTatCacGatTagCatTaa- Complemento SEQ ID NO 31 3' completo , LNA 3 3578 :miR-155 5 ' -TcAcgATtaGcAtTA-3 ' Nuevo diseño SEQ ID NO 32 3818 :miR-155 5 ' -TcAcGATtaGCAtTA-3 ' Nuevo diseño SEQ ID NO 33 potenciado 3818' :miR-155 5 ' -ACGATtAGCAtTA-3 ' ED - 13mer SEQ ID NO 34 3818" :miR-155 5 ' -GATtAGCaTTA-3 ' ED - llmer SEQ ID NO 35 3758' miR-155 5 ' -TCMACMGMATTAMGCMATMTA-3 ' Nuevo diseño - SEQ ID NO 36 2' MOE 3758" miR-155 5 ' -TCFACFGFATTFAFGCFATFTA-3 ' Nuevo diseño - SEQ ID NO 37 2 ' fluoro Objetivo :has-miR-21 MIMAT0000076 uagcuuaucagacugauguuga SEQ ID NO 4 miR-21 5' -TCAAcatcagtctgataaGCTA-3' Complemento SEQ ID NO 38 completo, intervalo raiR-21 5' -tcaacaTCAGTCTGataagcta-3' Complemento SEQ ID NO 39 complete, bloque miR-21 5' -tcAtcAtcAgtCtgAtaAGcTt-3' Complemento SEQ ID NO 40 complete, LNA 3 miR-21 5' -TcAgtCTgaTaAgCT-3' Nuevo diseño SEQ ID NO 41 miR-21 5' -TcAgTCTgaTAAgCT-3 ' Nuevo diseño SEQ ID NO 42 potenciado miR-21 AGTCTgATAAgCT-3' - ED - 13mer SEQ ID NO 43 miR-21 5 ' -TCTgAtAAGCT .3 ' - ED - llmer SEQ ID NO 44 miR-21 5'- TCMAGMTMCTGMAMTAMAGMCT-3 ' Nuevo diseño - SEQ ID NO 45 2' MOE miR-21 5' -TCFAGFTFCTGFAFTAFAGFCT-3' Nuevo diseño - SEQ ID NO 46 2 ' fluoro Objetivo:has-miR-375 MIMAT0000728 uuuguucguucggcucgcguga SEQ ID NO 5 miR- 5' -TCTCgcgtgccgttcgttCTTT-3' Complemento SEQ ID NO 47 375 completo, intervalo miR- 5' -tctcgcGTGCCGTTcgttcttt-3' Complemento SEQ ID NO 48 375 completo, bloque miR- 5' -tcTcgCgtGccGttCgtTctTt-3' Complemento SEQ ID NO 49 375 completo, LNA_3 miR- 5' -GtGccGTtcGTcTT 3' Nuevo diseño SEQ ID NO 50 375 miR- 5' -GtGcCGTtcGTTcTT 3' Nuevo diseño SEQ ID NO 51 375 potenciado miR- 5' -GCCGTtCgTTCTT 3' ED - 13mer SEQ ID NO 52 375 miR- 5' -CGTTcGTTCTT 3' ED - llmer SEQ ID NO 53 375 miR- 5'- GTMGCMCMGTTMCMGTMTCMTT 3' Nuevo diseño - SEQ ID NO 54 375 2'MOE miR- 5' -GTFGCFCFGTTFCFGTFTCFTT 3' Nuevo diseño - SEQ ID NO 55 375 2 ' fluoro Las letras mayúsculas sin un superindice M o F, se refieren a unidades LNA. La letra minúscula = ADN, excepto la letra minúscula en negrita = ARN . Las citosinas LNA pueden estar opcionalmente metiladas. Las letras mayúsculas seguidas de un superíndice M se refieren a unidades 2 ??? de ARN . Las letras mayúsculas seguidas de un superíndice F se refieren a unidades 2 ' fluoro de ADN, la letra minúscula se refiere al ADN . Los oligos anteriores pueden ser en una modalidad completamente fosforotioato, pero otros enlaces de nucleobase como se describen pueden ser usados. En una modalidad, los enlaces de nucleobase son todos fosfodiéster . Se considera que para el uso dentro del cerebro/médula espinal es preferible usar enlaces fosfodiéster , por ejemplo, para el uso de los antimiR que indican miR21. Los oligonucleótidos según la invención, pueden en una modalidad, tener una secuencia de nucleobases 5 '-3' seleccionada el grupo que comprende: LdLddLLddLdLdLL (Nuevo diseño) Ld Ld LLLd d LLLd LL (Nuevo diseño potenciado) LML LLMMLMLMLL (Nuevo diseño-2 ' MOE ) LMLMLLLMMLLLMLL (Nuevo diseño potenciado-2 ' MOE) LFLFFLLFFLFLFLL (Nuevo diseño-2' Fluoro) LFLFLLLFFLLLFLL (Nuevo diseño potenciado-2' Fluoro) LddLddLddL (d) (d) (L) (d) (d) (L) (d) "cada tercero dLddLddLdd (L) (d) (d) (L) (d) (d) (L) "cada tercero ddLddLddLd (d) (L) (d) (d) (L) (d) (d) "cada tercero LMMLMMLMML (M) (M) (L) (M) (M) (L) (M) "cada tercero MLMMLMMLMM (L) (M) (M) (L) (M) (M) (L) "cada tercero MMLMMLMMLM (M) (L) (M) (M) (L) (M) (M) "cada tercero LFFLFFLFFL (F) (F) (L) (F) (F) (L) (F) "cada tercero FLFFLFFLFF (L) (F) (F) (L) (F) (F) (L) cada tercero FFLFFLFFLF (F) (L) (F) (F) (L) (F) (F) "cada tercero dLdLdLdLdL (d) (L) (d) (L) (d) (L) (d) "cada segundo LdLdLdLdL (d) (L) (d) (L) (d) (L) (d) (L) "cada segundo MLMLMLMLML (M) (L) (M) (L) ( ) (L) (M) "cada segundo LMLML LML (M) (L) (M) (L) (M) (L) ( ) (L) "cada segundo FLFLFLFLFL (F) (L) (F) (L) (F) (L) (F) "cada segundo LFLFLFLFL (F) (L) (F) (L) (F) (L) (F) (L) "cada segundo Donde L = unidad LNA, d = unidades de ADN, M = ARN de 2'MOE, F = 2 ' Fluoro y los residuos entre paréntesis son opcionales . Los ejemplos específicos de los oligonucleótidos según la presente invención pueden ser seleccionados del grupo que comprende de tgCatGgaTttGcaCa (SEQ ID NO 82), tgCatGgaTttGcaC (SEQ ID NO 83), CatGgaTttGcaC (SEQ ID NO 84), tGcAtGgAtTtGcAc (SEQ ID NO 85), CAtGgAtTtGcAc (SEQ ID NO 86), CatGGatTtGcAC (SEQ ID NO 87), TgCatGGatTtGcAC (SEQ ID NO 88), TgCaTgGaTTtGcACa (SEQ ID NO 89), cCatTgtCacActCca (SEQ ID NO 90), cCatTgtAacTctCca (SEQ ID NO 91), ccAttGtcAcaCtcCa (SEQ ID NO 92), cCatTgtCacActCc (SEQ ID NO 93), atTgtCacActCc (SEQ ID NO 94), ccAttGtcAcaCtcC (SEQ ID NO 95), AttGtcAcaCtcC (SEQ ID NO 96), aTtGtCaCaCtCc (SEQ ID NO 97), AttGTcaCaCtCC (SEQ ID NO 98), CcAttGTcaCaCtCC (SEQ ID NO 99), CcaTtgTcacActcCa (SEQ ID NO 100), CCAttgtcacacTCCa (SEQ ID NO 101), tCacGatTagCatTaa (SEQ ID NO 102), aTcaCgaTtaGcaTta (SEQ ID NO 103), TcAcGaTtAgCaTtAa (SEQ ID NO 104), AtcAcGaTtAgCaTta (SEQ ID NO 105), gAgcCgaAcgAacAa (SEQ ID NO 106), gcCgaAcgAacAa (SEQ ID NO 107), GaGcCgAaCgAaCaA (SEQ ID NO 108), y GcCgAaCgAaCaA (SEQ ID NO 109); donde una letra minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una letra mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA, con la mayúscula C refiriéndose a MeC . Será evidente que el diseño de nucleobases LNA/DNA en los ejemplos anteriores específicos puede ser aplicado a otros ol igonucleót idos según la invención.

Conj ugados La invención también proporciona conjugados que comprenden el oligonucleótido según la invención. En una modalidad de la invención, el compuesto oligomérico está unido a ligandos/conjugados, que pueden usarse, por ejemplo, para aumentar la absorción celular de oligonucleótidos antisentido. Esta conjugación puede ocurrir en las posiciones terminales 5'/3'-OH pero los ligandos también pueden ocurrir en los azúcares y/o las bases. En particular, el factor de crecimiento al cual el oligonucleótido antisentido puede ser conjugado, puede comprender transferrina o folato. Los complejos de transferrina-polilisina-oligonucleótido o complejos de folato-polilisina-oligonucleótido pueden estar preparados para la absorción por células que expresan niveles elevados de receptor folato o transferrina . Otros ejemplos de conjugados/ligandos son porciones de colesterol, intercaladores dobles, como acridina, poli-L-lisina , "protección de extremos" con uno o varios de los grupos de unión resistentes a nucleasa, como fosforomonotioato, y lo similar. La invención también proporciona un conjugado que comprende el compuesto según la invención como se describe aquí y al menos una porción no nucleotidica o no polinucleotidica covalentemente unida al compuesto. Por lo tanto, en una modalidad donde el compuesto de la invención consiste de s ácidos nucleicos específicos, como se describen aquí, el compuesto también puede comprender al menos una porción no nucleotidica o no polinucleotidica (por ejemplo, no comprende uno o varios nucleótidos o análogos nucléotidos) covalentemente unido al compuesto. La porción de no nucleobase puede por ejemplo, ser o comprender un esterol, como el colesterol. Por lo tanto, será reconocido que el oligonucleótido de la invención, como el oligonucleótido usado en formulaciones (terapéuticas) farmacéuticas puede comprender componentes de no nucleobase adicionales, como los conjugados aquí definidos.

La unidad LNA En una modalidad preferida, la unidad LNA tiene la estructura química general mostrada en Esquema de Reacción 1 a continuación : Esquema de reacción 1 donde X es seleccionado del grupo que comprende O, S y NRH, donde RH es H o alquilo Cl-4; el Y es (-ch2) r, donde r es un número entero de 1-4; y B es una base nitrogenada. En una modalidad preferida de la invención, r es 1 o 2, particularmente 1, es decir, una unidad LNA preferida que tiene la estructura química mostrada en el Esquema de Reacción 2 a continuación: Esquema de Reacción 2 donde X y B son como se definen anteriormente.

En una modalidad interesante, las unidades LNA incorporadas en los oligonucleótidos de la invención son indistintamente seleccionadas del grupo que consiste de unidades tiol-LNA, unidades amino-LNA y unidades oxi-LNA. Asi, la unidad tiol-LNA puede hacer mostrar la estructura química en Esquema de Reacción 3 a continuación: Esquema de Reacción 3 3A 3B donde B es como se define anteriormente. Preferiblemente, la unidad tiol-LNA está en su forma beta-D, es decir, tiene la estructura mostrada en 3A anteriormente . Igualmente, la unidad amino-LNA puede tener la estructura química mostrada en el Esquema de Reacción 4 a continuación: Esquema de Reacción 4 4A 4B donde B y RH son como se definen anteriormente.

Preferentemente, la unidad amino-LNA está en su forma beta-D, es decir tiene UK, la estructura mostrada en 4A anteriormente . La unidad oxi-LNA puede tener la estructura química en el Esquema de Reacción 5 a continuación: Esquema de Reacción 5 5A 5B donde B es como se define anteriormente. Preferentemente, la unidad oxi-LNA oxi en su forma beta-D, es decir tiene la estructura mostrada en 5A anteriormente.

Como se indica anteriormente, B es una base nitrogenada que puede ser de origen natural o artificial. Los ejemplos específicos de bases nitrogenadas incluyen la adenina (A) , citosina (C) , 5-metilcitosina (MeC) , isocitosina, pseudoisositocina , guanina (G) , timina (T) , uracilo (U) , 5-bromouracilo , 5-propiniluracilo, 5-propinil-6, 5-metiltiazoluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina , inosina, 2 , 6-diaminopurina, 7-propin-7-deazaadenina, 7-propin-7-deazaguanina y 2-cloro-6-aminopurina .

Grupos terminales Los ejemplos específicos de grupos terminales incluyen grupos terminales seleccionados del grupo que comprende hidrógeno, azido, halógeno, ciano, nitro, hidroxilo, Prot-O, Acto-O, mercapto, Prot-S-, Act-S-, alquiltiol Ci_6, amino, Prot-N (RH) - Act-N (RH) -, mono o di (alquilo Ci-6) amino, alcoxilo Ci-6 opcionalmente substituido, alquilo Ci_6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente substituido, alqueniloxilo C2-6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-6 opcionalmente substituido, alquinilo C2-6 opcionalmente sustituido, monofosfato que incluye monofosfato protegido, monotiofosfato que incluye monotiofosfato protegido, difosfato que incluye difosfato protegido, ditiofosfato que incluye ditiofosfato protegido, trifosfato que incluye trifosfato protegido, tritiofosfato que incluye tritiofosfato protegido, donde Prot es un grupo de protección para - OH, -SH y -NH(RH), y Act es un grupo de activación para - OH,-SH, y -NH(RH), y RH es hidrógeno o alquilo Ci_6. Ejemplos de grupos de protección fosfato incluyen S-acetiltioetilo (SATE) y S-pivalotietilo ( t-butyl-SATE) . Incluso otros ejemplos de grupos terminales incluyen intercaladores de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos reporteros, ligandos, carboxi, sulfono, hidroximetilo, PrOt-O-CH2-, ACt-0-CH2-, aminometilo, Prot-N (RH)-CH2-, Act-N (RH)- CH2-, carboximetilo, sulfonometilo, donde Prot es un grupo de protección para,-0H7-SH y -NH (RH) y el Act es un grupo de activación para - OH,-SH, y -NH (RH) y RH es el hidrógeno o d-6-alquilo . Los ejemplos de grupos de protección para grupos -OH y - SH que incluyen tritilo substituido, tal como 4,4 '-dimetoxitritiloxilo (DMT), 4 -monometoxitritiloxilo (MMT) ; tritiloxilo, 9- ( 9-fenil ) xanteniloxilo opcionalmente substituido (pixilo) , metoxytetrahidropiraniloxilo (mthp) opcionalmente sustituido; sililoxilo, como trimetilsililoxilo (TMS) , triisopropilsililoxilo (TIPS), tert-butil-dimetilsililoxilo (TBD S) , trietilsililoxilo, fenildimetilsililoxilo ; ter-butiléteres ; acétales (incluyendo dos grupos hidroxilo) ; aciloxilo, como acetilo o acetilos substituidos por halógeno, por ejemplo, cloroacetiloxilo o fluoroacetiloxilo, isobutiriloxilo, pivaloiloxilo, benzoiloxilo y benzoilos substituidos, metoximetiloxilo (MOM) , éteres de bencilo o éteres de bencilo substituidos tales como 2 , 6-diclorobenciloxilo (2, 6-CI2BzI ) . Además, cuando Z o Z* son hidroxilo pueden estar protegidos por la unión a un soporte sólido, opcionalmente por un ligador. Los ejemplos de grupos de protección amina incluyen fluorenilmetoxicarbonilamino (Fmoc), ter-butiloxicarbonilamino (BOC) , trifluoroacetilamino, aliloxicarbonilamino (alloc, AOC) , Z-benciloxicarbonilamino (Cbz) , benciloxicarbonilamino substituido, como 2-cloro-benciloxicarbonilamino (2-CIZ), monometoxitritilamino (MMT) , dimetoxitritilamino (DMT) , ftaloilamino, y 9-xantenilamino (de 9 fenilos) (pixilo) . El grupo de activación preferentemente regula acoplamientos a otros residuos y/o monómeros nucleotidicos y después de que se ha completado el acoplamiento el grupo de activación es comúnmente convertido a un enlace de internucleósido . Ejemplos de tales grupos de activación incluyen O-fosforamidita opcionalmente substituida, 0-fosfotriester opcionalmente substituido, el 0-fosfodiéster opcionalmente substituido, H-fosfonato opcionalmente substituido, y 0-fosfonato opcionalmente substituido. En el contexto presente, el término "fosforamidita" significa un grupo de la fórmula-P (ORx)-N (Ry) 2, donde Rx designa un grupo alquilo opcionalmente substituido, por ejemplo, metilo, 2-cianoetilo, o bencilo, y cada uno de Ry designa grupos alquilo opcionalmente substituidos, por ejemplo, etilo o isopropilo, o el grupo-N (Ry) 2 forma un grupo morfolino (-N (CH2CH2) 20) . Rx preferentemente designa 2-cianoetilo y los dos Ry son preferentemente idénticos y designa isopropilo. En consecuencia, una fosforamidita particularmente preferida es N, N-diisopropil-0 - ( 2-cianoetil ) fosforamidita . Los grupos terminales más preferidos son hidroxilo, mercapto y amino, particularmente hidroxilo.

Terapia y composiciones farmacéuticas Como se explicó al principio, los oligonucleótidos de la invención constituirán fármacos adecuados con propiedades mejoradas. El diseño de un fármaco potente y seguro requiere poner a punto diversos parámetros, como afinidad/especificidad, estabilidad en líquidos biológicos, absorción celular, modo de acción, propiedades farmacocinéticas y toxicidad. En consecuencia, en un aspecto adicional la presente invención está relacionada con una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido según la invención y un diluyente farmacéuticamente aceptable, portador o adyuvante.

Preferentemente el portador es solución salina o solución salina amortiguada. En un aspecto adicional, la presente invención está relacionada con un oligonucleótido según la presente invención para el uso como un medicamento. Como será entendido, la dosificación es dependiente sobre la severidad y lrespuesta del estado de enfermedad a ser tratadoy al curso de tratamiento que dura de varios días a varios meses, o hasta que una cura sea efectuada o una disminución del estado de enfermedad es lograda. Las listas óptimas de dosificación pueden ser calculadas de medidas de acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente. Las dosis óptimas pueden variar según la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales. Generalmente, puede ser estimado basado en los EC50 encontrados para ser efectivos en modelos de animal in vitro e in vivo. En términos generales, la dosis abarca desde O.Olyg a lg por kg de peso corporal y puede ser suministrada una vez o más al día, cada semana, mensualmente o cada año, o incluso una vez cada 2 a 10 años o mediante la infusión continua por horas hasta varios meses. Las tasas de repetición para la dosificación pueden ser estimadas basadas en tiempos de permanencia cuantificados y concentraciones del fármaco en líquidos corporales o tejidos. Siguiendo un tratamiento exitoso, puede ser deseable tener al paciente bajo terapia de mantenimiento para prevenir la repetición de recurrencia del estado de enfermedad.

Composiciones farmacéuticas Como se indica anteriormente, la invención también se relaciona con una composición farmacéutica, que comprende al menos un oligonucleótido de la invención como un ingrediente activo. Se deberá entender que la composición farmacéutica de acuerdo con la invención opcionalmente comprende un portador farmacéutico y que la composición farmacéutica opcionalmente comprende compuestos adicionales, como compuestos quimioterapéuticos , compuestos antiinflamatorios, compuestos antivirales y/o compuestos inmunorreguladores . Los oligonucleótidos de la invención pueden usarse "como es" o en la forma de una variedad de sales farmacéuticamente aceptables. Como se usa en la presente, el término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales que retienen la actividad biológica deseada de los oligonucleótidos aquí identificados y muestran efectos toxicológicos mínimos indeseados. Los ejemplos no limitantes de tales sales pueden ser formados con un aminoácido orgánico y sales básicas de adición formadas con cationes metálicos, como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio y los senejantes o con un catión formado de amoníaco, N, N-dibenciletilendiamina , D-glucosamina, tetrametilamonio o etilendiamina . En una modalidad de la invención, el oligonucleótido puede estar en forma de un profármaco. Los oligonucleótidos son por virtud iones cargados negativamente. Debido a la naturaleza lipofílica de membranas celulares, la absorción celular de oligonucleótidos es reducida en comparación con equivalentes neutros o lipofílicos. Este "impedimento de polaridad" puede ser evitado por el uso del enfoque del profármaco (ver por ejemplo, Crooke, R. M. (1998) en Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlín, Alemania, volumen 131, pps 103-140). Los agentes aglutinantes farmacéuticamente aceptables y adyuvantes pueden comprender parte del fármaco formulado. Los ejemplos de métodos de administración para la administración de los agentes terapéuticos descritos aquí, así como detalles de formulaciones farmacéuticas, sales, pueden estar bien descritos en otra parte por ejemplo en las solicitudes provisionales estadounidenses 60/838,710 y 60/788,995, que son incorporadas aquí por referencia y las solicitudes danesas, PA 2006 00615 que también está incorporada aquí por referencia. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposoma. Estas composiciones pueden ser generadas a partir de una variedad de componentes que incluyen, líquidos pero no están limitados a, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes . La administración del fármaco al tejido de tumor puede ser potenciada al incluir la administración mediada por un portador, en los que se incluyen pero no se limitan a liposomas catiónicos, ciclodextrinas , derivados de porfirina, dendrímeros de cadena ramificada, polímeros de polietilenimina, nanopartículas y microesferas (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54 (l):3-27). Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser de manera conveniente presentadas en una forma de dosificación unitaria, pueden estar preparadas según métodos convencionales conocidos en la industria farmacéutica. Tales métodos incluyen la etapa de combinar los ingredientes activos con el portador o excipiente farmacéutico. En términos generales, las formulaciones son preparadas por la combinación uniforme e intima de los ingredientes activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos y luego, si es necesario, agitar el producto. Las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas en cualquiera de muchas posibles formas de dosificación tal como, pero no limitadas a pastillas, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles suaves y supositorios. Las composiciones de la presente invención también pueden ser formuladas como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mezclados. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrana. La suspensión también puede contener estabilizadores. Los compuestos de la invención también pueden ser conjugados a sustancias de fármaco activas, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico. En otra modalidad, las composiciones de la invención pueden contener uno o varios compuestos de oligonucleótido, apuntados a un primer micro-ARN y uno o varios compuestos de oligonucleótido adicionales apuntados a un segundo objetivo de micro-ARN. Dos o más compuestos combinados pueden usarse conjuntamente o secuencialmente . Los compuestos descritos aquí son útiles para un número de aplicaciones terapéuticas como se indica anteriormente. En términos generales, los métodos terapéuticos de la invención se incluye la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un oligonucleótido a un mamífero, particularmente un humano. En una cierta modalidad, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o varios compuestos de la invención y (b) uno o varios agentes quimioterapéuticos . Cuando se usan con los compuestos de la invención, los agentes quimioterapéuticos pueden usarse individualmente, secuencialmente o en combinación con uno o varios de otros agentes quimioterapéuticos o en combinación con radioterapia. Todos los agentes quimioterapéuticos conocidos por el experto en la técnica son incorporados aquí como tratamientos combinados con un compuesto según la invención. Otros agentes activos, como fármacos antiinflamatorios, incluyen pero no se limitan a fármacos antiinflamatorios no esferoidales y corticosteroides , fármacos antivirales y fármacos inmunorreguladores también pueden ser combinados en composiciones de la invención. Dos o más compuestos combinados pueden usarse conjuntamente o secuencialmente . Los ejemplos de indicaciones terapéuticas pueden ser sometidas a tratamiento por las composiciones farmacéuticas de la invención: microARN Posibles indicaciones médicas miR-21 Glioblastoma , cáncer de pecho miR-122 Hipercolesterolemia, hepatitis C, hemocrornatosis miR-19b Linfoma y otros tipos de tumor miR-155 Linfoma, cáncer de pecho y pulmón miR-375 Diabetes, trastornos metabólicos miR-181 Diferenciación del mioblasto, trastornos autoinmunitarios El ARNm de tropomisina 1 de gen inhibidor de tumor (TPM1) ha sido indicado como un objetivo de miR-21. El ARNm de miotrofina (mtpn) ha sido indicado como un objetivo de miR 375. En incluso un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con el uso de un oligonucleótido según la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que comprende: aterosclerosis, hipercolesterolemia e hiperlipidemia ; cáncer, glioblastoma, cáncer de mama, linfoma, cáncer de pulmón; diabetes, trastornos metabólicos; diferenciación de mioblasto; trastornos inmunes. La invención además se refiere a unos oligonucleótidos según la invención para el uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que comprende: aterosclerosis, hipercolesterolemia e hiperlipidemia; cáncer, glioblastoma, cáncer de mama, linfoma, cáncer de pulmón; diabetes, trastornos metabólicos ; diferenciación de mioblasto; trastornos inmunes. La invención proporciona un método de tratamiento para el malestar de enfermedad o condición de un sujeto seleccionada del grupo que comprende: aterosclerosis , hipercolesterolemia e hiperlipidemia ; cáncer, glioblastoma, cáncer de mama, linfoma, cáncer de pulmón; diabetes, trastornos metabólicos; diferenciación de mioblasto; trastornos inmunes, el método comprende la etapa de administrar un oligonucleótido o composición farmacéutica de la invención al sujeto en necesidad del mismo.

Cáncer Incluso en un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con el uso de un oligonucleótido según la invención o un conjugado del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En otro aspecto, la presente invención concierne con un método para el tratamiento de o profilaxis contra cáncer, el método comprende la administración de un oligonucleótido de la invención o un conjugado del mismo, o una composición farmacéutica de la invención a un paciente en necesidad del mismo. Tales tumores malignos pueden incluir neoplasia linforreticular , leucemia linfoblástico, tumores cerebrales, tumores gástricos, plasmacitomas , mieloma múltiple, leucemia, tumores de tejido conjuntivo, linfornas y tumores sólidos. En el uso de un compuesto de la invención o un conjugado del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, el cáncer puede estar apropiadamente en forma de un tumor sólido. Análogamente, en el método para tratar el cáncer descrito aquí, el cáncer puede estar apropiadamente en forma de un tumor sólido. Además, el cáncer es también apropiadamente un carcinoma. El carcinoma es comunmente seleccionado del grupo que comprende un melanoma maligno, carcinoma celular básico, carcinoma ovárico, carcinoma de pecho, cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células renales, carcinoma de vejiga, cáncer de vejiga superficial recurrente, carcinoma de estómago, carcinoma prostético, carcinoma pancreático, carcinoma de pulmón, carcinoma cervical, displasia cervical, papilomatosis de laringe, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal y tumores carcinoides. Más comunmente, el carcinoma es seleccionado del grupo que comprende melanoma maligno, cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de pecho, carcinoma de colon y carcinoma de células renales. El melanoma maligno es comunmente seleccionado del grupo que comprende melanoma de extensión superficial, melanoma nodular, melanoma de lentigo maligna, melanoma acral, melanoma amelanótico y melanoma desmoplástico .

Alternativamente, el cáncer puede ser apropiadamente un sarcoma. El sarcoma está comunmente en la forma seleccionada del grupo que comprende osteosarcoma , sarcoma de Ewing, condrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, fibrosarcoma y sarcoma de Kaposi. Alternativamente, el cáncer puede ser apropiadamente un glioma . Otra modalidad está dirigida al uso de un oligonucleótido según la invención o un conjugado del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, donde el medicamento además comprende un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo que comprende adrenocorticosteroides , como prednisona, dexametasona o decadrón; altretamina (hexaleno, hexametilmelamina (HMM) ) ; amifostina (etiol); aminoglutetimida (citadreno) ; amsacrina (M-AMSA) ; anastrozol (arimidex) ; andrógeno, como testosterona ; asparaginasa (elspar) ; bacilo calmette-gurin; bicalutamida (casodex) ; bleomicina (blenoxano) ; busulfán (milerán) ; carboplatino (paraplatino) ; carmustina (BCNU, BiCNU) ; clorambucilo (leukerán); clorodesoxiadenosina (2-CDA, cladribina, leustatina) ; cisplatino (platinol); arabinósido de citosina (citarabina) ; dacarbazina (DTIC); dactinomicina (actinomicina-D, cosmegén) ; daunorubicina (cerubidina) ; docetaxelo (taxotere) ; doxorubicina ( adriomicina ) ; epirubicina; estramustina (emcit); estrógenos, como dietilstilbestrol (DES); etópsido (VP-16, VePesid, etopofos); fludarabina (fludara); flutamida (eulexina) ; 5-FUDR (floxuridina) ; 5-fluorouracilo (5-FU); gemcitabina (gemzar) ; goserelina (zodalex); herceptina (trastuzumab) ; hidroxiurea (hidrea); idarubicina ( idamicina ) ; ifosfamida; IL-2 (proleucina, aldesleucina) ; interferón alfa (intrón A, roferón A); irinotecano (camptosar) ; leuprolido (luprón); levamisol (ergamisol) ; lomustina (CCNU) ; mecloratamina (mustargeno, mostaza de nitrógeno) ; melfalano (alquerano) ; mercaptopurina (purinetol, de 6 DIPUTADOS) ; metotrexato (mexate) ; mitomicina-C (mutamucina) ; mitoxantrona (novantrona) ; octreotido ( sandostatina ) ; pentostatina ( 2-deoxicoformicina , nipent) ; plicamicina (mitramicina , mitracina); prorocarbazina (matulán) ; estreptozocina ; tamoxifino (nolvadex) ; taxol (paclitaxel) ; tenipósido (vumon, VM-26) ; tiotepa; topotecano (hicamtina) ; tretinoina (vesanoide, ácido retinoico all-trans) ; vinblastina (valban) ; vincristina (Oncovina) y vinorelbina (navelbina) . Apropiadamente, el agente quimioterapéutico adicional es seleccionado de taxanos, como Taxol, Paclitaxel o Docetaxel. Del mismo modo, la invención está dirigida además al uso de un oligonucleótido según la invención o un conjugado del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, donde el tratamiento además comprende la administración de un agente quimioterapéutico adicional seleccionado del grupo que comprende adrenocorticosteroides, como prednisona, dexametasona o decadrón; altretamina (hexaleno, hexametilmelamina (HMM) ) ; amifostina (etiol); aminoglutetimida (citadreno); amsacrina (M-AMSA) ; anastrozol (arimidex) ; androgeno, como testosterona ; asparaginasa (elspar) ; bacilo calmette-gurin; bicalutamida (casodex) ; bleomicina (blenoxano) ; busulfán (milerán) ; carboplatino (paraplatino ) ; carmustina (BCNU, BiCNU) ; clorambucilo ( leukerán) ; clorodesoxiadenosina (2-CDA, cladribina, leustatina) ; cisplatino (platinol); arabinósido de citosina (citarabina) ; dacarbazina (DTIC); dactinomicina (actinomicina-D, cosmegén) ; daunorubicina (cerubidina) ; docetaxelo (taxotere); doxorubicina ( adriomicina ) ; epirubicina ; estramustina (emcit); estrógenos, como dietilstilbestrol (DES); etópsido (VP-16, VePesid, etopofos); fludarabina (fludara); flutamida (eulexina); 5-FUDR ( floxuridina ) ; 5-fluorouracilo (5-FU); gemcitabina (gemzar) ; goserelina (zodalex); herceptina (trastuzumab) ; hidroxiurea (hidrea) ; idarubicina (idamicina) ; ifosfamida; IL-2 (proleucina, aldesleucina) ; interferón alfa (intrón A, roferón A); irinotecano (camptosar) ; leuprolido (luprón); levamisol (ergamisol ) ; lomustina (CCNU) ; mecloratamina (mustargeno, mostaza de nitrógeno) ; melfalano (alquerano) ; mercaptopurina (purinetol, de 6 DIPUTADOS) ; metotrexato (mexate) ; mitomicina-C (mutamucina) ; mitoxantrona (novantrona ) ; octreotido ( sandostatina ) ; pentostatina ( 2-deoxicoformicina , nipent); plicamicina (mitramicina , mitracina) ; prorocarbazina (matulán) ; estreptozocina ; tamoxifino (nolvadex) ; taxol (paclitaxel ) ; tenipósido (vumon, VM-26); tiotepa; topotecano (hicamtina) ; tretinoina (vesanoide, ácido retinoico all-trans); vinblastina (valban) ; vincristina (Oncovina) y vinorelbina (navelbina). Apropiadamente, el tratamiento además comprende la administración de un agente quimioterapéutico adicional seleccionado de taxanos, como Taxol, Paclitaxel o Docetaxel. Alternativamente establecido, la invención está además dirigida a un método para tratar el cáncer, el método comprende la administración de un oligonucleótido de la invención o un conjugado del mismo o una composición farmacéutica según la invención a un paciente en necesidad del mismo y caracterizado porque además comprende la administración de un agente quimioterapéutico adicional. La administración adicional puede ser tal que el reactivo quimioterapéutico adicional es conjugado al compuesto de la invención, está presente en la composición farmacéutica, o es administrado en una formulación separada.

Enfermedades infecciosas Está contemplado que los compuestos de la invención pueden ser ampliamente aplicables a un amplio intervalo de enfermedades infecciosas, como difteria, tétanos, pertussis, polio, hepatitis B, hepatitis C, gripe de influenza, sarampión, paperas, y rubéola. Hsa-miR122 es indicado en la infección de hepatitis-C y como tales oligonucleótidos según la invención que apuntan a miR-122, puede ser usado para tratar la infección de Hepatitis-C . En consecuencia, incluso otro aspecto de la presente invención relaciona el uso de un oligonucleótido según la invención o un conjugado del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad infecciosa, asi como un método para tratar una enfermedad infecciosa, el método comprende administrar un oligonucleótido según la invención o un conjugado del mismo, o una composición farmacéutica según la invención a un paciente en necesidad del mismo .

Enfermedades inflamatorias La respuesta inflamatoria es un mecanismo esencial de la defensa del organismo contra el ataque de agentes infecciosos y también está implicado en la patogénesis de muchas enfermedades agudas y crónicas, incluyendo trastornos autoinmunitarios . A pesar de ser necesario para luchar contra patógenos, los efectos de un estallido inflamatorio pueden ser devastadores. A menudo es por lo tanto necesario restringir la semiología de inflamación con el uso de fármacos antiinflamatorios. La inflamación es un proceso complejo normalmente activado por la lesión tisular que incluye la activación de una matriz grande de enzimas, el aumento de permeabilidad vascular y extravasación de líquidos de sangre, migración celular y liberación de mediadores químicos, todos apuntados tanto para destruir como reparar el tejido lesionado.

En aún otro aspecto, la presente invención está relacionada con el uso de un oligonucleótido según la invención o un conjugado del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, así como un método para tratar una enfermedad inflamatoria, el método comprende la administración de un oligonucleótido según la invención o un conjugado del mismo o una composición farmacéutica según la invención a un paciente en necesidad del mismo . En una modalidad preferida de la invención, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad reumática y/o enfermedades de tejido conjuntivo, como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE) o Lupus, escleroderma, polomiositis , enfermedad inflamatoria del intestino, dermatomiositis, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, vasculitis, artritis psoriática, dermatitis psoriática exfoliativa, pemphigus vulgaris y síndrome de Sjorgren, en particular enfermedad inflamatoria del intestino y enfermedad de Crohn.

Alternativamente, la enfermedad inflamatoria puede ser una inflamación no reumática, como bursitis, sinovitis, capsulitis, tendinitis y/o otras lesiones inflamatorias del origen traumático y/o deportivo.

Enfermedades metabólicas Una enfermedad metabólica es un trastorno causado por la acumulación de productos químicos producidos naturalmente en el cuerpo. Estas enfermedades son por lo general serias, algunas incluso amenazan la vida. Otros pueden reducir el desarrollo físico o causan retraso mental. La mayor parte de niños con estos trastornos, al principio, no muestran señales obvias de enfermedad. La proyección apropiada en el nacimiento a menudo puede descubrir estos problemas. Con un diagnóstico temprano y tratamiento, las enfermedades metabólicas a menudo pueden ser manejadas efectivamente. En aún otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de un oligonucleótido según la invención o un conjugado del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad metabólica, así como un método para tratar una enfermedad metabólica, el método comprende la administración de un oligonucleótido según la invención o un conjugado del mismo o una composición farmacéutica según la invención a un paciente en necesidad del mismo.

En una modalidad preferida de la invención, la enfermedad metabólica es seleccionada del grupo que comprende Amiloidosis, Biotinidasa, OMIM (Herencia en Linea Mendeliana en el Hombre), síndrome de Crigler Najjar, diabetes, Apoyo de Fabry y Grupo de Información, trastornos de oxidación de ácido graso, galactosemia , deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) , aciduria glutárica, Organización Internacional de la Acidemia Glutárica, acidemia glutárica tipo I, acidemia glutárica tipo II, acidemia glutárica tipo I, acidemia glutárica tipo II, F-HYPDRR hipofosfatemia familiar, raquitismo resistente a vitamina D, enfermedad de Krabbe, deficiencia de hidroxiacil CoA deshidrogenasa de cadena larga (LCHAD) , Grupo de Manosidosis, enfermedad de orina de jarabe de maple, trastornos mitocondriales, Síndromes de mucopolisacaridosis : Niemann Pick, acidemias orgánicas, PKU, enfermedad de Pompe, porfiria, síndrome metabólico, hiperlipidemia y trastornos lipidíeos heredados, trimetilaminuria : síndrome de olor a pescado y trastornos del ciclo de la urea.

Trastornos hepáticos Incluso en otro aspecto, la presente invención está relacionada con el uso de un oligonucleótido según la invención o un conjugado del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno hepático, así como un método para tratar un trastorno hepático, el método comprende la administración de un oligonucleótido según la invención o un conjugado del mismo o una composición farmacéutica según la invención a un paciente en necesidad del mismo. En una modalidad preferida de la invención, el trastorno hepático es seleccionado del grupo que comprende Atresia biliar, Síndrome de Alagille, antitripsina alfa 1, tirosinemia, hepatitis neonatal, y enfermedad de Wilson.

Otros usos Los oligonucleótidos de la presente invención pueden ser utilizados como reactivos de investigación para diagnóstico, terapia y profilaxis. En la investigación, el oligonucleótido puede ser usado específicamente para inhibir la síntesis de genes indicadores en células y animales experimentales que así facilitan el análisis funcional del indicador o una valoración de su utilidad como un indicador para la intervención terapéutica. En el diagnóstico, los oligonucleótidos pueden ser usados para detectar y cuantificar la expresión indicadora en células y tejidos por Northern blotting, hibridación in situ o métodos similares. Para la terapéutica, un animal o un humano, con sospecha de tener una enfermedad o trastorno, que puede ser sometido a tratamiento al modular la expresión de un indicador que es sometido a tratamiento al administrar los compuestos de oligonucleótido de conformidad con esta invención. Además son proporcionados métodos para tratar a un animal, particularmente un ratón y una rata y para tratar a un humano con sospecha de tener o estar propenso a una enfermedad o condición asociada con la expresión del indicador, administrando una cantidad efectiva terapéuticamente o profilácticamente de uno o varios de los compuestos de oligonucleótido o las composiciones de la invención.

Uso terapéutico de oligonucleótidos indicadores para miR- 122a En la sección de ejemplos, se demuestra que un LNA-antimiR ™, como SPC3372 que indica miR-122a reduce niveles de colesterol plasmáticos. Por lo tanto, otro aspecto de la invención es el uso de los oligonucleótidos anteriormente descritos que indican miR-122a como medicina. En incluso otro aspecto de la invención es el uso de los oligonucleótidos anteriormente descritos que indican miR-122a para la preparación de un medicamento para el tratamiento de mayores niveles de colesterol plasmáticos. El experto en la técnica apreciará que los mayores niveles de colesterol plasmáticos son indeseables cuando aumenta el riesgo de diversas condiciones, por ejemplo, aterosclerosis . En todavía otro aspecto de la invención es el uso de los oligonucleótidos anteriormente descritos que indican miR-122a para regular aceleradamente los niveles de ARNm de Nrdg3, Aldo A, Bckdk o CD320.

Otras modalidades: Las siguientes modalidades pueden ser combinadas con otras modalidades de la invención como se describe aquí. 1. Un oligonucleótido que tiene una longitud de 12 a 26 nucleótidos que tienen una secuencia de ADN nuclear de posiciones dos a siete o de posiciones tres a ocho, contando a partir del extremo 3': acgttt, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos o tres, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente o un conjugado del mismo. 2. Un oligonucleótido que tiene una longitud de 12 a 26 nucleótidos que tienen una secuencia de ADN nuclear de posiciones dos a siete o de posiciones tres a ocho, contando del extremo 3': ctcaca, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos o tres, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente; o un conjugado del mismo. 3. Un oligonucleótido que tiene una longitud de 12 a 26 nucleótidos que tienen una secuencia de ADN nuclear de posiciones dos a siete o de posiciones tres a ocho, contando del extremo 3': ttacga, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos o tres, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente; o un conjugado del mismo. 4. Un oligonucleótido que tiene una longitud de 12 a 26 nucleótidos que tienen una secuencia de ADN nuclear de posiciones dos a siete o de posiciones tres a ocho, contando del extremo 3': acaagc; donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos o tres, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente; o un conjugado de la misma. 5. El oligonucleótido según cualquiera de modalidades 1 a 4 o un conjugado del mismo, donde al menos dos, tal como dos o tres, unidades de ADN de posiciones uno a seis, dos a siete o tres a ocho, contando del extremo 3', han sido substituidos por su unidad LNA correspondiente y donde las unidades LNA son separadas por al menos una unidad de ADN. 6. El oligonucleótido según la modalidad 5 o un conjugado del mismo, donde la cantidad de unidades de ADN consecutivas de posiciones uno a seis, dos a siete o tres a ocho, contando del extremo 3 , es como máximo dos. 7. El oligonucleótido según la modalidad 6 o un conjugado del mismo, donde cada segundo nucleótido de posiciones uno a seis, dos a siete o tres a ocho, contando del extremo 3', es una unidad LNA. 8. El oligonucleótido según la modalidad 6 o un conjugado del mismo, nucleótido donde cada tercero de posiciones uno a seis, dos a siete o tres a ocho, contando del extremo 3', es una unidad LNA. 9. El oligonucleótido según la modalidad 6 o un conjugado del mismo, donde el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones uno a seis, dos a siete o tres a ocho, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende: xxXxxX, xxXxXx, xXxxXx, xXxXxx, XxxXxx, xXxXxX, XxXxXx, XxxXxX, y XxXxxX; donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad de AD . 10. El oligonucleótido según la modalidad 9 o un conjugado del mismo, donde el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones uno a seis, dos a siete o tres a ocho, contando del extremo 3 ' , es seleccionado del grupo que comprende xxXxxX, xXxxXx, XxxXxx, xXxXxX, y XxXxXx; donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad de ADN. 11. El oligonucleótido según la modalidad 1 un conjugado del mismo que tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, contando del extremo 3' : acgttta, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 12. El oligonucleótido según modalidad 2 o un conjugado del mismo que tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, contando del extremo 3' : ctcacac, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 13. El oligonucleót ido según modalidad 3 o un conjugado del mismo que tiene secuencia de ADN de posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, contando del extremo 3' : ttacgat, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 14. El oligonucleótido según modalidad 4 o un conjugado del mismo que tiene una secuencia de ADN de posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, contando del extremo 3' : acaagca, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 15. El oligonucleótido según cualquiera de modalidades 11 a 14 o un conjugado del mismo, donde al menos dos, tal como dos, tres o cuatro, unidades de ADN de posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, contando del extremo 3 1 , han sido substituidos por su unidad LNA correspondiente y donde las unidades LNA son separadas por al menos una unidad de ADN. 16. El oligonucleótido según la modalidad 15 o un conjugado del mismo, donde la cantidad de unidades de ADN consecutivas de posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, contando del extremo 3 ' , es como máximo dos. 17. El oligonucleótido según la modalidad 16 o un conjugado del mismo, donde cada segundo nucleótido de posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, contando del extremo 3 ' , es una unidad LNA. 18. El oligonucleótido según la modalidad 16 o un conjugado del mismo, nucleótido donde cada tercero de posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, contando del extremo 3 ' , es una unidad LNA. 19. El oligonucleótido según la modalidad 16 o un conjugado del mismo, donde el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xxXxxXx, xxXxXxx, xXxxXxx, xxXxXxX, xXxxXxX, xXxXxxX, xXxXxXx, XxxXxxX, XxxXxXx, XxXxxXx, XxXxXxx, y XxXxXxX; donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad de ADN. 20. El oligonucleótido según la modalidad 19 o un conjugado del mismo, donde el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xxXxxXx, xXxxXxx, XxxXxxX, xXxXxXx, XxXxXxX, y XxXxXxx; donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad de ADN . 21. El oligonucleótido según modalidad 11 o tener del mismo conjugado una secuencia de ADN de posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, contando del extremo 3': acgtttag, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 22. El oligonucleótido según modalidad 12 o tener del mismo conjugado una secuencia de ADN de posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, contando del extremo 3': ctcacact, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 23. El oligonucleótido según modalidad 13 o tener del mismo conjugado una secuencia de ADN de posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, contando del extremo 3': ttacgatt, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 24. El oligonucleótido según modalidad 14 o tener del mismo conjugado una secuencia de ADN de posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, contando del extremo 3': acaagcaa, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres o cuatro, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 25. El oligonucleótido según cualquiera de modalidades 21 a 24 o un conjugado del mismo, donde al menos dos, tal como dos, tres o cuatro, unidades de ADN de posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, contando del extremo 3', han sido substituidos por su unidad LNA correspondiente y donde las unidades LNA son separadas por al menos una unidad de ADN. 26. El oligonucleótido según la modalidad 25 o un conjugado del mismo, donde la cantidad de unidades de ADN consecutivas de posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, contando del extremo 3', es como máximo dos. 27. El oligonucleótido según la modalidad 26 o un conjugado del mismo, donde cada segundo nucleótido de posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, contando del extremo 3', es una unidad LNA. 28. El oligonucleótido según la modalidad 26 o un conjugado del mismo, nucleótido donde cada tercero de posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, contando del extremo 3', es una unidad LNA. 29. El oligonucleótido según la modalidad 26 o un conjugado del mismo, donde el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xxXxxXxx, xxXxxXxX, xxXxXxxX, xxXxXxXx, xXxxXxxX, xXxxXxXx, xXxXxxXx, xXxXxXxx, XxxXxxXx, XxxXxXxx, XxXxxXxx, xXxXxXxX, XxXxXxxX, XxXxxXxX, XxxXxXxX, y XxXxXxXx; donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad de ADN . 30. El oligonucleótido según la modalidad 29 o un conjugado del mismo, donde el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xxXxxXxx, xXxxXxxX, XxxXxxXx, xXxXxXxX, XxXxXxXx, y XxXxXxxX; donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad de ADN. 31. El oligonucleótido según modalidad 21 o tener del mismo conjugado una secuencia de ADN de posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, contando del extremo 3' : acgtttagg, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres, incluso más preferentemente al menos cuatro, tal como cuatro o cinco, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 32. El oligonucleótido según modalidad 22 o tener del mismo conjugado una secuencia de ADN de posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, contando del extremo 3' : ctcacactg, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres, incluso más preferentemente al menos cuatro, tal como cuatro o cinco, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 33. El oligonucleótido según modalidad 23 o tener del mismo conjugado una secuencia de ADN de posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, contando del extremo 3': ttacgatta, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres, incluso más preferentemente al menos cuatro, tal como cuatro o cinco, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 34. El oligonucleótido según modalidad 24 o tener del mismo conjugado una secuencia de ADN de posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, contando del extremo 3' : acaagcaag, donde al menos uno, tal como uno, preferentemente al menos dos, tal como dos, más preferentemente al menos tres, tal como tres, incluso más preferentemente al menos cuatro, tal como cuatro o cinco, las unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 35. El oligonucleótido según cualquiera de modalidades 21 a 24 o un conjugado del mismo, donde al menos dos, tal como dos, tres, cuatro o cinco, unidades de ADN de posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, contando del extremo 3', han sido substituidos por su unidad LNA correspondiente y donde las unidades LNA son separadas por al menos una unidad de ADN . 36. El oligonucleótido según la modalidad 35 o un conjugado del mismo, donde la cantidad de unidades de ADN consecutivas de posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, contando del extremo 3', es como máximo dos. 37. El oligonucleótido según la modalidad 36 o un conjugado del mismo, donde cada segundo nucleótido de posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, contando del extremo 3', es una unidad LNA. 38. El oligonucleótido según la modalidad 36 o un conjugado del mismo, donde cada tercer nucleótido de posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, contando del extremo 3', es una unidad LNA. 39. El oligonucleótido según la modalidad 36 o un conjugado del mismo, donde el patrón de substitución para los nucleótidos en posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, contando del extremo 3 ' , es seleccionado del grupo que comprende xxXxxXxxX, xxXxxXxXx, xxXxXxxXx, xxXxXxXxx, xXxxXxxXx, xXxxXxXxx, xXxXxxXxx, XxxXxxXxx, xxXxXxXxX, xXxxXxXxX, xXxXxxXxX, xXxXxXxxX, XxxXxxXxX, XxxXxXxxX, XxXxxXxxX, XxxXxXxXx, XxXxxXxXx, XxXxXxxXx, XxXxXxXxx, y XXXXXXXXX; donde "X" denota una unidad LNA y "x" denota una unidad de ADN. 40. El oligonucleótido según cualquiera de las modalidades precedentes o un conjugado del mismo, donde el nucleótido tiene una longitud de 12 a 24 nucleótidos, como una longitud de 12 a 22 nucleótidos, preferentemente una longitud de 12 a 20 nucleótidos, como una longitud de 12 a 19 nucleótidos, más preferentemente una longitud de 12 a 18 nucleótidos, como una longitud de 12 a 17 nucleótidos, incluso más preferentemente una longitud de 12 a 16 nucleótidos. 41. El oligonuecleotide según la modalidad 1 que tiene una secuencia seleccionada del grupo que comprende tgMeCatGgaTttGcaMeCa, tg eCatGgaTttGca MeC, MeCatGgaTttGcaMeC, tGcAtGgAtTtGcAc, CAtGgAtTtGcAc, MeCatGGatTtGcAMeC, TgMeCatGGatTtGcAMeC, y TgMeCaTgGaTTtGcACa ; donde una minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA; o un conjugado del mismo. (SEQ ID NOS: 82-89) 42. El oligonuecleotide según la modalidad 2 que tiene una secuencia seleccionada del grupo que comprende cMeCatTgtCacActMeCca, cMeCatTgtAacTct eCca , ccAttGtcAcaMeCtcMeCa, CMeCatTgtMeCacActMeCc , atTgtMeCacActMeCc, ccAttGtcAcaMeCtcMeC, AttGtcAcaMeCtcMeC, aTtGtMeCaCaMeCtMeCc, AttGTcaMeCaMeCtMeCMeC, MeCcAttGTcaMeCaMeCtMeCMeC, MeCcaTtgTcacActcMeCa, y MeCMeCAttgtcacacTMeCMeCa; donde una minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA; o un conjugado del mismo. (SEQ ID NOS: 90-101) 43. El oligonucleótido según la modalidad 3 que tiene una secuencia seleccionada del grupo que comprende tMeCacGatTagMeCatTaa, aTcaMeCgaTtaGcaTta , TcAcGaTt AgMeCaTtAa , AtcAcGaTtAgMeCaTta ; donde una minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA; o un conjugado del mismo. (SEQ ID NOS: 102-105) . 44. El oligonucleótido según la modalidad 4 que tiene una secuencia seleccionada del grupo que comprende gAgcMeCgaAcgAacAa, gcMeCgaAcgAacAa, GaGcMeCgAaMeCgAaMeCaA, y GcMeCgAaMeCgAaMeCaA; donde una minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA; o un conjugado del mismo. (SEQ ID NOS: 106-109) . 45. El oligonucleótido según cualquiera de las modalidades precedentes o un conjugado del mismo, donde el oligonucleótido comprende al menos un grupo de unión de internucleósido que difiere del fosfodiéster . 46. El oligonucleótido según la modalidad 45 o un conjugado del mismo, donde el grupo de unión de internucleósido, que difiere del fosfodiéster , es el fosforotioato . 47. El oligonucleótido según la modalidad 46 o un conjugado del mismo, donde todos los grupos de unión de internucleósido son fqsforotioato . 48. El oligonucleótido según cualquiera de las modalidades precedentes o un conjugado del mismo, donde las unidades LNA son indistintamente seleccionadas del grupo que comprende unidades tiol-LNA, unidades LNA amino y unidades LNA oxi . 49. El oligonucleótido según la modalidad 48 o un conjugado del mismo, donde las unidades LNA están en la forma beta-D. 50. El oligonucleótido según la modalidad 48 o un conjugado del mismo, donde las unidades LNA son unidades LNA oxi en la forma beta-D. 51. El oligonucleótido según cualquiera de las modalidades precedentes o un conjugado del mismo para uso como un medicamento. 52. Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido según cualquiera de modalidades 1-50 o un conjugado del mismo y un portador farmacéuticamente aceptable. 53. La composición según la modalidad 52, donde el portador es solución salina o solución salina amortiguada. 54. El uso de un oligonucleótido según cualquiera de modalidades 1-50 o un conjugado del mismo, o una composición según la modalidad 52 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer. 55. Un método para el tratamiento de cáncer, que comprende la etapa de administrar un oligonucleótido según cualquiera de las modalidades 1-50 o un conjugado de las mismas, o una composición según la modalidad 52. 56. El uso de un oligonucleótido según cualquiera de las modalidades 1-50 o un conjugado de las mismas, o una composición según la modalidad 52 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de niveles mayores de colesterol plasmáticos. 57. El uso de un oligonucleótido según cualquiera de las modalidades 1-50 o un conjugado de las mismas, o una composición según la modalidad 52 para regular aceleradamente los niveles de ARNm de Nrdg3, Aldo A, Bckdk 0 CD320.

SECCIÓN EXPERIMENTAL Ejemplo 1: Síntesis de monómero Los componentes básicos del monómero LNA y los derivados del mismo estuvieron preparados siguiendo los procedimientos publicados y las referencias citadas allí. Ver por ejemplo WO 03/095467 Al y D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparación de Fosforamiditas LNA, Síntesis 6, 802-808.

E emplo 2 : Síntesis de oligonucleótido Los oligonucleótidos fueron sintetizados usando el enfoque de fosforamidita sobre un sintetizador de Expedite 8900/MOSS (Sistema de Síntesis de Oligonucleótido Múltiple) a ?µ???? o a ?dµt??? escala. Para la síntesis a escala más grande, un Akta Oligo Pilot (GE Healthcare) se usó. Al final de la síntesis (DMT-on) , los oligonucleótidos fueron escindidos del soporte sólido usando el amoníaco acuoso durante 1-2 horas a temperatura ambiente, y después fueron desprotegidos durante 4 horas a 65 °C. Los oligonucleótidos fueron purificados por HPLC de fase inversa (RP-HPLC) . Después de la eliminación del grupo-DMT, los oligonucleótidos estaban caracterizados por AE-HPLC, RP-HPLC, y CGE y la masa molecular fueron confirmados por el ESI-MS. Ver a continuación para más detalles.

Preparación del soporte sólido LNA Preparación del succinil hemiester LNA El monómero de 5 ' -O-Dmt-3 ' -hydroxy-LNA (500 mg. ) , el anhídrido succínico (1.2eq) y DMAP (1.2eq.) fueron disueltos en DCM (35mL) . La reacción fue agitada a temperatura ambiente durante la noche. Después de extracciones con NaH2P04 0.1 pH 5.5 (2x) y salmuera (Ix), la capa orgánica fue deshidratada además con el anhidro Na2S04 filtrado y evaporado. El derivado de hemiester fue obtenido en 95% de la producción y se usó sin ninguna otra purificación.

Preparación del soporte LNA El derivado de hemiester con anterioridad preparado (90µ???1) fue disuelto en una cantidad mínima de CMF; DIEA y pyBOP (90umol) fueron añadidos y mezclados conjuntamente durante 1 minuto. Esta mezcla preactivada fue combinada con LCAA-CPG (500 A, 80-120 tamaño de malla, 300 mg.), y agitada en un sintetizador manual. Después de 1.5 horas a temperatura ambiente, el soporte fue filtrado y lavado con DMF, DCM y MeOH. Después del secado, la carga fue determinada a 57umol/g (ver Tom Brown, Dorcas J. S. Brown. Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis. En: F.Eckstein, editor. Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13-14) .

Alargamiento del oligonucleótido El acoplamiento de fosforamiditas (A(bz), G(ibu), 5-methyl-C (bz) ) o ?-ß-cyanoethyl-phosphoramidite) es llevado a cabo por el empleo de una solución de 0.1 m de la amidita protegida 5 '-O-DMT en el acetonitrilo y DCI (4, 5-dicianoimidazol) en el acetonitrilo (0.25M) como el activador. La tiolación es llevada a cabo por el empleo de cloruro de xantano (0.01M en el acetonitrilo: 10% de piridina) . El resto de los reactivos es comunmente usado para la síntesis de oligonucleotidos.

Purificación mediante RP-HPLC: Columna: Xterra RPi8 Velocidad de flujo: 3ml/min Amortiguadores: 0.1M de acetato de amonio a pH 8 y acetonitrilo Abreviaturas : D T: Dimetoxitritilo DCI: , 5-Dicianoimidazol D AP: 4-Dimetilaminopiridina DCM: Diclorometano D F: Dimetilformamida THF: Tetrahidrofurano DIEA: N, N-diisopropiletilamina PyBOP: Hexafluorofosfato benzotriazol-l-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio Bz: Benzoilo Ibu: Isobutirilo Ejemplo 3: Diseño de los oligonucleótidos anti-miR LNA y temperaturas de fusión Micro-ARN con especificidad de objetivo: miR-122a: 51 -uggagugugacaaugguguuugu-3 ' SEQ ID NO: 1 miR-122a 3' a 5': 3 ' -uguuugugguaacagugugaggu-5 ' (SEQ ID NO: 1 orientación inversa) . Tabla 1 secuencias del oligonucleotido anti-miR LNA y Tm: SEQ Oligo SEQ ID Secuencia : Tm ID ID (°C) NO: 2 SPC3370 Diseño SEQ ID 5' - Estructura PS 75 XxxX 56 cCatTgtCacActCca-3' 3 SPC3372 Diseño SEQ ID 5' - Estructura PS 69 XxxX 57 ccAttGtcAcaCtcCa-3' 4 SPC3375 Gapmer SEQ 5' - Estructura PS 69 ID58 CCAttgtcacacTCCa-3' 5 SPC3549 15-mer SEQ ID 5' -CcAttGTcaCaCtCC- Estructura PS 78 59 3' 6 SPC3550 Control SEQ ID 5' -CcAttCt^aCcCtAC- Estructura PS 32 disparej o 60 3' 7 SPC3373 Control SEQ ID 5' - Estructura PS 46 dispare o 61 ccAttGtcTcaAtcCa-3' 8 SPC3548 13-mer SEQ ID 5' -AttGTcaCaCtCC-3' Estructura PS 62 Minúscula: ADN, mayúscula: LNA (todos LNA C estaban metilados) , subrayado: malapareamiento Las temperaturas de fusión fueron evaluadas en la secuencia de miR-122a madura, usando un oligonucleótido ARN miR-122a sintético unido con el fosforotioato. El oligo dúplex LNA anti-miR/miR-122a se diluyó a 3uM en 500µ1 de ARNasa sin H20, que se mezcló posteriormente con 500µ1 de amortiguador de dimerización 2x (cono final de oligo/dúplex. 1,5µ?, amortiguador Tm 2x: 200 mm de NaCI, 0,2mM EDTA, 20 mm de NaP, pH 7,0, DEPC sometido a tratamiento para remover ARNasa) . Se calentó la mezcla primero a 95 grados durante 3 minutos; luego se dejó enfriándose a temperatura ambiente (RT) durante 30 minutos. Siguiendo la incubación RT la Tm fue cuantificada sobre La bda 40 Espectrofotómetro UV/VIS con el programador de temperatura peltier PTP6 usando el software PE Templab (Perkin Elmer) . La temperatura fue elevada gradualmente de 20°C a 95°C y luego descendió otra vez a 20°C, registrando continuamente una absorción a 260 nm. Los primeros derivados y máximos locales, tanto de la fusión como de templadura, fueron usados para evaluar el punto de fusión/templadura (Tm) ; ambos deberían lanzar valores similares/iguales de Tm. Para el primer derivado, 91 puntos se usaron para calcular la cuesta.

Al sustituir el oligonucleótido de antimir y la molécula complementaria de ARN, el ensayo anterior puede ser usado para determinar la Tm de otros oligonucleótidos, como los oligonucleótidos según la invención. Sin embargo, en una modalidad el Tm puede elaborarse con una molécula complementaria de ADN (enlaces de fosforotioato) . Comunmente, la Tm cuantificado en comparación con una molécula complementaria de ADN es aproximadamente 10°C menos que la Tm con un complemento equivalente de ARN. La Tm con complemento de ADN puede usarse por lo tanto en los casos en que el dúplex tiene una Tm muy elevada.

Medidas de la temperatura de fusión (Tm) Se sabe que para oligonucleótidos con la Tm muy elevada, las pruebas anteriores de Tm pueden ser insuficientes para determinar 1a Tm. En tal caso, el empleo de una molécula fosforotioatada complementaria de ADN puede posterioremente bajar la Tm. El empleo de formamida es rutinario en el análisis de la hibridación de los oligonucleotidos (ver Hutton 1977, NAR 4 (10) 3537-3555) . En el ensayo anterior, la inclusión de 15% de formamida comunmente baja la Tm aproximadamente 9°C, y la inclusión de 50% de formamida comunmente baja la Tm aproximadamente 30°C. Por lo tanto, usando estas proporciones, es posible determinar la Tm relativo de un oligonucleótido con su molécula complementaria ARN ( fosfodiéster ) , aun cuando la Tm del dúplex es, por ejemplo, más elevada de 95°C (en ausencia de la formamida) . Para los oligonucleotidos con una Tm muy elevada, un método alternativo de determinar la Tm es hacer titulaciones y ponerlo un gel para observar la cadena sencilla contra el dúplex, y mediante esas concentraciones y proporciones determinar Kd (la constante de disociación) que está relacionado con delta G y también Tm.

Ejemplo 4: La estabilidad de los oligonucleotidos LNA en plasma del ser humano o de las ratas La estabilidad del oligonucleótido LNA fue analizada en el plasma humano o rata (también podría ser a partir de plasma de ratón, mono o perro) . En 45µ1 del plasma, se añade 5µ1 del oligonucleótido LNA (a una concentración final de 20µ?) . Los oligonucleótidos LNA son incubados en el plasma durante periodos de tiempo que abarcan de 0 a 96 horas a 37 °C (el plasma es analizado para ver la actividad de nucleasa hasta 96 horas y no muestra ninguna diferencia en el patrón de la escisión de nucleasa) . En el periodo de tiempo indicado, las muestras son rápidamente congeladas en nitrógeno liquido. 2µ1 (igual a 40pmol) del oligonucleótido LNA en el plasma fue diluido mediante la adición de 15µ1 de agua y 3µ1 de colorante de carga 6x ( Invitrogen) . Una escala lObp (Invitrogen, EE . UU 10821-015) es usada como marcador. A ?µ? de la escala, se añade ?µ? de la carga 6x y 4µ1 de agua. Las muestras son mezcladas, calentadas a 65°C durante 10 minutos y cargadas a un gel de prefuncionamiento (16% acrilamida, 7 M UREA, Ix TBE, prefuncionamiento a 50 vatios durante 1 hora) y funcionan a 50-60 vatios durante 2Vz horas. Posteriormente, el gel es teñido con Ix SyBR-oro (sondas moleculares) en Ix TBE durante 15 minutos. Las bandas fueron visualizadas usando un phosphoimager de BioRad.

Ejemplo 5: modelo in vltro: Cultivo celular El efecto de oligonucleótidos LNA sobre la (cantidad) expresión de ácido nucleico con especificidad de objetivo puede ser analizada en cualquier tipo de una variedad de células si el ácido nucleico con especificidad de objetivo esté presente a niveles mensurables. El objetivo puede ser expresado endógenamente o por transfección transitoria o estable de un ácido nucleico que codifica para el ácido nucleico . El nivel de expresión del ácido nucleico con especificidad de objetivo puede ser rutinariamente determinado usando, por ejemplo, el análisis de Northern blot (incluyendo micro-RNA Northern) , PCR Cuantitativo (incluyendo qPCR micro-ARN) , ensayos de protección de Ribonucleasa. El siguiente tipo celular es proporcionado con objetivos ilustrativos, pero otro tipo celular puede usarse rutinariamente, si el objetivo es expresado en el tipo celular elegido. Las células se cultivan en el medio apropiado como se describe a continuación y se mantienen a 37 °C, con una humedad del 95-98% y 5% de C02. Las células son rutinariamente sometidas a pases de atenuación 2 o 3 veces por semana. 15PC3: la linea celular de cáncer de próstata en humanos 15PC3 fue amablemente donada por el Doctor F. Baas, del Laboratorio de Neurozintuigen, AMC, los Países Bajos, y cultivada en DME (Sigma) +10% de suero fetal de bovino (FBS) + Glutamax I + gentamicina. PC3: la línea celular de cáncer de próstata en humanos PC3 fue adquirido del ATCC, y fue cultivado en el Mapache F12 con glutamine (Gibco) + 10%FBS + gentamicina. 518A2: la línea celular de cáncer de melanoma en humanos 518A2 fue amablemente donada por doctor B. Jansen, de la Sección de Oncología experimental, Farmacología Molecular, Departamento de la Farmacología Clínica, de la Universidad de Viena, y fue cultivada en DMEM (Sigma) + 10% de suero fetal de bovino (FBS) + Glutamax I + gentamicina. HeLa : la línea celular de carcinoma cervical HeLa fue cultivada en MEM (Sigma) que contienelO% de suero fetal de bovino y gentamicina a 37 °C, con 95% de humedad y 5% de C02 .

MPC-I1: la línea celular de mieloma múltiple de murino MPC-I1 fue adquirida del ATCC, y mantenida en DMEM con 4mMGlutamax + 10% suero equino. DU-145: la línea celular de cáncer de próstata en humanos DU-145 fue adquirida del ATCC, y mantenida en RPMI con Glutamax + 10%FBS. RCC-4 +/-VHL: la línea celular de cáncer renal en humanos RCC4 establemente transfectado con el plásmido que expresa VHL o plásmido vacío fue adquirida de ECACC y mantenida según instrucciones de los fabricantes. 786-0: La línea celular de carcinoma celular renal en humanos 786-0 fue adquirida del ATCC, y mantenida según instrucciones de los fabricantes. HUVEC: la línea celular endotelial de vena umbilical de humano HUVEC fue adquirida de Camcrex, y mantenida en un medio tipo EGM-2. K562: la línea celular de leucemia mielógena crónica en humanos K562 fue adquirida de ECACC, y mantenida en RPMI con Glutamax + 10%FBS. U87MG: la linea celular de glioblastoma en humanos U87MG fue adquirida del ATCC, y mantenida según las instrucciones de los fabricantes . B16: la linea celular de melanoma de murino B16 fue adquirida del ATCC, y mantenida según las instrucciones de los fabricantes. LNCap: la linea celular de cáncer de próstata en humanos LNCap fue adquirida del ATCC, y mantenida en RPMI con Glutamax + 10%FBS Huh-7: hígado de humano, epitelial como es cultivado en Eagles MEM con 10%FBS, 2 mm Glutamax I, Ix aminoácidos no esenciales, Gentamicina 25ug/ml. L428: (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM, Braunschwieg, Alemania) ) : linfoma de linfocito B humano mantenido en RPMI 1640 complementado con 10%FCS, L-glutamina y antibióticos. L1236: (Sammlung alemán für Mikroorganismen (DSM, Braunschwieg, Alemania) ) : linfoma de linfocito B de humano mantenido en RPMI 1640 complementado con 10%FCS, L-glutamina y antibióticos.

Ejemplo 6: modelo in vitro: Tratamiento con oligonucleótido antisentido de anti-miR ??? La línea celular Huh-7 que expresa miR-122a fue transfectada con anti-miR LNA a concentraciones de 1 y lOOnM según el protocolo 2000 de liopfectamina optimizado (LF2000, Invitrogen) (como sigue) . Las células de Huh-7 fueron cultivadas en Eagles MEM con 10%FBS, 2 mm Glutaraax I, Ix aminoácidos no esenciales, Gentamicina 25yg/ml. Las células fueron sembradas en placas de 6 pocilios (300000 células por pocilio), en un volumen total de 2,5ml el día antes de transfeccion. El día de transfeccion, una solución que contiene LF2000 diluido en Optimem (Invitrogen) fue preparada (1.2ml de optimem + 3,75µ1 de LF2000 por pocilio, final 2.5pg de LF2000/ml, el volumen de la suma total de 1.5ml) . Los oligonucleótidos LA (anti-miR de LNA) también fueron diluidos en optimem. 285µ1 de optimem + 15µ1 de LNA oligonuclotide (??µ? de reserva de oligonucleótido para la concentración final lOOnM, y 0,luM para la concentración final lnM) . La células fueron lavadas una vez en optimem; luego el 1.2ml de la mezcla optimem/LF2000 fue añadido a cada pocilio. Las células fueron incubadas 7 minutos a temperatura ambiente en la mezcla LF2000, donde se añadió la solución de 300µ1 del oligonucleótido optimem después. La célula fue incubada además durante cuatro horas con el oligonucleótido y el Iipofectamine 2000 (en la incubadora celular regular a 37 °C, 5% de C02) . Después de estas cuatro horas, el medio/mezcla fue retirado, y el medio regular completo fue añadido. Las células pudieron crecer durante 20 horas más. Las células fueron recolectadas en Trizol (Invitrogen) 24 horas después de la transfeccion. El ARN fue extraído según un protocolo de Trizol convencional, siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen) , sobre todo para retener el micro-ARN en la extracción del ARN total. Ejemplo 7: modelo in vitro e ín vivo: el Análisis de la Inhibición de Oligonucleótido de la expresión miR por los niveles de miR-122a cuantitativo con micro-ARN PCR especifico en las muestras de ARN fue evaluado en un instrumento PCR ABI 7500 de tiempo real rápido (Applied Biosystems, EE. UU) , usando un kit especifico qRT-PCR de miR-122a, mirVana (Ambion, EE. UU) y cebadores de miR-122a (A bion, EE. UU) . El procedimiento fue conducido según el protocolo de los fabricantes.

Resultados : El nuevo diseño del oligonucleótido anti-miR LNA con miR-122a especifico (es decir SPC3349 (también llamado SPC 3549)) resultó ser más eficiente en la inhibición de miR-122a en 1 nM en comparación con modelos de diseño anteriores, incluyendo los adornos "cada tercero" y "gapmer" (SPC3370, SPC3372, SPC3375) se encontraban a 100 nM. Se descubrió que el control de malapareamiento no inhibía miR-122a (SPC3350) . Se muestran los resultados en la figura 1.

Ejemplo 8: La evaluac ón de la especificidad inactivada del antagcmir LNA., usando la determinación del perfil de la expresión de micrcmatriz de miARN. A) Categorización del ARN para determinar el perfil de micromatriz de miARN El ARN total fue extraído usando el reactivo Trizol (Invitrogen) y extremo 3' categorizado por el empleo de la ligase ARN T4 y el ligador de ARN categorizado Cy3 o Cy5 (5'-P04-rUrUrU-Cy3/dT-3 ' o 5 ' -P04-rUrUrU-Cy5/dT-3 ' ) . Las reacciones de la categorización contenían 2-5 g del ARN total, ligador de ARN 15 µ?, 50 mM Tris-HCI (pH 7.8), 10 mm de MgCI2, 10 mm de DTT, 1 mm de ATP, 16% de polietilenglicol y ligase T4 de 5 unidades ARN (Ambion, EE . UU) , y fueron incubadas a 30 °C durante 2 horas, después la inactivación por calor de ligase ARN T4 a 80° C durante 5 minutos.

B) La hibridación de micromatriz y lavados de la posthibridación Las sondas de captura del o 1 i gonuc 1 e ó t i do LNA modificado que comprenden sondas para todos los miARN del ratón (Mus musculus) y del humano (Homo sapiens) anotados en la publicación 7.1 de la base de datos microARN, incluyendo un grupo de sondas positivas y negativas de control, fueron adquiridas de Exiqon (Exiqon, Dinamarca) , y usadas para imprimir las mi croma t r i ce s para la determinación del perfil de miARN. Las sondas de captura contienen un ligador modificado C6-amino de terminal 5', y fueron diseñadas para tener un Tm de 72°C contra los miARN con especificidades de objetivo complementarios por ajuste del contenido LNA y longitud de las sondas de captura. Las sondas de captura fueron diluidas a una concentración final de 10µ? en 150 mm de amortiguador de fosfato de sodio (pH 8.5) , y se descubrieron por cuadruplicado en los portaobjetos de Codelink (Amersham B i o s c i e nce s ) , usando la Microrejilla II microseleccionadora de BioRobotics con una humedad de 45% y a temperatura ambiente. Los portaobjetos reconocidos fueron posteriormente procesados como el fabricante recomienda. . Al ARN identificado lo combinaron para formar un híbrido con las mi c rorna t r i ce s de LNA durante la noche a 65°C en una mezcla de hibridación que contiene 4x SSC, 0.1% SDS, lyg/µ? de ADN espermático de arenque y 38% formamida. Los portaobjetos híbridos fueron lavadas tres veces en 2 x SSC, 0.025% SDS a 65°C; luego tres veces en 0.08x SSC, y finalmente tres veces en 0.4x SSC a temperatura ambiente.

C) Exploración de matriz, análisis de imagen y procesamiento de la información Las mi c r orna t r i ce s fueron revisadas usando el escáner ArrayWorx (Applied Precisión, EE. UU) , según las recomendaciones del fabricante. Las imágenes exploradas fueron importadas a TIGR Spotfinder versión 3.1 (Saeed et al., 2003) para la extracción de intensidades de mancha promedio e intensidades de referencia locales medianas, excluyendo manchas con intensidades por debajo del fondo local mediano + 4x desviaciones estándares. Las intensidades correlacionadas con el fondo fueron normalizadas usando el paquete estabilizador de la normalización con varianza versión 1.8.0 (Huber et al., 2002) para R (www.r-project.org) . Las intensidades de las manchas replicadas promediadas usando Microsoft Excel. Las sondas que muestran un coeficiente de varianza > a 100% fueron excluidas de los futuros análisis de datos .

Ejemplo 9: Detección de micro-ARN por hibridación in situ La detección de micro-ARN en las secciones de tejido fijado con formalina e introducido con parafina por hibridación in situ.

A) Preparación de las secciones fijadas con formalina e introducidas con parafina para hibridación in situ Las muestras introducidas con parafina de archivo son recuperadas y seccionadas en secciones de 5 a 10 mm y montadas en portaobjetos positivamente cargados, usando el método de flotación. Los portaobjetos se almacenan a 4 °C hasta que los experimentos in situ se realicen.

B) Hibridación in situ A las secciones de los portaobjetos se les quita la parafina con xylene, y luego se les hidrata de nuevo mediante una serie de dilución de etanol (del 100% a 25%). Los portaobjetos se sumergen en agua tratada con DEPC y sujeta a HCI y tratamiento de 0.2% de Glicina, fijado de nuevo en 4% de pa r a f orma 1 deh i do y sometidas a tratamiento con anhídrido acético/trietanolamina; se enjuaga los portaobjetos en varios lavados de PBS IX entre tratamientos. Se hace un pre-híbrido de los portaobjetos en solución hyb (50% formamida, 5X SSC, 500mg/ml de levadura tRNA, IX Denhardt) a 50°C durante 30 minutos. Luego, 3pmol de la sonda LNA categorizada FITC (Exiqon, Dinamarca) complementaria a cada uno de los miRIMA seleccionados se añade a la solución hyb. y se deja hacer el híbrido durante una hora a una temperatura de 20 a 25 °C por debajo de la Tm predecido de la sonda (comunmente entre 45 y 55°C según la secuencia miRIMA) . Después ser lavada en 0. IX y 0.5X SCC a 65°C, una reacción de amplificación de señal de tiramida fue llevada a cabo, usando el kit Genpoint Fluorescein (FITC) ( DakoCytomation, Dinamarca), siguiendo las recomendaciones del vendedor. Finalmente, los portaobjetos son montados la solución Prolong oro. La reacción de fluorescencia se puede desarrollar durante 16 a 24 horas antes de documentar la expresión del miARN seleccionado usando un microscopio de epifluorecencia .

Detección de micro-ARN por la preparación entera de la hibridación in situ del pez cebra, Xenopus y embriones de ratón . Todos los pasos de lavado y de incubación se llevan a cabo en tubos eppendorf de 2 mi. Los embriones son fijados durante la noche a 4°C en 4% de paraformaldehido en PBS y posteriormente transferidos mediante una serie graduada (25% de MeOH en PBST (PBS que contiene 0.1% de Tween-20 del), 50% MeOH en PBST, 75% de MeOH en PBST) a 100% de metanol y almacenados a -20°C durante varios meses. El primer día, los embriones de hibridación in situ son hidratados de nuevo por incubaciones sucesivas durante 5 minutos en 75% de MeOH en PBST, 50% de MeOH en PBST, 25% de MeOH en PBST y 100% PBST (4 x 5 minutos ) . El pez, el ratón y los embriones de Xenopus son tratados con proteinaseK (10pg/ml en PBST) durante 45 minutos a 37°C, fijados de nuevo durante 20 minutos en 4% de paraformaldehido en PBS, y lavados durante 3 x 5 minutos con PBST. Después de un breve lavado en agua, la actividad de la fosfatase alcalina endógena es bloqueada por la incubación de los embriones en 0.1M tri-etanolamine y 2.5% de anhídrido acético durante 10 minutos, seguida de un breve lavado en agua y un lavado en PBST de 5 x 5 minutos. Los embriones son transferidos luego al amortiguador de hibridación (50% de Formamida, 5x SSC, 0.1% de Tween, 9.2 mm de ácido cítrico , 50ug/ml de heparina, 500ug/ml de ARN de levadura) de 2 a 3 hora a la temperatura de hibridación. La hibridación se lleva a cabo en el amortiguador de hibridación precalentado fresco que contiene 10 nM de 3' DIG - sonda LNA categorizada (Diagnósticos Roche) complementario a cada miARN seleccionado. Se realizan los lavados que prosiguen a la hibridación a temperatura de hibridación por incubaciones sucesivas durante 15 minutos en HM- (amortiguador de hibridación sin heparina y ARN de levadura), 75% HM-/25% 2x SSCT (SSC que contiene 0.1% de Tween-20), 50% HM-/50% 2x SSCT, 25% HM-/75% 2x SSCT, 100% 2x SSCT, y en 0.2x SSCT durante 2 x 30 minutos. Posteriormente, los embriones son transferidos a PBST por incubaciones sucesivas durante 10 minutos en 75% 0.2x SSCT/25% PBST, 50% 0.2x SSCT/50% PBST, 25% 0.2x SSCT/75% PBST y 100% de PBST. Después de obstruirse durante 1 hora en amortiguador de bloqueo (2% de suero de ovejas / 2mg:ml de BSA en PBST) , los embriones son incubados durante la noche a 4°C en el amortiguador de bloqueo que contiene fragmentos FAB anti-DIG-AP (Roche, 1/2000) . Al día siguiente, los embriones del pez cebra son lavados durante 6 x 15 minutos en PBST, ratón y X. embriones tropicalis son lavados durante 6 x 1 hora en TBST, que contiene 2 mm de levamisol, y luego durante 2 días a 4°C con el refresco regular de amortiguador de lavado.

Después los lavados de anticuerpos posteriores, los embriones son lavados durante 3 x 5 minutos en amortiguador de tinción (100 mm de tris HCI pH9.5, 50 mm de MgCI2, 100 mm de NaCI, 0.1% tween 20) . La tinción se llevó a cabo en amortiguador suministrado de de NBT (Roche, 50mg/ml de la reserva) y 3.5yl/ml de BCIP (Roche, 50mg/ml de la reserva) . La reacción se detiene con 1 mm de EDTA en PBST y los embriones son almacenados a 4°C. Los embriones son montados en la solución de Murray (2:1 benzylbenzoato : benzylalcohol ) vía una serie de metanol cada vez mayor (25% de MeOH en PBST, 50% de MeOH en PBST, 75% de MeOH en PBST, 100% de MeOH) antes de la representación óptica .

Ejemplo 10: modelo in vltro: Aislamiento y análisis de la expresión de ARNm (aislamiento total de ARN y síntesis de ADNc para análisis de ARNm) El ARN total fue aislado usando el mini kit de RNeasy (Qiagen) o usando el reactivo Trizol ( Invitrogen) . Para el aislamiento de ARN total usando el mini kit de RNeasy (Qiagen) , las células fueron lavadas con PBS, y el Amortiguador de Lisis Celular (RTL, Qiagen) complementado con 1% mercaptoetanol fue añadido directamente a los pocilios. Después de unos minutos, las muestras fueron procesadas según las instrucciones del fabricante.

Para el análisis in vivo de la expresión de mRIMA, primero se homogeneizaron las muestras de tejido usando el homogeneizador 300 MM Retsch, y el ARN total fue aislado usando el reactivo Trizol o el mini kit RNeasy como se describe por el fabricante. La primera síntesis de la cadena (ADNc a partir de ARNm) fue llevada a cabo usando el kit OmniScript Reverse Transcriptase o M-MLV Reverse transcriptase (esencialmente descrito por el fabricante (Ambion) ) según las instrucciones del fabricante (Qiagen) . Cuando se usó OmniScript Reverse Transcriptase 0.5 g del ARN total, cada muestra fue ajustada a 12µ1 y mezclada con 0.2µ1 de poly (dT) 12-18 (0.5µ? / µ 1) (Tecnologías de Vida), 2µ1 de la mezcla dNTP (5 mm cada uno), 2µ1 de amortiguador RT lOx, 0.5µ1 de RNAguard ™ ARNasa Inhibiyor (33 unidades/ml, Amersham) y ?µ? del OmniScript Reverse Transcriptase; luego se incubó a 3 °C durante 60 minutos e inactivación de calor a 93°C durante 5 minutos. Cuando se llevó a cabo la primera síntesis de cadena usando decamers al azar y -MLV-Reverse Transcriptase (esencialmente como se describe por el fabricante (Ambion) ) . 0.25µg del ARN total de cada muestra fue ajustado a 10.8µ1 en H20. 2µ1 de decamers y 2µ1 de la mezcla dNTP (2.5 mM cada uno) fue añadido. Las muestras fueron calentadas a 70°C durante 3 minutos y se enfriaron inmediatamente en agua helada y añadieron 3.25µ1 de una mezcla que contiene (2µ1 del amortiguador RT 10x; ?µ? de M LV Transcriptase inverso; 0.25µ1 de inhibidor RNAase). El ADNc es sintetizado a 42°C durante 60 minutos; luego sigue la etapa de inactivación a 95°C durante 10 minutos y finalmente se enfria a 4°C. El ADNc puede usarse además para el cálculo de ARNm por el PCR cuantitativo de tiempo real, por ejemplo. La expresión de ARNm puede ser estudiada en una variedad de modos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ARNm pueden ser cuantificados, por ejemplo, mediante análisis de Northern blot, reacción en cadena de polimerasa competitiva (PCR), estudio de protección de Ribonucleasa (RPA) o PCR de tiempo real. El PCR cuantitativo de tiempo real es preferido actualmente. El análisis de ARN puede ser llevado a cabo sobre ARN o ARNm celular total. Los métodos de aislamiento de ARN y análisis de ARN, como el análisis de Northern blot, son rutinarios en la técnica y son mostrados, por ejemplo, en "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley e Hijos. (PCR) cuantitativo de tiempo real puede ser convenientemente llevado a cabo usando comercialmente disponible iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System, disponible a partir de BioRAD. El PCR cuantitativo de tiempo real es un método muy conocido en la técnica, y es mostrado, por ejemplo, en Heid et al. Real time quantitative PCR, Investigación sobre Genoma (1996), 6: 986-994.

Ejemplo 11: La absorción del oligonucleotido LNA y la eficacia in vivo. Estudio in vivo: Seis grupos de animales (5 ratones por grupo) son sometidos a tratamiento de la siguiente manera. A los animales del grupo 1 se les inyectó 0.2ml de solución salina por i.v. 3 días sucesivos; el grupo 2 recibo 2.5mg/kg de SPC3372; el 3 recibió 6.25mg/kg; el 4 recibió 12.5mg/kg, y el 5 recibió 25mg/kg, mientras que el grupo 6 recibió 25mg/kg de SPC 3373 (oligonucleotido de malapareamiento ANTIMIR DE LIMA ™) , todos de la misma manera. Todas as dosis fueron calculadas a partir de los pesos corporales de cada animal al Dia 0 Antes de medicar (Dia 0) y 24 horas después de la última dosis (Dia 3) , la sangre orbital retro fue recolectada en tubos con EDTA y la fracción plasmática recolectada y congelado a -80 °C para el análisis de colesterol. Los hígados de sacrificio fueron disecados, y una porción fue cortada en cubos de 5 mm y sumergida en 5 volúmenes de RNAIater helado. Una segunda porción fue congelada de inmediato en nitrógeno líquido, y fue almacenada para el crioseccionamiento . El ARN total fue extraído de muestras hepáticas como se describió anteriormente, y fue analizado para niveles de miR-122a por el QPCR de micro-ARN específico. La figura 5 demuestra una clara respuesta a la dosis obtenida con SPC3372 con un IC50 a ca 3-5mg/kg, mientras que se detectó inhibición de miR-122a al usar el malapareamiento antagomir de LNA SPC 3373 para miR-122a.

Ejemplo 12 : Respuesta a la dosis LNA-antimiR-122a in vivo en ratones hembra CS7/BL/J. Estudio in vivo: Diez grupos de animales (embra C57/BL6; 3 ratones por grupo) son sometidos a tratamiento de la siguiente manera. A los animales del grupo 1 se les inyectó 0.2ml de solución salina por i.p. el día 0, el día 2 y el dia 4. Los grupos del 2 al 10 se les medicó mediante i.p. con tres conos diferentes. (25mg/kg, 5mg/kg y lmg/kg) de cualquiera LNA antimiR-122a/SPC3372 (grupo 2-4), LNA antimir-122a/SPC3548 (grupo 5-7) o LNA antimir-122a/SPC3549 (grupo 8-10); las secuencias de antimir-122a LNA se proporcionan en Tabla 1. Los tres oligonucleótidos de antimir-122a LNA tienen como objetivo el miR-122a especifico del higdo. Las dosis fueron calculadas a partir de los pesos corporales de cada animal al Dia 0. Los animales fueron sacrificados 48 horas después de la última dosis (Dia 6) ; la sangre retro-orbital fue recolectada en tubos con EDTA y la fracción plasmática recolectada y congelado a -80°C para el análisis de colesterol. Los hígados de sacrificio fueron disecados, y una porción fue cortada en cubos de 5 mm y sumergida en 5 volúmenes de RNAIater helado. Una segunda porción fue congelada de inmediato en nitrógeno líquido, y fue almacenada para el crioseccionamiento . El ARN total fue extraído de muestras hepáticas usando el reactivo Trizol según las recomendaciones del fabricante (Invitrogen, EE. UU) , y fue analizado para niveles de miR-122a por QPCR específico para el micro-ARN según las recomendaciones del fabricante (Ambion, EE. UU) . Las figuras 2a-2b demuestran una clara respuesta a la dosis obtenida con las tres moléculas de antimir-122a LNA (SPC3372, SPC3548, SPC3549) . Tanto SPC3548 como SPC3549 muestran la eficacia considerablemente mejorada in vivo en el silenciamiento de miR-122a (observado en los niveles reducidos de miR-122a) en comparación con SPC3372, siendo el más potente con SPC3549 (IC50 ca lmg/kg) . El ejemplo anterior fue repetido usando SPC3372 y SPC 3649, al usar 5 ratones por grupo y los datos combinados (un total de ocho ratones por grupo) se muestra en la Figura 2b.

Ejemplo 12a: Northern Blot. La Técnica Northern blot con microARN específico mostrando obstrucción miR-122 reforzada por SPC3649, en comparación con SPC3372 en hígados de ratón sometidos a tratamiento de LNA-antimiR. Los oligos usados en este ejemplo: SPC3649: 51-CcAttGTcaCaCtCC-3 ' (SEQ ID 59) Nuevo diseño SPC3372: 51-CcAttGtcAcaCtcCa-3' (SEQ ID 57) Diseño anterior Decidimos evaluar el efecto de SPC3649 a niveles de miARN miR-122 en los hígados de ratones sometidos a tratamiento con SPC3649. Los LNA-antimiR SPC3649 y SPC3372 fueron administrados en ratones por tres ratones sometidos a tratamiento con inyecciones i.p. cada dos días durante un periodos de seis días a dosis indicadas; esto es seguido del sacrificio de los animales 48 horas después de la última dosis. El ARN total fue extraído de los hígados. Los niveles de miR-122 fueron evaluados por el micro-ARN Northern blot específico (figura 6). El tratamiento de ratones normales con SPC3649 dio como resultado la reducción notablemente mejorada, dependiente de la dosis de miR-122. El microARN Northern blot específico que compara SPC3649 con SPC3372 se llevó a cabo (figura 6) . SPC3649 bloqueó completamente miR-122 tanto a 5 como a 25mg/kg como se observa por la ausencia de miR-122 maduro de cadena simple y sólo la presencia de la banda doble entre el LNA-antimiR y miR-122. La comparación la banda doble con la madura en el SPC3649 de Northern blot parece igualmente eficiente a lmg/kg como SPC3372 a 25mg/kg.

Ejemplo 13: Evaluación de niveles de colesterol en plasma en ratones sometidos a tratamiento con LNA anti-miR122 El nivel de colesterol total fue cuantificado en el plasma usando un CP Colesterol de estudio colométrico de ABX Pentra. El colesterol fue cuantificado siguiendo hidrólisis enzimática y oxidación (2,3). 21.5µ1 de agua fueron añadidos a 1.5µ1 del plasma. 250µ1 del reactivo fue añadido y, en 5 minutos, el contenido de colesterol cuantificó a una longitud de onda de 540n . Las medidas sobre cada animal se hicieron dos veces. La sensibilidad y la linealidad fueron analizadas con un compuesto de control diluido doblemente (ABX Pentra N control). El nivel de colesterol fue determinado por la substracción del fondo, y fue presentado relativo a los niveles de colesterol en el plasma de ratones sometidos a tratamiento con solución salina. Las figuras 3a-3b demuestran un nivel marcadamente hacia abajo de colesterol plasmático en los ratones que recibieron SPC3548 y SPC3549 en comparación con el control de solución salina a Día 6.

Ejemplo 14: la Evaluación del objetivo de miR-122a, ARNm, en Ratones sometidos a tratamiento con LNA-antimiR-122a Los animales con control de solución salina y tratados con diferentes LNA-antimiR -122a fueron sacrificados 48 horas después de la última dosis (Día 6), y el ARN total fue extraído de muestras hepáticas usando el reactivo Trizol según las recomendaciones del fabricante (Invitrogen, EE. UU) . Los niveles de ARNm fueron evaluados por el RT-PCR cuantitativo de tiempo real para dos genes objetivo de miR-122a, Bckdk (cadena ramificada ketoacid deshidrogenasa kinase, ENSMUSG00000030802 ) y aldolasa A (aldoA, ENSMUSG000000S000S ) , respectivamente, así como para GAPDH como el control, usando estudios de Taqman según las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, EE. UU) . La figura 4a y 4b demuestran un claro aumento dependiente de la dosis de los dos genes objetivo de miR-122a, Bckdk Y AldoA, respectivamente, como una respuesta al tratamiento con tres moléculas de antimir-122a LNA (SPC3372, SPC3548, SPC3549) . En contraste, los ensayos de qPCR para el control de GAPDH no revelaron ninguna diferencia en los niveles de ARNm GAPD en los Ratones sometidos a tratamiento con LNA-antimiR-122a en comparación con los del control de solución salina (Figura 4c). Los niveles de ARNm de AldoA Y Bckdk eran considerablemente más elevados en los ratones sometidos a tratamiento con SPC3548 y SPC3549, en comparación con los ratones sometidos a tratamiento con SPC3372 (Figura 4a y 4b), demostrando de esa manera su eficacia mejorada in vivo.

Ejemplo 15: Duración de acción de oligonucleotido LNA in vivo.

Estudio in vivo: Dos grupos de animales (21 ratones por grupo) son sometidos a tratamiento de la siguiente manera. Los animales del grupo 1 fue inyectados con 0.2ml de solución salina por i.v. durante 3 días sucesivos; el grupo 2 recibió 25mg/kg de SPC3372 de la misma manera. Todas las dosis fueron calculadas a partir de los pesos corporales de cada animal al Día 0. Después de la última dosis (Día 3), 7 animales de cada grupo fueron sacrificados el Día 9, el Día 16 y el Día 23, respectivamente. Antes de esto, cada día, sangre de órbita retro era recolectada en tubos que contienen EDTA y la fracción plasmática recolectada y almacenada y congelada a -80°c para el análisis de colesterol de cada día. Los hígados de sacrificio fueron disecados, y una porción fue cortada en cubos de 5 mm y sumergida en 5 volúmenes de RNAIater helado. Una segunda porción fue congelada de inmediato en nitrógeno líquido, y fue almacenada para el crioseccionamiento . El ARN total fue extraído de muestras hepáticas como se describió anteriormente, y fue analizado para niveles de miR-122a por QPCR con micro-ARN específico. La figura 7 (los días de acrificio 9, 16 o 23 corresponden al sacrificio de 1 , 2 o 3 semanas después de la última dosis) demuestra una inhibición doble en los ratones que recibieron SPC3372 en comparación con los del control de solución salina, y esta inhibición todavía podía ser detectada el Día 16, mientras que para el día 23 los niveles mil22a se acercaron a los del grupo de solución salina .

Ejemplo 16: Duración de acción del oligonucleotido LNA in vivo . Estudio in vivo: Dos grupos de animales (21 ratones por grupo) son sometidos a tratamiento de la siguiente manera. Los animales del grupo 1 fue inyectados con 0.2ml de solución salina por i.v. durante 3 días sucesivos; el grupo 2 recibió 25mg/kg de SPC3372 de la misma manera. Todas las dosis fueron calculadas a partir de los pesos corporales de cada animal al Día 0. Después de la última dosis (Día 3) , 7 animales de cada grupo fueron sacrificados el Día 9, el Día 16 y el Día 23, respectivamente. Antes de esto, cada día, sangre de órbita retro era recolectada en tubos que contienen EDTA y la fracción plasmática recolectada y almacenada y congelada a -80°c para el análisis de colesterol de cada día. Los hígados de sacrificio fueron disecados, y una porción fue cortada en cubos de 5 mm y sumergida en 5 volúmenes de RNAIater helado. Una segunda porción fue congelada de inmediato en nitrógeno líquido, y fue almacenada para el crioseccionamiento. El ARN total fue extraído de muestras hepáticas como se describió anteriormente, y fue analizado para niveles de miR-122a por el QPCR con micro-ARN específico. La figura 8 demuestra un inhibición doble en los ratones que recibieron SPC3372 en comparación con los del control de solución salina, y esta inhibición todavía podría ser detectada el Día 16, mientrasque para el Día 23, los niveles de miR-122a se acercaron a los del grupo de solución salina.

En cuanto a los ejemplos 17 a 22, los procedimientos que siguen se aplican: A los ratones NMRI se les administró SPC3372de forma intravenosa usando dosis diarias que van desde 2.5 a 25 mg./kgs durante tres días consecutivos. Los animales fueron sacrificados 24 horas, 1, 2 o 3 semanas después de la última dosis. Los hígados fueron recolectados, cortados en piezas y sumergidos en RNAIater (Ambion) o congelados de inmediato. El ARN fue extraído con el reactivo Trizol según las instrucciones del fabricante (Invitrogen) del tejido RNAIater, salvo que el ARN precipitado fue lavado en 80% de etanol, y no en vortex. El ARN se usó para el qPCR TaqMan ARNm según el fabricante (Applied Biosystems) o Northern blot (ver más adelante). Las piezas congeladas de inmediato fueron crioseccionadas para hibridaciones in situ. Además, en cuanto a figuras 9-14, se designa LNA-antimiR a SPC3372 y SPC3373 (el control de malapareamiento ) es "el mm" designado en vez de usar el número SPC.

Ejemplo 17 : el dependiente de dosis miR-122a apunta la inducción de ARNm por la inhibición de SPC3372 DE miR-122a Los ratones son sometidos a tratamiento con diferentes dosis de SPC3372 durante tres días consecutivos, como se describió anteriormente, y son sacrificados 24 horas después de la última dosis. El ARN total extraído del hígado fue sometido a qPCR. Los genes con el sitio con especificidad de objetivo miR-122 predecido y observado para ser regulados completamente por el análisis de micromatriz fueron investigados para la inducción dependiente de la dosis al aumentar las dosis de SPC3372 usando qPCR. El ARN hepático total de 2 a 3 ratones sacrificados por grupo 24 horas después de la última dosis fue sometido a qPCR para los genes indicados. En la figura 9 se muestran los niveles de ARNm con relación al grupo de solución salina, n=2-3 (2.5-12.5mg/kg por día: n=2, ninguna desviación estándar). También se muestra el control de malapareamiento (mm, SPC3373). Genes estudiados: Nrdg3 Aldo A, Bckdk, CD320 con sitio con especificidad de objetivo miR-122 predecido. Aldo B y Gapdh no tienen un sitio con especificidad de objetivo miR-122a predecido. Una inducción clara dependiente de la dosis fue observada de los genes objetivo de miR-122a después del tratamiento con dosis diferentes de SPC3372.

Ejemplo 18: Inducción transitoria de ARNm con objetivo miR- 122a siguiendo el tratamiento con SPC3372 Los ratones hembra NMRI son tratados con 25mg/kg de SPC3372 al día junto con el control de solución salina durante tres días consecutivos, y son sacrificados 1, 2 o 3 semanas después de la última dosis, respectivamente. El ARN fue extraído de hígados y los niveles de ARNm de ARNm objetivo de miR-122a predecidos, seleccionados por datos de micromatriz fueron investigados por qPCR. Tres animales de cada grupo fueron analizados.

Genes estudiados: Nrdg3 Aldo A, Bckdk, CD320 con sitio con especificidad de objetivo miR-122 predecido. Gapdh no tiene un sitio con especificidad de objetivo miR-122a predecido. Se observó una inducción transitoria seguida de una restauración de niveles de expresión normales en la analogía con la restauración de niveles normales de miR-122a (la figura 10) . Los niveles de ARm son normalizados a los niveles de paciente GAPDH y al promedio del grupo tratado con solución salina a cada punto temporal individual. También se incluyen los valores de los animales sacrificados 24 horas después de la última dosis. Se muestra el promedio y la desviación estándar, n=3 (24 h n=3) .

Ejemplo 19: Inducción de VIdIr en hígado por tratamiento con SPC3372 Las mismas muestras de ARN hepáticas que en el ejemplo anterior fueron investigadas para inducción de VIdIr. Un aumento transitorio fue observada después del tratamiento con SPC3372, como con los otros ARNm con objetivo miR-122a predecidos (figura 11) Ejemplo 20: Estabilidad de dúplex de miR-122a/ SPC3372 en plasma de ratón La estabilidad del SPC3372 /miR-122a y SPC3372 dúplex fue analizada en el plasma de ratón a 37°C más de 96 horas. En la figura 12 se muestra una PAGE teñido con SYBR-Gold.

SPC3372 era completamente estable más de 96 horas. El SPC3372/miR-122a dúplex fue inmediatamente truncado (la degradación de la región de miR-122a de cadena simple no cubierta por SPC3372), pero a partir de entonces casi completamente estable más de 96 horas. El hecho de que un dúplex SPC3372/miR-122 preconformado mostrara estabilidad en el suero más de 96 horas conjuntamente con la estabilidad doble térmica elevada de la molécula SPC3372 apoyó nuestra noción acerca de que la inhibición de miR-122a por SPC3372 se debió a la formación estable dúplex entre las dos moléculas, que también ha sido reportada en el cultivo celular (Naguibneva et al. 2006).

Ejemplo 21: el proceso de remoción de miR-122a maduro por SPC3372 lleva a la formación dúplex El ARN hepático también fue sometido al Northern blot de microARN. En la figura 13 se muestra como una membrana sondada con una sonda especifica de miR-122a (panel superior) y explorada de nuevo con una sonda especifica de Let-7 (panel inferior) . Con la sonda de miR-122, dos bandas podrían ser detectadas; un correspondiente a miR-122 maduro , y la otra correspondiente a un dúplex entre SPC3372 y miR-122. Para confirmar el silenciamiento de miR-122, las muestras de ARN hepáticas fueron objetivas al pequeño ARN análisis de Northern blot, que mostró niveles considerablemente reducidos de miR-122 maduro detectable, de conformidad con nuestros resultados de RT-PCR de tiempo real. En la comparación, los niveles del control dejado-7a no fueron alterados. De manera interesante, observamos la acumulación dependiente de la dosis de un miR-122 cambiado / SPC3372 heteroduplex banda, sugiriendo que SPC3372 no apunte miR-122 para la degradación, pero más bien una al micro-ARN, asi sterically obstrucción de su función.

El análisis de Northern blot fue llevado a cabo de la siguiente manera: La preparación de membranas nothern se llevó a cabo como se describe en Sempere et al. 2002, excepto por los siguientes cambios: el ARN total, 10yg por cadena, en amortiguador que carga formamida (47.5% de formamida, 9 mm de EDTA, 0.0125% de Bromophenol Azul, 0.0125% Cianol xileno, 0.0125% SDS) fue cargado en 15% del gel de poliacrilamida Novex TBE-Urea desnaturalizador (Invitrogen) sin precalentar el ARN. El ARN fue transferido de manera electroforática a un GeneScreen con la Membrana de Transferencia de Hibridación adicional ( PerkinElmer ) a 200mA por 35 minuto. Las membranas fueron sondadas con oligonucleótidos categori zados como 32P, modificados con LNA complementarios con micro-RNAs*' maduros. Los oligonucleótidos LNA fueron definidos e hibridados a la membrana como se describe en Valóczi et al., 2004 excepto por los siguientes cambios: la prehibridación y las soluciones de hibridación contuvieron 50% de formamida, 0.5% SDS, 5x SSC, 5x de la solución de Denhardt y 20µg/ml del ADN espermático de arenque desnaturalizado y esquilado. Las hibridaciones se realizaron a 45°C. Las manchas fueron visualizadas al explorar en un escáner Storm 860. La señal de la membrana del fondo fue sustraída de las señales radioactivas que provienen de las bandas miARN . Los valores de las señales miR-122 fueron corregidos para diferencias de carga basadas en la señal let-7. Para determinar el tamaño de las señales radioactivas, el Decade arker System (Ambion) se usó siguiendo las recomendaciones de los proveedores.

Ejemplo 22 : el proceso de remoción de roiR- 22a por SPC3372 junto con la distribución de SPC3372 evaluado por la hibridación in situ de secciones hepáticas Las secciones crio-hepáticas de animales sometidos a tratamiento fueron sometidas a hibridaciones in situ para detección y localización de miR-122 Y SPC3372 (figura 14). Una sonda complementaria a miR-122 podría detectar miR-122a. Una segunda sonda era complementaria a SPC3372. L que se muestra en la figura 14 es un revestimiento, en verde está la distribución y cantidades evidentes de miR-122a y SPC3372, y en azul está la mancha nuclear DAPI, a lOx de aumento. Los aumentos de lOOx revelan la distribución intracelular de miR- 122a y SPC3372 dentro de las células hepáticas de ratón. Las secciones hepáticas de animales de control de solución salina mostraron un patrón de tinción miR-122 resistente sobre la sección hepática completa, mientras que las secciones de ratones sometidos a tratamiento con SPC3372 mostraron un patrón de tinción incompleto considerablemente reducido. En contraste, la molécula de SPC3372 fue fácilmente detectada en el hígado sometido a tratamiento con SPC3372, pero no en el hígado con control que no se trató con solución salina. El aumento más elevado localizó miR~122a al citoplasma en el hepatocytes, donde el el patrón miR-122 in situ fue claramente separada en espacios diferenciados, mientras la molécula SPC3372 fue distribuida regularmente en el citoplasma completo .

Ejemplo 23: Análisis de Micromatriz Llevamos a cabo la determinación del perfil de todo el genoma llevada de muestras totales de ARN a partir de ratones con solución salina sometidos tratados con hígados 122 antimiR de control de malapareamineto LNA 24 horas después de la última utilización de dosis Affymetrix Mouse Genome 430 de 2.0 matrices. El análisis de los datos de matriz reveló 455 transcripciones que fueron reguladas aceleradamente en los hígados de ratones sometidos a tratamiento con LNA-antimiR en comparación con solución salina y controles de malapareamiento de LNA; mientras 54 transcripciones eran lentificadas (Figura 15a). Un total de 415 de los regulados aceleradamente y 53 transcripciones lentificadas podría ser identificado en la base de datos Ensembl. Posteriormente, examinamos las 3' regiones no traducidas (UTRs) de los ARNm diferencialmente expresados para la presencia de la secuencia 6nt CACTCC, correspondiente al complemento inverso del nucleótido de 2-7 región simiente en miR-122 maduro. La cantidad de transcripciones que tienen al menos una secuencia de reconocimiento de miR-122 era 213 (51%) entre las transcripciones reguladas aceleradamente, y 10 (19%) dentro de las transcripciones lentificadas, mientras la frecuencia en una población de secuencia aleatoria era 25%; lo que implica que un fondo significativo de los ARNm regulados aceleradamente representa objetivos de miR-122 directos en el hígado (Figura 15b) . El tratamiento de antimiR LNA mostró la reducción máxima de niveles de miR-122 en 24 horas, reducción de 50% a una semana y emparejó controles de solución salina tres semanas después de la última dosis LNA (Ejemplo 12 "diseño anterior") . Esto coincidió con un número marcadamente reducido de genes diferencialmente expresados entre los dos grupos de ratones a los puntos temporales posteriores. En comparación con los 509 ARNm 24 horas después de la última dosis de LNA, identificamos 251 genes diferencialmente expresados después de una semana, pero sólo 18 genes después de tres semanas del tratamiento (Figura 15c y 15d) . En términos generales, los genes regularon aceleradamente 24 horas después de que el tratamiento de antimiR LNA luego volvió hacia niveles de control durante las siguientes dos semanas (Figura 15d) . Para concluir, una porción grande de genes crecientes /de-reprimidos después del tratamiento antimiR LNA es objetivo de miR-122; lo que indica un efecto muy específico para bloquear miR-122. También los genes crecientes/de-reprimidos se acercan a niveles normales 3 semanas después del fin del tratamiento sugieren un efecto terapéutico relativamente duradero, sin embargo no causan una modificación permanente; es decir, el efecto es reversible.

MÉTODOS : Determinación de la expresión génica de ratones tratados con LNA-antimiR. Los perfiles de expresión de hígados de solución salina y ratones sometidos a tratamiento con LNA-antimiR fueron comparados. Los ratones hembra NMRI son sometidos a tratamiento con 25mg/kg por día de LNA-antimiR junto con el control de solución salina durante tres días consecutivos, y son sacrificados 24 horas, 1, 2 o 3 semanas después de la última dosis. Además, los perfiles de expresión de los hígados de ratón sometidos a tratamiento con el oligonucleótido de control LNA de malapareamiento fueron obtenidos 24 horas después de la última dosis. Tres ratones de cada grupo fueron analizados, produciendo un total de 21 perfiles de expresión. La calidad del ARN y la concentración fueron cuantificadas usando un Bioanalizador Agilent 2100 y Nanodrop ND-1000, respectivamente. El ARN total fue procesado siguiendo las instrucciones del kit de síntesis de ADNc de Un ciclo de Reactivos de Amplificación 3' de la Expresión del GeneChip (Affymetrix Inc, Santa Clara, CA, EE. UU) para producir el ADNc de cadena doble. Esto se usó como patrón para generar cRNA caracterizado por biotin, siguiendo las especificaciones del fabricante. Quince microgramos de cRNA caracterizado por biotin fueron fragmentados a cadenas de entre 35 y 200 bases de longitud, de la cual 10 microgramos se hicieron híbridos en el Genoma de Ratón Affymetrix 430 de 2.0 matrices durante la noche en el horno de hibridación GeneChip 6400 que usa procedimientos convencionales. Las matrices fueron lavadas y teñidas en uns Estación GeneChip Fluidics 450. La exploración fue llevada a cabo con el Escánder GeneChip 3000 y el análisis de imagen fue llevado a cabo usando GeneChip Operating Software. La normalización y el análisis estadístico se llevaron a cabo usando el paquete de software LIMMA para environment27 programado en R. Las sondas reportadas como ausente por el software GCOS en todas las hibridaciones fueron removidas del conjunto de datos. Además, un filtro de intensidad fue aplicado al conjunto de datos para quitar sondas que mostraron intensidades de fondo corregido por debajo de 16. Los datos fueron normalizados usando normalization28 cuantil. La expresión diferencial fue evaluada usando un método de modelo lineal. Los valores P fueron ajustados para pruebas múltiples usando el Benjamini y Hochberg. Se consideró que las pruebas eran significativas si los valores p ajustados fueran p <0.05. La agrupación y la visualización de datos de matriz de Affymetrix se llevó a cabo usando el MultiExperiment Viewer software29.

Predicción de sitio con especificidad de objetivo Las transcripciones con 3' UTRs anotados fueron extraídas de la base de datos Ensembl (Publicación 41) usando la herramienta de búsqueda de datos de EnsMart, y revisadas para la presencia de la secuencia de CACTCC que es el complemento inverso de la semilla del nucleótido 2-7 en la secuencia de miR-122 maduro. Como un control de referencia, en un grupo de 1000 secuencias con una longitud de 1200nt, correspondiente al promedio de la longitud de 3' UTR de las transcripciones reguladas aceleradamente y lentificadas 24 horas después de la última dosis de LNA-antimiR, fueron buscadas las 6 correspondencias de semilla nucleot idicas de miR-122. Esto se llevó a cabo 500 veces y la cuenta promedio se usó para comparación.

Ejemplo 24. La inhibición dependiente de la dosis de miR-122 en el hígado de ratón por LNA-antimiR es potenciada en comparación con la inhibición de antagomir de miR-122 Los ratones hembra NMRI son sometidos a tratamiento con dosis indicadas de LNA-antimiR (SPC3372) junto con un control de malapareamiento (mm, SPC3373), solución salina y antagomir (SPC3595) durante tres días consecutivos y son sacrificados 24 horas después de la última dosis (como en el ejemplo 11 "diseño anterior", n=5) . Los niveles de miR-122 son analizados con qPCR y normalizados a los del grupo tratado con solución salina. Los genes con el sitio con especificidad de objetivo miR-122 predecido y regulado en la determinación del perfil de la expresión (AldoA, Nrdg3, Bckdk y CD320) mostraron la desrepresión dependiente de la dosis al aumentar la dosis de LNA-antimiR cuantificada por qPCR. La desrepresión era consecuentemente más elevada en todos los ARNm con objetivo miR-122 analizados (AldoA, Bckdk, CD320 y figuras 17, 18, 19, 20 de Nrdg3) en ratones sometidos a tratamiento con LNA-antimiR en comparación con ratones sometidos a tratamiento con antagomir. Esto también fue indicado al analizar la inhibición de miR-122 por qPCR especifico para miR-122 (Figura 16). Por lo tanto LNA-antimiRs presenta una inhibición funcional más potente de miR-122 que el antagomir de dosis correspondiente.

Ejemplo 25. La inhibición de miR-122 por LNA-antimiR en ratones hipercolesterolemicos junto con la reducción de colesterol y la desrepresión de ARNm con objetivo miR-122 A los ratones hembra C57BL/6J se les dio de comer una dieta alta en grasas durante 13 semanas antes de la iniciación del tratamiento con SPC3649. Esto dio como resultado el aumento de peso a 30-35g en comparación con el peso de ratones normales, que estaba un poco debajo de los 20g, según el peso que registraron al principio del tratamiento con LNA-antimiR. Los ratones con dieta alta en grasas presentaron un nivel total de colesterol plasmático considerablemente más alto de aproximadamente 130mg/dl, por lo que los ratones quedaron como hipercolesterolémicos en comparación con el nivel normal de aproximadamente 7 mg/dl. Tanto los ratones hipercolesterolémicos como normales son sometidos a tratamiento dos veces a la semana con 5 mg./kgs de SPC3649 y el SPC3744 de control correspondiente del malapareamiento durante un periodo de estudio de 5 semanas y media. Las muestras de sangre fueron recolectadas cada semana y el colesterol plasmático total fue cuantificado durante el curso completo del estudio. Sobre sacrificar a los ratones, el hígado y las muestras de sangre fueorn preparadas para que de ellas se extrayera totalmente el ARN, miARN y el cálculo de ARNm, la evaluación de los niveles de suero transaminase , e histología hepática.

El tratamiento de ratones hipercolesterolémicos con SPC3649 dio como resultado la reducción del colesterol plasmático total de aproximadamente 30% en comparación con ratones testigo tratados con solución salina después de 10 días, y se mantuvo a este nivel durante todo el estudio (Figura 21) . El efecto no fue el mismo que en el de los ratones con dieta normal. Sin embargo, el control de malapareamiento SPC3744 no afectó los niveles de colesterol plasmático ni en ratones hipercolesterolémicos ni en los normales. El cálculo de la inhibición de miR-122 y de la desrepresión del gen ARNm, con objetivo miR-122, (AldoA y Bckdk) después de que el tratamiento de larga duración con SPC3649 reveló un perfil comparable tanto en ratones hipercolesterolémicos como en ratones normales (Figuras 22, 23, 24), demostrando asi la potencia de SPC3649 en el antagonismo de miR-122 en ambos grupos de ratones. El ensayo qPCR de miR-122 indicó que también el control del malapareamiento SPC3744 tenia un efecto sobre niveles de miR-122 en los hígados de ratones sometidos a tratamiento, aunque en menor grado en comparación con SPC3649. Esto reducción podría estar asociada con el lazo del vástago qPCR. Consecuente con esta noción, El tratamiento de ratones con el control de malapareamiento SPC3744 no dio como resultado ninguna desrepresión funcional de los genes directos objetivo de miR-122 (Figuras 23 y 24), ni reducción del colesterol plasmático (Figura 21); lo que implica que el antagonismo intervenido con SPC3649 de miR-122 es muy especifico in vivo.

Las enzimas hepáticas en hígados de ratones hipercolesterolémicos y normales fueron evaluadas después del tratamiento SPC3649 de larga duración. Ningún cambio en los niveles de aminotransferase (ALT y AST) de alanina y aspartate fue detectado en ratones hipercolesterolémicos sometidos al tratamiento SPC3649, en comparación con ratones tratados con solución salina (Figuras 25 y 26) . Un nivel de ALT posiblemente elevado fue observado en los ratones normales después del tratamiento de larga duración con SPC3649 ( Figura 26) .

Ejemplo 26 Métodos para llevar a cabo el experimento y análisis de LNA antimiR / hipercolesterolémico : Ratones y medicación. Se usaron ratones hembra C57BL/6J (Animales de Laboratorio Taconic M&B, Ejby, Dinamarca) . Todas las sustancias fueron formuladas en solución salina fisiológica (0.9% de NaCI) a la concentración final que permite a los ratones recibir un volumen de inyección intraperitoneal de 10ml/kg. En el estudio de obesidad inducida por dieta, los ratones recibieron una dieta (D12492, Dietas de Investigación) alta en grasas (60EN%) durante 13 semanas para aumentar su nivel de colesterol en la sangre antes de que la medicación comenzara. El régimen de dosis fue ampliado a 5 semanas y media de 5mg/kg de LNA-antimiR™ dos veces cada semana. El plasma sanguíneo fue recolectado una vez por semana durante el período completo de medicación. Después de completar el experimento, los ratones fueron sacrificados y el ARN fue extraído de sus hígados para futuros análisis. El suero también fue recolectado para el análisis de enzimas hepáticas.

Extracción de ARN total. Los hígados disecados de ratones sacrificados fueron inmediatamente almacenados en el ARN más tarde (Ambion) . El ARN total fue extraído con el reactivo Trizol, según las instrucciones del fabricante ( Invitrogen) , salvo que la bolita precipitada de ARN fue lavada en 80% de etanol, más no en vortexed .

RT-PCR cuantitativo de Micro RNA específico. EL miR-122 y los niveles de micro-ARN let-7a fueron cuant ificados con el Ensayo de micro-ARN TaqMan (Applied Biosystems), según las instrucciones del fabricante. La reacción RT fue diluida diez veces en agua y posteriormente usada para la amplificación de PCR de tiempo real, según las instrucciones del fabricante. Una serie de dilución de ADNc doble del ARN hepático total de un animal sometido a tratamiento de solución salina o reacción de ADNc de células transíectadas de práctica (usando 2.5 veces más ARN total que en las muestras) sirvió como patrón para asegurar una gama (Ct contra la cantidad relativa de copias) de la- amplificación. El instrumento PCR 7500 o 7900 de tiempo real de Applied Biosystems se usó para la amplificación.

RT-PCR cuantitativo El cálculo ARNm de los genes seleccionados se llevó a cabo usando ensayos de TaqMan convencionales (Applied Biosystems) . La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo con decamers al azar, 0.5 g del ARN total, y enzima M MLV RT de Ambion según un protocolo convencional. El primer ADNc de hilo fue diluido posteriormente 10 veces en agua sin nucleasa antes de ser añadido a la mezcla de reacción de RT-PCR. Una serie de dilución de ADNc doble del ARN hepático total de un animal sometido a tratamiento de solución salina o reacción de ADNc de células transíectadas de práctica (usando 2.5 veces más ARN total que en las muestras) sirvió como patrón para asegurar una gama lineal (Ct contra la cantidad relativa de copias) de la amplificación. El instrumento PCR 7500 o 7900 de tiempo real de Applied Biosystems se usó para la amplificación.

Medidas metabólicas. Inmediatamente antes, la sangre de seno retro-orbital de sacrificio fue recolectada en tubos EDTA-recubiertos y después se hizo el aislamiento de la fracción plasmática. El colesterol plasmático total fue analizado usando ABX Pentra Colesterol CP (Horiba Group, Diagnósticos Horiba ABX) según las instrucciones del fabricante.

Medida de enzimas hepáticas (ALT y AST) El suero de cada ratón individual fue preparado de la siguiente manera: las muestras de sangre estuvieron almacenadas a temperatura ambiente durante 2 horas antes de la centrifugación (10 minutos, 3000 revoluciones por minuto a temperatura ambiente). Después de la centrifugación, el suero fue recolectado y congelado a 20 °C. La medida de AST y ALT se llevó a cabo en placas de 96 pocilios usando reactivos de AST y ALT de ABX Pentra, siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, las muestras de suero fueron diluidas 2.5 veces con H20 y cada muestra fue ensayada doz veces. Después de la adición de 50 µ? de muestra diluida o estándar (multical de ABX Pentra) a cada pocilio, se agregó 200µ1 a 37°C de la mezcla de reactivo ALT o AST fue a cada pocilio. Se llevaron a cabo medidas cinéticas durante 5 minutos con un intervalo de 30 segundos a 340nm y 37°C, usando un espectrofotómetro .

Ejemplo 27: Modulación de la duplicación de Hepatitis C por LNA-antimiR (SPC3649) Los oligos usados en este ejemplo (mayúscula: LNA, minúscula: ADN, los LNA Cs son metilo, y los LNA son preferentemente B-D-oxy (o subíndice después del residuo LNA) : SPC3649 (LNA-antimiR objetivo miR-122, está en la síntesis inicial a pequeña escala designada SPC3549) 5'-mCs°c5As0tstsGs0Ts0c mCs0asmCs0tsmCsomC0-3' SPC3648 (LNA-antimiR objetivo miR-122, está en la síntesis inicial a pequeña escala designada SPC3548) 5'-As°tstsGs0Ts0csasmCs0asmCsotsmCsomC°-3' SPC3550 (4 nt control disparejo para SPC3649) SEQ ID 63 r , _mp o„ » _ m om o m o mp _ » ompo_ o , 2'OMe anti-122: longitud total (23 nt ) oligo 2 ' OMe modificado complementario a miR-122 2'OMe Ctrl: control modificado 2'OMe confuso La duplicación de Hepatitis C (HCV) ha mostrado ser facilitada por miR-122, y, por consiguiente, se ha demostrado que el antagonismo de miR-122 afecta la duplicación de HCV en un modelo celular de hepatoma in vítro. Evaluamos la eficacia de SPC3649 que reduce la duplicación de HCV en el modelo celular con base Huh-7. Las diferentes moléculas de LNA-antimiR junto con un antisentido y un oligonucleótido de subida 2' de OMe son transíectadas en células Huh-7; HCV es capaz de duplicarse durante 48 horas. Las muestras totales de ARN extraídas de las células de Huh-7 se someten al análisis de Northern blot.

Ejemplo 28 Oligonucleótido antisentido de LNA-antimiR™ reforzado con objetivo miR-21 Secuencia de miR-21 madura de la miRBase del Instituto er : > hsa-miR-21 MIMAT0000076 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA (SEQ ID NO 4) > Mmu-miR-21 MI AT0000530 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA (SEQ ID NO 64) Secuencia de Compuestos: SPC3521 miR-21 5' - TCAgtctgataaGCTa-3 ' (diseño FAM gap-mer) - (SEQ ID NO 65) SPC3870 miR-21 5' - TCCgtcttagaaGATa-3 * (SEQ (mm) FAM ID NO 66) SPC3825 miR-21 5' - TcTgtCAgaTaCgAT-3 ' (nuevo FAM diseño) - ( SEQ ID NO 67) SPC3826 miR-¦21 5' - TcAgtCTgaTaAgCT-3 ' - (SEQ ID (mm) FAM NO 68) SPC3827 miR-•21 5' - TcAGtCTGaTaAgCT-3 ' - (nuevo FAM diseño reforzado) - (SEQ ID NO 69) Todos los compuestos tienen un un eje completamente o casi completamente tiolatado y tienen aquí también una etiqueta de FAM en el extremo 5'. El miR-21 ha sido muestran para ser regulado aceleradamente en amba glioblastoma (Chan et al. Cáncer Research 2005, 65 (14), p6029) y cáncer de mama (lorio et al. 2005 de Cáncer Research, 65 (16), p7065) y por lo tanto ha sido considerado un micro-ARN 'oncogénico' potencial. Chan. también muestran la inducción de la apoptosis en células de glioblastoma al fastidiar miR-21 con 210Me o LNA modificó oligonucleótidos antisentido. Por lo tanto, los agentes que fastidian miR-21 tienen el potencial para hacerse la terapéutica para el tratamiento de la glioblastoma y otros tumores sólidos, como el cáncer de mama. Presentamos el oligonucleótido modificado de LNA potenciado que apunta miR-21, un LNA-antimiR ™, con propiedades sorprendentemente buenas de inhibir miR-21 satisfecho con los objetivos terapéuticos arriba mencionados . Las rutas de administración terapéuticas adecuadas son, por ejemplo, inyecciones intracraneales en glioblastomas, inyecciones intratumuraesl en glioblastoma y cáncer de mama, asi como administración sistémica en el cáncer de mama.

Inhibición de miR-21 en la linea celular de glioblastoma U373 y linea celular de cáncer de mama MCF-7. La eficacia de LNA-anitmiR actual ™ es evaluada por transfeccion concentraciones a diferentes, junto con oligonucleótidos de control, en U373 y lineas celulares MCF-7 conocidas expresar miR-21 (u otros miR-21 expresión de lineas celulares también) . Transfeccion es llevada a cabo usando el protocolo de Lipofectamine2000 convencional (Invitrogen) . 24 horas fijan transfeccion, las células son recolectadas y el ARN total extrajo la utilización del protocolo Trizol (Invitrogen). La evaluación de niveles miR-21, según tratamiento y concentración usada se lleva a cabo por miR-21 especifico, lazo del vástago RT-PCR de tiempo real (Biosystems aplicado) , o alternativamente por análisis de Northern blot no radiactivos específicos miR-21. Los niveles miR-21 detectados en comparación con control de vehículo reflejan el potencial inhibitorio del LNA-antimiR ™.

Inhibición funcional de miR-21 por la evaluación del aumento del gen objetivo de miR-21. El efecto del antagonismo de miR-21 se investiga a travé de la clonación de la secuencia correspondiente perfecta con especificidad de objetivo miR-21 ante un sistem de indicador de luciferase Renilla estándar (entre la codificación de la secuencia y 31 UTR, psiCHECK-2, Promega) -ver el Ejemplo 29. La construcción del indicador y LNA-antimiR ™ serán co-transfectados en miR-21 que expresa líneas celulares (excepto U373, MCF-7) . Las células son cosechadas 24 horas después de la transfección en amortiguador de lisis pasivo, y la actividad de luciferase es cuantificada según un protocolo convencional (Promega, el Sistema Dual de Ensayo de Indicador de Luciferase) . La inducción de la actividad de luciferase se usa para demostrar el efecto funcional de LNA-antimiR ™ que es antagonista de miR-21.

Ejemplo 29: Estudio del indicador de Luciferasa para evaluar la inhibición funcional del micro-ARN por LNA-antimiRs y otros oligos de acción selectiva de micro-ARN: Generalización de un nuevo diseño potenciado como se prefiere para bloquear la función de micro-ARN Los oligos usados en este ejemplo (mayúscula: LNA, minúscula: el ADN) para evaluar LNA-antimiR que dereprime el efecto sobre el indicador de luciferase con la secuencia clonada del objetivo de ARN micro mediante el bloqueo del ARN micro respectivo: Objetivo: hsa-mIR-122a ?????00021 uggagugugacaaugguguuugu Presentado en la linea celular HUH-7 que expresa miR-122 Oligo #, microARN objetivo, oligosecuencia Diseño Complemento completo, 3962: miR-122 5'-ACAAacaccattgtcacacTCCA-3' intervalo Complemento completo, 3965: miR-122 5'-acaaacACCATTGTcacactcca-3' bloque 3972: miR-122 5 ' -acAaaCacCatTgtCacActCca-3 ' Complemento completo, LNA 3 3549 (3649) : miR- 5 ' -CcAttGTcaCaCtCC-3 ' Nuevo diseño 122 3975: miR-122 5 ' -CcAtTGTcaCACtCC-3 ' Nuevo diseño potenciado Objetivo: hsa-mi-R-lSb MIM¾TC)000074 injirjr-aaaTirygivjraaaanyy¾ Presentado en la línea celular HeLa que expresa miR-19b Oligo #, microARN objetivo, oligosecuencia Diseño Complemento completo, 3963: miR-19b 5'- TCAGttttgcatggatttgCACA-3 ' intervalo Complemento completo, 3967: miR-19b 5 ' -tcagttTTGCATGGatttgcaca-3 ' bloque 3973: miR-19b 5 ' -tcAgtTttGcaTggAttTgcAca-3 ' Complemento completo, LNA 3 3560: miR-19b 5'- TgCatGGatTtGcAC-3 ' Nuevo diseño 3976: miR-19b 5 ' -TgCaTGGatTTGcAC-3 ' Nuevo diseño potenciado Objetivo: hsa-miR-155 ??????00?66 Presentado en la linea celular 5187?2 que expresa miR-155 Oligo #, microARN objetivo, oligpsecsjencia Diseño Complemento completo, 3964: miR-155 5 ' -CCCCtatcacgattagcaTTAA-3 ' intervalo Complemento completo, 3968: miR-155 5 ' -cccctaTCACGATTagcattaa-3 ' bloque 3974: miR-155 5 ' -cCccTatCacGatTagCatTaa-3 ' Complemento completo, LNA 3 3758: miR-155 5 ' -TcAcgATtaGcAtTA-3 ' Nuevo diseño 3818: miR-155 5' -TcAcGATtaGCAtTA-3' Nuevo diseño potenciado SEQ ID NO como antes. Un indicador plásmido (psiCheck-2 Promega) que codifica tanto las variantes luciferase de Renilla como las de Luciérnaga fue tramado de modo que el 3 ' UTR de luciferase Renilla incluyera una sola copia de una secuencia completamente complementaria para miARN que está en investigación . Las células que expresan endógenamente los miARN investigados (HuH-7 para miR-122a, HeLa para miR-19b, 518A2 para miR-155) estaban co-trans fectadas con LNA-antimiRs u otros oligonucleótidos miR ligadores (la longitud complementaria es decir longitud completa) y el indicador plásmido de objetivo micro-ARN correspondiente con Liopfectamina ( Invitrogen ) . La transfección y la medida de actividad de luciferase se llevaron a cabo según las instrucciones del fabricante (Invitorgen Lipofectamine 2000/Promega Dual-luciferase kit) , usando de 150000 a 300000 células por pocilio en placasde 6 pocilios. Para compensar las densidades variables de las células y la eficiencia de la transfección, se normalizó la señal de luciferasa Renilla con la señal Luciérnaga de luciferase. Todos los experimentos se llevaron a cabo tres veces. Sorprendentemente, el nuevo diseño y el nuevo diseño potenciado eran los mejores inhibidores funcionales para tres objetivos de micro-ARN, miR-155, miR-19b y miR-122 (figuras 27, 28, 29) . Los resultados están resumidos a continuación en la tabla 3. Resumen del resultado: Tabla 3. Función del grado de la desrepresión de miR-155 endógeno, miR-19b y miR-122a por diversos diseños de la de antimiR LNA.

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Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido monocatenario, o un conjugado de lo mismo, teniendo una longitud de 8 a 26 unidades de nucleobase, y un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque el oligonucleótido comprende una secuencia de ADN nuclear de posiciones dos a siete o de posiciones tres a ocho, contando del extremo 3' de 3' acgttt 5' (SEQ ID NO 6) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos o tres, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidos por su unidad LNA correspondiente. 2. Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido monocatenario, o un conjugado de lo mismo, teniendo una longitud de 8 a 26 unidades de nucleobase, y un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque el oligonucleótido comprende una secuencia de ADN nuclear de posiciones dos a siete o de posiciones tres a ocho, contando del extremo 3' de 3' ctcaca 5' (SEQ ID NO 7) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos o tres, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 3. Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido monocatenario, o un conjugado de lo mismo, teniendo una longitud de 8 a 26 unidades de nucleobase, y un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque el oligonucleótido comprende una secuencia de ADN nuclear de posiciones dos a siete o de posiciones tres a ocho, contando del extremo 3' de 3' ttacga 5' (SEQ ID NO 8) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos o tres, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 4. Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido monocatenario, o un conjugado de lo mismo, teniendo una longitud de 8 a 26 unidades de nucleobase, y un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque el oligonucleótido comprende una secuencia de ADN nuclear de posiciones dos a siete o de posiciones tres a ocho, contando del extremo 3' de 3' acaagc 5' (SEQ ID NO 9) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos o tres, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente. 5. Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido monocatenario, o un conjugado de lo mismo, teniendo una longitud de 8 a 26 unidades de nucleobase, y un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque el oligonucleót ido comprende una secuencia de ADN nuclear de posiciones dos a siete o de posiciones tres a ocho, contando del extremo 3' de 3' cgaata 5' (SEQ ID NO 10) donde al menos 1, tal como 1, preferentemente al menos dos, tal como dos o tres, unidades de ADN en la secuencia han sido substituidos por su unidad LNA correspondiente y donde el oligonucleót ido no comprende una región de más de 7 unidades de ADN contiguas. 6. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque la secuencia de nucleobase del oligonucleótido es complementaria a una secuencia nucleótida en una secuencia de micro-ARN de humano seleccionada del grupo que comprende (miR 19b) UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA (SEQ ID 1) (miR 122a) UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU (SEQ ID 2) (miR 155) UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG (SEQ ID 3) (miR 375) UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA (SEQ ID 4) (miR 21) UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA (SEQ ID 5) 7. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque el oligonucleótido tiene una longitud de entre 10-17 nucleobases. 8. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque el oligonucleótido tiene una longitud de entre 10-16 nucleobases . 9. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque el oligonucleótido tiene una longitud de entre 12-26 nucleobases . 10. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque al menos dos unidades de ADN de posiciones uno a seis, dos a siete, o tres a ocho, del oligonucleótido, contando del extremo 3', han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente y donde las unidades LNA son separadas por al menos una unidad de ADN. 11. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque al menos tres unidades de ADN de posiciones uno a seis, dos a siete, o tres a ocho, del oligonucleótido, contando del extremo 3', han sido substituidas por su unidad LNA correspondiente y donde las unidades LNA son separadas por al menos una unidad de ADN. 12. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizada porque la cantidad de unidades de ADN consecutivas de posiciones uno a seis, dos a siete, o tres a ocho, del oligonucleótido, contando del extremo 3', es como máximo dos. 13. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque cada segundo nucleótido de posiciones uno a seis, dos a siete, o tres a ocho del oligonucleótido, contando del extremo 3', es una unidad LNA. 14. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 12 nucleótido, caracterizada porque cada tercer oligonucleótido de posiciones uno a seis, dos a siete, o tres a ocho, contando del extremo 3', es una unidad LNA. 15. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizada porque el número total de unidades LNA de posiciones uno a seis, dos a siete, o tres a ocho, del oligonucleótido, contando del extremo 3' está entre 2 y 6 unidades LNA. 16. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizada porque la primera nucleobase del oligonucleótido, contando del extremo 3', es un análogo nucleótido, como una unidad LNA. 17. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizada porque la segunda nucleobase del oligonucleótido, contando del extremo 3' , es un análogo nucleótido, como una unidad LNA. 18. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizada porque el patrón de substitución para las nucleobases en posiciones uno a seis, dos a siete o tres a ocho, del oligonucleótido , contando del extremo 3' , es seleccionado del grupo que comprende xxXxxX, xxXxXx, xXxxXx, xXxXxx, XxxXxx, xXxXxX, XxXxXx, XxxXxX, y XxXxxX; xxXxxX, xXxxXx, XxxXxx, xXxXxX, y XxXxXx; donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA y "x" denota una unidad de ADN. 19. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizada porque el patrón de substitución para las nucleobases en posiciones uno a siete, dos a ocho o tres a nueve, del oligonucleótido, contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xxXxxXx, xxXxXxx, xXxxXxx, xxXxXxX, xXxxXxX, xXxXxxX, xXxXxXx, XxxXxxX, XxxXxXx, XxXxxXx, XxXxXxx, XxXxXxX, xxXxxXx, xXxxXxx, XxxXxxX, xXxXxXx, XxXxXxX, y XxXxXxx; donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA y "x" denota una unidad de ADN. 20. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque el patrón de substitución para las nucleobases en posiciones uno a ocho, dos a nueve o tres a diez, del oligonucleót ido , contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xxXxxXxx, xxXxxXxX, xxXxXxxX, xxXxXxXx, xXxxXxxX, xXxxXxXx, xXxXxxXx, xXxXxXxx, XxxXxxXx, XxxXxXxx, XxXxxXxx, xXxXxXxX, XxXxXxxX, XxXxxXxX, XxxXxXxX, XxXxXxXx; xxXxxXxx, xXxxXxxX, XxxXxxXx, xXxXxXxX, XXXXXXXX, y XxXxXxxX; donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA y "x" denota una unidad de AD . 21. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizada porque el patrón de substitución para las nucleobases en posiciones uno a nueve, dos a diez o tres a once, del o 1 i gonuc 1 eó t i do , contando del extremo 3', es seleccionado del grupo que comprende xxXxxXxxX, xxXxxXxXx, xxXxXxxXx, xxXxXxXxx, xXxxXxxXx, xXxxXxXxx, xXxXxxXxx, XxxXxxXxx, xxXxXxXxX, xXxxXxXxX, xXxXxxXxX, xXxXxXxxX, XxxXxxXxX, XxxXxXxxX, XxXxxXxxX, XxxXxXxXx, XxXxxXxXx, XxXxXxxXx, XxXxXxXxx, y XXXXXXXXX; donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA y "x" denota una unidad de ADN. 22. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizada porque el o 1 i g onuc 1 eó t i do comprende una región de la secuencia de nucleobase contigua que es 100 % complementaria a la región simiente de micro-ARN de humano . 23. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las rei indicaciones 1-22, caracterizada porque el noveno y/o el décimo nucleótido del oligonucleótido, contando del extremo 3' , es un análogo nucleótido, como una unidad LNA. 24. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, caracterizada porque el oligonucleótido no comprende una región de más de 5 unidades de nucleótido de ADN consecutivas. 25. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, caracterizada porque el oligonucleótido comprende al menos una región que comprende al menos dos unidades consecutivas de análogo nucleótido, como al menos dos unidades LNA consecutivas. 26. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizada porque el oligonucleótido no comprende una región de más de 7 unidades consecutivas de análogo nucleótido, como unidades LNA . 27. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el oligonucleótido no comprende una región de más de 3 unidades consecutivas de análogo nucleótido, como unidades LNA. 28. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1-27, caracterizada porque la secuencia de nucleobase del oligonucleótido que es complementario a la secuencia de la región simiente de micro-ARN, es seleccionada del grupo que comprende (X)Xxxxxx, (X)xXxxxx, (X)xxXxxx, (X)xxxXxx, (X)xxxxXx y (X)xxxxxX, como se lee en una dirección 3' -5', donde "X" denota que un análogo nucleótido, (X) denota un análogo nucleótido opcional, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN, 29. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, caracterizada porque el oligonucleótido comprende al menos dos unidades de análogo nucleótido, como al menos dos unidades LNA, en posiciones que son complementarias a la región simiente de miARN . 30. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la secuencia de nucleobase del oligonucleótido que es complementario a la secuencia de la región simiente de micro-ARN, es seleccionada del grupo que comprende (X)XXxxxx, (X)XxXxxx, (X)XxxXxx, (X)XxxxXx, (X)XxxxxX, (X)xXXxxx, (X)xXxXxx, (X)xXxxXx, (X)xXxxxX, (X)xxXXxx, (X)xxXxXx, (X)xxXxxX, (X)xxxXXx, (X)xxxXxX y (X)xxxxXX, en donde "X" denota que un análogo nucleótido, como una unidad LNA, (X) denota un análogo nucleótido opcional, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. 31. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 1-28, caracterizada porque el oligonucleótido comprende al menos tres unidades de análogo nucleótido, como al menos tres unidades LNA, en posiciones que son complementarias a la región simiente de miARN . 32. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la secuencia de nucleobase del oligonucleótido que es complementario a la secuencia de la región simiente de micro-ARN, es seleccionada del grupo que comprende (X)XXXxxx, (X)xXXXxx, (X)xxXXXx, (X)xxxXXX, (X)XXxXxx, (X)XXxxXx, (X)XXxxxX, (X)xXXxXx, (X)xXXxxX, (X)xxXXxX, (X)XxXXxx, (X)XxxXXx, (X)XxxxXX, (X)xXxXXx, (X)xXxxXX, (X)xxXxXX, (X)xXxXxX y (X)XxXxXx, donde "X" denota que un análogo nucleótido, como una unidad LNA, (X) denota un análogo nucleótido opcional, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN . 33. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 1-28, caracterizada porque el oligonucleótido monocatenario comprende al menos cuatro unidades de análogo nucleótido, como al menos cuatro unidades LNA, en posiciones que son complementarias a la región simiente de miARN. 34. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la secuencia de nucleobase del oligonucleótido que es complementario a la secuencia de la región simiente de micro-ARN, es seleccionada del grupo que comprende (X)xxXXX, (X)xXxXXX, (X)xXXxXX, (X)xXXXxX, (X)xXXXXx, (X)XxxXXXX, (X)XxXxXX, (X)XxXXxX, (X)XxXXx, (X)XXxxXX, (X)XXxXxX, (X)XXxXXx, (X)XXXxxX, (X)XXXxXx, y (X)XXXXxx, donde "X" denota que un análogo nucleótido, como una unidad LNA, (X) denota un análogo nucleótido opcional, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o AR . 35. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 1-28, caracterizada porque el oligonucleótido comprende al menos cinco unidades de análogo nucleótido, como al menos cinco unidades LNA, en posiciones que son complementarias a la región simiente de miARN . 36. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la secuencia de nucleobase del oligonucleótido que es complementario a la secuencia de la región simiente de micro-ARN, es seleccionada del grupo que comprende (X)xXXXXX, (X)XxXXXX, (X)XXxXXX, (X)XXXxXX, (X)XXXXxX y (X)XXXXXx, donde "X" denota que un análogo nucleótido, como una unidad LNA, (X) denota un análogo nucleótido opcional, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. 37. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 1-28, caracterizada porque el oligonucleótido comprende seis o siete unidades de análogo nucleótido, como seis o siete unidades LNA, en posiciones que son complementarias a la región simiente de miAR . 38. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la secuencia de nucleobase del oligonucleótido que es complementario a la secuencia de la región simiente de micro-ARN, es seleccionada del grupo que comprende XXXXXX, XxXXXXX, XXxXXXX, XXXxXXX, XXXXxXX, XXXXXxX y XXXXXXx, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o AR . 39. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-38, caracterizada porque los dos motivos de nucleobase en la posición 7 a 8, contando del extremo 3' del oligonucleótido monocatenario, se seleccionan del grupo que comprende xx, XX, xX y Xx, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. 40. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39, caracterizada porque el oligonucleótido comprende al menos 12 nucleobases y donde los dos motivos de nucleobase en la posición 11 a 12, contando del extremo 3' del oligonucleótido monocatenario, son seleccionados del grupo que comprende xx, XX, xX y Xx, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN . 41. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-40, caracterizada porque el oligonucleótido comprende al menos 13 nucleobases y donde los tres motivos de nucleobase en la posición 11 a 13, contando del extremo 3' , son seleccionados del grupo que comprende xxx, Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX y XXX, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN . 42. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-41, caracterizada porque el oligonucleótido comprende al menos 14 nucleobases y donde los cuatro motivos de nucleobase en las posiciones 11 a 14, contando del extremo 3' , son seleccionadas del grupo que comprende xxxx, Xxxx, xXxx, xxXx, xxxX, XXxx, XxXx, XxxX, xXXx, xXxX, xxXX, XXXx, XxXX, xXXX, XXxX y XXXX donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. 43. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-42, caracterizada porque el oligonucleótido comprende 15 nucleobases y los cinco motivos de nucleobase en la posición 11 a 15, contando del extremo 3' , son seleccionados del grupo que comprende Xxxxx, xXxxx, xxXxx, xxxXx, xxxxX, XXxxx, XxXxx, XxxXx, XxxxX, xXXxx, xXxXx, xXxxX, xxXXx, xxXxX, xxxXX, XXXxx, XXxxX, XxxXX, xXXXx, xxXXX, XXxXX, XxXxX, XXXXx, XXXxX, XXxXX, XxXXXX, xXXXX, y XXXXX donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN . 44. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-43, caracterizada porque el oligonucleotido comprende 16 nucleobases y los seis motivos de nucleobase en las posiciones 11 a 16, contando del extremo 3' , son seleccionadas del grupo que comprende Xxxxxx, xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx, xxxxXx, xxxxxX, XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX , xxXXxx, xxXxXx, xxXxxX, xxxXXx, xxxXxX, xxxxXX, XXXxxx, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, XxXXxx, XxXxXx, XxXxxX, XxxXXx, XxxXxX, XxxxXX, xXXXxx, xXXxXx, xXXxxX, xXxXXx, XXxXxX, xXxxXX, xxXXXx, xxXXxX, xxXxXX, xxxXXX, XXXXxx, XXXxxX, XXxxXX, XxxXXX, xxXXXX, xXxXXX, XxXxXX, XXxXxX, XXXxXx, xXXxXX, XxXXxX, XXxXXx, xXXXxX, XxXXXx, xXXXXx, xXXXXX, XxXXXX, XXxXXX, XXXxXX, XXXXxX, XXXXXx, y XXXXXX donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN . 45. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque el oligonucleotido comprende entre 17 y 26 nucleobases, donde las nucleobases 17-26, contando del extremo 3', son cada una indistintamente seleccionadas del grupo que comprende X y x, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o AR . 46. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-45, caracterizada porque los motivos de nucleobase para las tres nucleobases más hacia 5' del oligonucleótido, son seleccionadas del grupo que comprende Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX y XXX, donde "X" denota un análogo nucleótido, como una unidad LNA, como una unidad LNA, y "x" denota una unidad de nucleótido de ADN o ARN. 47. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-46, caracterizada porque "x" denota una unidad de ADN. 48. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-47, caracterizada porque el oligonucleótido monocatenario comprende una unidad de análogo nucleótido, como una unidad LNA, al extremo 5' . 49. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-48, caracterizada porque las unidades de análogo nucleótido, tal como X, son indistintamente seleccionadas del grupo que comprende: unidad de 2 ' -O-alquil-ARN, unidad de 2'-OMe-ARN, unidad de 2 ' -amino- ADN, unidad de 2 ' -fluoro-ADN , unidad LNA, unidad de PNA, unidad de HNA, unidad de INA. 50. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque todas las nucleobases son unidades de análogo nucleótido. 51. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 49 o 50, caracterizada porque las unidades de análogo nucleótido, tal como X, son indistintamente seleccionadas del grupo que comprende: unidades 2 ' -OMe-RiMA, unidades de 2 ' -fluoro-ADN , y unidades LNA, 52. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49-51, caracterizada porque el oligonucleótido comprende al menos una unidad análoga LNA y al menos una unidad de análogo nucleótido adicional LNA distinto. 53. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la unidad o las unidades de análogo nucleótido no LNA son indistintamente seleccionadas de unidades de 2'-OMe ARN y unidades de 2'-fluoro ADN. 54. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el oligonucleótido monocatenario comprende al menos una secuencia XYX o YXY, donde X es LNA e Y es cualquiera de una unidad de 2 ' -OMe ARN y una unidad de 2 '-fluoro ADN. 55. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque la secuencia de nucleobases del oligonucleótido monocatenario comprende unidades alternativas X e Y. 56. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-49, caracterizada porque el oligonucleótido monocatenario comprende la unidades alternantes de LNA y ADN (Xx) o (xX) . 57. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-49, caracterizada porque el oligonucleótido monocatenario comprende un motivo de LNA alternante seguido de 2 unidades de ADN (Xxx) , xXx o xxX. 58. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-57, caracterizada porque al menos una de las unidades de ADN o del análogo nucleótido no LNA es sustituida por una nucleobase LNA en una posición seleccionada de las posiciones identificadas como unidades de nucleobase de LIMA de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 59. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-58, caracterizada porque "X" dona una unidad LNA. 60. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-59, caracterizada porque el oligonucleótido monocatenario comprende al menos 5 unidades LNA. 61. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque el oligonucleótido monocatenario comprende al menos 7 unidades de LIMA. 62. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-61, caracterizada porque al menos una de las nucleobases LNA es citosina o guanina. 63. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 62, caracterizada porque al menos tres de las nucleobases LNA son indistintamente seleccionadas de citosina o guanina . 6 . La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-63, caracterizada porque los análogos nucléotidos tienen una estabilidad dúplex térmica más elevada de nucleótido de ARN complementario que la estabilidad dúplex térmica de un nucleótido de ADN equivalente al nucleótido de ARN complementario . 65. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-64, caracterizada porque los análogos nucléotidos confieren la estabilidad de suero potenciada al oligonucleótido . 66. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-65, caracterizada porque el oligonucleótido no interviene en la escisión basada en ARNasaH de una molécula de ARN monocatenaria complementaria . 67. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-66, caracterizada porque el oligonucleót ido es capaz de formar un dúplex con una molécula de ácido nucleico de ARN monocatenario complementario con enlaces internucleosidicos de fosfodiéster , donde el dúplex tiene un Tm de al menos aproximadamente 60°C. 68. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque el ol igonucleót ido es capaz de formar un dúplex con una molécula de ácido nucleico de ARN monocatenario complementario con enlaces internucleosidicos de fos fodiéster , donde el dúplex tiene un Tm de entre aproximadamente 70°C hasta aproximadamente 95°C 69. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque el oligonucleót ido es capaz de formar un dúplex con una molécula de ácido nucleico de ARN monocatenario complementario con enlaces internucleosidicos de fos fodiéster , donde el dúplex tiene un Tm de entre aproximadamente 70°C hasta aproximadamente 90°C, tal como entre aproximadamente 70°C y 85°C. 70. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-69, caracterizada porque el oligonucleótido es capaz de formar un dúplex con una molécula de ácido nucleico de ADN monocatenario complementario con enlaces de internucleosidicos de fosfodiéster , donde el dúplex tiene un Tm de entre aproximadamente 50 °C hasta aproximadamente 90°C 71. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-70, caracterizada porque el oligonucleótido monocatenario tiene una longitud de 10 a 16, como una longitud de 10, 11, 12, 13,14, 15 o 16 nucleobases . 72. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 71, caracterizada porque el oligonucleótido monocatenario tiene una longitud de 15 o 16 nucleobases. 73. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-72, caracterizada porque la unidad LNA o las unidades son indistintamente seleccionadas del grupo que comprende oxi-LNA, tiol-LNA, y amino-LNA, en las configuraciones de L-a Y D-ß o en combinaciones de lo mismo. 74. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada porque la unidad LNA o las unidades son beta D oxi-LNA. 75. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada porque las unidades LNA están en alfa-L amino LNA. 76. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-75, caracterizada porque el oligonucleótido monocatenario comprende entre 3 y 17 unidades LNA. 77. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-76, caracterizada porque el oligonucleótido comprende al menos un grupo de unión de internucleósido que se diferencia del fosfato. 78. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 77, caracterizada porque el oligonucleótido comprende al menos un enlace de internucleósido de fosforotioato . 79. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 78, caracterizada porque el oligonucleótido comprende enlaces de fosforotioato y fosfodiéster . 80. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 77, caracterizada porque todos los enlaces de internucleósido son enlaces de fosforotioato . 81. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-79, caracterizada porque el oligonucleótido comprende al menos un enlace de internucleósido de fosfodiéster . 82. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque todos los enlaces de internucleósido son enlaces de fosfodiéster . 83. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-82, caracterizada porque el portador es solución salina o solución salina amortiguada. 84. Un oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-75, caracterizado porque el oligonucleótido monocatenario comprende al menos un enlace de fosforotioato y/o donde al menos la primera nucleobase 5' y/o última nucleobase '3 son una nucleobase LNA. 85. Un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleobase seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 82, SEQ ID NO 83, SEQ ID NO 84, SEQ ID NO 85, SEQ ID NO 86, SEQ ID NO 87, SEQ ID NO 88, y SEQ ID NO 89; caracterizado porque una minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA; y donde las citosinas LNA están opcionalmente metiladas, o un conjugado de lo mismo. 86. Un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleobase seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 90, SEQ ID NO 91, SEQ ID NO 92, SEQ ID NO 93, SEQ ID NO 94, SEQ ID NO 95, SEQ ID NO 96, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 98, SEQ ID NO 99, SEQ ID NO 100, y SEQ ID NO 101; caracterizado porque una minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA; y donde las citosinas LNA son opcionalmente metiladas, o un conjugado de lo mismo. 87. Un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleobase seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 102, SEQ ID NO 103, SEQ ID NO 104, y SEQ ID NO 105; caracterizado porque una minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA; y donde las citosinas LNA son opcionalmente metiladas, o un conjugado de lo mismo. 88. Un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleobase seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO 106, SEQ ID NO 107, SEQ ID NO 108 y SEQ ID NO 109; caracterizado porque una minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA, y donde las citosinas LNA son opcionalmente metiladas, o un conjugado de lo mismo. 89. Un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleobase seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO 65, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO 67, SEQ ID NO 68, y SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45, y SEQ ID NO 46, caracterizado porque una minúscula identifica la base nitrogenada de una unidad de ADN y una mayúscula identifica la base nitrogenada de una unidad LNA, y donde las citosinas LNA son opcionalmente metiladas, o un conjugado de lo mismo. 90. El oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84-89, caracterizado porque los enlaces de internucleobase son de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 77-82. 91. El oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84-90, caracterizado porque las secuencias de nucleobase de oligonucleótido comprenden la secuencia de nucleobase. 92. Un conjugado que comprende el oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84-91, caracterizado porque y al menos una entidad de no nucleobase covalentemente unida al mismo. 93. El conjugado de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque la entidad de no nucleobase comprende esterol, como el colesterol. 94. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el oligonucleótido o conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84-93, y un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable. 95. El uso de un oligonucleótido monocat enario o conjugado de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 1-93 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento contra una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpres ión del micro-ARN, como una enfermedad seleccionada del grupo que comprende mayores niveles de colesterol plasmático, a t e ros c 1 e ro s i s , hipercolesterolemia o hipe r 1 ip idemi a , Hepatitis C, cáncer y un trastorno metabólico, como diabetes. 96. Un método para el tratamiento contra una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o la sobreexpresión del micro-ARN, caracterizado porque comprende la etapa de administrar una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-93 a una persona en la necesidad del tratamiento, como una persona que sufre una enfermedad seleccionada del grupo que comprende mayores niveles de colesterol plasmático, aterosclerosis , hipercolesterolemia o hiperlipidemia , Hepatitis C, cáncer y un trastorno metabólico, como la diabetes . 97. Un método para reducir la cantidad efectiva de un objetivo miARN en una célula o un organismo, caracterizado porque comprende la administración de una composición o un oligonucleót ido monocat enar io de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-93 a la célula u organismo. 98. El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque la reducción de la cantidad efectiva del objetivo miARN ocurre vía el antagonismo in vivo. 99. Un método para la desrepresión de un ARNm con especificidad de objetivo ae un miARN en una célula o un organismo, caracterizado porque comprende la administración de una composición o un oligonucleótido monocatenario de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-93 a la célula u organismo. 100. Un método para la síntesis de un oligonucleótido monocatenario de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-93, caracterizado porque comprende las etapas de: a. Seleccionar una primera nucleobase, contando del extremo 3' , que es una nucleobase LNA. b. Opcionalmente seleccionar una segunda nucleobase, al contar del extremo 3' , que es una nucleobase LNA. c. Seleccionar una región del oligonucleótido monocatenario que corresponde a cualquiera de las regiones identificadas en las reivindicaciones 1-5 o la región simiente de miARN. d. Opcionalmente seleccionar dos nucleobases adicionales que son como en la reivindicación y una séptima y octava nucleobase como de conformidad con la reivindicación 39. e. Opcionalmente seleccionar una región 5' del oligonucleótido monocatenario de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-45. f. Opcionalmente seleccionar entre 1 y 10 nucleobases adicionales que pueden ser seleccionadas del grupo que comprende nucleótidos y análogos nucléotidos, como el LNA. g. Opcionalmente seleccionar una terminal 5' del oligonucleótido monocatenario de conformidad con la reivindicación 46. donde la síntesis es llevada a cabo por la síntesis secuencial de las regiones definidas en etapas a-f, donde la síntesis puede ser llevada a cabo en cualquier dirección de 3'-5' (a al f) o 5'-3' (f al a), y donde el oligonucleótido monocatenario es complementario a una secuencia encontrada dentro de una secuencia seleccionada del grupo que comprende: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 5. 101. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque la síntesis es llevada a cabo en la dirección a-f 3' a 5'. 102. El uso de un oligonucleótido de entre 8-16 nucleobases de longitud, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento contra una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión del micro-ARN, donde el oligonucleótido es complementario a una secuencia correspondiente que está presente en una secuencia seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, y SEQ ID NO 5. 103. El uso de conformidad con la reivindicación 102, donde la enfermedad es seleccionada del grupo que comprende mayores niveles de colesterol plasmáticos, aterosclerosis , hipercolesterolemia o hiperlipidemia , Hepatitis C, cáncer y un trastorno metabólico, como la diabetes. 104. Un método para el tratamiento contra una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o la sobreexpresión del micro-ARN, caracterizado porque la etapa de administrar un oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-100 o un conjugado de lo mismo, a una persona en necesidad del tratamiento. 105. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la persona sufre una enfermedad seleccionada del grupo que comprende mayores niveles de colesterol plasmático, aterosclerosis, hipercolesterolemia o hiperlipidemia, Hepatitis C, cáncer y un trastorno metabólico, como la diabetes. 106. Uso de un oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-93 o un conjugado de lo mismo, para regular aceleradamente los niveles de ARNm de Nrdg3, Aldo A, Bckdk o CD320. 107. Un método para reducir la cantidad efectiva de un objetivo miARN en una célula o un organismo, caracterizado porque comprende la administración de una composición o un oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-93 o un conjugado de lo mismo a la célula u organismo . 108. Un método para la desrepresión de un ARNm con especificidad de objetivo de miARN en una célula o un organismo, caracterizado porque comprende la administración de una composición o un oligonucleótido de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 1-93 o un conjugado de lo mismo a la célula u organismo. 109. El tratamiento contra una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o la sobreexpresión del micro-ARN, caracterizado porque comprende la etapa de administrar una composición (como la composición farmacéutica) que comprende un oligonucleótido monocatenario de entre 8-16 nucleobases de longitud, a una persona en necesidad del tratamiento, en donde el oligonucleótido es complementario a una secuencia correspondiente que está presente en una secuencia seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, y SEQ ID NO 5. 110. Un método para reducir la cantidad efectiva de un objetivo miARN en una célula o un organismo, que comprende la administración de una composición (como la composición farmacéutica) que comprende un oligonucleótido monocatenario de entre 8-16 nucleobases, a la célula u organismo, caracterizado porque el oligonucleótido es complementario a una secuencia correspondiente que está presente en una secuencia seleccionada del grupo que comprende SEQ ID IMO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 5. 111. Un método para la desrepresión de un ARNm con especificidad de objetivo de un miARN en una célula o un organismo, que comprende un oligonucleótido monocatenario de entre 8-16 nucleobases (u o una composición que comprende el oligonucleótido) a la célula o el organismo, caracterizado porque el oligonucleótido es complementario a una secuencia correspondiente que está presente en una secuencia seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, y SEQ ID NO 5. 112. Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido monocatenario de una longitud de entre 8 y 16 unidades de nucleobase, un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque al menos una de las unidades de nucleobase del oligonucleótido monocatenario es un análogo nucleótido, y donde el oligonucleótido monocatenario es complementario a una secuencia de micro-ARN de humano, donde el oligonucleótido es complementario a una secuencia correspondiente que está presente en una secuencia seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, y SEQ ID NO 5. 113. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque es para el tratamiento contra una enfermedad seleccionada del grupo que comprende mayores niveles de colesterol plasmático, aterosclerosis, hipercolesterolemia o hiperlipidemia, Hepatitis C, cáncer y un trastorno metabólico como la diabetes .