CN108220381A - 试剂在制备药物中的用途以及筛选药物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了试剂在制备药物中的用途，所述药物用于抑制下列的至少之一：乳腺癌上皮细胞或乳腺癌细胞的上皮间质转化；乳腺癌肿瘤干细胞的生成；乳腺癌细胞的迁移与侵袭；乳腺癌肿瘤的生长，其中，所述试剂用于抑制miR‑501‑5p。发明人发现，抑制miR‑501‑5p后，乳腺癌上皮细胞或乳腺癌细胞的上皮间质转化、乳腺癌肿瘤干细胞的生成、乳腺癌细胞的迁移与侵袭以及乳腺癌肿瘤的生长均受到显著抑制，用于抑制miR‑501‑5p的试剂所制备的药物可有效抑制上述疾病的发生过程。

Description

试剂在制备药物中的用途以及筛选药物的方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及试剂在制备药物中的用途以及筛选药物的方法。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居全世界女性肿瘤首位，且乳腺癌发病率呈上升趋势。在我国，乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，女性乳腺癌发病率(粗率)全国合计为42.55/10万，且发病年龄呈现年轻化趋势。全球每年大约有20万患者死于乳腺癌的复发、转移，大约占每年新发乳腺癌患者的20％。在诊断时发生转移的患者，常规的治疗通常最初能够有效的控制疾病的发展，但随着时间的发展，大多数患者最终会病情恶化。因此对于乳腺癌细胞转移、复发根源的研究，和乳腺癌的早期诊断一样具有重要的现实意义。

传统疗法如放疗和化疗能够消除肿瘤肿块，但对少数具有恶性作用的肿瘤细胞仍然不能起到完全杀死的作用，这些恶性肿瘤细胞仍然能够存活并自我更新，进一步发展为恶性肿瘤，这一类细胞就叫做肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)。研究发现，肿瘤细胞的异质性是肿瘤干细胞演化成为具有不同生物学特性的癌细胞所造成的，目前常规的肿瘤治疗方法只能消灭大部分的肿瘤细胞，肿瘤干细胞对传统疗法具有抵抗作用，并且能够在某些条件下由非肿瘤干细胞转化而来。研究发现这部分细胞具有自我更新和特定分化的能力，并在维持肿瘤生长、血管生成及促进肿瘤侵袭转移中起决定性作用。到目前为止，已在乳腺癌、白血病、胶质瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌和肝癌等恶性肿瘤中发现了肿瘤干细胞的存在。2003年Al-Hajj等首次在乳腺癌标本中分离出乳腺癌干细胞，发现几百个Lin-CD44+CD24-/lowESA+细胞在NOD/SCID小鼠中就可以形成肿瘤。乳腺癌的复发和转移是肿瘤治疗最终失败的原因，消灭肿瘤干细胞是治疗肿瘤、预防复发和转移的关键。因此，寻找能彻底控制乳腺癌干细胞生长的抗癌新疗法，就需要我们深入研究乳腺癌干细胞的自我更新和分化演变的生物学机制。

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞转化为具有间质表型细胞的生物学过程，即上皮细胞向间充质细胞转分化的过程，它不仅赋予乳腺癌细胞迁移和侵袭特征,还可使癌细胞获得自我更新能力而具有干细胞的特性，从而促进乳腺癌肿瘤干细胞的产生，前期研究发现，无论是乳腺上皮细胞还是乳腺癌细胞，经历EMT后其干细胞含量均增加，结果提示EMT和乳腺癌干细胞之间存在直接的联系。Hill等的研究发现缺氧可影响EMT相关基因的表达，进而诱导干细胞表型，提示乳腺癌细胞经历EMT后可以获得干细胞特征，促进乳腺癌肿瘤干细胞的产生。近年来一系列研究结果表明，miRNAs通过负性调控靶基因表达，在乳腺癌EMT过程、肿瘤干细胞产生和维持过程中都发挥重要作用。自分泌或旁分泌的生长激素(hGH)可以通过调控miR-96-182-183的表达促进乳腺癌细胞的EMT过程，并且增加肿瘤细胞的侵袭能力。在紫杉醇耐药的乳腺癌细胞中miR-125b可以通过调控下游靶基因Sema4C调控EMT过程。MiR-200家族可以通过靶向调控ZEB1和ZEB2基因的表达抑制EMT过程和肿瘤细胞的迁移。

EMT是乳腺癌细胞自身塑性的重要标志，深入研究miRNA在EMT与乳腺癌干细胞中的调控作用机制，对于揭开乳腺癌的复发与转移的分子机制研究以及寻找新的乳腺癌靶向治疗方法具有重要的意义。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

发明人通过乳腺癌三维培养体系，采用高通量筛选技术筛选调控乳腺癌肿瘤干细胞的miRNA分子，意外地发现，miR-501-5p与乳腺癌上皮细胞或乳腺癌细胞的上皮间质转化密切相关。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了试剂在制备药物中的用途，所述药物用于抑制下列的至少之一：乳腺癌上皮细胞或乳腺癌细胞的上皮间质转化；乳腺癌肿瘤干细胞的生成；乳腺癌细胞的迁移与侵袭；乳腺癌肿瘤的生长，其中，所述试剂用于抑制miR-501-5p。发明人发现，抑制miR-501-5p后，乳腺癌上皮细胞或乳腺癌细胞的上皮间质转化、乳腺癌肿瘤干细胞的生成、乳腺癌细胞的迁移与侵袭以及乳腺癌肿瘤的生长均受到显著抑制，用于抑制miR-501-5p的试剂所制备的药物可有效抑制上述疾病的发生过程。

根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述抑制是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR和锌指核酸酶至少之一实现的。上述方式可特异性实现miR-501-5p的敲除或下调，进而有效抑制miR-501-5p。

根据本发明的实施例，所述抑制是通过反义核酸实现的，所述试剂具有SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列。

UCUCACCCAGGGACAAAGGAUU(SEQ ID NO:1)。

根据本发明的实施例，所述试剂是以包括选自下列至少之一的形式提供的：缀合物、脂质体、前体、模拟物、表达所述试剂的构建体。根据本发明的实施例，利用上述形式的至少之一，可实现试剂在患者体内的特异性靶向到目标和试剂在目标区域发挥相应的生理效应。

根据本发明的实施例，所述缀合物包括所述试剂以及包括纳米颗粒、胆固醇、多肽的至少之一。纳米颗粒、胆固醇、多肽与试剂所形成的缀合物，可实现试剂在患者体内的特异性靶向到目标和试剂在目标区域发挥相应的生理效应，试剂以上述缀合物的形式提供，其稳定性、靶向性进一步提高。

根据本发明的实施例，所述纳米颗粒为聚乙烯亚胺、半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐。发明人通过实验发现，以聚乙烯亚胺、半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐作为纳米颗粒结合试剂所获得的纳米颗粒-核酸缀合物的稳定性和靶向性进一步提高。

根据本发明的实施例，所述构建体进一步包括控制序列，所述控制序列与所述试剂可操作的连接。控制序列可有序和高效地调控试剂在受体细胞中的高效表达，进而实现药物功能发挥的有效性和有序性。

根据本发明的实施例，所述药物成注射剂、缓释微球制剂。药物以注射剂或缓释微球制剂的形式导入患者体内，可降低药物在人体内的降解速率，进一步提高药物在目标治疗位点的有效药量和药效。

根据本发明的实施例，所述药物以注射、口服或灌肠原位给药的方式给药。发明人发现，上述给药方式可进一步提高药物在目标治疗位点的有效药量和药效。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种筛选药物的方法，所述药物用于抑制下列的至少之一：乳腺癌上皮细胞或乳腺癌细胞的上皮间质转化；乳腺癌肿瘤干细胞的生成；乳腺癌细胞的迁移与侵袭；乳腺癌肿瘤的生长。根据本发明的实施例，所述方法包括：将候选药物与乳腺癌疾病模型接触，接触后乳腺癌疾病模型的miR-501-5p的表达水平低于接触前乳腺癌疾病模型的miR-501-5p的表达水平，是候选药物作为候选药物的指示。利用根据本发明实施例的上述方法筛选获得的药物可显著抑制乳腺癌上皮细胞或乳腺癌细胞的上皮间质转化、乳腺癌肿瘤干细胞的生成、乳腺癌细胞的迁移与侵袭以及乳腺癌肿瘤的生长。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述乳腺癌疾病模型为MCF7细胞。

附图说明

图1是根据本发明实施例的流式检测乳腺癌肿瘤干细胞表面标志CD44、CD24的结果图；

图2是根据本发明实施例的qRT-PCR的方法检测EMT相关标记物mRNA的表达的结果图；

图3是根据本发明实施例的Western Blot检测EMT相关标记物蛋白的表达的结果图；

图4是根据本发明实施例的采用Transwell的方法检测肿瘤的迁移能力的结果图；

图5是根据本发明实施例的集落克隆形成实验结果图；以及

图6是根据本发明实施例的裸鼠成瘤实验的结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例

1、实验材料

乳腺癌细胞系MCF7

2、方法

1)乳腺癌肿瘤干细胞三维培养体系的建立：为避免细胞因快速增殖而出现的缺氧或代谢废物无法排出而导致细胞死亡，将乳腺癌细胞系细胞接种于构建的支架材料后，进行三维动态培养。

2)MCF7细胞过表达miR-501-5p。

3)流式检测乳腺癌肿瘤干细胞表面标志CD44、CD24：在miR-501-5p过表达体系中，过表达3d后检测；在miR-501-5p敲除体系中，敲除3-4d后检测。

4)采用qRT-PCR的方法检测EMT相关标记物mRNA的表达.主要检测上皮标志：E-cadherin；间质标志：N-cadherin,α-SMA，Vimentin；转录因子：snail1。具体操作如下：

在Pubmed上搜寻所检测基因的序列，生成引物的序列，用引物设计软件Primer3.0合成检测物所需的引物。引物长度一般为15～30bp，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也会影响到反应的特异性。随机分布四种碱基，避免一些碱基是嘌呤或嘧啶聚集，同一个碱基不要连续出现3个以上。3’端的碱基必须与模板严格配对，不修饰，防止二级结构的形成。5’末端的碱基可以是游离的，最好是G或C。末位碱基最好是A，防止错配发生，G或者C也可以，禁止连续出现两个以上的T。禁止引物自身有互补的现象。同时还要注意，引物与非特异扩增序列不能发生互补，防止非特异扩增。

5)采用Western Blot检测EMT相关标记物蛋白的表达。

6)采用Transwell的方法检测肿瘤的迁移能力，实验具体方法如下：将二维和三维上培养的乳腺癌肿瘤干细胞培养基的FBS减少到2％，饥饿12小时，消化细胞，制备单细胞悬液。将细胞的悬液调整到相应浓度,取200μL直接接种到24-well的Transwell板内，Transwell孔内的培养基只含有2％的血清，而24-well室内的培养基是500μL含有10％的FBS，正常培养24小时。孔内加入的数量要根据实际情况来定，由于不同细胞的迁移能力不同，所以接种的数量也相应的不同，否则会形成要么难以计数，要么检测的不准。培养基的选择也有很大差异。在加入Transwell时要小心，禁止板底产生气泡，以免结果受到影响。将Transwell小孔取出，用棉签轻轻多次擦拭上层的细胞，尽量擦干净，小心别把孔内的网弄擦坏。将小孔放入0.1％结晶紫染色20分钟。水洗3次，5分钟/次，在洗的时候尽可能的多观察，防止洗涤过量，然后在显微镜下拍照，计数。

7)集落克隆形成实验：将二维和三维培养的细胞消化成细胞悬液；尽可能的反复吹打，充分分散细胞，通过细胞计数多次确认细胞浓度。吹打一次计数一次，计数的次数多对细胞浓度的确定很重要；将细胞悬液梯度稀释成实验所用的浓度，取5mL细胞悬液接种到低贴附板内，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀；将低贴附板放置37℃、5％CO2的培养箱内中培养，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液；当观察到有克隆形成时，终止培养，镜下计数。

8)裸鼠成瘤实验：将不同培养的肿瘤细胞直接注射至雌性裸鼠脂肪垫，观察裸鼠的成瘤情况。实验所用的裸鼠为BALB/c-nu，实验的操作以及动物的使用均符合中华人民共和国卫生部的管理条例。具体方法如下：将培养的细胞消化成单细胞悬液，用细胞培养基重悬，将每50ul肿瘤细胞悬液的含量调整为1×106个组，每个组准备6份，冰上运输。选取6周大小的裸鼠BALB/c-nu，每组6只，将肿瘤细胞悬液注射到裸鼠的左侧腋下，每只裸鼠50ul，培养观察。每周测量2次肿瘤的体积，在无菌环境下饲养4周。

3、实验数据

1)流式检测乳腺癌肿瘤干细胞表面标志CD44、CD24。结果如图1所示。结果显示，MCF7细胞转染miR-501-5p minics后，CD44+/CD24-的比例增加，由6.76％增加至12.49％。

2)采用qRT-PCR的方法检测EMT相关标记物mRNA的表达。结果如图2所示。结果显示，MCF7细胞过表达miR-501-5p后，上皮标志E-cadherin的mRNA水平下调，而N-cadherin、Twist、Vimentin、a-SMA的mRNA水平上调。

3)采用Western Blot检测EMT相关标记物蛋白的表达。结果如图3所示。结果显示，MCF7细胞过表达miR-501-5p后，间质标志N-cadherin、snail蛋白上调。

4)采用Transwell的方法检测肿瘤的迁移能力，结果如图4所示，结果显示MCF7细胞转染miR-501-5p minics后，Transwell结果显示过表达miR-501-5p后细胞的侵袭与迁移能力增强。MCF7细胞转染miR-501-5p inhibitor后，侵袭与迁移能力减弱。

5)集落克隆形成实验。结果如图5所示。结果显示，与Minics NC组相比较，MCF7细胞转染miR-501-5p minics培养7d后，细胞团的数量明显多于Minics NC组，并且细胞团的大小也大于Minics NC组；与Inhibitors NC组相比较，MCF7细胞转染miR-501-5pinhibitors培养7d后，细胞团的数量明显少于Minics NC组，并且细胞团的大小也小于Minics NC组。

6)裸鼠成瘤实验，结果如图6所示，结果显示，MCF7细胞转染miR-501-5p minics后，将细胞注射至雌性裸鼠脂肪垫处，生长28d后，处死小鼠，取材并进行统计分析。结果显示，转让miR-501-5p minics后，肿瘤生长增加。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 国家卫生计生委科学技术研究所

<120> 试剂在制备药物中的用途以及筛选药物的方法

<130> PIDC3176307

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反义核酸的核苷酸序列

<400> 1

ucucacccag ggacaaagga uu 22

Claims (9)

1.试剂在制备药物中的用途，所述药物用于抑制下列的至少之一：

乳腺癌上皮细胞或乳腺癌细胞的上皮间质转化；

乳腺癌肿瘤干细胞的生成；

乳腺癌细胞的迁移与侵袭；

乳腺癌肿瘤的生长，

其中，所述试剂用于抑制miR-501-5p。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR和锌指核酸酶至少之一实现的。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述抑制是通过反义核酸实现的，所述试剂具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂是以包括选自下列至少之一的形式提供的：

缀合物、脂质体、前体、模拟物、表达所述试剂的构建体。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述缀合物包括所述试剂以及包括纳米颗粒、胆固醇、多肽的至少之一，

任选地，所述纳米颗粒为聚乙烯亚胺、半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述构建体进一步包括控制序列，所述控制序列与所述试剂可操作的连接。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物成注射剂、缓释微球制剂，

任选地，所述药物以注射、口服或灌肠原位给药的方式给药。

8.一种筛选药物的方法，所述药物用于抑制下列的至少之一：

乳腺癌上皮细胞或乳腺癌细胞的上皮间质转化；

乳腺癌肿瘤干细胞的生成；

乳腺癌细胞的迁移与侵袭；

乳腺癌肿瘤的生长，

其特征在于，包括：

将候选药物与乳腺癌疾病模型接触，

接触后乳腺癌疾病模型的miR-501-5p的表达水平低于接触前乳腺癌疾病模型的miR-501-5p的表达水平，是候选药物作为候选药物的指示。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述乳腺癌疾病模型为MCF7细胞。