KR20170005627A - Parp 및 탄키라제 동시 저해제에 대한 감수성 결정 방법 - Google Patents

Parp 및 탄키라제 동시 저해제에 대한 감수성 결정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PARP(Poly ADP Ribose Polymerase) 및 탄키라제(tankyrase) 동시 저해제에 대한 감수성 결정 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, PARP 및 탄키라제 동시 저해제에 대한 감수성을 갖는 환자군을 분류함으로써 대장암 치료 효과를 극대화 할 수 있다.

Description

PARP 및 탄키라제 동시 저해제에 대한 감수성 결정 방법{Method for Determining Susceptibility to Dual Inhibitor against PARP and Tankyrase}
본 발명은 PARP(Poly ADP Ribose Polymerase) 및 탄키라제(tankyrase) 동시 저해제에 대한 감수성 결정 방법에 관한 것이다.
바이오마커란 ‘정상적인 생물학적 과정, 질병 진행 상황, 그리고 치료방법에 대한 약물의 반응성을 객관적으로 측정하고 평가할 수 있는 지표’라고 정의하고 있다. 최근 유전자 분석기술의 발달로 특정 유전자의 변이와 특정 질병 사이의 관련성에 대한 연구가 증가하면 서 바이오마커는 유전자와 유전적 변이, 그로 인한 RNA, 단백질, 대사물질 발현의 차이를 모두 아우르는 분자적, 생물학적 지표로 재(再)정의되고 있다.
또한, 좀 더 효과적인 치료를 위해 의약품의 치료효과를 극대화 시키거나 부작용을 최소화 할 수 있는 환자군을 분류하고자 바이오마커의 감수성 여부를 판단 할 수 있는 동반진단제(Companion Dignostics Device, CDx)의 개발이 이루어지고 있다.
대장은 소장(작은창자)의 끝에서 시작해 항문까지 연결된 약 150 ㎝의 긴 튜브 모양의 소화기관으로, 맹장, 결장, 직장 및 항문관으로 나뉘며, 이 가운데 결장 및 직장에 생기는 악성 종양이 대장암이다. 대장암의 대부분은 선암(샘암), 즉 점막에 샘세포에 생기는 암이며, 그 밖에 림프종, 악성 유암종, 평활근육종 같은 것이 원발성으로 생길 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 대장암 치료제인 PARP(Poly ADP Ribose Polymerase) 및 탄키라제(Tankyrase) 동시 저해제의 치료 효과를 극대화시키기 위해 상기 PARP 및 탄키라제 동시 저해제에 대한 감수성(susceptibility)을 결정하는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 대장암 환자로부터 분리한 대장암 세포의 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4의 유전자형이 돌연변이형인 경우에 상기 PARP 및 탄키라제 저해제의 치료효과가 극대화 될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 PARP 및 탄키라제 동시 저해제에 대한 감수성 결정 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 PARP 및 탄키라제 동시 저해제에 대한 감수성 결정용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 PARP(Poly ADP Ribose Polymerase) 및 탄키라제(Tankyrase) 동시 저해제에 대한 감수성(susceptibility) 결정 방법을 제공한다:
(a) 대장암 환자로부터 대장암 세포를 분리하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 대장암 세포의 핵산 분자를 분리하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 핵산 분자의 p53 유전자 및 LIG4(DNA ligase 4) 유전자의 유전자형을 확인하는 단계로, 상기 p53 유전자의 유전자형이 정상형이고, 상기 LIG4 유전자의 유전자형이 돌연변이형인 경우 PARP 및 탄키라제 저해제에 대하여 감수성이 있는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
본 발명자들은 대장암 치료제인 PARP(Poly ADP Ribose Polymerase) 및 탄키라제(Tankyrase) 저해제의 치료 효과를 극대화 시키기 위해 상기 PARP 및 탄키라제 저해제에 대한 감수성(susceptibility)을 결정하는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 대장암 환자로부터 분리한 대장암 세포의 p53 유전자이 정상형이고 LIG4 유전자의 유전자형이 돌연변이형인 경우에 상기 PARP 및 탄키라제 저해제의 치료효과가 극대화 될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 PARP 및 탄키라제 동시 저해제에 대한 감수성 결정 방법을 단계별로 상세히 설명한다.
단계 (a) 대장암 세포의 분리
우선, 대장암 환자로부터 대장암 세포를 얻기 위하여, 대장암 조직을 절단한 다음 적합한 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다.
상기 단백질 분해효소는 파파인(papain), 판크레아틴(pancreatin), 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 펩신(pepsin), 스트렙토키나제(streptokinase), 스트렙토도르나제(streptodornase), ficain(피카인), 카르복시펩티다제(0carboxypeptidase), 아미노펩티다제(aminopeptidase), 키모파파인(chymopapain), 브로멜린(bromelin) 및 서브틸리신(subtilisin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 분해효소이다.
단계 (b) 핵산 분자의 분리
다음, 상기 단계 (a)의 대장암 세포의 핵산 분자를 분리한다.
본 명세서에서, “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 방법에 있어서, 상기 핵산 분자는 대장암 환자의 대장암 조직으로부터 분리한 대장암 세포로부터 얻을 수 있다.
단계　(c) p53 및 LIG4의 유전자형 확인
다음, 상기 단계 (b)의 핵산 분자의 p53 유전자 및 LIG4(DNA ligase 4) 유전자의 유전자형을 확인하는 단계로, 상기 p53 유전자의 유전자형이 정상형이고, 상기 LIG4 유전자의 유전자형이 돌연변이형인 경우 PARP 및 탄키라제 저해제에 대하여 감수성이 있는 것으로 판단한다.
상기 유전자형을 확인하기 위하여, 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)). 출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다 (참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 동물세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성 할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (c)는 유전자형을 규명(genotyping)하는데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 단계 (c)는 DNA 시퀀싱, PCR(Polymerase Chain Reaction), RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD(Random Amplified Polymorphic Detection), AFLPD(Amplified Fragment Length Polymorphism Detection), ASO(Allele Specific Oligonucleotide) 프로브 또는 DNA 마이크로어레이에 의해 실시될 수 있다.
상기 p53 유전자의 유전자형이 정상형이고, 상기 LIG4 유전자의 유전자형이 돌연변이형인 경우 PARP 및 탄키라제 저해제에 대하여 감수성이 있는 것으로 판단한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 p53 유전자는 유전자형이 정상형인 경우에 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 LIG4 유전자는 유전자형이 정상형인 경우에 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 LIG4 유전자의 유전자형이 돌연변이형인 경우는 LIG4의 뉴클레오타이드 서열의 변이를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 LIG4 유전자는 서열목록 제2서열의 8번째 염기인 시토신(cytosine)이 티민(thymine)으로 치환(substitution), 26번째 염기인 시토신(cytosine)이 티민(thymine)으로 치환, 833번째 염기인 구아닌(guanine)이 아데닌(adenine)으로 치환 및 1704번째 염기인 티민(thymine)이 시토신(cytosine)으로 치환되는 경우로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경우에 유전자형이 돌연변이형인 것으로 판단한다.
상기 LIG4 유전자의 유전자형이 돌연변이형인 경우는 LIG4의 아미노산 서열의 변이를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 LIG4 유전자는 서열목록 제3서열의 3번째 아미노산인 알라닌(Alanine)이 발린(Valine)으로 치환, 9번째 아미노산인 트레오닌(threonine)이 이소루신(Isoleucine)으로 치환, 278번째 아미노산인 아르기닌(arginine)이 히스티딘(histidine)으로 치환 및 568번째 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid)이 티민(thymine) 염기가 시토신(cytosine)으로 치환 된 아스파르트산(aspartic acid)으로 치환되는 경우로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경우에 유전자형이 돌연변이형인 것으로 판단한다.
상기 핵산 분자의 p53 유전자 및 LIG4(DNA ligase 4) 유전자의 유전자형을 확인하는 단계로, 상기 p53 유전자의 유전자형이 정상형이고, 상기 LIG4 유전자의 유전자형이 돌연변이형인 경우 PARP 및 탄키라제 저해제에 대하여 감수성이 있는 것으로 판단한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 PARP 및 탄키라제 저해제는 8-[(디메틸아미노)메틸]-10-에톡시-1,2,3,4-테트라히드로벤조[h][1,6]나프티리딘-5(6H)-온 또는 6-{4-[(5-옥소-1,2,3,4,5,6-헥사히드로벤조[h][1,6]나프티리딘-8-일)메틸]피페라진-1-일}니코티노니트릴이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) p53 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및 (b) LIG4(DNA ligase 4) 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 PARP(Poly ADP Ribose Polymerase) 및 탄키라제(Tankyrase) 동시 저해제에 대한 감수성(susceptibility) 결정용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.
프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 p53은 GenBank 접근번호 NM_000546.5, LIG4는 GenBank 접근번호 NM_002312.3 에 뉴클레오타이드 서열이 개시되어 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 p53 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열이고, 상기 LIG4 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 LIG4 유전자 돌연변이형을 검출하기 위해 서열목록 제8서열 및 제9서열의 프라이머 쌍, 서열목록 제10서열 및 제11서열의 프라이머 쌍 및 서열목록 제12서열 및 제13서열의 프라이머 쌍을 이용한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 PARP(Poly ADP Ribose Polymerase) 및 탄키라제(Tankyrase) 동시 저해제에 대한 감수성(susceptibility) 결정 방법 및 키트를 제공한다.
(b) 본 발명은 PARP 및 탄키라제 동시 저해제에 대한 감수성을 갖는 환자군을 분류함으로써 대장암 치료 효과를 극대화 할 수 있다.
도 1은 인간 대장암 세포주 HCT116에서 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-283의 항암 감수성과 p53 존재 유무 및 DNA 복구 관련 유전자(ATR, XLF, XRCC4 및 LIG4)의 관련성을 분석한 결과를 보여준다.
도 2는 다양한 인간 대장암 세포주(RKO, LoVo 및 SW620)에서 p53 유전자형 및 LIG4 유전자형에 따른 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-283 및 올라파립(olaparib) 처리에 대한 세포사멸을 분석한 결과를 보여준다.
도 3은 p53 유전자형 및 LIG4 유전자형이 정상형인 인간 대장암 세포주 HCT116에서 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-283 및 올라파립 처리에 대한 DNA 손상을 분석한 결과를 면역화학법을 통해 나타낸다.
도 4는 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 인간 대장암 세포주 RKO에서 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-283 및 올라파립 처리에 대한 DNA 손상을 분석한 결과를 면역화학법을 통해 나타낸다.
도 5a 및 5b는 인간 대장암 세포주 HCT116 및 RKO에서 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-283 및 올라파립 처리에 대한 DNA 손상 및 세포사멸을 웨스턴블럿을 통해 나타낸다.
도 6은 인간 대장암 세포주 HCT8(p53 WT/LIG4 WT)에 돌연변이형 LIG4(G833A 또는 T1704C)를 과발현 시키고 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-283 처리에 대한 세포사멸을 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 인간 대장암 세포주 SW620(p53 MT/LIG4 WT)에 돌연변이형 LIG4(G833A 또는 T1704C)를 과발현 시키고 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-283 처리에 대한 세포사멸을 분석한 결과를 나타낸다.
도 8a 및 8b는 인간 대장암 세포주 HCT8(p53 WT/LIG4 WT)에 돌연변이형 LIG4(G833A 또는 T1704C)를 과발현 시키고 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-283 및 올라파립 처리에 대한 DNA 손상 및 세포사멸 분석 결과를 나타낸다.
도 9a 및 9b는 인간 대장암 세포주 RKO(p53 WT/LIG4 MT)에 돌연변이형 p53과 정상형 LIG4를 각각 과발현 시키고 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-283 및 올라파립 처리에 대한 세포사멸 분석 결과를 나타낸다.
도 10a 및 10b는 p53 유전자형 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 인간 대장암 세포주(RKO, LoVo)에서 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-283 및 JPI-547 처리에 대한 세포사멸을 비교 분석한 결과를 보여준다.
도 11a 내지 11d는 인간 대장암 세포주 RKO(p53 WT/LIG4 MT), SW620(p53 MT/LIG4 WT), HCT8(p53 WT/LIG4 WT), KM12C(p53 MT/LIG4 MT)에 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-283과 JPI-547 및 올라파립과 NVP-TNKS656 처리에 대한 세포사멸 분석 결과를 나타낸다.
도 12a 및 12b는 인간 대장암 세포주 RKO(p53 WT/LIG4 MT)에 돌연변이형 p53과 정상형 LIG4를 각각 과발현 시키고 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-547 및 올라파립 처리에 대한 세포사멸 분석 결과를 나타낸다.
도 13a 및 13b는 인간 대장암 세포주 LoVo(p53 WT/LIG4 MT)에 돌연변이형 p53과 정상형 LIG4를 각각 과발현 시키고 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-547 및 올라파립 처리에 대한 세포사멸 분석 결과를 나타낸다.
도 14a 및 14b는 인간 대장암 세포주 LoVo(p53 WT/LIG4 MT)에 돌연변이형 p53과 정상형 LIG4를 각각 과발현 시키고 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-547 및 올라파립 처리에 대한 DNA 손상 및 세포사멸을 웨스턴블럿을 통해 나타낸다.
도 15a 및 15b는 인간 대장암 세포주 RKO(p53 WT/LIG4 MT)을 이용한 인 비보 이종이식 모델(in vivo xenograft model)에서 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-283과 올라파립 투여에 대한 종양억제 분석 결과를 나타낸다.
도 16a 및 16b는 인간 대장암 세포주 SW620(p53 MT/LIG4 WT)를 이용한 인 비보 이종이식 모델에서 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-283과 올라파립 투여에 대한 종양억제 분석 결과를 나타낸다.
도 17a 및 17b는 인간 대장암 세포주 KM12C(p53 MT/LIG4 MT)를 이용한 인 비보 이종이식 모델에서 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-283과 올라파립 투여에 대한 종양억제 분석 결과를 나타낸다.
도 18a 및 18b는 인간 대장암 세포주 RKO(p53 WT/LIG4 MT)을 이용한 인 비보 이종이식 모델에서 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-547과 올라파립 투여에 대한 종양억제 분석 결과를 나타낸다.
도 19a 및 19b는 인간 대장암 세포주 KM12C(p53 MT/LIG4 MT)를 이용한 인 비보 이종이식 모델에서 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-547 투여에 대한 종양억제 분석 결과를 나타낸다.
도 20은 대장암 환자 유래 세포 11-CT-79558D(p53 WT/LIG4 MT), 11-CT-80464B(p53 WT/LIG4 MT)와 11CT-94575(p53 WT/LIG4 WT), 13CT-78649B(p53 WT/LIG4 WT)에 PARP/탄키라제 동시 저해제인 JPI-547 및 올라파립 처리에 대한 세포 모양 변화 분석 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 발명에 사용된 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제 JPI-283의 IUPAC 명칭은 8-[(디메틸아미노)메틸]-10-에톡시-1,2,3,4-테트라히드로벤조[h][1,6]나프티리딘-5(6H)-온 이며, JPI-547의 IUPAC 명칭은 6-{4-[(5-옥소-1,2,3,4,5,6-헥사히드로벤조[h][1,6]나프티리딘-8-일)메틸]피페라진-1-일}니코티노니트릴 이다.
실시예 1: PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 IC 50 분석
본 발명자들은 18종의 인간 대장암 세포주(한국세포주은행 및 ATCC 구입)에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 항암 활성을 분석하고자, 인 비트로 셀 베이스 어세이(in vitro cell base assay)를 통해 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283에 대한 세포주들의 생존능(cell viability)과 IC50을 측정하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 총 18종의 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute 1640; 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 각 세포주를 96웰 플레이트에 웰 당 2×103개씩 37℃에서 24시간 배양하고 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283을 최대 100 μM에서 최소 0.390625 μM으로 2배씩 희석하여(100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM, 1.5625 μM, 0.78125 μM 및 0.390625 μM) 처리 한 후 37℃에서 72시간 배양하여 약물 처리군과 비처리군을 MTS 분석(Promega, CellTiter 96 AQeous One Solution)을 이용하여 각 세포주의 생존능을 측정하고 PRISM 프로그램을 이용하여 각 세포주의 IC50을 측정하였다.
실험 결과
18종의 인간 대장암 세포주에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 각각 처리하여 MTS 분석을 이용하여 IC50을 분석한 결과, 10종(HCT116, HT29, RKO, LoVo, LS174T, Colo201, Colo205, Colo320HSR, HCT8 및 Caco-2)의 세포주에서 JPI-283의 유의성 있는 IC50값을 나타내었다.
Figure pat00001
실시예 2: p53 유전자형에 따른 JPI-238의 항암 감수성
본 발명자들은 18종의 인간 대장암 세포주에서 실시예 1과 같은 실험 방법으로 인 비트로 셀 베이스 어세이(in vitro cell base assay)를 통해 18종의 인간 대장암 세포주와 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 항암효능과 p53 유전자의 유전형과의 연관성을 분석하였다.
실험 결과
18종의 인간 대장암 세포주에서 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 IC50과 대장암에서 흔히 발생하는 p53의 유전자형을 비교 분석한 결과, p53 유전자형이 정상인 대장암 세포들이 IC50 값이 낮게 분석되어 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 p53 유전자형과의 관련성을 나타내었다.
p53 야생형
세포주		 IC50(μM) p53 돌연변이형
세포주		 IC50(μM)
JPI-283 JPI-283
LS174T 12.19 Colo320HSR 8.267
HT29 32.21
RKO 12.3 Caco-2 19.24
Colo205 24.45
HCT116 13.18 Colo201 28.43
DLD-1 85.57
LoVo 18.57 SW620 96.65
HCT-15 >100
HCT8 39.5 LS1034 >100
KM12C >100
SW48 >100 SW1417 >100
SW480 >100
실시예 3: JPI-238의 항암 감수성 유전자형 분석
본 발명자들은 p53 유전자 존재 유무 및 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 존재하는 인간 대장암 세포주 HCT116에 DNA 복구 유전자로 알려진 ATR, XLF, XRCC4 및 LIG4 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283을 처리 한 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 정상인 HCT116과 p53 유전자가 결손되어 있는 HCT116 p53 널(null) 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 60 ㎜ 플레이트에 웰 당 1×105 개씩 37℃에서 24시간 배양하고 리포펙타민 2000(Lipofectamin 2000, invitrogen)으로 ATR, XLF, XRCC4 및 LIG4(서열목록 제4서열; ATR siRNA 5'-GAGUUCUCAGAAGUCAACC-3', 서열목록 제5서열; XLF siRNA 5'-CGCUGAUUCGAGAUCGAUUGA-3', 서열목록 제6서열; XRCC4 siRNA 5'-CUGAUCUCUCUGGGUUGGCUU-3', 서열목록 제7서열; LIG4 siRNA 5`-GGGAGUGUCUCAUGUAAUA-3`)를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283을 25 μM 및 50 μM 처리하고 48시간 배양 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
실험 결과
p53의 유전자형이 정상인 대장암 세포주인 HCT116 및 p53-결손 HCT116(HCT116 p53 null)에서 p53 유전자의 존재 유무에 따라 DNA 복구 관련 유준자들을 넉다운(knockdown) 시킨 후 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283에만 감수성을 나타내는 DNA 복구 유전자를 분석한 결과 p53 유전자가 정상이고 LIG4 유전자가 결손되었을 경우 세포사멸이 크게 증가하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283에 선택적인 결과를 나타내었다(도 1).
실시예 4: 대장암 세포에서의 LIG4 유전자형 분석
본 발명자들은 대장암 세포주에서의 LIG4 유전형을 확인하기 위하여 20종의 대장암 세포주에서 LIG4의 유전자형을 RT-PCR과 시퀀싱을 통해 변이/결핍 여부를 분석하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 총 20종의 대장암 세포주를 각각 균질기(homogenizer)로 트라이졸(Trizol) RNA 추출법을 이용하여 총 RNA를 추출하여 500 ng의 총 RNA를 cDNA로 재합성하여 LIG4 프라이머(서열목록 제8서열; LIG4 프라이머 Exon2-1 정방향 프라이머 5'-GCTAGCTGCTATTGCAGATATTGAGC-3', 서열목록 제9서열; LIG4 프라이머 Exon2-1 역방향 프라이머 5'-AGAACCTTCAGTAGGAGAAGCACCAA-3', 서열목록 제10서열; LIG4 프라이머 Exon2-2 정방향 프라이머 5'-CCTGGTGAGAAGCCATCTGT-3', 서열목록 제11서열; LIG4 프라이머 Exon2-2 역방향 프라이머 5'-GCCTTCCCCCTAAGTTGTTC-3')를 이용하여 PCR을 수행하여 1% 아가로즈 겔에 전기영동 후 Et-Br 염색을 통하여 LIG4의 발현이 확인된 PCR 생산물을 생거 시퀀싱법(sanger sequencing)을 통하여 돌연변이 분석을 확인하였다.
실험 결과
20종의 인간 대장암 세포주에서 LIG4 유전자형의 돌연변이 여부를 생거 시퀀싱 방법으로 LIG4 유전자의 기능 상실 돌연변이 부위로 알려진 G833 및 T1704 부위를 분석한 결과, 20 종 중 8 종의 대장암 세포주에서 LIG4 유전자형의 돌연변이가 있음을 확인하였다.
Figure pat00002
실시예 5: p53 및 LIG4 유전자형에 따른 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 유전자형 및 LIG4 유전자형에 따른 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 세포사멸 정도를 분석하고자 p53 유전자가 정상형이면서 LIG4 유전자가 돌연변이형인 RKO, LoVo 인간 대장암 세포주 및 p53 유전자가 돌연변이형이고 LIG4 유전자가 정상형인 SW620 인간 대장암 세포주에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리 한 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 정상형이면서 LIG4 유전자가 돌연변이형인 RKO, LoVo 인간 대장암 세포주와 p53 유전자가 돌연변이형이고 LIG4 유전자가 정상형인 SW620 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 60 ㎜ 플레이트에 웰 당 1×105 개씩 37℃에서 24시간 배양하고 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 각각 25 μM 및 50 μM 처리하고 48시간 배양 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
실험 결과
p53 및 LIG4의 유전자형이 다른 인간 대장암 세포주에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리하여 세포사멸 정도를 관찰한 결과 p53 유전자형이 정상이면서 LIG4 유전자형이 돌연변이형을 갖는 RKO, LoVo 세포주에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283에 의한 세포사멸이 유도되고 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립에서는 세포사멸 효과가 없는 것을 볼 수 있으며, p53 유전자형이 돌연변이형이고 LIG4가 정상형인 SW620에서는 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 올라파립 모두 세포사멸 효능이 낮은 것을 관찰할 수 있어 p53 유전자형이 정상이면서 LIG4 유전자형이 돌연변이형에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283에 선택적인 결과를 보여준다(도 2).
실시예 6: p53 유전자형 정상형 세포의 DNA 손상 분석
본 발명자들은 p53 유전자가 정상형인 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 DNA 손상 정도를 분석하고자 p53 유전자가 정상형인 HCT116 인간 대장암 세포주에 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283와 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리 한 후 DNA 손상 여부를 r-H2AX의 발현 정도로 면역화학 방법으로 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 정상형인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 60 ㎜ 플레이트에 웰 당 1×105 개씩 37℃에서 24시간 배양하고 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 각각 50 μM 처리하고 48시간 배양 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 상온에서 15분 동안 고정하고 10분 동안 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 0.5% 트리톤(triton) X-100으로 10분간 투과화(permeabilization) 하고 10분 동안 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 5% BSA로 상온에서 1시간 블로킹하고 r-H2AX 항체를 1% BSA에 1:100으로 희석하여 4℃에서 밤새 반응시킨 후 10분 동안 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체(alexa fluor®488 fitc)를 1% BSA에 1:100으로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 10분 동안 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 염색하여 형광현미경으로 r-H2AX의 발현 정도를 확인하였다.
실험 결과
p53 유전자가 정상형인 인간 대장암세포주 HCT116에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리하여 DNA의 손상 여부를 면역화학(imuunocytochemistry) 방법으로 r-H2AX의 발현양을 관찰한 결과, 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 처리한 군이 올라파립을 처리한 군보다 r-H2AX의 발현이 증가되는 것으로 보아 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인JPI-283의 DNA 손상을 유도하는 것을 보여준다(도 3).
실시예 7: p53 유전자형 정상형 및 LIG4 유전자형 돌연변이형 세포의 DNA 손상 분석
본 발명자들은 p53 유전자가 정상형이고 LIG4 유전자가 돌연변이형인 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 DNA 손상 정도를 분석하고자 p53 유전자가 정상형이고 LIG4 유전자가 돌연변이형인 RKO 인간 대장암 세포주에 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283와 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리 한 후 DNA 손상 여부를 r-H2AX의 발현 정도로 면역화학 방법 방법으로 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 정상형이고 LIG4 유전자가 돌연변이형인 RKO 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 60 ㎜ 플레이트에 웰 당 1×105 개씩 37℃에서 24시간 배양하고 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 각각 50 μM 처리하고 48시간 배양 후 4% 파라포름알데하이드로 상온에서 15분 동안 고정하여 5분 동안 10번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 0.5% 트리톤 X-100으로 10분동안 투과화하고 10분 동안 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 5% BSA로 상온에서 1시간 블로킹하고 r-H2AX 항체를 1% BSA에 1:100으로 희석하여 4℃에서 밤새 반응시킨 후 10분 동안 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체(alexa fluor®488 fitc)를 1% BSA에 1:100으로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 10분 동안 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 DAPI를 염색하여 형광현미경으로 r-H2AX의 발현 정도를 확인하였다.
실험 결과
p53 유전자형은 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이인 인간 대장암 세포주 RKO에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리하여 DNA의 손상 여부를 면역화학 방법으로 r-H2AX의 발현양을 관찰한 결과 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 처리한 군에서만 r-H2AX의 발현이 증가되는 것으로 보아 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 DNA 손상을 유도하는 것을 보여준다(도 4).
실시예 8: p53 유전자형 정상형 및 LIG4 유전자형 돌연변이형 세포의 DNA 손상 및 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 유전자가 정상형 및 LIG4 유전자가 돌연변이형인 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 DNA 손상 정도와 세포사멸 정도를 분석하고자 p53 유전자와 LIG4 유전자가 정상형인 HCT116 인간 대장암 세포주와 p53 유전자가 정상형이고 LIG4 유전자가 돌연변이형인 RKO 인간 대장암 세포주에 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283와 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리 한 후 웨스턴블럿 방법으로 r-H2AX의 발현 정도로 DNA 손상 여부를 확인하고 절단형 카스페이즈 3(cleaved caspase 3)의 발현 정도로 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자와 LIG4 유전자가 정상형인 HCT116 인간 대장암 세포주와 p53 유전자가 정상형이고 LIG4 유전자가 돌연변이형인 RKO 인간 대장암 세포주들을 RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 60 ㎜ 플레이트에 웰 당 1×105 개씩 37℃에서 24시간 배양하고 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283와 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 각각 50 μM 처리하고 48시간 배양 후 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 RIPA 버퍼를 이용하여 세포들을 용해시킨 후 고속원심분리기를 이용하여 단백질을 추출하여 세포들 당 30 ㎍의 단백질을 웨스턴블럿 방법으로 전기영동하여 단백질을 분리 후 PDVF 막에 트랜스퍼하여 r-H2AX, 절단형 카스페이즈 3, b-액틴 항체를 5% 탈지우유에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분 동안 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% 탈지우유에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분 동안 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL(Enhanced Chemiluminescence) 완충액을 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 안티바디에 대한 단백질의 발현을 현상하였다
실험 결과
p53 유전자형이 정상형인 인간 대장암 세포주 HCT116 및 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이인 인간 대장암 세포주 RKO에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리하여 DNA의 손상 정도와 세포사멸 정도를 웨스턴블럿으로 r-H2AX과 절단형 카스페이즈 3의 발현양을 관찰한 결과, 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 처리한 군이 올라파립을 처리한 군보다 r-H2AX의 발현이 증가되고 절단형 카스페이즈 3의 발현양 또한 증가되는 것으로 보아 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 DNA 손상과 세포사멸을 유도하는 것을 보여준다(도 5).
실시예 9: p53 유전자형이 정상형인 세포주에서 LIG4 유전자형이 돌연변이형 세포인 경우 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형일 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 세포사멸 정도를 분석하고자 p53 유전자가 정상형이고 LIG4 유전자형이 정상형인 HCT8 인간 대장암 세포주에 LIG4 돌연변이형을 과발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리 한 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 정상형이면서 LIG4 유전자가 정상형인 HCT8 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 60 ㎜ 플레이트에 웰 당 1×105 개씩 37℃에서 24시간 배양하고 리포펙타민2000(invitrogen)으로 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 G833A 또는 T1704C 플라스미드 DNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 과 발현 시킨 후 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 각각 25uM, 50uM 처리하고 48시간 배양 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
실험 결과
p53 유전자형 및 LIG4 유전자형이 정상형인 인간 대장암 세포주 HCT8에서 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 G833A 또는 T1704C를 과 발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283을 처리하여 세포사멸 정도를 트립판 블루 염색 배제 방법(Trypan blue exclusion assay)으로 관찰한 결과 LIG4 돌연변이 유전자를 삽입하지 않은 대조군(empty)과 비교하여 LIG4 돌연변이 G833A 또는 T1704C를 과 발현하였을 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283에 의한 세포사멸이 증가되는 것을 보여준다(도 6).
실시예 10: p53 유전자형이 돌연변이형인 세포주에서 LIG4 유전자형 돌연변이형 세포인 경우 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 유전자형이 돌연변이형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형일 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 세포사멸 정도를 분석하고자 p53 유전자가 돌연변이형이고 LIG4 유전자형이 정상형인 SW620 인간 대장암 세포주에 LIG4 돌연변이형을 과발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리 한 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 돌연변이형이면서 LIG4 유전자가 정상형인 SW620 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 60 ㎜ 플레이트에 웰 당 1×105 개씩 37℃에서 24시간 배양하고 리포펙타민2000(invitrogen)으로 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 G833A 또는 T1704C 플라스미드 DNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 과발현 시킨 후 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 각각 25 μM 및 50 μM 처리하고 48시간 배양 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
실험 결과
p53 유전자형이 돌연변이형이고 LIG4 유전자형이 정상형인 인간 대장암 세포주 SW620에서 LIG4 유전자 돌연변이형인 G833A 또는 T1704C를 과발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283을 처리하여 세포사멸 정도를 트립판 블루 염색 배제 방법으로 관찰한 결과 LIG4 돌연변이 유전자를 삽입하지 않은 대조군(empty)과 비교하여 LIG4 돌연변이 G833A 또는 T1704C를 과발현하였을 경우, 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283에 의한 세포사멸이 변화가 없는 것으로 보아 도 5와 같이 p53 유전자형이 정상형인 경우에만 LIG4 돌연변이에 대한 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283에 의한 세포사멸이 유도되는 것을 보여준다(도 7).
실시예 11: p53 유전자형이 정상형인 세포주에서 LIG4 유전자형 돌연변이형 세포인 경우 DNA 손상 및 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 유전자형이 돌연변이형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형일 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 세포사멸 정도와 DNA 손상 정도를 분석하고자 실시예 9와 동일하게 실험을 진행하였다. 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하고 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 RIPA 버퍼를 이용하여 세포들을 용해시킨 후 고속원심분리기를 이용하여 단백질을 추출하여 세포들 당 30 ㎍의 단백질을 웨스턴블럿 방법으로 전기영동하여 단백질을 분리 후 PDVF 막에 트랜스퍼하여 r-H2AX, 절단형 캐스페이즈 3, b-액틴 항체를 5% 탈지우유에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% 탈지우유에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분동안 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL 버퍼를 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 안티바디에 대한 단백질의 발현을 현상하였다
실험 결과
p53 유전자형 및 LIG4 유전자형이 정상형인 인간 대장암 세포주 HCT8에서 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 G833A 또는 T1704C를 과발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리하여 트립판 블루 염색 배제 방법으로 세포사멸 정도를 관찰하고 웨스턴블럿으로 DNA의 손상 정도와 세포사멸 정도를 r-H2AX과 절단형 카스페이즈 3의 발현양을 관찰한 결과, 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 처리한 군이 경쟁약물로 올라파립보다 LIG4 돌연변이 유전자를 삽입하지 않은 대조군(empty)과 비교하여 LIG4 돌연변이 G833A 또는 T1704C를 과발현하였을 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283에 의한 세포사멸이 증가되는 것이 관찰되고(도 8a), r-H2AX의 발현과 절단형 카스페이즈 3의 발현양 또한 증가되는 것으로 보아 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이일 경우에만 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 DNA 손상과 세포사멸을 유도하는 것을 보여준다(도 8b).
실시예 12: p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 세포주에서 p53 돌연변이형 및 LIG4 정상형 발현에 따른 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형일 경우 돌연변이형 p53 및 정상형 LIG4의 발현에 따른 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 세포사멸 정도를 분석하고자 p53 유전자가 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 RKO 인간 대장암 세포주를 실시예 7과 동일하게 배양하고 p53 돌연변이형 플라스미드 DNA와 LIG4 유전자형이 정상형인 플라스미드 DNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 과 발현 시킨 후 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 각각 25 μM 및 50 μM 처리하고 48시간 배양 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
실험 결과
p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 인간 대장암 세포주 RKO에서 p53 돌연변이형 유전자를 과발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리하여 트립판 블루 염색 배제 방법으로 세포사멸 정도를 결과, p53 돌연변이형 유전자를 삽입하지 않은 대조군(empty)과 비교하여 p53 돌연변이형 유전자를 과발현하였을 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283에 의한 세포사멸이 감소되는 것이 관찰되었다(도 9a). p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 인간 대장암 세포주 RKO에서 LIG4 정상형 유전자를 과 발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리하여 트립판 블루 염색 배제 방법으로 세포사멸 정도를 결과, LIG4 정상형 유전자를 삽입하지 않은 대조군(empty)과 비교하여 LIG4 정상형 유전자를 과 발현하였을 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283에 의한 세포사멸이 감소되는 것이 관찰되어 (도 9b) p53이 정상형이고 LIG4가 돌연변이형일 경우 JPI-283에 세포사멸이 가장 높은 것을 보여준다(도 9).
실시예 13: p53 및 LIG4 유전자형에 따른 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547의 IC 50 분석
본 발명자들은 p53 및 LIG4 유전자형이 서로 다른 RKO(p53wt/LIG4mt), HCT8(p53wt, LIG4wt), SW620(p53mt, LIG4wt), KM12C(p53mt, LIG4mt) 4종의 인간 대장암 세포주에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 JPI-547의 항암 활성을 분석하고자, 인 비트로 셀 베이스 어세이(in vitro cell base assay)를 통해 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283와 JPI-547에 대한 세포주들의 생존능(cell viability)과 IC50을 측정하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 총 4종의 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 각 세포주를 96 웰 플레이트에 웰 당 2×103개씩 37℃에서 24시간 배양하고 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 JPI-547을 최대 100 μM에서 최소 0.390625 μM으로 2배씩 희석하여(100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM, 1.5625 μM, 0.78125 μM 및 0.390625 μM) 처리 한 후 37℃에서 72시간 배양하여 약물 처리군과 비처리군을 MTS 분석(Promega, CellTiter 96 AQeous One Solution)를 이용하여 각 세포주의 생존능을 측정하고 PRISM 프로그램을 이용하여 각 세포주의 IC50을 측정하였다.
실험 결과
4종의 인간 대장암 세포주에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 JPI-547을 각각 처리하여 MTS 분석을 이용하여 IC50을 분석한 결과, 4종의 세포주 중 p53이 정상형이고 LIG4가 돌연변이형인 RKO에서 JPI-283과 JPI-547에서 가장 낮은 IC50값을 나타내어 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283와 JPI-547은 p53이 정상형이고 LIG4가 돌연변이형인 경우에 항암효능이 가장 우수한 것을 보여준다(표 4).
Figure pat00003
실시예 14: p53 및 LIG4 유전자형에 따른 JPI-283과 JPI-547의 효능 분석
본 발명자들은 p53 유전자형 및 LIG4 유전자형에 따른 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 세포사멸 정도를 분석하고자 p53 유전자가 정상형이면서 LIG4 유전자가 돌연변이형인 RKO와 LoVo 인간 대장암 세포주에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 JPI-547을 처리 한 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 비교 확인하였다. 상기 RKO 및 LoVo 인간 대장암 세포주는 실시예 5와 동일한 조건으로 배양하고 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 JPI-547을 각각 25 μM 및 50 μM 처리하여 48시간 배양 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
실험 결과
p53 유전자가 정상형이면서 LIG4 유전자가 돌연변이형인 인간 대장암 세포주 RKO 및 LoVo에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 JPI-547을 각각 처리하여 세포사멸 정도를 관찰한 결과 p53 유전자형이 정상이면서 LIG4 유전자형이 돌연변이형을 갖는 RKO 및 LOVO 세포주에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283보다 JPI-547에 의한 세포사멸 효능이 높은 것을 볼 수 있으며 p53 유전자형이 정상이면서 LIG4 유전자형이 돌연변이형에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547이 JPI-283보다 선택적인 결과를 보여준다(도 10).
실시예 15: p53 유전자형과 LIG4 유전자형이 서로 다른 세포주에서의 JPI -283 및 JPI -547에 대한 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이인 세포주 RKO, p53 유전자형이 돌연변이형이고 LIG4 유전자형이 정상형인 세포주 SW620, p53 유전자형과 LIG4 유전자형이 정상인 세포주 HCT8, 그리고 p53 유전자형과 LIG4 유전자형이 돌연변이인 세포주 KM12C에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 JPI-547의 세포사멸 정도를 분석하고자 p53 유전자형과 LIG4 유전자형이 각기 다른 RKO, HCT, SW620 및 KM12C의 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 60 ㎜ 플레이트에 웰 당 1×105 개씩 37℃에서 24시간 배양하고 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283, JPI-547 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립과 Tankyrase 저해제인 NVP-TNKS656를 각각 25 μM 및 50 μM 처리하고 48시간 배양 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
실험 결과
p53 유전자형과 LIG4 유전자형이 서로 다른 인간 대장암 세포주 RKO, SW620, HCT8 및 KM12C에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283, JPI-547 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립과 Tankyrase 저해제인 NVP-TNKS656를 처리하여 트립판 블루 염색 배제 방법으로 세포사멸 정도를 분석한 결과, p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 세포주 RKO에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 JPI-547의 세포사멸을 관찰할 수 있었고 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립과 Tankyrase 저해제인 NVP-TNKS656에 의한 세포사멸이 모두 변화 없는 것이 관찰되었다(도 11a). p53이 돌연변이형이고 LIG4가 정상형인 세포주 SW620, p53과 LIG4 유전자형이 정상형인 세포주 HCT8, p53과 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 세포주 KM12C 경우에는 JPI-283과 JPI-547 및 PARP 저해제인 올라파립과 Tankyrase 저해제인 NVP-TNKS656에 의한 세포사멸이 일어나지 않는 것을 보아 p53이 정상형이고 LIG4가 돌연변이형인 경우에만 JPI-283 및 JPI-547에 의한 세포사멸을 보여준다(도 11a 내지 11d).
실시예 16: p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 세포주 RKO 에서 p53 돌연변이형 및 LIG4 정상형 과발현에 따른 JPI -547에 대한 세포사멸 분석
본 발명자들은 실시예 12과 같이 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형일 경우 돌연변이형 p53 및 정상형 LIG4의 발현에 따른 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547의 세포사멸 정도를 분석하고자 p53 유전자가 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 RKO 인간 대장암 세포주에 p53 돌연변이형 및 LIG4 정상형을 각각 과 발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리 한 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 정상형이면서 LIG4 유전자가 돌연변이형인 RKO 인간 대장암 세포주를 실시예 12과 동일한 조건으로 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 p53 돌연변이형 플라스미드 DNA와 LIG4 유전자형이 정상형인 플라스미드 DNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 과 발현 시킨 후 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 각각 25 μM 및 50 μM 처리하고 48시간 배양 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
실험 결과
p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 인간 대장암 세포주 RKO에서 p53 돌연변이형 유전자를 과발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리하여 트립판 블루 염색 배제 방법으로 세포사멸 정도를 결과, p53 돌연변이형 유전자를 삽입하지 않은 대조군(empty)과 비교하여 p53 돌연변이형 유전자를 과발현하였을 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283에 의한 세포사멸이 감소되는 것이 관찰되었다(도 12a). p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 인간 대장암 세포주 RKO에서 LIG4 정상형 유전자를 과발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리하여 트립판 블루 염색 배제 방법으로 세포사멸 정도를 결과, LIG4 정상형 유전자를 삽입하지 않은 대조군(empty)과 비교하여 LIG4 정상형 유전자를 과발현하였을 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547에 의한 세포사멸이 감소되는 것이 관찰되어 p53이 정상형이고 LIG4가 돌연변이형일 경우 JPI-547에 세포사멸이 가장 높은 것을 보여준다(도 12a 및 12b).
실시예 17: p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 세포주 LoVo 에서 p53 돌연변이형 및 LIG4 정상형 과발현에 따른 JPI-547에 대한 세포사멸 분석
본 발명자들은 실시예 12과 같이 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형일 경우 돌연변이형 p53 및 정상형 LIG4의 발현에 따른 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547의 세포사멸 정도를 분석하고자 p53 유전자가 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 LoVo 인간 대장암 세포주에 p53 돌연변이형 및 LIG4 정상형을 각각 과발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리 한 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 실시예 12의 RKO 세포 배양 및 트랜스펙션 방법과 동일하다. 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 각각 25 μM 및 50 μM 처리하고 48시간 배양 후 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
실험 결과
p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 인간 대장암 세포주 LoVo에서 p53 돌연변이형 유전자를 과 발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리하여 트립판 블루 염색 배제 방법으로 세포사멸 정도를 결과, p53 돌연변이형 유전자를 삽입하지 않은 대조군(empty)과 비교하여 p53 돌연변이형 유전자를 과발현하였을 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547에 의한 세포사멸이 감소되는 것이 관찰되고 (도 13a), p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 인간 대장암 세포주 LoVo에서 LIG4 정상형 유전자를 과발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리하여 트립판 블루 염색 배제 방법으로 세포사멸 정도를 결과, LIG4 정상형 유전자를 삽입하지 않은 대조군(empty)과 비교하여 LIG4 정상형 유전자를 과발현하였을 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547에 의한 세포사멸이 감소되는 것이 관찰되어(도 13b) p53이 정상형이고 LIG4가 돌연변이형일 경우 JPI-547에 세포사멸이 가장 높은 것을 보여준다(도 13a 및 13b).
실시예 18: p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 세포주 LoVo 에서 p53 돌연변이형 및 LIG4 정상형 과발현에 따른 JPI -547에 대한 DNA 손상 및 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형일 경우 돌연변이형 p53 및 정상형 LIG4의 발현에 따른 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547의 DNA 손상 정도와 세포사멸 정도를 분석하고자 p53 유전자가 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 LoVo 인간 대장암 세포주를 실시예　17과 동일한 조건으로 배양 및 처리하여 웨스턴블럿 방법으로 r-H2AX의 발현 정도로 DNA 손상 여부를 확인하고 절단형 카스페이즈 3(cleaved caspase 3)의 발현 정도로 세포사멸 정도를 실시예 11과 동일한 방법으로 확인하였다.
실험 결과
p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 인간 대장암 세포주 LoVo에서 p53 돌연변이형 유전자를 과발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리하여 DNA의 손상 정도와 세포사멸 정도를 웨스턴블럿으로 r-H2AX과 절단형 카스페이즈 3(cleaved caspase 3)의 발현양을 관찰한 결과, p53 돌연변이형 유전자를 삽입하지 않은 대조군(empty)과 비교하여 p53 돌연변이형 유전자를 과발현하였을 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547에 의한 r-H2AX 발현과 절단형 카스페이즈 3(cleaved caspase 3)의 발현양이 감소되는 것이 관찰되고(도 14a), p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 인간 대장암 세포주 LoVo에서 LIG4 정상형 유전자를 과발현하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 DNA의 손상 정도와 세포사멸 정도를 웨스턴블럿으로 r-H2AX과 절단형 카스페이즈 3(cleaved caspase 3)의 발현양을 관찰한 결과, LIG4 정상형 유전자를 삽입하지 않은 대조군(empty)과 비교하여 LIG4 정상형 유전자를 과발현하였을 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547에 의한 r-H2AX 발현과 절단형 카스페이즈 3(cleaved caspase 3)의 발현양이 감소되는 것이 관찰되어(도 14b), p53이 정상형이고 LIG4가 돌연변이형일 경우에만 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547의 DNA 손상과 세포사멸을 유도하는 것을 보여준다(도 14).
실시예 19: p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 세포주 RKO 를 이용한 이종이식 동물 모델에서의 JPI-283과 올라파립에 대한 종양 억제 효능 분석
본 발명자들은 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형일 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 올라파립에 대한 인 비보 동물 모델에서의 종양 억제 효능을 분석하고자 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 RKO 인간 대장암 세포주를 6주령 자성 누드마우스(BALB/c-nude, 중앙실험동물 구입)에 이식하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 투여 한 후 종양의 크기를 측정하여 종양 억제 효능 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 정상형이면서 LIG4 유전자가 돌연변이형인 RKO 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 1×107 개씩 누드마우스에 이식한 후 종양의 크기가 100 ㎣이 되었을 때 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 각각 25 mpk 및 50 mpk 씩 총 27일 동안 매일 경구 투여하고 3일마다 종양의 크기를 측정하고 약물투여 종료 후 종양을 적출하여 무게를 측정하였다.
실험 결과
p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 인간 대장암 세포주 RKO에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 투여하여 종양 억제 효능 정도를 관찰한 결과, 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 종양억제 효능이 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립 투여군 보다 종양의 크기가 감소되고 종양의 무게 또한 감소되는 것으로 보아 p53이 정상형이고 LIG4가 돌연변이형일 경우에는 JPI-283에 대한 종양 억제 효능이 일어나는 것을 보여준다(도 15a 및 15b).
실시예 20: p53 유전자형이 돌연변이형이고 LIG4 유전자형이 정상형인 세포주 SW620 를 이용한 이종이식 동물 모델에서의 JPI-283과 올라파립에 대한 종양 억제 효능 분석
본 발명자들은 p53 유전자형이 돌연변이형이고 LIG4 유전자형이 정상형일 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283의 인 비보 동물 모델에서의 종양 억제 효능을 분석하고자 p53 유전자형이 돌연변이형이고 LIG4 유전자형이 정상형인 SW620 인간 대장암 세포주를 6주령 자성 누드마우스(BALB/c-nude, 중앙실험동물 구입)에 이식하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립 투여 한 후 종양의 크기를 측정하여 종양 억제 효능 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 돌연변이형이면서 LIG4 유전자가 정상형인 SW620 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 1×107 개씩 누드마우스에 이식한 후 종양의 크기가 100 ㎣이 되었을 때 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283과 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 각각 25 mpk 및 50mpk 씩 총 27일 동안 매일 경구 투여하고 3일마다 종양의 크기를 측정하고 약물투여 종료 후 종양을 적출하여 무게를 측정하였다.
실험 결과
p53 유전자형이 돌연변이형이고 LIG4 유전자형이 정상형인 인간 대장암 세포주 SW620에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 투여하여 종양 억제 효능 정도를 관찰한 결과, 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립에 의한 종양 크기와 무게 모두 변화 없는 것이 관찰되어 p53이 돌연변이형이고 LIG4가 정상형일 경우에는 JPI-283과 올라파립에 대한 종양 억제 효능이 일어나지 않는 것을 보여준다(도 16a 및 16b).
실시예 21: p53 유전자형과 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 세포주 KM12C 를 이용한 이종이식 동물 모델에서의 JPI -283에 대한종양 억제 효능 분석
본 발명자들은 p53 유전자형과 LIG4 유전자형이 돌연변이형일 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283에 대한 인 비보 동물 모델에서의 종양 억제 효능을 분석하고자 p53 유전자형과 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 KM12C 인간 대장암 세포주를 6주령 자성 누드마우스(BALB/c-nude, 중앙실험동물 구입)에 이식하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 투여 한 후 종양의 크기를 측정하여 종양 억제 효능 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자와 LIG4 유전자가 돌연변이형인 KM12C 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 1×107 개씩 누드마우스에 이식한 후 종양의 크기가 100 ㎣이 되었을 때 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 각각 25 mpk 및 50 mpk 씩 총 18일 동안 매일 경구 투여하고 3일마다 종양의 크기를 측정하고 약물투여 종료 후 종양을 적출하여 무게를 측정하였다.
실험 결과
p53 유전자형과 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 인간 대장암 세포주 KM12C에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 투여하여 종양 억제 효능 정도를 관찰한 결과, 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-283 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립에 의한 종양 크기 및 무게도 모두 변화 없는 것이 관찰되어 p53과 LIG4가 모두 돌연변이형일 경우에는JPI-283과 올라파립에 대한 종양 억제 효능이 일어나지 않는 것을 보여준다(도 17a 및 17b).
실시예 22: p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 세포주 RKO 를 이용한 이종이식 동물 모델에서의 JPI-547 및 올라파립에 대한 종양 억제 효능 분석
본 발명자들은 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형일 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547과 올라파립에 대한 인 비보 동물 모델에서의 종양 억제 효능을 분석하고자 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 RKO 인간 대장암 세포주를 6주령 자성 누드마우스(BALB/c-nude, 중앙실험동물 구입)에 이식하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547과 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 투여 한 후 종양의 크기를 측정하여 종양 억제 효능 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 정상형이면서 LIG4 유전자가 돌연변이형인 RKO 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 1×107 개씩 누드마우스에 이식한 후 종양의 크기가 100 ㎣이 되었을 때 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547과 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 각각 25 mpk 및 50mpk 씩 총 27일 동안 매일 경구 투여하고 3일마다 종양의 크기를 측정하고 약물투여 종료 후 종양을 적출하여 무게를 측정하였다.
실험 결과
p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 인간 대장암 세포주 RKO에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547과 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 투여하여 종양 억제 효능 정도를 관찰한 결과, 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547의 종양억제 효능이 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립 투여군 보다 종양의 크기가 감소되고 종양의 무게 또한 감소되는 것으로 보아 p53이 정상형이고 LIG4가 돌연변이형일 경우에는 JPI-547에 대한 종양 억제 효능이 일어나는 것을 보여준다(도 18a 및 18b).
실시예 23: p53 유전자형과 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 세포주 KM12C 를 이용한 이종이식 동물 모델에서의 JPI-547에 대한종양 억제 효능 분석
본 발명자들은 p53 유전자형과 LIG4 유전자형이 돌연변이형일 경우 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547에 대한 인 비보 동물 모델에서의 종양 억제 효능을 분석하고자 p53 유전자형과 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 KM12C 인간 대장암 세포주를 6주령 자성 누드마우스(BALB/c-nude, 중앙실험동물 구입)에 이식하여 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547을 투여 한 후 종양의 크기를 측정하여 종양 억제 효능 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자와 LIG4 유전자가 돌연변이형인 KM12C 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 1×107 개씩 누드마우스에 이식한 후 종양의 크기가 100 ㎣이 되었을 때 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547을 각각 25 mpk 및 50 mpk 씩 총 15일 동안 매일 경구 투여하고 3일마다 종양의 크기를 측정하고 약물투여 종료 후 종양을 적출하여 무게를 측정하였다.
실험 결과
p53 유전자형과 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 인간 대장암 세포주 KM12C에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547을 투여하여 종양 억제 효능 정도를 관찰한 결과, 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547에 의한 종양 크기 및 무게 모두 변화 없는 것이 관찰되어 p53과 LIG4가 모두 돌연변이형일 경우에는 JPI-547에 대한 종양 억제 효능이 일어나지 않는 것을 보여준다(도 19a 및 19b).
실시예 24: 대장암 환자 유래 세포에서의 LIG4 유전자형 분석
본 발명자들은 대장암 환자 유래 세포에서의 LIG4 유전형을 확인하기 위하여 36개의 대장암 환자 유래 세포주에서 LIG4의 유전자형을 RT-PCR과 시퀀싱을 통해 변이/결핍 여부를 분석하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 36개의 대장암 환자 유래 세포주를 각각 균질기(homogenizer)로 트라이졸(Trizol) RNA 추출법을 이용하여 총 RNA를 추출하여 500 ng의 총 RNA를 cDNA로 재 합성하여 LIG4 프라이머(서열목록 제12서열; LIG4 프라이머 Exon1-1 정방향 프라이머 5'-TTGCTTTACTAGTTAAACGAGAAGATTCA-3', 서열목록 제13서열; LIG4 프라이머 Exon1-1 역방향 프라이머 5'-TTCGTTCTAAAGTTGAACACAAATCTG-3', 서열목록 제8서열; LIG4 프라이머 Exon2-1 정방향 프라이머 5'-GCTAGCTGCTATTGCAGATATTGAGC-3', 서열목록 제9서열; LIG4 프라이머 Exon2-1 역방향 프라이머 5'-AGAACCTTCAGTAGGAGAAGCACCAA-3', 서열목록 제10서열; LIG4 프라이머 Exon2-2 정방향 프라이머 5'-CCTGGTGAGAAGCCATCTGT-3', 서열목록 제11서열; LIG4 프라이머 Exon2-2 역방향 프라이머 5'-GCCTTCCCCCTAAGTTGTTC-3')를 이용하여 PCR을 수행하여 1% 아가로즈 겔에 전기영동 후 Et-Br 염색을 통하여 LIG4의 발현이 확인된 PCR 생산물을 생거 시퀀싱법(sanger sequencing)을 통하여 돌연변이 분석을 확인하였다.
실험 결과
36개의 대장암 환자 유래 세포주에서 LIG4의 C8, C27, G833 및 T1704 부위의 돌연변이를 분석한 결과 14개의 대장암 환자 유래 세포주에서 LIG4의 돌연변이가 분석 되었다(표 5).
Figure pat00004
실시예 25: 대장암 환자 조직에서의 LIG4 유전자형 분석
본 발명자들은 대장암 환자 조직에서의 LIG4 유전형을 확인하기 위하여 39개의 대장암 환자 유래 조직에서 LIG4의 유전자형을 RT-PCR과 시퀀싱을 통해 변이/결핍 여부를 분석하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 39개의 대장암 환자 유래 조직을 각각 균질기(homogenizer)로 트라이졸(Trizol) RNA 추출법을 이용하여 총 RNA를 추출하여 500 ng의 총 RNA를 cDNA로 재 합성하여 LIG4 프라이머(서열목록 제12서열; LIG4 프라이머 Exon1-1 정방향 프라이머 5'-TTGCTTTACTAGTTAAACGAGAAGATTCA-3', 서열목록 제13서열; LIG4 프라이머 Exon1-1 역방향 프라이머 5'-TTCGTTCTAAAGTTGAACACAAATCTG-3', 서열목록 제8서열; LIG4 프라이머 Exon2-1 정방향 프라이머 5'-GCTAGCTGCTATTGCAGATATTGAGC-3', 서열목록 제9서열; LIG4 프라이머 Exon2-1 역방향 프라이머 5'-AGAACCTTCAGTAGGAGAAGCACCAA-3', 서열목록 제10서열; LIG4 프라이머 Exon2-2 정방향 프라이머 5'-CCTGGTGAGAAGCCATCTGT-3', 서열목록 제11서열; LIG4 프라이머 Exon2-2 역방향 프라이머 5'-GCCTTCCCCCTAAGTTGTTC-3')를 이용하여 PCR을 수행하여 1% 아가로즈 겔에 전기영동 후 Et-Br 염색을 통하여 LIG4의 발현이 확인된 PCR 생산물을 생거 시퀀싱법(sanger sequencing)을 통하여 돌연변이 분석을 확인하였다.
실험 결과
39개의 대장암 환자 조직에서 LIG4의 C8, C27, G833 및 T1704 부위의 돌연변이를 분석한 결과 9개의 대장암 환자 조직에서 LIG4의 돌연변이가 분석 되었다(표 6).
Figure pat00005
실시예 26: p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 정상형 또는 돌연변이형인 대장암 환자 유래 세포에서의 약물 효능 분석
본 발명자들은 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 정상형 또는 돌연변이형인 대장암 환자 유래 세포 11-CT-79558D(p53 WT/LIG4 MT), 11-CT-80464B(p53 WT/LIG4 MT)와 11CT-94575(p53 WT/LIG4 WT), 13CT-78649B(p53 WT/LIG4 WT)에에서 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547의 약물 효능 정도를 분석하고자 p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 각기 다른 4종의 인간 대장암 환자 유래 세포를 REBM(Renal Growth Basal Medium; 5% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 배양하여 60 ㎜ 플레이트에 웰 당 1×105 개씩 37℃에서 24시간 배양하고 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 각각 25 μM 및 50 μM 처리하고 48시간 배양 후 세포 모양의 변화를 분석하여 약물 효능을 확인하였다.
실험 결과
p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 서로 다른 인간 대장암 환자 유래 세포를 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547 및 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립을 처리하여 현미경을 이용하여 세포 모양의 변화 정도를 관찰한 결과, p53 유전자형이 정상형이고 LIG4 유전자형이 돌연변이형인 대장암 환자 유래 세포 11-CT-79558D(p53 WT/LIG4 MT) 및 11-CT-80464B(p53 WT/LIG4 MT)에서만 신규 PARP/Tankyrase 동시 저해제인 JPI-547에 대한 세포 모양이 사멸되는 것을 관찰할 수 있었고 경쟁약물로 PARP 저해제인 올라파립에서는 세포의 모양 변화가 없는 것이 관찰되어 p53이 정상형이고 LIG4가 돌연변이형인 경우에만 JPI-547에 의한 세포사멸에 대한 약물 반응을 보여준다(도 20).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> THE ASAN FOUNDATION <120> Method for Determining Susceptibility to Dual Inhibitor against PARP and Tankyrase <130> PN150117 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1182 <212> DNA <213> Nucleotide sequence of p53 <400> 1 atggaggagc cgcagtcaga tcctagcgtc gagccccctc tgagtcagga aacattttca 60 gacctatgga aactacttcc tgaaaacaac gttctgtccc ccttgccgtc ccaagcaatg 120 gatgatttga tgctgtcccc ggacgatatt gaacaatggt tcactgaaga cccaggtcca 180 gatgaagctc ccagaatgcc agaggctgct ccccccgtgg cccctgcacc agcagctcct 240 acaccggcgg cccctgcacc agccccctcc tggcccctgt catcttctgt cccttcccag 300 aaaacctacc agggcagcta cggtttccgt ctgggcttct tgcattctgg gacagccaag 360 tctgtgactt gcacgtactc ccctgccctc aacaagatgt tttgccaact ggccaagacc 420 tgccctgtgc agctgtgggt tgattccaca cccccgcccg gcacccgcgt ccgcgccatg 480 gccatctaca agcagtcaca gcacatgacg gaggttgtga ggcgctgccc ccaccatgag 540 cgctgctcag atagcgatgg tctggcccct cctcagcatc ttatccgagt ggaaggaaat 600 ttgcgtgtgg agtatttgga tgacagaaac acttttcgac atagtgtggt ggtgccctat 660 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacat gtgtaacagt 720 tcctgcatgg gcggcatgaa ccggaggccc atcctcacca tcatcacact ggaagactcc 780 agtggtaatc tactgggacg gaacagcttt gaggtgcgtg tttgtgcctg tcctgggaga 840 gaccggcgca cagaggaaga gaatctccgc aagaaagggg agcctcacca cgagctgccc 900 ccagggagca ctaagcgagc actgcccaac aacaccagct cctctcccca gccaaagaag 960 aaaccactgg atggagaata tttcaccctt cagatccgtg ggcgtgagcg cttcgagatg 1020 ttccgagagc tgaatgaggc cttggaactc aaggatgccc aggctgggaa ggagccaggg 1080 gggagcaggg ctcactccag ccacctgaag tccaaaaagg gtcagtctac ctcccgccat 1140 aaaaaactca tgttcaagac agaagggcct gactcagact ga 1182 <210> 2 <211> 2736 <212> DNA <213> Nucleotide sequence of LIG4 <400> 2 atggctgcct cacaaacttc acaaactgtt gcatctcacg ttccttttgc agatttgtgt 60 tcaactttag aacgaataca gaaaagtaaa ggacgtgcag aaaaaatcag acacttcagg 120 gaatttttag attcttggag aaaatttcat gatgctcttc ataagaacca caaagatgtc 180 acagactctt tttatccagc aatgagacta attcttcctc agctagaaag agagagaatg 240 gcctatggaa ttaaagaaac tatgcttgct aagctttata ttgagttgct taatttacct 300 agagatggaa aagatgccct caaactttta aactacagaa cacccactgg aactcatgga 360 gatgctggag actttgcaat gattgcatat tttgtgttga agccaagatg tttacagaaa 420 ggaagtttaa ccatacagca agtaaacgac cttttagact caattgccag caataattct 480 gctaaaagaa aagacctaat aaaaaagagc cttcttcaac ttataactca gagttcagca 540 cttgagcaaa agtggcttat acggatgatc ataaaggatt taaagcttgg tgttagtcag 600 caaactatct tttctgtttt tcataatgat gctgctgagt tgcataatgt cactacagat 660 ctggaaaaag tctgtaggca actgcatgat ccttctgtag gactcagtga tatttctatc 720 actttatttt ctgcatttaa accaatgcta gctgctattg cagatattga gcacattgag 780 aaggatatga aacatcagag tttctacata gaaaccaagc tagatggtga acgtatgcaa 840 atgcacaaag atggagatgt atataaatac ttctctcgaa atggatataa ctacactgat 900 cagtttggtg cttctcctac tgaaggttct cttaccccat tcattcataa tgcattcaaa 960 gcagatatac aaatctgtat tcttgatggt gagatgatgg cctataatcc taatacacaa 1020 actttcatgc aaaagggaac taagtttgat attaaaagaa tggtagagga ttctgatctg 1080 caaacttgtt attgtgtttt tgatgtattg atggttaata ataaaaagct agggcatgag 1140 actctgagaa agaggtatga gattcttagt agtattttta caccaattcc aggtagaata 1200 gaaatagtgc agaaaacaca agctcatact aagaatgaag taattgatgc attgaatgaa 1260 gcaatagata aaagagaaga gggaattatg gtaaaacaac ctctatccat ctacaagcca 1320 gacaaaagag gtgaagggtg gttaaaaatt aaaccagagt atgtcagtgg actaatggat 1380 gaattggaca ttttaattgt tggaggatat tggggtaaag gatcacgggg tggaatgatg 1440 tctcattttc tgtgtgcagt agcagagaag ccccctcctg gtgagaagcc atctgtgttt 1500 catactctct ctcgtgttgg gtctggctgc accatgaaag aactgtatga tctgggtttg 1560 aaattggcca agtattggaa gccttttcat agaaaagctc caccaagcag cattttatgt 1620 ggaacagaga agccagaagt atacattgaa ccttgtaatt ctgtcattgt tcagattaaa 1680 gcagcagaga tcgtacccag tgatatgtat aaaactggct gcaccttgcg ttttccacga 1740 attgaaaaga taagagatga caaggagtgg catgagtgca tgaccctgga cgacctagaa 1800 caacttaggg ggaaggcatc tggtaagctc gcatctaaac acctttatat aggtggtgat 1860 gatgaaccac aagaaaaaaa gcggaaagct gccccaaaga tgaagaaagt tattggaatt 1920 attgagcact taaaagcacc taaccttact aacgttaaca aaatttctaa tatatttgaa 1980 gatgtagagt tttgtgttat gagtggaaca gatagccagc caaagcctga cctggagaac 2040 agaattgcag aatttggtgg ttatatagta caaaatccag gcccagacac gtactgtgta 2100 attgcagggt ctgagaacat cagagtgaaa aacataattt tgtcaaataa acatgatgtt 2160 gtcaagcctg catggctttt agaatgtttt aagaccaaaa gctttgtacc atggcagcct 2220 cgctttatga ttcatatgtg cccatcaacc aaagaacatt ttgcccgtga atatgattgc 2280 tatggtgata gttatttcat tgatacagac ttgaaccaac tgaaggaagt attctcagga 2340 attaaaaatt ctaacgagca gactcctgaa gaaatggctt ctctgattgc tgatttagaa 2400 tatcggtatt cctgggattg ctctcctctc agtatgtttc gacgccacac cgtttatttg 2460 gactcgtatg ctgttattaa tgacctgagt accaaaaatg aggggacaag gttagctatt 2520 aaagccttgg agcttcggtt tcatggagca aaagtagttt cttgtttagc tgagggagtg 2580 tctcatgtaa taattgggga agatcatagt cgtgttgcag attttaaagc ttttagaaga 2640 acttttaaga gaaagtttaa aatcctaaaa gaaagttggg taactgattc aatagacaag 2700 tgtgaattac aagaagaaaa ccagtatttg atttaa 2736 <210> 3 <211> 911 <212> PRT <213> Amino acid sequence of LIG4 <400> 3 Met Ala Ala Ser Gln Thr Ser Gln Thr Val Ala Ser His Val Pro Phe 1 5 10 15 Ala Asp Leu Cys Ser Thr Leu Glu Arg Ile Gln Lys Ser Lys Gly Arg 20 25 30 Ala Glu Lys Ile Arg His Phe Arg Glu Phe Leu Asp Ser Trp Arg Lys 35 40 45 Phe His Asp Ala Leu His Lys Asn His Lys Asp Val Thr Asp Ser Phe 50 55 60 Tyr Pro Ala Met Arg Leu Ile Leu Pro Gln Leu Glu Arg Glu Arg Met 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Ile Lys Glu Thr Met Leu Ala Lys Leu Tyr Ile Glu Leu 85 90 95 Leu Asn Leu Pro Arg Asp Gly Lys Asp Ala Leu Lys Leu Leu Asn Tyr 100 105 110 Arg Thr Pro Thr Gly Thr His Gly Asp Ala Gly Asp Phe Ala Met Ile 115 120 125 Ala Tyr Phe Val Leu Lys Pro Arg Cys Leu Gln Lys Gly Ser Leu Thr 130 135 140 Ile Gln Gln Val Asn Asp Leu Leu Asp Ser Ile Ala Ser Asn Asn Ser 145 150 155 160 Ala Lys Arg Lys Asp Leu Ile Lys Lys Ser Leu Leu Gln Leu Ile Thr 165 170 175 Gln Ser Ser Ala Leu Glu Gln Lys Trp Leu Ile Arg Met Ile Ile Lys 180 185 190 Asp Leu Lys Leu Gly Val Ser Gln Gln Thr Ile Phe Ser Val Phe His 195 200 205 Asn Asp Ala Ala Glu Leu His Asn Val Thr Thr Asp Leu Glu Lys Val 210 215 220 Cys Arg Gln Leu His Asp Pro Ser Val Gly Leu Ser Asp Ile Ser Ile 225 230 235 240 Thr Leu Phe Ser Ala Phe Lys Pro Met Leu Ala Ala Ile Ala Asp Ile 245 250 255 Glu His Ile Glu Lys Asp Met Lys His Gln Ser Phe Tyr Ile Glu Thr 260 265 270 Lys Leu Asp Gly Glu Arg Met Gln Met His Lys Asp Gly Asp Val Tyr 275 280 285 Lys Tyr Phe Ser Arg Asn Gly Tyr Asn Tyr Thr Asp Gln Phe Gly Ala 290 295 300 Ser Pro Thr Glu Gly Ser Leu Thr Pro Phe Ile His Asn Ala Phe Lys 305 310 315 320 Ala Asp Ile Gln Ile Cys Ile Leu Asp Gly Glu Met Met Ala Tyr Asn 325 330 335 Pro Asn Thr Gln Thr Phe Met Gln Lys Gly Thr Lys Phe Asp Ile Lys 340 345 350 Arg Met Val Glu Asp Ser Asp Leu Gln Thr Cys Tyr Cys Val Phe Asp 355 360 365 Val Leu Met Val Asn Asn Lys Lys Leu Gly His Glu Thr Leu Arg Lys 370 375 380 Arg Tyr Glu Ile Leu Ser Ser Ile Phe Thr Pro Ile Pro Gly Arg Ile 385 390 395 400 Glu Ile Val Gln Lys Thr Gln Ala His Thr Lys Asn Glu Val Ile Asp 405 410 415 Ala Leu Asn Glu Ala Ile Asp Lys Arg Glu Glu Gly Ile Met Val Lys 420 425 430 Gln Pro Leu Ser Ile Tyr Lys Pro Asp Lys Arg Gly Glu Gly Trp Leu 435 440 445 Lys Ile Lys Pro Glu Tyr Val Ser Gly Leu Met Asp Glu Leu Asp Ile 450 455 460 Leu Ile Val Gly Gly Tyr Trp Gly Lys Gly Ser Arg Gly Gly Met Met 465 470 475 480 Ser His Phe Leu Cys Ala Val Ala Glu Lys Pro Pro Pro Gly Glu Lys 485 490 495 Pro Ser Val Phe His Thr Leu Ser Arg Val Gly Ser Gly Cys Thr Met 500 505 510 Lys Glu Leu Tyr Asp Leu Gly Leu Lys Leu Ala Lys Tyr Trp Lys Pro 515 520 525 Phe His Arg Lys Ala Pro Pro Ser Ser Ile Leu Cys Gly Thr Glu Lys 530 535 540 Pro Glu Val Tyr Ile Glu Pro Cys Asn Ser Val Ile Val Gln Ile Lys 545 550 555 560 Ala Ala Glu Ile Val Pro Ser Asp Met Tyr Lys Thr Gly Cys Thr Leu 565 570 575 Arg Phe Pro Arg Ile Glu Lys Ile Arg Asp Asp Lys Glu Trp His Glu 580 585 590 Cys Met Thr Leu Asp Asp Leu Glu Gln Leu Arg Gly Lys Ala Ser Gly 595 600 605 Lys Leu Ala Ser Lys His Leu Tyr Ile Gly Gly Asp Asp Glu Pro Gln 610 615 620 Glu Lys Lys Arg Lys Ala Ala Pro Lys Met Lys Lys Val Ile Gly Ile 625 630 635 640 Ile Glu His Leu Lys Ala Pro Asn Leu Thr Asn Val Asn Lys Ile Ser 645 650 655 Asn Ile Phe Glu Asp Val Glu Phe Cys Val Met Ser Gly Thr Asp Ser 660 665 670 Gln Pro Lys Pro Asp Leu Glu Asn Arg Ile Ala Glu Phe Gly Gly Tyr 675 680 685 Ile Val Gln Asn Pro Gly Pro Asp Thr Tyr Cys Val Ile Ala Gly Ser 690 695 700 Glu Asn Ile Arg Val Lys Asn Ile Ile Leu Ser Asn Lys His Asp Val 705 710 715 720 Val Lys Pro Ala Trp Leu Leu Glu Cys Phe Lys Thr Lys Ser Phe Val 725 730 735 Pro Trp Gln Pro Arg Phe Met Ile His Met Cys Pro Ser Thr Lys Glu 740 745 750 His Phe Ala Arg Glu Tyr Asp Cys Tyr Gly Asp Ser Tyr Phe Ile Asp 755 760 765 Thr Asp Leu Asn Gln Leu Lys Glu Val Phe Ser Gly Ile Lys Asn Ser 770 775 780 Asn Glu Gln Thr Pro Glu Glu Met Ala Ser Leu Ile Ala Asp Leu Glu 785 790 795 800 Tyr Arg Tyr Ser Trp Asp Cys Ser Pro Leu Ser Met Phe Arg Arg His 805 810 815 Thr Val Tyr Leu Asp Ser Tyr Ala Val Ile Asn Asp Leu Ser Thr Lys 820 825 830 Asn Glu Gly Thr Arg Leu Ala Ile Lys Ala Leu Glu Leu Arg Phe His 835 840 845 Gly Ala Lys Val Val Ser Cys Leu Ala Glu Gly Val Ser His Val Ile 850 855 860 Ile Gly Glu Asp His Ser Arg Val Ala Asp Phe Lys Ala Phe Arg Arg 865 870 875 880 Thr Phe Lys Arg Lys Phe Lys Ile Leu Lys Glu Ser Trp Val Thr Asp 885 890 895 Ser Ile Asp Lys Cys Glu Leu Gln Glu Glu Asn Gln Tyr Leu Ile 900 905 910 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> ATR siRNA <400> 4 gaguucucag aagucaacc 19 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> XLF siRNA <400> 5 cgcugauucg agaucgauug a 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> XRCC4 siRNA <400> 6 cugaucucuc uggguuggcu u 21 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> LIG4 siRNA <400> 7 gggagugucu cauguaaua 19 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> LIG4 Exon2-1 Forward primer <400> 8 gctagctgct attgcagata ttgagc 26 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> LIG4 Exon2-1 Reverse primer <400> 9 agaaccttca gtaggagaag caccaa 26 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> LIG4 Exon2-2 Forward primer <400> 10 cctggtgaga agccatctgt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> LIG4 Exon2-2 Reverse primer <400> 11 gccttccccc taagttgttc 20 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> LIG4 Exon1-1 Forward primer <400> 12 ttgctttact agttaaacga gaagattca 29 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> LIG4 Exon1-1 Reverse primer <400> 13 ttcgttctaa agttgaacac aaatctg 27

Claims (9)

  1. 다음의 단계를 포함하는 PARP(Poly ADP Ribose Polymerase) 및 탄키라제(Tankyrase) 동시 저해제에 대한 감수성(susceptibility) 결정 방법:
    (a) 대장암 환자로부터 대장암 세포를 분리하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 대장암 세포의 핵산 분자를 분리하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 핵산 분자의 p53 유전자 및 LIG4(DNA ligase 4) 유전자의 유전자형을 확인하는 단계로, 상기 p53 유전자의 유전자형이 정상형이고, 상기 LIG4 유전자의 유전자형이 돌연변이형인 경우 PARP 및 탄키라제 동시 저해제에 대하여 감수성이 있는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 DNA 시퀀싱, PCR(Polymerase Chain Reaction), RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD(Random Amplified Polymorphic Detection), AFLPD(Amplified Fragment Length Polymorphism Detection), ASO(Allele Specific Oligonucleotide) 프로브 또는 DNA 마이크로어레이에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 p53 유전자는 유전자형이 정상형인 경우에 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 LIG4 유전자는 유전자형이 정상형인 경우에 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 LIG4 유전자는 서열목록 제2서열의 8번째 염기인 시토신(cytosine)이 티민(thymine)으로 치환(substitution), 26번째 염기인 시토신(cytosine)이 티민(thymine)으로 치환, 833번째 염기인 구아닌(guanine)이 아데닌(adenine)으로 치환 및 1704번째 염기인 티민(thymine)이 시토신(cytosine)으로 치환되는 경우로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경우에 유전자형이 돌연변이형인 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 LIG4 유전자는 서열목록 제3서열의 3번째 아미노산인 알라닌(Alanine)이 발린(Valine)으로 치환, 9번째 아미노산인 트레오닌(threonine)이 이소루신(Isoleucine)으로 치환, 278번째 아미노산인 아르기닌(arginine)이 히스티딘(histidine)으로 치환 및 568번째 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid)이 티민(thymine) 염기가 시토신(cytosine)으로 치환 된 아스파르트산(aspartic acid)으로 치환되는 경우로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경우에 유전자형이 돌연변이형인 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. (a) p53 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및 (b) LIG4(DNA ligase 4) 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 PARP(Poly ADP Ribose Polymerase) 및 탄키라제(Tankyrase) 동시 저해제에 대한 감수성(susceptibility) 결정용 키트.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 p53 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열인 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 LIG4 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열인 것을 특징으로 하는 키트.
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