CN111979290B - Spp1基因在制备增强卵巢癌患者对parp抑制剂敏感性的药物中的应用 - Google Patents

Spp1基因在制备增强卵巢癌患者对parp抑制剂敏感性的药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111979290B
CN111979290B CN202010920298.3A CN202010920298A CN111979290B CN 111979290 B CN111979290 B CN 111979290B CN 202010920298 A CN202010920298 A CN 202010920298A CN 111979290 B CN111979290 B CN 111979290B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
igrov1
ovarian cancer
drug
resistant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010920298.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111979290A (zh
Inventor
程海凌
刘丕旭
易婧妍
桑晓琳
刘冲亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Hospital of Dalian Medical University
Original Assignee
Second Hospital of Dalian Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Hospital of Dalian Medical University filed Critical Second Hospital of Dalian Medical University
Priority to CN202010920298.3A priority Critical patent/CN111979290B/zh
Publication of CN111979290A publication Critical patent/CN111979290A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111979290B publication Critical patent/CN111979290B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0695—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了SPP1基因在制备增强卵巢癌患者对PARP抑制剂敏感性的药物中的应用。本发明证明了SPP1基因与卵巢癌细胞对PARP抑制剂敏感性有关，抑制SPP1基因表达的试剂可以通过下调SPP1基因表达提高卵巢癌细胞对PARP抑制剂的敏感性；此外，本发明构建了具有肿瘤干细胞特性的卵巢癌PARP抑制剂稳定耐药细胞株。SPP1基因的应用对卵巢癌细胞的耐药性逆转、卵巢癌耐药分子机制和有效联合用药方案的研究具有重要的意义。

Description

SPP1基因在制备增强卵巢癌患者对PARP抑制剂敏感性的药物 中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及SPP1基因在制备增强卵巢癌患者对PARP抑制剂敏感性的药物中的应用。
背景技术
卵巢癌是女性最常见生殖系统恶性肿瘤之一，发病率和死亡率高，且易复发，严重威胁着女性的生命健康。卵巢癌早期无明显临床表现，故多数患者确诊时已为晚期，且常伴有腹膜内转移，而晚期卵巢癌治疗困难，患者预后差，而且短期内容易复发，致死率极高，五年生存率仅为30％。卵巢癌临床治疗方式以减瘤术加术后辅助化疗为主，约70-80％卵巢癌对铂类药物为主的初次化疗有效，可暂时缓解病情，但多数化疗患者会出现耐药复发，最终高达70％的卵巢癌患者死于复发的恶性晚期卵巢癌，因此深入研究驱动卵巢癌耐药复发的分子作用机制，探寻可逆转卵巢癌耐药的抗癌新靶点对其临床治疗意义重大。肿瘤耐药细胞株已成为肿瘤基础研究的重要工具，大量临床前研究利用肿瘤耐药细胞株揭示癌细胞耐药的分子作用机制，以研发可逆转肿瘤耐药的抗癌治疗新靶点和预测抗癌治疗敏感性的生物标志物。
PARP(Poly ADP-Ribose Polymerase)是DNA修复酶，能够通过识别DNA单链断裂，启动修复活性，是肿瘤治疗的主要靶点之一。PARP抑制剂可有效阻断DNA单链断裂修复，若细胞中同时存在同源重组修复(HRR)途径的缺陷，将导致双链断裂无法修复或由错误性的非同源末端连接(NHEJ)进行修复，从而造成“合成致死效应”。此外PARP抑制剂还可以稳定PARP蛋白核DNA复合物，导致PARP滞留在DNA损伤位点(PARP trapping)，从而产生细胞毒性起到杀伤肿瘤细胞的作用。临床试验研究表明，虽然PARP抑制剂对HRR缺陷型卵巢癌疗效显著，但仍有少数患者对PARP抑制剂耐药，且多数一开始对PARP抑制剂敏感的患者，经过一段时间治疗也会出现继发性耐药，最终导致卵巢肿瘤的复发，因此深入探寻PARP抑制剂耐药分子作用机制，探寻逆转PARP抑制剂耐药的治疗新方案，将对拓展PARP抑制剂的临床应用范围意义重大。
AstraZeneca公司研发的Olaparib是到目前为止临床研究最广泛、文献报道最多的第3代PARP抑制剂。其作为口服PARP-1和PARP-2的抑制剂，在2014年12月19日被美国FDA正式批准用于治疗伴有BRCA1/2缺失的晚期卵巢恶性肿瘤，同时也是全球首个被批准的PARP抑制剂。2016年，FDA还批准了Olaparib的突破性疗法，用于治疗患有BRCA基因缺失或ATM基因突变的转移性前列腺癌患者。而我国也已于2018年8月批准Olaparib用于治疗铂敏感复发型卵巢癌维持治疗，这也是我国首个获批上市的卵巢癌靶向新药，因此研究卵巢癌细胞对Olaparib的耐药机制对临床卵巢癌的靶向治疗具有重要意义。
目前尚未见广泛用于卵巢癌靶向治疗的PARP抑制剂稳定耐药性细胞株的相关报道，并且SPP1基因在制备增强卵巢癌患者对PARP抑制剂敏感性的药物中的应用也没有相关的研究和报道。本发明首次将SPP1基因应用于增强卵巢癌患者对PARP抑制剂敏感性药物的制备，并且成功构建了具有肿瘤干细胞特性的卵巢癌PARP抑制剂耐药性细胞株。
发明内容
基于此，针对上述技术问题，本发明的目的在于提供SPP1基因在制备增强卵巢癌患者对PARP抑制剂敏感性的药物中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一种卵巢癌PARP抑制剂耐药性细胞株的构建方法。
进一步，所述的构建方法包括先梯度加药再大剂量冲击的组合筛选方法。
进一步，所述的梯度加药优选为7个浓度梯度，分别为：0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM、12μM、15-16μM。
进一步，所述的大剂量冲击优选为50μM的药物浓度处理卵巢癌细胞。
进一步，所述的卵巢癌细胞包括IGROV1细胞、Hey细胞、SKOV-3细胞、SKOV-3/DDP细胞、A2780细胞、HO8910细胞、3AO细胞、OVCAR3细胞、OVCA433细胞、PEA-1细胞、PEO-1细胞、F9细胞、OVCA420细胞、OVCA429细胞，优选为IGROV1细胞。
在本发明的实施例中，采用所述的先梯度加药再大剂量冲击的组合筛选方法建立耐药性细胞株，不仅更好地模拟了临床肿瘤患者的治疗过程，同时也最大程度地兼容了梯度加药和大剂量冲击两种方法。
本发明的第二方面提供了根据本发明第一方面所述的构建方法构建的卵巢癌PARP抑制剂耐药性细胞株。
进一步，所述细胞株保藏于大连医科大学附属第二医院，地址：中国，大连。
优选地，所述细胞株具有肿瘤干细胞的特性。
更优选地，所述细胞株中SPP1基因高表达。
在本发明的实施例中，所述细胞株制备完成后，在不含PARP抑制剂的完全培养基中脱药培养，对其进行了一个月的撤药处理，保证了细胞的稳定耐药性，之后通过96孔板有限稀释法分离出单克隆耐药性细胞株，最大程度地保证了耐药性细胞株作为研究工具的单一背景。
在本发明的实施例中，对所述的细胞株进行了形态学观察和生物学特性鉴定，检测了所述细胞株对PARP抑制剂药物的敏感性，检测了所述细胞株经PARP抑制剂药物治疗后细胞内DNA断裂损伤情况。
优选地，所述细胞株对PARP抑制剂药物的敏感性是通过细胞克隆形成实验和3D成球培养实验来进行检测的。
更优选地，所述细胞株经PARP抑制剂药物治疗后细胞内DNA断裂损伤情况是通过免疫荧光实验检测DNA损伤标记蛋白γH2AX的表达水平来反映的。
在本发明的实施例中，通过检测所述细胞株中ALDH1A1和SPP1的表达对所述细胞株的肿瘤干细胞的特性进行了评估。
进一步，所述ALDH1A1的基因ID为：Entrez Gene:216，所述SPP1的基因ID为：Entrez Gene:6696。
优选地，所述细胞株的肿瘤干细胞的特性是通过转录组学测序和实时荧光定量PCR来进行检测分析的。
本发明的第三方面提供了本发明第二方面所述的细胞株在研究肿瘤干细胞模型中的应用。
进一步，所述的肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。其对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用，肿瘤干细胞可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，因此肿瘤往往在常规肿瘤治疗方法消灭大部分普通肿瘤细胞后的一段时间内复发。本发明所述的细胞株具有肿瘤干细胞的特性，因此其在研究肿瘤干细胞模型中具有重要应用。
本发明的第四方面提供了SPP1基因在制备增强卵巢癌患者对PARP抑制剂敏感性的药物中的应用。
进一步，所述PARP抑制剂包括Olaparib、Rucaparib、Niraparib和Talazoparib，优选地，所述PARP抑制剂为Olaparib。
进一步，所述药物包括抑制SPP1基因表达的试剂。
进一步，所述试剂为siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、小分子化合物、肽和抗体中的一种或多种。
进一步，所述的试剂为双链分子。
进一步，所述的双链分子为siRNA。
进一步，所述siRNA是指小干扰RNA(Small interfering RNA)，又称为短干扰RNA(Short interfering RNA)或沉默RNA(Silencing RNA)，是一段20到25个核苷酸大小的双链RNA(dsRNA)，在生物学上有许多不同的用途。siRNA具有磷酸化5’末端的短双链RNA和具有两个突出核苷酸的羟基化3’末端。作为双链的核糖核酸借助Dicer酶可以将较长的双链RNA或小发夹RNA(small hairpin RNA)切成siRNA，siRNA可以经由多种不同转染(transfection)技术导入细胞内，与具有互补的序列的信使核糖核酸进行特异性结合来抑制表达，对特定基因产生具有专一性的敲弱(knockdown)效果。因此可以利用经过适当剪裁的siRNA的互补性，来对已知序列的基因进行标定，由于原则上任何基因都可以被具有互补序列的合成siRNA敲低，因此siRNA是在后基因组时代验证基因功能和药物靶向的重要工具。
进一步，所述的siRNA的序列如SEQ ID NO.5～6所示。
在本发明的实施例中，所述SPP1基因的差异表达的检测方法，包括但不限于，转录组学测序分析、高通量测序方法、northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交法、基于微球的流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)法、胶体金试纸条。优选为转录组学测序分析。
在本发明的实施例中，所述siRNA与本发明的目的信使核糖核酸进行特异性结合，来抑制SPP1基因的表达。可以以化学或酶活性学的方式合成小干扰核糖核酸，并不特别限定小干扰核糖核酸的制备方法，可使用在本领域内公知的方法进行制备。
本发明的第五方面提供了一种增强卵巢癌患者对PARP抑制剂敏感性的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包括有效量的抑制SPP1基因表达的试剂。
进一步，所述药物组合物还可以包括有效量的抗肿瘤药物及药学上可接受的载体和/或辅料。
进一步，所述载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域技术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物(例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油)，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味矫臭剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂、抗氧化剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液，诸如此类的也可加入其中，适合的药学上接受的载体及制剂在Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人，本发明的药物组合物的适合的给药剂量应考虑制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏度等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
进一步，所述药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
进一步，所述药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于，静脉内、腹膜内、眼内、动脉内、肺内、口服、小泡内、肌肉内、气管内、皮下的、局部的、吸入、通过皮肤、通过胸膜、通过粘膜、皮肤、肠胃、关节内、心室内、直肠、阴道、颅骨内、尿道内、肝内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
进一步，所述药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
除非另有定义，本发明上下文中的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。此外，对部分术语解释如下。
本文中使用的术语“肿瘤干细胞特性”通常是指肿瘤组织中少数具有自我更新和无限增殖潜能的细胞具有的相关特性，具体表现为处于未分化状态、端粒酶活性高、以对称或非对称方式分裂、表现有SP细胞特性、再生能力和肿瘤的异质性、与正常干细胞相似的归巢和迁徙途径、与正常干细胞相似的信号传导通路、与正常干细胞相似的分子标记、增殖不受控制、增殖后分化异常。
本文中使用的术语“差异表达”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较，经测定mRNA的量或水平，在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的RNA和/或所述生物标志物mRNA的一种或多种剪接变体表达水平的差异。
本发明的优点和有益效果：
(1)本发明首次将SPP1基因应用于增强卵巢癌患者对PARP抑制剂敏感性的药物的制备，该基因的应用对卵巢癌细胞的耐药性逆转、卵巢癌耐药分子机制和有效联合用药方案的研究具有重要的临床意义。
(2)本发明构建了国内外首例卵巢癌靶向治疗的PARP抑制剂稳定耐药性的细胞株，并且该细胞株具有肿瘤干细胞特性。为肿瘤干细胞在抗癌治疗耐药中的作用研究提供了重要的细胞系模型。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示卵巢癌细胞IGROV1的Olaparib耐药细胞株筛选流程图及所得到的耐药细胞株镜下观察图；
图2显示倒置相差显微镜下IGROV1亲本细胞和IGROV1-R耐药细胞的观察图(X100)，其中，A图：IGROV1亲本细胞，B图：IGROV1-R耐药细胞；
图3显示流式细胞术检测IGROV1亲本细胞和IGROV1-R耐药细胞的侧向散射特征(SSC)的结果图；
图4显示卵巢癌IGROV1亲本细胞和IGROV1-R耐药细胞在2D培养条件下，对PARP抑制剂Olaparib治疗后的结果扫描图及定量图，其中，A：结果扫描图，B：定量图；
图5显示IGROV1亲本细胞和IGROV1-R耐药细胞在3D基质胶培养条件下，对PARP抑制剂Olaparib治疗后的结果图，其中，A图：IGROV1亲本细胞，B图：IGROV1-R耐药细胞；
图6显示IGROV1亲本细胞和IGROV1-R6/9耐药细胞经Olaparib治疗后，细胞中DNA单链断裂损失标志物γH2AX免疫荧光检测图；
图7显示IGROV1亲本细胞和IGROV1-R6/9耐药细胞经转录组测序后得到的基因表达变化图；
图8显示IGROV1亲本细胞和IGROV1-R6/9耐药细胞转录组测序得到的ALDH1A1和SPP1表达变化图；
图9显示qRT-PCT检测IGROV1亲本细胞和IGROV1-R6/9耐药细胞中，ALDH1A1和SPP1在转录水平的表达结果图；
图10显示qRT-PCT检测IGROV1-R6/9耐药细胞中siRNA介导的SPP1基因表达敲低效率结果图；
图11显示敲低SPP1基因表达的IGROV1-R6/9耐药细胞对Olaparib敏感性的结果图，其中，A图：IGROV-R6耐药细胞，B图：IGROV1-R9耐药细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的实质性内容。下列实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1人源卵巢癌PARP抑制剂耐药性细胞株IGROV1-R的诱导建立
1.1实验材料
人源卵巢癌细胞株IGROV1细胞由哈佛大学医学院Dana-farber癌症研究所的JeanZhao博士惠赠；RPMI1640培养基购买于生物工程股份有限公司(中国)；PARP抑制剂Olaparib购买于上海翰香公司(中国)；青霉素、链霉素购买于GIBCO公司(美国)；胎牛血清购买于Bioind(BI)公司(以色列)。
1.2实验方法
(1)将人源卵巢癌细胞株IGROV1培养于含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37℃，5％CO2培养箱中进行维持培养。
(2)当细胞密度达到70-90％时，弃掉上清，更换为含有PARP抑制剂Olaparib的培养基。Olaparib药物起始浓度为0.5μM，在37℃，5％CO2条件下继续培养，每72小时更换含相同浓度Olaparib的新鲜培养基，直至细胞长满。
(3)将步骤(2)中长满的细胞进行传代，使其贴壁后细胞密度达到70％左右；逐步增加Olaparib的作用浓度，继续在37℃，5％CO2条件下培养，期间每隔72小时更换含Olaparib的新鲜培养基，使细胞系对Olaparib的耐受浓度逐步达到15-16μM，维持该浓度直至细胞长满。
(4)将细胞进行传代处理，使其贴壁后细胞密度达到70％左右，更换含有50μM高浓度Olaparib的培养基，在37℃，5％CO2条件下继续培养；维持该浓度，期间每隔72小时更换含Olaparib的新鲜培养基，直至细胞长满。
(5)将步骤(4)中长满的细胞进行传代处理，在不含Olaparib的完全培养基中，在37℃，5％CO2条件下继续培养，历经大约3-4周。
(6)将细胞进行消化后悬浮计数，按照500个细胞接种到10个96孔板的标准进行稀释法单克隆培养，在37℃，5％CO2条件下继续培养1周后，通过镜下观察，找出单克隆培养孔进行标记，并进行后续扩大培养，最终得到PARP抑制剂Olaparib单克隆耐药细胞株。
1.3实验结果
卵巢癌细胞IGROV1的Olaparib耐药细胞株筛选流程图和所得到的耐药细胞株镜下观察结果图见图1。
实施例2对IGROV1-R进行形态学观察和生物学特性鉴定
1.1显微镜下进行细胞形态学观察
倒置相差显微镜观察PARP抑制剂耐药性细胞株IGROV1-R的形态。
实验方法：取对数生长期IGROV1亲本细胞和IGROV1-R耐药细胞株，换液后在倒置相差显微镜下观察活细胞形态并拍照。
实验结果：结果显示，IGROV1亲本细胞呈多角形，形态较一致，细胞内结构均匀(见图2A)，IGROV1-R细胞大小、形态均发生变化，细胞更圆润，并且成团分布(见图2B)。
1.2流式细胞分析术对IGROV1-R耐药细胞的大小及细胞颗粒度复杂性进行表征
流式细胞分析术中的侧向角散射光(SSC)可反映细胞内颗粒度的复杂程度。本发明中，使用流式细胞分析术检测了IGROV1亲本细胞和IGROV1-R耐药细胞株的胞内颗粒度的复杂程度。
实验方法：分别取对数生长期的IGROV1亲本细胞和IGROV1-R耐药细胞，分别消化后进行终止反应；将细胞转移至1.5mL离心管中，于800rpm离心5分钟后弃去上清，用1mLPBS将细胞轻轻重悬，再次离心清洗细胞(此过程重复两遍)；加入PBS将细胞重悬，用滤网将细胞过滤，得到的单个细胞悬液进行检测。
实验结果：结果显示，与IGROV1亲本细胞相比，IGROV1-R耐药细胞株均具有更大的侧向角散射值，表明IGROV1-R耐药细胞株内的颗粒复杂度更高(见图3)。
实施例3评估IGROV1-R耐药细胞对PARP抑制剂Olaparib的药物敏感性
1.1细胞克隆形成实验(2D条件下细胞培养方法)检测IGROV1-R耐药细胞对PARP抑制剂Olaparib的药物敏感性
细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等的重要技术方法。在本发明中，利用细胞克隆形成实验以检测IGROV1-R耐药细胞对PARP抑制剂Olaparib的药物敏感性。
实验方法：
(1)分别取对数生长期IGROV1亲本细胞和IGROV1-R耐药细胞，消化并计数后，重悬为1×105/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入200μL细胞悬液(1500个/孔)；96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。
(2)用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔换入200μL相应的含药培养基，96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养72小时。
(3)培养结束后，从培养箱中取出细胞，倒掉培养基，加入PBS清洗1-2次，用1％的结晶紫室温染色15分钟。
(4)弃去染液，用自来水轻轻漂洗培养板直至颜色清亮，室温过夜晾干，视情况拍照。
(5)晾干的96孔板每孔加入50-100μL 50％的冰乙酸洗脱，摇床室温孵育1小时后，用酶标仪在λ＝570nm条件下测量每个孔的OD值，并使用Graphpad Prism软件进行定量统计分析。
实验结果：结果扫描图见图4A，定量图见图4B，结果显示IGROV1亲本细胞在Olaparib 8μM时，大部分细胞已经被杀死；而IGROV1-R耐药细胞IGROV1-R2/3/4/6/9经Olaparib 8μM处理后，大部分细胞仍然存活；而最高浓度32μM处理时，IGROV1-R耐药细胞仍有大量存活，其中IGROV1-R3/6克隆对Olaparib的耐受性最强。表明在2D条件的细胞培养下，与IGROV1亲本细胞相比，IGROV1-R细胞对PARP抑制剂Olaparib产生了耐药性。
1.2 3D成球培养实验检测IGROV1-R耐药细胞对PARP抑制剂Olaparib的药物敏感性
3D成球培养实验是一种在体外能够准确描述细胞真实微环境的方法。本发明中，使用3D成球培养实验检测了IGROV1-R耐药细胞对PARP抑制剂Olaparib的药物敏感性。
实验方法：
(1)96孔板和移液器头置于-20℃冰箱预冷30分钟，并在冰上加入基质胶与基础培养基1:1充分混合后静置3分钟，迅速将混合液加入96孔板中，100μL/孔，镜下观察是否有气泡，去除气泡干扰后轻轻地将96孔板放入37℃培养箱中培养1小时。
(2)分别取对数生长期IGROV1亲本细胞和IGROV1-R耐药细胞，将细胞消化后计数，取适量细胞用含有2％FBS和2％基质胶的培养基稀释。从37℃培养箱中取出配好下层胶的96孔板，每孔铺入100μL上层细胞悬液，轻柔地将铺好的细胞放入细胞培养箱中。
(3)待细胞生长至3-4天，镜下观察单细胞是否增殖成团，将成团的细胞进行分组加药换液处理，实验组加入2μM Olaparib，以等量的DMSO作为对照组。每3天换一次液。并每天观察细胞球体生长状态。
(4)待出现明显药物趋势后，记录实验天数为处理终点，用倒置相差显微镜拍照备份，根据细胞成球情况分成完整、半完整以及破碎三种程度进行后续分析定量。
实验结果：结果显示，经PARP抑制剂Olaparib处理后，IGROV1亲本细胞的成球生长受到很大程度的抑制，而且明显导致球体破碎和细胞死亡(见图5A)；而IGROV1-R耐药细胞株的成球生长均未受到明显影响(见图5B)。表明本发明所得到的5个单克隆细胞株对PARP抑制剂Olaparib产生了不同程度的耐药性。
实施例4评估IGROV1-R耐药细胞经PARP抑制剂Olaparib治疗后细胞内DNA断裂损伤情况
PARP抑制剂Olaparib能够使细胞中DNA单链断裂损伤修复。本发明通过免疫荧光实验检测了经Olaparib处理后IGROV1亲本细胞和IGROV1-R耐药细胞中DNA损伤标记蛋白γH2AX的表达情况。
实验方法：
(1)准备24孔培养皿，将无菌盖玻片放置于培养皿的每个孔内。从培养箱中分别取对数生长期的IGROV1亲本细胞和IGROV1-R耐药细胞，经消化后铺到带有载玻片的培养皿中，等待细胞贴壁后进行2μM Olaparib的处理。
(2)药物处理24小时后，取出培养皿，弃去培养基，用PBS洗一遍，加入4％的多聚甲醛，室温固定15分钟。
(3)弃去多聚甲醛，用PBS清洗三遍，每遍5分钟，加入0.3％的Triton透膜15分钟。
(4)弃掉Triton后用PBS清洗三遍，每次5分钟。滴加5％的BSA封闭液，室温封闭1小时。
(5)弃掉封闭后滴加一抗，4℃孵育过夜。并用PBS清洗3遍，每遍5分钟。
(6)滴加荧光二抗，室温避光孵育60分钟。
(7)滴加配置好的DAPI染液，避光孵育15分钟。PBS避光清洗一遍。
(8)滴加防猝灭封片胶封片。使用正置立式荧光显微镜拍照采集图像。
(9)计数分析：每组分别观察100个细胞，细胞核内含超过5个γH2AX灶点即为阳性细胞。
实验结果：结果显示经PARP抑制剂Olaparib处理后，与IGROV1亲本细胞相比，IGROV1-R耐药细胞株中的γH2AX蛋白表达水平显著降低(见图6)，表明IGROV1-R耐药细胞比IGROV1亲本细胞具有更强的DNA断裂损伤修复能力，进一步表明了IGROV1-R耐药细胞对PARP抑制剂产生了耐药性。
实施例5转录组学测序分析IGROV1-R耐药细胞内基因在转录水平的变化
为了研究IGROV1-R耐药株对PARP抑制剂耐药的分子机制，本发明将IGROV1亲本细胞和IGROV1-R6/9耐药单克隆进行转录组测序分析。
实验方法：
(1)培养过夜的IGROV1亲本细胞和IGROV1-R耐药细胞经PBS清洗后，加入适量的TRIZOL，静置5分钟后转移至1.5mL无RNA酶的EP管。
(2)加入200mL氯仿，剧烈摇动15秒，室温静置3分钟。
(3)于预冷的4℃的离心机中12000rpm离心15分钟；取出上清于一新的1.5mL无RNA酶的EP管，并加入等体积预冷的异丙醇，混匀后静置15分钟。
(4)于预冷的4℃离心机中12000rpm离心15分钟；弃掉上清并加入无RNA酶的75％乙醇1mL，4℃离心机中12000rpm离心5分钟，重复操作该步骤1次。
(5)弃上清液后晾干离心管；加入无RNA酶水20μL，RNA溶解后测定浓度。
(6)进行转录组测序分析(由诺禾致源公司(Novogene)完成)。
实验结果：转录组测序分析结果显示耐药细胞株IGROV1-R6/9与亲本细胞IGROV1存在多种基因表达水平的差异(见图7)。
实施例6评估IGROV1-R耐药细胞株中肿瘤干细胞的特性
1.1转录组学测序分析IGROV1-R耐药细胞株中肿瘤干细胞相关基因表达的变化
实验方法：对实施例5中的转录组测序结果进行进一步的分析。
实验结果：结果显示肿瘤干细胞标志物ALDH1A1和肿瘤干细胞相关基因SPP1在IGROV1-R6/9耐药细胞株中均发生显著高表达(见图8)，该结果初步提示IGROV1-R6/9耐药细胞株具有肿瘤干细胞的特性。
1.2实时荧光定量PCR检测IGROV1-R耐药细胞株中肿瘤干细胞相关基因表达的变化
为进一步明确IGROV1-R6/9耐药细胞株中肿瘤干细胞的特性，本发明利用实时荧光定量PCR检测了IGROV1亲本细胞和IGROV1-R耐药细胞株中ALDH1A1和SPP1的表达。
实验方法：
(1)逆转录PCR
反应体系如表1所示。
表1逆转录PCR的反应体系
Figure BDA0002666502120000141
反应过程：37℃，15分钟；85℃，5秒；
得到的逆转录cDNA产物，用无菌水稀释40倍后储存在-80℃备用。
(2)实时荧光定量PCR
反应体系如表2所示。将溶液在管底部轻轻混合，并以6000rpm短暂离心。
表2实时荧光定量PCR的反应体系
Figure BDA0002666502120000151
反应过程：
(a)50℃，2分钟；95℃，2分钟预变性；
(b)95℃，15秒变性，根据引物Tm决定退火温度，时间15秒，72℃，1分钟延伸，40个循环；
(c)最后95℃，1分钟，60℃，30秒，95℃，30秒。
其中，ALDH1A1的模板上游引物F和模板下游引物R的序列如下：
模板上游引物F为5’-GTTGTCAAACCAGCAGAGCA-3’(SEQ ID NO.1)
模板下游引物R为5’-CTGTAGGCCCATAACCAGGA-3’(SEQ ID NO.2)
SPP1的模板上游引物F和模板下游引物R的序列如下：
模板上游引物F为5’-AAGCGAGGAGTTGAATGGTGCAT-3’(SEQ ID NO.3)
模板下游引物R为5’-TGTGGGTTTCAGCACTCTGCTTCAT-3’(SEQ ID NO.4)
实验结果：结果显示在耐药细胞克隆株IGROV1-R6/9中，肿瘤干细胞标志物ALDH1A1和肿瘤干细胞相关基因SPP1的表达均发生显著升高(见图9)，表明IGROV1-R6/9耐药细胞株均具有肿瘤干细胞的特性。
实施例7评估SPP1基因在IGROV1-R耐药细胞株中对PARP抑制剂Olaparib耐药中的作用
为了研究SPP1的高表达是否在耐药细胞株的耐药机制中起到关键作用，本发明在IGROV1-R耐药细胞株中通过siRNA介导SPP1基因表达的沉默，检测对PARP抑制剂Oalaprib药物敏感性的影响。
1.1实时荧光定量PCR检测IGROV1-R6/9耐药细胞中siRNA介导的SPP1基因表达敲低效率
实验方法：转染按照Invitrogen公司Lipofectamin2000转染试剂说明书进行。
(1)转染前一天，将适量细胞接种在6孔板上，用新鲜培养基培养，使第二天细胞生长至60-80％。
(2)取1.5mL离心管，在200μL opti-MEM中加入5μL Lipo2000，手指轻弹混匀，室温静置5分钟；另取一个1.5mL离心管，在200μL opti-MEM中加入5μL siRNA，手指轻弹混匀。其中，针对SPP1基因的siRNA序列如下：
正义链为5’-ACGAGUCAGCUGGAUGACCtt-3’(SEQ ID NO.5)
反义链为5’-GGUCAUCCAGCUGACUCGUtt-3’(SEQ ID NO.6)
(3)将opti-MEM-Lipo2000混合液滴加至opti-MEM-siRNA管中，手指轻弹混匀，室温静置15-20分钟。
(4)弃去带转染的细胞的培养基，PBS清洗一遍，加入5％FBS的新鲜培养基准备转染。
(5)将配好的siRNA混合液滴加至细胞中，37℃温育24-48小时，更换培养液进行后续实验。
(6)按照实施例5中的步骤提取细胞中的RNA。
(7)按照实施例6中的步骤实时荧光定量PCR检测IGROV1-R6/9耐药细胞中siRNA介导的SPP1基因的沉默效果。
实验结果：结果显示IGROV1-R6/9耐药细胞中，SPP1基因的表达得到一定程度的敲低(见图10)。
1.2检测敲低SPP1基因表达的IGROV1-R6/9耐药细胞对PARP抑制剂Olaparib敏感性的影响
对经siRNA介导敲低SPP1基因表达的IGROV1-R6/9耐药细胞进行了PARP抑制剂Olaparib药物敏感性的实验。
实验方法：具体实施步骤同实施例3中的细胞克隆形成实验，即2D条件下细胞培养方法。
实验结果：结果显示：耐药细胞IGROV1-R6/9中，敲低SPP1基因的表达可增加耐药细胞IGROV1-R6(见图11A)和耐药细胞IGROV1-R9(见图11B)对PARP抑制剂Olaparib的敏感性。
上述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 大连医科大学附属第二医院
<120> SPP1基因在制备增强卵巢癌患者对PARP抑制剂敏感性的药物中的应用
<141> 2020-09-04
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttgtcaaac cagcagagca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgtaggccc ataaccagga 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagcgaggag ttgaatggtg cat 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtgggtttc agcactctgc ttcat 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgagucagc uggaugacct t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggucauccag cugacucgut t 21

Claims (5)

1.SPP1基因抑制剂在制备增强SPP1基因高表达的PARP抑制剂耐药卵巢癌患者对PARP抑制剂敏感性的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PARP抑制剂包括Olaparib、Rucaparib、Niraparib和Talazoparib。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述PARP抑制剂为Olaparib。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的SPP1基因抑制剂为siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、小分子化合物、肽和抗体中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的siRNA的序列如SEQ ID NO.5~6所示。
CN202010920298.3A 2020-09-04 2020-09-04 Spp1基因在制备增强卵巢癌患者对parp抑制剂敏感性的药物中的应用 Active CN111979290B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010920298.3A CN111979290B (zh) 2020-09-04 2020-09-04 Spp1基因在制备增强卵巢癌患者对parp抑制剂敏感性的药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010920298.3A CN111979290B (zh) 2020-09-04 2020-09-04 Spp1基因在制备增强卵巢癌患者对parp抑制剂敏感性的药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111979290A CN111979290A (zh) 2020-11-24
CN111979290B true CN111979290B (zh) 2021-07-13

Family

ID=73448442

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010920298.3A Active CN111979290B (zh) 2020-09-04 2020-09-04 Spp1基因在制备增强卵巢癌患者对parp抑制剂敏感性的药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111979290B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112458174B (zh) * 2020-12-01 2021-07-30 河北仁博科技有限公司 miR-4527在制备诊断或治疗肿瘤耐药性的制剂中的应用
CN114214418A (zh) * 2022-02-10 2022-03-22 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种评估肺癌患者对质子放疗敏感性的生物标志物及其用途
CN114712507B (zh) * 2022-03-30 2023-08-04 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种trim4在制备治疗卵巢癌药物的增敏剂或逆转耐药剂中的应用
CN114712515A (zh) * 2022-03-30 2022-07-08 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种dll4抑制剂联合parp抑制剂在制备治疗卵巢癌药物中的应用
CN115074311B (zh) * 2022-06-29 2023-05-02 浙江大学医学院附属妇产科医院 人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株及用途

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biao Zeng等.SPP1 promotes ovarian cancer progression via Integrin β1/FAK/AKT signaling pathway.《OncoTargets and Therapy》.2018,第11卷1333-1343. *
PARP 抑制剂在卵巢癌治疗中的研究现状;黄馨禾等;《医药信息》;20191130;第32卷(第21期);26-29 *
SPP1 promotes ovarian cancer progression via Integrin β1/FAK/AKT signaling pathway;Biao Zeng等;《OncoTargets and Therapy》;20181231;第11卷;1333-1343 *
不同方法建立卵巢癌紫杉醇耐药细胞株对临床用药方案的启发;黄在菊等;《中国药师》;20081231;第11卷(第10期);1135-1137 *
多西紫杉醇诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡及耐药前后的蛋白质组学研究;萧畔;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20130515(第05期);E072-18 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111979290A (zh) 2020-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111979290B (zh) Spp1基因在制备增强卵巢癌患者对parp抑制剂敏感性的药物中的应用
Fang et al. MicroRNA‐29b suppresses tumor angiogenesis, invasion, and metastasis by regulating matrix metalloproteinase 2 expression
Zhou et al. miR-200b/c-RAP1B axis represses tumorigenesis and malignant progression of papillary thyroid carcinoma through inhibiting the NF-κB/Twist1 pathway
CN106834486A (zh) 骨肉瘤分子诊疗标志物及其应用
CN109468382A (zh) lncRNA在肺腺癌诊疗中的应用
CN109468380B (zh) Il1r2在乳腺癌预后评估与靶向治疗中的应用
CN108559748B (zh) 一种cd4阳性细胞特异的dna核酸适体及其嵌合体
CN108034655B (zh) 一种长非编码rna及其组合物在诊断/治疗结直肠癌中的应用
CN107164554B (zh) Asprv1作为生物标志物在喉鳞癌诊疗中的应用
CN116855607B (zh) circCHPT1在制备非小细胞肺癌早期诊断或预后检测试剂盒中的应用
CN105457041B (zh) miR-26a在非小细胞肺癌中的应用
WO2018049925A1 (zh) 筛选抗乳腺癌转移化合物的方法及相关化合物的应用
CN116808218A (zh) 生物标志物在头颈鳞癌治疗中的应用
CN108165631B (zh) 一种骨肉瘤的生物标志物syt12及其应用
KR20170005627A (ko) Parp 및 탄키라제 동시 저해제에 대한 감수성 결정 방법
CN114703190A (zh) 一种靶向抑制KIAA1429基因表达的ShRNA在慢性髓细胞白血病中的应用
CN107496923A (zh) 一种与肾透明细胞癌相关的生物标志物
CN110628791B (zh) 一种tRNA修饰酶基因在非小细胞肺癌中的应用
Martin et al. The clinical and biological implications of N-WASP expression in human colorectal cancer
CN106729756A (zh) 生物标志物作为靶标在肺腺癌诊治中的应用
CN107184983B (zh) 一种肺腺癌的诊治靶标
CN107881240B (zh) 骨肉瘤的诊治标志物
CN108085388B (zh) 一种与骨肉瘤发生发展相关的基因及其应用
CN112662780A (zh) 检测hnrnpm表达的试剂在制备诊断和/或预后判断肝癌中的应用及药物组合物
CN104342440A (zh) CDKL1基因及其siRNA和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant