CN114214418A - 一种评估肺癌患者对质子放疗敏感性的生物标志物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种评估肺癌患者对质子放疗敏感性的生物标志物及其用途，所述的评估肺癌患者对质子放疗敏感性的生物标志物为ARID1A。本发明还提供了检测如ARID1A的物质和检测对PARP抑制剂耐药的物质在制备评估肺癌患者对质子放疗敏感性的产品中的用途。本发明研究发现，对PARP抑制剂耐受的细胞株联合ARID1A缺失，能提高肺癌患者对质子放疗的敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种评估肺癌患者对质子放疗敏感性的生物标志物及其用途。
背景技术
根据2019年的肿瘤流行病学报告可知(Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancerstatistics, 2019；69(1):7-34.)，肺癌的发病率约占13％，其中最常见的组织病理学类型为非小细胞肺癌(NSCLCs)。遗憾的是目前NSCLC患者诊断后的5年生存期仅占25％(SiegelRL,Miller KD, Jemal A.Cancer statistics,2019.CA:a cancer journal forclinicians.2019；69(1):7-34.)，因此提高NSCLC的早期诊断和/或靶向治疗人群的富集诊断具有广泛的临床应用前景。尽管目前 NSCLC患者受益于靶向化疗药物和免疫治疗(Ettinger DS,et al.NCCN Guidelines Insights: Non-Small Cell Lung Cancer,Version 2.2021.2021；19(3):254-66.)，但是根据NCCN指南我们可以看出放射治疗还是早期和局部NSCLCs患者的首选治疗方案。如图30所示，其中左图为质子放疗(proton)和光子放疗(photon)对肺癌患者照射的比较图，从图中可知，质子治疗相对于光子治疗的主要优点是其SOBP(Spread-out bragg peak)能够直接抵达肿瘤位置，而对周围正常组织的辐射小，因此，短期及长期副作用小或几乎没有；提升癌症病者的生活质量；减少对发育中的儿童病人之影响；减少次发性癌症的风险。右图为质子和光子照射进入体内的射线路径图，从图可知，质子放疗的最佳位置(SOBP)直达肿瘤，而X射线能量最高在体表，到达肿瘤后能量减弱，因此照射强度不够，还会对周围组织造成极大的辐射，从而增加患者副反应和次级肿瘤发生率。
目前是临床放射治疗领域国际认可的最为尖端和理想的肿瘤放射治疗技术。由于质子放疗技术要求高，基础建设成本高，耗时长，目前国内仅肿瘤医院质子重离子医院和2021年宣布投入使用的瑞金质子重离子治疗投入了真正的临床应用。
上海市质子重离子医院自2015年投入使用后(时间长)，截至2018年12月，收治I-II 期肺癌(早期肺癌)31例，临床数据显示患者肿瘤2年局部控制率高达96％，2年生存率达91％，毒副反应轻微，仅1例患者发生III级毒副反应，远低于常规光子治疗的III级毒副反应发生率(可降低高达50％左右)。无创，肿瘤控制率高，毒副反应轻微，是质子放疗治疗早期肺癌的突出优势。同时，上海市质子重离子医院临床数据显示，质子治疗因其能级高，穿透性强，其适应症范围较普通光子放疗有极大的拓宽，目前主要推荐用于中枢神经系统肿瘤(脑膜瘤、垂体瘤、听神经瘤及星形细胞瘤)，颅底肿瘤(脊索瘤、软骨肉瘤)，头颈部肿瘤(鼻咽癌、口腔癌、咽瘤、喉瘤、腺样囊性癌)，胸部肿瘤(肺癌、食管癌、胸腺瘤)，腹盆腔肿瘤(肝脏肿瘤、前列腺癌、胰腺癌、复发直肠癌)，其它肿瘤(乳腺癌、骨和软组织肉瘤)(https://www.sphic.org.cn/zlys/index_22.aspx)。
但是临床上质子治疗主要根据放射生物效应数值(RBE)来确定患者的放疗剂量，目前采用的是“一刀切”的方案，即对所有肿瘤都按与光子治疗比对，肿瘤杀伤力为90％所需要的质子放射剂量(RBE0.1＝X-ray dose/Proton dose)来计算肿瘤患者的总放射剂量。但在实际临床应用过程中，研究者已经发现，有一些肿瘤对质子放疗比较敏感，有一些肿瘤对质子放疗比较耐受(Luhr A,et al.Relative biological effectiveness in protonbeam therapy-Current knowledge and future challenges.Clinical andtranslational radiation oncology.2018；9:35-41.)，如果仍然按照RBE0.1＝1.1的“一刀切”方案，就仍然存在对某些敏感肿瘤带来毒副作用，或者给敏感肿瘤患者带来不必要的经济负担(据《全球肿瘤医生网》显示，我国质子治疗的费用在25～30万人民币之间)。尽管临床前研究数据显示，同源重组损伤修复缺陷(HR deficiency) 的肿瘤对质子放疗更加敏感，但是细胞学中的研究提示HR缺陷细胞的RBE0.1仍然小于体外肿瘤细胞平均值1.15(IntJ Radiation Oncol Biol Phys,Vol.91,No.5,pp.1081e1089,2015)，且临床放射剂量仅减少5％左右，临床转化潜力非常有限。
人ARID1A基因定位于人类染色体1p35.3，编码蛋白为SWI/SNF家族成员之一。SWI/SNF 家族成员蛋白具有解螺旋酶和ATP酶活性，能够通过改变特定基因附近染色质结构而调控这些基因的转录。ARID1A蛋白作为ATP依赖性染色质重塑复合物SWI/SNF中的成员之一，对于正常染色质上处于静止状态的基因转录激活是必须的。最近的研究(ARID1Amutations in endometriosis-associated ovarian carcinomas,WiegandKC et al.,NEngl J Med.,Oct 14,2010； Frequent mutations of chromatin remodeling geneARID1Ain ovarian clear cell carcinoma，Jones S et al.,Science,Oct 8,2010)发现，ARID1A基因作为一个抑癌基因，在半数以上的卵巢癌中频繁发生突变。
目前开展的质子治疗相关临床研究(clinicaltrial.com)数据显示主要的研究目的在于探索质子治疗的毒副反应，并无伴随诊断分子标记物依赖性的质子放疗相关临床实验，表明精准实施质子治疗目前面临有效分子标记物的困境。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种评估肺癌患者对质子放疗敏感性的生物标志物及其用途。
本发明通过数据表明，体外NSCLC细胞对PARP抑制剂的半数抑制浓度IC50值与质子放疗的RBE0.1值呈正相关；并建立相对高通量的细胞模型(n＝21)库，确定质子放疗的RBE0.1值>1.3的NSCLC细胞，其分子特征为ARID1A的截断突变，而进一步统计发现ARID1A截断突变与其蛋白表达显著负相关，说明参与同源重组损伤修复的ARID1A缺陷较其它HR分子缺陷(如BRCA1/2，FANCA，FANCD2，XRCC3，RAD51等)导致的HR功能缺失更加显著的调控质子放疗的敏感性。随后，通过建立内源性和获得性PARPi耐药(以下简称PR)，发现PARPi耐药的NSCLC联合ARID1A缺失导致的HR功能缺陷特异性的预测了质子放疗的敏感性。综上所述，本发明提出联合检测NSCLC细胞中ARID1A的表达可以显著预测该肿瘤对质子治疗的敏感人群，为质子的精准治疗提供了可靠的伴随诊断分子标记物。
本发明的目的之一在于提供，一种评估肺癌患者对质子放疗敏感性的生物标志物，所述生物标志物为ARID1A。
本发明的目的之二在于提供，检测如上文所述的生物标志物的物质在制备评估肺癌患者对质子放疗敏感性的产品中的用途。
优选地，所述检测生物标志物的物质包括如下中的至少一项：
1)检测ARID1A表达的物质；
2)检测ARID1A突变的物质；
3)检测ARID1A蛋白活性的物质。
更优选地，所述突变为截断突变。
更优选地，所述ARID1A表达包括ARID1A蛋白表达和/或ARID1A基因转录。
本发明的目的之三在于提供，检测如上文所述的生物标志物的物质和检测对PARP抑制剂耐药的物质在制备评估肺癌患者对质子放疗敏感性的产品中的用途。
优选地，所述检测对PARP抑制剂耐药的物质包括检测对PARP抑制剂的半数抑制浓度 IC50值；和/或，检测RAD51 foci阳性细胞百分率。
优选地，所述PARP抑制剂选自Olaparib、Rucaparib和Niraparib中至少一种。
优选地，所述检测生物标志物的物质包括如下中的至少一项：
1)检测ARID1A表达的物质；
2)检测ARID1A突变的物质；
3)检测ARID1A蛋白活性的物质。
更优选地，所述突变为截断突变。
更优选地，所述ARID1A表达包括ARID1A蛋白表达和/或ARID1A基因转录。
本发明的目的之四在于提供，一种评估肺癌患者对质子放疗敏感性的产品，所述产品包括检测如上文所述的生物标志物的物质和检测对PARP抑制剂耐药的物质。
优选地，所述产品包括试剂盒、芯片、膜条。
本发明的目的之五在于提供，一种用于提高肺癌患者对质子放疗敏感性的增敏剂，所述增敏剂包括1)～3)至少任一项：
1)抑制ARID1A蛋白活性的物质；
2)抑制ARID1A基因转录或表达的物质。
3)导致对PARP抑制剂耐药的物质。
本发明的目的之六在于提供，如上文所述的增敏剂在制备用于提高肺癌患者对质子放疗敏感性的产品中的应用。
本发明的目的之七在于提供，一种评估患者对质子放疗敏感性的方法，包括如下步骤：
1)检测生物样本的ARID1A表达或活性，得到检测结果一；
2)检测生物样本对PARP抑制剂的耐受性，得到检测结果二；
3)根据检测结果一和检测结果二，评估患者对质子放疗的敏感性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明发现，内源性对PARP抑制剂耐受的NSCLC细胞中ARID1A缺陷对质子放疗更加敏感；构建获得性对PARP抑制剂耐受的NSCLC细胞，发现ARID1A在获得性对PARP 抑制剂耐受的NSCLC细胞中缺陷后对质子放疗更加敏感，综合说明ARID1A在对PARP抑制剂耐受的NSCLC细胞中缺失对质子治疗敏感性显著增强。
2)本发明发现，ARID1A截断突变的NSCLC细胞与其对PARP抑制剂的半数抑制浓度IC50高度相关，也与质子放疗RBE0.1高度相关。进一步发现，ARID1A截断突变联合对PARP 抑制剂耐受的NSCLC细胞对质子放疗显著敏感，能作为评估肺癌患者对质子放疗敏感性的指标。
3)本发明发现，ARID1A的靶向药或靶向分子制剂(抗体/小分子抑制剂/CRISPR-Cas9 制剂)与质子放疗联合治疗Olaparib耐药的患者可极大的减少放射剂量，从而降低患者的辐射副反应，减轻经济负担，避免二次肿瘤的发生。
附图说明
图1显示为本发明的实施例1中经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后，15种NSCLC细胞的存活比例曲线图。
图2显示为本发明的实施例1中经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后，15种NSCLC细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值与质子放疗的RBE0.1值的相关性曲线图。
图3显示为本发明的实施例1中从GDSC数据库中获得的Olaparib处理72h后，19种NSCLC 细胞的半数抑制浓度IC50值与质子放疗的RBE0.1值的相关性曲线图。
图4显示为本发明的实施例2中从COSMIC细胞数据库中获得的肺腺癌细胞(LUAD)体细胞遗传突变与对Olaparib化疗敏感性和耐受性的火山图。其中，mut代表突变，左边箭头代表越往左走，对Olaparib越敏感；右边的箭头代表越往右走，对Olaparib越耐受。
图5显示为本发明的实施例2中从GDSC细胞数据库获得的ARID1A截断突变型NSCLC细胞和ARID1A野生型NSCLC细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值的柱形图。其中，WT代表野生型，Mut代表突变型。
图6显示为本发明的实施例2中ARID1A截断突变型NSCLC细胞和ARID1A野生型NSCLC 细胞的质子放疗的RBE0.1值的比较图。其中，WT代表野生型，Mut代表突变型。
图7显示为本发明的实施例3中ARID1A野生型NSCLC细胞和ARID1A截断突变型NSCLC细胞中ARID1A表达的免疫印迹图。
图8显示为本发明的实施例3中8种NSCLC细胞中ARID1A的表达水平与质子放疗RBE0.1值的Pearson相关性分析图。
图9显示为本发明的实施例3中四个亚型NSCLC细胞与质子放疗RBE0.1值的统计图。其中，Res WT代表对Olaparib耐受的ARID1A野生型细胞；Res Mut代表对Olaparib耐受的ARID1A截断突变型细胞；Sen WT代表对Olaparib敏感的ARID1A野生型细胞；Sen Mut 代表对Olaparib敏感的ARID1A截断突变型细胞。
图10显示为本发明的实施例4中以H23细胞为对象，采用siRNA技术干扰ARID1A表达48h后的免疫印迹图。其中，siCtr1为空白对照siRNA，siARID1A代表靶向ARID1A敲除的siRNA。
图11显示为本发明的实施例4中以H23细胞为对象，采用siRNA技术干扰ARID1A表达48后再经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后的细胞存活曲线图。
图12显示为本发明的实施例4中siCtr1组和siARID1A组质子放疗的RBE0.1值的比较图。
图13显示为本发明的实施例4中经不同浓度的Olaparib处理72h后，CALU6细胞中ARID1A表达的免疫印迹图。
图14显示为本发明的实施例4中经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后，CALU6 细胞、H23细胞和A549细胞的细胞存活曲线图。
图15显示为本发明的实施例4中经2.5μM Olaparib溶液处理24h再接受X射线或质子放疗后，CALU6细胞的质子放疗RBE0.1值的图。其中，Vehicle组代表空白对照组，细胞经DMSO 处理24h再接受X射线或质子放疗；Olaparib组代表实验组，细胞经2.5μM Olaparib溶液处理24h再接受X射线或质子放疗。
图16显示为本发明的实施例5中H23细胞和H23PR细胞ARID1A表达的免疫印迹图。
图17显示为本发明的实施例5中H23细胞和H23PR细胞中ARID1A表达的生物学重复数据统计分析图。
图18显示为本发明的实施例5中经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后，H23细胞和H23PR细胞的细胞存活曲线图。
图19显示为本发明的实施例5中A549细胞和A549PR细胞ARID1A表达的免疫印迹图。
图20显示为本发明的实施例5中A549细胞和A549PR细胞中ARID1A表达的生物学重复数据统计分析图。
图21显示为本发明的实施例5中分别经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后，A549 细胞和A549PR细胞的细胞存活曲线图。
图22显示为本发明的实施例5中H23PR细胞分别经X射线和质子射线化疗后细胞克隆形成的存活曲线图。其中，X代表细胞经X射线放疗，P代表细胞经质子射线放疗。
图23显示为本发明的实施例5中H23细胞和H23PR细胞的质子放疗的RBE0.1值的比较图。
图24显示为本发明的实施例5中分别经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天，H23细胞、H23PR细胞和H23PR ARID1A-V5细胞的生存曲线图。其中，H23PR ARID1A-V5代表H23PR细胞过表达ARID1A。
图25显示为本发明的实施例5中H23PR细胞和H23PR ARID1A-V5细胞经X射线(X)和质子射线(P)化疗后细胞克隆形成的存活曲线图。其中，图A为H23PR ARID1A-V5细胞分别经X射线(X)和质子射线(P)照射后细胞克隆形成的存活曲线图；图B为H23PR细胞分别经X射线、质子射线(P)照射后以及H23PR ARID1A-V5细胞分别经X射线、质子射线(P)照射后细胞克隆形成的存活曲线图。
图26显示为本发明的实施例5中A549细胞和A549PR细胞的图。其中，图A为A549PR细胞分别经X射线和质子射线作用后细胞克隆形成的存活曲线图；图B为A549细胞和A549PR细胞的质子放疗RBE0.1值的比较图；图C为免疫印迹法检测A549PR细胞转染siCtrl或者siARID1A 48h后ARID1A的干扰效率；图D为A549细胞和A549PR细胞转染siCtrl或者siARID1A后不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后细胞存活曲线图；E图为A549PR 细胞转染siCtrl后分别经X射线或者质子射线(P)作用后细胞克隆形成的存活曲线图；F图为A549PR细胞转染siARID1A后，分别经X射线(X)或者质子射线(P)作用后细胞克隆形成的存活曲线图；G图为A549PR耐受细胞转染siCtrl或者siARID1A后质子放疗RBE0.1值的比较图。
图27显示为本发明的实施例6中经10μM Olaparib溶液处理8h后，13种NSCLC细胞的RAD51 foci阳性细胞百分率比较图。
图28显示为本发明的实施例6中经10μM Olaparib溶液处理8h后，H23PR细胞、A549PR 细胞和H460PR细胞中RAD51 foci阳性细胞百分率比较图。
图29显示为本发明的ARID1A提高NSCLC患者质子放疗敏感性的技术方案图。
图30显示为现有技术中的质子和光子放射治疗肺癌的比较图。其中，左图箭头为肿瘤位置，圆圈为肿瘤周围正常组织；右图为质子和光子射线进入人体的能量曲线图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)是一类存在于真核细胞中催化PAR形成的细胞核酶，对DNA损伤修复、基因转录和表达、基因组稳定性的维持、细胞周期调控及细胞凋亡等生理过程发挥着重要作用。PARP抑制剂主要是以烟酰胺结构为基础来设计，其结构同底物NAD+接近，通过阻断NAD+与PARP催化活性位点的结合从而对PARP产生抑制。PARP抑制剂最初作为放化疗药物的增敏剂。
本发明采用Olaparib处理15种NSCLC细胞发现，细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值与质子放疗的RBE0.1值呈正相关，通过GDSC数据库验证，NSCLC细胞对Olaparib越耐受，质子治疗就越敏感；进一步，通过建立获得性Olaparib耐受细胞发现，获得性Olaparib耐受细胞对质子放疗更加敏感。同时，建立相对高通量的细胞模型(n＝21)库，确定体外质子放疗的RBE0.1值>1.3的NSCLC细胞，其分子特征为ARID1A的截断突变，而进一步统计发现ARID1A的截断突变与其蛋白表达显著负相关，说明参与同源重组损伤修复的ARID1A缺陷较其它HR分子缺陷(如BRCA1/2,FANCA，FANCD2，XRCC3，RAD51等)导致的HR功能缺失更加显著的调控质子放疗的敏感性ARID1A截断突变联合Olaparib耐受的NSCLC细胞对质子放疗极显著敏感。因此，ARID1A能作为评估肺癌患者对质子放疗敏感性的生物标志物，同时检测NSCLC 细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值也能评估肺癌患者对质子放疗敏感性，进一步发现对 PARP耐药的NSCLC联合ARID1A缺失导致的HR功能缺陷特异性的预测了质子放疗的敏感性。此外，本发明发现，Olaparib处理后，RAD51 foci阳性细胞百分率无显著变化的细胞更倾向于Olaparib耐药。而细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值与质子放疗的RBE0.1值呈显著正相关。因此，经Olaparib处理后，RAD51 foci阳性细胞百分率表现，能作为肺癌患者质子放疗敏感性的预测分子标记物。综上所述，本发明为质子的精准治疗提供了可靠的伴随诊断分子标记物。
生物标志物
本发明的第一方面提供，一种评估肺癌患者对质子放疗敏感性的生物标志物。
本发明中的术语“生物标志物”是指以可用于预测个体的疾病状态的不同浓度存在于个体中的生物分子。生物标志物可包括，但不限于，核酸、蛋白质及其变体和片段。生物标志物可以是包含编码该生物标志物的全部或部分核酸序列或这类序列的互补体的DNA。可用于本发明的生物标志物核酸被认为包括包含任何目的核酸序列的全部或部分序列的DNA和 RNA。
在本发明中，所述的生物标志物为ARID1A。生物标志物包括ARID1A基因及其编码的蛋白及其同源物，突变和同等型。该术语涵盖全长、未加工的生物标志物以及源自细胞中加工的任何形式的生物标志物。该术语涵盖生物标志物的天然发生变体，例如剪接变体、等位变体、截断突变。在本发明中，所述的突变优选为截断突变。根据美国NCI和遗传学教育的基因组学术语定义，本申请实施例中的“截断突变”指编码基因DNA序列改变形成终止密码子从而导致蛋白质产物变短的突变。
本发明中的术语“患者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括，但不限于，人类、非人灵长类、犬、猫、啮齿动物等。进一步，患者是人类患者。术语“患者”涵盖患有癌症 (例如，肺癌)的个体，包括已经经历或进行切除(手术)以去除癌组织的候选者的那些个体。
在本发明中，所述的肺癌包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌。进一步，所述的肺癌为小细胞肺癌。更进一步，所述的非小细胞肺癌包括鳞状细胞癌、大细胞癌和肺腺癌。
生物标志物检测
本发明的另一方面提供，检测如上文所述的生物标志物的物质在制备评估肺癌患者对质子放疗敏感性的产品中的用途。
在本发明中，所述检测生物标志物的物质包括如下中的至少一项：
1)检测ARID1A表达的物质；
2)检测ARID1A突变的物质；
3)检测ARID1A蛋白活性的物质。
定性和定量地检测和/或测定ARID1A的表达水平的方法包括但不限于，包括常规PCR、 qPCR和数字PCR的聚合酶链式反应(PCR)、原位杂交(例如但不限于荧光原位杂交(“FISH”)、凝胶电泳、测序和序列分析、微阵列分析和本领域已知的其它技术。
在某些实施方式中，检测方法可以是实时PCR(RT-PCR)、定量PCR、荧光PCR、RT-MSP(RT甲基化特异性聚合酶链式反应)、DNA的PicoGreenTM(Molecular Probes，Eugene，OR)检测、放射免疫测定或DNA的直接放射性标记。例如但不限于，可以将核酸生物标志物反转录成cDNA，然后进行聚合酶链式反应(RT-PCR)；或者，如在美国专利号为5,322,770中所述的，单一酶可用于两个步骤，或者如R.L.Marshall等人，PCR Methods and Applications4： 80-84(1994)所述，可以将生物标志物反转录成cDNA，然后进行对称缺口连接酶链式反应 (RT-AGLCR)。
在某些实施方式中，实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)用于评价生物标志物的mRNA 水平。生物标志物和对照mRNA的水平可以在待评价的肺癌患者癌组织或对质子放疗敏感的肺癌患者癌组织中定量。在某些实施方式中，一种或多种生物标志物的水平可以在生物样品中定量。
在某些实施方式中，可以使用原位杂交可视化，其中放射性标记的反义RNA探针与生物样品例如活检样品的薄切片杂交、洗涤、用RNA酶切割并暴露于敏感性乳剂用于放射自显影。样品可以用苏木精染色以显示样品的组织学组成，并且用合适的滤光器的暗场成像显示显影的乳剂。也可以使用非放射性标记比如地高辛。
在某些非限制性实施方式中，可以通过荧光原位杂交(FISH)进行核酸生物标志物表达的评价。FISH是可以直接鉴定细胞中DNA或RNA的特定区域的技术，因此使得能够目测测定组织样品中的生物标志物表达。FISH是一种可以相对快速和灵敏、并且也可以自动化的直接的原位技术。当单独通过FISH难以测定生物标志物的表达水平时，可以将免疫组织化学与 FISH方法相结合。
在某些实施方式中，可以在DNA阵列、芯片或微阵列上检测核酸生物标志物的表达。将生物标志物对应的寡核苷酸固定在芯片上，然后将芯片与从受试者获得的生物样品例如肿瘤组织样品的标记核酸杂交。包含生物标志物转录物的样品获得阳性杂交信号。制备DNA阵列的方法及其应用是本领域公知的。
在某些实施方式中，为了监测核酸生物标志物mRNA的表达水平，可以从待测生物样品中提取mRNA、逆转录并可以产生荧光标记的cDNA探针。然后将标记的cDNA探针应用于能够与生物标志物杂交的微阵列，允许探针与微阵列杂交并扫描载玻片以测量荧光强度。该强度与杂交强度和生物标志物的表达水平相关。
用于检测生物标志物的探针的类型包括cDNA、核糖核酸探针、合成的寡核苷酸和基因组探针。使用的探针的类型通常由具体情况决定，例如，比如核糖核酸探针用于原位杂交，而 cDNA用于RNA印迹法。在某些非限制性实施方式中，探针针对具体生物标志物RNA独特的核苷酸区域。探针可以所需的一样短，以差异性识别具体生物标志物mRNA转录物，并且可以短至例如15个碱基。也可以使用至少17个碱基、18个碱基和20个碱基的探针。在某些实施方式中，引物和探针在严格条件下与具有对应于靶基因的核苷酸序列的核酸片段特异性杂交。本文使用的术语“严格条件”是指只有在序列之间存在至少95％或至少97％的同一性时才会发生杂交。
探针标记的形式可以是任何合适的形式，比如使用例如32P和35S的放射性同位素、或荧光团。可以通过使用适当的标记的碱基来实现用放射性同位素的标记，无论所述探针是化学合成还是生物合成的。
用于检测和/或测定生物标志物例如ARID1A蛋白的水平的方法，对本领域技术人员而言是熟知的，并且包括但不限于质谱技术、一维或二维凝胶分析系统、色谱、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫组织化学。这些方法使用抗体或抗体等同物来检测蛋白质，或使用生物物理技术。也可以使用抗体阵列或蛋白质芯片。
在某些非限制性实施方式中，用于测量生物标志物表达的检测方法包括以下步骤：将生物样品例如组织样品与选择性结合生物标志物的抗体或其变体(例如，片段)接触，以及检测抗体或其变体是否结合样品。该方法还可以包括将样品与第二抗体例如标记的抗体接触。该方法还可以包括例如一个或多个洗涤步骤，以除去一种或多种试剂。
在某些非限制性实施方式中，免疫印迹可用于检测和定量生物标志物的蛋白质表达水平。细胞或组织可以在裂解缓冲液中匀浆以形成裂解物，然后进行SDS-PAGE并印迹至膜，比如硝酸纤维素滤膜。然后将抗体(未标记的)与膜接触，并通过二次免疫试剂例如标记的蛋白 A或抗免疫球蛋白(合适的标记包括125I、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)来分析。也可以使用色谱检测。在某些实施方式中，可以使用增强的化学发光系统(例如，来自PerkinElmerLife Sciences，Boston，Mass.)，用抗生物标志物的抗体进行免疫检测。然后可以将膜剥离，并用对照蛋白特异性的对照抗体再印迹。
免疫组织化学可用于检测例如在活检样品中的生物标志物的表达和/或存在。可以将合适的抗体与例如细胞薄层接触，接着洗涤以除去未结合的抗体，然后与标记的第二抗体接触。可以通过荧光标志物、比如过氧化物酶的酶类、抗生物素蛋白或放射性标记进行标记。该试验可以使用显微镜可视地评分，并且可以对结果进行定量。基于机器或自动成像系统也可用于测量生物标志物的免疫染色结果。
适合用于免疫组织化学的各种自动化的样品处理、扫描和分析系统在本领域中是可获得的。这样的系统可以包括自动化的染色(参见，例如Benchmark系统，VentanaMedicalSystems， Inc.)和显微镜扫描、计算机化的图像分析、连续切片比较(以对样品的方向和大小中的变量进行控制)、数字报告生成，以及样品(比如放置组织切片的载玻片)的存档和跟踪。细胞成像系统是商业上可获得的，其将常规光学显微镜与数字图像处理系统相结合以对细胞和组织包括免疫染色的样品进行定量分析。参见，例如CAS-200系统(Becton，Dickinson&Co.)。
针对生物标志物的标记抗体也可以用于成像目的，例如，以检测受试者的细胞中生物标志物的存在。合适的标记包括放射性同位素，碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc)，荧光标记比如荧光素和罗丹明，以及生物素。可以使用不同的酶比如过氧化物酶、碱性磷酸酶或不同的色原体比如DAB、AEC或Fast Red来显现免疫酶相互作用。标记的抗体或抗体片段将优先聚集在包含生物标志物的细胞的位置处。然后可以使用已知的技术检测标记的抗体或其变体，例如抗体片段。
抗体包括与待检测的生物标志物足够有力并特异性结合的、无论天然或合成的、全长或其片段、单克隆或多克隆的任何抗体。抗体可以具有至多约10～6M、10～7M、10～8M、10～9 M、10～10M、10～11M和10～12M的Kd。短语“特异性结合”是指，例如抗体与表位或抗原或抗原决定簇的结合，其结合方式为可以用相同或相似的表位、抗原或抗原决定簇的第二制备物置换或竞争该结合。
可以使用的抗体及其衍生物包括多克隆或单克隆抗体、合成的和工程化的抗体、嵌合的、人的、人源化的、灵长类化的(CDR移植)、镶嵌化的(veneered)或单链抗体、相产生的抗体(phase produced antibody)(例如，来自噬菌体展示文库)、以及抗体的功能性结合片段。例如，可以使用能够结合生物标志物或其部分的抗体片段，其包括但不限于Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2片段。这样的片段可以通过酶剪切或通过重组技术产生
在某些非限制性实施方式中，使用除抗体之外的特异性结合多肽的试剂，比如肽。可以通过本领域已知的任何方法，例如肽噬菌体展示文库，来鉴定特异性结合的肽。通常，可以使用能够检测生物标志物多肽的一种试剂，从而检测生物标志物的存在和/或进行定量。
此外，可以使用质谱比如MALDI/TOF(飞行时间)、SELDI/TOF、液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)、毛细管电泳-质谱、核磁共振光谱或串联质谱(例如MS/MS、MS/MS/MS、ESI-MS/MS等)来检测生物标志物。
质谱方法是本领域公知的，并且已经用于定量和/或鉴定生物分子，比如蛋白质(参见，例如Li等人(2000)Tibtech 18：151-160；Rowley等人(2000)Methods20：383-397；和Kuster 和Mann(1998)Curr.Opin.Structural Biol.8：393-400)。而且，已经开发了允许对分离的蛋白质进行至少部分从头测序的质谱技术。Chait等人，Science 262：89-92(1993)；Keough 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96：7131-6(1999)；综述见Bergman，EXS88：133-44(2000)。
检测生物标志物或其它物质的存在通常包括检测信号强度。这可以依次反映结合于底物的多肽的数量和特性。例如，在某些实施方式中，可以比较(例如，可视化地或通过计算机分析)来自第一样品和第二样品的光谱的峰值的信号强度，以测定具体生物标志物的相对量。软件程序比如Biomarker Wizard程序(Ciphergen Biosystems,Inc.，Fremont，Calif.)可用于帮助分析质谱。
在本发明中，所述突变为截断突变。
在本发明中，所述ARID1A表达包括ARID1A蛋白表达和/或ARID1A基因转录。
本发明的另一方面提供，检测如上文所述的生物标志物的物质和检测对PARP抑制剂耐药的物质在制备评估肺癌患者对质子放疗敏感性的产品中的用途。
本发明中，所述的PARP抑制剂选自Olaparib、Rucaparib和Niraparib中至少一种。优选为， Olaparib。
本发明中，所述检测对PARP抑制剂耐受的物质包括检测对PARP抑制剂的半数抑制浓度 IC50值；和/或，检测RAD51的foci阳性细胞百分率。
试剂盒
本发明的另一方面，还提供了一种评估肺癌患者对质子放疗敏感性的产品，所述产品包括检测如上文所述的生物标志物的物质和检测对PARP抑制剂耐药的物质。
本发明中，所述产品包括试剂盒、芯片、膜条。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供了用于预测肺癌患者对质子放疗敏感性的试剂盒、芯片、膜条，其包含用于检测前述部分所示生物标志物的试剂。所述试剂盒、芯片、膜条还包括描述使用试剂盒以测定ARID1A是否可能在肺癌中产生抗癌效果的说明书或支持材料，和/或提及描述其的网站或出版物。
试剂盒、芯片、膜条的类型包括但不限于包装的生物标志物特异性的探针和引物组(例如TaqMan探针/引物组)、阵列/微阵列、生物标志物特异性的抗体、生物标志物特异性的珠，其还包含一个或多个探针、引物或用于检测本发明的一种或多种生物标志物的其它试剂。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供了用于预测肺癌患者对质子放疗敏感性的试剂盒，其包含用于检测核酸生物标志物的存在的工具。
在具体的非限制性实施方式中，试剂盒可包含适合于聚合酶链式反应(PCR)或核酸测序的一对寡核苷酸引物，用于检测待鉴定的核酸生物标志物。一对引物可包含与上述生物标志物互补的核苷酸序列，并且具有足够长度以与所述生物标志物选择性杂交。或者，互补核苷酸可选择性地与生物标志物位置5′和/或3′足够接近的特定区域杂交，以进行PCR和/或测序。试剂盒中可包含多种生物标志物特异性的引物，以同时检测多于一种生物标志物。试剂盒还可以包含一种或多种聚合酶、逆转录酶和核苷酸碱基，其中核苷酸碱基还可以被可检测地标记。
在某些非限制性实施方式中，引物的长度可以是至少约10个核苷酸或至少约15个核苷酸或至少约20个核苷酸，和/或至多约200个核苷酸或至多约150个核苷酸或至多约100个核苷酸或至多约75个核苷酸或至多约50个核苷酸。
在另一个非限制性实施方式中，寡核苷酸引物可固定在固体表面、基板或支持物上，例如固定在核酸微阵列上，其中每个寡核苷酸引物与固体表面或支持物结合的位置是已知的和可鉴定的。寡核苷酸可以固定到基板，比如玻璃、塑料、纸、尼龙或其它类型的膜、滤器、芯片、珠或任何其它合适的固体支持物上。多核苷酸可以直接在基板上合成，或者分离于基板合成，然后固定在基板上。使用已知的方法制备阵列。
在具体的非限制性实施方式中，试剂盒可包含至少一种适于原位杂交或原位荧光杂交的核酸探针，用于检测待鉴定的生物标志物。此类试剂盒通常包含一种或多种对各种生物标志物具有特异性的寡核苷酸探针。用于测试多种生物标志物的工具可任选地包含在单一试剂盒中。
在某些实施方式中，试剂盒可包括容器(包括适用于在本方法的自动化实施中使用的微量滴定板)，每个容器具有方法中使用的各种试剂(通常为浓缩形式)一种或多种，包括例如，预制的微阵列、缓冲液、适当的三磷酸核苷(例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP，或rATP、rCTP、rGTP和UTP)、逆转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、以及一个或多个本发明的探针和引物(例如，适当长度的连接到与RNA聚合酶反应的启动子的聚(T)或随机引物)。
在非限制性实施方式中，本发明提供用于预测肺癌患者对质子放疗敏感性的试剂盒，其包含用于检测上文所述的生物标志物水平的工具。
在非限制性实施方式中，试剂盒可包含至少一种抗体或其抗原结合片段，用于待鉴定的生物标志物的免疫检测。可以使用如本领域技术人员通常已知的常规的免疫技术制备特异性靶向生物标志物的多克隆和单克隆抗体。试剂盒的免疫检测试剂可包括与给定抗体或抗原本身相关的或连接的可检测标记。此类可检测标记包括例如化学发光或荧光的分子(若丹明、荧光素、绿色荧光蛋白、荧光素酶、Cy3、Cy5或ROX)、放射性标记(3H、35S、32P、14C) 或131I或酶(碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)。
在另一个非限制性实施方式中，可提供一种或多种生物标志物特异性的抗体结合于固体支持物，比如柱基质、阵列或微量滴定板的孔。或者，支持物可以作为试剂盒的单独元件提供。
在某些非限制性实施方式中，当试剂盒中的测量工具使用阵列时，上述生物标志物的组可构成呈现在微阵列上的生物标志物的种类的至少10％或至少20％或至少30％或至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％。
在某些非限制性实施方式中，本发明公开的试剂盒可包含用于检测样品中生物标志物表达水平的一种或多种探针、引物、抗体或其他检测试剂。例如，试剂盒可以包含用于检测生物样品中生物标志物的蛋白质表达水平的抗体或其片段。
在某些非限制性实施方式中，本发明公开的试剂盒可包含用于检测样品中ARID1A表达水平的一种或多种探针、引物、抗体或其它检测试剂。例如，试剂盒可以包含用于检测生物样品中ARID1A的蛋白质表达水平的抗体或其片段。
在某些非限制性实施方式中，本发明公开的试剂盒可包含用于检测样品中ARID1A的表达水平的一种或多种探针、引物、抗体或其它检测试剂。例如，试剂盒可以包含用于检测生物样品中ARID1A的蛋白质表达水平的抗体或其片段。
试剂盒还可包含用于允许在癌症样品中的生物标志物水平与参考对照样品中的生物标志物水平之间进行比较的工具。例如但不限于，本发明公开的试剂盒包含一种或多种用于检测参考蛋白或mRNA的探针、引物、抗体或其它检测试剂，其可以用于将样品中一种或多种生物标志物的表达水平归一化以允许比较。参考蛋白例如管家蛋白的非限制性实例包括α-或β -微管蛋白、肌动蛋白、丝切蛋白、黏着斑蛋白和GADPH。
在某些非限制性实施方式中，试剂盒还可以包括使用试剂盒检测目的生物标志物的说明书。
增敏剂
本发明的另一方面，还提供了一种用于提高肺癌患者对质子放疗敏感性的增敏剂。在某些非限制性实施方式中，所述的增敏剂包括1)～3)至少任一项：
1)抑制ARID1A蛋白活性的物质；
2)抑制ARID1A基因转录或表达的物质。
3)导致对PARP抑制剂耐药的物质。
本发明中“增敏剂”是指任何可抑制上文所述的生物标志物或其表达产物的稳定性、抑制所述的生物标志物的表达、降低所述的生物标志物的有效作用时间或抑制所述的生物标志物的转录的物质。
本发明中，所述的增敏剂包括抑制和/或降低生物标志物的表达和/或活性的化合物、分子、化学品、多肽、蛋白质。非限制性实例包括特异性抑制生物标志物的表达或活性的核酶、反义寡核苷酸、shRNA分子和siRNA分子。另外一个非限制性实例包括与生物标志物核酸序列的至少一部分同源的反义、shRNA或siRNA核酸序列，其中所述部分相对于生物标志物核酸序列的同源性为至少约75％或至少约80％或至少约85％或至少约90％或至少约95％或至少约 98％，其中百分比的同源性可以通过例如BLAST或FASTA软件测定。在某些非限制性实施方式中，互补部分可以构成至少10个核苷酸或至少15个核苷酸或至少20个核苷酸或至少25个核苷酸或至少30个核苷酸，并且反义核酸、shRNA或siRNA分子的长度可以至多15或至多20或至多25或至多30或至多35或至多40或至多45或至多50或至多75或至多100个核苷酸。反义、 shRNA或siRNA分子可以包含DNA或非典型或非天然存在的残基，例如但不限于硫代磷酸酯残基。
在某些非限制性实施方式中，所述的增敏剂还包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂。
本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。
本发明的增敏剂可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的增敏剂的施用途径不受限制，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明的增敏剂的剂量不受限制，只要获得期望的效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。
本发明的另一方面提供，一种评估肺癌患者对质子放疗敏感性的方法，包括如下步骤：
1)检测生物样本的ARID1A表达或活性，得到检测结果一；
2)检测生物样本对PARP抑制剂的耐受性，得到检测结果二；
3)根据检测结果一和/或检测结果二，评估肺癌患者对质子放疗的敏感性。
如本文所用，术语“样本”是指从如本文所述的目的来源获得或衍生的生物样本。在一些实施方案中，目的来源包含生物体，诸如动物或人。在一些实施方案中，生物样本包含生物组织或液体。在一些实施方案中，生物样本可以是或包含骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针活检样本；含有细胞的体液；游离漂浮核酸；痰液；唾液；尿液；脑脊液腹膜液；胸膜液；粪便；淋巴；皮肤拭子；口服拭子；鼻拭子；洗涤物(washings)或灌洗物，诸如导管灌洗物或支气管肺泡灌洗物；吸出物；刮屑；骨髓标本；组织活检标本；手术标本；粪便，其他体液，分泌物和/或排泄物；和/或其中的细胞等。在一些实施方案中，生物样本是或包含从个体获得的细胞。在一些实施方案中，样本是通过任何合适的手段直接从目的来源获得的“初级样本”。例如，在一些实施方案中，通过选自以下的方法获得初级生物样本：活组织检查(例如，细针抽吸或组织活组织检查)、手术组织、体液(例如，血液、淋巴、粪便等)的收集等。
在某些实施方式中，所述的生物样本为NSCLC细胞。
在某些实施方式中，将生物标志物的水平与参考对照水平进行比较。本文可互换使用的的“参考对照水平”或“参考对照表达水平”可以使用例如参考对照样品来确立。参考对照样品的非限制性实例包括对质子放疗敏感的肺癌患者样本。
在某些实施方式中，检测肺癌患者的肿瘤细胞中的ARID1A表达或活性包括：检测ARID1A蛋白表达和/或检测ARID1A转录表达。
在某些实施方式中，所述的检测结果一包括：表达或不表达。
在某些实施方式中，检测肺癌患者的肿瘤细胞中对PARP抑制剂的耐受性包括：对PARP 抑制剂的半数抑制浓度IC50或RAD51 foci阳性细胞百分率。对PARP抑制剂的半数抑制浓度 IC50值＞10μM为耐受，对PARP抑制剂的半数抑制浓度IC50值＜10μM为敏感；RAD51foci 阳性细胞百分率变化显著为敏感，RAD51 foci细胞百分率变化不显著为耐受。
在某些实施方式中，所述的检测结果二包括：敏感和耐受。
如果检测结果一为不表达，检测结果二为敏感，则说明肺癌患者对质子放疗不敏感。后续可进行Olaparib治疗。
如果检测结果一为不表达，检测结果二为耐受，则说明肺癌患者对质子放疗敏感。后续可进行质子放疗。
如果检测结果一为表达，检测结果二为敏感，则说明肺癌患者对质子放疗不敏感。后续进行Olaparib治疗。
如果检测结果一为表达，检测结果二为耐受，后续可进行ARID1A靶向药或Olaparib进行质子放疗增敏。
本发明的ARID1A提高NSCLC患者质子放疗敏感性的技术方案详见图29。
本发明的另一方面提供，一种提高对质子放疗敏感性的方法，包括如下步骤：
1)检测生物样本对PARP抑制剂的耐受性，
2)根据检测结果，判定为敏感，则采用PARP抑制剂对所述的生物样本处理，获得对PARP 抑制剂耐受的生物样本，然后用药物或siRNA干扰技术抑制ARID1A的表达。
本申请中的下述具体实施例中，不同浓度梯度的Olaparib溶液的浓度梯度为：0μM、 0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、20μM、40μM、50μM、80μM、100μM。
实施例1
本实施例中，Olaparib溶液处理15种NSCLC细胞后，分析NSCLC细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值与质子放疗RBE0.1值之间的相关性，包括如下：
1、15种NSCLC细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值
实验细胞：15种NSCLC细胞，包括H23细胞、H1792细胞、H1838细胞、H3122细胞、A549、H460细胞、HCC44细胞、H1666细胞、CALU6细胞、H1703细胞、H1563细胞、JPC3 细胞、H441细胞、COR-L105细胞、H1793细胞。
试剂：Olaparib(奥拉帕尼)溶解于二甲基亚砜中并储存于-20℃作为母液，使用前将药 Olaparib用细胞培养对应的完全培养基稀释至12个不同浓度梯度的Olaparib溶液，浓度梯度分别为0μM、0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、20μM、40μM、50μM、80μM、 100μM。
取对数生长期的15种实验细胞，以8000个细胞/mL，每孔各100μL，接种于96孔板中。细胞培养24h贴壁后，每种细胞分别加入不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天，随后加入 30μl CTG试剂，按照
发光法细胞活力检测试剂盒说明书操作，检测细胞活力。以0μM处理为对照，换算细胞存活百分率，然后通过Graph Prism 8数据处理软件，通过绘制量效曲线计算药物的半数抑制浓度(IC50)值，15种NSCLCs细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值见表1。
表1
从表1可知，不同细胞经Olaparib处理后，对Olaparib的半数抑制浓度IC50值不同。根据半数抑制浓度IC50值为10μM，将NSCLC细胞分为内源性Olaparib耐受细胞和内源性Olaparib敏感细胞，内源性Olaparib耐受细胞包括H1666、CALU6、H1703、H1563、JPC3、H441、COR-L105、 H1793，内源性Olaparib敏感细胞包括H23、H1792、H1838、H3122、A549、H460、HCC44。
图1为本实施例中经不同浓度Olaparib溶液处理6天后，15种NSCLC细胞的细胞存活比例曲线图。
从表1和图1可知，NSCLC细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值越大，细胞对Olaprib越耐受。
2、12种NSCLC细胞的质子放疗的RBE0.1值
细胞：12种NSCLC细胞，包括H23、H1792、H3122、A549、H460、HCC44、H1666、 CALU6、H1703、H1563、JPC3、H1793。
通过细胞克隆实验，检测了12种NSCLC细胞的质子放疗的RBE0.1值。
细胞克隆实验参见文献(1)：(1)Liu Q,Ghosh P,Magpayo N,Testa M,Tang S,Gheorghiu L,et al.Lung cancer cell line screen links fanconi anemia/BRCApathway defects to increased relative biological effectiveness of protonradiation.International journal of radiation oncology, biology,physics.2015；91(5):1081-9。
质子放疗RBE0.1值的计算方法，参考文献(2)：(2)Paganetti H.Relativebiological effectiveness(RBE)values for proton beam therapy.Variations as afunction of biological endpoint,dose,and linear energy transfer.Physics inmedicine and biology.2014；59(22):R419-72。
12种NSCLC细胞的质子放疗的RBE0.1值见表2。
表2
3、NSCLC细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值与质子放疗的RBE0.1值的相关性分析
将步骤1获得对Olaparib的半数抑制浓度IC50值与步骤2获得的质子放疗的RBE0.1值，进行 Pearson相关性分析。
图2为本实施例中12种细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值与质子放疗的RBE0.1值的相关性曲线图。
从图2可知，NSCLC细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值与质子放疗的RBE0.1值呈正相关，r＝0.7274，**p＝0.0073；表明对Olaparib的半数抑制浓度IC50值越大，RBE0.1值就越大，也即NSCLCs细胞对Olaparib越耐受，细胞对质子放疗越敏感。
4、根据GDSC数据库，分析细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值与质子放疗的RBE0.1值的相关性
从癌症药物敏感性基因组学(GDSC)数据库中，提取经Olaparib处理72h后，19种NSCLC 细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值，并与步骤2获得的质子放疗的RBE0.1值进行Pearson相关性分析。19种NSCLC细胞包括H23、H1792、H3122、A549、H460、HCC44、H1666、CALU6、 H1703、H1563、JPC3、H1793、ABC-1、H1869、PC14、H299、H520、H1915、HCC827。
图3为本实施例的从GDSC数据库提取的19种NSCLC细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值与质子放疗的RBE0.1值的相关性曲线图。
从图3可知，经Olaparib处理72h后，细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值与质子放疗的 RBE0.1值呈正相关，r＝0.6054，**p＝0.006；说明NSCLC细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值越大，质子放疗的RBE0.1值就越大，也即NSCLC细胞对Olaparib越耐受，说明细胞对质子放疗越敏感。
综合实施例1的结果表明，NSCLC细胞对Olaparib越耐受，质子治疗就越敏感。
实施例2
本实施例中，分析NSCLC细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值与ARID1A截断突变的相关性，包括如下：
通过COSMIC数据库(https://cancer.sanger.ac.uk/cell_lines)，分析对Olaparib敏感和对 Olaparib耐受的肺腺癌细胞(LUAD)的体细胞突变情况。
图4为本实施例中从COSMIC细胞数据库获得的肺腺癌细胞(LUAD)遗传突变与Olaparib 化疗敏感性和耐受性的火山图。其中，mut代表突变，左边箭头代表越往左走，对Olaparib越敏感；右边的箭头代表越往右走，对Olaparib越耐受。
从图4可知，与野生型肺腺癌细胞相比，ARID1A截断突变型肺腺癌细胞对Olaparib的耐受性更加显著(*p＝0.0344)；与野生型肺腺癌细胞相比，KRAS突变肺腺癌细胞对Olaparib的敏感性无显著统计学差异(p>0.05)；与野生型肺腺癌细胞相比，MET突变肺腺癌细胞对 Olaparib的敏感性无显著统计学差异(p>0.05)。
图5为本实施例中从GDSC细胞数据库获得的ARID1A截断突变型NSCLC细胞和ARID1A 野生型NSCLC细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值的柱形图。其中，WT代表野生型，Mut 代表突变型。
从图5可知，与ARID1A野生型NSCLC细胞相比，ARID1A截断突变型NSCLC细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值显著增高(*p＝0.0364)；说明ARID1A截断突变型细胞对Olaparib 更加耐受。
图6为本实施例中ARID1A截断突变型NSCLC细胞和ARID1A野生型NSCLC细胞的质子放疗的RBE0.1值的比较图。其中，WT代表野生型，Mut代表突变型。
从图6可知，与ARID1A野生型NSCLC细胞相比，ARID1A截断突变型NSCLC细胞的质子放疗的RBE0.1值显著增高(***p＝0.0006)，说明ARID1A截断突变型细胞对质子放疗更加敏感。
实施例2的结果综合说明，ARID1A截断突变型NSCLC细胞对Olaparib耐受，但对质子放疗特异性的敏感。
实施例3
本实施例中，进行了ARID1A野生型NSCLC细胞、ARID1A截断突变型NSCLC细胞中ARID1A表达量检测，以及ARID1A表达量与质子放疗RBE0.1值的相关性分析，包括如下：
实验对象：8种NSCLC细胞，包括ARID1A野生型NSCLC细胞和ARID1A截断突变型NSCLC细胞。其中，ARID1A野生型NSCLC细胞为：H23、H1792、A549、CALU6和JPC3； ARID1A截断突变型NSCLC细胞为：H460、H1563和H1793。
以β-actin为内参，采用免疫印迹法检测ARID1A野生型NSCLC细胞和ARID1A截断突变型NSCLC细胞中ARID1A的表达，采用Image J分析免疫印迹蛋白条带的灰度值，计算ARID1A的相对表达量。同时，采用细胞克隆实验检测各细胞的质子放疗的RBE0.1值。
1、NSCLC细胞中ARID1A表达水平与质子放疗的RBE0.1值的相关性分析
图7为本实施例中ARID1A野生型NSCLC细胞和ARID1A截断突变型NSCLC细胞中ARID1A表达的免疫印迹图。
从图7可知，ARID1A截断突变型NSCLC细胞几乎不表达ARID1A。
图8为本实施例中8种NSCLC细胞中ARID1A的表达水平与质子放疗的RBE0.1值的Pearson相关性分析图。
从图8可知，ARID1A表达水平与质子放疗的RBE0.1值成显著负相关(**p＝0.0084，r＝-0.8442)。
2、NSCLC细胞中ARID1A表达水平以及NSCLC细胞对Olaparib的半数抑制浓度IC50值与质子放射剂量RBE0.1值之间的相关性分析
根据对Olaparib的半数抑制浓度IC50值，将NSCLC细胞分为Olaparib耐受细胞和Olaparib 敏感细胞。其中，IC50值>10μM为Olaparib耐受细胞，标记为Res；IC50值<10μM为Olaparib 敏感细胞，标记为Sen。采用IC50＝10μM作为Olaparib敏感(Sen)和耐受(Res)临界值有两个依据：一个是临床Olaparib血药浓度Cmax＝13.1μM，即人体血液中能达到的Olaparib最高浓度为13.1μM，参考文献为：Clin Cancer Res 2017Jul 15；23(14):3489-3498.doi: 10.1158/1078-0432.CCR-16-3083；一个是有课题组定义临床Olaparib耐药体系以IC50>10μM 为临界值，参考文献为：Cancer Discov.2018Nov；8(11):1404-1421.doi:10.1158/2159-8290.CD-18-0474。
根据ARID1A的突变信息，将NSCLC细胞分为ARID1A野生型细胞和ARID1A截断突变型细胞。其中，ARID1A野生型细胞标记为WT，ARID1A截断突变型细胞标记为Mut。
综合对Olaparib的半数抑制浓度IC50值和ARID1A的突变信息，将NSCLC细胞分为四个亚型，分别为Res WT、Res Mut、Sen WT、Sen Mut，通过单因素的ANOVA统计学分析方法，进行ARID1A截断突变联合Olaparib耐受性与质子放疗的RBE0.1值的差异分析。
图9为本实施例中四个亚型NSCLC细胞与质子放疗的RBE0.1值的统计图。其中，ResWT 代表对Olaparib耐受的ARID1A野生型细胞；Res Mut代表对Olaparib耐受的ARID1A截断突变型细胞；Sen WT代表对Olaparib敏感的ARID1A野生型细胞；Sen Mut代表对Olaparib敏感的ARID1A截断突变型细胞。
从图9可知，ARID1A截断突变联合Olaparib耐受的NSCLC细胞，即Res Mut亚型NSCLC 细胞对质子放疗极显著敏感(RBE0.1＝1.4)。
实施例3的结果综合说明，ARID1A截断突变型NSCLC细胞几乎不表达ARID1A；ARID1A 表达量与质子放疗的RBE0.1值成显著负相关；ARID1A截断突变且对Olaparib耐受的NSCLC细胞对质子放疗极显著敏感。
实施例4
本实施例中，分别以内源性Olaparib耐受细胞和内源性Olaparib敏感细胞为例，采用干扰技术或药物敲减法，以抑制细胞中ARID1A的表达，并进行与质子放疗的敏感性研究，包括如下：
1、以内源性对Olaparib敏感细胞为对象，采用siRNA技术干扰细胞中ARID1A表达，再经Olaparib处理，检测ARID1A的敲减效率、细胞存活率，并比较质子放疗的RBE0.1值。
所用靶向ARID1A的siRNA的靶向序列来源于文献：Chang L,Azzolin L,Di BiagioD, Zanconato F,Battilana G,Lucon Xiccato R,et al.The SWI/SNF complex is amechanoregulated inhibitor of YAP and TAZ.Nature.2018；563(7730):265-9.。
细胞：H23细胞，为内源性Olaparib敏感细胞。
H23细胞转染siRNA 48h后，通过免疫印迹检测ARID1A的敲减效率，作为实验组，标记为siARID1A组。同时设立空白对照组，标记为siCtr1组。然后，siARID1A组和siCtr1组分别经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后，检测细胞存活率。
图10为本实施例中，以H23细胞为对象，用siRNA技术干扰ARID1A表达48h后的免疫印迹图。其中，siCtr1为空白对照siRNA，siARID1A代表靶向ARID1A敲除的siRNA。
从图10可知，ARID1A在H23细胞中成功敲减，也即siRNA能有效减少ARID1A的蛋白水平。
图11为本实施例中，以H23细胞为对象，用siRNA技术干扰ARID1A表达48h后，再经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后的细胞存活曲线图。其中，R代表耐受，对Olaparib的半数抑制浓度IC50值>10μM；S代表敏感，对Olaparib的半数抑制浓度IC50值<10μM。
从图11可知，siCtr1组对Olaparib的半数抑制浓度IC50值为3.61μM；siARID1A组对Olaparib的半数抑制浓度IC50值为1.89μM，表明siARID1A组和siCtrl组均为Olaparib敏感细胞。
图12为本实施例中siCtr1组和siARID1A组的质子放疗RBE0.1值的比较图。
从图12可知，采用siRNA干扰技术降低H23细胞中ARID1A表达，对质子放疗不敏感，siCtr1组和siARID1A组对质子放疗的敏感性无显著差异(p>0.05)。
2、以内源性对Olaparib耐受细胞为对象，采用药物敲减细胞中ARID1A表达，再经Olaparib处理，检测ARID1A的敲减效率、细胞存活率，并比较质子放疗的RBE0.1值。
细胞：CALU6细胞，为内源性Olaparib耐受细胞；H23细胞，为内源性Olaparib敏感细胞；A549，为内源性Olaparib敏感细胞。
图13为本实施例中经0μM、5μM、10μM的Olaparib溶液处理72h后，CALU6细胞中ARID1A表达的免疫印迹图。
从图13可知，Olaparib显著抑制了CALU6细胞中ARID1A的表达。
图14为本实施例中分别经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后，CALU6细胞、H23 细胞和A549细胞的细胞存活曲线图。其中，R代表耐受，对Olaparib的半数抑制浓度IC50值>10μM；S代表敏感，对Olaparib的半数抑制浓度IC50值<10μM。
从图14可知，CALU6细胞为内源性Olaparib耐受细胞(IC50值>10μM)。
随后，以CALU6细胞为对象，经2.5μM Olaparib溶液处理24h后，接受X射线或质子放疗，为实验组(标记为Olaparib组)，得到Olaparib组质子放疗的RBE0.1值。同时，以Calu6细胞为对象，经DMSO处理24h，接受X射线或质子放疗，为空白对照组(标记为Vehicle 组)，得到Vehicle组质子放疗的RBE0.1值。
图15为本实施例中经Olaparib处理24h再接受X射线或质子放疗后，CALU6细胞的质子放疗RBE0.1值的图。其中，Vehicle组代表空白对照组，细胞经DMSO处理24h再接受X 射线或质子放疗；Olaparib组代表实验组，细胞经2.5μM Olaparib溶液处理24h再接受X射线或质子放疗。
图15可知，CALU6细胞经Olaparib与质子放疗联合处理后，其对质子放疗敏感性显著增加(***p＝0.0003)。
本实施例4的综合结果说明，内源性Olaparib敏感细胞经siRNA敲减后，能抑制细胞中 ARID1A表达，但仍为Olaparib敏感细胞，其对质子放疗不敏感。而内源性Olaparib耐受细胞经Olaparib处理后，能抑制细胞中ARID1A表达；经Olaparib和质子放疗联合处理内源性 Olaparib耐受细胞，能显著提高其对质子放疗的敏感性。因此，内源性Olaparib耐受细胞中 ARID1A缺陷对质子放疗更加敏感。
实施例5
本实施例中，构建获得性Olaparib耐受细胞并以其为研究对象，采用干扰技术或药物敲减法，以抑制细胞中ARID1A的表达，并进行与质子放疗的敏感相关性研究，包括如下：
1、获得性Olaparib耐受细胞的构建
(1)利用高浓度脉冲法(Olaparib浓度为100μM，平均8个月时间)，对H23细胞构建获得性Olaparib耐受细胞，得到的耐受细胞标记为H23PR，并通过免疫印迹实验，检测 H23细胞和H23PR细胞中ARID1A的表达。
耐受构建方法参考文献为：Sharma SV,Lee DY,Li B,Quinlan MP,Takahashi F,Maheswaran S,et al.A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state incancer cell subpopulations.Cell. 2010；141(1):69-80。
图16为本实施例中H23细胞和H23PR细胞ARID1A的免疫印迹图。
从图16可知，构建的H23PR细胞中ARID1A的表达量降低。
图17为本实施例中H23细胞和H23PR细胞中ARID1A表达量的生物学重复数据统计分析图。
从图17可知，H23PR细胞中ARID1A的表达量显著低于H23细胞。
将H23细胞和H23PR细胞分别经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后，观察细胞存活率。
图18为本实施例中经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后，H23细胞和H23PR细胞的细胞存活曲线图。
从图18可知，H23细胞的半数抑制浓度IC50值为2.584μM，而H23PR细胞的半数抑制浓度IC50值为19.43μM，说明H23细胞获得性Olaparib耐药模型(H23PR)构建成功。
(2)以A549细胞为研究对象，采用与H23PR细胞的构建方法，构建获得性Olaparib耐药，标记为A549PR细胞，通过免疫印迹实验检测A549细胞和A549PR细胞中ARID1A 的表达。
图19为本实施例中A549细胞和A549PR细胞ARID1A的免疫印迹图。
从图19可知，与A549细胞比较，A549PR细胞中ARID1A的表达无显著变化。
图20为本实施例中A549细胞和A549PR细胞中ARID1A表达的生物学重复数据统计分析图。
从图20可知，与A549细胞比较，A549PR细胞中ARID1A的表达无显著差异。
将A549细胞和A549PR细胞分别经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后，观察细胞存活率。
图21为本实施例中分别经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后，A549细胞和A549PR细胞的细胞存活曲线图。
从图21可知，A549细胞的半数抑制浓度IC50值为9.903μM，而A549PR细胞的半数抑制浓度IC50值为27.39μM，说明获得性Olaparib耐药模型(A549PR)构建成功。
尽管两个模型都显著耐药，但是ARID1A的表达却完全不一致，H23PR细胞中ARID1A表达显著缺失，而A549PR细胞中的ARID1A表达无显著改变，表明ARID1A的表达与Olaparib的耐药不相关。
2、检测了H23细胞和H23PR细胞的质子放疗的RBE0.1值
图22为本实施例中H23PR细胞分别经X射线(X)和质子射线(P)放疗后细胞克隆形成的存活曲线图。其中，X代表细胞经X射线放疗，P代表细胞经质子射线放疗。
从图22可知，ARID1A表达缺陷的H23PR细胞经质子射线放疗后，细胞存活率降低，表明其对质子放疗更加敏感。
图23为本实施例中H23细胞和H23PR细胞的质子放疗的RBE0.1值的比较图。
从图23可知，与H23细胞的质子放疗的RBE0.1值相比，H23PR耐药细胞中质子放疗的RBE0.1值显著增高，表明ARID1A在获得性Olaparib耐受的NSCLC细胞中缺陷后对质子放疗更加敏感。
构建H23PR ARID1A-V5细胞：125μLOpti-MEM稀释7.5μL Lipo3000组成混合物1；再125μL Opti-MEM稀释5μL P3000和2.5μg pcDNA6-ARID1A-V5(ARID1A-V5，addgene#39311)组成混合物2；将混合物1和2混合均匀后在室温下孵育12min。然后将250μL的混合物滴加到培养液中，6h后更换为正常培养基，转染48h后每孔中加入5-10μg/ml Blasticidin(InvivoGen，#ant-bl-05)，定期更换含Blasticidin细胞培养液，20天后，筛选转染克隆细胞，扩增后保种，利用免疫印迹验证，从而构建获得H23PR ARID1A-V5细胞，即ARID1A过表达H23PR细胞。
将H23细胞、H23PR细胞、H23PR ARID1A-V5细胞分别经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后，观察各细胞的细胞存活率。
图24为本实施例中经不同浓度梯度的Olaparib溶液处理6天后，H23细胞、H23PR细胞和H23PR ARID1A-V5细胞的细胞存活曲线图。其中，H23PR ARID1A-V5代表H23PR细胞过表达ARID1A。
从图24可知，H23PR ARID1A-V5细胞相对于H23PR细胞无显著改变，仍然为Olaparib 耐受细胞。
图25为本实施例中H23PR ARID1A-V5细胞经X射线(X)和质子射线(P)化疗后细胞克隆形成的存活曲线图。其中，A图为H23PR ARID1A-V5细胞经X射线(X)和质子射线(P)化疗后细胞克隆形成的存活曲线图；B图为H23PR细胞分别经X射线、质子射线(P) 照射后以及H23PR ARID1A-V5细胞分别经X射线、质子射线(P)照射后细胞克隆形成的存活曲线图。
从图25可知，ARID1A缺失的H23PR细胞中过表达ARID1A挽救ARID1A的表达后，其对光子(X-ray)和质子(Proton)的治疗反应没有差异。
图26为A549PR细胞的图。其中：图A为A549PR细胞分别X射线和质子射线化疗后细胞克隆形成的存活曲线图；图B为A549细胞和A549PR细胞的质子放疗的RBE0.1值的比较图；图C为免疫印迹法检测A549PR细胞转染siCtrl或者siARID1A 48h后ARID1A的干扰效率；图D为A549细胞和A549PR细胞转染siCtrl或者siARID1A后Olaparib处理后的细胞存活曲线图；图E为A549PR细胞转染siCtrl后分别经X射线、质子射线(P)作用后细胞克隆形成的存活曲线图；图F为A549PR细胞转染siARID1A后，分别经X射线(X)或者质子射线(P)作用后细胞克隆形成存活曲线图；图G为A549PR细胞转染siCtrl或者siARID1A 后质子放疗RBE0.1值的比较图。
从图26可知，利用siRNA干扰A549PR细胞中的ARID1A的表达量，发现，与对照组细胞的质子放疗RBE0.1值相比，敲减ARID1A后的A549PR细胞的质子放疗的RBE0.1值显著增高，表明表达ARID1A且对Olaparib耐受细胞，能通过基因敲减或药物敲减方法来抑制 ARID1A的表达从而提高NSCLC细胞对质子放疗的敏感性。
综合实施例5的结果表明，ARID1A在获得性Olaparib耐受的NSCLC细胞中缺陷后对质子放疗更加敏感。
实施例6
本实施例中，采用Olaparib分别处理内源性Olaparib耐受细胞和获得性Olaparib耐受细胞中RAD51 foci阳性细胞百分率变化情况，包括如下：
实验对象：13种NSCLC细胞，根据对Olaparib的半数抑制浓度IC50值分为Olaparib敏感细胞和Olaparib耐受细胞。其中，半数抑制浓度IC50值<10μM为Olaparib敏感细胞，半数抑制浓度IC50值>10μM为Olaparib耐受细胞。
Olaparib敏感细胞包括H23、H1792、H3122、A549、H460和HCC44；Olaparib耐受细胞包括H1666、CALU6、H1703、H1563、JPC3、H441和H1793。
10μM Olaparib溶液分别处理13种NSCLC细胞8h后，采用免疫荧光方法检测RAD51foci阳性细胞百分率，并进行t检验统计分析。同时，设立对照组，对照组处理的试剂为DMSO，标记为Vehicle组。其中，阳性细胞百分率为：100个细胞中RAD51 foci数目>10的细胞百分率。
免疫荧光法：
4×104细胞接种于8孔板，处理过夜后，加入10μM Olaparib溶液处理8h，随后细胞经 PBS清洗后，用4％PFA在室温下固定细胞15min，然后用0.5％Triton X的PBS溶液进行破膜，再滴加山羊血清抗体(5％goat-serum的PBS溶液)在室温下封闭45min。随后滴加一抗(3％GS的PBS溶液)于4℃过夜孵育，处理结束后用PBS洗涤，然后滴加二抗体在37℃处理45min，采用DAPI进行染核，滴加封片剂进行激光共聚焦观察。
图27为本实施例中采用10μM Olaparib溶液处理8h后，13种NSCLC细胞中RAD51foci 阳性细胞百分率比较图。其中：*为p<0.05，**为p<0.01，***为p<0.001，****为p<0.0001。
从图27可知，内源性Olaparib敏感细胞经Olaparib处理后RAD51 foci阳性细胞百分率显著增加，而内源性Olaparib耐受细胞经Olaparib处理后RAD51 foci阳性细胞百分率无显著改变。
以H23PR细胞、A549PR细胞和H460PR细胞为实验对象，用10μM Olaparib溶液处理8h后，检测各细胞中RAD51 foci阳性细胞百分率。H460PR细胞的构建方法同实施例2中的H23PR细胞。同时，设立空白对照组，空白对照组处理的试剂为DMSO，标记为Vehicle组。
图28为本实施例中经10μM Olaparib溶液处理8h后，H23PR细胞、A549PR细胞和H460PR细胞中的RAD51 foci阳性细胞百分率的变化图。
从图28可知，获得性Olaparib耐受细胞经Olaparib处理后，细胞中RAD51 foci阳性细胞百分率无显著改变。
Olaparib敏感细胞和Olaparib耐受细胞分别用10μM Olaparib溶液处理8h，得到细胞中的RAD51 foci阳性细胞百分率，然后采用Pearson卡方检验统计分析Olaparib敏感细胞和 Olaparib耐受细胞分别与RAD51 foci阳性细胞百分率变化情况之间的相关性。t检验后p>0.05 为NO，即不显著改变，p<0.05为YES，即显著改变，结果见表3。
表3
从表2可知，经Olaparib处理8h后，Olaparib敏感细胞中RAD51 foci阳性细胞百分率显著变为100％，而Olaparib耐受细胞中RAD51 foci阳性细胞百分率显著变为43％，Pearson 卡方统计分析发现p＝0.026，表明二者显著差异，即Olaparib敏感细胞中RAD51foci阳性细胞百分率的变化更明显。
本实施例6的综合结果可知，与乳腺癌中的应用场景不同，经Olaparib处理后，NSCLC 细胞中RAD51 foci阳性细胞百分率无显著变化的细胞更倾向于对Olaparib耐药，说明RAD51 foci阳性细胞百分率可以作为Olaparib的耐受评估分子标记物，即在NSCLC细胞中，细胞经 Olaparib作用后RAD51 foci阳性细胞百分率无显著改变提示NSCLC患者对Olaparib耐受。
综合可知，本发明发现ARID1A能作为评估肺癌患者对质子放疗敏感性的生物标志物， ARID1A联合对PARP抑制剂耐受的NSCLC细胞能作为评估肺癌患者对质子放疗敏感性的指标。同时发现ARID1A的靶向药或靶向分子制剂(抗体/小分子抑制剂/CRISPR-Cas9制剂)与质子放疗联合治疗Olaparib耐药的患者可极大的减少放射剂量，从而降低患者的辐射副反应，减轻经济负担，避免二次肿瘤的发生。综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (12)
1.一种评估肺癌患者对质子放疗敏感性的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为ARID1A。
2.检测如权利要求1所述的生物标志物的物质在制备评估肺癌患者对质子放疗敏感性的产品中的用途。
3.检测如权利要求1所述的生物标志物的物质和检测对PARP抑制剂耐药的物质在制备评估肺癌患者对质子放疗敏感性的产品中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述检测对PARP抑制剂耐药的物质包括检测对PARP抑制剂的半数抑制浓度IC50值；和/或，检测RAD51 foci阳性细胞百分率。
5.如权利要求2或3或4所述的用途，其特征在于，所述检测生物标志物的物质包括如下中的至少一项：
1)检测ARID1A表达的物质；
2)检测ARID1A突变的物质；
3)检测ARID1A蛋白活性的物质。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述突变为截断突变；
和/或，所述ARID1A表达包括ARID1A蛋白表达和/或ARID1A基因转录。
7.一种评估肺癌患者对质子放疗敏感性的产品，其特征在于，所述产品包括检测如权利要求1所述的生物标志物的物质和检测对PARP抑制剂耐药的物质。
8.如权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片、膜条。
9.如权利要求3所述的用途或如权利要求7所述的产品，其特征在于，所述PARP抑制剂选自Olaparib、Rucaparib和Niraparib中至少一种。
10.一种用于提高肺癌患者对质子放疗敏感性的增敏剂，其特征在于，所述增敏剂包括1)～3)至少任一项：
1)抑制ARID1A蛋白活性的物质；
2)抑制ARID1A基因转录或表达的物质。
3)导致对PARP抑制剂耐药的物质。
11.如权利要求10所述的增敏剂在制备用于提高肺癌患者对质子放疗敏感性的产品中的应用。
12.一种评估肺癌患者对质子放疗敏感性的方法，包括如下步骤：
1)检测生物样本的ARID1A表达或活性，得到检测结果一；
2)检测生物样本对PARP抑制剂的耐药性，得到检测结果二；
3)根据检测结果一和/或检测结果二，评估肺癌患者对质子放疗的敏感性。
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| CN102808016A (zh) * | 2011-05-30 | 2012-12-05 | 上海人类基因组研究中心 | Arid1a基因及其编码蛋白产物的应用 |
| CN103026227A (zh) * | 2010-04-22 | 2013-04-03 | 不列颠哥伦比亚省癌症分社 | 新的卵巢癌生物标志物和靶 |
| CN111979290A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-11-24 | 大连医科大学附属第二医院 | Spp1基因在制备增强卵巢癌患者对parp抑制剂敏感性的药物中的应用 |
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2022
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