KR20160057416A - 식도암에 대한 분자적 진단 검사 - Google Patents

식도암에 대한 분자적 진단 검사 Download PDF

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Abstract

식도 선암(OAC)을 위한 분자 진단적 검사의 확인을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 상기 검사는 신규한 DNA 손상 수선 결손 분자적 아형을 정의하고 이러한 아형의 환자의 분류를 가능하게 한다. 본 발명은 OAC 환자가 임의의 화학치료법의 투여에 앞서 치료 요법에 대해 임상적으로 반응성 또는 비-반응성인지를 결정하는데 이용될 수 있다. 본 검사는 현재 이용되고 있는 표준 세포독성 화학치료요법제 등 DNA 손상 또는 수선에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미치는 여러 약물과 함께 이용될 수 있다. 특히 본 발명은 특정 예측적 마커의 조합의 이용에 관한 것이고, 상기 예측적 마커의 발현은 치료 요법에 대한 반응성 또는 비-반응성과 연관이 있다.

Description

식도암에 대한 분자적 진단 검사{Molecular diagnostic test for oesophageal cancer}
본 발명은 DNA 손상 수선 결손(DNA-damage repair deficiency: DDRD) 아형 (subtype)의 이용을 포함하는 특정 치료를 위한 식도암(oesophageal cancer)의 반응성(responsiveness)을 예측하는데 유용한 분자적 진단 검사에 관한 것이다. 본 발명은 식도암 환자(특히 식도 선암(oesophageal adenocarcinoma: OAC) 환자)의 이러한 아형의 확인으로부터 유래하는, 이러한 DNA 손상 수선 결손 분자적 아형을 확인하기 위해 이용되는 44-유전자 분류 모델 등 다양한 분류자의 산출(generation) 및 이용을 포함한다. 일 적용은, DNA 손상 유발 제제 및 DNA 수선 표적 치료를 포함하는, 식도암 치료 약물 종류(class)에 대한, 반응성의 계층화 및 환자의 선별이다. 본 발명은 신규한 치료제의 임상 시험 평가 동안의 강화 전략(enrichment strategy)을 위한 환자군 선별뿐 아니라, 통상적인 치료 선택을 인도할 수 있는 검사를 제공한다. DNA 수선 결손 아형은, 예를 들면 신선/동결(fresh/frozen: FF) 또는 포르말린 고정 파라핀 포매(formalin fixed paraffin embedded: FFPE) 환자 시료로부터 확인할 수 있다.
제약 산업은 현재 투여되는 약물보다 더욱 효과적이거나, 더욱 특이적이거나, 또는 더 적은 부작용을 갖는 새로운 약물 치료 선택권을 계속해서 추구한다. 인간 집단 내의 유전적 가변성이 많은 약물의 효과에서 실질적인 차이를 초래하기 때문에 약물 치료법 대안이 끊임없이 개발 중에 있다. 그러므로, 광범위한 약물 치료법 선택권이 현재 이용 가능하더라도, 환자가 반응하지 못하는 상황에 더 많은 치료가 항상 요구된다.
전통적으로, 의사에 의해 이용되는 치료 패러다임은 질환을 치료하는데 가능한 가장 높은 성공률을 가져오는 제1차 선택 약물(first-line drug) 치료법을 처방하는 것이었다. 첫 번째가 비효과적일 경우 대안적 약물 치료법이 그 후 처방된다. 이러한 패러다임은 분명하게 특정 질환에 대한 최고의 치료방법이 아니다. 예를 들면, 암과 같은 질환에서, 첫 번째 치료는 종종 가장 중요하고, 성공적인 치료를 위해 최고의 기회를 제공하며, 따라서 특정 환자의 질환에 대해 가장 효과적으로 될 초기 약물을 선택할 증대된 필요성이 존재한다
식도암(식도의 암)은 매우 공격적인 질병이고, 세계에서 가장 흔한 10종의 암 중 하나이다. 지난 30년간 영국에서 더욱 흔한 것이 되었다. 성인에게 9번째로 흔한 암이며, 매년 영국에서 대략 8,500 사례가 진단된다(CRUK 통계). 식도암은 여성보다는 남성에게서 약 2배 흔하다. 선암(adenocarcinoma)은 선세포(glandular cell)에서 시작되는 암을 의미한다. 식도암에서는, 식도의 점막에서 점액을 만드는 세포들이 그러한 것들이다. 선암의 수는 지난 20년간 증가해왔다. 이들은 현재 진단되는 모든 식도암의 절반을 막 넘게 차지하고 있고, 나머지 발생은 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma)이 차지한다. 선암은 식도 아래 1/3에서 주로 발견된다.
일반적으로 식도 선암(OAC) 초기 단계의 치료는 수술이다. 수술적 치료는 비록 오로지 약 20%의 케이스이기는 하지만 반복적으로 장기간의 생존을 제공하는 유일한 치료이다(Muller JM et al. Br J Surg (1990) 77:845). 절제 수술의 결과는 우수할 수 있다. 종양이 점막에 국한될 때는 5년 생존율이 80%가 넘고, 점막 하 조직(submucosa)이 포함될 때는 50% 내지 80%이다(Bonavina L. Br J Surg (1995) 82:98; Holscher AH, et al. Br J Surg (1997) 84:1470).
마이크로어레이 및 분자 유전학의 출현은 질병의 진단 능력 및 예후 분류에서 상당한 영향력을 줄 잠재성을 가지고 있으며, 이는 정해진 치료 계획에 대한 개별 환자의 반응의 예측을 도울 수 있다. 마이크로어레이는 거대한 양의 유전적 정보의 분석을 제공하고, 그로 인한 개체의 유전적 지문을 제공한다. 이러한 기술이 궁극적으로 맞춤형 약물 치료 계획에 대한 필수적인 도구를 제공할 것이라는 지대한 관심이 존재한다.
현재, 헬스케어 전문가들은 그들이 화학요법적 제제로부터 이익을 받을 암환자를 확인하는 것을 도울 방법이 거의 없다. 어떤 약물 치료가 특정 암의 생리에 대해 가장 효과적일 것인지 정확하게 예측하기 위한 방법들이 이용 가능하지 않기 때문에, 최적의 제1차 선택 약물의 확인은 어렵다. 이러한 단점은 상대적으로 열악한 단일 제제 반응율 및 암 이환율 및 사망의 증가를 초래한다. 또한, 환자는 종종 불필요하게 비효과적인 독성 약물 치료를 받는다.
분자적 마커는, 예를 들면 유방암에서, 적절한 치료를 선택하기 위해 사용되어 왔다. HER2 성장 인자 수용체뿐 아니라 에스트로겐 및 프로게스테론 호르몬 수용체를 발현하지 않는 "3중 음성"이라 불리는 유방 종양은 PARP-1 저해제 치료에 반응을 나타낸다(Linn, S. C., and Van 't Veer, L., J. Eur J Cancer 45 Suppl 1, 11-26 (2009); O'Shaughnessy, J., et al. N Engl J Med 364, 205-214 (2011)). 최근의 연구는 유방 종양의 3중 음성 상태가 PARP-1 저해제를 포함하는 조합에 반응성을 나타내지만, 개별적인 PARP-1 저해제에는 그렇지 않을 수 있음을 나타낸다(O'Shaughnessy et al., 2011).
더욱이, 화학요법적 제제에 반응성을 나타내는 분자적 아형과 관련된 유전자 분류법을 확립하기 위한 다른 연구들이 있었다(Farmer et al. Nat Med 15, 68-74 (2009); Konstantinopoulos, P. A., et al., J Clin Oncol 28, 3555-3561 (2010)).
WO 2012/037378은 DNA 손상 수선 결손 분석인 44-유전자 DNA 마이크로어레이 분석을 기재한다. 이러한 분석은 DNA 손상 반응 FA/BRCA 경로를 잃어, DNA 손상 화학요법적 제제에 감수성(sensitivity)인 암의 분자적 하위군을 확인한다(Kennedy & D'Andrea Journal of Clinical Oncology (2006) 24:3799, Turner et al Nature Reviews Cancer (2004) 4:814).
유방암의 경우, 203명 유방암 환자에서 DDRD 분석이 선행보조적(neoadjuvant) DNA-손상 화학요법(5-플루오로우라실, 안트라시클린(anthracycline) 및 시클로포스파미드(cyclophosphamide))에 대한 반응을 예측하는 것을 보여주었다(Odd 비: 4.01)(95% Cl: 1.69-9.54). 보조적 5-플루오로우라실, 에피루비신 및 시클로포스파미드 치료에 의하여 치료된 191명의 초기(early) 유방암 환자의 코호트에서, 상기 분석은 0.37의 위험비(hazard ratio)로 5년의 재발 없는 생존을 예측하였다.
많은 경우의 OAC에서, 수술은 보통 시스플라틴 및 플루오로우라실의 조합인 선행보조적 화학치료 후에 이루어진다. 이러한 치료는 종양의 크기를 감소시키는데 이용된다. 그러나 모든 환자들이 이러한 형태의 치료에 반응을 보이지 않는 것이 알려져 있으며, 아직까지는 이러한 선행보조적 화학치료로부터 이득을 얻을 OAC 환자들을 확인하기 위한 검사가 없다. 따라서 많은 환자들은 치료적인 이득 없이 화학치료와, 관련된 부작용 및 삶의 질의 저하를 겪는다. DNA 손상 반응 경로는 식도암의 진행에서 중요한 것으로 알려져 왔다(He et al (2013) Carginogeneisis 34:139; Motoori et al International Journal of Oncology (2010) 37:1113). 따라서, 수술에 앞선 선행보조적 화학치료에 관련하여 OAC 환자들을 계층화하기 위한 검사에 대한 임상적 요구가 매우 크다.
본 발명은 식도암, 특히 OAC를 치료하기 위한 백금 기반 치료 등 특정 치료로부터 어떠한 환자들이 이득을 얻을지 결정하기 위해서, DNA 손상 수선의 결손을 확인하는 방법의 적용에 기초한다. 본 발명은 전사체(transcript)의 일부 또는 전부가 과발현 또는 하향발현되는 때와 같은, 식도암에서 발현되는 유전자 산물 마커의 수집을 이용하는 방법에 관한 것이고, DNA 손상 수선에 결손을 갖는 식도암의 아형을 확인한다. 본 발명은 또한 DNA-손상(DNA-damaging) 치료제에 대한 반응성 또는 저항성을 나타내기 위한 방법을 제공한다. 다른 측면으로는, 이러한 유전자 또는 유전자 산물 목록은 마이크로어레이, Q-PCR, 면역조직화학, ELISA 또는 다른 mRNA 또는 단백질 발현을 정량화할 수 있는 기술 등 당업계에 알려진 방법을 이용하여 전달될 수 있는 단일 파라미터 또는 다중 파라미터적 예측 검사의 기초를 형성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 측면에 따르면, DNA-손상 치료제로 치료하기 위해 (특히) 식도 선암(OAC) 등의 식도암을 갖는 개체의 반응성을 예측하는 방법으로서,
a. 개체로부터 얻은 검사 시료 내 하나 이상의 바이오마커/유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 바이오마커는, CXCL10, MX1, IDO1, IF144L, CD2, GBP5, PRAME, ITGAL, LRP4, 및 APOL3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커/유전자와 같이, 표 1A, 1B, 2A, 2B, 3 및/또는 4에 열거된 것로부터 선택된 것인 단계;
b. 상기 발현 수준을 포착하는(capture) 검사 점수를 유도하는 단계;
c. 상기 검사 점수 및 반응성을 연관시키는 정보를 포함하는 임계 점수를 제공하는 단계; 및
d. 상기 검사 점수를 상기 임계 점수와 비교하는 단계를 포함하고; 상기 반응성은 상기 검사 점수가 상기 임계 점수를 초과할 때 예측 및/또는 상기 반응성의 결여는 상기 검사 점수가 상기 임계 점수를 초과하지 않을 때 예측되는 것인 방법을 제공한다.
상기 방법은 개체를 위한 적절한 치료를 선택하기 위한 방법 또는 검사 및 치료 방법으로서 수행될 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 검사 점수가 임계 점수를 초과하는 경우(반응성이 예측됨), 그 개체는 DNA-손상 치료제로 치료한다. 유사하게, 검사 점수가 임계 점수를 초과하지 않는 경우(반응성이 예측되지 않음), 그 개체는 DNA-손상 치료제로 치료하지 않는다. 이러한 상황에서, 대안적인 치료가 고려될 수 있다. OAC에 대하여, 대안적인 치료는 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid) 또는 탁산(taxane) 등의 체세포 분열 저해제의 투여를 포함할 수 있다. 예시적인 빈카 알칼로이드는 비노렐빈(vinorelbine)을 포함한다. 예시적인 탁산은 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel)을 포함한다. 대안적으로, 상기 치료는 화학치료 모두를 배제하는 것일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 또한 반응성인 것으로 확인된 개체의 이후의 치료를 포함할 수 있다. 상응하는 키트 또한 고려된다. 상기 방법은 전형적으로 인 비트로에서 수행된다. 그러므로 상기 방법은 분리된, 또는 사전 분리된 시료를 이용하여 수행된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체로부터 검사 시료를 얻는 단계를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 검사 시료 내의 적어도 표 1 내지 4 중 임의의 10종의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다. 더욱 구체적으로, 일부 구체예에서 상기 방법은 적어도 10 종 및 최대 표 2B에 열거된 모든 44 종의 다른 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 발현 수준은 표 1A, 1B 또는 3에 기재된 표적 서열(서열번호: 1-24, 서열번호: 25-50 또는 서열번호: 51-230) 중 적어도 하나에 결합하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 측정한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 검사 시료 내의 하나 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 것을 추가적으로 포함하고, 상기 하나 이상의 바이오마커는 CDR1, FYB, TSPAN7, RAC2, KLHDC7B, GRB14, AC138128.1, KIF26A, CD274, CD109, ETV7, MFAP5, OLFM4, PI15, FOSB, FAM19A5, NLRC5, PRICKLE1, EGR1, CLDN10, ADAMTS4, SP140L, ANXA1, RSAD2, ESR1, IKZF3, OR2l1P, EGFR, NAT1, LATS2, CYP2B6, PTPRC, PPP1R1A, 및 AL137218.1로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 특정 구체예에서, 상기 검사 점수는 모든 바이오마커의 발현 수준을 포착한다. 일부 구체예에서, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 또는 0.5 등 대략 0.1 내지 0.5의 값에서 검사 점수가 임계 점수를 초과할 때 반응성이 예측된다. 예를 들면 대략 0.3681이다.
식도암은 전형적으로 식도 선암(OAC)이며, 초기 단계일 수 있다. 대안적으로, 상기 OAC는 후기(late stage) 또는 전이성 질병일 수 있다. 반응성이 예측될 시에 대한 치료는 전형적으로 선행보조적 치료이다. 그러나, 이는 보조적 치료를 추가적으로 또는 대안적으로 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명은 임의의 한 DNA-손상 치료제에 한정되지 않는다; 임의의 범위의 DNA-손상 치료제, 예를 들면 DNA 손상 및/또는 DNA 손상 수선에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미치는 DNA-손상 치료제는 반응자 및 비-반응자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 DNA-손상 치료제는 DNA 손상 제제, DNA 수선 표적 치료제, DNA 손상 신호 전달(signalling)의 저해제, DNA 손상 유발(induced) 세포 주기 정지(cell cycle arrest)의 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 열 충격 단백질 저해제 및 DNA 합성의 저해제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함한다. 더욱 구체적으로, 상기 DNA-손상 치료제는 백금-함유 제제, 겜시타빈(gemcitabine) 또는 5-플루오로우라실과 같은 뉴클레오시드 유사체(analogue), 또는 카페시타빈(capecitabine)과 같은 이들의 전구약물, 에피루비신 또는 독소루비신 등의 안트라시클린(anthracycline), 시클로포스파미드 등의 알킬화 제제, 이온화 방사선 또는 방사선 및 화학치료의 조합 (화학방사선 요법) 중 하나 이상으로부터 선택된 것일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 DNA-손상 치료제는 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)으로부터 선택된 백금 기반 제제와 같은 백금-함유 제제를 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에서는, 본 발명의 방법이 백금 기반 치료로부터 더욱 이익을 얻기 쉬운 OAC 환자의 예후적(prognostic) 지표로서 반응성/작용을 예측할 수 있음을 실험적으로 나타내었다. 상기 방법은 DNA-손상 치료제와 추가적인 치료법 또는 약물과 함께 치료하는 것에 대한 반응성을 예측할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 조합 치료법을 위한 반응성을 예측할 수 있다. 따라서 일부 구체예에서, 추가적인 약물은 체세포 분열 저해제이다.상기 체세포 분열 저해제는 빈카 알칼로이드 또는 탁산일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 빈카 알칼로이드는 비노렐빈이다. 다른 구체예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀 또는 도세탁셀이다. 특정 구체예에서, 하기의 (조합) 치료에 대한 반응자가 확인된다: 식도암의 치료에서, 시스플라틴/카르보플라틴 및 5-플루오로우라실(CF), 시스플라틴/카르보플라틴 및 카페시타빈(CX), 에피루비신/독소루비신, 시스플라틴/카르보플라틴 및 플루오로우라실(ECF), 에피루비신/독소루비신, 옥살리플라틴 및 카페시타빈(EOX), 및 파클리탁셀, 이리노테칸(irinotecan) 및 비노렐빈과의 조합, 탁산과 함께 또는 탁산 없이 방사선 또는 화학방사선 치료.
본 발명은 전체 생존(overall survival), 진행 없는 생존(progression free survival), 질병 없는 생존, RECIST로 정의된 방사선 반응, 완전 반응, 부분 반응, PSA, CEA, CA125, CA15-3 및 CA19-9와 같은, 그러나 이에 제한되지는 않는, 안정한 질병 및 혈청학적 마커 등의 여러 반응 분류를 이용하여, 약물(DNA-손상 치료제)에 대한 반응을 예측하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 단독 또는 표준 치료의 상황에서 DNA 손상 조합 치료요법으로 치료된 식도 선암(OAC) 환자의 내시경 초음파, CT, 나선형 CT, FDG-PET, 병리학적, 조직학적 반응을 평가할 수 있다.
본 발명은 본래는 유방암 및 난소암에서 확인된 DNA 손상 반응 결손(DDRD) 분자적 아형에 의존한다(WO2012/037378; 본 명세서에 참조로서 통합됨). 이러한 분자적 아형은 일부 구체예에서 두 개의 다른 유전자 분류자(classifier)를 이용하여 검출할 수 있다 - 하나는 40 유전자 길이 및 하나는 44 유전자 길이. DDRD 분류자는 Almac Breast Disease Specific Array(DSA™) 상에 53 프로브 세트로 구성된 분류로 처음 정의되었다. 그 능력의 맥락에서 상기 분류의 기능적 연관성을 입증하고, DNA-손상을 포함하는 화학치료 요법에 대한 반응성을 예측하기 위하여, 그 분류자는 유전자 수준에서 재정의될 필요가 있었다. Almac Breast DSA®이 아닌 마이크로어레이 플랫폼에서 프로파일된 독립적인 데이터 세트로부터의 마이크로어레이 데이터를 이용한 DDRD 분류자의 평가가 용이해졌다. 유전자 수준에서의 분류자 정의를 용이하게 하기 위해, 그 유전자들에 대한 Almac Breast DSA® 프로브 세트 맵이 정의될 필요가 있었다. 여기에는 Ensembl 및 NCBI Reference Sequece와 같은 공개적으로 이용가능한 게놈 브라우저 데이터베이스의 이용이 포함된다. 44-유전자 DDRD 분류자 모델은 40-유전자 DDRD 분류자 모델을 대체한다. 본 명세서에서 나타내는 결과는 44 및 40 유전자 분류자 모델 및 본 명세서에 개시된 마커로부터 유래한 관련 분류자 모델은 OAC의 경우 DNA-손상 치료제를 포함하는 화학치료 요법에 대한 반응의 효과적이고 유의한 예측자임을 증명하였다.
40-유전자 분류자 모델(표 2A 및 2B 참조) 및 44-유전자 분류자 모델과 같은, 표 1A 및 1B(또는 표 3 및 4)의 유전자를 기반으로 한 분류자 모델을 이용한 DDRD 아형의 확인은 DNA-손상 치료제 및 DNA 수선 표적 치료제를 포함하는 표준 OAC 치료제 종류에 대한 반응을 예측, 또는 이에 대한 환자를 선별하는데 이용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 PCR 및 실시간 및 엔드 포인트 방법 및 qPCR과 같은 PCR의 모든 변형을 포함하는 핵산 증폭, 차세대 시퀀싱(NGS), 마이크로어레이, 및 면역 조직 화학 등의 면역 분석, ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 상기 열거된 통상적인 진단 용도를 위한 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 유전자 또는 유전자 산물 및 mRNA 또는 단백질 발현의 양을 분석하기 위한 적절한 시약 및 지시자(direction)를 포함한다. 상기 키트는 표 1A, 1B 및/또는 3에 기재된 표적 서열에 결합하는 적절한 프라이머 및/또는 프로브를 포함할 수 있다. 상기 표적 서열은 서열번호 1-24, 서열번호 25-50 또는 서열번호 51-230을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된 것일 수 있다. 단백질 수준에서 발현이 결정되는 때 상기 키트는 관심 있는 단백질에 특이적인 결합제(binding agent)를 포함할 수 있다. 상기 결합제는 모든 조각 및 이의 유도체들을 포함하기 위한 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 다양한 구체예의 문맥에서, 용어 "항체"는 관련 단백질에 대한 특이적 결합 친화력을 갖는 모든 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 분자를 포함한다(IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들의 조합, 및 모든 척추동물, 예를 들면 인간, 염소, 토끼 및 마우스 등의 포유류에서의 면역 반응 동안 생성되는 유사 분자를 예시로서 포함하지만 이에 한정되지 않음). 본 발명의 다양한 구체예에서 유용한 특이적 면역글로불린은 IgG 이소형(isotype)을 포함한다. 본 발명의 다양한 구체예에서 유용한 항체는 기원이 모노클론성 또는 폴리클론성일 수 있으나 전형적으로는 모노클론성 항체이다. 항체는 인간 항체, 비-인간 항체, 또는 비-인간 항체의 인간화 버전, 또는 키메라 항체일 수 있다. 항체 인간화를 위한 다양한 기술이 잘 확립되어 있으며 모든 적절한 기술이 사용될 수 있다. 용어 "항체"는 또한 적어도 항원의 에피토프를 특이적으로 인식 및 결합하는 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 리간드를 의미하고, 이는 관련 단백질을 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 모든 항체 유도체 및 조각으로 확장된다. 이러한 유도체 및 조각들은 Fab 조각, F(ab')2 조각, Fv 조각, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, Fc 조각 등을 포함할 수 있다. 용어 항체는 중쇄 및 경쇄 모두로 구성된 항체를 포함하고, 또한 중쇄(오직) 항체(연골 어류 또는 카멜리드(camelid) 종으로부터 유래된 것일 수 있는)도 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 단백질보다 더욱 특이적이게, 예를 들면 본 명세서에서 확인된 두 개의 다른 표적 단백질(표 1 내지 4 참조)에 이중 특이적이게, 조작된 것일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 키트는 또한 검사에서 반응성이 예측되는 경우에 투여되기 위한 특이적 DNA-손상 치료제를 포함한다. 이러한 제제는 즉 OAC 치료에 특이적으로 맞게 조정된, 투여형(dosage form) 등의 형태로 제공될 수 있다. 상기 키트는 OAC 치료 요법에 따른 투여에 대한 적절한 지시서와 함께 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 DNA 손상 반응-결손(DDRD) 인간 OAC 종양을 확인하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은, DNA에 직접적 또는 간접적으로 손상을 주거나, 또는 정상적인 DNA 손상 신호 전달 및/또는 수선 과정을 저해하는 약물 등, DNA-손상 치료제에 민감하고 반응성인 환자, 또는 저항성이고 반응하지 않는 환자를 확인하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 통상적인 환자의 치료를 제시하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 직접적 또는 간접적으로 DNA 손상 및/또는 DNA 손상 수선에 영향을 주는 종류의 약물 등의 신규한 DNA-손상 치료제가 특히 OAC의 치료에 테스트 되는 경우의 임상 시험을 위한 환자를 선별하는 것에 관한 것이다.
본 발명 및 방법은, 본 발명의 모든 전사체의 분석을 위해, 신선/동결(FF) 조직뿐 아니라 미세 바늘 흡인(fine needle aspiration: FNA)을 포함하여, 보관된 포르말린 고정 파라핀-포매(FFPE) 생검 물질의 이용을 수용하고, 따라서 이용 가능한 생검 물질의 유형과 가장 넓게 호환 가능하다. 발현 수준은 FFPE 조직, 신선 동결 조직 또는 RNAlater® 등의 용액 내 저장되어 있던 신선 조직으로부터 얻은 RNA를 이용하여 결정할 수 있다.
따로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 업계의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 비록 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동등한 모든 방법, 장치, 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에서 이용될 수 있으나, 바람직한 방법, 장치 및 물질을 하기에 기재한다.
본 출원에서 인용된 모든 간행물, 공개된 특허 문서, 및 특허 출원은 본 출원과 관련된 기술분야(들)의 기술 수준을 나타낸다. 본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 공개된 특허 문서, 및 특허 출원은 각각의 개별적인 간행물, 공개된 특허문서, 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타나는 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로서 포함된다.
본 명세서에서 이용되는 "하나" 및 "일"(관사 "a" 및 "an")은 관사의 문법적 대상이 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)인 것을 의미한다. 예를 들면, 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, "일 요소"는 하나 이상의 요소를 의미한다.
현재 암 분야에서 연구 노력의 주요 목적은 임상적 치료 결정에 분자적 파라미터를 포함시킴으로써 환자의 전신 수술 치료의 효능을 증가시키는 것이다. 약물유전학/유전체학은 외부 화합물 또는 약물에 대한 개체의 반응성에 관여하는 유전학/유전체학적 요인의 학문이다. 본 발명의 마커의 발현에 자극 또는 억제 효과를 갖는 작용제 또는 조절제가 환자의 식도암을(예방적으로 또는 치료적으로) 치료하기 위해 개체에 투여될 수 있다. 그러한 치료와 함께 개체의 약물유전체(pharmacogenomics)를 고려하는 것이 또한 이상적이다. 치료제 대사의 차이는 약동학적 활성 약물의 용량 및 혈액 농도 사이의 관계를 변경시켜 심각한 독성 또는 치료의 실패를 초래할 수 있다. 따라서, 개체의 약물유전체를 이해하는 것은 예방적 또는 치료적 치료에 대한 효과적인 작용제(예를 들면, 약물)의 선택을 허용한다. 그러한 약물유전체는 또한 적절한 투여량 및 치료 요법을 결정하는데 이용될 수 있다. 따라서, 개체 내 본 발명의 마커의 발현 수준은 그로써 개체의 치료적 또는 예방적 치료를 위한 적절한 작용제(들)을 선택하도록 결정될 수 있다.
본 발명은 DNA-손상 치료제를 이용한 치료에 대한 반응성을 예측하기 위해 특정 식도암 조직에서 발현되는 유전자 또는 유전자 산물 마커(이후 "바이오마커"로 언급)의 집합의 이용에 관한 것이다. 다른 측면에서, 이러한 바이오마커 목록은 마이크로어레이, Q-PCR, NGS, 면역조직화학, ELISA 또는 mRNA 또는 단백질 발현을 정량화 할 수 있는 다른 기술 등으로 당업계에 알려진 방법을 이용하여 전달될 수 있는 단일 파라미터 또는 다중 파라미터 예측 검사의 기반을 형성할 수 있다.
본 발명은 또한 세포독성적 화학치료 또는 식도암(특히 OAC)를 위한 특정 치료 이후의 진단을 위해 유용한 키트 및 방법에 관한 것이다. 일부 또는 전부의 전사체가 과발현 또는 하향발현되는 때, 상기 발현 프로필은 DNA-손상 치료제에 대한 반응성 또는 저항성을 나타내는 방법이 제공된다. 이러한 키트 및 방법은 식도 선암(OAC)를 갖는 환자의 종양에서 다르게 발현되는 유전자 또는 유전자 산물 마커를 이용한다. 본 발명의 일 구체예에서, 이러한 보관 조직 시료 내 바이오마커의 발현 프로필은 하나 이상의 DNA-손상 치료제에 대한 반응성과 함께 발현 프로필과 관계있는 데이터베이스 또는 모델을 만들기 위한 통계적 방법 또는 관계 모델 하에서 임상적 결과(반응 또는 생존)와 관련된다. 그 예측 모델은 이후 DNA-손상 치료제(들)에 대한 반응성이 알려지지 않은 환자의 반응성을 예측하기 위해 사용될 수 있다. 다른 많은 구체예에서, 환자군은 환자의 임상적 결과, 예후, 또는 DNA-손상 치료제에 대한 반응성에 기반하여 적어도 두 개의 종류로 나뉘어질 수 있고, 그 바이오마커는 실질적으로 이러한 환자 종류 사이의 종류 구분과 관련이 있다. 본 명세서에 기재된 생물학적 경로는 DNA-손상 치료제를 이용한 OAC의 치료에 대한 반응성에 예측성이 있는 것으로 나타났다.
예측적 마커 패널/발현 분류자
식도암/OAC 조직에서 발현되는 유전적 분류자로서의 바이오마커의 집합이 제공되고, 이는 식도암/OAC 치료에 이용되는 DNA-손상 치료제 등의 치료제에 대한 반응성 또는 저항성을 결정하는데 유용하다. 이러한 집합은 "마커 패널(marker panel)", "발현 분류자(expression classifier)", 또는 "분류자(classifier)"로 지칭될 수 있다. 상기 집합은 표 1에 나타나 있다. 이러한 집합은, 이후 OAC-관련 플랫폼(실시예 참조)에 매핑한(mapping) 표 1A 및 1B(WO 2012/037378 참조)에 나타나 있는 바이오마커의 본래의 집합으로부터 유래되었다. 표 2B에 나타나 있는 44 유전자 분류자 등의 분류자의 적용은 DNA-손상 치료제에 대한 OAC 환자의 반응성이 결정될 수 있게 한다. 본 발명은 이러한 유전자 또는 표적 서열 중 하나 이상의 발현 수준을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
본 방법에서 유용한 바이오마커는 따라서 표 1 내지 4에 확인되어 있다. 이러한 바이오마커들은 환자(OAC를 갖는)의 치료제에 대한 반응 또는 이의 결핍을 결정하기 위한 예측 값을 갖는 것으로서 확인되었다. 이들의 발현은 제제, 더욱 구체적으로는 DNA-손상 치료제에 대한 반응성과 연관이 있다. 식도암 종양, 특히 선암 또는 편평 상피세포암에서 확인된 바이오 마커의 집합의 발현을 시험하여, 어느 치료제 또는 치료제의 조합이 암 및 일부 구체예에서는 OAC 세포의 성장율을 가장 감소시킬 수 있는 것 같은지를 결정하는 것이 가능하다. 확인된 전사체 유전자 또는 유전자 산물 마커의 집합을 시험하여, 치료제 또는 그의 조합이 암의 성장률을 가장 덜 감소시킬 것 같은지를 결정하는 것 또한 가능하다. 바이오마커의 집합의 발현을 조사하는 것으로, 따라서 비효과적이거나 또는 부적절한 치료제를 제거하는 것이 가능하다. 중요하게는, 특정 구체예에서, 이러한 결정은 환자 사례별(patient-by-patient) 기반 또는 작용제 사례별(agent-by-agent) 기반으로 이루어질 수 있다. 따라서, 특정 치료 요법이 특정 환자 또는 환자의 유형에 이익이 될 것 같은지 또는 아닌지, 및/또는 특정 요법이 계속되어야 하는지를 결정할 수 있다.
표 1A-본래 유방암에서 검사되고 OAC에 대해 매핑된(Xcel 어레이를 통한) 유전자의 목록
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
표 1B-본래 유방암에서 검사되고 OAC에 대해 매핑된(Xcel 어레이를 통한) 유전자의 목록
Figure pct00007
표 1A 및/또는 1B 및/또는 3에서 언급된 바이오마커의 전부 또는 일부는 예측적 바이오마커 패널에 이용될 수 있다. 예를 들면, 표 1A 및/또는 1B 및/또는 3의 바이오마커로부터 선별된 바이오마커 패널은 본 발명에서 제공되는 방법을 이용하여 생성할 수 있고, 표 1A 및/또는 1B 및/또는 3 및에 기재된 바이오마커 하나 내지 전부, 및 각각 및 이들 사이의 모든 조합(예를 들면, 4개의 선별된 바이오마커, 16개의 선별된 바이오마커, 74개의 선별된 바이오마커 등)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 예측적 바이오마커 세트는 적어도 5, 10, 20, 40, 60, 100, 150, 200 또는 300 또는 그 보다 많은 바이오마커를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 예측적 바이오마커는 5, 10, 20, 40, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 또는 700을 넘지 않는 바이오마커를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 예측적 바이오마커 세트는 표 1A 및/또는 1B 및/또는 3에 열거된 복수의 바이오마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 예측적 바이오마커 세트는 표 1A 및/또는 1B 및/또는 3에 열거된 바이오 마커의 적어도 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%를 포함한다. 선별된 예측적 바이오마커 세트는 본 발명에 기재된 방법 및 당업계에 유사한 방법을 이용하여 제공된 바이오마커로부터 모을 수 있다. 일 구체예에서, 상기 바이오마커 패널은 표 1의 모든 50종 바이오마커 또는 표 3에 열거된 모든 바이오 마커를 포함한다. 다른 구체예예서, 상기 바이오마커 패널은 표 2A 및 2B에 기재된 40 또는 44 유전자 패널에 대응한다.
예측적 바이오마커 세트는 가변적인 크기를 갖는 실제 스케일 상의 상응하는 스칼라 무게와의 조합으로 정의될 수 있고, 이는 추가적으로 선형 또는 비-선형, 대수, 삼각함수 또는 상관 평균(corrlative mean)을 대수, 통계 학습(statistical learning), 베이시안(Bayesian), 회귀 또는 유사한 알고리즘을 통해 단일 스칼라 값에 조합되고, 이는 수학적으로 도출된 결정 함수와 함께 예측적 모델을 제공하고, 이로서 시료로부터의 발현 프로필을 특정된 약물 또는 약물 종류에 대한 반응자 또는 비-반응자, 저항성 또는 비-저항성의 개별적 종류로 해석할 수 있다.
이러한 바이오마커 구성(membership)을 포함하는 예측 모델은, 알려진 약물 반응 및/또는 저항성 또는 미확인 분자적 아형(즉, DDRD) 분류를 갖는 과거 환자 시료로부터의 대표 발현 프로필 세트로부터, 교차 유효성 검사(cross-validation), 부트스트래핑(bootstrapping) 또는 유사한 샘플링 기술하에, 민감도, 특이도, 음성 및 양성 예측 값, 위험율 또는 이들의 모든 조합에 최적화된 러닝 웨이트(learning weight) 및 결정 임계에 의해 개발된다.
일 구체예에서, 상기 바이오마커는, 개별 가중치(weight)가 양수 또는 음수일 수 있는, 그들 신호의 가중치 합을 형성하는데 이용된다. 그 결과의 합("결정적 기능(decisive function)")은 소정의 기준(reference) 점수 또는 값과 비교된다. 상기 기준 점수 또는 값과의 비교는 진단 또는 임상적 상태 또는 결과를 예측하는데 이용될 수 있다.
상기한 바와 같이, 당업자는 표 1A 및/또는 1B 및/또는 3에 제공된 분류자 또는 분류자들에 포함된 바이오마커가 치료제에 대한 반응성 또는 저항성에 대한 분류자에서 동일하지 않은 가중치를 이끌어낼 것을 인식할 것이다. 그러므로, 하나의 서열이 치료제에 대한 반응성 등의 결과를 진단 또는 예측하는데 이용되는 것이 적을 수 있으나, 더 많은 서열을 사용하여 특이도 및 민감도 또는 진단 또는 예측 정확도가 증가할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "가중치(weight)"는 통계적 계산에서 항목의 상대적인 중요도를 의미한다. 유전자 발현 분류자 내의 각각의 바이오마커의 가중치는 당업계에 알려진 분석 방법을 이용하여 환자 시료의 데이터 세트 상에서 결정될 수 있다. 유전자 특이적 편향(bias) 값 또한 적용될 수 있다. 유전자 특이적 편향은, 당업자에 이해될 수 있는 바와 같이, 트레이닝(training) 중인 데이터 세트에 대해 상대적으로 상기 분류자 내의 각각의 유전자의 평균 중심(mean centre)에 요구될 수 있다. 특정 편향 값이 표 4에 나타나 있으며, 본 발명의 방법 및 키트에 따라 적용될 수 있다.
일 구체예에서 상기 바이오마커 패널은 표 2A에 자세히 기재된 40종의 바이오마커 및 상기 표에 자세히 기재된 대응하는 순위 및 가중치, 또는, 예를 들면 질병 설정(setting)에 의존하는, 대안적인 순위 및 가중치에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 상기 바이오마커 패널은 표 2B에 자세히 기재된 44종의 바이오마커 및 상기 표에 자세히 기재된 대응하는 순위 및 가중치, 또는, 예를 들면 질병 설정에 의존하는, 대안적인 순위 및 가중치에 관한 것이다. 표 2A 및 2B는, 교차 유효성 검사 하에서 측정된 화합물 결정 점수 함수 내의 평균 가중치 순위로서, 분류자에서 가중치가 감소하는 순서로 상기 바이오마커들의 순위를 매긴다. 다른 구체예에서, 상기 바이오마커 패널은 표 4에 자세히 기재된 44종의 바이오마커 및 상기 표에 자세히 기재된 대응하는 순위 및 가중치, 또는, 예를 들면 질병 설정에 의존하는, 대안적인 순위 및 가중치에 관한 것이다.
표 2A
40-유전자 DDRD 분류자 모델에 대한 유전자 ID 및 EntrezGene ID 및 이와 연관된 순위 및 가중치
Figure pct00008
Figure pct00009
표 2B
44-유전자 DDRD 분류자 모델에 대한 유전자 ID 및 EntrezGene ID 및 이와 연관된 순위 및 가중치
Figure pct00010
Figure pct00011
표 3은 표 2A 및 표 2B의 유전자를 나타내는 Xcel 어레이(Almac)로부터의 프로브 세트와 이들의 서열 ID 번호에 대한 참조를 나타낸다.
표 3-Xcel 플랫폼에 매핑된 44-유전자 시그니쳐(signature)에 포함된 유전자의 표적 서열에 대한 프로브 세트 ID 및 서열번호
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
표 4-44-유전자 DDRD 분류자 모델에 대한 유전자 기호(symbol) 및 관련한 가중치 및 편향
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
다른 구체예에서, 표 1A 및/또는 1B, 표 2A 및/또는 2B 및/또는 표 3 및/또는 4에 열거된 바이오마커의 하위군(subset)들은 본 명세서에 기재된 방법에서 이용될 수 있다. 이러한 하위군들은 표 2A 또는 2B에서 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-44, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 36-44, 11-20, 21-30, 31-40, 및 31-44로 순위 매겨진 바이오마커들을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
일 측면에서, 개체 내 치료제 반응성은 개체로부터의 검사(생물학적) 시료 상의 분석을 수행하고, GBP5, CXCL10, IDO1 및 MX1 중 적어도 하나의 바이오마커 및 표 2B에 열거된 바이오마커로부터 선택된 적어도 N개의 추가적인 바이오마커에 각각 해당하는 바이오마커 값을 검출하는 것으로 예측될 수 있고, 상기 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "바이오마커"는 유전자, mRNA, cDNA, 안티센스 전사체, miRNA, 폴리펩티드, 단백질, 단백질 조각, 또는 유전자 발현 수준 또는 단백질 생성 수준을 표시하는 임의의 다른 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열을 의미할 수 있다. 일부 구체예에서, CXCL10, IDO1, CD2, GBP5, PRAME, ITGAL, LRP4, APOL3, CDR1, FYB, TSPAN7, RAC2, KLHDC7B, GRB14, AC138128.1, KIF26A, CD274, ETV7, MFAP5, OLFM4, PI15, FOSB, FAM19A5, NLRC5, PRICKLE1, EGR1, CLDN10, ADAMTS4, SP140L, ANXA1, RSAD2, ESR1, IKZF3, OR2I1P, EGFR, NAT1, LATS2, CYP2B6, PTPRC, PPP1R1A, 또는 AL137218.1의 바이오마커를 언급할 때는, 상기 바이오마커는 각각 CXCL10, IDO1, CD2, GBP5, PRAME, ITGAL, LRP4, APOL3, CDR1, FYB, TSPAN7, RAC2, KLHDC7B, GRB14, AC138128.1, KIF26A, CD274, ETV7, MFAP5, OLFM4, PI15, FOSB, FAM19A5, NLRC5, PRICKLE1, EGR1, CLDN10, ADAMTS4, SP140L, ANXA1, RSAD2, ESR1, IKZF3, OR2I1P, EGFR, NAT1, LATS2, CYP2B6, PTPRC, PPP1R1A, 또는 AL137218.1의 mRNA를 포함한다. 추가적인 또는 다른 구체예에서, MX1, GBP5, IFI44L, BIRC3, IGJ, IQGAP3, LOC100294459, SIX1, SLC9A3R1, STAT1, TOB1, UBD, C1QC, C2orf14, EPSTI, GALNT6, HIST1H4H, HIST2H4B, KIAA1244, LOC100287927, LOC100291682, 또는 LOC100293679의 바이오마커를 언급할 때는, 상기 바이오마커는 각각 MX1, GBP5, IFI44L, BIRC3, IGJ, IQGAP3, LOC100294459, SIX1, SLC9A3R1, STAT1, TOB1, UBD, C1QC, C2orf14, EPSTI, GALNT6, HIST1H4H, HIST2H4B, KIAA1244, LOC100287927, LOC100291682, 또는 LOC100293679의 안티센스 전사체를 포함한다.
추가적인 측면에서, 개체로부터의 검사(생물학적) 시료 상에 분석을 수행하고, 바이오마커 GBP5, CXCL10, IDO1 및 MX1 및 표 2B에 열거된 바이오마커로부터 선택된 적어도 N개의 추가적인 바이오마커에 각각 해당하는 바이오마커 값을 검출하는 것으로 개체 내의 치료제 반응성이 예측되거나 또는 암 진단이 표시되고, 상기 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36이다. 추가적인 구체예에서, 개체로부터의 검사(생물학적) 시료 상에 분석을 수행하고, 바이오마커 GBP5 및 표 2B에 열거된 바이오마커로부터 선택된 적어도 N개의 추가적인 바이오마커에 각각 해당하는 바이오마커 값을 검출하는 것으로 개체 내의 치료제 반응성이 예측되거나 또는 암 진단이 표시되고, 상기 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39이다. 추가적인 측면에서, 개체로부터의 검사(생물학적) 시료 상에 분석을 수행하고, 바이오마커 CXCL10 및 표 2B에 열거된 바이오마커로부터 선택된 적어도 N개의 추가적인 바이오마커에 각각 해당하는 바이오마커 값을 검출하는 것으로 개체 내의 치료제 반응성이 예측되거나 또는 암 진단이 표시되고, 상기 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39이다. 추가적인 측면에서, 개체로부터의 검사(생물학적) 시료 상에 분석을 수행하고, 바이오마커 IDO1 및 표 2B에 열거된 바이오마커로부터 선택된 적어도 N개의 추가적인 바이오마커에 각각 해당하는 바이오마커 값을 검출하는 것으로 개체 내의 치료제 반응성이 예측되거나 또는 암 진단이 표시되고, 상기 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39이다. 추가적인 측면에서, 개체로부터의 검사(생물학적) 시료 상에 분석을 수행하고, 바이오마커 MX-1 및 표 2B에 열거된 바이오마커로부터 선택된 적어도 N개의 추가적인 바이오마커에 각각 해당하는 바이오마커 값을 검출하는 것으로 개체 내의 치료제 반응성이 예측되거나 또는 암 진단이 표시되고, 상기 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39이다.
추가적인 측면에서, 개체로부터의 검사(생물학적) 시료 상에 분석을 수행하고, 바이오마커 CXCL10, MX1, IDO1 및 IFI44L 중 적어도 두 개의 바이오마커 및 표 2B에 열거된 바이오마커로부터 선택된 적어도 N개의 추가적인 바이오마커에 각각 해당하는 바이오마커 값을 검출하는 것으로 개체 내의 치료제 반응성이 예측되거나 또는 암 진단이 표시되고, 상기 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40이다. 추가적인 측면에서, 개체로부터의 검사(생물학적) 시료 상에 분석을 수행하고, 바이오마커 CXCL10, MX1, IDO1 및 IFI44L 및 표 2B에 열거된 바이오마커로부터 선택된 적어도 N개의 추가적인 바이오마커에 각각 해당하는 바이오마커 값을 검출하는 것으로 개체 내의 치료제 반응성이 예측되거나 또는 암 진단이 표시되고, 상기 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40이다. 추가적인 측면에서, 개체로부터의 검사(생물학적) 시료 상에 분석을 수행하고, 바이오마커 CXCL10 및 표 2B에 열거된 바이오마커로부터 선택된 적어도 N개의 추가적인 바이오마커에 각각 해당하는 바이오마커 값을 검출하는 것으로 개체 내의 치료제 반응성이 예측되거나 또는 암 진단이 표시되고, 상기 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 또는 43이다. 추가적인 측면에서, 개체로부터의 검사(생물학적) 시료 상에 분석을 수행하고, 바이오마커 MX1 및 표 2B에 열거된 바이오마커로부터 선택된 적어도 N개의 추가적인 바이오마커에 각각 해당하는 바이오마커 값을 검출하는 것으로 개체 내의 치료제 반응성이 예측되거나 또는 암 진단이 표시되고, 상기 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 또는 43이다. 추가적인 측면에서, 개체로부터의 검사(생물학적) 시료 상에 분석을 수행하고, 바이오마커 IDO1 및 표 2B에 열거된 바이오마커로부터 선택된 적어도 N개의 추가적인 바이오마커에 각각 해당하는 바이오마커 값을 검출하는 것으로 개체 내의 치료제 반응성이 예측되거나 또는 암 진단이 표시되고, 상기 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 또는 43이다. 추가적인 측면에서, 개체로부터의 검사(생물학적) 시료 상에 분석을 수행하고, 바이오마커 IFI44L 및 표 2B에 열거된 바이오마커로부터 선택된 적어도 N개의 추가적인 바이오마커에 각각 해당하는 바이오마커 값을 검출하는 것으로 개체 내의 치료제 반응성이 예측되거나 또는 암 진단이 표시되고, 상기 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 또는 43이다.
다른 구체예에서, 상기 표 1A, 1B 및/또는 3에 열거된 표적 서열들, 또는 이들의 하위군들은 본 명세서에 기재된 방법에서 이용될 수 있다. 상기 표적 서열은 표적 서열과 혼성화하는 프라이머 및/또는 프로브의 디자인을 목적으로 이용될 수 있다. 적절한 프라이머 및/또는 프라이머의 디자인은 표적 서열이 확인되면 당업자의 능력 범위 내에 있다. NCBI-primer-BLAST 툴과 같은, 다양한 프라이머 디자인 툴이 이러한 목적을 돕기 위해 자유롭게 이용 가능하다; Ye et al, BMC Bioinformatics. 13:134 (2012) 참조. 상기 프라이머 및/또는 프로브들은 엄격한(stringent) 조건(본 명세서에 기재된 바와 같은) 하에서 표적 서열과 혼성화하기 위해 디자인된 것일 수 있다. 프라이머 및/또는 프로브는 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 (또는 초과) 뉴클레오티드 길이인 것일 수 있다. 각각의 하위군은 동일한 바이오마커를 가리키는 다중의 프라이머 및/또는 프로브를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 표들은 일부 경우 동일한 전체 유전자(overall gene) 내에 다중의 표적 서열이 있는 것을 나타낸다. 이러한 프라이머 및/또는 프로브들은 본 발명의 방법을 수행하기에 유용한 키트에 포함될 수 있다. 상기 키트는 예를 들면 어레이 또는 PCR 기반 키트일 수 있고, 폴리머라제 및/또는 dNTP 등의 추가적인 시약을 포함할 수 있다.
분류자 모델을 이용한 유전자 발현 측정
다양한 방법이 바이오마커를 확인하고 질병을 진단히기 위한 시도로서 이용되어 왔다. 단백질-기반 마커에 대해서는 2차원 전기영동, 질량분석 및 면역분석법(immunoassay method)이 포함된다. 핵산 마커에 대해서는 mRNA 발현 프로파일, 마이크로RNA 프로파일, 서열분석(sequencing), FISH, 유전자 발현 연속 분석(serial analysis of gene expression: SAGE), 메틸화 프로파일 및 대규모 유전자 발현 어레이(large-scale gene expression array)를 포함한다.
바이오마커가 개체에서 비정상적인 과정, 질병 또는 기타 상태를 나타내거나 그의 징후인 경우, 그 바이오마커는 일반적으로 개체에서 질병 또는 기타 상태가 없는 정상 과정을 나타내거나 그의 징후인 바이오마커의 발현 수준 또는 값과 비교하여 과-발현된 또는 저-발현된 것으로 기술된다. "상향-조절(Up-regulation)", "상향-조절된(up-regulated)", "과-발현(over-expression)", "과-발현된(over-expressed)", 및 그의 모든 변형은 건강하거나 또는 정상적인 개체 유래의 유사한 생물학적 시료에서 통상적으로 검출되는 바이오마커의 값 또는 수준(또는 값 또는 수준의 범위) 보다 높은 생물학적 시료 내 바이오마커의 값 또는 수준을 의미하는 것과 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 또한 특정 질병의 여러 단계에서 검출될 수 있는 바이오마커의 값 또는 수준 (또는 값 또는 수준의 범위)보다 높은 생물학적 시료 내 바이오마커의 값 또는 수준을 의미할 수 있다.
"하향-조절(Down-regulation)", "하향-조절된(down-regulated)", "저-발현(under-expression)", "저-발현된(under-expressed)", 및 그의 임의의 변형은 건강하거나 또는 정상적인 개체 유래의 유사한 생물학적 시료에서 통상적으로 검출되는 바이오마커의 값 또는 수준 (또는 값 또는 수준의 범위) 보다 낮은 생물학적 시료 내 바이오마커의 값 또는 수준을 의미하는 것과 상호교환적으로 사용된다. 용어는 또한 특정 질환의 상이한 단계에서 검출될 수 있는 바이오마커의 값 또는 수준 (또는 값 또는 수준의 범위) 보다 낮은 생물학적 시료 내 바이오마커의 값 또는 수준을 의미할 수 있다.
또한, 과-발현된 또는 저-발현된 바이오마커는 또한 개체에서 정상 과정 또는 질환 또는 기타 병태의 부재를 나타내거나 이의 징후인 바이오마커의 "정상" 발현 수준 또는 값과 비교하여 "다르게 발현된(differentially expressed)" 것 또는 "다른 수준(differential level)" 또는 "다른 값(differential value)"을 갖는 것으로 지칭될 수 있다. 따라서, 바이오마커의 "다른 발현"은 또한 바이오마커의 "정상" 발현 수준으로부터의 변형으로 지칭될 수 있다.
용어 "다른 바이오마커 발현(differential biomarker expression)" 및 "다른 발현(differential expression)"은 정상 개체에서 그것의 발현과 비교하여, 또는 특정 치료법에 대해 상이하게 반응하거나 상이한 예후를 갖는 환자에서 그것의 발현과 비교하여, 특정 질환으로부터 고통받는 개체에서 보다 높거나 또는 보다 낮은 수준으로 발현이 활성화된 바이오마커를 지칭하는 것과 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 또한 발현이 동일한 질환의 상이한 단계에서 보다 높거나 보다 낮은 수준으로 활성화되는 바이오마커를 포함한다. 차등적으로 발현된 바이오마커가 핵산 수준 또는 단백질 수준에서 활성화되거나 또는 저해될 수 있다는 것, 또는 상이한 폴리펩티드 산물을 초래하는 대안적 스플라이싱에 적용될 수 있다는 것이 또한 이해된다. 그러한 차이는 mRNA 수준, miRNA 수준, 안티센스 전사물 수준, 또는 단백질 표면 발현, 폴리펩티드의 분비 또는 기타 분할을 포함하는 다양한 변화에 의해 입증될 수 있다. 다른 바이오마커 발현은 둘 이상의 유전자 또는 그들의 유전자 산물들 사이의 발현의 비교; 또는 둘 이상의 유전자 또는 그들의 유전자 산물들 사이의 발현율의 비교; 또는 심지어 정상 개체와 질환으로부터 고통받는 개체 사이에서 상이한, 동일한 유전자의 두가지 상이하게 처리된 산물의 비교; 또는 동일한 질환의 다양한 단계 사이에서 상이한, 동일한 유전자의 두가지 상이하게 처리된 산물의 비교를 포함할 수 있다. 다른 발현은 예를 들면, 정상 및 질환 세포 중, 또는 상이한 질환 현상 또는 질환 단계를 겪는 세포 중에서 바이오마커의 일시적 또는 세포적 발현 패턴에서의 정량적 및 정성적 차이를 모두 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 얻은 발현 프로필은 시료 내 하나 이상의 핵산의 양 또는 수준이 결정된 유전적 또는 핵산 발현 프로필이다. 이러한 구체예에서, 상기 시료는 진단적 또는 예후적 방법에서 발현 프로파일을 만들기 위해 분석된(즉, 시료 내 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하기 위해) 상기 시료는 핵산 시료를 포함한다. 상기 핵산 시료는 분석되는 세포 또는 조직의 표현형 결정성 바이오마커(phenotype determinative biomarker)의 발현 정보를 포함하는 핵산의 집단을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 핵산은, 시료가 얻어진 숙주 세포 또는 조직의 발현 정보를 상기 시료가 보존하고 있는 때까지는, 예를 들면 mRNA, cRNA, cDNA 등의 RNA 또는 DNA 핵산을 포함할 수 있다. 상기 시료는 당업계에 알려진 방법으로서, 예를 들면, 세포로부터 mRNA 분리에 의해, 준비될 수 있고, 상기 분리된 mRNA는, 다른 유전자 발현(differential gene expression) 분야에서 알려진 바와 같이 cDNA, cRNA 등을 준비하기 위해 분리, 증폭 또는 이용된다. 따라서, 시료 내 mRNA의 수준을 결정하는 것은 mRNA로부터 cDNA 또는 cRNA를 준비하는 것 및 이후 cDNA, 또는 cRNA를 측정하는 것을 포함한다. 상기 시료는 전형적으로 치료를 필요로 하는 개체로부터, 예를 들면 표준화 프로토콜을 이용한 조직 생검을 통해, 수확된 세포 또는 조직으로부터 준비되고, 핵산이 생산될 수 있는 세포 유형 또는 조직은 결정되어야 할 표현형의 발현 패턴이 존재하는 모든 조직을 포함하고, 질병 세포 또는 조직, 체액 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
검사 시료 내 하나 이상의 바이오마커의 특정된 발현 수준을 나타내는 발현 패턴은 임의의 편리한 프로토콜을 이용하여 최초(initial) 핵산 시료로부터 생성할 수 있다. 차등 유전자 발현/바이오마커 분석 분야에서 사용되는 것 등의 발현 프로필을 생성시키는 여러 방법들의 종류가 알려져 있고, 발현 프로필을 생성시키기 위한 프로토콜 중 하나의 대표적이고 편리한 유형은 어레이-기반 유전자 발현 프로파일 생성 프로토콜이다. 이러한 적용은 수천 개 유전자 각각에 대해 여러 프로브가 고정화 되어 있는 (유리)칩 등의 표면이 이용되는 혼성화 분석이다. 이러한 표면 상에는 일반적으로 각각의 분석되어야 하는 유전자 내의 다중 표적 영역이 있고, 표적 영역 당 다중(보통 11 내지 100) 프로브가 있다. 이러한 방법으로, 각각의 유전자 발현은 상기 표면 상의 다중(수십) 프로브에 혼상화하는 것으로 평가된다. 이러한 분석에서, 표적 핵산의 시료는 분석되는 최초 핵산으로부터 처음 준비되고, 상기 준비는 라벨, 예를 들면 신호 생성 시스템의 일원으로, 표적 핵산을 라벨링하는 것을 포함할 수 있다. 표적 핵산 시료 제조 후, 시료는 혼성화 조건 하에서 어레이와 접촉되고, 여기서 복합체가 어레이 표면에 부착된 프로브 서열에 상보적인 표적 핵산 사이에서 형성된다. 그 후 혼성화된 복합체의 존재가 정성적으로 또는 정량적으로 검출된다. 주제 방법에서 사용되는 발현 프로파일을 생성하는데 실시될 수 있는 특정 혼성화 기술은 미국 특허 번호 5,143,854; 5,288,644; 5,324,633; 5,432,049; 5,470,710; 5,492,806; 5,503,980; 5,510,270; 5,525,464; 5,547,839; 5,580,732; 5,661,028; 5,800,992; 상기 문서의 개시는 본 명세서에 참조로 포함됨; 및 WO 95/21265; WO 96/31622; WO 97/10365; WO 97/27317; EP 373 203; 및 EP 785 280에서 기재된 기술을 포함한다. 이러한 방법에서, 그 발현이 분석되어야 하는 각각의 바이오마커에 대한 하나 또는 여러 프로브를 포함하는 "프로브" 핵산의 어레이는 상기 기재된 표적 핵산과 접촉된다. 접촉은 혼성화 조건 하에, 예를 들면, 전술된 바와 같은 엄격한 혼성화 조건 하에서 수행되며, 결합되지 않은 핵산은 이후 제거된다. 혼성화된 핵산의 결과 패턴은 탐침되었던 각각의 바이오마커에 대한 발현에 관한 정보를 제공하고, 여기서 발현 정보는 유전자가 발현되는지 또는 발현되지 않는지, 및 통상적으로, 어떤 수준으로 발현되었는지에 관해서이며, 발현데이터, 즉 발현 프로필은 정성적 및 정량적 둘 다 일 수 있다. 상기 방법은 어레이 상의 모든 다른 프로브의 하위군에 대하여 혼성화 패턴을 정규화(normalizing)하는 것을 포함할 수 있다.
바이오마커 발현 분류자 제조
일 구체예에서, 암 조직 내 바이오마커의 상대적인 발현 수준은 유전자 발현 프로필을 형성하기 위해 측정될 수 있다. 환자 조직 시료로부터의 바이오마커 세트의 유전자 발현 프로필은 화합물 결정 점수(또는 검사 점수)의 형태로 요약될 수 있고, 환자 데이터의 학습 세트(training set)로부터 수학적으로 계산된 것일 수 있는 점수 임계에 비교될 수 있다. 상기 점수 임계는 치료에 대한 반응성/비-반응성과 같은, 그러나 이에 한정되지는 않는, 여러 특징들에 기반하여 환자군을 분류한다. 상기 환자 트레이닝 세트 데이터는 바람직하게는 예후, 재발 가능성, 장기 생존, 임상 결과, 치료 반응, 진단, 암 분류 또는 개체 유전체 프로필로 특징지어진 OAC 조직 시료로부터 유래된다. 대안적으로는 분자적 아형(DDRD)이 잘 정의되고 특성화된 환자 코호트로부터의 데이터 세트를 나타낼 수 있다. 발현 프로필 및 환자 시료(검사 점수)로부터의 해당하는 결정 점수는 수학적으로 유도된 점수 결정 임계와 동일한 측면에 해당하는 트레이닝 세트 내 환자 시료의 특징과 관련 있을 수 있다. 선형 분류자 스칼라 산출 값(output)의 임계는, 트레이닝 데이터 세트에서 관찰되는 것과 같이, 교차 유효성 검사하에서 민감도 및 특이도의 합을 최대화하기 위해 최적화될 수 있다. 대안적으로는 상기 민감도 및 분석의 양성 예측 값은, 다른 질병 표시에서 상기 검사의 제안된 임상적 유용성을 기반으로, 특이도 및 음성 예측 값을 대가로 증가될 수 있고, 또는 그 반대도 될 수 있다.
주어진 샘플에 대한 전반적인 발현 데이터는 시작 물질의 상이한 양, 추출 및 증폭 반응의 다른 효율 등을 수정하기 위해 당업자에게 알려진 방법을 이용하여 정규화할 수 있다. 진단적 또는 예후적 신호(call)(예를 들면, 치료제에 대한 반응성 또는 저항성)를 만들기 위해 정규화된 데이터 상의 선형 분류자를 이용하는 것은 데이터 공간(data space)을 분할하기 위한 효율적 수단, 즉, 상기 분류자 내의 모든 유전자에 대한 발현 값의 모든 가능한 조합을 분리 초평면(separating hyperplane)으로 두 개의 분리된 반쪽으로 나누는 것이다. 이러한 분리는 트레이닝 예시의 대규모 세트로부터, 예를 들면 치료제에 대한 반응성 또는 저항성을 보이는 환자로부터, 실험적으로 유도될 수 있다. 보편성(generality)에 대한 손실 없이, 다만, 예를 들면 치료제에 대한 반응성 또는 저항성으로부터, 그 결정이 변경될 것인 남은 바이오마커들에 대한 임계를 자동적으로 정의하는 일 바이오마커는 제외하고, 모든 바이오마커에 대한 값의 특정 고정된 세트를 추정할 수 있다. 이러한 동적 임계를 넘는 발현 값은 치료제에 대한 저항성(음성 가중치를 갖는 바이오마커에 대하여) 또는 반응성(양성 가중치를 갖는 바이오마커에 대하여)을 나타낼 것이다. 상기 임계의 정확한 값은 실제로 측정된 분류자 내의 모든 다른 바이오마커 발현 프로필에 기반하지만, 특정 바이오마커의 일반적인 표시는 고정되어 남아있다, 즉, 높은 값 또는 "상대적 과발현"은 언제나 반응성(양성 가중치를 갖는 유전자) 또는 저항성(음성 가중치를 갖는 유전자)에 공헌한다. 그러므로, 전반적인 유전자 발현 분류자의 맥락에서, 상대적 발현은 특정 바이오마커의 상향- 또는 하향-조절이 치료제에 대해 반응성 또는 내성을 나타내는지를 표시할 수 있다.
일 구체예에서, 검사 시료, 예를 들면 환자 조직 시료의 바이오마커 발현 프로필은, 선형 분류자에 의해 평가된다. 본 명세서에서 사용된, 선형 분류자는 개별적 바이오마커 강도의 가중된 합계를 화합물 결정 점수 ("결정 함수")로 나타낸다. 결정 점수는 그 후 민감도 및 특이도에 관해 시료가 점수 임계보다 초과 (결정 함수 양성) 또는 미만 (결정 함수 음성)인지를 나타내는 특정한 세트-점수에 상응하는, 소정의 컷-오프 점수 임계와 비교된다.
효과적으로, 이는 상기 데이터 공간, 즉 바이오마커 발현 값의 모든 가능한 조합 세트가 다른 임상적 분류 또는 예측에 해당하는 두 개의 상호 배타적인 반쪽으로 나뉘는 것을 의미하며, 예를 들면, 하나는 치료제에 대한 반응성 및 다른 하나는 저항성에 해당한다. 전반적인 분류자의 맥락에서, 특정 바이오마커의 상대적 과-발현은 결정 점수를 증가시키거나 (양의 가중치), 그것을 감소시킬 수 있고 (음의 가중치), 이에 따라 예를 들면 치료제에 대한 반응성 또는 내성의 전반적인 결정에 대해 기여한다.
용어 "곡선 아래 영역(area under the curve)" 또는 "AUC"는 수신자 조작 특성(receiver operating characteristic: ROC) 곡선 아래의 영역을 의미하고, 이들 둘 모두는 당업계에 잘 알려져 있다. AUC 측정은 전체 데이터 범위에 걸쳐 분류자의 정확도를 비교하는데 유용하다. 높은 AUC을 갖는 분류자는 관심 있는 두 그룹(예를 들면, OAC 암 시료 및 정상 또는 대조군 시료) 사이에서 비확인된 것을 정확하게 분류하는데 높은 능력을 갖는다. ROC 곡선은 두 집단 (예를 들면, 치료제에 대해 반응성인 개체 및 비반응성인 개체) 사이를 구별하는데 있어서 특정한 특징 (예를 들면, 본 명세서에 기재된 임의의 바이오마커 및/또는 생물의학 정보의 임의의 항목)의 성능을 플롯팅하는데 유용하다. 통상적으로, 전체 집단 (예를 들면, 케이스 및 대조군)에 대한 특정 데이터는 단일 특징의 값을 기준으로 하여 오름차순으로 정렬된다. 그 후, 그 특징에 대한 각 값에 대해, 데이터에 대한 진양성율(true positive rate) 및 가양성율(false positive rate)이 계산된다. 진양성율은 특징에 대한 값보다 높은 경우의 수를 세고, 그 후 총 경우의 수로 나는 것에 의해 결정된다. 위양성율은 특징에 대한 값보다 높은 대조군의 수를 세고, 그 후 총 대조군의 수로 나누는 것에 의해 결정된다. 비록 이러한 정의는 대조군과 비교하여 특징이 경우들에서 증가된 시나리오를 의미하더라도, 이러한 정의는 또한 특징이 대조군과 비교하여 보다 낮은 시나리오에도 적용한다 (그러한 시나리오에서, 그 특징에 대한 값 미만의 시료가 집계될 것이다). ROC 곡선은 단일 특징 및 기타 단일 결과에 대해 생성될 수 있고, 예를 들면, 단일 합계 값을 제공하기 위해 2개 이상의 특징의 조합이 수학적으로 결합될 수 있고(예를 들면, 덧셈, 뺄셈, 곱셈 등), 이러한 단일 합계 값은 ROC 곡선에서 플롯팅될 수 있다. 이러한 특성(feature)의 조합은 검사를 포함할 수 있다. 상기 ROC 곡선은 검사의 가양성율(1-특이도)에 대한 검사의 진양성율(민감도)의 플롯(plot)이다.
이러한 양의 해석, 즉 치료제에 대한 컷-오프 임계 반응성 또는 저항성은, 알려진 결과를 갖는 환자군으로부터의 개발 단계("트레이닝")로부터 유래된다. 결정 점수에 대한 상응하는 가중치 및 반응성/저항성 컷-오프 임계는 당엽자에게 알려진 방법으로 트레이닝 데이터로부터 선험적으로(a priori) 고정된다. 본 방법의 바람직한 구체예에서, 부분 최소 제곱 판별 분석(Partial Least Squares Discriminant Analysis: PLS-DA)은 상기 가중치를 결정하기 위해 사용된다(L. Stahle, S. Wold, J. Chemom. 1 (1987) 185-196; D. V. Nguyen, D.M. Rocke, Bioinformatics 18 (2002) 39-50). 당업자에게 알려진 분류를 수행하기 위한 다른 방법들 또한, 예를 들면, 식도암(OAC) 분류자의 전사체에 적용될 때, 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다.
다른 방법들이 상기 바이오마커들에서 측정된 정량적 데이터를 예후 또는 다른 진단적 용도로 전환하는데 이용될 수 있다. 이러한 방법들은 패턴 인식(Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001), 머신 러닝(Scholkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002, Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995), 통계학(Hastie et al. The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001), 바이오인포매틱스(Dudoit et al., 2002, J. Am. Statist. Assoc. 97:77-87, Tibshirani et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6567-6572) 또는 계량분석화학(chemometrics)(Vandeginste, et al., Handbook of Chemometrics and Qualimetrics, Part B, Elsevier, Amsterdam 1998)의 분야로부터의 방법을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
트레이닝 단계에서, 반응성/저항성 둘 모두의 사례에 대한 환자 시료가 측정되고 그 예측 방법은 상기 트레이닝 데이터로부터의 고유 정보(inherent information)를 이용하여 최적화되어, 상기 트레이닝 세트 또는 향후의 시료 세트를 최적으로 예측한다. 이러한 트레이닝 단계에서, 상기 사용된 방법은 훈련 또는 파라미터화되어 특정 강도 패턴으로부터 특정 예측 신호(call)를 예측할 수 있게 된다. 적절한 변형 또는 전-처리 단계가, 데이터에 진단적 방법 또는 알고리즘을 실시하기 전에, 측정된 데이터와 함께 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 각각의 전사체에 대한 전-처리 강도 값의 가중치 합이 형성되고 트레이닝 세트에 대해 최적화된 임계 값에 비교된다(Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001). 상기 가중치는 부분 최소 자승법(Partial Least Squares: PLS)(Nguyen et al., 2002, Bioinformatics 18 (2002) 39-50)) 또는 서포트 벡터 머신(Support Vector Machine: SVM)(Scholkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002)을 포함하는, 그러나 이에 한정되지는 않는, 다양한 선형 분류 방법에 의해 유도될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 데이터는 상기 기재한 바와 같이 가중치 합을 적용하기 전에 비선형적으로 변형된다. 이러한 비선형 변형은 상기 데이터의 차원(dimensionality)을 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 비선형 변환 및 가중치 가산은 또한 절대적으로 수행될 수 있으며, 예를 들면 커넬 함수의 이용을 통해 수행될 수 있다(Scholkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002).
본 발명의 다른 구체예에서, 새로운 데이터 시료는 실제로 측정된 트레이닝 시료 또는 인공적으로 만들어진 원형(prototype)인 두 개 이상의 종류의 원형과 비교된다. 이러한 비교는 적절한 유사도 측정, 예를 들면, 그러나 이에 제한되지는 않는, 유클리디안 거리(Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001), 상관 계수(Van't Veer, et al. 2002, Nature 415:530) 등을 이용하여 수행된다. 새로운 시료는 이후 가장 가까운 원형 또는 부근의 가장 많은 수의 원형과 예후 그룹과 함께 할당된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 판단 트리(dicision tree)(Hastie et al., The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001) 또는 랜덤 포레스트(Breiman, Random Forests, Machine Learning 45:5 2001)가 전사체 세트 또는 이들의 산물에 대하여 측정된 강도 데이터로부터의 예후적 신호를 만드는데 이용된다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 신경 네트워크(Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995)가 전사체 세트 또는 이들의 산물에 대하여 측정된 강도 데이터로부터의 예후적 신호를 만드는데 이용된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 선형, 대각선형(diagonal linear), 이차(quadratic) 및 로지스틱 판별 분석을 포함하는, 그러나 이에 한정되지는 않는, 판별 분석(discriminant analysis)(Duda et al., Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001)이 전사체 세트 또는 이들의 산물에 대하여 측정된 강도 데이터로부터의 예후적 신호를 만드는데 이용된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 마이크로어레이에 대한 예측 분석(Prediction Analysis for Microarray: PAM)(Tibshirani et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6567-6572)이 전사체 세트 또는 이들의 산물에 대하여 측정된 강도 데이터로부터의 예후적 신호를 만드는데 이용된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 클래스 유추의 소프트 독립 모델링(Soft Independent Modelling of Class Analogy: SIMCA)(Wold, 1976, Pattern Recogn. 8:127-139)이 전사체 세트 또는 이들의 산물에 대하여 측정된 강도 데이터로부터의 예후적 신호를 만드는데 이용된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, c-인덱스가 예측 능력을 정량화하기 위해 이용된다. 상기 인덱스는 바이오마커를 검열(censored)될 수 있는 연속 반응 변수(contiruous response variable)에 적용한다. 상기 c 인덱스는 환자의 생존 시간이 순서대로 나열되어(ordered) 높은 생존 예측을 갖는 개체가 오래 생존한 자가 되도록 하는, 모든 환자 쌍(pair)의 비율이다. 두 개체의 생존 시간은 두 개체가 검열되거나, 또는 하나가 실패하고 다른 하나의 후속 시간이 상기 처음의 실패 시간 미만인 경우에는 순서대로 할 수 없다. 상기 c 인덱스는 예측 및 관찰된 생존 사이의 일치의 가능성이고, 무작위적 예측에 대해서 c=0.5, 완전한 판별 모델에 대해서는 c=1을 갖는다(Frank E. Harrell, Jr. Regression Modeling Strategies, 2001).
치료제
상기 기재한 바와 같이, 본 명세서에 기재된 상기 방법은 비정상적인 DNA 수선를 갖는 종양을 표적으로 하는 치료제(이후, "DNA-손상 치료제"로 언급함)에 대한 반응성 또는 비-반응성으로서, 초기 OAC를 포함하는 OAC로부터 고통 받는 환자의 분류를 허용한다. 본 명세서에 이용되는 "DNA-손상 치료제"는 DNA를 직접적으로 손상시키는 것으로 알려진 제제, DNA 손상 수선을 막는 제제, DNA 손상 신호 전달을 저해하는 제제, DNA 손상 유발 세포 주기 정지를 저해하는 제제, 및 DNA 손상을 간접적으로 선도하는 과정을 저해하는 제제로 알려진 것들을 포함한다. OAC를 치료하는데 이용되는 일부 현재의 치료제 등은 하기의 DNA-손상 치료제를 포함한다.
1) DNA 손상 제제(DNA damaging agent)
a. 알킬화제(시스플라틴, 카르보플라틴, 및 옥살리플라틴; 시클로포스파미드; 부술판(busulphan) 등의 백금 함유 제제)
b. 토포이소머라제(topoisomerase) Ⅰ 저해제(이리노테칸; 토포테칸)
c. 토포이소머라제 Ⅱ 저해제(에토포시드; 독소루비신 및 에피루비신 등의 안트라시클린)
d. 이온화 방사선
2) DNA 수선 표적 치료법(DNA repair targeted therapy)
a. 비-상동 말단-접합(Non-homologous end-joining)의 저해제(DNA-PK 저해제, Nu7441, NU7026)
b. 상동 재조합의 저해제
c. 뉴클레오티드 절제 수선의 저해제
d. 염기 절단 수선의 저해제(PARP 저해제, AG014699, AZD2281, ABT-888, MK4827, BSI-201, INO-1001, TRC-102, APEX 1 저해제, APEX 2 저해제, 리가제(ligase) III 저해제)
e. 판코니 빈혈 경로(Fanconi anemia pathway)의 저해제
3) DNA 손상 신호 전달의 저해제
a. ATM 저해제(CP466722)
b. CHK1 저해제(XL-844,UCN-01, AZD7762, PF00477736)
c. CHK2 저해제(XL-844, AZD7762, PF00477736)
d. ATR 저해제(AZ20)
4) DNA 손상 유발 세포 주기 정지(DNA damage induced cell cycle arrest)의 저해제
a. Wee 1 키나제 저해제
b. CDC25a, b 또는 c 저해제
5) DNA 손상을 간접적으로 유도하는 과정의 저해
a. 히스톤 데아세틸라제 저해제
b. 열 충격 단백질 저해제(geldanamycin, AUY922)
6) DNA 합성의 저해제
a. 피리미딘 유사체(5-FU, 겜시타빈)
b. 전구약물(카페시타빈)
반응성을 예측하기 위한 상기 논의된 치료제들은 선행보조적 환경에 적용될 수 있다. 그러나 이들은 추가적인 또는 대안적인 보조적 환경에 적용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 발명은 임의의 DNA-손상 치료제에 한정되지 않는다; 이는, 예를 들면, DNA 손상 및/또는 DNA 손상 수선에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미치는, DNA-손상 치료제의 임의의 범위에 대한 반응자 및 비-반응자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 DNA-손상 치료제는 DNA 손상제, DNA 수선 표적 치료법, DNA 손상 신호 전달의 저해제, DNA 손상 유발 세포 주기 정지의 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 열 충격 단백질 저해제 및 DNA 합성의 저해제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함한다. 더욱 구체적으로는, 상기 DNA-손상 치료제는 백금-함유 제제, 겜시타빈 또는 5-플루오로우라실과 같은 뉴클레오시드 유사체, 또는 카페시타빈과 같은 이들의 전구약물, 에피루비신 또는 독소루비신과 같은 안트라실린, 시클로포스파미드와 같은 알킬화제, 이온화 방사선 또는 (이온화) 방사선 및 화학치료법의 조합(화학방사선 요법) 중 하나 이상으로부터 선택된 것일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 DNA-손상 치료제는 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴과 같은 백금 기반 제제 등의 백금-함유 제제를 포함한다. 상기 방법 및 키트는 DNA-손상 치료제 및 이와 함께 추가적인 치료법(방사선 등) 또는 약물로 치료하는 것에 대한 반응성을 예측할 수 있다. 따라서 상기 방법 및 키트는 조합 요법에 대한 반응성을 예측할 수 있다. 일부 구체예에서, 추가적인 치료제는 체세포 분열 저해제이다. 상기 체세포 분열 저해제는 빈카 알칼로이드 또는 탁산이다. 특정 구체예에서, 상기 빈카 알칼로이드는 비노렐빈이다. 다른 구체예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀 또는 도세탁셀이다. 특정 구체예에서, 하기의 치료에 대한 반응자가 확인된다: OAC의 치료에서, 시스플라틴/카르보플라틴 및 5-플루오로우라실(CF), 시스플라틴/카르보플라틴 및 카페시타빈(CX), 에피루비신/독소루비신, 시스플라틴/카르보플라틴 및 플루오로우라실(ECF), 에피루비신/독소루비신, 옥살리플라틴 및 카페시타빈(EOX), 및 파클리탁셀, 이리노테칸 및 비노렐빈과의 조합, 탁산과 함께 또는 탁산 없이 방사선 또는 화학방사선 치료.
질병 및 조직 출처
본 명세서에 기재된 상기 예후적 분류자는 식도암, 특히 OAC를 치료하기 위한 치료제에 대한 반응성 또는 저항성을 결정하는데 유용하다. 상기 식도암은 전형적으로 식도 선암(OAC)이고, 초기 단계일 수 있다.
일 구체예에서, 본 명세서에 기재된 상기 방법은 DNA 손상 제제, DNA 손상 표적 치료법, DNA 손상 신호 전달의 저해제, DNA 손상 유발 세포 주기 정지의 저해제, DNA 손상을 간접적으로 유발하는 과정의 저해제 및 DNA 합성의 저해제 종류의 화학요법제로 치료되는 OAC를 언급하지만, 이러한 종류에 한정되는 것은 아니다. 이러한 화학요법제들 각각은 본 명세서에서 사용되는 용어로서 "DNA-손상 치료제"로 간주된다.
"생물학적 시료(biological sample)", "시료(sample)", 및 "검사 시료(test sample)"는 개체로부터 수득되거나 또는 달리 유래되는 임의의 물질, 생물학적 액체, 조직, 또는 세포를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 이것은 혈액(전혈, 백혈구, 말초혈액 단핵세포, 버피 코트, 혈장 및 혈청을 포함), 가래, 눈물, 점액, 세비액, 비강 흡입물(nasal aspirate), 입김, 소변, 정액, 침, 뇌수막액, 양수, 선액(glandular fluid), 림프액, 유관액(nipple aspirate), 기관지 흡입물, 윤활액, 관절 흡입물, 복수, 세포, 세포 추출물, 및 뇌척수액을 포함한다. 이것은 또한 상기한 모든 것의 실험적으로 분리된 분획을 포함한다. 예를 들면, 혈액 시료는 혈청, 또는 적혈구 또는 백혈구(류코사이트)와 같은 특정 유형의 혈액 세포를 포함하는 분획으로 분획화될 수 있다. 원할 경우, 시료는 조직 및 액체 시료의 조합과 같은, 개체 유래의 시료의 조합일 수 있다. 용어 "생물학적 시료"는 또한 예를 들면 대변 시료, 조직 시료, 또는 조직 생검 유래와 같은, 균질화된 고형 물질을 포함하는 물질을 포함한다. 용어 "생물학적 시료"는 또한 조직 배양물 또는 세포 배양물로부터 유래된 물질을 포함한다. 임의의 적합한 생물학적 시료를 수득하는 방법이 사용될 수 있다; 예시적 방법은 예를 들면, 사혈, 면봉법 (예를 들면, 구강 면봉법), 및 미세 바늘 흡입물 생검 절차를 포함한다. 일부 구체예에서, 시료들은 내시경으로 얻는 것일 수 있다. 개체로부터 얻거나 또는 유래된 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻은 후 임의의 적절한 방법으로 처리된 시료 등을 모두 포함한다.
일부 경우에서, 상기 표적 세포는 종양 세포, 예를 들면 OAC 세포일 수 있다. 상기 표적 세포는 새로 얻은 시료, 동결 시료, 생검 시료, 채액 시료, 혈액 시료, 파라빈-포매 고정 조직 시료와 같은 보존된 시료(즉, 조직 블록) 또는 세포 배양물 등의 인간 및 동물 조직을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는, 임의의 조직 출처로부터 유래된다.
일부 특정 구체예에서, 상기 시료들은 소포(vesicle)를 포함하거나, 포함하지 않을 수 있다.
방법 및 키트
유전자 발현 분석을 위한 키트
본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위한 시약, 도구, 및/또는 지시서는 키트 내에 제공될 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 식도암 환자를 위한 적절한 치료법을 결정하기 위한 시약, 도구, 및 지시서를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 생검 등 환자로부터의 조직 시료를 수집하기 위한 시약 및 조직을 처리하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한, 환자 시료 내의 바이오마커의 발현 수준을 결정하기 위해, RT-PCR 및 qPCR를 포함하는 핵산 증폭, NGS, 노던 블롯, 단백체 분석, 또는 면역조직화학 수행하기 위한 시약 등의 바이오마커 발현 분석을 수행하기 위한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 예를 들면, RT-PCR을 수행하기 위한 프라이머, 노던 블롯 분석을 수행하기 위한 프로브, 및/또는 웨스턴 블롯, 면역조직화학 및 ELISA 등 단백체 분석을 수행하기 위한 항체가 이러한 키트 내에 포함될 수 있다. 상기 분석을 위한 적절한 버포 또한 포함될 수 있다. 상기의 임의의 분석에 필요한 검출 시약 또한 포함될 수 있다. 적절한 시약 및 방법이 본 명세서에 더 자세하게 기재되어 있다.
일부 구체예에서, 표 1A(서열번호 1-24), 1B(서열번호 25-50) 및/또는 3(서열번호 51-230), 또는 이들의 하위군에 열거된 표적 서열들은 본 명세서에 기재된 방법 및 키트에 사용될 수 있다. 상기 표적 서열들은 표적 서열에 혼성화하는 프라이머 및/또는 프로브를 디자인하기 위한 목적으로 이용되는 것일 수 있다. 적절한 프라이머 및/또는 프로브의 디자인은 표적 서열이 확인되면 당업자의 능력 범위 내에 있다. NCBI-primer-BLAST 툴과 같은, 다양한 프라이머 디자인 툴이 이러한 목적을 돕기 위해 자유롭게 이용 가능하다. 상기 프라이머 및/또는 프로브들은 엄격한 조건 하에서 표적 서열과 혼성화하기 위해 디자인된 것일 수 있다. 프라이머 및/또는 프로브는 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 (또는 초과) 뉴클레오티드 길이인 것일 수 있다. 각각의 하위군은 동일한 바이오마커를 표적으로 하는 다중의 프라이머 및/또는 프로브를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 표들은 일부 경우 동일한 전체 유전자(overall gene) 내에 다중의 표적 서열이 있는 것을 나타낸다. 이러한 프라이머 및/또는 프로브들은 본 발명의 방법을 수행하기에 유용한 키트에 포함될 수 있다. 상기 키트는 예를 들면 어레이 또는 PCR 기반 키트일 수 있고, 폴리머라제 및/또는 dNTP 등의 추가적인 시약을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 특징적인 키트는 또한 바이오마커 발현에 대한 분석을 어떻게 수행하는지 기재하는 지시서를 포함할 수 있다. 상기 지시서는 또한, 기준 코호트 내의 바이오마커의 발현 수준을 어떻게 결정하는지를 포함하여, 어떻게 코호트를 결정하는지와, 검사 환자들에 대한 비교를 위한 기준을 결정하기 위한 발현 데이터를 어떻게 수집하는지에 대한 지시를 포함할 수 있다. 상기 지시서는 또한 검사 환자 내의 바이오마커 발현 분석을 위한 지시 및 그 발현을 기준 코호트의 발현과 비교하고 이후 검사 환자에 대한 적절한 화학요법을 결정하기 위한 지시를 포함할 수 있다. 적절한 화학요법을 결정하기 위한 방법이 위에서 기술되었고 설명서 시트에 상세하게 기술될 수 있다.
키트에 포함된 정보 자료는 서술, 지시, 홍보물이거나 본 명세서에 기술된 방법과 연관된 다른 자료 및/또는 본 명세서에 기술된 방법을 위한 시약의 용도일 수 있다. 예를 들어, 키트의 정보 자료는 키트의 사용자가, 특히 이들이 특정 치료제에 대한 양성 응답을 가지는 인간의 확률을 적용할 경우에 유전자 발현 분석을 수행하고 결과를 해석하는데 대한 실질적인 정보를 얻을 수 있는 연락처, 예컨대, 물리적 주소, 이메일 주소, 웹사이트, 또는 전화번호를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 특징된 키트는 또한 바이오마커 발현으로부터 특정한 치료제에 대한 양성 반응성을 가질 가능성이 있는 환자를 추론하기 위해 필요한 소프트웨어를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 키트는 추가적으로 개체가 반응성으로 예상되는 경우의 투여를 위한 DNA-손상 치료제를 포함한다. OAC의 치료를 위해 본 명세서에 기재된 특정 제제 또는 제제의 조합 모두가 상기 키트에 통합될 수 있다. 상기 제제 또는 제제의 조합은 특이적으로 OAC 치료에 맞게 조정된 투여형 등의 형태로 제공될 수 있다. 상기 키트는, 예를 들면 선행보조 및/또는 보조적 치료의, OAC 치료법에 따른 투여를 위한 적절한 지시와 함께 제공될 수 있다.
a) 유전자 발현 프로파일링 방법
생물학적 시료에서 mRNA를 측정하는 것은 생물학적 시료에서 해당 단백질의 수준의 검출을 위한 대용으로서 이용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 기술된 임의의 바이오마커 또는 바이오마커 패널은 또한 적절한 RNA를 검출하는 것에 의해 검출될 수 있다. 유전자 발현 프로파일링 방법은 마이크로어레이, RT-PCT, qPCR, NGS, 노던 블롯, SAGE, 질량 분석법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
mRNA 발현 수준은 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR 이후 qPCR)에 의해 측정될 수 있다. RT-PCR은 mRNA로부터 cDNA를 생성하는데 이용된다. cDNA는 DNA 증폭 과정 진행으로서 형광을 생산하기 위해 qPCR 어세이에서 이용될 수 있다. 표준 곡선과의 비교함으로써, qPCR은 세포당 mRNA의 카피수와 같은 절대적 측정치를 생성할 수 있다. 노던 블롯, 마이크로어레이, 전화분석(Invader assay), 및 모세관 전기이동과 결합된 RT-PCR은 모두 시료에서 mRNA의 발현 수준을 측정하는데 이용되어 왔다. Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004을 참조한다.
miRNA 분자는 코딩하지 않지만 유전자 발현을 조절할 수 있는 소형 RNA이다. mRNA 발현 수준의 측정에 적합한 임의의 방법이 또한 상응하는 miRNA에 대해 이용될 수 있다. 최근 많은 실험실들이 질환에 대한 바이오마커로서 miRNA의 이용을 조사해왔다. 많은 질환들은 광범위한 전사 조절을 포함하고, miRNA의 바이오마커로서의 역할을 발견할 수 있다는 것은 놀랍지 않다. miRNA 농도 및 질환 사이의 연결관계는 흔히 단백질 수준 및 질환 사이의 연결관계보다 덜 명확하나, miRNA 바이오마커의 가치는 상당할 수 있다. 물론, 질환 중 다르게 발현된 임의의 RNA에서와 같이, 인 비트로 진단 산물의 개발이 직면하는 문제는 miRNA가 병든 세포에서 생존하고 분석을 위해 쉽게 추출되거나, 또는 miRNA가 혈액 또는 그들이 측정될 만큼 충분히 생존해야하는 다른 매트릭스로 방출된다는 요건을 포함할 것이다. 비록 많은 잠재적인 단백질 바이오마커가 병리 및 기능의 부위에 측분비(paracrine) 방식으로 의도적으로 분비되지만, 단백질 바이오마커는 유사한 요건을 갖는다. 많은 잠재적 단백질 바이오마커들이 그 단백질이 합성되는 세포 바깥에서 기능하도록 설계된다.
유전자 발현은 또한 질량분석 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 다양한 구성의 질량분석계가 바이오마커 값을 검출하는데 이용될 수 있다. 질량 분석의 여러 유형이 이용가능하고 또는 다양한 구성으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 질량 분석은 다음의 주요 구성요소를 갖는다: 시료 주입구, 이온 공급원, 질량 분석기, 검출기, 진공 시스템, 및 장비 제어 시스템, 및 데이터 시스템. 시료 주입구, 이온 공급원, 및 질량 분석기의 차이는 일반적으로 장비의 종류 및 그것의 성능으로 정의한다. 예를 들면, 주입구는 모세관-컬럼 액체 크로마토그래피 공급원일 수 있거나 또는 기질보조 레이저 탈착에서 이용되는 것과 같은 직접적 프로브 또는 스테이지일 수 있다. 통상적인 이온 공급원은 예를 들면, 나노분무기 및 마이크로분무기를 포함하는 매트릭스 전자분무 또는 기질보조 레이저 탈착이다. 통상적인 질량 분석기는 사중극 질량 필터, 이온 트랩 매스 분석기 및 시간-비행(time-of-flight) 질량 분석기를 포함한다. 추가적인 질량 분석 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다 (Burlingame et al., Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998); Kinter and Sherman, New York (2000) 참조).
단백질 바이오마커 및 바이오마커 값은 다음 중 임의의 것에 의해 검출 및 측정될 수 있다: 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS), ESI-MS/MS, ESI-MS/(MS)n, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 비행시간 질량분석법(MALDITOF-MS), 표면-증강 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량분석법(SELDI-TOF-MS), 실리콘 상의 탈착/이온화(DIOS), 2차 이온 질량분석법(SIMS), 4극형 비행시간(Q-TOF), 탠덤 비행시간 (TOF/TOF) 기술, 소위 울트라플렉스(ultraflex) III TOF/TOF, 대기압 화학적 이온화 질량분석법(APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS).sup.N, 대기압 광이온화 질량분석법(APPI-MS), APPI-MS/MS, 및 APPI-(MS).sup.N, 4 극형 질량분석법, Fourier 변환 질량분석법(FTMS), 정량적 질량분석법, 및 이온 포획 질량분석법.
시료 제조 전략은 단백질 바이오마커의 질량 분광 특징분석 및 바이오마커 값의 결정 전에 시료를 표지하고 농축하는데 이용된다. 표지 방법은 절대적인 정량을 위한 동중원소 태그(iTRAQ) 및 세포 배양액에서 아미노산으로의 안정한 동위원소 표지(SILAC)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 질량 분광 분석 전에 후보 바이오마커 단백질에 대한 시료를 선택적으로 농축하기 위해 사용되는 포획제는 앱타머, 항체, 핵산 탐침, 키메라, 소형 분자, F(ab')2 단편, 단일 사슬 항체 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 핵산, 렉틴, 리간드-결합 수용체, 어피바디(affybody), 나노바디(nanobody), 안키린, 도메인 항체, 대안적 항체 스캐폴드(예컨대 디아체(diabody) 등) 각인된 중합체, 아비머(avimer), 펩티드모방체, 펩토이드, 펩티드 핵산, 트레오스 핵산, 호르몬 수용체, 시토카인 수용체, 및 합성 수용체, 및 그의 변형 및 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
앞서 말한 어세이는 암 치료제의 반응성을 예측하는 방법에 유용한 바이오마커 값의 검출을 가능하게 하며, 상기 방법은 OAC로 고통 받는 개체 유래의 생물학적 시료에서 표 1 내지 4에서 제공된 바이오마커로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이오마커에 각각 해당하는, N개 이상의 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하며, 본 명세서에서 자세히 기재된, 바이오마커 값을 이용하는 분류는 개체가 치료제에 대해 반응성일지를 표시한다. 특정 기술된 예측적 바이오마커가 치료제에 대한 반응성을 예측하는데 오직 유용한 반면, 2개 이상의 바이오마커의 패널로서 각각 유용한 바이오마커의 다중 서브세트의 그룹화를 위한 방법이 본 명세서에 또한 기재된다. 따라서, 본 출원의 다양한 구체예는 N개의 바이오마커를 포함하는 조합을 제공하며, 여기서 N은 3개 이상의 바이오마커이다. N이 임의의 전술된 범위, 및 유사하나, 보다 높은 순서의, 범위로부터 임의의 수가 되도록 선택될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 따라, 바이오마커 값은 개별적으로 검출되고 분류되며, 또한 일괄하여, 예를 들면 멀티플렉스 어세이 형식과 같이 검출되고 분류될 수 있다.
b) 마이크로어레이 방법
일 구체예에서, 본 발명은 "올리고뉴클레오티드 어레이" (또한 본 명세서에서 "마이크로어레이"라고도 명명됨)을 이용한다. 마이크로어레이는 세포에서 바이오마커의 발현을 분석 및 특히 암 조직의 바이오마커의 발현을 측정하는데 이용될 수 있다.
일 구체예에서, 바이오마커 어레이는 세포에 존재하는 mRNA 전사물을 나타내는 검출 가능하게 표지된 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, 총 세포 mRNA 또는 표지된 cRNA로부터 합성된 형광성으로-표지된 cDNA)를 마이크로어레이와 혼성화하는 것에 의해 생산된다. 마이크로어레이는 세포 또는 유기체의 유전체 내 수많은 유전자, 바람직하게는 대부분 또는 거의 모든 유전자의 산물에 대해 수차적인 배열의 결합 (예를 들면, 혼성화) 부위를 갖는 표면이다. 마이크로어레이는 당해 기술분야에서 공지된 수많은 방식으로 제조될 수 있다. 어떻게 제조되었든, 마이크로어레이는 특정 특징을 공유한다. 상기 어레이는 재생가능하고, 제공된 어레이의 다중 카피가 생산되는 것을 허용하며, 서로 쉽게 비교된다. 바람직하게 마이크로어레이는 소형이고, 일반적으로 5 cm2 보다 작으며, 그들은 결합 (예를 들면, 핵산 혼성화) 조건 하에서 안정한 물질들로부터 제조된다. 마이크로 어레이에서 소정의 결합 부위 또는 결합 부위의 고유 세트는 특이적으로 세포에서 단일 유전자의 산물에 특이적으로 결합할 것이다. 특정 구체예에서, 각각의 위치에 부착된 공지된 서열을 포함하는 위치적 지정 가능한 어레이가 이용된다.
세포의 RNA에 상보적인 cDNA 가 만들어지고 적합한 혼성화 조건 하에서 마이크로어레이와 혼성화될 때, 임의의 특정 유전자에 해당하는 어레이 내 위치에 대한 혼성화의 수준이 그 유전자/바이오마커로부터 전사된 mRNA의 세포내 출현율을 반영할 것이라는 것이 이해될 것이다. 예를 들면, 총 세포의 mRNA에 상보적인 검출 가능하게 표지된(예를 들면, 형광단에 의해) cDNA 또는 cRNA가 마이크로어레이와 혼성화될 경우, 세포에서 전사되지 않는 유전자에 해당하는 어레이 상의 위치(즉, 유전자의 산물과 특이적으로 결합가능)는 신호 (예를 들면, 형광 신호)를 거의 또는 전혀 가지지 않을 것이고, 코딩된 mRNA가 출현하는 유전자는 상대적으로 강한 신호를 가질 것이다. 핵산 혼성화 및 세척 조건은 탐침이 특정 어레이 부위에 "특이적으로 결합하거나" 또는 "특이적으로 혼성화하도록", 즉, 탐침이 상보적인 핵산 서열을 갖는 서열 어레이 부위에는 혼성화하거나, 이중가닥을 이루거나 결합하지만, 비-상보적인 핵산 서열을 갖는 부위에 혼성화하지 않도록 선택된다. 폴리뉴클레오티드 중 더 짧은 것이 25 염기 이하일 때, 표준 염기-쌍형성 규칙을 이용하여 어떠한 미스매치도 없는 경우 또는, 폴리뉴클레오티드 중 더 짧은 것이 25 염기보다 길 때, 5% 이하의 미스매치가 존재할 경우에, 본 명세서에 사용된, 하나의 폴리뉴클레오티드 서열은 또 다른 서열에 상보적인 것으로 간주된다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 완벽하게 상보적이다(미스매치 없음). 일상적인 실험을 이용한 음성 대조를 포함하는 혼성화 분석을 수행함으로써 특정 혼성화 조건이 특정한 혼성화를 유도함이 증명될 수 있다.
최적의 혼성화 조건은 표지된 프로브 및 고정된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 길이(예컨대, 올리고머 vs. 200 염기를 초과하는 폴리뉴클레오티드) 및 유형(예를 들면, RNA, DNA, PNA)에 의존할 것이다. 핵산에 대한 특정(즉, 엄격한) 혼성화 조건을 위한 일반적인 파라미터는, 모든 목적에 있어서 그의 전체가 포함된, Sambrook et al., 및, 상기와 동일한, in Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing and Wiley-interscience, NY (1987)에 기재된다. cDNA 마이크로어레이가 이용될 경우, 통상적인 혼성화 조건은 5xSSC 플러스 0.2% SDS에서 65℃에서 4 시간 동안 혼성화 이후, 저 엄격도(stringency) 세척 버퍼 (1xSSC 플러스 0.2% SDS)에서 25℃에서 세척 후, 고 엄격도 세척 버퍼 (0.1SSC 플러스 0.2% SDS)에서 25℃에서 10분간 세척한다 (Shena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, p. 10614 (1996) 참조). 유용한 혼성화 조건은 또한, 예를 들면, Tijessen, Hybridization With Nucleic Acid 프로브s", Elsevier Science Publishers B.V. (1993) 및 Kricka, "Nonisotopic DNA Probe Techniques", Academic Press, San Diego, Calif. (1992)에서 제공된다.
마이크로어레이 플랫폼은 Affymetrix, Illumina 및 Agilent 등의 회사에서 제조된 것들을 포함한다. Affymetrix에 의해 제조된 마이크로어레이 플랫폼의 예시는 U133 Plus2 array, Almac proprietary XcelTM array 및 Breast Cancer DSA® 및 Lung Cancer DSA®을 포함하는 Almac proprietary Cancer DSAs®를 포함한다.
c) 면역어세이 방법
면역어세이 방법은 항체의 그의 상응하는 표적 또는 분석물에 대한 반응을 기초로 하며 특정 어세이 형식에 따라 샘플 내 분석물을 검출할 수 있다. 면역반응성을 기초로 하여 어세이 방법의 특이성 및 감응성을 개선하기 위해, 단일클론 항체가 이들의 특이적인 에피토프 인식으로 인해 흔히 사용된다. 다중클론 항체는 또한 단일클론 항체에 비해 표적에 대한 이들의 증가된 친화성으로 인해 다양한 면역어세이에서 성공적으로 사용되어 왔다. 면역어세이는 광범위한 생물학적 샘플 매트릭스와 사용되도록 고안되었다 면역어세이 형식은 정성적, 반-정량적, 및 정량적 결과를 제공하기 위해 고안되어 왔다.
정량적 결과는 검출될 특정 분석물의 공지된 농도로 형성되는 표준 곡선을 사용하여 생성될 수 있다. 미지 샘플로부터의 응답 또는 신호는 표준 곡선 위에 도시되고, 미지 샘플 내 표적에 해당하는 양 또는 값이 정해진다.
수많은 면역어세이 형식이 고안된 바 있다. ELISA 또는 EIA는 분석물/바이오마커의 검출에 대해서 정량적일 수 있다. 이러한 방법은 분석물 또는 항체에 표지를 부착하는 것에 의존적이며 표지 성분은, 직접적으로나 간접적으로, 효소를 포함한다. ELISA 검사는 분석물의 직접, 간접, 경쟁적, 또는 샌드위치 검출로 형식화될 수 있다. 다른 방법은 예를 들어, 방사성동위원소 (I125) 또는 형광과 같은 표지에 의존적이다. 부가적인 기술은 예를 들어, 응집, 비탁법, 혼탁도측정법, 웨스턴 블롯, 면역침강법, 면역세포화학, 면역조직화학, 유세포분석법, Luminex 어세이, 및 기타 (ImmunoAssay: A Practical Guide, Brian Law 편집, Taylor & Francis, Ltd. 발행, 2005 년도 판 참조)를 포함한다.
예시적인 어세이 형식은 효소-결합 면역흡착 어세이(ELISA), 방사선 면역 어세이, 형광법, 화학발광법, 및 형광 공명 에너지 전이(FRET) 또는 시간 분해-FRET (TR-FRET) 면역어세이를 포함한다. 바이오마커를 검출하기 위한 절차의 예는 생체마커 면역침강법 그 이후 크기 및 펩티드 수준 식별을 가능하게 하는 정량적 방법, 가령 겔 전기영동, 모세관 전기이동, 평면 전기크로마토그래피 등을 포함한다.
검출 가능한 표지 또는 신호 생성 물질을 검출 및/또는 정량하는 방법은 표지의 성질에 의존적이다. 적절한 효소에 의해 촉매되는 반응의 산물은 (여기서 검출가능한 표지는 효소임; 상기 참조) 제한 없이, 형광, 빛, 또는 방사선일 수 있거나 이들은 가시광선 또는 자외선을 흡수할 수 있다. 그러한 검출 가능한 표지를 검출하기 위해 적절한 검출기의 예는 제한 없이, x-선 필름, 방사능 계수기, 섬광 계수기, 분광광도계, 색도계, 형광계, 광도계, 및 밀도측정기를 포함한다.
검출을 위한 임의의 방법은 반응의 임의의 적절한 준비, 처리, 및 분석을 가능하게 하는 임의의 형식으로 수행될 수 있다. 이는, 예를 들어, 다중-웰 어세이 플레이트(예컨대, 96 웰 또는 384 웰) 내 또는 임의의 적절한 어레이 또는 마이크로어레이를 이용하는 것일 수 있다. 다양한 제제를 위한 모액이 수동 또는 로봇식으로 제조될 수 있고, 이후의 모든 피펫팅, 희석, 혼합, 분산, 세척, 항온처리, 샘플 판독, 데이터 수집 및 분석은 검출가능한 표지를 검출할 수 있는 시판되는 분석 소프트웨어, 로봇장치, 및 검출 장비를 이용하여 로봇식으로 실시될 수 있다.
임상적 용도
일부 구체예에서, 치료 요법에 대해 반응성인 OAC 환자를 확인 및/또는 선별하기 위한 방법들이 제공된다. 특히, 상기 방법들은 직접적 또는 간접적으로 DNA를 손상시키는 제제를 투여하는 것을 포함하는 치료 요법에 반응성인 암 환자를 확인 또는 선별하는 것에 관한 것이다. 치료 요법에 대해 비-반응성인 환자를 확인하기 위한 방법들 또한 제공된다. 이러한 방법들은 전형적으로 환자의 종양(원발성, 전이성 또는 혈액, 또는 혈액 내 성분, 소변, 타액 및 다른 체액 등, 그러나 이에 한정되지는 않는, 종양으로부터의 다른 유도체)(예를 들면, 환자의 암세포) 내 예후적 마커 집단의 발현 수준을 결정하고, 그 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하고, 및 시료 내 발현이 치료제에 대한 반응성 또는 비-반응성에 해당하는 선별된 예후적 바이오마커 또는 바이오마커 세트의 발현 패턴 또는 프로파일을 포함하는지 확인하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, DNA-손상 치료제에 의한 치료에 대한 식도 선암(OAC)을 갖는 개체의 반응성을 예측하는 방법은
a. 개체로부터 얻은 검사 시료 내 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 바이오마커는 표 1A 및/또는 1B 및/또는 2A 및/또는 2B 및/또는 3 및/또는 4로부터 선택된 것인 단계;
b. 상기 발현 수준을 포착하는 검사 점수를 유도하는 단계;
c. 상기 검사 점수 및 반응성을 연관시키는 정보를 포함하는 임계 점수를 제공하는 단계; 및
d. 상기 검사 점수를 상기 임계 점수와 비교하는 단계를 포함하고; 상기 반응성은 상기 검사 점수가 상기 임계 점수를 초과할 때 예측되는 것인 방법이다.
특정 구체예에서, DNA-손상 치료제에 의한 치료에 대한 식도 선암(OAC)을 갖는 개체의 반응성을 예측하는 방법은 하기의 단계를 포함한다: 개체로부터 검사 시료를 얻는 것; 검사 시료 내의 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 것으로서, 상기 발현 수준은 CXCL10, MX1, IDO1, IF144L, CD2, GBP5, PRAME, ITGAL, LRP4, 및 APOL3으로 구성된 군으로부터 선택된 것; 발현 수준을 포착하는 검사 점수를 유도하는 것; 상기 검사 점수 및 반응성과 관련 있는 정보를 포함하는 임계 점수를 제공하는 것; 및 상기 검사 점수를 상기 임계 점수와 비교하는 것; 상기 반응성은 상기 검사 점수가 상기 임계 점수를 초과할 때 예측되는 것. 당업자는 실시예 1의 설명(teaching)을 포함하는 본 명세서에 제공되는 설명을 이용하여, 적절한 임계 점수 및 적절한 바이오마커 가중치 및 편향을 결정할 수 있다.
다른 구체예에서, DNA-손상 치료제에 의한 치료에 대한 식도 선암(OAC)을 갖는 개체의 반응성을 예측하는 방법은 검사 시료 내의 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하고, 상기 하나 이상의 바이오마커는 CXCL10, MX1, IDO1, IF144L, CD2, GBP5, PRAME, ITGAL, LRP4, APOL3, CDR1, FYB, TSPAN7, RAC2, KLHDC7B, GRB14, AC138128.1, KIF26A, CD274, CD109, ETV7, MFAP5, OLFM4, PI15, FOSB, FAM19A5, NLRC5, PRICKLE1, EGR1, CLDN10, ADAMTS4, SP140L, ANXA1, RSAD2, ESR1, IKZF3, OR2l1P, EGFR, NAT1, LATS2, CYP2B6, PTPRC, PPP1R1A, 및 AL137218.1로 구성된 군으로부터 선택된 것이다. 표 2A 및 2B는 예시적인 유전자 시그니쳐(또는 유전자 분류자)를 제공하고, 상기 바이오마커는 여기에 열거된 40 또는 44 유전자 산물로 각각 구성되고, 및 상기 임계는 여기에 열거된 개별적 유전자 산물 가중치로부터 유도된다. 이러한 구체예 중 하나에서 상기 바이오마커는 표 2B에 열거된 44 유전자 산물로 구성되고, 상기 바이오마커는 표 2B에서 제공되는 가중치와 연관되고, 0.3681의 임계 점수 등의 임계점수를 초과하는 검사 점수는 그 개체가 DNA-손상 치료제에 대한 반응성일 수 있는 가능성을 나타낸다.
치료제에 대한 접촉이 없을 시의 암의 성장과 비교하여, 치료제에 접촉한 결과로 그의 성장율이 저해된다면, 암은 치료제에 대해 "반응성"이다.
치료제에 대한 접촉이 없을 시의 암의 성장과 비교하여, 치료제에 접촉한 결과로 그의 성장율이 저해되지 않거나 또는 매우 적은 정도로 저해된다면, 암은 치료제에 대해 "비-반응성"이다. 상기한 바와 같이, 암의 성장은 다양한 방법으로 측정될 수 있으며, 예를 들면 종양의 크기 또는 종양 형태에 적절한 종양 마커의 발현이 측정될 수 있다. 치료제에 대한 비-반응성이 되는 정도(quality)는 주어진 치료제에 대해 "비-반응성"의 다른 수준을 나타내는 다른 암과 함께, 다른 조건 하에서 매우 가변적이다. 또한, 비-반응성의 측정은 종양 크기의 성장을 넘어, 환자의 삶의 질, 전이의 정도 등 추가적인 기준을 이용하여 평가될 수 있다.
이러한 검사의 적용은 전체 생존, 진행 없는 생존, RECIST로 정의된 방사선 반응, 완전 반응, 부분 반응, PSA, CEA, CA125, CA15-3 및 CA19-9와 같은, 그러나 이에 제한되지는 않는, 안정한 질병 및 혈청학적 마커를 포함하는, 그러나 이에 제한되지는 않는 종점을 예측할 것이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 단독, 또는 표준 치료 상황에서 DNA 손상 조합 치료요법 치료된 식도 선암(OAC) 환자의 내시경 초음파, CT, 나선형 CT, FDG-PET, 병리학적, 조직학적 반응을 평가하는 것이 이용될 수 있다.
하나 이상의 핵산 또는 코딩된 단백질 등 생물학적 유도체 시료 내의 RNA, DNA 또는 단백질의 검출, 정량 및 정성을 위한, 정량적 PCR(QPCR), 효소-연결 면역흡착 분석(ELISA) 또는 면역조직화학(IHC) 등을 포함하는 어레이 또는 비-어레이 기반 방법이 이용될 수 있다.
분석된 시료로부터 발현 프로필을 얻은 후, 상기 발현 프로필은 기준 또는 대조군 프로필과 비교하여 세포 또는 조직, 따라서, 시료가 채취된 숙주의 치료 반응적 표현형과 관련한 진단을 낸다. 본 명세서에서 발현 프로필과 관련하여 사용된 용어 "기준(reference)" 및 "대조군(control)"은 주어진 환자의 발현 분류자를 해석하고 예후 또는 예측적 종류를 지정하기 위해 이용되는 표준화된 유전자의 패턴 또는 유전자 산물 발현 또는 특정 바이오마커의 발현 수준을 의미한다. 상기 기준 또는 대조군 발현 프로필은 원하는 표현형, 예를 들면 반응성 표현형을 갖는 것으로 알려진 시료로부터 얻은 것일 수 있고, 따라서 양성 기준 또는 대조군 프로필일 수 있다. 또한, 상기 기준 프로필은 원하는 표현형을 가지지 않는 것으로 알려진 시료로부터 얻은 것일 수 있고, 따라서 음성 기준 프로필일 수 있다.
정량적 PCR이 하나 이상의 핵산의 수준을 정량화하는 방법으로서 이용되는 경우, 이 방법은 이중-라벨 형광성 프로브(예를 들면, TaqMan® 프로브 또는 분자 비콘(molecular beacon) 또는 FRET/Light Cycler 프로브)에 의해 방출되는 형광의 측정을 통해 PCR 산물의 축적을 정량화하는 것일 수 있다. Scorpion 및 Ampliflyor 시스템과 같이 프로브가 프라이머에 내재된 방법과 같은 일부 방법은 별도의 프로브를 필요로 하지 않을 수 있다.
특정 구체예에서, 얻어진 발현 프로필은 단일 기준 프로필과 비교되어 분석되는 시료의 표현형과 연관된 정보를 얻는다. 또 다른 구체예에서는, 얻어진 발현 프로필은 두개 이상의 기준 프로필과 비교되어 분석되는 시료의 표현황과 관련한 더 깊은 정보를 얻는다. 예를 들면, 얻어진 발현 프로필은 양상 및 음성 기준 프로필과 비교되어 그 시료가 관심 있는 표현형을 갖는지 여부에 대한 확실한 정보를 얻을 수 있다.
얻은 발현 프로필의 비교 및 하나 이상의 기준 프로필은 예를 들면, 발현 프로필의 디지털 이미지를 비교하는 것, 발현 데이터의 데이터베이스를 비교하는 것 등 어레이 업계의 당업자에게 알려진 다양한 방법론에 따른 임의의 편리한 방법론을 이용하여 수행될 수 있다. 발현 프로필을 비교하는 방법을 기재하는 특허는 미국 특허 번호 6,308,170 및 6,228,575를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니고, 이들에 개시된 내용은 본 명세서에 참조로서 통합된다. 발현 프로필을 비교하는 방법 또한 상기에 기재되어 있다.
상기 비교 단계는 얻어진 발현 프로필이 하나 이상의 기준 프로필과 얼마나 유사 또는 비유사한지에 관한 정보로 이어지고, 이 유사성 정보는 분석되는 시료의 표현형을 결정하는데 이용된다. 예를 들면, 양성 대조군과의 유사성은 분석된 시료가 반응성 기준 시료와 유사한 반응성 표현형을 갖는 것을 나타낸다. 마찬가지로, 음성 대조군과의 유사성은 분석되는 시료가 비-유사성 기준 시료에 유사한 비-유사성 표현형을 가지는 것을 나타낸다.
바이오마커의 발현 수준은 다른 기준 발현 수준과 더 비교될 수 있다. 예를 들면, 기준 발현 수준은 바이오마커 또는 바이오마커 세트의 발현이 정보가 있는 것인지(informative) 평가하고, 환자가 반응성 또는 비-반응성인지 결정하기 위한 평가를 만들기 위해 사전-결정된 발현의 표준 기준 수준일 수 있다. 추가적으로, 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것은 환자가 반응성 또는 비-반응성인지 결정하기 위한 평가를 만들기 위해, 바이오마커로서 동시에 측정된 발현의 내부 기준 마커 수준과 비교될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 바이오마커를 포함하지 않지만, 일정한 발현 수준을 증명하는 것으로 알려진, 구분되는 마커 패널의 발현이 내부 기준 마커 수준으로서 평가될 수 있고, 상기 바이오마커 발현의 수준은 기준에 대한 비교로서 결정된다. 대안적인 구체예에서, 비-종양 시료인 조직 시료에서 선별된 바이오마커의 발현은 내부 기준 마커 수준으로서 평가될 수 있다. 바이오마커의 발현 수준은 특정 양상에서 증가된 발현을 갖는 것으로 결정될 수 있다. 바이오마커의 발현 수준은 다른 양상에서 감소된 발현을 갖는 것으로 결정될 수 있다. 상기 발현 수준은 기준 수준과 비교하여 발현에서 정보적인 변화가 없는 것으로 결정될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 명세서에서 제공되는 방법에 의해 결정된 것으로서 사전 결정된 표준 발현 수준에 대비하여 결정된다.
본 발명은 또한 환자의 통상적인 치료를 제시하는 것에 관한 것이다. 진단 검사에서, 직접적 또는 간접적으로 DNA 손상 및/또는 DNA 손상 수선에 영향을 미치는 종류의 약물에 대하여 반응성이라고 나타난 환자에게는 그 치료가 시행될 수 있고, 환자 및 종양학자 모두는 환자가 이익을 얻을 것임을 확신할 수 있다. 진단 검사에서 비-반응성으로 지정된 환자는 그들에게 더 이득을 제공하기 쉬운 대안적인 치료법의 대상으로 확인될 수 있다.
본 발명은 OAC를 치료하기 위해 직접적 또는 간접적으로 DNA 손상 및/또는 DNA 손상 수전에 영향을 미치는 종류의 신규한 약물의 임상시험을 위한 환자를 선별하는 것에 관한 것이다. 반응성의 가능성을 갖는 풍부한 시험 집단은 관련 기준하에서 약물의 더욱 철저한 평가를 용이하게 할 것이다.
본 발명은 또한 DNA 손상 반응 결손(DDRD)와 관련한 OAC를 갖거나 또는 OAC의 발병에 취약한 환자로서 진단을 내리는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 DDRD는 환자의 세포 또는 세포들이 DNA 손상을 수선하는 능력이 감소되고, 감소된 능력은 종량의 발달 또는 성장의 원인 인자인 모든 상태로서 정의된다. DDRD 진단은 또한 선암과 관련 있는 것일 수 있다. 식도 선암(OAC)를 갖는 개체를 진단하는 방법은,
a. 개체로부터 얻은 검사 시료 내 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 것으로서, 상기 하나 이상의 바이오마커는 표 1A, 1B, 2A, 2B, 3 또는 4로부터 선택된 것인 단계;
b. 상기 발현 수준을 포착하는 검사 점수를 유도하는 단계;
c. 상기 검사 점수 및 OAC의 진단을 관련시키는 정보를 포함하는 임계 점수를 제공하는 단계; 및
d. 상기 검사 점수를 상기 임계 점수와 비교하는 단계를 포함할 수 있고; 상기 개체는, 상기 검사 점수가 상기 임계 점수를 초과할 때, OAC를 갖거나 또는 OAC가 발병할 수 있는 개체로 결정되는 것인 방법이다..
상기 진단하는 방법은 개체로부터 검사 시료를 얻는 단계; 검사 시료 내의 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 발현 수준은 CXCL10, MX1, IDO1, IF144L, CD2, GBP5, PRAME, ITGAL, LRP4, 및 APOL3으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 단계; 상기 발현 수준을 포착하는 검사 점수를 유도하는 단계; 상기 검사 점수 및 OAC의 진단과 관련 있는 정보를 포함하는 임계 점수를 제공하는 단계; 및 상기 검사 점수를 상기 임계 점수와 비교하는 단계; 상기 개체는, 상기 검사 점수가 상기 임계 점수를 초과할 때, 암을 갖거나 또는 암이 발병할 수 있는 개체로 결정되는 단계를 포함할 수 있다. 당업자는 실시예 1의 설명을 포함하는 본 명세서에 제공되는 설명을 이용하여, 적절한 임계 점수 및 적절한 바이오마커 가중치 및 편향을 결정할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 DDRD와 관련한 OAC를 갖거나, 또는 OAC 발병에 취약한 환자로서 진단을 내리는 방법은 검사 시료 내의 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하고, 상기 하나 이상의 바이오마커는 CXCL10, MX1, IDO1, IF144L, CD2, GBP5, PRAME, ITGAL, LRP4, APOL3, CDR1, FYB, TSPAN7, RAC2, KLHDC7B, GRB14, AC138128.1, KIF26A, CD274, CD109, ETV7, MFAP5, OLFM4, PI15, FOSB, FAM19A5, NLRC5, PRICKLE1, EGR1, CLDN10, ADAMTS4, SP140L, ANXA1, RSAD2, ESR1, IKZF3, OR2l1P, EGFR, NAT1, LATS2, CYP2B6, PTPRC, PPP1R1A, 및 AL137218.1로 구성된 군으로부터 선택된 것이다. 표 2A 및 2B는 예시적인 유전자 시그니쳐(또는 유전자 분류자)를 제공하고, 상기 바이오마커는 여기에 열거된 40 또는 44 유전자 산물로 각각 구성되고, 및 상기 임계는 여기에 열거된 개별적 유전자 산물 가중치로부터 유도된다. 이러한 구체예 중 하나에서 상기 바이오마커는 표 2B에 열거된 44 유전자 산물로 구성되고, 상기 바이오마커는 표 2B에서 제공되는 가중치와 연관되고, 0.3681의 임계 점수와 같은 임계점수를 초과하는 검사 점수는 OAC의 진단 또는 OAC 발병에 취약한 것을 나타낸다.
도 1: 선행보조적 화학치료법으로 치료받은 EAC 환자의 재발 없는 생존(relapse-free survival: RFS)를 예측하는, DDRD 시그니쳐에 대한 카플란 마이어 플롯(Kaplan Meier plot).
도 2: 선행보조적 화학치료법으로 치료받은 EAC 환자의 전체 생존(PFS)을 예측하는, DDRD 시그니쳐에 대한 카플란 마이어 플롯.
도 3: 선행보조적 화학치료법으로 치료받지 않은 EAC 환자의 생존(PFS)을 예측하는, DDRD 시그니쳐에 대한 카플란 마이어 플롯.
하기의 실시예들은 설명하는 것으로서 제공되는 것이고, 제한하는 것이 아니다.
실시예 1 - DDRD 분석의 식도 선암(OAC)에 대한 적용 및 검증(validation)
방법
시료
인간 조직의 사용에 대한 적절한 윤리적 승인 및 동의 정보를 받은 46명의 FFPE 사전-화학치료(백금-기반; 시스플라틴 치료) 식도 내시경 생검 시료를 식도암(OAC)에서의 DDRD 분석(표 2B에 열거된 44개 유전자를 기반)의 예측 능력을 증명하기 위해 이용하였다. 시료마다 "염색된(marked up)" 해마톡실린 & 에오신(H&E) 염색 슬라이드와 함께 시료마다 5개의 FFPE 조직 슬라이드를 얻었다. H&E 슬라이드의 병리학적 아형을 조사하였고, 현미경 사용 없는 절단(macrodissection)의 대상으로 선택하였다.
유전자 발현 프로파일링
모든 시료는 질관리 환경에서 적절한 표준 작업 절차(SOP)에 따라 수행하였다.
시료당 모든 5개 부분(section)은 현미경의 사용 없이 절단하였고, Ambion RecoverAll 키트를 이용하여 추출하였다. 그 용해물은 두 개로 분리하였고 대부분의 경우에서 재료의 오직 한 절반만이 프로파일링에 충분하였다. 2번의 경우에서 현미경 없이 절단된 재료의 두 개의 모든 분취가 추출되었다. 시료는 무작위로 선정하고 3 배치(batch) 이후에서 추출하였다.
그 후의 추출 시료 농도는 Nanodrop 100 분광광도계를 이용하여 결정하였다. cDNA 증폭을 위한 적절한 RNA 농도를 수득하기 위해 5개 시료에 대해 진공 농축이 필요하였다.
본래의 1차 추출물 또는 2차 재추출물이든 모든 36개 RNA 시료는 NUGEN V3 FFPE Amplification 키트를 이용한 증폭에 앞서 진공 농축하였다. Ovation® FFPE WTA System을 이용하여 46개 시료를 프로파일링 하였다. 이후 분광광도계 및 Agilent 2100 Bioanalyzer를 이용한, 생성된 cDNA의 질관리를 하였고, 상기 시료들을 단편화하고 NuGEN Encore biotin module을 이용하여 라벨링하였다. 이후 단편화 QC를 하고, 상기 단편화 및 라벨링된 산물을 Affymetrix GeneChip® array 상에서의 혼성화 방법에 대한 NuGEN 지침에 따라 이후 Xcel 어레이에 혼성화시켰다.
어레이 QC
데이터의 질관리(QC) 평가를 프로파일링하는 마이크로어레이가 수행되었다. 시료 및 어레이 질은 Almac의 고유의 도구를 이용하여 평가하였다. 46개 시료 중 하나는 마이크로어레이 QC에 실패하였다. 이 시료는 이미지 분석, 신호 표시, 환산 계수(scaling factor) 및 분산에 실패하였다. 그러므로 이후의 분석에서 45개 시료만 사용되었다.
데이터 준비
시료는 RMA 설정(배경 보정; 평균의 중앙값을 이용한 분위수 표준화(quantile normalisation); 중앙값 수정 요약(median polish summarisation))의 Almac의 사전 처리 도구를 이용하여 사전 처리하였다. DDRD 유전자를 나타내는 프로브 세트의 교차 매핑(cross mapping)이 분석을 위한 적절한 프로브 세트를 추출하기 위해 이용되었다.
분류자 점수 계산
분류자의 유전자들을 매핑하는 프로브 세트를, 안티-센스 프로브 세트를 제외하고(가능하다면), 결정하였다. 분류자의 각각의 유전자들에 관계있는 모든 프로브 세트에 대한 감소된 유전자 강도 매트릭스를 초래하는 중앙 강도(median intensity)를 계산하였다. 특정 어레이 플랫폼 상에 유전자에 대한 프로브 세트가 존재하지 않는 경우, 트레이닝 데이터로부터 관찰된 평균은 보충원(replacement)으로서 이용되었다. 각각의 시료에 대한 모든 프로브 세트의 상기 중앙 값이 계산되고, 감소된 유전자 강도 매트릭스로부터 차감되었다.
시료의 분류자 점수는 시그니쳐 내 유전자 발현의 가중치 합으로서 계산하였다.
Figure pct00022
상기 w i 는 각각의 유전자에 대한 가중치이고, b i 는 트레이닝 데이터(표 4)에 대해 상대적인 각각의 유전자의 중앙을 정하기 위해 요구되는 유전자-특이 편향이고, a median 은 어레이 상의 모든 프로브 세트에 걸친 중앙 발현 강도이고, ge i 는 사전-처리 후 관찰되는 유전자 발현 수준이고, 및 k=0.3738은 오프셋 상수이다.
상기 분류자 점수는 각각의 시료에 대해 계산되었고, 이는 이후, 예를 들면 더 반응성일 가능성으로부터 덜 반응성일 가능성으로, 환자를 계층화하는데 이용될 수 있다.
결과
표 5. 재발 없는 생존의 다변수 분석(43 시료, 20 미발생 및 23 발생)
Figure pct00023
Cox 비례 위험 회귀(Cox proportional hazards regression)를 이용한 결과, 재발 없는 생존에 대한 DDRD 분석의 통계적으로 유의한 효과가 있다. 상기 효과는 다른 주요 위험 인자가 상기 모델에 포함되었을 때 통계적으로 유의하다(위험율 0.07, 95% CI(0.007, 0.643), p=0.019). 상기 모델에 포함된 공변량(Covariates)은 임상 전문의가 지시하였다.
표 6. 전체 생존의 다변수 분석(43 시료, 17 미발생 및 26 발생)
Figure pct00024
Cox 비례 위험 회귀(Cox proportional hazards regression)를 이용한 결과, 전체 생존에 대한 DDRD 분석의 통계적으로 유의한 효과가 있다. 상기 효과는 다른 주요 위험 인자가 상기 모델에 포함되었을 때 통계적으로 유의하다(위험율 0.11, 95% CI(0.014, 0.885), p=0.038). 상기 모델에 포함된 공변량은 임상 전문의가 지시하였다.
결론
DDRD 분석이, 다른 주요한 공변량을 조정한 후, 식도암에서 재발 없는 생존(p=0.019) 및 전체 생존(p=0.038)의 유효한 예측자임을 증명하는 증거가 제시되었다.
실시예 2
배경
식도암은 전세계에서 8번째로 흔한 암이고, 매년 480,000건이 진단된다. UK에서는 남성의 상기 질병 발병률이 지난 45년간 68% 증가하였고 그 중 가장 일반적인 병리학적 아형은 선암이다. 식도 선암(OAC)의 이러한 증가의 원인은 불분명하지만, 이러한 종양의 발달은 전암성 화생성 조건(pre-malignant metaplastic condition)인, 바렛 식도(Barrett's oesophagus)와 강하게 연관성이 있다. 이는 비만과 함께 위-식도 역류 질환, 흡연 및 알콜 섭취에 의해 초래되고, OAC의 가장 강력한 위험 인자 중 하나이다. 바렛 식도를 스크리닝하기 위한 노력 및 수술 전 잠재적인 치유 수술로부터 이득을 받을 가능성이 큰 OAC 환자를 선별하려는 노력에도 불구하고, 생존율은 낮게 남아있다. 5년 생존률은 13%이며 심지어 초기 국소적 한정된 질병에서도 이러한 수치는 40%를 거의 넘기지 못한다. 전체 생존에서의 유의한 향상이 선행보조적 또는 수술전후의 치료에서 증명되었으나, 개별적 환자를 위한 최적의 접근 방식은 불분명하게 남아있다. 반응성을 예측할 수 있고, 임상의가 가장 이득이될 선행보조적 치료로 환자를 계층화할 수 있게 하는 바이오마커를 확인하기 위한 긴급한 요구가 있다.
식도 선암 - 환자 코호트
OAC에서 가장 활성인 약물 중 하나가 DNA-손상 제제 시스플라틴인 것을 고려하여 본 발명자들은 OAC에서 DDRD 시그니쳐의 효능을 조사하기로 결정하였다. 본 발명자들은 북 아일랜드 암 센터에서 시스플라틴-기반 선행보조적 화합치료법으로 치료받고, 이후 2004년 및 2010년 사이에 절제 수술을 받은 초기 OAC 환자로부터의 63개의 포르팔린 고정 파라핀 포매(FFPE) 사전-처리 내시경 생검 표본을 분석하였다(표 7 및 8).
본 실시예에서 사용된 63개 시료는 실시예 1의 45 시료를 포함한다. 본 발명자들은 추가적인 적은 양의 세트를 프로파일링하고, 본 분석을 위해 두 시료 세트를 함께 통합하였다. 따라서, 실시예 1에 기재된 방법들은 본 실시예에 적용 가능하다.
현미경 사용 없는 절단을 위한 표시에 앞서 병리학적 아형에 대하여 생검을 조사하였고 적어도 70% 선암 조직을 포함하는 시료는 앞쪽으로 두었다(be to be taken forward). 매치되는 절제 표본은 Mandard 점수(<3=병리학적 반응)에 따라 점수를 매겼다. 63개 FFPE 생검 표본 중 62개로부터 충분한 RNA를 추출하였고(98.4%), 보관된 FFPE 조직에 최적화된 cDNA 마이크로어레이-기반 기술인 XcelTM 어레이(Almac/Affymetrix)에 혼성화시켰다. 모든 시료는 DDRD 분석을 위해 점수를 매겼다.
표 7 - 환자 특성
Figure pct00025
표 8 - 종양 특성
Figure pct00026
DDRD 점수 및 예후 사이의 연관성은 Kaplan-Meier 분석 및 Cox 비례 위험 회귀로 평가하였다. 총 13개 시료(21%)가 DDRD 양성으로, 남은 49개 시료(79%)는 DDRD 음성으로 특징화되었다. DDRD 분석 양성은 통계적으로 유의한 재발 없는 생존(RFS)(HR 0.33; 95% CI 0.13-0.87; p=0.024)과의 관계를 증명하였고, DDRD+ve 환자에 대해 65.2개월 vs DDRD-ve 환자에 대해 33.9개월의 중앙 RFS의 결과를 내었다(도 1). 이후의 다중 변수 분석에서 DDRD 분석의 RFS에 대한 효과는 다른 주요한 위험 인자가 상기 모델에 포함될 때 통계적으로 유의한 것으로 남았다(HR 0.31, 95%CI (0.110, 0.877), p=0.027)(표 9). 전체 생존(OS) 중앙 값은 DDRD+ve 환자에서 유의하게 높았다(94.3개월 vs 32.2개월; HR 0.32; 95% CI 0.12-0.82; p=0.017)(도 2). 이후의 다중 변수 분석에서 OS에 대한 DDRD 분석의 효과는 다른 주요 위험 인자가 상기 모델에 포함될 때 통계적으로 유의한 것으로 남았다(HR 0.36, 95%CI (0.132, 0.953), p=0.040). 이러한 결과는 DDRD 분석이 초기 단계의 식도 선암에 대한 선행보조적 화합치료법의 환경에서 강력한 예후적 마커임을 나타낸다.
표 9. 재발 없는 생존에 대한 DDRD 분석의 예측 값의 다변수 분석
Figure pct00027
표 10. 전체 생존에 대한 DDRD 분석의 예측 값의 다변수 분석
Figure pct00028
OAC -화학치료법의 경험이 없는(naive) 경우에서의 DDRD
DDRD 분석이 치료와는 독립적으로 예후적인지 여부를 결정하기 위해, 이를 식도 및 위-식도 접합부 종양에 대한 잠재적으로 치료 절제술로부터 유래한 75개의 신선한 동결 조직 시료의 데이터 세트에 적용하였다. 이러한 절제술은 1992년 내지 2000년에 수행되었고, 모든 환자는 선행보조적 화학치료법을 받지 않았다. 모든 시료는 주문 제작한 Agilent 44K 60-mer 올리고-마이크로어레이를 이용하여 분석하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 생존자에서 DDRD 양성 및 음성군 사이에 차이점이 나타나지 않았다(HR 0.64, 95%CI 0.17-2.43). 데이터 세트 사이의 일관된 분석 플랫폼을 제공하기 위한 추가적인 Affymetrix-기반 유효성 검증 세트를 모색하고 있다.
결론
·DDRD 분석은 치료 접근방식을 개인화하고 초기 EAC 환자의 결과를 향상시킬 수 있다.
·EAC의 FFPE 조직으로부터 최초의 어레이-기반 바이오마커가 개발되어야 한다.
·사전-처리 FFPE 내시경 생검의 98%에 대해서 전사적 프로파일링이 성공적이다.
·DDRD 분석은 예후와의 강력한 연관성을 증명하였다.
·양성 DDRD 분석 결과는 음성 분석군과 비교하여 증가된 RFS(HR 0.31, 95%CI (0.11-0.88), p=0.027) 및 OS(HR 0.36, 95%CI (0.13-0.95), p=0.04)를 예측한다.
·DDRD 양성 환자는, DDRD 음성 환자의 17%와 비교하여, 59%의 5년 생존률을 가진다.
·이러한 유효성 검증 세트의 확장이 본 분석의 통계적 능력을 증가시키기 위해 진행 중이다.
·초기 EAC에서 DDRD 분석의 역할은 전향적 임상 시험에서 평가될 것이다.
본 발명의 다양한 구체예들은 본 명세서에 기재된 특정 구체예에 의한 범위에 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서에 기재된 것 이외에도 본 발명의 다양한 구체예의 다양한 변형이 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백하게 될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함된다. 더욱이, 본 명세서에 기재된 모든 구체예들은, 적절하게, 넓게 적용될 수 있고 임의 및 모든 다른 일관된 실시예들과 결합할 수 있는 것으로 간주된다.
본 명세서에는, 개시 내용의 전체가 본 명세서에 참조로서 통합되는 다양한 공개 문헌들이 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> Almac Diagnostics Limited <120> Molecular diagnostic test for oesophageal cancer <130> P128543WO00 <150> GB1316027.0 <151> 2013-09-09 <160> 230 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 541 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gggaccaagg tggagatcaa acgtaagtgc actttcctaa tgctttttct tataaggttt 60 taaatttgga gcctttttgt gtttgagata ttagctcagg tcaattccaa agagtaccag 120 attctttcaa aaagtcagat gagtaaggga tagaaaagta gttcatctta aggaacagcc 180 aagcgctagc cagttaagtg aggcatctca attgcaagat tttctctgca tcggtcaggt 240 tagtgatatt aacagcgaaa agagattttt gtttagggga aagtaattaa gttaacactg 300 tggatcacct tcggccaagg gacacgactg gagattaaac gtaagtaatt tttcactatt 360 gtcttctgaa atttgggtct gatggccagt attgactttt agaggcttaa ataggagttt 420 ggtaaagatt ggtaaatgag ggcatttaag atttgccatg ggttgcaaaa gttaaactca 480 gcttcaaaaa tggatttgga gaaaaaaaga ttaaattgct ctaaactgaa tgacacaaag 540 t 541 <210> 2 <211> 600 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tttattggtc ttcagatgtg gctgcaaaca cttgagactg aactaagctt 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catatattga ggaaaaataa agcgattggt ttttcttaag gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 <210> 27 <211> 600 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 cagaaaggcc cgcccctccc cagacctcga gttcagccaa aacctcccca tggggcagca 60 gaaaactcat tgtccccttc ctctaattaa aaaagataga aactgtcttt ttcaataaaa 120 agcactgtgg atttctgccc tcctgatgtg catatccgta cttccatgag gtgttttctg 180 tgtgcagaac attgtcacct cctgaggctg tgggccacag ccacctctgc atcttcgaac 240 tcagccatgt ggtcaacatc tggagttttt ggtctcctca gagagctcca tcacaccagt 300 aaggagaagc aatataagtg tgattgcaag aatggtagag gaccgagcac agaaatctta 360 gagatttctt gtcccctctc aggtcatgtg tagatgcgat aaatcaagtg attggtgtgc 420 ctgggtctca ctacaagcag cctatctgct taagagactc tggagtttct tatgtgccct 480 ggtggacact tgcccaccat cctgtgagta aaagtgaaat aaaagctttg actagaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 <210> 28 <211> 600 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (302)..(302) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (570)..(570) <223> n is a, 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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 <210> 36 <211> 600 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 tccccagaca ccgccacatg gcttcctcct gcgtgcatgt gcgcacacac acacacacac 60 gcacacacac acacacacac tcactgcgga gaaccttgtg cctggctcag agccagtctt 120 tttggtgagg gtaaccccaa acctccaaaa ctcctgcccc tgttctcttc cactctcctt 180 gctacccaga aatcatctaa atacctgccc tgacatgcac acctcccctg ccccaccagc 240 ccactggcca tctccacccg gagctgctgt gtcctctgga tctgctcgtc attttccttc 300 ccttctccat ctctctggcc ctctacccct gatctgacat ccccactcac gaatattatg 360 cccagtttct gcctctgagg gaaagcccag aaaaggacag aaacgaagta gaaaggggcc 420 cagtcctggc ctggcttctc ctttggaagt gaggcattgc acggggagac gtacgtatca 480 gcggcccctt gactctgggg actccgggtt tgagatggac acactggtgt ggattaacct 540 gccagggaga cagagctcac aataaaaatg gctcagatgc cacttcaaag aaaaaaaaaa 600 <210> 37 <211> 420 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 gggcggttct ccaagcaccc agcatcctgc tagacgcgcc gcgcaccgac ggaggggaca 60 tgggcagagc aatggtggcc aggctcgggc tggggctgct gctgctggca ctgctcctac 120 ccacgcagat ttattccagt 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300 cttcaaagga acaggtcctg atagctcttg ttatatgcaa agtggaaagg taacgtgact 360 gttctctgca tttcctgcct ttcaattgag tgaagacaga cagatgattt attgggcatt 420 tcctagcctc cccttcacca taggaaacca gactgaaaaa aaggtgcaaa ttttaaaaag 480 atgtgtgagt atcttgaggg ggctggggga gaattcctgt gtaccactaa agcaaaaaaa 540 gaaaactctc taacagcagg acctctgatc tggaggcata ttgaccataa atttacgcca 600 <210> 48 <211> 491 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 tttttctgag caacatcatt ccccccattt tcaaccacca tccctccctg gtactaaagg 60 gaatgctgca aggaggaaaa gaagggagaa gggaagcaga ggtggtggag aaggatctga 120 aatgctactt cctgcacgct ttttttcttc ttggaggtgg aaggagtgga ggatgatgat 180 gaaaattcaa gcagcatgta ctagacggca gagcagcatg agctacatcc acactgtgca 240 aagtccttaa tgtgcacacc tagaggagca agggccctgt tctcagttaa cagttgtcaa 300 gagacaaaga caggttgtcc tgctgggtta actggcaagg aaagttttag ggactatgat 360 ggctctctat tctccacata atgcagactg taaacagact aaatcagggc tgccttctct 420 tccaatagaa agtagcaacg atagttaggc atggtggttc acaccttgta accctagcac 480 ttcgtgggca g 491 <210> 49 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DNA <213> Homo sapiens <400> 63 acactaacat ttccagtagt cacatgtgat tgttttgttt tcgtagaaga atactgcttc 60 tattttgaaa aaagagtttt ttttctttct atggggttgc agggatggtg tacaacaggt 120 cctagcatgt atagctgcat agatttcttc acctgatctt tgtgtggaag atcagaatga 180 atgcagttgt gtgtctatat tttcccctct caaaatcttt tagaattttt ttggaggtgt 240 ttgttttctc cagaataaag gtattacttc tcgtgcc 277 <210> 64 <211> 251 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 agtttcaacc cctcagaatc cagcaatttc caaacatcct cctccaccac ctggtcatgg 60 ttcccaggca cctagtcatc gtcccccgcc tcctggacac cgtgttcagc accagcctca 120 gaagaggcct cctgctccgt cgggcacaca agttcaccag cagaaaggcc cgcccctccc 180 cagacctcga gttcagccaa aacctcccca tggggcagca gaaaactcat tgtccccttc 240 ctctaattaa a 251 <210> 65 <211> 274 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 ccatgtggtc aacatttgga gtttttggtc tcctcagaga gctccatcac accagtaagg 60 agaagcaata taagtgtgat tgcaagaatg gtagaggacc gagcacagaa atcttagaga 120 tttcttgtcc cctctcaggt catgtgtaga tgcgataaat caagtgattg gtgtgcctgg 180 gtctcactac aagcagccta 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62 <210> 79 <211> 264 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 attttcacta caaccctgta aggaggcttg agaaagaaga tgacattccc aaaggcacat 60 ttgggcaagc aggaacttgg gcaagtattt taacatcttt aaacctcagt gaattcattt 120 ttttaaaaag aaaaaaattt gttgagcacc gctgtaagcc cagtgctgta ctaggggctg 180 aagacaatgc atcaaacagg tcacacggag acagggttcc tgccccagga aatttaaagt 240 ccagcaggga agatggacat tcat 264 <210> 80 <211> 289 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 tcctaatctg tgtgtgccct gtaacctgac tggttaacag cagtcctttg taaacagtgt 60 tttaaactct cctagtcaat atccacccca tccaatttat caaggaagaa atggttcaga 120 aaatattttc agcctacagt tatgttcagt cacacacaca tacaaaatgt tccttttgct 180 tttaaagtaa tttttgactc ccagatcagt cagagcccct acagcattgt taagaaagta 240 tttgattttt gtctcaatga aaataaaact atattcattt ccactctca 289 <210> 81 <211> 56 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 gccatgttgg tactagttat taatcatatc taaccaactg taggtgttct ttcctg 56 <210> 82 <211> 274 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 atatggtacg ttttaacctt gaaagttttg caatgatgaa agcagtattt gtacaaatga 60 aaagcagaat tctcttttat atggtttata ctgttgatca gaaatgttga ttgtgcattg 120 agtattaaaa aattagatgt atattattca ttgttcttta ctcatgagta ccttataata 180 ataataatgt attctttgtt aacaatgcca tgttggtact agttattaat catatctaac 240 caactgtagg tgttctttcc tgataacttt ttta 274 <210> 83 <211> 101 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 ccaactggca caattcaatt cctactgtac ccatcatgca cagatggctg aagtattgag 60 aacgctccag tgaccgggag gcaatagtct gtctctctgt c 101 <210> 84 <211> 261 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 ttcttctctg ctgagcctgc aggcccgtcc tgcctgcctg gggtgcccgg gagacgcggg 60 cctgctccgg agactgctga ctgccggtcc tgttagtcag gtgtcagccc tgtctctgcc 120 gaagagactc ttctctttat tttaaattaa accctcagag caccaccaaa gcatcacttt 180 tctccctcca ttggtgttct cattctttga tgttacttgt ttgaacacca ctattagtag 240 ttggagattt gttcctgaga a 261 <210> 85 <211> 277 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 aagtcatttt tcagggtcct tcaggaagtc atccagagtt ataatggccc attatttaat 60 ggtcagagtt tacttaggct ttcactactt ccactgccca cttgaaacag ggaaaaatat 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Homo sapiens <400> 121 ggctgaggtt gggtttgtca tcacagaggg ggtgggcctg gaaagggtcc ttcccaagct 60 gccccggctc cggcggcccg ggccggcagc ctctgccagc cagcgtcctc acggcctccc 120 cctcgcctgt ttctt 135 <210> 122 <211> 107 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 122 agcaagtgta gacaccttcg agggcagaga tcgggagatt taagatgtta cagcatattt 60 ttttttcttg ttttacagta ttcaattttg tgttgattca gctaaat 107 <210> 123 <211> 247 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 ggctgaggtt gggtttgtca tcacagaggg ggtgggcctg gaaagggtcc ttcccaagct 60 gccccggctc cggcggcccg ggccggcagc ctctgccagc cagcgtcctc acggcctccc 120 cctcgcctgt ttcttttgaa agcaagtgta gacaccttcg agggcagaga tcgggagatt 180 taagatgtta cagcatattt ttttttcttg ttttacagta ttcaattttg tgttgattca 240 gctaaat 247 <210> 124 <211> 67 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 acgcctgtgt ccccgcgttc tgagaagtcc tctgtcttcg tgtcactagg tccagaaagt 60 cgcgccg 67 <210> 125 <211> 142 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 cagggccgag gaataagcga caattctggt ttttctcccc tggccgtcgt tcgccagcct 60 ccttcatttt cctgagttcc cgctgaagta tatactacct atgagtccaa ttaacatgag 120 tattatgcta gttctatcct ac 142 <210> 126 <211> 279 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 126 ctttcgccac tcacggacct tgaggccagt tgacggccct tctccccacg cctgtgtccc 60 cgcgttctga gaagtcctct gtcttcgtgt cactaggtcc agaaagtcgc gccgggcaga 120 ggcgcaggcg gggccggcag ggccgaggaa taagcgacaa ttctggtttt tctcccctgg 180 ccgtcgttcg ccagcctcct tcattttcct gagttcccgc tgaagtatat actacctatg 240 agtccaatta acatgagtat tatgctagtt ctatcctac 279 <210> 127 <211> 263 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 127 ccatgggaga actggatgtt caccaggggt cagcattggc cttgaagtgt ggagaagggt 60 catcttggca gaggtggcaa ggtggtgagc ccctggggct gagcacaggt gcgtctggtg 120 agaggggcct ggccatgacc gcagtgactg ctcttcactg tcacctcctt tgctcctcag 180 gccacctgcg cagagggtgt gatccttgca tgactttgcc attgaggaaa tgcaagggta 240 gaaagtgcag tctcgtcggc cgc 263 <210> 128 <211> 252 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 128 gggtcagaag gttagcctgc aggtgtggga tcacagaggt gtcctagtga tggagcttgt 60 atgctctatg ggttaaaaac 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agatgacaca 120 aaagttctct gcagaaatga agaagggaaa tatggttatg tccttcggag ttacctagcg 180 gacaatgatg gagagatcta tgatgatatt gctgatggct gcatctatga caatgact 238 <210> 137 <211> 260 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 137 ttcaacacag ctgtggtctt cctctgaata ttagcagaag tttcttattc aaaggcctcc 60 tcccagaaga agtcagtggg aagagatggc caggggagga agtgggttta ttttctgttg 120 ctattgatag tcattgtatt actagaaatg aactgttgat gaatagaata tattcaggac 180 aatttggtca attccaatgc aagtacggaa actgagttgt cccaaattga tgtgacagtc 240 aggctgtttc atcttttttg 260 <210> 138 <211> 177 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 138 gacttgcatt gcagtctgac agtaattttt tttctgattg agaattatgt aaattcaata 60 caatgtcagt ttttaaaagt caaagttaga tcaagagaat atttcagagt tttggtttac 120 acatcaagaa acagacacac atacctagga aagatttaca caatagataa tcatctt 177 <210> 139 <211> 114 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 attttttcaa actttcatat agagttataa gattatgatg ctggtatctg gtaaaatgta 60 catcccagta gtccaatagt ttaaatgttt attgcttcct ttaagagatt ataa 114 <210> 140 <211> 153 <212> 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taattatgtg taattatact agaagttttg taatctgtat cttatca 167 <210> 144 <211> 234 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 144 taatcttctc tattgtatac ttgatttgtc cattaatatt tctgtccatt atttcttgct 60 tttattttta ttgttgattt ctttctactt actttgagtt taattggtat tttttctgac 120 tttttgaagt gaaagtctat ataattaatt ttcagccttt ctccatttct aatacatatg 180 tttaaactta tatgattttt gtaacatttt atcttcattg tataagtttt aaca 234 <210> 145 <211> 263 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 gttttggttt tgttaatctt ctctattgta tacttgattt gtccattaat atttctgtcc 60 attatttctt gcttttattt ttattgttga tttctttcta cttactttga gtttaattgg 120 tattttttct gactttttga agtgaaagtc tatataatta attttcagcc tttctccatt 180 tctaatacat atgtttaaac ttatatgatt tttgtaacat tttatcttca ttgtataagt 240 tttaacaagt atcttttgtc att 263 <210> 146 <211> 70 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 ataaagaagg aagagtgttt catttatatc tgaatgaaaa tatgaatgac tctaagtaat 60 tgaattaatt 70 <210> 147 <211> 240 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 147 ctagccaggg agaaagagtg agatcctggc tcaaaaaaac 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ctttatttta gaggaaaagc tgtcagtttt tcactgctga 60 atatgatgtt aactatgaac tttttataca tgtatttact atgttgaggt aatttccttt 120 tactcctggt ttaagtgttt tttgtttttt tttgtttttt ttttttttta aatcatggaa 180 ggacttgggt tttatcaaat gtcttttctg tatctattga gatgaccaat ttgtattagt 240 cagcgttctt ca 252 <210> 151 <211> 272 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151 tcctctcatc tgcatttctc agaaatgccc tccctgccca gtggtgactt tccctcgtca 60 ctcctatgga gttctacctg gagcccagcc atgtgtggaa ctgtgaagtt tactcctctg 120 taaagatggt ttaaagaaag tcagcttctg aaatgtaaca atgctaaccc ttgctggaac 180 cctgtaagaa atagccctgc tgatagtttt ctaggtttat catgtttgat ttttacactg 240 aaaaataaaa aaatcctggt atgtttgaaa tt 272 <210> 152 <211> 213 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 152 accatcgcac ttgagccagt cgattccatc ccatatctca tatgaagact ttaaaaagga 60 gaatttctag ccctcaacac cttgtaagga ctttagtttc tggctctttt ttcaaaggag 120 attatattca aaaggaatac taaaaaatta gccaggcata atggcaaaca ctggtagtcc 180 cagctatttt gaaggctgag gtgacaggct cac 213 <210> 153 <211> 213 <212> DNA <213> 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agttgtggga gacaagatca cagctatgag 60 cacctcgcac ggtgtccagg atgcacagca caatccatga tgcgttttct ccccttacgc 120 actttgaaac ccatgctaga aaagtgaata catctgactg tgctccactc caacctccag 180 cctggatgtc cctgtctggg ccctttttct gttttttatt ctatgttcag caccactggc 240 accaaa 246 <210> 162 <211> 185 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 162 gaggaccggc tgcagacctc actctgagtg gcaggcagag aaccaaagct gcttcgctgc 60 tctccaggga gaccctcctg ggatgggcct gagaggccgg ggctcaggga aggggctggg 120 atcggaactt cctgctcttg tttctggaca actttcccct tctgctttaa aggttgtcga 180 ttatt 185 <210> 163 <211> 234 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 163 ggcctcacac aaggagtgtt tggcttacag tgaattgtcc ggggggtttt gcccacctcc 60 tcctcatctc cgtattcttc agcttcatcc aaaactgact tagaagcctc ccttgaccct 120 cacctgacta ttcacaggtt atagcacttt atgtttttca gttctgttat tttaattggt 180 gcctctgttt gtgatcttta agaacataaa attctggcaa gtaactattt gcta 234 <210> 164 <211> 223 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 164 aagattcctg tgtactggtt tacatttgtg tgagtggcat actcaagtct gctgtgcctg 60 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taatgaatga ctagcccaat 180 tatccttata aattgaatat ggtgaccaaa tgctttgata tcatactact ctgcctttgt 240 gggcacatat gtagacacta cta 263 <210> 196 <211> 81 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 196 cactaagttc caattttgtt gctgaattgc ttctgtgagt tcacttttca gttctaagga 60 agaataatat ttgctacata t 81 <210> 197 <211> 204 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 197 atttgctaca tatttcacag gggttcttat gaaggtaaat ttaccagatt aataaaaatt 60 tatgaatatt aaaattatca ttaataatat aaaacactta tttgagatta aattaaattt 120 ttcatgagcc cctctttggc aggaactctg tttaattctt tgtatttatc ccagcttctt 180 aaatggtggc tgtaacataa taaa 204 <210> 198 <211> 195 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 198 taatcctcaa atatactgta ccattttaga tattttttaa acagattaat ttggagaagt 60 tttattcatt acctaattct gtggcaaaaa tggtgcctct gatgttgtga tatagtattg 120 tcagtgtgta catatataaa acctgtgtaa acctctgtcc ttatgaacca taacaaatgt 180 agctttttaa agtcc 195 <210> 199 <211> 206 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 199 taatcctcaa atatactgta ccattttaga tattttttaa acagattaat ttggagaagt 60 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DNA <213> Homo sapiens <400> 205 tctttaaatt agaggatgct gtgccattga gtactttaag ttaatatgag gttctggttc 60 aaggaaaact tacgttggat ctgaaccaat gagcagatat tttgatatgt gccactcttg 120 catatacatc tcagtcctaa ctaaagattc tagtggcatc caggaccttt agggaggcat 180 <210> 206 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 206 tctttaaatt agaggatgct gtgccattga gtactttaag ttaatatgag gttctggttc 60 aaggaaaact tacgttggat ctgaaccaat gagcagatat tttgatatgt gccactcttg 120 catatacatc tcagtcctaa ctaaagattc tagtggcatc caggaccttt agggaggcat 180 <210> 207 <211> 294 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 207 ctagatttgc cagggaacca gaatttatgg atgaactgat tgcttatatt ttagtcaggg 60 tttataaatg tagatggtca aatttacatt gcctagtgat ggaaaattca actttttttg 120 attttttttt ccaatattaa aaaaggctct gtatgcatgg tggggctatg taagtactct 180 ttaaaactat ggccctatta atcttacaag tgttacttat gggtcaagca atgtaaactg 240 tataaatgta aaaacaaccc ctccacacac ataacccctg gaatatatgg taaa 294 <210> 208 <211> 154 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 208 cactgcgtct ggcaataatg 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Claims (31)

  1. DNA-손상 치료제로 치료하기 위해 식도 선암(OAC)을 갖는 개체의 반응성을 예측하는 방법으로서,
    a. 개체로부터 얻은 검사 시료 내 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 바이오마커는 표 2B, 1A, 1B, 2A, 3 및/또는 4에 열거된 것들로부터 선택된 것인 단계;
    b. 상기 발현 수준을 포착하는(capture) 검사 점수를 유도하는 단계;
    c. 상기 검사 점수 및 반응성을 연관시키는 정보를 포함하는 임계 점수를 제공하는 단계; 및
    d. 상기 검사 점수를 상기 임계 점수와 비교하는 단계를 포함하고; 상기 반응성은 상기 검사 점수가 상기 임계 점수를 초과할 때 예측되고, 및/또는 상기 반응성의 결여는 상기 검사 점수가 상기 임계 점수를 초과하지 않을 때 예측되는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커는 CXCL10, MX1, IDO1, IF144L, CD2, GBP5, PRAME, ITGAL, LRP4, 및 APOL3으로 이루어진 군으로부터 선택된 것 및/또는 CDR1, FYB, TSPAN7, RAC2, KLHDC7B, GRB14, AC138128.1, KIF26A, CD274, CD109, ETV7, MFAP5, OLFM4, PI15, FOSB, FAM19A5, NLRC5, PRICKLE1, EGR1, CLDN10, ADAMTS4, SP140L, ANXA1, RSAD2, ESR1, IKZF3, OR2l1P, EGFR, NAT1, LATS2, CYP2B6, PTPRC, PPP1R1A, 및 AL137218.1으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 바이오마커 모두의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 발현 수준은 표 1A(서열번호 1-24), 1B(서열번호 25-50) 및/또는 3(서열번호 51-230)에 기재된 표적 서열 중 하나 이상에 결합하는 프라이머 및/또는 프로브를 이용하여 측정하는 것인 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 OAC는 초기 단계, 후기 단계 또는 전이성 질병인 것인 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 DNA-손상 치료제는 DNA 손상 제제, DNA 수선 표적 치료제, DNA 손상 신호 전달(signalling)의 저해제, DNA 손상 유발 세포 주기 정지의 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 열 충격 단백질 저해제 및 DNA 합성의 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 DNA-손상 치료제는 백금-함유 제제, 겜시타빈 또는 5-플루오로우라실과 같은 뉴클레오시드 유사체 또는 카페시타빈과 같은 이들의 전구약물, 에피루비신 또는 독소루비신과 같은 안트라시클린, 시클로포스파미드와 같은 알킬화 제제, 이온화 방사선 또는 방사선 및 화학치료의 조합(화학방사선법) 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 DNA-손상 치료제는 백금-함유 제제를 포함하는 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 백금 기반 제제는 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴으로부터 선택된 것인 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 DNA-손상 치료제와 함께 추가적인 치료법으로 치료하는 것에 대한 반응성을 예측하는 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 추가적인 치료법은 체세포 분열 저해제인 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 체세포 분열 저해제는 빈카 알칼로이드 또는 탁산인 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 빈카 알칼로이드는 비노렐빈인 것인 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 탁산은 파클리탁셀 또는 도세탁셀인 것인 방법.
  15. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 DNA-손상 치료제를 포함하는 조합 치료법에 대한 반응성을 예측하는 것으로서, 상기 조합 치료법은 하기로부터 선택된 것인 방법:
    a. 시스플라틴/카르보플라틴 및 5-플루오로우라실
    b. 시스플라틴/카르보플라틴 및 카페시타빈
    c. 에피루비신/독소루비신, 시스플라틴/카르보플라틴 및 플루오로우라실
    d. 에피루비신/독소루비신, 옥살리플라틴 및 카페시타빈
    e. 시스플라틴/카르보플라틴 및 파클리탁셀
    f. 시스플라틴/카르보플라틴 및 이리노테칸
    g. 시스플라틴/카르보플라틴 및 비노렐빈
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 조합 치료법은 파클리탁셀과 같은 탁산, 이리노테칸과 같은 토포이소머라제 저해제, 비노렐빈과 같은 빈카알칼로이드 또는 화학방사선법 중 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료는 선행보조적 치료 및/또는 보조적 치료인 것인 방법.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법에서 반응성이 예측되는 경우, 상기 개체는 DNA-손상 치료제로 치료되는 것인 방법.
  19. 청구항 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법에서 반응성의 결여가 예측되는 경우, 상기 개체는 DNA-손상 치료제로 치료되지 않는 것인 방법.
  20. 청구항 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료는 선행보조적 백금-기반 치료인 것인 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 방법에서 반응성의 결여가 예측되는 경우, 상기 개체는 체세포 분열 저해제로 치료되는 것인 방법.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응성은 전체 생존, 진행 없는 생존 및/또는 질병 없는 생존을 포함 또는 증가된 것인 방법.
  23. (a) 개체에 DNA-손상 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 식도 선암(OAC)을 치료하는 방법으로서, 상기 개체는, 개체로부터 얻은 검사 시료 내 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준으로부터 유도한 검사 점수에 기반하여, DNA-손상 치료제에 대해 반응성인 것으로 예측되는 것이고, 상기 하나 이상의 바이오마커는 표 2B, 1A, 1B, 2A, 3 및/또는 4에 열거된 것들로부터 선택된 것인 방법; 또는
    (b) 식도 선암(OAC)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 DNA-손상 치료제로서, 그 개체는, 개체로부터 얻은 검사 시료 내 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준으로부터 유도한 검사 점수에 기반하여, DNA-손상 치료제에 대해 반응성인 것으로 예측되는 것이고, 상기 하나 이상의 바이오마커는 표 2B, 1A, 1B, 2A, 3 및/또는 4에 열거된 것들로부터 선택된 것인 DNA-손상 치료제.
  24. (a) 개체에 체세포 분열 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 식도 선암(OAC)을 치료하는 방법으로서, 상기 개체는, 개체로부터 얻은 검사 시료 내 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준으로부터 유도한 검사 점수에 기반하여, DNA-손상 치료제에 대해 비-반응성인 것으로 예측되는 것이고, 상기 하나 이상의 바이오마커는 표 2B, 1A, 1B, 2A, 3 및/또는 4에 열거된 것들로부터 선택된 것인 방법; 또는
    (b) 식도 선암(OAC)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 체세포 분열 저해제로서, 그 개체는, 개체로부터 얻은 검사 시료 내 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준으로부터 유도한 검사 점수에 기반하여, DNA-손상 치료제에 대해 비-반응성인 것으로 예측되는 것이고, 상기 하나 이상의 바이오마커는 표 2B, 1A, 1B, 2A, 3 및/또는 4에 열거된 것들로부터 선택된 것인 체세포 분열 저해제.
  25. 청구항 23 또는 24의 방법 또는 용도에서, 상기 검사 점수는 청구항 1 내지 22 중 어느 하나의 방법에 따라 유도된 것인 방법.
  26. 표 3(서열번호 51-230)에 기재된 표적 서열 중 하나 이상과 혼성화 하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 식도 선암(OAC)을 갖는 개체의 DNA-손상 치료제에 의한 치료에 대한 반응성을 예측하기 위한 키트.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 프라이머 또는 프로브는 표 3에 기재된 표적 서열 중 10개 이상과 혼성화하는 것인 키트.
  28. 청구항 26 또는 27에 있어서, DNA-손상 치료제를 더 포함하는 것인 키트.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 DNA-손상 치료제는 특이적으로 OAC의 치료를 위한 투여 제형으로 제공되는 것인 키트.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 치료는 선행보조적 또는 보조적 치료인 것인 키트.
  31. 청구항 26 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 DNA-손상 치료제는 백금-기반 제제를 포함하는 것인 키트.
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