CN115369163A

CN115369163A - Ryr2及其下调剂在治疗转移性结直肠癌中的应用

Info

Publication number: CN115369163A
Application number: CN202110535129.2A
Authority: CN
Inventors: 谢东; 陈天伟; 李晶晶; 夏季
Original assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Priority date: 2021-05-17
Filing date: 2021-05-17
Publication date: 2022-11-22

Abstract

本发明提供了一种RYR2及其下调剂在治疗转移性结直肠癌中的应用。本发明人通过分析结直肠癌转录组数据以及大样本量的分析研究，揭示了RYR2在结直肠癌或其癌转移中高表达且促进结直肠癌或其癌转移的进展，其可以作为抑制结直肠癌或其转移的新型靶点。以其作为靶标，可开发抑制结直肠癌或其转移癌的药物，以及对结直肠癌或其转移癌进行诊断、预后评估等。

Description

RYR2及其下调剂在治疗转移性结直肠癌中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和药物学领域，更具体地，本发明涉及RYR2及其下调剂在治疗转移性结直肠癌中的应用。

背景技术

结直肠癌(ColoRectal Cancer，CRC)是消化道系统最常见的恶性肿瘤。一半的确诊患者会发展为转移性的结直肠癌(metastatic ColoRectal Cancer，mCRC)，这已成为结直肠癌相关死亡的主要原因。基于EGFR信号通路在CRC以及mCRC中的高度激活，EGFR的抗体，Cetuximab和Panitumumab，被认证和传统的化疗方案，包括FOLFOX和FOLFIRI，联合用于mCRC的治疗。然而，携有KRAS激活突变(一般位于第12位和13位密码子)的mCRC患者被排除在EFGR抗体疗法外，导致预后不良。正确的干预和治疗对于这一类mCRC患者来说是非常需要的。而对于KRAS突变患者中转移发生发展机制的认识不足阻碍了相应治疗策略的发展。

钙离子调节了多种生物学事件，包括肿瘤转移。一项早期研究报道，介导了胞外钙离子流入内质网，从而重新充满胞内钙库的STIM/ORAI，对于乳腺癌的转移是非常关键的。大量研究揭示了钙离子在肿瘤进程中的重要作用，其中牵涉到许多分子，包括钙离子通道，钙离子转运子，钙离子结合蛋白等，以及被胞内钙离子水平调控的多种通路。然而，钙离子的变化所引起的细胞表型非常复杂，这与钙离子的激活及作用模式有关。在钙离子相关信号通路激活过程中，胞外刺激汇合于内质网上的钙离子通道。这些通道包括两个家族：inositol triphosphate receptors 1-3(IP3R1-3)和ryanodine receptors 1-3(RyR1-3)。IP3Rs结合胞内的inositol 1,4,5triphosphate(IP3)，从而将钙离子从内质网释放到细胞质中。RYRs多在大脑、心脏和肌肉中表达，感受膜电压的变化。IP3Rs被认为在非可兴奋性细胞通路中发挥作用，而RyRs多在可兴奋性的神经和肌肉细胞中发挥功能。

Andrew R.Marks实验室在2004年的一篇Science文章中，揭示了RyR2的抑制剂JTV519对于心率不齐的保护作用。JTV519(也被称为K201)，是一个1,4-benzothiazepine的衍生物，有着很强的心脏保护功能。多项研究发现JVT519能够通过最小化RyR2的过度磷酸化，以及稳定RyR2和FKBP12.6复合体，在4周慢性右心室起搏的狗中降低肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)的钙离子泄露，并改善心脏的功能。然而，本领域中尚不清楚RYR2的其它方面的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型结直肠癌或其转移相关的药学靶点。

本发明的目的还在于提供一种RYR2及其下调剂在治疗转移性结直肠癌中的应用。

在本发明的第一方面，提供RYR2的应用，用于：作为抑制结直肠癌或其癌转移的靶标；作为对结直肠癌或其癌转移进行诊断或预后的标志物；制备结直肠癌或其癌转移诊断或预后的诊断试剂；或作为筛选抑制结直肠癌或其癌转移的药物的靶标。

在本发明的另一方面，提供RYR2的下调剂的应用，用于制备抑制结直肠癌或其癌转移的组合物。

在一个优选例中，所述的抑制结直肠癌或其癌转移包括：预防、缓解或治疗结直肠癌或其癌转移。

在另一优选方式中，所述结直肠癌为KRAS突变型结直肠癌。

在另一优选方式中，所述RYR2的下调剂包括(但不限于)：下调RYR2活性的物质或下调RYR2的表达、稳定性或减少其有效作用时间的物质。

在另一优选方式中，所述下调剂包括选自(但不限于)：干扰或敲除RYR2的试剂；针对RYR2的化学小分子拮抗剂或抑制剂；特异性与RYR2结合的结合分子(如抗体或配体)；或，干扰RYR2与效应分子(如其下游蛋白或相互作用蛋白)的相互作用的试剂。

在另一优选方式中，所述干扰或敲除RYR2的试剂包括(但不限于)：特异性干扰RYR2的编码基因表达的干扰分子，针对RYR2的CRISPR基因编辑试剂，针对RYR2的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将RYR2进行功能丧失性突变。

在另一优选方式中，所述针对RYR2的化学小分子拮抗剂或抑制剂包括：S107。

在另一优选方式中，所述干扰分子包括shRNA，siRNA，miRNA，反义核酸等，或能形成所述siRNA、shRNA，miRNA，反义核酸等的构建体。

在另一优选方式中，所述的干扰分子为shRNA；较佳地，其靶向序列包括：SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3或其组合(针对人)；或包括：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或其组合(针对鼠)。

在另一优选方式中，用于将sgRNA或干扰分子等下调剂引入细胞内的表达构建物(表达载体)包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的表达载体包括：腺相关病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体。

在另一优选方式中，所述的RYR2选自下组：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；(b)将(a)所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1～20个，1-10个，1-5个，1-3个或1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有(a)或(b)多肽功能的RYR2衍生物，或其活性片段；(c)序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，同源性≥85％(如同源性≥88％，≥90％，≥92％，≥94％，≥96％，≥98％或≥99％)的RYR2衍生物，或其活性片段。

在本发明的另一方面，提供特异性识别或扩增RYR2的试剂的用途，用于制备对结直肠癌或其癌转移进行诊断或预后的诊断试剂或试剂盒；较佳地，所述结肠癌是KRAS突变型结肠癌。

在另一优选方式中，所述的试剂包括(但不限于)：特异性结合RYR2蛋白的结合分子(如抗体或配体)；特异性扩增RYR2基因的引物；特异性识别RYR2基因的探针；或，特异性识别RYR2基因的芯片。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒，包括：RYR2的下调剂；较佳地，所述下调剂为干扰分子，所述的干扰分子为shRNA；较佳地，所述shRNA靶向序列包括：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或其组合(针对人)；或包括：SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6或其组合(针对鼠)。

在另一优选方式中，所述下调剂为针对RYR2的化学小分子拮抗剂或抑制剂，包括：S107(CAS号：927871-76-9)。

在另一优选例中，所述的药物组合物中，还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

在本发明的另一方面，提供一种筛选抑制结直肠癌或其癌转移的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达RYR2；和，(2)检测所述体系中RYR2的表达或活性；若所述候选物质在统计学上下调(显著下调，如下调10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等，或使之不表达或没有活性)RYR2的表达或活性，则该候选物质是降低结直肠癌或其癌转移的潜在物质。

在另一优选方式中，步骤(1)所述体系为结直肠癌细胞(培养物)体系；步骤(2)还包括：检测所述体系中结直肠癌细胞的转移能力；若其转移能力下降(显著下降，如下降10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等)，则该候选物质是降低结直肠癌或其癌转移的潜在物质。

在另一优选方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对RYR2、其片段或变异体、其编码基因或其上下游分子或信号通路设计的调控分子或其构建体(如shRNA，siRNA，基因编辑试剂，表达载体，重组的病毒或非病毒构建体等)，化学小分子(如特异性抑制剂或拮抗剂)，相互作用分子等。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如表达RYR2的细胞或细胞培养物)、亚细胞(培养物)体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于抑制结直肠癌或其癌转移有用的物质。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。

附图说明

图1、RYR2在KRAS突变转移性结直肠癌病人中表达升高并且RYR2高表达病人预后更差；

(A)流程图展示数据筛选逻辑；

(B)散点图展示结直肠癌病人组织中RYR2信使RNA的表达；

(C，D)Kaplan-Meier分析展示生存曲线；

(E)散点图展示RYR2信使RNA的表达。

图2、RYR2敲低或者使用S107抑制RYR2活性显著抑制结直肠癌细胞的迁移能力；

(A)通过Western Blot检测RYR2的敲低效果；

(B，E)线图展示Fluo 4AM相对荧光强度随着时间的变化；

(C，F)典型图片展示Transwell实验的结果；

(D)柱形图展示C中3个视野的细胞量；

(G，H)线形图展示MTT细胞生长实验的结果。

图3、RYR2敲低显著抑制结直肠癌细胞的体内转移能力；

(A)通过Western Blot检测RYR2的敲低效果；

(B)典型图片展示裸鼠体内荧光信号强度；

(C)代表性图片展示裸鼠整个肺脏的外观；

(D)柱状图展示每只小鼠肺部的肿瘤数目。

图4、S107显著抑制结直肠癌细胞体内转移能力；

(A)典型图片展示裸鼠体内荧光信号强度；

(B)代表性图片展示裸鼠整个肺脏的外观；

(C)柱状图展示每只小鼠肺部的肿瘤数目；

(D)HE图片展示裸鼠肺部的形态；

(E)柱状图展示每只小鼠的肿瘤面积。

具体实施方式

本发明人通过分析结直肠癌转录组数据以及大样本量的分析研究，揭示了RYR2(Ryanodine Receptor 2)在结直肠癌或其癌转移中高表达且促进结直肠癌或其癌转移的进展，其可以作为抑制结直肠癌或其转移(较佳地为抑制其转移)的新型靶点。以其作为靶标，可开发抑制(包括缓解或治疗)结直肠癌或其转移癌的药物，以及对结直肠癌或其转移癌进行诊断、预后评估等。

RYR2及其功能

本发明所述RYR2可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的RYR2也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组RYR2，以应用于实验或临床。在应用时，可采用重组的RYR2。所述的RYR2包括全长的RYR2或其生物活性片段。优选的，所述的RYR2的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:1所示的序列基本上相同。根据RYR2的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的RYR2的氨基酸序列也包括在本发明中。RYR2或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。

任何一种RYR2的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，RYR2的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的RYR2的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长RYR2的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长RYR2的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明人深入研究临床数据后，确定了以RYR2作为结直肠癌或其癌转移的研究靶点。围绕这一靶点，本发明人进行了深入的实验论证，所述实验论证包括细胞水平上以及动物水平上的论证，具体包括：

(1)RYR2作为mCRC治疗靶点的发现；

(2)靶向RYR2对CRC细胞迁移能力的影响；

(3)敲低RYR2在体内对CRC细胞转移能力的影响；

(4)S107处理在体内对CRC细胞转移能力的影响。

RYR2下调剂及其应用

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种RYR2或其编码基因的下调剂的用途，用于制备抑制结直肠癌或其癌转移的药物组合物。所述的结直肠癌较佳地为KRAS突变型结直肠癌。

如本文所用，所述的RYR2或其编码基因的下调剂包括了抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂等，这些术语可互换使用。

所述的RYR2或其编码基因的下调剂是指任何可降低RYR2的活性、降低RYR2或其编码基因的稳定性、下调RYR2的表达、减少RYR2有效作用时间、或抑制RYR2基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调RYR2有用的物质，从而可用于抑制结直肠癌或其癌转移。例如，所述的下调剂是：特异性干扰RYR2基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；是特异性与RYR2基因编码的蛋白结合的抗体或配体；等等。

作为本发明的一种优选方式，所述的下调剂是针对RYR2的小分子化合物。本领域技术人员可以采用适于小分子化合物的筛选的方法，来进行这类小分子化合物的筛选。所述的筛选可以依托本领域现有的或将要开发的各种化合物库，或自行建立一些新化合物库。

作为本发明的优选方式，所述的小分子化合物是S107(7-methoxy-4-methyl-3,5-dihydro-2H-1,4-benzothiazepine)。S107的治疗功效最初见于骨骼肌中：S107处理的小鼠骨骼肌中calstabin和RyR1的结合增强，并能改善肌力生成和运动能力。在Duchennemuscular dystrophy小鼠中，S107通过降低致病性的心肌和骨骼肌中的SR钙离子泄露，从而降低心律不齐的发生以及改善肌肉功能。S107能稳定功能缺陷的RyR2突变也拓展了它的治疗应用。RyR2的突变导致它和calstabin2的亲和性降低，而这些突变发现和人及小鼠中的癫痫有关。而用S107处理能防止癫痫的发生。

S107主要用于治疗RyR相关的钙离子通道紊乱的肌肉、心脏和神经性疾等。但是，并尚未被应用于直接抑制肿瘤相关的治疗方案中。本发明首次揭示S107用于结直肠癌的治疗作用。S107的结构式如下：

在本发明中，所述的小分子化合物(如S107)可以是纯净形式存在的化合物，或纯度大于85％(较佳地大于90％，例如大于95％，98％，99％)的化合物。在得知其化学结构的情况下，所述的小分子化合物可通过化学合成的方式获得。本发明还包括化合物的前体，所述的“前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成具有活性的该化合物。

本发明还包括上述S107的异构体、溶剂合物，或它们的药学上可接受的盐，只要它们也具有与S107具有相同或基本相同的功能。所述的“药学上可接受的盐”是指化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。

作为本发明的一种优选方式，所述的下调剂可以是RYR2特异性的干扰RNA分子(如siRNA、shRNA、miRNA等)，本领域人员可以理解到，根据本发明中提供的RYR2序列信息，可以制备获得此类干扰RNA分子。对干扰RNA分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。所述的干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

在一些实施例中，RNAi用于抑制RYR2。RNAi是一种进化上保守的细胞防御机制，用于控制包括人在内的大多数真核生物中外源基因的表达。RNAi通常由双链RNA(dsRNA)触发，并引起单链靶RNA的序列特异性mRNA降解。mRNA降解的介体是小干扰RNA双链体(siRNAs)，通常由长dsRNA在细胞内酶切产生。siRNAs的长度通常约为21个核苷酸(例如21-23个核苷酸)。在将小RNA或RNAi导入细胞后，据信该序列被传递到称为RISC(RNA诱导沉默复合物)的酶复合物。RISC识别目标并用核酸内切酶切割它。值得注意的是，如果较大的RNA序列被传递到细胞，RNA酶III酶(Dicer)会将较长的dsRNA转化为21-23nt的ds-siRNA片段。

在优选的实施例中，利用shRNA技术进行干扰作用。shRNA是一种RNA序列，它可以使一个紧密的发夹旋转，可以用来沉默基因表达通过RNA干扰。shRNA使用导入细胞的载体并利用启动子(如U6)来确保shRNA始终被表达。这种载体通常传递给子细胞，使基因沉默得以遗传。shRNA发夹结构被细胞机制切割成siRNA，然后与RNA诱导沉默复合物(RISC)结合。这种复合物结合并切割与它结合的siRNA相匹配的mRNAs。shRNA由RNA聚合酶III转录。

最为优选地，所述的干扰分子为shRNA；较佳地，其靶向序列包括：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或其组合(针对人)；或包括：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或其组合(针对鼠)。所述的shRNA提供了适当的敲低效果，对机体没有可见毒害，但对于转移性结肠癌的抑制效果尤其理想。

作为可选的实施方式，使用与编码RYR2的一个或多个核酸特异性杂交的反义化合物来调节RYR2表达。寡聚物与其靶核酸的特异性杂交干扰了核酸的正常功能。这种通过与靶核酸特异性杂交的化合物对靶核酸功能的调节通常被称为“反义”。

作为本发明的一种可选的方式，可采用CRISPR/Cas(如Cas9)系统进行靶向的基因编辑，从而在靶向疾病的区域敲除RYR2基因。常见的敲除RYR2基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9 mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的核酸共转到靶向区域或靶向细胞中。在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到细胞内。所述的能形成所述sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，或所述的能形成所述Cas9mRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA及Cas9 mRNA。

作为本发明的一种可选的方式，可采用同源重组的方法，特异性地靶向于RYR2，使之发生表达缺陷或缺失表达。也可应用Cre和loxp方法使动物或细胞的基因组中相关基因选择性的敲除，表达降低或失活。

以上为一些代表性的下调RYR2的方式，应理解，本发明提供了一种全新的靶点，在本领域技术人员了解了本发明的总体方案后，还可以采取本领域已知的其它方法或正在发展的方法来对RYR2进行调控，这些方法也包含在本发明中。

诊断及预后评估相关的应用

本发明中，揭示了对结直肠癌或其癌转移的发生和发展有着重要调控作用的靶标。基于本发明人的这一新发现，可以将RYR2作为抑制结直肠癌或其癌转移、或筛选抑制结直肠癌或其癌转移的药物的靶标(或标志物)：(i)进行肿瘤的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关结直肠癌或其癌转移人群的治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法。比如，可分离出由RYR2的基因表达异常的人群，从而可进行更有针对性的治疗。所述的结直肠癌较佳地为KRAS突变型结直肠癌。

可以通过判断待评估样本中RYR2的表达情况或活性情况，来预测提供该待评估样本的受试者的结直肠癌或其癌转移的预后情况，选择合适的药物实施治疗。通常，可以规定一个RYR2的阈值，当RYR2的表达情况高于所规定的阈值时，考虑采用抑制RYR2的方案进行治疗。所述的阈值对于本领域技术人员而言是易于确定的，例如可以通过将正常人细胞或组织中的RYR2的表达情况与患者细胞或组织中的RYR2的表达情况进行比较后，获得RYR2表达异常的阈值。根据测定参数、测定仪器等的不同，所述的阈值的具体数值可以是不同的。

可采用各种本领域已知的技术来检测RYR2的基因的存在与否以及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。

本发明还提供了用于在分析物中检测RYR2或其编码基因的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增RYR2的引物；或特异性识别RYR2的探针来确定RYR2基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合RYR2编码的蛋白的抗体或配体来确定RYR2的表达情况。

针对RYR2基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与RYR2基因上特定位点发生特异性结合，而不与RYR2基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。

利用特异性结合RYR2的抗体来检测分析物中RYR2表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。

本发明还提供了用于在分析物中检测RYR2基因的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增RYR2基因的引物；特异性识别RYR2基因的探针；或特异性结合RYR2基因编码的蛋白的抗体或配体。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。

药物筛选

在得知了RYR2的高表达或高活性与结直肠癌或其癌转移的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制RYR2或其编码基因的表达或活性的物质。可从所述的物质中找到对于抑制结直肠癌或其癌转移真正有用的药物。

因此，本发明提供一种筛选抑制结直肠癌或其癌转移的潜在物质(候选物质或候选药物)的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达RYR2的体系；和检测所述体系中RYR2的表达或活性；若所述候选物质可抑制RYR2的表达或活性，则表明该候选物质是抑制结直肠癌或其癌转移的潜在物质。所述的表达RYR2的体系较佳的是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达RYR2的细胞；或可以是重组表达RYR2的细胞。此外，也可通过观测RYR2与其上下游蛋白的相互作用情况，来评估所述潜在物质是否是有用的。

结合本发明人的研究结果，作为本发明的筛选方式的优选方式，还可进一步通过分析所述体系中结直肠癌细胞的转移能力；若其转移能力下降，则该候选物质是降低结直肠癌或其癌转移的潜在物质。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到RYR2的表达或活性的改变，还可设置对照组(Control)，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达RYR2的体系。所述的对照组包括但不限于：不加候选物质的空白对照、空质粒对照等。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制结直肠癌或其癌转移真正有用的物质。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的抑制结直肠癌或其癌转移的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制RYR2的表达和活性，进而抑制结直肠癌或其癌转移有用的物质。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的0.0001-10wt％)的所述的RYR2或其编码基因的下调剂，以及药学上可接受的载体。

作为本发明的一种优选方式，提供了一种用于抑制结直肠癌或其癌转移的组合物，所述的组合物含有有效量的RYR2或其编码基因的下调剂，以及药学上可接受的载体。

在本发明的优选方式中，所述的下调剂包括但不限于：敲除或沉默RYR2的试剂，特异性与RYR2结合的结合分子(如抗体或配体)，针对RYR2的化学小分子拮抗剂或抑制剂，等等。在更具体的方式中，所述的下调剂包括但不限于：针对RYR2的CRISPR基因编辑试剂，特异性干扰RYR2的编码基因表达的干扰分子，针对RYR2的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将RYR2进行功能丧失性突变。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

在得知了所述RYR2或其编码基因的下调剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的下调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物或人。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将RYR2的下调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带RYR2的下调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的RYR2下调剂，具体情况需视所述的下调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明所述的RYR2或其编码基因的下调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的RYR2或其编码基因的下调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

本发明的具体实施例中，给出了一些针对动物如鼠的给药方案。从动物如鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据Meeh-Rubner公式来进行计算：Meeh-Rubner公式：A＝k×(W^2/3)/10,000。式中A为体表面积，以m²计算；W为体重，以g计算；K为常数，随动物种类而不同，一般而言，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。应理解的是，根据药物以及临床情形的不同，根据有经验的药师的评估，给药剂量的换算是可以变化的。

本发明还提供了含有所述的药物组合物或直接含有所述的RYR2或其编码基因的下调剂的药盒。此外，所述的药盒中还可包括说明药盒中药物的使用方法的说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、RYR2多肽序列(人源，SEQ ID NO:1；NP_001026.2)

MADGGEGEDEIQFLRTDDEVVLQCTATIHKEQQKLCLAAEGFGNRLCFLESTSNSKNVPPDLSICTFVLEQSLSVRALQEMLANTVEKSEGQVDVEKWKFMMKTAQGGGHRTLLYGHAILLRHSYSGMYLCCLSTSRSSTDKLAFDVGLQEDTTGEACWWTIHPASKQRSEGEKVRVGDDLILVSVSSERYLHLSYGNGSLHVDAAFQQTLWSVAPISSGSEAAQGYLIGGDVLRLLHGHMDECLTVPSGEHGEEQRRTVHYEGGAVSVHARSLWRLETLRVAWSGSHIRWGQPFRLRHVTTGKYLSLMEDKNLLLMDKEKADVKSTAFTFRSSKEKLDVGVRKEVDGMGTSEIKYGDSVCYIQHVDTGLWLTYQSVDVKSVRMGSIQRKAIMHHEGHMDDGISLSRSQHEESRTARVIRSTVFLFNRFIRGLDALSKKAKASTVDLPIESVSLSLQDLIGYFHPPDEHLEHEDKQNRLRALKNRQNLFQEEGMINLVLECIDRLHVYSSAAHFADVAGREAGESWKSILNSLYELLAALIRGNRKNCAQFSGSLDWLISRLERLEASSGILEVLHCVLVESPEALNIIKEGHIKSIISLLDKHGRNHKVLDVLCSLCVCHGVAVRSNQHLICDNLLPGRDLLLQTRLVNHVSSMRPNIFLGVSEGSAQYKKWYYELMVDHTEPFVTAEATHLRVGWASTEGYSPYPGGGEEWGGNGVGDDLFSYGFDGLHLWSGCIARTVSSPNQHLLRTDDVISCCLDLSAPSISFRINGQPVQGMFENFNIDGLFFPVVSFSAGIKVRFLLGGRHGEFKFLPPPGYAPCYEAVLPKEKLKVEHSREYKQERTYTRDLLGPTVSLTQAAFTPIPVDTSQIVLPPHLERIREKLAENIHELWVMNKIELGWQYGPVRDDNKRQHPCLVEFSKLPEQERNYNLQMSLETLKTLLALGCHVGISDEHAEDKVKKMKLPKNYQLTSGYKPAPMDLSFIKLTPSQEAMVDKLAENAHNVWARDRIRQGWTYGIQQDVKNRRNPRLVPYTLLDDRTKKSNKDSLREAVRTLLGYGYNLEAPDQDHAARAEVCSGTGERFRIFRAEKTYAVKAGRWYFEFETVTAGDMRVGWSRPGCQPDQELGSDERAFAFDGFKAQRWHQGNEHYGRSWQAGDVVGCMVDMNEHTMMFTLNGEILLDDSGSELAFKDFDVGDGFIPVCSLGVAQVGRMNFGKDVSTLKYFTICGLQEGYEPFAVNTNRDITMWLSKRLPQFLQVPSNHEHIEVTRIDGTIDSSPCLKVTQKSFGSQNSNTDIMFYRLSMPIECAEVFSKTVAGGLPGAGLFGPKNDLEDYDADSDFEVLMKTAHGHLVPDRVDKDKEATKPEFNNHKDYAQEKPSRLKQRFLLRRTKPDYSTSHSARLTEDVLADDRDDYDFLMQTSTYYYSVRIFPGQEPANVWVGWITSDFHQYDTGFDLDRVRTVTVTLGDEKGKVHESIKRSNCYMVCAGESMSPGQGRNNNGLEIGCVVDAASGLLTFIANGKELSTYYQVEPSTKLFPAVFAQATSPNVFQFELGRIKNVMPLSAGLFKSEHKNPVPQCPPRLHVQFLSHVLWSRMPNQFLKVDVSRISERQGWLVQCLDPLQFMSLHIPEENRSVDILELTEQEELLKFHYHTLRLYSAVCALGNHRVAHALCSHVDEPQLLYAIENKYMPGLLRAGYYDLLIDIHLSSYATARLMMNNEYIVPMTEETKSITLFPDENKKHGLPGIGLSTSLRPRMQFSSPSFVSISNECYQYSPEFPLDILKSKTIQMLTEAVKEGSLHARDPVGGTTEFLFVPLIKLFYTLLIMGIFHNEDLKHILQLIEPSVFKEAATPEEESDTLEKELSVDDAKLQGAGEEEAKGGKRPKEGLLQMKLPEPVKLQMCLLLQYLCDCQVRHRIEAIVAFSDDFVAKLQDNQRFRYNEVMQALNMSAALTARKTKEFRSPPQEQINMLLNFKDDKSECPCPEEIRDQLLDFHEDLMTHCGIELDEDGSLDGNSDLTIRGRLLSLVEKVTYLKKKQAEKPVESDSKKSSTLQQLISETMVRWAQESVIEDPELVRAMFVLLHRQYDGIGGLVRALPKTYTINGVSVEDTINLLASLGQIRSLLSVRMGKEEEKLMIRGLGDIMNNKVFYQHPNLMRALGMHETVMEVMVNVLGGGESKEITFPKMVANCCRFLCYFCRISRQNQKAMFDHLSYLLENSSVGLASPAMRGSTPLDVAAASVMDNNELALALREPDLEKVVRYLAGCGLQSCQMLVSKGYPDIGWNPVEGERYLDFLRFAVFCNGESVEENANVVVRLLIRRPECFGPALRGEGGNGLLAAMEEAIKIAEDPSRDGPSPNSGSSKTLDTEEEEDDTIHMGNAIMTFYSALIDLLGRCAPEMHLIHAGKGEAIRIRSILRSLIPLGDLVGVISIAFQMPTIAKDGNVVEPDMSAGFCPDHKAAMVLFLDRVYGIEVQDFLLHLLEVGFLPDLRAAASLDTAALSATDMALALNRYLCTAVLPLLTRCAPLFAGTEHHASLIDSLLHTVYRLSKGCSLTKAQRDSIEVCLLSICGQLRPSMMQHLLRRLVFDVPLLNEHAKMPLKLLTNHYERCWKYYCLPGGWGNFGAASEEELHLSRKLFWGIFDALSQKKYEQELFKLALPCLSAVAGALPPDYMESNYVSMMEKQSSMDSEGNFNPQPVDTSNITIPEKLEYFINKYAEHSHDKWSMDKLANGWIYGEIYSDSSKVQPLMKPYKLLSEKEKEIYRWPIKESLKTMLAWGWRIERTREGDSMALYNRTRRISQTSQVSVDAAHGYSPRAIDMSNVTLSRDLHAMAEMMAENYHNIWAKKKKMELESKGGGNHPLLVPYDTLTAKEKAKDREKAQDILKFLQINGYAVSRGFKDLELDTPSIEKRFAYSFLQQLIRYVDEAHQYILEFDGGSRGKGEHFPYEQEIKFFAKVVLPLIDQYFKNHRLYFLSAASRPLCSGGHASNKEKEMVTSLFCKLGVLVRHRISLFGNDATSIVNCLHILGQTLDARTVMKTGLESVKSALRAFLDNAAEDLEKTMENLKQGQFTHTRNQPKGVTQIINYTTVALLPMLSSLFEHIGQHQFGEDLILEDVQVSCYRILTSLYALGTSKSIYVERQRSALGECLAAFAGAFPVAFLETHLDKHNIYSIYNTKSSRERAALSLPTNVEDVCPNIPSLEKLMEEIVELAESGIRYTQMPHVMEVILPMLCSYMSRWWEHGPENNPERAEMCCTALNSEHMNTLLGNILKIIYNNLGIDEGAWMKRLAVFSQPIINKVKPQLLKTHFLPLMEKLKKKAATVVSEEDHLKAEARGDMSEAELLILDEFTTLARDLYAFYPLLIRFVDYNRAKWLKEPNPEAEELFRMVAEVFIYWSKSHNFKREEQNFVVQNEINNMSFLITDTKSKMSKAAVSDQERKKMKRKGDRYSMQTSLIVAALKRLLPIGLNICAPGDQELIALAKNRFSLKDTEDEVRDIIRSNIHLQGKLEDPAIRWQMALYKDLPNRTDDTSDPEKTVERVLDIANVLFHLEQKSKRVGRRHYCLVEHPQRSKKAVWHKLLSKQRKRAVVACFRMAPLYNLPRHRAVNLFLQGYEKSWIETEEHYFEDKLIEDLAKPGAEPPEEDEGTKRVDPLHQLILLFSRTALTEKCKLEEDFLYMAYADIMAKSCHDEEDDDGEEEVKSFEEKEMEKQKLLYQQARLHDRGAAEMVLQTISASKGETGPMVAATLKLGIAILNGGNSTVQQKMLDYLKEKKDVGFFQSLAGLMQSCSVLDLNAFERQNKAEGLGMVTEEGSGEKVLQDDEFTCDLFRFLQLLCEGHNSDFQNYLRTQTGNNTTVNIIISTVDYLLRVQESISDFYWYYSGKDVIDEQGQRNFSKAIQVAKQVFNTLTEYIQGPCTGNQQSLAHSRLWDAVVGFLHVFAHMQMKLSQDSSQIELLKELMDLQKDMVVMLLSMLEGNVVNGTIGKQMVDMLVESSNNVEMILKFFDMFLKLKDLTSSDTFKEYDPDGKGVISKRDFHKAMESHKHYTQSETEFLLSCAETDENETLDYEEFVKRFHEPAKDIGFNVAVLLTNLSEHMPNDTRLQTFLELAESVLNYFQPFLGRIEIMGSAKRIERVYFEISESSRTQWEKPQVKESKRQFIFDVVNEGGEKEKMELFVNFCEDTIFEMQLAAQISESDLNERSANKEESEKERPEEQGPRMAFFSILTVRSALFALRYNILTLMRMLSLKSLKKQMKKVKKMTVKDMVTAFFSSYWSIFMTLLHFVASVFRGFFRIICSLLLGGSLVEGAKKIKVAELLANMPDPTQDEVRGDGEEGERKPLEAALPSEDLTDLKELTEESDLLSDIFGLDLKREGGQYKLIPHNPNAGLSDLMSNPVPMPEVQEKFQEQKAKEEEKEEKEETKSEPEKAEGEDGEKEEKAKEDKGKQKLRQLHTHRYGEPEVPESAFWKKIIAYQQKLLNYFARNFYNMRMLALFVAFAINFILLFYKVSTSSVVEGKELPTRSSSENAKVTSLDSSSHRIIAVHYVLEESSGYMEPTLRILAILHTVISFFCIIGYYCLKVPLVIFKREKEVARKLEFDGLYITEQPSEDDIKGQWDRLVINTQSFPNNYWDKFVKRKVMDKYGEFYGRDRISELLGMDKAALDFSDAREKKKPKKDSSLSAVLNSIDVKYQMWKLGVVFTDNSFLYLAWYMTMSVLGHYNNFFFAAHLLDIAMGFKTLRTILSSVTHNGKQLVLTVGLLAVVVYLYTVVAFNFFRKFYNKSEDGDTPDMKCDDMLTCYMFHMYVGVRAGGGIGDEIEDPAGDEYEIYRIIFDITFFFFVIVILLAIIQGLIIDAFGELRDQQEQVKEDMETKCFICGIGNDYFDTVPHGFETHTLQEHNLANYLFFLMYLINKDETEHTGQESYVWKMYQERCWEFFPAGDCFRKQYEDQLN

2、通过RNAi的方法对RYR2进行敲低(Knockdown)

使用pLKO.1空载构建RYR2 shRNA慢病毒载体，对于人的结直肠癌细胞而言，设计如下序列：

Scramble靶向序列：5’-cctaaggttaagtcgccctcg-3’(SEQ ID NO:4)；

shRYR2 1#靶向序列：5’-atgaaccatttgccgttaata-3’(SEQ ID NO:2)；

shRYR2 2#靶向序列：5’-gccataatacaaggtctaatt-3’(SEQ ID NO:3)。

对于鼠源结直肠癌细胞CT26而言，设计如下序列：

Scramble靶向序列：5’-cctaaggttaagtcgccctcg-3’(SEQ ID NO:7)；

shmRYR2 2#靶向序列：5’-gatccgatttgtggactataa-3’(SEQ ID NO:5)；

shmRYR2 3#靶向序列：5’-atgagccatttgccgttaata-3’(SEQ ID NO:6)。

包装病毒后感染细胞，然后通过Puromycin筛选出稳定敲低的细胞pool。

2、Fluo 4-AM染色

将细胞铺于皿中，并在实验全过程中保持在Hepes缓冲溶液中。将细胞与4uM的钙离子指示剂Fluo 4-AM孵育。外加入ATP引起胞内钙流变化，然后在Zeiss Confocol显微镜下进行time course的拍摄。

3、细胞侵袭迁移实验(Transwell migration assay)

将细胞消化后用无血清培养基重悬，置于Transwell上层小室中，细胞数量为1～5x10⁵。下层小室则加入10％FBS的培养基，置于37℃培养箱。8-10小时候取出，使用结晶紫固定染色后晾干，然后在显微镜下计数。

4、尾静脉注射转移模型

取1x10⁷个细胞加入1毫升无血清1640培养基中。取5周龄的裸鼠进行尾静脉注射实验，每只裸鼠注射100微升。

实施例1、RYR2靶点的发现

临床上缺乏针对KRAS突变的转移性结直肠癌病人的靶向治疗方案。为了改变这一现状，本发明人对来源于TCGA结直肠癌转录组数据的分析，数据筛选逻辑如图1A。

本发明人在大样本量的分析研究的基础上发现，与KRAS野生型转移性病人相比，RYR2的表达在KRAS突变的转移性结直肠癌病人中显著升高，而在不发生转移的结肠癌患者中，在KRAS WT和突变病人间没有显著性差别(图1B)。

根据病人的生存期来统计，RYR2高表达病人的总体生存期和无病生存期更短(图1C，D)。

根据病灶的情况来统计，转移灶中RYR2的表达显著高于原位灶(图1E)。

上述结果表明，RYR2是一种与结直肠癌的发生发展或转移密切相关的靶点。

实施例2、RYR2敲低或者S107处理显著降低细胞的迁移能力

利用靶向于人结直肠癌细胞的shRNA，本发明人通过RNAi的方法对结直肠癌细胞中的RYR2进行敲低，敲低效果如图2A所示。与Scramble组相比，敲低组的表达极为显著地下降。

为验证敲低RYR2后细胞对钙离子释放条件的响应，本发明人使用5μMATP处理细胞，通过Fluo 4-AM检测荧光强度变化。结果显示，敲低RYR2的细胞钙离子释放能力显著降低，如图2B。

本发明人对敲低了RYR2的SW480细胞和DLD-1细胞行Transwell实验，检测癌细胞体外迁移能力。结果显示，敲低RYR2后的癌细胞体外迁移能力显著降低，如图2C，D。

本发明人对SW480细胞和DLD-1细胞使用S107处理48小时，检测细胞内钙离子对5μM ATP的响应。结果显示，S107处理显著降低细胞内钙离子的释放，如图2E。

本发明人通过Transwell检测SW480和DLD-1细胞在S107处理下的迁移能力。结果发现，S107处理能显著降低细胞的体外迁移能力，如图2F。

本发明人通过MTT实验。结果显示，S107处理细胞对细胞的增殖能力没有影响，如图2G-H。

实施例3、RYR2敲低显著降低癌细胞体内转移能力

利用靶向于鼠结直肠癌细胞的shRNA，本发明人通过RNAi的方法对Luciferase标记的CT26鼠源的小鼠结肠癌细胞CT26中的RYR2进行敲低，敲低效果如图所示(图3A)。

进行尾静脉肺转移实验，具体流程如下：消化计数各细胞，按照2x10⁶铺入10cm细胞培养皿中。第2天换液，第3天消化计数，取1x10⁷细胞加入1毫升无血清1640培养基中。取5周龄的裸鼠进行尾静脉注射实验，每只裸鼠注射100微升，每组5只。对每只裸鼠注射Luciferase底物，记录荧光图片，记为第0天。之后每隔4天记录荧光变化。至第14天处死所有小鼠，取肺，拍照，对每个肺脏进行转移灶的计数，然后固定包埋整个肺脏，进行切片HE染色。结果显示，RNAi敲低组动物的肺脏肿瘤数极为显著地下降，RYR2显著抑制CT26细胞体内转移能力，如图3B-D。

实施例4、S107给药显著降低癌细胞体内转移能力

进行尾静脉肺转移实验，探索S107对癌细胞(小鼠结肠癌细胞CT26)体内转移能力的影响。具体流程如下：消化计数CT-Luciferase细胞，按照2x10⁶/皿铺入3皿10-cm细胞培养皿中。同时，对照组加入10微升DMSO，S107组加入10微升10mM的S107。第二天换液，第三天消化计数，取1x10⁷细胞加入1毫升无血清1640培养基中。取5周龄的裸鼠进行尾静脉注射实验，每只裸鼠注射100微升，每组5只。对每只裸鼠注射Luciferase底物，记录荧光图片，记为第0天。之后每隔4天记录荧光变化。每隔一天通过腹腔注射方式给药，溶剂为10％的DMSO，S107浓度为30mg/kg。小鼠在给药期间没有观察到机体产生其他副作用/毒性，至第15天处死所有小鼠，取肺，拍照，对每个肺脏进行转移灶的计数，然后固定包埋整个肺脏，进行切片HE染色。

结果显示，S107处理组动物的肺脏肿瘤数极为显著地下降，S107处理能显著抑制CT26细胞体内转移能力，如图4A-E。

实施例5、基于RYR2表达或活性的药物筛选

细胞：过表达RYR2的结直肠癌细胞。

测试组：培养所述过表达RYR2的结直肠癌(KRAS突变型)细胞，给予候选物质；

对照组：培养所述过表达RYR2的结直肠癌(KRAS突变型)细胞，不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中RYR2的表达或活性情况，并进行比较。如果测试组中RYR2的表达或活性在统计学上低于(如低30％或更低)对照组，就表明该候选物是抑制结直肠癌的潜在物质。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海营养与健康研究所

<120> RYR2及其下调剂在治疗转移性结直肠癌中的应用

<130> 212385

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4967

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Asp Gly Gly Glu Gly Glu Asp Glu Ile Gln Phe Leu Arg Thr

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Val Leu Gln Cys Thr Ala Thr Ile His Lys Glu Gln

20 25 30

Gln Lys Leu Cys Leu Ala Ala Glu Gly Phe Gly Asn Arg Leu Cys Phe

35 40 45

Leu Glu Ser Thr Ser Asn Ser Lys Asn Val Pro Pro Asp Leu Ser Ile

50 55 60

Cys Thr Phe Val Leu Glu Gln Ser Leu Ser Val Arg Ala Leu Gln Glu

65 70 75 80

Met Leu Ala Asn Thr Val Glu Lys Ser Glu Gly Gln Val Asp Val Glu

85 90 95

Lys Trp Lys Phe Met Met Lys Thr Ala Gln Gly Gly Gly His Arg Thr

100 105 110

Leu Leu Tyr Gly His Ala Ile Leu Leu Arg His Ser Tyr Ser Gly Met

115 120 125

Tyr Leu Cys Cys Leu Ser Thr Ser Arg Ser Ser Thr Asp Lys Leu Ala

130 135 140

Phe Asp Val Gly Leu Gln Glu Asp Thr Thr Gly Glu Ala Cys Trp Trp

145 150 155 160

Thr Ile His Pro Ala Ser Lys Gln Arg Ser Glu Gly Glu Lys Val Arg

165 170 175

Val Gly Asp Asp Leu Ile Leu Val Ser Val Ser Ser Glu Arg Tyr Leu

180 185 190

His Leu Ser Tyr Gly Asn Gly Ser Leu His Val Asp Ala Ala Phe Gln

195 200 205

Gln Thr Leu Trp Ser Val Ala Pro Ile Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala

210 215 220

Gln Gly Tyr Leu Ile Gly Gly Asp Val Leu Arg Leu Leu His Gly His

225 230 235 240

Met Asp Glu Cys Leu Thr Val Pro Ser Gly Glu His Gly Glu Glu Gln

245 250 255

Arg Arg Thr Val His Tyr Glu Gly Gly Ala Val Ser Val His Ala Arg

260 265 270

Ser Leu Trp Arg Leu Glu Thr Leu Arg Val Ala Trp Ser Gly Ser His

275 280 285

Ile Arg Trp Gly Gln Pro Phe Arg Leu Arg His Val Thr Thr Gly Lys

290 295 300

Tyr Leu Ser Leu Met Glu Asp Lys Asn Leu Leu Leu Met Asp Lys Glu

305 310 315 320

Lys Ala Asp Val Lys Ser Thr Ala Phe Thr Phe Arg Ser Ser Lys Glu

325 330 335

Lys Leu Asp Val Gly Val Arg Lys Glu Val Asp Gly Met Gly Thr Ser

340 345 350

Glu Ile Lys Tyr Gly Asp Ser Val Cys Tyr Ile Gln His Val Asp Thr

355 360 365

Gly Leu Trp Leu Thr Tyr Gln Ser Val Asp Val Lys Ser Val Arg Met

370 375 380

Gly Ser Ile Gln Arg Lys Ala Ile Met His His Glu Gly His Met Asp

385 390 395 400

Asp Gly Ile Ser Leu Ser Arg Ser Gln His Glu Glu Ser Arg Thr Ala

405 410 415

Arg Val Ile Arg Ser Thr Val Phe Leu Phe Asn Arg Phe Ile Arg Gly

420 425 430

Leu Asp Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Asp Leu Pro

435 440 445

Ile Glu Ser Val Ser Leu Ser Leu Gln Asp Leu Ile Gly Tyr Phe His

450 455 460

Pro Pro Asp Glu His Leu Glu His Glu Asp Lys Gln Asn Arg Leu Arg

465 470 475 480

Ala Leu Lys Asn Arg Gln Asn Leu Phe Gln Glu Glu Gly Met Ile Asn

485 490 495

Leu Val Leu Glu Cys Ile Asp Arg Leu His Val Tyr Ser Ser Ala Ala

500 505 510

His Phe Ala Asp Val Ala Gly Arg Glu Ala Gly Glu Ser Trp Lys Ser

515 520 525

Ile Leu Asn Ser Leu Tyr Glu Leu Leu Ala Ala Leu Ile Arg Gly Asn

530 535 540

Arg Lys Asn Cys Ala Gln Phe Ser Gly Ser Leu Asp Trp Leu Ile Ser

545 550 555 560

Arg Leu Glu Arg Leu Glu Ala Ser Ser Gly Ile Leu Glu Val Leu His

565 570 575

Cys Val Leu Val Glu Ser Pro Glu Ala Leu Asn Ile Ile Lys Glu Gly

580 585 590

His Ile Lys Ser Ile Ile Ser Leu Leu Asp Lys His Gly Arg Asn His

595 600 605

Lys Val Leu Asp Val Leu Cys Ser Leu Cys Val Cys His Gly Val Ala

610 615 620

Val Arg Ser Asn Gln His Leu Ile Cys Asp Asn Leu Leu Pro Gly Arg

625 630 635 640

Asp Leu Leu Leu Gln Thr Arg Leu Val Asn His Val Ser Ser Met Arg

645 650 655

Pro Asn Ile Phe Leu Gly Val Ser Glu Gly Ser Ala Gln Tyr Lys Lys

660 665 670

Trp Tyr Tyr Glu Leu Met Val Asp His Thr Glu Pro Phe Val Thr Ala

675 680 685

Glu Ala Thr His Leu Arg Val Gly Trp Ala Ser Thr Glu Gly Tyr Ser

690 695 700

Pro Tyr Pro Gly Gly Gly Glu Glu Trp Gly Gly Asn Gly Val Gly Asp

705 710 715 720

Asp Leu Phe Ser Tyr Gly Phe Asp Gly Leu His Leu Trp Ser Gly Cys

725 730 735

Ile Ala Arg Thr Val Ser Ser Pro Asn Gln His Leu Leu Arg Thr Asp

740 745 750

Asp Val Ile Ser Cys Cys Leu Asp Leu Ser Ala Pro Ser Ile Ser Phe

755 760 765

Arg Ile Asn Gly Gln Pro Val Gln Gly Met Phe Glu Asn Phe Asn Ile

770 775 780

Asp Gly Leu Phe Phe Pro Val Val Ser Phe Ser Ala Gly Ile Lys Val

785 790 795 800

Arg Phe Leu Leu Gly Gly Arg His Gly Glu Phe Lys Phe Leu Pro Pro

805 810 815

Pro Gly Tyr Ala Pro Cys Tyr Glu Ala Val Leu Pro Lys Glu Lys Leu

820 825 830

Lys Val Glu His Ser Arg Glu Tyr Lys Gln Glu Arg Thr Tyr Thr Arg

835 840 845

Asp Leu Leu Gly Pro Thr Val Ser Leu Thr Gln Ala Ala Phe Thr Pro

850 855 860

Ile Pro Val Asp Thr Ser Gln Ile Val Leu Pro Pro His Leu Glu Arg

865 870 875 880

Ile Arg Glu Lys Leu Ala Glu Asn Ile His Glu Leu Trp Val Met Asn

885 890 895

Lys Ile Glu Leu Gly Trp Gln Tyr Gly Pro Val Arg Asp Asp Asn Lys

900 905 910

Arg Gln His Pro Cys Leu Val Glu Phe Ser Lys Leu Pro Glu Gln Glu

915 920 925

Arg Asn Tyr Asn Leu Gln Met Ser Leu Glu Thr Leu Lys Thr Leu Leu

930 935 940

Ala Leu Gly Cys His Val Gly Ile Ser Asp Glu His Ala Glu Asp Lys

945 950 955 960

Val Lys Lys Met Lys Leu Pro Lys Asn Tyr Gln Leu Thr Ser Gly Tyr

965 970 975

Lys Pro Ala Pro Met Asp Leu Ser Phe Ile Lys Leu Thr Pro Ser Gln

980 985 990

Glu Ala Met Val Asp Lys Leu Ala Glu Asn Ala His Asn Val Trp Ala

995 1000 1005

Arg Asp Arg Ile Arg Gln Gly Trp Thr Tyr Gly Ile Gln Gln Asp Val

1010 1015 1020

Lys Asn Arg Arg Asn Pro Arg Leu Val Pro Tyr Thr Leu Leu Asp Asp

1025 1030 1035 1040

Arg Thr Lys Lys Ser Asn Lys Asp Ser Leu Arg Glu Ala Val Arg Thr

1045 1050 1055

Leu Leu Gly Tyr Gly Tyr Asn Leu Glu Ala Pro Asp Gln Asp His Ala

1060 1065 1070

Ala Arg Ala Glu Val Cys Ser Gly Thr Gly Glu Arg Phe Arg Ile Phe

1075 1080 1085

Arg Ala Glu Lys Thr Tyr Ala Val Lys Ala Gly Arg Trp Tyr Phe Glu

1090 1095 1100

Phe Glu Thr Val Thr Ala Gly Asp Met Arg Val Gly Trp Ser Arg Pro

1105 1110 1115 1120

Gly Cys Gln Pro Asp Gln Glu Leu Gly Ser Asp Glu Arg Ala Phe Ala

1125 1130 1135

Phe Asp Gly Phe Lys Ala Gln Arg Trp His Gln Gly Asn Glu His Tyr

1140 1145 1150

Gly Arg Ser Trp Gln Ala Gly Asp Val Val Gly Cys Met Val Asp Met

1155 1160 1165

Asn Glu His Thr Met Met Phe Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Leu Asp

1170 1175 1180

Asp Ser Gly Ser Glu Leu Ala Phe Lys Asp Phe Asp Val Gly Asp Gly

1185 1190 1195 1200

Phe Ile Pro Val Cys Ser Leu Gly Val Ala Gln Val Gly Arg Met Asn

1205 1210 1215

Phe Gly Lys Asp Val Ser Thr Leu Lys Tyr Phe Thr Ile Cys Gly Leu

1220 1225 1230

Gln Glu Gly Tyr Glu Pro Phe Ala Val Asn Thr Asn Arg Asp Ile Thr

1235 1240 1245

Met Trp Leu Ser Lys Arg Leu Pro Gln Phe Leu Gln Val Pro Ser Asn

1250 1255 1260

His Glu His Ile Glu Val Thr Arg Ile Asp Gly Thr Ile Asp Ser Ser

1265 1270 1275 1280

Pro Cys Leu Lys Val Thr Gln Lys Ser Phe Gly Ser Gln Asn Ser Asn

1285 1290 1295

Thr Asp Ile Met Phe Tyr Arg Leu Ser Met Pro Ile Glu Cys Ala Glu

1300 1305 1310

Val Phe Ser Lys Thr Val Ala Gly Gly Leu Pro Gly Ala Gly Leu Phe

1315 1320 1325

Gly Pro Lys Asn Asp Leu Glu Asp Tyr Asp Ala Asp Ser Asp Phe Glu

1330 1335 1340

Val Leu Met Lys Thr Ala His Gly His Leu Val Pro Asp Arg Val Asp

1345 1350 1355 1360

Lys Asp Lys Glu Ala Thr Lys Pro Glu Phe Asn Asn His Lys Asp Tyr

1365 1370 1375

Ala Gln Glu Lys Pro Ser Arg Leu Lys Gln Arg Phe Leu Leu Arg Arg

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<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Scramble

<400> 4

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<210> 5

<211> 21

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<210> 7

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<213> Scramble

<400> 7

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Claims

1.RYR2的应用，用于：

作为抑制结直肠癌或其癌转移的靶标；

作为对结直肠癌或其癌转移进行诊断或预后的标志物；

制备结直肠癌或其癌转移诊断或预后的诊断试剂；或

作为筛选抑制结直肠癌或其癌转移的药物的靶标。

2.RYR2的下调剂的应用，用于制备抑制结直肠癌或其癌转移的组合物。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌为KRAS突变型结直肠癌。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述RYR2的下调剂包括：下调RYR2活性的物质或下调RYR2的表达、稳定性或减少其有效作用时间的物质。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述下调剂包括选自：

干扰或敲除RYR2的试剂；

针对RYR2的化学小分子拮抗剂或抑制剂；

特异性与RYR2结合的结合分子；或

干扰RYR2与效应分子的相互作用的试剂。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述干扰或敲除RYR2的试剂包括：特异性干扰RYR2的编码基因表达的干扰分子，针对RYR2的CRISPR基因编辑试剂，针对RYR2的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将RYR2进行功能丧失性突变；或

所述针对RYR2的化学小分子拮抗剂或抑制剂包括：S107。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述干扰分子包括shRNA，siRNA，miRNA，反义核酸等，或能形成所述siRNA、shRNA，miRNA，反义核酸等的构建体；较佳地，所述的干扰分子为shRNA；较佳地，其靶向序列包括：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或其组合；或包括：SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6或其组合。

8.特异性识别或扩增RYR2的试剂的用途，用于制备对结直肠癌或其癌转移进行诊断或预后的诊断试剂或试剂盒；较佳地，所述结肠癌是KRAS突变型结肠癌。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括：

特异性结合RYR2蛋白的结合分子；

特异性扩增RYR2基因的引物；

特异性识别RYR2基因的探针；或，

特异性识别RYR2基因的芯片。

10.一种用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒，包括：RYR2的下调剂；较佳地，所述下调剂为干扰分子，所述的干扰分子为shRNA；较佳地，所述shRNA靶向序列包括：SEQ ID NO:2、SEQID NO:3或其组合；或包括：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或其组合；或

所述下调剂为针对RYR2的化学小分子拮抗剂或抑制剂，包括：S107。

11.一种筛选抑制结直肠癌或其癌转移的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达RYR2；和

(2)检测所述体系中RYR2的表达或活性；若所述候选物质在统计学上下调RYR2的表达或活性，则该候选物质是降低结直肠癌或其癌转移的潜在物质。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述体系为结直肠癌细胞体系；步骤(2)还包括：检测所述体系中结直肠癌细胞的转移能力；若其转移能力下降，则该候选物质是降低结直肠癌或其癌转移的潜在物质。