JP2020182407A - Egfr遺伝子変異陽性非小細胞肺癌の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.上皮成長因子受容体(EGFR)遺伝子変異陽性非小細胞肺癌(NSCLC)に罹患した患者におけるEGFRチロシンキナーゼ阻害剤(EGFR-TKI)の治療効果の予測、及び/又は予後の判定を補助する方法であって、
(i)患者由来のサンプル中のLINC00460の発現量を検出するステップ、
(ii)ステップ(i)において検出した発現量を基準値と比較するステップ
を含み、
基準値と比較して発現量が高いことが治療効果が低く、発現量が低いことが治療効果が高いとの予測、あるいは
基準値と比較して発現量が高いことが予後が悪く、発現量が低いことが予後が良好であるとの判定
を可能とする、上記方法。
2.患者由来のサンプルが組織サンプル又は血液サンプルである、上記1記載の方法。
3.患者が、腫瘍摘出手術後のヒト患者である、上記1又は2記載の方法。
4.予後が、無増悪生存期間又は全生存期間である、上記1〜3のいずれか記載の方法。
5.EGFR遺伝子変異陽性非小細胞肺癌(NSCLC)患者の治療又は再発防止のための医薬であって、LINC00460の発現阻害剤を有効成分とする、該医薬。
6.LINC00460の発現阻害剤が、LINC00460プロモーター領域の機能を阻害するものである、上記5記載の医薬。
7.LINC00460の発現阻害剤が、LINC00460のエクソンの一部又は全部の転写を阻害するものである、上記5記載の医薬。
8.EGFRチロシンキナーゼ阻害剤(EGFR-TKI)と組み合わせて投与される、上記5〜7のいずれか記載の医薬。
さらに、本発明は、EGFR遺伝子変異陽性肺癌におけるゲフィチニブなどのEGFR-TKI治療において、LINC00460をターゲットにすることで、EGFR-TKIの治療効果を改善し、予後を改善することができる。EGFR-TKI耐性の症例においても、治療効果の向上を期待することができる。
(i)患者由来のサンプル中のLINC00460の発現量を検出するステップ、
(ii)ステップ(i)において検出した発現量を基準値と比較するステップ
を含み、
基準値と比較して発現量が高いことが治療効果が低く、発現量が低いことが治療効果が高いとの予測、あるいは
基準値と比較して発現量が高いことが予後が悪く、発現量が低いことが予後が良好であるとの判定
を可能とする、上記方法を提供する。
当業者であれば、本明細書の記載、及び当分野における技術常識に基づいて、本発明の医薬を取得することができる。
この場合、本発明の医薬は、EGFR-TKIの投与の前、EGFR-TKIの投与と同時、又はEGFR-TKIの投与の後で投与することができる。また、本発明の医薬は、EGFR-TKIと同じ投与経路で投与しても良く、EGFR-TKIと異なる経路で投与しても良い。
尚、実施例で使用した細胞株は、10% FBS及び抗生物質(ペニシリンおよびストレプトマイシン)を添加したDMEM中で培養した。
The Cancer Genome Atlas(TCGA)によりNSCLCの次世代シーケンサーによるRNA-seqデータセット及び臨床データセットを入手(Genomic Data Commons (GDC) website, https://portal/gdc.cancer.gov)して解析し、EGFR遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌およびEGFR-TKIに耐性を獲得した細胞において高発現する遺伝子を探索した。
LINC00460リバースプライマー:5'-CTTTCCCACGCTCAGTCTTTC-3'(配列番号3)
GAPDHリバースプライマー:5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'(配列番号5)
その結果、図1Aに示すように、EGFR遺伝子変異陽性患者で有意な高発現を認め、qPCRによる検証でも上記データ解析結果と同様の結果が得られた。
正常細胞モデルとしてHEK293細胞を用い、EGFRのリガンドであるEGFの高濃度処理、及びゲフィチニブでの前処理がLINC00460の発現にもたらす影響を検討した。
野生型EGFR、及びEGFR活性型変異体(19del及びL858R)をそれぞれ発現するようにこれらの遺伝子を組み込んだ発現ベクター(pIRESpuro-EGFR(WT、19del及びL858R)、東邦大学薬学部 菅野博士よりご供与頂いた)を用いて、H1299細胞株に導入し、野生型(WT)及びEGFR活性型変異体(19del及びL858R)の安定発現株を作製した。
実施例1で使用したPC9細胞株は、EGFR遺伝子変異陽性(エクソン19欠損型)でゲフィチニブ感受性の高い肺腺癌細胞株である。このPC-9細胞株(10,000個)にゲフィチニブ(1μM)を暴露して、処理後の36時間後(細胞死が生じる直前)に発現量を定量すると、コントロール群(溶媒DMSO処理)に比してLINC00460の発現は減少していた(データは示さない)。
LINC00460は染色体13q33.2上にコードされていることが知られている。EGFRを介したLINC00460の発現を制御するメカニズムを特定するために、LINC00460のプロモーター領域が存在することが想定される転写開始部位(TSS)の上流配列の断片を含む構築物を作製し、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、LINC00460の発現調節領域を探索した。ルシフェラーゼ活性は、Dual Luciferase Assay System(Promega)を用いて検討した。
PC9細胞株、及び実施例4で作製したゲフィチニブ耐性PC9-GR細胞株を用いて、実施例5と同様のルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。
次に、LINC00460をノックアウトするために、2つのsgRNAとspCas9を同時に発現する発現ベクターを構築した。
gRNA1:5’-TCCCTGTGCGCGCATAGCAG-3’(配列番号6、標的はエクソン1の上流)
gRNA2:5’-CCATGCAGGGCCCCCCTCAT-3’(配列番号7、標的はエクソン3の下流)
実施例7と同様にして、実施例3で用いた野生型および異なる2種類のEGFR変異体を発現する3種の細胞株(WT、19del、及びL858R)におけるLINC00460コード領域欠損細胞株(WT+KO、19del+KO、及びL858R+KO)を作製した。
実施例7で得られた3種の細胞株を様々な濃度のEGFR-TKI(ゲフィチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ)で処理し、実施例8と同様にして72時間後の細胞生存率を定量した。
EGFR遺伝子変異陽性肺癌の術後再発患者23名(ゲフィチニブ治療あり)の組織検体から全RNAを抽出し、GAPDH mRNAを内部標準としてLINC00460の発現量をqRT-PCRにより定量し、患者をLINC00460高発現群(12名)と低発現群(11名)に分けた。
両群の患者は、下記の表1に示すように、臨床的特徴については有意差は認められなかった。
EGFR遺伝子変異陽性肺癌39例において、血液検体(血漿遊離RNA)でLINC00460が検出できるかどうかを検討した。
その結果、図9に示すように、LINC00460は血液検体(血漿遊離RNA)からでも検出することが可能であり、相対定量値は18.5±54.7であった。
Claims (8)
- 上皮成長因子受容体(EGFR)遺伝子変異陽性非小細胞肺癌(NSCLC)に罹患した患者におけるEGFRチロシンキナーゼ阻害剤(EGFR-TKI)の治療効果の予測、及び/又は予後の判定を補助する方法であって、
(i)患者由来のサンプル中のLINC00460の発現量を検出するステップ、
(ii)ステップ(i)において検出した発現量を基準値と比較するステップ
を含み、
基準値と比較して発現量が高いことが治療効果が低く、発現量が低いことが治療効果が高いとの予測、あるいは
基準値と比較して発現量が高いことが予後が悪く、発現量が低いことが予後が良好であるとの判定
を可能とする、上記方法。 - 患者由来のサンプルが組織サンプル又は血液サンプルである、請求項1記載の方法。
- 患者が、腫瘍摘出手術後のヒト患者である、請求項1又は2記載の方法。
- 予後が、無増悪生存期間又は全生存期間である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- EGFR遺伝子変異陽性非小細胞肺癌(NSCLC)患者の治療又は再発防止のための医薬であって、LINC00460の発現阻害剤を有効成分とする、該医薬。
- LINC00460の発現阻害剤が、LINC00460プロモーター領域の機能を阻害するものである、請求項5記載の医薬。
- LINC00460の発現阻害剤が、LINC00460のエクソンの一部又は全部の転写を阻害するものである、請求項5記載の医薬。
- EGFRチロシンキナーゼ阻害剤(EGFR-TKI)と組み合わせて投与される、請求項5〜7のいずれか1項記載の医薬。
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2019
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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MA, G. ET AL.: "Long Noncoding RNA LINC00460 Promotes the Gefitinib Resistance of Nonsmall Cell Lung Cancer Through", DNA AND CELL BIOLOGY, vol. 38, JPN6022044263, January 2019 (2019-01-01), pages 176 - 183, ISSN: 0004903916 * |
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