CN111187835B

CN111187835B - 胰腺癌的靶点erbb2及其在诊断和治疗中的应用

Info

Publication number: CN111187835B
Application number: CN201910107869.9A
Authority: CN
Inventors: 王跃祥; 李张
Original assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Priority date: 2019-02-02
Filing date: 2019-02-02
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2039-02-02
Also published as: CN111187835A

Abstract

本发明涉及胰腺癌的靶点ERBB2及其在诊断和治疗中的应用。具体地，本发明提供了一种ERBB2基因、mRNA、cDNA、或蛋白或其检测试剂的用途，(i)用作检测胰腺癌的标志物；和/或(ii)用于制备检测胰腺癌的诊断试剂或试剂盒。本发明的ERBB2基因或其蛋白的抑制剂可有效治疗胰腺癌，并且，ERBB2基因或其蛋白的抑制剂可与KRAS抑制剂、和/或其他预防和/或治疗胰腺癌的药物联用，并且对胰腺癌的治疗有显著的协同效果。

Description

胰腺癌的靶点ERBB2及其在诊断和治疗中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤学和诊断领域。更具体地，本发明涉及胰腺癌的靶点 ERBB2及其在诊断和治疗中的应用。

背景技术

胰腺癌是一种起源于胰腺细胞的恶性肿瘤。根据2018年癌症统计结果显示，在全球范围内，胰腺癌的新发病例占所有癌症的2.5％，不在前十名之列，但死亡病例占所有癌症的4.5％，位居第七，在美国这个比例达到了7％，位列第四，而在我国胰腺癌死亡病也已上升至第6位。在胰腺癌中，比例最高的是起源于胰腺上皮的胰腺导管腺癌，占比90％左右。胰腺导管腺癌早期难于诊断，易发生转移，确诊后预后很差，中位生存时间不超过6个月，5年生存率低于 5％。造成这一现象的主要原因有：一是在遗传学水平上，人们对于胰腺癌发生、发展的认识不够充分；二是对于一些现在已知的与胰腺癌密切相关的驱动基因，如KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4，还没有很好的靶向治疗的药物。

胰腺癌很难在早期被诊断发现，多数发现时均已处于中晚期。目前，外科手术是治疗胰腺癌的常用方法，但临床诊断为胰腺癌的患者仅约20％是可切除，另80％为不可切除或晚期胰腺癌。即使是首诊获切除的患者，其中位生存时间为16～20月，最终出现复发或转移。遗憾的是，目前尚无很好的提高晚期胰腺癌的治疗方法。虽然已经有很多研究致力于胰腺癌的治疗，但在过去的50年里，其五年生存率仍然低于5％。

作为胰腺癌临床一线化疗的药物主要有吉西他滨、5-氟尿嘧啶、结合型白蛋白紫杉醇等。这些广谱化疗药特异性差，药效有限，平均仅能增加患者3-6 个月的生存时间。因此，本领域迫切需要开发具有诊断和治疗作用的胰腺癌的靶点。

发明内容

本发明的目的就是提供一种具有诊断和治疗作用的胰腺癌的靶点。

在本发明第一方面，提供了一种ERBB2基因、mRNA、cDNA、或蛋白或其检测试剂的用途，(i)用作检测胰腺癌的标志物；和/或(ii)用于制备检测胰腺癌的诊断试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述胰腺癌选自下组：胰腺导管腺癌、胰腺腺泡细胞癌、或其组合。

在另一优选例中，所述诊断试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)或蛋白质芯片。

在另一优选例中，所述的蛋白包括全长蛋白或蛋白片段。

在另一优选例中，所述的ERBB2基因、mRNA、cDNA、或蛋白来源于哺乳动物，较佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人，更佳地，来源于被诊断患有胰腺癌的患者。

在另一优选例中，所述ERBB2基因、mRNA、cDNA、或蛋白来源于患有胰腺癌的患者。

在另一优选例中，所述ERBB2基因、mRNA、cDNA、或蛋白为突变的 ERBB2基因、mRNA、cDNA、或蛋白。

在另一优选例中，所述突变选自下组：错义突变、缺失突变、插入突变、点突变、基因扩增、基因融合、或其组合。

在另一优选例中，所述ERBB2基因含有选自下组的一个或多个基因突变位点(表A)：

表A

/>

其中，核苷酸位置编号基于野生型人ERBB2编码基因(mRNA)序列 (NM_004448)。

在另一优选例中，所述ERBB2基因的登录号为NG_007503。

在另一优选例中，所述ERBB2mRNA的登录号为NM_004448。

在另一优选例中，所述ERBB2蛋白的登录号为NP_004439。

在另一优选例中，所述检测包括实体肿瘤样本检测、正常组织(瘤旁组织) 样本检测。

在另一优选例中，所述检测是血液样本检测和/或血清样本检测。

在另一优选例中，所述检测试剂包括ERBB2的特异性抗体、ERBB2的特异性结合分子、特异性扩增引物、探针或芯片。

在另一优选例中，所述检测试剂选自下组：抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)、蛋白质芯片、或其组合。

在另一优选例中，所述试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：

(a)针对ERBB2基因的特异性引物；

(b)用于检测一种或多种所述基因突变位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种所述基因突变位点的芯片；

(d)用于检测一种或多种所述基因突变位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体。

在另一优选例中，所述的ERBB2蛋白或其特异性抗体或特异性结合分子偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述ERBB2的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在另一优选例中，所述ERBB2蛋白还包括ERBB2蛋白的衍生物。

在另一优选例中，所述ERBB2蛋白的衍生物包括经修饰的ERBB2蛋白、氨基酸序列与天然ERBB2蛋白同源且具有天然ERBB2蛋白活性的蛋白分子、含有ERBB2蛋白氨基酸序列的融合蛋白。

在另一优选例中，所述经修饰的ERBB2蛋白是PEG化的ERBB2蛋白。

在另一优选例中，所述“氨基酸序列与天然ERBB2蛋白同源且具有天然 ERBB2蛋白活性的蛋白分子”是指其氨基酸序列与ERBB2蛋白相比具有≥80％的同源性，较佳地，≥85％的同源性，较佳地≥90％的同源性，更佳地≥95％的同源性，最佳地≥98％或99％的同源性；并且具有天然ERBB2蛋白活性的蛋白分子。

在另一优选例中，所述检测试剂或试剂盒还用于区分(a)胰腺癌和癌旁组织。

本发明第二方面提供了一种用于检测胰腺癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测ERBB2基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测胰腺癌。

表A

/>

其中，核苷酸位置编号基于野生型人ERBB2编码基因序列(NM_004448)。

在另一优选例中，所述ERBB2具有选自下组的一个或多个氨基酸残基突变(表B)：

表B

/>

其中，氨基酸位置编号基于野生型人ERBB2蛋白序列(NP_004439)。

在另一优选例中，所述的检测胰腺癌指判断患有胰腺癌的可能性大小。

在另一优选例中，所述判断包括预先判断(预测)。

在另一优选例中，所述的检测ERBB2基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂包括：

(a).抗ERBB2蛋白的特异性抗体；和/或

(b).特异性扩增ERBB2的mRNA或cDNA的特异性引物。

在另一优选例中，所述检测试剂包括一种或多种选自下组的试剂：

(a)针对ERBB2基因的特异性引物；

(b)用于检测一种或多种所述基因突变位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种所述基因突变位点的芯片；

在另一优选例中，所述检测是实体肿瘤组织样本检测。

在另一优选例中，所述检测ERBB2基因、mRNA、cDNA、或蛋白或其检测试剂可作为对照品或参照品。

在另一优选例中，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于：

(i)检测胰腺癌；和/或

(ii)区分胰腺癌和癌旁组织；和/或

(iii)区分胰腺癌恶性程度的级别。

在另一优选例中，所述胰腺癌恶性程度的级别包括0期、I A期、I B期、II A 期、IIB期、III期和IV期。

在另一优选例中，所述的检测对象为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的试剂盒还用于预测胰腺癌患者的生存时间或预后。

本发明第三方面提供了一种检测胰腺癌的方法，所述方法包括：

a)提供来自受试者的测试样品；

b)检测测试样品中ERBB2蛋白的表达水平和/或ERBB2蛋白的突变状况；和

c)将步骤b)中所测定的ERBB2蛋白的表达水平与对照进行比较，

其中，与所述对照相比，所述样品中ERBB2蛋白的表达水平高于参比值，表明受试者患胰腺癌的几率高于一般人群(对照组人群)或受试者受试者所患胰腺癌的恶性程度的级别高于一般人群(对照组人群)；和/或

如果所述样品中ERBB2蛋白含有选自下组的一个或多个氨基酸突变位点，则表明受试者患胰腺癌的几率高于一般人群(对照组人群)或受试者所患胰腺癌的恶性程度的级别高于一般人群(对照组人群)；

p.R103Q；

p.R217C；

p.S310F；

p.S423N；

p.S423R；

p.S423_V424>RN；

p.V424I；

p.V424D；

p.R678Q；

p.Q679L；

p.E698del；

p.G704R；

p.E717D；

p.T718M；

p.L755S；

p.A775_G776insYVMA；

p.V777L；

p.V842I；

p.R849W；

p.V1128I；

p.R1161Q；

其中，氨基酸位置编号基于野生型人ERBB2蛋白序列(NP_004439)。

在另一优选例中，所述的受试者为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述测试样品为胰腺癌的实体瘤组织样本。

在另一优选例中，所述的测试样品包括胰腺癌的血液样本和/或血清样本。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。

在另一优选例中，所述参比值为截断值(cut-off值)。

在另一优选例中，所述参比值为样品中ERBB2的相对表达水平。

在另一优选例中，所述参比值为1.5。

在另一优选例中，通过RT-PCR或免疫组织化学检测样品中的ERBB2蛋白的表达水平。

本发明第四方面提供了一种确定治疗方案的方法，包括：

a)提供来自受试者的测试样品；

c)基于所述样品中的ERBB2蛋白的表达水平和/或ERBB2蛋白的突变状况来确定治疗方案。

在另一优选例中，所述的受试者为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，当所述样品中ERBB2蛋白的表达水平高于参比值，表明受试者患胰腺癌的几率高于一般人群(对照组人群)或受试者所患胰腺癌的恶性程度的级别高于一般人群(对照组人群)，所述治疗方案包括ERBB2抑制剂疗法、ERBB2抑制剂与KRAS抑制剂联用的疗法，优选ERBB2抑制剂疗法。

在另一优选例中，当ERBB2蛋白含有选自下组的一个或多个氨基酸突变位点，则表明受试者患胰腺癌的几率高于一般人群(对照组人群)或受试者所患胰腺癌的恶性程度的级别高于一般人群(对照组人群)，所述治疗方案包括 ERBB2抑制剂疗法、ERBB2抑制剂与KRAS抑制剂联用疗法。

在另一优选例中，所述ERBB2抑制剂疗法、ERBB2抑制剂与KRAS抑制剂联用疗法选自下组：

ERBB2抑制剂疗法：抗体、小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、或其组合；

KRAS抑制剂疗法：小分子化合物，选自下组：ARS-1620、ARS-853、 Deltarasin、6H05、Fendiline hydrochloride、KRpep-2d、K-Ras(G12C)inhibitor 9、 K-Ras(G12C)inhibitor 12、K-Ras(G12C)inhibitor 6、或其组合。

在另一优选例中，所述ERBB2抑制剂疗法选自下组：Neratinib、 Mubritinib、Afatinib、Canertinib、Lapatinib、Irbinitinib、Varlitinib、Sapitinib、 Poziotinib、Mubritinib、Dacomitinib、CP-724714、Tyrphostin AG 879、AEE788、 AC480、Trastuzumab、Pertuzumab、或其组合。

在另一优选例中，当受试者患有胰腺癌的几率高于一般人群(对照组人群) 或受试者所患胰腺癌的恶性程度的级别高于一般人群(对照组人群)时，所述治疗方案还包括ERBB2抑制剂疗法、ERBB2抑制剂与KRAS抑制剂联用疗法；和其他治疗胰腺癌药物的联用。

在另一优选例中，所述其他治疗胰腺癌的药物选自下组：吉西他滨(Gemcitabine)、FOLFIRINOX组合药、或其组合。

本发明第五方面提供了一种ERBB2基因或其蛋白抑制剂的用途，用于制备预防和/或治疗胰腺癌的药物。

在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、microRNA、 siRNA、shRNA、或其组合。

在另一优选例中，所述ERBB2基因或其蛋白抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、或其组合。

在另一优选例中，所述抑制剂包括抑制ERBB2基因或其蛋白突变的抑制剂。

在另一优选例中，所述ERBB2基因或其蛋白为突变的ERBB2基因或其蛋白。

在另一优选例中，所述ERBB2基因或其蛋白抑制剂选自下组：Neratinib、Mubritinib、Afatinib、Canertinib、Lapatinib、Irbinitinib、Varlitinib、Sapitinib、Poziotinib、Mubritinib、Dacomitinib、CP-724714、Tyrphostin AG 879、AEE788、 AC480、Trastuzumab、Pertuzumab、或其组合。

本发明第六方面提供了一种药物组合物，包括：

(a1)ERBB2基因或其蛋白的抑制剂；

(a2)KRAS抑制剂；和

(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物还包括：

(c)其他预防和/或治疗胰腺癌的药物。

在另一优选例中，所述抑制剂包括抑制ERBB2基因或其蛋白突变的抑制剂，选自下组：Neratinib、Mubritinib、Afatinib、Canertinib、Lapatinib、Irbinitinib、Varlitinib、Sapitinib、Poziotinib、Mubritinib、Dacomitinib、CP-724714、TyrphostinAG 879、AEE788、AC480、Trastuzumab、Pertuzumab、或其组合。

在另一优选例中，所述组分(a1)与组分(a2)的重量比为100:1－0.01:1，较佳地，10:1－0.1:1，更佳地，2:1－0.5:1。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(a)的含量为1％－99％，较佳地，10％－90％，更佳地，30％－70％。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(a2)的含量为1％－99％，较佳地，10％－90％，更佳地，30％－70％。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(c)的含量为1％－99％，较佳地，10％－90％，更佳地，30％－70％。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(a1)和任选的组分(a2)和任选的组分(c)占所述药物组合物总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括注射剂型、和口服剂型。

在另一优选例中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、和颗粒剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括缓释型剂型、和非缓释型剂型。

本发明第七方面提供了一种药盒，包括：

(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的ERBB2基因或其蛋白的抑制剂，或含有ERBB2基因或其蛋白的抑制剂的药物；

(b1)第二容器，以及位于所述第二容器中的KRAS抑制剂，或含有KRAS 抑制剂的药物。

在另一优选例中，所述药盒还包括：

(c1)第三容器，以及位于所述第三容器中的其他预防和/或治疗胰腺癌的药物，或含有其他预防和/或治疗胰腺癌的药物的药物。

在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器、第三容器是相同或不同的容器。

在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含ERBB2基因或其蛋白的抑制剂的单方制剂。

在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含KRAS抑制剂的单方制剂。

在另一优选例中，所述的第三容器的药物是含其他预防和/或治疗胰腺癌的药物的单方制剂。

在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书。

在另一优选例中，所述说明书记载了选自下组的一个或多个说明：

(a)将ERBB2基因或其蛋白的抑制剂预防和/或治疗胰腺癌的方法；

(b)将ERBB2基因或其蛋白的抑制剂与KRAS抑制剂、和/或其他预防和/或治疗胰腺癌药物联用来预防和/或治疗胰腺癌的方法；

(c)检测胰腺癌患者的ERBB2蛋白的表达水平或ERBB2蛋白的突变状况，同时施用ERBB2基因或其蛋白的抑制剂来预防和/或治疗胰腺癌的方法；

(d)检测胰腺癌患者的ERBB2蛋白的表达水平或ERBB2蛋白的突变状况，同时联用ERBB2基因或其蛋白的抑制剂；和KRAS抑制剂、和/或其他预防和/ 或治疗胰腺癌药物来预防和/或治疗胰腺癌的方法。

本发明第八方面提供了一种本发明第六方面所述的药物组合物或本发明第七方面所述的药盒的用途，用于预防和/或治疗胰腺癌。

在另一优选例中，所述药物组合物中，ERBB2基因或其蛋白的抑制剂的作用浓度为40-400000ng/ml，较佳地，400-40000ng/ml，更佳地，2000-8000ng/ml。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述KRAS抑制剂的作用浓度为 10-100000ng/ml，较佳地，100-10000ng/ml，更佳地，500-2000ng/ml。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述其他预防和/或治疗胰腺癌的药物的作用浓度为10-100000ng/ml，较佳地，100-10000ng/ml，更佳地，500-2000 ng/ml。

在另一优选例中，所述药物组合物或药盒包括(a)ERBB2基因或其蛋白的抑制剂；和(b)任选的KRAS抑制剂；和(c)任选的其他预防和/或治疗胰腺癌的药物；和(d)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物或药盒中，所述ERBB2基因或其蛋白的抑制剂；和(b)任选的KRAS抑制剂；和(c)任选的其他预防和/或治疗胰腺癌的药物占所述药物组合物或药盒总重的0.01-99.99wt％,较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

本发明第九方面提供了一种预防和/或治疗原胰腺癌的方法，包括：

给需要的对象施用ERBB2基因或其蛋白的抑制剂；或本发明第六方面所述的药物组合物或本发明第七方面所述的药盒。

在另一优选例中，所述对象包括患有胰腺癌的人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。

在另一优选例中，所述ERBB2基因或其蛋白的抑制剂的施用剂量为 0.24-2400mg/kg体重，较佳地为2.4-240mg/kg体重，最佳地为12-48mg/kg体重。

在另一优选例中，所述KRAS抑制剂的施用剂量为0.06-600mg/kg体重，较佳地为0.6-60mg/kg体重，最佳地为3-12mg/kg体重。

在另一优选例中，所述其他预防和/或治疗胰腺癌的药物的施用剂量为 0.06-600mg/kg体重，较佳地为0.6-60mg/kg体重，最佳地为3-12mg/kg体重。

在另一优选例中，所述ERBB2基因或其蛋白的抑制剂的施用频率为1-4 次/天，较佳地为1-2次/天。

在另一优选例中，所述KRAS抑制剂的施用频率为1-4次/天，较佳地为 1-2次/天。

在另一优选例中，所述其他预防和/或治疗胰腺癌的药物的使用频率为1-4 次/天，较佳地为1-2次/天。

在另一优选例中，所述ERBB2基因或其蛋白的抑制剂的相邻2次施用的间隔时间为为6小时以上，较佳地为12小时以上，最佳地为24小时以上。

在另一优选例中，所述KRAS抑制剂的相邻2次施用的间隔时间为6小时以上，较佳地为12小时以上，最佳地为24小时以上。

在另一优选例中，所述其他预防和/或治疗胰腺癌的药物的相邻2次施用的间隔时间为为6小时以上，较佳地为12小时以上，最佳地为24小时以上。

在另一优选例中，所述ERBB2基因或其蛋白的抑制剂与任选的KRAS抑制剂、和任选的其他预防和/或治疗胰腺癌的药物同时或先后施用。

本发明第十方面提供了一种体外非治疗性的抑制胰腺癌生长或增殖的方法，包括步骤：在ERBB2基因或其蛋白抑制剂的存在下，培养胰腺癌细胞，从而抑制胰腺癌细胞的生长或增殖。

在另一优选例中，所述胰腺癌细胞高表达ERBB2蛋白。

在另一优选例中，所述胰腺癌细胞表达突变的ERBB2蛋白。

在另一优选例中，所述方法还包括向胰腺癌细胞的培养体系中添加KRAS 抑制剂；和/或其他预防和/或治疗胰腺癌的药物，从而抑制胰腺癌细胞的生长或增殖。

在另一优选例中，所述胰腺癌细胞为体外培养的细胞。

本发明第十一方面提供了一种筛选预防和/或治疗胰腺癌的候选化合物的方法，所述方法包括步骤：

(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中ERBB2的表达量(E1)和/或活性(A1)；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中ERBB2的表达量 (E0)和/或活性(A0)；

其中，如果测试组中细胞的ERBB2的表达量(E1)和/或活性(A1)显著低于对照组，就表明该测试化合物是对ERBB2的表达和/或活性有抑制作用的预防和/或治疗胰腺癌的候选化合物。

在另一优选例中，所述的ERBB2的表达量是通过RT-PCR或免疫组织化学检测而得出的。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对胰腺癌细胞生长或增殖的抑制作用；和/或进一步测试其对ERBB2基因是否有下调的作用。

在另一优选例中，在步骤(b)中包括步骤：测试组中，胰腺癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察胰腺癌细胞的数量和/或生长情况；在对照组中，在胰腺癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察胰腺癌细胞的数量和/或生长情况；其中，如果测试组中胰腺癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对胰腺癌细胞的生长或增殖有抑制作用的预防和/或治疗胰腺癌细胞的候选化合物。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(a)中所确定的候选化合物施用于哺乳动物模型，测定其对哺乳动物的影响。

在另一优选例中，所述哺乳动物为患有胰腺癌的哺乳动物。

在另一优选例中，所述“显著低于”指E1/E0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。

在另一优选例中，所述“显著低于”指A1/A0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。

在另一优选例中，所述细胞包括胰腺癌细胞。

在另一优选例中，所述胰腺癌细胞包括胰腺导管腺癌细胞。

在另一优选例中，所述细胞为体外培养的细胞。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)中 ERBB2基因突变情况。A，在293例PDAC病人中ERBB2基因突变频率。293 例病人基因组测序数据来自TCGA Pan-Cancer Atlas program(n＝184)和UTSW PDAC sequencing program(n＝109)。B,PDAC病人ERBB2和KRAS基因突变情况图示。C，TCGA和COSMIC数据库中ERBB2基因错义突变在ERBB2 蛋白结构域上的分布。ECD,胞外结构域；TM,跨膜结构域；TKD,蛋白激酶结构域；SD,C端信号结构域。D，ERBB2基因扩增的PDAC病人具有较高的 ERBB2mRNA表达。采用TCGA PDAC数据(n＝184)，x轴显示ERBB2基因拷贝数(每一个点代表一位病人)。y轴显示PDAC病人样本中ERBB2的 RNA表达量。E，根据ERBB2表达量对PDAC病人进行Kaplan-Meier生存分析，数据来自TCGA PAAD(左)和GES21501(右)数据库。

图2显示了ERBB2突变导致人胰腺上皮细胞发生致癌转化。A，人胰腺上皮细胞系(HPNE)感染ERBB2野生型(WT)或者突变病毒，收样后取30ug蛋白进行Western blotting检测。EV代表对照空载体组。B，柱状图显示在Fig 2A 中以WT条带为基准的蛋白条带定量的值。C-D，ERBB2突变促进HPNE细胞锚定不依赖生长。将HPNE细胞或者KRAS^G12D激活突变转化的HPNE细胞感染ERBB2WT或者突变病毒，铺板到软琼脂中(做3组重复)，培养21天后采用噻唑蓝(MTT)染色。图中显示典型的孔板(C)和平均克隆数量(D)(平均数±标准差)。E-G，ERBB2突变促进HPNE-KRAS在裸鼠体内的移植瘤生长。图中显示肿瘤生长曲线(E)，肿瘤大小拍照(F)和肿瘤称重(G)。误差线为5个重复样本平均值±标准误。#，与ERBB2WT相比具有统计学差异。 *，与EV相比具有统计学差异。

图3显示了ERBB2突变促进PDAC细胞ERBB2信号通路激活，细胞锚定不依赖生长和体内移植肿瘤的生长。A，人PDAC细胞系HPAFII感染ERBB2野生型(WT)或者突变病毒，收样后取30ug蛋白进行Western blotting检测。B，柱状图显示在Fig 3A中以WT条带为基准的蛋白条带定量的值。C-D，ERBB2 突变促进HPAFII细胞锚定不依赖生长。将HPAFII细胞转导ERBB2WT或者突变病毒，铺板到软琼脂中(做3组重复)，培养5周后采用噻唑蓝(MTT) 染色。图中显示典型的孔板(C)和平均克隆数量(D)(平均数±标准差)。 E-G，ERBB2突变促进HPAFII细胞在裸鼠体内的移植瘤生长。图中显示肿瘤生长曲线(E)，肿瘤大小拍照(F)和肿瘤称重(G)。误差线为4个重复样本平均值±标准误。#，与ERBB2WT相比具有统计学差异。*，与EV相比具有统计学差异。

图4显示了在ERBB2扩增的PDAC细胞CAPAN1中敲除ERBB2基因抑制 ERBB2信号、集落形成、锚定不依赖生长和体内移植肿瘤的生长。A，一系列 PDAC细胞中ERBB2基因转录水平，采用FPKM值表示。B，在一系列PDAC 细胞系中采用Western blotting检测ERBB2蛋白表达水平。C，Western blotting 检测显示ERBB2敲除导致AKT磷酸化降低。D-E，ERBB2基因沉默抑制PDAC 细胞克隆形成能力。CAPAN1细胞导入ERBB2 sgRNA或者对照质粒，铺板到六孔板中，培养3周采用结晶紫染色。图中显示典型的孔(D)和细胞融合度相对定量(E)。F-G，ERBB2敲除导致PDAC细胞锚定不依赖生长降低。在 CAPAN1细胞中导入ERBB2 sgRNA或者对照质粒，铺板到软琼脂中(做3个复孔)，培养21天并采用MTT进行染色。图中显示典型的孔(F)和平均克隆数量(G)(平均值±标准差)。H-J，ERBB2敲除导致CAPAN1裸鼠移植瘤生长受到抑制。图中显示肿瘤生长曲线(H)，肿瘤大小拍照(I)和肿瘤称重 (J)。误差线为5个重复样本平均值±标准误。

图5显示了ERBB2V777L和V842I突变降低PDAC细胞对KRAS基因的依赖性。A-C，根据显微镜明场拍照和集落形成实验，ERBB2V777L和V842I 突变减弱KRAS敲低导致的HPAFII细胞生长抑制。将转导过EV，ERBB2WT 或者突变的HPAFII细胞铺板到6孔板中，再感染KRASshRNA或者PLKO对照。在病毒感染后8天和11天拍照。比例尺为500μm。D，采用Westernblotting 检测Fig 5A中的细胞蛋白变化。E，柱状图显示在Fig 5D中以WT条带为基准的蛋白条带定量的值。

图6、ERBB2突变对ERBB2抑制剂neratinib敏感。A，ERBB2突变在软琼脂集落形成实验中对药物的敏感性。将导入ERBB2WT或者突变的HPNE 细胞铺板到六孔板中(三个复孔)，并采用500nmol/L neratinib或者等量DMSO 处理，每周两次。克隆生长5周后采用MTT进行染色。B-C，将导入ERBB2WT 或者V777L和V842I突变HPNE细胞铺板到六孔板中(三个复孔)，然后采用 62.5、125、250、500nmol/L neratinib或者等量DMSO处理5周，每周两次。Neratinib对克隆数量的影响进行定量并作图。D，将导入ERBB2WT或者V777L 和V842I突变的HPAFII细胞采用KRAS抑制(采用KRAS shRNA敲低)， neratinib(250nmol/L)或者两者合并(neratinib+KRAS敲低)处理。细胞增殖抑制采用显微镜明场拍照图片展示。比例尺为500μm。E，Neratinib可以有效的抑制转导了ERBB2WT或者V777L和V842I突变的HPAFII细胞ERBB2和 AKT磷酸化。在HPAFII细胞中感染ERBB2WT或者突变慢病毒，然后采用0、 250和500nM neratinib处理4h，收取蛋白采用Western blotting检测。

图7、联合使用ERBB2抑制剂neratinib和KRAS抑制剂ARS-1620可以有效抑制胰腺癌中AKT和MAPK的激活。将MIAPaCa2细胞感染ERBB2WT 或者突变慢病毒，然后采用500nMneratinib、1000nM ARS-1620或者500nM neratinib+1000nM ARS-1620处理6h，然后收取蛋白采用Western blotting检测。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在胰腺癌中存在 ERBB2的基因或其蛋白突变，而在正常组织中没有ERBB2的基因或其蛋白突变。因此，可根据ERBB2基因可用作检测胰腺癌的标志物。并且，申请人还意外的发现，ERBB2基因或其蛋白的抑制剂可有效治疗胰腺癌，并且，ERBB2基因或其蛋白的抑制剂可与KRAS抑制剂、和/或其他预防和/或治疗胰腺癌的药物联用，并且对胰腺癌的治疗有显著的协同效果。在此基础上，本发明人完成了本发明。

如本文所用，术语“ARS-1620”的分子式为C21H17ClF2N4O2，结构式为

如本文所用，术语“ARS-853”的分子式为C22H29ClN4O3，结构式为

如本文所用，术语“Deltarasin”的分子式为C21H17ClF2N4O2，结构式为

如本文所用，术语“6H05”的分子式为C20H30ClN3O2S3.CF3COOH，结构式为

如本文所用，术语“Fendiline hydrochloride”的分子式为C23H25N.HCl，结构式为

如本文所用，术语“KRpep-2d”的分子式为C108H182N44O25S2，结构式为

如本文所用，术语“K-Ras(G12C)inhibitor 9”的分子式为C16H21ClIN3O4S，结构式为：

如本文所用，术语“K-Ras(G12C)inhibitor 12”的分子式为C15H17ClIN3O3，结构式为：

如本文所用，术语“K-Ras(G12C)inhibitor 6”的分子式为C17H22Cl2N2O3S，结构式为：

如本文所用，术语“Neratinib”的分子式为C30H29ClN6O3，结构式为：

如本文所用，术语“Mubritinib”的分子式为C25H23F3N4O2，结构式为：

如本文所用，术语“Afatinib”的分子式为C24H25ClFN5O3，结构式为：

如本文所用，术语“Canertinib”的分子式为C24H25ClFN5O3，结构式为：

如本文所用，术语“Lapatinib”的分子式为C29H26ClFN4O4S，结构式为：

如本文所用，术语“Irbinitinib”的分子式为C26H24N8O2，结构式为：

如本文所用，术语“Varlitinib”的分子式为C22H19ClN6O2S，结构式为：

如本文所用，术语“Sapitinib”的分子式为C23H25ClFN5O3，结构式为：

如本文所用，术语“Poziotinib”的分子式为C23H21Cl2FN4O3，结构式

为

如本文所用，术语“Dacomitinib”的分子式为C24H25ClFN5O2，结构式为：

如本文所用，术语“CP-724714”的分子式为C27H27N5O3，结构式为：

如本文所用，术语“Tyrphostin AG 879”的分子式为C18H24N2OS，结构式为

如本文所用，术语“AEE788”的分子式为C27H32N6，结构式为

如本文所用，术语“AC480”的分子式为C27H27FN8O3，结构式为

如本文所用，术语“Trastuzumab”曲妥珠单抗是人源重组的ERBB2抗体抑制剂，与ERBB2的胞外区域相结合。MW:145.53KD。

如本文所用，术语“Pertuzumab”是一种人源单克隆抗体，抑制ERBB2 二聚化、破坏ERBB2与其他ERBB家族成员结合的能力。MW:148KD。

如本文所用，术语“FOLFIRINOX组合药”包含oxaliplatin、irinotecan、fluorouracil和folinic acid。

其中，“oxaliplatin”的分子式为C8H14N2O4Pt，结构式为

“irinotecan”的分子式为C33H38N4O6.HCl.3H2O，结构式为

“fluorouracil”的分子式为C4H3FN2O2，结构式为

“folinic acid”的分子式为C20H21N7O7.Ca，结构式为

胰腺癌

胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤，其发病率逐年增加，在全球男性癌症死亡率中排名第八，女性癌症死亡率中排名第九。在胰腺癌中，比例最高的是起源于胰腺上皮的胰腺导管腺癌，占比90％左右。胰腺导管腺癌很难在早期被诊断发现，多数发现时均已处于中晚期。目前，外科手术是常用的治疗方法，但临床诊断为胰腺导管腺癌的患者仅约20％具有手术指证，绝大部分为不可切除或晚期胰腺癌。即使是首诊获手术切除的患者，其中位生存时间在16～20月，最终出现复发或转移。遗憾的是，目前尚无很好的提高胰腺癌的治疗方法。虽然已经有很多研究致力于胰腺癌的治疗，但在过去的50年里，其五年生存率仍然低于5％。

样品

本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样品可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。样品也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触方式使得对样品进行的测试可以提供与受试者有关的信息。样品也可以是已经与其它材料接触过的材料，这种其它材料不是受试者的，但是能够使第一材料随后被测试以确定与受试者有关的信息，例如样品可以是探针或解剖刀的清洗液。样品可以为接触受试者之外的生物材料源，只要本技术领域的专业人员仍然能够从样品确定与受试者有关的信息就行。

表达

如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cDNA，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。

参比值

如本文所用，术语“参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参比值是根据对比较ERBB2蛋白的表达与已知的临床结果的研究进行的统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。

在本发明中，所述参比值指截断值(cut-off值)，指实体瘤中ERBB2的相对表达水平，优选相对表达水平为1.5(平均值)。

ERBB2蛋白和多核苷酸

在本发明中，术语“本发明蛋白”、“ERBB2蛋白”、“ERBB2多肽”可互换使用，都指具有ERBB2氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的ERBB2蛋白。此外，该术语还包括全长的ERBB2及其片段。本发明所指的ERBB2蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。

ERBB2(erb-b2receptor tyrosine kinase 2)蛋白为原癌基因erbB-2编码的185kDa的细胞膜受体，为表皮生长因子受体EGFR家族成员之一。

人的ERBB2蛋白全长为1255个氨基酸(登录号为NP_004439)。鼠的ERBB2 蛋白全长为1256个氨基酸(登录号为NP_001003817)。

在本发明中，术语“ERBB2基因”、“ERBB2多核苷酸”可互换使用，都指具有ERBB2核苷酸序列的核酸序列。

人ERBB2基因的基因组全长53kbp(NCBI GenBank登录号为2064)，其转录产物mRNA序列全长4545bp(NCBI GenBank登录号为NM_004448)。

鼠ERBB2基因的基因组全长33kbp(NCBI GenBank登录号为13866)，其转录产物mRNA序列全长5012bp(NCBI GenBank登录号为NM_001003817)。

人和鼠ERBB2，在DNA水平的相似性为86％，蛋白序列相似性为88％。

需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。

在得到了ERBB2的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的ERBB2核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA 分子(如载体)和细胞中。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的ERBB2多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人ERBB2多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，ERBB2多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含ERBB2编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用 MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

基因突变

基因突变(DNA序列变异，gene mutation)是由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或替换，而引起的基因结构的改变。

基因上发生基因突变的位点即为本文中的突变位点，在突变位点上可以发生碱基的增添、缺失或替换。

如“chr11:g.67051695A>C”表示在人第11号染色体上的g.67051695位点由A 突变为了C。

“chr11:g.64577368_64577374(GCGGGTC)>-”表示在人第11号染色体上的g.64577368至64577374位点的GCGGGTC缺失。

“chr19:g.14938120->T”表示在人第19号染色体上的g.14938120位点增添了碱基T。

一类典型的基因突变是SNV，即单核苷酸变异，尤其是导致氨基酸突变的 SNV。

在本发明中，以下述核苷酸突变为例，进行说明。

其中，c.308G>A指ERBB2编码基因(Coding sequence,CDS)的第308 位的G突变为A。

c.649C>T指ERBB2编码基因(Coding sequence,CDS)的649位的C突变为T。

c.1269_1271CGT>AAA指ERBB2编码基因(Coding sequence,CDS)的 1269-1271位的CGT突变为AAA。

c.2091_2093delGGA指ERBB2编码基因(Coding sequence,CDS)的 2091-2093位的CGA缺失突变。

c.2324_2325insATACGTGATGGC指ERBB2编码基因(Coding sequence, CDS)的2324位和2325位之间插入ATACGTGATGGC。

此外，在本发明中，还存在氨基酸突变的情况，以下述为例。

如p.R103Q指ERBB2蛋白编码序列(NP_001003817)的103位的R突变为Q。

p.S423_V424>RN指ERBB2蛋白编码序列(NP_001003817)的423-424 位的SV突变为RN。

p.E698del指ERBB2蛋白编码序列(NP_001003817)的698位的E发生缺失突变。

p.A775_G776insYVMA指ERBB2蛋白编码序列(NP_001003817)的775 位的A和776位的G之间插入YVMA。

单核苷酸变异(SNV)

单核苷酸变异是人类基因组中的DNA序列变异，在各种生物学和生物医学的应用中获得了越来越多的重要性。SNVs可以用来探索人类种群进化历史、分析法医样品，因此在遗传学中发挥重要作用。药物遗传学利用这些DNA变异来阐明构成不同药物功效或不良事件的基础遗传因素。

本发明涉及鉴定特定疾病的单核苷酸变异(SNVs)，其明确鉴定为与胰腺癌相关，因此，或者在疾病症状存在之前，可以对这些个体进行干预，例如饮食改变，锻炼和/或药物治疗。鉴定涉及胰腺癌的SNVs有助于更好的理解疾病过程，改善诊断试剂和治疗试剂。

如本文所用，术语“SNV”是指在个体群体之间不同的人类基因组中特定位置上的单核苷酸变异。在本发明中，SNV可以通过它的名称或通过位于特定序列的位置来确定。如SNV“[G/A]”表示在该序列的该位置的核苷酸碱基(或等位基因)可以是鸟嘌呤或腺嘌呤。

如本文所用，INDEL插入缺失标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。

如本文所用，本发明公开的核苷酸序列包括所述核苷酸序列的互补序列。另外，术语“SNV”包括在一组等位基因中的任何等位基因。

如本文所用，术语“等位基因”是指在定义SNV的核苷酸选择中特定的核苷酸。

如本文所用，术语“风险等位基因”是指与胰腺癌疾病关联的等位基因。

如本文所用，术语“单倍型”是指来自于两个或多个SNVs的具体等位基因的组合。

如本文所用，术语“风险状态单倍型”是指与胰腺癌疾病相关联的单倍型。

各具体基因及其所含的突变位点见表A。

表A

如无特殊说明，本发明中基因位点编号依据人类基因组序列(UCSC)hg19 版本。

各具体的氨基酸突变位点见表B。

表B

其中，氨基酸位置编号基于野生型人ERBB2蛋白序列(NP_004439)。

含突变位点的多核苷酸

本发明还提供了含本发明所述突变位点的多核苷酸。在本发明的一个优选地实施方式中，本发明还提供了含有所述多核苷酸的载体、宿主细胞。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的多态式。多核苷酸可以含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、和/或它们的类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，包括单链、双链和三螺旋分子结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。如以下非限制性实施例：基因或基因片段、外显子、内含子、 mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针、引物。多核苷酸也可以包括经修饰的核酸分子，如甲基化核酸分子和核酸分子类似物。

在另一优选例中，所述的多核苷酸本身还可以包括检测所述多核苷酸的检测试剂，包括引物、探针、扩增产物、或质粒。

如本文所用，术语“基本分离的”或“分离的”多核苷酸是指基本没有天然的相关序列的多核苷酸。基本上没有是指至少50％、较优地至少70％、更优地至少80％或最优地至少90％不含其它天然相关物质。“分离的多核苷酸”还包括重组的多核苷酸。

如本文所用，术语“在严格条件下杂交”意在描述杂交条件，在该条件下，彼此至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％相同的核苷酸序列典型地彼此保持杂交。这些严格的条件是本领域技术人员已知的并且可以在Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y(1989)中找到。严格杂交的一个非限制性实例是在约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC) 中杂交，接着在0.2xSSC，0.1％SDS中在50-65℃下一次或多次洗涤。

如本文所用，术语“引物”是指在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

如本文所用，术语“载体”是指可以携带插入的DNA并且可以为维持在宿主细胞中的DNA分子。载体也可以为克隆载体，克隆媒介物等。术语“载体” 包括主要功能为将核酸分子插入到细胞中的载体，主要功能在于复制核酸的复制载体，和用于转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体，还包括提供多余一种上述功能的载体。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是载体或核酸分子和/或蛋白质整合的接受体。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，并且由于天然的、随机的或有意突变，所述子代可能未必与亲代完全相同(在形态上或在总DNA互补序列上)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸转染的细胞。“分离的宿主细胞”是指已经与它来源的生物在物理上分离的宿主细胞。

特异性抗体

在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗ERBB2的特异性抗体”可互换使用。

本发明还包括对人ERBB2多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人ERBB2基因产物或片段。较佳地，指那些能与人ERBB2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人ERBB2蛋白的分子，也包括那些并不影响人ERBB2蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人ERBB2基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链 Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人ERBB2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人ERBB2蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975； Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292, 1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人ERBB2蛋白功能的抗体以及不影响人ERBB2蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人ERBB2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人ERBB2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞 (例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人ERBB2蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是组织样本或血清样本)中的人ERBB2蛋白。由于ERBB2蛋白存在胞外区，因此在胞外区脱落并进入血液的情况下，这些可溶性的ERBB2胞外区就可成为血清检测的靶对象。

检测方法

利用突变的ERBB2存在于胰腺癌的实体瘤组织中和体液(优选血清或血液) 中，且与胰腺癌的危险度密切相关这一特点，本发明还提供了检测胰腺癌的方法。

在本发明的一个优选例中，本发明提供一种检测突变的ERBB2的高通量二代测序法以及Sanger测序、荧光定量PCR(qPCR)、单核苷酸多态性(SNP) 基因组分析、原位免疫荧光法(FISH)等。

检测试剂盒

基于突变的ERBB2与胰腺癌的相关性，即突变的ERBB2存在于胰腺癌实体瘤组织中和体液(优选血液或血清)中，因此突变的ERBB2可以作为胰腺癌的一种诊断标志物。

本发明还提供了一种检测胰腺癌的诊断试剂盒，它含有检测ERBB2基因、 mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测胰腺癌；

其中，所述的标签或说明书注明以下内容：

(i)检测胰腺癌；和/或

(ii)区分胰腺癌和癌旁组织；和/或

(iii)区分胰腺癌的恶性程度。

应理解，在本发明首次揭示了本发明突变位点与胰腺癌的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含所述突变位点的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在这些突变位点。

通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补 (尤其是引物的5'端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明突变位点的对应位置。

虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为 100-3000bp，较佳地为150-2000bp，更佳地为200-1000bp。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现，在胰腺癌中存在ERBB2的突变(如错义突变、缺失突变、插入突变、点突变、基因扩增、基因融合等)，而正常组织中不存在。

(2)本发明首次发现，ERBB2(尤其是突变的ERBB2)可用作检测胰腺癌的标志物。

(3)本发明首次发现，ERBB2基因的相对表达随着胰腺癌患者风险程度的增加而降低。

(4)本发明首次发现，ERBB2的突变可促进人胰腺上皮细胞发生致癌转化、胰腺癌的生长、促进胰腺癌的细胞生长、促进PDAC细胞ERBB2信号通路激活、细胞锚定不依赖生长和体内移植肿瘤的生长。

(5)本发明首次发现，ERBB2基因或其蛋白的抑制剂可有效抑制ERBB2 信号、集落形成、锚定不依赖生长和体内移植肿瘤的生长。

(6)本发明首次发现，ERBB2基因或其蛋白的抑制剂可有效治疗胰腺癌。

(7)本发明首次发现，ERBB2基因或其蛋白的抑制剂可与KRAS抑制剂、和/或其他预防和/或治疗胰腺癌的药物(如吉西他滨)联用，从而有效治疗胰腺癌，并且有协同效果。

(8)本发明首次发现，ERBB2的突变可降低胰腺癌细胞(如PDAC细胞) 对KRAS基因的依赖性，从而减弱KRAS抑制带来的治疗效果。

(9)本发明首次发现，ERBB2的突变对ERBB2抑制剂敏感。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。

通用方法

(1)ERBB2突变质粒构建：ERBB2野生型质粒购自GeneCopoeia^TM (#EX-Z2866-Lv105)。采用QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (#210518)构建ERBB2 R103Q、R217C、S310F、S423R、S423_V424>RN、V424D、 R678Q、Q679L、E698Del、E717D、T718M、L755S、R849W、V777L、V842I 等突变质粒。ERBB2 sgRNA序列采用Opimized CRISPRDesign web tool (http://crispr.mit.edu/)设计，克隆插入lentiCRISPRv2 vector(Addgene,plasmid #52961)。KRAS G12D编码序列通过RT-PCR扩增得到，并克隆插入pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒表达质粒(System biosciences#CD510B-1)。

(2)Cell Titer-

Luminescent Cell Viability Assay检测细胞增殖：将感染ERBB2突变质粒过表达载体病毒的胰腺癌细胞铺板到96孔板中，测定感染病毒后6d的cell viability，酶标仪检测发光值，绘制细胞生长曲线。

(3)平板集落形成实验：将CAPAN1细胞感染ERBB2 sgRNA病毒，然后按照1500/孔铺板6孔板中，培养3周后采用多聚甲醛固定15min，结晶紫染色3h，扫描仪进行扫描。

(4)软琼脂克隆形成实验：将HPNE、HPAFII细胞感染ERBB2突变质粒表达病毒，然后按照一定数量铺板到0.4％top agar中，下层胶为0.6％bottom agar，每周补充两次200ul新鲜培养基，培养3周后采用1mg/ml MTT染色3hr，采用扫描仪扫描，并计算克隆数量。

(5)Western blotting检测：加入蛋白裂解缓冲液与蛋白酶抑制剂裂解细胞，采用细胞刮刀将细胞刮下，4℃摇床过夜后13000rpm离心30min，取上清采用BCA法测定蛋白含量，将蛋白浓度调整至2ug/ul，取30ug蛋白进行Western blotting检测。反应条件为10％SDS-PAGE，120V电泳，100V 80min转膜，5％BSA 封闭1h，一抗孵育过夜，二抗孵育2h，ECL发光检测。

(6)裸鼠成瘤实验：将HPAFII、CAPAN1、KRAS-HPNE细胞按照2×10⁶细胞/只接种于6周龄BALB-C裸鼠腋下，每隔3d测定肿瘤大小一次，三周后处死小鼠并剥取肿瘤拍照称重，肿瘤大小计算公式为V＝(L×W2)/2。

实施例1胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)中 ERBB2基因突变情况分析

实验步骤：

1)根据TCGA数据库分析PDAC病人中ERBB2基因突变情况，包括基因扩增、突变等；

2)根据TCGA数据库和COSMIC数据库对PDAC病人中ERBB2基因错义突变情况进行分析；

3)根据PROGgeneV2数据库 (http://watson.compbio.iupui.edu/chirayu/proggene/database/index.php)对ERBB2基因表达与PDAC患者预后的相关性进行分析。

实验结果如图1所示。结果表明胰腺癌患者肿瘤组织中含有ERBB2基因错义突变、基因扩增等，基因扩增导致胰腺癌病人ERBB2mRNA表达增加，ERBB2 表达高的患者预后差。其中，图1A，在293例PDAC病人中ERBB2基因突变频率。293例病人基因组测序数据来自TCGAPan-Cancer Atlas program(n＝184)和 UTSW PDAC sequencing program(n＝109)。图1B,PDAC病人ERBB2和KRAS基因突变情况图示。图1C，TCGA和COSMIC数据库中ERBB2基因错义突变在 ERBB2蛋白结构域上的分布。ECD,胞外结构域；TM,跨膜结构域；TKD,蛋白激酶结构域；SD,C端信号结构域。图1D，ERBB2基因扩增的PDAC病人具有较高的ERBB2mRNA表达。采用TCGA PDAC数据(n＝184)，x轴显示ERBB2基因拷贝数(每一个点代表一位病人)。y轴显示PDAC病人样本中ERBB2的RNA 表达量。图1E，根据ERBB2表达量对PDAC病人进行Kaplan-Meier生存分析，数据来自TCGA PAAD(左)和GES21501(右)数据库。

实施例2

ERBB2突变导致人胰腺上皮细胞(HPNE)发生致癌转化

实验步骤：

1)在HPNE细胞中导入ERBB2突变，western blotting检测pERBB2,pEGFR 变化；

2)在HPNE细胞或者KRAS^G12D转化的HPNE细胞中导入ERBB2突变，采用软琼脂集落形成实验检测细胞克隆形成能力的变化；

3)在KRAS^G12D转化的HPNE细胞中导入EV，ERBB2WT或者V777L和 V842I突变，皮下接种到裸鼠，测量体内肿瘤形成能力的变化。

结果如图2所示，结果表明ERBB2能够促进HPNE细胞发生致癌转化，并且与KRAS激活突变具有协同作用。其中，图2A，人胰腺上皮细胞系(HPNE) 感染ERBB2野生型(WT)或者突变病毒，收样后取30ug蛋白进行Western blotting检测。EV代表对照空载体组。图2B，柱状图显示在图2A中以WT条带为基准的蛋白条带定量的值。图2C-2D，ERBB2突变促进HPNE细胞锚定不依赖生长。将HPNE细胞或者KRAS^G12D激活突变转化的HPNE细胞感染ERBB2 WT或者突变病毒，铺板到软琼脂中(做3组重复)，培养21天后采用噻唑蓝 (MTT)染色。图2中显示典型的孔板(C)和平均克隆数量(D)(平均数± 标准差)。图2E-2G，ERBB2突变促进HPNE-KRAS在裸鼠体内的移植瘤生长。图2中显示肿瘤生长曲线(E)，肿瘤大小拍照(F)和肿瘤称重(G)。误差线为5个重复样本平均值±标准误。#，与ERBB2WT相比具有统计学差异。*，与EV相比具有统计学差异。

实施例3

ERBB2突变促进PDAC细胞ERBB2信号通路激活，细胞锚定不依赖生长和体内移植肿瘤的生长

实验步骤：

1)在PDAC细胞系HPAFII中导入ERBB2突变，western blotting检测 pERBB2,pAKT变化；

2)在PDAC细胞系HPAFII细胞中导入ERBB2突变，采用软琼脂集落形成实验检测细胞克隆形成能力的变化；

3)在PDAC细胞系HPAFII细胞中导入EV，ERBB2WT或者V777L和 V842I突变，接种到裸鼠腋下，测量肿瘤形成能力的变化。

结果如图3所示。结果表明ERBB2激活突变可以促进胰腺癌细胞恶性进展。其中图3A，PDAC细胞系HPAFII感染ERBB2野生型(WT)或者突变病毒，收样后取30ug蛋白进行Western blotting检测。图3B，柱状图显示在图3A中以WT条带为基准的蛋白条带定量的值。图3C-3D，ERBB2突变促进HPAFII 细胞锚定不依赖生长。将HPAFII细胞转导ERBB2WT或者突变病毒，铺板到软琼脂中(做3组重复)，培养5周后采用噻唑蓝(MTT)染色。图3中显示典型的孔板(C)和平均克隆数量(D)(平均数±标准差)。图3E-3G，ERBB2 突变促进HPAFII细胞在裸鼠体内的移植瘤生长。图3中显示肿瘤生长曲线(E)，肿瘤大小拍照(F)和肿瘤称重(G)。误差线为4个重复样本平均值±标准误。 #，与ERBB2WT相比具有统计学差异。*，与EV相比具有统计学差异。

实施例4

在ERBB2扩增的PDAC细胞中敲除ERBB2基因抑制ERBB2信号、集落形成、锚定不依赖生长和体内移植肿瘤的生长

实验步骤：

1)采用RNA-seq测定一系列PDAC细胞系ERBB2mRNA表达；

2)采用Western blotting检测一系列PDAC细胞系ERBB2蛋白表达；

3)构建ERBB2基因敲除CRISPR/Cas9sgRNA质粒，包装慢病毒，感染 CAPAN1细胞，Western blotting检测ERBB2和pAKT表达变化；

4)在CAPAN1细胞中采用ERBB2CRISPR/Cas9sgRNA质粒进行ERBB2 基因敲除，采用平板集落形成实验，软琼脂集落形成实验和裸鼠移植瘤形成实验测定变化。

结果如图4所示，结果表明ERBB2基因扩增会导致胰腺癌细胞恶性进展。其中图4A，一系列PDAC细胞中ERBB2基因转录水平，采用FPKM值表示。图4B，在一系列PDAC细胞系中采用Western blotting检测ERBB2蛋白表达水平。图4C，Western blotting检测显示ERBB2敲除导致AKT磷酸化降低。图 4D-4E，ERBB2基因沉默抑制PDAC细胞克隆形成能力。CAPAN1细胞导入 ERBB2 sgRNA或者对照质粒，铺板到六孔板中，培养3周采用结晶紫染色。图4中显示典型的孔(D)和细胞融合度相对定量(E)。图4F-4G，ERBB2 敲除导致PDAC细胞锚定不依赖生长降低。在CAPAN1细胞中导入ERBB2 sgRNA或者对照质粒，铺板到软琼脂中(做3个复孔)，培养21天并采用MTT 进行染色。图4中显示典型的孔(F)和平均克隆数量(G)(平均值±标准差)。如4H-4J，ERBB2敲除导致CAPAN1裸鼠移植瘤生长受到抑制。图4中显示肿瘤生长曲线(H)，肿瘤大小拍照(I)和肿瘤称重(J)。误差线为5个重复样本平均值±标准误。

实施例5

ERBB2突变降低PDAC细胞对KRAS基因的依赖性

实验步骤：

1)构建KRAS shRNA慢病毒，先在HPAFII细胞中导入ERBB2WT或者 V777L和V842I慢病毒，然后再导入KRAS shRNA或者空白对照慢病毒，培养8 天、11天后拍照，并收集蛋白做Western blotting检测蛋白表达的变化。

结果如图5所示，结果表明ERBB2突变导致胰腺癌细胞对KRAS的依赖性降低。图5A-5C，根据显微镜明场拍照和集落形成实验，ERBB2V777L和 V842I突变减弱KRAS敲低导致的HPAFII细胞生长抑制。将转导过EV，ERBB2 WT或者突变的HPAFII细胞铺板到6孔板中，再感染KRAS shRNA或者PLKO 对照。在病毒感染后8天和11天拍照。比例尺为500μm。图5B，采用Western blotting检测图5A中的细胞蛋白变化。图5C，柱状图显示在图5B中以WT条带为基准的蛋白条带定量的值。

实施例6 ERBB2突变对ERBB2抑制剂neratinib敏感

实验步骤：

1)在HPNE细胞中感染ERBB2WT或者突变慢病毒，铺板到软琼脂中，采用不同浓度neratinib处理后采用MTT染色；

2)在HPAFII细胞中感染ERBB2WT或者突变慢病毒，然后再导入KRAS shRNA或者空白对照，采用250nM neratinib处理细胞后拍照；

3)在HPAFII细胞中感染ERBB2WT或者突变慢病毒，然后采用0、250 和500nMneratinib处理4h，然后收取蛋白采用Western blotting检测。

结果如图6所示。结果表明胰腺癌中ERBB2突变可以被neratinib抑制。其中图6A，ERBB2突变在软琼脂集落形成实验中对药物的敏感性。将导入 ERBB2WT或者突变的HPNE细胞铺板到六孔板中(三个复孔)，并采用 500nmol/L neratinib或者等量DMSO处理，每周两次。克隆生长5周后采用 MTT进行染色。图6B-6C，将导入ERBB2WT或者V777L和V842I突变HPNE 细胞铺板到六孔板中(三个复孔)，然后采用62.5、125、250、500nmol/L neratinib 或者等量DMSO处理5周，每周两次。Neratinib对克隆数量的影响进行定量并作图。图6D，将导入ERBB2WT或者V777L和V842I突变的HPAFII细胞采用KRAS抑制(采用KRAS shRNA敲低)，neratinib(250nmol/L)或者两者合并(neratinib+KRAS敲低)处理。细胞增殖抑制采用显微镜明场拍照图片展示。比例尺为500μm。图6E，Neratinib可以有效的抑制转导了ERBB2WT或者V777L和V842I突变的HPAFII细胞ERBB2和AKT磷酸化。在HPAFII细胞中感染ERBB2WT或者突变慢病毒，然后采用0、250和500nM neratinib处理4h，收取蛋白采用Westernblotting检测。

实施例7联合使用ERBB2抑制剂neratinib和KRAS抑制剂ARS-1620 可以有效抑制胰腺癌中AKT和MAPK的激活

实验步骤：

1)将MIAPaCa2细胞感染ERBB2WT或者突变慢病毒，然后采用500nM neratinib、1000nM ARS-1620或者500nM neratinib+1000nM ARS-1620 处理6h，然后收取蛋白采用Western blotting检测。

结果如图7所示。结果表明联合使用ERBB2抑制剂neratinib和KRAS抑制剂ARS-1620可以有效的抑制胰腺癌中AKT和MAPK的激活，从而有效地抑制胰腺癌的生长。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种药物组合物，其特征在于，包括：

(a1) ERBB2基因或其蛋白的抑制剂；

(a2) KRAS抑制剂；和

(b) 药学上可接受的载体。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括：

(c) 其他治疗胰腺癌的药物。

3.一种药盒，包括：

(a1) 第一容器，以及位于所述第一容器中的ERBB2基因或其蛋白的抑制剂，或含有ERBB2基因或其蛋白的抑制剂的药物；

(b1) 第二容器，以及位于所述第二容器中的KRAS抑制剂，或含有KRAS抑制剂的药物。

4.如权利要求3所述的药盒，其特征在于，所述药盒还包括：

(c1) 第三容器，以及位于所述第三容器中的其他预防和/或治疗胰腺癌的药物，或含有其他治疗胰腺癌的药物的药物。

5.一种权利要求1所述的药物组合物或权利要求3所述的药盒的用途，其特征在于，用于制备治疗胰腺癌的药物。