KR101844541B1 - Parp 저해제에 대한 감수성 예측용 신규한 바이오 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Parp 저해제에 대한 감수성 예측용 신규한 바이오 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PARP 저해제에 대한 감수성을 예측하기 위한 신규한 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, p53 유전자 및/또는 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자를 포함하는, PARP(poly ADP ribose polymerase) 저해제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커; 상기 바이오 마커의 유전자 발현 수준; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 키트; PARP 저해제에 대한 감수성 예측 방법; 대상의 PARP 저해제에 대한 감수성 증진제; 및 상기 감수성 증진제 및 PARP 저해제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, PARP 저해제에 대한 감수성 예측 효과가 우수하므로, 본 발명은 대장암 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 신규한 바이오 마커 및 이의 용도{Novel Biomarkers for Predicting Susceptibility to PARP Inhibitor and Uses Thereof}
본 발명은 PARP 저해제에 대한 감수성을 예측하기 위한 신규한 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것이다
일반적으로 항암 요법에서, 항암제를 투여하였을 때의 생체의 반응성은 약제의 표적이 되는 암세포의 이 약제에 대한 감수성에 크게 의존한다. 이러한 암세포의 약제에 대한 감수성은, 암세포마다 크게 상이하다. 이러한 감수성의 차이는, 이 약제의 표적 분자 또는 이에 관련하는 인자의 양적 또는 질적 차이, 또는 약제 내성의 획득 등에 기인한다. 이러한 배경을 근거로, 표적이 되는 암세포가 약제에 대하여 감수성을 나타낼 경우에 특이적으로 나타나는 암세포의 유전적 변화를 확인할 수 있다면, 조기에 약제의 효과 판정, 치료법의 확립, 새로운 치료법의 선택 등이 가능해져 대단히 유익하다. 또한, 치료에 앞서 생체 조직편 등에 의해 취득된 암 조직에서, 통상의 방법에 따라 암세포를 분리한 후 약제 처리를 실시하여, 이 암세포가 약제 감수성인지 여부를 상기 변화에 의해 측정하면, 이 약제에 의한 치료가 유효한지 여부를 미리 예측할 수 있기 때문에 임상적으로 매우 유용하다.
최근 주목 받고 있는 암치료를 위한 신규한 접근법은 합성 치사(synthetic lethality)에 관한 것으로, 합성 치사란 두 개의 유전자(또는 두 유전자 산물들) 중 하나에만 돌연변이가 있는 경우 세포가 생존할 수 있지만, 두 개의 유전자 모두에 돌연변이가 있는 경우에는 세포가 죽음에 이르게 되는 것을 의미한다. 이와 같은 2 종 이상의 돌연변이의 유전적 상호작용으로 사멸을 유도하는 예로는 BRCA1/2와 올라파립을 들 수 있다. 다시 말해, 합성치사는 돌연변이 및 약물이 함께 작용하여 암세포를 사멸시키는 것으로, 암-관련 돌연변이에 의해 합성 치사되는 유전자(또는 유전자 산물)를 타겟팅하면, 암세포만을 사멸시키고 정상적인 세포는 살아남게 된다. 따라서, 합성 치사는 항암 제제의 개발을 위한 프레임워크를 제공한다. 그러나, 합성 치사 유전자들(및 유전자 산물들)의 확인 부재 등으로 인하여 이에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.
한편, 올라파립(Olaparib, AZD2281)은 암세포의 비정상적인 증식을 억제하는 기능을 가진 항암제로, "PARP 단백질"의 저해제이다. PARP는 세포 내 DNA가 손상 받은 경우, 이를 복구(repair)하는 기능을 하는 단백질로, 세포가 DNA의 수리를 마치고, 지속적으로 증식을 할 수 있도록 기여하는데 큰 역할을 수행한다. 올라파립은 이 PARP의 기능을 저해함으로써, 암세포의 증식을 저해한다. 이러한 올라파립은 난소암, 유방암의 표적치료제로 잘 알려져 있으며, 특히 BRCA1, BRCA2의 돌연변이를 유전적으로 가지고 있는 암 환자들에게 효과적인 항암제로 알려져 있다.
즉, 항암제의 효과는 DNA 복구(repair) 능력에 영향을 많이 받으며, 또한, 항암제는 내성과 독성에 관해서 개인차가 상이하므로, 적합한 치료반응성 표식자를 이용한 선별은 항암제 치료의 획기적인 진보를 초래할 수 있다. 이에, 특정 유전자에 따른 개별 항암제의 치료반응성에 관한 연구가 최근 지속적으로 활발하게 전개되고 있다.
그러나 특정약제에 대한 생체반응 관련요소의 복합적 작용, 치료제 및 투여방식의 다양성과 방대한 시료확보의 어려움으로 아직 괄목할 만한 성과가 미약한 현실이다.
이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 대장암에서 항암제인 PARP 저해제에 대한 감수성을 예측할 수 있는 방법을 개발하기 위하여, PARP 저해제 중 하나인 올라파립의 대장암에서의 감수성을 예측하는 바이오 마커로서 DNA 복구(repair)에 관련된 p53 유전자 및 DNA-PK 유전자의 발현 정상 및/또는 억제 양상과 유전자 변이를 분석하였고, 그 결과, 대장암 세포에서 p53 유전자 및/또는 DNA-PK 유전자의 발현 정상 및/또는 억제 양상과 유전자 돌연변이에 따라 올라파립의 약물 감수성으로 인한 세포사멸 정도가 상이한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 키트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 PARP 저해제에 대한 감수성 예측 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 PARP 저해제에 대한 감수성 증진제를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 PARP 저해제에 대한 감수성 증진제 및 PARP 저해제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 PARP 저해제에 대한 감수성 증진제 및 PARP 저해제를 대상에게 공동 투여하는 단계를 포함하는, PARP 저해제에 대한 감수성 증진 방법을 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 p53 유전자(gene bank number: NM_000546.5) 및/또는 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase)(gene bank number: NM_006904.6) 유전자를 포함하는, PARP(poly ADP ribose polymerase) 저해제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커를 제공한다.
본 발명의 가장 큰 특징은 p53 유전자, DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자를 바이오 마커로 이용하여 PARP-1 저해제에 대한 감수성을 예측하는 것이다.
본 발명의 바이오 마커는 항암제에 대한 감수성의 지표가 될 수 있으며, 항암제에 대한 감수성 마커로서의 정확성 및 신뢰도도 탁월하므로 암의 발생, 발전 및/또는 전이의 치료에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "감수성"은 개개의 환자의 암에 대하여 특정약물이 효과를 나타내는 지 여부를 의미한다.
예컨대, 상기 특정약물은 주로 항암제이며, 이들 항암제에는 암의 종류에 따라 효과를 나타내는 경우와 효과를 나타내지 않는 경우가 있다. 또한, 유효한 것으로 인정되고 있는 종류의 암이어도, 개개의 환자에 따라 효과를 나타내는 경우와 효과를 나타내지 않는 경우가 있는 것이 알려져 있다. 이와 같은 개개의 환자의 암에 대해 항암제가 효과를 나타내는 지 여부를 항암제 감수성이라고 한다. 따라서, 본 발명에 따라 치료 개시 전에 효과를 기대할 수 있는 환자(반응자)와, 효과를 기대할 수 없는 환자(무반응자)를 예측할 수 있으면, 유효성과 안전성이 높은 화학 요법이 실현될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예측"은 본원에서 대상 환자가 약물 또는 약물 세트에 대해 유리하게 또는 불리하게 반응할 가능성을 지칭하는데 사용된다. 한 실시양태에서, 예측은 이러한 반응의 정도에 관한 것이다. 예컨대, 예측은 환자가 처치 후, 예를 들어 특정한 치료제의 처치 및/또는 원발성 종양의수술적 제거 및/또는 특정 기간 동안의 화학요법 후에 암 재발 없이 생존할 지의 여부 및/또는 그러할 확률에 관한 것이다. 본 발명의 예측은 대장암 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료를 결정하는데 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측은 환자가 치료 처치, 예컨대 주어진 치료적 처치, 예를 들어 주어진 치료제 또는 조합물의 투여, 수술적 개입, 화학요법 등에 유리하게 반응할 것인지 또는 치료적 처치 후에 환자의 장기 생존이 가능한 지의 여부를 예측하는데 있어서 유용한 도구이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 p53 유전자 및/또는 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자 발현 수준; 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 p53 유전자 및/또는 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자 발현 수준의 측정은, 상기 유전자 내 돌연변이 존재 여부 측정 및/또는 분석을 포함한다.
즉, 상기 유전자 내 하나 이상의 변이의 존재는 상기 유전자 중 어느 하나의 발현 억제를 유발할 수 있으므로, 본 발명은 상기 유전자들의 돌연변이의 존재를 확인함으로써 PARP-1 저해제에 대한 감수성에 미치는 영향을 예측할 수 있다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 본 명세서에서 사용되는 표현 "유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준 측정"은 해당 시료 내에서 검출하고자 하는 타겟을 검출하는 것을 의미한다. 본 발명에서는, 상기 검출하고자 하는 타겟은 시료 내 해당 유전자의 mRNA 및/또는 단백질이다. 즉, 유전자의 전사 산물인 RNA 또는 유전자 산물인 단백질을 검출함으로써 상기 유전자의 발현 여부와 돌연변이를 확인할 수 있다.
RNA 또는 단백질의 검출은 통상적으로는 대상으로부터 분리된 시료부터 RNA 또는 단백질을 추출하여, 추출물 중의 RNA 또는 단백질을 검출함으로써 실시할 수 있다. 이러한 RNA 또는 단백질의 검출은 면역분석학적 방법, 하이브리드화 반응 및 증폭반응에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 용이하게 실시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 유전자 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함한다.
상기 mRNA의 발현 여부를 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 즉, 핵산의 검출은 유전자를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있다.
예컨대, 프라이머를 이용한 mRNA의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.
또한, PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 sanger 시컨싱과 같은 유전자 서열 분석 방법을 사용하여 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 돌연변이 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 포함한다.
상기 단백질의 발현 여부를 측정하는 제제는 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 의미하고, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합을 모두 포함한다.
상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv를 모두 포함한다. 항체 생산은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PARP는 PARP-1, PARP-2 또는 PARP-3이며, 가장 바람직하게는 PARP-1이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PARP 저해제는 신경통, 중증근무력증, 근 위축증, 근위축성 측삭경화증(ALS), 진행성 근 위축증, 길레인-발레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 헝틴톤 질환, 알쯔하이머 질환, 파킨슨병, 아테롬성 동맥경화증, 협심증, 심근경색, 심장 마비, 바이패스 수술에 의한 심혈계 손상, ACTH 생성 종양, 급성 림프구성 또는 림프아구성 백혈병, 급성 또는 만성의 림포구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 방광암, 뇌종양, 유방암, 경관암, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 자궁내막증, 식도암, 방광암, 에윙스 육종(Ewing's sarcoma), 설암, 홉킨스 림프종, 카포시스 육종, 신장암, 간암, 폐암, 중피종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 비홉킨 림프종, 골육종, 난소암, 유선암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 페니스암, 레티노블라스토마, 피부암, 위암, 갑상선압, 자궁암, 고환암, 윌름스 종양 및 트로포블라스토마로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상에 대한 치료제이다. 보다 바람직하게는 ACTH 생성 종양, 급성 림프구성 또는 림프아구성 백혈병, 급성 또는 만성의 림포구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 방광암, 뇌종양, 유방암, 경관암, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 자궁내막증, 식도암, 방광암, 에윙스 육종(Ewing's sarcoma), 설암, 홉킨스 림프종, 카포시스 육종, 신장암, 간암, 폐암, 중피종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 비홉킨 림프종, 골육종, 난소암, 신경아세포종, 유선암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 페니스암, 레티노블라스토마, 피부암, 위암, 갑상선압, 자궁암, 고환암, 윌름스 종양, 및 트로포블라스토마로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상에 대한 치료제이며, 가장 바람직하게는 대장암에 대한 치료제이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대장암(colon cancer)"은 직장암, 결장암 및 항문암을 통칭하는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PARP 저해제는, AZD2281(올라파립, Olaparib), ABT888(벨리파립, Veliparib), AG014699(루카파립, Rucaparib), MK-4827(니라파립, Niraparib), BMN-673(탈라조파립, Talazoparib), BSI201(이니파립, Iniparib), BGP15(O-(3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl)nicotinic-amidoxime), INO1001(3-Aminobenzamide), ONO2231, 니코틴아미드(nicotinamide), 3-아미노벤즈아미드(3-amino benzamide), 3,4-디히드로-5-[4-(1-피페리디닐)부톡시]-1(2H)-이소퀴놀론(3,4-dihydro-5-[4-(1-piperidinyl)butoxy]-1(2H)-isoquinolone), 벤즈아미드(benzamide), 퀴놀론(quinolone), 이소퀴놀론(isoquinolone), 벤조피론(benzopyrone), 사이클릭 벤즈아미드(cyclic benzamide), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 인돌(indole) 및 펜안트리디논(phenanthridinone)으로 이루어진 군에서 1 종 이상 선택되며, 보다 바람직하게는 AZD2281(올라파립, Olaparib), ABT888(벨리파립, Veliparib), AG014699(루카파립, Rucaparib), MK-4827(니라파립, Niraparib), BMN-673(탈라조파립, Talazoparib) 및 BSI201(이니파립, Iniparib)로 이루어진 군에서 선택되고, 가장 바람직하게는 AZD2281, 즉, 올라파립(Olaparib)이다.
본 발명의 조성물은 상술한 유전자의 발현 여부 및 유전자 돌연변이를 측정하는 제제뿐만 아니라, 항원-항체 복합체의 형성을 정량 또는 정성적으로 측정 가능하게 하는 라벨, 면역학적 분석에 사용되는 통상적인 도구, 시약 등을 더 포함할 수 있다.
항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 산화환원 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈옥시다제와루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트카복실라제, 아스파르테이트아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 산화환원 분자에는 페로센, 루테늄착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8, [Os(bpy)3]2+,[RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4-등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H,14C,32P,35S,36Cl,51Cr,57Co,58Co, 59Fe,90Y,125I,131I,186Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 조성물은 상술한 바이오 마커를 유효성분으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 키트를 제공한다.
상기 키트에는 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다.
상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 키트는 상술한 바이오 마커를 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 PARP 저해제에 대한 감수성 예측 방법을 제공한다:
(a) 대상으로부터 생물학적 시료를 준비하는 단계;
(b) 상기 생물학적 시료 내 p53 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) (b) 단계에서 측정한 발현 수준 확인 결과에 기초하여 상기 대상의 PARP 저해제에 대한 감수성을 판정하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 방법은 상기 (b) 단계에서 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준 및/또는 상기 유전자 돌연변이 존재 여부 측정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 예측 방법은, 대상 환자로부터 생물학적 시료를 획득하고, 상기 시료 내에서 상술한 유전자들의 발현 여부를 측정한 후, 정상 시료와 비교하여, 기재된 유전자의 발현 수준이 정상(야생형)과 비교하여 억제되었거나 감소한 경우 및 유전자의 돌연변이가 존재 여부에 따라, 당해 시료가 PARP-1 저해제에 대하여 감수성이 있다라고 판정하는 공정을 포함하여 이루어진다.
즉, 본 발명의 예측 방법은 시료 내에서의 특정 유전자들의 발현 여부를 암세포의 항암제에 대한 감수성의 지표로 하는 점을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 방법은 상기 (c) 단계에서 (i) p53 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준 및/또는 상기 유전자 서열이 정상(야생형)인 경우; 및/또는 (ii) DNA-PK 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상에 비하여 저발현인 경우와 유전자 돌연변이가 발생한 경우, 대상의 PARP 저해제에 대한 감수성이 있는 것으로 판정한다.
보다 상세하게는, 본 발명의 상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 측정한 발현 여부 확인과 유전자 돌연변이 분석 결과를 기초로 하여, p53 유전자는 정상적으로 존재 및/또는 발현(기능)하며 유전자 서열이 정상이고 DNA-PK 유전자의 발현 수준은 정상(야생형)의 값에 비하여 억제 및/또는 감소되며 유전자 서열이 돌연변이가 확인된 경우, 대상 환자로부터 획득된 당해 종양 세포가 항암제인 PARP 저해제에 대하여 감수성이 있는 것으로 판정하는 것이다.
본 명세서에서 상기 유전자들의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어 "저발현"은 바이오 마커가 비정상 프로세스, 질환 혹은 개체 내 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 경우, 해당 바이오 마커 유전자의 야생형의 발현 수준 혹은 값; 또는 건강하거나 정상인 개체로부터 획득된 생물학적 시료에서 검출되는 바이오 마커의 값 혹은 수준 범위 보다 낮은 생물학적 시료 내의 바이오 마커의 값 혹은 수준을 지칭한다. 또한, 이는 바이오 마커의 "정상" 발현 수준 혹은 값과 비교해서 "차동(differential) 수준" 혹은 "차동 값"을 지니거나 "상이하게 발현된" 것으로서 지칭될 수 있으며, 발현에 있어서 정량적 차이뿐만 아니라 정성적 차이의 둘 모두를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 p53 유전자 및/또는 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자의 발현 수준; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 수준의 측정은, 상기 유전자 내 변이 여부 측정을 추가적으로 포함한다.
본 발명은 상기 유전자들의 변이의 존재를 확인하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 유전자 내 하나 이상의 변이의 존재는 상기 유전자 중 어느 하나의 발현 억제를 유발할 수 있으며 이는 상술한 바와 같이 PARP-1 저해제에 대한 감수성에 영향을 미칠 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "변이" 또는 "돌연변이"는, 해당 유전자의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 염기 치환, 결실, 삽입, 증폭 및 재배열을 포함한다. 뉴클레오티드 변이는 참조 서열(예를 들어, 야생형 서열)에 대한 뉴클레오티드 서열의 변화 (예를 들어, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 역위 또는 치환, 예컨대 단일 뉴클레오티드다형성 (SNP))를 지칭한다.
이 용어는 또한 달리 나타내지 않는다면, 뉴클레오티드 서열의 보체에서의 상응하는 변화도 포함한다. 뉴클레오티드 변이는 체세포 돌연변이 또는 배선 다형성일 수 있다.
또한, 아미노산 변이는 참조 서열 (예를 들어, 야생형 서열)에 비해 아미노산 서열의 변화 (예를 들어, 1개 이상의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 예컨대 내부 결실 또는 N- 또는 C-말단의 말단절단(truncation))를 지칭한다.
상기 변이의 검출은 당업계에 널리 공지되어 있는 기술을 이용하여 표적 분자 클로닝 및 서열 분석에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, DNA 서열분석; 대립유전자-특이적 뉴클레오티드 혼입 검정 및 대립유전자-특이적 프라이머 연장 검정 (예를 들어, 대립유전자-특이적 PCR, 대립유전자-특이적 라이게이션 연쇄 반응 (LCR) 및 갭-LCR)을 비롯한 프라이머 연장 검정; 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화 검정 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드라이게이션검정); 절단제로부터의 보호를 이용하여 핵산 이중나선 내의 미스매치된 염기를 검출하는 절단 보호 검정; MutS단백질 결합 분석; 변이체 및 야생형 핵산 분자의 이동성을 비교하는 전기영동 분석; 변성-구배 겔 전기영동(DGGE, 예를 들어 문헌 [Myers et al. (1985) Nature 313:495]에서와 같음); 미스매치된 염기 쌍에서의 RNase절단의 분석; 헤테로 이중나선 DNA의 화학적 또는 효소적 절단의 분석; 질량 분광측정법 (예를 들어, MALDITOF); 유전적 비트 분석 (GBA); 5' 뉴클레아제 검정 (예를 들어, 택맨(TaqMan®; 및 분자 비콘을 사용하는 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 실시간 PCR과 시퀀싱을 이용하여 본 발명의 DNA-PK 유전자의 특이적 변이를 검출하였다.
상기 변이는 다음과 같다: DNA-PK(gene bank number: NM_006904.6) 게놈 엑손 5의 487번째 염기부터 496번째 염기까지 반복되는 10개의 아데닌(adenine) 염기가 9개로 frameshift 되는 변이, 엑손 76의 10,807번째 염기부터 10,814번째 염기까지 반복되는 8개의 아데닌(adenine) 염기가 9개로 frameshift 되는 변이, 7825번째 염기인 아데닌(adenine)이 시토신(cytosine)으로 치환되는 변이, 9185번째 염기인 티민(thymine)이 구아닌(guanine)으로 치환되는 변이.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"란 본 발명의 바이오 마커의 발현이 검출될 수 있는 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 특별히 이에 제한되지 않고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.
본 발명의 방법은 상술한 바이오 마커를 이용하여 감수성이 있는 것으로 판정하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자 발현 또는 이의 단백질 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 대상의 PARP 저해제에 대한 감수성 증진제 또는 감수성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 대상은 p53 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준이 정상이며, p53 유전자의 야생형을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, p53 정상 유전자가 존재하는 경우 올라파립을 처리하고 DNA-PK 유전자 발현 여부에 따른 암세포 생존율을 측정한 결과, DNA-PK 유전자의 발현 수준을 억제시킨 암세포에서 올라파립에 따른 세포 생존률이 탁월하게 감소되는 것을 확인한 반면, p53 정상 유전자가 존재하지 않는 경우 DNA-PK 유전자 발현을 억제시켰을 때, 세포 생존율에는 큰 영향을 미치지 못한 것을 확인하였다.
따라서, 이는 p53 정상 유전자의 존재(p53 정상 유전자의 정상적인 발현 및 기능); 및 DNA-PK 유전자의 발현 억제가 올라파립에 대한 암세포의 감수성을 증진시킨다는 것을 제시하며, 이를 기반으로 하여 본 발명은 대상의 PARP 저해제에 대한 탁월한 감수성 증진 효과를 제공한다.
본 발명의 감수성 증진제 또는 증진용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 기타 첨가제, 예를 들면, 안정제, 완화제, 유화제 등을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 부형제로서 미결정 셀룰로오소, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스 등이 사용될 수 있고, 붕해제로서 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘 등이 사용될 수 있다. 결합제로는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크 등으로부터 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 p53 정상 유전자의 존재 및 DNA-PK 유전자의 발현 억제는 PARP 저해제 처리시 암세포의 성장을 감소시킨다.
상기 DNA-PK 유전자의 발현은 DNA-PK 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연 추출물 및 화학물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상에 의해 억제된다.
보다 바람직하게는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA) 또는 miRNA(microRNA)이며, 가장 바람직하게는 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "siRNA"는, 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상 DNA-PK mRNA에 특이적으로 결합하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 것을 의미한다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 siRNA는 서열번호 3의 염기서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 상기 miRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 염기서열로서, 이에 제한되지는 않으나 안티센스 RNA, 안티센스 DNA 및 안타고니스트(antagonist) mRNA를 포함한다.
본 발명의 방법은 상술한 바이오 마커인 p53 유전자 및 DNA-PK 유전자의 발현 수준을 이용하여 PARP 저해제에 대한 감수성을 증진시키므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 감수성 증진제 및 PARP 저해제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, p53 정상 유전자 및 DNA-PK 유전자가 상호작용하여 암세포의 PARP 저해제에 대한 감수성을 상당히 증진시켜 세포사멸사를 향상시키는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 조성물의 유효 성분인 DNA-PK 유전자 또는 이의 단백질의 발현 억제제는 정상세포에는 영향을 미치지 않고 암세포에서만 특이적으로 발현 수준을 억제하여 아폽토시스에 의한 암세포의 세포사멸을 유도한다.
따라서, 본 발명의 조성물은 DNA-PK 유전자 또는 이의 단백질의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 PARP 저해제와 함께 암세포에 투여함으로써 암세포의 세포사를 증진시킬 수 있어, 항암제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 의한 개선, 예방 또는 치료 대상 질병인 "암(cancer) "은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 본 명세서에서 상기 암은 악성 종양(malignant tumor)과 동일한 의미로도 사용된다.
본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 암은 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 위암(stomach cancer), 간암(liver cancer), 혈액암(blood cancer), 뼈암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 머리 또는 목암(head or neck cancer), 피부 또는 안구 흑색종(cutaneous or intraocular melanoma), 자궁육종(uterine sarcoma), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문암(anal cancer), 대장암(colon cancer), 난관암(fallopian tube carcinoma), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 소장암(small intestine cancer), 내분비암(endocrine cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 신장암(adrenal cancer), 연조직종양(soft tissue tumor), 요도암(urethral cancer), 전립선암(prostate cancer), 기관지암(bronchogenic cancer), 골수암(bone marrow tumor)등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 대장암(colon cancer)의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "예방" 은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 (i) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (ii) 질환 또는 질병의 경감; 및 (iii) 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.
또한, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 증진제 내 DNA-PK 유전자 또는 이의 단백질의 발현 억제제의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 위중도 등을 고려하여 결정하며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상술한 감수성 증진제 및 PARP 저해제를 이용하여 암세포의 세포사를 향상시키므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 감수성 증진제 및 PARP 저해제를 해당 대상에게 공동 투여하는 단계를 포함하는, PARP 저해제에 대한 감수성 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, p53 정상 유전자 및 DNA-PK 유전자가 상호작용하여 암세포의 PARP 저해제에 대한 감수성을 상당히 증진시켜 세포사를 향상시키는 것을 확인하였다.
따라서, DNA-PK 유전자 또는 이의 단백질의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 PARP 저해제와 함께 암세포에 투여함으로써 암세포의 PARP 저해제에 대한 민감도를 증진시킬 수 있다.
본 발명의 방법은 상술한 바이오 마커인 p53 유전자 및 DNA-PK 유전자의 발현 수준을 이용하여 PARP 저해제에 대한 감수성을 증진시키므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다
본 발명의 PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커를 이용하면, 개개의 환자의 상기 감수성을 치료 개시 전에 확실하게 판정할 수 있어, 치료 효과가 높은 항암제의 선택이 가능해진다. 또한, 효과가 얻어지지 않는 항암제의 사용을 회피할 수 있기 때문에 불필요한 부작용을 회피할 수 있다.
도 1a은 p53 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(Olaparib, AZD2281)의 항암 활성 분석 결과를 보여준다.
도 1b는 p53 정상 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 p53 활성 및 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 1c는 p53 유전자의 기능 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 p53 활성 및 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 1d는 p53 유전자의 발현 억제에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 2a는 p53 정상 유전자 존재 시 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 2b는 p53 정상 유전자 부재 시 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 2c는 p53 정상 유전자 및 DNA-PK 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 2d는 p53 유전자의 기능 부재 및 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 3a는 p53 정상 유전자 존재 시 다른 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 3b는 p53 정상 유전자 부재 시 다른 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 4a는 p53 정상 유전자 존재 시 DNA 복구 유전자의 부재에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 4b는 p53 정상 유전자 부재 시 DNA 복구 유전자의 부재에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 5는 대장암 환자 유래 종양조직에서의 p53과 DNA-PK 유전자형 분석 결과를 보여준다.
도 6은 대장암 환자 유래 종양세포에서 p53과 DNA-PK 유전자형에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 7은 DNA-PK 유전자 결핍 시 올라파립(AZD2281)에 대한 DNA 복구 활성 분석 결과를 보여준다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. p53 정상 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(Olaparib, AZD2281)의 약물 감수성 분석
1-1. p53 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(Olaparib, AZD2281)의 항암 활성 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(Olaparib, AZD2281)의 항암 활성을 분석하고자, 총 19 종의 인간 대장암 세포주[p53 유전자가 정상인 6 종의 대장암 세포주(LS174T, HCT116, RKO, LoVo, HCT8, SW48)와 p53 유전자가 결실되거나 변이인 3 종의 대장암 세포주(Colo320HSR, KM12C, SW1417, HCT116p53 null, HCT-15, SW480, Colo201, HT29, LS1034, DLD-1, Caco-2, Colo205, SW620)]에서 인 비트로 셀 베이스 어세이(in vitro cell base assay)를 통해 항암제인 올라파립(AZD2281)에 대한 각 세포주들의 생존능(cell viability)과 IC50을 측정하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: 총 19 종의 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 각 세포주를 96-웰 플레이트에 웰당 2X103개씩 37℃에서 24 시간 배양하고, 올라파립(AZD2281)을 최대 100 uM에서 최소 0.390625 uM으로 2 배씩 희석하여(100 uM, 50 uM, 25 uM, 12.5 uM, 6.25 uM, 3.125 uM, 1.5625 uM, 0.78125 uM, 0.390625 uM) 처리한 후 37℃에서 72 시간 배양하여, 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 MTS 어세이(Promega, CellTiter 96 AQeous One Solution)를 이용하여 각 세포주의 생존능(cell viability)을 측정하고 PRISM 프로그램을 이용하여 각 세포주의 IC50을 측정하였다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, p53 유전자가 존재 및/또는 정상적으로 발현하는 경우, 올라파립(AZD2281)에 대한 감수성이 높다는 것을 보여준다.
1-2. p53 정상 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 p53 활성 및 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(Olaparib, AZD2281)의 p53 활성 및 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 존재하는 세포주 HCT116과 HCT116의 p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null에올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리한 후, 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
또한, 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 p53 활성의 표지자인 p-p53 (phospho-p53) 및 세포사멸 표지자인 cleaved PARP를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: HCT116과 HCT116의 p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 각 세포주를 60 mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 올라파립(AZD2281)을 최대 50 uM에서 최소 5 uM으로(50 uM, 25 uM, 10 uM, 5 uM) 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다. 세포사멸 정도를 측정한 각 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 RIPA 버퍼를 이용하여 세포들을 용해시킨 후 고속 원심분리기를 이용하여 단백질을 추출하여 각 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리 세포들 당 30ug의 단백질을 웨스턴 블롯(western blot)법으로 전기영동하여 단백질을 분리 후 PDVF 막(membrane)에 트랜스퍼하여 p53, p-p53, cleaved PARP, tubulin 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL 버퍼를 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 항체에 대한 단백질의 발현을 현상하였다.
그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 존재하고 있는 세포주에서만 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 농도 별로 유도되고(cleaved PARP의 증가), p53의 활성이 증가되었다.
1-3. p53 유전자의 기능 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 p53 활성 및 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 유전자의 기능 유무에 따른 올라파립(Olaparib, AZD2281)의 p53 활성 및 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 기능하는 세포주인 RKO 및 LoVo 대장암 세포주와 p53 유전자가 변이된 세포주인 Colo205에 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리한 후, 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
또한, 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 p53 활성의 표지자인 p-p53 (phospho-p53)및 세포사멸 표지자인 cleaved PARP를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자가 정상인 RKO 및 LoVo 대장암 세포주와 p53 유전자가 변이된 세포주 Colo205 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 각 세포주를 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 올라파립(AZD2281)을 최대 50uM에서 최소 5 uM으로(50 uM, 25 uM, 10 uM, 5 uM) 처리 한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다. 세포사멸 정도를 측정한 각 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 RIPA 버퍼를 이용하여 세포들을 용해시킨 후 고속 원심분리기를 이용하여 단백질을 추출하여 각 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리 세포들 당 30 ug의 단백질을 웨스턴 블롯(western blot)법으로 전기영동하여 단백질을 분리 후 PDVF 막에 트랜스퍼하여 p53, p-p53, cleaved PARP, tubulin 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL 버퍼를 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 항체에 대한 단백질의 발현을 현상하였다.
그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 기능하고 있는 세포주에서만 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 농도 별로 유도되고(cleaved PARP의 증가), p53의 활성이 증가되었다.
1-4. p53 유전자 억제에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 p53 유전자의 발현 수준을 억제시켰을 때, 올라파립(Olaparib, AZD2281)에 의한 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 기능하는 세포주인 HCT116 대장암 세포주에 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리한 후, 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자가 정상인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 p53 siRNA(서열번호 21; p53 siRNA 5'-AAGACUCCAGUGGUAAUCUAC-3')를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시켰다.
상기 세포들에 올라파립(AZD2281)을 최대 50 uM에서 최소 5uM으로(50 uM, 25 uM, 10 uM, 5 uM) 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 p53 siRNA 처리군과 양성 대조군인 scramble siRNA 처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이, p53 유전자가 기능하고 있는 경우에는 올라파립(AZD2281)에 의해 세포사멸이 농도 별로 유도되고 p53 유전자를 억제하였을 경우 올라파립(AZD2281)에 의해 세포사멸이 감소되었다.
실시예 2. p53 정상 유전자 및 DNA 복구(repair)유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 약물 감수성 분석
2-1. p53 정상 유전자 존재 시 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자 존재 시 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 존재하는 세포주 HCT116에 DNA 복구 유전자로 알려진 ATM, ATR 및 DNA-PK 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 ATM, ATR 및 DNA-PK 단백질의 발현량 감소를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자가 정상인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 ATM, ATR 및 DNA-PK siRNA (서열번호 1; ATM siRNA 5'-AAGCGCCUGAUUCGAGAUCCUUU-3', 서열번호 2; ATR siRNA 5'-AACCUCCGUGAUGUUGCUUGA-3', 서열번호 3; DNA-PK siRNA 5'-AAAGGGCCAAGCUGUCACUCU-3')를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 각 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 RIPA 버퍼를 이용하여 세포들을 용해시킨 후 고속 원심분리기를 이용하여 단백질을 추출하여 세포들 당 30ug의 단백질을 웨스턴 블롯(western blot)법으로 전기영동하여 단백질을 분리 후 PDVF 막에 트랜스퍼하여 ATM, ATR, DNA-PK, tubulin 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL 버퍼를 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 항체에 대한 단백질의 발현을 현상하였다.
또한, 여기에 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 정상인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 ATM, ATR 및 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 최대 25uM에서 최소 5uM으로(25uM, 10uM, 5uM) 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 존재하고 있는 경우, DNA-PK 유전자의 발현을 감소시킨 세포주에서만 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 농도 별로 증가되었다.
2-2. p53 정상 유전자 부재 시 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자의 부재 시 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자를 결실시킨 세포주HCT116 p53 null에 DNA 복구 유전자로 알려진 ATM, ATR 및 DNA-PK 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 ATM, ATR 및 DNA-PK 단백질의 발현량 감소를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 ATM, ATR 및 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 각 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 RIPA 버퍼를 이용하여 세포들을 용해시킨 후 고속 원심분리기를 이용하여 단백질을 추출하여 세포들 당 30ug의 단백질을 웨스턴 블롯(western blot)법으로 전기영동하여 단백질을 분리 후 PDVF 막에 트랜스퍼하여 ATM, ATR, DNA-PK, tubulin 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL 버퍼를 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 항체에 대한 단백질의 발현을 현상하였다.
또한, 여기에 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 ATM, ATR 및 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 최대 25uM에서 최소 5uM으로(25uM, 10uM, 5uM) 처리 한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 존재하지 않는 경우, ATM, ATR 및 DNA-PK 유전자의 발현을 감소시켜도 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸은 농도 별로 증가되지 않았다.
2-3. p53 정상 유전자 및 DNA-PK 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자 및 DNA-PK 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 존재하는 세포주 HCT116과 HCT116의 p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null에 DNA-PK 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 DNA-PK 단백질의 발현량 감소를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: HCT116과 HCT116의 p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null 인간 대장암 세포주들을 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 각 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 RIPA 버퍼를 이용하여 세포들을 용해시킨 후 고속 원심분리기를 이용하여 단백질을 추출하여 세포들 당 30ug의 단백질을 웨스턴 블롯(western blot)법으로 전기영동하여 단백질을 분리 후 PDVF 막에 트랜스퍼하여 DNA-PK, tubulin 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL 버퍼를 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 항체에 대한 단백질의 발현을 현상하였다.
또한, 여기에 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 HCT116과 HCT116의 p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 최대 50uM에서 최소 5uM으로(50uM, 25uM, 10uM, 5uM) 처리 한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 존재하는 경우에만, 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 농도 별로 증가되었다. 또한, p53 정상 유전자가 존재하는 경우에만, DNA-PK 유전자의 발현을 감소시켰을 때 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 농도 별로 증가되었다.
2-4. p53 유전자의 기능 부재 및 DNA 복구유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 유전자의 기능 부재 및 ATR 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 유전자가 변이된 세포주 DLD-1에 DNA 복구 유전자로 알려진 ATM, ATR, DNA-PK 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 상기 ATM, ATR, DNA-PK 단백질의 발현량 감소를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자가 변이된 세포주 Colo205 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 ATM, ATR 및 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 각 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 RIPA 버퍼를 이용하여 세포들을 용해시킨 후 고속 원심분리기를 이용하여 단백질을 추출하여 세포들 당 30ug의 단백질을 웨스턴 블롯(western blot)법으로 전기영동하여 단백질을 분리 후 PDVF 막에 트랜스퍼하여 ATM, ATR, DNA-PK, tubulin 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL 버퍼를 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 항체에 대한 단백질의 발현을 현상하였다.
또한, 여기에 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 변이된 세포주 Colo205 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 ATM, ATR 및 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 최대 50uM에서 최소 5uM으로(50uM, 25uM, 10uM, 5uM) 처리 한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 2d에 나타낸 바와 같이, p53 유전자의기능이 존재하지 경우, ATM, ATR 및 DNA-PK 유전자의 발현을 감소시켜도 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸은 농도 별로 증가되지 않았다.
실시예 3. p53 정상 유전자 및 다른 DNA 복구(repair) 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 약물 감수성 분석
3-1. p53 정상 유전자 존재 시 다른 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자 존재 시 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 존재하는 세포주 HCT116에 다른 DNA 복구 유전자로 알려진 XLF 및 XRCC4 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 RT-PCR을 통해 XLF 및 XRCC4 유전자의 mRNA 발현량 감소를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자가 정상인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 XLF 및 XRCC4 siRNA(서열번호 4; XLF siRNA 5'-GCAUUACAGUGCCAAGUGA-3', 서열번호 5; XRCC4 siRNA 5'-AAUCUUGGGACAGAACCUAAA-3')를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 각 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 Trizol RNA 추출법을 이용하여 총 RNA를 추출하여 500ng의 총 RNA를 cDNA로 재합성하여 XLF 및 XRCC4 primer(서열번호 7; XLF forward primer 5'-GAGGTCCAAGTGGGACAGAA-3', 서열번호 8; XLF reverse primer 5'-GTGTGGTGCTTTCTTGCTGA-3', 서열번호 9; XRCC4 forward primer 5'-GGCAATGGAAAAAGGGAAAT-3', 서열번호 10; XRCC4 reverse primer 5'-CGGTCAGCAGTCATTTCAGA-3')를 이용하여 PCR을 수행하여 1% agarose gel에 전기영동 후 Et-Br 염색을 통하여 XLF 및 XRCC4의 발현을 확인하였다.
또한, 여기에 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 정상인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 XLF 및 XRCC4 siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 최대 25uM에서 최소 10uM으로(25uM, 10uM) 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 존재하고 있는 경우, XLF 및 XRCC4 유전자의 발현 수준을 감소시켜도 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 증가되지 않았다.
3-2. p53 정상 유전자 부재 시 다른 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자의 부재 시 다른 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null에 다른 DNA 복구 유전자로 알려진 XLF 및 XRCC4 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 XLF 및 XRCC4 siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 최대 25uM에서 최소 10uM으로(25uM, 10uM) 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 존재하지 않는 경우, XLF 및 XRCC4 유전자의 발현 수준을 감소시켜도 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 증가되지 않았다.
실시예 4. p53 정상 유전자 및 DNA 복구(repair) 유전자의 부재에 따른 올라파립(AZD2281)의 약물 감수성 분석
4-1. p53 정상 유전자 존재 시 DNA 복구 유전자의 부재에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자 존재 시 DNA 복구 유전자의 부재에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 존재하는 세포주 HCT116, LoVo 및 RKO 대장암 세포주에 DNA 복구 유전자로 알려진 ATM, ATR, XRCC4, XLF 및 DNA-PK 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 올라파립(AZD2281)을 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자가 정상인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 ATM, ATR, XLF, XRCC4 및 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 25uM으로 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 존재하고 있는 경우, 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 유의성있게 증가되었고, 특히, DNA-PK 유전자의 발현을 감소시켰을 때 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 더욱 증가되었다.
4-2. p53 정상 유전자 부재 시 DNA 복구 유전자의 부재에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자의 부재 시 DNA 복구 유전자의 부재에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null에 DNA 복구 유전자로 알려진 ATM, ATR, XRCC4, XLF 및 DNA-PK 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 올라파립(AZD2281)을 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 ATM, ATR, XLF, XRCC4 및 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 25uM으로 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, p53 유전자가 존재하지 않는 경우, ATM, ATR, XRCC4, XLF 및 DNA-PK 유전자의 발현을 감소시켜도 올라파립(AZD2281)에 의한 유의성있는 세포사멸은 증가되지 않았다. 특히, 도 4a와는 달리 DNA-PK 유전자의 발현 수준을 감소시켜도 세포사멸이 더욱 증가되지 않았다.
실시예 5. 대장암 환자 유래 종양 조직에서의 p53 과 DNA-PK 유전자형 분석
실제 대장암 환자에서의 p53과 DNA-PK의 유전자형을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 7개의 대장암 환자 종양 조직, 21개 대장암 환자 유래 종양세포, 7개의 대장암 환자 유래 종양생성 동물모델 조직에서, 면역염색 (IHC)을 통해 p53의 발현과 돌연변이를 확인하고 RT-PCR과 시퀀싱을 통해 DNA-PK의 유전자형의 변이/결실(mutation/deficient) 여부를 분석하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: 대장암 환자 종양 조직, 대장암 환자 유래 종양세포, 대장암 환자 유래 종양생성 동물모델 조직을 각각 균질기(homogenizer)로 Trizol RNA 추출법을 이용하여 분쇄하여 총 RNA를 추출하여 500ng의 총 RNA를 Accupower?RT-PCR premix Kit(바이오니아, BIONEER)를 이용하여 cDNA로 재 합성하여 DNA-PK primer (서열번호 13; DNA-PK Exon5 forward primer 5'-GCCAGAAGATCGCACCTTAC-3', 서열번호 14; DNA-PK Exon5 reverse primer 5'-GTGAGGACAACCCCTTCAGA-3', 서열번호 15; DNA-PK Exon76 forward primer 5'-AAGGATTAAAAGTAAGTTGG-3', 서열번호 16; DNA-PK Exon76 reverse primer 5'-AAGTAGCATGTTGGTAATGT-3', 서열번호 17; DNA-PK 7825 site forward primer 5'-CCAGCATGAGCCCAGATTAT-3', 서열번호 18; DNA-PK 7825 site reverse primer 5'-TCAGATGAGGGACTGGTGTG-3', 서열번호 19; DNA-PK 9185 site forward primer 5'-AAGCCGAGAAGGATTTTTGG-3', 서열번호 20; DNA-PK 9185 site reverse primer 5'-TCAGATGAGGGACTGGTGTG-3')로 Accupower?PCR premix Kit (바이오니아, BIONEER)를 이용하여 총 20ul volume으로 PCR 수행 (Exon 5; step 1 95℃ 5분 - step 2 95℃ 30초 - step 3 62℃ 30초 - step 4 72℃ 30초 - step 5 72℃ 10분 - step 2 ~ step 4 35cycle, Exon 76; step 1 95℃ 5분 - step 2 95℃ 30초 - step 3 56℃ 30초 - step 4 72℃ 30초 - step 5 72℃ 10분 - step 2 ~ step 4 35cycle, 7825 site; step 1 95℃ 5분 - step 2 95℃ 30초 - step 3 67℃ 30초 - step 4 72℃ 30초 - step 5 72℃ 10분 - step 2 ~ step 4 35cycle, 9185 site; step 1 95℃ 5분 - step 2 95℃ 30초 - step 3 58℃ 30초 - step 4 72℃ 30초 - step 5 72℃ 10분 - step 2 ~ step 4 35cycle)을 하여 PCR 생산물 10ul를 1% agarose gel에 전기영동 후 Et-Br 염색을 통하여 DNA-PK 유전자들의 PCR 생산물을 확인하고 이 PCR 생산물 나머지 10ul를 QIAquick PCR Purification Kit (퀴아젠, QIAGEN)로 정제 후 상기 각각의 primer를 이용하여 sanger 시퀀싱 (마크로젠, Macrogen)을 하여 DNA-PK의 돌연변이 분석을 확인하였다.
또한, p53 항체를 이용하여 IHC 면역염색을 통해 p53 유전자의 발현과 돌연변이 유무 분석을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 대장암 환자조직 7개, 대장암 환자유래 종양세포 21개, 대장암 환자 유래 종양생성 동물모델 조직 7개를 포함한 총 35개의 환자 유래 조직에서 p53 유전자의 정상형은 11개이고 돌연변이형은 24개로 분석되었으며 DNA-PK 유전자의 정상형은 28개이고 돌연변이형은 7개로 분석되었다. 이 중 2개의 대장암 환자 종양에서 p53 유전자가 정상형이고 DNA-PK 유전자가 돌연변이형이 분석되었다.
실시예 6. 대장암 환자 유래 종양세포에서 p53 과 DNA-PK 유전자형에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
실제 대장암 환자에서 유래된 종양세포주를 이용하여 p53과 DNA-PK의 유전자형에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸을 분석하기 위해, 본 발명자들은 p53 유전자가 정상형이고 DNA-PK 유전자가 정상형인 대장암 환자 유래 종양세포주 11-CT-79511B, 11-CT-97845D와 p53 유전자가 정상형이고 DNA-PK 유전자가 돌연변이형인 대장암 환자 유래 종양세포주 11-CT-78093B, 11-CT-79724B와 p53 유전자가 돌연변이형이고 DNA-PK 유전자가 정상형인 11-CT-78481A와 p53 유전자형과 DNA-PK 유전자형이 돌연변이형인 11-CT-76479B에 올라파립(AZD2281)을 처리 한 후 세포 모양의 변화를 관찰하여 p53과 DNA-PK 유전자형에 따라 세포사멸이 유도되는지 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53과 DNA-PK 유전자형이 서로 다른 6종의 대장암 환자 유래 세포를 REBM(Renal Growth Basal Medium; 5% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신) (LONZA)에 배양하여 60 ㎜ 플레이트에 웰 당 1×104 개씩 37℃에서 24시간 배양하고 올라파립(AZD2281)을 최대 50uM에서 최소 25uM으로(50uM, 25uM) 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군의 세포 모양 변화를 관찰하여 약물 효능을 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, p53 유전자가 정상형이고 DNA-PK 유전자가 돌연변이형인 대장암 환자 유래 종양 세포주 11-CT-78093B와 11-CT-79724B에서만 올라파립(AZD2281)에 의해 세포의 모양이 사멸되는 것을 관찰할 수 있고 p53 유전자와 DNA-PK 유전자가 정상형인 대장암 환자 유래 종양 세포주 11-CT-79511B와 11-CT97845D 및 p53 유전자가 돌연변이형이고 DNA-PK 유전자가 정상형인 11-CT-78481A와 p53 유전자형과 DNA-PK 유전자형이 돌연변이형인 11-CT-76479B 대장암 환자 유래 종양 세포에서는 올라파립(AZD2281)에 의한 세포의 모양이 변화가 없는 것을 확인할 수 있다.
따라서, p53 유전자 및 DNA-PK 유전자는 PARP 저해제인 올라파립(AZD2281)에 대한 감수성 예측용 바이오 마커로서의 가능성을 보여준다.
실시예 7. DNA-PK 유전자 겹핍 시 올라파립(AZD2281)에 대한 DNA 복구 활성 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자 존재 시 DNA-PK 유전자 존재 유무와 올라파립(AZD2281)에 대한 DNA 복구 활성을 분석하고자, p53 정상 유전자가 존재하는 세포주 HCT116에 DNA-PK 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 올라파립(AZD2281)처리에 따른 NHEJ(Non-homologous end joining) DNA 복구 활성을 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자가 정상인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 DNA-PK siRNA(서열번호 3; DNA-PK siRNA 5'-AAAGGGCCAAGCUGUCACUCU-3')를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 pEGFP-N1 vector(Clontech)를 HindIII(NEB)로 2시간 enzyme cutting하여 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 각각 1ug씩 세포 내 유입을 시키고 올라파립(AZD2281)을 최대 50uM에서 최소 25uM으로(50uM, 25uM) 처리한 후 37℃에서 24시간 배양하여 GFP의 발현을 비교함으로써 NHEJ(Non-homologous end joining) DNA 복구 활성을 확인하였다.
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, DNA-PK 유전자만 감소 시킨 경우 감소 시키지 않은 경우보다 GFP의 발현이 상대적으로 낮고 DNA-PK 유전자를 감소 시키고 올라파립(AZD2281)을 처리한 경우에 GFP의 발현이 올라파립(AZD2281)을 처리 하지 않은 경우에 비해 더 낮게 발현하는 것으로 관찰되었고, 도 7b에 나타낸 바와 같이, DNA-PK 유전자를 감소시키고 올라파립(AZD2281)을 처리한 경우에 GFP가 발현되는 세포의 수가 올라파립(AZD2281)을 처리하지 않은 경우에 비해 더 적은 수로 발현하는 것으로 관찰되어 DNA-PK 유전자가 감소되어 있는 경우 올라파립(AZD2281)에 의해 NHEJ(Non-homologous end joining) DNA 복구 활성이 낮은 것을 확인하였다.
<110> THE ASAN FOUNDATION <120> Novel Biomarkers for Predicting Susceptibility to PARP Inhibitor and Uses Thereof <130> ASAN1.95p-1 <150> KR 10-2014-0096661 <151> 2014-07-29 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATM siRNA <400> 1 aagcgccuga uucgagaucc uuu 23 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATR siRNA <400> 2 aaccuccgug auguugcuug a 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-PK siRNA <400> 3 aaagggccaa gcugucacuc u 21 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XLF siRNA <400> 4 gcauuacagu gccaaguga 19 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XRCC4 siRNA <400> 5 aaucuuggga cagaaccuaa a 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA ligase IV siRNA <400> 6 aagccagaca aaagagguga a 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XLF forward primer <400> 7 gaggtccaag tgggacagaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XLF reverse primer <400> 8 gtgtggtgct ttcttgctga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XRCC4 forward primer <400> 9 ggcaatggaa aaagggaaat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XRCC4 reverse primer <400> 10 cggtcagcag tcatttcaga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA ligase IV forward primer <400> 11 gcagcctcgc tttatgattc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA ligase IV reverse primer <400> 12 ctgccagatc agaggctttc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-PK Exon5 forward primer <400> 13 cccgcactac attgatgtac 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-PK Exon5 reverse primer <400> 14 taagaccttg gtagagaaaa cc 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-PK Exon76 forward primer <400> 15 tgacaggatt ggagcaatga tg 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-PK Exon76 reverse primer <400> 16 gccagtccat acctgaataa ac 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-PK 7825 site forward primer <400> 17 ccagcatgag cccagattat 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-PK 7825 site reverse primer <400> 18 tcagatgagg gactggtgtg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-PK 9185 site forward primer <400> 19 aagccgagaa ggatttttgg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-PK 9185 site reverse primer <400> 20 tcagatgagg gactggtgtg 20 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 siRNA <400> 21 aagacuccag ugguaaucua c 21

Claims (24)

  1. 대장암 환자 유래의 생물학적 시료 내 p53 유전자(gene bank number: NM_000546.5) 및 DNA-PK 유전자(DNA-dependent protein kinase)(gene bank number: NM_006904.6)의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는, 대장암에서의 PARP 저해제(poly ADP ribose polymerase)인 AZD2281(올라파립, Olaparib)에 대한 감수성 예측을 위한 정보제공 방법으로서,
    상기 p53 유전자의 유전자형이 정상형(gene bank number: NM_000546.5)이고, 상기 DNA-PK 유전자의 유전자형이 돌연변이형인 경우 PARP 저해제에 대하여 감수성이 있는 것으로 판단하며;
    상기 DNA-PK 유전자의 돌연변이형은 DNA-PK(gene bank number: NM_006904.6) 게놈 엑손 5의 487번째 염기부터 496번째 염기까지 반복되는 10개의 아데닌(adenine) 염기가 9개로 프레임쉬프트(frameshift)되는 경우, 엑손 76의 10,807번째 염기부터 10,814번째 염기까지 반복되는 8개의 아데닌(adenine) 염기가 9개로 프레임쉬프트(frameshift)되는 경우, 7825번째 염기인 아데닌(adenine)이 시토신(cytosine)으로 치환되는 경우, 및 9185번째 염기인 티민(thymine)이 구아닌(guanine)으로 치환되는 경우로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경우인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 삭제
  3. p53 유전자 및 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase)(gene bank number: NM_006904.6) 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 대장암에서의 PARP 저해제인 AZD2281(올라파립, Olaparib)에 대한 감수성 예측용 조성물로서,
    상기 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase)(gene bank number: NM_006904.6) 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는, DNA-PK(gene bank number: NM_006904.6) 게놈 엑손 5의 487번째 염기부터 496번째 염기까지 반복되는 10개의 아데닌(adenine) 염기가 9개로 프레임쉬프트(frameshift)되는 경우, 엑손 76의 10,807번째 염기부터 10,814번째 염기까지 반복되는 8개의 아데닌(adenine) 염기가 9개로 프레임쉬프트(frameshift)되는 경우, 7825번째 염기인 아데닌(adenine)이 시토신(cytosine)으로 치환되는 경우, 및 9185번째 염기인 티민(thymine)이 구아닌(guanine)으로 치환되는 경우로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경우의 DNA-PK 유전자 돌연변이형을 타겟으로 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 프라이머는, 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍; 및 서열번호 17 및 18의 프라이머 쌍; 및 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍;으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 3 항의 조성물을 포함하는, 대장암에서의 PARP 저해제인 AZD2281(올라파립, Olaparib)에 대한 감수성 예측용 키트.
  11. 삭제
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  15. DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자 발현 또는 이의 단백질 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 대장암에서의 PARP 저해제인 AZD2281(올라파립, Olaparib)에 대한 감수성 증진제로서,
    상기 억제제는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 siRNA이며;
    상기 대장암 내 p53 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준은 정상인 것을 특징으로 하는, 감수성 증진제.
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  22. 제 15 항에 있어서, 상기 감수성 증진제는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 감수성 증진제.
  23. 제 15 항의 감수성 증진제 및 PARP 저해제인 AZD2281(올라파립, Olaparib)를 유효성분으로 포함하는, 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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