WO2016018089A1 - Parp 저해제에 대한 감수성 예측용 신규한 바이오 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Parp 저해제에 대한 감수성 예측용 신규한 바이오 마커 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2016018089A1
WO2016018089A1 PCT/KR2015/007966 KR2015007966W WO2016018089A1 WO 2016018089 A1 WO2016018089 A1 WO 2016018089A1 KR 2015007966 W KR2015007966 W KR 2015007966W WO 2016018089 A1 WO2016018089 A1 WO 2016018089A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
cancer
dna
parp
sensitivity
Prior art date
Application number
PCT/KR2015/007966
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김태원
진동훈
홍승우
문재희
신재식
황이연
김정희
이하름
최은경
김승미
정수아
하승희
이대희
이은영
이슬
이정신
이재련
홍용상
김규표
김정은
박성준
김봉철
Original Assignee
재단법인 아산사회복지재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 아산사회복지재단 filed Critical 재단법인 아산사회복지재단
Publication of WO2016018089A1 publication Critical patent/WO2016018089A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention was made by the task number HI06C0868 under the support of the Ministry of Health and Welfare of the Republic of Korea, the research and management institution of the task is the Korea Health Industry Development Institute, the research project name "Seoul Asan Hospital leading characterization research project", the research project title “Wnt Development of Targeted Anticancer Drugs ", the lead organization is Seoul Asan Hospital's Leading Cancer Research Group, and the research period is 2011.12.01 ⁇ 2016.11.30.
  • the present invention has been made by the task number 2013R1A2A2A01067394 under the support of the Ministry of Science, ICT and Future Planning, the research management specialized organization of the project is the Korea Research Foundation, the research project name is "medium-level researcher support project”, the research project name is "E3 involved in the Ubiquitination pathway Identifying the role of p34SEI-1 as a co-factor of ligase ", the host institution is Ulsan University, and the research period is from December 1, 2016 to November 30, 2016.
  • the present invention relates to novel biomarkers and their use for predicting susceptibility to PARP inhibitors.
  • the responsiveness of the living body when the anticancer agent is administered depends largely on the sensitivity of the cancer cell to which the target of the agent is to this agent.
  • the sensitivity of such cancer cells to drugs is greatly different for each cancer cell. This difference in sensitivity is due to the quantitative or qualitative difference of the target molecule of the drug or a factor related thereto, or the acquisition of drug resistance.
  • genetic changes in cancer cells that are specific when the target cancer cells show sensitivity to the drug can be identified, early determination of the effect of the drug, establishment of the treatment method, selection of a new treatment method, etc. It becomes possible and is very advantageous.
  • cancer tissues obtained by living tissue pieces or the like prior to treatment are separated from cancer cells according to a conventional method and then subjected to drug treatment, and it is determined whether the cancer cells are drug sensitive by the above-described changes. It is very clinically useful because it can predict in advance whether the treatment is effective.
  • a novel approach for the treatment of cancer in recent years has been about synthetic lethality, which means that a cell can survive if only one of the two genes (or two gene products) has a mutation. Mutations in all of the dog's genes means that the cell will die. Examples of inducing death by the genetic interaction of two or more such mutations include BRCA1 / 2 and olaflip.
  • synthetic lethality is a combination of mutations and drugs that kill cancer cells. Targeting genes (or gene products) that are synthetically killed by cancer-related mutations kills only cancer cells and survives normal cells.
  • synthetic lethality provides a framework for the development of anticancer agents. However, due to the lack of identification of synthetic lethal genes (and gene products), there is little research on this.
  • Olaparib is an anticancer agent having a function of inhibiting abnormal proliferation of cancer cells, and is an inhibitor of "PARP protein".
  • PARP is a protein that repairs DNA when damaged in the cell, and plays a big role in contributing to the cell's completion of DNA repair and continuous proliferation.
  • Olaparib inhibits the proliferation of cancer cells by inhibiting the function of this PARP.
  • Olaparip is well known as a target therapy for ovarian cancer and breast cancer, and is particularly known as an effective anticancer agent for cancer patients who have genetic mutations of BRCA1 and BRCA2.
  • the present inventors have developed a method for predicting susceptibility to PARP inhibitors, which are anticancer agents in colorectal cancer, to repair DNA as a biomarker that predicts susceptibility to colorectal cancer of olopalip, one of the PARP inhibitors.
  • Gene expression and the normal and / or suppression pattern of p53 gene and DNA-PK gene and gene mutation were analyzed.
  • the normal and / or inhibitory expression of p53 gene and / or DNA-PK gene in colorectal cancer cells The present invention was completed by confirming that the degree of apoptosis due to drug susceptibility of olopapar according to the gene mutation is different.
  • an object of the present invention is to provide a biomarker for predicting sensitivity to PARP inhibitors.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for predicting sensitivity to a PARP inhibitor.
  • Another object of the present invention to provide a kit for predicting sensitivity to PARP inhibitors.
  • Another object of the present invention is to provide a method for predicting sensitivity to a PARP inhibitor.
  • Another object of the present invention to provide a sensitivity enhancer for PARP inhibitors.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising a PARP inhibitor and a PARP inhibitor as an active ingredient.
  • another object of the present invention is to provide a method for enhancing sensitivity to a PARP inhibitor, comprising co-administering a sensitivity enhancer to the PARP inhibitor and a PARP inhibitor to a subject.
  • the present invention provides a PARP comprising a p53 gene (NM_000546.5) and / or a DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) (gene bank number: NM_006904.6) gene. It provides a biomarker for predicting sensitivity to (poly ADP ribose polymerase) inhibitor.
  • a PARP comprising a p53 gene (NM_000546.5) and / or a DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) (gene bank number: NM_006904.6) gene. It provides a biomarker for predicting sensitivity to (poly ADP ribose polymerase) inhibitor.
  • the biggest feature of the present invention is to predict sensitivity to PARP-1 inhibitor using p53 gene, DNA-PK (DNA-dependent protein kinase) gene as a biomarker.
  • the biomarker of the present invention may be an indicator of sensitivity to anticancer drugs, and may be used for treatment of cancer development, development and / or metastasis since it is excellent in accuracy and reliability as a sensitivity marker for anticancer drugs.
  • sensitivity means whether a particular drug has an effect on the cancer of an individual patient.
  • the specific drugs are mainly anticancer agents, and these anticancer agents may or may not show effects depending on the type of cancer. Moreover, even if it is a kind of cancer recognized as effective, it is known that there may be a case where an effect is shown and an effect does not show by individual patients. Whether an anticancer agent is effective for cancer of each individual patient is called anticancer drug sensitivity. Therefore, if the patient (responder) who can expect the effect and the patient (non-responder) who cannot expect the effect according to the present invention can be predicted, chemotherapy with high efficacy and safety can be realized.
  • prediction is used herein to refer to the likelihood that a subject patient will respond favorably or adversely to a drug or set of drugs.
  • the prediction relates to the extent of this response.
  • the prediction relates to whether and / or the probability that a patient will survive without cancer recurrence after treatment, for example after treatment with a particular therapeutic agent and / or after surgical removal of the primary tumor and / or chemotherapy for a particular period of time.
  • the predictions of the present invention can be used clinically to determine treatment by selecting the most appropriate mode of treatment for colorectal cancer patients.
  • the prediction of the present invention is to determine whether the patient will respond favorably to a therapeutic treatment, such as a given therapeutic treatment, eg, administration of a given therapeutic agent or combination, surgical intervention, chemotherapy or the like, or whether the patient's long-term survival is possible after the therapeutic treatment. It is a useful tool for predicting whether or not.
  • a therapeutic treatment such as a given therapeutic treatment, eg, administration of a given therapeutic agent or combination, surgical intervention, chemotherapy or the like. It is a useful tool for predicting whether or not.
  • the invention provides p53 gene and / or DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) gene expression levels; Or it provides a composition for predicting susceptibility to PARP inhibitor, including an agent for measuring the level of protein expression thereof.
  • DNA-PK DNA-dependent protein kinase
  • the measurement of the p53 gene and / or DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) gene expression level includes measuring and / or analyzing the presence of mutations in the gene.
  • the present invention can predict the effect on sensitivity to PARP-1 inhibitors by confirming the presence of mutations in the genes. .
  • the expression "measurement of expression level of a gene or protein thereof" as used herein means detecting a target to be detected in a sample.
  • the target to be detected is mRNA and / or protein of the corresponding gene in the sample. In other words, by detecting RNA or a protein product of the transcription product of the gene, whether or not the expression of the gene can be confirmed.
  • RNA or protein can usually be carried out by extracting RNA or protein from a sample separated from the subject, and detecting the RNA or protein in the extract.
  • the detection of such RNA or protein can be measured by immunoassay methods, hybridization reactions and amplification reactions, but can be easily carried out using various techniques known in the art, without being limited thereto.
  • the agent for measuring the gene expression level comprises an antisense oligonucleotide, primer pair or probe that specifically binds to the mRNA of the gene.
  • the agent for measuring the expression of the mRNA is selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, primer pairs, probes and combinations thereof specific to the gene. That is, detection of a nucleic acid can be performed by an amplification reaction using a nucleic acid molecule encoding a gene or one or more oligonucleotide primers hybridized to the complement of the nucleic acid molecule.
  • detection of mRNA using a primer may be performed by amplifying a gene sequence using an amplification method such as PCR, and then checking whether the gene is amplified by a method known in the art.
  • It can also be performed by amplifying a gene sequence using an amplification method such as PCR, and then checking whether the gene is mutated by a method known in the art using a gene sequence analysis method such as sanger sequencing.
  • an amplification method such as PCR
  • the agent for measuring the protein expression level comprises an antibody, peptide or nucleotide that specifically binds to the protein.
  • the agent for measuring the expression of the protein refers to an antibody that specifically binds to the protein, and includes all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant antibodies, and combinations thereof.
  • Such antibodies are polymorphic, monoclonal, recombinant and two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of antibody molecules such as Fab, F (ab '). ), F (ab ') 2 and Fv.
  • Antibody production can be readily prepared using techniques well known in the art to which this invention pertains, and antibodies made and commercially available can be used.
  • the PARP is PARP-1, PARP-2 or PARP-3, most preferably PARP-1.
  • the PARP inhibitor is neuralgia, myasthenia gravis, muscular dystrophy, muscular dystrophy (ALS), progressive muscular atrophy, Guillain-Barre syndrome, Hectinton's disease, Alzheimer's disease Disease, Parkinson's disease, atherosclerosis, angina pectoris, myocardial infarction, heart attack, cardiovascular injury by bypass surgery, ACTH producing tumor, acute lymphocytic or lymphoblastic leukemia, acute or chronic lymphocytic leukemia, acute nonlymphoid Leukemia, bladder cancer, brain tumor, breast cancer, cervical cancer, chronic myeloid leukemia, lymphoma, endometriosis, esophageal cancer, bladder cancer, Ewing's sarcoma, tongue cancer, Hopkins lymphoma, Kaposi's sarcoma, kidney cancer, liver cancer, lung cancer, mesothelioma , Multiple myeloma, neuroblastoma, non-Hop
  • ACTH producing tumor acute lymphocytic or lymphoblastic leukemia, acute or chronic lymphocytic leukemia, acute nonlymphocytic leukemia, bladder cancer, brain tumor, breast cancer, cervical cancer, chronic myeloid leukemia, lymphoma, endometriosis, esophageal cancer , Bladder cancer, Ewing's sarcoma, tongue cancer, Hopkins lymphoma, Kaposi's sarcoma, kidney cancer, liver cancer, lung cancer, mesothelioma, multiple myeloma, neuroblastoma, non-Hopkin's lymphoma, osteosarcoma, ovarian cancer, neuroblastoma, mammary cancer, prostate Cancer, pancreatic cancer, colon cancer, penis cancer, retinoblastoma, skin cancer, gastric cancer, thyroid pressure, uterine cancer, testicular cancer, Wilms' tumor, and tropoblastoma. It is a cure for colorectal
  • colon cancer refers to rectal cancer, colon cancer and anal cancer collectively.
  • the PARP inhibitor AZD2281 (olaparib, Olaparib), ABT888 (Veliparib, Veliparib), AG014699 (Lucaparib, Rucaparib), MK-4827 (Niraparib, Niraparib), BMN- 673 (Talazoparib), BSI201 (Iniparib), BGP15 (O- (3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl) nicotinic-amidoxime), INO1001 (3-Aminobenzamide), ONO2231, Nicotinamide (nicotinamide), 3-amino benzamide, 3,4-dihydro-5- [4- (1-piperidinyl) butoxy] -1 (2H) -isoquinolone (3,4 -dihydro-5- [4- (1-piperidinyl) butoxy] -1 (2H) -isoquinolone, benzamide, quinolone, isoquino
  • composition of the present invention as well as agents for measuring the expression and gene mutation of the above-described genes, as well as labels that enable quantitative or qualitative measurement of antigen-antibody complex formation, conventional tools used in immunological analysis, reagents And the like may be further included.
  • Labels that enable qualitative or quantitative determination of antigen-antibody complex formation include, but are not limited to, enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules, and radioisotopes.
  • Enzymes that can be used as detection labels include ⁇ -glucuronidase, ⁇ -D-glucosidase, ⁇ -D-galactosidase, urease, peroxidase, alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, and glucoseoxy Multidase, Hexokinase and GDPase, RNase, Glucose Oxidase War Luciferase, Phosphofructokinase, Phosphoenolpyruvate Carboxylase, Aspartate Aminotransferase, Phosphorylpyruvate Decarboxylase, ⁇ - Latamases and the like, but are not limited thereto.
  • Fluorescent materials include, but are not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde, fluorescamine, and the like.
  • Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives.
  • Luminescent materials include, but are not limited to, acridinium ester, luciferin, luciferase, and the like.
  • Microparticles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like.
  • the redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K 4 W (CN) 8 , [Os (bpy) 3 ] 2+ , [RU (bpy) 3 ] 2+ , [MO (CN) 8 ] 4-, and the like.
  • Radioisotopes include, but are not limited to, 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 13 1I, 186 Re, and the like.
  • Such tools or reagents include, but are not limited to, suitable carriers, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like.
  • the label may include a substrate and a reaction terminator capable of measuring enzyme activity.
  • Carriers include soluble carriers, insoluble carriers, and examples of soluble carriers include physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, and examples of insoluble carriers include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, poly Acrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharides, other paper, glass, metal, agarose and combinations thereof.
  • composition of the present invention includes the above-described biomarker as an active ingredient, the overlapping description is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the present invention provides a kit for predicting sensitivity to a PARP inhibitor, comprising the composition.
  • the kit may include not only agents for measuring the expression level of the gene, but also tools, reagents, and the like commonly used in the art for immunological analysis.
  • Such tools or reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling materials capable of producing detectable signals, chromophores, solubilizers, cleaners, buffers, stabilizers, and the like.
  • the label is an enzyme, it may include a substrate and a reaction terminator capable of measuring enzyme activity.
  • Carriers include soluble carriers, insoluble carriers, and examples of soluble carriers include physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, and examples of insoluble carriers include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, poly Acrylonitrile, fluorine resin, crosslinked dextran, polysaccharides, polymers such as magnetic fine particles plated with latex metal, other papers, glass, metals, agarose and combinations thereof.
  • kit of the present invention includes the above-described biomarker as a configuration, duplicated content is omitted to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the present invention provides a method for predicting susceptibility to a PARP inhibitor comprising the following steps:
  • step (c) determining the susceptibility to the PARP inhibitor of the subject based on the result of confirming the expression level measured in step (b).
  • the method further comprises the step (b) measuring the DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) gene or its protein expression level and / or the presence of the gene mutation.
  • DNA-PK DNA-dependent protein kinase
  • a biological sample is obtained from a target patient, the expression level of the genes described above is measured in the sample, and the expression level of the genes described is compared with that of the normal (wild type). If inhibited or reduced and the presence of a mutation in the gene, the process comprises determining that the sample is sensitive to PARP-1 inhibitors.
  • the prediction method of the present invention is characterized in that the expression of specific genes in a sample is used as an index of sensitivity of the cancer cell to the anticancer agent.
  • the method comprises the steps of (c) when (i) the expression level of the p53 gene or protein thereof and / or the gene sequence is normal (wild type); And / or (ii) the expression level of the DNA-PK gene or protein thereof is low compared to normal and in the case of gene mutation, it is determined that the subject is sensitive to the PARP inhibitor.
  • step (c) of the present invention is based on the expression check and gene mutation analysis results measured in step (b), p53 gene is normally present and / or expressed (function) and the gene sequence Is normal and the expression level of the DNA-PK gene is inhibited and / or reduced compared to the normal (wild-type) value and if the gene sequence is mutated, the tumor cells obtained from the subject patient are susceptible to PARP inhibitors, which are anticancer agents. It is determined that there is.
  • the term “low expression” is used to refer to the expression level of the genes, when the biomarker indicates or is an abnormal process, disease or other condition in the subject, the expression level or value of the wild type of the biomarker gene of interest. ; Or the value or level of the biomarker in the biological sample that is lower than the value or level range of the biomarker detected in the biological sample obtained from a healthy or normal individual. It may also be referred to as having "differential levels” or “differential values” or “differently expressed” compared to "normal” expression levels or values of biomarkers, as well as quantitative differences in expression. Include both qualitative differences.
  • the present invention provides an expression level of the p53 gene and / or DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) gene;
  • the measurement of the expression level of the protein of the gene further includes determining whether the mutation in the gene.
  • the present invention may further comprise the step of confirming the presence of the mutation of the genes.
  • the presence of one or more mutations in the gene may lead to inhibition of expression of any of the genes, which may affect sensitivity to PARP-1 inhibitors as described above.
  • mutation includes base substitution, deletion, insertion, amplification, and rearrangement of the nucleotide and amino acid sequences of the gene of interest.
  • Nucleotide variation refers to a change in nucleotide sequence (eg, insertion, deletion, inversion or substitution of one or more nucleotides, such as single nucleotide polymorphism (SNP)) with respect to a reference sequence (eg wild type sequence).
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • nucleotide variations can be somatic mutations or germline polymorphisms.
  • amino acid variations may include changes in amino acid sequence (eg, insertion, substitution or deletion of one or more amino acids, such as internal deletions or truncations at the N- or C-terminus, relative to a reference sequence (eg wild type sequence)). (truncation)).
  • Detection of such mutations can be performed by target molecule cloning and sequencing using techniques well known in the art. DNA sequencing, for example; Primer extension, including allele-specific nucleotide incorporation assays and allele-specific primer extension assays (eg, allele-specific PCR, allele-specific ligation chain reaction (LCR) and gap-LCR) black; Allele-specific oligonucleotide hybridization assays (eg, oligonucleotide ligation assays); Cleavage protection assays that use protection from cleavage agents to detect mismatched bases in nucleic acid duplexes; MutS protein binding assays; Electrophoretic analysis comparing the mobility of variants and wild type nucleic acid molecules; Denaturation-gradient gel electrophoresis (as in DGGE, eg, Myers et al.
  • DNA-PK gene bank number: NM_006904.6
  • a frameshift of 8 adenine bases repeated from 10,807th base to 10,814th base frame is shifted into 9, Adenine, a 7825th base, is substituted with cytosine, and 9185th base, thymine
  • biological sample refers to any sample obtained from an individual whose expression of the biomarker of the invention can be detected.
  • the biological sample is any one selected from the group consisting of saliva, biopsy, blood, skin tissue, liquid culture, feces and urine, without being particularly limited thereto. It can be prepared by treatment in a method conventionally used in the art.
  • the duplicated content is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the present invention comprises a DNA-PK (DNA-dependent protein kinase) gene expression or a susceptibility enhancer for a PARP inhibitor of the subject comprising an inhibitor that inhibits the expression or activity of the protein as an active ingredient or It provides a composition for enhancing sensitivity.
  • DNA-PK DNA-dependent protein kinase
  • a susceptibility enhancer for a PARP inhibitor of the subject comprising an inhibitor that inhibits the expression or activity of the protein as an active ingredient or It provides a composition for enhancing sensitivity.
  • the subject means that the p53 gene or its protein expression level is normal and has a wild type of p53 gene.
  • the p53 normal gene when the p53 normal gene is present in the treatment of olhaparip and measuring the cancer cell survival rate according to the expression of DNA-PK gene, as a result of suppressing the expression level of the DNA-PK gene in the cancer cell While it was confirmed that the cell viability was excellently reduced, when the p53 normal gene is not present, when DNA-PK gene expression was suppressed, it was confirmed that the cell viability was not significantly affected.
  • this includes the presence of the p53 normal gene (normal expression and function of the p53 normal gene); And it suggests that the inhibition of expression of DNA-PK gene enhances the sensitivity of cancer cells to olaparip, based on this, the present invention provides an excellent effect of enhancing the sensitivity to the PARP inhibitor of the subject.
  • the sensitivity enhancer or the composition for promotion of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that may be used in the present invention may be used by selecting conventional excipients, disintegrants, binders, glidants, other additives such as stabilizers, emollients, emulsifiers and the like.
  • microcrystalline cellulose, lactose, low-substituted hydroxycellulose, or the like may be used as an excipient, sodium starch glycolate, calcium monohydrogen phosphate, or the like may be used as a disintegrant.
  • As the binder polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropyl cellulose, or the like may be used, and the lubricant may be selected from magnesium stearate, silicon dioxide, talc and the like.
  • the presence of p53 normal gene and inhibition of expression of DNA-PK gene reduce cancer cell growth upon treatment with PARP inhibitor.
  • the expression of the DNA-PK gene is siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), ribozyme, DNAzyme, PNA (peptide) that specifically binds to mRNA of the DNA-PK gene. nucleic acids), antisense oligonucleotides, antibodies, aptamers, natural extracts, and chemicals.
  • RNA small interference RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • miRNA miRNA
  • siRNA refers to a small RNA fragment of 21-25 nucleotides in size that is produced by cleavage of double-stranded RNA by Dicer to specifically bind to mRNA having complementary sequences to inhibit expression. Say that. By means of specifically binding to DNA-PK mRNA for the purpose of the present invention means inhibiting the expression of the gene.
  • siRNA can be synthesized chemically or enzymatically. The method for producing siRNA is not particularly limited, and methods known in the art can be used.
  • the siRNA comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • antisense oligonucleotide is a nucleotide sequence that binds to the miRNA complementarily to inhibit expression, but includes, but is not limited to, antisense RNA, antisense DNA and antagonist mRNA.
  • the method of the present invention enhances sensitivity to PARP inhibitors by using the expression levels of the p53 gene and the DNA-PK gene, which are the biomarkers described above, the overlapping description is omitted to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the above-described sensitivity enhancer and PARP inhibitor as an active ingredient.
  • the p53 normal gene and the DNA-PK gene interact with each other to significantly increase the susceptibility to PARP inhibitors of cancer cells to improve cell death.
  • the inhibitor of expression of the DNA-PK gene or a protein thereof as an active ingredient of the composition of the present invention does not affect normal cells and specifically inhibits expression levels only in cancer cells to induce apoptosis of cancer cells.
  • composition of the present invention can enhance the cell death of cancer cells by administering the expression inhibitor or activity inhibitor of the DNA-PK gene or protein thereof to the cancer cells together with the PARP inhibitor, and can be very useful as an anticancer agent.
  • Cancer a disease to be improved, prevented or treated by the compositions of the present invention, is an aggressive property in which cells divide and grow, ignoring normal growth limits, and an invasive property that penetrates surrounding tissues. , And generically refers to diseases caused by cells having metastatic properties that spread to other parts of the body. In the present specification, the cancer is also used in the same sense as a malignant tumor.
  • Cancers to which the compositions of the present invention can be applied include breast cancer, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer. cancer, skin cancer, head or neck cancer, cutaneous or intraocular melanoma, uterine sarcoma, ovarian cancer, rectal cancer , Anal cancer, colon cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical cancer, small intestine cancer, endocrine cancer cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, kidney cancer, soft tissue tumor, urethral cancer, prostate cancer, bronchogenic cancer ), But not limited to bone marrow tumor (bone marrow tumor).
  • composition of the present invention can be applied to the prevention or treatment of colon cancer.
  • prevention means to inhibit the occurrence of a disease or condition in an animal that has not been diagnosed as having a disease or condition but is prone to such disease or condition.
  • treatment refers to (i) inhibiting the development of a disease or condition; (ii) alleviation of the disease or condition; And (iii) elimination of the disease or condition.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention can be determined in a variety of ways depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction. It may be prescribed.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001-1000 mg / kg (body weight) per day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and when administered parenterally, may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like. It is preferable that the route of administration is determined according to the type of the disease to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied.
  • the concentration of the inhibitor of expression of the DNA-PK gene or its protein in the enhancer which is an active ingredient included in the composition of the present invention, is determined in consideration of the purpose of treatment, the condition of the patient, the period of time required, the severity of the disease, and the like and is limited to a specific range of concentration. It doesn't work.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • composition of the present invention improves the cell death of cancer cells by using the above-described sensitivity enhancer and PARP inhibitor, duplicate descriptions are omitted to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the present invention provides a method for enhancing sensitivity to a PARP inhibitor, comprising co-administering the above-described sensitivity enhancer and a PARP inhibitor to a corresponding subject.
  • the p53 normal gene and the DNA-PK gene interact with each other to significantly increase the sensitivity of cancer cells to PARP inhibitors to improve cell death.
  • the sensitivity of the cancer cell to the PARP inhibitor may be enhanced.
  • the method of the present invention enhances sensitivity to PARP inhibitors by using the expression levels of the p53 gene and the DNA-PK gene, which are the biomarkers described above, the overlapping description is omitted to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the biomarker for predicting sensitivity to the PARP inhibitor of the present invention it is possible to reliably determine the sensitivity of the individual patient before the start of treatment, so that an anticancer agent having a high therapeutic effect can be selected. In addition, unnecessary side effects can be avoided because the use of an anticancer agent for which no effect is obtained can be avoided.
  • Figure 1a shows the results of the anti-cancer activity of Olaparib (AZD2281) with or without the p53 gene.
  • Figure 1b shows the results of p53 activity and apoptosis of Olaparip (AZD2281) with or without the p53 normal gene.
  • Figure 1c shows the results of p53 activity and apoptosis of Olaparip (AZD2281) according to the function of the p53 gene.
  • Figure 1d shows the results of apoptosis analysis of Olaparip (AZD2281) according to the inhibition of the expression of the p53 gene.
  • Figure 2a shows the results of apoptosis analysis of Olaparip (AZD2281) according to the presence or absence of the DNA repair gene in the presence of the normal p53 gene.
  • Figure 2b shows the results of apoptosis analysis of Olaparip (AZD2281) according to the presence or absence of the DNA repair gene in the absence of the normal p53 gene.
  • Figure 2c shows the results of apoptosis analysis of olaparip (AZD2281) with or without the p53 normal gene and DNA-PK gene.
  • Figure 2d shows the results of apoptosis analysis of Olaparip (AZD2281) according to the absence of the function of the p53 gene and the presence of the DNA repair gene.
  • Figure 3a shows the results of apoptosis analysis of Olaparip (AZD2281) according to the presence or absence of other DNA repair genes in the presence of the normal p53 gene.
  • Figure 3b shows the results of apoptosis analysis of Olaparip (AZD2281) according to the presence or absence of other DNA repair genes in the absence of the normal p53 gene.
  • Figure 4a shows the results of apoptosis analysis of Olaparip (AZD2281) in the absence of the DNA repair gene in the presence of the normal p53 gene.
  • Figure 4b shows the results of apoptosis analysis of Olaparip (AZD2281) in the absence of the DNA repair gene in the absence of the normal p53 gene.
  • 5 shows the results of p53 and DNA-PK genotyping in tumor tissue derived from colon cancer patients.
  • Figure 6 shows the results of apoptosis analysis of Olaparip (AZD2281) according to p53 and DNA-PK genotype in colorectal cancer-derived tumor cells.
  • Figure 7 shows the results of DNA repair activity analysis for olaflip (AZD2281) in the DNA-PK gene deficiency.
  • the conditions and methods of the experiment were as follows: A total of 19 human colorectal cancer cell lines were cultured in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin), and each cell line was stored at 37 ° C. in a 96-well plate at 2 ⁇ 10 3 per well. Incubate for 24 hours, and olaparip (AZD2281) was diluted 2-fold from 100 uM up to 0.390625 uM (100 uM, 50 uM, 25 uM, 12.5 uM, 6.25 uM, 3.125 uM, 1.5625 uM, 0.78125 uM, 0.390625 uM) ) And incubated at 37 ° C.
  • FIG. 1A when the p53 gene is present and / or normally expressed, it shows that susceptibility to olopalip (AZD2281) is high.
  • the present inventors analyzed the degree of p53 activity and apoptosis of Olaparib (AZD2281) according to the presence or absence of the normal p53 gene, in the cell line HCT116 p53 null deletion cell line HCT116 and the HCT116 p53 gene is present After treatment with Olaparip (AZD2281) by concentration, the degree of cell death was confirmed by measuring the number of cells by trypan blue staining method.
  • Each cell was measured using a centrifuge, and the cells were lysed using RIPA buffer. Then, proteins were extracted using a high-speed centrifuge to treat each oligolip (AZD2281) group.
  • 30 ug of protein per untreated cell was electrophoresed by western blot to isolate proteins and transfer them to PDVF membrane to transfer p53, p-p53, cleaved PARP and tubulin antibodies to 5% skim milk. After diluting at 1: 2000 ratio for 12 hours at 4 ° C, washing with TBS-T buffer three times for 15 minutes, and then diluting the secondary antibody to 5% skim milk at 1: 2000 ratio for 2 hours at room temperature for 15 minutes. After washing three times with TBS-T buffer to induce luminescence of PDVF membrane using ECL buffer, the expression of protein for each antibody was developed using X-ray film.
  • apoptosis (AZD2281) induced apoptosis by concentration (increase of cleaved PARP) only in the cell line in which the normal p53 gene was present, and the activity of p53 was increased.
  • the present inventors studied the RKO and LoVo colorectal cancer cell lines and the p53 gene mutated p53 genes. After treatment with oligolip (AZD2281) for each concentration in Colo205, the degree of cell death was confirmed by measuring the number of cells by trypan blue staining method.
  • the conditions and methods of the experiment were as follows: RKO and LoVo colon cancer cell lines with normal p53 gene and Colo205 human colon cancer cell line with mutated p53 gene were cultured in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin). Cell lines were incubated for 24 hours at 37 ° C.
  • apoptosis (AZD2281) induced cell death by concentration (increase of cleaved PARP) only in cell lines in which p53 normal genes function, and p53 activity was increased.
  • the inventors When the inventors inhibited the expression level of p53 gene by siRNA knockdown method, the inventors climbed up to HCT116 colon cancer cell line, a cell line in which p53 normal gene functions, to analyze the degree of apoptosis caused by Olaparib (AZD2281). After the treatment of the granules (AZD2281) by concentration, the degree of cell death was confirmed by measuring the number of cells by trypan blue staining method.
  • HCT116 human colorectal cancer cell line with normal p53 gene was cultured in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) and incubated at 37 ° C. for 24 hours at 37 ° C. in 1 ⁇ 10 5 cells per 60 mm plate.
  • P53 siRNA SEQ ID NO: 21; p53 siRNA 5′-AAGACUCCAGUGGUAAUCUAC-3 ′ was introduced into Lipopectamin2000 (invitrogen) and knocked down at 37 ° C. for 48 hours.
  • the cells were treated with lipase (AZD2281) from a maximum of 50 uM to a minimum of 5 uM (50 uM, 25 uM, 10 uM, 5 uM) and incubated at 37 ° C. for 48 hours to treat p53 siRNA and scramble siRNA as a positive control group. Treatment group was counted by counting viable and dead cells by trypan blue staining to determine the degree of apoptosis.
  • lipase ALD2281
  • apoptosis (AZD2281) induced apoptosis by concentration when the p53 gene was functioning, and apoptosis was reduced when the p53 gene was inhibited by olaflip (AZD2281). .
  • HCT116 human colorectal cancer cell line with normal p53 gene was cultured in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) and incubated at 37 ° C. for 24 hours at 37 ° C. in 1 ⁇ 10 5 cells per 60 mm plate.
  • ATM, ATR and DNA-PK siRNA SEQ ID NO: 1; ATM siRNA 5'-AAGCGCCUGAUUCGAGAUCCUUU-3 ', SEQ ID NO: 2; ATR siRNA 5'-AACCUCCGUGAUGUUGCUUGA-3', SEQ ID NO: 3; DNA-PK with Lipopectamin2000 (invitrogen)).
  • siRNA 5'-AAAGGGCCAAGCUGUCACUCU-3 ' was introduced into cells, knocked down at 37 ° C for 48 hours, and each cell was obtained using a centrifuge, and the obtained cells were lysed using RIPA buffer.
  • electrophoresis of 30ug of protein per cell by Western blot method to separate the protein and transfer to PDVF membrane to transfer ATM, ATR, DNA-PK, tubulin antibody 5% skim milk each After diluting at 1: 2000 ratio for 12 hours at 4 ° C, washing with TBS-T buffer three times for 15 minutes, and then diluting the secondary antibody to 5% skim milk at 1: 2000 ratio for 2 hours at room temperature for 15 minutes. After washing three times with TBS-T buffer to induce luminescence of PDVF membrane using ECL buffer, the expression of protein for each antibody was developed using X-ray film.
  • the oligolip (AZD2281) was treated here for each concentration, and the degree of cell death was confirmed by measuring the number of cells by trypan blue staining method.
  • the conditions and methods of the above experiments were incubated in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) HCT116 human colorectal cancer cell line with normal p53 gene, incubated for 24 hours at 37 ° C. with 1 ⁇ 10 5 per well in a 60 mm plate and Lipopectamin2000 (invitrogen). Intracellular influx of ATM, ATR and DNA-PK siRNA were knocked down at 37 ° C.
  • olaflip olaflip
  • 5 uM 25 uM, 10 uM, 5 uM
  • the apoptosis (AZD2281) treated group and the untreated group were counted by a trypan blue staining method to measure the number of viable cells and dead cells.
  • the present inventors In order to analyze the degree of apoptosis of olaparip (AZD2281) according to the presence or absence of a DNA repair gene in the absence of the p53 normal gene, the present inventors have identified ATM, ATR, and DNA, which are known as DNA repair genes, in the cell line HCT116 p53 null, which has deleted the normal p53 gene.
  • the DNA-PK gene was reduced in gene expression by siRNA knockdown method, and then Western blot confirmed the decrease in the expression level of ATM, ATR and DNA-PK protein.
  • the conditions and methods of the experiment were as follows: Cell line HCT116 p53 null human colorectal cancer cell line deleted p53 gene incubated in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) in a 60mm plate, 5 ⁇ 1X10 per well at 37 °C After 24 hours of incubation, ATM, ATR and DNA-PK siRNA were introduced into the cells with Lipopectamin2000 (invitrogen), knocked down at 37 ° C. for 48 hours, and each cell was obtained using a centrifuge. The cells were lysed using RIPA buffer, protein was extracted using a high-speed centrifuge, and 30 ug of protein per cell was electrophoresed by Western blot.
  • the proteins were separated and transferred to PDVF membrane to ATM, After diluting ATR, DNA-PK, and tubulin antibodies at a ratio of 1: 2000 in 5% skim milk, each reaction was performed three times for 15 minutes at 4 ° C for 15 minutes, followed by washing with TBS-T buffer for 2 hours. 1: 2000 By dilution rate for 2 hours at room temperature and washed with TBS-T buffer three times 15 minutes using a X-ray film to induce the luminescence PDVF membrane using the ECL buffer it was developed for expression of the protein of each antibody.
  • the oligolip (AZD2281) was treated here for each concentration, and the degree of cell death was confirmed by measuring the number of cells by trypan blue staining method.
  • the conditions and methods of the above experiments were carried out by incubating HCT116 p53 null human colorectal cancer cell line in which the p53 gene was deleted in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) and incubating at 37 ° C. for 24 hours at 37 ° C. with 1 ⁇ 10 5 per 60 mm plate. Intracellular influx of the ATM, ATR, and DNA-PK siRNA with Lipopectamin2000 (invitrogen) was allowed to knock down at 37 ° C.
  • apoptosis (AZD2281) by apoptosis (AZD2281) did not increase by concentration even if the expression of the ATM, ATR and DNA-PK gene was reduced.
  • the present inventors examined cell lines HCT116 and pCT null which are deleted from p53 gene of HCT116 and HCT116.
  • the DNA-PK gene was reduced in gene expression by siRNA knockdown method, and then Western blot was confirmed to reduce the amount of expression of DNA-PK protein.
  • HCT116 and HCT116 cell lines lacking p53 gene HCT116 p53 null human colorectal cancer cell lines were cultured in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) in a 60 mm plate at 1 ⁇ 10 per well. Incubated at 37 ° C. for 5 hours at 37 ° C. and incubating the DNA-PK siRNA with Lipopectamin2000 (invitrogen) for 24 hours to knock down at 37 ° C. for 48 hours. Each cell was obtained using a centrifuge.
  • -Diluted PK and tubulin antibodies at a ratio of 1: 2000 in 5% skim milk, washed 12 times at 4 ° C for 3 minutes, and then washed three times for 15 minutes with TBS-T buffer. After diluting at a ratio of 2000, reacting at room temperature for 2 hours, washing with TBS-T buffer three times for 15 minutes, inducing luminescence of PDVF membrane using ECL buffer, and developing protein expression for each antibody using X-ray film. It was.
  • the oligolip (AZD2281) was treated here for each concentration, and the degree of cell death was confirmed by measuring the number of cells by trypan blue staining method.
  • cell lines were deleted p53 gene in HCT116 and HCT116 HCT116 p53 null human colon cancer cell line RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) and cultured 1X10 5 each 37 °C per well in 60mm plates in Incubate for 24 hours at and incubate the DNA-PK siRNA in cells with Lipopectamin2000 (invitrogen) and knock down at 37 ° C.
  • oparip (AZD2281) at a maximum of 50 uM to at least 5 uM (50 uM, 25 uM, 10uM, 5uM) after 48 hours incubation at 37 °C was treated with Oparip (AZD2281) group and non-treated group by trypan blue staining to count the number of viable cells and dead cells was measured apoptosis.
  • apoptosis by Olaparip was increased by concentration.
  • apoptosis was increased by concentration when the expression of the DNA-PK gene was reduced only when the p53 normal gene was present.
  • ATM, ATR, DNA- known as a DNA repair gene in the cell line DLD-1 mutated p53 gene The expression of the ATM, ATR, DNA-PK protein was decreased by Western blot after the gene expression was reduced by siRNA knockdown method.
  • Cell line Colo205 human colorectal cancer cell line mutated with p53 gene was cultured in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) in a 60 mm plate at 1x10 5 per well at 37 ° C 24
  • the cells were incubated in time and incubated with ATM, ATR, and DNA-PK siRNA using Lipopectamin2000 (invitrogen), knocked down at 37 ° C. for 48 hours, and each cell was obtained using a centrifuge.
  • Cells were lysed using RIPA buffer, protein was extracted using a high-speed centrifuge, and 30 ug of protein per cell was electrophoresed by Western blot.
  • the proteins were separated and transferred to PDVF membrane to transfer ATM, ATR. Dilute DNA-PK and tubulin antibodies at a ratio of 1: 2000 in 5% skim milk, wash them with TBS-T buffer three times for 15 minutes after 12 hours reaction at 4 ° C, and then wash the secondary antibodies in 5% skim milk. : 2000 rain
  • the expression of the protein of each antibody using a X-ray film to induce the luminescence PDVF membrane was developed by dilution to 2 hours at room temperature and washed with TBS-T buffer three times 15 minutes using ECL buffer to.
  • the oligolip (AZD2281) was treated here for each concentration, and the degree of cell death was confirmed by measuring the number of cells by trypan blue staining method.
  • the conditions and methods of the above experiments were carried out by incubating the human colon cancer cell line Colo205 human colon cancer cell line with p53 gene mutation in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) and incubating 24 hours at 37 ° C. in a 60 mm plate at 5 ° C. for 24 hours and Lipopectamin2000 (invitrogen) knocked down the ATM, ATR, and DNA-PK siRNA into the cells for 48 hours and then knocked down at 37 ° C.
  • olaflip (AZD2281) was reduced from 50 uM to 5 uM (50 uM, 25 uM, 10 uM, 5 uM) and then cultured for 48 hours at 37 °C to count the apoptosis (AZD2281) treated group and untreated group by the trypan blue staining counting the number of viable cells and dead cells.
  • apoptosis (AZD2281) apoptosis according to the presence or absence of a DNA repair gene in the presence of a p53 normal gene
  • siRNA the XLF and XRCC4 genes known as other DNA repair genes in the cell line HCT116 where the p53 normal gene is present After decreasing gene expression by knockdown method, mRNA expression of XLF and XRCC4 genes was reduced by RT-PCR.
  • HCT116 human colorectal cancer cell line with normal p53 gene was cultured in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) and incubated at 37 ° C. for 24 hours at 37 ° C. in 1 ⁇ 10 5 cells per 60 mm plate.
  • XLF and XRCC4 siRNA SEQ ID NO: 4; XLF siRNA 5′-GCAUUACAGUGCCAAGUGA-3 ′, SEQ ID NO: 5; XRCC4 siRNA 5′-AAUCUUGGGACAGAACCUAAA-3 ′
  • Lipopectamin2000 invitrogen
  • each cell was obtained using a centrifuge, and each cell obtained was extracted with total RNA using Trizol RNA extraction. 500ng of total RNA was resynthesized with cDNA to obtain XLF and XRCC4 primers (SEQ ID NO: 7; XLF forward primer 5'-GAGGTCCAAGTGGGACAGAA-3 ', SEQ ID NO: 8; XLF reverse primer 5'-GTGTGGTGCTTTCTTGCTGA-3', SEQ ID NO: 9; XRCC4 forward primer 5'-GGCAATGGAAAAAGGGAAAT-3 ', SEQ ID NO: 10; XRCC4 reverse primer 5'-CGGTCAGCAGTCATTTCAGA-3 ') After electrophoresis, PCR over a 1% agarose gel was performed to determine the expression of XLF and XRCC4 through the Et-Br staining.
  • the oligolip (AZD2281) was treated here for each concentration, and the degree of cell death was confirmed by measuring the number of cells by trypan blue staining method.
  • the conditions and methods of the above experiments were incubated in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) HCT116 human colorectal cancer cell line with normal p53 gene, incubated for 24 hours at 37 ° C. with 1 ⁇ 10 5 per well in a 60 mm plate and Lipopectamin2000 (invitrogen).
  • XlF and XRCC4 siRNA were introduced into cells, knocked down at 37 ° C.
  • olaflip (AZD2281) was reduced from a maximum of 25 uM to a minimum of 10 uM (25 uM, 10 uM).
  • the cells were incubated at 37 ° C. for 48 hours, and the apoptosis (AZD2281) -treated group and the untreated group were counted by the number of viable cells and dead cells by trypan blue staining.
  • apoptosis did not increase apoptosis by reducing the expression level of the XLF and XRCC4 gene.
  • XLF apoptosis
  • HCT116 p53 null a DNA repair gene in the cell line HCT116 p53 null
  • the conditions and methods of the experiment were as follows: Cell line HCT116 p53 null human colorectal cancer cell line deleted p53 gene incubated in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) in a 60mm plate, 5 ⁇ 1X10 per well at 37 °C Incubate for 24 hours at 24 hours and incubate the XLF and XRCC4 siRNAs with Lipopectamin2000 (invitrogen) and knock down at 37 ° C. for 48 hours.Olaphalips (AZD2281) from 25 uM at maximum to 10 uM (25 uM, 10 uM) After treatment, the cells were incubated at 37 ° C. for 48 hours, and the apoptosis (AZD2281) -treated group and the untreated group were counted by the number of viable cells and dead cells by trypan blue staining.
  • apoptosis apoptosis due to the absence of DNA repair genes in the presence of p53 normal genes
  • the present inventors identified ATM as a DNA repair gene in HCT116, LoVo and RKO colorectal cancer cell lines containing p53 normal genes.
  • ATR, XRCC4, XLF and DNA-PK genes were reduced in gene expression by siRNA knockdown method, then treated with olaparip (AZD2281) and cell count was measured by trypan blue staining to determine the degree of cell death.
  • HCT116 human colorectal cancer cell line with normal p53 gene was cultured in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) and incubated at 37 ° C. for 24 hours at 37 ° C. in 1 ⁇ 10 5 cells per 60 mm plate.
  • the cell was introduced into Lipopectamin2000 (invitrogen) with ATM, ATR, XLF, XRCC4 and DNA-PK siRNA, knocked down at 37 ° C for 48 hours, and then treated with Olaparip (AZD2281) at 25uM and then at 37 ° C. After 48 hours incubation in the Olaparip (AZD2281) treated group and untreated group tryppan blue staining was counted the number of viable cells and dead cells by measuring the apoptosis.
  • apoptosis by olaflip was significantly increased, particularly when the expression of the DNA-PK gene was reduced. Apoptosis was further increased.
  • apoptosis due to the absence of the DNA repair gene in the absence of the p53 normal gene
  • ATM, ATR, and XRCC4 known as DNA repair genes in the cell line HCT116 p53 null, which lacked the normal p53 gene.
  • XLF and DNA-PK genes were treated with olopalip (AZD2281) and cell count was measured by trypan blue staining to confirm the degree of cell death.
  • the conditions and methods of the experiment were as follows: Cell line HCT116 p53 null human colorectal cancer cell line deleted p53 gene incubated in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) in a 60mm plate, 5 ⁇ 1X10 per well at 37 °C Incubated for 24 hours at incubation with Lipopectamin2000 (invitrogen) and incubating the ATM, ATR, XLF, XRCC4 and DNA-PK siRNA in cells for 48 hours, then knocking down at 37 ° C for 48 hours and treating olaflip (AZD2281) with 25 uM. After culturing at 37 ° C. for 48 hours, the apoptosis (AZD2281) treated group and the untreated group were counted by a trypan blue staining method to measure the number of viable cells and dead cells.
  • RNA-derived tumor cells colon cancer patient-derived tumor-generating animal model tissue, respectively, as a homogenizer and triturated by Trizol RNA extraction.
  • 500 ng of total RNA was re-synthesized into cDNA using Accupower RT-PCR premix kit (BIONIA, BIONEER) and DNA-PK primer (SEQ ID NO: 13; DNA-PK Exon5 forward primer 5'-GCCAGAAGATCGCACCTTAC-3 ' , SEQ ID NO: 14; DNA-PK Exon5 reverse primer 5'-GTGAGGACAACCCCTTCAGA-3 ', SEQ ID NO: 15; DNA-PK Exon76 forward primer 5'-AAGGATTAAAAGTAAGTTGG-3', SEQ ID NO: 16; DNA-PK Exon76 reverse primer 5'- AAGTAGCATGTTGGTAATGT-3 ', SEQ ID NO: 17; DNA-PK 7825 site forward primer 5'-CCAGCATGAGCCC
  • the normal form of the p53 gene in a total of 35 patient-derived tissues including seven colorectal cancer patient tissues, 21 colorectal cancer-derived tumor cells, 7 colorectal cancer-derived tumor-generating animal model tissue Were 11, mutants were 24, and the normal DNA-PK gene was 28 and 7 were mutated. Two of the colorectal cancer tumors were analyzed for p53 gene and mutant DNA-PK gene.
  • 11-CT-78481A and p53 genotype mutant and normal DNA-PK gene were raised to 11-CT-76479B with mutant DNA-PK genotype and treated with lipase (AZD2281) and observed changes in cell morphology. It was confirmed whether apoptosis was induced according to the DNA-PK genotype.
  • the conditions and methods of the experiment were as follows: cells from six colon cancer patients with different p53 and DNA-PK genotypes were identified as REBM (Renal Growth Basal Medium; 5% FBS, 1% penicillin / streptomycin) (LONZA). Incubated in a 60 mm plate at 1 ⁇ 10 4 per well for 24 hours at 37 ° C. and raise olaflip (AZD2281) from a maximum of 50 uM to a minimum of 25 uM (50 uM, 25 uM) After treatment, the cells were incubated for 48 hours at 37 ° C. to confirm the drug efficacy by observing the change in the cell morphology of the olaflip (AZD2281) treated group and the untreated group.
  • REBM Random Growth Basal Medium
  • FBS penicillin / streptomycin
  • the shape of the cells by the olepage (AZD2281) only in tumor cell lines 11-CT-78093B and 11-CT-79724B derived from colorectal cancer patients whose p53 gene was normal and the DNA-PK gene was mutated.
  • 11-CT-79511B and 11-CT97845D and 11-CT97845D and p53 genes are mutated and normal DNA-PK genes are normal, and the p53 and DNA-PK genes are normal.
  • the shape of cells caused by olaparip (AZD2281) is not changed.
  • the p53 gene and the DNA-PK gene show potential as biomarkers for predicting susceptibility to OPAPAR (AZD2281), a PARP inhibitor.
  • HCT116 human colorectal cancer cell line with normal p53 gene was cultured in RPMI1640 (10% FBS, 1% penicillin / streptomycin) and incubated at 37 ° C. for 24 hours at 37 ° C. in 1 ⁇ 10 5 cells per 60 mm plate.
  • DNA-PK siRNA (SEQ ID NO: 3; DNA-PK siRNA 5'-AAAGGGCCAAGCUGUCACUCU-3 ') was introduced into the cells by Lipopectamin2000 (invitrogen) and knocked down at 37 ° C for 48 hours, followed by pEGFP-N1 vector ( Clontech) was subjected to enzyme cutting with HindIII (NEB) for 2 hours, followed by 1 ug of intracellular infusion with Lipopectamin2000 (invitrogen), respectively.Olaphalip (AZD2281) was reduced from maximum 50uM to minimum 25uM (50uM, 25uM) After treatment, the cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours to compare the expression of GFP, thereby confirming non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair activity.
  • NHEJ non-homologous end joining

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 PARP 저해제에 대한 감수성을 예측하기 위한 신규한 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, p53 유전자 및/또는 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자를 포함하는, PARP(poly ADP ribose polymerase) 저해제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커; 상기 바이오 마커의 유전자 발현 수준; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 키트; PARP 저해제에 대한 감수성 예측 방법; 대상의 PARP 저해제에 대한 감수성 증진제; 및 상기 감수성 증진제 및 PARP 저해제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, PARP 저해제에 대한 감수성 예측 효과가 우수하므로, 본 발명은 대장암 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 신규한 바이오 마커 및 이의 용도
본 발명은 대한민국 보건복지부의 지원 하에서 과제번호 HI06C0868에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국보건산업진흥원, 연구사업명은 "서울아산병원 선도형 특성화 연구사업", 연구과제명은 "Wnt를 표적으로 하는 항암제 개발", 주관기관은 서울아산병원 선도형 암 연구사업단, 연구기간은 2011.12.01 ~ 2016.11.30이다.
본 발명은 대한민국 미래창조과학부의 지원 하에서 과제번호 2013R1A2A2A01067394에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국연구재단, 연구사업명은 "중견연구자지원사업", 연구과제명은 "Ubiquitination pathway에 관여하는 E3 ligase의 co-factor로서의 p34SEI-1의 역할 규명", 주관기관은 울산대학교, 연구기간은 2013.12.01 ~ 2016.11.30이다.
본 발명은 PARP 저해제에 대한 감수성을 예측하기 위한 신규한 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
일반적으로 항암 요법에서, 항암제를 투여하였을 때의 생체의 반응성은 약제의 표적이 되는 암세포의 이 약제에 대한 감수성에 크게 의존한다. 이러한 암세포의 약제에 대한 감수성은, 암세포마다 크게 상이하다. 이러한 감수성의 차이는, 이 약제의 표적 분자 또는 이에 관련하는 인자의 양적 또는 질적 차이, 또는 약제 내성의 획득 등에 기인한다. 이러한 배경을 근거로, 표적이 되는 암세포가 약제에 대하여 감수성을 나타낼 경우에 특이적으로 나타나는 암세포의 유전적 변화를 확인할 수 있다면, 조기에 약제의 효과 판정, 치료법의 확립, 새로운 치료법의 선택 등이 가능해져 대단히 유익하다. 또한, 치료에 앞서 생체 조직편 등에 의해 취득된 암 조직에서, 통상의 방법에 따라 암세포를 분리한 후 약제 처리를 실시하여, 이 암세포가 약제 감수성인지 여부를 상기 변화에 의해 측정하면, 이 약제에 의한 치료가 유효한지 여부를 미리 예측할 수 있기 때문에 임상적으로 매우 유용하다.
최근 주목 받고 있는 암치료를 위한 신규한 접근법은 합성 치사(synthetic lethality)에 관한 것으로, 합성 치사란 두 개의 유전자(또는 두 유전자 산물들) 중 하나에만 돌연변이가 있는 경우 세포가 생존할 수 있지만, 두 개의 유전자 모두에 돌연변이가 있는 경우에는 세포가 죽음에 이르게 되는 것을 의미한다. 이와 같은 2 종 이상의 돌연변이의 유전적 상호작용으로 사멸을 유도하는 예로는 BRCA1/2와 올라파립을 들 수 있다. 다시 말해, 합성치사는 돌연변이 및 약물이 함께 작용하여 암세포를 사멸시키는 것으로, 암-관련 돌연변이에 의해 합성 치사되는 유전자(또는 유전자 산물)를 타겟팅하면, 암세포만을 사멸시키고 정상적인 세포는 살아남게 된다. 따라서, 합성 치사는 항암 제제의 개발을 위한 프레임워크를 제공한다. 그러나, 합성 치사 유전자들(및 유전자 산물들)의 확인 부재 등으로 인하여 이에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.
한편, 올라파립(Olaparib, AZD2281)은 암세포의 비정상적인 증식을 억제하는 기능을 가진 항암제로, "PARP 단백질"의 저해제이다. PARP는 세포 내 DNA가 손상 받은 경우, 이를 복구(repair)하는 기능을 하는 단백질로, 세포가 DNA의 수리를 마치고, 지속적으로 증식을 할 수 있도록 기여하는데 큰 역할을 수행한다. 올라파립은 이 PARP의 기능을 저해함으로써, 암세포의 증식을 저해한다. 이러한 올라파립은 난소암, 유방암의 표적치료제로 잘 알려져 있으며, 특히 BRCA1, BRCA2의 돌연변이를 유전적으로 가지고 있는 암 환자들에게 효과적인 항암제로 알려져 있다.
즉, 항암제의 효과는 DNA 복구(repair) 능력에 영향을 많이 받으며, 또한, 항암제는 내성과 독성에 관해서 개인차가 상이하므로, 적합한 치료반응성 표식자를 이용한 선별은 항암제 치료의 획기적인 진보를 초래할 수 있다. 이에, 특정 유전자에 따른 개별 항암제의 치료반응성에 관한 연구가 최근 지속적으로 활발하게 전개되고 있다.
그러나 특정약제에 대한 생체반응 관련요소의 복합적 작용, 치료제 및 투여방식의 다양성과 방대한 시료확보의 어려움으로 아직 괄목할 만한 성과가 미약한 현실이다.
이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 대장암에서 항암제인 PARP 저해제에 대한 감수성을 예측할 수 있는 방법을 개발하기 위하여, PARP 저해제 중 하나인 올라파립의 대장암에서의 감수성을 예측하는 바이오 마커로서 DNA 복구(repair)에 관련된 p53 유전자 및 DNA-PK 유전자의 발현 정상 및/또는 억제 양상과 유전자 변이를 분석하였고, 그 결과, 대장암 세포에서 p53 유전자 및/또는 DNA-PK 유전자의 발현 정상 및/또는 억제 양상과 유전자 돌연변이에 따라 올라파립의 약물 감수성으로 인한 세포사멸 정도가 상이한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 키트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 PARP 저해제에 대한 감수성 예측 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 PARP 저해제에 대한 감수성 증진제를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 PARP 저해제에 대한 감수성 증진제 및 PARP 저해제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 PARP 저해제에 대한 감수성 증진제 및 PARP 저해제를 대상에게 공동 투여하는 단계를 포함하는, PARP 저해제에 대한 감수성 증진 방법을 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 p53 유전자(gene bank number: NM_000546.5) 및/또는 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase)(gene bank number: NM_006904.6) 유전자를 포함하는, PARP(poly ADP ribose polymerase) 저해제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커를 제공한다.
본 발명의 가장 큰 특징은 p53 유전자, DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자를 바이오 마커로 이용하여 PARP-1 저해제에 대한 감수성을 예측하는 것이다.
본 발명의 바이오 마커는 항암제에 대한 감수성의 지표가 될 수 있으며, 항암제에 대한 감수성 마커로서의 정확성 및 신뢰도도 탁월하므로 암의 발생, 발전 및/또는 전이의 치료에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "감수성"은 개개의 환자의 암에 대하여 특정약물이 효과를 나타내는 지 여부를 의미한다.
예컨대, 상기 특정약물은 주로 항암제이며, 이들 항암제에는 암의 종류에 따라 효과를 나타내는 경우와 효과를 나타내지 않는 경우가 있다. 또한, 유효한 것으로 인정되고 있는 종류의 암이어도, 개개의 환자에 따라 효과를 나타내는 경우와 효과를 나타내지 않는 경우가 있는 것이 알려져 있다. 이와 같은 개개의 환자의 암에 대해 항암제가 효과를 나타내는 지 여부를 항암제 감수성이라고 한다. 따라서, 본 발명에 따라 치료 개시 전에 효과를 기대할 수 있는 환자(반응자)와, 효과를 기대할 수 없는 환자(무반응자)를 예측할 수 있으면, 유효성과 안전성이 높은 화학 요법이 실현될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예측"은 본원에서 대상 환자가 약물 또는 약물 세트에 대해 유리하게 또는 불리하게 반응할 가능성을 지칭하는데 사용된다. 한 실시양태에서, 예측은 이러한 반응의 정도에 관한 것이다. 예컨대, 예측은 환자가 처치 후, 예를 들어 특정한 치료제의 처치 및/또는 원발성 종양의수술적 제거 및/또는 특정 기간 동안의 화학요법 후에 암 재발 없이 생존할 지의 여부 및/또는 그러할 확률에 관한 것이다. 본 발명의 예측은 대장암 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료를 결정하는데 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측은 환자가 치료 처치, 예컨대 주어진 치료적 처치, 예를 들어 주어진 치료제 또는 조합물의 투여, 수술적 개입, 화학요법 등에 유리하게 반응할 것인지 또는 치료적 처치 후에 환자의 장기 생존이 가능한 지의 여부를 예측하는데 있어서 유용한 도구이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 p53 유전자 및/또는 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자 발현 수준; 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 p53 유전자 및/또는 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자 발현 수준의 측정은, 상기 유전자 내 돌연변이 존재 여부 측정 및/또는 분석을 포함한다.
즉, 상기 유전자 내 하나 이상의 변이의 존재는 상기 유전자 중 어느 하나의 발현 억제를 유발할 수 있으므로, 본 발명은 상기 유전자들의 돌연변이의 존재를 확인함으로써 PARP-1 저해제에 대한 감수성에 미치는 영향을 예측할 수 있다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 본 명세서에서 사용되는 표현 "유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준 측정"은 해당 시료 내에서 검출하고자 하는 타겟을 검출하는 것을 의미한다. 본 발명에서는, 상기 검출하고자 하는 타겟은 시료 내 해당 유전자의 mRNA 및/또는 단백질이다. 즉, 유전자의 전사 산물인 RNA 또는 유전자 산물인 단백질을 검출함으로써 상기 유전자의 발현 여부와 돌연변이를 확인할 수 있다.
RNA 또는 단백질의 검출은 통상적으로는 대상으로부터 분리된 시료부터 RNA 또는 단백질을 추출하여, 추출물 중의 RNA 또는 단백질을 검출함으로써 실시할 수 있다. 이러한 RNA 또는 단백질의 검출은 면역분석학적 방법, 하이브리드화 반응 및 증폭반응에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 용이하게 실시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 유전자 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함한다.
상기 mRNA의 발현 여부를 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 즉, 핵산의 검출은 유전자를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있다.
예컨대, 프라이머를 이용한 mRNA의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.
또한, PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 sanger 시컨싱과 같은 유전자 서열 분석 방법을 사용하여 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 돌연변이 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 포함한다.
상기 단백질의 발현 여부를 측정하는 제제는 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 의미하고, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합을 모두 포함한다.
상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv를 모두 포함한다. 항체 생산은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PARP는 PARP-1, PARP-2 또는 PARP-3이며, 가장 바람직하게는 PARP-1이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PARP 저해제는 신경통, 중증근무력증, 근 위축증, 근위축성 측삭경화증(ALS), 진행성 근 위축증, 길레인-발레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 헝틴톤 질환, 알쯔하이머 질환, 파킨슨병, 아테롬성 동맥경화증, 협심증, 심근경색, 심장 마비, 바이패스 수술에 의한 심혈계 손상, ACTH 생성 종양, 급성 림프구성 또는 림프아구성 백혈병, 급성 또는 만성의 림포구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 방광암, 뇌종양, 유방암, 경관암, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 자궁내막증, 식도암, 방광암, 에윙스 육종(Ewing's sarcoma), 설암, 홉킨스 림프종, 카포시스 육종, 신장암, 간암, 폐암, 중피종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 비홉킨 림프종, 골육종, 난소암, 유선암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 페니스암, 레티노블라스토마, 피부암, 위암, 갑상선압, 자궁암, 고환암, 윌름스 종양 및 트로포블라스토마로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상에 대한 치료제이다. 보다 바람직하게는 ACTH 생성 종양, 급성 림프구성 또는 림프아구성 백혈병, 급성 또는 만성의 림포구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 방광암, 뇌종양, 유방암, 경관암, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 자궁내막증, 식도암, 방광암, 에윙스 육종(Ewing's sarcoma), 설암, 홉킨스 림프종, 카포시스 육종, 신장암, 간암, 폐암, 중피종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 비홉킨 림프종, 골육종, 난소암, 신경아세포종, 유선암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 페니스암, 레티노블라스토마, 피부암, 위암, 갑상선압, 자궁암, 고환암, 윌름스 종양, 및 트로포블라스토마로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상에 대한 치료제이며, 가장 바람직하게는 대장암에 대한 치료제이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대장암(colon cancer)"은 직장암, 결장암 및 항문암을 통칭하는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PARP 저해제는, AZD2281(올라파립, Olaparib), ABT888(벨리파립, Veliparib), AG014699(루카파립, Rucaparib), MK-4827(니라파립, Niraparib), BMN-673(탈라조파립, Talazoparib), BSI201(이니파립, Iniparib), BGP15(O-(3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl)nicotinic-amidoxime), INO1001(3-Aminobenzamide), ONO2231, 니코틴아미드(nicotinamide), 3-아미노벤즈아미드(3-amino benzamide), 3,4-디히드로-5-[4-(1-피페리디닐)부톡시]-1(2H)-이소퀴놀론(3,4-dihydro-5-[4-(1-piperidinyl)butoxy]-1(2H)-isoquinolone), 벤즈아미드(benzamide), 퀴놀론(quinolone), 이소퀴놀론(isoquinolone), 벤조피론(benzopyrone), 사이클릭 벤즈아미드(cyclic benzamide), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 인돌(indole) 및 펜안트리디논(phenanthridinone)으로 이루어진 군에서 1 종 이상 선택되며, 보다 바람직하게는 AZD2281(올라파립, Olaparib), ABT888(벨리파립, Veliparib), AG014699(루카파립, Rucaparib), MK-4827(니라파립, Niraparib), BMN-673(탈라조파립, Talazoparib) 및 BSI201(이니파립, Iniparib)로 이루어진 군에서 선택되고, 가장 바람직하게는 AZD2281, 즉, 올라파립(Olaparib)이다.
본 발명의 조성물은 상술한 유전자의 발현 여부 및 유전자 돌연변이를 측정하는 제제뿐만 아니라, 항원-항체 복합체의 형성을 정량 또는 정성적으로 측정 가능하게 하는 라벨, 면역학적 분석에 사용되는 통상적인 도구, 시약 등을 더 포함할 수 있다.
항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 산화환원 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈옥시다제와루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트카복실라제, 아스파르테이트아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 산화환원 분자에는 페로센, 루테늄착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8, [Os(bpy)3]2+,[RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4-등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H,14C,32P,35S,36Cl,51Cr,57Co,58Co, 59Fe,90Y,125I,131I,186Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 조성물은 상술한 바이오 마커를 유효성분으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 키트를 제공한다.
상기 키트에는 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다.
상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 키트는 상술한 바이오 마커를 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 PARP 저해제에 대한 감수성 예측 방법을 제공한다:
(a) 대상으로부터 생물학적 시료를 준비하는 단계;
(b) 상기 생물학적 시료 내 p53 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) (b) 단계에서 측정한 발현 수준 확인 결과에 기초하여 상기 대상의 PARP 저해제에 대한 감수성을 판정하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 방법은 상기 (b) 단계에서 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준 및/또는 상기 유전자 돌연변이 존재 여부 측정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 예측 방법은, 대상 환자로부터 생물학적 시료를 획득하고, 상기 시료 내에서 상술한 유전자들의 발현 여부를 측정한 후, 정상 시료와 비교하여, 기재된 유전자의 발현 수준이 정상(야생형)과 비교하여 억제되었거나 감소한 경우 및 유전자의 돌연변이가 존재 여부에 따라, 당해 시료가 PARP-1 저해제에 대하여 감수성이 있다라고 판정하는 공정을 포함하여 이루어진다.
즉, 본 발명의 예측 방법은 시료 내에서의 특정 유전자들의 발현 여부를 암세포의 항암제에 대한 감수성의 지표로 하는 점을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 방법은 상기 (c) 단계에서 (i) p53 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준 및/또는 상기 유전자 서열이 정상(야생형)인 경우; 및/또는 (ii) DNA-PK 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상에 비하여 저발현인 경우와 유전자 돌연변이가 발생한 경우, 대상의 PARP 저해제에 대한 감수성이 있는 것으로 판정한다.
보다 상세하게는, 본 발명의 상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 측정한 발현 여부 확인과 유전자 돌연변이 분석 결과를 기초로 하여, p53 유전자는 정상적으로 존재 및/또는 발현(기능)하며 유전자 서열이 정상이고 DNA-PK 유전자의 발현 수준은 정상(야생형)의 값에 비하여 억제 및/또는 감소되며 유전자 서열이 돌연변이가 확인된 경우, 대상 환자로부터 획득된 당해 종양 세포가 항암제인 PARP 저해제에 대하여 감수성이 있는 것으로 판정하는 것이다.
본 명세서에서 상기 유전자들의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어 "저발현"은 바이오 마커가 비정상 프로세스, 질환 혹은 개체 내 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 경우, 해당 바이오 마커 유전자의 야생형의 발현 수준 혹은 값; 또는 건강하거나 정상인 개체로부터 획득된 생물학적 시료에서 검출되는 바이오 마커의 값 혹은 수준 범위 보다 낮은 생물학적 시료 내의 바이오 마커의 값 혹은 수준을 지칭한다. 또한, 이는 바이오 마커의 "정상" 발현 수준 혹은 값과 비교해서 "차동(differential) 수준" 혹은 "차동 값"을 지니거나 "상이하게 발현된" 것으로서 지칭될 수 있으며, 발현에 있어서 정량적 차이뿐만 아니라 정성적 차이의 둘 모두를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 p53 유전자 및/또는 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자의 발현 수준; 또는 상기 유전자의 단백질의 발현 수준의 측정은, 상기 유전자 내 변이 여부 측정을 추가적으로 포함한다.
본 발명은 상기 유전자들의 변이의 존재를 확인하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 유전자 내 하나 이상의 변이의 존재는 상기 유전자 중 어느 하나의 발현 억제를 유발할 수 있으며 이는 상술한 바와 같이 PARP-1 저해제에 대한 감수성에 영향을 미칠 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "변이" 또는 "돌연변이"는, 해당 유전자의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 염기 치환, 결실, 삽입, 증폭 및 재배열을 포함한다. 뉴클레오티드 변이는 참조 서열(예를 들어, 야생형 서열)에 대한 뉴클레오티드 서열의 변화 (예를 들어, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 역위 또는 치환, 예컨대 단일 뉴클레오티드다형성 (SNP))를 지칭한다.
이 용어는 또한 달리 나타내지 않는다면, 뉴클레오티드 서열의 보체에서의 상응하는 변화도 포함한다. 뉴클레오티드 변이는 체세포 돌연변이 또는 배선 다형성일 수 있다.
또한, 아미노산 변이는 참조 서열 (예를 들어, 야생형 서열)에 비해 아미노산 서열의 변화 (예를 들어, 1개 이상의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 예컨대 내부 결실 또는 N- 또는 C-말단의 말단절단(truncation))를 지칭한다.
상기 변이의 검출은 당업계에 널리 공지되어 있는 기술을 이용하여 표적 분자 클로닝 및 서열 분석에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, DNA 서열분석; 대립유전자-특이적 뉴클레오티드 혼입 검정 및 대립유전자-특이적 프라이머 연장 검정 (예를 들어, 대립유전자-특이적 PCR, 대립유전자-특이적 라이게이션 연쇄 반응 (LCR) 및 갭-LCR)을 비롯한 프라이머 연장 검정; 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화 검정 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드라이게이션검정); 절단제로부터의 보호를 이용하여 핵산 이중나선 내의 미스매치된 염기를 검출하는 절단 보호 검정; MutS단백질 결합 분석; 변이체 및 야생형 핵산 분자의 이동성을 비교하는 전기영동 분석; 변성-구배 겔 전기영동(DGGE, 예를 들어 문헌 [Myers et al. (1985) Nature 313:495]에서와 같음); 미스매치된 염기 쌍에서의 RNase절단의 분석; 헤테로 이중나선 DNA의 화학적 또는 효소적 절단의 분석; 질량 분광측정법 (예를 들어, MALDITOF); 유전적 비트 분석 (GBA); 5' 뉴클레아제 검정 (예를 들어, 택맨(TaqMan®; 및 분자 비콘을 사용하는 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 실시간 PCR과 시퀀싱을 이용하여 본 발명의 DNA-PK 유전자의 특이적 변이를 검출하였다.
상기 변이는 다음과 같다: DNA-PK(gene bank number: NM_006904.6) 게놈 엑손 5의 487번째 염기부터 496번째 염기까지 반복되는 10개의 아데닌(adenine) 염기가 9개로 frameshift 되는 변이, 엑손 76의 10,807번째 염기부터 10,814번째 염기까지 반복되는 8개의 아데닌(adenine) 염기가 9개로 frameshift 되는 변이, 7825번째 염기인 아데닌(adenine)이 시토신(cytosine)으로 치환되는 변이, 9185번째 염기인 티민(thymine)이 구아닌(guanine)으로 치환되는 변이.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"란 본 발명의 바이오 마커의 발현이 검출될 수 있는 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 특별히 이에 제한되지 않고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.
본 발명의 방법은 상술한 바이오 마커를 이용하여 감수성이 있는 것으로 판정하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자 발현 또는 이의 단백질 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 대상의 PARP 저해제에 대한 감수성 증진제 또는 감수성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 대상은 p53 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준이 정상이며, p53 유전자의 야생형을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, p53 정상 유전자가 존재하는 경우 올라파립을 처리하고 DNA-PK 유전자 발현 여부에 따른 암세포 생존율을 측정한 결과, DNA-PK 유전자의 발현 수준을 억제시킨 암세포에서 올라파립에 따른 세포 생존률이 탁월하게 감소되는 것을 확인한 반면, p53 정상 유전자가 존재하지 않는 경우 DNA-PK 유전자 발현을 억제시켰을 때, 세포 생존율에는 큰 영향을 미치지 못한 것을 확인하였다.
따라서, 이는 p53 정상 유전자의 존재(p53 정상 유전자의 정상적인 발현 및 기능); 및 DNA-PK 유전자의 발현 억제가 올라파립에 대한 암세포의 감수성을 증진시킨다는 것을 제시하며, 이를 기반으로 하여 본 발명은 대상의 PARP 저해제에 대한 탁월한 감수성 증진 효과를 제공한다.
본 발명의 감수성 증진제 또는 증진용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 기타 첨가제, 예를 들면, 안정제, 완화제, 유화제 등을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 부형제로서 미결정 셀룰로오소, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스 등이 사용될 수 있고, 붕해제로서 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘 등이 사용될 수 있다. 결합제로는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크 등으로부터 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 p53 정상 유전자의 존재 및 DNA-PK 유전자의 발현 억제는 PARP 저해제 처리시 암세포의 성장을 감소시킨다.
상기 DNA-PK 유전자의 발현은 DNA-PK 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연 추출물 및 화학물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상에 의해 억제된다.
보다 바람직하게는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA) 또는 miRNA(microRNA)이며, 가장 바람직하게는 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "siRNA"는, 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상 DNA-PK mRNA에 특이적으로 결합하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 것을 의미한다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 siRNA는 서열번호 3의 염기서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 상기 miRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 염기서열로서, 이에 제한되지는 않으나 안티센스 RNA, 안티센스 DNA 및 안타고니스트(antagonist) mRNA를 포함한다.
본 발명의 방법은 상술한 바이오 마커인 p53 유전자 및 DNA-PK 유전자의 발현 수준을 이용하여 PARP 저해제에 대한 감수성을 증진시키므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 감수성 증진제 및 PARP 저해제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, p53 정상 유전자 및 DNA-PK 유전자가 상호작용하여 암세포의 PARP 저해제에 대한 감수성을 상당히 증진시켜 세포사멸사를 향상시키는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 조성물의 유효 성분인 DNA-PK 유전자 또는 이의 단백질의 발현 억제제는 정상세포에는 영향을 미치지 않고 암세포에서만 특이적으로 발현 수준을 억제하여 아폽토시스에 의한 암세포의 세포사멸을 유도한다.
따라서, 본 발명의 조성물은 DNA-PK 유전자 또는 이의 단백질의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 PARP 저해제와 함께 암세포에 투여함으로써 암세포의 세포사를 증진시킬 수 있어, 항암제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 의한 개선, 예방 또는 치료 대상 질병인 "암(cancer) "은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 본 명세서에서 상기 암은 악성 종양(malignant tumor)과 동일한 의미로도 사용된다.
본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 암은 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 위암(stomach cancer), 간암(liver cancer), 혈액암(blood cancer), 뼈암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 머리 또는 목암(head or neck cancer), 피부 또는 안구 흑색종(cutaneous or intraocular melanoma), 자궁육종(uterine sarcoma), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문암(anal cancer), 대장암(colon cancer), 난관암(fallopian tube carcinoma), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 소장암(small intestine cancer), 내분비암(endocrine cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 신장암(adrenal cancer), 연조직종양(soft tissue tumor), 요도암(urethral cancer), 전립선암(prostate cancer), 기관지암(bronchogenic cancer), 골수암(bone marrow tumor)등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 대장암(colon cancer)의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "예방" 은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 (i) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (ii) 질환 또는 질병의 경감; 및 (iii) 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.
또한, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 증진제 내 DNA-PK 유전자 또는 이의 단백질의 발현 억제제의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 위중도 등을 고려하여 결정하며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상술한 감수성 증진제 및 PARP 저해제를 이용하여 암세포의 세포사를 향상시키므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 감수성 증진제 및 PARP 저해제를 해당 대상에게 공동 투여하는 단계를 포함하는, PARP 저해제에 대한 감수성 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, p53 정상 유전자 및 DNA-PK 유전자가 상호작용하여 암세포의 PARP 저해제에 대한 감수성을 상당히 증진시켜 세포사를 향상시키는 것을 확인하였다.
따라서, DNA-PK 유전자 또는 이의 단백질의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 PARP 저해제와 함께 암세포에 투여함으로써 암세포의 PARP 저해제에 대한 민감도를 증진시킬 수 있다.
본 발명의 방법은 상술한 바이오 마커인 p53 유전자 및 DNA-PK 유전자의 발현 수준을 이용하여 PARP 저해제에 대한 감수성을 증진시키므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커를 이용하면, 개개의 환자의 상기 감수성을 치료 개시 전에 확실하게 판정할 수 있어, 치료 효과가 높은 항암제의 선택이 가능해진다. 또한, 효과가 얻어지지 않는 항암제의 사용을 회피할 수 있기 때문에 불필요한 부작용을 회피할 수 있다.
도 1a은 p53 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(Olaparib, AZD2281)의 항암 활성 분석 결과를 보여준다.
도 1b는 p53 정상 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 p53 활성 및 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 1c는 p53 유전자의 기능 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 p53 활성 및 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 1d는 p53 유전자의 발현 억제에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 2a는 p53 정상 유전자 존재 시 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 2b는 p53 정상 유전자 부재 시 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 2c는 p53 정상 유전자 및 DNA-PK 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 2d는 p53 유전자의 기능 부재 및 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 3a는 p53 정상 유전자 존재 시 다른 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 3b는 p53 정상 유전자 부재 시 다른 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 4a는 p53 정상 유전자 존재 시 DNA 복구 유전자의 부재에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 4b는 p53 정상 유전자 부재 시 DNA 복구 유전자의 부재에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 5는 대장암 환자 유래 종양조직에서의 p53과 DNA-PK 유전자형 분석 결과를 보여준다.
도 6은 대장암 환자 유래 종양세포에서 p53과 DNA-PK 유전자형에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석 결과를 보여준다.
도 7은 DNA-PK 유전자 결핍 시 올라파립(AZD2281)에 대한 DNA 복구 활성 분석 결과를 보여준다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. p53 정상 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(Olaparib, AZD2281)의 약물 감수성 분석
1-1. p53 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(Olaparib, AZD2281)의 항암 활성 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(Olaparib, AZD2281)의 항암 활성을 분석하고자, 총 19 종의 인간 대장암 세포주[p53 유전자가 정상인 6 종의 대장암 세포주(LS174T, HCT116, RKO, LoVo, HCT8, SW48)와 p53 유전자가 결실되거나 변이인 3 종의 대장암 세포주(Colo320HSR, KM12C, SW1417, HCT116p53 null, HCT-15, SW480, Colo201, HT29, LS1034, DLD-1, Caco-2, Colo205, SW620)]에서 인 비트로 셀 베이스 어세이(in vitro cell base assay)를 통해 항암제인 올라파립(AZD2281)에 대한 각 세포주들의 생존능(cell viability)과 IC50을 측정하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: 총 19 종의 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 각 세포주를 96-웰 플레이트에 웰당 2X103개씩 37℃에서 24 시간 배양하고, 올라파립(AZD2281)을 최대 100 uM에서 최소 0.390625 uM으로 2 배씩 희석하여(100 uM, 50 uM, 25 uM, 12.5 uM, 6.25 uM, 3.125 uM, 1.5625 uM, 0.78125 uM, 0.390625 uM) 처리한 후 37℃에서 72 시간 배양하여, 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 MTS 어세이(Promega, CellTiter 96 AQeous One Solution)를 이용하여 각 세포주의 생존능(cell viability)을 측정하고 PRISM 프로그램을 이용하여 각 세포주의 IC50을 측정하였다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, p53 유전자가 존재 및/또는 정상적으로 발현하는 경우, 올라파립(AZD2281)에 대한 감수성이 높다는 것을 보여준다.
1-2. p53 정상 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 p53 활성 및 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(Olaparib, AZD2281)의 p53 활성 및 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 존재하는 세포주 HCT116과 HCT116의 p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null에올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리한 후, 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
또한, 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 p53 활성의 표지자인 p-p53 (phospho-p53) 및 세포사멸 표지자인 cleaved PARP를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: HCT116과 HCT116의 p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 각 세포주를 60 mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 올라파립(AZD2281)을 최대 50 uM에서 최소 5 uM으로(50 uM, 25 uM, 10 uM, 5 uM) 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다. 세포사멸 정도를 측정한 각 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 RIPA 버퍼를 이용하여 세포들을 용해시킨 후 고속 원심분리기를 이용하여 단백질을 추출하여 각 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리 세포들 당 30ug의 단백질을 웨스턴 블롯(western blot)법으로 전기영동하여 단백질을 분리 후 PDVF 막(membrane)에 트랜스퍼하여 p53, p-p53, cleaved PARP, tubulin 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL 버퍼를 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 항체에 대한 단백질의 발현을 현상하였다.
그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 존재하고 있는 세포주에서만 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 농도 별로 유도되고(cleaved PARP의 증가), p53의 활성이 증가되었다.
1-3. p53 유전자의 기능 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 p53 활성 및 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 유전자의 기능 유무에 따른 올라파립(Olaparib, AZD2281)의 p53 활성 및 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 기능하는 세포주인 RKO 및 LoVo 대장암 세포주와 p53 유전자가 변이된 세포주인 Colo205에 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리한 후, 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
또한, 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 p53 활성의 표지자인 p-p53 (phospho-p53)및 세포사멸 표지자인 cleaved PARP를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자가 정상인 RKO 및 LoVo 대장암 세포주와 p53 유전자가 변이된 세포주 Colo205 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 각 세포주를 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 올라파립(AZD2281)을 최대 50uM에서 최소 5 uM으로(50 uM, 25 uM, 10 uM, 5 uM) 처리 한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다. 세포사멸 정도를 측정한 각 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 RIPA 버퍼를 이용하여 세포들을 용해시킨 후 고속 원심분리기를 이용하여 단백질을 추출하여 각 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리 세포들 당 30 ug의 단백질을 웨스턴 블롯(western blot)법으로 전기영동하여 단백질을 분리 후 PDVF 막에 트랜스퍼하여 p53, p-p53, cleaved PARP, tubulin 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL 버퍼를 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 항체에 대한 단백질의 발현을 현상하였다.
그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 기능하고 있는 세포주에서만 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 농도 별로 유도되고(cleaved PARP의 증가), p53의 활성이 증가되었다.
1-4. p53 유전자 억제에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 p53 유전자의 발현 수준을 억제시켰을 때, 올라파립(Olaparib, AZD2281)에 의한 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 기능하는 세포주인 HCT116 대장암 세포주에 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리한 후, 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자가 정상인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 p53 siRNA(서열번호 21; p53 siRNA 5'-AAGACUCCAGUGGUAAUCUAC-3')를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시켰다.
상기 세포들에 올라파립(AZD2281)을 최대 50 uM에서 최소 5uM으로(50 uM, 25 uM, 10 uM, 5 uM) 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 p53 siRNA 처리군과 양성 대조군인 scramble siRNA 처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이, p53 유전자가 기능하고 있는 경우에는 올라파립(AZD2281)에 의해 세포사멸이 농도 별로 유도되고 p53 유전자를 억제하였을 경우 올라파립(AZD2281)에 의해 세포사멸이 감소되었다.
실시예 2. p53 정상 유전자 및 DNA 복구(repair)유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 약물 감수성 분석
2-1. p53 정상 유전자 존재 시 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자 존재 시 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 존재하는 세포주 HCT116에 DNA 복구 유전자로 알려진 ATM, ATR 및 DNA-PK 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 ATM, ATR 및 DNA-PK 단백질의 발현량 감소를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자가 정상인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 ATM, ATR 및 DNA-PK siRNA (서열번호 1; ATM siRNA 5'-AAGCGCCUGAUUCGAGAUCCUUU-3', 서열번호 2; ATR siRNA 5'-AACCUCCGUGAUGUUGCUUGA-3', 서열번호 3; DNA-PK siRNA 5'-AAAGGGCCAAGCUGUCACUCU-3')를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 각 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 RIPA 버퍼를 이용하여 세포들을 용해시킨 후 고속 원심분리기를 이용하여 단백질을 추출하여 세포들 당 30ug의 단백질을 웨스턴 블롯(western blot)법으로 전기영동하여 단백질을 분리 후 PDVF 막에 트랜스퍼하여 ATM, ATR, DNA-PK, tubulin 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL 버퍼를 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 항체에 대한 단백질의 발현을 현상하였다.
또한, 여기에 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 정상인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 ATM, ATR 및 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 최대 25uM에서 최소 5uM으로(25uM, 10uM, 5uM) 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 존재하고 있는 경우, DNA-PK 유전자의 발현을 감소시킨 세포주에서만 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 농도 별로 증가되었다.
2-2. p53 정상 유전자 부재 시 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자의 부재 시 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자를 결실시킨 세포주HCT116 p53 null에 DNA 복구 유전자로 알려진 ATM, ATR 및 DNA-PK 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 ATM, ATR 및 DNA-PK 단백질의 발현량 감소를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 ATM, ATR 및 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 각 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 RIPA 버퍼를 이용하여 세포들을 용해시킨 후 고속 원심분리기를 이용하여 단백질을 추출하여 세포들 당 30ug의 단백질을 웨스턴 블롯(western blot)법으로 전기영동하여 단백질을 분리 후 PDVF 막에 트랜스퍼하여 ATM, ATR, DNA-PK, tubulin 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL 버퍼를 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 항체에 대한 단백질의 발현을 현상하였다.
또한, 여기에 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 ATM, ATR 및 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 최대 25uM에서 최소 5uM으로(25uM, 10uM, 5uM) 처리 한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 존재하지 않는 경우, ATM, ATR 및 DNA-PK 유전자의 발현을 감소시켜도 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸은 농도 별로 증가되지 않았다.
2-3. p53 정상 유전자 및 DNA-PK 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자 및 DNA-PK 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 존재하는 세포주 HCT116과 HCT116의 p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null에 DNA-PK 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 DNA-PK 단백질의 발현량 감소를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: HCT116과 HCT116의 p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null 인간 대장암 세포주들을 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 각 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 RIPA 버퍼를 이용하여 세포들을 용해시킨 후 고속 원심분리기를 이용하여 단백질을 추출하여 세포들 당 30ug의 단백질을 웨스턴 블롯(western blot)법으로 전기영동하여 단백질을 분리 후 PDVF 막에 트랜스퍼하여 DNA-PK, tubulin 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL 버퍼를 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 항체에 대한 단백질의 발현을 현상하였다.
또한, 여기에 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 HCT116과 HCT116의 p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 최대 50uM에서 최소 5uM으로(50uM, 25uM, 10uM, 5uM) 처리 한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 존재하는 경우에만, 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 농도 별로 증가되었다. 또한, p53 정상 유전자가 존재하는 경우에만, DNA-PK 유전자의 발현을 감소시켰을 때 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 농도 별로 증가되었다.
2-4. p53 유전자의 기능 부재 및 DNA 복구유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 유전자의 기능 부재 및 ATR 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 유전자가 변이된 세포주 DLD-1에 DNA 복구 유전자로 알려진 ATM, ATR, DNA-PK 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 상기 ATM, ATR, DNA-PK 단백질의 발현량 감소를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자가 변이된 세포주 Colo205 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 ATM, ATR 및 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 각 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 RIPA 버퍼를 이용하여 세포들을 용해시킨 후 고속 원심분리기를 이용하여 단백질을 추출하여 세포들 당 30ug의 단백질을 웨스턴 블롯(western blot)법으로 전기영동하여 단백질을 분리 후 PDVF 막에 트랜스퍼하여 ATM, ATR, DNA-PK, tubulin 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL 버퍼를 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 항체에 대한 단백질의 발현을 현상하였다.
또한, 여기에 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 변이된 세포주 Colo205 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 ATM, ATR 및 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 최대 50uM에서 최소 5uM으로(50uM, 25uM, 10uM, 5uM) 처리 한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 2d에 나타낸 바와 같이, p53 유전자의기능이 존재하지 경우, ATM, ATR 및 DNA-PK 유전자의 발현을 감소시켜도 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸은 농도 별로 증가되지 않았다.
실시예 3. p53 정상 유전자 및 다른 DNA 복구(repair) 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 약물 감수성 분석
3-1. p53 정상 유전자 존재 시 다른 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자 존재 시 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 존재하는 세포주 HCT116에 다른 DNA 복구 유전자로 알려진 XLF 및 XRCC4 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 RT-PCR을 통해 XLF 및 XRCC4 유전자의 mRNA 발현량 감소를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자가 정상인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 XLF 및 XRCC4 siRNA(서열번호 4; XLF siRNA 5'-GCAUUACAGUGCCAAGUGA-3', 서열번호 5; XRCC4 siRNA 5'-AAUCUUGGGACAGAACCUAAA-3')를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 각 세포들을 원심분리기를 이용하여 획득하였고 획득한 각 세포들을 Trizol RNA 추출법을 이용하여 총 RNA를 추출하여 500ng의 총 RNA를 cDNA로 재합성하여 XLF 및 XRCC4 primer(서열번호 7; XLF forward primer 5'-GAGGTCCAAGTGGGACAGAA-3', 서열번호 8; XLF reverse primer 5'-GTGTGGTGCTTTCTTGCTGA-3', 서열번호 9; XRCC4 forward primer 5'-GGCAATGGAAAAAGGGAAAT-3', 서열번호 10; XRCC4 reverse primer 5'-CGGTCAGCAGTCATTTCAGA-3')를 이용하여 PCR을 수행하여 1% agarose gel에 전기영동 후 Et-Br 염색을 통하여 XLF 및 XRCC4의 발현을 확인하였다.
또한, 여기에 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험의 조건과 방법은 p53 유전자가 정상인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 XLF 및 XRCC4 siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 최대 25uM에서 최소 10uM으로(25uM, 10uM) 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 존재하고 있는 경우, XLF 및 XRCC4 유전자의 발현 수준을 감소시켜도 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 증가되지 않았다.
3-2. p53 정상 유전자 부재 시 다른 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자의 부재 시 다른 DNA 복구 유전자의 존재 유무에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null에 다른 DNA 복구 유전자로 알려진 XLF 및 XRCC4 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 올라파립(AZD2281)을 농도 별로 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 XLF 및 XRCC4 siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 최대 25uM에서 최소 10uM으로(25uM, 10uM) 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 존재하지 않는 경우, XLF 및 XRCC4 유전자의 발현 수준을 감소시켜도 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 증가되지 않았다.
실시예 4. p53 정상 유전자 및 DNA 복구(repair) 유전자의 부재에 따른 올라파립(AZD2281)의 약물 감수성 분석
4-1. p53 정상 유전자 존재 시 DNA 복구 유전자의 부재에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자 존재 시 DNA 복구 유전자의 부재에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자가 존재하는 세포주 HCT116, LoVo 및 RKO 대장암 세포주에 DNA 복구 유전자로 알려진 ATM, ATR, XRCC4, XLF 및 DNA-PK 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 올라파립(AZD2281)을 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자가 정상인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 ATM, ATR, XLF, XRCC4 및 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 25uM으로 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, p53 정상 유전자가 존재하고 있는 경우, 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 유의성있게 증가되었고, 특히, DNA-PK 유전자의 발현을 감소시켰을 때 올라파립(AZD2281)에 의한 세포사멸이 더욱 증가되었다.
4-2. p53 정상 유전자 부재 시 DNA 복구 유전자의 부재에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자의 부재 시 DNA 복구 유전자의 부재에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 정도를 분석하고자, p53 정상 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null에 DNA 복구 유전자로 알려진 ATM, ATR, XRCC4, XLF 및 DNA-PK 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 올라파립(AZD2281)을 처리하고 트립판 블루 염색법으로 세포수를 측정하여 세포사멸 정도를 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자를 결실시킨 세포주 HCT116 p53 null 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 상기 ATM, ATR, XLF, XRCC4 및 DNA-PK siRNA를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 올라파립(AZD2281)을 25uM으로 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군을 트립판 블루 염색법으로 생존 세포수와 사멸 세포수를 세어 세포사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, p53 유전자가 존재하지 않는 경우, ATM, ATR, XRCC4, XLF 및 DNA-PK 유전자의 발현을 감소시켜도 올라파립(AZD2281)에 의한 유의성있는 세포사멸은 증가되지 않았다. 특히, 도 4a와는 달리 DNA-PK 유전자의 발현 수준을 감소시켜도 세포사멸이 더욱 증가되지 않았다.
실시예 5. 대장암 환자 유래 종양 조직에서의 p53과 DNA-PK 유전자형 분석
실제 대장암 환자에서의 p53과 DNA-PK의 유전자형을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 7개의 대장암 환자 종양 조직, 21개 대장암 환자 유래 종양세포, 7개의 대장암 환자 유래 종양생성 동물모델 조직에서, 면역염색 (IHC)을 통해 p53의 발현과 돌연변이를 확인하고 RT-PCR과 시퀀싱을 통해 DNA-PK의 유전자형의 변이/결실(mutation/deficient) 여부를 분석하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: 대장암 환자 종양 조직, 대장암 환자 유래 종양세포, 대장암 환자 유래 종양생성 동물모델 조직을 각각 균질기(homogenizer)로 Trizol RNA 추출법을 이용하여 분쇄하여 총 RNA를 추출하여 500ng의 총 RNA를 Accupower RT-PCR premix Kit(바이오니아, BIONEER)를 이용하여 cDNA로 재 합성하여 DNA-PK primer (서열번호 13; DNA-PK Exon5 forward primer 5'-GCCAGAAGATCGCACCTTAC-3', 서열번호 14; DNA-PK Exon5 reverse primer 5'-GTGAGGACAACCCCTTCAGA-3', 서열번호 15; DNA-PK Exon76 forward primer 5'-AAGGATTAAAAGTAAGTTGG-3', 서열번호 16; DNA-PK Exon76 reverse primer 5'-AAGTAGCATGTTGGTAATGT-3', 서열번호 17; DNA-PK 7825 site forward primer 5'-CCAGCATGAGCCCAGATTAT-3', 서열번호 18; DNA-PK 7825 site reverse primer 5'-TCAGATGAGGGACTGGTGTG-3', 서열번호 19; DNA-PK 9185 site forward primer 5'-AAGCCGAGAAGGATTTTTGG-3', 서열번호 20; DNA-PK 9185 site reverse primer 5'-TCAGATGAGGGACTGGTGTG-3')로 Accupower PCR premix Kit (바이오니아, BIONEER)를 이용하여 총 20ul volume으로 PCR 수행 (Exon 5; step 1 95℃ 5분 - step 2 95℃ 30초 - step 3 62℃ 30초 - step 4 72℃ 30초 - step 5 72℃ 10분 - step 2 ~ step 4 35cycle, Exon 76; step 1 95℃ 5분 - step 2 95℃ 30초 - step 3 56℃ 30초 - step 4 72℃ 30초 - step 5 72℃ 10분 - step 2 ~ step 4 35cycle, 7825 site; step 1 95℃ 5분 - step 2 95℃ 30초 - step 3 67℃ 30초 - step 4 72℃ 30초 - step 5 72℃ 10분 - step 2 ~ step 4 35cycle, 9185 site; step 1 95℃ 5분 - step 2 95℃ 30초 - step 3 58℃ 30초 - step 4 72℃ 30초 - step 5 72℃ 10분 - step 2 ~ step 4 35cycle)을 하여 PCR 생산물 10ul를 1% agarose gel에 전기영동 후 Et-Br 염색을 통하여 DNA-PK 유전자들의 PCR 생산물을 확인하고 이 PCR 생산물 나머지 10ul를 QIAquick PCR Purification Kit (퀴아젠, QIAGEN)로 정제 후 상기 각각의 primer를 이용하여 sanger 시퀀싱 (마크로젠, Macrogen)을 하여 DNA-PK의 돌연변이 분석을 확인하였다.
또한, p53 항체를 이용하여 IHC 면역염색을 통해 p53 유전자의 발현과 돌연변이 유무 분석을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 대장암 환자조직 7개, 대장암 환자유래 종양세포 21개, 대장암 환자 유래 종양생성 동물모델 조직 7개를 포함한 총 35개의 환자 유래 조직에서 p53 유전자의 정상형은 11개이고 돌연변이형은 24개로 분석되었으며 DNA-PK 유전자의 정상형은 28개이고 돌연변이형은 7개로 분석되었다. 이 중 2개의 대장암 환자 종양에서 p53 유전자가 정상형이고 DNA-PK 유전자가 돌연변이형이 분석되었다.
실시예 6. 대장암 환자 유래 종양세포에서 p53과 DNA-PK 유전자형에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸 분석
실제 대장암 환자에서 유래된 종양세포주를 이용하여 p53과 DNA-PK의 유전자형에 따른 올라파립(AZD2281)의 세포사멸을 분석하기 위해, 본 발명자들은 p53 유전자가 정상형이고 DNA-PK 유전자가 정상형인 대장암 환자 유래 종양세포주 11-CT-79511B, 11-CT-97845D와 p53 유전자가 정상형이고 DNA-PK 유전자가 돌연변이형인 대장암 환자 유래 종양세포주 11-CT-78093B, 11-CT-79724B와 p53 유전자가 돌연변이형이고 DNA-PK 유전자가 정상형인 11-CT-78481A와 p53 유전자형과 DNA-PK 유전자형이 돌연변이형인 11-CT-76479B에 올라파립(AZD2281)을 처리 한 후 세포 모양의 변화를 관찰하여 p53과 DNA-PK 유전자형에 따라 세포사멸이 유도되는지 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53과 DNA-PK 유전자형이 서로 다른 6종의 대장암 환자 유래 세포를 REBM(Renal Growth Basal Medium; 5% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신) (LONZA)에 배양하여 60 ㎜ 플레이트에 웰 당 1×104 개씩 37℃에서 24시간 배양하고 올라파립(AZD2281)을 최대 50uM에서 최소 25uM으로(50uM, 25uM) 처리한 후 37℃에서 48시간 배양하여 올라파립(AZD2281) 처리군과 비처리군의 세포 모양 변화를 관찰하여 약물 효능을 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, p53 유전자가 정상형이고 DNA-PK 유전자가 돌연변이형인 대장암 환자 유래 종양 세포주 11-CT-78093B와 11-CT-79724B에서만 올라파립(AZD2281)에 의해 세포의 모양이 사멸되는 것을 관찰할 수 있고 p53 유전자와 DNA-PK 유전자가 정상형인 대장암 환자 유래 종양 세포주 11-CT-79511B와 11-CT97845D 및 p53 유전자가 돌연변이형이고 DNA-PK 유전자가 정상형인 11-CT-78481A와 p53 유전자형과 DNA-PK 유전자형이 돌연변이형인 11-CT-76479B 대장암 환자 유래 종양 세포에서는 올라파립(AZD2281)에 의한 세포의 모양이 변화가 없는 것을 확인할 수 있다.
따라서, p53 유전자 및 DNA-PK 유전자는 PARP 저해제인 올라파립(AZD2281)에 대한 감수성 예측용 바이오 마커로서의 가능성을 보여준다.
실시예 7. DNA-PK 유전자 겹핍 시 올라파립(AZD2281)에 대한 DNA 복구 활성 분석
본 발명자들은 p53 정상 유전자 존재 시 DNA-PK 유전자 존재 유무와 올라파립(AZD2281)에 대한 DNA 복구 활성을 분석하고자, p53 정상 유전자가 존재하는 세포주 HCT116에 DNA-PK 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 유전자 발현을 감소시킨 후 올라파립(AZD2281)처리에 따른 NHEJ(Non-homologous end joining) DNA 복구 활성을 확인하였다.
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같다: p53 유전자가 정상인 HCT116 인간 대장암 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에 배양하여 60mm 플레이트에 웰 당 1X105개씩 37℃에서 24시간 배양하고 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 DNA-PK siRNA(서열번호 3; DNA-PK siRNA 5'-AAAGGGCCAAGCUGUCACUCU-3')를 세포 내 유입을 시켜 48시간 동안 37℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후 pEGFP-N1 vector(Clontech)를 HindIII(NEB)로 2시간 enzyme cutting하여 Lipopectamin2000(invitrogen)으로 각각 1ug씩 세포 내 유입을 시키고 올라파립(AZD2281)을 최대 50uM에서 최소 25uM으로(50uM, 25uM) 처리한 후 37℃에서 24시간 배양하여 GFP의 발현을 비교함으로써 NHEJ(Non-homologous end joining) DNA 복구 활성을 확인하였다.
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, DNA-PK 유전자만 감소 시킨 경우 감소 시키지 않은 경우보다 GFP의 발현이 상대적으로 낮고 DNA-PK 유전자를 감소 시키고 올라파립(AZD2281)을 처리한 경우에 GFP의 발현이 올라파립(AZD2281)을 처리 하지 않은 경우에 비해 더 낮게 발현하는 것으로 관찰되었고, 도 7b에 나타낸 바와 같이, DNA-PK 유전자를 감소시키고 올라파립(AZD2281)을 처리한 경우에 GFP가 발현되는 세포의 수가 올라파립(AZD2281)을 처리하지 않은 경우에 비해 더 적은 수로 발현하는 것으로 관찰되어 DNA-PK 유전자가 감소되어 있는 경우 올라파립(AZD2281)에 의해 NHEJ(Non-homologous end joining) DNA 복구 활성이 낮은 것을 확인하였다.

Claims (24)

  1. p53 유전자(gene bank number: NM_000546.5)를 포함하는, PARP(poly ADP ribose polymerase) 저해제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 바이오 마커는 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase)(gene bank number: NM_006904.6) 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커.
  3. p53 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 조성물은 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 PARP는 PARP-1, PARP-2 또는 PARP-3인 것을 특징으로 하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 PARP 저해제는 신경통, 중증근무력증, 근 위축증, 근위축성 측삭경화증(ALS), 진행성 근 위축증, 길레인-발레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 헝틴톤 질환, 알쯔하이머 질환, 파킨슨병, 아테롬성 동맥경화증, 협심증, 심근경색, 심장 마비, 바이패스 수술에 의한 심혈계 손상, ACTH 생성 종양, 급성 림프구성 또는 림프아구성 백혈병, 급성 또는 만성의 림포구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 방광암, 뇌종양, 유방암, 경관암, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 자궁내막증, 식도암, 방광암, 에윙스 육종(Ewing's sarcoma), 설암, 홉킨스 림프종, 카포시스 육종, 신장암, 간암, 폐암, 중피종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 비홉킨 림프종, 골육종, 난소암, 유선암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 페니스암, 레티노블라스토마, 피부암, 위암, 갑상선압, 자궁암, 고환암, 윌름스 종양 및 트로포블라스토마로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상에 대한 치료제인 것을 특징으로 하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물.
  7. 제 3 항에 있어서, 상기 PARP 저해제는 AZD2281(올라파립, Olaparib), ABT888(벨리파립, Veliparib), AG014699(루카파립, Rucaparib), MK-4827(니라파립, Niraparib), BMN-673(탈라조파립, Talazoparib), BSI201(이니파립, Iniparib), BGP15(O-(3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl)nicotinic-amidoxime), INO1001(3-Aminobenzamide), ONO2231, 니코틴아미드(nicotinamide), 3-아미노벤즈아미드(3-amino benzamide), 3,4-디히드로-5-[4-(1-피페리디닐)부톡시]-1(2H)-이소퀴놀론(3,4-dihydro-5-[4-(1-piperidinyl)butoxy]-1(2H)-isoquinolone), 벤즈아미드(benzamide), 퀴놀론(quinolone), 이소퀴놀론(isoquinolone), 벤조피론(benzopyrone), 사이클릭 벤즈아미드(cyclic benzamide), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 인돌(indole) 및 펜안트리디논(phenanthridinone)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물.
  8. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물.
  9. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물.
  10. 제 3 항 또는 제 4 항의 조성물을 포함하는, PARP 저해제에 대한 감수성 예측용 키트.
  11. (a) 대상으로부터 생물학적 시료를 준비하는 단계;
    (b) 상기 생물학적 시료 내 p53 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) (b) 단계에서 측정한 발현 수준 확인 결과에 기초하여 상기 대상의 PARP 저해제에 대한 감수성을 판정하는 단계;
    를 포함하는 PARP 저해제에 대한 감수성 예측 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 예측 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 (c) 단계에서
    (i) p53 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준이 정상인 경우; 및/또는
    (ii) DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준이 정상에 비하여 저발현인 경우,
    상기 대상은 PARP 저해제에 대한 감수성이 있는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 예측 방법.
  14. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준의 측정은, 상기 유전자 손실 또는 단백질 손실 또는 이들의 변이 존재 여부 측정을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 예측 방법.
  15. DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) 유전자 발현 또는 이의 단백질 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 대상의 PARP 저해제에 대한 감수성 증진제.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 대상은 p53 유전자 또는 이의 단백질 발현 수준이 정상인 것을 특징으로 하는, 감수성 증진제.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 억제제는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연 추출물 및 화학물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 감수성 증진제.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 감수성 증진제.
  19. 제 15 항에 있어서, 상기 PARP는 PARP-1, PARP-2 또는 PARP-3인 것을 특징으로 하는, 감수성 증진제.
  20. 제 15 항에 있어서, 상기 PARP 저해제는 신경통, 중증근무력증, 근 위축증, 근위축성 측삭경화증(ALS), 진행성 근 위축증, 길레인-발레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 헝틴톤 질환, 알쯔하이머 질환, 파킨슨병, 아테롬성 동맥경화증, 협심증, 심근경색, 심장 마비, 바이패스 수술에 의한 심혈계 손상, ACTH 생성 종양, 급성 림프구성 또는 림프아구성 백혈병, 급성 또는 만성의 림포구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 방광암, 뇌종양, 유방암, 경관암, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 자궁내막증, 식도암, 방광암, 에윙스 육종(Ewing's sarcoma), 설암, 홉킨스 림프종, 카포시스 육종, 신장암, 간암, 폐암, 중피종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 비홉킨 림프종, 골육종, 난소암, 유선암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 페니스암, 레티노블라스토마, 피부암, 위암, 갑상선압, 자궁암, 고환암, 윌름스 종양 및 트로포블라스토마로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상에 대한 치료제인 것을 특징으로 하는, 감수성 증진제.
  21. 제 15 항에 있어서, 상기 PARP 저해제는 AZD2281(올라파립, Olaparib), ABT888(벨리파립, Veliparib), AG014699(루카파립, Rucaparib), MK-4827(니라파립, Niraparib), BMN-673(탈라조파립, Talazoparib), BSI201(이니파립, Iniparib), BGP15(O-(3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl)nicotinic-amidoxime), INO1001(3-Aminobenzamide), ONO2231, 니코틴아미드(nicotinamide), 3-아미노벤즈아미드(3-amino benzamide), 3,4-디히드로-5-[4-(1-피페리디닐)부톡시]-1(2H)-이소퀴놀론(3,4-dihydro-5-[4-(1-piperidinyl)butoxy]-1(2H)-isoquinolone), 벤즈아미드(benzamide), 퀴놀론(quinolone), 이소퀴놀론(isoquinolone), 벤조피론(benzopyrone), 사이클릭 벤즈아미드(cyclic benzamide), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 인돌(indole) 및 펜안트리디논(phenanthridinone)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 감수성 증진제.
  22. 제 15 항에 있어서, 상기 감수성 증진제는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 감수성 증진제.
  23. 제 15 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 감수성 증진제 및 PARP 저해제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  24. 제 15 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 감수성 증진제 및 PARP 저해제를 대상에게 공동 투여하는 단계를 포함하는, PARP 저해제에 대한 감수성 증진 방법.
PCT/KR2015/007966 2014-07-29 2015-07-29 Parp 저해제에 대한 감수성 예측용 신규한 바이오 마커 및 이의 용도 WO2016018089A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20140096661 2014-07-29
KR10-2014-0096661 2014-07-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016018089A1 true WO2016018089A1 (ko) 2016-02-04

Family

ID=55217871

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2015/007966 WO2016018089A1 (ko) 2014-07-29 2015-07-29 Parp 저해제에 대한 감수성 예측용 신규한 바이오 마커 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101844541B1 (ko)
WO (1) WO2016018089A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022061001A1 (en) * 2020-09-16 2022-03-24 Splash Pharmaceuticals, Inc. Methods for patent selection and treatment of cancer
CN114796226A (zh) * 2021-12-17 2022-07-29 新乡医学院 奥拉帕尼在诱导核仁应激中的应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021086107A1 (ko) * 2019-10-30 2021-05-06 (재)록원바이오융합연구재단 Parp 저해제에 대한 반응성 결정방법
US20230383363A1 (en) * 2020-11-04 2023-11-30 GC Genome Corporation Method for determining sensitivity to parp inhibitor or dna damaging agent using non-functional transcriptome
KR102557456B1 (ko) * 2021-09-02 2023-07-19 주식회사 펄스인마이어스 항암 활성을 가지는 adp-리보오스 결합 펩티드 및 이의 용도

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUANG, H. C. ET AL.: "Differential anti-proliferative activities of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitors in triple-negative breast cancer cells", BREAST CANCER RES. TREAT., vol. 134, no. 2, 8 June 2012 (2012-06-08), pages 649 - 659, XP035088852, DOI: doi:10.1007/s10549-012-2106-5 *
JELINIC, P. ET AL.: "New insights into PARP inhibitors'' effect on cell cycle and homology-directed DNA damage repair", MOL. CANCER THER., vol. 13, no. 6, 2 April 2014 (2014-04-02), pages 1645 - 1654 *
KUBOTA, E. ET AL.: "Low ATM protein expression and depletion of p53 correlates with olaparib sensitivity in gastric cancer cell lines", CELL CYCLE, vol. 13, no. 13, 19 May 2014 (2014-05-19), pages 2129 - 2137 *
TO, C. ET AL.: "The PARP inhibitors, veliparib and olaparib, are effective chemopreventive agents for delaying mammary tumor development in BRCA1-deficient mice", CANCER PREV. RES. (PHILA., vol. 7, no. 7, 9 May 2014 (2014-05-09), pages 698 - 707 *
WILLIAMSON, C. T. ET AL.: "Enhanced cytotoxicity of PARP inhibition in mantle cell lymphoma harbouring mutations in both ATM and p53", EMBO MOL. MED., vol. 4, no. 6, 13 March 2012 (2012-03-13), pages 515 - 527 *
YUAN, Y. ET AL.: "Novel targeted therapeutics: inhibitors ofMDM2, ALK and PARP", J. HEMATOL. ONCOL., vol. 4, no. 16, 20 April 2011 (2011-04-20) *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022061001A1 (en) * 2020-09-16 2022-03-24 Splash Pharmaceuticals, Inc. Methods for patent selection and treatment of cancer
CN114796226A (zh) * 2021-12-17 2022-07-29 新乡医学院 奥拉帕尼在诱导核仁应激中的应用
CN114796226B (zh) * 2021-12-17 2023-09-12 新乡医学院 奥拉帕尼在诱导核仁应激中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160014565A (ko) 2016-02-11
KR101844541B1 (ko) 2018-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016018089A1 (ko) Parp 저해제에 대한 감수성 예측용 신규한 바이오 마커 및 이의 용도
WO2016036172A1 (ko) 단백질 키나제 억제제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커 및 이의 용도
Akino et al. The Ras effector RASSF2 is a novel tumor-suppressor gene in human colorectal cancer
WO2016018087A1 (ko) Egfr-표적제제에 대한 감수성 예측용 신규한 바이오 마커 및 이의 용도
WO2016018088A1 (ko) Met 저해제에 대한 감수성 예측용 신규한 바이오 마커 및 이의 용도
US20130052644A1 (en) Predictive Markers Useful in the Treatment of Fragile X Syndrome (FXS)
US20220023294A1 (en) Synthetic lethality and the treatment of cancer
WO2012087004A2 (en) Use of upr signaling pathway genes ire1 and hxl1 for treatment of fungal infection and meningitis
WO2021107644A1 (ko) 항암 효과 증진을 위한 ERRγ 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도
WO2022019604A1 (ko) 간암 특이적 바이오 마커 및 이의 용도
WO2017007241A1 (ko) Parp 및 탄키라제 동시 저해제에 대한 감수성 결정 방법
WO2015108328A1 (ko) 대장암 마커로서의 신규 ntrk1 융합유전자 및 이의 용도
WO2014038890A1 (ko) Axl을 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 암 진단용 조성물
WO2018174506A1 (ko) Sulf2 유전자를 이용한 소라페닙 치료에 대한 감수성 예측방법 및 sulf2 저해제를 포함하는 암 치료용 조성물
WO2011013912A2 (ko) 암에 대한 방사선 치료 증진용 약학 조성물 및 암에 대한 방사선 치료 증진용 활성물질을 스크리닝하는 방법
Doroszko et al. Luteinizing hormone and GATA4 action in the adrenocortical tumorigenesis of gonadectomized female mice
WO2016172795A1 (en) Modulating uracil-dna glycosylase and uses thereof
WO2023101457A1 (ko) 담도암의 예방 또는 치료용 조성물
US10690656B2 (en) Methods of screening and treatment with USP4 inhibitors
WO2022169342A2 (ko) 암 전이 억제용 약학 조성물
Xia et al. Real-time PCR assay with high resolution melting for EGFR and BIM mutation of lung cancer.
WO2023172032A1 (ko) Nmur2 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
WO2023096351A1 (ko) 상피세포성장인자수용체(egfr) 변이를 갖는 암 치료용 조성물
WO2023068404A1 (ko) Eml4-alk 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공 방법 및 alk 저해제 내성 비소세포폐암 치료용 조성물
WO2021154056A2 (ko) 유사유전자의 신경교종의 악성도 진단을 위한 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15827351

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15827351

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1