ES2906454T3 - Método para determinar la sensibilidad al inhibidor simultáneo contra PARP y Tanquirasa - Google Patents

Método para determinar la sensibilidad al inhibidor simultáneo contra PARP y Tanquirasa Download PDF

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Abstract

Un método para determinar la susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP (Poli ADP Ribosa Polimerasa) y Tanquirasa, comprendiendo el método las siguientes etapas: (a) aislar moléculas de ácido nucleico de células de cáncer colorrectal que han sido tomadas de un paciente con cáncer colorrectal (b) identificar genotipos de un gen p53 y un gen LIG4 (ADN ligasa 4) en la molécula de ácido nucleico de la etapa (a), en donde, cuando el genotipo del gen p53 es de tipo normal y el genotipo del gen LIG4 es de tipo mutante, se determina que el paciente tiene susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP y Tanquirasa, en donde, cuando el gen p53 comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, el genotipo es de tipo normal y en donde, cuando el gen LIG4 consiste en una o más variantes de secuencia seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de citosina por timina en la posición 8, una sustitución de citosina por timina en la posición 26, una sustitución de guanina por adenina en la posición 833 y una sustitución de timina por citosina en la posición 1704 de SEQ ID NO: 2, el genotipo es de tipo mutante.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para determinar la sensibilidad al inhibidor simultáneo contra PARP y Tanquirasa
Campo técnico
La presente divulgación se realizó bajo la Tarea Núm. HI06C0868 con el apoyo del Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea. El instituto especializado en gestión de investigación de la tarea anterior es el Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea, el nombre del proyecto de investigación es "Leading Specialization Research Project", el nombre de la tarea de investigación es "Development of anticancer drugs targeting Wnt signaling mechanism" y el instituto de investigación es el Instituto para la Investigación Innovadora del Cáncer del Centro Médico Asan en Seúl. El período de investigación es del 1 de diciembre de 2013 al 30 de noviembre de 2016.
La presente invención se refiere a un método para determinar la susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP (Poli ADP Ribosa Polimerasa) y Tanquirasa.
Técnica anterior
Los biomarcadores se definen como "indicadores que pueden medir y evaluar objetivamente la respuesta de los fármacos a los procesos biológicos normales, la progresión de la enfermedad y los métodos de tratamiento". Recientemente, con el desarrollo de la tecnología de análisis de genes, ha aumentado la investigación sobre la relación entre una mutación de un gen específico y una enfermedad específica, por lo que un biomarcador puede redefinirse como un indicador molecular y biológico que cubre las diferencias en el gen y la mutación genética, las diferencias en las expresiones de ARN, proteínas y metabolitos.
Además, se ha desarrollado el Companion Diagnostic Device (CDx), mediante el cual se puede determinar la susceptibilidad de los biomarcadores, para clasificar a los pacientes de modo que se pueda maximizar el efecto del tratamiento con los medicamentos o se puedan minimizar los efectos secundarios de los medicamentos para un tratamiento más eficaz.
El intestino grueso es un tracto digestivo largo en forma de tubo de alrededor de 150 cm conectado desde el extremo del intestino delgado hasta el ano. Se divide en ciego, colon, recto y conducto anal. Los tumores malignos que surgen en el colon y el recto se consideran cánceres de colon. La mayoría de los cánceres de colon son adenocarcinomas (es decir, adenocarcinoma), que es un cáncer de las células glandulares en las membranas mucosas. Además, se pueden presentar protopatías tales como linfomas, tumores carcinoides malignos, leiomiosarcoma, etc.
A lo largo de esta memoria descriptiva se hace referencia y se citan numerosas tesis y documentos relacionados con patentes.
Wahlberg et al (Nature Biotechnology, 2012, 30, 283-289) divulgan el análisis estructural de inhibidores de PARP y tanquirasa. Hsiao y Smith (J Cell Biol, 2009, 184, 515-526) se refieren a telómeros hermanos disfuncionales y NHEJ.
Divulgación
Problema técnico
Los autores de la presente invención han intentado desarrollar un método para determinar la susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP y Tanquirasa para maximizar el efecto del tratamiento con el inhibidor simultáneo contra PARP (Poli ADP Ribosa Polimerasa) y Tanquirasa, que es un fármaco contra el cáncer de colon. Como resultado, los autores de la presente invención han completado la presente invención al confirmar que el efecto del tratamiento con un inhibidor simultáneo contra PARP y Tanquirasa se puede maximizar cuando el genotipo de p53 de las células de cáncer colorrectal aislado de un paciente con cáncer colorrectal es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante.
Por consiguiente, un aspecto de la presente divulgación es proporcionar un método para determinar la susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP y Tanquirasa.
Otro aspecto de la presente divulgación es proporcionar un kit para determinar la susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP y Tanquirasa.
Otros aspectos y ventajas de la presente divulgación se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención, reivindicaciones y dibujos.
Solución técnica
De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para determinar la susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP (Poli ADP Ribosa Polimerasa) y Tanquirasa, comprendiendo el método las siguientes etapas:
(a) aislar células de cáncer colorrectal de pacientes con cáncer colorrectal;
(b) aislar moléculas de ácido nucleico de células de cáncer colorrectal de la etapa (a); y
(c) identificar genotipos de un gen p53 y un gen LIG4 (ADN ligasa 4) en la molécula de ácido nucleico de la etapa (b), en donde cuando el genotipo del gen p53 es de tipo normal y el genotipo del gen LIG4 es de tipo mutante, se determina que el paciente es susceptible a un inhibidor simultáneo contra PARP y Tanquirasa.
Los autores de la presente invención han intentado desarrollar un método para determinar la susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP y Tanquirasa para maximizar el efecto del tratamiento con el inhibidor simultáneo contra PARP (Poli ADP Ribosa Polimerasa) y Tanquirasa, que es un fármaco contra el cáncer de colon. Como resultado, los autores de la presente invención han confirmado que el efecto del tratamiento con los inhibidores simultáneos contra PARP y Tanquirasa se puede maximizar cuando el genotipo de p53 de las células de cáncer colorrectal aisladas de un paciente con cáncer colorrectal es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante.
El método para determinar la susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP y Tanquirasa según la presente divulgación se describirá en detalle paso a paso.
Etapa (a) Aislamiento de células de cáncer colorrectal
En primer lugar, para obtener células de cáncer colorrectal de un paciente con cáncer colorrectal, estas se podrían obtener cortando tejido canceroso colorrectal y a continuación, tratándolo con una enzima proteolítica apropiada.
La enzima proteolítica puede ser una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en papaína, pancreatina, tripsina, quimotripsina, pepsina, estreptoquinasa, estreptodornasa, ficaína, carboxipeptidasa, aminopeptidasa, quimopapaína, bromelina y subtilisina.
Etapa (b) Aislamiento de moléculas de ácido nucleico
A continuación, se aíslan las moléculas de ácido nucleico de las células de cáncer de colon de la etapa (a).
Como se emplea en este documento, el término "molécula de ácido nucleico" tiene un significado amplio que incluye moléculas de ADN (ADNg y ADNc) y ARN, y el nucleótido, que es una unidad constitutiva básica en la molécula de ácido nucleico, incluye no solo nucleótidos naturales, sino también análogos en los que se modifican radicales de azúcar o base (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, Nueva York (1980); Uhlman y Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).
En el método de la presente divulgación, la molécula de ácido nucleico se puede obtener de células de cáncer de colon aisladas de tejido de cáncer de colon de un paciente con cáncer de colon.
Etapa (c) Identificación de los genotipos p53 y LIG4
A continuación, como etapa de confirmación de los genotipos del gen p53 y del gen LIG4 (ADN ligasa 4) de la molécula de ácido nucleico de la etapa (b), en la que cuando el genotipo del gen p53 es de tipo normal y el genotipo del gen LIG4 es de tipo mutante, hay susceptibilidad a los inhibidores de PARP y Tanquirasa.
Para confirmar los genotipos, cuando el material de partida es ADNg, el aislamiento del ADNg se puede llevar a cabo según métodos convencionales conocidos en la técnica (véase Rogers y Bendich (1994)). Cuando el material de partida es ARNm, el ARN total se aísla mediante un método convencional conocido en la técnica (véanse Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3a ed. Cold Spring Harbor Press (2001)); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons (1987); y Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156 (1987)). El ARN total aislado se sintetiza para proporcionar ADNc utilizando transcriptasa inversa. Dado que el ARN total se aísla de células animales, tiene una cola poli-A en el extremo del ARNm. El ADNc se puede sintetizar fácilmente utilizando cebadores oligo dT y transcriptasa inversa utilizando tal característica de secuencia (véanse PNAS USA, 85: 8998 (1988); Libert F, et al., Science, 244: 569 (1989); y Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3a ed. Cold Spring Harbor Press (2001)).
En el método de la presente divulgación, la etapa (c) se puede llevar a cabo aplicando varios métodos conocidos en la técnica utilizados para la genotipificación del genotipo.
Según un aspecto de la presente divulgación, la etapa (c) se puede realizarse mediante secuenciación de ADN, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), detección polimórfica amplificada aleatoriamente (RAPD), detección de polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLPD), sonda ASO (oligonucleótido específico de alelo) o micromatriz de ADN.
Si el genotipo del gen p53 es de tipo normal y el genotipo del gen LIG4 es de tipo mutante, se determina que tiene susceptibilidad a los inhibidores de PARP y tanquirasa.
De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el gen p53 incluye una secuencia de nucleótidos, representada en la lista de secuencias por SEQ ID NO: 1 cuando el genotipo del mismo es de tipo normal, y el gen LIG4 incluye una secuencia de nucleótidos, representada en la lista de secuencias por SEQ ID NO: 2 cuando el genotipo de la misma es de tipo normal.
Cuando el genotipo del gen LIG4 es de tipo mutante, incluye la mutación de la secuencia de nucleótidos de LIG4.
De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, cuando el gen LIG4 consiste una o más variantes de secuencia seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de citosina por timina en la posición 8, una sustitución de citosina por timina en la posición 26, una sustitución de guanina por adenina en la posición 833 y una sustitución de timina por citosina en la posición 1704 de SEQ ID NO: 2, se determina que el genotipo es de tipo mutante.
Cuando el genotipo del gen LIG4 es de tipo mutante, incluye la mutación de la secuencia de aminoácidos de LIG4.
De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, cuando el gen LIG4 consiste una o más variantes de secuencia seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de alanina por valina en la posición 3, una sustitución de treonina por isoleucina en la posición 9, una sustitución de arginina por histidina en la posición 278 y una sustitución de timina del ácido aspártico (GAT) por citosina en la posición 568 de SEQ ID NO: 3, se determina que el genotipo es de tipo mutante.
Cuando la base timina del ácido aspártico (GAT), que es el aminoácido 568, se sustituye por citosina, la base timina en el GAT, que es un codón que codifica el ácido aspártico, el aminoácido 568, es un ácido aspártico (GAC) sustituido con citosina.
Como etapa para confirmar los genotipos del gen p53 y el gen LIG4 (ADN ligasa 4) de la molécula de ácido nucleico, cuando el genotipo del gen p53 es de tipo normal y el genotipo del gen LIG4 es de tipo mutante, se determina que tiene susceptibilidad a los inhibidores de PARP y Tanquirasa.
Según un aspecto de la presente divulgación, el nombre IUPAC del inhibidor de PARP y tanquirasa, Compuesto A, es 8-[(dimetilamino)metil]-10-etoxi-1,2,3,4-tetrahidrobenzo[h][1,6]naftiridin-5(6H)-ona, y el nombre IUPAC del Compuesto B es 6-{4-[(5-oxo-1,2,3,4,5,6-hexahidrobenzo[h][1,6]naftiridin-8-il)metil]piperazin-1 -il}nicotinonitrilo.
De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, la presente divulgación proporciona un kit para determinar la susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP (Poli ADP Ribosa Polimerasa) y Tanquirasa, en el que el kit incluye: (a) un cebador o una sonda que se unen específicamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un gen p53; y (b) un cebador o una sonda que se unen específicamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un gen LIG4 (ADN ligasa 4).
Como se emplea en el presente documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido de hebra sencilla que puede actuar como punto de partida para la síntesis de ADN dirigida por molde en condiciones adecuadas (es decir, otros cuatro nucleósidos trifosfato y enzimas de polimerización) en un tampón adecuado a una temperatura adecuada. La longitud adecuada del cebador suele ser de 15 a 30 nucleótidos, aunque varía según varios factores, tales como la temperatura y el uso del cebador. Las moléculas de cebador cortas generalmente requieren temperaturas más bajas para formar un complejo híbrido suficientemente estable con el molde.
No es necesario que la secuencia del cebador tenga una secuencia completamente complementaria a una secuencia parcial del molde, y es suficiente que el cebador tenga suficiente complementariedad dentro de un rango capaz de hibridarse con el molde y actuar como un cebador único. Por lo tanto, no es necesario que el cebador en la presente divulgación tenga una secuencia perfectamente complementaria a la secuencia de nucleótidos mencionada anteriormente que es un molde, y es suficiente que el cebador tenga suficiente complementariedad dentro de un rango capaz de hibridarse con la secuencia del gen y actuar como cebador. Los expertos en la técnica pueden realizar fácilmente el diseño de tal cebador con referencia a la secuencia de nucleótidos descrita anteriormente, por ejemplo, utilizando un programa para el diseño de cebadores (p. ej., el programa PRIMER 3).
Como se emplea en el presente documento, el término "sonda" se refiere a un oligómero lineal de monómeros o conexiones naturales o modificados, incluidos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, y puede hibridar específicamente con una secuencia de nucleótidos diana, y está presente de forma natural o es sintetizada artificialmente. La sonda de la presente descripción es preferiblemente de hebra sencilla y es un oligodioxirribonucleótido.
La secuencia de nucleótidos del marcador de la presente divulgación a la que se hace referencia en la preparación del cebador o la sonda se puede confirmar mediante GenBank. Por ejemplo, el p53 de la presente descripción tiene la secuencia de nucleótidos con el número de acceso de GenBank NM_000546.5 y el LIG4 tiene la secuencia de nucleótidos con el número de acceso de GenBank NM_002312.3, y los cebadores o sondas se pueden diseñar con referencia a esta secuencia.
De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, la secuencia de nucleótidos que codifica el gen p53 está representada por SEQ Id NO: 1 y la secuencia de nucleótidos que codifica el gen LIG4 está representada por SEQ ID NO: 2.
De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, para detectar el gen LIG4 mutante, se utilizan un par de cebadores representados por SEQ ID NO: 8 y 9, un par de cebadores representados por SEQ ID NO: 10 y 11 y un par de los cebadores representados por SEQ ID NO: 12 y 13.
Efectos ventajosos
Las características y ventajas de la presente divulgación se resumen a continuación:
(a) La presente divulgación proporciona un método y un kit para determinar la susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP (poli ADP ribosa polimerasa) y tanquirasa.
(b) La presente divulgación puede maximizar el efecto del tratamiento del cáncer de colon mediante la clasificación de grupos de pacientes con susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP y Tanquirasa.
Descripción de los dibujos
La FIG. 1 ilustra los resultados del análisis de la susceptibilidad anticáncer con el Compuesto A y la relevancia de la presencia o ausencia de p53 y los genes relacionados con la reparación del ADN (ATR, XLF, XRCC4 y LIG4) del Compuesto A, en los que el Compuesto A es un inhibidor simultáneo contra PARP/Tanquirasa en la línea celular de cáncer de colon humano HCT116.
La FIG. 2 ilustra los resultados del análisis de apoptosis para los tratamientos con el Compuesto A y olaparib, que son inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, según el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 en varias líneas celulares de cáncer de colon humano (RKO, LoVo y SW620).
La FIG. 3 ilustra los resultados del análisis del daño en el ADN para los tratamientos con el Compuesto A y olaparib, que son inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, en la línea celular de cáncer de colon humano HCT116 en la que el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son de tipo normal, a través de métodos inmunoquímicos.
La FIG. 4 ilustra los resultados del análisis del daño en el ADN para los tratamientos con el Compuesto A y olaparib, que son inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, en la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, a través de métodos inmunoquímicos.
Las FIG. 5A y 5B ilustran el daño en el ADN y la apoptosis para los tratamientos con el Compuesto A y olaparib, que son inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, en líneas celulares de cáncer de colon humano HCT116 y RKO a través de transferencia Western.
La FIG. 6 ilustra los resultados del análisis de apoptosis para el tratamiento con el Compuesto A, que es un inhibidor simultáneo contra PARP/Tanquirasa, después de expresar en exceso LIG4 de tipo mutante (G833A o T1704C) en la línea celular de cáncer de colon humano HCT8 (p53 WT/LIG4 WT).
La FIG. 7 ilustra los resultados del análisis de apoptosis para el tratamiento con el Compuesto A, que es un inhibidor simultáneo contra PARP/Tanquirasa, que expresa en exceso LIG4 de tipo mutante (G833A o T1704C) en la línea celular de cáncer de colon humano SW620 (p53 MT/LIG4 WT).
Las FIG. 8A y 8B ilustran los resultados del análisis del daño en el ADN y la apoptosis para los tratamientos con el Compuesto A y olaparib, que son inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, después de expresar en exceso LIG4 de tipo mutante (G833A o T1704C) en la línea celular de cáncer de colon humano Hc T8 (p53 WT/LIG4 WT).
Las FIG. 9A y 9B ilustran los resultados del análisis de apoptosis para los tratamientos con el Compuesto A y olaparib, que son inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, después de expresar en exceso cada uno de p53 de tipo mutante y LIG4 de tipo normal en la línea celular de cáncer de colon humano RKO (p53 WT/LIG4 MT).
Las FIG. 10A y 10B ilustran los resultados del análisis comparativo de apoptosis para los tratamientos con el Compuesto A y el Compuesto B, que son los inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, en la línea celular de cáncer de colon humano (RKO, LoVo) en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante.
Las FIG. 11A a 11D ilustran los resultados del análisis de apoptosis para los tratamientos con el Compuesto A, Compuesto B, olaparib y NVP-TNKS656, que son los inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, en las líneas celulares de cáncer de colon humano RKO (p53 WT/LIG4 MT), SW620 (p53 MT/LIG4 WT), HCT8 (p53 WT/LIG4 WT) y KM12C (p53 MT/LIG4 MT).
Las FIG. 12A y 12B ilustran los resultados del análisis de apoptosis para el tratamiento con el Compuesto B y olaparib, que son los inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, expresando en exceso cada uno de p53 de tipo mutante y LIG4 de tipo normal en la línea celular de cáncer de colon humano RKO (p53 WT/LIG4 MT).
Las FIG. 13A y 13B ilustran los resultados del análisis de apoptosis para el tratamiento con el Compuesto B y olaparib, que son los inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, expresando en exceso cada uno de p53 de tipo mutante y LIG4 de tipo normal en la línea celular de cáncer de colon humano LoVo (p53 WT/LIG4 MT).
Las FIG. 14A y 14B ilustran el daño en el ADN y la apoptosis para el tratamiento con el Compuesto B y olaparib, que son los inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, expresando en exceso cada uno de p53 de tipo mutante y LIG4 de tipo normal en la línea celular de cáncer de colon humano LoVo (p53 WT/LIG4 MT) a través de transferencia Western.
Las FIG. 15A y 15B ilustran los resultados del análisis de inhibición tumoral con el Compuesto A y olaparib, que son inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, en un modelo in vivo de modelo de xenoinjerto utilizando la línea celular de cáncer de colon humano RKO (p53 WT/LIG4 MT).
Las FIG. 16A y 16B ilustran los resultados del análisis de inhibición tumoral para la administración del Compuesto A y olaparib, que son inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, en un modelo in vivo de modelo de xenoinjerto utilizando la línea celular de cáncer de colon humano SW620 (p53 MT/LIG4 WT).
Las FIG. 17A y 17B ilustran los resultados del análisis de inhibición tumoral para la administración del Compuesto A y olaparib, que son inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, en un modelo in vivo de modelo de xenoinjerto utilizando la línea celular de cáncer de colon humano KM12C (p53 MT/LIG4 MT)
Las FIG. 18A y 18B ilustran los resultados del análisis de inhibición tumoral para la administración del Compuesto B y olaparib, que son inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, en un modelo in vivo de modelo de xenoinjerto utilizando la línea celular de cáncer de colon humano RKO (p53 WT/LIG4 MT).
Las FIG. 19A y 19B ilustran los resultados del análisis de inhibición tumoral para la administración del Compuesto B, que es un inhibidor simultáneo contra PARP/Tanquirasa, en un modelo in vivo de modelo de xenoinjerto utilizando la línea celular de cáncer de colon humano KM12C (p53 MT/LIG4 MT).
La FIG. 20 muestra los resultados del análisis de cambio de forma celular para el tratamiento con el Compuesto B y olaparib, que son inhibidores simultáneos contra PARP/Tanquirasa, en células obtenidas a partir de pacientes con cáncer de colon 11-CT-79558D (p53 WT/LIG4 MT), 11-CT-80464B (p53 WT/LIG4 MT) y 11CT-94575 (p53 WT/LIG4 WT), 13CT-78649B (p53 WT/LIG4 WT).
Modos de la invención
A continuación, la presente divulgación se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos. Los expertos en la técnica deben entender que estos aspectos son solo para describir la presente divulgación con más detalle y que el alcance de la presente divulgación no está limitado por estos aspectos de acuerdo con la esencia de la presente divulgación.
El nombre IUPAC del Compuesto A, nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa utilizado en la presente divulgación es 8-[(dimetilamino)metil]-10-etoxi-1,2,3,4-tetrahidrobenzo[h][1,6]naftiridin-5(6H)-ona, y el nombre IUPAC del Compuesto B es 6-{4-[(5-oxo-1,2,3,4,5,6-hexahidrobenzo[h][1,6]naftiridin-8-il)metil]piperazin-1-il}nicotinonitrilo.
Ejemplo 1: Análisis de CI 50 del Compuesto A como inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa
Los autores de la presente invención realizaron un ensayo in vitro basado en células para analizar la actividad anticancerosa del Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, en 18 líneas celulares de cáncer de colon humano (adquiridas en Korean Cell Line Bank y ATCC), y se midieron la viabilidad celular y CI50 de las líneas celulares para el Compuesto A, el nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa.
Como condiciones y métodos experimentales, se cultivaron un total de 18 líneas celulares de cáncer de colon humano en RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640; FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%), y cada línea celular se cultivó en una placa de 96 pocillos para 2 x 103 por pocillo a 37°C durante 24 horas y el nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, Compuesto A, se diluyó en un múltiplo de 2 a un máximo de 100 pM y un mínimo de 0,390625 pM (100 pM, 50 pM, 25 pM, 12,5 pM, 6,25 pM, 3,125 pM, 1,5625 pM, 0,78125 pM y 0,390625 pM). Después del tratamiento, se cultivó a 37°C durante 72 horas. En cuanto al grupo de tratamiento farmacológico y el grupo sin tratamiento, la viabilidad celular de cada línea celular se midió mediante análisis MTS (Promega, CellTiter 96 AQeous One Solution) y la CI50 de cada línea celular se midió utilizando el programa PRISM.
Resultado del experimento
Como resultado del análisis de CI50 utilizando el análisis MTS de cada una de las 18 líneas celulares de cáncer de colon humano tratadas con el Compuesto A, un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, se mostraron los valores de CI50 significativos del Compuesto A en las líneas celulares de 10 especies (HCT116, HT29, RKO, LoVo, LS174T, Colo201, Colo205, Colo320HSR, HCT8 y Caco-2).
[Tabla 1]
Figure imgf000007_0002
Ejemplo 2: Susceptibilidad anticáncer con el Compuesto A según el genotipo de p53
Los autores de la presente invención analizaron la correlación de 18 líneas celulares de cáncer de colon humano, el efecto anticanceroso del Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa y el genotipo del gen p53 a través de un ensayo in vitro basado en células en el mismo método experimental que el Ejemplo 1 en 18 líneas celulares de cáncer de colon humano.
Resultado del experimento
Como resultado de la comparación con la CI50 del Compuesto A, que es un inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y el genotipo de p53 que se encuentra comúnmente en el cáncer de colon en 18 líneas celulares de cáncer de colon humano, las células de cáncer de colon con el genotipo de p53 normal se analizaron con valores de CI50 bajos. Se mostró la relación entre el genotipo de p53 y el Compuesto A, un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa.
Tabla 2
Figure imgf000007_0001
Ejemplo 3: Análisis del genotipo de susceptibilidad anticáncer del Compuesto A
Para analizar el grado de apoptosis por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, dependiendo de la presencia o ausencia del gen p53 y la presencia o ausencia del gen de reparación del ADN, los autores de la presente invención redujeron la expresión génica mediante un método de modificación genética para reducir la expresión de ARNip de ATR, XLF, XRCC4 y LIG4 conocido como gen de reparación de ADN en la línea celular de cáncer de colon humano HCT116 en la que está presente el gen normal p53, y después, trataron con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa. A continuación, se midió el número de células mediante un ensayo de tinción con azul de tripano para confirmar el grado de apoptosis. Como condiciones y métodos experimentales, la línea celular de cáncer de colon humano HCT 116 nula para p53 en la que el gen p53 es normal y HCT116 y el gen p53 son deficientes se cultiva en RPMI1640 (FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%), y se cultivaron 1x 105 por pocillo a 37°C durante 24 horas en una placa de 60 mm. Se infundieron ATR, XLF, XRCC4 y LIG4 (SEQ ID NO: 4; ARNip de ATR 5'-GAGUUCUCAGAAGUCAACC-3', SEQ ID NO: 5; ARNip de XLF 5'-CGCUGAUUCGAGAUCGAUUGA-3', SEQ ID NO: 6; ARNip de XRCC45'-CUGAUCUCUCUGGGUUGGCUU-3', SEQ ID NO: 7; ARNip de LIG4 5'-GGGAGUGUCUCAUGUAAUA-3') a las células por medio de Lipofectamina 2000 (Invitrogen), y se inactivaron a 37°C durante 48 horas. Las células se trataron con Compuesto A 25 pM y 50 pM, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa. Después de 48 horas de cultivo, se midió el número de células mediante tinción con azul de tripano y se confirmó el grado de apoptosis.
Resultado del experimento
Los genes relacionados con la reparación del ADN se desactivaron según la presencia o ausencia del gen p53 en HCT 116 y HCT 116 deficiente en p53 (HCT 116 nula para p53), que son líneas celulares de cáncer de colon con p53 de genotipo normal. Como resultado del análisis de un gen de reparación del ADN que muestra la susceptibilidad solo en el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, en caso de que el gen p53 sea normal y el gen LIG sea deficiente, la apoptosis aumenta significativamente, mostrando por lo tanto un resultado selectivo en el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa (FIG. 1).
Ejemplo 4: Análisis del genotipo de LIG4 en células de cáncer de colon
Para confirmar el genotipo de LIG4 en la línea celular de cáncer de colon, los autores de la presente invención analizaron la mutación/deficiencia del genotipo de LIG4 en 20 líneas celulares de cáncer de colon mediante RT-PCR y secuenciación. Las condiciones y métodos del experimento fueron los siguientes: un total de 20 líneas celulares de cáncer de colon se sometió a extracción de ARN total con el método de extracción de ARN Trizol utilizando un homogeneizador, y se resintetizaron 500 ng de ARN total en ADNc y se realizó la PCR utilizando el cebador para LIG4 (SEQ ID NO: 8; cebador para LIG4 cebador directo para el Exón2-1 5'-GCTAGCTGCTATTGCAGATATTGAGC-3', SeQ ID NO: 9; cebador para LIG4 cebador inverso para el Exón2-1 5'-AGAACCTTCAGTAGGAGAAGCACCAA-3', SEQ ID NO: 10; cebador para LIG4 cebador directo para el Exón2-2 cebador directo para el Exón2-2, 5'-CCTGGTGAGAAGCCATCTGT-3', SEQ ID NO: 11; cebador para LIG4, cebador inverso para el Exón2-2, 5'-GCCTTCCCCCTAAGTTGTTC-3'). Después de la electroforesis en gel de agarosa al 1%, el análisis de mutantes se confirmó mediante secuenciación de Sanger del producto de PCR en la que se confirmó la expresión de LIG4 mediante tinción con Et-Br.
Resultado del experimento
Para confirmar si existe alguna mutación del genotipo de LIG4 en 20 líneas celulares de cáncer de colon humano, los sitios G833 y T1704, que se conocen como sitios de mutación de mal funcionamiento del gen LIG4, se analizaron mediante el método de secuenciación de Sanger. Como resultado, se ha confirmado que existe una mutación del genotipo de LIG4 en 8 líneas celulares de cáncer de colon de entre 20 de ellas.
[Tabla 3]
Figure imgf000009_0001
Ejemplo 5: Análisis de la apoptosis según los genotipos de p53 y LIG4
Para analizar el grado de apoptosis por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa según el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4, los autores de la presente invención trataron con un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, el Compuesto A, y un fármaco inhibidor de PARP competitivo, olaparib, RKO, línea celular de cáncer de colon humano LoVo en la que el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante y una línea celular de cáncer de colon humano SW620 en la que el gen p53 es de tipo mutante y el gen LIG4 es de tipo normal. El número de células se midió mediante un ensayo de tinción con azul de tripano para confirmar el grado de apoptosis. Las condiciones y métodos del experimento fueron los siguientes: RKO, línea celular de cáncer de colon humano LoVo en la que el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante y línea celular de cáncer de colon humano SW620 en la que el gen p53 es de tipo mutante y el gen LIG4 es de tipo normal se cultivaron en RPMI1640 (FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%) y se cultivaron en una placa de 60 mm a 1 x 105 por pocillo durante 24 horas a 37°C. El compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, se utilizaron para el tratamiento a 25 pM y 50 pM cada uno y para el cultivo durante 48 horas. El número de células se midió mediante un ensayo de tinción con azul de tripano para confirmar el grado de apoptosis.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado de apoptosis mediante el tratamiento con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, de una línea celular de cáncer de colon humano cuyos genotipos de p53 y LIG4 son diferentes, la apoptosis fue inducida por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, en RKO, línea celular de cáncer de colon humano LoVo en la que el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante, y no se observó ningún efecto de apoptosis con olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo. En la línea celular de cáncer de colon humano SW620 en la que el gen p53 es de tipo mutante y el gen LIG4 es de tipo normal, se observó que tanto el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, como olaparib mostraron un bajo efecto de apoptosis, mostrando así un resultado selectivo en el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa en el que el genotipo de p53 es normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante (FIG. 2).
Ejemplo 6: Análisis de daño en el ADN de células con genotipo de p53 de tipo normal
Para analizar el grado de daño en el ADN por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa cuando el gen p53 es de tipo normal, los autores de la presente invención trataron con un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, Compuesto A, y el fármaco inhibidor de PARP competitivo, olaparib, la línea celular de cáncer de colon humano HCT116 en la que el gen p53 es de tipo normal, y a continuación, se confirmó el daño en el ADN mediante un método inmunoquímico como el nivel de expresión de r-H2AX. Las condiciones y métodos del experimento fueron los siguientes: la línea celular de cáncer de colon humano HCT 116 en la que el gen p53 es de tipo normal se cultivó en RPMI1640 (FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%) y se cultivó en una placa de 60 mm a 1 x 105 por pocillo durante 24 horas a 37°C. El compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, se utilizaron para el tratamiento a 50 pM cada uno y para el cultivo durante 48 horas. Después de fijar con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente y lavar tres veces con tampón TBS-T durante 10 minutos, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% durante 10 minutos. Después de lavar tres veces durante 10 minutos con tampón TBS-T, se bloquearon con BSA al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo contra r-H2AX se diluyó a una razón de 1: 100 en BSA al 1%, se hizo reaccionar durante la noche a 4°C, se lavó tres veces durante 10 minutos con tampón TBS-T y el anticuerpo secundario (alexa fluor®488 fitc) se diluyó a una razón de 1:100 en BSA al 1%, se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas, a continuación, se lavó con tampón TBS-TA tres veces durante 10 minutos y se tiñó con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) para confirmar el nivel de expresión de r-H2AX bajo un microscopio de fluorescencia.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del daño en el ADN con el nivel de expresión de r-H2AX mediante el método de inmunocitoquímica mediante el tratamiento con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, de una línea celular de cáncer de colon humano HCT116 en la que el gen p53 es de tipo normal, un grupo tratado con el Compuesto A, el nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, mostró una mayor expresión de r-H2AX que el grupo tratado con olaparib, induciendo así daño en el ADN con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa (FIG.
3).
Ejemplo 7: Análisis de daños en el ADN de células con genotipo de p53 y genotipo de LIG4 mutante
Para analizar el grado de daño en el ADN por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, cuando el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante, los autores de la presente invención trataron con un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, Compuesto A, y con el fármaco inhibidor de PARP competitivo, olaparib, la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante, y se confirmó el daño en el ADN mediante el método inmunoquímico como el nivel de expresión de r-H2AX. Las condiciones y métodos del experimento fueron los siguientes: la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante se cultivó en RPMI1640 (FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%) y se cultivó en una placa de 60 mm a 1 x 105 por pocillo durante 24 horas a 37°C. El compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, se utilizaron para el tratamiento a 50 pM cada uno y para el cultivo durante 48 horas. Después de fijar con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente y lavar diez veces con tampón TBS-T durante 5 minutos, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% durante 10 minutos. Después de lavar tres veces durante 10 minutos con tampón TBS-T, se bloquearon con BSA al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo contra r-H2AX se diluyó a una razón de 1:100 en BSA al 1%, se hizo reaccionar durante la noche a 4°C, se lavó tres veces durante 10 minutos con tampón TBS-T y el anticuerpo secundario (alexa fluor®488 fitc) se diluyó a una razón de 1:100 en BSA al 1%, se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas y a continuación, se lavó con tampón TBS-TA tres veces durante 10 minutos y se tiñó con DAPI para confirmar el nivel de expresión de r-H2AX bajo un microscopio de fluorescencia.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del daño en el ADN con el nivel de expresión de r-H2AX mediante el método de inmunocitoquímica al tratar con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante, la expresión de r-H2AX aumentó solo en el grupo tratado con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, lo que indica que se induce daño en el ADN con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa (FIG. 4).
Ejemplo 8: Análisis de daño en el ADN y apoptosis de células con genotipo de p53 de tipo normal y con genotipo de LIG4 de tipo mutante
Para analizar el grado de daño en el ADN y el grado de apoptosis con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, cuando el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante, los autores de la presente invención trataron con un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, Compuesto A, y el fármaco inhibidor de PARP competitivo, olaparib, la línea celular de cáncer de colon humano HCT 116 en la que el gen p53 y el gen LIG4 son de tipo normal y la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante, y a continuación, se confirmó el daño en el ADN con el nivel de expresión de r-H2Ax mediante el método de transferencia Western y se confirmó el grado de apoptosis con el nivel de expresión de caspasa 3 escindida. Las condiciones y el método del experimento fueron los siguientes: la línea celular de cáncer de colon humano HCT 116 en la que el gen p53 y el gen LIG4 son de tipo normal y la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante se cultivaron en RPMI1640 (FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%) y se cultivaron en una placa de 60 mm a 1 x 105 por pocillo durante 24 horas a 37°C. El compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, se utilizaron para el tratamiento a 50 pM cada uno y para el cultivo durante 48 horas. A continuación, las células se obtuvieron utilizando una centrífuga. Cada célula así obtenida se disolvió utilizando un tampón RIPA y las proteínas se extrajeron utilizando una centrífuga de alta velocidad. Se sometieron a electroforesis 30 pg de proteína por célula mediante el método de transferencia Western para separar las proteínas y se transfirieron a la membrana PDVF. Los anticuerpos contra r-H2AX, caspasa 3 truncada y b-actina se diluyeron a 1:2000 cada uno en leche desnatada al 5%. A continuación, las células se hicieron reaccionar a 4°C durante 12 horas y después, se lavaron tres veces durante 15 minutos con tampón TBS-T. Los anticuerpos secundarios se diluyeron cada uno a una razón de 1:2000 en leche desnatada al 5% y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Se lavaron con tampón TBS-T tres veces durante 15 minutos para inducir la luminiscencia de la membrana PDVF utilizando una solución tampón de ECL (Enhanced Chemiluminescence) para desarrollar la expresión de proteína en cada anticuerpo utilizando una película de rayos X.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado de daño en el ADN y apoptosis con los niveles de expresión de r-H2AX y caspasa 3 truncada mediante transferencia de Western al tratar con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco competitivo Inhibidor de PARP, la línea celular de cáncer de colon humano HCT116 en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, el grupo tratado con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, se mostró una mayor expresión de r-H2AX que el grupo tratado con olaparib, y se mostró una mayor cantidad de expresión de la caspasa 3 truncada, induciendo así daño en el ADN por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y apoptosis (FIG. 5).
Ejemplo 9: Análisis de apoptosis en caso de que el genotipo de LIG4 sea de tipo mutante en una línea celular en la que el genotipo de p53 sea de tipo normal
Para analizar el grado de apoptosis con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, cuando el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, los autores de la presente invención trataron con un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, Compuesto A, y el fármaco inhibidor de PARP competitivo, olaparib, mientras se expresaba en exceso LIG4 de tipo mutante en la línea celular de cáncer de colon humano HCT8 en la que el gen p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo normal. A continuación, se midió el número de células mediante un ensayo de tinción con azul de tripano para confirmar el grado de apoptosis. Las condiciones y los métodos del experimento anterior fueron los siguientes: la línea celular de cáncer de colon humano HCT8 en la que el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo normal se cultivó en RPMI1640 (FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%) y se cultivó en una placa de 60 mm a 1 x 105 por pocillo durante 24 horas a 37°C. El ADN del plásmido con G833A o T1704C en el que el genotipo de LIG4 es de tipo mutante se infundió a las células por medio de Lipofectamina 2000 (Invitrogen), y a continuación, se expresó en exceso a 37°C durante 48 horas. A continuación, las células se trataron con 25 pM y 50 pM de Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa y olaparib, un fármaco inhibidor de PARP competitivo. Después de 48 horas de cultivo, se midió el número de células mediante tinción con azul de tripano y se confirmó el grado de apoptosis.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado de apoptosis mediante el ensayo de exclusión de colorante con azul de tripano mediante el tratamiento con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa mientras se expresan G833A o T1704C en los que el genotipo de LIG4 es de tipo mutante en la línea celular de cáncer de colon humano HCT8 en la que el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son de tipo normal, en comparación con un grupo de control (vacío) en el que no se inserta un gen mutante LIG4, en caso de que se expresen en exceso LIG4 mutante G833A o T1704C, se mostró que la apoptosis aumentó con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa (FIG. 6).
Ejemplo 10: Análisis de apoptosis en el caso de células con el genotipo de LIG4 mutante en una línea celular en la que el genotipo de p53 es de tipo mutante
Para analizar el grado de apoptosis por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, cuando el genotipo de p53 es de tipo mutante y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, los autores de la presente invención trataron con un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, Compuesto A, y el fármaco inhibidor de PARP competitivo, olaparib, mientras se expresaba en exceso LIG4 de tipo mutante, en la línea celular de cáncer de colon humano SW620 en la que el gen p53 es de tipo mutante y el genotipo de LIG4 es de tipo normal. A continuación, se midió el número de células mediante un ensayo de tinción con azul de tripano para confirmar el grado de apoptosis. Las condiciones y métodos del experimento anterior fueron los siguientes: la línea celular de cáncer de colon humano SW620 en la que el gen p53 es de tipo mutante y el gen LIG4 es de tipo normal se cultivó en RPMI1640 (FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%) y se cultivó en una placa de 60 mm a 1 x 105 por pocillo durante 24 horas a 37°C. El ADN del plásmido con G833A o T1704C en el que el genotipo de LIG4 es de tipo mutante se infundió a las células por medio de Lipofectamina 2000 (Invitrogen), y a continuación, se expresó en exceso a 37°C durante 48 horas. A continuación, las células se trataron con 25 pM y 50 pM de Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa y olaparib, un fármaco inhibidor de PARP competitivo. Después de 48 horas de cultivo, se midió el número de células mediante tinción con azul de tripano y se confirmó el grado de apoptosis.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado de apoptosis mediante el ensayo de exclusión de colorante con azul de tripano mediante el tratamiento con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa mientras se expresan G833A o T1704C donde que el genotipo de LIG4 es de tipo mutante en la línea celular de cáncer de colon humano SW620 en la que el genotipo de p53 es de tipo mutante y el genotipo de LIG4 es de tipo normal, en comparación con un grupo de control (vacío) en el que no se insertaba un gen de LIG4 mutante, en caso de que se exprese en exceso LIG4 mutante G833A o T1704C, no se mostró ningún cambio en la apoptosis con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa,. Como se ilustra en la FIG. 5, solo en caso de que el genotipo de p53 sea de tipo normal, la apoptosis fue inducida por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa para LIG4 mutante (FIG. 7).
Ejemplo 11: Análisis del daño en el ADN y de la apoptosis en células con el genotipo de LIG4 mutante en la línea celular en la que el genotipo de p53 es de tipo normal
Los autores de la presente invención realizaron un experimento de la misma manera que el Ejemplo 9 para analizar el grado de apoptosis y el daño en el ADN por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, cuando el genotipo de p53 es de tipo mutante y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante. El número de células se midió mediante el método de tinción con azul de tripano y se confirmó el grado de apoptosis. Las células se obtuvieron utilizando una centrífuga. Cada célula así obtenida se disolvió utilizando un tampón RIPA y las proteínas se extrajeron utilizando una centrífuga de alta velocidad. Se sometieron a electroforesis 30 gg de proteína por célula mediante el método de transferencia Western para separar las proteínas y se transfirieron a la membrana PDVF. Los anticuerpos contra r-H2AX, caspasa 3 truncada y b-actina se diluyeron a una razón de 1:2000 en leche desnatada al 5%. A continuación, las células se hicieron reaccionar a 4°C durante 12 horas y después, se lavaron tres veces durante 15 minutos con tampón TBS-T. Los anticuerpos secundarios se diluyeron cada uno a una razón de 1:2000 en leche desnatada al 5% y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Se lavaron con tampón TBS-T tres veces durante 15 minutos para inducir la luminiscencia de la membrana PDVF utilizando solución tampón ECL para desarrollar la expresión de proteínas en cada anticuerpo utilizando una película de rayos X.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado de daño en el ADN y el grado de apoptosis por r-H2AX y el nivel de expresión de la caspasa 3 truncada por transferencia Western y la observación del grado de apoptosis mediante ensayo de exclusión de colorante con azul de tripano al tratar con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, mientras se expresan en exceso G833A o T1704C donde el genotipo de LIG4 es de tipo mutante en la línea celular de cáncer de colon humano HCT8 en la que el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son de tipo normal, el grupo tratado con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, mostró un aumento de apoptosis por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa en caso de expresar en exceso LIG4 mutante G833A o T1704C en comparación con un grupo de control (vacío) en el que no se inserta un gen de LIG4 mutante, en lugar de olaparib, que es un fármaco competitivo (FIG. 8A). La expresión de r-H2AX y la cantidad de expresión de caspasa 3 truncada también aumentaron, lo que indica que solo cuando el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, se indujeron el daño en el ADN y la apoptosis por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa (FIG. 8B)
Ejemplo 12: Análisis de apoptosis mediante la expresión de p53 de tipo mutante y LIG4 de tipo normal en una línea celular en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante
Para analizar el grado de apoptosis por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa según la expresión de p53 de tipo mutante y LIG4 de tipo normal cuando el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el gen p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante se cultivó de la misma manera que en el Ejemplo 7. El ADN plasmídico con p53 de tipo mutante y el ADN plasmídico en el que el genotipo de LIG4 es de tipo normal se infundieron a las células durante 48 horas para la expresión en exceso a 37°C, y a continuación, el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, se utilizaron como tratamiento a 25 gM y 50 gM, respectivamente, durante 48 horas. El número de células se midió mediante un ensayo de tinción con azul de tripano para confirmar el grado de apoptosis.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado de apoptosis mediante el ensayo de exclusión de colorante con azul de tripano mediante el tratamiento con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor competitivo de PARP, mientras se expresa en exceso el gen p53 de tipo mutante en la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, en caso de que el gen p53 de tipo mutante se exprese en exceso en comparación con un grupo de control (vacío) en el que no se inserta el gen p53 de tipo mutante, se observó que la apoptosis se reducía por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa (FIG. 9A). Como resultado de la observación del grado de apoptosis mediante el ensayo de exclusión de colorante con azul de tripano mediante el tratamiento con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, mientras se expresa en exceso el gen LIG4 de tipo normal del línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, en caso de que se expresara en exceso un gen LIG4 de tipo normal en comparación con un grupo de control (vacío) en el que no se inserta un gen LIG4 de tipo normal, se observó que la apoptosis se reducía por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa (FIG. 9B). Cuando p53 es de tipo normal y LIG4 es de tipo mutante, la apoptosis por el Compuesto A es máxima (FIG. 9).
Ejemplo 13: Análisis de CI 50 del Compuesto B que es un inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa según los genotipos de p53 y LIG4
Para analizar la actividad anticancerosa de los Compuestos A y B, que son inhibidores simultáneos de PARP/Tanquirasa, en cuatro tipos de líneas celulares de cáncer de colon humano RKO (p53 WT/LIG4 MT), HCT8 (p53 WT, LIG4 WT), SW620 (p53 MT, LIG4 WT) y KM12C (p53 MT, LIG4 MT) con diferentes genotipos de p53 y LIG4, los autores de la presente invención midieron la viabilidad celular y la CI50 de las líneas celulares para los Compuestos A y B, que son inhibidores simultáneos de PARP/Tanquirasa, a través de ensayo basado en células in vitro. Las condiciones y los métodos del experimento fueron los siguientes: se cultivaron cuatro tipos de líneas celulares de cáncer de colon humano en RPMI1640 (FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%), y cada línea celular se cultivó en una placa de 96 pocillos a 2 x 103 por pocillo a 37°C durante 24 horas, y el nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, Compuesto A, se diluyó en un múltiplo de 2 a un máximo de 100 pM y un mínimo de 0,390625 pM (100 pM, 50 pM, 25 pM, 12,5 pM, 6,25 pM, 3,125 pM, 1,5625 pM, 0,78125 pM y 0,390625 pM). Después del tratamiento, se cultivó a 37°C durante 72 horas. En cuanto al grupo de tratamiento con fármaco y el grupo sin tratamiento, la viabilidad celular de cada línea celular se midió mediante análisis MTS (Promega, CellTiter 96 AQeous One Solution) y la CI50 de cada línea celular se midió utilizando el programa PRISM.
Resultado del experimento
Como resultado del análisis de CI50 utilizando el análisis MTS de cada una de las 4 líneas celulares de cáncer de colon humano tratadas con los Compuestos A y B, que son nuevos inhibidores simultáneos de PARP/Tanquirasa, los valores de CI50 más bajos de los Compuestos A y B se mostraron en RKO en la que p53 es de tipo normal y LIG4 es de tipo mutante entre los 4 tipos de líneas celulares, lo que indica que los Compuestos A y B, que son nuevos inhibidores simultáneos de PARP/Tanquirasa, muestran el efecto anticanceroso más sobresaliente en caso de que p53 sea de tipo normal y LIG4 sea de tipo mutante (Tabla 4).
[Tabla 4]
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Ejemplo 14: Análisis de eficacia del Compuesto A y el Compuesto B según los genotipos de p53 y LIG4
Para analizar el grado de apoptosis por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, según el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4, los autores de la presente invención trataron con los Compuestos A y B, que son nuevos inhibidores simultáneos de PARP/Tanquirasa, las líneas celulares de cáncer de colon humano RKO y LoVo en las que el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante. A continuación, se midió el número de células mediante un ensayo de tinción con azul de tripano para confirmar el grado de apoptosis. Las líneas celulares de cáncer de colon humano RKO y LoVo se cultivaron en las mismas condiciones que en el Ejemplo 5. Los compuestos A y B, que son nuevos inhibidores simultáneos de PARP/Tanquirasa, se utilizaron como tratamiento a 25 pM y 50 pM, respectivamente, durante 48 horas. Después de 48 horas de cultivo, se midió el número de células mediante un ensayo de tinción con azul de tripano para confirmar el grado de apoptosis.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado de apoptosis mediante el tratamiento con cada uno de los Compuestos A y B, que son nuevos inhibidores simultáneos de PARP/Tanquirasa, de las líneas celulares de cáncer de colon humano RKO y LoVo en las que el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante, de las líneas celulares RKO y LoVo en las que el gen p53 es de tipo normal y un gen LIG4 es de tipo mutante, se muestra que el efecto de apoptosis es alto en virtud del Compuesto B en comparación con el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa. En caso de que el genotipo de p53 sea normal y el genotipo de LIG4 sea de tipo mutante, el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, mostró un resultado selectivo en comparación con el Compuesto A.
Ejemplo 15: Análisis de apoptosis por el Compuesto A y el Compuesto B en líneas celulares con genotipo de p53 y genotipo de LIG4 diferentes
Para analizar el grado de apoptosis por los Compuestos A y B, que son nuevos inhibidores simultáneos de PARP/Tanquirasa, en una línea celular RKO en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, una línea celular SW620 en la que el genotipo de p53 es de tipo mutante y el genotipo de LIG4 es de tipo normal, una línea celular HCT8 en la que el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son normales, y una línea celular KM12C en la que el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son mutantes, las líneas celulares de cáncer de colon humano de RKO, HCT, SW620 y KM12C con diferente genotipo de p53 y genotipo de LIG4 se cultivaron en RPMI1640 (FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%) y se cultivaron en una placa de 60 mm a 1 x 105 por pocillo durante 24 horas a 37°C. Los compuestos A y B, que son nuevos inhibidores simultáneos de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, y NVP-TNKS656, que es un inhibidor de Tanquirasa, se utilizaron como tratamiento a 25 pM y 50 pM cada uno. Después de 48 horas de cultivo, se midió el número de células mediante un ensayo de tinción con azul de tripano para confirmar el grado de apoptosis.
Resultado del experimento
Como resultado del análisis del grado de apoptosis mediante el ensayo de exclusión de colorante con azul de tripano mediante el tratamiento con los Compuestos A y B, que son nuevos inhibidores simultáneos de PARP/Tanquirasa, olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, y NVP-TNKS656, que es un inhibidor de Tanquirasa de las líneas celulares de cáncer de colon humano RKO, SW620, HCT8 y KM12C con diferente genotipo de p53 y genotipo de LIG4, fue posible observar la apoptosis por los Compuestos A y B, que son nuevos inhibidores simultáneos de PARP/Tanquirasa, en la línea celular RKO en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante. Asimismo, se observó que no había cambios en la apoptosis por olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, y NVP-TNKS656, que es un inhibidor de tanquirasa (FIG. 11A). No se produjo apoptosis por los compuestos A y B, olaparib, que es un inhibidor de PARP, y NVP-TNKS656, que es un inhibidor de tanquirasa en la línea celular SW620 en la que p53 es de tipo mutante y LlG4 es de tipo normal, la línea celular HCT8 en el que los genotipos de p53 y LIG4 son de tipo normal, y la línea celular KM12C en la que los genotipos de p53 y LIG4 son de tipo mutante, lo que indica que los Compuestos A y B mostraron apoptosis solo en caso en que p53 sea de tipo normal y LIG4 sea un mutante tipo (FIGS. 11A a 11D).
Ejemplo 16: Análisis de apoptosis por el Compuesto B según la expresión en exceso de p53 de tipo mutante y LIG4 de tipo normal en la línea celular RKO en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante
Al igual que en el Ejemplo 12, para analizar el grado de apoptosis por el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, según la expresión de p53 de tipo mutante y LIG4 de tipo normal, cuando el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, los autores de la presente invención trataron con un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, Compuesto B, y el fármaco inhibidor de PARP competitivo, olaparib, mientras se expresaba en exceso p53 de tipo mutante y LIG4 de tipo normal en la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el gen p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante. A continuación, se midió el número de células mediante un ensayo de tinción con azul de tripano para confirmar el grado de apoptosis. Las condiciones y los métodos del experimento anterior fueron los siguientes: se cultivó una línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante en las mismas condiciones que en el Ejemplo 12. El ADN plasmídico con p53 de tipo mutante y el ADN plasmídico en el que el genotipo de LIG4 es de tipo normal se infundieron a las células por medio de Lipofectamina 2000 (Invitrogen) y a continuación, se expresaron en exceso a 37°C durante 48 horas. A continuación, el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, se utilizaron como tratamiento a 25 pM y 50 pM cada uno. Después de 48 horas de cultivo, se midió el número de células mediante un ensayo de tinción con azul de tripano y se confirmó el grado de apoptosis.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado de apoptosis mediante el ensayo de exclusión de colorante con azul de tripano mediante el tratamiento con el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor competitivo de PARP, mientras se expresa en exceso el gen p53 de tipo mutante en la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, en caso de que el gen p53 de tipo mutante se exprese en exceso en comparación con un grupo de control (vacío) en el que no se inserta el gen p53 de tipo mutante, se observó que la apoptosis se reducía mediante el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa (FlG. 12A). Como resultado de la observación del grado de apoptosis mediante el ensayo de exclusión de colorante con azul de tripano mediante el tratamiento con el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, mientras se expresa en exceso un gen LIG4 de tipo normal en la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, en caso de que se exprese en exceso un gen LIG4 de tipo normal en comparación con un grupo de control (vacío) en el que no se inserta un gen LIG4 de tipo normal, se observó que la apoptosis se reducía por el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa. Cuando p53 es de tipo normal y LIG4 es de tipo mutante, la apoptosis por el Compuesto B es máxima (FIG. 12A y 12B).
Ejemplo 17: Análisis de apoptosis por el Compuesto B según la expresión en exceso de p53 de tipo mutante y LIG4 de tipo normal en la línea celular LoVo en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante
Al igual que en el Ejemplo 12, para analizar el grado de apoptosis por el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, según la expresión de p53 de tipo mutante y LIG4 de tipo normal cuando el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, los autores de la presente invención trataron con un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, Compuesto B, y el fármaco inhibidor de PARP competitivo, olaparib, mientras se expresaba en exceso p53 de tipo mutante y LIG4 de tipo normal en la línea celular de cáncer de colon humano LoVo en la que el gen p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante. A continuación, se midió el número de células mediante un ensayo de tinción con azul de tripano para confirmar el grado de apoptosis. Las condiciones y métodos del experimento anterior fueron los mismos que los métodos de cultivo de células RKO y métodos de transfección del Ejemplo 12. El Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, se utilizaron como tratamiento a 25 pM y 50 pM cada uno. Después de 48 horas de cultivo, se midió el número de células mediante un ensayo de tinción con azul de tripano y se confirmó el grado de apoptosis.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado de apoptosis mediante el ensayo de exclusión de colorante con azul de tripano mediante el tratamiento con el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor competitivo de PARP, mientras se expresa en exceso el gen p53 de tipo mutante en la línea celular de cáncer de colon humano LoVo en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, en caso de que el gen p53 de tipo mutante se exprese en exceso en comparación con un grupo de control (vacío) en el que no se inserta el gen p53 de tipo mutante, se observó que la apoptosis se reducía mediante el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa (FlG. 13A). Como resultado de la observación del grado de apoptosis mediante el ensayo de exclusión de colorante con azul de tripano mediante el tratamiento con el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, mientras se expresa en exceso un gen de tipo normal LIG4 en la línea celular de cáncer de colon humano LoVo en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, en caso de que se exprese en exceso un gen LIG4 de tipo normal en comparación con un grupo de control (vacío) en el que no se inserta un gen de tipo normal LIG4, se observó que la apoptosis se reducía mediante el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa (FlG. 13B). Cuando p53 es de tipo normal y LIG4 es de tipo mutante, la apoptosis por el Compuesto B es máxima (FlG. 13A y 13B).
Ejemplo 18: Análisis de daño en el ADN y apoptosis por el Compuesto B según la expresión en exceso de p53 de tipo mutante de y LIG4 de tipo normal en la línea celular LoVo en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante
Para analizar el grado de daño en el ADN y el grado de apoptosis por el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, según la expresión p53 de tipo mutante y LIG4 de tipo normal cuando el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, los autores de la presente invención cultivaron y trataron la línea celular de cáncer de colon humano LoVo en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante en las mismas condiciones que en el Ejemplo 17. El daño en el ADN se confirmó mediante el método de transferencia Western a nivel de expresión de r-H2AX, y el grado de apoptosis se confirmó mediante el mismo método que en el Ejemplo 11 a nivel de expresión de la caspasa 3 escindida.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado de daño en el ADN y el grado de apoptosis por transferencia Western por medio de la cantidad de expresión de r-H2AX y caspasa 3 escindida al tratar con el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, mientras que expresa en exceso el gen p53 de tipo mutante en la línea celular de cáncer de colon humano LoVo en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, en caso de que el gen p53 de tipo mutante fuera expresado en exceso en comparación con un grupo de control (vacío) en el que no se inserta el gen p53 de tipo mutante, se observó que la expresión de r-H2AX y la cantidad de expresión de caspasa 3 escindida se reducían mediante el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/tanquirasa (FlG. 14A). Como resultado de la observación del grado de daño en el ADN y el grado de apoptosis por transferencia Western por medio de la cantidad de expresión de r-H2AX y caspasa 3 escindida al tratar con el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, mientras se expresa en exceso el gen p53 de tipo mutante en la línea celular de cáncer de colon humano LoVo en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, en caso de que un gen LIG4 de tipo normal fuera expresado en exceso en comparación con un grupo de control (vacío) en el que no se inserta un gen LIG4 de tipo normal, se observó que la expresión de r-H2AX y la cantidad de expresión de caspasa 3 escindida se reducían mediante el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/tanquirasa (FlG. 14B). Sólo cuando p53 es de tipo normal y LIG4 es de tipo mutante, se indujeron el daño en el ADN y la apoptosis por el Compuesto B (FlG. 14).
Ejemplo 19: Efecto de inhibición tumoral por el compuesto A y olaparib en un modelo animal de xenotrasplante utilizando una línea celular RKO en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante
Para analizar el efecto de inhibición tumoral sobre un modelo animal in vivo para el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y un modelo animal in vivo para olaparib, cuando el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, los autores de la presente invención trasplantaron la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante a un ratón carente de sistema inmunitario de 6 semanas de edad (BALB/c-nude, adquirido del Central Experimental Animal) y se les administró el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo. A continuación, se midió el tamaño del tumor para confirmar el grado del efecto de inhibición del tumor. Las condiciones y métodos del experimento fueron los siguientes: la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante se cultivó en RPMI1640 (FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%). Cuando el tamaño del tumor alcanzó los 100 mm3 después de ser trasplantado a un ratón carente de sistema inmunitario a 1 x 107, el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, se administraron por vía oral a 25 mpk y 50 mpk diariamente durante un total de 27 días. El tamaño del tumor se midió cada tres días. Después de completar la administración del fármaco, los tumores se recolectaron y pesaron.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado del efecto de inhibición tumoral mediante la administración del Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo a la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, con el efecto de inhibición tumoral del Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, el tamaño del tumor se redujo en comparación con el grupo al que se administró olaparib, que es un competitivo fármaco inhibidor de PARP, y el peso del tumor se redujo, lo que indica que el efecto de inhibición tumoral para el Compuesto A se produjo en el caso en el que p53 es de tipo normal y LIG4 es de tipo mutante (FIG. 15A y 15B).
Ejemplo 20: Análisis del efecto de inhibición tumoral por el compuesto A y olaparib en un modelo animal de xenotrasplante utilizando una línea celular SW620 en la que el genotipo de p53 es de tipo mutante y el genotipo de LIG4 es de tipo normal
Para analizar el efecto de inhibición tumoral por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, en un modelo animal in vivo cuando el genotipo de p53 es de tipo mutante y el genotipo de LIG4 es de tipo normal, los autores de la presente invención trasplantaron la línea celular de cáncer de colon humano SW620 en la que el genotipo de p53 es de tipo mutante y el genotipo de LIG4 es de tipo normal a un ratón carente de sistema inmunitario de 6 semanas de edad (BALB/c-nude, adquirido del Central Experimental Animal) y se le administró el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo. A continuación, se midió el tamaño del tumor para confirmar el grado del efecto de inhibición del tumor. Las condiciones y métodos del experimento fueron los siguientes: la línea celular de cáncer de colon humano SW620 en la que el gen p53 es de tipo mutante y el gen LIG4 es de tipo normal se cultivó en RPMI1640 (FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%). Cuando el tamaño del tumor alcanzó los 100 mm3 después de ser trasplantado a un ratón carente de sistema inmunitario a 1 x 107, el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, se administraron por vía oral a 25 mpk y 50 mpk diariamente durante un total de 27 días. El tamaño del tumor se midió cada tres días. Después de completar la administración del fármaco, los tumores se recolectaron y pesaron.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado del efecto de inhibición tumoral mediante la administración del Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo a la línea celular de cáncer de colon humano SW620 en la que el genotipo de p53 es de tipo mutante y el genotipo de LIG4 es de tipo normal, no hubo cambios ni en el tamaño ni en el peso del tumor por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, lo que indica que no se produjo ningún efecto de inhibición tumoral para el Compuesto A y olaparib en el caso en el que p53 es de tipo normal y LlG4 es de tipo mutante (FIG. 16A y 16B).
Ejemplo 21: Análisis del efecto de inhibición tumoral por el Compuesto A en un modelo animal de xenotrasplante utilizando una línea celular KM12C en la que el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son de tipo mutante
Para analizar el efecto de inhibición tumoral por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, en un modelo animal in vivo cuando el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son de tipo mutante, los autores de la presente invención trasplantaron la línea celular de cáncer de colon humano KM12C en la que el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son de tipo mutante a un ratón carente de sistema inmunitario de 6 semanas de edad (BALB/c-nude, adquirido del Central Experimental Animal) y se le administró el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo. A continuación, se midió el tamaño del tumor para confirmar el grado del efecto de inhibición del tumor. Las condiciones y métodos del experimento fueron los siguientes: la línea celular de cáncer de colon humano KM12C en la que el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son de tipo mutante se cultivó en RPMI1640 (FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%). Cuando el tamaño del tumor alcanzó los 100 mm3 después de ser trasplantado a un ratón carente de sistema inmunitario por 1 x 107, el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, se administraron por vía oral a 25 mpk y 50 mpk diariamente durante un total de 18 días. El tamaño del tumor se midió cada tres días. Después de completar la administración del fármaco, los tumores se recolectaron y pesaron.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado de un efecto de inhibición tumoral mediante la administración del Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo a la línea celular de cáncer de colon humano KM12C en la que el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son de tipo mutante, no hubo cambios ni en el tamaño ni en el peso del tumor por el Compuesto A, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, lo que indica que no se produjo efecto de inhibición tumoral para el Compuesto A y olaparib en el caso en el que tanto p53 como LIG4 eran de tipo mutante (FIG. 17A y 17B).
Ejemplo 22: Análisis del efecto de inhibición tumoral por el compuesto B y olaparib en un modelo animal de xenotrasplante utilizando una línea celular RKO en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante
Para analizar el efecto de inhibición tumoral sobre un modelo animal in vivo por el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, cuando el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, los autores de la presente invención trasplantaron la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante a un ratón carente de sistema inmunitario de 6 semanas de edad (BALB/c-nude, adquirido del Central Experimental Animal) y se le administró el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo. A continuación, se midió el tamaño del tumor para confirmar el grado del efecto de inhibición del tumor. Las condiciones y métodos del experimento fueron los siguientes: la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el gen p53 es de tipo normal y el gen LIG4 es de tipo mutante se cultivó en RPMI1640 (FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%). Cuando el tamaño del tumor alcanzó los 100 mm3 después de ser trasplantado a un ratón carente de sistema inmunitario a 1 x 107, el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, se administraron por vía oral a 25 mpk y 50 mpk diariamente durante un total de 27 días. El tamaño del tumor se midió cada tres días. Después de completar la administración del fármaco, los tumores se recolectaron y pesaron.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado del efecto de inhibición tumoral mediante la administración del Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo a la línea celular de cáncer de colon humano RKO en la que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, con el efecto de inhibición tumoral por el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, el tamaño del tumor se redujo en comparación con el grupo al que se administró olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo, y el peso del tumor se redujo, lo que indica que el efecto de inhibición tumoral para el Compuesto B se produjo en el caso en el que p53 es de tipo normal y LIG4 es de tipo mutante (FIG. 18A y 18B).
Ejemplo 23: Análisis del efecto de inhibición tumoral por el Compuesto B en un modelo animal de xenotrasplante utilizando una línea celular KM12C en la que el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son de tipo mutante
Para analizar el efecto de inhibición tumoral por el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, en un modelo animal in vivo cuando el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son de tipo mutante, los autores de la presente invención trasplantaron la línea celular de cáncer de colon humano KM12C en la que el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son de tipo mutante en un ratón carente de sistema inmunitario de 6 semanas de edad (BALB/c-nude adquirido del Central Experimental Animal) y se le administró el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa. A continuación, se midió el tamaño del tumor para confirmar el grado del efecto de inhibición del tumor. Las condiciones y métodos del experimento fueron los siguientes: la línea celular de cáncer de colon humano KM12C en la que el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son de tipo mutante se cultivó en RPMI1640 (FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%). Cuando el tamaño del tumor alcanzó los 100 mm3 después de ser trasplantado a un ratón carente de sistema inmunitario a 1 x 107, el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, se administró por vía oral a 25 mpk y 50 mpk diariamente durante un total de 15 días. El tamaño del tumor se midió cada tres días. Después de completar la administración del fármaco, los tumores se recolectaron y pesaron.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado de un efecto de inhibición tumoral mediante la administración del Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, a la línea celular de cáncer de colon humano KM12C en la que el genotipo de p53 y el genotipo de LIG4 son de tipo mutante, no hubo cambios ni en el tamaño ni en el peso del tumor por el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, lo que indica que no se produjo ningún efecto de inhibición tumoral para el Compuesto B en el caso en el que tanto p53 como LIG4 son de tipo mutante (FIG. 19A y 19B).
Ejemplo 24: Análisis del genotipo de LIG4 en células obtenidas de pacientes con cáncer de colon
Para confirmar el genotipo de LIG4 en células obtenidas de pacientes con cáncer de colon, los autores de la presente invención analizaron la mutación/deficiencia del genotipo de LIG4 en 36 líneas celulares obtenidas de pacientes con cáncer de colon mediante RT-PCR y secuenciación. Las condiciones y métodos del experimento fueron los siguientes: un total de 36 líneas celulares obtenidas a partir de pacientes con cáncer de colon se sometió a extracción del ARN total con el método de extracción de ARN T rizol utilizando un homogeneizador, y 500 ng de ARN total se resintetizaron a ADNc y se llevó a cabo la PCR utilizando el cebador para LIG4 (SEQ ID NO: 12; cebador para LIG4 cebador directo para el Exón1-1 5'-TTGCTTTACTAGTTAAACGAGAAGATTCA-3', SEQ ID NO: 13; cebador para LIG4 cebador inverso para el Exón1-1 5'-TTCGTTCTAAAGTTGAACACAAAATCTG-3', SEQ ID NO: 8; cebador para LIG4 cebador directo para el Exón2-1 5'-GCTAGCTGCTATTGCAGATATTGAGC-3', SeQ ID NO: 9; cebador para LIG4 cebador inverso para el Exón2-1 5'-AGAACCTTCAGTAGGAGAAGCACCAA-3', SEQ ID NO: 10; cebador para LIG4 cebador directo el Exón2-2 5'-CCTGGTGAGAAGCCATCTGT-3', SEQ ID NO: 11; cebador para LIG4 cebador inverso para el Exón2-2 5'-GCCTTCCCCCTAAGTTGTTC-3'). Después de la electroforesis en gel de agarosa al 1%, el análisis de mutantes se confirmó mediante secuenciación de Sanger del producto de PCR en el que se confirmó la expresión de LIG4 mediante tinción con Et-Br.
Resultado del experimento
Como resultado de analizar si existe alguna mutación en los sitios C8, C27, G833 y T1704 de LIG4 en 36 líneas celulares obtenidas de pacientes con cáncer de colon, se analizaron mutaciones en LIG4 en 14 líneas celulares obtenidas de pacientes con cáncer de colon (Tabla 5).
[Tabla 5]
Figure imgf000018_0001
Ejemplo 25: Análisis de genotipos de LIG4 en tejidos de pacientes con cáncer de colon
Para confirmar el genotipo de LIG4 en los tejidos de pacientes con cáncer de colon, los autores de la presente invención analizaron la mutación/deficiencia del genotipo de LIG4 en 39 tejidos obtenidos a partir de pacientes con cáncer de colon mediante RT-PCR y secuenciación. Las condiciones y métodos del experimento fueron los siguientes: un total de 39 tejidos obtenidos a partir de pacientes con cáncer de colon se sometió a extracción del ARN total con el método de extracción de ARN Trizol utilizando un homogeneizador, y se resintetizaron 500 ng de ARN total a ADNc y se llevó a cabo la PCR utilizando el cebador para LIG4 (SEQ ID NO: 12; cebador para LIG4 cebador directo para el Exón1-1 5'-TTGCTTTACTAGTTAAACGAGAAGATTCA-3', SEQ ID NO: 13; cebador para LIG4 cebador inverso para el Exón1-1 5'-TTCGTTCTAAAGTTGAACACAAAATCTG-3', SEQ ID NO: 8; cebador para LIG4 cebador directo para el Exón2-1 5'-GCTAGCTGCTATTGCAGATATTGAGC-3', SeQ ID NO: 9; cebador para LIG4 cebador inverso para Exón2-1 5'-AGAACCTTCAGTAGGAGAAGCACCAA-3', SEQ ID NO: 10; cebador para LIG4 cebador directo para el Exón2-2 5'-CCTGGTGAGAAGCCATCTGT-3', SEQ ID NO.: 11; cebador para LIg4 cebador inverso para el Exón2-2 5'-GCCTTCCCCCTAAGTTGTTC-3'). Después de la electroforesis en gel de agarosa al 1%, el análisis de mutantes se confirmó mediante secuenciación de Sanger del producto de PCR en el que se confirmó la expresión de LIG4 mediante tinción con Et-Br.
Resultado del experimento
Como resultado de analizar si existe alguna mutación en los sitios C8, C27, G833 y T1704 de LIG4 en 39 tejidos de pacientes con cáncer de colon, se analizaron las mutaciones en LIG4 en 9 tejidos de pacientes con cáncer de colon (Tabla 6).
[Tabla 6]
Figure imgf000019_0001
m u i bcimt: ai i : ' t a i i m ;«¡i« ¡ t » itninrii tiitmi w t : m t mr.vr
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Ejemplo 26: Análisis de la eficacia del fármaco en células obtenidas de pacientes con cáncer de colon en las que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo normal o mutante
Para analizar el grado de eficacia farmacológica del Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, se obtuvieron células de pacientes con cáncer de colon 11-CT-79558D (p53 WT/LIG4 MT), 11-CT-80464B (p53 WT/LIG4 MT) y 11CT-94575 (p53 WT/LIG4 WT), 13CT-78649B (p53 WT/LIG4 WT) en las que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo normal o mutante, cuatro diferentes tipos de células derivadas de pacientes con cáncer de colon humano REBM (Medio Basal de Crecimiento Renal; FBS al 5%, penicilina/estreptomicina al 1%) en las que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo normal o muíante, y se cultivaron en una Placa de 60 mm a 1 x 105 células/pocillo durante 24 horas a 37°C. Las células se utilizaron como tratamiento a 25 pM y 50 pM de Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un fármaco inhibidor de PARP competitivo. Después de 48 horas de cultivo, se analizó el cambio de forma de las células para confirmar la eficacia del fármaco.
Resultado del experimento
Como resultado de la observación del grado de cambio en la forma celular al tratar las células obtenidas de pacientes con cáncer de colon humano en las que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es diferente con el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, y olaparib, que es un inhibidor de PARP, utilizando un microscopio, se observó que la forma celular para el Compuesto B, que es un nuevo inhibidor simultáneo de PARP/Tanquirasa, murió solo en las células obtenidas de pacientes con cáncer de colon 11-CT-79558D (p53 WT/LIG4 MT) y 11-CT-80464B (p53 WT/LIG4 MT) en las que el genotipo de p53 es de tipo normal y el genotipo de LIG4 es de tipo mutante, y que no hubo cambios en la forma celular con olaparib, que es un inhibidor de PARP, exhibiendo así una reacción de fármaco para la apoptosis por el Compuesto B solo en el caso en el que p53 es de tipo normal y LIG4 es de tipo mutante (Figura 20).

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar la susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP (Poli ADP Ribosa Polimerasa) y Tanquirasa, comprendiendo el método las siguientes etapas:
(a) aislar moléculas de ácido nucleico de células de cáncer colorrectal que han sido tomadas de un paciente con cáncer colorrectal
(b) identificar genotipos de un gen p53 y un gen LIG4 (ADN ligasa 4) en la molécula de ácido nucleico de la etapa (a),
en donde, cuando el genotipo del gen p53 es de tipo normal y el genotipo del gen LIG4 es de tipo mutante, se determina que el paciente tiene susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP y Tanquirasa,
en donde, cuando el gen p53 comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, el genotipo es de tipo normal y
en donde, cuando el gen LIG4 consiste en una o más variantes de secuencia seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de citosina por timina en la posición 8, una sustitución de citosina por timina en la posición 26, una sustitución de guanina por adenina en la posición 833 y una sustitución de timina por citosina en la posición 1704 de SEQ ID NO: 2, el genotipo es de tipo mutante.
2. El método según la reivindicación 1, en donde la etapa (b) se realiza mediante secuenciación de ADN, Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP), Detección Polimórfica Amplificada Aleatoria (RAPD), Detección de Polimorfismo de Longitud de Fragmento Amplificado (AFLPD), sonda ASO (Oligonucleótido Específico de Alelo) o micromatriz de ADN.
3. El uso de un kit para determinar la susceptibilidad a un inhibidor simultáneo contra PARP (Poli ADP Ribosa Polimerasa) y Tanquirasa, comprendiendo el kit: (a) un cebador o una sonda que se unen específicamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un gen p53; y (b) un cebador o una sonda que se unen específicamente a una secuencia de nucleótidos que codifica LIG4 (ADN ligasa 4).
4. El uso según la reivindicación 3, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el gen p53 está representada por SEQ ID NO: 1.
5. El uso según la reivindicación 3, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el gen LIG4 está representada por SEQ ID NO: 2.
6. 8-[(Dimetilamino)metil]-10-etoxi-1,2,3,4-tetrahidrobenzo[h][1,6]naftiridin-5(6H)-ona o 6-{4-[(5-oxo-1,2,3,4,5,6-hexahidrobenzo[h][1,6]naftiridin-8-il)metil]piperazin-1-il}nicotinonitrilo para su uso en el tratamiento de un cáncer colorrectal en un sujeto que tiene el gen p53 de tipo normal y el gen LIG4 de tipo mutante.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CA3219248A1 (en) * 2021-05-18 2022-11-24 Hyun Ju Cha Parp inhibitor-resistant cancer therapeutic agent
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2559652C (en) * 2004-03-15 2017-02-14 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Methods of using sns-595 in treating cancer
CA2639416C (en) * 2007-09-11 2019-12-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Diagnostic test for susceptibility to b-raf kinase inhibitors
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