CN116637122B - 环状RNA circ-DCUN1D4在肝癌诊断和治疗中的新用途 - Google Patents

环状RNA circ-DCUN1D4在肝癌诊断和治疗中的新用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了环状RNA circ‑DCUN1D4在肝癌诊断和治疗中的新用途，本发明首次发现环状RNA circ‑DCUN1D4是一个全新的肝癌诊断和治疗靶点，所述环状RNA circ‑DCUN1D4能够发挥有效杀伤肝癌细胞的体内治疗效果，可用于肿瘤免疫治疗药物的制备中。本发明为肝癌的诊断和治疗提供了新的靶点，在肝癌的临床治疗方面具有广阔的应用前景。

Description

环状RNA circ-DCUN1D4在肝癌诊断和治疗中的新用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及环状RNA circ-DCUN1D4在肝癌诊断和治疗中的新用途。
背景技术
肝癌（原发性肝癌）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其由肝细胞癌、肝内胆管细胞癌及混合型肝癌等组成，其中，肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌的主要形式，约占原发性肝癌的90%。肝癌的发生率和死亡率呈逐年上升的趋势，其主要危险因素除了慢性乙型肝炎病毒（HBV）及丙型肝炎病毒（HCV）感染之外，进食黄曲霉毒素污染的食品、大量饮酒、肥胖、吸烟和2型糖尿病等也会导致肝癌的发生，并且其主要危险因素因地区不同而产生差异。虽然肝癌发生发展的各种危险因素已被揭示，精准医疗（Precision medicine，PM）和多学科团队（Multidisciplinary team，MDT）的概念也被应用于肝癌的治疗中，但是近年来肝癌患者的长期生存率无明显提高，肝癌患者的预后差、死亡率高的问题依旧严峻。肝癌术后复发和转移是预后不良的主要原因，其五年生存率低于20%。因此，寻找肝癌治疗的新型靶点、探索肝癌的新型疗法对于肝癌的早期诊断、早期治疗和预后评估具有重要意义。
环状RNA（circularRNA，circRNA）是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴，且以共价键形成的环形结构的非编码RNA。由于环状RNA呈封闭式的环状结构，不易被RNase R酶消化，相较于线性RNA能够更稳定地存在于生物体中。尽管环状RNA被陆续挖掘和报道，但是其在生理和病理方面的功能依旧不甚明确，目前已有的研究结论表明环状RNA的作用主要有以下几个方面：1、环状RNA可通过竞争性吸附miRNA，即作为miRNA海绵发挥作用；2、环状RNA可与RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBP）相互作用以调控表达；3、环状RNA可作为转录调节因子发挥作用；4、部分环状RNA可翻译成蛋白质或者是多肽从而影响功能。越来越多的研究证明环状RNA在许多类型的癌症中存在异常表达且发挥着重要作用，因此，环状RNA有望成为癌症治疗的潜在靶点，为临床治疗癌症、提高患者生存率提供了新的可能。
迄今为止，尚未见环状RNA circ-DCUN1D4在诊断和/或治疗肝癌中的应用的相关研究或报道。
发明内容
为了克服现有技术中存在的上述不足，本发明的目的在于提供环状RNA circ-DCUN1D4在肝癌诊断和治疗中的新用途。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了环状RNA circ-DCUN1D4和/或环状RNA circ-DCUN1D4表达促进剂在制备用于治疗和/或预防肝癌的药物中的应用；
进一步，所述环状RNA circ-DCUN1D4的CircBase ID为hsa_circ_0007928。
进一步，所述环状RNA circ-DCUN1D4对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示；
所述环状RNA circ-DCUN1D4对应的RNA序列如SEQ ID NO:2所示；
所述环状RNA circ-DCUN1D4为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列转录后经剪接形成的首尾相连的环状结构；
所述环状RNA circ-DCUN1D4为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列首尾连接而成的环状结构。
进一步，所述药物包括用于治疗和/或预防肝癌的分子靶向药物、生物制剂、药物组合物。
进一步，所述环状RNA circ-DCUN1D4表达促进剂包括能够促进环状RNA circ-DCUN1D4表达的天然纯化物质、经修饰的天然纯化物质、半合成物质、化学合成物质和/或其任意组合。
进一步，所述环状RNA circ-DCUN1D4表达促进剂包括环状RNA circ-DCUN1D4、含有环状RNA circ-DCUN1D4的重组载体、含有环状RNA circ-DCUN1D4的纳米颗粒、含有环状RNA circ-DCUN1D4的蛋白微球、含有环状RNA circ-DCUN1D4的脂质体、含有环状RNA circ-DCUN1D4的PEG修饰蛋白、含有环状RNA circ-DCUN1D4的细胞外囊泡和/或其任意组合；
优选地，所述载体包括DNA质粒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、结合DNA质粒的脂质体、结合DNA质粒的分子耦联体和/或结合DNA质粒的多聚物。
在一些实施方案中，所述环状RNA circ-DCUN1D4表达促进剂是指能够促进环状RNA circ-DCUN1D4表达的物质，包括但不限于：能够促进环状RNA circ-DCUN1D4表达的天然纯化物质、经修饰的天然纯化物质、半合成物质、化学合成物质和/或其任意组合，任何能够促进环状RNA circ-DCUN1D4表达的物质均在本发明的保护范围内。
在一些实施方案中，所述载体并无特别限制，只要能够用于递送本发明所述的环状RNA circ-DCUN1D4以过表达circ-DCUN1D4的载体均在本发明的保护范围内，在本发明的具体实施方案中，所述载体为pCDNA3.1载体。
本发明的第二方面提供了一种用于治疗和/或预防肝癌的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包含本发明第一方面中所述的环状RNA circ-DCUN1D4和/或环状RNA circ-DCUN1D4表达促进剂；
优选地，所述药物组合物还可包含药学上可接受的载体和/或辅料；
优选地，所述药物组合物还可包含用于治疗和/或预防肝癌的其它药物；
更优选地，所述其它药物包括抗病毒药物、化疗药物、靶向治疗药物、免疫治疗药物、中成药物和/或其任意组合；
最优选地，所述抗病毒药物包括恩替卡韦、拉米夫定、索非布韦、达诺瑞韦、替诺福韦酯、阿德福韦酯、奥司他韦、替比夫定、利托那韦；
最优选地，所述化疗药物包括氟尿嘧啶、环磷酰胺、阿霉素、顺铂、卡铂、丝裂霉素、柔红霉素、表阿霉素、吉西他滨、伊利替康、奥沙利铂、米托蒽醌；
最优选地，所述靶向治疗药物包括索拉非尼、瑞戈非尼、仑伐替尼、多纳非尼、瑞戈非尼、阿帕替尼、卡博替尼；
最优选地，所述免疫治疗药物包括阿替利珠单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗、替雷利珠单抗、贝伐珠单抗、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗；
最优选地，所述中成药物包括槐耳颗粒、肝复乐、华蟾素胶囊、补中益气丸。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或辅料的具体示例性例子包括但不限于：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
在一些实施方案中，适合的药学上可接受的载体和/或辅料在Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或活性物质的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。如此配制的药物组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式将药物进行给药，使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明所述的药物组合物施用于人。
在一些实施方案中，本发明所述的药物组合物的适合给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗和/或预防有效的给药剂量。
本发明的第三方面提供了如下任一方面的应用：
(1) 检测环状RNA circ-DCUN1D4表达水平的试剂在制备肝癌诊断产品或肝癌诊断试剂中的应用；
所述环状RNA circ-DCUN1D4为本发明第一方面中所述的环状RNA circ-DCUN1D4；
(2) 环状RNA circ-DCUN1D4在筛选用于治疗和/或预防肝癌的候选药物中的应用；
所述环状RNA circ-DCUN1D4为本发明第一方面中所述的环状RNA circ-DCUN1D4。
进一步，上述应用(1)中所述的试剂包括特异性扩增环状RNA circ-DCUN1D4的引物和/或特异性识别环状RNA circ-DCUN1D4的探针；
优选地，所述特异性扩增环状RNA circ-DCUN1D4的引物的序列如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4所示。
本发明的第四方面提供了一种诊断肝癌的诊断产品或诊断试剂。
进一步，所述诊断产品或诊断试剂包含本发明第三方面中所述的试剂；
优选地，所述诊断产品还包含通过测序技术、核酸杂交技术和/或核酸扩增技术检测环状RNA circ-DCUN1D4表达水平的试剂；
优选地，所述诊断产品包括试剂盒、芯片和/或试纸条；
优选地，所述诊断产品通过检测环状RNA circ-DCUN1D4在待测样本中的表达水平诊断肝癌。
在一些实施方案中，所述试剂盒为RT-PCR试剂盒，其可进一步包含反转录聚合酶链式反应所必需的元件。RT-PCR试剂盒包含一对特异性针对环状RNA circ-DCUN1D4的引物。所述引物是具有特异性针对所述环状RNA的核酸序列的核苷酸，其长度可为约7至50bp，更特别为约10-39 bp。
在一些实施方案中，所述RT-PCR试剂盒还可包含测试管或合适的器皿、反应缓冲液（不同pH值和镁浓度）、脱氧核苷酸（dNTP）、酶（例如Taq聚合酶和反转录酶）、脱氧核糖核酸酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、DEPC-水和无菌水。
在一些实施方案中，所述试剂盒为DNA芯片试剂盒，其可进一步包含用于操作DNA芯片所必需的元件。所述DNA芯片试剂盒可包含与环状RNA circ-DCUN1D4对应的cDNA或相当于其片段的寡核苷酸结合的底物、及用于构建荧光标记的探针的试剂、药剂和酶。此外，所述底物可包含对照cDNA或相当于其片段的寡核苷酸。
优选地，所述诊断试剂还包含通过测序技术、核酸杂交技术和/或核酸扩增技术检测环状RNA circ-DCUN1D4表达水平的试剂；
优选地，所述诊断试剂通过检测环状RNA circ-DCUN1D4在待测样本中的表达水平诊断肝癌。
本发明的第五方面提供了如下任一种方法：
(1) 一种筛选用于治疗和/或预防肝癌的候选药物的方法，所述方法包括如下步骤：
①用待测物质处理表达或含有本发明第三方面中所述的环状RNA circ-DCUN1D4的体系；
②检测所述体系中环状RNA circ-DCUN1D4的表达；
③选择可促进环状RNA circ-DCUN1D4表达的测试物质为候选药物；
优选地，所述体系包括细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系和/或动物体系。
在一些实施方案中，所述待测物质为任何可能对肝癌具有治疗和/或预防作用的物质、或任何可能促进本发明所述环状RNA circ-DCUN1D4表达的物质，在本发明中，所述待测物质并无特别限制。
(2) 一种体外非治疗目的地抑制肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞迁移、抑制肝癌细胞侵袭和/或抑制肝癌组织形成的方法,所述方法包括如下步骤：在有需要的体系中加入有效量的本发明第一方面中所述的环状RNA circ-DCUN1D4和/或环状RNA circ-DCUN1D4表达促进剂。
本发明还提供了一种治疗和/或预防肝癌的方法，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用有效量的本发明第一方面中所述的环状RNA circ-DCUN1D4和/或环状RNAcirc-DCUN1D4表达促进剂、和/或本发明第二方面所述的药物组合物。
在一些实施方案中，当施用本发明第一方面中所述的环状RNA circ-DCUN1D4和/或环状RNA circ-DCUN1D4表达促进剂、和/或本发明第二方面所述的药物组合物时，可以全身施用，或者可以将所述物质直接施用至存在癌细胞或者癌前细胞的特定部位。因此，可以以有效地将所述物质递送至癌细胞或癌前细胞的任何方式来完成施用。
在一些实施方案中，所述施用的方式包括但不限于：局部、经皮、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、口服、鼻内滴注、腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病灶内或通过施用于诸如鼻、咽喉和支气管的粘膜来施用所述物质。
本发明还提供了一种诊断和/或辅助诊断肝癌的方法，所述方法包括如下步骤：检测受试者来源的样本中本发明第一方面环状RNA circ-DCUN1D4的表达水平，若与正常人相比，受试者来源的样本中环状RNA circ-DCUN1D4的表达水平显著降低，则该受试者被诊断为患有肝癌的患者或被诊断为有较高风险患有肝癌的疑似患者。
在一些实施方案中，所述受试者是指任何动物，还指人类和非人类的动物。所述非人类的动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物（特别是高等灵长类动物）、绵羊、狗、啮齿类动物（如小鼠或大鼠）、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等，在本发明的具体实施方案中，所述受试者优选为人。
在一些实施方案中，所述样本是指获自或衍生自目标受试者的组合物，其包含有待例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定的细胞实体和/或其他分子实体。该样本可以获自受试者的血液和生物来源的其他流体样本及组织样本，如活检组织样本或从其衍生的组织培养物或细胞。组织样本的来源可以是实体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保藏的器官或组织样本、活检组织或吸出物；血液或任意血液组分；体液；来自个体妊娠或发育的任何时间的细胞；或血浆。所述样本包括在其获得后以任何方式处理过的生物样本，如经试剂处理、稳定化、或针对某些成分（如蛋白质或多核苷酸）富集、或包埋在用于切片目的的半固体或固体基质中。本发明中所述的样本包括但不限于：血液、组织、血液来源的细胞、血清、血浆、淋巴液、滑膜液、细胞提取物及其组合，在优选的实施方案中，所述样本选自于受试者的组织样本或血液样本。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
本发明首次发现环状RNA circ-DCUN1D4是一个全新的肝癌诊断和治疗靶点，体外细胞实验和体内功能实验的结果显示环状RNA circ-DCUN1D4在肝癌中的表达显著下调，过表达circ-DCUN1D4能够显著抑制肝癌细胞的细胞活力、细胞增殖能力、细胞迁移和侵袭能力、肿瘤形成能力，所述环状RNA circ-DCUN1D4能够发挥有效杀伤肝癌细胞的体内治疗效果，可用于肿瘤免疫治疗药物的制备中。本发明为肝癌的诊断和治疗提供了新的靶点，在肝癌的临床治疗方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为circ-DCUN1D4的特征结构图；
图2为circ-DCUN1D4扩增产物拼接位点的一代测序图；
图3为RNase R对circ-DCUN1D4和mDCUN1D4的消化对比图，其中，mock为不采用RNase R酶处理的对照组；
图4为QPCR检测肝癌细胞系和正常肝细胞系中circ-DCUN1D4的表达结果对比图；
图5为过表达circ-DCUN1D4的肝癌细胞与对照细胞系的细胞活力对比图，其中，左侧为肝癌细胞HepG2，右侧为肝癌细胞HCCLM3；横坐标为组别，纵坐标为OD450值（代表细胞活率），vector为转染空载体pCDNA3.1-vector的对照细胞系，circ-DCUN1D4为转染pCDNA3.1-circ-DCUN1D4质粒（过表达circ-DCUN1D4）的细胞系；
图6为EDU细胞增殖检测结果图，其中，A图：结果图，B图：统计图，pCDNA3.1-vector为转染空载体的对照细胞系，circ-DCUN1D4为转染pCDNA3.1-circ-DCUN1D4质粒（过表达circ-DCUN1D4）的细胞系；
图7为细胞划痕实验结果图，其中，A图：结果图，B图：统计图；
图8为克隆形成实验结果图，其中，A图：结果图，B图：统计图；
图9为细胞周期与凋亡检测的结果图；
图10为过表达circ-DCUN1D4对裸鼠体内肝癌肿瘤增殖的影响，其中，A图：瘤内注射circ-DCUN1D4过表达纳米颗粒后第28天的裸鼠皮下瘤生长情况，B图：裸鼠皮下肿瘤体积增长曲线；
图11为circ-DCUN1D4能够与miR-590-5p结合的结果图；
图12为miR-590-5p能够阻抑circ-DCUN1D4对于肝癌细胞活率的抑制作用结果图；
图13为miR-590-5p能够阻抑circ-DCUN1D4对于肝癌细胞增殖的抑制作用结果图，其中，A图：结果图，B图：统计图；
图14为miR-590-5p能够阻抑circ-DCUN1D4对于肝癌细胞迁移的抑制作用结果图，其中，A图：结果图，B图：统计图；
图15为miR-590-5p能够阻抑circ-DCUN1D4对于肝癌成瘤性的抑制作用结果图，其中，A图：结果图，B图：统计图；
图16为miR-590-5p能够恢复circ-DCUN1D4对于肝癌细胞周期的阻滞结果图。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。为了促进对本发明的理解，此处对本发明中涉及到的如下术语进行解释：
在本文中使用，术语“引物”，是指能够形成与模板链互补的碱基对（basepair），并且起到用于复制模板链的起始点作用的7-50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。
在本文中使用，术语“探针”，是指短至几个到长达数百碱基的核酸片段，例如RNA或DNA，所述核酸片段可以与mRNA建立特异性结合并且可以因Labeling作用而确定特定mRNA的存在。探针可以按寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针和RNA探针等形式制备。可以基于本领域已知内容对探针和杂交条件进行恰当选择。
在本文中使用，术语“表达水平”同“水平”，是指本发明所述的环状RNA circ-DCUN1D4表达的绝对量或相对量，可以通过多种技术确定所述环状RNA circ-DCUN1D4的表达水平，特别地，可以通过使用本领域技术人员熟知的方法对本发明所述的环状RNA circ-DCUN1D4的绝对量或相对量进行检测。
在本文中使用，术语“治疗”，通常涉及治疗人类或动物（例如，被兽医所应用），其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展（包括降低病症发展速度、使病症发展停止）、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施（例如预防）的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
在本文中使用，术语“预防”，是指由施用本发明第一方面中所述的环状RNA circ-DCUN1D4和/或环状RNA circ-DCUN1D4表达促进剂、和/或本发明第二方面所述的药物组合物时引起的肝癌疾病失调或状况的发展、复发、发作或散播的完全或部分的抑制。
在本文中使用，术语“诊断”，是指基于与个体相关的一个或多个的症状、数据或其他信息，来对个体的健康状态或状况的发现、判断或认知。个体的健康状态可被诊断为健康的/正常的（即不存在疾病或疾患），或者可被诊断为不健康的/异常的（即存在疾病或疾患），术语诊断、早期诊断、进行诊断及这些术语的变化型包括与特定疾病或疾患（在本发明中具体指肝癌）相关的疾病/病症的早期发现；疾病的特性或分类；疾病的进展、治愈或复发的发现；个体的处置或治疗后对疾病的反应的发现，在本发明中，所述肝癌的诊断和/或辅助诊断包括对不患有肝癌的个体和患有肝癌的个体进行区分。
在本文中使用，术语“药物组合物”，可具有选自如下的任一种制剂：溶液剂、颗粒剂、悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、胶囊、乳剂、糖浆、灭菌水溶液剂、非水溶液剂、冻干制剂和栓剂。此外，所述药物组合物可以一次或多次施用。此时，可以以液体制剂、粉剂、气雾剂、胶囊或栓剂的形式施用所述药物组合物。在具体实施方案中，本发明提供的药物组合物可根据实际需要制成各种剂型，并可由临床医师根据受试者的种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它本领域技术人员公知的任何合适的给药方式。
在本文中使用，术语“有效量”，是指具有治疗效果的量或在治疗对象中产生治疗效果所需要的量。例如，药物治疗上或药学上有效量是指产生需要的治疗效果所需要的药物的量，治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物研究和/或体外研究的结果来反映。药学上有效量取决于几个因素，包括但不限于：治疗对象的特征因素（如身高、体重、性别、年龄和用药史）、罹患疾病的严重程度等。
在本文中使用，术语“施用”，是指将存在于身体外部的物质（例如，本文描述的环状RNA circ-DCUN1D4、环状RNA circ-DCUN1D4表达促进剂和/或药物组合物）注射或物理上递送进入受试者的动作，例如，通过粘膜的、真皮内的、静脉内的、肌肉内的递送和/或本领域已知的任何其他物理递送的方法。当疾病、失调或状况，或其症状被治疗时，施用所述物质一般在疾病、失调或状况或其症状发作之后进行。当疾病、失调或状况，或其症状被预防时，施用所述物质一般在疾病、失调或状况或其症状发作之前进行。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
本发明所用的主要材料和试剂信息如下表1。
本发明中所述环状RNA circ-DCUN1D4（CircBase ID: hsa_circ_0007928）包含DCUN1D4基因的第2至第6号外显子，其环化的核苷酸序列有389个碱基，目前尚未有任何关于circ-DCUN1D4在肝癌细胞功能研究上的相关报道。
circ-DCUN1D4对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，环状RNA的结构为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列转录后经剪接形成的首尾相连的环状结构。circ-DCUN1D4对应的RNA序列如SEQ ID NO:2所示，circ-DCUN1D4的结构为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列首尾连接而成的环状结构。
circ-DCUN1D4对应的cDNA序列：
ATTTTCAGCTGAACTCTCATCTCTCAACACTGGCAAATATTCATAAGATCTACCACACCCTTAATAAGCTGAACCTAACAGAAGACATTGGCCAAGACGATCACCAAACAGGAAGTCTGCGGTCTTGCAGTTCTTCAGACTGCTTTAATAAAGTGATGCCACCAAGGAAAAAGAGAAGACCTGCCTCTGGAGATGATTTATCTGCCAAGAAAAGTAGACATGATAGCATGTATAGAAAATATGATTCGACTAGAATAAAGACTGAAGAAGAAGCCTTTTCAAGTAAAAGGTGCTTGGAATGGTTCTATGAATATGCAGGAACTGATGATGTTGTAGGCCCTGAAGGCATGGAGAAATTTTGTGAAGACATTGGTGTTGAACCAGAAAAC (SEQ ID NO:1)
circ-DCUN1D4对应的RNA序列：
AUUUUCAGCUGAACUCUCAUCUCUCAACACUGGCAAAUAUUCAUAAGAUCUACCACACCCUUAAUAAGCUGAACCUAACAGAAGACAUUGGCCAAGACGAUCACCAAACAGGAAGUCUGCGGUCUUGCAGUUCUUCAGACUGCUUUAAUAAAGUGAUGCCACCAAGGAAAAAGAGAAGACCUGCCUCUGGAGAUGAUUUAUCUGCCAAGAAAAGUAGACAUGAUAGCAUGUAUAGAAAAUAUGAUUCGACUAGAAUAAAGACUGAAGAAGAAGCCUUUUCAAGUAAAAGGUGCUUGGAAUGGUUCUAUGAAUAUGCAGGAACUGAUGAUGUUGUAGGCCCUGAAGGCAUGGAGAAAUUUUGUGAAGACAUUGGUGUUGAACCAGAAAAC (SEQ ID NO:2)
实施例1 环状RNA的构建
在本实施例中，发明人设计了能够扩增circ-DCUN1D4（CircBase ID: hsa_circ_0007928）的特异性引物对，并利用该引物对扩增DCUN1D4基因的环状RNA，通过一代测序的方法证实了环状RNA的拼接位点（backsplicing junction site），之后通过RNase R消化实验，确定了circ-DCUN1D4是表达为具有闭合环状结构的环状RNA分子。具体实验方法如下：
1、细胞总RNA提取及浓度测定
（1）待6孔板细胞超过90%时，弃掉旧的培养液，用PBS清洗一次后，每孔加入1 mLTrizol，然后转移至1.5 mL EP管中；
（2）将EP管在室温条件下放置10分钟，以便核酸蛋白复合物充分分离；
（3）在EP管内添加0.2 mL氯仿，震荡大约10 s，然后在室温条件下放置5 min；氯仿是非极性分子，能有效抑制RNA酶活性，当加入Trizol的细胞溶液和氯仿混合时，蛋白质的水分子被氯仿去掉，使蛋白失去水和状态而变性，加速水相和有机相的分离；
（4）12000 g，4℃离心15 min，此时EP管溶液分为3层，底层为红色有机物，上层为无色水相，RNA存在于水相中；
（5）将上层液（约450 mL）转移至新的EP管内，然后加入相同体积的异丙醇，室温条件下放置10 min；异丙醇可吸收RNA周围水分，使其沉淀；
（6）12000 g，4℃离心10 min，离心后可在管底和管侧看到白色RNA沉淀物，弃掉上清液；
（7）将RNA沉淀用75% DEPC-乙醇溶液洗涤，7500 g，4℃离心5 min，弃掉上清液；
（8）将RNA沉淀置于生物安全柜中5 min，晾干后加入20 μL DEPC水溶解RNA，该步骤在冰上操作；
（9）用ScanDrop100超微量核酸测定仪检测细胞总RNA纯度和浓度。
2、cDNA逆转录
在冰上进行逆转录反应体系配制（以20 μL体系为例），配制完成后加入已准备好的细胞总RNA进行逆转录，所述逆转录反应体系如表2所示。
逆转录反应条件如下：在37℃下反应15分钟，之后在85℃下反应5秒。降温至4℃后，将反应得到的cDNA稀释5倍，之后置于-20℃冰箱保存。
3、引物设计
利用Primer3.0在线工具设计引物，再用NCBI Blast进行验证。
引物的设计原则如下：（1）引物GC含量在50-60%；（2）引物长度为17-25 bp；（3）引物Tm在57-63℃；（4）引物的位置避开目的序列的三级结构；（5）避免G或C碱基重复次；（6）避免引物末端碱基为A；（7）引物及产物避免形成二级结构；（8）产物长度在100-150 bp之间；（9）产物避免有4个单碱基重复。
通过上述设计原则，共设计出5对引物，本实施例中所采用的引物对如下，所述引物对由北京睿博兴科公司合成。
F：5’-ACTGATGATGTTGTAGGCCC-3’ (SEQ ID NO:3)
R：5’-GCCAATGTCTTCTGTTAGGTTCAG-3’ (SEQ ID NO:4)
在一个或多个实施例中，也可采用上述引物对以外的其他引物对进行扩增。
4、一代测序
利用上述引物对扩增逆转录得到的cDNA后，对扩增产物进行一代测序。
5、RNase R消化实验
RNase R酶是一种能够消化线性RNA但对环状RNA几乎没有影响的RNA酶。
将1 μg细胞总RNA与3 U RNase R酶以10 μL的体积在37℃下孵育30分钟，之后升温至75℃并保持10分钟使RNase R酶失活，最后通过RT-qPCR分析是否添加RNase R对circDCUN1D4和mDCUN1D4的影响。
6、实验结果
circ-DCUN1D4的特征结构图和circ-DCUN1D4扩增产物拼接位点的一代测序结果图分别如图1和图2所示，circ-DCUN1D4源自DCUN1D4基因的第2到6号外显子，一代测序的结果证明circ-DCUN1D4存在反向剪切连接，且准确地显示了扩增产物的拼接位点，表明circ-DCUN1D4的形成不是由于基因组的重组错配。
RNase R对circDCUN1D4和mDCUN1D4的消化对比图如图3所示，线性的mDCUN1D4经Rnase R酶消化后表达显著降低，而circDCUN1D4耐受Rnase R酶的消化作用，证实其具有环状结构。
实施例2 circ-DCUN1D4在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达检测
通过荧光定量PCR（QPCR）检测circ-DCUN1D4在肝癌细胞和对应正常肝细胞系中的表达差异，发现circ-DCUN1D4在肝癌细胞中的表达明显低于正常肝细胞，表明circ-DCUN1D4能够用于肝癌诊断。具体实验方法如下：
1、细胞中总RNA提取及浓度测定
（1）在6孔细胞培养板中加入1 mL Trizol裂解10 min后收入1.5 mL EP管中；
（2）将EP管在室温条件下放置约10分钟，以便核酸蛋白复合物能够充分分离；
（3）在EP管内添加0.2 mL氯仿，震荡大约10 s，然后在室温条件下放置5 min；
（4）12000 g，4℃离心15 min，此时EP管溶液分为3层，底层为红色有机物，上层为无色水相，RNA存在于水相中；
（5）将上层液（约450 mL）转移至新的EP管内，然后加入相同体积的异丙醇，室温条件下放置10 min；
（6）12000 g，4℃离心10 min，离心后可在管底和管侧看到白色RNA沉淀物，弃掉上清液；
（7）将RNA沉淀用75% DEPC-乙醇溶液洗涤，7500 g，4℃离心5 min，弃掉上清液；
（8）将RNA沉淀置于生物安全柜中5 min，晾干后加入20 μL DEPC水溶解RNA，该步骤在冰上操作；
（9）用ScanDrop100超微量核酸测定仪检测RNA纯度和浓度。
2、QPCR扩增实验
采用实施例1中的cDNA逆转录方法进行组织RNA逆转录。
在冰上进行PCR反应体系配制（以20 μL体系为例），配制完成后再加入已逆转录得到的cDNA模板。其中，PCR反应体系如表3所示。
用于扩增环状RNA circ-DCUN1D4的引物对采用实施例1中如SEQ ID NO:3-SEQ IDNO:4所示的引物对。
反应条件如下：
第一步，预变性，95℃，5分钟；
第二步，PCR反应（40个循环），95℃，20秒；60℃，20秒；72℃，20秒。
第三步，融解曲线分析，65℃，5秒；95℃，5秒。
进行定量分析。目标基因的相对表达量计算公式为：2-△△Ct＝2-[(△Ct)Test-(△Ct)Control]。其中，△Ct＝Ct目的-Ct管家，Ct目的为目标基因Ct值，Ct管家为管家基因Ct值，△Ct表示各样本目的基因相对管家基因的相Ct值，△△Ct＝(△Ct)Test-(△Ct)Control表示处理组相对对照组进行归一化，2-△△Ct表示处理组相对对照组的相对表达量，表示目标基因相对表达倍数。
3、实验结果
上述QPCR实验结果如图4所示，结果显示，circ-DCUN1D4在肝癌细胞HepG2和Huh7以及HCCLM3中的表达显著低于正常肝细胞L02，表明circ-DCUN1D4在肝癌发生发展中具有重要意义，可以作为肝细胞癌患者的理想预后标志物，并能够在肝癌诊断中产生积极作用。
实施例3 过表达circ-DCUN1D4对肝癌细胞增殖、侵袭和转移的影响
将circ-DCUN1D4和随机序列vector构建到专用过表达环状RNA的pCDNA3.1载体上，在HepG2细胞上转染pCDNA3.1-circ-DCUN1D4和pCDNA3.1-vector分别作为处理组和对照组，通过CCK-8细胞活性检测circ-DCUN1D4过表达对肝癌细胞的活性的影响，通过EDU细胞增殖实验检测circ-DCUN1D4过表达对肝癌细胞增殖能力的影响，通过细胞划痕实验考察circDCUN1D4过表达对肝癌细胞迁移与侵袭能力的影响，通过克隆形成实验考察circ-DCUN1D4过表达对肝癌细胞成瘤能力的影响，通过细胞周期与凋亡实验检测circ-DCUN1D4过表达对肝癌细胞凋亡的影响。
1、CCK-8细胞活性检测实验
活细胞线粒体中的脱氢酶可以与WST-8化合物相互反应，最终将其还原成亲水溶性甲瓒染料，溶解后呈黄色，生成的黄色甲瓒数量与活细胞的数量呈正相关，也即活细胞数量越多，溶液的黄色程度越高，因此利用这一特征进行细胞活性和增殖的检测。
（1）在96孔板中每孔接种10000个HepG2细胞，待培养12 h细胞贴壁后分别转染pCDNA3.1-circ-DCUN1D4和pCDNA3.1-vector作为处理组和对照组；
（2）于48 h在对应区域孔中加入10 μL的CCK-8试剂；
（3）放置到37℃，5% CO2的恒温培养箱进行培养，时间约为2小时；
（4）最后用酶标仪在450 nm处测定吸光值。
2、EDU细胞增殖检测实验
细胞增殖检测试剂盒（BeyoClick™ EdU Cell Proliferation Kit with AlexaFluor 555）（购自于上海碧云天生物科技有限公司），是一种基于DNA合成过程中胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine）类似物EdU（5-ethynyl-2’-deoxyuridine）的掺入，并通过随后的点击反应（Click reaction）使EdU被Alexa Fluor 555所标记，从而实现简单、快速、高灵敏地检测细胞增殖的试剂盒。
（1）将30万个癌细胞接种于6孔板中，待培养12 h细胞贴壁后分别转染pCDNA3.1-circ-DCUN1D4和pCDNA3.1-vector作为处理组和对照组；
（2）培养48 h后弃去培养基，加入PBS洗涤三遍后，加入1 mL 4%的多聚甲醛室温固定10 min；
（3）弃去4%的多聚甲醛，加入PBS洗涤三遍后，加入1 mL 0.1%的triton X-100室温孵育10 min；
（4）弃去0.1%的triton X-100溶液，加入PBS洗涤三遍后，利用上述BeyoClick™EdU-555细胞增殖检测试剂盒进行检测。
3、细胞划痕实验
（1）在24孔细胞培养板划线，首先用马克笔在24孔板的背部进行划线，每孔划3-5条线，随后接种6万个HepG2细胞，待培养12 h细胞贴壁后分别转染pCDNA3.1-circ-DCUN1D4和pCDNA3.1-vector作为处理组和对照组；
（2）转染六个小时后利用200 μL的枪头在培养孔正中间划一道竖痕，随后利用PBS清洗一遍，加入新鲜培养基在镜下拍照记为0 h；
（3）在48 h利用PBS清洗一遍后进行拍照记为48 h；
（4）利用image J处理图片计算划痕愈合率。
4、克隆形成实验
（1）于6孔板培养板中各实验组接种1000个细胞/孔，待培养12 h细胞贴壁后分别转染pCDNA3.1-circ-DCUN1D4和pCDNA3.1-vector作为处理组和对照组；
（2）继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态；
（3）克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照，然后PBS洗涤1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗涤1次；
（4）每孔加入结晶紫染液1 mL，染细胞10-20 min；
（5）PBS洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照（分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照）；
（6）利用image J处理图片，计算克隆形成的细胞数量。
5、细胞周期与凋亡检测实验
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit）（购自于上海碧云天生物科技有限公司），是一种采用经典的碘化丙啶染色（Propidiumstaining，即PI staining）方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒。碘化丙啶是一种双链DNA的荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。
（1）于6孔板培养板中各实验组接种30万个细胞/孔，待培养12 h细胞贴壁后分别转染pCDNA3.1-circ-DCUN1D4和pCDNA3.1-vector作为处理组和对照组；
（2）待细胞转染48 h后，弃去培养基，加入PBS清洗1遍，加入胰酶消化收取细胞，300 g离心5 min后弃去上清；
（3）加入1 mL 70%的冰浴乙醇，放入4℃冰箱固定12 h；
（4）300 g离心5 min后弃去上清，利用上述细胞周期与凋亡检测试剂盒进行染色；
（5）利用流式细胞仪器收集染色后的细胞；
（6）利用modfit处理流式数据。
6、实验结果
CCK-8细胞活性检测实验的实验结果如图5所示，结果显示，在circ-DCUN1D4过表达后，肝癌细胞的细胞活力受到明显抑制，肝癌细胞的活性明显减弱。
EDU细胞增殖检测实验的实验结果如图6A和图6B所示，结果显示，在circ-DCUN1D4过表达后，肝癌细胞的细胞增殖能力受到明显抑制，肝癌细胞分裂能力明显减弱。
细胞划痕实验的实验结果如图7A和图7B所示，结果显示，过表达circ-DCUN1D4的肝癌细胞系相较于空载体的对照组肝癌细胞系，肝癌细胞的迁移与侵袭能力受到明显抑制。
克隆形成实验的实验结果如图8A和图8B所示，结果显示，过表达circ-DCUN1D4的细胞株相较于空载体的对照组细胞株，肝癌细胞的成瘤能力受到明显抑制。
细胞周期与凋亡检测实验的实验结果如图9所示，结果显示，过表达circ-DCUN1D4的细胞株相较于空载体的对照组细胞株，肝癌细胞的细胞周期明显迟滞在G2时期，并且有20%的细胞发生了凋亡。
以上实验结果表明，circ-DCUN1D4及其表达产物能够有效应用于肝癌的治疗中。
实施例4 过表达circ-DCUN1D4对裸鼠体内肝癌细胞增殖的影响
1、实验方法
本实施例采用4-6周龄的雄性裸鼠进行实验，裸鼠均购自于北京维通利华实验动物有限公司。
将对数期生长的HepG2细胞利用胰酶消化后，300 g离心5 min进行细胞计数，将细胞以107个/100 μL的密度重悬在无血清DMEM培养基中，在裸鼠左腋皮下按100 μL/只的体积进行注射，7天后检测瘤体大小，当瘤体体积超过100 mm3后进行后续实验。
筛选符合标准的成瘤裸鼠作为评价模型，进行裸鼠皮下瘤瘤内分别注射pCDNA3.1-vector和pCDNA3.1-circ-DCUN1D4过表达纳米颗粒，每周测量一次肿瘤体积（V＝1/2×a×b2，a为长轴，b为短轴），游标卡尺测量肿瘤最长和最短部位，绘制肿瘤体积增长曲线。
2、实验结果
实验结果如图10A和图10B所示，结果显示，导入过表达circ-DCUN1D4的circ-DCUN1D4组肿瘤体积明显缩小（见图10A）。从皮下注射肿瘤细胞系开始计算，第28天处死裸鼠，取出肿瘤后拍照并绘制裸鼠皮下肿瘤体积增长曲线，结果显示，过表达circ-DCUN1D4的pCDNA3.1-circ-DCUN1D4组的肿瘤体积明显小于对照组pCDNA3.1-Vector的肿瘤体积（见图10B）。
以上实验结果表明，过表达circ-DCUN1D4能够显著抑制肝癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力，也即circ-DCUN1D4及其表达产物能够有效应用于肝癌的治疗中。
实施例5 circ-DCUN1D4在肝癌内的作用机制
1、双荧光素酶报告基因实验验证circ-DCUN1D4与miR-590-5p的互作关系
实验方法：通过前期的实验验证，本发明发现miR-590-5p可能是circ-DCUN1D4的潜在靶miRNA，通过circintercame网站分析了circ-DCUN1D4与miR-590-5p的潜在结合位点，随后构建了包含circ-DCUN1D4与miR-590-5p结合位点部分碱基序列的野生型荧光素酶载体（Luc-circ-DCUN1D4）及突变型荧光素酶载体（Luc-circ-DCUN1D4-Mut）。通过在293FT细胞中分别同时转染miR-590-5p mimics与circ-DCUN1D4野生型荧光素酶载体、同时转染miR-590-5p mimics与circ-DCUN1D4突变型荧光素酶载体。
实验结果：结果如图11所示，结果显示，同时转染miR-590-5p mimics与circ-DCUN1D4野生型荧光素酶载体，双荧光素酶相对活性显著下调，而同时转染miR-590-5pmimics与circ-DCUN1D4突变型荧光素酶载体，双荧光素酶相对活性则基本不发生变化。以上实验结果说明circ-DCUN1D4能与miR-590-5p结合，circ-DCUN1D4通过“miRNA海绵作用”调控miR-590-5p的表达。
2、miR-590-5p能够阻抑circ-DCUN1D4对于肝癌细胞活率的抑制作用
实验方法：分别在HepG2和HCCLM3两种肝癌细胞系中进行pCDNA3.1-vector的转染、pCDNA3.1-circ-DCUN1D4和miR-NC共转染以及miR-590-5p mimics和pCDNA3.1-circ-DCUN1D4共转染，在转染48 h后，利用CCK-8试剂盒检测3个处理组的细胞活率，具体检测方法如实施例3中所述。
实验结果：结果如图12所示，结果显示，过表达pCDNA3.1-circ-DCUN1D4显著抑制了HepG2和HCCLM3两种肝癌细胞的细胞活率，而将miR-590-5p mimics和pCDNA3.1-circ-DCUN1D4共转染后，相较于单独转染pCDNA3.1-circ-DCUN1D4的细胞，细胞活率得到了一定程度的恢复，说明miR-590-5p能够阻抑circ-DCUN1D4对于肝癌细胞活率的抑制作用。
3、miR-590-5p能够阻抑circ-DCUN1D4对于肝癌细胞增殖的抑制作用
实验方法：分别在HepG2和HCCLM3两种肝癌细胞系中进行pCDNA3.1-vector的转染、pCDNA3.1-circ-DCUN1D4和miR-NC共转染以及miR-590-5p mimics和pCDNA3.1-circ-DCUN1D4共转染，在转染48 h后，利用EDU增殖检测试剂盒检测3个处理组的细胞增殖性，具体检测方法如实施例3中所述。
实验结果：结果如图13A和13B所示，结果显示，过表达pCDNA3.1-circ-DCUN1D4显著抑制了HepG2和HCCLM3两种肝癌细胞的细胞增殖能力，而将miR-590-5p mimics和pCDNA3.1-circ-DCUN1D4共转染后，相较于单独转染pCDNA3.1-circ-DCUN1D4的细胞，其增殖能力得到了一定程度的恢复，说明miR-590-5p能够阻抑circ-DCUN1D4对于肝癌细胞增殖能力的抑制作用。
4、miR-590-5p能够阻抑circ-DCUN1D4对于肝癌细胞迁移的抑制作用
实验方法：分别在HepG2和HCCLM3两种肝癌细胞系中进行pCDNA3.1-vector的转染、pCDNA3.1-circ-DCUN1D4和miR-NC共转染以及miR-590-5p mimics和pCDNA3.1-circ-DCUN1D4共转染，在转染48 h后，通过细胞划痕实验检测3个处理组的细胞迁移侵袭能力变化，具体检测方法如实施例3中所述。
实验结果：结果如图14A和14B所示，结果显示，过表达pCDNA3.1-circ-DCUN1D4显著抑制了HepG2和HCCLM3两种肝癌细胞的细胞迁移侵袭能力，而将miR-590-5p mimics和pCDNA3.1-circ-DCUN1D4共转染后，相较于单独转染pCDNA3.1-circ-DCUN1D4的细胞，其迁移和侵袭能力得到了一定程度的恢复，说明miR-590-5p能够阻抑circ-DCUN1D4对于肝癌细胞迁移侵袭能力的抑制。
5、miR-590-5p能够阻抑circ-DCUN1D4对于肝癌成瘤性的抑制作用
实验方法：分别在HepG2和HCCLM3两种肝癌细胞系中进行pCDNA3.1-vector的转染、pCDNA3.1-circ-DCUN1D4和miR-NC共转染以及miR-590-5p mimics和pCDNA3.1-circ-DCUN1D4共转染，在转染48 h后，通过克隆形成实验检测3个处理组的细胞成瘤能力的变化，具体检测方法如实施例3中所述。
实验结果：结果如图15A和15B所示，结果显示，过表达pCDNA3.1-circ-DCUN1D4显著抑制了HepG2和HCCLM3两种肝癌细胞的成瘤能力，而将miR-590-5p mimics和pCDNA3.1-circ-DCUN1D4共转染后，相较于单独转染pCDNA3.1-circ-DCUN1D4的细胞，其成瘤能力得到了一定程度的恢复，说明miR-590-5p能够阻抑circ-DCUN1D4对于肝癌细胞成瘤能力的抑制作用。
6、miR-590-5p能够恢复circ-DCUN1D4对于肝癌细胞周期的阻滞
实验方法：分别在HepG2和HCCLM3两种肝癌细胞系中进行pCDNA3.1-vector的转染、pCDNA3.1-circ-DCUN1D4和miR-NC共转染以及miR-590-5p mimics和pCDNA3.1-circ-DCUN1D4共转染，在转染48 h后，利用细胞周期检测试剂盒检测3个处理组的细胞周期不同间期占比的变化，具体检测方法如实施例3中所述。
实验结果：结果如图16所示，结果显示，过表达pCDNA3.1-circ-DCUN1D4显著将HepG2和HCCLM3两种肝癌细胞的细胞周期阻滞在G2期，而将miR-590-5p mimics和pCDNA3.1-circ-DCUN1D4共转染后，相较于单独转染pCDNA3.1-circ-DCUN1D4的细胞，其细胞周期在G2期的阻滞得到了一定程度的恢复，说明miR-590-5p能够恢复circ-DCUN1D4对于肝癌细胞周期的阻滞作用。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.环状RNA circ-DCUN1D4表达促进剂在制备用于治疗和/或预防肝癌的药物中的应用；
所述环状RNA circ-DCUN1D4的CircBase ID为hsa_circ_0007928；
所述环状RNA circ-DCUN1D4对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示；
所述环状RNA circ-DCUN1D4对应的RNA序列如SEQ ID NO:2所示；
所述环状RNA circ-DCUN1D4为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列转录后经剪接形成的首尾相连的环状结构；
所述环状RNA circ-DCUN1D4为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列首尾连接而成的环状结构；
所述环状RNA circ-DCUN1D4表达促进剂为环状RNA circ-DCUN1D4、含有环状RNAcirc-DCUN1D4的重组载体、含有环状RNA circ-DCUN1D4的纳米颗粒、含有环状RNA circ-DCUN1D4的蛋白微球、含有环状RNA circ-DCUN1D4的脂质体、含有环状RNA circ-DCUN1D4的PEG修饰蛋白、含有环状RNA circ-DCUN1D4的细胞外囊泡和/或其任意组合。
2.一种用于治疗和/或预防肝癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1中所述的环状RNA circ-DCUN1D4表达促进剂。
3.一种体外非治疗目的地抑制肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞迁移、抑制肝癌细胞侵袭和/或抑制肝癌组织形成的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在肝癌细胞体系中加入有效量的权利要求1中所述的环状RNA circ-DCUN1D4表达促进剂。
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