CN118021981A - 环状RNA circACADM表达促进剂在肝癌诊断和治疗中的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了环状RNA circACADM表达促进剂在制备用于治疗和/或预防肝癌的药物中的应用,其中所述环状RNA circACADM的circBase ID为hsa_circ_0008129。本发明首次发现环状RNA circACADM是一个全新的肝癌诊断和治疗靶点,所述环状RNA circACADM能够发挥有效杀伤肝癌细胞的体内治疗效果,可用于肿瘤免疫治疗药物的制备中。本发明为肝癌的诊断和治疗提供了新的靶点,在肝癌的临床治疗方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体地,本发明涉及环状RNA circACADM表达促进剂在肝癌诊断和治疗中的新用途。
背景技术
肝癌,也称为肝脏恶性肿瘤,是指在肝脏组织中发生的癌变。肝癌有四个显著的危害性:高致命性、恶性程度较高、发展迅速、容易发生远处转移。肝癌的隐蔽性强,在早期往往没有明显的症状和体征,很难被察觉,导致很多患者在确诊时已经错过了最佳治疗时机。肝癌具有高并发症风险,容易侵犯周围的器官和组织,导致严重的并发症,如肝功能衰竭、腹水、黄疸等;肝癌的治疗相对复杂,需要综合考虑患者的整体状况、肿瘤的位置、大小、数量以及肝功能等因素,选择合适的治疗方法。因此开发早期诊断技术和有效的治疗手段是治疗肝癌的重要研究方向。
环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子,它们在细胞中形成闭环结构,因此具有很高的稳定性。近年来,越来越多的研究表明,circRNA在包括肝癌在内的多种肿瘤的发生和发展中扮演着重要角色。其参与了肝癌的发生、发展和治疗响应等多个环节。随着对circRNA研究的深入,它们有望为肝癌的早期诊断、治疗和预后评估提供新的策略和方法。
迄今为止,尚未见环状RNA circACADM在诊断和/或治疗肝癌中的应用的相关研究或报道。
发明内容
为了克服现有技术中存在的上述不足,本发明的目的在于提供环状RNAcircACADM在肝癌诊断和治疗中的新用途。
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
本发明的第一方面提供了环状RNA circACADM表达促进剂在制备用于治疗和/或预防肝癌的药物中的应用;
进一步,所述环状RNA circACADM的circBase ID为hsa_circ_0008129。
进一步,所述环状RNA circACADM对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示;
所述环状RNA circACADM对应的RNA序列如SEQ ID NO:2所示;
所述环状RNA circACADM为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列转录后经剪接形成的首尾相连的环状结构;
所述环状RNA circACADM为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列首尾连接而成的环状结构。
进一步,所述药物包括用于治疗和/或预防肝癌的分子靶向药物、生物制剂、药物组合物。
进一步,所述环状RNA circACADM表达促进剂包括能够促进环状RNA circACADM表达的天然纯化物质、经修饰的天然纯化物质、半合成物质、化学合成物质和/或其任意组合。
进一步,所述环状RNA circACADM表达促进剂包括环状RNA circACADM、含有环状RNA circACADM的重组载体、含有环状RNA circACADM的纳米颗粒、含有环状RNA circACADM的蛋白微球、含有环状RNA circACADM的脂质体、含有环状RNA circACADM的PEG修饰蛋白、含有环状RNA circACADM的细胞外囊泡和/或其任意组合;
优选地,所述载体包括DNA质粒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、结合DNA质粒的脂质体、结合DNA质粒的分子耦联体和/或结合DNA质粒的多聚物。
在一些实施方案中,所述环状RNA circACADM表达促进剂是指能够促进环状RNAcircACADM表达的物质,包括但不限于:能够促进环状RNA circACADM表达的天然纯化物质、经修饰的天然纯化物质、半合成物质、化学合成物质和/或其任意组合,任何能够促进环状RNA circACADM表达的物质均在本发明的保护范围内。
在一些实施方案中,所述载体并无特别限制,只要能够用于递送本发明所述的环状RNA circACADM以过表达circACADM的载体均在本发明的保护范围内,在本发明的具体实施方案中,所述载体为pCDNA3.1载体。
本发明的第二方面提供了一种用于治疗和/或预防肝癌的药物组合物。
进一步,所述药物组合物包含本发明第一方面中所述的环状RNA circACADM表达促进剂;
优选地,所述药物组合物还可包含药学上可接受的载体和/或辅料;
优选地,所述药物组合物还可包含用于治疗和/或预防肝癌的其他药物;
更优选地,所述其他药物包括抗病毒药物、化疗药物、靶向治疗药物、免疫治疗药物、中成药物和/或其任意组合;
最优选地,所述抗病毒药物包括恩替卡韦、拉米夫定、索非布韦、达诺瑞韦、替诺福韦酯、阿德福韦酯、奥司他韦、替比夫定、利托那韦;
最优选地,所述化疗药物包括氟尿嘧啶、环磷酰胺、阿霉素、顺铂、卡铂、丝裂霉素、柔红霉素、表阿霉素、吉西他滨、伊利替康、奥沙利铂、米托蒽醌;
最优选地,所述靶向治疗药物包括索拉非尼、瑞戈非尼、仑伐替尼、多纳非尼、瑞戈非尼、阿帕替尼、卡博替尼;
最优选地,所述免疫治疗药物包括阿替利珠单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗、替雷利珠单抗、贝伐珠单抗、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗;
最优选地,所述中成药物包括槐耳颗粒、肝复乐、华蟾素胶囊、补中益气丸。
在一些实施方案中,所述药学上可接受的载体和/或辅料的具体示例性例子包括但不限于:糖类,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;纤维素及其衍生物,如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化剂,如润湿剂,如月桂基硫酸钠;着色剂;调味剂;压片剂、稳定剂;抗氧化剂;防腐剂;无热原水;等渗盐溶液;和磷酸盐缓冲液等。
在一些实施方案中,适合的药学上可接受的载体和/或辅料在Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中有详细的记载,这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或活性物质的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味,在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式,或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。如此配制的药物组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式将药物进行给药,使用药物组合物时,是将安全有效量的本发明所述的药物组合物施用于人。
在一些实施方案中,本发明所述的药物组合物的适合给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方,熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗和/或预防有效的给药剂量。
本发明的第三方面提供了环状RNA circACADM作为诊断标志物在制备用于诊断和/或评估肝癌试剂中的应用。
进一步,所述环状RNA circACADM为本发明第一方面所述的环状RNA circACADM。
进一步,所述试剂包括特异性扩增环状RNA circACADM的引物和/或特异性识别环状RNA circACADM的探针;
优选地,所述特异性扩增环状RNA circACADM的引物的序列如SEQ ID NO:3-SEQID NO:4所示。
本发明的第四方面提供了一种用于诊断肝癌的产品。
进一步,所述产品包含本发明第三方面所述的试剂;
优选地,所述产品还包含通过测序技术、核酸杂交技术和/或核酸扩增技术检测环状RNA circACADM表达水平的试剂;
优选地,所述产品包括试剂盒、芯片和/或试纸条;
优选地,所述产品通过检测环状RNA circACADM在待测样本中的表达水平诊断肝癌。
在一些实施方案中,所述试剂盒为RT-PCR试剂盒,其可进一步包含反转录聚合酶链式反应所必需的元件。RT-PCR试剂盒包含一对特异性针对环状RNA circACADM的引物。所述引物是具有特异性针对所述环状RNA的核酸序列的核苷酸,其长度可为约7至50 bp,更特别为约10-39 bp。
在一些实施方案中,所述RT-PCR试剂盒还可包含测试管或合适的器皿、反应缓冲液(不同pH值和镁浓度)、脱氧核苷酸(dNTP)、酶(例如Taq聚合酶和反转录酶)、脱氧核糖核酸酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、DEPC-水和无菌水。
在一些实施方案中,所述试剂盒为DNA芯片试剂盒,其可进一步包含用于操作DNA芯片所必需的元件。所述DNA芯片试剂盒可包含与环状RNA circACADM对应的cDNA或相当于其片段的寡核苷酸结合的底物,及用于构建荧光标记的探针的试剂、药剂和酶。此外,所述底物可包含对照cDNA或相当于其片段的寡核苷酸。
本发明的第五方面提供了一种体外非治疗目的地抑制肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞迁移、抑制肝癌细胞侵袭和/或抑制肝癌组织形成的方法,所述方法包括如下步骤:在有需要的体系中加入有效量的本发明第一方面所述的环状RNA circACADM表达促进剂。
本发明还提供了一种治疗和/或预防肝癌的方法,所述方法包括如下步骤:给有需要的受试者施用有效量的本发明第一方面中所述的环状RNA circACADM和/或环状RNAcircACADM表达促进剂、和/或本发明第二方面所述的药物组合物。
在一些实施方案中,当施用本发明第一方面中所述的环状RNA circACADM表达促进剂、和/或本发明第二方面所述的药物组合物时,可以全身施用,或者可以将所述物质直接施用至存在癌细胞或者癌前细胞的特定部位。因此,可以以有效地将所述物质递送至癌细胞或癌前细胞的任何方式来完成施用。
在一些实施方案中,所述施用的方式包括但不限于:局部、经皮、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、口服、鼻内滴注、腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病灶内或通过施用于诸如鼻、咽喉和支气管的粘膜来施用所述物质。
本发明还提供了一种诊断和/或辅助诊断肝癌的方法,所述方法包括如下步骤:检测受试者来源的样本中本发明第一方面所述环状RNA circACADM的表达水平,若与正常人相比,受试者来源的样本中环状RNA circACADM的表达水平显著降低,则该受试者被诊断为患有肝癌的患者或被诊断为有较高风险患有肝癌的疑似患者。
在一些实施方案中,所述受试者是指任何动物,还指人类和非人类的动物。所述非人类的动物包括所有脊椎动物,例如,哺乳动物,如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛,和任何家畜或宠物;以及非哺乳动物,如鸡,两栖类,爬行动物等,在本发明的具体实施方案中,所述受试者优选为人。
在一些实施方案中,所述样本是指获自或衍生自目标受试者的组合物,其包含有待例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定的细胞实体和/或其他分子实体。该样本可以获自受试者的血液和生物来源的其他流体样本及组织样本,如活检组织样本或从其衍生的组织培养物或细胞。组织样本的来源可以是实体组织,如来自新鲜、冷冻和/或保藏的器官或组织样本、活检组织或吸出物;血液或任意血液组分;体液;来自个体妊娠或发育的任何时间的细胞;或血浆。所述样本包括在其获得后以任何方式处理过的生物样本,如经试剂处理、稳定化、或针对某些成分(如蛋白质或多核苷酸)富集,或包埋在用于切片目的的半固体或固体基质中。本发明中所述的样本包括但不限于:血液、组织、血液来源的细胞、血清、血浆、淋巴液、滑膜液、细胞提取物及其组合,在优选的实施方案中,所述样本选自于受试者的组织样本或血液样本。
相对于现有技术,本发明具有的优点和有益效果:
本发明首次发现环状RNA circACADM是一个全新的肝癌诊断和治疗靶点,体外细胞实验和体内功能实验的结果显示环状RNA circACADM在肝癌中的表达显著下调,过表达circACADM能够显著抑制肝癌细胞的细胞活力、细胞增殖能力、细胞迁移和侵袭能力、肿瘤形成能力,所述环状RNA circACADM能够发挥有效杀伤肝癌细胞的体内治疗效果,可用于肿瘤免疫治疗药物的制备。本发明为肝癌的诊断和治疗提供了新的靶点,在肝癌的临床治疗方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为circACADM的特征结构图;
图2为circACADM扩增产物拼接位点的一代测序图;
图3为RNase R酶对circACADM和mACADM消化后的RNA相对表达量对比图;
图4为QPCR检测肝癌组织和癌旁组织中circACADM的表达结果对比图;
图5为QPCR检测肝癌细胞HepG2、肝癌细胞HCCLM3和正常肝细胞L02中circACADM的表达结果对比图;
图6为过表达circACADM的肝癌细胞与对照细胞系的细胞活力对比图,其中,左侧为肝癌细胞HepG2,右侧为肝癌细胞HCCLM3;横坐标为组别,纵坐标为OD450值(代表相对细胞活率),vector为转染空载体pCDNA3.1-vector的对照细胞系,circACADM为转染pCDNA3.1-circACADM质粒(过表达circACADM)的细胞系;
图7为EDU细胞增殖检测结果,其中,A图为结果图,B图为统计图,vector为转染空载体pCDNA3.1-vector的对照细胞系,circACADM为转染pCDNA3.1-circACADM质粒(过表达circACADM)的细胞系;
图8为细胞划痕实验结果,其中,A图为结果图,B图为统计图,vector为转染空载体pCDNA3.1-vector的对照细胞系,circACADM为转染pCDNA3.1-circACADM质粒(过表达circACADM)的细胞系;
图9为克隆形成实验结果图,其中,A图为结果图,B图为统计图,vector为转染空载体pCDNA3.1-vector的对照细胞系,circACADM为转染pCDNA3.1-circACADM质粒(过表达circACADM)的细胞系;
图10为过表达circACADM对NCG小鼠体内肝癌肿瘤增殖影响的结果,其中,A图为瘤内注射circACADM过表达纳米颗粒后第28天的NCG小鼠皮下瘤生长情况,B图为NCG小鼠皮下肿瘤体积增长曲线,vector为转染空载体pCDNA3.1-vector的对照细胞系,circACADM为转染pCDNA3.1-circACADM质粒(过表达circACADM)的细胞系。
具体实施方式
除非另有定义,否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。为了促进对本发明的理解,此处对本发明中涉及到的如下术语进行解释:
在本文中使用,术语“引物”,是指能够形成与模板链互补的碱基对(basepair),并且起到用于复制模板链的起始点作用的7-50个核酸序列。引物通常合成而得,但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同,只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子,有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰,但不限于此。
在本文中使用,术语“探针”,是指短至几个到长达数百碱基的核酸片段,例如RNA或DNA,所述核酸片段可以与mRNA建立特异性结合并且可以因Labeling作用而确定特定mRNA的存在。探针可以按寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针和RNA探针等形式制备。可以基于本领域已知内容对探针和杂交条件进行恰当选择。
在本文中使用,术语“表达水平”同“水平”,是指本发明所述的环状RNA circACADM表达的绝对量或相对量,可以通过多种技术确定所述环状RNA circACADM的表达水平,特别地,可以通过使用本领域技术人员熟知的方法对本发明所述的环状RNA circACADM的绝对量或相对量进行检测。
在本文中使用,术语“治疗”,通常涉及治疗人类或动物(例如,被兽医所应用),其中可达到某些预期的治疗效果,例如,抑制病症的发展(包括降低病症发展速度、使病症发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途,也包括在术语“治疗”中。
在本文中使用,术语“预防”,是指由施用本发明第一方面中所述的环状RNAcircACADM和/或环状RNA circACADM表达促进剂和/或本发明第二方面所述的药物组合物时引起的肝癌疾病失调或状况的发展、复发、发作或散的完全或部分的抑制。
在本文中使用,术语“诊断”,是指基于与个体相关的一个或多个的症状、数据或其他信息,来对个体的健康状态或状况的发现、判断或认知。个体的健康状态可被诊断为健康的/正常的(即不存在疾病或疾患),或者可被诊断为不健康的/异常的(即存在疾病或疾患),术语诊断、早期诊断、进行诊断及这些术语的变化型包括与特定疾病或疾患(在本发明中具体指肝癌)相关的疾病/病症的早期发现;疾病的特性或分类;疾病的进展、治愈或复发的发现;个体的处置或治疗后对疾病的反应的发现,在本发明中,所述肝癌的诊断和/或辅助诊断包括对不患有肝癌的个体和患有肝癌的个体进行区分。
在本文中使用,术语“药物组合物”,可具有选自如下的任一种制剂:溶液剂、颗粒剂、悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、胶囊、乳剂、糖浆、灭菌水溶液剂、非水溶液剂、冻干制剂和栓剂。此外,所述药物组合物可以一次或多次施用。此时,可以以液体制剂、粉剂、气雾剂、胶囊或栓剂的形式施用所述药物组合物。在具体实施方案中,本发明提供的药物组合物可根据实际需要制成各种剂型,并可由临床医师根据受试者的种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其他本领域技术人员公知的任何合适的给药方式。
在本文中使用,术语“有效量”,是指具有治疗效果的量或在治疗对象中产生治疗效果所需要的量。例如,药物治疗上或药学上有效量是指产生需要的治疗效果所需要的药物的量,治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物研究和/或体外研究的结果来反映。药学上有效量取决于几个因素,包括但不限于:治疗对象的特征因素(如身高、体重、性别、年龄和用药史)、罹患疾病的严重程度等。
在本文中使用,术语“施用”,是指将存在于身体外部的物质(例如,本文描述的环状RNA circACADM、环状RNA circACADM表达促进剂和/或药物组合物)注射或物理上递送进入受试者的动作,例如,通过粘膜的、真皮内的、静脉内的、肌肉内的递送和/或本领域已知的任何其他物理递送的方法。当疾病、失调或状况,或其症状被治疗时,施用所述物质一般在疾病、失调或状况或其症状发作之后进行。当疾病、失调或状况,或其症状被预防时,施用所述物质一般在疾病、失调或状况或其症状发作之前进行。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
本发明所用的主要材料和试剂信息如下表1。
表1 主要材料和试剂
序号 | 试剂名称 | 生产公司 | 货号 |
1 | EasyScript® First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | 北京全式金生物 | AE301-02 |
2 | RNase R酶 | 上海碧云天生物技术有限公司 | R7092S |
3 | SuperReal 荧光定量预混试剂增强版(SYBR Green) | 天根生化科技(北京)有限公司 | FP205 |
4 | Cell Counting Kit-8 (CCK-8试剂盒) | 上海碧云天生物科技有限公司 | C0038 |
5 | BeyoClick™ EdU-555细胞增殖检测试剂盒 | 上海碧云天生物科技有限公司 | C0075S |
6 | 正常肝细胞L02 | 尚恩生物科技有限公司 | SNL-141 |
7 | 人肝癌细胞系HepG2 | 北纳生物科技有限公司 | BNCC338070 |
8 | 人高转移肝癌细胞HCCLM3 | 北纳生物科技有限公司 | BNCC338460 |
本发明中所述环状RNA circACADM(circBase ID: hsa_circ_0008129)来源于1号染色体上的ACADM基因12个外显子中的6、8、9、11号4个外显子,环化的核苷酸序列有477个碱基,目前尚未有任何circACADM和肝癌细胞功能相关的报道。
circACADM对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示,环状RNA的结构为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列转录后经剪接形成的首尾相连的环状结构。circACADM对应的RNA序列如SEQ ID NO:2所示,circACADM的结构为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列首尾连接而成的环状结构。
circACADM对应的cDNA序列(SEQ ID NO:1):
GCTTATTGTGTAACAGAACCTGGAGCAGGCTCTGATGTAGCTGGTATAAAGACCAAAGCAGAAAAGAAAGGAGATGAGTATATTATTAATGGTCAGAAGATGTGGATAACCAACGGAGGAAAAGCTAATTGGTATTTTTTATTGGCACGTTCTGATCCAGATCCTAAAGCTCCTGCTAATAAAGCCTTTACTGGATTCATTGTGGAAGCAGATACCCCAGGAATTCAGATTGGGAGAAAGGAATTAAACATGGGCCAGCGATGTTCAGATACTAGAGGAATTGTCTTCGAAGATGTGAAAGTGCCTAAAGAAAATGTTTTAATTGGTGACGGAGCTGGTTTCAAAGTTGCAATGGGAGCTTTTGATAAAACCAGACCTGTAGTAGCTGCTGGTGCTGTTGGATTAGCACAAAGAGCTTTGGATGAAGCTACCAAGTATGCCCTGGAAAGGAAAACTTTCGGAAAGCTACTTGTAGAG
circACADM对应的RNA序列(SEQ ID NO:2):
GCUUAUUGUGUAACAGAACCUGGAGCAGGCUCUGAUGUAGCUGGUAUAAAGACCAAAGCAGAAAAGAAAGGAGAUGAGUAUAUUAUUAAUGGUCAGAAGAUGUGGAUAACCAACGGAGGAAAAGCUAAUUGGUAUUUUUUAUUGGCACGUUCUGAUCCAGAUCCUAAAGCUCCUGCUAAUAAAGCCUUUACUGGAUUCAUUGUGGAAGCAGAUACCCCAGGAAUUCAGAUUGGGAGAAAGGAAUUAAACAUGGGCCAGCGAUGUUCAGAUACUAGAGGAAUUGUCUUCGAAGAUGUGAAAGUGCCUAAAGAAAAUGUUUUAAUUGGUGACGGAGCUGGUUUCAAAGUUGCAAUGGGAGCUUUUGAUAAAACCAGACCUGUAGUAGCUGCUGGUGCUGUUGGAUUAGCACAAAGAGCUUUGGAUGAAGCUACCAAGUAUGCCCUGGAAAGGAAAACUUUCGGAAAGCUACUUGUAGAG
实施例1 环状RNA的构建
本实施例中,发明人设计了能够扩增circACADM(circBase ID:hsa_circ_0008129)的特异性引物对,并利用该引物对扩增ACADM基因的环状RNA,通过一代测序的方法证实了环状RNA的拼接位点(backsplicing junction site),之后通过RNase R消化实验,确定了circACADM为表达为具有闭合环状结构的环状RNA分子。具体实验方法如下:
1、细胞总RNA提取及浓度测定
(1)待6孔板细胞超过90%时,弃掉旧的培养液,用PBS清洗一次后,每孔加入1mLTrizol,然后转移至1.5 mL EP管;
(2)将EP管在室温条件下放置10分钟,以便核酸蛋白复合物充分分离;
(3)在EP管内添加0.2mL氯仿,震荡大约10s,然后在室温条件下放置5min;氯仿是非极性分子,能有效抑制RNA酶活性,当加入Trizol的细胞溶液和氯仿混合时,蛋白质的水分子被氯仿去掉,使蛋白失去水和状态而变性,加速水相和有机相的分离;
(4)12000g,4℃离心15min,此时EP管溶液分为3层,底层为红色有机物,上层为无色水相,RNA存在于水相中;
(5)将上层液(约450mL)转移至新的EP管内,然后加入相同体积的异丙醇,室温条件下放置10min;异丙醇可吸收RNA周围水分,使其沉淀;
(6)12000g,4℃离心10min,离心后可在管底和管侧看到白色RNA沉淀物,弃掉上清液;
(7)将RNA沉淀用75%DEPC-乙醇溶液洗涤,7500g,4℃离心5min,弃掉上清液;
(8)将RNA沉淀置于生物安全柜中5min,晾干后加入20微升DEPC水溶解RNA,该步骤在冰上操作;
(9)用ScanDrop100超微量核酸测定仪检测细胞总RNA纯度和浓度。
2、cDNA逆转录
在冰上进行逆转录反应体系配制(以20μL体系为例),配制完成后加入已准备好的细胞总RNA进行逆转录,所述逆转录反应体系如表2所示。
表2 反应体系
逆转录反应条件如下:在37℃下反应15分钟,之后在85℃下反应5秒。降温至4℃后,将反应得到的cDNA稀释5倍,之后置于-20℃冰箱保存。
3、引物设计
利用Primer3.0在线工具设计引物,再用NCBI Blast进行验证。
引物的设计原则如下:(1)引物GC含量在50-60%;(2)引物长度为17-25bp;(3)引物Tm在57-63℃;(4)引物的位置避开目的序列的三级结构;(5)避免G或C碱基重复次;(6)避免引物末端碱基为A;(7)引物及产物避免形成二级结构;(8)产物长度在100-150bp之间;(9)产物避免有4个单碱基重复。
通过上述设计原则,共设计出引物5对,本实施例采用的引物对如下,所述引物对由北京睿博兴科公司合成:
F:5 '-ACTGATGATGTTGTAGGCCC-3 '(SEQ ID NO:3)
R:5 '-GCCAATGTCTTCTGTTAGGTTCAG-3 '(SEQ ID NO:4)
在一个或多个实施例中,也可采用上述引物对以外的其他引物对进行扩增。
4、一代测序
利用上述引物对扩增逆转录得到的cDNA后,对扩增产物进行一代测序。
5、RNase R消化实验
RNase R酶是一种能够消化线性RNA但对环状RNA几乎没有影响的RNA酶。
将1 μg细胞总RNA与3 U RNase R酶以10 μL的体积在37℃下孵育30分钟,之后升温至75℃并保持10分钟使RNase R酶失活,最后通过RT-qPCR分析是否添加RNase R对circACADM和mACADM的影响。
6、实验结果
circACADM的特征结构图和circACADM扩增产物拼接位点的一代测序结果图分别如图1和图2所示,circACADM源自ACADM基因的外显子,一代测序的结果证明circACADM存在反向剪切连接,且准确地显示了扩增产物的拼接位点,表明circACADM的形成不是由于基因组的重组错配。
RNase R对circACADM和mACADM的消化对比图如图3所示,线性的mACADM经Rnase R酶消化后表达显著降低,而circACADM耐受Rnase R酶的消化作用,证实其具有环状结构。
实施例2 circACADM在临床样本组织和细胞系中的表达检测
通过荧光定量PCR(QPCR)检测circACADM在12例临床患者的肝癌以及癌旁组织中的表达量,以及肝癌细胞系和对应正常肝细胞系中的表达差异,发现circACADM不仅在肝癌组织(Tumor)中的表达量明显低于癌旁组织(Normal),在肝癌细胞系中的表达量也明显低于正常肝细胞,表明circACADM能够用于肝癌诊断。具体实验方法如下:
1、细胞中总RNA提取及浓度测定
(1)在6孔细胞培养板中加入1mL Trizol裂解10min后收入1 .5mL EP管;
(2)将EP管在室温条件下放置约10分钟,以便核酸蛋白复合物能够充分分离;
(3)在EP管内添加0 .2mL 的氯仿,震荡大约10s,然后在室温条件下放置5min;
(4)12000g,4℃离心15min,此时EP管溶液分为3层,底层为红色有机物,上层为无色水相,RNA存在于水相中;
(5)将上层液(约450mL)转移至新的EP管内,然后加入相同体积的异丙醇,室温条件下放置10min;
(6)12000g,4℃离心10min,离心后可在管底和管侧看到白色RNA沉淀物,弃掉上清液;
(7)将RNA沉淀用75%DEPC-乙醇溶液洗涤,7500g,4℃离心5min,弃掉上清液;
(8)将RNA沉淀置于生物安全柜中5min,晾干后加入20μL DEPC水溶解RNA,该步骤在冰上操作;
(9)用ScanDrop100超微量核酸测定仪检测RNA纯度和浓度。
2、QPCR扩增实验
采用实施例1中的cDNA逆转录方法进行组织RNA逆转录。
在冰上进行PCR反应体系配制(以20μL体系为例),配制完成后再加入已逆转录得到的cDNA模板。其中,PCR反应体系如表3所示:
表3 PCR反应体系
用于扩增环状RNA circACADM的引物对采用实施例1中如SEQ ID NO:3-SEQ IDNO:4所示的引物对:
F:5 '-ACTGATGATGTTGTAGGCCC-3 '(SEQ ID NO:3)
R:5 '-GCCAATGTCTTCTGTTAGGTTCAG-3 '(SEQ ID NO:4)
反应条件包括:
第一步,预变性,95℃,5分钟;
第二步,PCR反应(40个循环),95℃,20秒;60℃,20秒;72℃,20秒。
第三步,融解曲线分析,65℃,5秒;95℃,5秒。
PCR扩增后进行定量分析。目标基因的相对表达量计算公式为:2-△△Ct=2-【(△Ct)Test-(△Ct)Control】。其中,△Ct=Ct目的-Ct管家,Ct目的为目标基因Ct值,Ct管家为管家基因Ct值,△Ct表示各样本目的基因相对管家基因的相Ct值,△△Ct=(△Ct)Test-(△Ct)Control,表示处理组相对对照组进行归一化,2-△△Ct表示处理组相对对照组的相对表达量,表示目标基因相对表达倍数。
3、实验结果
上述QPCR实验结果如图4和5所示,circACADM在肝癌组织(Tumor)中的表达量明显低于癌旁组织(Normal),并且在肝癌细胞HepG2和HCCLM3中的表达显著低于正常肝细胞L02,表明circACADM在肝癌发生发展中有重要意义,可以作为肝细胞癌患者的理想预后标志物,并能够在肝癌诊断中产生积极作用。
实施例3 过表达circACADM对肝癌细胞增殖、侵袭和转移的影响
将circACADM和随机序列vector构建到专用过表达环状RNA的pCDNA3.1载体上,在HepG2细胞上转染pCDNA3.1-circACADM和pCDNA3.1-vector作为处理组和对照组,通过CCK8细胞活性检测circACADM过表达对肝癌细胞的活性的影响,通过EDU细胞增殖实验检测circACADM过表达对肝癌细胞增殖能力的影响,通过细胞划痕实验考察circACADM过表达对肝癌细胞迁移与侵袭能力的影响,通过克隆形成实验考察circACADM过表达对肝癌细胞成瘤能力的影响。
1、CCK-8细胞活性检测实验
活细胞线粒体中的脱氢酶可以与WST-8化合物相互反应,最终将其还原成亲水溶性甲瓒染料,溶解后呈黄色,生成的黄色甲瓒数量与活细胞的数量呈正相关,也即活细胞数量越多,溶液的黄色程度越高,因此利用这一特征进行细胞增殖检测。
(1)在96孔板中每孔接种10000的HepG2细胞,待培养12h细胞贴壁后分别转染pCDNA3.1-circACADM和pCDNA3.1-vector作为处理组和对照组;
(2)于48h在对应区域孔中加入10μL的CCK-8试剂;
(3)放置到37℃,5%CO2的恒温培养箱进行培养,时间约为2小时;
(4)最后用酶标仪在450nm处测定吸光值。
2、EDU细胞增殖检测实验
细胞增殖检测试剂盒(BeyoClick™ EdU Cell Proliferation Kit with AlexaFluor 555)(购自于上海碧云天生物科技有限公司),是一种基于DNA合成过程中胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine)类似物EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)的掺入,并通过随后的点击反应(Click reaction)使EdU被Alexa Fluor 555所标记,从而实现简单、快速、高灵敏地检测细胞增殖的试剂盒。
(1)将30万癌细胞接种于6孔板中,待培养12h细胞贴壁后分别转染pCDNA3.1-circACADM和pCDNA3.1-vector作为处理组和对照组;
(2)培养48h后弃去培养基,加入PBS洗涤三遍后,加入1mL 4%的多聚甲醛室温固定10min;
(3)弃去4%的多聚甲醛,加入PBS洗涤三遍后,加入1mL 0.1%的triton X-100室温孵育10min;
(4)弃去0.1%的triton X-100溶液,加入PBS洗涤三遍后,利用上述BeyoClick™EdU-555细胞增殖检测试剂盒进行检测。
3、细胞划痕实验
(1)在24孔细胞培养板划线,首先用马克笔在24孔板的背部进行划线,每孔划3-5条线,随后接种6万HepG2细胞,待培养12h细胞贴壁后分别转染pCDNA3.1-circACADM和pCDNA3.1-vector作为处理组和对照组;
(2)转染六个小时后利用200ul的黄色枪头在培养孔正中间划一道竖痕,随后利用PBS清洗一遍,加入新鲜培养基在镜下拍照记为0h;
(3)在48h利用PBS清洗一遍后进行拍照记为48h;
(4)利用Image J处理图片计算划痕愈合率。
4.克隆形成实验
(1)于6孔板培养板中各实验组接种1000个细胞/孔,待培养12h细胞贴壁后分别转染pCDNA3.1-circACADM和pCDNA3.1-vector作为处理组和对照组;
(2)继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止,中途每隔3天进行换液并观察细胞状态;
(3)克隆完成后,在显微镜下对细胞进行拍照,然后PBS洗涤1次,每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min,PBS洗涤1次;
(4)每孔加入结晶紫染液1mL,染细胞10-20 min;
(5)PBS洗涤细胞数次,晾干,数码相机拍照(分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照);
(6)利用Image J处理图片计算克隆形成的细胞数量。
5、实验结果
CCK-8细胞活性检测的实验结果如图6所示,在circACADM过表达后,肝癌细胞的细胞活力到明显抑制,肝癌细胞的活性明显减弱。
EDU细胞增殖检测的实验结果如图7所示,在circACADM过表达后,肝癌细胞的细胞增殖能力受到明显抑制,肝癌细胞分裂能力明显减弱。
细胞划痕实验的实验结果如图8A和8B所示,过表达circACADM的肝癌细胞系相较于空载体的对照组肝癌细胞系,肝癌细胞的迁移与侵袭能力受到明显抑制。
克隆形成实验的实验结果如图9A和图9B所示,过表达circACADM的细胞株相较于空载体的对照组细胞株,肝癌细胞的成瘤能力受到明显抑制。
以上实验表明,circACADM基因及其表达产物能够应用于肝癌的治疗。
实施例4 过表达circACADM对NCG小鼠体内肝癌细胞增殖的影响
1、实验方法
本实施例采用6周的雄性NCG小鼠进行实验,NCG小鼠均购自北京维通利华实验动物有限公司。
将对数期生长的HepG2细胞利用胰酶消化后,300g离心5min进行细胞计数,将细胞以107个/100 μL的密度重悬在无血清DMEM培养基中,在NCG小鼠左腋皮下按100μL/只的体积进行注射,7天后检测瘤体大小,当瘤体体积超过100mm3后,进行后续实验。
筛选符合标准的成瘤NCG小鼠作为评价模型,进行NCG小鼠皮下瘤瘤内注射pCDNA3.1-vector和pCDNA3.1-circACADM过表达纳米颗粒,每周测量一次肿瘤体积(V=1/2×a×b2,a为长轴,b为短轴),游标卡尺测量肿瘤最长和最短部位,绘制肿瘤体积增长曲线。
2、实验结果
实验结果如图10A和图10B所示,导入过表达circACADM的circACADM组肿瘤体积明显缩小(见图10A)。从皮下注射肿瘤细胞系开始计算,第28天处死NCG小鼠,取出肿瘤后拍照,并绘制裸鼠皮下肿瘤体积增长曲线,结果显示,过表达circACADM的pCDNA3.1-circACADM组的肿瘤体积明显小于对照组pCDNA3.1-Vector的肿瘤体积(见图10B)。
以上实验说明,过表达circACADM能明显抑制肝癌细胞在NCG小鼠皮下的成瘤能力,也即circACADM及其表达产物能够有效应用于肝癌的治疗中。
Claims (10)
1.环状RNA circACADM表达促进剂在制备用于治疗和/或预防肝癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述环状RNA circACADM的circBase ID为hsa_circ_0008129。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述环状RNA circACADM对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示;
所述环状RNA circACADM对应的RNA序列如SEQ ID NO:2所示;
所述环状RNA circACADM为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列转录后经剪接形成的首尾相连的环状结构;
所述环状RNA circACADM为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列首尾连接而成的环状结构。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述环状RNA circACADM表达促进剂包括能够促进环状RNA circACADM表达的天然纯化物质、经修饰的天然纯化物质、半合成物质、化学合成物质和/或其任意组合。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述环状RNA circACADM表达促进剂包括环状RNA circACADM、含有环状RNA circACADM的重组载体、含有环状RNA circACADM的纳米颗粒、含有环状RNA circACADM的蛋白微球、含有环状RNA circACADM的脂质体、含有环状RNA circACADM的PEG修饰蛋白、含有环状RNA circACADM的细胞外囊泡和/或其任意组合。
6.一种用于治疗和/或预防肝癌的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含权利要求1-5中任一项中所述的环状RNA circACADM表达促进剂。
7.环状RNA circACADM作为诊断标志物在制备用于诊断和/或评估肝癌试剂中的应用,其特征在于,所述环状RNA circACADM为权利要求1-5中任一项中所述的环状RNAcircACADM。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述试剂包括特异性扩增环状RNAcircACADM的引物和/或特异性识别环状RNA circACADM的探针;
所述特异性扩增环状RNA circACADM的引物的序列如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4所示。
9.一种用于诊断肝癌的产品,其特征在于,所述产品包含权利要求7或8中所述的试剂;
所述产品包括试剂盒、芯片和/或试纸条;
所述产品通过检测环状RNA circACADM在待测样本中的表达水平诊断肝癌。
10.一种体外非治疗目的地抑制肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞迁移、抑制肝癌细胞侵袭和/或抑制肝癌组织形成的方法,所述方法包括如下步骤:在有需要的体系中加入有效量的权利要求1-5中任一项中所述的环状RNA circACADM表达促进剂。
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