CN101314794A

CN101314794A - 口腔鳞状细胞癌的检测方法及抑制方法

Info

Publication number: CN101314794A
Application number: CNA2008101086663A
Authority: CN
Inventors: 稻泽让治; 井本逸势; 铃木江美奈
Original assignee: Fujifilm Corp; Tokyo Medical and Dental University NUC
Current assignee: Fujifilm Corp; Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority date: 2007-05-30
Filing date: 2008-05-30
Publication date: 2008-12-03
Also published as: US20090011950A1; JP2008295327A; EP1997911A2; EP1997911A3

Abstract

本发明通过以口腔鳞状细胞癌中基因组结构的变化为指标来提供一种检测包括恶性程度在内的口腔鳞状细胞癌的方法。本发明发现以口腔鳞状细胞癌的基因组结构变化为指标，可以检测包括恶性程度在内的口腔鳞状细胞癌。另外本发明还发现，在口腔鳞状细胞癌中，通过使失活的基因恢复，可以抑制口腔鳞状细胞癌的增殖。

Description

口腔鳞状细胞癌的检测方法及抑制方法

技术领域

本发明涉及一种以通过观察口腔鳞状细胞癌的基因型对口腔鳞状细胞癌进行初期诊断为目的、通过检测特定染色体区域中存在的基因的变化来检测癌症的方法。

背景技术

口腔鳞状细胞癌(oral squamous-cell carcinoma(OSCC))分类属于头颈癌，是主要发生于口腔粘膜上皮等部位的肿瘤。在头颈癌中口腔鳞状细胞癌的发生率高达35％左右，在全世界每年对27万人造成影响(Parkin，DM.，et al.，CA Cancer J Clin.55，74-108，2002)。口腔鳞状细胞癌的发病部位以舌部最多，其次以牙龈(牙床)为多。此外，在颊粘膜、颚、口底等其它的口腔粘膜、以及颚骨、唾液腺上也有发生。

近年来，尽管用于口腔鳞状细胞癌的诊断和治疗的方法一直在发展，但是其预后没有得到改善。为此，期望找到口腔鳞状细胞癌的致病基因并阐明其功能，从而建立起一种用于有效的治疗方法和进行化学预防的新型战略性见解。

[非专利文件1]Parkin，DM.，et al.，CA Cancer J Clin.55，74-108，2002

发明内容

发明所要解决的问题

如果能够阐明来源于口腔、主要是来源于口腔上皮的细胞发生癌化时在基因水平上的机制，就能够在基因水平上发现来源于口腔的细胞发生癌化、对口腔鳞状细胞癌的恶性程度进行诊断以及对口腔鳞状细胞癌的发展进行控制，进一步，就应该能够根据该机制来筛选、开发药物或确立治疗的方法。具体来说，可以认为，通过鉴定出在口腔鳞状细胞癌中显示特征性行为的基因，并以该基因为中心进行技术上的研究，从而可以解决上述课题。即，本发明要解决的问题是：鉴定出在口腔鳞状细胞癌等癌症中显示特征性行为的基因，从而提供一种癌症的检测方法及细胞增殖抑制剂。

解决问题的手段

比较基因组杂交技术(Comparative Genomic Hybridization(CGH))是一种可用于解析伴随基因组中多个基因的扩增或缺失、或者基因失活所致的基因异常的简便、迅速、最佳方法。因此，为了解析与癌化和癌症恶化等有关的基因组上的基因异常，本发明人对在CGH阵列上载有的800种或4500种BAC/PAC DNA进行CGH阵列分析(MCG Cancer Array-800、MCG Whole Genome-4500；Takada H.，et al.，Cancer Sci.96，100-105，2005；Inazawa J.，et al.，Cancer Sci.95，559-563，2004)，成功地鉴定出了与促进源自口腔的细胞癌化有关的癌基因，即，成功地鉴定了含有1的磷酸核糖基转移酶结构域(Phosphoribosyl transferase domain containing 1(PRTFDC1))基因。然后，又成功地发现，PRTFDC1基因的缺失或者失活，即PRTFDC1蛋白质的减少会显著地促进口腔鳞状细胞癌的增殖，而且，如果使PRTFDC1基因的转录产物或蛋白质增加，口腔鳞状细胞癌的增殖会显著地降低，由此完成了本发明。

即，根据本发明，提供一种癌症的检测方法，该方法通过检测存在于样本的染色体区域1q21、2q24.1-q24.2、3p13、7p11.2、10p12.1、11p15.4、11p15.2、11p13.3、11q22、11q23.3、12p13、12q24.31、13q33.3-q34、12q24.1、19q13、或22q12.1中的基因发生的至少一种变化，来检测样本的癌化，包括其恶性程度。

优选的是，所述基因为BCL9、MITF、EGFR、PTH、BCL1、FGF4、CCND1、FGF3、PGR、YAP1、CIAP1、MMP7、MMP1、CCND2、FGF6、BCL7A、DP1、GAS6、SUPT5H、PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2中的至少一个。

优选的是，所述基因的变化为基因扩增、缺失和失活中的至少一种。

优选的是，所述基因的变化是由CpG岛的甲基化而引起的失活。

本发明的方法是一种癌症检测方法，其通过检测BCL9、MITF、EGFR、PTH、BCL1、FGF4、CCND1、FGF3、PGR、YAP1、CIAP1、MMP7、MMP1、CCND2、FGF6、BCL7A、DP1、GAS6、或SUPT5H基因的扩增、或者PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的缺失来检测样本的癌化，包括检测样本的癌化的恶性程度。

优选的是，通过检测PRTFDC1基因的缺失或失活来检测样本的癌化，包括检测样本的癌化的恶性程度。

优选的是，所述样本为源自口腔的组织。

优选的是，所述癌症为口腔鳞状细胞癌。

优选的是，采用DNA芯片法、Southern印迹法、Northern印迹法、实时RT-PCR法、FISH法、CGH法、或阵列CGH法、亚硫酸氢盐测序法、COBRA法对所述基因的变化进行检测。

本发明进一步还提供一种抑制细胞增殖的方法，该方法包括将PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因、或者将作为该基因的表达产物的蛋白质，在体外导入到细胞中。

本发明进一步还提供一种细胞增殖抑制剂，其含有PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因、或者作为该基因的表达产物的蛋白质。

本发明进一步还提供一种激活细胞增殖的方法，其包括将PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或功能缺失型基因在体外导入到肿瘤细胞中。

本发明进一步还提供一种细胞增殖激活剂，其含有PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或功能缺失型基因。

本发明进一步还提供一种物质的筛选方法，其为：针对由于其中的PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的CpG岛发生甲基化而导致基因表达被抑制的口腔鳞状细胞癌，使该口腔鳞状细胞癌与待测物质接触以检测所述基因的表达，当与未接触待测物质的体系相比较，发现所述基因的表达增加时，可将该待测物质筛选为可以通过将所述基因的CpG岛脱甲基化而使该基因活化的抗肿瘤物质。

发明效果

根据本发明，可以切实地把握来源于口腔的细胞样本是否发生癌化及其恶性程度。而且，在口腔鳞状细胞癌中，通过导入基因表达失活的PRTFDC1基因的转录产物，从而可以抑制口腔鳞状细胞癌的增殖。而且，可以对作为由于PRTFDC1基因表达失活而引发的口腔鳞状细胞癌的治疗剂进行筛选。

附图说明

在图1中，(a)表示18种口腔鳞状细胞癌细胞株经MCG CancerArray-800确定的拷贝数的扩增与缺失在全部基因组中的频率。克隆基于UCSC作图位置(http://genome.ucsc.edu/[version May，2004])按照1-22、X、Y染色体的顺序进行排列。星号表示确认有高水平扩增(log₂比值＞2)、或有纯合缺失(log₂比值＜-2)的区域。图1中的(b)表示HSC-6细胞株在CGH阵列中的代表性结果。另外，在10p12染色体中的RP11-165A20、80K21、66P13(箭头)显示出明显的拷贝数降低(log₂比值＜-2)。图1中的(c)表示HSC-6细胞株中10号染色体的拷贝数情况的结果。箭头表示10p12染色体区域的候选克隆。

图2中(a)显示HSC-6细胞株的10p12染色体纯合缺失区域的图谱。点样于阵列中的BAC用水平线表示。白线为log₂比值＜-2的BAC、黑线为log₂比值＞-2的BAC。HSC-6细胞株中纯合缺失的最小范围由基因组PCR确定，用白色双箭头表示。用白或黑线表示经基因组PCR确定的HSC-6细胞株中位于纯合缺失区域周围的8个基因、纯合缺失(6个基因)或残留基因(2个基因)。图2中的(b)表示的是18种口腔鳞状细胞癌细胞株中位于10p12染色体纯合缺失区域周围的8个基因与GAPDH基因(对照)的基因组PCR结果。在图2中，(c)表示的是通过RT-PCR确定口腔鳞状细胞癌细胞株、正常口腔上皮细胞株RT7与正常口腔上皮原代细胞中的PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、GAF2基因的表达。DW表示蒸馏水，箭头表示图2b所示的纯合缺失细胞株(HSC-6)。在18种细胞株中，无PRTFDC1基因纯合缺失的8种细胞株(OM-1、OM-2、NA、ZA、Ca9-22、HSC-2、HSC-3、KON)显示完全的基因沉默，1种细胞株(HOC-313)同正常的对照相比显示出表达降低。在图2中，(d)表示的是用5-aza-dCyd(5μM或10μM)处理5天和/或用TSA(100ng/ml)处理24小时(经处理的为+、未经处理的为-)后的口腔鳞状细胞癌细胞株(NA、HSC-2、ZA)中PRTFDC1基因的RT-PCR的分析结果。

图3中(a)表示的是PRTFDC1基因外显子1周围的801-bp的CpG岛(从-373至+418)的图。CpG部位用竖线表示。外显子1用空白窗口表示，转录起始点标记为+1。启动子分析中所使用的片段(片段1、2、3)用粗黑线表示。COBRA和亚硫酸氢盐测序(区域1和区域2)所确定的区域用空白条(open bar)表示。用于COBRA法的限制酶部位MluI和TaqI用黑色或灰色箭头表示。图3中的(b)表示的是PRTFDC1基因的CpG岛的启动子活性。构建了pGL3空载体(mock)和包含CpG岛区域1-3不同序列的报告基因质粒。将这些构建体与内部对照载体(pRL-hTK)同时转化到NA和HSC-2细胞中。相对于对照物，将荧光素酶活性标准化。数据表示的是3个独立试验的平均值±SD。图3中的(c)表示的是将口腔鳞状细胞癌细胞株中的PRTFDC1区域1与区域2用MluI和TaqI分别消化以后的COBRA的代表性结果。箭头表示在甲基化的CpG识别位点处切断的片段。箭头表示未被切断(非甲基化)的片段。切断的DNA片段为阳性的8种细胞用星号表示。图3中(d)表示的是表达PRTFDC1的细胞和未表达PRTFDC1的细胞(-)中所确认的PRTFDC1区域1(62CpG位点)和区域2((33CpG位点)的亚硫酸氢盐测序的代表性结果。各白色和黑色的方块分别表示非甲基化和甲基化的CpG部位。每列来自一种克隆。NT表示未做测试。

图4(a)表示的是47例口腔鳞状细胞癌临床样本中的12例、阳性对照(HSC-2)、阴性对照(HO-1-N1)细胞株中PRTFDC1基因区域1和区域2的COBRA的代表性结果。确定有切断的DNA片段(箭头)的原发口腔鳞状细胞癌用星号表示。图4中(b)表示的是亚硫酸氢盐测序确定的口腔鳞状细胞癌的4种原代细胞中的PRTFDC1基因区域1和区域2的甲基化状态。

图5表示的是口腔鳞状细胞癌增殖中的PRTFDC1基因表达的效果。将pCMV-3Tag4-PRTFDC1或pCMV-3Tag4-mock转化到PRTFDC1基因缺失的细胞株(NA和OM-2)中。图5中的(a)表示的是用从转化后48小时的细胞中所提取的蛋白质5μg，采用抗Myc抗体进行Western印迹分析。图5中的(b)表示的是对不表达PRTFDC1基因的细胞株(NA和OM-2)进行菌落形成分析。向这些细胞中瞬时地转化包含PRTFDC1基因的Myc标签载体(pCMV-3Tag4-PRTFDC1)或者空载体(pCMV-3Tag4-mock)。在G418的存在下进行药物筛选3周。图5(b)中左侧表示的是转化3周后形成耐药性菌落的结果。转化有PRTFDC1基因的细胞所形成的菌落比转化有空载体的细胞要少；右侧表示的是对菌落形成的定量分析，计数＞2mm的菌落个数，其结果用三个独立试验的平均值±SD来表示。

具体实施方式

下面进一步详细说明本发明。

(1)癌症的检测方法

本发明的癌症检测方法的特征在于，通过存在于检测样本的染色体区域1q21、2q24.1-q24.2、3p13、7p11.2、10p12.1、11p15.4、11p15.2、11p13.3、11q22、11q23.3、12p13、12q24.31、13q33.3-q34、12q24.1、19q13、22q12.1中的基因发生的至少一种变化，来检测样本的包括恶性程度的癌化。更具体来说，通过检测样本中的BCL9、MITF、EGFR、PTH、BCL1、FGF4、CCND1、FGF3、PGR、YAP1、CIAP1、MMP7、MMP1、CCND2、FGF6、BCL7A、DP1、GAS6、或SUPT5H基因的扩增、或者PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的缺失来检测样本的癌化，包括检测样本的癌化的恶性程度。特别优选的是，通过检测来源于口腔的细胞中的PRTFDC1基因的缺失或失活，可以检测出来源于口腔的细胞的包括恶性程度在内的癌化。

根据人基因组计划的成果，PRTFDC1基因的转录产物是已知的，该基因为存在于10p12染色体区域中的一个基因。虽然已知PRTFDC1基因的编码蛋白为一种具有磷酸核糖基转移酶结构域的蛋白质，但其详细的功能尚不明。还未发现该PRTFDC1基因是一种重要的与口腔鳞状细胞癌的发病或恶性程度相关的癌相关基因。

如上所述，本检测方法的特征在于，对来源于口腔的细胞或口腔鳞状细胞癌中的PRTFDC1基因的缺失或失活进行检测。

作为检测PRTFDC1基因的缺失或失活的对象的来源于口腔的细胞或口腔鳞状细胞癌，最好是样本提供者的活检组织细胞。

该样本组织细胞无论是来源于健康人口腔的细胞还是口腔鳞状细胞癌患者的癌组织，实际上，主要的受检对象都是这样的组织：根据检查等的结果发现口腔粘膜或舌、牙龈等中存在有疑似癌化的病变部位时的病变组织；或者为已经确诊为口腔鳞状细胞癌，但需要判定其恶性程度和进展程度的口腔鳞状细胞癌的组织等。

根据本检测方法，在“根据检查等的结果发现口腔中存在有疑似癌化的病变部位时的病变组织”中确认PRTFDC1存在基因缺失或失活的情况下，如果判定该病变组织正在进行癌化，或者已经处于癌化状态、并且恶性程度在持续增加，提示需要及早地进行正式治疗(通过手术等切除病变部位、正式的化学疗法等)。另外，在“已经确诊为口腔鳞状细胞癌，但需要判定其恶性程度和进展程度的口腔鳞状细胞癌的组织”中确认存在PRTFDC1基因的缺失或失活的情况下，如果判定癌组织的恶性程度在持续增加，也提示需要及早地进行正式治疗(通过手术等切除病变部位、正式的化学疗法等)。作为样本而采集的口腔鳞状细胞癌组织经过必要的处理(例如，由所采集的细胞来制备DNA或RNA)后可以用作进行本检测方法的对象。

(2)PRTFDC1基因缺失的检测

作为可直接进行PRTFDC1基因缺失检测的代表性方法，可以列举CGH(比较基因组杂交，comparative Genomic Hybridization)法、FISH(荧光原位杂交，Fluorescence In Situ Hybridization)法。该实施方案中的本检测方法为这样的方法：对具有PRTFDC1基因的BAC(细菌人工染色体，Bacterial Artificial Chromosome)DNA、YAC(酵母人工染色体，Yeast Artificial Chromosome)DNA、PAC(P1衍生的人工染色体，P1-derived Artificial Chromosome)DNA(下面也称为BAC DNA等)进行标记后，进行FISH检测，即可以检测出是否存在PRTFDC1基因(即，PRTFDC1基因是否缺失)。具体来说，作为含有PRTFDC1基因的BAC DNA，可以列举RP11-165A20等。

采用固定有基因组DNA的基质来进行上述实施方案中的方法是合适的，而且在现实中也是这样进行的。

通过制造多个基因组DNA的固定基质来实用化时，由于通常所得到的BAC DNA的量很少，所以就需要将该DNA作为基因扩增产物而获得(该基因扩增过程也称为“无穷化”)。在该无穷化过程中，首先将BAC DNA等用识别4碱基的酶(例如RsaI、DpnI、HaeIII)等消化以后，加入连接物进行连接。连接物为由10-30个碱基、合适的是由15-25个碱基组成的寡核苷酸，具有2条互补序列的链，退火以后，形成平滑末端一侧的3′末端的寡核苷酸需要磷酸化。接下来，采用与连接物一方的寡核苷酸具有相同序列的引物，通过PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)法进行扩增，即可以实现无穷化。另一方面，可以将各BAC DNA等中的特征性的50-70个碱基的氨基化寡核苷酸作为检测用探针。

这样，通过将无穷化的BAC DNA等固定于基质上、特别合适的是固定于固体基质上，即可以制备出所希望的DNA固定化基质。所述固体基质优选为玻璃板。玻璃等固体基质更优选通过聚-L-赖氨酸、氨基硅烷、金·铝等的沉积将该基质进行包被。

点接于基质上的上述无穷化的DNA的浓度优选为10pg/μl～5μg/μl，更优选为1ng/μl～200ng/μl。点接量优选为1nl～1μl，更优选为10nl～100nl。另外，对固定于基质上的各个点的大小和形状不特别限定，例如，大小可以为直径0.01mm～1mm，从上面看的形状可以为圆形至椭圆形。对干燥点的厚度也不特别限定，为1μm至100μm。进一步，点的个数不特别限定，每个使用的基质上为10个～50,000个点，更优选为100个～5,000个点。虽然各个DNA的点接次数在一次至四次的范围内，但优选两次重复或三次重复点接。

干燥点的制备(例如)可以通过采用点样仪将无穷化的BACDNA等滴接于基质上，形成多个点以后，将点干燥而制得。点样仪可以使用喷墨式打印机、针式阵列打印机、双喷射式(注册商标)打印机，优选使用喷墨式打印机。例如，可以使用GENESHOT(日本名古屋市的ガイシ株式会社生产)等。

这样，通过将无穷化的BAC DNA等固定于基质上，特别合适的是固定于固体基质上，即可以制备出所希望的DNA固定化基质。

另外，作为直接检测该PRTFDC 1基因缺失的手段之一，可以列举Southern印迹法。Southern印迹法是将从样本得到的基因组DNA分离并固定，通过检测该基因组DNA与PRTFDC1基因的杂交来检测样本中该基因存在的方法。

而且，也可以通过Northern印迹法、实时RT-PCR法进行PRTFDC1基因的缺失检测。Northern印迹是一种将由样本中获得的mRNA分离、固定，通过检测该mRNA与PRTFDC1基因的杂交、从而检测该样本中该基因的mRNA存在的一种方法。实时RT-PCR法是通过逆转录反应和聚合酶链式反应进行目标基因扩增、并实时进行测定的一种方法，根据扩增倍率即可以对作为模板的mRNA进行定量。该定量可以采用荧光色素来进行，有两种方法。即：采用在双链DNA中特异性插入(intercalate)发出荧光的色素(例如，SYBR绿)的方法，以及采用使荧光色素结合在扩增的DNA序列中的特异性寡核苷酸上的探针的方法。

(3)PRTFDC1基因失活的检测

已有报道，当富含CpG的启动子和外显子区域发生密集甲基化时就会发生转录失活(Bird A.P.，et al.，Cell，99，451-454，1999)。在癌细胞中，与其它区域相比，CpG岛存在高频率的且密集的甲基化，启动子区域的超甲基化(hypermethylation)与癌症中的癌抑制基因的失活紧密相关(Ehrlich M.，et al.，Oncogene，21，6694-6702，2002)。

如后所述，实际上，PRTFDC1基因的外显子中存在的CpG岛具有启动子活性，而且，该CpG岛甲基化的程度与一部分口腔鳞状细胞癌中的PRTFDC1基因的表达抑制强烈相关。

而且，通过在作为脱甲基化试剂的5-氮脱氧胞嘧啶(5-aza-dCyd)的存在下培养口腔鳞状细胞癌，可以使CpG岛脱甲基化，其结果是，可以使PRTFDC1基因的表达恢复。根据这些结果可以判断，CpG岛的高频率甲基化(hypermethylation)是高频率地引发口腔鳞状细胞癌中的癌抑制基因表达抑制的原因之一。

通过上述检测方法，对于被判断为PRTFDC1基因表达量减少的样本细胞(来源于癌组织的原发癌细胞)，使该细胞与脱甲基化试剂(5-氮脱氧胞嘧啶)发生作用，从而使基因的表达量恢复。即，在使脱甲基化试剂与样本细胞发生作用、从而使基因的表达量恢复的情况中，样本细胞中的基因受到抑制的主要原因为CpG岛的甲基化，所以通过对样本提供者给予具有脱甲基化作用的药物，预期可获得相应的抗肿瘤效果。

(4)细胞增殖的抑制方法以及细胞增殖抑制剂

本发明进一步提供一种抑制细胞增殖的方法，该方法包括将PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因、或将作为该基因的表达产物的蛋白质在体外导入细胞中。并且，本发明还提供一种含有上述基因或蛋白质的细胞增殖抑制剂。

在处理PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因时，其可以是本领域技术人员采用公知的技术从培养细胞等中获得的cDNA，也可以是采用PCR法等通过酶学方法而合成的DNA。在采用PCR法获得DNA时，使用人染色体DNA或cDNA库作为模板，使用经设计的引物进行PCR扩增，以使得目标碱基序列可以得到扩增。PCR扩增得到的DNA片段可以被克隆到适当的载体中，其中该载体在大肠杆菌等宿主中能够增殖。

PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的检测探针或引物的制备、以及目标基因的克隆等操作对于本领域技术人员来说均是已知的，例如，可以参照1989年冷泉港实验室(冷泉港，纽约)编著的“Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版)”，或John Wiley & Sons(1987～1997)年出版的“CurrentProtocols in Molecular Biology，Supplement 1～38”等记载的方法进行制备。

PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因可以重组入载体中以重组载体的形式使用。载体为病毒载体或动物细胞表达用载体，优选使用病毒载体。作为病毒载体，可以列举逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体、牛痘病毒载体、慢病毒载体等。其中，由于逆转录病毒载体在感染细胞以后病毒基因组整合进入宿主染色体内，从而可以使整合进入载体内的外源基因能够稳定、长期地表达，所以特别优选使用逆转录病毒载体。

动物细胞表达用载体例如可以采用pCXN2(Gene，1991年第108卷第193-200页)、PAGE207(日本特开平6-46841号公报)或其变体等。

将上述重组载体导入到适当的宿主中进行转化，对得到的转化体进行培养即可以进行生产。当重组载体为病毒载体时，导入该载体的宿主可以采用具有产生病毒能力的细胞，例如，COS-7细胞、CHO细胞、BALB/3T3细胞、HeLa细胞等。逆转录病毒载体的宿主可以使用ΨCRE、ΨCRIP、MLV等；腺病毒载体及腺相关病毒载体的宿主可以是来源于人胎儿肾脏的293细胞等。可以采用磷酸钙法等将病毒载体导入到动物细胞内。而重组载体为动物细胞表达用载体时，导入该载体的宿主可以使用大肠杆菌K12菌株、HB101菌株、DH5α菌株等，大肠杆菌的转化是本领域技术人员公知的。

所得到的转化体分别在合适的培养基、培养条件下培养。例如，大肠杆菌转化体的培养可以使用含有生长发育所必需的碳源、氮源、无机物以及其它物质的pH5～8左右的液体培养基来进行培养。通常在15～43℃下培养约8～24小时左右。此时，在培养结束以后，目的重组载体可以通过通常的DNA分离纯化方法制得。

此外，动物细胞转化体的培养例如可以使用含有约5～20％胎牛血清的199培养基、MEM培养基、DMEM培养基等进行培养。培养基的pH优选为约6～8。通常在30～40℃下培养约18～60小时。此时，由于含有该载体的病毒粒子释放于培养上清中，所以可以通过氯化铯离心法、聚乙二醇沉淀法、过滤浓缩法等对病毒粒子进行浓缩和纯化而获得目的重组载体。

本发明的细胞增殖抑制剂可以通过将作为有效成分的上述基因与基因治疗剂中通常使用的基剂一起配合而制得。而且，当将上述基因重组整合进入病毒载体中时，制备含有重组载体的病毒粒子，将其与基因治疗剂中通常使用的基剂一起配合。

为了配制作为有效成分的上述基因或蛋白质，所使用的基剂可以使用通常注射液中使用的基剂，例如，蒸馏水、氯化钠或氯化钠与无机盐的混合物等的盐溶液、甘露醇、乳糖、葡聚糖、葡萄糖等的溶液、甘氨酸、精氨酸等氨基酸溶液、有机酸溶液或盐溶液与葡萄糖溶液的混合溶液等。或者，根据本领域技术人员公知的常用方法，也可以在这些基剂中使用渗透压调节剂、pH调节剂、植物油、表面活性剂等佐剂，以溶液、悬浊液、分散液的形式配制为注射剂。这些注射剂可以通过粉末化、冻干等操作制备为用时溶解的制剂。

本发明的细胞增殖抑制剂的给药形式可以是通常的静脉内、动脉内等的全身给药方式，或者也可以是局部注射或经口给药等局部给药方式。此外，当细胞增殖抑制剂在给药时，也可以采用与插管技术、基因导入技术、或者外科手术等的组合给药形式。

本发明的细胞增殖抑制剂的给药量因患者年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型等而异，但一般来说，成年人每日摄入的重组基因的重量在1μg/kg体重至1000mg/kg体重左右的范围内，优选为从10μg/kg体重至100mg/kg体重左右的范围内。给药次数不作特别限定。

(5)细胞增殖的激活方法及细胞增殖激活剂

根据本发明，提供一种激活细胞增殖的方法，其包括：将PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或功能缺失型基因在体外导入到肿瘤细胞中。而且提供一种含有上述siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或功能缺失型基因的细胞增殖激活剂。

siRNA为约20个碱基(例如为约21～23个碱基)或者不足20个碱基长度的双链RNA。通过在细胞中表达这种siRNA，即可以抑制作为该siRNA的靶标的基因(在本发明中为PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2)的表达。

只要能够引发RNAi，本发明中所使用的siRNA可以是任何形式。这里，所谓“siRNA”是“短干扰RNA(short interfering RNA)”的简称，或者是人工化学合成的，或者是生物化学方法合成的，或者是在生物体内合成的，或者是约40个碱基以上的双链RNA在体内分解为10个碱基对以上的短双链RNA。通常，其具有5′-磷酸、3′-OH的结构，3′末端有约2个突出的碱基。该siRNA与特异性蛋白质结合，形成RISC(RNA诱导的沉默复合物，RNA-induced-silencing-complex)。该复合物能够识别与该siRNA具有相同序列的mRNA并与之结合，通过RNaseIII样的酶活性，在siRNA的中部将mRNA切断。

优选的是，siRNA的序列与作为切断靶标的mRNA的序列100％一致，但是，在siRNA的中部以外的碱基不一致的情形下，多数情况下RNAi的切断活性还会部分残留，所以也可不必100％一致。

优选的是，siRNA的碱基序列与表达应该被抑制的PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的碱基序列之间具有同源性的区域不包含该基因的翻译起始区。原因在于：由于预想到在翻译起始区中siRNA会与各种转录因子、翻译因子结合，从而在效果上就会不能与mRNA结合，可以预测其效果会降低。因此，具有同源性的序列，优选为距离该基因翻译起始区20个碱基，更优选为距离该基因翻译起始区70个碱基。具有同源性的序列例如可以是该基因3′末端附近的序列。

根据本发明的另外一种实施形式，作为通过RNAi抑制目标基因表达的因子，其还可以使用3′末端具有突出部的短的发卡式结构的shRNA(short hairpin RNA)。所谓“shRNA”是指通过在单链RNA中包含部分回文结构的碱基序列、从而在分子内形成双链结构、形成类似于发卡一样的结构的约20个碱基对以上的分子。这样的shRNA被导入细胞内以后，在细胞内被分解为约20个碱基(代表性地为例如21个碱基、22个碱基、23个碱基)的长度，与siRNA一样可以引发RNAi。如上所述，shRNA由于可以与siRNA一样引发RNAi，在本发明中也可以有效地加以应用。

shRNA优选具有3′突出末端。虽然双链部分的长度并不做特别限定，但优选为约10个核苷酸以上，更优选为约20个核苷酸以上。这里，3′突出末端优选为DNA，更优选为至少2个核苷酸以上的DNA，进一步更优选为2～4个核苷酸的DNA。

如上所述，在本发明中，作为可以通过RNAi来抑制PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的表达的因子，可以使用siRNA或者shRNA。siRNA的优点在于：(1)即便是导入到细胞内部，RNA本身也不会重组入正常细胞的染色体中，所以其不是一种能够引起遗传给后代的变异的治疗方法，安全性高；以及，(2)短双链RNA的化学合成比较容易，形成双链形式更稳定，等等。而shRNA的优点是：通过长期抑制基因表达进行治疗时，可以制作在细胞内能够形成转录shRNA的载体，然后将其导入到细胞内部。

通过本发明中所使用的RNAi来抑制PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因表达的siRNA或者shRNA可以是人工化学合成，也可以将由正义链和反义链的DNA序列反向连接形成的发卡结构的DNA通过T7RNA聚合酶在体外合成RNA而制备。体外合成时，使用T7RNA聚合酶和T7启动子，由模板DNA可以合成反义和正义的RNA。将它们在体外退火以后导入细胞内，即可以引发RNAi，抑制目标基因的表达。这里，可以采用例如磷酸钙法、或者各种转染试剂(例如oligofectamine、lipofectamine和lipofection)将那些RNA导入细胞内。

上述siRNA或者shRNA可以作为细胞增殖激活剂使用。本发明的细胞增殖激活剂的给药方法可以是经口给药或非经口给药(例如静脉给药、肌肉给药、皮下给药、皮内给药、粘膜给药、直肠给药、阴道给药、患病部位的局部给药、皮肤给药等等)、患部直接给药等。本发明的制剂作为药物组合物使用时，必要时可以添加药学上许可的添加剂。药学上许可的添加剂的具体例子可以列举抗氧化剂、保存剂、着色剂、调味剂、以及稀释剂、乳化剂、悬浊剂、溶剂、填料、增量剂、缓冲剂、传输介质、稀释剂、载体、赋形剂和/或药学佐剂等。但并不仅限于这些。

本发明的药剂的制剂形式不作特别限定。例如可以列举口服液剂、注射剂、缓释剂等等。将本发明的药剂作为上述制剂而用于处方时的溶剂可以是水性溶剂也可以是非水性溶剂。

进一步，本发明的细胞增殖激活剂的有效成分siRNA或者shRNA可以以非病毒载体或病毒载体的形式给药。当为非病毒载体的形式时，可以使用脂质体导入核酸分子的方法(脂质体法、HVJ-脂质体法、阳离子脂质体法、脂质体转染法、Lipofectamine法等)、显微注射法、用基因枪(Gene Gun)与载体(金属颗粒)一起将核酸分子转入细胞内的方法等。而当将siRNA或者shRNA以病毒载体形式给药于生物体时，可以使用重组腺病毒、逆转录病毒等病毒载体。在无毒化的逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、仙台病毒、SV40等DNA病毒或RNA病毒中导入能够表达siRNA或者shRNA的DNA，使细胞或组织被该重组病毒感染，即可以将基因导入细胞或组织中。

根据使用目的、疾病的严重程度、患者年龄、体重、性别、既往史、或者作为有效成分的siRNA或者shRNA的种类，本领域技术人员可以决定本发明的细胞增殖激活剂的给药量。虽然siRNA或者shRNA的给药量不作特别限定，例如可为约0.1ng/kg/日～约100mg/kg/日，优选为约1ng/kg/日～约10mg/kg/日。一般是给药后1～3日可见RNAi的效果。因此，优选以1日～3日一次的频率给药。使用表达载体时，可以按一周左右给药一次。

本发明中，也可以将反义寡核苷酸作为细胞增殖激活剂使用。本发明中所使用的反义寡核苷酸为与PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的DNA序列中的连续5～100个碱基序列互补的、或杂交的核苷酸，也可以是DNA或RNA任意一个，或者，只要在功能上没有损害，也可以是它们的修饰物。在本说明书中，所谓“反义寡核苷酸”，不仅指与构成DNA或mRNA的预定区域的核苷酸相对应的核苷酸完全互补的核苷酸，只要DNA或mRNA与寡核苷酸能够稳定杂交，也可以存在一些错配。

另外，反义寡核苷酸也可以进行修饰。通过适当的修饰，该反义寡核苷酸在生物体内很难分解，更加稳定，从而可以阻碍ITIIα。这种修饰后的寡核苷酸可以列举为S-oligo型(硫代磷酸酯型)、C-5噻唑型、D-oligo型(磷酸二酯型)、M-oligo型(甲基磷酸酯型)、肽核酸型、磷酸二酯键型、C-5丙烯基嘧啶型、2-O-丙基核糖、2′-甲氧基乙氧基核糖型等修饰型的反义寡核苷酸。而且，反义寡核苷酸也可以是通过将构成磷酸基团的氧原子的至少一部分为硫原子取代而被修饰。这种反义寡核苷酸的核酸酶耐受性、水溶性、对RNA的亲和性特别优异。将构成磷酸基团的氧原子的至少一部分为硫原子取代而被修饰的反义寡核苷酸例如可以是S-Oligo型等的寡核苷酸。

反义寡核苷酸的碱基数优选为小于或等于50个，更优选为小于或等于25个。碱基数过多会导致寡核苷酸的合成的工夫与成本大大增加，收率也会降低。而反义寡核苷酸的碱基数为大于等于5个，优选为大于等于9个。碱基数小于等于4个时，对目标基因的特异性降低，所以是不优选的。

反义寡核苷酸(或其衍生物)可以通过通常的方法合成，例如，通过市售的DNA合成装置(例如Applied Biosystems公司制造的等等)即可以很容易地合成。作为合成法，采用Phosphoroamidite的固相合成法、采用氢膦酸酯的固相合成法等等均可以获得。

在本发明中，当反义寡核苷酸用作细胞增殖激活剂时，一般是以包含反义寡核苷酸和制剂用添加物(载体、赋形剂等)的药物组合物的形式提供的。可以对包括人在内的哺乳动物以药物形式给予反义寡核苷酸。对反义寡核苷酸的给药途径不作特别限定，经口给药或非经口给药(例如肌肉给药、静脉给药、皮下给药、腹腔给药、鼻腔等粘膜给药、或者吸入给药等)中的任意一种均可。

对反义寡核苷酸的制剂形式不作特别限定。经口给药的制剂例如可以列举片剂、胶囊剂、细粒剂、粉末剂、颗粒剂、口服液剂、糖浆剂等；非经口给药的制剂例如可以列举注射剂、滴剂、栓剂、吸入剂、黏膜吸收剂、皮肤吸收剂、滴鼻剂、滴耳剂等等。包含反义寡核苷酸的药剂的形式、可使用的制剂用添加物、制剂的制造方法等本领域技术人员均可适当地选择。

反义寡核苷酸的给药量可以综合考虑患者的性别、年龄、体重、疾病的严重程度、给药目的为预防还是治疗、或者其它合并症状的有无等等而适当地选择，但一般给药量为约0.1μg/kg体重/日～100mg/kg体重/日，优选为约0.1μg/kg体重/日～10mg/kg体重/日。

本发明中，也可以将PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的功能缺陷型基因作为细胞增殖激活剂使用。所谓“功能缺陷型基因”是指在该基因中导入变异以使其功能缺失的基因。具体来说，与此相对应的基因为翻译一般被称为突变蛋白质的基因，突变蛋白质是指由该基因形成的氨基酸序列中至少一个组成氨基酸缺失、至少一个组成氨基酸被别的氨基酸取代、至少一个氨基酸被附加等原本的功能缺失的蛋白质。

当功能缺失型基因作为细胞增殖激活剂使用时，可以通过将作为有效成分的上述基因与基因治疗剂中通常使用的基剂共同配合而制备。而且，当将上述基因重组入病毒载体时，制备含有该重组载体的病毒粒子，将其与基因治疗剂中通常使用的基剂共同配合。

上述基剂可以使用通常注射液中使用的基剂，例如，蒸馏水、氯化钠或氯化钠与无机盐的混合物等的盐溶液、甘露醇、乳糖、葡聚糖、葡萄糖等的溶液、甘氨酸、精氨酸等的氨基酸溶液、有机酸溶液或盐溶液与葡萄糖溶液的混合溶液等。或者，根据本领域技术人员公知的常用方法，也可以在这些基剂中使用渗透压调节剂、pH调节剂、植物油、表面活性剂等佐剂，以溶液、悬浊液、分散液的形式配制成注射剂。这些注射剂可以通过粉末化、冻干等操作制备成用时溶解的制剂。

功能缺失型基因的给药形式可以是通常的静脉内、动脉内等全身给药，或者也可以是局部注射或经口给药等局部给药方式。给药时，也可以采用与插管技术、基因导入技术、或者外科手术等的组合给药形式。

功能缺失型基因的给药量因患者年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型等等而异，但一般成年人每日摄入的重组基因的重量在1μg/kg体重至1000mg/kg体重左右的范围内。优选为从10μg/kg体重至100mg/kg体重左右的范围内。给药次数不作特别限定。

另外，上述本发明的各种基因治疗剂也可以在按常法制备的脂质体悬浊液中添加基因、通过冷冻后融解而制得。调制脂质体的方法有薄膜震荡法、超声波法、逆相蒸发法、表面活性剂去除法等。优选的是，在超声波处理脂质体悬浮液以后，添加基因可以提高基因的包封率。包封有基因的脂质体可以直接或与水、生理盐水等混悬后静脉给药。

(6)抗肿瘤物质的筛选方法

如上所述，对于口腔鳞状细胞癌，PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的失活是主要的原因，因此，可以认为，使这些基因的作用正常化的药物可用作口腔鳞状细胞癌的抗肿瘤制剂。特别是，在该失活的主要原因是由于PRTFDC1基因的CpG岛发生甲基化的情况中，使这些主要原因得以解除、缓和的药剂即可以用作抗肿瘤制剂。

作为进行这种筛选方法的前提，需要确保在样本中存在PRTFDC1基因的表达量被抑制的口腔鳞状细胞癌细胞。即，本发明的筛选方法中，需要的是“由于PRTFDC1基因的CpG岛发生甲基化而引起的PRTFDC1基因表达被抑制的口腔鳞状细胞癌细胞”。在基于如上所述见解的基础上，采用常法就可以建立这些细胞株。例如，从至少已经被确认为PRTFDC1基因失活的细胞中，选择使该细胞与已知的脱甲基化试剂(如5-氮脱氧胞嘧啶)进行作用后PRTFDC1基因水平得以恢复的细胞，将该细胞继代培养，即可以建立“由于PRTFDC1基因的CpG岛发生甲基化而引起的PRTFDC1基因表达被抑制的口腔鳞状细胞癌细胞”(以下也称为甲基化癌细胞株)。

本发明的筛选方法中，需要将上述甲基化癌细胞株与待测物质相接触。对该接触的方式不作特别限定，可以将待测物质以适当的稀释倍数进行稀释后添加到甲基化细胞株的培养基中，接着进行培养，从而使它们接触。然后，定量测定添加待测物质前甲基化癌细胞株中的PRTFDC1基因的表达量，以及适当地间隔一定的时间定量测定添加待测物质后的PRTFDC1基因的表达量，将添加待测物质前、后所测定的PRTFDC1基因的表达量之差，与不添加待测物质而在相同条件下进行培养后的对照培养物进行比较，当与对照培养物相比，如果添加待测物质后的培养基中的PRTFDC1基因表达量增加时，则将该待测物质筛选作为在使用甲基化癌细胞株的试剂中的“通过使PRTFDC1基因的CpG岛脱甲基化而可以使PRTFDC1基因得以活化的抗肿瘤物质”。

另外，进行本筛选方法时，也可以将筛选出来的有希望成为口腔鳞状细胞癌的抗肿瘤成分的物质进一步进行体内筛选，例如，适宜的是，以口腔鳞状细胞癌的增殖抑制效果和裸鼠的生存率得以提高为指标，在植入有上述甲基化癌细胞株的裸鼠体内进行筛选，将范围缩小至最终的候选物质。

下面通过实施例进一步详细地说明本发明，但本发明并不因这些实施例而受到特定限制。

实施例

实施例1：口腔鳞状细胞癌中基因的变化

为了检测出口腔鳞状细胞癌中的新型基因变化，采用由18种口腔鳞状细胞癌细胞株(OM-1、OM-2、TSU、ZA、NA、Ca9-22、HOC-313、HOC-815、HSC-2、HSC-3、HSC-4、HSC-5、HSC-6、HSC-7、KON、SKN-3、HO-1-N-1、KOSC-2)制备的基因组DNA，采用MCG CancerArray-800和MGC Whole Genome Array-4500来进行CGH阵列分析(图1a)。以来源于正常的口腔上皮的细胞株(RT7)所提取的基因组DNA为对照用Cy5进行标记；以由口腔鳞状细胞癌细胞株所制备的基因组DNA为被检DNA采用Cy3进行标记。具体来说，将DpnII消化的基因组DNA(0.5μg)、分别在0.6mM dATP、0.6mM dTTP、0.6mM dGTP、0.3mM dCTP、0.3mM Cy3-dCTP(口腔鳞状细胞癌细胞)或者0.3mM Cy5-dCTP(正常细胞)的存在下，用BioPrime ArrayCGH Genomic Labeling System(Invitrogen公司生产)进行标记。Cy3和Cy5标记的dCTP购自GE Healthcare公司。在Cot-1DNA(Invitrogen公司生产)的存在下将两种标记的基因组DNA加入乙醇中使其沉淀，然后溶解于120μl的杂交混合液(50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖(Dextran sulfate)、2×SSC(1×SSC：150mM NaCl/15mM柠檬酸钠)、4％十二烷基硫酸钠、pH7.0)中，在37℃孵育30分钟以后，将所得物加入在杂交仪(Gene TAC；ハ一バ一ドバイオサイエンス公司)上设置的CGH阵列上，孵育48～72小时。然后，将CGH阵列在50％甲酰胺/2×SSC溶液(pH7.0)中在50℃下清洗15分钟，接下来在2×SSC/0.1％SDS中于50℃下清洗15分钟。风干以后，将CGH阵列用GenePix 4000B扫描仪(美国加利福尼亚州AxonInstruments公司制造)监测来源于Cy3和Cy5的荧光。得到的结果用GenePix Pro 6.0成像软件(美国加利福尼亚州Axon Instruments公司制造)进行分析。将来源于Cy3的荧光强度的平均值和来源于Cy5的荧光强度的平均值调整为相同值，求得Cy3/Cy5的比值。当在基因组中没有异常时，Cy3/Cy5的比值为1(log2比值＝0)，而该比值为1.32以上(log₂比值为0.4以上)时判定为存在基因组扩增，该比值为4以上(log₂比值为2以上)时判定为显著扩增。当比值为0.75以下(log₂比值为-0.4以下)时可判断基因组有可能发生杂合子缺失，当比值为0.25以下(log₂比值为-2以下)时可判定发生纯合子缺失的可能性极大。其结果如表1和表2所示。

表1

表1.使用MCG Cancer Array-800和Whole Genome Array-4500由CGH阵列分析

所测定的在口腔鳞状细胞癌细胞株中的高水平扩增(log₂比值＞2.0)

^a根据UCSC Genome Browser(2004年5月版)

^b代表性候选的位于BAC周围的致癌基因

表2

表2.使用MCG Cancer Array-800和Whole Genome Array-4500由CGH阵列分析所测定的在口腔鳞状细胞癌细胞株中的纯合缺失(log₂比值＜-2.0)

^a根据UCSC Genome Browser(2004年5月版)

^b位于BAC周围的基因，该基因的纯合缺失由基因组PCR确认

在18种口腔鳞状细胞癌中，发生高水平的基因扩增的为10种(55.6％)，可以确认15个基因座。而在18种口腔鳞状细胞癌中，发生基因缺失的为2种，可以确认2个基因座。

实施例2：口腔鳞状细胞癌中10p12染色体缺失区域中所含有的基因的分离

为了确定在口腔鳞状细胞癌(HSC-6)的10p12染色体纯合缺失区域中所包含的基因，首先，使用来自HSC-6细胞的基因组PCR，确定纯合缺失区域的范围。基因组PCR中所使用的引物序列如表3所示。

表3

补充表2.本研究中所用的引物序列

由CGH阵列的结果及人基因组数据库(http://genome.ucsc.edu/)可以确认，缺失区域为最大约2.95Mb的缺失(图1b、图2a)。然后，可以确认在该区域中存在7个基因。

其中，仅在HSC-6细胞(1/18，5.6％；图2b)中，可以确认PRTFDC1基因、c10或f63基因、THNSL1基因、GPR158基因、MYO3A基因、GAD2基因发生纯合缺失，而ARHGAP21基因并没有发生缺失。

实施例3：关于口腔鳞状细胞癌细胞株中PRTFDC1 mRNA表达的消失

为了了解上述6个基因(PRTFDC1基因、c10或f63基因、THNSL1基因、GPR158基因、MYO3A基因、GAD2基因)的表达水平，对18种口腔鳞状细胞癌细胞株、正常口腔上皮细胞进行了反转录PCT(RT-PCR)。具体来说，从培养的细胞株中提取RNA，采用SuperScript First-Strand Synthesis System(Invitrogen公司)，合成单链cDNA，采用补充资料表1中所示的引物序列进行PCR。另外，采用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH基因)作为对照物。其结果发现，与HSC-6细胞一样，在10p12染色体区不应该发生纯合缺失的8个细胞株中，PRTFDC1 mRNA的表达也完全消失(图2c)。而且，同RT7细胞、来自正常口腔粘膜的原代细胞相比，HOC-313细胞显示出表达减少(1/18，5.6％)。这样的口腔鳞状细胞癌细胞株中的PRTFDC1 mRNA的表达消失可能是由于除基因组缺失以外的机制(例如后生遗传现象)所致。另一方面，c10或f63、THNSL1、GPR158基因表达的消失或降低的发生频率低。

在RT7细胞和源自正常口腔粘膜的原代细胞中均没有发现MYO3A基因、GAD2基因的表达。可以认为这是由于：根据表达数据库(ncbi.nlm.nih.gov和http://www.lsbm.org/database/index.html)的结果，这些基因由于显示出组织特异性的表达模式，所以在源自口腔的细胞中并不表达。

实施例4：脱甲基化对PRTFDC1基因表达的影响

为了研究PRTFDC1基因的表达抑制是否是由于DNA甲基化的原因所致，采用PRTFDC1基因不表达的口腔鳞状细胞癌细胞株，分别用1μM、5μM的脱甲基化试剂5-aza-dCyd处理5天，和/或用100ng/ml的脱乙酰化抑制剂TSA处理24小时。从这些细胞中提取RNA，用RT-PCR检测PRTFDC1基因的表达(图2d)。其结果是，5-aza-dCyd处理以后，PRTFDC1基因的基因表达得以恢复。由该结果可以明显地推定，PRTFDC1基因的表达抑制与DNA甲基化相关。另外，TSA处理后，并未见到PRTFDC1基因的表达存在差异，由此明显可以看出，PRTFDC1基因的表达调节受组蛋白脱乙酰化的影响小。

实施例5：关于PRTFDC1基因CpG岛的启动子活性

CpG岛的甲基化是抑制基因表达的机制之一。采用CpGPLOT程序(http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot)分析了PRTFDC1基因的CpG岛，结果显示，在PRTFDC1基因的外显子1的周围存在有CpG岛(图3a)。为了研究该CpG岛的启动子活性，将包含该CpG岛周围的区域分为3个片段(片段1、片段2、片段3)，将这些片段插入到荧光素酶报告质粒(pGL3-Basic载体，Promega公司生产)中，并转化到口腔鳞状细胞癌细胞株(NA、HSC-2)中(图3a)。采用双荧光素酶报告基因阵列检测系统(Promega公司)，按照其操作指南测定荧光素酶的活性，测定含有各片段的pGL3载体所产生的荧光素酶活性(图3b)。其结果显示，片段1和3的荧光素酶活性较高(图3b)

实施例6：口腔鳞状细胞癌细胞株和口腔鳞状细胞癌临床样本中PRTFDC1基因CpG岛的甲基化状态

实际上，在口腔鳞状细胞癌细胞株中，为了确认PRTFDC1基因的外显子1的CpG岛的甲基化状态，对上述两个区域(片段1、片段2)采用结合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)法进行分析(图3a)。

具体来说，使用EZ DNA甲基化试剂盒(美国加利福尼亚州的Zymo RESEARCH生产)，将源自口腔鳞状细胞癌细胞株的基因组DNA(2μg)在亚硫酸氢钠中于50℃下处理过夜，采用经设计的引物(补充资料表1)进行PCR以扩增目标区域。将所得到的PCR产物用MluI限制性酶(New England BioLabs)或TaqI限制性酶(NewEngland BioLabs)进行消化。利用MluI或TaqI不消化未被甲基化的但被亚硫酸氢钠修饰的序列，而可消化发生甲基化的但未被亚硫酸氢钠修饰的序列的性质，检测甲基化的程度。将PCR片段进行电泳以后，采用MultiGauge 2.0(富士フイルム株式会社)根据密度测定法来测定发生甲基化片段的带和未被甲基化片段的带的浓度比，发生甲基化区域的甲基化程度用百分比表示。另外，将这些序列亚克隆入TOPO TA克隆载体(Invitrogen公司)中，确定其碱基序列。

其结果是，表达PRTFDC1基因的细胞株(TSU、HOC-815、HSC-4、HSC-5、HSC-7、SKN-3、HO-1-N1、KOSC-2)和RT7细胞在两个区域中均显示出明显的低甲基化倾向(图3c)。但是，在PRTFDC1基因没有表达或表达低的细胞株中，在两个区域中均显示出显著的高频率的甲基化(图3c)。特别是，由于区域2高频率地发生甲基化，由上述启动子分析的结果可以看出，区域2发生的甲基化对于PRTFDC 1基因表达的抑制起重要的作用。

进一步采用亚硫酸氢盐测序法(Toyota M.，et al.，Cancer Res.59，2307，1999)进行分析，确认了PRTFDC1基因的CpG岛的甲基化程度(图3d)。其结果显示，在PRTFDC1基因未发生纯合缺失、但表达消失的细胞株(表4)ZA、HSC-2中，PRTFDC1基因的CpG部位显示出非常高的甲基化倾向。而在表达了PRTFDC1基因的细胞株RT7、KOSC-2中，未发生甲基化。

表4

补充表1.PRTFDC1基因的基因组拷贝数、mRNA表达和CpG岛超甲基化的状态

^a根据材料和方法中所述的COBRA来测定甲基化状态

^bNT，未检测

接下来，为了确定口腔鳞状细胞癌的临床样本中的PRTFDC1基因CpG岛的甲基化状态，采用47例口腔鳞状细胞癌，利用COBRA法进行分析(图4a)。结果显示，在47个病例中有8个病例(17.0％)的PRTFDC1基因CpG岛出现甲基化等位基因。另外，在所有样本中都确认有非甲基化等位基因，这可能是由于正常细胞受到污染所致。在COBRA分析中，被判定为阳性的口腔鳞状细胞癌(1、68、69、75，图4b)经亚硫酸氢盐测序确定为甲基化状态。结果可以确认，在COBRA阳性的口腔鳞状细胞癌中，存在甲基化等位基因。

对47例口腔鳞状细胞癌的PRTFDC1基因Cp岛甲基化与临床病理诊断的相关性的调查结果如表5所示。

表5

表3.临床病理学数据与PRTFDC1基因CpG岛的超甲基化之间的关系

^a根据材料和方法中所述的甲基化特异性PCR来测定甲基化状态

^bP值得自X²或Fisher精确检验法，并且当p＜0.05(双侧)时为统计学显著

^c13个病例无此信息

^d16个病例无此信息

^e9个病例无此信息

实施例7：通过PRTFDC1基因的活化来抑制口腔鳞状细胞癌的增殖

根据前述结果，研究了PRTFDC1基因表达活化是否可以抑制口腔鳞状细胞癌的增殖。首先，构建了能够表达PRTFDC1基因的并具有Myc标签的质粒(pCMV-3Tag4-PRTFDC1)。该质粒可以用于检测全长的PRTFDC1基因的作用。该质粒是这样制备的：将通过RT-PCR扩增得到的PRTFDC1基因的cDNA插入到pCMV-3Tag4载体(Stratagene公司)中，使得Myc标签与翻译框匹配连接。采用没有插入PRTFDC1基因的空载体(pCMV-3Tag4-mock)作为对照。将这些表达质粒与作为转化试剂的FuGENE6(Roch Diagnostics)混合，转至NA、OM-2细胞中。48小时后回收细胞。采用抗Myc抗体(Cell Signaling Technology公司)经Western印迹确认有PRTFDC1蛋白质的表达(图5a)。

另外，在转染3周后，在作为新霉素类药物的G418的存在下使细胞增殖，用70％乙醇将增殖后的细胞固定，用结晶紫进行染色并计数。其结果显示，与用空载体转染后的细胞相比，用pCMV-3Tag4-PRTFDC1转染后的细胞的菌落数显著减少(图5b)。该结果明确显示，PRTFDC1基因的表达活化具有作为可抑制口腔鳞状细胞癌增殖的癌抑制剂的功能。

序列表

<110>富士胶片株式会社

国立大学法人东京医科齿科大学

<120>口腔鳞状细胞癌的检测方法及抑制方法

<130>FI-080772-59：56

<150>JP No.2007-143110

<151>2007-05-30

<160>36

<170>Patentln version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>1

caccttggct tcaacaaaca g 21

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>2

ctggccaagg atattatgaa ag 22

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>3

tataccaaag aagatccgca ag 22

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>4

atgcattacc tccactgcat g 21

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>5

atattgctac agaagcatat gag 23

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>6

tttgcccagt cgttctggac 20

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>7

tccagtgatt aaagccagaa tg 22

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>8

caagaggcaa gagaacccag 20

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>9

aacgtgtcag tggtggacct g 21

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>10

gttggtgaag agaacatcca g 21

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>11

tataccaaag aagatccgca ag 22

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>12

attacctccc ttgacggctc 20

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>13

atattgctac agaagcatat gag 23

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>14

gagaagcatg tggtttggca 20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>15

agagagaatg agtcgcctct 20

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>16

aattagattt tggtggtatt gg 22

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>17

tggatttggg aattaggggt t 21

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>18

aaatgtaaat tttttatttt ggggt 25

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>19

ggttgggcat tcgctgcag 19

<210>20

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>20

ccttcattga gacaaatcga tc 22

<210>21

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>21

gtgttctaat aaatataacg gttat 25

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>22

gattttggac aagttgttcc ac 22

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>23

tcctctggat ccaagctgtg 20

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>24

tttacctttc attagcctta atac 24

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>25

ttgccgctgg gtttgagatg 20

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>26

aggacacgtt gcctctcttc 20

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>27

agtgggtgtc gctgttgaag 20

<210>28

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>28

tcagatctct gaagtattca ttg 23

<210>29

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>29

aaagttgtgc tgttggtatc atg 23

<210>30

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>30

gaaatcgctg tgcatgttta tc 22

<210>31

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>31

atatttccag ttgggcatag ag 22

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>32

attggcttat ggtgcgagac 20

<210>33

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>33

ttgccgctgg gtttgagatg 20

<210>34

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>34

accctttccc ctctcctac 19

<210>35

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>35

accccaaaat aaaaaattta cattt 25

<210>36

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>36

cccaaaaaaa aaaaaacctc caa 23

Claims

1.一种癌症的检测方法，该方法通过检测存在于样本的染色体区域1q21、2q24.1-q24.2、3p13、7p11.2、10p12.1、11p15.4、11p15.2、11p13.3、11q22、11q23.3、12p 13、12q24.31、13q33.3-q34、12q24.1、19q13、或22q12.1中的基因发生的至少一种变化，来检测样本的癌化，包括检测样本的癌化的恶性程度。

2.权利要求1所述的癌症的检测方法，其中所述基因为BCL9、MITF、EGFR、PTH、BCL1、FGF4、CCND1、FGF3、PGR、YAP1、CIAP1、MMP7、MMP1、CCND2、FGF6、BCL7A、DP1、GAS6、SUPT5H、PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2中的至少一个。

3.权利要求1或2所述的癌症的检测方法，其中所述基因变化为扩增、缺失和失活中的至少一种。

4.权利要求1至3中任意一项所述的癌症的检测方法，其中所述基因的变化是由CpG岛的甲基化而引起的失活。

5.一种癌症的检测方法，该方法通过检测BCL9、MITF、EGFR、PTH、BCL1、FGF4、CCND1、FGF3、PGR、YAP1、CIAP1、MMP7、MMP1、CCND2、FGF6、BCL7A、DP1、GAS6、或SUPT5H基因的扩增、或者PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的缺失来检测样本的癌化，包括检测样本的癌化的恶性程度。

6.一种癌症的检测方法，该方法通过检测PRTFDC1基因的缺失或失活来检测样本的癌化，包括检测样本的癌化的恶性程度。

7.权利要求1至6中任意一项所述的癌症的检测方法，其中所述样本为源自口腔的组织。

8.权利要求1至7中任意一项所述的癌症的检测方法，其中所述癌症为口腔鳞状细胞癌。

9.权利要求1至8中任意一项所述的癌症的检测方法，其中采用DNA芯片法、Southern印迹法、Northern印迹法、实时RT-PCR法、FISH法、CGH法、或者阵列CGH法、亚硫酸氢盐测序法、COBRA法对所述基因的变化进行检测。

10.一种抑制细胞增殖的方法，其包括将PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因、或将作为该基因的表达产物的蛋白质在体外导入到细胞中。

11.一种细胞增殖抑制剂，其含有PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因、或作为该基因的表达产物的蛋白质。

12.一种激活细胞增殖的方法，其包括将PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或功能缺失型基因在体外导入到肿瘤细胞中。

13.一种细胞增殖激活剂，其含有PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或功能缺失型基因。

14.一种物质的筛选方法，其为：针对由于其中的PRTFDC1、c10或f63、THNSL1、GPR158、MYO3A、或GAF2基因的CpG岛发生甲基化而导致基因表达被抑制的口腔鳞状细胞癌，使该口腔鳞状细胞癌与待测物质接触以检测所述基因的表达，当与未接触该待测物质的体系相比较，发现所述基因的表达增加时，可将该待测物质筛选为可以通过将所述基因的CpG岛脱甲基化而使该基因活化的抗肿瘤物质。