JPH0646841A - トランスフェリン非要求性細胞 - Google Patents
トランスフェリン非要求性細胞Info
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- JPH0646841A JPH0646841A JP4198132A JP19813292A JPH0646841A JP H0646841 A JPH0646841 A JP H0646841A JP 4198132 A JP4198132 A JP 4198132A JP 19813292 A JP19813292 A JP 19813292A JP H0646841 A JPH0646841 A JP H0646841A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 有用蛋白質生産の宿主細胞として有用な、ト
ランスフェリン非含有無血清培地で増殖継代可能なＢリ
ンパ球系細胞を提供する。 【構成】 トランスフェリンをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用
い、無血清培地中で増殖継代可能な細胞を形質転換して
得られるトランスフェリンを含有しない無血清培地中で
３代以上増殖継代可能なＢリンパ球系細胞に関する。
ランスフェリン非含有無血清培地で増殖継代可能なＢリ
ンパ球系細胞を提供する。 【構成】 トランスフェリンをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用
い、無血清培地中で増殖継代可能な細胞を形質転換して
得られるトランスフェリンを含有しない無血清培地中で
３代以上増殖継代可能なＢリンパ球系細胞に関する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、有用蛋白質生産の宿主
細胞として有用な、トランスフェリンを含有しない無血
清培地で３代以上増殖継代可能なＢリンパ球系細胞に関
する。
細胞として有用な、トランスフェリンを含有しない無血
清培地で３代以上増殖継代可能なＢリンパ球系細胞に関
する。
【０００２】
【従来の技術】多くの動物由来の蛋白質は、糖鎖の付加
など翻訳後修飾を受けているが、大腸菌にはこれらの修
飾機構が存在しないため、大腸菌を宿主として遺伝子操
作技術を用いて蛋白質を生産した場合には天然型と同様
の修飾構造を有する蛋白質を得ることができない。
など翻訳後修飾を受けているが、大腸菌にはこれらの修
飾機構が存在しないため、大腸菌を宿主として遺伝子操
作技術を用いて蛋白質を生産した場合には天然型と同様
の修飾構造を有する蛋白質を得ることができない。
【０００３】また、動物細胞を用いて蛋白質を生産させ
た場合には、目的とする蛋白質を大量かつ永続的に得る
ことは困難である。組換え動物細胞を用いた大量培養技
術はこのような制約を解消する方法として有力であり、
ジヒドロ葉酸還元酵素（dihydrofolate reductase ; 以
下、ｄｈｆｒという) 欠損チャイニーズ・ハムスター卵
巣〔 CHO ; Chinese hamster ovary〕細胞を用いた組換
えプラスミノーゲン活性化因子 (以下、ｔ−ＰＡとい
う) の発現（特開昭59-183693 号公報) 、Ｂ型肝炎ウイ
ルス表面抗原の発現〔BIO/TECHNOLOGY、 3巻、561 頁
(1985年) 〕などが知られている。しかし、本来ＣＨＯ
細胞は接着系の細胞なので、大量培養には不向きであ
る。
た場合には、目的とする蛋白質を大量かつ永続的に得る
ことは困難である。組換え動物細胞を用いた大量培養技
術はこのような制約を解消する方法として有力であり、
ジヒドロ葉酸還元酵素（dihydrofolate reductase ; 以
下、ｄｈｆｒという) 欠損チャイニーズ・ハムスター卵
巣〔 CHO ; Chinese hamster ovary〕細胞を用いた組換
えプラスミノーゲン活性化因子 (以下、ｔ−ＰＡとい
う) の発現（特開昭59-183693 号公報) 、Ｂ型肝炎ウイ
ルス表面抗原の発現〔BIO/TECHNOLOGY、 3巻、561 頁
(1985年) 〕などが知られている。しかし、本来ＣＨＯ
細胞は接着系の細胞なので、大量培養には不向きであ
る。
【０００４】また、ＣＨＯ細胞はヒト由来の細胞株では
ないのでヒト由来の蛋白質を生産させても、蛋白質に付
加した糖鎖の構造が本来のヒト由来のもと同じになると
は限らない。実際、ヒト・エリスロポエチンをＣＨＯ細
胞で発現させた場合、その糖鎖構造はヒト由来の天然の
ものと異なっていることが知られている (国際公開WO85
/2610 号公報) 。
ないのでヒト由来の蛋白質を生産させても、蛋白質に付
加した糖鎖の構造が本来のヒト由来のもと同じになると
は限らない。実際、ヒト・エリスロポエチンをＣＨＯ細
胞で発現させた場合、その糖鎖構造はヒト由来の天然の
ものと異なっていることが知られている (国際公開WO85
/2610 号公報) 。
【０００５】動物細胞大量培養による有用物質生産には
いくつかの問題点が指摘されている。１つは、動物細胞
の細胞密度が低いことであるが、この点は種々の灌流培
養装置が開発されており、用いる細胞に応じて培養装置
を使い分けることによってある程度解消できる。１番の
問題点は、動物細胞の生育には、糖、アミノ酸、ビタミ
ン、核酸等を含む基礎培地に血清を添加しなければなら
ないことである。動物細胞培養における血清の役割は、
細胞にホルモンや成長因子などの液性因子を供給するこ
とである。しかし、血清は高価であるばかりか、多種多
様な蛋白質を含み、その量は目的蛋白質の数倍から数千
倍にも及び、目的蛋白質の精製を複雑にする。また、ロ
ット毎に品質が異なり、細胞への影響も大きく、ウイル
スやマイコプラズマの汚染源となる可能性がある。その
ため既に育種された生産株から血清の添加を必要としな
いように無血清培地馴化株を育種することも行われる
が、馴化させるのに一定期間を必要とするばかりか、目
的蛋白質の生産性を維持したまま馴化させるのは困難な
場合もある。
いくつかの問題点が指摘されている。１つは、動物細胞
の細胞密度が低いことであるが、この点は種々の灌流培
養装置が開発されており、用いる細胞に応じて培養装置
を使い分けることによってある程度解消できる。１番の
問題点は、動物細胞の生育には、糖、アミノ酸、ビタミ
ン、核酸等を含む基礎培地に血清を添加しなければなら
ないことである。動物細胞培養における血清の役割は、
細胞にホルモンや成長因子などの液性因子を供給するこ
とである。しかし、血清は高価であるばかりか、多種多
様な蛋白質を含み、その量は目的蛋白質の数倍から数千
倍にも及び、目的蛋白質の精製を複雑にする。また、ロ
ット毎に品質が異なり、細胞への影響も大きく、ウイル
スやマイコプラズマの汚染源となる可能性がある。その
ため既に育種された生産株から血清の添加を必要としな
いように無血清培地馴化株を育種することも行われる
が、馴化させるのに一定期間を必要とするばかりか、目
的蛋白質の生産性を維持したまま馴化させるのは困難な
場合もある。
【０００６】このような観点から、有用蛋白質の生産の
ために該蛋白質をコードする遺伝子を導入する宿主細胞
としては、浮遊培養で大量培養技術が確立しているヒト
由来の細胞で、かつ無血清培地で増殖継代可能な細胞が
好ましい。浮遊培養で大量培養技術が確立しているヒト
由来の宿主細胞としては、例えばＢリンパ球系細胞株ナ
マルバ（Namalwa)細胞が知られており、ヒト・エリスロ
ポエチン (特開昭62-171696 号公報) およびヒト顆粒球
−マクロファージ・コロニー刺激因子（特開昭64-20097
号公報) 、プロウロキナーゼおよびヒト成熟型顆粒球コ
ロニー刺激因子 (特開平2-257891号公報) の発現が知ら
れている。
ために該蛋白質をコードする遺伝子を導入する宿主細胞
としては、浮遊培養で大量培養技術が確立しているヒト
由来の細胞で、かつ無血清培地で増殖継代可能な細胞が
好ましい。浮遊培養で大量培養技術が確立しているヒト
由来の宿主細胞としては、例えばＢリンパ球系細胞株ナ
マルバ（Namalwa)細胞が知られており、ヒト・エリスロ
ポエチン (特開昭62-171696 号公報) およびヒト顆粒球
−マクロファージ・コロニー刺激因子（特開昭64-20097
号公報) 、プロウロキナーゼおよびヒト成熟型顆粒球コ
ロニー刺激因子 (特開平2-257891号公報) の発現が知ら
れている。
【０００７】血清に代えて、ホルモンや成長因子などの
液性因子を添加する方法で無血清培地化が試みられてい
る。無血清培地に用いられるホルモンや成長因子として
は、インスリン、トランスフェリン、ハイドロコーチゾ
ン、上皮細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由
来成長因子等があげられるが、種類および作用などは細
胞成長因子 (日本組織培養学会編・朝倉書店、1984年)
に詳しく記載されている。また、新たな成長因子の探索
もなされている。
液性因子を添加する方法で無血清培地化が試みられてい
る。無血清培地に用いられるホルモンや成長因子として
は、インスリン、トランスフェリン、ハイドロコーチゾ
ン、上皮細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由
来成長因子等があげられるが、種類および作用などは細
胞成長因子 (日本組織培養学会編・朝倉書店、1984年)
に詳しく記載されている。また、新たな成長因子の探索
もなされている。
【０００８】無血清培養に必要とされている成長因子
は、細胞によって異なり、種々の成長因子を組み合わせ
た無血清培養が数多く報告されている。例えば、ＣＨＯ
細胞は、インスリン、トランスフェリンおよびセレン
〔In vitro Cellular & Developmental Biology 、21
巻、588 頁 (1985年) 〕、HeLa細胞はインスリン、トラ
ンスフェリン、ハイドロコーチゾン、上皮細胞成長因子
および繊維芽細胞成長因子〔Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA、75巻、901 頁 (1978年) 〕、ＢＨＫ細胞はインスリ
ン、トランスフェリン、繊維芽細胞成長因子、フィブロ
ネクチンおよびオレイン酸〔Journal of Cellular Phys
iology、 114巻、215 頁 (1983年) 〕、ナマルバ細胞は
インスリンおよびトランスフェリン (特開昭60-6190 号
公報) の組合せによる無血清培養が報告されている。こ
のように、多くの細胞が無血清培養時の増殖継代に蛋白
性の液性因子としてトランスフェリンを要求することが
知られている。
は、細胞によって異なり、種々の成長因子を組み合わせ
た無血清培養が数多く報告されている。例えば、ＣＨＯ
細胞は、インスリン、トランスフェリンおよびセレン
〔In vitro Cellular & Developmental Biology 、21
巻、588 頁 (1985年) 〕、HeLa細胞はインスリン、トラ
ンスフェリン、ハイドロコーチゾン、上皮細胞成長因子
および繊維芽細胞成長因子〔Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA、75巻、901 頁 (1978年) 〕、ＢＨＫ細胞はインスリ
ン、トランスフェリン、繊維芽細胞成長因子、フィブロ
ネクチンおよびオレイン酸〔Journal of Cellular Phys
iology、 114巻、215 頁 (1983年) 〕、ナマルバ細胞は
インスリンおよびトランスフェリン (特開昭60-6190 号
公報) の組合せによる無血清培養が報告されている。こ
のように、多くの細胞が無血清培養時の増殖継代に蛋白
性の液性因子としてトランスフェリンを要求することが
知られている。
【０００９】たとえば、ナマルバ細胞を親株として無血
清培地に馴化したナマルバ (Namalwa)ＫＪＭ−１株（特
開昭60-6190 号公報）は、蛋白性の液性因子としてイン
スリンとトランスフェリンのみを含む培地で増殖継代可
能である。また、親株であるナマルバ細胞と同様、ｄｈ
ｆｒの遺伝子増幅系を用いた効率的な異種蛋白質の発現
が可能であることが知られている〔Cytotechnology、 4
巻、 173頁 (1990年)〕。しかし、トランスフェリンは
高価であり、また大量培養による医薬品製造の観点か
ら、添加に使用するトランスフェリンは非常に高純度の
ものが要求される。
清培地に馴化したナマルバ (Namalwa)ＫＪＭ−１株（特
開昭60-6190 号公報）は、蛋白性の液性因子としてイン
スリンとトランスフェリンのみを含む培地で増殖継代可
能である。また、親株であるナマルバ細胞と同様、ｄｈ
ｆｒの遺伝子増幅系を用いた効率的な異種蛋白質の発現
が可能であることが知られている〔Cytotechnology、 4
巻、 173頁 (1990年)〕。しかし、トランスフェリンは
高価であり、また大量培養による医薬品製造の観点か
ら、添加に使用するトランスフェリンは非常に高純度の
ものが要求される。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、トラ
ンスフェリンを含有しない培地で３代以上増殖継代可能
なＢリンパ球系細胞を提供することにある。
ンスフェリンを含有しない培地で３代以上増殖継代可能
なＢリンパ球系細胞を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、トラン
スフェリンを含有しない培地で３代以上増殖継代可能な
Ｂリンパ球系細胞を提供することができる。該Ｂリンパ
球系細胞は、トランスフェリンをコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換え体ＤＮＡ
を用い、無血清培地中で増殖継代可能な細胞を形質転換
することにより得られ、トランスフェリン非含有培地で
親株に匹敵する増殖速度および最高細胞到達密度を有す
る。
スフェリンを含有しない培地で３代以上増殖継代可能な
Ｂリンパ球系細胞を提供することができる。該Ｂリンパ
球系細胞は、トランスフェリンをコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換え体ＤＮＡ
を用い、無血清培地中で増殖継代可能な細胞を形質転換
することにより得られ、トランスフェリン非含有培地で
親株に匹敵する増殖速度および最高細胞到達密度を有す
る。
【００１２】以下に本発明を詳細に説明する。トランス
フェリン非含有無血清培地で増殖する細胞の親株として
は、無血清培地で継代増殖可能なＢリンパ球系細胞なら
いずれの細胞も用いることができる。好適な例としてヒ
ト由来のナマルバ細胞があげられ、具体的には無血清培
地馴化ナマルバＫＪＭ−１株あるいはグルタミン非要求
性ナマルバＫＪＭ−１−ＧＡ株〔Cytotechnology、１
巻、151 頁(1988)〕などがあげられる。
フェリン非含有無血清培地で増殖する細胞の親株として
は、無血清培地で継代増殖可能なＢリンパ球系細胞なら
いずれの細胞も用いることができる。好適な例としてヒ
ト由来のナマルバ細胞があげられ、具体的には無血清培
地馴化ナマルバＫＪＭ−１株あるいはグルタミン非要求
性ナマルバＫＪＭ−１−ＧＡ株〔Cytotechnology、１
巻、151 頁(1988)〕などがあげられる。
【００１３】トランスフェリンをコードする遺伝子とし
ては、トランスフェリンをコードするものであればｃＤ
ＮＡ、染色体ＤＮＡのいずれでも良いし、合成ＤＮＡ等
を用いて調製することも可能である。トランスフェリン
としての生物活性を保持しているペプチドをコードして
いれば、ＤＮＡの一部の塩基配列が削除または他の塩基
配列に置換されていてもよく、いかなる誘導体も利用で
きる。また、ヒト由来のものばかりでなく、必要があれ
ばマウス、ウシ、ブタ、ウマなどのヒト以外の動物由来
のものも用いることができる。好適には、ヒト・トラン
スフェリンｃＤＮＡ〔Proc. Natl. Acad. Sci.USA 、81
巻、2752頁 (1984年) 〕を用いることができる。
ては、トランスフェリンをコードするものであればｃＤ
ＮＡ、染色体ＤＮＡのいずれでも良いし、合成ＤＮＡ等
を用いて調製することも可能である。トランスフェリン
としての生物活性を保持しているペプチドをコードして
いれば、ＤＮＡの一部の塩基配列が削除または他の塩基
配列に置換されていてもよく、いかなる誘導体も利用で
きる。また、ヒト由来のものばかりでなく、必要があれ
ばマウス、ウシ、ブタ、ウマなどのヒト以外の動物由来
のものも用いることができる。好適には、ヒト・トラン
スフェリンｃＤＮＡ〔Proc. Natl. Acad. Sci.USA 、81
巻、2752頁 (1984年) 〕を用いることができる。
【００１４】トランスフェリンを発現させるベクターと
しては、トランスフェリンをコードする遺伝子を発現可
能なものであれば如何なるベクターも用いることができ
るが、好適なベクターとしては、プラスミドｐＡＧＥ１
０３〔J. Biochem. 、101 巻、1307頁 (1987年) 〕、プ
ラスミドｐＡＧＥ１０７〔Cytotechnology、３巻、 133
頁 (1990年) 〕などがあげられる。
しては、トランスフェリンをコードする遺伝子を発現可
能なものであれば如何なるベクターも用いることができ
るが、好適なベクターとしては、プラスミドｐＡＧＥ１
０３〔J. Biochem. 、101 巻、1307頁 (1987年) 〕、プ
ラスミドｐＡＧＥ１０７〔Cytotechnology、３巻、 133
頁 (1990年) 〕などがあげられる。
【００１５】これらを用いた組換え体ＤＮＡ、すなわち
ヒト・トランスフェリン発現プラスミドの構築方法は実
施例１に記載している。本発明で用いた実験手法の条件
は、特に断らない限り以下の方法にしたがって行った。
組換えＤＮＡ技術の一般的手法については、特開平2-22
7075号公報あるいはサンブルック(Sambrook)、フリッチ
(Fritsch) 、マニアチス(Maniatis)〔Molecular Clonin
g, A Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor
Laboratory Press(1989年）〕らに述べられている方法
を用いることができる。プラスミドの大腸菌への導入
は、コーエンらの方法〔Proc. Natl. Acad, Sci. USA.
、69巻、2110頁 (1972年) 〕を用いることができる。
また、形質転換株からのプラスミドの単離は公知の方法
〔Nucleic Acids Res. 、7巻、1513頁 (1979年) 〕に従
って行う。動物細胞へのＤＮＡの導入方法としては、現
在までに知られているいかなる方法も利用可能である
が、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnolo
gy、 3巻、 133頁(1990 年) 〕、リン酸カルシウム法
〔Virology、 52 巻、 456頁(1973年) 〕、リポフェク
ション法〔Proc. Natl. Acad, Sci. USA. 、84巻、7413
頁 (1987年) 〕等を使用することができる。
ヒト・トランスフェリン発現プラスミドの構築方法は実
施例１に記載している。本発明で用いた実験手法の条件
は、特に断らない限り以下の方法にしたがって行った。
組換えＤＮＡ技術の一般的手法については、特開平2-22
7075号公報あるいはサンブルック(Sambrook)、フリッチ
(Fritsch) 、マニアチス(Maniatis)〔Molecular Clonin
g, A Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor
Laboratory Press(1989年）〕らに述べられている方法
を用いることができる。プラスミドの大腸菌への導入
は、コーエンらの方法〔Proc. Natl. Acad, Sci. USA.
、69巻、2110頁 (1972年) 〕を用いることができる。
また、形質転換株からのプラスミドの単離は公知の方法
〔Nucleic Acids Res. 、7巻、1513頁 (1979年) 〕に従
って行う。動物細胞へのＤＮＡの導入方法としては、現
在までに知られているいかなる方法も利用可能である
が、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnolo
gy、 3巻、 133頁(1990 年) 〕、リン酸カルシウム法
〔Virology、 52 巻、 456頁(1973年) 〕、リポフェク
ション法〔Proc. Natl. Acad, Sci. USA. 、84巻、7413
頁 (1987年) 〕等を使用することができる。
【００１６】形質転換株の取得および培養は、公知の方
法〔Cytotechnology、 3巻、 133頁（1990年）、あるい
は特開平2-257891号公報〕に準じて行うことができる。
例えば、培地としては、各種血清（例えばウシ胎児血
清）を加えたハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地（以上フ
ローラボ社製）、ダルベッコＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６
４０培地（以上日水製薬社製）、ＭＥＭ ＡＬＰＨＡ培
地（ＧＩＢＣＯ社製）およびこれらの混合培地が用いら
れる。
法〔Cytotechnology、 3巻、 133頁（1990年）、あるい
は特開平2-257891号公報〕に準じて行うことができる。
例えば、培地としては、各種血清（例えばウシ胎児血
清）を加えたハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地（以上フ
ローラボ社製）、ダルベッコＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６
４０培地（以上日水製薬社製）、ＭＥＭ ＡＬＰＨＡ培
地（ＧＩＢＣＯ社製）およびこれらの混合培地が用いら
れる。
【００１７】培地には必要により、グルタミン0.５〜６
ｍＭ、抗生物質〔ペニシリン（25U/ml) 、ストレプトマ
イシン (25μg/ml) 、Ｇ４１８（0.３〜0.５mg／ml）、
ハイグロマイシンＢ（0.３〜0.５mg／ml）など〕、重曹
（0.１〜0.２％）などを適量加えてもよい。好ましく
は、ＩＴＰＳＧＦ培地〔7.５％NaHCO3を 1／40量、 200
mM L-グルタミン溶液 (GIBCO 社製) を３％、ペニシリ
ン・ストレプトマイシン溶液（GIBCO 社製、5,000units
／mlペニシリン− 5,000μg ／mlストレプトマイシン)
を0.５％、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′
−２−エタンスルホン酸（Ｎ−２−hydroxyethylpipera
zine−Ｎ′−２−ethanesulfonic acid ;以下 HEPESと
いう) （１０ｍＭ）、インスリン（３μｇ／ml）、トラ
ンスフェリン（５μｇ／ml）、ピルビン酸ナトリウム
（５ｍＭ）、亜セレン酸ナトリウム（１２５ｎＭ）、ガ
ラクトース（１mg／ml）およびプルロニックＦ６８（東
邦千葉化学社製）（0.１％ w／v)を含むＲＰＭＩ１６４
０培地（日水製薬社製）〕、ＩＰＳＧＦ培地〔トランス
フェリン非含有培地；7.５％NaHCO3を 1／40量、200ｍ
Ｍ Ｌ−グルタミン溶液（ＧＩＢＣＯ社製）を３％、ペ
ニシリン・ストレプトマイシン溶液（GIBCO 社製、5,00
0units／mlペニシリン−5,000 μg ／mlストレプトマイ
シン) を0.５％、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、インスリン
（３μｇ／ml）、ピルビン酸ナトリウム（５ｍＭ）、亜
セレン酸ナトリウム（１２５ｎＭ）、ガラクトース（１
mg／ml）およびプルロニックＦ６８（東邦千葉化学社
製）（0.１％ w／v)を含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水
製薬社製）〕あるいは、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を２〜
１０％、7.５％ NaHCO3 を 1／40量、２００ｍＭ Ｌ−
グルタミン溶液（ＧＩＢＣＯ社製）を３％およびペニシ
リン・ストレプトマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ社製、5,00
0units／mlペニシリン−5,000 μg ／mlストレプトマイ
シン) を0.５％含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社
製）を用いることができる。
ｍＭ、抗生物質〔ペニシリン（25U/ml) 、ストレプトマ
イシン (25μg/ml) 、Ｇ４１８（0.３〜0.５mg／ml）、
ハイグロマイシンＢ（0.３〜0.５mg／ml）など〕、重曹
（0.１〜0.２％）などを適量加えてもよい。好ましく
は、ＩＴＰＳＧＦ培地〔7.５％NaHCO3を 1／40量、 200
mM L-グルタミン溶液 (GIBCO 社製) を３％、ペニシリ
ン・ストレプトマイシン溶液（GIBCO 社製、5,000units
／mlペニシリン− 5,000μg ／mlストレプトマイシン)
を0.５％、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′
−２−エタンスルホン酸（Ｎ−２−hydroxyethylpipera
zine−Ｎ′−２−ethanesulfonic acid ;以下 HEPESと
いう) （１０ｍＭ）、インスリン（３μｇ／ml）、トラ
ンスフェリン（５μｇ／ml）、ピルビン酸ナトリウム
（５ｍＭ）、亜セレン酸ナトリウム（１２５ｎＭ）、ガ
ラクトース（１mg／ml）およびプルロニックＦ６８（東
邦千葉化学社製）（0.１％ w／v)を含むＲＰＭＩ１６４
０培地（日水製薬社製）〕、ＩＰＳＧＦ培地〔トランス
フェリン非含有培地；7.５％NaHCO3を 1／40量、200ｍ
Ｍ Ｌ−グルタミン溶液（ＧＩＢＣＯ社製）を３％、ペ
ニシリン・ストレプトマイシン溶液（GIBCO 社製、5,00
0units／mlペニシリン−5,000 μg ／mlストレプトマイ
シン) を0.５％、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、インスリン
（３μｇ／ml）、ピルビン酸ナトリウム（５ｍＭ）、亜
セレン酸ナトリウム（１２５ｎＭ）、ガラクトース（１
mg／ml）およびプルロニックＦ６８（東邦千葉化学社
製）（0.１％ w／v)を含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水
製薬社製）〕あるいは、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を２〜
１０％、7.５％ NaHCO3 を 1／40量、２００ｍＭ Ｌ−
グルタミン溶液（ＧＩＢＣＯ社製）を３％およびペニシ
リン・ストレプトマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ社製、5,00
0units／mlペニシリン−5,000 μg ／mlストレプトマイ
シン) を0.５％含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社
製）を用いることができる。
【００１８】培養には、種々の培養ビン、ディッシュ、
組織培養用プレート、ローラボトル、スピンナーフラス
コ、ジャーファーメンターなどを用いることができる。
培養は、２０〜５０℃、好適には３０〜４０℃の温度範
囲、１×１０2 〜１×１０8cells ／ml、好ましくは５
×１０4 〜１×１０6cells／mlの細胞密度で、１〜20日
間培養する。
組織培養用プレート、ローラボトル、スピンナーフラス
コ、ジャーファーメンターなどを用いることができる。
培養は、２０〜５０℃、好適には３０〜４０℃の温度範
囲、１×１０2 〜１×１０8cells ／ml、好ましくは５
×１０4 〜１×１０6cells／mlの細胞密度で、１〜20日
間培養する。
【００１９】本発明で得られるＢリンパ球系細胞の具体
例としては、ナマルバ（Namalwa ）細胞ＫＪＦ−１、Ｋ
ＪＦ−２、ＫＪＦ−３、ＫＪＦ−４、ＫＪＦ−５、ＫＪ
Ｆ−６があげられる。ナマルバ細胞ＫＪＦ−１はブダペ
スト条約に基づいて平成４年７月２１日付けで工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第３９３８号（FE
RM BP-3938)として寄託されている。
例としては、ナマルバ（Namalwa ）細胞ＫＪＦ−１、Ｋ
ＪＦ−２、ＫＪＦ−３、ＫＪＦ−４、ＫＪＦ−５、ＫＪ
Ｆ−６があげられる。ナマルバ細胞ＫＪＦ−１はブダペ
スト条約に基づいて平成４年７月２１日付けで工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第３９３８号（FE
RM BP-3938)として寄託されている。
【００２０】次に、本発明の実施例を示す。
【００２１】
実施例１ ヒト・トランスフェリン発現プラスミドｐＭ
ｏ１ｈＴｆ１の構築： （１）Moloney ネズミ白血病ウイルス (以下、Mo-MuLV
という) の末端反復配列(long terminal repeat ; 以
下、LTR という) プロモーター／エンハンサーを運ぶベ
クターｐＡＧＥ１４７の構築（図１参照） プラスミドｐＰＭＯＬ１( 特開平1-63394 号公報）２μ
g を１０ｍＭトリス−塩酸（pH7.5)、６ｍＭ ＭｇＣｌ
2 および６ｍＭ ２−メルカプトエタノールからなる緩
衝液（以下、Ｙ−０緩衝液と略記する）３０μｌに溶解
し、２０単位のＳｍａＩ（宝酒造社製；以下、とくに断
らない限り制限酵素は宝酒造社製のものを使用した）を
加え、３０℃で３時間消化反応を行った。その後、Ｎａ
Ｃｌを５０ｍＭになるように添加し、２０単位のＣｌａ
Ｉを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液
をアガロースゲル電気泳動後、Ｍｏ−ＭｕＬＶのＬＴＲ
プロモーター／エンハンサーを含む約0.６kbのＤＮＡ断
片を回収した。
ｏ１ｈＴｆ１の構築： （１）Moloney ネズミ白血病ウイルス (以下、Mo-MuLV
という) の末端反復配列(long terminal repeat ; 以
下、LTR という) プロモーター／エンハンサーを運ぶベ
クターｐＡＧＥ１４７の構築（図１参照） プラスミドｐＰＭＯＬ１( 特開平1-63394 号公報）２μ
g を１０ｍＭトリス−塩酸（pH7.5)、６ｍＭ ＭｇＣｌ
2 および６ｍＭ ２−メルカプトエタノールからなる緩
衝液（以下、Ｙ−０緩衝液と略記する）３０μｌに溶解
し、２０単位のＳｍａＩ（宝酒造社製；以下、とくに断
らない限り制限酵素は宝酒造社製のものを使用した）を
加え、３０℃で３時間消化反応を行った。その後、Ｎａ
Ｃｌを５０ｍＭになるように添加し、２０単位のＣｌａ
Ｉを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液
をアガロースゲル電気泳動後、Ｍｏ−ＭｕＬＶのＬＴＲ
プロモーター／エンハンサーを含む約0.６kbのＤＮＡ断
片を回収した。
【００２２】次に、下記２種の合成ＤＮＡを自動ＤＮＡ
合成機〔 380A ; アプライド・バイオシステムズ社 (Ap
plied Biosystems Co., Ltd ) 製〕を用いて合成した。
合成機〔 380A ; アプライド・バイオシステムズ社 (Ap
plied Biosystems Co., Ltd ) 製〕を用いて合成した。
【００２３】
【化１】
【００２４】このようにして得られた合成ＤＮＡ２５ピ
コモル（pmoles) ずつを５０ｍＭトリス−塩酸（pH7.
6)、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭジチオスレイトール
（以下、ＤＴＴと略記する）、0.１ｍＭ ＥＤＴＡおよ
び0.５ｍＭアデノシン３リン酸（以下、ＡＴＰと略記す
る）からなる緩衝液（以下、Ｔ４キナーゼ緩衝液と略記
する）１０μｌに溶解し、５単位のＴ４ＤＮＡキナーゼ
（宝酒造社製、以下同じ）を加え、３７℃で３０分間反
応させることにより５′末端をリン酸化した。
コモル（pmoles) ずつを５０ｍＭトリス−塩酸（pH7.
6)、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭジチオスレイトール
（以下、ＤＴＴと略記する）、0.１ｍＭ ＥＤＴＡおよ
び0.５ｍＭアデノシン３リン酸（以下、ＡＴＰと略記す
る）からなる緩衝液（以下、Ｔ４キナーゼ緩衝液と略記
する）１０μｌに溶解し、５単位のＴ４ＤＮＡキナーゼ
（宝酒造社製、以下同じ）を加え、３７℃で３０分間反
応させることにより５′末端をリン酸化した。
【００２５】上記で得た、プラスミドｐＰＭＯＬ１由来
のＣｌａＩ−ＳｍａＩ断片（0.６kb) 0.０５μｇと５′
リン酸化された２種の合成ＤＮＡ（１ピコモルずつ）お
よびＨｉｎｄIII リンカー（５′−ｐＣＡＡＧＣＴＴＧ
−３′；宝酒造社製）（１ピコモル）を６６ｍＭ トリ
ス−塩酸（pH7.5)、 6. ６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ
ＤＴＴおよび0.１ｍＭ ＡＴＰからなる緩衝液（以
下、Ｔ４リガーゼ緩衝液と略記する）３０μｌに溶解
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製、以下同じ）２０
０単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。エ
タノール沈澱により該ＤＮＡ断片を回収した後、２０μ
ｌの１０ｍＭ トリス−塩酸（pH7.5)、６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび６ｍＭ ２−メルカ
プトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−１００緩衝
液と略記する）に溶解し、１０単位のＨｉｎｄIII およ
び１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で２時間消化反応
を行った。反応をフェノール−クロロホルム抽出により
停止させ、エタノール沈澱により該ＤＮＡを回収した。
のＣｌａＩ−ＳｍａＩ断片（0.６kb) 0.０５μｇと５′
リン酸化された２種の合成ＤＮＡ（１ピコモルずつ）お
よびＨｉｎｄIII リンカー（５′−ｐＣＡＡＧＣＴＴＧ
−３′；宝酒造社製）（１ピコモル）を６６ｍＭ トリ
ス−塩酸（pH7.5)、 6. ６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ
ＤＴＴおよび0.１ｍＭ ＡＴＰからなる緩衝液（以
下、Ｔ４リガーゼ緩衝液と略記する）３０μｌに溶解
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製、以下同じ）２０
０単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。エ
タノール沈澱により該ＤＮＡ断片を回収した後、２０μ
ｌの１０ｍＭ トリス−塩酸（pH7.5)、６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび６ｍＭ ２−メルカ
プトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−１００緩衝
液と略記する）に溶解し、１０単位のＨｉｎｄIII およ
び１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で２時間消化反応
を行った。反応をフェノール−クロロホルム抽出により
停止させ、エタノール沈澱により該ＤＮＡを回収した。
【００２６】一方、プラスミドｐＡＧＥ１０７〔Cytote
chnology、３巻、 133頁 (1990年)〕１μｇを３０μｌ
のＹ−１００緩衝液に溶解し、１０単位のＨｉｎｄIII
と１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で２時間消化反応
を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、Ｇ４
１８耐性遺伝子およびアンピシリン（以下、Ａｐとい
う）耐性遺伝子を含む約6.０kbのＤＮＡ断片を回収し
た。
chnology、３巻、 133頁 (1990年)〕１μｇを３０μｌ
のＹ−１００緩衝液に溶解し、１０単位のＨｉｎｄIII
と１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で２時間消化反応
を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、Ｇ４
１８耐性遺伝子およびアンピシリン（以下、Ａｐとい
う）耐性遺伝子を含む約6.０kbのＤＮＡ断片を回収し
た。
【００２７】上記で得たプラスミドｐＡＧＥ１０７由来
ＨｉｎｄIII −ＸｈｏＩ断片（6.０kb) 0.３μｇとプラ
スミドｐＰＭＯＬ１由来ＨｉｎｄIII −ＸｈｏＩ断片
（0.６３kb) 0.０１μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２０μｌ
に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２００単位を加え、１２
℃で１６時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸
菌ＨＢ１０１株をコーエンらの方法によって形質転換
し、Ａｐ耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法
に従ってプラスミドを単離した。得られたプラスミドの
構造は制限酵素消化により確認した。このプラスミドを
ｐＡＧＥ１４７と呼ぶ。
ＨｉｎｄIII −ＸｈｏＩ断片（6.０kb) 0.３μｇとプラ
スミドｐＰＭＯＬ１由来ＨｉｎｄIII −ＸｈｏＩ断片
（0.６３kb) 0.０１μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２０μｌ
に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２００単位を加え、１２
℃で１６時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸
菌ＨＢ１０１株をコーエンらの方法によって形質転換
し、Ａｐ耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法
に従ってプラスミドを単離した。得られたプラスミドの
構造は制限酵素消化により確認した。このプラスミドを
ｐＡＧＥ１４７と呼ぶ。
【００２８】（２）ハイグロマイシンＢ（以下、Ｈｙｇ
Ｂという）耐性遺伝子をマーカーとするベクターｐＡＧ
Ｅ２０７の構築（図２参照） プラスミドｐＡＧＥ１０７中のＧ４１８耐性遺伝子をＨ
ｙｇＢ耐性遺伝子にすげかえたプラスミドｐＡＧＥ２０
７を造成した。ＨｙｇＢ耐性遺伝子は、プラスミドｐ２
０１〔Ｎature 、313 巻、 812頁 (1985年) 〕より切り
出して使用した。
Ｂという）耐性遺伝子をマーカーとするベクターｐＡＧ
Ｅ２０７の構築（図２参照） プラスミドｐＡＧＥ１０７中のＧ４１８耐性遺伝子をＨ
ｙｇＢ耐性遺伝子にすげかえたプラスミドｐＡＧＥ２０
７を造成した。ＨｙｇＢ耐性遺伝子は、プラスミドｐ２
０１〔Ｎature 、313 巻、 812頁 (1985年) 〕より切り
出して使用した。
【００２９】プラスミドｐＡＧＥ１０７の１μｇを１０
ｍＭトリス−塩酸（pH7.5)、６ｍＭＭｇＣｌ2 、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌおよび６ｍＭ ２−メルカプトエタノール
からなる緩衝液（以下、Ｙ−５０緩衝液と略記する）３
０μｌに溶解し、２０単位のＣｌａＩを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。その後、ＮａＣｌ濃度が１５
０ｍＭになるようにＮａＣｌを添加し、２０単位のＭｌ
ｕＩを加え、さらに３７℃で２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約4.６kbのＤＮ
Ａ断片を回収した。
ｍＭトリス−塩酸（pH7.5)、６ｍＭＭｇＣｌ2 、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌおよび６ｍＭ ２−メルカプトエタノール
からなる緩衝液（以下、Ｙ−５０緩衝液と略記する）３
０μｌに溶解し、２０単位のＣｌａＩを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。その後、ＮａＣｌ濃度が１５
０ｍＭになるようにＮａＣｌを添加し、２０単位のＭｌ
ｕＩを加え、さらに３７℃で２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約4.６kbのＤＮ
Ａ断片を回収した。
【００３０】また、プラスミドｐ２０１の0.５μｇをＹ
−５０緩衝液３０μｌに溶解し、２０単位のＮａｒＩ
〔ニュー・イングランド・バイオラボ（New England Bi
olab)社製〕を加え、３７℃で２時間消化反応を行っ
た。エタノール沈澱後、３０μｌのＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ緩衝液〔５０ｍＭトリス−塩酸（pH7.5)、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、0.１ｍＭ ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン
３リン酸）、0.１ｍＭ ｄＣＴＰ（デオキシシチジン３
リン酸）、0.１ｍＭ ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン３
リン酸）、0.１ｍＭ ｄＴＴＰ（デオキシチミジン３リ
ン酸）〕に溶かし、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレノー断片（宝酒造社製。以下、クレノー断片と
いう）を加え、３７℃で６０分間反応させ、ＮａｒＩ消
化によって生じた５′突出末端を平滑末端に変えた。反
応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出と
エタノール沈澱の後、２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に
溶解し、ＣｌａＩリンカー（５’−ｐＣＡＴＣＧＡＴＧ
−３′：宝酒造社製）を0.０５μｇとＴ４ＤＮＡリガー
ゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行
った。エタノール沈澱後、Ｙ−５０緩衝液３０μｌに溶
解し、１０単位のＣｌａＩを加え、３７℃で２時間消化
反応を行った。その後、ＮａＣｌ濃度が１５０ｍＭにな
るようにＮａＣｌを添加し、１０単位のＭｌｕＩを加
え、さらに３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液
をアガロースゲル電気泳動後、ＨｙｇＢ耐性遺伝子を含
む約1.６kbのＤＮＡ断片を回収した。
−５０緩衝液３０μｌに溶解し、２０単位のＮａｒＩ
〔ニュー・イングランド・バイオラボ（New England Bi
olab)社製〕を加え、３７℃で２時間消化反応を行っ
た。エタノール沈澱後、３０μｌのＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ緩衝液〔５０ｍＭトリス−塩酸（pH7.5)、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、0.１ｍＭ ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン
３リン酸）、0.１ｍＭ ｄＣＴＰ（デオキシシチジン３
リン酸）、0.１ｍＭ ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン３
リン酸）、0.１ｍＭ ｄＴＴＰ（デオキシチミジン３リ
ン酸）〕に溶かし、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレノー断片（宝酒造社製。以下、クレノー断片と
いう）を加え、３７℃で６０分間反応させ、ＮａｒＩ消
化によって生じた５′突出末端を平滑末端に変えた。反
応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出と
エタノール沈澱の後、２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に
溶解し、ＣｌａＩリンカー（５’−ｐＣＡＴＣＧＡＴＧ
−３′：宝酒造社製）を0.０５μｇとＴ４ＤＮＡリガー
ゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行
った。エタノール沈澱後、Ｙ−５０緩衝液３０μｌに溶
解し、１０単位のＣｌａＩを加え、３７℃で２時間消化
反応を行った。その後、ＮａＣｌ濃度が１５０ｍＭにな
るようにＮａＣｌを添加し、１０単位のＭｌｕＩを加
え、さらに３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液
をアガロースゲル電気泳動後、ＨｙｇＢ耐性遺伝子を含
む約1.６kbのＤＮＡ断片を回収した。
【００３１】上記で得た、プラスミドｐＡＧＥ１０７由
来のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片（4.６kb) 0.２μｇとプラ
スミドｐ２０１由来のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片（1.６k
b)0.１μｇとをＴ４リガーゼ緩衝液３０μｌに溶解し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６
時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１
０１株をコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｐ耐
性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプ
ラスミドを単離し、その構造を制限酵素消化により確認
した。このプラスミドをｐＡＧＥ２０７と呼ぶ。
来のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片（4.６kb) 0.２μｇとプラ
スミドｐ２０１由来のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片（1.６k
b)0.１μｇとをＴ４リガーゼ緩衝液３０μｌに溶解し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６
時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１
０１株をコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｐ耐
性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプ
ラスミドを単離し、その構造を制限酵素消化により確認
した。このプラスミドをｐＡＧＥ２０７と呼ぶ。
【００３２】（３）Ｍｏ−ＭｕＬＶのＬＴＲプロモータ
ー／エンハンサーを有し、ＨｙｇＢ耐性遺伝子をマーカ
ーとするベクターｐＡＧＥ２４７の構築（図３参照） （１）で得られたプラスミドｐＡＧＥ１４７の２μｇを
３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、１０単位のＨｉ
ｎｄIII と１０単位のＸｈｏｌを加えて３７℃で２時間
消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、Ｍｏ−ＭｕＬＶのＬＴＲプロモーター／エンハンサ
ーを含む約0.６３kbのＤＮＡ断片を回収した。
ー／エンハンサーを有し、ＨｙｇＢ耐性遺伝子をマーカ
ーとするベクターｐＡＧＥ２４７の構築（図３参照） （１）で得られたプラスミドｐＡＧＥ１４７の２μｇを
３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、１０単位のＨｉ
ｎｄIII と１０単位のＸｈｏｌを加えて３７℃で２時間
消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、Ｍｏ−ＭｕＬＶのＬＴＲプロモーター／エンハンサ
ーを含む約0.６３kbのＤＮＡ断片を回収した。
【００３３】一方、（２）で構築したプラスミドｐＡＧ
Ｅ２０７の２μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶解
し、１０単位のＨｉｎｄIII と１０単位のＸｈｏＩを加
えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動後、ＨｙｇＢ耐性遺伝子およびＡｐ
耐性遺伝子を含む約5.８kbのＤＮＡ断片を回収した。上
記で得た、プラスミドｐＡＧＥ１４７由来のＨｉｎｄII
I −ＸｈｏＩ断片（0.６３kb) 0.０５μｇとプラスミド
ｐＡＧＥ２０７由来のＨｉｎｄIII −ＸｈｏＩ断片（5.
8kb)０.1μｇをＴ４リガーゼ緩衝液３０μｌに溶解し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１２℃で１６時
間結合反応を行った。
Ｅ２０７の２μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶解
し、１０単位のＨｉｎｄIII と１０単位のＸｈｏＩを加
えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動後、ＨｙｇＢ耐性遺伝子およびＡｐ
耐性遺伝子を含む約5.８kbのＤＮＡ断片を回収した。上
記で得た、プラスミドｐＡＧＥ１４７由来のＨｉｎｄII
I −ＸｈｏＩ断片（0.６３kb) 0.０５μｇとプラスミド
ｐＡＧＥ２０７由来のＨｉｎｄIII −ＸｈｏＩ断片（5.
8kb)０.1μｇをＴ４リガーゼ緩衝液３０μｌに溶解し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１２℃で１６時
間結合反応を行った。
【００３４】該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株をコ
ーエンらの方法によって形質転換し、Ａｐ耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化
により確認した。このプラスミドをｐＡＧＥ２４７と呼
ぶ。
ーエンらの方法によって形質転換し、Ａｐ耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化
により確認した。このプラスミドをｐＡＧＥ２４７と呼
ぶ。
【００３５】（４）ヒト・トランスフェリンのＮ末側領
域を運ぶプラスミドｐＴｆＮ４の構築（図４参照）。 プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1984年) 、81巻、2752-2756 頁に記載の方法で作製さ
れ、該文献中２７５３頁図２に記載のＤＮＡ配列を有す
るプラスミド（以下、該プラスミドをプラスミドｐＴＦ
Ｒ２７Ａと称す。）３μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝
液に溶解し、２０単位のＨｇｉＡＩ〔ニュー・イングラ
ンド・バイオラボ（New England Biolab) 社製〕を加
え、３７℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈澱
後、３０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶かし、
６単位のクレノー断片を加え、１６℃で６０分間反応さ
せ、ＨｇｉＡＩ消化によって生じた３′突出末端を平滑
末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、ク
ロロホルム抽出とエタノール沈澱の後、該ＤＮＡ断片を
３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、１０単位のＥｃ
ｏＲＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反
応液をアガロースゲル電気泳動後、ヒト・トランスフェ
リン遺伝子のＮ末側を含む約0.９kbのＤＮＡ断片を回収
した。
域を運ぶプラスミドｐＴｆＮ４の構築（図４参照）。 プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1984年) 、81巻、2752-2756 頁に記載の方法で作製さ
れ、該文献中２７５３頁図２に記載のＤＮＡ配列を有す
るプラスミド（以下、該プラスミドをプラスミドｐＴＦ
Ｒ２７Ａと称す。）３μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝
液に溶解し、２０単位のＨｇｉＡＩ〔ニュー・イングラ
ンド・バイオラボ（New England Biolab) 社製〕を加
え、３７℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈澱
後、３０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶かし、
６単位のクレノー断片を加え、１６℃で６０分間反応さ
せ、ＨｇｉＡＩ消化によって生じた３′突出末端を平滑
末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、ク
ロロホルム抽出とエタノール沈澱の後、該ＤＮＡ断片を
３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、１０単位のＥｃ
ｏＲＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反
応液をアガロースゲル電気泳動後、ヒト・トランスフェ
リン遺伝子のＮ末側を含む約0.９kbのＤＮＡ断片を回収
した。
【００３６】一方、プラスミドｐＵＣ１８〔 Gene 、33
巻、 103頁 (1985年) 〕２μｇを３０μｌのＹ−１００
緩衝液に溶解し、１０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃
で２時間消化反応を行った。エタノール沈澱後、３０μ
ｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶かし、６単位のク
レノー断片を加え、１６℃で６０分間反応させ、Ｂａｍ
ＨＩ消化によって生じた５′突出末端を平滑末端に変え
た。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム
抽出とエタノール沈澱の後、該ＤＮＡ断片を３０μｌの
Ｙ−１００緩衝液に溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩを加
えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動後、Ａｐ耐性遺伝子を含む約2.７kb
のＤＮＡ断片を回収した。
巻、 103頁 (1985年) 〕２μｇを３０μｌのＹ−１００
緩衝液に溶解し、１０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃
で２時間消化反応を行った。エタノール沈澱後、３０μ
ｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶かし、６単位のク
レノー断片を加え、１６℃で６０分間反応させ、Ｂａｍ
ＨＩ消化によって生じた５′突出末端を平滑末端に変え
た。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム
抽出とエタノール沈澱の後、該ＤＮＡ断片を３０μｌの
Ｙ−１００緩衝液に溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩを加
えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動後、Ａｐ耐性遺伝子を含む約2.７kb
のＤＮＡ断片を回収した。
【００３７】上記で得た、プラスミドｐＴＦＲ２７Ａ由
来のＥｃｏＲＩ−ＨｇｉＡＩ（平滑末端）断片（0.９k
b) 0.１μｇとプラスミドｐＵＣ１８由来のＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ（平滑末端）断片（2.７kb) 0.１μｇをＴ
４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行
った。
来のＥｃｏＲＩ−ＨｇｉＡＩ（平滑末端）断片（0.９k
b) 0.１μｇとプラスミドｐＵＣ１８由来のＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ（平滑末端）断片（2.７kb) 0.１μｇをＴ
４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行
った。
【００３８】該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株をコ
ーエンらの方法によって形質転換し、Ａｐ耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離し、その構造を制限酵素消化により確認した。こ
のプラスミドをｐＴｆＮ４と呼ぶ。
ーエンらの方法によって形質転換し、Ａｐ耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離し、その構造を制限酵素消化により確認した。こ
のプラスミドをｐＴｆＮ４と呼ぶ。
【００３９】（５）ヒト・トランスフェリンのＣ末側領
域を運ぶプラスミドｐＴｆＣ２の構築（図５参照） プラスミドｐＴＦＲ２７Ａの３μｇを３０μｌのＹ−１
００緩衝液に溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。該反応液に１０単位の
ＢｓｔＰＩを加え、６０℃で２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、ヒト・トランス
フェリン遺伝子のＣ末側を含む約1.１kbのＤＮＡ断片を
回収した。
域を運ぶプラスミドｐＴｆＣ２の構築（図５参照） プラスミドｐＴＦＲ２７Ａの３μｇを３０μｌのＹ−１
００緩衝液に溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。該反応液に１０単位の
ＢｓｔＰＩを加え、６０℃で２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、ヒト・トランス
フェリン遺伝子のＣ末側を含む約1.１kbのＤＮＡ断片を
回収した。
【００４０】一方、プラスミドｐＵＣ１８の２μｇを３
０μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、１０単位のＢａｍ
ＨＩと１０単位のＥｃｏＲＩを加え、３７℃で２時間消
化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、Ａｐ耐性遺伝子を含む約2.７kbのＤＮＡ断片を回収
した。次に、下記２種の合成ＤＮＡを自動ＤＮＡ合成機
〔３８０Ａ、アプライド・バイオシステムズ社（Applie
d Biosystems Co., Ltd)製〕を用いて合成した。
０μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、１０単位のＢａｍ
ＨＩと１０単位のＥｃｏＲＩを加え、３７℃で２時間消
化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動
後、Ａｐ耐性遺伝子を含む約2.７kbのＤＮＡ断片を回収
した。次に、下記２種の合成ＤＮＡを自動ＤＮＡ合成機
〔３８０Ａ、アプライド・バイオシステムズ社（Applie
d Biosystems Co., Ltd)製〕を用いて合成した。
【００４１】
【化２】
【００４２】このようにして得られた合成ＤＮＡ２５ピ
コモル（pmoles) ずつを１０μｌのＴ４キナーゼ緩衝液
に溶解し、５単位のＴ４ＤＮＡキナーゼを加え、３７℃
で３０分間反応させることにより５′末端をリン酸化し
た。得られた、プラスミドｐＴＦＲ２７Ａ由来のＥｃｏ
ＲＩ−ＢｓｔＰＩ断片（1.１kb) 0.１μｇと５′リン酸
化された２種の合成ＤＮＡ（１ピコモルずつ）およびプ
ラスミドｐＵＣ１８由来のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片
（2.７kb)0. １μgをＴ４リガーゼ緩衝液３０μｌに溶
解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２００単位を加え、１２℃で
１６時間結合反応を行った。
コモル（pmoles) ずつを１０μｌのＴ４キナーゼ緩衝液
に溶解し、５単位のＴ４ＤＮＡキナーゼを加え、３７℃
で３０分間反応させることにより５′末端をリン酸化し
た。得られた、プラスミドｐＴＦＲ２７Ａ由来のＥｃｏ
ＲＩ−ＢｓｔＰＩ断片（1.１kb) 0.１μｇと５′リン酸
化された２種の合成ＤＮＡ（１ピコモルずつ）およびプ
ラスミドｐＵＣ１８由来のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片
（2.７kb)0. １μgをＴ４リガーゼ緩衝液３０μｌに溶
解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２００単位を加え、１２℃で
１６時間結合反応を行った。
【００４３】該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株をコ
ーエンらの方法によって形質転換し、Ａｐ耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離し、その構造を制限酵素消化により確認した。こ
のプラスミドをｐＴｆＣ２と呼ぶ。
ーエンらの方法によって形質転換し、Ａｐ耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離し、その構造を制限酵素消化により確認した。こ
のプラスミドをｐＴｆＣ２と呼ぶ。
【００４４】（６）Ｍｏ−ＭｕＬＶのＬＴＲプロモータ
ー／エンハンサーを用いたヒト・トランスフェリン発現
プラスミドｐＭｏ１ｈＴｆ１の構築（図６参照） （４）で得られたプラスミドｐＴｆＮ４の２μｇを３０
μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、１０単位のＳａｌＩ
と１０単位のＥｃｏＲＩを加え、３７℃で２時間消化反
応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、ヒ
ト・トランスフェリン遺伝子のＮ末側を含む約0.９kbの
ＤＮＡ断片を回収した。
ー／エンハンサーを用いたヒト・トランスフェリン発現
プラスミドｐＭｏ１ｈＴｆ１の構築（図６参照） （４）で得られたプラスミドｐＴｆＮ４の２μｇを３０
μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、１０単位のＳａｌＩ
と１０単位のＥｃｏＲＩを加え、３７℃で２時間消化反
応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、ヒ
ト・トランスフェリン遺伝子のＮ末側を含む約0.９kbの
ＤＮＡ断片を回収した。
【００４５】一方、（５）で得られたプラスミドｐＴｆ
Ｃ２の２μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、
１０単位のＢａｍＨＩと１０単位のＥｃｏＲＩを加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロー
スゲル電気泳動後、ヒト・トランスフェリン遺伝子のＣ
末側を含む約1.１kbのＤＮＡ断片を回収した。さらに、
（３）で得られたプラスミドｐＡＧＥ２４７の２μg を
30μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、１０単位のＢａｍ
ＨＩと１０単位のＳａｌＩを加え、３７℃で２時間消化
反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、
Ａｐ耐性遺伝子とＨｙｇＢ耐性遺伝子を含む約6.５kbの
ＤＮＡ断片を回収した。
Ｃ２の２μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、
１０単位のＢａｍＨＩと１０単位のＥｃｏＲＩを加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロー
スゲル電気泳動後、ヒト・トランスフェリン遺伝子のＣ
末側を含む約1.１kbのＤＮＡ断片を回収した。さらに、
（３）で得られたプラスミドｐＡＧＥ２４７の２μg を
30μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、１０単位のＢａｍ
ＨＩと１０単位のＳａｌＩを加え、３７℃で２時間消化
反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、
Ａｐ耐性遺伝子とＨｙｇＢ耐性遺伝子を含む約6.５kbの
ＤＮＡ断片を回収した。
【００４６】得られた、プラスミドｐＴｆＮ４由来のＥ
ｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片（0.９kb)0.05μｇとプラスミ
ドｐＴｆＣ２由来のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（1.１
kb)0.１μｇおよびプラスミドｐＡＧＥ２４７由来のＢ
ａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片（6.５kb) 0.１μｇをＴ４リガ
ーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７
５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行った。
ｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片（0.９kb)0.05μｇとプラスミ
ドｐＴｆＣ２由来のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（1.１
kb)0.１μｇおよびプラスミドｐＡＧＥ２４７由来のＢ
ａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片（6.５kb) 0.１μｇをＴ４リガ
ーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７
５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行った。
【００４７】該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株をコ
ーエンらの方法によって形質転換し、Ａｐ耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離し、その構造を制限酵素消化により確認した。こ
のプラスミドをｐＭｏｌｈＴｆ１と呼ぶ。
ーエンらの方法によって形質転換し、Ａｐ耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離し、その構造を制限酵素消化により確認した。こ
のプラスミドをｐＭｏｌｈＴｆ１と呼ぶ。
【００４８】実施例２ ヒト・トランスフェリン発現プ
ラスミドｐＭｏｌｈＴｆ１およびベクターｐＡＧＥ２４
７のナマルバＫＪＭ−１株への導入とトランスフェリン
非含有無血清培地での増殖性の比較 実施例１で構築したヒト・トランスフェリン発現プラス
ミドｐＭｏｌｈＴｆ１およびコントロールのベクターｐ
ＡＧＥ２４７の、無血清培地馴化ナマルバＫＪＭ−１株
への導入は、エレクトロポレーション法に準じて行っ
た。すなわち、該細胞株を４×１０7cells／mlになるよ
うにＫ−ＰＢＳ〔１３７ｍＭ ＫＣｌ、2.７ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、8.１ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 、1.５ｍＭ ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 、４ｍＭ ＭｇＣｌ2 〕に懸濁し、この細胞懸濁液
４０μｌとＤＮＡ溶液（濃度１μｇ／μｌ）４μｌを融
合チェンバーＳＳＨ−Ｃ１３（電極間距離２mm) 内で混
合した。細胞融合装置ＳＳＨ−１（島津製作所製）を用
いて電圧3.０KV／cm、パルス幅１００μsec 、パルス回
数２回の条件で遺伝子導入を行った。
ラスミドｐＭｏｌｈＴｆ１およびベクターｐＡＧＥ２４
７のナマルバＫＪＭ−１株への導入とトランスフェリン
非含有無血清培地での増殖性の比較 実施例１で構築したヒト・トランスフェリン発現プラス
ミドｐＭｏｌｈＴｆ１およびコントロールのベクターｐ
ＡＧＥ２４７の、無血清培地馴化ナマルバＫＪＭ−１株
への導入は、エレクトロポレーション法に準じて行っ
た。すなわち、該細胞株を４×１０7cells／mlになるよ
うにＫ−ＰＢＳ〔１３７ｍＭ ＫＣｌ、2.７ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、8.１ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 、1.５ｍＭ ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 、４ｍＭ ＭｇＣｌ2 〕に懸濁し、この細胞懸濁液
４０μｌとＤＮＡ溶液（濃度１μｇ／μｌ）４μｌを融
合チェンバーＳＳＨ−Ｃ１３（電極間距離２mm) 内で混
合した。細胞融合装置ＳＳＨ−１（島津製作所製）を用
いて電圧3.０KV／cm、パルス幅１００μsec 、パルス回
数２回の条件で遺伝子導入を行った。
【００４９】１０分間静置した後、ＩＴＰＳＧＦ培地で
希釈し、生細胞数を測定した。このときの染色にはエリ
スロシンＢ（和光純薬社製）を用いた。生細胞濃度が５
×１０4cells／mlになるようにＩＴＰＳＧＦ培地で希釈
し、２００μｌずつ９６穴マイクロタイター・プレート
（ＮＵＮＣ社製）に分注した。３７℃、ＣＯ2 インキュ
ベーターで２４時間培養後、ＨｙｇＢ（生化学工業社
製）を0.３mg／mlになるように加えた。１０〜１４日間
培養し、出現したコロニー数を測定した。
希釈し、生細胞数を測定した。このときの染色にはエリ
スロシンＢ（和光純薬社製）を用いた。生細胞濃度が５
×１０4cells／mlになるようにＩＴＰＳＧＦ培地で希釈
し、２００μｌずつ９６穴マイクロタイター・プレート
（ＮＵＮＣ社製）に分注した。３７℃、ＣＯ2 インキュ
ベーターで２４時間培養後、ＨｙｇＢ（生化学工業社
製）を0.３mg／mlになるように加えた。１０〜１４日間
培養し、出現したコロニー数を測定した。
【００５０】実験は、２回行った。それぞれの遺伝子導
入効率を第１表および第２表に示した。
入効率を第１表および第２表に示した。
【００５１】
【表１】
【００５２】
【表２】
【００５３】ウシ胎児血清（以下、ＦＣＳと略記する）
を２％、ＨｙｇＢを0.３mg／ml、7.５％ＮａＨＣＯ3 を
1／40量、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液（ＧＩＢＣ
Ｏ社製）を３％およびペニシリン・ストレプトマイシン
溶液（ＧＩＢＣＯ社製、5,000units／mlペニシリン−
5,000μｇ／mlストレプトマイシン）を0.５％含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）（以下、第一培地と
略記する）を９６穴プレートに５０μｌ各穴づつに加え
てさらに培養した。細胞がコンフルーエントまで増殖し
た時点で、第一培地を0.８ml加えて４８穴プレート（Co
star社製) に継代した（以下の実験は、とくに断らない
限り４８穴プレートを使用した）。
を２％、ＨｙｇＢを0.３mg／ml、7.５％ＮａＨＣＯ3 を
1／40量、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液（ＧＩＢＣ
Ｏ社製）を３％およびペニシリン・ストレプトマイシン
溶液（ＧＩＢＣＯ社製、5,000units／mlペニシリン−
5,000μｇ／mlストレプトマイシン）を0.５％含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）（以下、第一培地と
略記する）を９６穴プレートに５０μｌ各穴づつに加え
てさらに培養した。細胞がコンフルーエントまで増殖し
た時点で、第一培地を0.８ml加えて４８穴プレート（Co
star社製) に継代した（以下の実験は、とくに断らない
限り４８穴プレートを使用した）。
【００５４】生育の良好な細胞株（各穴毎に形質転換株
の数が異なっているが、１つの穴由来の細胞株の混合培
養をここでは細胞株という）を、ＨｙｇＢを0.３mg／ml
含むＩＴＰＳＧＦ培地（以下、第二培地と略記する）に
1／5 量で継代した。同様の条件でもう一度継代した
後、ＨｙｇＢを0.３mg／ml含むＩＰＳＧＦ培地（以下、
第三培地と略記する。）に 1／5 量で継代した。３〜４
日間培養するとコンフルーエントになるまで増殖したの
で、同様の条件で継代した。増殖を検討した株数および
４８穴プレートにおける各培地での継代回数を第３表お
よび第４表に示した。
の数が異なっているが、１つの穴由来の細胞株の混合培
養をここでは細胞株という）を、ＨｙｇＢを0.３mg／ml
含むＩＴＰＳＧＦ培地（以下、第二培地と略記する）に
1／5 量で継代した。同様の条件でもう一度継代した
後、ＨｙｇＢを0.３mg／ml含むＩＰＳＧＦ培地（以下、
第三培地と略記する。）に 1／5 量で継代した。３〜４
日間培養するとコンフルーエントになるまで増殖したの
で、同様の条件で継代した。増殖を検討した株数および
４８穴プレートにおける各培地での継代回数を第３表お
よび第４表に示した。
【００５５】
【表３】
【００５６】
【表４】
【００５７】このように、ベクター（ｐＡＧＥ２４７）
を導入した形質転換株は、親株と同様、トランスフェリ
ン非含有培地での増殖継代は不可能であった。一方、ト
ランスフェリン要求性株にトランスフェリン発現プラス
ミド（ｐＭｏｌｈＴｆ１）を導入することにより、トラ
ンスフェリン非含有培地でも増殖継代が可能となった。
を導入した形質転換株は、親株と同様、トランスフェリ
ン非含有培地での増殖継代は不可能であった。一方、ト
ランスフェリン要求性株にトランスフェリン発現プラス
ミド（ｐＭｏｌｈＴｆ１）を導入することにより、トラ
ンスフェリン非含有培地でも増殖継代が可能となった。
【００５８】実施例３ ナマルバＫＪＭ−１株、コント
ロール株およびヒト・トランスフェリン発現プラスミド
導入株の最高細胞到達密度の比較 実施例２で得られたプラスミドｐＭｏ１ｈＴｆ１導入ナ
マルバＫＪＭ−１株（ＨｙｇＢ耐性株）の中で、トラン
スフェリン非含有培地で良好な生育を示す株を６株〔そ
れぞれ、ナマルバＫＪＦ−１、ナマルバＫＪＦ−２、ナ
マルバＫＪＦ−３、ナマルバＫＪＦ−４、ナマルバＫＪ
Ｆ−５、ナマルバＫＪＦ−６と命名する〕、コントロー
ルであるベクターｐＡＧＥ２４７導入ナマルバＫＪＭ−
１株（ＨｙｇＢ耐性株）を３株〔それぞれ、コントロー
ル−１、コントロール−２、コントロール−３と命名す
る〕選び、親株と最高細胞到達密度を比較した。
ロール株およびヒト・トランスフェリン発現プラスミド
導入株の最高細胞到達密度の比較 実施例２で得られたプラスミドｐＭｏ１ｈＴｆ１導入ナ
マルバＫＪＭ−１株（ＨｙｇＢ耐性株）の中で、トラン
スフェリン非含有培地で良好な生育を示す株を６株〔そ
れぞれ、ナマルバＫＪＦ−１、ナマルバＫＪＦ−２、ナ
マルバＫＪＦ−３、ナマルバＫＪＦ−４、ナマルバＫＪ
Ｆ−５、ナマルバＫＪＦ−６と命名する〕、コントロー
ルであるベクターｐＡＧＥ２４７導入ナマルバＫＪＭ−
１株（ＨｙｇＢ耐性株）を３株〔それぞれ、コントロー
ル−１、コントロール−２、コントロール−３と命名す
る〕選び、親株と最高細胞到達密度を比較した。
【００５９】初日（０日）に1.００×１０6cells／mlの
細胞濃度で、２５-cm2の組織培養用フラスコ (greiner
社製) に接種した（液量５ml）。この時、親株およびコ
ントロール株はＩＴＰＳＧＦ培地を、トランスフェリン
非要求性株はＩＰＳＧＦ培地（トランスフェリン不含培
地）を用いた。また、培地には選択薬剤であるＨｙｇＢ
は添加していない（以降の実験も同様である）。
細胞濃度で、２５-cm2の組織培養用フラスコ (greiner
社製) に接種した（液量５ml）。この時、親株およびコ
ントロール株はＩＴＰＳＧＦ培地を、トランスフェリン
非要求性株はＩＰＳＧＦ培地（トランスフェリン不含培
地）を用いた。また、培地には選択薬剤であるＨｙｇＢ
は添加していない（以降の実験も同様である）。
【００６０】ＣＯ2 インキュベーターにて、３７℃で２
４時間培養後、細胞濃度を測定した。遠心（1,000rpm、
１０分間）して細胞を回収し、同様の条件でさらに培養
した。同様の操作を１２日間行い、最高細胞到達密度を
比較した。結果を第５表に示した。以上の結果から、ト
ランスフェリン非要求性株はトランスフェリンを含まな
いＩＰＳＧＦ培地で親株およびコントロール株に匹敵す
る最高細胞到達密度を示すことが明らかとなった。
４時間培養後、細胞濃度を測定した。遠心（1,000rpm、
１０分間）して細胞を回収し、同様の条件でさらに培養
した。同様の操作を１２日間行い、最高細胞到達密度を
比較した。結果を第５表に示した。以上の結果から、ト
ランスフェリン非要求性株はトランスフェリンを含まな
いＩＰＳＧＦ培地で親株およびコントロール株に匹敵す
る最高細胞到達密度を示すことが明らかとなった。
【００６１】
【表５】
【００６２】実施例４ ナマルバＫＪＭ−１株、コント
ロール株およびヒト・トランスフェリン発現プラスミド
導入株の増殖速度の比較 実施例２で得られたプラスミドｐＭｏ１ｈＴｆ１導入ナ
マルバＫＪＭ−１株（ＨｙｇＢ耐性株）の中で、トラン
スフェリン非含有培地で良好な生育を示す株を６株〔そ
れぞれ、ナマルバＫＪＦ−１、ナマルバＫＪＦ−２、ナ
マルバＫＪＦ−３、ナマルバＫＪＦ−４、ナマルバＫＪ
Ｆ−５、ナマルバＫＪＦ−６と命名する〕、コントロー
ルであるベクターｐＡＧＥ２４７導入ナマルバＫＪＭ−
１株（ＨｙｇＢ耐性株）を３株〔それぞれ、コントロー
ル−１、コントロール−２、コントロール−３と命名す
る〕選び、親株と細胞増殖速度を比較した。
ロール株およびヒト・トランスフェリン発現プラスミド
導入株の増殖速度の比較 実施例２で得られたプラスミドｐＭｏ１ｈＴｆ１導入ナ
マルバＫＪＭ−１株（ＨｙｇＢ耐性株）の中で、トラン
スフェリン非含有培地で良好な生育を示す株を６株〔そ
れぞれ、ナマルバＫＪＦ−１、ナマルバＫＪＦ−２、ナ
マルバＫＪＦ−３、ナマルバＫＪＦ−４、ナマルバＫＪ
Ｆ−５、ナマルバＫＪＦ−６と命名する〕、コントロー
ルであるベクターｐＡＧＥ２４７導入ナマルバＫＪＭ−
１株（ＨｙｇＢ耐性株）を３株〔それぞれ、コントロー
ル−１、コントロール−２、コントロール−３と命名す
る〕選び、親株と細胞増殖速度を比較した。
【００６３】初日（０日）に3.５８×１０5 〜5.００×
１０5cells／mlの細胞濃度で、２５-cm2の組織培養用フ
ラスコに接種した (液量５ml）。この時、親株およびコ
ントロール株はＩＴＰＳＧＦ培地を、トランスフェリン
非要求性株はＩＰＳＧＦ培地を用いた。ＣＯ2 インキュ
ベーターにて、３７℃で培養し、経時的に細胞濃度を測
定した。結果を第６表および図７に示した。
１０5cells／mlの細胞濃度で、２５-cm2の組織培養用フ
ラスコに接種した (液量５ml）。この時、親株およびコ
ントロール株はＩＴＰＳＧＦ培地を、トランスフェリン
非要求性株はＩＰＳＧＦ培地を用いた。ＣＯ2 インキュ
ベーターにて、３７℃で培養し、経時的に細胞濃度を測
定した。結果を第６表および図７に示した。
【００６４】
【表６】
【００６５】さらに、親株およびコントロール株に匹敵
する増殖速度を示したナマルバＫＪＦ−１株、ナマルバ
ＫＪＦ−３株、ナマルバＫＪＦ−６株について再実験を
行った。結果を第７表および図８に示した。
する増殖速度を示したナマルバＫＪＦ−１株、ナマルバ
ＫＪＦ−３株、ナマルバＫＪＦ−６株について再実験を
行った。結果を第７表および図８に示した。
【００６６】
【表７】
【００６７】以上の結果から、トランスフェリン要求性
株であるナマルバＫＪＭ−１株にヒト・トランスフェリ
ン発現プラスミドを導入することにより、トランスフェ
リン非含有無血清培地で親株およびコントロール株に匹
敵する細胞増殖速度および最高細胞到達密度を示す細胞
株が育種可能であることが示された。
株であるナマルバＫＪＭ−１株にヒト・トランスフェリ
ン発現プラスミドを導入することにより、トランスフェ
リン非含有無血清培地で親株およびコントロール株に匹
敵する細胞増殖速度および最高細胞到達密度を示す細胞
株が育種可能であることが示された。
【００６８】
【発明の効果】本発明により、有用蛋白質生産の宿主細
胞として有用な、トランスフェリン非含有無血清培地で
増殖継代可能な細胞が提供される。
胞として有用な、トランスフェリン非含有無血清培地で
増殖継代可能な細胞が提供される。
【００６９】
【００７０】配列番号：１ 配列の長さ：６２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 フラグメント型：中間型フラグメント 配列 GTAACCTGAG AAAATGTTCC ACCTCATCAC TCCTGGAAGC GTGCACTTTC CGTAGGCCTT 60 AG 62
【００７１】配列番号：２ 配列の長さ：６１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 フラグメント型：中間型フラグメント 配列 GATCCTAAGG CCTACGGAAA GTGCACGCTT CCAGGAGTGA TGAGGTGGAA CATTTTCTCA 60 G 61
【図１】プラスミドｐＡＧＥ１４７の構築工程を示す。
【図２】プラスミドｐＡＧＥ２０７の構築工程を示す。
【図３】プラスミドｐＡＧＥ２４７の構築工程を示す。
【図４】プラスミドｐＴｆＮ４の構築工程を示す。
【図５】プラスミドｐＴｆＣ２の構築工程を示す。
【図６】プラスミドｐＭｏ１h Ｔｆ１の構築工程を示
す。
す。
【図７】トランスフェリン非要求株と親株およびコント
ロール株の細胞増殖速度を示す。
ロール株の細胞増殖速度を示す。
【図８】トランスフェリン非要求株と親株およびコント
ロール株の細胞増殖速度を示す。
ロール株の細胞増殖速度を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】 トランスフェリンを含有しない培地で、
３代以上増殖継代可能なＢリンパ球系細胞。 - 【請求項２】 Ｂリンパ球系細胞が、トランスフェリン
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ
断片との組換え体ＤＮＡを用い、無血清培地中で増殖継
代可能な細胞を形質転換して得られることを特徴とする
請求項１記載のＢリンパ球系細胞。 - 【請求項３】 Ｂリンパ球系細胞がヒト由来のＢリンパ
球系細胞である請求項１記載のＢリンパ球系細胞。 - 【請求項４】 ヒト由来のＢリンパ球系細胞がナマルバ
（Namalwa)細胞である請求項３記載のＢリンパ球系細
胞。 - 【請求項５】 ナマルバ（Namalwa)細胞が、ナマルバ
（Namalwa)ＫＪＦ−１株、ナマルバ（Namalwa)ＫＪＦ−
３株およびナマルバ（Namalwa)ＫＪＦ−６株から選ばれ
る細胞である請求項４記載のＢリンパ球系細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4198132A JPH0646841A (ja) | 1992-07-24 | 1992-07-24 | トランスフェリン非要求性細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4198132A JPH0646841A (ja) | 1992-07-24 | 1992-07-24 | トランスフェリン非要求性細胞 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646841A true JPH0646841A (ja) | 1994-02-22 |
Family
ID=16385985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4198132A Withdrawn JPH0646841A (ja) | 1992-07-24 | 1992-07-24 | トランスフェリン非要求性細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0646841A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0806477A1 (en) * | 1995-01-25 | 1997-11-12 | Vessel Research Laboratory Co., Ltd. | Recombinant dna prepared by integrating dna that codes for myosin heavy-chain sm1 isoform protein into vector dna, and microorganism and arteriosclerosis remedy both containing the recombinant dna |
| EP1837399A1 (en) | 2006-03-22 | 2007-09-26 | FUJIFILM Corporation | Anticancer agent |
| EP1837405A2 (en) | 2006-03-22 | 2007-09-26 | FUJIFILM Corporation | Method for detecting cancer and method for suppressing cancer |
| EP1997911A2 (en) | 2007-05-30 | 2008-12-03 | FUJIFILM Corporation | Method for detecting oral squamous-cell carcinoma and method for suppressing the same |
| EP1997910A2 (en) | 2007-05-30 | 2008-12-03 | FUJIFILM Corporation | Method for detecting ovarian cancer and method for suppresssing the same |
-
1992
- 1992-07-24 JP JP4198132A patent/JPH0646841A/ja not_active Withdrawn
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0806477A1 (en) * | 1995-01-25 | 1997-11-12 | Vessel Research Laboratory Co., Ltd. | Recombinant dna prepared by integrating dna that codes for myosin heavy-chain sm1 isoform protein into vector dna, and microorganism and arteriosclerosis remedy both containing the recombinant dna |
| EP0806477A4 (en) * | 1995-01-25 | 2000-01-05 | Vessel Research Lab Co Ltd | RECOMBINATION DNA PREPARED BY DNA INTEGRATION THAT ENCODES AN ISOFORMS SM1 HEAVY CHAIN PROTEIN OF MYOSINE IN A DNA VECTOR, AND MICROORGANISM AND ARTERIOSCLEROSIS REMEDY CONTAINING EACH OF THESE RECOMBINATION DNA |
| US6593304B1 (en) | 1995-01-25 | 2003-07-15 | Vessell Research Laboratory Co. Ltd. | Recombinant dna comprising dna coding for myosin heavy chain sm1 iso-form protein inserted into vector dna microorganism carrying the recombinant dna, and an agent for treatment of arteriosclerosis comprising the recombinant dna |
| EP1837399A1 (en) | 2006-03-22 | 2007-09-26 | FUJIFILM Corporation | Anticancer agent |
| EP1837405A2 (en) | 2006-03-22 | 2007-09-26 | FUJIFILM Corporation | Method for detecting cancer and method for suppressing cancer |
| EP1997911A2 (en) | 2007-05-30 | 2008-12-03 | FUJIFILM Corporation | Method for detecting oral squamous-cell carcinoma and method for suppressing the same |
| EP1997910A2 (en) | 2007-05-30 | 2008-12-03 | FUJIFILM Corporation | Method for detecting ovarian cancer and method for suppresssing the same |
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